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PAMELLA ARAUJO MALAGRINO
Perfil proteômico da lesão renal aguda induzida por isquemia e
reperfusão
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências
Programa de Ciências Médicas
Área de concentração: Distúrbios Genéticos de
Desenvolvimento e Metabolismo.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre da Costa Pereira
(Versão corrigida. Resolução CoPGr 6018/11, de 13 de outubro de 2011. A versão original está
disponível na Biblioteca da FMUSP)
São Paulo
2019
PAMELLA ARAUJO MALAGRINO
Perfil proteômico da lesão renal aguda induzida por isquemia e
reperfusão
Tese apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade
de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências
Programa de Ciências Médicas
Área de concentração: Distúrbios Genéticos de
Desenvolvimento e Metabolismo
Orientador: Prof. Dr. Alexandre da Costa Pereira
São Paulo
2019
Dedico esta tese à minha família, meus amigos e todas as pessoas boas que
passaram pela minha vida e me fizeram ser uma pessoa melhor.
Agradecimentos
Primeiramente agradeço a Deus, Nossa Senhora, Jesus e a todos os Espíritos de Luz
que me rodeiam por me darem saúde, amor e paciência para execução deste trabalho e
condução da minha vida. Agradeço a Eles também por colocar na minha vida todas estas
pessoas maravilhosas que fazem/fizeram parte da minha vida.
Mãe (Marilene Aparecida de Araújo Malagrino), Pai (João Alberto Tavolaro
Malagrino) e Irmã (Pollyana Araujo Malagrino), vocês são o melhor presente que Deus
poderia me dar, sempre me amando, apoiando e ensinando a ser uma pessoa melhor.
Laura Fagundes, minha irmã mais vaidosa, obrigada por todos os momentos juntas e o
carinho recebido. A toda a minha família, tios, tias, primos e primas toda a gratidão pelo
carinho com que vocês sempre me tratam.
Agradeço também a todas as meninas que moraram comigo nesses anos, só durante
o período do doutorado foram 4 maravilhosas amigas (Gabriela Cozin Aragão, Clarisse
Coutinho, Paolla Pazelli Rosolem e Nayara Almeida Bastos). Vocês foram minha
segunda família, agradeço de coração as conversas, os ensinamentos, o carinho e o amor
compartilhado.
Aos amigos externos ao meu trabalho (Rodrigo Degli Esposti, Leonardo Marino,
Ana Paula Carneiro, Larissa Nogarol e toda a minha turma do CIE) por estarem sempre
presente e me ajudando no que quer que eu precise. Agradeço também minha psicóloga
Cláudia por ser mais uma a me ajudar durante esse período de doutorado com tantas
adversidades que encontramos no caminho.
No trabalho são inúmeras pessoas para agradecer, ciência não se faz sozinha, ela é
fruto de um trabalho conjunto em prol do conhecimento e crescimento coletivo, vocês
verão o tanto de pessoas que colaboraram neste trabalho.
Meu muito obrigada ao meu orientador Alexandre da Costa Pereira, pela confiança,
carinho e toda a ajuda necessária durante estes mais de 8 anos juntos. Você tem o coração
tão grande quanto sua inteligência e você dividiu eles com a gente. Agradeço também a
sua esposa e nossa colaboradora Silvia Titan, pelas grandes ajudas com as análises e
compartilhamento das amostras.
Ao meu grupo, devo todo este trabalho (Gabriela Venturini, Juliana Alvim,
Kallyandra Padilha e Tamiris Carneiro Gois). Cada uma destas meninas lindas deu o seu
melhor como profissional e como amigas que nos tornamos. Visto que passamos o maior
tempo dentro do trabalho, foi com elas que dividi a maior parte da minha vida nesses
anos. “Chorei as pitangas”, ri muito, dividimos trabalho, discutimos ciência, nos
divertimos, enfim aprendi de tudo com elas. Vocês são demais! Sou muito grata a toda
ajuda, atenção e carinho que elas me deram. Gabi, além da grande amiga que você se
tornou para mim, eu queria te agradecer por toda a parte profissional. A maior parte do
que sei hoje sobre proteômica, nitração e metabolômica devo a você que foi uma
excelente professora, sempre teve muita paciência e carinho comigo. Obrigada por
compartilhar seu conhecimento e até sua psicóloga comigo!
Obrigada ao Krieger pelo suporte do laboratório e à Adriana Girardi pelas ajudas
nas discussões de resultados e carinho comigo. Agradeço a todo seu grupo que também
sempre me ajudou nos experimentos de renal e com amizade sincera (Renato, Flávia,
Acaris, Daniel, Danúbia).
Agradeço também aos colegas do laboratório, Thais, Rafael, João, Léo, Camila,
Nathalia Iguaracy, Agatha, Sassa, Thayane, Ayumi, Luis Fernando, Leiliane, Gabriela,
Cynthia, Anna Laura, Juliana, Paulo, Carol e Bruno pelas discussões científicas e
pessoais pelo laboratório e durante os almoços.
Thiago Pires e Luz Marina, obrigada por todos os ensinamentos na parte de
estatística, adoro aprender Estatística. E ao Márcio Chaves com os ensinamentos de
histologia.
Agradeço ao médico Joaquim Maurício Leal Filho e ao Rafael Dariolli pelo
desenvolvimento do modelo de porcos. Obrigada as pessoas do laboratório vizinho Victor
Debbas, Andrea Kuramoto e toda a equipe que sempre me receberam muito bem. Aos
colegas do Laboratório de Pneumologia (Milena, Vanessa e Carlos) pelos auxílios com
os ELISAS.
Fabiana Evangelista, obrigada pela oportunidade de fazer um estágio com alunos
maravilhosos do curso Aspectos Metabólicos e Nutricionais da Atividade Física II de
2017. Aprendi muito com eles e com você, o carinho e o amor com que você dá aulas é
contagiante. Parabéns! Que o mundo tenha mais professores como você.
Agradeço também a todos os funcionários do Laboratório que facilitam nossas
vidas com a burocracia ou arrumando a nossa bagunça (Andrea, Sileide, Brendo, Ana,
Ednalva, Priscilla, Maúde, Silvana, Mari, Elida, Renata).
Não posso me esquecer dos meus amigos do Fleury (Jéssica Salgueiro, Karina
Cardozo e Valdemir Carvalho) que nos receberam de portas abertas dando todo o suporte
necessário com o espectrômetro de Massas. E ao Giuseppe que assim como eles, me
ajudou com as discussões sobre as análises proteômicas.
Obrigada aos meus professores das matérias de pós-graduação pelos conhecimentos
transferidos, e ao pessoal da pós-graduação (Rose, Angélica e Ângela) que nos ajudam
com mais burocracias.
Não me esquecendo da base, onde iniciei minha iniciação científica e me deu os
conhecimentos básicos necessários para eu chegar até aqui, agradeço a Angelina Zanesco,
Carlos Sponton e Cynara Rodovalho.
É muito difícil escrever aqui o nome de todas as pessoas que me ajudaram nesse
trabalho, pois ele é fruto do que tenho me tornado como pessoa, e cada pessoa que passou
na minha vida me deixou um pouquinho dela, algumas que eu até nem sei o nome. Foram
conversas numa sessão terapêutica, num barzinho, num congresso, no ônibus, no metrô
e até no avião. As vezes nem foram através de conversas, mas executando o trabalho
delas com amor de forma bem-feita, me trazendo conhecimento e inspiração. Quero
deixar registrado aqui a minha gratidão também a todas essas pessoas.
Tão importante quanto o apoio emocional e profissional foi o apoio financeiro para
mim e meu projeto. Então, agradeço ao grupo Fleury, a CAPES e a Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) (processo 2015/04492-0).
Esta tese está de acordo com as seguintes normas, em vigor no momento desta publicação:
Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors
(Vancouver)
Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e
Documentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por
Anneliese Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva
de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a ed. São Paulo: Serviço de
Biblioteca e Documentação; 2011.
Abreviaturas dos títulos dos periódicos de acordo com
List of Journals Indexed in Index Medicus
“Não há progresso sem esforço, vitória sem luta, aperfeiçoamento sem
sacrifício, assim como não existe tranquilidade sem paciência”
Emmanuel/Chico Xavier
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................... v
LISTA DE TABELAS ................................................................................. xi
LISTA DE SIGLAS ................................................................................... xiii
LISTA DE SÍMBOLOS ............................................................................. xix
RESUMO ................................................................................................. xxiii
ABSTRACT .............................................................................................. xxv
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 1
1.1 CAPÍTULO 1 - LESÃO RENAL AGUDA ........................................................ 3
1.1.1 Definições........................................................................................................ 3
1.1.2 Epidemiologia ................................................................................................. 4
1.1.3 Diagnóstico...................................................................................................... 6
1.1.4 Classificação da LRA ...................................................................................... 6
1.1.5 Isquemia e Reperfusão Renal .......................................................................... 8
1.1.6 Estresse oxidativo .......................................................................................... 11
1.2 CAPÍTULO 2 – NITRAÇÃO PROTEICA ...................................................... 23
1.2.1 Definição e origem ........................................................................................ 23
1.2.2 Métodos de dosagem de nitrotirosina............................................................ 25
1.2.3 Função ........................................................................................................... 29
1.3 CAPÍTULO 3 – BIOMARCADORES DE LESÃO RENAL AGUDA ........... 33
1.3.1 NGAL ............................................................................................................ 34
1.3.2 KIM-1 ............................................................................................................ 35
1.3.3 IL-18 .............................................................................................................. 36
1.3.4 L-FABP ......................................................................................................... 36
1.3.5 NAG .............................................................................................................. 37
1.3.6 TIMP-2 e IGFBP-7........................................................................................ 37
1.3.7 RBP ............................................................................................................... 38
1.3.8 β2-microglobulina ......................................................................................... 39
1.3.9 Métodos de descoberta de biomarcadores ..................................................... 41
1.3.10 Análise de Proteínas ...................................................................................... 42
2 OBJETIVOS ......................................................................................... 47
2.1 Objetivo geral ................................................................................................... 49
2.1.1 Objetivos específicos..................................................................................... 49
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................. 51
3.1 Reagentes Químicos ......................................................................................... 53
3.2 Modelo suíno de I/R renal ................................................................................ 54
3.3 Coletas das amostras ......................................................................................... 55
3.4 PROTEOMA TOTAL ...................................................................................... 56
3.4.1 Extração de proteínas do córtex renal ........................................................... 56
3.4.2 Digestão das proteínas do córtex renal .......................................................... 57
3.4.3 Preparação das amostras de soro ................................................................... 57
3.4.4 Preparação das amostras de urina.................................................................. 57
3.4.5 Digestão das proteínas do soro e da urina ..................................................... 58
3.4.6 LC-ESI-MS/MS ............................................................................................ 58
3.4.7 Identificação e quantificação dos peptídeos e proteínas do LC-ESI-MS/MS
59
3.4.8 Identificação das proteínas predominantemente renais ................................. 62
3.4.9 Biologia de Sistemas ..................................................................................... 62
3.4.10 Ensaio de atividade da DPPIV ...................................................................... 62
3.4.11 Validação em pacientes com nefropatia diabética ........................................ 63
3.5 NITROPROTEOMA ........................................................................................ 65
3.5.1 Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) ............................................ 65
3.5.2 Imunohistoquimica ........................................................................................ 65
3.5.3 Extração de proteínas do córtex renal para o nitroproteoma ......................... 66
3.5.4 Enriquecimentos de proteínas nitradas por imunoprecipitação..................... 66
3.5.5 Digestão das nitroproteínas ........................................................................... 67
3.5.6 Identificação e quantificação dos peptídeos e proteínas do LC-ESI-MS/MS
68
3.5.7 Identificação de proteínas predominantemente renais .................................. 71
3.5.8 Biologia de Sistemas ..................................................................................... 71
3.5.9 Validação por bioinformática ........................................................................ 71
3.5.10 SDS-PAGE com immunobloting .................................................................. 72
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ........................................................ 75
4.1 Proteoma Total .................................................................................................. 77
4.1.1 Proteoma do córtex renal............................................................................... 77
4.1.2 Proteoma do soro ........................................................................................... 80
4.1.3 Proteoma da urina.......................................................................................... 81
4.1.4 Sumário dos Resultados Proteoma Total ...................................................... 88
4.1.5 Considerações finais do Proteoma Total ....................................................... 90
4.2 Nitroproteoma ................................................................................................... 91
4.2.1 Nitração proteica total em córtices renais pós I/R renal ................................ 91
4.2.2 Caracterização do nitroproteoma do córtex renal após I/R renal .................. 95
4.2.3 Nitroproteoma do Soro ................................................................................ 112
4.2.4 Nitroproteoma da urina ............................................................................... 122
4.2.5 Abundância das proteínas nitradas no modelo de LRA por I/R renal ......... 137
4.2.6 Limitações do estudo ................................................................................... 139
4.2.7 Sumário dos resultados – Nitroproteoma .................................................... 140
4.2.8 Considerações finais do Nitroproteoma ...................................................... 143
5 CONCLUSÕES .................................................................................. 145
6 REFERÊNCIAS .................................................................................. 149
7 ANEXO 1 ............................................................................................ 183
8 ANEXO 2 ............................................................................................ 221
9 ANEXO 3 ............................................................................................ 225
v
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Prognóstico da doença renal crônica (DRC) baseado na albuminúria e na taxa
de filtração glomerular (TFG). Traduzido de Levey & Coresh 2012. .............................. 4
Figura 2. Necrose tubular aguda por isquemia/reperfusão (I/R). Após a I/R ocorre perda
da borda em escova dos túbulos proximais, perda de polaridade e redistribuição de
integrinas e Na+K+ATPase para a superfície apical com perda do formato tubular. Cálcio
e espécies reativas de oxigênio atuam nestas alterações com subsequente morte celular
por necrose e/ou apoptose. Células viáveis e inviáveis descamam e seguem para o lúmen
obstruindo-o e reduzindo a taxa de filtração glomerular. O rim pode se restaurar
completamente espalhando e desdiferenciando células viáveis para substituir as
lesionadas. Diversos fatores de crescimento ajudam na restauração dos epitélios
tubulares. Esquema modificado de Thadhani et.al, 1996. .............................................. 10
Figura 3. Estrutura da mitocôndria. Wikepédia, ilustrado por Felipe Fontoura baseado na
figura de Mariana Ruiz. .................................................................................................. 13
Figura 4.Produção de ATP na mitocôndria. Os elétrons produzidos no ciclo do ácido
cítrico (TCA) são transportados pelo NADH e FADH2 até os complexos I e II,
respectivamente. Estes elétrons passam pelo complexo III e são captados pelo oxigênio
no complexo IV. A medida que os elétrons são transferidos de um complexo para outro,
os prótons (H+) são ativamente bombeados para o espaço intermembranar, mantendo o
potencial de membrana e impulsionando a produção de ATP pela ATP sintase. MEM:
membrana externa mitocondrial, MIM: membrana interna mitocondrial. Figura adaptada
de Bhargava et al, 2017. ................................................................................................. 15
Figura 5.Molécula de tirosina sofrendo ação de agentes nitrantes para a formação da 3-
nitrotirosina. (TSIKAS; DUNCAN, 2014). .................................................................... 23
Figura 6.Modificações proteicas produzidas por reações do óxido nítrico (NO).
(ADAMS; FRANCO; ESTEVEZ, 2015). ...................................................................... 24
Figura 7. Número de publicações de artigos no PubMed relacionados com a palavra-
chave “nitrotyrosine” entre os períodos de 1990 e 2018. ............................................... 29
Figura 8. Metabolismo das células dos túbulos após LRA isquêmica. Inicialmente, com
a isquemia há uma depleção de ATP capaz de ativar caspases, fosfolipases e aumentar o
Ca2+ intracelular que cuminam na morte celular. Concominantemente há um aumento
excessivo da produção de óxido nítrico (NO) pela iNOS aumentando as espécies reativas
de nitrogênio como o peroxinitrito e conquenquentemente gerando uma lesão oxidativa e
a nitrosilação ou nitração de proteínas que é agravada com a reperfusão via conversão da
hipoxantina acumulada durante a isquemia e convertida em xantina. Traduzido de
(Devarajan 2006). ........................................................................................................... 31
Figura 9. Resumo da atividade dos principais biomarcadores de LRA. Traduzido de
Andreucci et al. 2007. ..................................................................................................... 40
vi
Figura 10. Análise de Componente Principal para o perfil nitroproteômico dos córtices
isquêmico e contralateral. E gráfico de porcentagem de necrose tubular aguda do modelo
de I/R renal publicado por Malagrino et al., 2014. ......................................................... 55
Figura 11. Fluxograma utilizado na identificação de biomarcadores candidatos a LRA.
Inicialmente, as proteínas foram limpas e selecionadas pela sua presença em pelo menos
3 animais. A seguir, foi feito o teste t de Student para comparar a média dos valores entre
o rim contralateral e isquêmico, as proteínas diferentes seguiram para análise de sistemas
biológicos (SB). No soro e na urina, apenas as proteínas que apareceram após a isquemia
foram selecionadas para análise de sistemas biológicos (SB) e comparação com as
proteínas renais e os bancos de órgão especifico para análise de proteínas
predominantemente renais. ............................................................................................. 61
Figura 12. Esquema utilizado nas análises dos proteomas. ........................................... 64
Figura 13 Fluxograma utilizado para a análise do nitroproteoma.. Primeiramente, foram
removidas as proteínas incertas dos nitroproteomas da urina, rins e soro, seguido da
aplicação do filtro biológico. Para o tecido renal foram avaliadas as proteínas
diferencialmente expressas entre os rins contralateral e isquêmico considerando os fold
change log2FC≤-1 or FC≥1 em pelo menos 3 animais. Já para urina e soro foram feitas
analises de agrupamento hieráquico para identificação de proteínas com comportamentos
semelhantes entre os tempos de I/R analisados. Por fim, foram feitas a demonstração
gráfica dos resultados por heatmap, as análises de biologia de sistemas e a identificação
de proteínas predominantemente renais. Apenas as proteínas predominantemente renais
encontradas nos rins seguiram para validação por bioinformática e expressão proteica.
........................................................................................................................................ 70
Figura 14. Esquema utilizado nas análises dos nitroproteomas. ................................... 73
Figura 15. Análise funcional das 535 proteínas do córtex renal que se mostraram
estatisticamente diferentes entre os rins isquêmico e contralateral. Os números no gráfico
de pizza representam o número percentual de proteínas na respectiva categoria funcional
com base no banco de dados do Gene Onthology e UniProt.......................................... 77
Figura 16. Heatmap da concentração das proteínas diferentemente expressas entre os rins
contralateral e isquêmico. C= contralateral, I=isquêmico. ............................................. 78
Figura 17. Proteínas presentes no soro, candidatas a biomarcadores de LRA. Seis
proteínas que apareceram ou desapareceram do soro após isquemia e reperfusão renal e
foram encontradas alteradas no rim isquêmico. O colormap mostra a diferença de
concentração destas proteínas antes, durante e após a isquemia. Nomes em português com
seus respectivos genes: proteína 2 relacionada a heat shock 70 kDa – HSPA8, proteína 60
kDa heat shock mitocondrial – HSPD1; colágeno tipo I alfa 1 – COL1A1; vimentina
VIM, plastina-2 – LCP1 e isomerase triosefosfato – TPI1............................................. 80
Figura 18. Proteínas presentes na urina, candidatas a biomarcadores de LRA. Quarenta e
nove proteínas que apareceram na urina antes, durante a após a isquemia e reperfusão e
foram encontradas alteradas no rim isquêmico. O colormap mostra a diferença de
concentração destas proteínas antes, durante eapósa isquemia. As proteínas destacadas
com letras vermelhas são proteínas predominantemente renais. .................................... 82
vii
Figura 19. Análise funcional das 49 proteínas urinárias candidatas a biomarcadores de
LRA. Os números no gráfico de pizza representam o número percentual de proteínas na
respectiva categoria funcional com base no banco de dados do Gene Onthology e UniProt.
........................................................................................................................................ 83
Figura 20. Absorbância da atividade da DPPIV na urina durante a isquemia/reperfusão
renal. p<0,05. Pos-rep = Pós reperfusão. ........................................................................ 85
Figura 21. Gráficos das correlações significativas da atividade da DPPIV urinaria com
os parâmetros clínicos e bioquímicos relacionados à função renal. ............................... 87
Figura 22. Nitração proteica dos rins contralaterais e isquêmicos. A. Quantificação das
proteínas nitradas representada pela média dos valores dos animais ± erro padrão da
média. B. Quantificação das proteínas nitradas com os valores absolutos para cada animal.
A absorbância foi obtida pelo método ELISA com anticorpo antinitrotirosina. P2, P3, P4
e P5 correspondem aos números das porcas utilizadas. ................................................. 92
Figura 23. Imunohistoquimica dos córtices renais contralaterais e isquêmicos com
anticorpo antinitrotirosina marcada em marrom para dois animais (P2 e P3). A magnitude
utilizada foi 200X. .......................................................................................................... 93
Figura 24. Immunobloting contra a proteína iNOS ou NOS2 do extrato proteico dos
cortices renais. As bandas foram quantificadas por densitometria e o GAPDH foi usado
como normalizador. Não houve diferença estatisticamente significativa entre os rins
(Wilcoxon pareado p=0,12). Cada sinal no gráfico representa um animal analisado. Os
valores foram expressos como média ± SEM. C = rim contralateral, I = rim isquêmico.
P4 = porca 4, P5 = porca 5. ............................................................................................ 95
Figura 25. Heatmap da expressão proteica padronizada pelo z-score (-2 a 2) nos rins
contralateral e isquêmico para cada animal. C2, C3, C4, C5 representam o rim
contralateral e I2, I3, I4, I5 representam o rim isquêmico. As proteínas foram
representadas pelo nome dos seus genes. ....................................................................... 97
Figura 26. Proteínas nitradas identificadas nos córtices renais dos rins após I/R renal
unilateral. As proteínas nitradas em ambos os rins foram destacadas com a cor laranja, e
as presentes apenas no rim contralateral estão em rosa. Em verde foi destacado o
metabolismo oxidativo exacerbado com á I/R renal. Já, as setas em rosa simbolizam o
transporte de metabólitos (bolinhas azuis) entre a célula e a mitocôndria. .................. 101
Figura 27. Immunobloting contra as proteínas mitocondriais VDAC1 e TOM20 do
extrato proteico dos cortices renais. As bandas foram quantificadas por densitometria e o
GAPDH foi usado como normalizador. Não houve diferença estatisticamente
significativa entre os rins para VDAC1 (Wilcoxon pareado p=0,37) e TOM20 (Wilcoxon
pareado p=0,62). Cada sinal no gráfico representa um animal analisado. Os valores foram
expressos como média ± SEM. C = rim contralateral, I = rim isquêmico. P4 = porca 4, P5
= porca 5. ...................................................................................................................... 103
Figura 28. Immunobloting contra BHMT2 do extrato proteico do córtex renal com e sem
enriquecimento por imunoprecipitação. O anticorpo utilizado reconheceu três bandas da
BHMT2: 40Kda, 37 e 39kDa. As bandas foram quantificadas por densitometria e o
GAPDH foi usado como normalizador somente para o extrato não enriquecido. Não
houve diferença estatisticamente significativa entre os rins. Cada sinal no gráfico
viii
representa um animal analisado. Os valores foram expressos como média ± SEM. M =
marcador de peso molecular, C = rim contralateral, I = rim isquêmico, IP =
imunoprecipitação. ....................................................................................................... 110
Figura 29. Immunobloting contra DPPIV do extrato proteico do córtex renal com e sem
enriquecimento por imunoprecipitação. O anticorpo utilizado reconheceu a forma solúvel
da DPPIV em 90KDa. As bandas foram quantificadas por densitometria e o GAPDH foi
usado como normalizador somente para as amostras não enriquecidas. Não houve
diferença estatisticamente significativa entre os rins. Cada sinal no gráfico representa um
animal analisado. Os valores foram expressos como média ± SEM. M = marcador de peso
molecular, C = rim contralateral, I = rim isquêmico, IP = imunoprecipitação. Note que os
animais que têm maiores valores de DPPIV total, têm menos DPPIV nitrada e os que têm
menores valores de DPPIV total tem mais proteína nitrada. ........................................ 111
Figura 30. Heatmap e dendograma da expressão proteica dos soros padronizada pelo z-
score (-1,5 a 1,5) durante o experimento de I/R renal. O dendrograma da vertical agrupa
os períodos mais similares da I/R, enquanto o dendograma da horizontal agrupa as
proteínas com comportamentos similares das expressões proteicas. Os retângulos
amarelos destacam os grupos de proteínas que mais separam os períodos analisados.
PreIsc = pré-isquemia; Isc = isquemia; R6 = 6h pós reperfusão; R11 = 11h pós reperfusão;
R16 = 16h pós reperfusão. As proteínas foram representadas com o nome dos seus genes
e a média dos valores de expressão dos 4 animais. ...................................................... 114
Figura 31. Proteínas nitradas totais no soro ao longo da I/R renal. O gráfico mostra a
diferença entre os tempos pós isquemia e basal (pré-isquemia), destacando o aumento pós
reperfusão. Todos os valores foram apresentados como média±erro padrão da média. A
análise para medidas repetidas (ANOVA) resultou em p<0,05, sem diferença no pós-teste,
mostrando que houve diferença na análise global da nitração proteica (Malagrino, 2014).
...................................................................................................................................... 115
Figura 32. Avaliação da expressão proteica da proteína DMGDH total e nitrada no córtex
renal e no soro dos animais antes e após a I/R. ............................................................ 121
Figura 33. Excreção de proteínas nitradas/creatinina na urina ao longo da I/R renal. O
gráfico mostra um aumento significativo da excreção de proteínas nitradas no início da
reperfusão – 15min (n=4). Todos os valores foram apresentados como média±erro padrão
da média. Análise para medidas repetidas (ANOVA) p<0,05, sendo * comparado ao valor
basal (Malagrino et al. 2014). ....................................................................................... 123
Figura 34. Excreção de proteínas nitradas/creatinina na urina ao longo da I/R renal. O
dendrograma da vertical agrupa os períodos mais similares da I/R, enquanto o
dendograma da horizontal agrupa as proteínas com similares comportamentos de
expressão proteica. Os retângulos amarelos destacam os grupos de proteínas que mais
diferenciam os períodos de I/R renal. PreIsc = pre isquemia; Isc = isquemia; R6 = 6h pós
reperfusão; R11 = 11h pós reperfusão; R16 = 16h pós reperfusão. As proteínas foram
representadas pelo nome dos seus genes. ..................................................................... 124
Figura 35. Heatmap da expressão proteica nas urinas padronizada pelo z-score (-1,5 a
1,5) durante o experimento de proteoma total urinário ao longo da isquemia e reperfusão
(I/R) renal com seus dendogramas. O dendrograma da vertical agrupa os períodos mais
ix
similares da I/R, enquanto o dendograma da horizontal agrupa as proteínas com similares
comportamentos de expressão proteica. PreIsc = pre isquemia; Isc = isquemia; R6 = 6h
pós reperfusão; R11 = 11h pós reperfusão; R16 = 16h pós reperfusão. As proteínas foram
representadas pelo nome dos seus genes. Estes resultados vieram de uma análise
complementar dos dados do proteoma total da urina desenvolvida na primeira parte desta
tese. ............................................................................................................................... 134
Figura 36. Box plots da expressão proteica das proteínas mais abundantes encontradas
no nitroproteoma para cada amostra. A. córtex renal, B. soro e C. urina. A expressão
proteica foi calculada pela intensidade dos íons. .......................................................... 137
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Correlação de Spearman entre a atividade da DPP IV na urina e os
parâmetros clínicos e bioquímicos dos pacientes com disfunção renal (56 pacientes). . 86
Tabela 2. Análise de enriquecimento de vias metabólicas para as 55 proteínas
diferencialmente expressas entre os rins contralateral e isquêmico após I/R renal. ....... 99
Tabela 3. Comparação da expressão proteica das proteínas presentes no Proteoma total
e no Nitroproteoma de córtices renais pós I/R renal. ................................................... 104
Tabela 4. Predição dos sítios de tirosina nitrada das proteínas candidatas a
biomarcadora de LRA no córtex renal por dois modelos preditores. ........................... 108
Tabela 5. Peptídeos e intensidade de íons para cada rim de cada animal analisado.... 112
Tabela 6. Análise de enriquecimento de vias metabólicas para os dois grupos de
proteínas encontrados, pré-isquemia/isquemia e reperfusão no nitroproteoma sérico após
I/R renal. ....................................................................................................................... 117
Tabela 7. Valores brutos da intensidade de íons para DMGDH e SEMG2. ................ 119
Tabela 8. Caracterização das proteínas urinárias encontradas no nitroproteoma durante
a I/R renal. .................................................................................................................... 125
xiii
LISTA DE SIGLAS
1D Uma dimensão
2D Duas dimensões
AADC Aromatic-L-amino-ácido decarboxilase
Acetil-CoA Acetilcoenzima A
ACN Acetonitrila
ADQI do inglês Acute Dialysis Quality Initiative
AHP Atlas Human Protein
AKIN do inglês Acute Kidney Injury Network
ALB Albumina
ANOVA Análise de variância
ApoA1 Apolipoproteína A1
ATP Adenosina trifosfato
BCA do inglês bicinchoninic acid protein assay
BHMT2 Betaina-Homocisteína Metiltransferase 2
BSA Albumina de soro bovino
CAPPesq Comissão de ética para análise de projetos de pesquisa
CO Citocromo oxidase
COL18A1 Cadeia alfa-1 do colágeno (XVIII)
COX1 Ciclooxigenase 1
CYB Citocromo B
Cyt C Citocromo C
DAD Rede de diodos
DDA Aquisição dependente de dados
xiv
DMP Dimethyl pimelimidate dihydrochloride
DNA do inglês Deoxyribonucleic acid
DPPIV Dipeptidil peptidase IV
DRC Doença renal crônica
DTT Ditiotreitol
ECA Enzima conversora de angiotensina
EDTA Ácido tetracétio Ethylenediamine tetraacetic acid
EGTA Ácido tetraacético glicol etileno
EIF2 Fator de iniciação eucariótica 2
ELISA Ensaio de imunoabsorção enzimática
ENA78 Peptídeo ativador de neutrófilos ENA-78
eNOS Sintase do Óxido Nítrico endotelial
ERNs Espécies reativas de nitrogênio
EROs Espécies reativas de oxigênio
ESI Ionização por electrospray
ESTs do inglês expressed sequence tag/ marcador de sequência
genética
ETFDH Transferência de elétrons flavoproteína-ubiquinona
óxidoredutase, mitocondrial
FADH2 Flavina-adenina dinucleótido
FC Fold change
FDA Food and Drug Administration
FDR Taxa de falsa descoberta
FGA Cadeia alfa do fibrinogênio
FL Fluorescência
GBA3 Glucosidase beta citosólica
xv
GC Cromatografia a gás
GCDH Glutaril-CoA desidrogenase mitocondrial
GESF Glomeruloesclerose segmentar e focal
GLP2R Receptor do peptídeo 2 semelhante ao glucagon
GMPc Guanosina monofosfato cíclico
GSH Glutationa reduzida
HCD Dissociação Induzida por Alta Energia de Colisão
HPLC do inglês High performance liquid chromatography/
Cromatografia líquida de alta eficiência.
HRP do ingês horseradish peroxidase
HSP90 do inglês Heat-shock protein 90/ Proteína de choque térmico 90
I/R Isquemia e reperfusão
IAA Iodoacetamida
IGFBP7 Proteína de ligação ao fator de crescimento de insulina 7
IgG Imunoglobulina G
IL-18 Interleucina 18
InCor Instituto do Coração
iNOS Sintase do Óxido Nítrico induzível
IP Imunoprecipitação
IPA Ingenuity Pathway Analysis
ISN Sociedade Internacional de Nefrologia
ITRAQ do inglês Isobaric tags for relative and absolute quantification
KDIGO do inglês kidney disease improving global outcomes
KIM-1 Molécula de lesão renal 1
LC Cromatografia líquida
xvi
L-FABP Proteína de ligação a ácidos graxos no fígado
LFQ Quantificação livre de marcação
LRA Lesão renal aguda
MALDI Ionização e dessorção a laser assistida por matriz
MB Membrana basal
MCP1 Proteína quimiostática de monócitos 1
MDRD Modificação da Dieta na Doença Renal
MnSOD Superóxido desmutase dependente de Manganês
MRM Monitoramento por multiplas reações
MS/MS Espectrometria de Massa em tandem
mtDNA DNA mitocondrial
Na+K+ATPase Bomba de sódio potássio
NADH Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo
NADPH Fosfato de nicotinamida adenina dinucleotideo reduzido
NAG N-acetil-β-D-glucosaminidase
NCBI National Center for Biotechnology Information
NCT Número do estudo clínico
NGAL Lipocalina associada à gelatinase de neutrófilos
NOS Sintase do óxido nítrico
NTA Necrose tubular aguda
PAICS Fosforibosilaminoimidazol carboxilase
PANTHER Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships
PBS Tampão fosfato de sódio
PBST Tampão fosfato de sódio com Tween 20
PFN1 Profilina-1
xvii
PGM1 Fosfoglucomutase-1
pH Potêncial hidrogeniônico
PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
RANTES Proteína específica de células T RANTES
RBP Proteína de ligação ao Retinol
RIFLE do inglês Risk, Injury, Failure, Loss and End-stage kidney disease
SB Sistemas biológicos
SDS Dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE Eletroforese de gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio
SEM Monitoramento de reação selecionada
SILAC do inglês Stable isotope labeling by amino acids in cell culture
SOD Superóxido desmutase
SPAER do inglês solid-phase active ester reagente
TCA Ciclo do ácido cítrico
TF Serotransferrina
TFA Ácido trifluoroacetico
TFG Taxa de filtração glomerular
TiGER Tissue-specific Gene Expression and Regulation`s
TIM Translocase da membrana interna de importação mitocondrial
TIMP-2 Inibidor tecidual de metaloproteínase 2
TMT do inglês Tandem mass tags
TNF-α Fator de necrose tumoral Alfa
TOM20 Subunidade 20 do receptor de importação mitocondrial
TUPA Targeted Urine Proteome Assay for kidney diseases
Tween 20 Polioxietileno-20-sorbitan monolaureato
xviii
UPLC Cromatografia liquida de ultra performance
USP Universidade de São Paulo
UTI Unidade de terapia intensiva
UV Radiação ultravioleta
VAPA Proteína A associada a proteína de membrana associada a vesícula
VDAC1 Proteína 1 do canal seletivo de ânions dependente de voltagem
xix
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem
< Menor
> Maior
°C Graus Celsius
µg Micrograma
µL Microlitro
µm Micrômetro
µM Micromolar
Ca2+ Ìons de Cálcio
Cl- Cloreto
cm Centímetro
cm2 Centímetro quadrado
CO2 Dióxido de carbono
dL Decilitro
F French
Fe++ Íon Ferro
G Força G
h Horas
H2O2 Peróxido de hidrogênio
K+ Potássio
KCl, Cloreto de potásio
xx
KDa Quilodalton
kg Quilograma
KH2PO4 Fosfato de potásio monobásico
M Molar
mg Miligrama
MgCl Cloreto de Magnésio
min minutos
mL Mililitro
mm Milímetro
mM Milimolar
mm3 Milímetro cúbico
Na+ Sódio
Na2HPO4 Fosfato de sódio
NaCl, Cloreto de sódio
NaH2PO4 Fosfato monossódico
NaHCO3 Bicarbonato de sódio
nm Nanometro
nM Nanomolar
NO- Nitrosil ânion
NO Óxido nítrico
NO+ Cátion nitrosonium
NO2- Dióxido de nitrogênio
O2- Superóxido
xxi
OH- Hidroxila
ONOO - Peroxinitrito
pg Picograma
ppm parte por milhão
rpm rotação por minutor
s Segundos
U unidade
ηM Nanomolar
ρM Picomolar
xxiii
Malagrino PA. Perfil proteômico da lesão renal aguda induzida por isquemia e
reperfusão [tese]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2019.
RESUMO
A principal dificuldade na identificação de novos biomarcadores para doenças renais
consiste em encontrar marcadores que são específicos do rim ou do processo patológico
em que se encontra, além de conseguir caracterizar a doença renal independente de outras
doenças pré-existentes. Assim, o objetivo deste estudo foi identificar novos candidatos a
biomarcadores, predominantemente renais, de lesão renal em um modelo suíno
controlado unilateral de lesão renal aguda (LRA) por isquemia/reperfusão (I/R) renal
percutânea. Para isto, foram feitas análises do proteoma e do nitroproteoma de amostras
de urina e soro nos períodos pré-isquemia, isquemia (60min) e pós-reperfusão (4 ou 6h,
11 e 16h), e das de amostras do córtex renal após 24h de reperfusão, todas no Q-
ExactiveTM. Os resultados foram analisados no MaxQuant seguidos da análise de biologia
de sistemas. A seleção das proteínas candidatas a biomarcadores de lesão renal foi
baseada na predominância de expressão dessas proteínas no rim através do banco TiGER
e/ou Atlas Human Protein. Foram identificadas 1365 proteínas no proteoma total dos
córtices renais, das quais 535 estavam presentes em pelo menos 3 animais e mais
expressas no rim isquêmico, com excessão da Xaa-pró aminopeptidase 2. Estas proteínas
participam dos processos de transcrição, tradução, adesão celular, proliferação e reparo,
importantes para a recuperação da lesão renal após 24h. A intersecção das proteínas sub
ou superexpressas no rim isquêmico com os proteomas do soro ou da urina resultou em
seis proteínas séricas (VIM, HPSA8, HSPD1, COL1A1, LCP1e TPI1) entre as 170
identificadas capazes de fornecer um painel para LRA ou processo degenerativo.
Enquanto na urina, foram identificadas 49 de 501 proteínas presentes na intersecção,
sendo 4 predominantemente renais (BHMT2, GBA3, DDC e DPPIV). A atividade da
DPPIV na urina aumentou após 4h de reperfusão retornando aos níveis basais após este
período validando o nosso candidato a biomarcador. A DPPIV também foi validada em
uma coorte de pacientes com nefropatia diabética que apresentou uma moderada
correlação com os parâmetros ligados a disfunção renal: MDRD, proteinúria,
hemoglobina glicada, PTH e renina. Apesar de não haver diferença na concentração de
xxiv
proteínas nitradas no rim contralateral e isquêmico houve uma diferença no perfil de
proteínas encontradas. Foram identificadas 843 proteínas no nitroproteoma dos córtices
renais das quais 53 estavam superexpressas no rim isquêmico e 2 no rim contralateral.
