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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E BIOLOGIA
CELULAR
PADRÕES DE DISTRIBUIÇÃO DE HETEROCROMATINA E REGIÕES
ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS EM “CASCUDOS”
(SILURIFORMES, LORICARIIDAE) DO RIO XINGÚ
EMANOEL OLIVEIRA DOS SANTOS
BELÉM – PARÁ 2006
Livros Grátis
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NEUROCIÊNCIAS E BIOLOGIA
CELULAR
PADRÕES DE DISTRIBUIÇÃO DE HETEROCROMATINA E REGIÕES
ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS EM “CASCUDOS”
(SILURIFORMES, LORICARIIDAE) DO RIO XINGÚ
EMANOEL OLIVEIRA DOS SANTOS
BELÉM – PARÁ
2006
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia Celular, da Universidade Federal do Pará, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre. Área de Concentração: Biologia Celular Orientador: Prof. Dr. Edivaldo H. C. de Oliveira
3
“Um homem sempre lembrará de
duas coisas em sua vida:
seus pais e seus filhos.”(Autor Desconhecido)
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“Num axioma que aplicais às vossas ciências. Não há efeito sem causa. Procurai a causa de
tudo o que não é obra do homem e a vossa razão responderá de Quem é.”
Allan Kardec
5
Dedico este trabalho a meus filhos:
Karen, Bruno, Bruna e Karell,
por ordem de chegada
em minha vida.
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A G R A D E C I M E N T O S
Primeiramente a Deus por Sua Força Infinita de Amor e Justiça.
A meus admiráveis pais, Adalberto e Maria Santos, que me favoreceram a
vida e dentro de suas condições, me deram a oportunidade de crescer em todos os
sentidos, e mesmo sem compreender exatamente o que faço, sempre estiveram ao
meu lado.
Ao Prof. Dr. Edivaldo Herculano C. de Oliveira, meu Orientador, por ter
aceitado este desafio, pela dedicação, pela amizade, pela paciência, pela confiança
depositada em mim, pelas criticas, pelas sugestões, e por tudo de bom que ele
representa a todos que os rodeiam.
Ao Prof. Dr. Julio César Pieczarka e a Profa. Dra. Cleusa Nagamachi pela
atenção e carinho, sempre disponíveis no Laboratório de Citogenética Animal da
UFPA.
Aos colegas de Laboratório que foram muitas vezes consultados por mim, nos
momentos das muitas dúvidas, alguns destes “irmãos científicos” como a Marcela, o
Fábio, e a Patrícia (baiana), e também, a Carol, o Danilo (negão), o Anderson
(andarilho), a Susana, o Paulo e a Liane, a Daniela, o Pablo, a dona Conceição
e ao Augusto e o Jaime Jr. por auxiliarem na identificação de algumas espécies.
Ao Técnico do Laboratório Jorge Rissino, grande companheiro do chá de
canela de todas as tardes, que entre as muitas virtudes, só possui um grande
defeito: torcer muito mal no futebol.
A Karine, minha esposa, que me apoiou e incentivou em todos os
momentos_ sem você e nossos bebês, o caminho até aqui teria sido mais dificil.
7
A Marina, minha admirável sogra, pelas palavras de incentivo e força nos
momentos certos.
A meus filhos Uely, Nuno, Nuninha e Karell que tiveram paciência, e mesmo
dentro do seu mundo infantil, compreenderam a ausência do seu papai em vários
momentos.
A meus irmãos: Adalberto, Aldeisa, Acácio, Antonio, Cristina, Everaldo,
Elizabeth e Rosangela, que estando próximos ou distantes, de alguma forma, me
apoiaram neste percurso.
Aos meus avós (in memorian), Ulisses, Vicentina, Alberto e Irene, muito
carinho e muitas saudades.
A Profa. Selma Gomes que me alfabetizou, e não desistiu deste seu aluno
num momento muito delicado de sua vida, além de que, mostrou-me o valor da
profissão de ser Professor.
Ao casal Kazuko e Getúlio Tsuchiyama pela amizade, carinho, conselhos e
incentivo para desenvolver este trabalho, que muito mais do que patrões, sempre
estiveram presentes como amigos de uma longa jornada.
E a todas as pessoas, que não foram citadas, que ao longo deste percurso
contribuíram para a minha formação pessoal e profissional.
Finalmente ao Programa de Pós-Graduação em Neurociências e Biologia
Celular, extendo-se a todos os professores deste programa, a UFPA, ao IBAMA por
fornecer algumas espécies estudadas, e a CAPES pelo apoio financeiro durante a
realização do curso.