Das 55 proteínas, 38% eram mitocondriais e relacionadas com as vias energéticas. Foi
possível validar a nitração de duas destas proteínas, a DPPIV e a BHMT2. No
nitroproteoma da urina identificou-se 126 proteínas das quais 27 se agruparam de forma
diferente para cada período do experimento baseado no comportamento da expressão
proteica. A excreção de proteínas nitradas também foi observada no tempo basal, supondo
um papel fisiológico da nitração. Além disso, o perfil de excreção de proteínas nitradas
ao longo da I/R foi independente das mudanças ocorridas no perfil proteico total. Por fim,
duas proteínas se destacaram como candidatas a biomarcador, a UMOD e a ALDOB. Já,
o nitroproteoma sérico resultou em 55 proteínas, das quais as 33 mais representativas dos
animais foram capazes de separar o período antes e após a reperfusão renal. Duas destas
proteínas foram consideradas candidatas a biomarcadores de lesão renal, a SEMG2 e a
DMGDH, esta última foi validada. A partir dos resultados gerados, foi possível identificar
alterações proteicas ao longo da I/R renal, novas proteínas nitradas e novos candidatos a
biomarcador de lesão renal. Novos estudos com uma abordagem mais direcionada e
aprofundada devem ser desenvolvidos, tanto para confirmar os candidatos a
biomarcadores e seu potencial uso clínico, quanto para analisar o comportamento
fisiopatológico e bioquímico das proteínas com e sem nitração na LRA por I/R renal em
rins morfo-fisiologicamente semelhantes aos encontrados em humanos.
Descritores: Proteômica; Lesão renal aguda; Isquemia; Nitração; Biomarcadores;
Espectrometria de massas; Nefropatias.
xxv
Malagrino PA. Proteomic profile of acute kidney disease induced by ischemia and
reperfusion [thesis]. São Paulo: “Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”;
2019.
ABSTRACT
The main bottleneck in studies aiming to identify novel biomarkers in kidney disease has
been the identification of markers that are organ and process specific and characterize the
kidney disease regarding other other pre-existing diseases. The aim of this study was to
identify new candidates, predominantly renal, that could be used as systemic biomarkes
for acute kidney disease (AKI) in a unilateral percutaneous controlled porcine renal
ischemia/reperfusion (I/R) model. The nitroproteome and proteome of urine and serum
samples were analyzed in Q-ExactiveTM on the period pre-ischemia, ischemia (60 min)
and 4, 11 and 16 h post-reperfusion. The renal cortex samples were analyzed only after
24 h of reperfusion. The results were analyzed in the MaxQuant followed by systems
biology analysis. The selection of candidate proteins for renal injury was based on the
predominance of expression of these proteins in the kidney through TiGER and Atlas
Human Protein. In renal cortex proteome, it was identified 1365 proteins which 535 were
present at least 3 animals and more expressed in ischemic kidney, with exception of Xaa-
pro aminopeptidase 2. These proteins participate of transcription, translational, cellular
adhesion, proliferation and repair, important for the recovery of renal injury after 24h.
Intersecting the set of proteins up- or down-regulated in the ischemic tissue with both
serum and urine proteomes, 6 serum proteins from 170 identified proteins (VIM, HPSA8,
HSPD1, COL1A1, LCP1 and TPI1) were identified that may provide a set of targets for
AKI or degenerative process. Additionally, 49 from 501 urinary proteins were identified
in the intersection, being 4 predominantly renal (BHMT2, GBA3, DDC and DPPIV). As
a proof of concept, the activity of DPPIV in the urine increased after 4h of reperfusion
returning to baseline levels after this period and with subsequent translational validation
in a cohort of patients with diabetic nephropathy who presented a moderate correlation
with the parameters related to renal dysfunction: MDRD, proteinuria, glycated
hemoglobin, PTH and renin.
xxvi
Althought there was no diference between nitrated proteins levels in contralateral and
ischemic kidneys, there was difference in the protein profile found. In niroproteome from
cortex were identified 843 proteins, of which 53 were up-regulated in the ischemic kidney
and 2 in the contralateral kidney. Of the 55 proteins, 38% were mitochondrial and related
to the energy pathways. It was possible to validate the nitration of two of these proteins,
DPPIV and BHMT2. In the urine nitroproteome, 126 proteins were identified, 27 of
which were grouped differently for each period of the experiment based on the behavior
of protein expression. The nitrated protein excretion was also observed at baseline,
assuming a physiological role of nitration. In adition, the profile of urine proteins along
I/R was independent of changes in the total protein profile. Finally, two proteins stood
out as candidates for biomarker, UMOD and ALDOB. The serum nitroproteome resulted
in 55 identified proteins, 33 were more representative from animals and they able to
distinguish the periods before and after renal reperfusion. Two predominantly renal
proteins, SEMG2 and DMGDH, were described as candidates to renal injury biomarkers
and the last protein was validated. From these results, proteins changes were observed
along the renal I/R, new nitrated proteins and new candidates for biomarkers of kidney
injury were identified. New studies with a more focused and in-depth approach should be
developed both to confirm the candidates for biomarkers and their potential clinical use
and to analyze the pathophysiological and biochemical behavior of the proteins with and
without nitration in AKI by I/R renal in kidneys morphologically and physiologically
similar to those found in humans.
Descriptors: Proteomics; Acute kidney injury; Ischemia; Nitration; Biomarkers; Mass
spectrometry; Kidney diseases.
1 INTRODUÇÃO
3
1.1 CAPÍTULO 1 - LESÃO RENAL AGUDA
Os rins são os principais responsáveis pela conservação da homeostase do
organismo. Eles atuam na reabsorção tubular de nutrientes, como a água, os íons e a
glicose, e na síntese de vitamina D ativa e hormônios como a eritropoetina e a renina,
garantindo assim, a manutenção do equilíbrio ácido-base, controle da pressão arterial e
eliminação de substâncias tóxicas do organismo. Qualquer alteração no rim gera graves
danos ao organismo, sendo a redução da função renal a característica mais marcante das
doenças renais. Esta redução pode ocorrer de forma progressiva levando a doença renal
crônica ou de forma abrupta, denominada lesão renal aguda (ZATZ, 2011).
1.1.1 Definições
A lesão renal aguda (LRA) é caracterizada por uma redução da função renal
baseada nos níveis de creatinina sérica e/ou diurese em até 7 dias e foi por anos
denominada insuficiência renal aguda. Como um rápido declínio da função renal é
frequentemente secundário a uma lesão estrutural, o termo “lesão” foi considerado mais
apropriado pelo grupo de pesquisadores da Acute Kidney Injury Network (AKIN, 2007)
e tem sido utilizado em substituição ao termo “insuficiência” desde sua publicação
(Mehta et al. 2007).
A LRA é considerada reversível se for tratada precocemente, mas nos casos em
que não há a recuperação total da função renal o quadro do paciente pode evoluir para a
doença renal crônica (DRC) (Coca et al. 2012; Jones et al. 2012). A DRC é caracterizada
pela presença de albuminúria e/ou pela diminuição da taxa de filtração glomerular (TFG)
a níveis inferiores a 60 mL/min por 1,73 m² durante 3 meses ou mais, independentemente
do diagnóstico clínico. Com base nestes parâmetros ela é dividida nos cinco estágios
apresentados na Figura 1 traduzida de Levey e Coresh (Levey and Coresh 2012).
4
Figura 1. Prognóstico da doença renal crônica (DRC) baseado na albuminúria e na taxa de filtração
glomerular (TFG). Traduzido de Levey & Coresh 2012.
Há uma forte interação entre a DRC e a LRA. A pré-existência da DRC aumenta
10 vezes as chances do desenvolvimento de LRA comparado à ausência de DRC (Ishani
et al. 2009). E assim como a DRC se torna um fator de risco para a LRA, a LRA também
se torna um fator de risco para a DRC.
Atualmente, dois grandes estudos de associação em pacientes têm demonstrado
que a LRA não só é um fator de risco para DRC, mas também pode colaborar com a
progressão da mesma e com a morte prematura (Amdur et al. 2009; Coca et al. 2012).
Amdur e colaboradores em um grande estudo retrospectivo de 5404 pacientes com LRA,
mostraram que o agravamento da doença por necrose tubular aguda aumenta o risco de
desenvolvimento de DRC grau 4 e reduz o tempo de sobrevida comparado a pacientes
controles sem LRA (Amdur et al. 2009). Dados semelhantes foram obtidos em uma
metanálise, mostrando que os pacientes com LRA apresentam um risco nove vezes maior
de desenvolver DRC e duas vezes maior de morrerem prematuramente comparados aos
pacientes sem LRA (Coca et al. 2012).
Portanto, há uma forte conexão entre a LRA e DRC tornando qualquer estudo que
vise o diagnóstico e/ou tratamento da LRA um benefício para os pacientes que sofrem
destas duas doenças renais.
1.1.2 Epidemiologia
A LRA atinge principalmente negros, homens, crianças e idosos (Xue et al. 2006)
(Susantitaphong, 2013). Ela afeta um quinto dos adultos e um terço das crianças
hospitalizados, estando associada a uma taxa de mortalidade de aproximadamente 23,9%
5
nos adultos e 13,8% nas crianças (Susantitaphong et al. 2013). Nos hospitais, a LRA é
uma séria complicação que acomete 12% dos pacientes transplantados (Mehrotra et al.
2012), 30% dos pacientes pós-cirurgia cardíaca (Arnaoutakis et al. 2007) e quando
avaliados creatinina sérica e débito urinário juntos, está presente em até 67% dos
pacientes em unidade de terapia intensiva (UTI) (Hoste et al. 2006; Piccinni et al. 2011).
No Brasil aproximadamente 10 milhões de pessoas apresentam complicações renais, das
quais 2 milhões sofrem com doenças renais crônicas. Um dado alarmante é que 60%
desses pacientes nem sabem que possuem esses problemas, agravando ainda mais a
doença, podendo levar a perda do órgão ou mesmo a morte (Sociedade Brasileira de
Nefrologia, 2009).
Uma análise de coorte conduzida em 20 Centros da Austrália, avaliando a
incidência de LRA em 10 anos, mostrou um crescimento anual de 2,8% (Bagshaw et al.
2007). Este aumento na incidência de LRA reflete a melhora da expectativa de vida da
população, que traz consigo o aumento dos fatores de risco como as doenças crônicas e
internações hospitalares, seguidos pelo uso de contrastes iodados para diagnósticos e
tratamentos com medicamentos nefrotóxicos (Nash et al. 2002; Schmitt et al. 2008). Além
disso, com o aumento da sensibilidade e do acesso ao diagnóstico de LRA (Rewa and
Bagshaw 2014), houve também um aumento do diagnóstico formal de LRA.
Além de aumentar a taxa de mortalidade, a LRA leva ao maior tempo de
internação do paciente e/ou tratamento dialítico (Bagshaw et al. 2008), gerando maiores
custos. A LRA sem acompanhamento de doenças graves, aumenta em até 5 dias o período
de internação com um custo extra de 2.600 dólares (Fischer et al. 2005). Este gasto supera
as internações hospitalares mais prevalentes como insuficiência cardíaca (2,2 mil
dólares), pneumonia (2,1 mil dólares) e sangramento gastrointestinal (2,1 mil dólares)
(Chertow et al. 2005).
Atualmente a preocupação com a LRA é tamanha, que a Sociedade Internacional
de Nefrologia (ISN) criou uma declaração chamada “0by25”, que visa eliminar as mortes
evitáveis devido à LRA a nível mundial até 2025. Inicialmente, eles incluíram a LRA nos
estudos da Global Burden of Disease para mostrar o impacto da doença na mortalidade
mundial, bem como os seus fatores de risco. Atualmente diversas informações
prospectivas têm sido coletadas tanto para estudos transversais quanto para de coorte.
Com esses resultados a ISN poderá obter uma melhor compreensão de como a LRA é
6
tratada em cada país e assim atuar de forma eficaz nos contextos que tem mais
deficiências (Mehta et al. 2015).
1.1.3 Diagnóstico
Embora avanços científicos tenham conseguido reduzir a taxa de mortalidade por
LRA, o aumento da incidência em conjunto com os tratamentos pouco eficazes, torna o
valor absoluto de mortes por LRA ainda muito elevado (Rewa and Bagshaw 2014). Este
aumento da mortalidade pode estar associado com o diagnóstico tardio e não especifico
da LRA. Por não apresentar sintomas ou apresentar sintomas comuns a várias doenças, o
diagnóstico é baseado nas alterações dos níveis de creatinina sérica e débito urinário,
impossibilitando uma intervenção precoce.
Ambos os aumentos dos níveis de creatinina sérica e redução do débito urinário
só se tornam evidentes quando mais de 50% da função renal é perdida (Shemesh et al.
1985). Além disso, alterações na creatinina sérica apresentam alguns problemas: não são
exclusivas apenas da LRA, servindo de diagnóstico para diversas doenças renais; podem
superestimar a função renal através da sua secreção tubular, quando há redução da TFG;
e seus níveis são facilmente afetados por diversos fatores não renais tais como: massa
muscular, dieta, gênero, uso de medicamentos e idade.
1.1.4 Classificação da LRA
A classificação de consenso mundial para LRA é recente e ainda vem sendo
alterada. Ela foi feita pela primeira vez em 2004 pelo grupo ADQI (Acute Dialysis Quality
Initiative), tendo como critério o aumento de creatinina sérica em até 7 dias e a redução
do débito urinário. Com base nestes parâmetros a LRA foi dividida em 5 estágios: risco,
lesão, falência, perda e estágio final da doença, conhecida como RIFLE (do inglês: Risk,
Injury, Failure, Loss and End-stage kidney disease) (Bellomo et al. 2004).
Baseados em novos estudos mostrando uma alta correlação de pequenos aumentos
de creatinina sérica com a mortalidade, em 2007, nefrologistas renomados do chamado
Acute Kidney Injury Network (AKIN) reduziram a classificação RIFLE para 3 estágios
com observação da elevação da creatinina sérica comparada ao valor basal ou aumento
mínimo de 0,3mg/dL em 48h (Mehta et al. 2007), devido à dificuldade de se possuir o
7
valor basal de creatinina sérica do paciente. Em 2012, o grupo KDIGO (do inglês kidney
disease improving global outcomes) publicou uma diretriz com orientações para o manejo
clínico dos pacientes com LRA, cuja aplicação tem sido utilizada atualmente na parte
clínica. Nessa diretriz, eles aumentaram o período de observação da creatinina sérica do
paciente de 48h, determinado pelo AKIN, para 7 dias (KDIGO, 2012), o qual pode ser
observado na Figura 1.
Estágio Creatinina sérica Débito urinário
1 Aumento ≥ 0,3mg/dL
(26,4µmol/L) em 48h
ou aumento entre 50 – 99% do
valor basal em 7 dias
<0,5ml/kg/h por mais de 6h
2 Aumento entre 100 -199%
do basal em 7 dias
<0,5ml/kg/h por mais de 12h
3 Aumento maior que 200%
do basal em 7 dias
ou ≥ 4,0 mg/dL (353,6
µmol/L)
ou em terapia de
substituição renal
<0,3ml/kg/h por 24h ou
anúria por 12 horas
A substituição renal inclui a hemodiálise, diálise peritoneal, terapia contínua de substituição renal ou
hemofiltração e o transplante renal.
Figura 1. Sistema de classificação para LRA segundo o KDIGO
A LRA pode ser gerada por diversos fatores, os quais foram divididos em três
categorias para facilitar o tratamento (Thadhani et al. 1996; Kopyt 2009):
- LRA pré-renal – ocorre quando a redução na TFG é apenas por alterações
hemodinâmicas (hipovolemia ou inadequada perfusão) sem lesões estruturais nos
néfrons, podendo ser reversível com o restabelecimento hemodinâmico rápido.
- LRA renal – ocorre quando há lesões estruturais renais. A principal forma de
lesão é a necrose tubular aguda (NTA) estando presente entre 70 a 90% dos pacientes
8
com LRA. Ela é decorrente de hipoperfusão renal, hipóxia e agentes nefrotóxicos, sendo
acompanhada de obstrução tubular e vazamento do filtrado glomerular para o interstício
renal. É um quadro reversível, mas em cerca de 50% dos casos os indivíduos precisam de
tratamento dialítico.
- LRA pós renal – ocorre em apenas 10% dos casos de LRA e é caracterizada pela
obstrução mecânica das vias urinárias, como cálculos ou tumores. Em casos de curtos
períodos de obstrução a lesão renal é considerada reversível.
1.1.5 Isquemia e Reperfusão Renal
A LRA pode ocorrer por desidratação, infecção e toxinas (Zuk and Bonventre
2016). No entanto, a principal causa da LRA é a isquemia renal (Thadhani et al. 1996),
resultado de um declínio generalizado ou localizado do suporte de oxigênio e nutrientes
para os tecidos, além de um déficit na remoção de resíduos do metabolismo (Le Dorze et
al. 2009). A isquemia é capaz de induzir a morte de células tubulares, conhecida por
necrose tubular aguda (NTA); e em casos em que não há reperfusão (restabelecimento do
fluxo sanguíneo) em um curto intervalo de tempo, ela pode levar à DRC (Preston and
Epstein 1997). O córtex é a região que mais recebe aporte do fluxo sanguíneo devido ao
direcionamento do sangue para os glomérulos, mas a porção mais afetada pela isquemia
é a medula externa que já tem um baixo aporte de oxigênio. Em especial as células mais
afetadas desta porção são as do segmento S3 do túbulo proximal, pois são ricas em
mitocôndrias para a síntese de ATP utilizada na reabsorção de proteínas e metabólitos,
além de possuírem uma baixa capacidade glicolítica (Lieberthal and Nigam 1998).
A patofisiologia da isquemia/reperfusão (I/R) é considerada complexa, mas
alguns estudos já relataram a diminuição da geração de ATP mitocondrial, perda da
permeabilidade seletiva das membranas celulares, diminuição da homeostase iônica
celular (aumento de sódio e cálcio), ativação de hidrolases, inflamação por ativação de
neutrófilos e síntese de moléculas de adesão e citocinas, e alteração da resposta vascular
(Devarajan 2006; Malek and Nematbakhsh 2015).
A isquemia ocorre principalmente devido à cirurgias, sepsis, traumas, contrastes
e medicamentos nefrotóxicos (Zuk and Bonventre 2016), além de condições patológicas
como a obstrução dos vasos (trombose e estenose), vasculites, hipovolemia e hipotensão
(Thadhani et al. 1996). Além disso, os insultos podem atingir um ou os dois rins. Por
exemplo, uma estenose da artéria renal pode atingir ambos os rins do paciente ou apenas
9
um deles, como na maioria dos casos de hipertensão renovascular (Jacobson 1988).
Os pacientes com LRA costumam apresentar um declínio da TFG, consequência
não só da isquemia que gera uma resposta vasoconstritora, mas também do mecanismo
de feedback túbulo-glomerular para evitar a perda de nutrientes e consequentemente de
mais energia. Este feedback túbulo-glomerular é caracterizado por uma redução na
reabsorção de cloreto de sódio que é transportado para a mácula densa, levando a
vasoconstrição da arteríola aferente e reduzindo a TFG (Bonventre 2003; Schnermann
2003; Schrier et al. 2004).
Nos vasos renais, a isquemia acaba lesionando as células endoteliais que
apresentam perda do glicocálice, desarranjo do citoesqueleto e diminuição da adesão
celular com desestruturação da matriz perivascular, aumento da permeabilidade
microvascular e vazamento do fluido para dentro do interstício (Basile 2007), que se
agravam após a reperfusão devido ao aumento do estresse oxidativo.
A lesão renal mais comumente encontrada em pacientes com LRA isquêmica é a
NTA (Vaidya et al. 2008). Ela é caracterizada histologicamente pela supressão e perda da
borda em escova dos túbulos proximais, perda do formato dos túbulos, dilatação dos
túbulos proximais e distais, obstrução dos túbulos por morte celular e áreas de
regeneração (Racusen and Solez 1992).
A NTA por I/R inicia-se com um deslocamento das proteínas Na+K+ATPases e
integrinas, que mantém a polaridade da célula e a junção celular, da porção basolateral da
membrana para a porção apical do túbulo proximal. Este descolamento leva ao desarranjo
do citoesqueleto e perda estrutural do túbulo por descamação de células viáveis para o
lúmen que podem obstruir o túbulo ou permitir o extravasamento de filtrado glomerular
para o interstício. Além disso, o deslocamento da Na+K+ATPase leva a perda da
polaridade responsável pela reabsorção de metabólitos do filtrado glomerular (Devarajan
2006) (Figura 2).
10
Figura 2. Necrose tubular aguda por isquemia/reperfusão (I/R). Após a I/R ocorre perda da borda em
escova dos túbulos proximais, perda de polaridade e redistribuição de integrinas e Na+K+ATPase para a
superfície apical com perda do formato tubular. Cálcio e espécies reativas de oxigênio atuam nestas
alterações com subsequente morte celular por necrose e/ou apoptose. Células viáveis e inviáveis descamam
e seguem para o lúmen obstruindo-o e reduzindo a taxa de filtração glomerular. O rim pode se restaurar
completamente espalhando e desdiferenciando células viáveis para substituir as lesionadas. Diversos fatores
de crescimento ajudam na restauração dos epitélios tubulares. Esquema modificado de Thadhani et.al, 1996.
Embora se destaque a NTA como uma lesão prejudicial ao rim, ela pode ser
considerada um mecanismo de proteção à lesão, sacrificando algumas células em
benefício do órgão como um todo, que consegue se recuperar caso a lesão seja
11
diagnosticada precocemente. Isso ocorre porque as células remanescentes são capazes de
se desdiferenciarem e restaurarem os túbulos desestruturados (Thadhani et al. 1996).
Em uma abordagem mais sistêmica e aguda de lesão renal por I/R, será destacado
o mecanismo de estresse oxidativo.
1.1.6 Estresse oxidativo
O estresse oxidativo ocorre quando há um desequilíbrio entre a geração de pró-
oxidantes ou espécies reativas de oxigênio (EROs) e a de antioxidantes.
As EROs são produzidas por fatores ambientais e celulares. Como fontes
ambientais destacam-se a irradiação de alta energia, poluentes do ar, produtos químicos
tóxicos e metabolismo de drogas. Já como fontes celulares, existem as enzimas da
membrana plasmática (lipoxigenase, sintase da prostaglandina, NADPH oxidase), cadeia
de transporte de elétrons mitocondrial (NADH desidrogenase, ubiquinona), peroxissomos
(oxidases e flavoproteínas), retículo endoplasmático e membrana nuclear (citocromo
P450 e citocromo b5) e outras enzimas como óxidoredutases (xantina oxidase,
mieloperoxidase, enzimas P450) ou heme-proteínas solúveis (hemoglobina, mioglobina,
citocromo c). Além dessas enzimas, as sintases do óxido nítrico (NOS) também são
capazes de produzir superóxido em uma reação secundária (Bartesaghi and Radi 2018).
Entre as principais moléculas oxidantes estudadas, estão os radicais livres, que
apresentam um ou mais elétrons desemparelhados que as tornam propensas a buscarem
rapidamente outras moléculas para se estabilizarem. Alguns exemplos são: o superóxido
(O2-), hidroxila (OH-), óxido nítrico (NO) e peroxinitrito (ONOO-).
As moléculas oxidantes podem atuar ajudando o sistema imune contra
antígenos, por exemplo, liberando peróxido de hidrogênio (H2O2) (Behe and Segal 2007)
ou como mensageiras secundárias específicas intracelular, regulando as diversas funções
celulares, especialmente a morte celular (Finkel 1999). Já as moléculas antioxidantes
como a glutationa reduzida (GSH), catalase, superóxido desmutases (SODs),
tiorredoxinas, peroxirredoxinas, entre outras, são responsáveis por ajudar a manter as
EROs em condições adequadas para que estes atuem apenas de forma benéfica
(Bartesaghi and Radi 2018).
Os rins mostram uma alta vulnerabilidade ao estresse oxidativo devido à sua
grande concentração de mitocôndrias. Isso ocorre porque as mitocôndrias são as
12
principais fontes de formação de EROs via cadeia respiratória e NADPH oxidases, além
de serem as primeiras a serem afetas por eles (Sureshbabu et al. 2015).
O processo de I/R renal leva a produção excessiva de EROs e à redução de
moléculas antioxidantes como a GSH, catalase e SOD (Kehrer and Klotz 2015). Esse
estresse oxidativo causa alterações na fosforilação oxidativa mitocondrial, depleção de
ATP e aumento de cálcio intracelular (Malek and Nematbakhsh 2015) gerando
peroxidação lipídica com lise das membranas celulares, quebra de DNA e consequente
morte celular (Li and Jackson 2002).
1.1.6.1 Mitocôndria
A mitocôndria é uma organela muito importante para a vida e morte da célula.
Sua origem é baseada na teoria endossinbionte em que bactérias gram-negativas similares
a Rickettsia prowazekki foram fagocitadas, sem posterior digestão, por células
progenitoras de células eucarióticas a mais de 2 bilhões de anos, vivendo em simbiose
com estas células (Anderson et al. 1981). Os fatos que fortalecem esta teoria é que as
mitocôndrias possuem uma estrutura similar a de bactérias com permeabilidade alta na
membrana externa e seletividade na membrana interna, além de possuírem seu próprio
DNA (mtDNA) de fita dupla em formato circular. O mtDNA não contém íntrons, não é
organizado por cromatinas, tem código genético diferente das células eucarióticas, não
tem um sistema de reparo eficiente e sofrem grande exposição as EROs, podendo sofrer
dez vezes mais mutações do que o DNA nuclear por estes motivos (Richter et al. 1988).
Uma mitocôndria possui de 1 a 10 cópias de DNA e a transmissão não segue os padrões
clássicos Mendelianos (SATOH and KUROIWA 1991; Schon et al. 2012). O mtDNA é
transmitido verticalmente de mãe para filho e codifica 37 genes, incluindo 13 subunidades
estruturais responsáveis pela fosforilação oxidativa, entre elas as citocromo C oxidases
(COI, COII, COIII), ATPase 6 e citocromo B (CYB) (Anderson et al. 1981). As proteínas
sintetizadas pela mitocôndria representam uma pequena fração das proteínas que a
compõem, a maioria das proteínas mitocondriais é sintetizada em sua forma precursora
pelo DNA nuclear no citosol e transportada para dentro da mitocôndria por um complexo
de translocases da membrana mitocondrial externa (TOM) e por um complexo da
membrana mitocondrial interna (TIM) (Opalinska and Meisinger 2015).
A mitocôndria geralmente tem formato cilíndrico alongado, mas pode assumir
13
diversas formas devido à sua plasticidade. Ela é formada por uma membrana externa que
permite a passagem de moléculas menores de 5000 daltons e uma membrana interna com
invaginações para aumentar a superfície de contato chamada cristas, que são altamente
impermeáveis a íons e pequenas moléculas. Entre as duas membranas situa-se o espaço
intramembrânico e dentro da membrana interna, a matriz mitocondrial (Ralto et al. 2016)
como mostrada na Figura 3.
Figura 3. Estrutura da mitocôndria. Wikepédia, ilustrado por Felipe Fontoura baseado na figura de Mariana
Ruiz.
As mitocôndrias são altamente dinâmicas e podem se deslocar dentro do
citoplasma de acordo com a necessidade, além de conseguir se fundir ou mesmo se
fragmentar, processos chamados de fusão e fissão, respectivamente.
Cada célula eucariótica possui entre centenas e milhares de mitocôndrias,
dependendo da demanda energética para realizar suas funções. Por exemplo, no rim, a
maior densidade de mitocôndrias se encontra no túbulo proximal e na porção espessa da
alça de Henle, comparada com outros segmentos do néfron, por necessitarem de energia
para reabsorção de solutos por transporte ativo (Weidemann and Krebs 1969). Por este
motivo, em casos de LRA, essas regiões são as primeiras a sofrer ruptura mitocondrial,
podendo afetar também os túbulos distais (Manny et al. 1980).
A quantificação das mitocôndrias pode ser feita de maneira direta pela análise
em microscopia eletrônica ou indireta através da expressão de proteínas estruturais.
Dentre as proteínas mais analisadas, duas que pertencem a membrana externa
14
mitocondrial se destacam: VDAC1 e TOM20. A proteína 1 do canal seletivo de ânions
dependente de voltagem (VDAC1) é um canal que medeia o fluxo de íons, nucleotídeos
e outros metabólitos, além de controlar a cadeia de elétrons (Heiden et al. 2000; Shoshan-
barmatz et al. 2017), enquanto a Subunidade 20 do receptor de importação mitocondrial
(TOM20) faz o reconhecimento do peptídeo sinal e transporta algumas proteínas para
dentro da mitocôndria (Opalinska and Meisinger 2015).
As mitocôndrias são importantes sítios de vias metabólicas essenciais a célula
incluindo a via da pirimidina, da biossíntese de ferro, ciclo da ureia e beta-oxidação, além
de participarem da termogênese, proliferação e homeostase celular. Porém, elas se
destacam por sua função na geração de ATP e pela ativação da morte celular por apoptose
(Emma et al. 2016).
A geração de ATP mitocondrial ocorre durante a respiração celular via
fosforilação oxidativa em conjunto com a oxidação de metabólitos pelo ciclo do ácido
cítrico (TCA) e catabolismo dos ácidos graxos via beta-oxidação. Em condições aeróbia,
a respiração celular inicia-se a partir do piruvato gerado na glicólise e dos ácidos graxos
que atravessam as membranas mitocondriais chegando a matriz. Ambos são convertidos
em acetil-CoA que serve de substrato para o TCA formar CO2 e moléculas altamente
energéticas transportadoras de elétrons, NADH e FADH2. Os elétrons carregados por
estas duas moléculas são então transferidos para o complexo I e II da cadeia
transportadora de elétrons na membrana interna mitocondrial, respectivamente. O
complexo III é responsável por facilitar a transferência dos elétrons via citocromo c (Cyt
C) para o complexo IV, onde os elétrons são captados pelo oxigênio formando o
superóxido (O2-). Durante todo o processo de transferência de elétrons nos complexos,
prótons de hidrogênio são lançados no espaço intermembrana para manter o gradiente
eletroquímico da mitocôndria, garantido também pela impermeabilidade da membrana
interna. Essa grande quantidade de prótons só consegue entrar novamente na matriz por
uma proteína muito importante chamada ATP sintase. Através dela os prótons entram
abundantemente e geram energia cinética para a formação de ATP, sendo os prótons
captados pelos superóxidos formando água (Figura 4). Esse processo é 10 vezes mais
energético que a glicólise sozinha (Bhargava and Schnellmann 2017). Além do ATP
servir como fonte energética, ele também evita o aumento do volume celular por meio da
bomba ATPase que equilibra a concentração de íons de sódio e água (Weidemann and
Krebs 1969).
15
Figura 4.Produção de ATP na mitocôndria. Os elétrons produzidos no ciclo do ácido cítrico (TCA) são
transportados pelo NADH e FADH2 até os complexos I e II, respectivamente. Estes elétrons passam pelo
complexo III e são captados pelo oxigênio no complexo IV. A medida que os elétrons são transferidos de
um complexo para outro, os prótons (H+) são ativamente bombeados para o espaço intermembranar,
mantendo o potencial de membrana e impulsionando a produção de ATP pela ATP sintase. MEM:
membrana externa mitocondrial, MIM: membrana interna mitocondrial. Figura adaptada de Bhargava et al,
2017.
O estresse oxidativo, bem como outros estímulos celulares como o aumento de
cálcio na matriz e sua alcalinização, tensão cada vez mais negativa na membrana interna
e uma alta proporção de NAD+/NADH, aumentam a permeabilidade mitocondrial
permitindo a passagem de moléculas menores de 1500Da prejudicando o potencial
elétrico da membrana (Zamzami and Kroemer 2001). A liberação de cálcio mitocondrial
também é capaz de ativar a permeabilidade das mitocôndrias vizinhas e liberar várias
proteínas pró-apoptóticas da mitocôndria para o citoplasma, incluindo o Cyt C. Algumas
dessas proteínas, promovem uma abertura ainda maior dos poros que resultam em um
desequilibrio osmótico com aumento do volume celular, podendo resultar em ruptura da
mitocôndria e morte celular (Ralto et al. 2016).
16
O oxigênio é determinante para o processo de síntese de ATP e morte celular. Em
células tubulares renais, por exemplo, quando se reduz a absorção renal, reduz também a
morte celular, sugerindo que ela está relacionada com a demanda de oxigênio (Brezis et
al. 1984). Tanto na falta quanto no excesso de oxigênio a célula é lesionada podendo levá-
la a morte. Na falta de oxigênio, como na isquemia, não há produção de ATP para
manutenção da célula, o que leva também ao acúmulo de ácidos graxos que pode atuar
como detergente e romper a membrana, culminando no processo de apoptose (Feldkamp
et al. 2006). Já com o excesso de oxigênio, como na reperfusão, o primeiro evento é uma
explosão de produção de superóxido pela mitocôndria (Zweier et al. 1987; Loor et al.
2011), causando além de um dano agudo, o início de uma patologia (Eltzschig; Eckle,
2011). Essa explosão causa um dano oxidativo na própria mitocôndria desestabilizando a
cadeia transportadora de elétrons e interrompendo assim, a síntese de ATP (Murphy and
Steenbergen 2008; Funk and Schnellmann 2012). Além da produção via mitocôndria, o
superóxido pode ser produzido por xantinas oxidase (Linas et al. 1990) e NADPH
oxidases (Braunersreuther et al. 2013), porém, parece que a ativação delas ocorre somente
após a explosão de superóxido pela mitocôndria, contribuindo para um dano mais
secundário e subsequente inflamação (Abramov et al. 2007). Este excesso de superóxido
leva ao aumento de outras EROs causando o estresse oxidativo que é capaz de causar
danos ao DNA e proteínas e ainda, aumentar a permeabilidade mitocondrial com
consequente morte celular (Li and Jackson 2002).
Além da síntese de EROs, há também na mitocôndria a produção de espécies
reativas de nitrogênio (ERNs) capazes de atuar de forma semelhante as EROs, sinalizando
e/ou levando a morte celular. A principal molécula envolvida na síntese das ERNs é o
óxido nítrico (NO). Na mitocôndria, o NO é produzido por uma sintase do óxido nítrico
(NOS), que alguns autores tem chamado de NOS mitocondrial. A produção do NO é
conduzida principalmente na membrana interna da mitocôndria na mesma taxa que a
produção de superóxido em condições fisiológicas (Giulivi et al. 1998). Pelo NO também
ser um radical livre como o superóxido, ambos estão ávidos por elétrons e reagem
rapidamente entre si formando o peroxinitrito, reduzindo a biodisponidade do oxigênio
para a produção energética (Giulivi et al. 1998) e reagindo com proteínas, resultando na
nitração proteica. Com a I/R, além do aumento de O2-, também há uma maior produção
de NO com a participação da NOS (Plotnikov et al. 2007), prejudicando ainda mais as
células.
17
Disfunções mitocondriais contribuem para o desenvolvimento e progressão de
várias doenças e podem levar a lesões renais. Por exemplo, as doenças mitocondriais
podem resultar em diversas tubulopatias como a sindrome de Fanconi, nefrite
tubulointersticial e doença renal cística, além de glomerulopatias como a
glomeruloesclerose segmentar focal (Emma et al. 2012). Em um estudo com 42 crianças
portadoras de doença mitocondrial, metade delas apresentou alguma disfunção renal,
sendo que oito manifestaram sintomas clínicos. Isso mostra que o mal funcionamento das
mitocôndrias pode levar a várias lesões renais, e que pessoas com doenças renais de causa
idiopática também podem ter sua origem em doenças mitocondriais, mostrando a intensa
relação entre lesões mitocondriais e renais que deve ser melhor compreendida (Martín-
Hernández et al. 2005)
A disfunção mitocondrial é uma mediadora crítica da LRA, sendo responsável
pela disfunção e morte das células tubulares (Venkatachalam and Weinberg 2012;
Ishimoto and Inagi 2016). Novos estudos têm mostrado que a disfunção mitocondrial
precede a sua manifestação clínica (Emma et al. 2016). Por exemplo, a análise dos rins
dos pacientes sobre parcial nefrectomia, após a oclusão hilar de 60min, apresentou
aparência histológica normal em microscopia de luz e um modesto aumento na
concentração de creatinina sérica; porém, ao visualizar os rins na microscopia eletrônica
encontrou-se várias alterações, incluindo aumento de volume mitocondrial (Parekh et al.
2013). Isso também foi observado em pacientes pós trauma físico e sepsis (Trump et al.
1975; Takasu et al. 2013). Assim, a análise do volume celular mitocondrial dentro das
células tubulares tem sido considerada a forma mais precoce e notável em toxicidade,
isquemia e LRA séptica, tanto em humanos, quanto em modelos animais (Tran et al. 2011;
Parekh et al. 2013; Takasu et al. 2013).
Além disso, alguns estudos mostraram uma redução na quantidade de proteínas
mitocondriais e no potencial de membrana das mitocôndrias após I/R (Funk;
schnellmann, 2012, Plotnikov, 2007). A concentração de ATP durante o início da
reperfusão se reduz, porém, se restabelece após 24h de reperfusão (JASSEM et al. 2002;
JASSEM and HEATON 2004; Plotnikov et al. 2007).
Dentro dos túbulos proximais danificados, a disfunção mitocondrial é persistente
após LRA e pode contribuir para a sua progressão (Funk and Schnellmann 2012), bem
como ser um elo entre a LRA e a DRC (Ishimoto and Inagi 2016). Para evitar este
acúmulo, o controle das mitocôndrias lesionadas é feito pelo processo de mitofagia, que
18
além de remover as mitocôndrias disfuncionais, também recicla seus componentes. A
mitofagia envolve o empacotamento da mitocôndria dentro de uma membrana dupla
chamada autofagossomo que se funde com os lisossomos fazendo a degradação da mesma
(Youle and Narendra 2011). Na I/R este processo acontece de forma mais tardia, não nas
primeiras 24h pós reperfusão (Funk and Schnellmann 2012).
Além de contribuir com as lesões celulares, as mitocôndrias também são
importantes para a regeneração celular em tecidos que sofreram I/R, (SONG; PHILLIS,
1996; IRVING et al., 2000; KORTH U et al., 2003; CHOUCHANI et al., 2014; EMMA
et al., 2016) e no caso da recuperação das células tubulares que sofreram uma lesão não
letal, a mitofagia e a biogênese mitocondrial podem ser essenciais (Ralto et al. 2016).
Devido à todas estas informações, a mitocôndria tem sido um alvo promissor
para o diagnóstico e tratamento da LRA (Emma et al. 2016; Ishimoto and Inagi 2016;
Ralto et al. 2016). Muitos medicamentos direcionados a mitocôndria atuam na
renoproteção, como análogos as quinonas (Mito-CP, SkQ1, SkQR1), mimético da SOD
(MitoQ), inibidor da permeabilidade da membrana mitocondrial (Ciclosporina A),
inibidor da atividade da citocromo c peroxidase (peptídeos Szeto-Schiller – Bendavia ou
elamipretide) e sensibilizador de cálcio com ativação dos canais de potássio via ATP
(Levosimedan, já usado no tratamento da insuficiência cardíaca congestiva
descompensada), sendo bons candidatos para a prevenção da LRA (Emma et al. 2016;
Ishimoto and Inagi 2016; Ralto et al. 2016). Alguns desses medicamentos já estão sendo
avaliados em “clinical trials”, como a MitoQ (NCT02364648), Ciclosporina A
(NCT02397213), Bendavia (NCT02436447), Levosimendan (NCT01720030).
1.1.6.2 Óxido nítrico (NO)
O NO é um gás em temperatura ambiente, com alta capacidade de se difundir para
células e órgãos vizinhos atuando como um mensageiro parácrino, sendo mais solúvel em
solventes apolares que polares. Por este motivo, dentro do organismo, o NO se concentra
mais em membranas e domínios hidrofóbicos de proteínas (Jr. et al. 1995). O NO é
considerado um radical livre por possuir um elétron desemparelhado entre os 11 elétrons
que possui, e por isso apresenta uma curta meia-vida de 6 a 50s em sistemas biológicos,
dependendo do lugar inserido (Gyglewski et al. 1986; Bedioui and Villeneuve 2003).
Fisiologicamente, o NO regula e atua nos sistemas cardiovascular, nervoso e imune.
19
O NO foi descoberto por Moncada e Ignarro em 1987 por sua ação como fator
relaxante derivado do endotélio (Ignarro et al. 1987; Palmer et al. 1987). Devido a isto, o
NO é mais conhecido por sua ação na vasodilatação arterial, em que a molécula de NO
produzida na célula endotelial difunde-se rapidamente para a célula da musculatura lisa
do vaso, ativando a guanilato ciclase solúvel, levando a formação de guanosina
monofosfato cíclico (GMPc) que reduz os níveis intracelulares de Ca2+, levando à
vasodilatação (MONCADA et al. 1988).
No entanto, ele apresenta outras funções importantes no organismo como: evita a
agregação plaquetária, atua como mediador do sistema nervoso central, serve como
agente citotóxico liberado pelas células imunológicas ou ainda reage rapidamente com
outras moléculas com ação antioxidante e formação de outras espécies reativas de
nitrogênio, que inclui o peroxinitrito (ONOO-), nitrosil ânion (NO-), cátion nitrosonium
(NO+), dióxido de nitrogênio (NO2-), trióxido de dinitrogênio, entre outros, que possuem
diversas outras funções (Moncada 1999; Bartesaghi and Radi 2018).
A principal função do NO no rim é regular a circulação sanguínea local, seja
através da vasodilação, inibição plaquetária, síntese de renina (Kurtz and Wagner 1998),
ou pela manutenção da reabsorção de sódio, competindo pelo oxigênio mitocondrial que
é importante para a síntese de ATP necessária para esta função (Laycock et al. 1998). O
NO pode ser sintetizado pela xantina oxidase e principalmente, pelas óxido nítrico
sintases (NOS).
A xantina oxidase é formada pela oxidação reversivel dos resíduos de cisteina
e/ou proteólise limitada da xantina desidrogenase que é amplamente expressa nos tecidos.
A produção de EROs e ERNs pela xantina oxidase se da pela conversão da hipoxantina
em xantina capaz de induz inicialmente o aumento de H2O2 e O2- na célula. Após a síntese
dessas EROs, o H2O2 na presença de ferro (Fe++), torna-se um radical hidroxil (ROH.)
altamente oxidativo e tóxico para a célula e o O2- reage rapidamente com o NO, formando
o ONOO- que danifica a célula com sua capacidade de oxidação, nitrosilação e nitração
de proteínas (Devarajan 2005). O O2- quando não reage com o NO no rim, leva a
natriurese, declíneo da taxa de filtração glomerular e fluxo sanguíneo (Chatterjee et al.
2000; Conesa et al. 2001; Mashiach et al. 2001), podendo o NO ser benéfico para o
sequestro de O2- . Durante a fase isquêmica, a redução de ATP faz com que a hipoxantina
se acumule, e com a reperfusão esta é convertida em xantina gerando o aumento de EROs
e consequente inflamação e necrose/apoptose tubular (Devarajan 2006). Além de
20
produzir as EROs, a xantina oxidase também é capaz de converter nitrito (NO2-) em NO
em condições de hipóxia, mas ainda não estão claros os benefícios e malefícios desta
conversão (Cantu-Medellin and Kelley 2013).
As NOSs são isoenzimas advindas de diferentes genes, que são capazes de
produzir NO a partir da L-arginina. Existem três formas de NOS: a neuronal conhecida
como nNOS ou NOS1; a induzível via citocina conhecida como iNOS ou NOS2; e a
endotelial chamada de eNOS ou NOS3. Os nomes neuronal e endotelial foram atribuídos
a estas enzimas por serem identificadas pela primeira vez nestas células, mas atualmente
sabe-se que elas podem ser encontradas em diversas outras células, inclusive nas renais.
Tanto a NOS1 quanto a NOS3 são ativadas pelo influxo de cálcio e sintetizam
quantidades pequenas, em picomolar, de NO (Batchelor et al. 2010) consideradas
benéficas ao organismo; enquanto a NOS2 é ativada independente de cálcio e capaz de
sintetizar altas concentrações de NO, considerada prejudicial quando não é utilizada
contra antígenos (Malek and Nematbakhsh 2015). Portanto, todas as funções do NO no
organismo dependem da concentração, local e duração da ação dessa molécula
(Goligorsky et al. 2002). Alguns insultos podem levar a alterações na concentração e
atividade dessas enzimas, entre eles a I/R.
Em 1994, pesquisadores demonstraram um aumento da atividade das NOS após
15min de hipóxia em células do túbulo proximal renal. Além disso, observou-se que uma
maior atividade dessas enzimas, com a adição de arginina ou nitroprussiato, estava
relacionada ao aumento da lesão celular por I/R (Yu et al. 1994). Com os experimentos
executados neste estudo, não foi possível detectar qual das NOS estava sendo ativada.
Atualmente, sabe-se que a I/R interfere nas NOS de duas maneiras no organismo, ela
reduz a síntese de NO pelas NOS1 e NOS3 e aumenta a síntese pela NOS2. A síntese de
NO pelas NOS1 e NOS3 apresentam respostas renoprotetoras, pois atuam como
vasodilatadoras, antioxidantes, antinflamatórias, mensageiras secundárias e inibidoras de
proteínas nucleares (Kanner et al. 1991; Granger and Kubes 1996; Phillips et al. 2009).
No entanto, com o desenvolvimento da lesão endotelial que ocorre com a I/R, o NO
sintetizado por estas enzimas é reduzido levando a um prejuízo da vasodilatação,
aumentando a agregação plaquetária e leucocitária, podendo levar a destruição das células
epiteliais por meio da congestão vascular, ou seja, não há reperfusão (Goligorsky et al.
2002). O aumento de doadores de NO ou administração de cofatores para eNOS
apresentam um papel renoprotetor, atenuando a LRA gerada pela I/R (Chander and
21
Chopra 2005).
Já as altas concentrações de NO geradas pela NOS2 pós I/R têm sido associadas
a um efeito citotóxico para as células tubulares renais (Yu et al. 1994; Peresleni et al.
1996), pois este excesso de NO gerado rapidamente pode se juntar a outros radicais livres
como o superóxido, agravando a lesão tubular (Beckman et al. 1990; Paller and Neumann
1991). Entre as diversas reações do NO, será destacada a formação do peroxinitrito para
a nitração proteica.
1.1.6.3 Peroxinitrito
O NO é capaz de reagir rapidamente, próxima da taxa de limite de difusão
(Beckman et al. 1990), com o superóxido (O2-) formando a molécula de peroxinitrito
(ONOO-) (Blough and Zafiriou 1995). Este processo compete com a reação do O2- com
a SOD e a difusão do NO através das células e dos tecidos para exercer sua função
sinalizadora (Bartesaghi and Radi 2018).
O peroxinitrito apresenta uma meia vida menor que 1s em pH fisiológico e por
isso a maioria desse composto fica restrita a região de produção desses compostos como
membranas plasmática e mitocôndrias (Bottari 2015).
A função biológica do peroxinitrito ainda permanece em debate. Enquanto alguns
autores acreditam no benefício dessa reação para eliminação dos superóxidos (Wink et
al. 1993) e formação, em algumas circunstâncias, de doadores lentos de NO pela reação
do peroxinitrito com algumas moléculas como a glutationa e a glicose (Moro et al. 1995);
outros acreditam numa função ainda mais prejudicial que o superóxido ao organismo,
com grande impacto nas células endoteliais pela regulação da expressão gênica
dependente de NFκB (Hecker et al. 1996).
O peroxinitrito é uma molécula altamente oxidante e o estresse nitrosativo tem
sido estudado em muitas doenças, entre ela a isquemia renal aguda, demostrando
contribuir com os mecanismos de danos renais (Yu et al. 1994). Alguns autores sugerem
que o efeito citotóxico do peroxinitrito deve-se a sua ação na peroxidação lipídica da
membrana (Gadelha et al. 1997), inibição da síntese de DNA (Szabo and Ohshima 1997)
e danos mitocondriais (Radi et al. 2002).
Em estudos in vitro, a presença de peroxinitrito foi verificada em túbulos
proximais isolados antes mesmo de 30 minutos de reoxigenação (Paller and Neumann
22
1991), podendo levar a um prejuízo da adesão do epitélio tubular a membrana basal,
contribuindo com a obstrução observada na LRA (Wangsiripaisan et al. 1999).
23
1.2 CAPÍTULO 2 – NITRAÇÃO PROTEICA
1.2.1 Definição e origem
Além do peroxinitrito atuar diretamente na mitocôndria e no DNA levando a
morte celular, ele também pode alterar a função das proteínas através de uma reação
denominada nitração. Esta modificação pós traducional pode ser oriunda de várias ERNs
e de mieloperoxidases na presença de NO2- e H2O2 que ocorre durante a inflamação, mas
no organismo a nitração por peroxinitrito é a mais comum (Beckmann et al. 1994;
Campolo et al. 2014).
A nitração pode ocorrer tanto nos aminoácidos tirosina quanto no triptofano e
fenilalanina. Porém, como apenas 15% dos resíduos de tirosina estão no interior das
proteínas, ele fica mais susceptível a nitração, sendo a forma nitrotirosina a mais comum
de ser encontrada e que tem sido dosada como forma indireta de detecção de estresse
oxidativo (Chiao et al. 1997; Souza et al. 1999). A nitrotirosina é formada por uma reação
de oxidação do anel aromático da tirosina que resulta em um radical tirosil, seguido pela
adição do grupo NO2 observado na Figura 5.
Figura 5.Molécula de tirosina sofrendo ação de agentes nitrantes para a formação da 3-nitrotirosina.
(TSIKAS; DUNCAN, 2014).
Outras formas de modificação pós traducional vinda das reações com o NO são a
nitrosilação, nitrosação e oxidação do tiol, formadas pela reação direta ou indireta do NO
24
com uma molécula que possui enxofre, como observado na Figura 6. (Adams et al. 1997).
Todas estas modificações também alteram as funções das proteínas e podem atuar como
sinalizador celular, porém de maneira diferente da nitração, sendo importante diferenciá-
las.
Figura 6.Modificações proteicas produzidas por reações do óxido nítrico (NO). (ADAMS; FRANCO;
ESTEVEZ, 2015).
Alguns fatores interferem diretamente na reação de nitração proteica como a
localização da tirosina na proteína (ela tem que estar exposta a superfície) e as forças
eletrostáticas ao redor da tirosina (Souza et al. 1999).
A tirosina nitrada é altamente conservada, presente desde levedura e plantas até
mamíferos (Bottari 2015). Foi relatada pela primeira vez in vitro no final dos anos
sessenta (Sokolovsky et al. 1966) e in vivo apenas no início dos anos noventa
(Ischiropoulos et al. 1992). Por esta descoberta ser relativamente recente, associada a falta
de métodos analíticos mais sensíveis e precisos para a dosagem e identificação de
25
tirosinas nitradas, que será falado a seguir, o resultado é um número reduzido de proteínas
nitradas identificadas, bem como carência nos estudos de sua função.
1.2.2 Métodos de dosagem de nitrotirosina
A determinação qualitativa e quantitativa de nitrotirosina de forma confiável é um
grande desafio até hoje (Tsikas 2017). A quantificação da nitrotirosina iniciou-se em 1990
com a técnica de cromatografia a gás (GC) com um analisador de energia térmica
(Ohshima et al. 1990) e hoje, conta com vários outros métodos, tanto para a quantificação
quanto para a identificação de proteínas nitradas.
Para a quantificação de nitrotirosina, sem distinção do tipo de proteína, tem sido
utilizado o método de Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) com anticorpo
antinitrotirosina, cromatografia com detector por fluorescência (HPLC-FL),
cromatografia com detector por ultravioleta (HPLC-UV), cromatografia com detector de
rede de diodos (HPLC-DAD), cromatografia com detector eletroquímico e cromatografia
gasosa ou líquida com espectrometria de massas (GC-MS e LC-MS), sendo este último
considerado padrão ouro devido a sua alta especificidade e sensibilidade. No método
ELISA, o cálculo de proteínas nitradas é baseado na quantificação das tirosinas nitradas
na amostra, independente se elas estão livres ou ligadas a proteína/peptídeo, e de quantas
tirosinas nitradas existem em uma única proteína (Teixeira et al. 2016; Tsikas 2017). Nos
demais métodos pode se ter a distinção da dosagem de nitrotirosina livre ou em
proteína/peptídeo dependendo dos procedimentos realizados. Em uma recente revisão de
literatura foi mostrado que a concentração de nitrotirosina abrange várias ordens de
grandezas, principalmente dentro do soro e da urina humana, variando entre ρM e µM,
dependendo da técnica utilizada. Os autores deste estudo acreditam que esta enorme
variação não é biológica, e sim, uma deficiência analítica, sugerindo a validação dos
valores via GC-MS ou LC-MS (Tsikas and Duncan 2014). Devido a inúmeros métodos
de análise, até o momento não existem valores de referência para a concentração de
nitrotirosina no plasma de humanos saudáveis. Porém, ao fazer uma análise aos pares dos
valores de diversos estudos que usaram a técnica padrão ouro, a concentração de
nitrotirosina nestes indivíduos se mostrou estar na ordem de ρM e ηM (Tsikas 2017).
Já, quando o objetivo é a identificação de todas ou de uma proteína nitrada, a
técnica LC-MS/MS continua sendo o padrão ouro. Porém, devido à baixa abundância da
26
tirosina nitrada nas amostras, o enriquecimento dela se faz extremamente necessário e
vários métodos têm sido desenvolvidos com esta finalidade.
No caso da identificação de todas as proteínas nitradas de uma amostra, ou seja,
o nitroproteoma, alguns artigos têm usado apenas a imunoprecipitação (IP) seguida de
western blot (Cruthirds et al. 2003), porém é essencial o uso do espectrômetro de massas
para confirmação da nitração dessas proteínas. A seguir estão listados alguns
processamentos pré-analítico feitos antes da análise no MS:
1) Gel de eletroforese 2D com western blot seguido da digestão proteica em gel
(Aulak et al. 2001, 2004; Ishii et al. 2013).
2) Focalização isoelétrica de solução seguida por SDS-PAGE 1D e digestão proteica
em gel (Kanski et al. 2005).
3) SDS-PAGE 1D e digestão proteica em gel (Tyther et al. 2007; Yakovlev et al.
2007).
4) Digestão proteica seguida da cromatografia líquida 2D (troca iônica e fase
reversa) (Sacksteder et al. 2006).
5) Imunoprecipitação das proteínas nitradas com anticorpo antinitrotirosina seguida
de SDS-PAGE 1D e digestão proteica em gel (MacMillan-Crow and Thompson
1999).
6) Cromatografia por afinidade com diversos tipos de coluna (com afinidade química
ou imunológica) para captação de proteínas nitradas (Abdelmegeed et al. 2013)
ou peptídeos nitrados (Helman and Givol 1971; Zhan and Desiderio 2006).
7) Digestão proteica, modificação química da nitrotirosina de peptídeos seguida por
captura de alta afinidade(Nikov et al. 2003; Dekker et al. 2012).
8) Imunoprecipitação das proteínas nitradas com anticorpo antinitrotirosina seguido
da digestão proteica em solução (Kanski et al. 2005).
9) Imunoprecipitação das proteínas nitradas com anticorpo antinitrotirosina seguido
da digestão proteica e quimioimunoprecipitação de peptídeos nitrados (Prokai et
al. 2014).
Todos os métodos têm suas premissas, vantagens e desvantagens. De maneira
geral, quanto menor a manipulação da amostra, menos nitrotirosina é perdida e mais
fidedigno é o resultado.
Os métodos que usam a eletroforese têm uma boa separação das proteínas e são
muito utilizados por identificarem bem os sítios de tirosina nitrada. Porém, apresentam
27
uma menor identificação proteica comparada as análises em solução, pois possuem um
limite bem baixo de amostra que pode ser aplicada no gel, a recuperação de proteínas de
membrana, alvo da nitração, é ruim e uma banda pode apresentar mais de uma proteína
(Abello et al. 2009). Além disso, após a eletroforese, normalmente é feita a análise por
western blot, que necessita de um anticorpo altamente específico para tirosina nitrada. O
mesmo anticorpo é desejado para a imunoprecipitação, porém em uma quantidade bem
maior, tornando a técnica demorada e cara (MacMillan-Crow and Thompson 1999). Além
disso, alguns estudos relataram que a quantidade de proteína nitrada imunoprecipitada
não foi suficiente para detecção em western blot e MS, visto que a quantidade de
nitrotirosina nas amostras é baixa e eles ainda submeteram as imunoprecipitações a
eletroforese (Kanski et al. 2005; Gokulrangan et al. 2007). Além da imunoprecipitação
de proteína nitrada, pode-se imunoprecipitar peptideos nitrados. Esta técnica foi utilizada
pela primeira vez por Helman and Givol, que recuperaram apenas 55% dos peptídeos
nitrados usando a coluna de sefarose com anticorpo (Helman and Givol 1971). A partir
deste estudo, novas técnicas mais efetivas para imunoprecipitar os peptídeos nitrados
surgiram, porém nenhuma delas conseguiu a eficiência esperada, em todas elas houveram
perdas dos peptídeos durante as derivações ou limpezas, ou ainda apresentaram muita
variação na massa/carga identificada (Feeney and Schöneich 2013).
O estudo de Gokulrangan e colaboradores comparou três técnicas para
identificação de proteínas nitradas e a técnica IP/1DE seguida de western blot foi a que
mais identificou proteínas nitradas comparada com gel 2D e focalização isoelétrica /1D.
(Gokulrangan et al. 2007). A Focalização isoelétrica de solução só é usada em casos que
não é possível fazer uma imunoprecipitação ou gel 2D. Ela permite a entrada de mais
amostra no gel SDS e é boa para proteínas de membrana, porém ela tem uma resolução
menor em comparação com o 2D, manifestada pela presença de proteínas de interesse em
várias frações coletadas (Kielbasa et al. 2000).
Uma alternativa para o uso de anticorpos é a quimioimunoprecipitação, em que a
nitrotirosina é quimicamente modificada e depois capturada em colunas de afinidade. Isto
pode ocorrer por diversas reações químicas, sendo a transformação da tirosina nitrada em
aminotirosina por ditionito de sódio a principal delas. A conversão de nitrotirosina em
aminotirosina pode ser explorada para discernir prontamente peptídeos de 3-
aminotirosina em um fundo de peptídeos não nitrado (Ghesquiere et al. 2006). A captação
da aminotirosina então pode ser capturada por reagente éster ativo de fase sólida em beads
28
de vidro (SPAER) (Prokai-tatrai et al. 2011). No entanto, na análise por MS, os peptideos
contendo aminotirosina tende a resultar em diferenças de massa de mais de 1 Da entre a
massa medida e calculada (Ghesquiere et al. 2006) resultando em um processamento
analítico mais complexo. A cromatografia 2D é excelente, mas requer uma extensa
análise de dados (Kanski et al. 2005). Por fim, diversos MS podem ser utilizados para
identificação da nitrotirosina, com ressalvas aos que utilizam a fonte de ionização MALDI
com luz laser a 337 nm, pois os peptídeos contendo nitrotirosina são sensíveis à luz desse
comprimento de onda e passam por um processo de decomposição (Petersson et al. 2001).
Assim, os maiores desafios no estudo da nitração da tirosina têm sido padronizar
as técnicas para as analises da nitrotirosina e desenvolver uma metodologia capaz de
garantir o sequenciamento do peptídeo nitrado na análise MS/MS a fim de confirmar com
certeza a nitração da tirosina na proteína/peptídeo estudado. A dificuldade vem
principalmente do fato da quantidade de tirosina nitrada ser muito baixa, com ocorrência
de 1 em 10 000 tirosinas (Uppu and Pryor 1996).
Quanto aos métodos de identificação de proteínas nitradas já conhecidas, os mais
comuns são: ELISA e western blot quando se tem anticorpo desenvolvido para a proteína
nitrada de interesse (Heffron et al. 2009), imunoprecipitação das proteínas nitradas com
anticorpo antinitrotirosina seguido de western blot com um anticorpo específico para a
proteína de interesse nos casos em que não se tem um anticorpo para a proteína nitrada,
e a proteômica direcionada baseada no perfil de fragmentação da proteína nitrada alvo
(Collins et al. 2012).
A dificuldade na dosagem e identificação da nitrotirosina, assim como
ferramentas para análise de função dessas proteínas in vivo, colaboram com o baixo
número de publicações observados, menos de 300 publicações nos anos mais recentes
(Figura 7), ao contrário de outras modificações pós traducionais como a glicosilação que
chegou a mais de 2 mil e a fosforilação mais de 14 mil publicações anuais.
29
Figura 7. Número de publicações de artigos no PubMed relacionados com a palavra-chave “nitrotyrosine”
entre os períodos de 1990 e 2018.
1.2.3 Função
Atualmente há uma enorme discussão sobre a função da nitração no organismo.
Tradicionalmente, a nitração é caracterizada como um processo irreversível, tornando-o
pouco adequada para a dinâmica de transdução de sinal, que precisa ter atividade
ativadora e desativadora. No entanto, um estudo de Deeb e colaborares em 2013
conseguiu isolar, identificar e quantificar uma denitrase da ciclooxigenase (COX1)
nitrada em diversos tecidos de ratos, inclusive no rim, demonstrando que a nitração é um
processo controlado e pode agir como um mecanismo de sinalização celular com alvos
específicos durante o estresse oxidativo (Deeb et al. 2013).
Não há consenso sobre a atuação direta da nitração proteica na sinalização celular,
porém ela pode atuar indiretamente neste contexto. Novos estudos mostraram que a
nitração da tirosina pode atuar de duas maneiras opostas nas cascatas de sinalização da
fosforilação: o radical NO2 pode se ligar ao resíduo da tirosina evitando a fosforilação
pelas tirosinas quinases, ou ainda, mimetizar a ação da fosfotirosina e promover o
processo de sinalização sem uma sinalização prévia (Gow et al. 1996; Mondoro et al.
1997; Li et al. 1998; Newman et al. 2002).
A nitração da tirosina causa grandes alterações na homeostase celular, pois pode
alterar a estrutura, localização e função das proteínas, seja reduzindo ou inativando a
6 6 4 4 14 23 55 71
139
184216
279281277303
348355
37
339344349375363362
29
291
245252254
0
50
100
150
200
250
300
350
400
19
90
19
91
19
92
19
93
19
94
19
95
19
96
19
97
19
98
19
99
20
00
20
01
20
02
20
03
20
04
20
05
20
06
20
07
20
08
20
09
20
10
20
11
20
12
20
13
20
14
20
15
20
16
20
17
20
18
Número de publicações no PubMed com o
termo"nitrotyrosine"
30
função (MnSOD, actina, prostaciclina sintase e tirosina hidroxilase) ou ganhando uma
função, previamente existente ou não (citocromo c, fibrinogênio, proteína quinase,
glutationa S-transferase e ApoA1) (Bartesaghi and Radi 2018). A nitração do citocromo
c, por exemplo, muda a conformação da proteína que leva a um aumento da atividade
peroxidica afetando a cadeia transportadora de elétrons (Abriata et al. 2009; Bartesaghi
and Radi 2018), enquanto a nitração de um único resíduo da heat-shock protein HSP90
pode induzir a morte celular (Franco et al. 2015). Essas alterações na conformação e
função das proteínas indicam que a formação de nitrotirosina não é apenas um
biomarcador de estresse oxidativo presente em diversas doenças, mas também participa
da fisiologia e patogênese do organismo (Nikov et al. 2003).
Estudos com seres humanos têm mostrado que a nitração plasmática tem vias
seletivas (Ryberg and Caidahl 2007; Souza et al. 2008; Abello et al. 2009; Ischiropoulos
2009) e que o rim tem um papel chave no controle dessas tirosinas nitradas no plasma.
Um estudo que avaliou a concentração de proteínas nitradas no plasma de crianças com
encefalopatia induzida por asfixia encontrou um aumento da nitração apenas nas crianças
que sofreram algum dano renal sem complicações no coração ou no fígado além dos
sintomas neurológicos (Wayenberg et al. 2009).
Independente do mecanismo de ação das proteínas nitradas, é fato que elas
participam do agravamento de diversas doenças (Adams et al. 2015), inclusive as renais
(Chirino et al. 2004). Tanto em modelos de toxicidade com cisplatina (Chirino et al. 2004)
ou que sofreram I/R, quanto em pacientes que sofreram rejeição do enxerto renal foi
verificado um aumento de proteínas nitradas nos rins (Chiao et al. 1997; Walker et al.
2000; Cruthirds et al. 2003).
Em modelos animais de isquemia têm-se observado aumento de proteínas nitradas
na superfície de células epiteliais dentro do lúmen celular do rim após 6 e 24h de
reperfusão (Chiao et al. 1997; Walker et al. 2000), bem como um aumento na
concentração de proteínas nitradas totais no soro e excretadas na urina logo após a
isquemia (Malagrino et al. 2014). Esses estudos demonstram a rapidez da nitração
proteica durante o processo de I/R, característica importante na busca de biomarcadores
para doenças renais.
Um resumo do metabolismo do estresse oxidativo nos túbulos renais após
isquemia e reperfusão está ilustrado na Figura 8.
31
Figura 8. Metabolismo das células dos túbulos após LRA isquêmica. Inicialmente, com a isquemia há uma
depleção de ATP capaz de ativar caspases, fosfolipases e aumentar o Ca2+ intracelular que cuminam na
morte celular. Concominantemente há um aumento excessivo da produção de óxido nítrico (NO) pela iNOS
aumentando as espécies reativas de nitrogênio como o peroxinitrito e conquenquentemente gerando uma
lesão oxidativa e a nitrosilação ou nitração de proteínas que é agravada com a reperfusão via conversão da
hipoxantina acumulada durante a isquemia e convertida em xantina. Traduzido de (Devarajan 2006).
Em pacientes com LRA, a nitração da tirosina no soro aumentou com a
gravidade da doença e foi independentemente associada à mortalidade desses pacientes
(Qian et al. 2013). Esse aumento também foi observado nos estágios iniciais da DRC
(Mitrogianni et al. 2004; Matsuyama et al. 2009), que retornaram aos níveis basais após
o transplante renal (Simmons et al. 2005; Galli 2007), mostrando novamente a
importância dos rins para concentração de proteínas nitradas.
Como dito, a dosagem da nitrotirosina tem sido um importante marcador de
estresse oxidativo se alterando em diversas doenças e pode ser controlada pelo bom
funcionamento dos rins. No entanto, ao ser lesionado, o rim além de reduzir a eliminação
da nitrotirosina, ele produz muitas ROS e RNS que acabam por nitrar também as próprias
proteínas. A identificação dessas proteínas e seu lugar dentro das vias moleculares podem
fornecer novos conhecimentos sobre a nitração de proteínas e biomarcadores para
doenças renais. A principal vantagem da avaliação de proteínas com modificações pós-
32
traducionais como biomarcadores é que ela ocorre antes da síntese de novas proteínas,
facilitando o diagnóstico precoce da doença.
33
1.3 CAPÍTULO 3 – BIOMARCADORES DE LESÃO RENAL AGUDA
Biomarcadores são todas as “substâncias que podem ser medidas e indicam a
ocorrência de processos biológicos (normais ou patológicos) ou respostas farmacológicas
a intervenções terapêuticas. Portanto, biomarcadores são importantíssimos para o
diagnóstico e prognóstico de doenças. No âmbito das doenças renais, os biomarcadores
têm sido amplamente estudados, seja para identificação de novos candidatos a
biomarcadores ou para validação dos já existentes.
Teoricamente, um bom biomarcador de LRA deve: ser fácil e simples de ser
medido, de preferência não-invasivo; ter uma capacidade de detecção mais precoce do
que o aumento da creatinina sérica; permitir a distinção de LRA de outras patologias;
identificar o tipo e a localização da causa da LRA; indicar a gravidade da doença; estimar
o início da lesão; prever o desfecho do paciente (recuperação, diálise e mortalidade), estar
intimamente relacionados com o tamanho da lesão e permitir o monitoramento das
respostas farmacológicas à terapia (Goodsaid et al. 2009; Andreucci et al. 2017). Porém,
na prática, é difícil encontrar um único biomarcador capaz de responder a todas estas
perguntas. Por exemplo, para LRA o melhor biomarcador existente e amplamente
utilizado é a creatinina sérica que está correlacionada com a redução da TFG, específica
para doenças renais, mas sofre a ação de fatores externos e se altera tardiamente.
Atualmente tem-se estudado avaliar a TFG também pela medida indireta da cistatina c
urinária em casos em que não há proteinúria (Charlton et al. 2014).
No caso da LRA, um biomarcador precoce da doença também deve ser capaz de
diagnosticar uma lesão tubular, pois ela frequentemente ocorre primeiro do que a queda
da função renal (Mehta et al. 2007). Neste sentido, novas proteínas biomarcadoras de
lesão tubular têm surgido na literatura, sendo as principais delas a: NGAL (Lipocalina
associada à gelatinase de neutrófilos), KIM-1 (Molécula de lesão renal 1), IL-18
(interleucina-18), L-FABP (Proteína de ligação a ácidos graxos no fígado), TIMP-2
(Inibidor tecidual de metaloproteinase 2), NAG (N-acetil-β-D-glucosaminidase), IGFBP-
7 (Proteína de ligação ao fator de crescimento de insulina 7), RBP (Proteína de ligação
ao Retinol) e β2-microglobulina (Lieske et al. 2014; Andreucci et al. 2017).
34
1.3.1 NGAL
A NGAL faz parte das proteínas da família das lipocalinas que atuam como
transportadoras de pequenas moléculas hidrofóbicas, como ésteres e lipídios (Kjeldsens
et al. 1993), e também como antioxidantes, sequestrando o ferro via sideróforos e
impedindo a ligação deste com EROs, prejudicando as células. (Mori et al. 2005).
A NGAL é uma proteína pequena de 25KDa descrita pela primeira vez em
grânulos de neutrófilos, mas presente também em células epiteliais durante a inflamação
e em células tumorais (Nielsen et al. 1996; Fernandez et al. 2005). Os neutrófilos
expressam a forma homodimérica (46KDa) da NGAL, enquanto as células epiteliais de
túbulos proximais expressam as formas monoméricas (25KDa) e heterodiméricas (Cai et
al. 2010). Ela é estimuladora do crescimento epitelial e protetora na isquemia (Mishra et
al. 2005; Yang et al. 2010; Andreucci et al. 2017), e tem se destacado como marcadora
de lesão de túbulo proximal (Schmidt-Ott et al. 2007).
A NGAL, urinária ou sérica, é o biomarcador para diagnóstico e prognóstico da
LRA mais promissor na literatura até o momento. Ela é facilmente detectada no plasma
ou na urina após I/R, aparecendo aumentada de 2 a 6h após o desenvolvimento de uma
LRA em pacientes (Mishra et al. 2005) e com melhor sensibilidade comparada a
creatinina sérica (Haase et al. 2009; Han et al. 2009; Paragas et al. 2012; Murray et al.
2014).
A NGAL é filtrada livremente pelos glomérulos e depois segue por dois caminhos:
a maior parte é reabsorvida no túbulo proximal, onde é degrada pela Megalina, e a menor
parte segue direto para urina (Hvidberg et al. 2005). Quando há uma lesão das células
tubulares renais, a NGAL é liberada no plasma e na urina, as concentrações de NGAL
sobem antes mesmo do aumento de creatinina sérica (Charlton et al. 2014). Acredita-se
que a NGAL do plasma tenha origem na porção espessa da alça de Henle e ductos
coletores renais por refluxo (Haase et al. 2011; Paragas et al. 2011), enquanto a NGAL
urinária seja mais específica que a sérica e derivada dos túbulos distais (Schmidt-Ott et
al. 2007; Haase et al. 2009).
Diversos estudos clínicos avaliando a concentração urinária da NGAL já foram
realizados e mostraram que a NGAL tem sido capaz de predizer LRA em pacientes com
choque séptico (Nickolas et al. 2008; Constantin et al. 2010; Martensson et al. 2010;
Simsek et al. 2013), transplantados de fígado (Li et al. 2012), que sofreram cirurgia
35
cardíaca (Mishra et al. 2005) e que utilizaram drogas nefrotóxicas (Nickolas et al. 2008;
Haase et al. 2009; Paragas et al. 2012). Em pacientes com diagnóstico subclínico de LRA,
somente a concentração de NGAL se elevou comparado a creatinina sérica (Haase et al.
2011). Além disso, ela tem sido considerada um bom biomarcador para o prognóstico da
LRA com desfecho de diálise ou morte (Haase et al. 2009; Constantin et al. 2010).
No entanto, apesar de aparentemente sensível, a NGAL é um marcador pouco
específico, pois esta proteína é expressa por neutrófilos e vários outros epitélios como o
de pulmões, traquéia, estômago e cólon (Cowland and Borregaard 1997), e pode ser
influenciada por doenças sistêmicas, doenças renais pré-existentes, cânceres e ainda,
infecções do trato urinário (Fernandez et al. 2005; Nickolas et al. 2008).
1.3.2 KIM-1
A KIM-1, também conhecida como receptor celular 1 do vírus da hepatite A, é
um receptor de fosfatidilserina responsável pela adesão celular e depuração dos detritos
apoptóticos/necróticos do lúmen tubular, direcionando as células mortas para os
lisossomos, evitando a ativação da resposta imune. (Ichimura 1998). Esta proteína não é
comumente expressa no rim, estando presente em grandes concentrações em células
dediferenciadas de túbulos proximais apenas quando sofreram uma lesão por isquemia ou
toxicidade (Han et al. 2002; Ichimura et al. 2008; Vaidya et al. 2008); se tornando um
biomarcador de LRA (Han et al. 2002; Vaidya et al. 2006). Pacientes com NTA isquêmica
apresentaram biopsias com enorme expressão de KIM-1 e maior excreção urinária desta
proteína comparada a outros tipos de lesões renais (Han et al. 2002). Não há presença da
KIM-1 em urina de indivíduos sadios, somente de pacientes com lesão renal, pois ela
aparece devido à uma clivagem proteolítica do ectodomínio da KIM-1durante o processo
de depuração dos detritos e restauração das células dos túbulos (Bailly et al. 2002).
O aumento de KIM-1 urinária pôde prever LRA em pacientes após 3h de cirurgia
cardíaca (Han et al. 2009; Koyner et al. 2010) e foi altamente correlacionado aos altos
índices de diálise e morte em pacientes em UTI (Liangos et al. 2007). No entanto, o
aumento da KIM-1 não é específico para LRA, pois está relacionada com um amplo
número de doenças renais como glomerulonefrites, nefropatias, rejeição aguda,
hipertensão, entre outras (Timmeren et al. 2007).
36
1.3.3 IL-18
A IL-18, também conhecida como interferon-γ, é uma citocina pró inflamatória
sintetizada por macrófagos, monócitos e células epiteliais do túbulo proximal renal
(Simsek et al. 2013). A IL-18 urinária aumenta muito com LRA causada pela isquemia e
a toxicidade, sendo possível diferenciar a LRA de infecção do trato urinário, DRC, pré-
renal azotemia e síndrome nefrótica (Parikh et al. 2004).
Pacientes com rejeição a transplantes têm apresentado níveis elevados de IL-18
no córtex renal e no soro comparado àqueles sem complicações (Striz et al. 2005).
Uma metanalise com 23 estudos concluiu que a IL-18 foi preditiva da LRA em
pacientes pós cirurgia cardíaca, em UTI e em pacientes de unidades coronarianas (Liu et
al. 2013). Através dos níveis de IL-18 na urina, conseguiram predizer a LRA em pacientes
após 4-6 horas da cirurgia cardíaca (Parikh et al. 2006) e correlacionar seus valores com
o aumento de internação dos pacientes em UTI (Parikh et al. 2011) e desenvolvimento de
LRA e mortalidade de pacientes com Síndrome da Insuficiência Respiratória (Parikh et
al. 2005). Em crianças com LRA não sépticas a IL-18 não só se elevou antes da creatinina
sérica, como também foi capaz de predizer a severidade da LRA e a mortalidade
(Washburn et al. 2008). No entanto, a expressão de IL-18 não é específica das células
renais e outras doenças podem alterar sua concentração, como a síndrome metabólica e a
Doença de Still do adulto (Yamaoka-tojo et al. 2011; Kudela et al. 2019).
1.3.4 L-FABP
A L-FABP está presente em todos os tecidos que possuem metabolismo de ácidos
graxos. Ela é responsável pela transferência de ácidos graxos entre as membranas
intracelular e extracelular na mitocôndria e tem sido correlacionada com o fluxo
sanguíneo capilar, tempo de isquemia, transplante renal e tempo de hospitalização
(Yamamoto et al. 2007b; Simsek et al. 2013). No rim a L-FABP situa-se no túbulo
proximal, e assim, como a KIM-1, a expressão de L-FABP não é detectada na urina de
indivíduos saudáveis, somente de indivíduos que sofreram LRA, sendo considerado um
bom biomarcador da doença (Kamijo et al. 2004; Yamamoto et al. 2007b).