8
R E S U M O
Três espécies de cascudos - Glyptoperichthys xinguensis, Pseudacanthicus sp.,
Scobinancistrus aureatus – pertencentes a família Loricariidae, do Rio Xingu-PA,
foram estudados citogeneticamente usando marcação convencional por Giemsa,
bandeamento C, Ag- NOR e marcação DAPI. O número diplóide foi o mesmo nas
espécies, com 2n=52. Contudo, algumas diferenças cromossomicas puderam ser
identificadas. Nenhum heteromorfismo cromossômico sexual foi identificado. Blocos
de heterocromatina constitutiva apresentaram uma distribuição similar entre as
espécies, nas regiões pericentroméricas e nas regiões distais nos braços longos de
alguns pares. Alguns desses blocos foram marcados pelo DAPI, indicando riqueza
de bases A-T. Ag-NOR foi encontrada no braço longo de um par subtelocêntrico e
subtelo/acrocentrico, exceto em Glyptoperichthys xinguensis na qual a marcação Ag-
NOR foi num par submetacêntrico. Os resultados demonstraram que essas espécies
possuindo número diplóide similar, algumas diferenças cromossômicas poderiam ser
usadas em sua identificação.
Palavras-Chaves: Loricariidae, Citogenética, Número Diplióide, Banda C, Ag-NOR, DAPI.
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ABSTRACT
Three species of sucker-mouth - Glyptoperichthys xinguensis Pseudacanthicus sp.,
Scobinancistrus auratus – belonging to family Loricariidae, from Xingu River, PA -
Brazil, were studied cytogenetically using conventional Giemsa staining, C-banding,
Ag-NOR and DAPI staining. Diploid number was the same in all the species, with
2n=52. However, some slight morphologic differences could be identified. No
heteromorphic sex chromosomes were identified. Constitutive heterocrhromatic
blocks showed a similar distribution in the species, in the pericentromeric region and
in the distal region of the long arm of some pairs. Some of these blocks were stained
by DAPI, indicating they are rich in A-T. Ag-NOR label was located on the long arm of
a subtelocentric and subtelo/acrocentric pair, except in Glyptoperichthys xinguensis,
in which the NOR-bearing pair was submetacentric. The results demonstrated that
although these species had similar diploid number, some chromosomal differences
could be used to identify species.
Key Words: Loricariidae, Cytogenetic, Diploid Number, C-Banding, Ag-NOR, DAPI.
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L I S T A D E F I G U R A S
Figura 01. Distribuição da família Loricariidae (ARMBRUSTER, 1997)................................07 Figura 02. Esquema geral de um Loricariidae (NELSON, 1994). .........................................08 Figura 03. Detalhe da boca circular de Pseudacanthicus sp (acari assacu), mostrando o par de barbilhões (setas maiores) e os dentes bífides (seta menor) ...........................................08 Figura 04. Relações Filogenéticas dos Siluriformes (ARMBRUSTER, 2004). ....................17 Figura 05. Filogenia de HOWES (1983) baseada em osteologia e miologia.........................19 Figura 06. Árvore filogenética para os Loricariidae, proposta por SCHAEFER (1986,1987).............................................................................................................................20 Figura 07. Árvore filogenética para os Loricariidae proposta por ARMBRUSTER (1997) baseado em características osteológicas. .............................................................................21 Figura 08. Filogenia das tribos de Hypostominae, proposta por ARMBRUSTER (1997) baseado em características osteológicas. ............................................................................22 Figura 09. Árvore filogenética para os Loricariidae inferiores proposta por MONTOYA-BURGOS et al. (1998) baseado em seqüências gênicas de RNAr mitocondrial 12S e 16S. ................................................................................................................................................23 Figura 10. Árvore filogenética para os Loricariidae superiores proposta por MONTOYA-BURGOS et al. (1998) baseado em seqüências gênicas de RNAr mitocondrial 12S e 16S. ...............................................................................................................................................24 Figura 11. Filogenia de Pterygoplichthys e gêneros relatados por WEBER (1992), baseado em osteologia e características externas. ..............................................................................26 Figura 12. Vista lateral de Glyptoperichthys xinguensis. .......................................................40 Figura 13. Vista lateral de Scobinancistrus aureatus. ...........................................................40 Figura 14. Vista dorsal de Scobinancistrus aureatus.............................................................40 Figura 15. Vista ventral-lateral de Scobinancistrus aureatus.................................................41 Figura 16. Vista lateral de Pseudacanthicus sp. ...................................................................41 Figura 17. Vista superior de Pseudacanthicus sp. ...............................................................41 Figura 18. Cariótipo por coloração convencional de Glyptoperichthys xinguensis................51 Figura 19. Metáfase com bandeamento C de Glyptoperichthys xinguensis, as setas indicam pares ricos em heterocromatina constitutiva. ........................................................................51 Figura 20. Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o cromossomo portador da NOR em Glyptoperichthys xinguensis. .........................................52
11
Figura 21. Metáfase de Glyptoperichthys xinguensis. Corada com DAPI, as setas indicam os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas. .......................................................52 Figura 22. Cariótipo por coloração convencional de Scobinancistrus aureatus....................54 Figura 23. Metáfase com bandeamento C de Scobinancistrus aureatus, as setas indicam pares ricos em heterocromatina constitutiva. ........................................................................54 Figura 24. Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o cromossomo portador da NOR em Scobinancistrus aureatus. .............................................55 Figura 25. Metáfase de Scobinancistrus aureatus corada com DAPI, as setas indicam os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas. .......................................................55 Figura 26. Cariótipo por coloração convencional de Pseudacanthicus sp............................57 Figura 27. Metáfase com bandeamento C de Pseudacanthicus sp., as setas indicam pares ricos em heterocromatina constitutiva....................................................................................57 Figura 28. Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o cromossomo portador da NOR em Pseudacanthicus sp........................................................58 Figura 29. Metáfase de Pseudacanthicus sp., corada com DAPI, as setas indicam os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas.........................................................58 Figura 30. Esquema comparativo das NORs entre os espécimes (a) Glyptoperichthys sp., (b) Glyptoperichthys xinguensis, (c) Pseudacanthicus sp. (d) Scobinancistrus aureatus..................................................................................................................................66