Na prática clínica, a L-FABP tem sido capaz de diagnosticar a LRA antes mesmo
da creatinina sérica em pacientes com nefrotoxicidade induzida por cisplatina (Negishi et
al. 2009), em choque séptico (Nakamura et al. 2009; Tsuchimoto et al. 2014), após uso
37
de contraste (Nakamura et al. 2006; Vijayasimha et al. 2013), após cirurgia cardíaca
(Katagiri et al. 2012) em pacientes de UTI com sepse (Doi et al. 2010) e em transplantados
renais (Yamamoto et al. 2007b). A L-FABP parece ser um biomarcador de lesão renal no
geral, pois também se mostrou alterada em pacientes com DRC (Kamijo et al. 2006).
1.3.5 NAG
A NAG é uma proteína produzida pelos lisossomos das células dos túbulos
proximais renais e atua na catálise da hidrólise do resíduo de glicose terminal em
glicoproteínas. Devido ao seu grande tamanho, aproximadamente 130KDa, a NAG não é
filtrada pelos glomérulos, portanto, aparece em maiores quantidades na urina após danos
tubulares (Waring and Moonie 2011; De Geus et al. 2012). A concentração de NAG
urinária se mostrou maior em pacientes de UTI que desenvolveram LRA comparado aos
que não desenvolveram (Westhuyzen et al. 2003) e se elevaram em pacientes de
intervenção coronariana percutânea terapêutica que desenvolveram LRA quando foram
submetidos ao uso de contraste (REN et al. 2011). Os altos índices urinários da NAG
também foram associados a um prognóstico ruim da LRA (Chew et al. 1993; Liangos et
al. 2007). Sozinha a NAG não tem uma boa sensibilidade, mas a associação dela com
outros biomarcadores pode melhorar muito o diagnóstico. Ela tem sido avaliada também
como biomarcador de lesão tubular em pacientes com nefropatia diabética (Siddiqui et al.
2019).
1.3.6 TIMP-2 e IGFBP-7
A TIMP-2 é uma proteína que atua na modulação da proteólise da matriz
extracelular através da inibição das metaloproteínases e é capaz de suprimir diretamente
a proliferação de células endoteliais (NCBI). Já a IGFBP-7 tem um papel importante na
regulação da biodisponibilidade de fatores de crescimento tipo insulina (IGF),
responsável pelo crescimento, diferenciação e proliferação celular de mamíferos, atuando
como um potencial supressor tumoral para diversos tipos de câncer (Chen et al. 2013).
Ambas as proteínas estão envolvidas com o a parada do ciclo celular em G1
durante as fases iniciais da lesão celular (Seo et al. 2006). Após uma lesão por septicemia
ou isquemia as células tubulares renais possuem um curto período de G1 para detenção
do ciclo celular, pois ela evita que DNAs danificados sejam replicados nas células filhas;
38
em G1 a célula fica esperando o seu reparo ou segue para morte celular (Witzgall et al.
1994; Rodier et al. 2007; Quan-hui et al. 2009).
Durante a LRA, as proteínas TIMP-2 e IGFBP7 na urina podem então, funcionar
como biomarcadores de lesão, antes mesmo que ela ocorra, possibilitando a recuperação
das células sem danos permanentes ao órgão (Kashani et al. 2013).
Além da isquemia, uma grande variedade de processos fisiológicos e patológicos
(inflamação, estresse oxidativo, diminuição da proliferação celular, radiação ultravioleta,
drogas e toxinas) (Johannes, Boonstra and Jan Andries 2004) podem alterar estas
proteínas e auxiliar na compreensão da LRA com diversas outras etiologias.
Um dos estudos mais importante na área de biomarcadores renais foi o estudo de
Kashani e colaboradores, que envolveu 35 UTIs e 1000 pacientes adultos. Neste estudo
os dois biomarcadores TIMP-2 e IGFBP-7 urinários foram comparados com outros 340
biomarcadores existentes, e foram considerados os melhores biomarcadores de LRA.
Devido à IGFBP-7 ter sido superior a TIMP-2 em pacientes cirúrgicos, e a TIMP-2 ter
sido melhor em LRA induzida por sepse, ambas foram usadas juntas no diagnóstico de
LRA e demonstraram uma área sob a curva de 0,80 (Kashani et al. 2013). O uso desses
dois biomarcadores juntos para diagnóstico de LRA também foi confirmado em outros
estudos (Bihorac et al. 2014; Meersch et al. 2014; Yamashita et al. 2014; Gocze et al.
2015; Wetz et al. 2015).
Para dosagem da TIMP-2 e IGFBP-7 urinárias em uma única dosagem, foi criado
o teste conhecido comercialmente como o Teste NephroCheck®. Este kit avalia o risco
do paciente desenvolver LRA moderada ou severa em 12h a partir da coleta da amostra e
foi aprovado pelo FDA em setembro de 2014. No estudo clínico com 420 pacientes de
UTI, a dosagem permitiu uma estratificação dos pacientes, distinguindo aqueles com um
risco menor daqueles em um maior risco de desenvolver AKI. Foi estabelecido um ponto
de corte > 0,3 (ng/mL), e destina-se a ser utilizado em rotina prática clínica como um
sinal para iniciar medidas preventivas e medidas protetoras. (Bihorac et al. 2014).
1.3.7 RBP
A proteína RBP é sintetizada no fígado e responsável pelo transporte de vitamina
A do fígado para outras partes do corpo. Ela passa facilmente pela barreira glomerular e
é reabsorvida e metabolizada pelos túbulos proximais. Graça a esta característica, ela tem
39
sido um bom biomarcador de lesão tubular. No entanto, a dosagem de RBP urinária só é
ideal quando a TFG ainda não está muito reduzida, uma vez que a captação tubular de
proteínas é um processo saturável (Bernard et al. 1987). Desta forma a dosagem de RBP
urinária tem sido usada como biomarcador na avaliação de tratamentos profiláticos para
LRA induzida pelo contraste (Sadat et al. 2011).
1.3.8 β2-microglobulina
A β2-microglobulin faz parte da cadeia leve da classe I das moléculas de
histocompatibilidade que sinaliza a presença de um antígeno para as células T citotóxicas
ativando o sistema imunológico e está presente em todas as células nucleadas. Em
condições fisiológicas, a β2-microglobulina se desprende da cadeia pesada durante a
renovação celular, cai na corrente sanguínea, é filtrada no glomérulo e reabsorvida e
metabolizada no túbulo proximal, somente 0,3% é excretado pela urina. Deste modo ela
está presente tanto no soro quanto na urina de indivíduos saudáveis. Assim, como todas
as proteínas reabsorvidas pelos túbulos, com a lesão tubular, a excreção dessa proteína
aumenta e pode servir de biomarcador de lesão tubular. Porém, esta proteína é pequena
(~12KDa) e facilmente filtrada, entrando em competição com outras proteínas maiores
quando há lesão glomerular, portanto, a excreção da β2-microglobulin só detecta uma
lesão tubular sobre condições de TFG normal ou levemente reduzida, assim como a RBP
(Bernier 1980). Ela tem sido um bom biomarcador de LRA induzida por toxicidade
(Dieterle et al. 2010) e de doença renal policística dominante (Messchendorp et al. 2018).
A principal desvantagem da dosagem da β2-microglobulina é que ela é instável
em urina ácida (Bernard et al. 1987).
Além desses biomarcadores, a literatura cita outros biomarcadores como α-
Glutationa S-Transferase (α-GST), π-Glutationa S-Transferase (π-GST), ɣGlutamil
Transpeptidase, fosfatase alcalina, porém ainda há poucos estudos (Andreucci et al.
2017). Um resumo das atividades destes biomarcadores pode ser observada na Figura
9.
.
40
a Os valores foram omitidos. b O limite superior do normal, definido como a média + 2DP das concentrações urinárias observadas em um grupo de 100 indivíduos
saudáveis. (dados de Bernard, 1987). c Dados de Westhuyzen, 2003. d A fosfatase alcalina pode existir numa forma ativa dimérica ou tetramérica com um peso molecular que varia entre 100 e 200 kDa. e A KIM-1 tem um peso molecular estimado de 104 kDa, embora o ectodomínio de 90 kDa seja eliminado no plasma e na urina. f Kashani et al., 2013 identificaram IGFBP7 e TIMP-2 como os melhores biomarcadores de AKI e descobriram que eles tinham valor
preditivo aditivo juntos; eles observaram que o risco de LRA aumentava
nitidamente acima de um valor de 0,3 (ng/mL)2/1000 para os valores multiplicados das concentrações desses 2 biomarcadores. g a seta indica um aumento. h +++ = altamente recomendado, ++ - = recomendado com algumas resalvas.
Figura 9. Resumo da atividade dos principais biomarcadores de LRA. Traduzido de Andreucci et al. 2007.
Apesar desses vários biomarcadores renais apresentarem uma boa sensibilidade,
eles não são específicos para o diagnóstico de LRA, podendo se alterar em diversas outras
condições clínicas (Simsek et al. 2013; Mårtensson and Bellomo 2014). Esta falta de
especificidade apresentada por estes biomarcadores deve-se ao fato dos estudos de
descoberta serem feitos diretamente com pacientes de LRA causado por inúmeros fatores,
como sepses, contraste radiográfico, nefrotoxinas (Simsek et al. 2013) e outras
comorbidades comum a esta doença (Bell et al. 2015). Uma boa alternativa para a
descoberta de biomarcadores mais específicos para a doença renal são os estudos em
modelo animal. Até o momento, estes estudos têm sido desenvolvidos com roedores (Liu
et al. 2012; Wei et al. 2014), os quais apresentam alta taxa metabólica (Kleiber 1947) e
uma morfologia renal muito diferente de humanos. Talvez, novos estudos feitos com
animais mais semelhante, como porcos (Simmons et al. 2008), possam auxiliar na
identificação de biomarcadores mais específicos para LRA.
41
Uma outra opção para melhorar a sensibilidade dos biomarcadores para o
diagnóstico de LRA tem sido a junção de mais de um biomarcador, como feito com a
TIMP-2 e IGFBP-7 (Kashani et al. 2013), e observado também em outros estudos (Han
et al. 2009). Devido a isto, e ao fato de um biomarcador não conseguir preencher todos
os requisitos para um bom biomarcador, atualmente tem-se sugerido o desenvolvimento
de uma painel de biomarcadores para o diagnóstico da LRA (Simsek et al. 2013), assim
como já vem sendo construído um painel para doenças renais através de ferramentas
proteômicas (Cantley et al. 2016).
1.3.9 Métodos de descoberta de biomarcadores
Diversas técnicas têm sido empregadas na busca de novos candidatos a
biomarcadores de LRA, como a transcriptômica, a metabolômica e a proteômica. Todas
elas podem fornecer informações sobre a condição de órgãos após uma lesão em
particular e, assim, identificar novos candidatos a biomarcador daquele tipo de lesão.
A transcriptômica, técnica que analisa a expressão de RNA mensageiros que serão
convertidos em proteínas, é uma das técnicas mais utilizadas para a descoberta de
biomarcadores junto com a proteômica e foi a técnica responsável por identificar os
candidatos a biomarcadores NGAL e KIM-1 apresentados anteriormente (Supavekin et
al. 2003; Amin et al. 2004). Estas duas moléculas foram descobertas com a análise
comparativa da expressão gênica de rins de animais com e sem LRA. No entanto, para
que estas moléculas pudessem se tornar candidatas a biomarcador de LRA com potencial
uso na clínica, uma análise proteica foi necessária para avaliar a presença dessas proteínas
em soro ou urina de animais e humanos (Amin et al. 2004; Mishra et al. 2005), pois se
tratando de diagnóstico, métodos não invasivos se tornam ideais (Smith et al. 2009).
Outra técnica utilizada para a busca de biomarcadores para LRA tem sido a
metabolômica, uma técnica recente nesta área. A vantagem de metabólitos como
biomarcadores é que eles são muito sensíveis e podem ser dosados em fluidos como soro
e urina, porém, falta estabilidade e especificidade. As alterações metabólicas podem não
persistir por muito tempo, se alterando muito rapidamente com mudanças genéticas e
ambientais. Além disso, os metabólitos circulam pelo organismo e participam de diversas
vias metabólicas em vários tipos celulares, não fornecendo o lugar específico da lesão.
42
Atualmente tem sido proposto o uso de painéis de metabólitos para aumentar esta
especificidade (Pena et al. 2015).
Por fim, a descoberta de biomarcadores pela técnica de proteômica também tem
sido muito utilizada (Cantley et al. 2016) e parece ser a forma mais adequada para a busca
de biomarcadores específicos de lesão renal. Alguns dos motivos que reforçam esta ideia
são que a proteômica pode ser feita em fluidos biológicos como soro, urina e saliva e as
proteínas circulantes podem sinalizar a origem da lesão se essas proteínas forem
específicas de determinados orgãos, por exemplo, a troponina I que sinaliza alterações
cardiacas por ser expressa exclusivamente no coração. Além disso, as alterações de
expressão proteica são mais estáveis que as de metabólitos, podendo permanecer assim,
por um tempo maior. Além de servir como biomarcador, as proteínas encontradas também
podem vir a serem alvos para futuro tratamento da doença.
1.3.10 Análise de Proteínas
As proteínas são moléculas capazes de realizar diversas funções celulares,
atuando na expressão de genes, catalisando reações metabólicas e compondo parte da
estrutura da célula. Alterações genéticas ou pós traducionais podem modificar a estrutura
da proteína afetando sua função, podendo levar a doenças ou mesmo se tornar marcadoras
destas.
Diversas técnicas tem sido aplicadas para a análise de proteínas, as mais
conhecidas são as que utilizam os anticorpos para análise de expressão proteica. A técnica
ELISA e a de Western Bloting são usadas para amostras de extratos protéicos ou fluidos
corporais e as técnicas de Imunohistoquímica e Imunofluorescência usadas para amostra
de tecidos ou células em lâminas, em que o foco é também a localização da proteína.
Todas estas técnicas consistem em ligar um anticorpo marcado na proteína que se deseja
identificar com posterior detecção da marcação do anticorpo. As vantagens dessas
técnicas são que elas são sensíveis devido a capacidade de amplificação do sinal do
anticorpo e também, podem ser analisadas direto em tecido ou células através de cortes
histológicos, fornecendo assim, a localização da proteína. A desvantagem é que precisam
de um anticorpo específico que evite inclusive a reação cruzada (Juncker et al. 2014) e
não são capazes de analisar um conjunto bem amplo de proteínas que estão sendo
expressas em determinadas amostras de uma só vez. O conjundo de “todas” as proteínas
43
que estão sendo expressas em células, orgãos ou tecido de um indivíduo chama-se
proteoma. Para caracterizar estes proteomas surgiram as técnicas de proteômica que se
baseam em procedimentos de indentificação destas proteínas por meio de técnicas de
separação de proteínas como eletroforese e cromatografia, seguido da análise em
espectrometro de massas e analise por bioinformática (HEIN et al., 2013).
Para as amostras complexas, os métodos de separação de proteínas são essenciais,
sendo a eletroforese bidimensional (2D) e a cromatografia líquida as mais utilizadas. A
eletroforese consiste em injetar uma amostras em um gel de poliacrilamida submetido a
um campo elétrico que separa as proteínas por ponto isoelétrico e volume molecular. Ao
final, cada ponto de proteína (spot) é submetido ao espectromentro de massas para
identificação e/ou caracterização das proteínas.
As análises feitas no Espectrômetro de Massas (MS) podem ou não ter uma
cromatografia líquida acoplada para a separação das proteínas ou peptídeos e são capazes
de identificar milhares de proteínas de uma só vez. A espectrometria de massas é baseada
na formação de íons na fase gasosa (com cargas positivas ou negativas) que podem ser
detectados de acordo com a sua razão massa/carga (m/z) (EL-ANEED; COHEN;
BANOUB, 2009).
As proteínas podem ser identificadas tanto em sua forma intacta conhecida como
Top-down quanto através de seus peptídeos chamada de Bottom-up. Na técnica Top-
down, proteínas com pequenos pesos moleculares (até 80KDa) podem ser identificadas
em suas diferentes proteoformas (ocorre devido a variantes genéticas, splicing alternativo
ou modificações pós traducionais) com a ajuda técnicas de separação e um MS de
altíssima resolução (Li et al. 2014b; Toby et al. 2016). Já para a análise BottomUp são
necessárias enzimas capazes de clivar as proteínas em peptídeos, como a enzima tripsina,
permitindo a análise de proteínas maiores, porém com mais dificuldades para se encontrar
modificações pós traducionais. A análise das proteínas no MS é feita através de três
processos: ionização, análise e detecção. Todo MS trabalha com estes processos, porém
cada processo pode ser feito de maneira diferente.
Existem vários tipos de fontes de íons, mas para a análise proteomica as mais
comuns são a eletrospray (ESI) e a dessorção/ionização a laser auxilidada por matriz
(MALDI) que geram uma ionização branda. Como analisador existe o quadrupolo, o
tempo de vôo (TOF), armadilha de íons linear (LIT), ressonância ciclotrônica de íons com
transformata de Fourier (FTICR) e Orbitrap. Por último segue o detector que pode ser o
44
do próprio orbitrap ou uma multiplicadora de elétrons. Todos esses ionizadores,
analisadores e detectores podem ser combinados de acordo com o objetivo da análise e o
tipo de amostra, podendo ser usados mais de um analisador juntos para aumentar a
confiabilidade da identificação, a denominada Espectrometria de Massas Sequêncial
(MS/MS).
Dois tipos de abordagem são aplicados em proteômica, uma abordagem com
proteínas alvos chamada de “targeted” ou direcionada e outra sem proteínas alvo,
conhecida como “shotgun”, “discovery” ou de descoberta. Na abordagem direcionada o
interesse está na identificação e/ou quantificação de proteínas alvos já conhecidos.
Para identificação dessas proteínas alvos, pode ser utilizado, o monitoramento de
uma reação selecionada (SRM) ou monitoramento de uma reação múltipla (MRM). Após
a digestão protéica, os peptídeos vão para o MS/MS, onde os peptídeos são ionizados e
separados de acordo com a massa/carga de cada peptídeo, eles então seguem para uma
câmara de colisão e são fragmentados em íons filhos, separados e analisados. São esses
íons pais e filhos que são monitorados e garantem a confiabilidade no resultado. No
SRM/MRM é possível monitorar centenas de íons filhos e consequentemente vários
peptídeos de uma vez, sendo uma técnica mais barata que a análise por ELISA
(Crutchfield et al. 2016). Já a quantificação absoluta é feita com a ajuda de um padrão.
Já a técnica de descoberta, é uma técnica que identifica “todas” as proteínas
presentes na amostra e a quantificação pode ser feita de forma relativa, comparando os
resultados entre os grupos analisados ou com uma proteína padrão. A detecção dos íons
via descoberta é baseada na abundância da proteína na amostra, na sua ionização e
peptideos de tamanho compativeis com o MS, assim, as proteínas detectadas são
principalmente as mais abundantes e bem ionizadas (Zhang et al. 2013).
Existem duas formas de análise de descoberta, a com marcação e a livre de
marcação, cada uma apresentando suas vantagens e desvantagens, devendo ser escolhidas
de acordo com o objetivo almejado. A análise com marcação foi criada para minimizar a
interferência da composição da amostra, dos processos de preparo e da corrida na
identificação e quantificação das proteínas. As marcações isotópicas mais conhecidas são:
SILAC, 2H, 13C, 15N, and 18O (Schnolzer et al. 1996; Oda et al. 1999; Zhu et al. 2002);
enquanto as isobáricas são: isobaric tags for relative and absolute quantification
(ITRAQ) e Tandem mass tags (TMT). A marcação permite com que até dez amostras
sejam analisadas todas juntas, em uma única corrida de forma mais confiável (Choe et al.
45
2007; Mcalister et al. 2012). No entanto, devido estas técnicas de marcação possuírem
um alto custo e serem limitadas a um pequeno número de grupos analisados devido sua
rotulagem, como no caso do SILAC que analisa no maximo 3 grupos juntos (não
marcado, marcados com 13C6, e 13C6 15N4), a maioria dos trabalhos tem sido
desenvolvidos com a técnica livre de marcação (label free). A vantagem da técnica livre
de marcação, além do preço e menor manipulação da amostra, é permitir uma maior
cobertura de sequência peptídica e maior taxa dinâmica que as técnicas por marcação,
permitindo a detecção de grandes alterações das proteínas entre os experimentos
(Bantscheff et al. 2007).
2 OBJETIVOS
49
2.1 Objetivo geral
O presente estudo tem como objetivo caracterizar o perfil proteômico e
nitroproteomico da lesão renal aguda causada por isquemia/reperfusão (I/R) renal a fim
de compreender melhor a patofisiologia e identificar novos candidatos a biomarcadores
sistêmicos e predominantemente renais da doença.
2.1.1 Objetivos específicos
Proteoma total
I. Identificar e comparar as proteínas identificadas no córtex renal do rim
contralateral e isquêmico após I/R renal.
II. Identificar no soro as proteínas que apresentaram aumento ou redução de
expressão após a I/R renal e quais delas eram predominantemente renais.
III. Identificar na urina as proteínas que foram excretadas após a I/R renal e quais
delas eram predominantemente renais.
VI. Caracterização fisiopatológica da lesão renal aguda induzida pela I/R renal
através de biologia de sistemas a partir dos resultados proteômicos.
V. Validações dos resultados apresentados pelas proteínas candidatas a
biomarcadores da LRA por I/R renal através de metodologia distinta e também por
avaliação dos soros de pacientes com nefropatia diabética.
Nitroproteoma
VI. Identificar e comparar as proteínas identificadas no córtex renal do rim
contralateral e isquêmico após I/R renal.
VII. Identificar painéis de proteínas no soro que caracterizam diferentes períodos
da I/R renal e proteínas predominantemente renais.
VIII. Identificar painéis de proteínas na urina que caracterizam diferentes períodos
da I/R renal e proteínas predominantemente renais.
IX. Caracterização fisiopatológica da lesão renal aguda induzida pela I/R renal
através de biologia de sistemas a partir dos resultados nitroproteômicos.
X. Validação da nitração de algumas proteínas candidatas a biomarcadores da
LRA por I/R renal através de metodologia distinta.
3 MATERIAIS E
MÉTODOS
53
3.1 Reagentes Químicos
Ureia (Sigma, número do catálogo U5128); Coquetel inibidor de protease (Sigma,
número do catálogo P8340); Coquetel inibidor de fosfatase 1 (Sigma, número do catálogo
P5726); Coquetel inibidor de fosfatase 3 (Sigma, número do catálogo P0044); BCA Kit
de detecção de proteína (Pearce, número do catálogo 23227); Microcon® YM-30
(Millipore, número do catálogo 42410); Iodoacetamida (Sigma, número do catálogo
I6125); Bicarbonato de Amônio (Sigma, número do catálogo A6141); Tripsina (Promega,
número do catálogo V511A); Cloreto de sódio - NaCl (Sigma, número do catálogo
793566); Ácido Trifluoroacético - TFA (Sigma, número do catálogo 40967); Acetonitrila
– ACN (Sigma, número do catálogo 34967); Proteína A HP SpinTrap (Ref 28-9031-32,
GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden); Filtros Amicon® Ultra-4 Centrifugal
Filter Units (Merck Millipore, número do catálogo UFC800308); Coluna de alta
performance HiTrap Blue (Ref 17- 412-01, GE Healthcare Life Sciences, Uppsala,
Sweden); Kit de detecção de proteína Bradford (Bio-Rad Protein Assay, Hercules, CA,
USA, número do catálogo 5000006); detergente RapiGest SF (Waters número do
catálogo 186001861); Ditiotreitol - DTT (Thermo Fisher scientific número do catálogo
15508-013); Vials de vidro (Waters total recovery vial número do catálogo 186000385c);
H-Gly-Pro-pNA tosilate (Bachem número do catálogo L-1295.0250); Inibidor de DPP IV
P32/98 (Abcam número do catálogo ab141724); Dimethyl pimelimidate dihydrochloride
- DMP (Sigma número do catálogo D8388); Trietanolamina (Sigma número do catálogo
T58300); Etanolamina (Sigma número do catálogo E9508). Ácido acético (Sigma número
do catálogo 320099), Nonidet NP-40 (Sigma número do catálogo SAJ-21-3277);
Deoxicolato de sódio (Sigma número do catálogo 238392); Dodecil sulfato de sódio
(Merck, número do catálogo 8220501000); Tris Base (Merck, número do catálogo
648310); Ácido clorídrico fumegante 37% (Merck, número do catálogo 100317); Esferas
ligadas a proteína A (Invitrogen # Dynalbeads 100-02D); Tween®20 (Sigma, número do
catálogo P2287); Glicina (Sigma, número do catálogo G8898); Azida sódica (Sigma,
número do catálogo S2002); Cloreto de sódio - NaCl (Sigma, número do catálogo
793566); Ácido fórmico (Sigma, número do catálogo 33015); Leite desnatado (Molico,
Nestle);
54
3.2 Modelo suíno de I/R renal
Durante o meu mestrado, desenvolvemos um modelo suíno de isquemia unilateral
renal seguido de reperfusão para futura identificação de biomarcadores para LRA
(Malagrino et al. 2014). Este modelo foi desenvolvido de acordo com os princípios éticos
em pesquisa animal do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e aprovado pelo
Comitê de Ética Institucional (CAPPesq protocolo 179/11). Resumidamente, cinco
fêmeas (Sus scrofa domesticus 15-20 kg) foram submetidas a isquemia/reperfusão I/R
renal unilateral por via percutânea. Após os animais serem anestesiados iniciou-se o
procedimento cirúrgico. Inicialmente, foi suturado um cateter Foley na bexiga urinária de
cada animal para a coleta de amostras de urina. Em seguida, uma bainha vascular 6
French (F) foi introduzida por dissecção da veia femoral comum direita, seguida pela
canulação da veia cava inferior com um cateter reto, acima das veias renais, para a coleta
sanguínea. Com o apoio de um cateter-guia 6F e uma corda-guia com 0,035”, outra bainha
vascular foi introduzida por dissecção da artéria femoral comum direita até a artéria renal
direita. Para a confirmação da posição do cateter, foi feita uma angiografia basal com uma
injeção de 5mL de contraste iodado (diatrizoato de meglumina e diatrizoato de sódio,
Pielograf 76%, Bracco, Madri, Espanha). Confirmada a posição, um cateter-balão 6F
(5x20mm, Cordis M3 PTA dilatation catheter, NJ, USA) foi levado até o mesmo local e
inflado até a completa oclusão da artéria renal direita por 120 minutos. Após estas duas
horas de isquemia, o cateter-balão foi lentamente desinflado e o rim foi reperfundido por
24h. Após este período, os rins foram retirados e os animais sacrificados.
Este modelo suíno de I/R renal foi caracterizado histologicamente e
bioquimicamente como um modelo de lesão renal aguda, respectivamente pela presença
de necrose tubular aguda e um ligeiro aumento na concentração de creatinina e NGAL
séricas.
Para a análise proteômica total foram utilizados os cinco animais, porém para a
avaliação do nitroproteoma foram utilizados apenas quatro deles. Um dos animais foi
excluído para uma melhor homogeneidade do grupo, pois este animal apresentou um
perfil de proteínas nitradas muito diferente dos outros animais, analisados por uma análise
de componente principal. Provavelmente isso tenha acontecido devido ao animal 1 ter
apresentado uma necrose tubular aguda menor que 50% (figura 10). Já é bem
estabelecida a relação entre lesão e estresse oxidativo.
55
Figura 10. Análise de Componente Principal para o perfil nitroproteômico dos córtices isquêmico e
contralateral. E gráfico de porcentagem de necrose tubular aguda do modelo de I/R renal publicado por
Malagrino et al., 2014.
Além da necrose tubular aguda, foi observado um aumento tanto da excreção de
glicose e proteína pela urina, quanto das frações de excreção de sódio, potássio e cloreto
em todos os animais. Por fim, nosso modelo apresentou um aumento das proteínas
nitradas no soro e na urina avaliadas por método ELISA, motivando o estudo do
nitroproteoma.
3.3 Coletas das amostras
Os rins coletados após 24 horas de reperfusão renal foram separados em córtex e
medula do rim isquêmico e do rim contralateral e congeladas no freezer -80ºC. Para este
trabalho utilizamos apenas as amostras de córtex renal por este apresentar maior lesão
com a I/R quando comparado com a medula.
56
As amostras de soro e urina foram coletadas em diversos períodos durante o
experimento. No entanto, para este estudo selecionamos os pontos mais representativos
baseados nas análises prévias de creatinina sérica (Malagrino et al. 2014). Desta forma,
amostras de soro e urina foram analisados em cinco períodos: pré-isquemia
(imediatamente antes da oclusão da artéria renal), isquemia (60 minutos após a oclusão
da artéria renal), 4 ou 6 horas pós reperfusão, 11 horas pós reperfusão e 16 horas pós
reperfusão.
Cabe salientar, que no nosso modelo, as amostras de urina (coletadas diretamente
da bexiga) e as de soro (coletadas da veia cava inferior acima das veias renais) vieram de
ambos os rins: isquêmico e contralateral. O rim contralateral foi utilizado na comparação
com o rim isquêmico apenas para detectar diferenças entre eles, ele não pode ser utilizado
como um rim controle de um animal sham, pois ele recebeu a carga de filtração do rim
isquêmico. Esta forma de análise foi escolhida em contraponto a coleta seletiva a partir
do rim isquêmico, a fim de detectar as alterações bioquímicas sutís e sistêmicas geradas
pela I/R renal que poderiam vir a fornecer biomarcadores iniciais para LRA.
3.4 PROTEOMA TOTAL
3.4.1 Extração de proteínas do córtex renal
As proteínas do córtex renal foram extraídas com pequenas modificações do
protocolo publicado por Wiśniewski e colaboradores (2009) (Wiśniewski and Zougman
2009). As proteínas foram extraídas a partir de 50mg do córtex renal isquêmico ou
contralateral com 400µL de tampão SDS de lise (4% (massa/volume) de SDS; 100mM
de Tris/HCl pH 7,6; 0,1M DTT; 7M de ureia e inibidores de proteases (PMSF 0,1% e
coquetel inibidor de proteases - 1:300) e fosfatases (Coquetel inibidor de fosfatase 1 e 2
- 1:300). Os córtex renais submersos no tampão foram lisados no aparelho Precellys®
(5000 rpm, dois ciclos de 20s, e 5s de intervalo entre os ciclos) e por duas vezes aquecidos
(95°C por 4min) e sonicados. Em seguida, os lisados foram centrifugados a 16000 x g por
5min a 4ºC e os sobrenadantes com as proteínas foram coletados. A concentração das
proteínas totais foi mensurada pelo kit de detecção proteico BCA.
57
3.4.2 Digestão das proteínas do córtex renal
Inicialmente, os filtros de 30kDa foram lavados duas vezes com 200μl de tampão
de ureia (8M ureia em 0,1M Tris/HCl pH 8,5). Após as lavagens, foram adicionadas
500µg de proteínas dos córtices renais aos filtros, seguidos da centrifugação a 14000 x g
por 15min. Antes da digestão, as cisteínas foram alquiladas com 100µL de 0,05M de
iodoacetamida (IAA) em tampão de ureia por 20 min a temperatura ambiente no escuro,
sendo o excesso de IAA removido por centrifugação a 14000 x g por 10min. Para retirada
do excesso de ureia, as amostras foram lavadas duas vezes com 100µL de tampão de ureia
e 100 µL de 0,05M de bicarbonato de amônio. Após a centrifugação, as proteínas foram
digeridas com tripsina (razão enzima por proteína 1:100) por 16 horas e os filtros foram
passados para um novo tubo seguido da centrifugação a 14000 x g por 10min. Em seguida,
50μl de 0,5M NaCl foram adicionados ao filtro com posterior centrifugação a 14000 x g
por 10min. Para finalizar, foram adicionados 0,1% de ácido trifluoroacetico (TFA) e 3%
de acetonitrila (ACN) para acidificar os peptídeos.
3.4.3 Preparação das amostras de soro
As proteínas abundantes do soro como as imunoglobulinas e albuminas foram
removidas através das colunas cromatográficas de alta performance HiTrap Blue e Protein
A HP SpinTrap seguindo o protocolo do fabricante. Após a remoção, 200 µL do soro
passado pela coluna Hitrap Blue e 100 µL do soro passados pela coluna Protein A HP
SpinTrap foram misturados e colocados no Speedvac para redução do volume. As
concentrações das proteínas foram obtidas pelo kit BCA.
3.4.4 Preparação das amostras de urina
As urinas coletadas foram primeiramente centrifugadas a 2950 × g por 10min a
4˚C para remoção de algumas células presentes, seguida da divisão em alíquotas e
armazenamento a -20°C.
Devido ao excesso de sal presente na urina e a baixa concentração proteica, foi
necessária a dessalinização e concentração das amostras. Para isto, após o
descongelamento, 4mL de urina foram introduzidos em filtros com valor de corte de 3
kDa e lavados 3 vezes com bicarbonato de amônio 50mM pH 8 (1:1), seguido da
58
centrifugação a 3005 x g por 30 minutos a 4ºC. O volume final de urina concentrada foi
de aproximadamente 500µL. Após a quantificação por Bradford, 50µg de proteínas de
cada amostra foram liofilizadas no SpeedVac.
3.4.5 Digestão das proteínas do soro e da urina
As amostras de soro e urina foram digeridas de acordo com Intasqui e
colaboradores (Intasqui et al. 2016), com pequenas modificações. Primeiramente as
amostras foram preparadas a partir da diluição de 50µg de proteínas totais de soro ou
urina em bicarbonato de amônio 50mM até completar o volume de 50µl;
Após o preparo de cada amostra, as proteínas foram desnaturadas com 25µL de
detergente RapiGest SF 0,2% por 15 min a 80°C, seguidas da redução das pontes de
sulfeto com 2,5µL de DTT 100 mM a 60°C por 30 min. Em seguida, as proteínas foram
alquiladas com 2,5µL de iodoacetamida 300mM sob incubação de 30 min a temperatura
ambiente no escuro. Para a digestão enzimática das proteínas, foram utilizados 10µL de
tripsina 0,05µg/µL por 16 horas a 37°C. Após este período, foram adicionados 10µL de
TFA 5%, seguido da incubação das amostras por 90min a 37°C para interrupção
enzimática e hidrolise do RapiGest. Para finalizar, as soluções com peptídeos trípticos
foram centrifugadas a 16000 x g por 30min a 6°C e os sobrenadantes transferidos para
pequenos frascos de vidro seguidos da adição de 85µL de uma solução de ACN 3% e
TFA 0,1%.
3.4.6 LC-ESI-MS/MS
Os proteomas foram analisados no espectrômetro de massas Thermo Scientific Q
ExactiveTM (San Jose, USA) acoplado a uma cromatografia liquida de ultra performance
(UPLC) nanoACQUITY da Waters (Milford, MA, USA). Para a corrida cromatográfica,
2μL foram carregados em uma coluna PST C18 nanoACQUITY Trap (180μm × 20mm)
com fluxo de 15μL/min de TFA 0,1% (vol/vol) durante 3 minutos. A separação analítica
dos peptídeos foi feita usando uma coluna nanoACQUITY UPLC HSS C18 (1,8μm,
75μm × 150mm), em um gradiente linear de ACN 1%/ácido fórmico 0,1% para ACN
60%/ácido fórmico 0,1% por 90 minutes num fluxo de 0,5μL/min. Os espectros foram
adquiridos entre 300−2000m/z com 70000 de resolução (m/z 200) e aquisição dependente
59
de dados (DDA) por seleção dos 10 ions precursores mais abundantes para espectrometria
de massas em tandem (MS/MS) por Dissociação Induzida por Alta Energia de Colisão
(HCD), fragmentação usando uma janela de isolamento 1,2 Da, energia de colisão de 30,
e a resolução de 35000. Cada amostra biológica do proteoma total foi analisada uma única
vez.
3.4.7 Identificação e quantificação dos peptídeos e proteínas do LC-ESI-MS/MS
O processamento dos espectros do espectrômetro de massas foi feito no software
Maxquant versão 1.5.1.2 (Cox and Mann 2008) (http://www.maxquant.org) junto com
software Andrômeda, interno ao MaxQuant. Este software usou o proteoma humano
completo (TrEMBL e SwissProt) do UniProt (Human 9606 com acesso em janeiro de
2015) como referência para a identificação dos peptídeos e proteínas. Embora as amostras
fossem de porcos, foi utilizada esta biblioteca de humanos devido à alta homologia de
ambos e devido o banco de dados de porcos ser pouco acurado. A procura do MS/MS no
banco de dados foi feita usando as informações padrão: tolerância de massa de 10ppm
para as principais buscas. A carbamidometilação da cisteína foi selecionada como
modificação fixa e a acetil NH2-terminal e oxidação (metionina) como modificações
variáveis. A tripsina foi selecionada como protease e permitimos apenas dois erros de
clivagem (misscleavage). Os resultados foram filtrados com uma taxa de falsa descoberta
(FDR) de 0,01 para proteínas e peptídeos e um mínimo de sete aminoácidos foram aceitos
para cada peptídeo. Os contaminantes foram eliminados baseado na biblioteca de
contaminantes do próprio MaxQuant.
A quantificação foi feita livre de marcação (label-free) com normalização LFQ,
calculada pelo MaxQuant baseada nos valores obtidos dentro do próprio grupo analisado
(ex. contralateral e isquêmico).
Após a identificação das proteínas pelos softwares, foi feita a limpeza de proteínas
contaminantes, duplicadas, incertas, sequenciadas ao acaso (comparado a uma biblioteca
de sequência reversa) e não anotadas. Além dissso, para aumentar a confiabilidade dos
dados, antes das analises estatísticas fizemos uma seleção das proteínas representativas
de cada amostra. Para as análises do proteoma total dos rins, apenas as proteínas presentes
em pelo menos 3 animais do mesmo grupo (contralateral e isquêmico) foram
selecionadas. No caso de uma proteína estar presente apenas dentro de um grupo, ela
60
também foi considerada na análise e o valor dela no grupo ausente foi considerado zero.
Já, para as análises dos proteomas do soro e da urina foram selecionadas apenas as
proteínas presentes em pelo menos 3 dos 5 animais avaliados em qualquer tempo.
Após a seleção das proteínas, usamos a análise estatística apenas para o proteoma
de córtex renal. Para comparar as médias entre os rins isquêmico e contralateral foi
utilizado o Teste T de Student pareado bicaudal, seguido da correção FDR para evitar o
erro do tipo I na estatística, também denominado falsos positivos. Estas análises
estatísticas foram feitas no software metaboanalyst 3.0 (Xia et al. 2009, 2012)
(www.metaboanalyst.ca) e consideradas significativamente diferentes as proteínas com
valores de p<0,05 em ambos os testes.
Para a seleção dos biomarcadores de LRA no soro e na urina foram selecionadas
apenas as proteínas que apareceram (tinham 0 de expressão em todos os animais no
período pré-isquemia) ou desapareceram após a isquemia (reduziram a expressão para
“0” após a isquemia em todos os animais). O fluxograma das análises dos proteomas pode
ser observado na Figura 11.
61
Figura 11. Fluxograma utilizado na identificação de biomarcadores candidatos a LRA. Inicialmente, as
proteínas foram limpas e selecionadas pela sua presença em pelo menos 3 animais. A seguir, foi feito o
teste t de Student para comparar a média dos valores entre o rim contralateral e isquêmico, as proteínas
diferentes seguiram para análise de sistemas biológicos (SB). No soro e na urina, apenas as proteínas que
apareceram após a isquemia foram selecionadas para análise de sistemas biológicos (SB) e comparação
com as proteínas renais e os bancos de órgão especifico para análise de proteínas predominantemente renais.
62
3.4.8 Identificação das proteínas predominantemente renais
Para a classificação das proteínas órgão (rim) especifica, foram utilizados o banco
de dados de expressão gênica Tissue-specific Gene Expression and Regulation`s (TiGER)
desenvolvido pela universidade Johns Hopkins (http://bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger) (Liu
et al. 2008) e o banco do Atlas Human Protein (http://www.proteínatlas.org) (Habuka et
al. 2014).
3.4.9 Biologia de Sistemas
Primeiramente, as proteínas do córtex renal que apresentaram diferença
estatisticamente significativa foram classificadas segundo suas funções biológicas através
da base de dados geneonthology (http://geneontology.org/) e UniProt
(http://www.uniprot.org) acessados em outubro de 2015. Para a análise das vias canônicas
alteradas pela I/R renal, todas as proteínas independentes do contraste foram associadas
ás vias canônicas existentes no banco de dados do programa Ingenuity Pathway Analysis
(IPA - Ingenuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA) (http://www.ingenuity.com)
através do teste Exato de Fisher. Para significância deste teste foram considerados apenas
os valores de p-valor < 0,01. Estas proteínas também foram relacionadas com outras
proteínas, fatores de transcrição e metabólitos do banco de dados do software para
formação de uma rede de interação molecular.
3.4.10 Ensaio de atividade da DPPIV
A análise da atividade da DPPIV na urina foi feita com uma adaptação do
protocolo previamente descrito por Pacheco e colaboradores (Pacheco et al. 2011).
Assim, cinquenta microlitros de urina foram encubados com 150µL do substrato (H-Gly-
Pro-pNA tosilato de 2,0 mmol/L) diluído em tampão Tris HCl (10 mM, pH 7,6) a 37°C
por 1 hora. Após este período, foi adicionado 200µL de tampão de acetato de sódio (0,5
mol / L, pH 4,2) para finalizar a reação de hidrólise do substrato seguida da análise no
espectrofotômetro com absorbância de 405nm. Para a verificação da especificidade do
ensaio de atividade da DPPIV, uma análise controle com um inibidor da DPP IV P3298
63
(200 µM) foi feita em paralelo para as mesmas amostras de urina dos animais. Todas as
amostras foram avaliadas em duplicatas.
Para avaliar a diferença de concentração da DPPIV urinária ao longo da I/R renal
nos animais foi aplicado o teste ANOVA para medidas repetidas com post-hoc Dunnet.
E para validação de que a concentração de DPPIV urinária estava associada a lesão renal,
foi realizado um teste de correlação de Spearman no software SPSS 17.0 entre a
concentração da DPPIV urinária e os parâmetros bioquímicos dos pacientes com
nefropatia diabética. Os valores de p inferiores a 0,05 foram considerados significativos.
3.4.11 Validação em pacientes com nefropatia diabética
A dosagem de DPPIV urinária, candidata a biomarcador de lesão renal, foi
realizada em amostras de urina de pacientes com variáveis clínicas e laboratoriais já
coletadas da linha de base do estudo clínico (NCT 00419835) concebidos a fim de
comparar o efeito da terapia de associação do inibidor de enzima conversora de
angiotensina (ECA) com o bloqueador do receptor de angiotensina II contra a
monoterapia com inibidores da ECA sobre a progressão da proteinúria (Titan et al. 2011).
Para esta validação, cinquenta e seis pacientes com nefropatia diabética
macroalbuminúricos atendidos no Serviço Ambulatório de Nefrologia do Hospital das
Clínicas, em São Paulo foram utilizados. Todos estes pacientes apresentavam diabetes
mellitus há mais de 5 anos e proteinúria acima de 500mg/dia (três medições anteriores).
Antes do ensaio clínico, amostras de soro e de urina foram coletadas em jejum pela
manhã, centrifugadas, aliquotadas e armazenadas a -20°C. A albumina do soro foi
determinada por teste de eletroforese, as concentrações de creatinina sérica foram
determinadas por reação de Jaffé e a hemoglobina glicada foi medida por cromatografia
líquida de alta eficiência. Todas as outras variáveis laboratoriais foram determinadas
utilizando técnicas laboratoriais convencionais. Exclusivamente para este estudo, a taxa
de filtração glomerular foi estimada pela Modificação da Dieta na Doença Renal (MDRD)
usando quatro variáveis: creatinina sérica, idade, raça e sexo.
O resumo de toda a metodologia utilizada nas análises dos proteomas total pode
ser observado na figura 12.
64
Figura 12. Esquema utilizado nas análises dos proteomas.
65
3.5 NITROPROTEOMA
3.5.1 Ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA)
Com o objetivo de quantificar as proteínas nitradas dos córtices renais
contralateral e isquêmico foi utilizado o kit de antinitrotirosina por ELISA sandwich
(Eastbiopharm – China) segundo recomendações do fabricante.
Para a extração das proteínas totais dos córtices renais, aproximadamente 200mg
de tecido de cada rim, contralateral e isquêmico, foram adicionados a 600μL de tampão
de extração (1mM EGTA, 1mM EDTA, 5mM KCl, 2mM MgCl2, 25mM HEPES) com
inibidores de proteases e fosfatases e levados ao aparelho Precellys em um programa de
3 ciclos de 6500rpm por 30s com parada de 20s por ciclo. Após a homogeneização, os
extratos foram centrifugados a 16000 x g por 15 minutos a 4ºC e coletados os
sobrenadantes. As análises por ELISA foram feitas com 12mg de proteínas totais de cada
rim dosadas por Bradford, seguida do ajuste do volume para 500µL que fora indicado
pelo fabricante.
3.5.2 Imunohistoquimica
Para as análises de localização das proteínas totais nitradas nos tecidos renais
isquêmicos e não isquêmicos, foram realizados ensaios de imunohistoquímica.
Após as 24 horas da reperfusão do rim direito, secções dos córtices renais
contralaterais e isquêmicos foram fixados em paraformaldeído 4% por 48 horas (com
trocas de paraformaldeído a cada 24h devido à grande quantidade de sangue).
O material foi colocado em cassetes histológicos e processado em um ciclo de 12
horas para desidratação, diafanização e parafinização (Leica TP1020 - Leica) com 2
banhos de uma hora de álcool 95%, 4 banhos de álcool 100% e 3 banhos de citrisolv e
paraplast 58°C. Os blocos foram mantidos a -20°C para facilitar os cortes no micrótomo.
Foram feitos cortes de 5μm de espessura e colocados em lâminas com carga elétrica para
uma melhor aderência dos cortes.
As lâminas com os cortes foram colocadas em uma jarra de coplin com uma solução
desparafinizadora com de citrato de sódio pH6.0 (Dewaxing &Antigen Retrieval Buffer
1 – Ref:PMB1 – 250, Spring) a 93°C em banho Maria por 30 minutos para recuperação
antigênica, ou seja, exposição dos epítopos das células dos tecidos. Após 40 minutos de
66
resfriamento, os cortes foram lavados com PBS e a peroxidase endógena foi bloqueada
com H2O2 3% por 2 vezes de 10 minutos. Os cortes foram lavados novamente com PBS
e incubados por 16 horas a 4°C com anticorpo anti-nitrotirosina (Millipore #06-284) na
concentração de 5μg/mL diluído em PBS/Caseína 2%. No dia seguinte o material foi
lavado por 20 minutos e incubado por 30 minutos a temperatura ambiente com anticorpo
secundário anti IgG de coelho conjugado com HRP (1:200). Após o período de incubação,
os cortes foram lavados e revelados com 3,3'-diaminobenzidina (DAB- Zymed) por 2
minutos. O material foi então contracorado com hematoxilina por 2 minutos, diafanizado
e montado com lamínula e resina permanente. As análises foram feitas em microscópio
de luz.
3.5.3 Extração de proteínas do córtex renal para o nitroproteoma
Aproximadamente 150mg de tecido do rim isquêmico ou contralateral foram
adicionados em 600μL de tampão de extração RIPA (50mM de TrisHCl pH=7,4, 150mM
de NaCl, Nonidet NP-40 1%, Deoxicolato de sódio 0,5% e SDS 0,1%) e inibidores de
proteases (PMSF 0,1% e coquetel inibidor de proteases - 1:300) e fosfatases (Coquetel
inibidor de fosfatase 1 e 2 - 1:300). Em seguida, os córtices renais submersos no tampão
foram lisados no aparelho Precellys® (5000 rpm, dois ciclos de 20s, e 5s de intervalo
entre os ciclos) e centrifugados a 10621 x g por 15min a 4ºC. Após a centrifugação, as
proteínas totais presentes no sobrenadante foram coletadas e quantificadas pelo kit BCA.
3.5.4 Enriquecimentos de proteínas nitradas por imunoprecipitação
Ligação covalente entre esferas (beads) magnéticas ligado a proteína A e o
anticorpo anti-nitrotirosina
Para o enriquecimento das proteínas nitradas, foi utilizada a técnica de
imunoprecipitação com anticorpo anti-nitrotirosina acoplado as esferas (beads)
magnéticas. Inicialmente, os beads magnéticos ligados a proteína A (Invitrogen
Dynalbeads #100-02D), que faz a ligação com as imunoglobulinas, foram lavados três
vezes com PBS (140 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO4 e 1,8 mM de
KH2PO4) e em seguida encubados com anticorpo anti-nitrotirosina (Millipore #06-284)
67
sobre agitação a 4°C por 16 horas. O anticorpo foi diluído em PBS no mesmo volume
final de beads magnéticos a ser utilizado, na proporção de 1µg de anticorpo para cada
5µL de bead magnético ligado a proteína A. Após a encubação, o sobrenadante foi
descartado e o complexo bead-anticorpo foi lavado três vezes com PBST (0,1% de Tween
20) sob agitação por 5 minutos. Para realizar a ligação covalente entre o anticorpo e a
proteína A acoplada ao bead, o complexo foi encubado com DMP 6,5mg/mL diluído em
200mM de trietanolamina por 30 min sob agitação em temperatura ambiente. Esse
processo foi repetido por três vezes, com uma lavagem com solução de 200mM de
trietanolamina por 5 minutos sob agitação entre as incubações com DMP. Após a ligação
do anticorpo com os beads, foi realizado o quenching com duas incubações de cinco
minutos com 50mM de etanolamina. Para retirada dos anticorpos que não se ligaram
covalentemente, o complexo bead-anticorpos foi lavado duas vezes com glicina 0,1M
com pH 2,5 por 10 minutos. O complexo bead-anticorpo foi armazenado a 4°C em PBS
com 2mM de azida sódica até o momento do uso.
Imunoprecipitação das proteínas nitradas
Antes da imunoprecipitação, parte das imunoglobulinas (IgGs) presentes nas
amostras foram retiradas. Para isto foram encubados separadamente 4mg de proteínas
totais do córtex renal, 5mg de proteínas totais do soro e 50µg da urina com 100ul de beads
magnéticos ligados a proteína A, que facilmente se liga as IgGs, por 16h sob agitação a
4°C. Em seguida, o sobrenadante foi retirado e encubado com 100uL de beads ligados
covalentemente ao anticorpo anti-nitrotirosina (Millipore #06-284) sob agitação a 4°C
por 16h para o enriquecimento das proteínas nitradas. Após a encubação, o sobrenadante
foi descartado e os beads foram lavados por três vezes com PBST 0,1% por 15 minutos.
Em seguida, as proteínas nitradas foram eluídas do anticorpo com quatro lavagens
consecutivas de 100μL de ácido acético 0,8M pH 2,1 por 10min. E por fim, o ácido
acético foi evaporado pelo SpeedVac e as amostras liofilizadas.
3.5.5 Digestão das nitroproteínas
As amostras de rim, soro e urina liofilizadas foram primeiramente ressuspendidas
em 50µl de bicarbonato de amônio 50mM, seguido do mesmo protocolo de digestão
utilizado no proteoma de soro e urina. Devido a baixa concentração de proteínas nitradas
68
no rim, optamos por não utilizar o mesmo protocolo utilizado no proteoma total renal, em
que a digestão é feita em colunas e há um pouco de perda proteica.
3.5.6 Identificação e quantificação dos peptídeos e proteínas do LC-ESI-MS/MS
Os nitroproteomas foram adquiridos no Orbitrap Q-Exactive e analisados nos
softwares MaxQuant/Andrômeda com os mesmos parâmetros utilizados no proteoma
total. Porém, para a identificação dos peptídeos, o parâmetro nitração da tirosina
(44,985Da) também foi utilizado como variável aleatória e as amostras foram analisadas
em triplicatas.
Devido à grande variação das protéinas nitradas quanto ao seu tipo e intensidade
dentro de cada grupo, a quantificação do nitroproteoma foi feita através dos íons sem a
normalização LFQ. Para a análise do nitroproteoma primeiramente foi feita a limpeza de
proteínas contaminantes, duplicadas, incertas, sequenciadas ao acaso (comparado a uma
biblioteca de sequência reversa) e não anotadas. Em seguida, foi calculada a média com
os valores das replicatas técnicas apenas com os valores presentes, ou seja, foram
desprezados os valores faltantes.
Para a confiabilidade das análises do nitroproteoma, as proteínas passaram por um
filtro biológico, em que foram selecionadas apenas as proteínas presentes em todos os
animais para as análises dos córtices renais; e as que estavam presentes em pelo menos 3
dos 4 animais avaliados em qualquer tempo para as analises do soro e da urina. As
proteínas não encontradas em algum dos animais foram consideradas igual a “zero” nesta
etapa.
Para a análise de abundância entre os nitroproteomas renais foi calculado um fold
change log2([rim isquêmico/rim controle]) para cada animal e apenas as proteínas que
apresentaram log2FC≤-1 ou log2FC≥1 em pelo menos 3 animais sem contradição, ou seja,
não apresentaram -1≥log2FC≥1 ao mesmo tempo, foram considerados diferencialmente
expressos e seguiram para as próximas análises. A intensidade de cada proteína foi
apresentada em um heatmap com os valores normalizados por log2 e padronizados por z-
score para cada animal, com a finalidade de minimizar a variância da expressão proteica
entre eles.
Por fim, no intuito de agrupar os tempos analisados de I/R por similaridade de
comportamento das proteínas nitradas encontradas, os nitroproteomas de soro e urina
69
foram avaliados pela análise de agrupamento hierárquico após serem as intensidades das
proteínas serem padronizadas pelo cálculo do z-score para garantir a mesma variância
entre elas e evitar pesos diferentes para cada proteína. Na análise de agrupamento
hierárquico foi utilizada a Correlação de Pearson como parâmetro de similaridade e o
algorítimo Ward ou de variância mínima para formação dos grupos. Este algorítimo é
baseado na análise estatística da partição da soma dos quadrados (SQ) totais, ou seja,
SQT(total) = SQE(extragrupo) + SQD(intragrupo), onde SQT é fixo. Portanto, quanto
maior SQE, menor o SQD e mais homogêneo é o grupo. A demonstração gráfica deste
agrupamento e da intensidade das expressões proteicas padronizadas pelo z-score foram
feitas por meio do heatmap com identificação de cada proteína pelo nome do gene.
Todas essas análises foram feitas no software MetaboAnalyst 4.0 (Xia, 2016)
(http://www.metaboanalyst.ca) e estão resumidas na Figura 13.
70
Figura 13 Fluxograma utilizado para a análise do nitroproteoma.. Primeiramente, foram removidas as
proteínas incertas dos nitroproteomas da urina, rins e soro, seguido da aplicação do filtro biológico. Para o
tecido renal foram avaliadas as proteínas diferencialmente expressas entre os rins contralateral e isquêmico
considerando os fold change log2FC≤-1 or FC≥1 em pelo menos 3 animais. Já para urina e soro foram feitas
analises de agrupamento hieráquico para identificação de proteínas com comportamentos semelhantes entre
os tempos de I/R analisados. Por fim, foram feitas a demonstração gráfica dos resultados por heatmap, as
análises de biologia de sistemas e a identificação de proteínas predominantemente renais. Apenas as
proteínas predominantemente renais encontradas nos rins seguiram para validação por bioinformática e
expressão proteica.
71
3.5.7 Identificação de proteínas predominantemente renais
As proteínas identificadas nos nitroproteomas foram classificadas como
predominantemente renal após comparação das mesmas com os bancos de dados Tissue-
specific Gene Expression and Regulation`s (TiGER) da Universidade Johns Hopkins
(http://bioinfo.wilmer.jhu.edu/tiger) (Liu et al. 2008) e Atlas Human Protein (AHP)
(http://www.proteínatlas.org) (Habuka et al. 2014).
O banco de dados TiGER fornece os principais genes expressos via análise de
marcador de sequência expressa (ESTs) e estatística para 30 tipos de tecido humanos,
incluindo o rim que foi usado neste estudo. Já o AHP se baseia na análise do transcriptoma
em 37 tipos de tecidos humanos para fornecer três categorias: tecido enriquecido
(expressão pelo menos cinco vezes maior em um tecido comparado aos a todos os outros),
grupo enriquecido (expressão cinco vezes maior em um grupo de 2 a 7 tecidos
comparados aos outros tecidos) e tecido aumentado (expressão cinco vezes maior em um
ou mais tecidos comparado com a expressão média de todos os tecidos). A presença da
proteína em um dos três grupos foi considerada como predominantemente renal.
3.5.8 Biologia de Sistemas
As proteínas diferenciamente expressas entre os córtices contralateral e isquêmico
e as proteínas do soro e da urina foram analisados pelo sistema de classificação
PANTHER (Protein ANalysis THrough Evolutionary Relationships). A versão utilizada
13.1 deste software (avaliado em 03/02/18) continha 15524 famílias de proteínas,
divididas em 79562 subfamilias de proteínas funcionalmente distintas. Para nosso estudo
foi feita uma análise de associação por Exato de Fisher com taxa de falsa descoberta
(FDR) utilizado as funções biológicas dos bancos de dados do “GO biological process
complete” e do “Reactome” dentro do PANTHER. A associação foi considerada
significativa quando ambos os testes obtiveram p-valor e FDR menor que 0,05.
3.5.9 Validação por bioinformática
Inicialmente, as proteínas nitradas predominatemente renais encontradas no
nitroproteoma do rim foram validadas por predição por duas ferramentas de
72
bioinformática iNitro-Try (http://app.aporc.org/iNitro-Tyr/) (Xu, 2014) e GPS-yNO2
(http://yno2.biocuckoo.org/) (Liu, 2011).
3.5.10 SDS-PAGE com immunobloting
A avaliação da expressão proteica da iNOS, VDAC-1, TOM20, DPPIV e
BHMT2 foram feitas por Electroforese em gel de SDS-Poliacrilamida Unidimensional
(SDS-PAGE). Para isto, 80µg de proteína total de córtex renal foram injectadas em géis
com 10% de poliacrilamida, com excessão do gel para analise da TOM20 em que foi
usado 15%. Em cada gel foi inserido também um padrão de peso molecular (BioRad
Kaleidoscope #161-0324). Após a eletroforese os géis foram transferidos para
membranas de 0,45 µm microporosa de nitrocelulose (GE -Amersham Protran Premium
0.45µm NC – ref 10600003) em sistemas de electrotransferência úmida a 4°C por 16
horas. Em seguida, cada membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado em solução
salina tamponada com PBS-Tween 20 (0,1%) por 1 hora e encubada com o anticorpo de
interesse a 4°C por 16h sob agitação. Foram usados os seguintes anticorpos primários:
anticorpo policlonal de coelho anti-iNOS/NOS type II (BD # 610332) 1:1000, anticorpo
policlonal de coelho anti-VDAC1/Porin (Abcam # ab15895) 1:1000, anticorpo policlonal
de coelho anti-TOM20 (Santa Cruz # 11415) 1:200, anticorpo policlonal de coelho anti-
CD26/DPPIV (Santa Cruz # 9153) 1:500, anticorpo policlonal de coelho anti-BHMT2
(Sigma # HPA044573) 1:250, anticorpo monoclonal de coelho anti-DMGDH (Abcam #
ab199534) 1:1000 e anti-GAPDH (Abcam# ab22555) 1:1000. Após as 16h os anticorpos
primários foram retirados, as membranas foram lavadas três vezes com PBST1% por 10
minutos e acrescentado o anticorpo secundário anti-coelho 1:3000. Após mais três
lavagens com PBST1% o anticorpo foi visualizado usando um sistema
quimioluminescente ou fluorescente e a magnitude do sinal foi calculada no software
Image J.
Para a validação das proteínas nitradas DPPIV e BHMT2 os procedimentos do
imunoblotting foram os mesmos anteriores, porém o gel de eletroforese foi carregado com
a imunoprecipitação feita com o anticorpo anti-nitrotirosina. Este procedimento consistiu
em um novo enriquecimento das proteínas nitradas conforme realizado no nitroproteoma,
seguido da ressuspenção das amostras de IP em 20µL de Tris 0,37M mais 10µL de tampão
de eletroforese com DTT e injeção de todo o volume em um gel com 10% de
73
poliacrilamida. Os resultados dos immunobloting foram comparados entre os dois rins
através do teste não-paramétrico e pareado de Wilcoxon. Atribuindo como diferença
significativa os valores e p menores que 0,05.
O resumo da metodologia utilizada pode ser visto na figura 14.
Figura 14. Esquema utilizado nas análises dos nitroproteomas.
4 RESULTADOS E
DISCUSSÕES
77
4.1 Proteoma Total
4.1.1 Proteoma do córtex renal
Antes das análises dos candidatos a biomarcadores sistêmicos, o proteoma do cortex
renal foi avaliado. O software MaxQuant identificou 1425 proteínas que passaram por
uma limpeza de contaminantes, identificação ao acaso (comparação com sequencia
reversa), detectadas com incerteza (putative), duplicadas e não anotadas, restando 1365
proteínas. Destas proteínas, 868 estavam presentes em pelo menos 3 das 5 replicatatas
biológicas e 535 foram diferencialmente expressas entre os rins contralateral e isquêmico.
Na tabela 1 do Anexo 1 seguem as proteínas diferencialmente expressas entre os rins
isquêmicos e contralaterais. As proteínas significativas foram classificadas de acordo com
suas funções na Figura 15. Em ordem decrescente as categorias mais abundantes de
proteínas foram: proteínas ribossomais (9%), proteínas de citoesqueleto (8%),
desidrogenases (7%), óxidorredutases (6%), transportadoras (5%), hidrolases (5%) e
chaperonas (4%).
Figura 15. Análise funcional das 535 proteínas do córtex renal que se mostraram estatisticamente diferentes
entre os rins isquêmico e contralateral. Os números no gráfico de pizza representam o número percentual
de proteínas na respectiva categoria funcional com base no banco de dados do Gene Onthology e UniProt.
78
Baseado na porcentagem de proteínas identificadas no nosso estudo em relação a
todas as proteínas presentes no banco de dados de vias do IPA (Ingenuity Pathway
Analysis), há evidencias de que as vias mais representativas foram: sinalização EIF2 (p-
valor 1.25x10-42 coincidência de 29.7%), remodelamento das junções aderentes epiteliais
(p-valor 6.05x10-24 coincidência de 38.2%), da sinalização das junções aderentes
epiteliais (p-valor 9.86x10-21 coincidência de 21.9%), regulação da eIF4 e sinalização da
p70S6K (p-valor 1.15x10-17 coincidência de 19.9%) e via de maturação de fagossomos
(p-valor 5.97x10-17 coincidência de 21.7%) . Com exceção da Xaa-Pro aminopeptidase 2,
todas as outras proteínas estatísticamente diferentes entre rim contralateral e isquêmico
estavam aumentadas (Figura 16).
Figura 16. Heatmap da concentração das proteínas diferentemente expressas entre os rins contralateral e
isquêmico. C= contralateral, I=isquêmico.
79
Os dados sugerem um aumento no processo de transcrição e tradução das
proteínas, o que foi reforçado pela análise de enriquecimento fornecido pela análise de
biologia de sistemas (sinalização e regulação da eIF4 e sinalização da p70S6K). O
remodelamento e sinalização das junções aderentes epiteliais também foram destacados
na análise de enriquecimento. As junções aderentes epiteliais são compostas por caderinas
e cateninas que se prendem ao citoesqueleto de actina mantendo a adesão célula-célula,
possibilitando também uma sinalização intracelular. Esta adesão é perdida com a redução
de ATP devido à internalização de e-caderinas e desarranjo do citoesqueleto de actina
que pode estar envolvido na perda das junções oclusivas também (Mandel et al. 1994). A
perda da adesão celular nos túbulos proximais após uma isquemia é acompanhada da
redistribuição da Na/K-ATPase da membrana basolateral para apical, perda de filamentos
de actina da borda em escova e aumento da permeabilidade das junções oclusiva,
resultando na descamação de células viáveis do túbulo proximal com posterior obstrução
luminal (Spiegel et al. 1989).
No entanto, o rim é capaz de recuperar a sua função após breves períodos de
isquemia. Alguns autores acreditam que esta recuperação é feita pelas células aderidas
que sobrevivem e que após a isquemia estas células se desdiferenciam e reestruturam os
túbulos proximais substituindo as células epiteliais perdidas (Bonventre 2003).
Portanto, o aumento da expressão de várias proteínas, principalmente as do
citoesqueleto, as transportadoras de íons e nutrientes e as chaperonas são essenciais para
a reestruturação dos túbulos perdidos (Kuznetsov et al. 1996). Após a diferenciação
celular e o rearranjo do citoesqueleto, as conecções célula-célula e célula-lamina basal
são restabelecidas e os fatores de crescimento podem atuar na proliferação de novas
células epiteliais para a reestruturação tubular. Acreditamos que, após 24 horas de I/R
renal, o córtex do rim isquêmico já iniciou o seu processo de recuperação, demonstrado
pelo aumento em proteínas de transcrição e proteínas de junção aderente epitelial. O nosso
estudo corrobora com outro estudo que mostrou uma regeneração do rim isquêmico
também depois de 24 horas após I/R com o aumento da expressão de proteínas
nefrogênicas (Villanueva et al. 2006).
Como pode ser observado na análise de biologia sistema, as proteínas expressas
diferencialmente também são representativas da maturação do fagossomo. O acúmulo de
autofagossomos nos rins após I/R já têm sido relatados e é importante para a proliferação
e reparo dos túbulos lesionados (Li et al. 2014a).
80
Portanto, o proteoma do córtex renal foi capaz de sugerir uma recuperação renal
após 24 horas de I/R renal.
4.1.2 Proteoma do soro
Foram identificadas 251 proteínas no proteoma do soro que após limpeza de
contaminantes, identificação ao acaso (comparação com sequencia reversa), detectadas
com incerteza (putative), duplicadas e não anotadas, restaram 170 proteínas. Para evitar
que a o resultado fosse uma representação de apenas um animal, foram selecionadas 136
proteínas que estavam presentes em pelo menos 3 dos 5 animais independente do tempo
analisado.
Para a seleção das proteínas candidatas a biomarcadores de LRA, primeiramente
foram selecionadas apenas as proteínas que apareceram (51 proteínas) ou desapareceram
(16 proteínas) do soro após I/R renal. Por exemplo: selecionamos as proteínas cuja a
quantificação no tempo pré isquemia ou isquemia e zero e após estes períodos são
quantificadas. Comparando estas proteínas selecionadas no soro com as proteínas
diferencialmente expressas no córtex renal, foi possível identificar 6 proteínas como
candidatas a biomarcadores de LRA (proteína 2 relacionada a heat shock 70 kDa –
HSPA8, proteína 60 kDa heat shock mitocondrial – HSPD1; colágeno tipo I alfa 1 –
COL1A1; vimentina VIM, plastina-2 – LCP1 e isomerase triosefosfato – TPI1) (Figura
17).
Figura 17. Proteínas presentes no soro, candidatas a biomarcadores de LRA. Seis proteínas que apareceram
ou desapareceram do soro após isquemia e reperfusão renal e foram encontradas alteradas no rim isquêmico.
O colormap mostra a diferença de concentração destas proteínas antes, durante e após a isquemia. Nomes
em português com seus respectivos genes: proteína 2 relacionada a heat shock 70 kDa – HSPA8, proteína
60 kDa heat shock mitocondrial – HSPD1; colágeno tipo I alfa 1 – COL1A1; vimentina VIM, plastina-2 –
LCP1 e isomerase triosefosfato – TPI1.
81
As proteínas heat shock de 70 e 60 kDa foram amplamente expressas após
isquemia, sugere-se que isso ocorra a fim de proteger o órgão contra o aumento das EROs
(Lin et al. 2001; Daugaard et al. 2007). O colágeno tipo I que se encontra aumentado na
glomeruloesclerose (Hornigold et al. 2013), também foi encontrado como um candidato
a biomarcador de LRA na urina. Finalmente, a vimentina é um marcador de epitélio renal
completamente indiferenciado e pode ser uma resposta a regeneração do rim (Hornigold
et al. 2013). Plastina-2 e Triosefosfato isomerase foram relatadas como biomarcadores de
detecção precoce de tumores malignos nos rins (Su Kim et al. 2013) e carcinomas de
células renais (Valera et al. 2010). Infelizmente, apesar de todas as proteínas serem
associadas a processos renais, elas também são amplamente expressas na maioria dos
tecidos e não específica para o rim (base de dados TiGER`s). Apesar destas proteínas não
serem renal específico, elas podem ser importantes no desenvolvimento de um painel que
capture informação clinicamente relevante na LRA.
4.1.3 Proteoma da urina
As proteínas oriundas da urina têm sido consideradas excelentes biomarcadores de
doenças renais, pois além da coleta ser não-invasiva, a urina reflete diretamente o estado
fisiológico do rim. Deste modo, o proteoma total urinário pode ajudar na identificação de
biomarcadores mais sensíveis e específicos para I/R renal.
Neste estudo, foram identificadas 604 proteínas urinárias. Após a limpeza,
restaram 501 proteínas. Destas proteínas, apenas 346 foram identificadas em pelo menos
3 animais independente do tempo. Para a identificação de candidatos a biomarcadores de
LRA, foram selecionadas apenas as proteínas que foram excretadas após a I/R renal (192
proteínas) e que apareceram alteradas no rim isquêmico: um total de 49 proteínas (Figura
18).
82
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83
As categorias mais abundantes entre as proteínas selecionadas foram: oxirredutases,
proteínas de citoesqueleto, hidrolases e chaperonas, todas estas juntas são responsáveis por mais
da metade de todas as categorias encontradas (Figura 19).
Figura 19. Análise funcional das 49 proteínas urinárias candidatas a biomarcadores de LRA. Os números no gráfico
de pizza representam o número percentual de proteínas na respectiva categoria funcional com base no banco de dados
do Gene Onthology e UniProt.
A análise de vias canônicas destacou as vias de remodelamento de junções aderentes
epiteliais (p-valor 1,49 x 10-5 coincidência de 5,9%), glicólise (p-valor 2,20 x 10-5 coincidência de
12%) e gliconeogênese (p-valor 2,20 x 10-5 coincidência de 12%). Alfa-actinina 4 e inibidor 1 de
dissociação da GDP com a Rho foram associados a lesão glomerular (p-valor 3,59 x 10-2, e 2,19 x
10-3, respectivamente) na lista de possíveis moléculas tóxicas ao rim, e polipeptídeo proativador
foi associado a degradação renal (p-valor 2,19x 10-3), demonstrando a associação destas proteínas
candidatas com as doenças renais.
84
Para aumentar a especificidade de biomarcadores urinários, as 49 proteínas candidatas a
biomarcadores foram comparadas com o banco de dados do TiGER que resultou em 4 proteínas
altamente expressas nos rins: descarboxilase dos aminoácidos L-aromáticos (AADC), Betaina-
Homocisteina Metiltransferase 2 (BHMT2), beta-glucosidase citosólica (GBA3) e dipeptidil
peptidase IV (DPPIV).
A AADC é uma proteína expressa no túbulo proximal e catalisa a descarboxilação de
aminoácidos aromáticos. A importância desta proteína para o rim é o seu papel na síntese de
dopamina, que é responsável por diminuir o dano renal causado pelo excesso de angiotensina II
(Yang et al. 2012). A BHMT2 é uma enzima que converte a homocisteína em metionina.
Curiosamente, o aumento da metionina em doentes com LRA foi significativamente associado
com a mortalidade (Sun et al. 2012) e também se mostrou elevada no soro no período isquêmico
no estudo metabolômico desenvolvido com estes mesmos animais (Malagrino et al. 2016). Já a
GBA3 é uma enzima que hidrolisa vários β-D-glicosídeos com a liberação de β-D-glicose (Yahata
et al. 2000). Possivelmente, esta é a primeira vez que estas três proteínas estão sendo associadas
com a LRA e sugeridas como biomarcadores para a condição. Assim, as análises de validação dos
dados, principalmente em humanos devem ser realizadas.
A DPPIV, também conhecida como CD26, é uma peptidase responsável pela remoção do
dipeptídeo da posição amino terminal de vários peptídeos (Sigdel et al. 2014). Diferentemente das
outras proteínas, estudos prévios já encontraram alterações na DPPIV em outras doenças renais
(Mitic et al. 2008; Zheng et al. 2016). A DPPIV tem sido muito estudada atualmente, devido ao
seu papel na homeostase da glicose e principalmente pelo uso medicamentoso dos seus inibidores
no tratamento do diabetes mellitus. Curiosamente, a inibição da DPPIV é capaz de melhorar a
função renal após a lesão I/R renal em ratos (Glorie et al. 2012) e preservar a função renal em
pacientes com insuficiência cardíaca (dos Santos et al. 2013) de forma independente do controle
da glicose. Ao comparar as nossas proteínas selecionadas a candidata a biomarcadores de LRA
com um estudo proteômico recente que criou um painel de proteínas urinárias para diagnosticar
doenças renais, a única proteína pertencente ao painel foi a DDPIV (Yahata et al. 2000)(Cantley
et al. 2016). A maior expressão de DPPIV é encontrada no túbulo proximal do rim e intestino
delgado, embora ela também possa ser encontrada, menos expressa, nos pulmões, pâncreas, fígado,
baço, estômago e coração (Hong et al. 1989; Matheeussen et al. 2012). Um estudo com a DPPIV
85
ligada a microvesículas da urina sugeriu que a excreção de DPPIV pode vir a partir de células
epiteliais tubulares e, portanto, estar relacionada com a disfunção tubular precoce (Sun et al.
2012a). Com base em todas estas evidências, a DPPIV foi selecionada entre as quatro candidatas
para posterior validação.
Primeiramente, validamos os resultados da DPPIV por outra metodologia, um ensaio de
atividade da DPPIV nas amostras de urina. E como se pode observar na Figura 20, os nossos
dados mostraram um aumento significativo da atividade da DPPIV urinária após 4 horas de
isquemia, recuperando-se a atividade basal após este período.
Figura 20. Absorbância da atividade da DPPIV na urina durante a isquemia/reperfusão renal. p<0,05. Pos-rep = Pós
reperfusão.
Além de validação da alteração da atividade da DPPIV na urina em nosso modelo, a relação
entre este potencial biomarcador e as medidas associadas à função renal em uma coorte de
pacientes com doença renal também foi descrita. Correlações significativas foram encontradas
86
entre a atividade da DPPIV na urina e MDRD (coeficiente de correlação = 0,28), hemoglobina
glicada (coeficiente de correlação = -0,33), proteinúria (coeficiente de correlação = 0,22),
hormônio da paratireóide - PTH (coeficiente de correlação = -0,44) e renina (coeficiente de
correlação = -0,28) (Tabela 2 e Figura 21).
Tabela 1. Correlação de Spearman entre a atividade da DPP IV na urina e os parâmetros clínicos
e bioquímicos dos pacientes com disfunção renal (56 pacientes).
Parâmetros Clínicos e
Bioquímicos
Coeficiente de correlação p-valor
Idade 0,10 0,46
Índice de Massa Corpórea -0,10 0,45
Sódio sérico (mEq/L) -0,08 0,54
Potássio sérico (mEq/L) -0,53 0,70
Cálcio sérico (mg/dL) 0,02 0,89
Fosfato sérico (mg/dL) -0,26 0,07
Ureia sérica (mg/dL) -0,22 0,10
Creatinina sérica (mg/dL) -0,23 0,08
Glicemia (mg/dL) -0,17 0,20
Hemoglobina glicada (g/dL) -0,33 0,01*
PTH (pg/mL) -0,44 <0,01*
Albumina FPE (mg/dL) -0,18 0,21
Ácido Úrico (mg/dL) 0,07 0,63
RBP (mg/g creatinina) 0,08 0,56
Renina (ng/mL) -0,27 0,04*
25OH-vitamina D (ng/mL) -0,01 0,96
Proteinúria (mg/dL) 0,30 0,02*
MDRD (ml/min/1,73 m2) 0,28 0,03*
PTH = Hormônio da paratireoide, FPE = Fração de proteína por eletroforese, RBP = Proteína ligada ao Retinol,
MDRD = Modificação da Dieta na Doença Renal, *p<0,05
87
Figura 21. Gráficos das correlações significativas da atividade da DPPIV urinaria com os parâmetros clínicos e
bioquímicos relacionados à função renal.
Embora, ao nosso conhecimento, não se tenha estudos correlacionando a DPPIV em urina
com estimativas de taxa de filtração glomerular, a atividade plasmática da DPPIV já se mostrou
correlacionada negativamente com ela (Zheng et al. 2016). Recentemente, os ensaios clínicos com
pacientes com diabetes mellitus tipo 2 mostraram uma redução da hemoglobina glicada e
albuminúria com inibidores de DPPIV (Scirica et al. 2013; Mori et al. 2014), inclusive em uma
meta-análise (Li et al. 2016). Curiosamente, o PTH foi descrito como inibidor da DPPIV em um
estudo com infusão de PTH em ratos enfartados (Huber et al. 2011) e a renina ainda não foi
correlacionada com a DPPIV na literatura. Desta forma, mais estudos devem garantir uma melhor
avaliação destas novas correlações.
Estes novos resultados acrescentam a descrição geral de apontar a identificação de
biomarcadores para a utilidade destas proteínas recentemente identificadas como instrumentos
clínicos para estratificação de doença.