12
L I S T A D E T A B E L A S
Tabela 01- Sinonímias das tribos propostas por ARMBRUSTER (2004) para a subfamília
Hypostominae. .......................................................................................................................10
Tabela 02- Tribos e gêneros da subfamília Hypostominae e seus sinônimos
(ARMBRUSTER, 2004)..........................................................................................................10
Tabela 03- Hipóteses da Especiação Geográfica na Amazônia durante o período Terciário e
o Quaternário (Cenozóico), como proposto por vários autores, segundo HAFFER (1997). .13
Tabela 04- Mudanças Hidrogeológicas documentadas que teriam influenciado a grande
diversidade de peixes de água doce nos Neotrópicos (MONTOYA-BURGOS, 2003)...........16
Tabela 05- Número Cromossômico e Fórmula Cariotípica das espécies estudadas...........63
S U M Á R I O
13
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................01
1.1 Considerações Gerais sobre os Peixes..............................................................01
1.2 Considerações Gerais sobre a Ordem Siluriformes, com ênfase na família
Loricariidae.................................................................................................................03 1.3 A Subfamília Hypostominae................................................................................09
1.4 O Contexto Temporal da Diversificação dos Peixes Neotropicais......................12
1.5 Aspectos Filogenéticos da Família Loricariidae.........................................16
1.6 Citogenética de Peixes................................................... ................26
1.6.1 Heterocromatina Constitutiva e Fluorocromo A-T específico.........................29
1.6.2 As Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs)............................................31
1.7 Aspectos Citogenéticos dos Siluriformes............................................................32
1.7.1 Dados Citogenéticos na família Loricariidae...................................................33
2 OBJETIVOS........................................................................................................38
2.1 Objetivo Geral....................................................................................................38
2.2 Objetivos Específicos.........................................................................................38
3 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................................39
3.1 Espécies Analisadas..........................................................................................39
3. 2 Técnicas Utilizadas..........................................................................................42
3.2.1 Técnica de Indução de Mitoses.......................................................................42
3.2.2 Obtenção dos Cromossomos Mitóticos...........................................................42
3.2.3 Preparação Citológica das Lâminas................................................................44
3.2.4 Técnica de Coloração Convencional...............................................................44
3.2.5 Técnica para o Bandeamento C......................................................................45
3.2.6 Técnica para detecção da Região Organizadora do Nucléolo (NOR).............46
3.2.7 Técnica de Marcação com DAPI......................................................................46
3.2.8 Análise Cromossômica e Captura de Imagens................................................47
3.2.9 Técnica de Revelação Fotográfica...................................................................48
3.3 Medidas Cromossômicas...................................................................................49
4 RESULTADOS......................................................................................................50
4.1 O Cariótipo de Glyptoperichthys xinguensis......................................................50
4.2 O Cariótipo de Scobinancistrus aureatus..........................................................53
4.3 O Cariótipo de Pseudacanthicus sp..................................................................56
5 DISCUSSÃO................................................................................................59
5.1 Análise Cromossômica e Fórmula Cariotípica...................................................60
14
5.2 Heterocromatina Constitutiva e Fluorocromo A-T específico............................63
5.3 As Regiões Organizadoras de Nucléolo (NORs)..............................................64
5.4 O Uso de Dados Citogenéticos na Identificação de Espécies...........................66
6 CONCLUSÔES....................................................................................................70
7 REFERÊNCIAS ....................................................................................................72
8- ANEXO – Preparo das Soluções..........................................................................82
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS PEIXES
Os peixes representam à maioria das espécies de vertebrados,
estimando-se em aproximadamente 24.618 o número de espécies válidas, o que
corresponderia aproximadamente à metade dos vertebrados conhecidos, sendo
encontrados em praticamente todos os tipos de massas de água doce e salgada do
planeta (NELSON, 1994). Mesmo sendo a maior diversidade conhecida de
vertebrados, boa parte destes extraordinários animais ainda não é conhecida pela
ciência, o que dificulta seu estudo. Isto se verifica principalmente na América do Sul,
que apresenta a mais rica fauna de peixes de água doce do mundo (AURICCHIO &
SALOMÃO, 2002).