Novos estudos também são importantes para a validação dos outros biomarcadores que,
para além de DPPIV, podem contribuir para um melhor diagnóstico e prognóstico de lesão renal.
88
4.1.4 Sumário dos Resultados Proteoma Total
4.1.4.1 Córtex renal
- Foram identificadas 1365 proteínas no proteoma dos dois córtices renais (contralateral e
isquêmico);
- 534 proteínas estavam superexpressas no rim isquêmico;
- 1 proteína, a Xaa-Pro aminopeptidase 2, estava superexpressa no rim contralateral;
- Caracterização das 535 proteínas diferencialmente expressas:
o Caracterização local e funcional: a maioria eram proteínas do ribossomo,
citoesqueleto, desidrogenase, óxidoredutase e transportadoras.
o Caracterização de vias: representativas das vias relacionadas com a regeneração
tubular - sinalização EIF2, remodelamento das junções aderentes epiteliais, da
sinalização das junções aderentes epiteliais, regulação da eIF4 e sinalização da
p70S6K e via de maturação de fagossomos.
4.1.4.2 Soro
- Foram identificadas 170 proteínas no proteoma do soro com diferentes tempos de coleta
pós I/R;
- 51 proteínas apareceram após I/R;
- 16 proteínas desapareceram após I/R;
- Destas 67 proteínas, 6 estavam presentes entre as proteínas diferencialmente expressas no
córtex renal (proteína 70 kDa relacionada a heat shock; mitocondrial 60 kDa heat shock;
colágeno tipo I alfa 1; vimentina, plastina-2 e triosefosfato isomerase).
o Nenhuma das 6 proteínas são específicas renais para serem biomarcadores
específicos da doença, mas juntas podem formar um painel muito informativo sobre
a LRA por I/R.
89
4.1.4.3 Urina
- Foram identificadas 501 proteínas;
- 49 proteínas começaram a ser excretadas após I/R;
o Caracterização funcional: maioria oxiredutase, proteína de citoesqueleto, hidrolase,
chaperona e protease.
o Caracterização de vias: remodelamento de junções aderentes epiteliais, glicólise e
gliconeogênese.
- 4 proteínas são expressas predominantemente pelos rins e candidatas a biomarcadoras de
lesão renal (descarboxilase dos aminoácidos L-aromáticos (AADC), Betaína-
Homocisteína Metiltransferase 2 (BHMT2), beta-glucosidase citosolica (GBA3) e
dipeptidil peptidase IV (DPPIV).
o Validação da DPPIV nos animais:
▪ A atividade da DPPIV aumentou após 4h de reperfusão e retornou aos níveis
basais após este período.
o Validação da DPPIV em 56 pacientes com nefropatia diabética:
▪ Correlação direta da atividade da DPPIV urinária com MDRD (R = 0,28),
proteinúria (R = 0,22) e inversa com hemoglobina glicada (R= -0,33),
hormônio da paratireóide (R= -0,44) e renina (R = -0,28).
90
4.1.5 Considerações finais do Proteoma Total
Neste estudo foi possível descrever quatro proteínas urinárias, com expressão gênica
predominantemente renal, que são alteradas em resposta a I/R renal controlada e podem se tornar
biomarcadores de disfunção renal. Destas proteínas, três foram relacionadas pela primeira vez com
a LRA.
Ao todo, esta análise integrativa dos proteomas pode fornecer um painel de biomarcadores
potenciais e predominantemente renais em muitos níveis, considerando as mudanças que ocorrem
no tecido e ecoam nos perfis de proteínas do soro e da urina. Portanto, por meio da análise do
proteoma foi possível identificar novos candidatos a biomarcadores de doença renal que podem
servir como biomarcadores não invasivos para a disfunção renal. Estudos futuros com ferramentas
analíticas que analisam apenas as proteínas alvos devem ser desenvolvidos para validar esses
achados e identificar quais das proteínas descritas têm potencial clínico como biomarcadores não
invasivos.
Os resultados do proteoma total foram publicados em janeiro de 2017 na revista
Journal of Proteomics. doi: 10.1016/j.jprot.2016.07.019. E segue no Anexo 3.
91
4.2 Nitroproteoma
4.2.1 Nitração proteica total em córtices renais pós I/R renal
Existem vários modelos de I/R renal que podem ser bilaterais ou unilaterais. O modelo
unilateral foi escolhido para este estudo por caracterizar uma lesão renal, porém sem grande perda
de função renal como ocorre nos modelos de isquemias bilaterais. Nesse modelo, o processo
patológico gerado pela isquemia é resultado da lesão ocorrida no rim isquêmico e alterações
compensatórias no rim contralateral, como aumento da taxa de filtração glomerular e diurese
(Fatemikia et al., 2016).
Durante a I/R renal unilateral, ambos os rins sofrem com o estresse oxidativo devido ao
aumento de EROs, inflamação, redução de antioxidantes e aumento na síntese de NO pela iNOS.
O aumento de EROs no rim isquêmico ocorre com a isquemia e abrupta reperfusão, enquanto no
rim contralateral ocorre devido às moléculas circulantes do rim lesionado (Meldrum et al., 2002;
Fatemikia et al., 2016). Assim, o estudo da nitração proteica de cada rim é importante para avaliar
o impacto de ambos no cenário geral da LRA.
Para iniciar a caracterização da nitração proteica nos rins, primeiramente foi avaliada a
concentração de proteínas nitradas totais, seguida da análise histológica para localização dessas
proteínas.
Como resultado da análise quantitativa, os valores de proteína nitrada após 24h de I/R
renal foram semelhantes nos rins contralaterais e isquêmicos como observado na Figura 22.
92
Figura 22. Nitração proteica dos rins contralaterais e isquêmicos. A. Quantificação das proteínas nitradas representada
pela média dos valores dos animais ± erro padrão da média. B. Quantificação das proteínas nitradas com os valores
absolutos para cada animal. A absorbância foi obtida pelo método ELISA com anticorpo antinitrotirosina. P2, P3, P4
e P5 correspondem aos números das porcas utilizadas.
A técnica de imunohistoquímica mostrou que as proteínas nitradas se localizam no citoplasma
das células tubulares e tufos glomerulares no rim contralateral e nas áreas sem NTA do rim
isquêmico. Enquanto nos lugares em que havia NTA no rim isquêmico, a localização da nitração
ocorreu também no interior dos túbulos (Figura 23).
93
Figura 23. Imunohistoquimica dos córtices renais contralaterais e isquêmicos com anticorpo antinitrotirosina marcada
em marrom para dois animais (P2 e P3). A magnitude utilizada foi 200X.
Estudos prévios que mostram o aumento de nitrotirosina nos rins isquêmicos os
compararam apenas com os rins dos animais sham (falso operados - controle), devido os modelos
serem feitos com isquemia bilateral ou unilateral com nefrectomia (CHIAO et al., 1997;
CRUTHIRDS et al., 2003, NOIRI et al., 2001). No estudo de Cruthirds e colaboradores, além deste
aumento de nitração proteica no rim isquêmico de ratos após I/R bilateral, foi observada a
localização celular renal destas proteínas nitradas, cujos resultados foram semelhantes ao que foi
encontrado neste nosso estudo de isquemia unilateral. Neste estudo de Cruthirds, as proteínas
nitradas encontradas nos rins dos ratos isquêmicos apresentaram uma localização celular diferente
dependendo do tempo de reperfusão executado. Logo após 3 horas de reperfusão, a nitração estava
presente no citosol dos túbulos proximais e distais e na superficie dos tufos glomerulares, já após
as 16h de reperfusão, a nitração também apareceu no lúmem (Cruthirds et al. 2003), efeito provável
94
da morte celular ocasionada pela NTA e observada em outros modelos de LRA (Noiri et al. 2001;
Chirino et al. 2004).
Em um estudo com isquemia unilateral parcial de 90% sem nefrectomia feito em cachorros,
foi observada uma redução dos níveis de nitrito/nitrato no rim isquêmico com posterior
recuperação após 4h reperfusão; enquanto no rim contralateral, não houve diferença na
concentração dos níveis de nitrito/nitrato (Tokuyama et al. 2003). Este comportamento de queda
pode ter ocorrido pela rápida reação de nitração com o aumento de ROS em um primeiro momento,
e a recuperação dos valores podem estar associados à melhora da função renal devido ao
restabelecimento do fluxo sanguíneo renal. Assim, no nosso modelo em que foram analisados os
rins após 24h de reperfusão, as alterações na quantidade de proteínas nitradas do rim isquêmico
podem ter sido normalizadas, e por isso, não foi detectada diferença entre os rins contralateral e
isquêmico. Esta normalização da nitração pode ter ocorrido com o aumento de excreção de
proteínas nitradas na urina, resultado observado em nosso artigo de caracterização do modelo de
I/R renal em suínos (Malagrino, et al., 2014).
O excesso de NO capaz de nitrar as células renais pode vir dos três tipos de óxido nítrico
sintase (NOS) presentes nas células renais ou inflamatórias (Yu et al. 1994; Bosse and Bachmann
1997; Park et al. 2003), porém, apenas o aumento da iNOS tem sido associada a lesão renal e ao
estresse oxidativo por produzir a maior concentração de NO em comparação as outras enzimas
(Chiao et al. 1997; Walker et al. 2000; Chirino et al. 2008). Portanto, um aumento da iNOS pode
indicar um aumento na concentração de NO nos rins.
Ao avaliar a expressão da iNOS ou NOS2, como observado na Figura 24, ambos os rins
apresentaram valores similares da enzima e provavelmente de NO nos dois rins como ocorrido no
estudo de Tokuyama 2003 (Tokuyama et al. 2003). A enzima pode ter sua atividade alterada, o
que não foi analisado neste trabalho, porém este resultado da expressão já vem em concordância
com a semelhante quantidade de nitrotirosina encontrada em ambos os rins.
95
Figura 24. Immunobloting contra a proteína iNOS ou NOS2 do extrato proteico dos cortices renais. As bandas foram
quantificadas por densitometria e o GAPDH foi usado como normalizador. Não houve diferença estatisticamente
significativa entre os rins (Wilcoxon pareado p=0,12). Cada sinal no gráfico representa um animal analisado. Os
valores foram expressos como média ± SEM. C = rim contralateral, I = rim isquêmico. P4 = porca 4, P5 = porca 5.
4.2.2 Caracterização do nitroproteoma do córtex renal após I/R renal
Tão importante quanto a quantificação das proteínas nitradas encontradas nos rins
contralaterais e isquêmicos é a identificação e caracterização destas proteínas feita por análise
proteômica.
No nitroproteoma do córtex renal dos rins isquêmico e contralateral foram identificadas
884 proteínas que, após passarem por filtros como limpeza de contaminantes, identificação ao
acaso, detectadas com incerteza, duplicadas e não anotadas, restaram 843 proteínas. Destas, 356
proteínas estavam presentes em pelo menos um rim de todos os animais (anexo I, tabela 2). As
proteínas apresentadas neste estudo serão identificadas pelo nome de seus genes para facilitar a
identificação das mesmas nas figuras e tabelas.
96
Interessantemente, nenhuma proteína apareceu somente no rim isquêmico, enquanto três
foram exclusivas do rim contralateral: Glutaril-CoA desidrogenase mitocondrial (GCDH),
Fosforibosilaminoimidazol carboxilase/Fosforibosilaminoimidazol succinocarboxamida sintase -
(PAICS) e Fosfoglucomutase-1 – (PGM1). A GCDH está envolvida na via de degradação da lisina,
triptofano e ácidos graxos para a síntese de acetil-CoA. Já, a PAICS e PGM1 tem ação sobre o
metabolismo de purinas, sendo que a PGM1 também pode atuar no metabolismo de glicose.
A comparação entre os nitroproteomas do rim isquêmico e contralateral mostrou 55
proteínas nitradas diferencialmente expressas entre eles, sendo duas delas Proteína A associada a
proteína de membrana associada a vesícula (VAPA) e Transferência de elétrons flavoproteína-
ubiquinona óxidoredutase, mitocondrial (ETFDH) mais expressas no rim isquêmico (Figura 25).
Vale ressaltar que como não temos um rim controle para comparação, não se pode garantir que as
proteínas nitradas no rim isquêmico aumentaram, pois elas podem ter reduzido no rim
contralateral; porém, para comparação dos rins contralateral e isquêmico usamos como critério o
parâmetro aumento da expressão proteica para um rim ou para o outro. A VAPA é uma proteína
de retículo endoplasmático, ancoradora de microtúbulos e responsável pela comunicação entre
organelas através de vesículas (Prosser et al. 2008) e a ETFDH é uma proteína essencial para a
transferência de elétrons de desidrogenases mitocondriais contendo flavina para a cadeia
respiratória.
97
Figura 25. Heatmap da expressão proteica padronizada pelo z-score (-2 a 2) nos rins contralateral e isquêmico para
cada animal. C2, C3, C4, C5 representam o rim contralateral e I2, I3, I4, I5 representam o rim isquêmico. As proteínas
foram representadas pelo nome dos seus genes.
98
As 55 proteínas diferentemente expressas em ambos os rins pertencem as seguintes classes:
oxirredutases (21%), hidrolases (19%), liases (12%) e ligadas aos ácidos nucleicos (10%).
Além disso, estas proteínas foram representativas de três vias energéticas: metabolismo de
aminoácidos e derivados (EHHADH, HADHA, GLUD1, GOT2, BHMT2, RPS3A, DLST,
PHGDH, GCDH, PDHB, ASL), metabolismo da glicose (glicólise e gliconeogênese – MDH2,
GOT2, PGM1, SLC25A13) e beta oxidação (EHHADH, HADHA, GK, GCDH). As três vias
foram mostradas na Tabela 3 com seus respectivos genes e valores de associação, sendo que a
beta oxidação está inclusa na via de metabolismo. Destas proteínas, destacam-se as relacionadas
ao ciclo do ácido cítrico (FH, DLST, SUCLG2, MDH2), também conhecido por ciclo do ácido
tricarboxílico – TCA.
99
Tabela 2. Análise de enriquecimento de vias metabólicas para as 55 proteínas diferencialmente
expressas entre os rins contralateral e isquêmico após I/R renal.
Vias do
Reactome
Homo
sapiens –
Ref 21042
Proteínas
encontradas
(55)
Fisher
(P-valor) FDR Genes
Metabolismo
(R-
HSA1430728)
1968 27 5,14E-14 1,02E-10
GOT2, PPP1CA, FH,
LYPLA1, LTA4H,
HBB, BHMT2,
NDUFV1, RPS3A,
DLST, PHGDH, GK,
SUCLG2, PAICS,
ETFDH, PGM1,
SLC25A13, HADHA,
MDH2, VAPA, GCDH,
EHHADH, P4HB,
PDHB, GLUD1,
ALDH1L1, ASL
Metabolismo do
piruvato e TCA
(R-HSA-71406)
46 5 2,14E-07 1,42E-04 FH, DLST, SUCLG2,
MDH2, PDHB
Metabolismo dos
aminoácidos e
derivados
(R-HSA-71291)
337 9 2,53E-07 1,26E-04
GOT2, BHMT2,
RPS3A, DLST,
PHGDH, GCDH,
PDHB, GLUD1, ASL
TCA e cadeia
respiratória de
elétrons
R-HSA1428517
162 7 2,74E-07 1,09E-04
FH, NDUFV1, DLST,
SUCLG2, ETFDH,
MDH2, PDHB
TCA
(R-HSA-71403)
18 4 2,92E-07 9,68E-05 FH, DLST, SUCLG2,
MDH2
Síntese de
aminoácidos e
interconversão
(transaminação)
(R-HSA-70614)
23 3 4,18E-05 1,19E-02 GOT2, PHGDH,
GLUD1
Metabolismo de
Glicose
(R-HSA-70326)
75 4 5,37E-05 1,34E-02 GOT2, PGM1,
SLC25A13, MDH2
Gliconeogênese
(R-HSA-70263) 32 3 1,03E-04 2,29E-02
GOT2, SLC25A13,
MDH2
TCA – sigla mais comum para denominação do ciclo do ácido cítrico. FDR - taxa de falsa descoberta.
100
A maioria das proteínas encontradas (38%) era mitocondrial e estão distribuidas dentro da
organela da seguinte forma:
Matriz mitocondrial, responsável pela síntese energética – 13 proteínas (DLST, ETFDH,
FH, GCDH, GLUD1, GOT2, PDHB, PRDX3, SUCLG2, LONP1, HADHA, HSPA9, TUFM),
sendo as quatro últimas encontradas no nucleóide mitocondrial.
Membrana interna, onde está localizada a cadeia transportadora de elétrons – 6 proteínas
(ETFDH, GCDH, GOT2, HADHA, NDUFV1, SLC25A13).
Membrana externa, responsável pela troca de metabólitos entre a mitocôndria e a célula –
1 proteína (GK). Esta proteína é a principal enzima que regula a captação do glicerol para dentro
da mitocôndria e o seu metabolismo.
Além das proteínas mitocondriais energéticas, também foram encontradas proteínas de
reparo e regulação gênica via mtDNA (LONP1), reguladoras do metabolismo do óxido nítrico
(LYPLA1), relacionadas a proliferação, resposta e manutenção mitocondrial (HSPA9) e presentes
no metabolismo do carbono (ALDH1L1).
Um resumo das proteínas nitradas encontradas nos córtices renais, especialmente as
mitocondriais, pode ser observado na Figura 26.
101
Fig
ura
26.
Pro
teín
as n
itra
das
id
enti
fica
das
no
s có
rtic
es r
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As
pro
teín
as n
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das
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I/R
ren
al.
Já,
as
seta
s em
rosa
sim
bo
liza
m o
tra
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ort
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e m
etab
óli
tos
(bo
lin
has
azuis
) en
tre
a cé
lula
e a
mit
ocô
nd
ria.
102
A alta porcentagem de proteínas nitradas mitocondriais já era esperada devido à reação de
nitração ser instantânea e a mitocôndria ser a maior produtora de EROs no organismo (Bottari
2015). Além disso, as mitocôndrias têm um papel importantíssimo na lesão e reparo de vários
tecidos que sofreram I/R (Song and Phillis 1996; Irving et al. 2000; Korth U et al. 2003; Chouchani
et al. 2014), inclusive nas doenças renais (Emma et al. 2016). A disfunção mitocondrial é um
mediador crítico da LRA (Ishimoto and Inagi 2016) e precede sua manifestação clínica (Emma et
al. 2016). Durante a I/R, a depletação de ATP altera a estrutura e a função mitocondrial reduzindo
sua quantidade, descolando-a espacialmente ou desestabilizando a cadeia transportadora de
elétrons (Funk and Schnellmann 2012; Ralto and Parikh 2016). Assim, essas alterações resultam
no excesso de EROs que leva a peroxidação lipídica, danos no DNA, apoptose e modificações pós
traducionais como a nitração da tirosina (Aulak et al. 2004; Groot and Rauen 2007; Ott et al. 2007).
Muitas proteínas mitocondriais têm sido descritas nitradas em vários tecidos saudáveis ou doentes,
incluindo algumas proteínas encontradas no nitroproteoma do córtex avaliado em nosso estudo. A
EHHADH (Kanski et al. 2005), HADHA (Kanski et al. 2005), PGM1 (Brunelli et al. 2012),
GLUD1 (Liu et al. 2009), MDH2 (Aulak et al. 2004; Koeck et al. 2009) e SUCLG2 (Koeck et al.
2004) já foram encontradas nitradas in vivo, sendo as três ultimas identificada após I/R em coração
ou fígado. Já a PDHB e a GOT2 foram identificadas como nitradas apenas in vitro (Scandurra et
al. 1975; Kohutiar et al. 2018) e as proteínas SLC25A13, GK, GCDH e DLST, do que é do nosso
conhecimento, não foram identificadas como nitradas na literatura até o momento.
O fato de a isquemia poder reduzir a quantidade de mitocôndrias após I/R bilateral pode
ter levado redução de mitocôndrias no rim isquêmico com menor concentração de proteínas
nitradas mitocondriais comparado ao rim contralateral (Funk and Schnellmann 2012). Para
verificar esta hipótese, as expressões de duas proteínas estruturais de membrana externa
mitocondrial que inferem a densidade de mitocôndrias foram analisadas. Tanto a expressão da
VDAC-1 quanto a da TOM20, não apresentaram diferença signicativa entre os rins isquêmico e
contralateral, refutando a hipótese de menor número de mitocôndrias no rim isquêmico (Figura
27). Porém, uma limitação para esta analise é claramente o número amostral.
103
Figura 27. Immunobloting contra as proteínas mitocondriais VDAC1 e TOM20 do extrato proteico dos cortices
renais. As bandas foram quantificadas por densitometria e o GAPDH foi usado como normalizador. Não houve
diferença estatisticamente significativa entre os rins para VDAC1 (Wilcoxon pareado p=0,37) e TOM20 (Wilcoxon
pareado p=0,62). Cada sinal no gráfico representa um animal analisado. Os valores foram expressos como média ±
SEM. C = rim contralateral, I = rim isquêmico. P4 = porca 4, P5 = porca 5.
Ao comparar as proteínas encontradas neste nitroproteoma com as diferencialmente
expressas no proteoma total dos cortices desses mesmos animais, foram identificadas 41 proteínas
presentes em ambas as análises. Cabe relembrar que no proteoma total há a presença de mais um
animal que não foi considerado no nitroproteoma. Destas proteínas, a ETFDH teve o mesmo
comportamento em sua forma total (com e sem nitração) e sua forma nitrada, ou seja, ambas
estavam aumentadas no rim contralateral. As demais proteínas em sua forma total se apresentaram
mais expressas no rim isquêmico, enquanto as nitradas se mostraram mais expressas no rim
contralateral (Tabela 4). A menor expressão das proteínas nitradas no rim isquêmico pode ter
ocorrido devido a excreção urinária ou pela síntese de novas proteínas observadas no proteôma
total, levando a uma diminuição da proporção de proteínas nitradas comparada ao valor total
proteico analisado.
104
Tabela 3. Comparação da expressão proteica das proteínas presentes no Proteoma total e no
Nitroproteoma de córtices renais pós I/R renal.
(Continua)
Proteoma
Nitroproteom
a
ID Gene Nomes das proteínas em inglês
Razão
ISQ/CL
Razão
log2ISQ/CL
LYPLA1 Acyl-protein thioesterase 1 8,65 0,41
PHGDH D-3-phosphoglycerate dehydrogenase 2,67 0,30
TWF1 Twinfilin-1 2,27 0,29
GDI2 Rab GDP dissociation inhibitor beta 2,26 0,24
VCL Vinculin 2,24 0,42
LAP3 Cytosol aminopeptidase 2,15 0,17
EHHADH Peroxisomal bifunctional enzyme 2,14 0,56
LTA4H Leukotriene A-4 hydrolase 2,10 0,45
HNRNPA3 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A3 2,10 0,48
HNRNPM Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein M 2,03 0,31
ILF2 Interleukin enhancer-binding factor 2 2,02 0,23
RAB11B Ras-related protein Rab-11B 1,93 0,54
BHMT2
S-methylmethionine-homocysteine S-methyltransferase
BHMT2 1,89 0,28
RPS3A 40S ribosomal protein S3a 1,87 0,38
RAB5C Ras-related protein Rab-5C 1,86 0,49
ATP6V1B2 V-type proton ATPase subunit B, brain isoform 1,81 0,51
VCP Transitional endoplasmic reticulum ATPase 1,80 0,37
GLUD1 Glutamate dehydrogenase 1, mitochondrial 1,80 0,38
GCDH Glutaryl-CoA dehydrogenase, mitochondrial 1,80 0,00
TUFM Elongation factor Tu, mitochondrial 1,73 0,76
GOT2 Aspartate aminotransferase 1,70 0,57
HSPA9 Stress-70 protein, mitochondrial 1,67 0,55
PPIB Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase B 1,66 0,45
P4HB Protein disulfide-isomerase 1,66 0,20
DPP4 Dipeptidyl peptidase 4 1,62 0,43
TCP1 T-complex protein 1 subunit alpha 1,61 0,20
DLST 2-oxoglutarate dehydrogenase complex component E2 1,60 0,42
MDH2 Malate dehydrogenase 1,58 0,34
ASL Argininosuccinate lyase 1,56 0,05
CCT4 T-complex protein 1 subunit delta 1,55 0,37
PGM1 Phosphoglucomutase-1 2,80 0,00
FH Fumarate hydratase, mitochondrial 1,48 0,26
105
Continuação da Tabela 4. Comparação da expressão proteica das proteínas presentes no Proteoma
total e no Nitroproteoma de córtices renais pós I/R renal.
(Continuação)
Proteoma
Nitroproteom
a
ID Gene Nomes das proteínas em inglês
Razão
ISQ/CL
Razão
log2ISQ/CL
PRDX3
Thioredoxin-dependent peroxide reductase,
mitochondrial 1,48 0,35
LONP1 Lon protease homolog, mitochondrial 1,46 0,37
NDUFV1
NADH dehydrogenase [ubiquinone] flavoprotein 1,
mitochondrial 1,45 0,50
SLC25A13 Calcium-binding mitochondrial carrier protein Aralar2 1,44 0,57
SUCLG2
Succinyl-CoA ligase [GDP-forming] subunit beta,
mitochondrial 1,41 0,44
MME Neprilysin 1,39 0,27
ALDH1L1 Cytosolic 10-formyltetrahydrofolate dehydrogenase 1,35 0,36
HADHA Trifunctional enzyme subunit alpha, mitochondrial 1,33 0,57
ETFDH
Electron transfer flavoprotein-ubiquinone
óxidoreductase, mitochondrial 1,61 1,45
Das 41 proteínas totais ou nitradas, 15 estão presentes na mitocôndria, sendo 13 na matriz
(HSPA9, LONP1, TUFM, PRDX3, NDUFV1, MDH2, GOT2, HADHA, GCDH, ETFDH,
GLUD1, DLST, SUCLG2) e duas na membrana interna (SLC25A13 e NDUFV1). Como
observado, embora os rins contralateral e isquêmico tenham a mesma densidade de mitocôndria,
o estresse nitrosativo após a I/R agiu de forma diferente em ambos os rins. Enquanto a quantidade
de algumas proteínas mitocondriais no rim isquêmico estava maior que no rim contralateral, a
quantidade dessas mesmas proteínas nitradas era menor.
As mitocôndrias são muito abundantes nos túbulos proximais devido à sua importância
na produção energética para reabsorção de nutrientes impedindo que eles sejam excretados na
urina. A energia é produzida pela oxidação de carboidratos, aminoácidos e ácidos graxos, todos
interligados pelo ciclo do ácido cítrico (TCA), responsável pela maior síntese de ATP.
O TCA é considerado o centro do metabolismo energético, ele fornece elétrons para o
complexo I da mitocôndria. O succinato segue para o complexo II que assim como o ETFDH,
fornecem eletrons para a redução de Q, que será utilizada nos complexos III, IV e V para geração
106
de energia para as células. As alterações neste ciclo levam ao acúmulo de succinato, que é uma
assinatura metabólica universal da isquemia, responsável pela produção de ROS mitocondrial
durante a reperfusão (Chouchani et al. 2014). Isto decorre da reversão da succinato desidrogenase
(SDH), pelo excesso de fumarato e reversão parcial da lançadeira malato/aspartato que funciona
no rim, fígado e coração (Chouchani et al. 2014).
Na análise do proteoma total do rim contralateral e isquêmico, observamos que algumas
destas proteínas do TCA estavam mais expressas no rim isquêmico, dentre elas as proteínas
responsáveis pela síntese de succinato, SDHA, SDHB e SUCLG2 e as presentes na lançadeira
malato/aspartato, SLC25A11, MDH1, MDH2, GOT1 e GOT2, sugerindo um aumento dessas vias
no rim isquêmico. Interessantemente, três proteínas da lançadeira malato-aspartato (SLC25A13,
GOT2, MDH2) foram identificadas nitradas e em maior concentração no rim contralateral,
mostrando que a nitração pode participar da regulação desse sistema. Além do aumento de
succinato, a lançadeira proporciona um mecanismo importante para regulação da glicólise e do
metabolismo do lactato, transferindo equivalentes redutores do citosol para as mitocôndrias.
Alguns estudos mostraram redução de metabólitos do TCA em LRA por cisplatina (Choi
et al. 2015) e em pacientes com DRC não diabética (Hallan et al. 2017). O reflexo das alterações
das proteínas do TCA apresentados no nosso nitroproteoma pôde ser observado em nosso estudo
anterior com análises metabolômicas a partir do sangue e da urina desses animais. Neste estudo
houve um aumento do glutamato sérico no tempo de isquemia, enquanto houve um aumento na
excreção urinária de piruvato, citrato, glicerol e 3-hidroxibutirato no primeiro momento da
reperfusão (Malagrino et al. 2016).
Huang e colaboradores, em um estudo de proteo-metabolômica com I/R renal unilateral
em ratos, revelaram um possível efeito compensatório parcial da função mitocondrial perdida do
rim isquêmico pelo rim contralateral em 24 horas de reperfusão (Huang et al. 2018). Não avaliamos
a função mitocondrial neste estudo, no entanto a regulação do TCA, por exemplo, pode estar sendo
feito parcialmente por uma modificação pós traducional como a nitração.
A nitração da tirosina é uma modificação pós traducional pouco estudada devido à
dificuldade de encontrar resíduos de tirosina nitrados e sua possível ação sobre a função proteica.
Uma vez identificada uma proteína nitrada, é necessario identificar a posição da tirosina nitrada
para verificar uma possível alteração estrutural da proteína. A resposta funcional da proteína vai
depender do tipo de proteína, conformação, interação com outras modificações pós traducionais
107
(principalmente fosforilação) e da localização da proteína dentro da célula (Batthyány et al. 2016).
A nitração de proteínas mitocondriais pode prevenir a apoptose, como citocromo c nitrado (Godoy
et al. 2009), inibir a atividade antioxidante de MnSOD (Macmillan-Crow et al. 1996; Yamakura
et al. 1998; MacMillan-Crow and Thompson 1999; Radi 2004) ou regular o metabolismo
mitocondrial por Hsp90 (Franco et al. 2015). Outros experimentos são necessários para entender
os mecanismos e a função real da nitração da tirosina em cada proteína no metabolismo.
4.2.1 Proteínas do córtex renal candidatas a biomarcadoras de LRA pós I/R renal
De todas as 55 proteínas diferencialmente expressas em ambos os rins, a BHMT2, MME,
ALDH1, DPPIV e EHHADH foram consideradas predominantemente renais e podem ser
consideradas boas candidatas a biomarcador de doença renal.
A técnica de imunoprecipitação de proteínas e não de peptídeos nitrados foi considerada a
melhor para ser empregada neste estudo, devido esssa ser capaz de identificar mais proteínas
nitradas. Porém, através desta técnica é muito difícil a identificação dos sítios de nitração nos
peptídeos sequenciados, apenas o sítio de nitração da HBB foi observado
(LLVVY(NO2)PWTQR). Isto ocorre porque o número de tirosinas nitradas é muito menor que o
total de tirosinas, os peptídeos nitrados são muito hidrofóbicos e o resíduo de nitração pode mudar
de acordo com a espécie nitrante (Batthyány et al. 2016).
Assim, para aumentar a confiança nessas candidatas a biomarcador de LRA, visto que não
foram identificados seus sítios de nitração, foi feita uma análise de predição de sítio de tirosina
nitrada por dois modelos preditores para cada proteína. Com excessão da BHMT2 e da DPPIV, a
nitração da tirosina das demais proteínas foi prevista em ambas Tabela 5.
108
Tabela 4. Predição dos sítios de tirosina nitrada das proteínas candidatas a biomarcadora de LRA
no córtex renal por dois modelos preditores.
Proteínas Número de
Tirosinas
iNitro-Tyr GPS-yNO2
BHMT2 10 0 1
MME 34 9 6
EHHADH 21 4 1
DPPIV 56 12 0
ALDH1 16 6 2
Caracterização de cada proteína candidata a biomarcador de LRA:
- Enzima bifuncional enoil-CoA hidratase/3-Hidroxiacil CoA desidrogenase expressa pelo
gene EHHADH é uma das quatro enzimas da via de beta-oxidação do peroxissomo. O mau
funcionamento da EHHADH peroxisomal pertuba o metabolismo mitocondrial e leva a Sindrome
de Fanconi, caracterizada pela perda renal de bicarbonato e fosfato (Klootwijk et al. 2014). A
EHHADH nitrada já foi encontrada em mitocôndria de coração de ratos em condições fisiológicas
normais (Kanski et al. 2005).
- Aldeido desidrogenase 1 (ALDH1) é uma enzima que converte aldeído em ácido
carboxílico com NADH. Prévios estudos com células de câncer pulmonar sugerem seu
envolvimento com a síntese de ATP a partir da NADH da fosforilação oxidativa (Kang et al. 2016)
e já identificaram a ALDH1 nitrada em fígado de camundongos saudáveis (Marshall et al. 2013).
- Endopeptidase neutra ou Neprilisin (MME) é uma metaloprotease dependente de zinco
que inativa vários peptídeos como angiotensina e peptídeos natriuréticos (Vijayaraghavan et al.
1990; Abassi et al. 1992; Park et al. 2003; Domenig et al. 2016).
- Betaina-Homocisteina S-Metiltransferase 2 (BHMT2) é uma enzima que converte
homocisteína em metionina. O aumento da homocisteína plasmática já é descrito como um fator
de risco para doença cardiovascular e também foi considerado um fator de risco independende
para a progressão de doença renal em pacientes diabéticos (Peng et al. 2015; Wang et al. 2015).
109
Um dos produtos da degradação da homocisteína, a metionina, foi observada elevada no plasma
durante o período isquêmico em nosso estudo metabolômico, bem como, associada com a
mortalidade de pacientes com LRA (Sun et al. 2012b; Malagrino et al. 2016).
- Dipeptidil peptidase IV (DPPIV) é uma enzima que cliva dipeptídeos como fator de
crescimento, citocinas, neuropeptídios e peptídeos vasoativos. O nível da DPPIV tem sido descrito
alterado pacientes com glomerulopatias, nefropatia diabética e disfunções cardíacas (Mitic et al.
2008; dos Santos et al. 2013; Zheng et al. 2016).
Coincidentemente, em nossa análise prévia do proteoma total a BHMT2 e a DPPIV
também foram descritas como boas candidatas a biomarcadores renais, porém foram encontradas
na urina (Malagrino et al. 2017).
Devido às duas destas proteínas predominantemente renais, BHMT2 e DPPIV, serem
inconclusivas quanto a presença de nitração, elas foram selecionadas para validação experimental
por imunoprecipitação de proteínas nitradas seguida do immunobloting. Os resultados
apresentados nas Figura 28, Figura 29 confirmaram que as duas proteínas avaliadas apresentam
pelo menos um sítio de tirosina nitrada.
110
Figura 28. Immunobloting contra BHMT2 do extrato proteico do córtex renal com e sem enriquecimento por
imunoprecipitação. O anticorpo utilizado reconheceu três bandas da BHMT2: 40Kda, 37 e 39kDa. As bandas foram
quantificadas por densitometria e o GAPDH foi usado como normalizador somente para o extrato não enriquecido.
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os rins. Cada sinal no gráfico representa um animal analisado.
Os valores foram expressos como média ± SEM. M = marcador de peso molecular, C = rim contralateral, I = rim
isquêmico, IP = imunoprecipitação.
111
Figura 29. Immunobloting contra DPPIV do extrato proteico do córtex renal com e sem enriquecimento por
imunoprecipitação. O anticorpo utilizado reconheceu a forma solúvel da DPPIV em 90KDa. As bandas foram
quantificadas por densitometria e o GAPDH foi usado como normalizador somente para as amostras não enriquecidas.
Não houve diferença estatisticamente significativa entre os rins. Cada sinal no gráfico representa um animal analisado.
Os valores foram expressos como média ± SEM. M = marcador de peso molecular, C = rim contralateral, I = rim
isquêmico, IP = imunoprecipitação. Note que os animais que têm maiores valores de DPPIV total, têm menos DPPIV
nitrada e os que têm menores valores de DPPIV total tem mais proteína nitrada.
Ao avaliar a quantificação da BHMT2 e DPPIV totais e nitradas, notou-se, no entanto, que
os valores dessas proteínas tiveram uma alta variabilidade, comum nas avaliações de estresse
oxidativo e foram semelhantes entre os rins contralateral e isquêmico. Infelizmente, este resultado
não valida as diferenças encontradas entre os rins contralateral e isquêmico em que estas proteínas
nitradas se mostraram mais abundantes no rim contralateral.
A abordagem proteômica de descoberta (shotgun) é uma excelente técnica para
identificação de proteínas, ela é altamente precisa e sensível. Porém, toda técnica tem sua limitação
e a da análise proteômica de descoberta feita no orbitrap é detectar em cada leitura, apenas os dez
peptídeos mais abundantes e bem ionizados naquele momento. Portanto, a falta de identificação
de uma proteína não indica sua ausência.
Para a DPPIV e a BHMT2 encontramos os seguintes resultados apresentados na Tabela 6.
É possível notar que estas proteínas não foram identificadas em todas as amostras de rim e que
112
pode ter sido suprimida por peptídeos de outras proteínas mais abundantes que foram lidas no
mesmo momento. Nosso resultado mostra a importância da validação dos resultados da proteomica
de descoberta.
Tabela 5. Peptídeos e intensidade de íons para cada rim de cada animal analisado.
Apesar de não haver diferença na quantidade de BHMT2 e DPPIV nitrada entre os dois
rins, a condição de nitração dessas proteínas deve ser analisada mais profundamente devido à
importância e especificidade dessas proteínas no rim. Interessantemente, nota-se na Figura 25 que
os animais que têm maiores valores de DPPIV total, têm menos DPPIV nitrada e os que têm
menores valores de DPPIV total tem mais proteína nitrada.
4.2.3 Nitroproteoma do Soro
Alguns estudos têm mostrado que a nitração proteica plasmática ou sérica está aumentada
em pacientes com doenças renais. Um estudo feito por Quian e colaboradores mostrou que
indivíduos com LRA apresentaram maiores valores de nitração proteica plasmática comparados
aos indivíduos saudáveis, além de um aumento dos valores de nitração com o agravamento da
doença, podendo servir como um preditor de morte em pacientes com LRA (Qian et al. 2013). A
mesma diferença significativa na concentração de proteínas nitradas também foi observada em
pacientes com DRC, dialíticos ou não, comparada aos indivíduos saudáveis (Piroddi et al. 2011).
Esses trabalhos mostram a importância da nitração proteica para as doenças renais e a possibilidade
de se identificar biomarcadores de doenças renais a partir do nitroproteoma sérico.
113
Em nosso estudo foram identificadas 99 proteínas no nitroproteoma que passaram pelo
mesmo procedimento de limpeza do córtex e se reduziram a 55 proteínas. Destas, foram
selecionadas apenas as que apareceram em pelo menos três dos quatro animais, independentemente
do tempo analisado, resultando em 36 proteínas que tiveram suas expressões demonstradas
graficamente no heatmap (Figura 30).
114
Figura 30. Heatmap e dendograma da expressão proteica dos soros padronizada pelo z-score (-1,5 a 1,5) durante o
experimento de I/R renal. O dendrograma da vertical agrupa os períodos mais similares da I/R, enquanto o dendograma
da horizontal agrupa as proteínas com comportamentos similares das expressões proteicas. Os retângulos amarelos
destacam os grupos de proteínas que mais separam os períodos analisados. PreIsc = pré-isquemia; Isc = isquemia; R6
= 6h pós reperfusão; R11 = 11h pós reperfusão; R16 = 16h pós reperfusão. As proteínas foram representadas com o
nome dos seus genes e a média dos valores de expressão dos 4 animais.
115
Através do dendrograma gerado pela análise de agrupamento das amostras, foi possível
observar que as amostras de soro foram classificadas em dois grupos: pré-isquemia/isquemia e
períodos de reperfusão. Ao agrupar as proteínas por similaridade de comportamento de expressão
encontramos três grupos de proteínas que caracterizam os períodos pré-isquemia/isquemia, 6h pós
reperfusão e 11 e 16h pós reperfusão. Dentro do período pré-isquemia não houveram proteínas
mais expressas que em outros períodos, sugerindo que após a I/R renal os níveis de proteínas
nitradas aumentam como observado em nosso estudo prévio que avaliou os níveis de nitrotirosina
no soro destes animais (Figura 31) (Malagrino et al. 2014). Alguns estudos relataram que os sinais
de dano protéico por estresse oxidativo/nitrosativo também aparecem no plasma desde os
primeiros estágios da DRC (Mitrogianni et al. 2004; Matsuyama et al. 2009).
Figura 31. Proteínas nitradas totais no soro ao longo da I/R renal. O gráfico mostra a diferença entre os tempos pós
isquemia e basal (pré-isquemia), destacando o aumento pós reperfusão. Todos os valores foram apresentados como
média±erro padrão da média. A análise para medidas repetidas (ANOVA) resultou em p<0,05, sem diferença no pós-
teste, mostrando que houve diferença na análise global da nitração proteica (Malagrino, 2014).
Ao analisar o período isquêmico, nota-se um aumento da expressão de oito proteínas
(GORASP1, AAR2, AKAP9, HBB, DMGDH, SEMG2, IGKV3-25, SEMG1) representativas da
regulação positiva da atividade da peptidase tipo serina e da heterooligomerização proteica. Estas
proteínas desempenham um papel importante nas funções dependentes da atividade da peptidase
do tipo serina, tais como digestão, hemostasia, apoptose, transdução de sinal, reprodução e resposta
116
imune (Hedstrom 2002). A inibição da serina-protease pelo Mesilato de Camostat foi descrita
como renoprotetora devido à supressão da expressão de citocinas inflamatórias e pró-fibróticas,
produção de ROS e sinalização do fator transformador do crescimento b (TGF-b) (Narita et al.
1984; Hayata et al. 2012; Morinaga et al. 2013; Ueda et al. 2015).
Embora muitas proteínas altamente abundantes no soro de porcos e humanos (Hortin et al.
2008; Zhang et al. 2012) sejam nitradas, com excessão da HBB elas não foram as mais abundantes
no nitroproteoma do grupo pré-isquemia/isquemia.
Diferentemente do grupo pré-isquemia/isquemia, o grupo reperfusão apresentou maiores
níveis de proteínas nitradas bem abundantes no soro. As 28 proteínas com maiores intensidades
foram altamente representativas dos processos biológicos bem descritos na I/R: organização de
membrana, regulação da resposta inflamatória aguda, resposta ao estresse e modificação proteica
pós-traducional (Tabela 7). Duas destas proteínas IGKV1D e IGKV3 não foram reconhecidas pelo
software. Algumas das proteínas de resposta ao estresse (YWHAZ, A2M, IGHG3, IGHM,
DOCK9) aproximaram o perfil proteico do período 11 e 16h do grupo pré-isquemia/isquemia,
mostrando a redução da resposta ao estresse oxidativo gerado pela I/R renal.
117
Tabela 6. Análise de enriquecimento de vias metabólicas para os dois grupos de proteínas
encontrados, pré-isquemia/isquemia e reperfusão no nitroproteoma sérico após I/R renal.
(Continua)
GO processo biológico
complete
Homo
sapiens
- REF
(21042)
Proteínas
encontradas
(27)
Fisher
(P-valor) FDR Genes
ISQUEMIA
Regulação positiva da atividade
da peptidase tipo serina
(GO:1902573)
3 2 9,48E-07 1,48E-02
SEMG1,
SEMG2,
HBB
Heterooligomerização proteica
(GO:0051291) 113 3 5,62E-06 1,10E-02
SEMG1,
SEMG3
REPERFUSÃO
Homeostase da retina
(GO:0001895) 71 4 2,09E-06 2,97E-03
Organização da membrana
(GO:0061024) 811 8 4,22E-06 4,41E-03
TF,
YWHAZ,
ACTG1,
YWHAG,
IGHG3,
CUL3,
IGHM,
SERPINA1
Regulação da ativação
complemento (GO:0030449) 113 4 1,23E-05 1,01E-02
Regulação da resposta
inflamatória aguda
(GO:0002673)
154 4 4,00E-05 1,69E-02
C4B, A2M,
IGKV2-29,
IGHG3
Degranulação plaquetária
(GO:0002576) 128 4 1,98E-05 1,41E-02
Via de sinalização do receptor
Fc-gamma envolvida na
fagocitose (GO:0038096)
134 4 2,36E-05 1,48E-02
Coagulação sanguínea
(GO:0007596) 289 5 2,65E-05 1,43E-02
118
Continuação da Tabela 7. Comparação da expressão proteica das proteínas presentes no Proteoma
total e no Nitroproteoma de córtices renais pós I/R renal.
(Continuação)
GO processo biológico
complete
Homo
sapiens
- REF
(21042)
Proteínas
encontradas
(27)
Fisher
(P-valor) FDR Genes
Resposta ao estresse
(GO:0006950) 3367 15 1,54E-06 2,41E-03
TF, C4B,
SERPINB6,
HPR, CUL3
YWHAZ,
ACTG1,
A2M, ALB,
IGHG3,
FCN1,
IGHM,
DOCK9,
SERPINA1,
PIK3R2
Ativação do complemento, via
clássica (GO:0006958) 162 4 4,85E-05 2,00E-02
Modificação proteica pós-
traducional (GO:0043687) 361 5 7,50E-05 2,67E-02
SERPINA1,
TF, ALB,
CP, CUL3
Regulação positiva do transporte
(GO:0051050) 936 7 1,10E-04 3,57E-02
As proteínas destacadas em negrito são as principais representantes da formação das proteínas nitradas. FDR - taxa de
falsa descoberta.
119
Duas proteínas encontradas no nitroproteoma do soro foram consideradas
predominatemente renais e podem se tornar boas candidatas a biomarcadoras de LRA:
Dimetilglicina desidrogenase, mitocondrial (DMGDH), a qual participa da degradação da betaína,
e Semenogelina-2 (SEMG2), envolvida na formação de uma matriz de gél que reveste os
espermatozóides ejaculados. Embora a SEMG2 seja expressa em células renais, o papel fisiológico
no órgão ainda não é conhecido (Lundwall et al. 2002). Ambas as proteínas DMGDH e SEMG2
apresentaram uma alta expressão proteica no período isquêmico com posterior queda após a
reperfusão e requerem validação (Tabela 8).
Tabela 7. Valores brutos da intensidade de íons para DMGDH e SEMG2.
Os valores das médias estão coloridos de vermelho, quanto maior a concentração de íons naquele período, mais
vermelha a média se encontra.
Na análise MS/MS do espectrômetro de massas, encontrou-se apenas um peptídeo para a
DMGDH, o SEITAGSTWHADFGIVK lidas entre 2 a 10 vezes (scan number). Porém, esta
proteína pode ser considerada bem identificada por ser uma proteína pequena de tamanho de
120
10,5KDa, e o seu peptídeo ser: exclusivo desta proteína (unique), ser encontrado em 7 amostras,
não possuir miscleavage e possuir uma boa sequência de íons (a2;b2;b2-H2O;b3;b4;b4-
H2O;b6;b6-H2O). Já para a SEMG2, foram encontrados três peptídeo, o DIFTTQDEIIVYNK
(y1;y2;y3;y4;y5;y6;y7;y8;y9;y10;y11;y12;y1-NH3;y2-NH3;y3-NH3;y7-NH3;y9-NH3;y10-
H2O) em 6 amostras, GSISIQTEEQIHGK (y1;y2;y3;y4;y6;y7;y8;y9;y10;y11;y1-NH3;y2-
NH3;y9-H2O;y9-NH3) em 14 amostras e o DVSQSSISFQIEK
(y1;y2;y3;y4;y5;y6;y7;y8;y9;y10;y11;y1-NH3;y2-H2O;y4-H2O;y4-NH3;y10-H2O;y10-NH3)
em 4 amostras, todos sem miscleavage e considerados exclusivos da proteína SEMG2 que possui
65,5 KDa.
A validação da DMGDH foi feita por western blot e confirmou a nitração da proteína,
embora não mostre diferença entre os tempos de I/R (Figura 32). Conjuntamente, foi analisada a
expressão da DMGDH nos rins dos animais e no soro em sua forma total (com ou sem nitração).
Não foi verificada diferença estatística entre os rins contralateral e isquêmico, porém foi visto um
aumento significativo desta proteína no soro após a I/R.
121
Figura 32. Avaliação da expressão proteica da proteína DMGDH total e nitrada no córtex renal e no soro dos animais
antes e após a I/R.
A DMGDH é expressa apenas nos túbulos hepáticos e renais e é a segunda enzima
envolvida na degradação da betaína. Primeiro, a glicina betaína vinda da degradação da colina é
clivada em N-N-Dimetilglicina pela BHMT1/2 com formação de metionina. Então, a N-N-
Dimetilglicina é clivada em sarcosina na mitocôndria pela DMGDH. A expressão gênica da
DMGDH é altamente sensível a variações na osmolaridade (Hoffmann et al. 2013) e aumentos dos
metabólitos desta via, colina, glicina e metionina, já foram observados durante a análise
metabolômica desses mesmos animais. Interessantemente, a enzima de ação anterior a DMGDH,
a BHMT2, se confirmou nitrada no nitroproteoma do córtex renal e foi caracterizada como boa
candidata a biomarcador de LRA no proteoma total de urina (Malagrino et al. 2017). Estes
122
resultados mostram uma suposta ação da I/R renal sobre a via de degradação da betaína com
participação da nitração que deve ser melhor investigada.
4.2.4 Nitroproteoma da urina
Naturalmente, indivíduos saudáveis excretam pela urina algumas determinadas proteínas
e em baixas concentrações. As proteínas na urina em condições fisiológicas têm diversas origens.
Primeiramente, ela pode vir do resultado da subtração da quantidade de proteína que atravessou a
barreira glomerular menos a que foi absorvida pelos túbulos. Ou também pode vir de mais três
processos: secreção tubular de proteínas do sangue, sintetizada pelas próprias células renais e
liberadas na urina ou ser acrescentada em um estágio posterior, por exemplo, por excreção da
próstata do homem (Haraldsson et al. 2008). Porém, quando há uma I/R ou outro insulto renal, as
lesões geradas no rim podem causar um aumento na excreção de proteínas, sendo chamada de
proteínuria quando os valores são superiores a 30mg/g de albumina/creatinina.
Levando em consideração ambas as condições fisiológica e patológica, e o nosso
resultado de um estudo anterior mostrando um aumento na excreção das proteínas nitradas totais
durante a isquemia e início da reperfusão (Figura 33) (Malagrino et al. 2014), foram feitas as
análises do nitroproteoma da urina ao longo da I/R renal. Diferentes perfis urinários de proteínas
nitradas e suas expressões proteicas podem ser utilizados como indicadores de lesão e ainda, como
biomarcadores de doenças renais.
123
Figura 33. Excreção de proteínas nitradas/creatinina na urina ao longo da I/R renal. O gráfico mostra um aumento
significativo da excreção de proteínas nitradas no início da reperfusão – 15min (n=4). Todos os valores foram
apresentados como média±erro padrão da média. Análise para medidas repetidas (ANOVA) p<0,05, sendo *
comparado ao valor basal (Malagrino et al. 2014).
Inicialmente, no nitroproteoma da urina foram identificadas 178 proteínas que passaram
pela limpeza resultando em 126 proteínas. Para garantir uma melhor confiabilidade nos resultados
e evitar que o resultado fosse a representação de apenas um animal foram selecionadas as proteínas
que apareceram em pelo menos três dos quatro animais, independente do tempo analisado,
totalizando 27 proteínas.
A análise de agrupamento por similaridade de comportamento das expressões proteicas
classificou os cinco períodos analisados em dois grupos, juntando os períodos pré-isquemia com
6h pós reperfusão e isquemia com 11 e 16h pós reperfusão, como demonstrado no dendograma
vertical acoplado ao heatmap na figura 8. Além disso, foi possível observar no heatmap pequenos
agrupamentos de proteínas vindas da urina com alta ou baixa intensidade que diferenciam cada
período analisado, e podem ser importantes para a compreensão do processo de I/R renal. No
período de pré-isquemia, as intensidades das proteínas CP, UMOD, CLU, AGT, APOH, KIF1B e
ACTG1 reduziram com a I/R renal, enquanto TF, COL18A1, PFN1, FGA e ALB aumentaram.
Três proteínas SPATS2L, GLP2R e IgJ se elevaram no período isquêmico. Durante a reperfusão
foi destacado o aumento das proteínas MYOC, ALDOB, VCP, ANPEP e LCA5 em 6h pós
124
reperfusão e das proteínas TF e COL18A1 em 16h pós reperfusão; além do declíneo da HBB,
LDHB, HR, IGHM e C3 em 11h pós reperfusão. Quatro proteínas PNF1, FGA, ALB e IGKC
aumentaram em ambos os períodos: isquêmico, 11 e 16h pós reperfusão. Todas essas proteínas
foram mostradas no heatmap da Figura 34 e caracterizadas por suas funções na Tabela 9.
Figura 34. Excreção de proteínas nitradas/creatinina na urina ao longo da I/R renal. O dendrograma da vertical agrupa
os períodos mais similares da I/R, enquanto o dendograma da horizontal agrupa as proteínas com similares
comportamentos de expressão proteica. Os retângulos amarelos destacam os grupos de proteínas que mais diferenciam
os períodos de I/R renal. PreIsc = pre isquemia; Isc = isquemia; R6 = 6h pós reperfusão; R11 = 11h pós reperfusão;
R16 = 16h pós reperfusão. As proteínas foram representadas pelo nome dos seus genes.
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128
Os pequenos grupos de proteínas que diferenciaram o grupo pré-ischemia (16
proteínas) do grupo isquemia/11e16h reperfusão (9 proteínas) foram analisados, porém
as proteínas de ambas não foram representavivas de nenhuma via.
Então, para ter uma visão mais geral do que está sendo excretado durante a I/R,
todas essas proteínas urinárias encontradas foram analisadas juntas e são representativas
das principais vias de formação das proteínas nitradas: metabolismo do óxido nítrico,
espécies reativas de oxigênio e resposta ao estresse (Tabela 10).
Tabela 10. Análise de enriquecimento de vias metabólicas para as 27 proteínas
encontradas no nitroproteoma ao longo da I/R renal.
(Continua)
GO processo biológico
completo
Homo
sapiens
REF
(21042)
Proteínas
encontradas
(27)
Fisher
(p-valor) FDR Genes
Regulação positiva do
processo de
biossíntese da
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(GO:0045429)
39 3 2,08E-05 2,17E-02 HBB, AGT,
CLU
Regulação positiva do
processo metabólico
do NO (GO:1904407)
39 3 2,08E-05 2,03E-02 HBB, AGT,
CLU
Agregação plaquetária
(GO:0070527) 42 3 2,57E-05 2,23E-02
Homeostase da retina
(GO:0001895) 70 5 3,79E-08 2,96E-04
Regulação positiva do
processo biosintético
das ROS
(GO:1903428)
48 3 3,75E-05 2,79E-02 HBB, AGT,
CLU
Regulação do
processo biossintético
do NO (GO:0045428)
51 3 4,46E-05 3,02E-02 HBB, AGT,
CLU
Adesão homotípica
célula-célula
(GO:0034109)
55 3 5,53E-05 3,45E-02
Degranulação
plaquetária
(GO:0002576)
128 5 6,71E-07 1,31E-03
Homeostase tecidual
(GO:0001894) 177 5 3,15E-06 4,91E-03
Cascata de ativação
proteica (GO:0072376) 190 5 4,41E-06 6,26E-03
Homeostase da
estrutura
anatômica(GO:0060249
297 6 1,93E-06 3,35E-03
129
Continuação da Tabela 10. Análise de enriquecimento de vias metabólicas para as 27
proteínas encontradas no nitroproteoma ao longo da I/R renal.
(Continua)
GO processo biológico
completo
Homo
sapiens
REF
(21042)
Proteínas
encontradas
(27)
Fisher
(p-valor) FDR Genes
Homeostase organismal
multicelular
(GO:0048871)
304 5 4,07E-05 2,88E-02
Resposta imune humoral
(GO:0006959) 323 5 5,40E-05 3,51E-02
Exocitose regulada
(GO:0045055) 700 9 1,43E-07 7,44E-04
Regulação positiva da
biogênese do
componente celular
(GO:0044089)
502 6 3,67E-05 2,86E-02
Exocitose
(GO:0006887) 794 9 4,10E-07 1,07E-03
Secreção pelas células
(GO:0032940) 997 10 2,39E-07 7,44E-04
Secreção (GO:0046903) 1110 10 6,37E-07 1,42E-03
Regulação positiva da
organização do
componente celular
(GO:0051130)
1174 9 1,00E-05 1,31E-02
Transporte mediado por
vesículas (GO:0016192) 1921 13 1,85E-07 7,20E-04
Processo homeostático
(GO:0042592) 1557 10 1,31E-05 1,57E-02
Regulação da qualidade
biológica(GO:0065008 3779 18 3,42E-08 5,33E-04
Resposta ao estresse
(GO:0006950) 3456 14 2,47E-05 2,27E-02
HBB, IgJ
COL18A1,
UMOD,
FGA, AGT,
HIST1H4A,
APOH,CLU
ACTG1,
IGKC, VCP
ALB, C3
Transporte
(GO:0006810) 4446 16 1,85E-05 2,06E-02
Estabelecimento de
localização
(GO:0051234)
4559 16 2,58E-05 2,12E-02
As proteínas destacadas em negrito são as principais representantes da formação das proteínas nitradas.
FDR - taxa de falsa descoberta.
130
Entre estas proteínas urinárias, duas foram consideradas predominantemente
renais: Uromodulina (UMOD) com queda na expressão proteica pós I/R renal e Frutose-
bisfosfato aldolase B (ALDOB) com alta expressão em 6h pós reperfusão (Tabela 11).
Tabela 11. Valores brutos da intensidade de íons para ALDOB e UMOD.
ALDO
B
Pré
Isquemia
Isquemi
a
6h
Reperfusão
11h
Reperfusão
16h
Reperfusão
P2 0 1063700 0 0 0
P3 0 0 0 0 0
P4 0 0 757870 315390 0
P5 7059167 835990 77355333 2230500 1897600
Média 1764792 474923 19528301 636473 474400
UMO
D
Pré
Isquemia
Isquemi
a
6h
Reperfusão
11h
Reperfusão
16h
Reperfusão
P2 0 0 0 0 5073300
P3 0 289460 0 0 0
P4 876525 175320 0 0 0
P5 509576667
1377757
3 5000323 7392067 9398800
Média 127613298 3560588 1250081 1848017 3618025 Os valores das médias estão coloridos de vermelho, quanto maior a concentração de íons naquele período,
mais vermelha a média se encontra.
No nitroproteoma da urina no período pré-isquemia pode-se observar proteínas
comumente excretadas na urina e que eram nitradas provavelmente pelo metabolismo
oxidativo basal, reduzindo a sua excreção após I/R renal.
A primeira proteína encontrada reduzida após o período de pré-isquemia foi a
uromodulina (UMOD), também conhecida como Tamm-Horsfall, a proteína mais
abundante na urina de indivíduos saudáveis (Pennica et al. 1987). Ela é expressa quase
exclusivamente no rim pelas células epiteliais do ramo espesso da alça ascendente de
Henle (Bachmann et al. 1990) e do túbulo distal (Tokonami et al. 2018). Ela atua no
131
balanço hídrico, resposta inflamatória sistêmica e renal, comunicação intertubular,
cristalização mineral e adesão bacteriana (Raffi et al. 2005; Mo et al. 2007; El-achkar and
Dagher 2015). Além de atuar também no transporte de sódio e divalentes, modulando a
atividade do cotransportador de sódio-potássio-cloreto NKCC2 e a abundância do canal
de potássio ROMK2, (Craddock 1976; Renigunta et al. 2011). A dosagem de UMOD se
correlaciona bem com a função renal e pode ser usada como biomarcadora de doenças
renais (Micanovic et al. 2019). No transplante, a excreção de UMOD é reduzida em casos
de início tardio da função do enxerto e com rejeição aguda, e aumentada com a
recuperação da saúde renal (Kaden et al. 1994). Em dois estudos populacionais com
idosos, os autores demonstraram que baixas concentrações de UMOD urinária em idosos
estão associadas ao risco de doença renal progressiva e mortalidade, sendo este parâmetro
melhor do que os outros marcadores estabelecidos de doença renal (Garimella et al. 2015,
2017). Por fim, estudos em crianças e adultos submetidos à cirurgia cardíaca mostram
que menores níveis de UMOD urinária no pré-operatório têm maior risco de LRA pós-
operatória (Askenazi et al. 2012; Garimella et al. 2017). Novos estudos têm avaliado
também a concentração de UMOD sérica como biomarcadora de lesões renais (Risch et
al. 2014; Leiherera et al. 2017). Como a UMOD é produzida por células renais, a menor
concentração delas no soro pode refletir uma menor quantidade ou função das mesmas
em pacientes com doença renal (Risch et al. 2014), assim a mesma explicação também
pode ser sugerida sobre a UMOD na urina.
Outra proteína reguladora de eletrólitos que foi reduzida na urina após I/R renal
foi o angiotensinogênio ou a angiotensina. Como o peptídeo encontrado na análise do
nitroproteoma pertencia as duas proteínas, a angiotensina vem da clivagem do
angiotensinogênio, não foi possível identificar com certeza qual delas estava presente,
por isso, elas foram caracterizadas juntas. Tanto o angiotensinogênio quanto a
angiotensina participam do sistema renina-angiotensina (RAS), que é muito importante
para controlar a pressão arterial e inflamação. Na urina, a excreção de angiotensinogênio
tem sido descrita como um biomarcador de atividade excessiva de RAS em doenças renais
(Yamamoto et al. 2007a). Portanto, o aumento do angiotensinogênio urinário tem sido
relatado como um potencial biomarcador da deterioração da função renal em pacientes
com DRC e gravidade da doença bem como, já descrita também como um biomarcador
para LRA (Yamamoto et al. 2007a; Kobori et al. 2008; Alge et al. 2013; Ba Aqeel et al.
2017)
132
As apolipoproteínas H e J, mais conhecidas como beta-2-glicoproteína (APOH)
e clusterina (CLU) respectivamente, também reduziram após I/R renal. A APOH é
facilmente filtrada no glomérulo e detectada na urina devido à sua carga positiva no
plasma (Norden et al. 1991). O grupo de Flynn publicou vários estudos sobre a APOH na
urina como um biomarcador de disfunção tubular, encontrada aumentada em pacientes
diabéticos sem proteinúria clínica e em várias outras doenças tubulares renais (Norden et
al. 1991; Lapsley et al. 1993)
A CLU é uma das principais glicoproteínas dos fluidos fisiológicos expressa em
vários tecidos. No rim, a CLU é expressa nos mesmos túbulos que a UMOD e sintetizada
em resposta à lesão tubular (Witzgall et al. 1994; Hidaka et al. 2002; Kharasch et al. 2006;
Ishii et al. 2007; Yang et al. 2007). A CLU tem papel protetor na lesão renal, evitando o
acúmulo de lipídios e a apoptose de células renais (Zhou et al. 2010; Heo et al. 2018). A
deficiência desta proteína desenvolveu uma glomerulopatia progressiva em camundongos
idosos, caracterizada pela deposição de complexos imunes no mesângio (Rosenberg et al.
2002). A excreção urinária de CLU já foi detectada como um biomarcador de lesão de
isquemia-reperfusão renal , fribrose e preditor tanto de atraso na função do enxerto após
4h de reperfusão quanto de estágio final da doença renal de crianças com nefrite lúpica
(Witzgall et al. 1994; Zhou et al. 2010; Jung et al. 2012; Pianta et al. 2015; Wu et al.
2018).
A ceruloplasmina (CP) é uma metaloenzima portadora de cobre e ferro com
ação antioxidante em baixo estresse oxidativo e pró-oxidante sob estresse oxidativo grave
pela doação de íons livres de cobre (Shukla et al. 2006). Ela é secretada e expressa
principalmente no fígado, mas também pode ser encontrada nas células epiteliais parietais
glomerulares do rim e bexiga urinária (Wiggins et al. 2006). O aumento sérico/plasmático
de ceruloplasmina foi relatado em pacientes com doença cardiovascular, diabetes mellitus
tipo I e tipo II e síndrome metabólica (Cunningham et al. 1995; Daimon et al. 1998; Kim
et al. 2002; Harris 2004). Além disso, na urina, o aumento da ceruloplasmina é preditivo
do desenvolvimento de microalbuminúria em pacientes diabéticos normoalbuminúricos
(NARITA et al. 2004; Narita et al. 2006), e do desenvolvimento da DRC em pacientes
com anemia falciforme (Saraf et al. 2016). A nitração da ceruloplasmina encontrada em
nosso estudo já foi identificada por imunoprecipitação seguida de western blot no plasma
e ultrafiltrado de pacientes em terapia de hemodiálise (Mitrogianni et al. 2004; Piroddi et
al. 2011) e, provavelmente, é excretada na urina.
133
Dois tipos de proteína de motilidade foram encontrados nitradas e em alta
concentração no período de pré-isquemia, a proteína tipo Kinesina (KIF1B) e actina
citoplasmática 2 (ACTG1) que estão envolvidas em vários tipos de motilidade celular.
Estudos identificaram a actina nitrada em células endoteliais tratadas com IL-1β ou TNFα
(Boota et al. 1996; Ferro et al. 1997) e em controles e camundongos com anemia
falciforme (Aslan et al. 2003). Os autores do último estudo sugeriram que o aumento da
nitração pode alterar a polimerização da actina nas células.
O aumento da concentração de uma proteína nitrada pode ocorrer porque
aumentou a quantidade de proteína e de espécies nitrantes e foi possível nitrar um maior
número delas ou porque aumentou apenas a quantidade de espécies nitrantes.
No caso da UMOD nitrada, a diminuição pode ter ocorrido devido à redução da
UMOD total observada na análise do proteoma total da urina (Figura 35), visto que
ambas reduziram no mesmo tempo. Já no caso do FGA nitrado e total, ambos aumentaram
pós I/R, porém o FGA nitrado aumentou primeiro, logo após a isquemia, mostrando um
aumento da nitração sem o aumento da síntese proteica. Comportamento este, que
corrobora com a nossa idéia de que a proteínas nitradas podem ser biomarcadores mais
precoces que apenas a avaliação do total das mesmas.
Além de poderem responder mais rápido ao insulto, algumas proteínas nitradas
não acompanham a expressão de suas proteínas totais e podem ser usadas como
biomarcadoras independente da concentração da proteína total. Por exemplo, a expressão
proteica da APOH, ACTG1, AGT e CP nitradas diminuiram após a I/R renal enquanto a
expressão total das mesmas, avaliadas no proteoma total, aumentaram pós reperfusão,
sendo o resultado na nitração o oposto ao da quantidade de proteína total. Este resultado
mostra a importancia da nitração dessas proteínas no estado basal, podendo ter um papel
fisiológico sob a função dessas proteínas e ainda que essas proteínas nitradas podem ser
candidatas a biomarcadores.
134
Figura 35. Heatmap da expressão proteica nas urinas padronizada pelo z-score (-1,5 a 1,5) durante o
experimento de proteoma total urinário ao longo da isquemia e reperfusão (I/R) renal com seus
dendogramas. O dendrograma da vertical agrupa os períodos mais similares da I/R, enquanto o dendograma
da horizontal agrupa as proteínas com similares comportamentos de expressão proteica. PreIsc = pre
isquemia; Isc = isquemia; R6 = 6h pós reperfusão; R11 = 11h pós reperfusão; R16 = 16h pós reperfusão.
As proteínas foram representadas pelo nome dos seus genes. Estes resultados vieram de uma análise
complementar dos dados do proteoma total da urina desenvolvida na primeira parte desta tese.
Algumas proteínas são menos abundantes na urina de indivíduos saudáveis,
como a serotransferrina (TF), a cadeia alfa-1 do colágeno XVIII (COL18A1), a profilina1
(PFN1), a cadeia alfa do fibrinogênio (FGA) e a albumina (ALB). O aumento da excreção
dessas proteínas em sua forma nitrada pode indicar uma lesão ocasionada pela I/R renal.
Além disso, essas proteínas são muito abundantes no soro e podem refletir lesões na
barreira glomerular ou no transporte de proteínas do soro para urina por células tubulares,
podendo funcionar como um painel de biomarcadores para o diagnóstico de lesão renal.
A TF é uma glicoproteína responsável pelo transporte de ferro do intestino e do
fígado para todas as células em proliferação no corpo. O aumento dela na urina tem sido
135
associado ao desenvolvimento de glomeruloesclerose segmentar e focal (GESF) em
vários estudos (Nafar et al. 2014; Zhao et al. 2015) e diabetes tipo I em estágio avançado
apresentando retinopatia e nefropatia (Caseiro et al. 2014). A TF nitrada já foi identificada
no nitroproteoma de pacientes com doença renal (Piroddi et al. 2011).
Já o COL18A1 é um proteoglicano de sulfato de heparan presente na membrana
basal (MB). No rim, ele é encontrado na MB, incluindo a cápsula de Bowman, BM
glomerular, tubular e vascular e matriz mesangial (Kinnunen et al. 2011). O
COL18A1está envolvido na glomerulonefrite e é regulado positivamente após I/R renal
e transplante renal (Bellini et al. 2007; Rienstra et al. 2010). Na I/R renal, o COL18A1
aumenta a inflamação por facilitar o influxo de leucócitos e danos tubular (Zaferani et al.
2014). O COL18A1 nitrado já foi detectado em lesões ateroscleróticas humanas após
análise com anticorpo anti-nitrotirosina (Thomson, 2012).
A FGA é uma glicoproteína envolvida na coagulação sanguínea. É sintetizada
principalmente pelo fígado e é convertida em fibrina pela ação da trombina. Em estudos
in vitro, o fibrinogênio pode destruir o citoesqueleto de actina e induzir apoptose e
inflamação pela secreção de quimiocinas e citocinas em podócitos (Banas et al. 2008;
Motojima et al. 2010; Wang et al. 2018). Além disso, o acúmulo de FGA no rim promove
a fibrose tubulointersticial (Wang et al. 2017, 2018). Como biomarcador, os níveis
urinários de fibrinogênio em pacientes com glomeruloesclerose segmentar e focal foram
positivamente correlacionados com os níveis de proteinúria e podem prever a progressão
da DRC para o estágio final da doença (Wang et al. 2016, 2017). O FGA é a proteína
nitrada mais abundante no plasma de pacientes com doença renal (Piroddi et al. 2011).
Ela pode ser induzida por inflamação, produzir resposta imunogênica e está associada a
um alto nível de trombogenicidade (Parastatidis et al. 2008; Heffron et al. 2009).
A PNF1 atua como um regulador complexo de montagem de actina monomérica
(G-actina) em filamentos (F-actina) (Bubb et al. 2003; Pollard and Borisy 2003). Esta
proteína foi encontrada aumentada na urina de pacientes com doença renal policística e a
PNF1 sérica foi independentemente associada com disfunção endotelial, eventos
cardiovasculares e sobrevida de pacientes com DRC (Bakun et al. 2012; Eroglu et al.
2017). A PNF1 já foi nitrada in vitro e verificado que a nitração inibe a sua propriedade
sequestradora de actina, reduzindo a concentração de monômero de actina ligada a ela
(Kasina et al. 2005).
136
A ALB é a proteína mais abundante no soro/plasma (Hortin et al. 2008) e
responsável por manter a pressão oncótica do sangue e transportar hormônios, ácidos
graxos livres, cálcio e bilirrubina. A albuminúria e a taxa de filtração glomerular são as
principais análises feitas para o diagnóstico de doença renal e são fatores de risco para
LRA em pacientes com DRC (Grams et al. 2010). A ALB nitrada já foi observada no
plasma de pacientes com doença renal e na medula de ratos espontâneamente hipertensos,
cujo nível era mais alto do que os ratos wistars (Tyther et al. 2007; Piroddi et al. 2011).
In vitro, a albumina mostrou dois de dezoito resíduos de tirosina suscetíveis à nitração
(Jiao et al. 2001).
Entre as três proteínas urinárias selecionadas para o período de isquemia
destaca-se o receptor do peptídeo 2 tipo glucagon (GLP2R). A ativação deste receptor
promove a absorção de carboidratos, gorduras e proteínas digeridas. A expressão do
mRNA do GLP-2R em camundongos é mais alta no intestino para estimular o
crescimento e a proliferação das células intestinais, seguido da bexiga onde a função é
desconhecida (Drucker and Yusta 2014; El-jamal et al. 2014). O mecanismo de
sinalização do GLP2R no intestino e sua ação em outros órgãos precisam ser estudados.
Não foram encontradas evidência dessa proteína nitrada na literatura.
Durante a reperfusão, a aldolase B (ALDOB) é a principal candidata a
biomarcadora da lesão renal por ser predominantemente renal e envolvida na
gliconeogênese (Yañez et al. 2005). A ALDOB foi encontrada superespressa no
carcinoma de células renais comparada com o tecido não maligno adjacente (Perroud et
al. 2006). Até o momento, apenas a ALDOA foi identificada nitrada.
Por fim, algumas proteínas identificadas em nosso estudo, como UMOD, CP,
AGT, APOH, ALB, C3, TF e LDHB já estão sendo analisadas no projeto Targeted Urine
Proteome Assay for kidney diseases (TUPA), uma análise robusta de espectrometria de
massa por monitoramento por multiplas reações (MRM) para quantificar e validar
biomarcadores entre 167 proteínas urinárias (Cantley et al. 2016).
Os resultados do nitroproteoma da urina corroboram com os dados da literatura
de que estas proteínas estão relacionadas várias doenças renais e algumas já foram
descritas nitradas. Acrescentamos à literatura a identificação da GLP2R e ALDOB nitrada
e o uso de proteínas nitradas como candidatas a biomarcadoras de lesão renal por I/R,
visto que permite uma resposta mais rápida que a síntese de proteínas.
137
4.2.5 Abundância das proteínas nitradas no modelo de LRA por I/R renal
As proteínas mais abundantes no nitroproteoma do córtex renal, soro e urina foram
ilustradas na Figura 36. Devido a HBB ser uma proteína muito abundante no sangue, a
quantidade dela nos tecidos renais foi muito superior as demais proteínas do próprio
tecido e foi retirada da avaliação.
Figura 36. Box plots da expressão proteica das proteínas mais abundantes encontradas no nitroproteoma
para cada amostra. A. córtex renal, B. soro e C. urina. A expressão proteica foi calculada pela intensidade
dos íons.
138
Além de identificar as proteínas nitradas mais abundantes nos nitroproteomas,
podem-se analisar também proteínas descritas no nitroproteoma do soro e da urina que
não são comumente encontradas nessas matrizes e podem servir de biomarcadores de
LRA por I/R renal.
Entre as proteínas séricas com maiores intensidades de íons no nitroproteoma, a
TULP3 e SPTBN5 se destacam por não serem umas das 150 proteínas mais abundantes
do soro (Hortin et al. 2008). Ambas foram mais expressas na isquemia e início da
reperfusão, retornando ao estado basal após 16h de reperfusão. A TULP3 é expressa em
vários tecidos e funciona como um adaptador geral para o tráfico ciliar de proteínas
integrais de membrana, incluindo os receptores acoplados as proteínas G e ao complexo
PC1/2 de policistina causador da doença renal policística (Badgandi et al. 2017). Já A
SPTBN5 é uma proteína de citoesqueleto com alta expressão no cerebelo, cordão
espinhal, estômago, glândula salivar, fígado, pâncreas, rim, bexiga e coração (Stabach
and Morrow 2000). Estudos com a avaliação dessas proteínas em doenças renais devem
ser feitos para comprovar a presença delas no soro e o papel que elas exercem no rim e
nas doenças renais.
Ao avaliar as proteínas mais abundantes no nitroproteoma urinário, a única
proteína incomum de ser excretada em urina de humanos saudáveis é a GLP2R, receptora
do hormônio GLP2, um dos responsáveis pela captação de glicose (Adachi et al. 2006).
A GLP2R é pouco expressa no rim de suínos (Chai and Jiang 2015) e pode ter vindo de
outros tecidos afetados pela I/R renal.
139
4.2.6 Limitações do estudo
Primeiramente, a comparação dos nitroproteomas de córtex renal foi realizada
apenas entre o rim contralateral e o isquêmico do mesmo animal para garantir uma
homogeinidade na variação genética e ambiental. No entanto, o rim contralateral não pode
ser considerado como controle para este experimento, visto que ele sofre com a isquemia
de maneira indireta. A presença de um animal controle sham (falso operado) poderia
fornecer outras informações a este estudo, como por exemplo, se a nitração em ambos os
rins aumentou ou não com a I/R renal.
Em segundo lugar, como a isquemia e a nitração são heterogêneas, a análise do
rim inteiro seria recomendada, porém no caso de rins grandes como o de porcos, essa
análise ficou inviável. Para análise do nitroproteoma de córtex foram utilizados pequenos
fragmentos dos rins das porcas, um fragmento para espectrômetro de massas e outro
próximo para validação.
Por fim, estas proteínas nitradas e candidatas a biomarcadoras de LRA foram
encontradas por análise proteômica de descoberta (shotgun) e devem ser validadas por
técnicas alvo-específica como espectrometria de massas SRM/MRM, western blot ou
histologia.
140
4.2.7 Sumário dos resultados – Nitroproteoma
4.2.7.1 Córtex renal
- Concentração de nitrotirosina semelhante entre os rins contralateral e isquêmico;
- Localização das nitrotirosinas: citoplasma das células tubulares e tufos
glomerulares no rim contralateral e nas áreas sem NTA do rim isquêmico. Nas
porções com NTA, foram localizadas também no interior dos túbulos;
- Não há diferença na expressão de iNOS entre os rins;
- Foram identificadas 843 proteínas no nitroproteoma dos dois córtices renais
(contralateral e isquêmico);
o Nenhuma proteína exclusiva do rim isquêmico;
o 3 proteínas exclusivas do rim contralateral - Glutaril-CoA desidrogenase
mitocondrial (GCDH), Fosforibosilaminoimidazol carboxilase - (PAICS)
e Fosfoglucomutase-1 – (PGM1).
- 53 proteínas estavam superexpressas no rim contralateral
- 2 proteínas estavam superexpressas no rim isquêmico (Proteína A associada a
proteína de membrana associada a vesícula (VAPA) e Transferência de elétrons
flavoproteína-ubiquinona óxidoredutase, mitocondrial (ETFDH).
- Caracterização das 55 proteínas diferencialmente expressas:
o Caracterização funcional: a maioria eram oxiredutases, hidrolases, liases
e ligadas aos ácidos nucleicos;
o Caracterização de vias: representativas das vias energéticas - metabolismo
de aminoácidos e derivados, metabolismo da glicose e beta oxidação, com
destaque para o ciclo do ácido cítrico.
- 38% das proteínas nitradas eram mitocondriais.
- Não foi verificado diferença de concentração mitocondrial via análise de
expressão de VDAC1 e TOM20.
- 5 proteínas são predominantemente renais BHMT2, MME, ALDH1, DPPIV e
EHHADH e foram consideradas candidatas a biomarcador de lesão renal. DPPIV
e BHMT2 também foram identificadas como biomarcador na urina, porém sem a
nitração.
141
o Validação da nitração das 5 proteínas por ferramentas de predição de
nitrotirosina.
▪ Confirmada
o Validação experimental da nitração da BHMT2 e DPPIV
o Nitração confirmada, porém o mesmo não ocorreu para as concentrações.
Ambas se mostraram semelhantes entre os dois rins.
4.2.7.2 Soro
- Foram identificadas 55 proteínas no nitroproteoma do soro com diferentes tempos
de coleta pós I/R;
- A análise de agrupamento hierárquico identificou 2 grupos: pré-
isquemia/isquemia e períodos de reperfusão.
o Período isquêmico: aumento da expressão de oito proteínas (GORASP1,
AAR2, AKAP9, HBB, DMGDH, SEMG2, IGKV3-25, SEMG1)
representativas da regulação positiva da atividade da peptidase tipo serina
e da heterooligomerização proteica.
o Período Reperfusão: as 28 proteínas com maiores intensidades foram
altamente representativas dos processos biológicos bem descritos na I/R,
organização de membrana, regulação da resposta inflamatória aguda,
resposta ao estresse e modificação proteica pós-traducional;
- 2 proteínas são predominantemente renais e candidatas a biomarcador de lesão
renal: Dimetilglicina desidrogenase, mitocondrial (DMGDH) e Semenogelina-2
(SEMG2). Ambas as proteínas apresentaram uma alta expressão proteica no
período isquêmico com posterior queda após a reperfusão.
4.2.7.3 Urina
- Foram identificadas 126 proteínas;
- 27 proteínas foram representativas dos tempos, ou seja, estavam presentes em pelo
menos 3 animais
142
o Caracterização de vias: metabolismo do óxido nítrico, espécies reativas de
oxigênio e resposta ao estresse
- A análise de agrupamento hierárquico identificou 2 grupos: pré-isquemia com 6h
pós reperfusão e isquemia com 11 e 16h pós reperfusão;
- Além disso, foi possível observar pequenos agrupamentos de proteínas com alta
ou baixa intensidade que diferenciam cada período analisado, e podem ser
importantes para a compreensão do processo de I/R renal.
- Algumas proteínas identificadas em nosso estudo, como UMOD, CP, AGT,
APOH, ALB, C3, TF e LDHB já vem sendo estudadas como biomarcadores de
doença renal.
- 2 proteínas são consideradas predominantemente renais e podem ser boas
candidatas a biomarcador de lesão renal, Uromodulina (UMOD) com queda na
expressão proteica pós I/R renal e Frutose-bisfosfato aldolase B (ALDOB) com
alta expressão em 6h pós reperfusão. A UMOD já vem sendo utilizada como
biomarcador de lesão renal na literatura.
143
4.2.8 Considerações finais do Nitroproteoma
Usando como ferramenta a proteômica, nosso estudo identificou várias proteínas
nitradas, até então não descritas na literatura, e proteínas candidatas a biomarcadoras de
lesão renal por I/R renal.
Na avaliação do nitroproteoma dos córtices renais foi verificado que, embora a
quantidade de nitração proteica seja a mesma nos rins contralateral e isquêmico, as
proteínas alvos desta nitração são diferentes, sendo a maioria de origem mitocôndrial.
Diferente da análise feita no proteoma total, no nitroproteoma não é possível ter
certeza sobre alterações em vias analisando apenas as proteínas nitradas em conjunto. A
nitração na tirosina pode acarretar desde nenhuma alteração até ao aumento ou
diminuição da função proteica, a depender da proteína, agente nitrante e localização da
mesma, como foi dito anteriormente. Portanto, novos estudos avaliando a posição da
tirosina nitrada e a função dessas proteínas encontradas neste estudo devem ser feitos
futuramente.
Cinco proteínas nitradas e predominatemente renais foram identificadas no córtex do
rim como candidatas a biomarcador de lesão renal. Validamos a nitração das cinco
proteínas por bioinformática, sendo duas delas, a DPPIV e a BHMT2, também validadas
por outra técnica experimental. Porém, não conseguimos validar a diferença destas
proteínas entre os rins contralateral e isquêmico, mostrando a necessidade da validação
da técnica de espectrometria de massas com análise de descoberta usadas para
quantificação.
As proteínas nitradas séricas respondem bem ao insulto de I/R renal. No
nitroproteoma de soro, foi possível agrupar os períodos pré-isquemia/isquemia e os de
reperfusão e associar as proteínas do grupo reperfusão com processos biológicos bem
descritos na I/R: organização de membrana, regulação da resposta inflamatória aguda,
resposta ao estresse e modificação proteica pós-traducional.
A DMGDH, considerada predominantemente renal, aumentou no período isquêmico
e se tornou uma candidata a biomarcador sérico de LRA. Validações ainda são
necessárias.
Com o nitroproteoma da urina descrevemos pela primeira vez, a ALDOB e a GLP2R
nitradas e confirmamos a existências das outras.
144
Foi possível verificar que as proteínas nitradas excretadas na urina podem ter
comportamento distinto da análise da sua proteína total, enquanto uma proteína total está
baixa no tempo basal, a mesma proteína nitrada pode estar alta. Isso fornece mais
possibilidades de candidatas a biomarcadores.
A identificação de proteínas nitradas em período pré-isquêmico mostra a importância
da nitração em condições fisológicas normais e sugere que a nitração exerce um papel
fisiológico importante sob a função dessas proteínas, e também respondem bem a I/R
renal.
Por fim, as proteínas não comumente encontradas no soro TULP3 e SPTBN5 e na
urina GLP2R foram identificadas nitradas neste estudo.
5 CONCLUSÕES
147
Por meio da análise do proteoma e do nitroprotôma foi possível identificar: alterações
proteicas durante a I/R renal, novas proteínas nitradas e novas proteínas candidatas a
biomarcadores de doença renal que podem servir como biomarcadores não invasivos para
a disfunção renal.
Esses estudos de “ômica” são abrangentes e apresentam uma visão ampla do
comportamento geral molecular da célula ou do organismo, importantes para o
direcionamento de estudos futuros.
A partir dos resultados gerados, novos estudos com uma abordagem mais direcionada
e aprofundada devem ser desenvolvidos, tanto para confirmar os candidatos a
biomarcadores e seu potencial uso clínico, quanto para analisar o comportamento
patofisiológico e bioquímico da LRA por I/R renal em rins morfo-fisiologicamente
semelhantes aos encontrados em humanos.
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8 ANEXO 2
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9 ANEXO 3
Journal of Proteomics 151 (2017) 66–73
Contents lists available at ScienceDirect
Journal of Proteomics
j ourna l homepage: www.e lsev ie r .com/ locate / jp rot
Proteome analysis of acute kidney injury – Discovery of newpredominantly renal candidates for biomarker of kidney disease☆
Pamella Araujo Malagrino a,⁎,1, Gabriela Venturini a,1, Patrícia Schneider Yogi a, Rafael Dariolli a,Kallyandra Padilha a, Bianca Kiers a, Tamiris Carneiro Gois a, Karina Helena Morais Cardozo b,Valdemir Melechco Carvalho b, Jéssica Silva Salgueiro b, Adriana Castello Costa Girardi a,Silvia Maria de Oliveira Titan c, José Eduardo Krieger a, Alexandre Costa Pereira a,⁎a Laboratory of Genetics and Molecular Cardiology, Heart Institute, University of São Paulo Medical School, São Paulo, SP, Brazilb Grupo Fleury, São Paulo, SP, Brazilc Renal Division, Department of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of São Paulo Medical School, São Paulo, SP, Brazil
☆ Financial Support: Fundação de Amparo a Pesquisa (05447-0, 2012/12042-7, 2013/13526-0, 13/17368-(25000180672/2011-81) and Fleury Group/FINEP (09.14.⁎ Corresponding authors at: Lab. of Genetics and Mole
Institute (InCor), University of São Paulo Medical Scho05403-000 São Paulo, SP, Brazil.
E-mail addresses: [email protected] (P.A. [email protected] (A.C. Pereira).
URL's: http://genetica.incor.usp.br/ (P.A. Malagrino), h(A.C. Pereira).
1 These authors contributed equally.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2016.07.0191874-3919/© 2016 Elsevier B.V. All rights reserved.
a b s t r a c t
a r t i c l e i n f oArticle history:Received 18 January 2016Received in revised form 12 May 2016Accepted 18 July 2016Available online 22 July 2016
The main bottleneck in studies aiming to identify novel biomarkers in acute kidney injury (AKI) has been theidentification of markers that are organ and process specific. Here, we have used different tissues from a con-trolled porcine renal ischemia/reperfusion (I/R) model to identify new, predominantly renal biomarker candi-dates for kidney disease. Urine and serum samples were analyzed in pre-ischemia, ischemia (60 min) and 4,11 and 16 h post-reperfusion, and renal cortex samples after 24 h of reperfusion. Peptides were analyzed onthe Q-Exactive™. In renal cortex proteome, we observed an increase in the synthesis of proteins in the ischemickidney compared to the contralateral, highlighted by transcription factors and epithelial adherens junction pro-teins. Intersecting the set of proteins up- or down-regulated in the ischemic tissue with both serum and urineproteomes, we identified 6 proteins in the serum thatmay provide a set of targets for kidney injury. Additionally,we identified 49, being 4 predominantly renal, proteins in urine. As prove of concept, we validated one of theidentified biomarkers, dipeptidyl peptidase IV, in a set of patients with diabetic nephropathy. In conclusion, weidentified 55 systemic proteins, some of them predominantly renal, candidates for biomarkers of renal disease.Biological significance: The main bottleneck in studies aiming to identify novel biomarkers in acute kidney injury(AKI) has been the identification of markers that are predominantly renal. In fact, putative biomarkers for thiscondition have also been identified in a number of other clinical scenarios, such as cardiovascular diseases, chron-ic kidney failure or in patients being treated in intensive care units froma number of conditions. Herewe proposea comprehensive, sequential screening procedure able to identify and validate potential biomarkers for kidneydisease, using kidney ischemia/reperfusion as a paradigm for a kidney pathological event.
© 2016 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords:Acute kidney injuryKidney diseaseRenal ischemiaProteomeBiomarkersDPPIV
FAPESP – 2011/04344-0, 2012/0), Proadi SUS Samaritano0055.00).cular Cardiology/LIM 13, Heartol, Av. Dr. Enéas C. Aguiar 44,
rino),
ttp://genetica.incor.usp.br/
1. Introduction
Acute kidney injury (AKI) is a serious complication that is increasingworldwide, affecting afifth of hospitalized adults and associated tomor-tality rates of about 20% [1]. AKI diagnosis ismainly based on the changeof serum creatinine levels and urine output. However, both increasedserum creatinine levels and urine output reduction only become evi-dent when more than 50% of renal function is lost [2]. Furthermore,changes in serum creatinine are not specific for AKI, and their levelsare affected by various non-renal factors such asmusclemass, diet, gen-der, medication use and age.
Efforts for the identification of an early biomarker for kidney dis-eases are increasing during the last years, and proteomicsmay be a use-ful tool for the discovery of new biomarkers [3]. In addition, it is possible
67P.A. Malagrino et al. / Journal of Proteomics 151 (2017) 66–73
that markers identified in one disease model may be useful to predictother conditions also associated with kidney function deterioration. Itis thus of great interest that biomarkers identified, for instance, in AKIcan add information to chronic kidney disease patients.
Proteins such as neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL),kidney injury molecule 1 (KIM-1), interleukin 18 (IL-18), liver fattyacid-binding protein (L-FABP) and insulin-like growth factor-bindingprotein 7, IGFBP7 [4,5], have recently emerged as potential candidatesfor AKI biomarkers in different studies. Despite these molecules havinga good sensitivity, they are not specific to AKI diagnosis, changing in var-ious other clinical conditions [4,6]. This lack of specificity is, indeed, oneof themain bottlenecks for theuse and adoption of newly described kid-ney disease biomarkers [7].
Suitable animal models, such as pigs [8], can help in the identifica-tion of specific biomarkers for kidney disease. Here,we have used differ-ent tissues from a controlled, unilateral, percutaneous porcine renalischemia/reperfusion (I/R) model to identify new, predominantlyrenal, biomarker candidates for kidney disease. In addition, we wereable to validate newly identified proteins in human samples of patientswith impaired kidney function.
2. Methods
2.1. Chemicals and reagents
Urea (Sigma, catalog number U5128); Protease Inhibitor Cocktail(Sigma, catalog number P8340); Phosphatase Inhibitor Cocktail 1(Sigma, catalog number P5726); Phosphatase Inhibitor Cocktail 2(Sigma, catalog number P0044); BCA Protein Assay Detects Protein kit(Pearce, catalog number 23227); Microcon® YM-30 (Millipore, catalognumber 42410); Iodoacetamide (Sigma, catalog number I6125); Am-monium Bicarbonate (Sigma, catalog number A6141); Trypsin(Promega, catalog number V511A); NaCl (Sigma, catalog number793566); TFA (Sigma, catalog number 40967); Acetonitrile (Sigma, cat-alog number 34967); HiTrap Blue high-performance column (Ref 17-412-01, GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Sweden); Protein A HPSpinTrap (Ref 28-9031-32, GE Healthcare Life Sciences, Uppsala, Swe-den); Amicon®Ultra-4 Centrifugal Filter Units (MerckMillipore, catalognumber UFC800308); Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad ProteinAssay, Hercules, CA, USA, catalog number 5000006); RapiGest SF deter-gent (Waters catalog number 186001861); DTT (Thermo Fisher scien-tific catalog number 15508-013); Glass Vials (Waters total recoveryvial catalog number 186000385c). H-Gly-Pro-pNA tosilate (Bachem cat-alog number L-1295.0250). P32/98 DPP IV inhibitor (Abcam catalognumber ab141724).
2.2. Animals
We have previously developed a swine model of unilateral renalischemia and reperfusion (I/R) aimed at biomarker identificationfor the condition in accordance with the ethical principles in animalresearch of the Brazilian College of Animal Experimentation and ap-proved by the Institutional Ethics Committee (CAPPesq Protocol179/11).
Animal model experiments were conducted according to Malagrinoand collaborators [9]. Briefly, five female pigs (Sus scrofa domesticus 15–20kg)were submitted to unilateral renal I/R. Initially, a 6Fmultipurposeguide-catheterwas introduced in the right femoral artery until the rightrenal artery. After an angiography, a balloon-catheter was introducedtogether with guide-catheter and inflated for 120 min (ischemia),followed by deflation (reperfusion) for 24 h. After reperfusion, the is-chemic and contralateral kidneys were collected. Fifty milliliters ofurine were collected directly from the bladder and serum was sampledfrom the inferior vena cava above the renal veins. In our model, urineand serum samples came from both the ischemic and contralateral kid-neys. This was done, as opposed to the selectively collection from the
ischemic kidney, in order to detect subtle biochemical changes generat-ed by renal I/R that could be used as an early, and systemic, biomarkerfor kidney disease. The ischemic and contralateral kidney sampleswere analyzed after 24 h of renal I/R. In addition, urine and serum sam-ples were analyzed in five periods: pre-ischemia (immediately beforerenal artery occlusion, 0min), ischemia (60min after renal artery occlu-sion), 4 h post-reperfusion, 11 h post-reperfusion and 16 h post-reper-fusion. These collection timeswere chosen based on representative timepoints regarding the increase in serum creatinine levels as showed inprevious work from our group [9].
Briefly, during ischemia/reperfusion, there were observed increasesin serum creatinine, serum neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL), fractional excretion of sodium, potassium and chloride andincreases in urinary glucose and protein. AKIwas confirmed by histolog-ical analysis.
2.3. Renal cortex protein extraction
Renal cortex proteins were extracted, with few modifications, ac-cording to Wiśniewski and collaborators [10]. Briefly, proteins wereextracted from 50mg of renal cortex from ischemic and contralateralkidneys with 400 μL of SDT-lysis buffer 4%(w/v) SDS, 100 mM Tris/HCl pH 7.6, 0.1 M DTT plus 7 M urea, proteases inhibitor (PMSF0.1% and Protease Inhibitor Cocktail) and phosphatases inhibitor(Phosphatase Inhibitor Cocktail 1 and Phosphatase Inhibitor Cocktail2). This mix was lysed in Precellys® (5000 rpm, two cycles of 20 s,and 5 s of stop between cycles), warmed at 95 °C for 4 min andsonicated. This procedure was repeated, followed by centrifugationat 16,000 ×g for 5 min at 4 °C. Proteins were measured by BCA Pro-tein Assay Detects Protein kit.
2.4. Renal cortex protein digestion
500 μg of protein were submitted to 30 KDa filters which werepreviously washed twice with urea buffer (8 M urea in 0.1 M Tris/HCl pH 8.5). Samples were centrifuged at 14,000 ×g for 15 min andwashed with 200 μL of urea buffer. Following, cysteines werealkylated with 100 μL of 0.05 M iodoacetamide (IAA) in urea bufferfor 20 min at room temperature in the dark. Excess of IAA wereremoved by centrifugation at 14,000 ×g for 10 min. Samples werewashed twice with 100 μL of urea buffer and 100 μL of 0.05 M ammo-nium bicarbonate. After centrifugation, proteins were digested withtrypsin (enzyme to protein ratio 1:100) for 16 h. The filter units werepassed to a new tube, centrifuged and 50 μL of 0.5 M NaCl was added.To acidify the peptides, after centrifugation, 0.1% TFA and 3% acetoni-trile were added.
2.5. Serum sample preparation
To remove the abundant serum proteins, such as albumin and im-munoglobulin, HiTrap Blue high-performance column and Protein AHP SpinTrapwere used following themanufacturer's protocol. After en-richment, 200 μL of serum in Hitrap Blue and 100 μL of serum in ProteinA HP SpinTrap were mixed, volume was reduced in Speedvac, and theproteins were quantified using the BCA kit.
2.6. Urine sample preparation
First, urine samples collected over the renal I/R protocol were centri-fuged at 2950 ×g for 10 min at 4 °C to remove cell debris. The superna-tants were aliquoted and stored at−20 °C.
After thawed, to concentrate and desalt, fourmilliliters of each urinesample were washed three times with ammonium bicarbonate 50 mMpH 8 (1:1) in a 3 kDa centrifugal filter. The volume was reduced to ap-proximately 500 μL. The proteins from each sample were quantifiedwith a Bradford Protein Assay Kit (Bio-Rad Protein Assay, Hercules,
Fig. 1. Flowchart used in the identification of kidney dysfunction biomarker candidates. Initially, proteinswerefiltered and selected by its presence in at least 3 animals. Following, differentmean values between contralateral and ischemic kidney were tested and subsequent systems biology analysis (SB) performed. In serum and urine, proteins were only selected forsubsequent analysis if they were first identified after ischemia. The proteins that appeared only after ischemia in urine and appeared or disappeared only after ischemia in serum werecompared with differently expressed renal proteins. Finally, proteins selected in the last step were compared with the Tissue-specific Gene Expression and Regulation's (TiGER)database for analysis of predominantly renal proteins.
68 P.A. Malagrino et al. / Journal of Proteomics 151 (2017) 66–73
CA, USA) and fifty micrograms of protein from each sample was lyoph-ilized in Speedvac.
2.7. Serum and urinary digestion
Urine and serum samples were digested, with few modifications, ac-cording to [11]. We resuspended 50 μg of total protein in 50 μL of50 mM ammonium bicarbonate, denatured with RapiGest SF detergent0.2% for 15 min at 80 °C, reduced the sulfate bonds with 2.5 μL of100 mM DTT at 60 °C for 30 min and alkylated with 2.5 μL of 300 mMiodoacetamide incubated for 30min at room temperature in the dark. Fol-lowing, proteins were enzymatically digested with 10 μL of trypsin0.05 μg/μL for 16 h at 37 °C. To stop the digestion and hydrolyze theRapiGest we added 10 μL of 5% TFA and incubated the sample for90 min at 37 °C. Finally, the tryptic peptide solution was centrifuged at16,000g for 30 min at 6 °C, transferred to glass vials and added 85 μL ofa solution 3% acetonitrile and 0.1% TFA.
2.8. LC-ESI-MS/MS
Analyses were performed on a Thermo Scientific Q Exactive™ (SanJose, USA) mass spectrometer coupled to nanoACQUITY UPLC Waters(Milford, MA, USA). For chromatographic runs, 2 μL were loaded ontoa PST C18 nanoACQUITY Trap column (180 μm × 20 mm) with flowrate set to 15 μL/min of 0.1% (vol/vol) trifluoroacetic acid during3 min. Analytic separation of the peptides was performed using ananoACQUITY UPLC HSS C18 Column (1.8 μm, 75 μm × 150 mm), in alinear 90 min gradient from 1% ACN/0.1% formic acid to 60% ACN/0.1%formic acid, at flow rate of 0.5 μL/min. Spectra were acquired over m/z300–2000 at 70,000 resolution (m/z 200) and data-dependentacquisition selected the top 10 most abundant precursor ions fortandem mass spectrometry by high-energy collision dissociation(HCD) fragmentation using an isolationwidth of 1.2 Da, collision energyof 30, and a resolution of 35,000. We analyzed once each biologicalreplicate.
Fig. 2. Function analysis of the 535 proteins of renal cortex that exhibited different protein expression between ischemic and contralateral kidneys. Pie chart. The numbers in the pie chartrepresent the percentage number of proteins in the respective functional category based in gene ontology and UniProt.
69P.A. Malagrino et al. / Journal of Proteomics 151 (2017) 66–73
2.9. Database search and bioinformatic analysis
Maxquant version 1.5.1.2 was used to process the raw data for pep-tide and protein identification (Cox & Mann, 2008, http://www.maxquant.org). Andromeda used Uniprot Complete Proteome Humanreference (Human 9606 with access in January 2015). MS/MS databasesearchwas performed using default settings, with a 10 ppmmass toler-ance for the main search. Cysteine carbamidomethylation was selectedas a fixedmodification and acetyl NH2-terminal and oxidation (methio-nine) were selected as variable modifications. Trypsin was selected asthe protease, with up to twomissed cleavages allowed. Results were fil-tered by a 0.01 false discovery rate at both protein and peptide levels.The minimum length of acceptable identified peptides was set asseven amino acids. The contaminants were eliminated based on a li-brary of contaminants from MaxQuant. Proteins with p-value differentfrom 1 were accepted. Label-free quantification was obtained throughnormalized (LFQ) data in MaxQuant.
2.10. Statistical analysis
For the analysis of renal proteins, only proteins present in at least 3animals in the same group (contralateral or ischemic)were used. PairedStudent's t-testwas used to comparemeans between ischemic and con-tralateral kidney. The two-tailed test with p b 0.05 and false discoveryrate (FDR b 0.05) was considered significant. Statistical analyses wereperformed in metaboanalyst 3.0 [12,13] (www.metaboanalyst.ca). Forthe analysis of urinary and serum proteins we used only proteins
Fig. 3. Proteins that appeared and diappered in serumafter ischemia and reperfusion andwere frepresent higher values (red=missing).
identified in at least 3 different animals at any time, that appeared ordisappeared after ischemia. Predominantly renal classification wasbased on the Tissue-specific Gene Expression and Regulation's (TiGER)database of Johns Hopkins University. The tissue-specific genes fromTiGER were based on the expression enrichment and statistical signifi-cance of expressed sequence tags (ESTs) [14]. Study flowchart can beobserved in Fig. 1. Spearman's correlation and Mann-Whitney U testwere performed in SPSS 17.0 for DPP IV activity analysis. p-Values b 0.05 were considered significant.
2.11. Pathways and network analysis
Kidney proteins were classified into functional categories based ongene ontology [15] and Uniprot (http://www.uniprot.org) accessed Oc-tober 2015. Statistically significant proteins regarding the describedcontrasts were also analyzed in Ingenuity Pathway Analysis (IPA - Inge-nuity Systems Inc., Redwood City, CA, USA) (http://www.ingenuity.com) for the characterization of canonical pathways related to renal I/R, and the relationship between these proteins with transcriptionfactors andmetabolites in the IPA's database (systems biology analysis).This program calculates the association between identified proteins andcanonical pathways by using a Fisher's Exact Test, here considered to besignificant for a p-value b 0.01.
2.12. Validation in patients with diabetic nephropathy
This analysis used urine samples of the baseline clinical andlaboratorial variables from the clinical trial (NCT 00419835) designed
ound changed in ischemic kidney.Warm colors represent the lowest values and cool colors
Fig.
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in order to compare the effect of association therapy of ACE inhibitorplus angiotensin II receptor blocker versus monotherapy with ACE in-hibitor on proteinuria progression [16].
For this study, fifty-six patients with macroalbuminuric diabetic ne-phropathy seen at the Nephrology Outpatient Service in the Hospitaldas Clínicas, Sao Paulo, were used. All these patients presented diabetesmellitus formore than 5 years and proteinuria above 500mg/day (threeprevious measurements). Before the clinical trial, fast serum and early-morning spot urine were collected, centrifuged, aliquoted and stored at−20 °C. Serum albumin was determined by electrophoresis testing andserum creatinine concentrations were determined by the Jaffé reaction.Glycated hemoglobin was measured by high-performance liquid chro-matography. All other laboratorial variables were determined usingconventional laboratorial techniques. Exclusively for this study, glomer-ular filtration rate was estimated by Modification of Diet in Renal Dis-ease (MDRD) using four variables: serum creatinine, age, race, andgender.
2.13. DPPIV activity assay
Urine DPPIV activity assaywas an adaptation of serum analysis, pre-viously described [17]. Fifty microliters of urine were incubated with150 μL of substrate (H-Gly-Pro-pNA tosylate 2.0 mmol/L) diluted inTris-HCl buffer (10 mM, pH 7.6) at 37°C for 1 h. To stop the reaction,200 μL was used sodium acetate buffer (0.5 mol/L, pH 4.2). The resultof the hydrolysis reaction of the substrate wasmeasured spectrophoto-metrically at absorbance 405 nm. All samples were performed induplicate.
3. Results and discussion
3.1. Renal cortex proteome
We identified 1425 proteins present in the renal cortex proteome.After cleaning by contaminants, reverse sequence comparison, putative,duplicate proteins and removingnon-annotated proteins, 1365proteinsremained. From these proteins, 868 were present in at least three bio-logical replicates. From these, 535 proteins were differentially quanti-fied between the ischemic and non-ischemic kidneys (Table 1 inSupplement). These were classified according to function. Ribosomalproteinswere themost abundant protein category (9%), followed by cy-toskeletal proteins (8%), dehydrogenases (7%), oxidoreductases (6%),transporters (5%), hydrolases (5%) and chaperones (4%) (Fig. 2).
Fig. 5. Functions analysis of the 49 urinary proteins candidates to AKI biomarkers. Pie chart. Tfunctional category based in Geneonthology and UniProt.
Top canonical pathway analysis based on the percentage of proteinsidentified through our study and the entire set of proteins in each path-way showed strong evidence for enrichment of proteins from the EIF2signaling (p-value 1.25×10−42 overlap of 29.7%), remodeling of epithe-lial adherens junction (p-value 6.05 × 10−24 overlap of 38.2%), epitheli-al adherens junction signaling (p-value 9.86 × 10−21 overlap of 21.9%),regulation of eIF4 and p70S6K signaling (p-value 1.15 × 10−17 overlapof 19.9%) and phagosome maturation pathways (p-value 5.97 × 10−17
overlap of 21.7%).Except from NADH dehydrogenase and Xaa-Pro aminopeptidase 2,
the other differentially expressed proteins were increased in ischemickidneys. These data suggest an increase in the transcription and transla-tion process of proteins, which was subsequently reinforced by theenriched pathways (EIF2 signaling and regulation of eIF4 and p70S6Ksignaling).
The increased expression of various proteins, mainly cytoskeletal,ions and nutrient transporter and chaperones are essential for therestructuring from the lost tubules in the first moment [18]. After celldifferentiation and rearrangement of the cytoskeleton, as cell-cell andcell-basal laminin reconnects, growth factors can act through prolifera-tion of new epithelial cells and tubular restructuring. Our data suggestthat after 24 h of renal I/R, the ischemic kidney cortex have alreadybegan its recovery process, showed by the increase in transcription pro-teins and proteins of epithelial adherens junction. Our study corrobo-rate other study that also showed kidney regeneration after 24 h postI/R with the increase of nephrogenic protein expression [19].
3.2. Serum proteome
We identified 251 proteins in the depleted serum proteome. One-hundred and seventy remained after filtering. From these, we selected136 present in at least three animals, regardless of analysis time, to en-sure that the difference in expressionwas not a variation present in onlyone individual.
In order to find biomarkers for kidney dysfunction, first we selectedonly proteins that appeared (51 proteins) or disappeared (16 protein)after renal I/R, e.g., quantification is zero in pre-ischemia time or zeroin ischemia, 4 h post-reperfusion, 11 h post-reperfusion and 16 h post-reperfusion, respectively. Comparing these proteins selected in theserumwith the proteins differentially expressed in the renal cortex pro-teome, we identified six common proteins as potential candidates (heatshock-related 70 kDa protein; 60 kDaheat shock protein,mitochondrial;collagen, type I, alpha 1; vimentin; plastin-2 and triosephosphate
he numbers in pie chart represent the percentage number of proteins in the respective
Table 1Spearman's correlation between DPPIV activity in urine and biochemical parameters ofpatients with macroalbuminuric diabetic nephropathy (56 patients).
Clinical and biochemical parameters Correlation coefficient p-Value
Age 0.10 0.46Body mass index −0.10 0.45Serum sodium −0.08 0.54Serum potassium −0.53 0.70Serum calcium 0.02 0.89Serum phosphorus −0.26 0.07Serum urea −0.22 0.10Serum creatinine −0.23 0.08Glycemia −0.17 0.20Glycated hemoglobin −0.33 0.01⁎
PTH −0.44 0.00⁎
Albumin EFP −0.18 0.21Uric acid 0.07 0.63RBP 0.08 0.56Renin −0.27 0.04⁎
25OH-vitamin D −0.01 0.96Proteinuria 0,30 0.02⁎
MDRD 0.28 0.03⁎
PTH= parathyroid hormone. EFP= electrophoresis fraction protein. RBP= retinol bind-ing protein. MDRD = modification of diet in renal disease.⁎ p b 0.05.
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isomerase) (Fig. 3). Heat shock 70 and 60 kDa were widely expressedafter ischemia, thought to protect against reactive oxygen species [20,21]. Collagen type I collaborates with glomerulosclerosis [22] and itwas also found as a candidate AKI biomarker in urine. Finally, vimentinis a marker of fully dedifferentiated renal epithelia and may be a re-sponse to kidney regeneration [19]. Plastin-2 and triosephosphate isom-erase have been reported as biomarkers of early detection of malignantkidney tumors [23] and renal cell carcinomas [24]. Unfortunately, allproteins are also widely expressed in most tissues (TiGER's database).
3.3. Urinary proteome
Urinary proteins have been considered excellent biomarkers for kid-ney diseases because sampling is noninvasive and they directly reflectthe physiological state of the kidney. In this studywe identified 604 pro-teins in theAKI urinaryproteome. Afterfiltering, 501proteins remained.To reduce the odds of false positive findings, we selected the 346 pro-teins that were identified in at least three different animals, regardlessof analysis time.
For downstream analysis, we only selected proteins that were ex-creted in urine after renal I/R (192 proteins) and that appeared changedin the ischemic kidney: a total of 49 proteins (Fig. 4).
The most abundant protein categories in our selected candidateswere: oxidoreductases, cytoskeletal proteins, hydrolases and chaper-ones, that corresponded to half of all proteins found. (Fig. 5). Canonicalpathway analysis showed that remodeling of epithelial adherens junc-tion (p-value 1.49 × 10−5 overlap of 5.9%), glycolysis (p-value2.20 × 10−5 overlap of 12%) and gluconeogenesis (p-value2.20 × 10−5 overlap of 12%) pathways were enriched in the selectedprotein set. Alfa-actinin 4 and Rho GDP-dissociation inhibitor 1were as-sociated to glomerular injury (p-value 3.59× 10−2, and 2.19 × 10−3, re-spectively) in the list of possible kidney toxicity molecules, andproactivator polypeptide was associated to renal degradation (p-value2.19 × 10−3) showing the association of these proteins with kidneydisease.
To increase the specificity of the identified urinary biomarkers,we compared our forty-nine selected proteins with the kidney tis-sue-specific gene list from TiGER's database. Only four proteinswere considered kidney specific: aromatic-L-amino-acid decarboxyl-ase (AADC), S-methylmethionine–homocysteine S-methyltrans-ferase BHMT2 (BHMT2), cytosolic beta-glucosidase (GBA3) anddipeptidyl peptidase IV (DPPIV). AADC is expressed in the proximaltubule and catalyzes the decarboxylation of aromatic amino acids.The importance of this protein to the kidney is its role in the synthe-sis of dopamine, which is responsible for diminishing the kidneydamage caused by the excess of angiotensin II [25]. BHMT2 convertshomocysteine to methionine. Interestingly, the increase in methio-nine in patients with AKI has been significantly associated with
Fig. 6. Absorbance of urinary DPPIV activity during renal I/R. p b 0.05. Post-rep =postreperfusion.
mortality [26] and this metabolite was also elevated in serum inthe ischemic period metabolomic study conducted with these sameanimals [37]. GBA3 is an enzyme that hydrolyzes various β-D-gluco-sides with the release of beta-D-glucose [27]. These 3 proteins havenot yet been associatedwith AKI, or suggested to work as biomarkersfor the condition.
Finally, dipeptidyl peptidase IV (DPPIV), also known as CD26, is apeptidase responsible for dipeptide removal from the amino terminusof a number of peptides [28]. Different from the other proteins, DPPIVhas been previously described as modified in other kidney diseases[29,30] and, nowadays, DPPIV inhibitors are widely used in diabetictreatment, due to the role of DPPIV on glucose homeostasis. Interesting-ly, DPPIV inhibition improves kidney function after renal I/R injury inrats [31] and preserved the renal function in patients with heart failure[32] independently of glucose control. In a recent study describing thedevelopment of a targeted urine proteome assay for kidney diseasesonly DDPIV from our specify proteins set was part of this panel [33].Most DPPIV expression is found in the kidney proximal tubule andsmall intestine, although it can also be found to a lower extent inlungs, pancreas, liver, spleen, stomach and heart [34,35]. However, astudywithmicrovesicle-boundDPPIV in urine suggested that the excre-tion of DPPIV can come from tubular epithelial cells and hence be relat-ed to early tubular impairment [36]. Based on these observations, DPPIVwas selected among the four candidates for validation.
Our data show that the urinary DPPIV activity is significantly in-creased after 4 h of ischemia, recovering to basal activity after this peri-od (Fig. 6).
In addition to validation of DPPIV in urine in our model, we also de-scribe the relation between this potential biomarker andmeasures asso-ciated with kidney function in a small cohort of humans with kidneydisease. Significant correlations were found between urine DPPIV activ-ity and MDRD (correlation coefficient = 0.28), glycated hemoglobin –glycatedHb (correlation coefficient=−0.33), urinary protein (correla-tion coefficient= 0.22), parathyroid hormone - PTH (correlation coeffi-cient = −0.44) and renin (correlation coefficient = −0.28) (Table 1).
These new results add to the overall description of biomarker iden-tification pointing towards the usability of these newly identified pro-teins as clinical tools for disease stratification.
New studies are also important for validation of the other bio-markers that, in addition to DPPIV, can contribute to a better diagnosisand prognosis of kidney injury.
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4. Conclusions
We describe four urinary proteins with predominantly renal geneexpression that are altered in response to controlled kidney I/R andcan be biomarkers of kidney dysfunction. Three of these proteins wererelated to AKI for the first time in our work.
Altogether, this integrative proteome analysis can provide a panel ofpotential and predominantly renal biomarkers inmany levels, consider-ing changes that occur in the tissue and echo in serum and urine proteinprofiles. Therefore, through proteome analysis we could identify newcandidates to kidney disease that can serve as non-invasive biomarkersfor kidney dysfunction. Future studies with target analytical toolsshould be developed to validate these findings and identify which ofthe described proteins have clinical potential as non-invasivebiomarkers.
Supplementary data to this article can be found online at http://dx.doi.org/10.1016/j.jprot.2016.07.019.
Financial support
This studywas funded by Fundação de Amparo a Pesquisa (FAPESP –2011/04344-0, 2012/05447-0, 2012/12042-7, 2013/13526-0, 13/17368-0), Proadi SUS Samaritano (25000180672/2011-81) and FleuryGroup/FINEP (09.14.0055.00).
Conflict of interest
The authors declare no conflict of interest.
Limitations, reasons for caution
These biomarkers candidates were found by shotgun proteomicsanalysis and a target analysis should be performed to confirm thesebiomarkers.
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