Os peixes ancestrais não possuíam mandíbula, eram bentônicos e
pertencentes à superclasse Agnatha. A maioria dos agnathos está extinta, mas esta
superclasse ainda é representada pelas lampréias e peixes-bruxa. Com a evolução
das mandíbulas e dos apêndices pares, os peixes tornaram-se mais ativos e
capazes de se alimentar de diferentes maneiras. Os peixes mandibulados atuais
estão divididos em dois grandes grupos: Chondrichthyes, com esqueleto
cartilaginoso, e Osteichthyes, com esqueleto ossificado pelo menos em parte, sendo
a maioria dos peixes atuais pertence a este grupo (NELSON, 1994).
Os Chondrichthyes estão divididos em duas subclasses,
Elasmobranchii (tubarões e arraias) e Holocephalii (quimeras). Na Amazônia só foi
registrada a presença de peixes da subclasse Elasmobranchii, a qual está dividida
em apenas duas ordens: Lamniformes e Rajiformes (FERREIRA et al., 1998).
Os Osteichthyes evoluíram de ancestrais desconhecidos há pouco
mais de 400 M.a. Por volta de 150 M.a depois, estes peixes eram superados em
2
número, primeiro pelos Placodermos, depois pelos Chondrichthyes, mas desde o
inicio do Permiano, os peixes ósseos tem dominado as águas do planeta. Desde o
fim da era Mesozóica estes peixes têm sido os mais abundantes de todos os
vertebrados. Seus hábitats e estruturas parecem ser tão diversos quanto permite a
adaptação comum à vida aquática. A maioria dos peixes desta classe tem crânio,
vértebras, cinturas, raios das nadadeiras e escamas ósseos. Alguns têm cartilagem,
que substituiu secundariamente o osso presente nos ancestrais. Os peixes ósseos
são os únicos vertebrados que possuem as brânquias de cada lado do corpo, no
interior de uma câmara comum recoberta por um opérculo ósseo móvel
(HILDBRAND, 1995).
Os Osteichthyes estão divididos em quatro subclasses, com destaque
à dos peixes cujas nadadeiras dispõem de raios de sustentação, a Actinopterygii
(BRUM, 1995). Nesta subclasse encontramos a maioria dos peixes ósseos, e que se
dispõem em três grupos denominados: Chondrostei (esturjões), Holostei (peixe-
lagarto) e Teleóstei, os quais são considerados como formando uma seqüência
evolutiva pela ordem dos nomes, diferenciando-se em relação ao grau de
ossificação do esqueleto, mobilidade ou pareamento de certos ossos do crânio e da
cintura escapular, forma das nadadeiras dorsal e caudal e presença ou não de
espiráculo (HILDBRAND, 1995).
Os Teleóstei estão distribuídos em cerca de 37 ordens, constituindo o
mais numeroso e bem sucedido grupo de peixes. Dentre os Teleósteos, o grupo
Euteleóstei caracteriza-se por constituir um clado extremamente grande, com cerca
de 31 ordens (NELSON, 1994). Neste grupo destacam-se os Ostariophysi que
apresentam a mais larga distribuição mundial, com quase a totalidade das espécies
dulcícolas, cerca de ¾ dos peixes de água doce do mundo (BRUM, 1995). A
3
superordem Ostariophysi agrupa cerca de 85% das espécies amazônicas, das quais
43% estão incluídas na ordem Characiformes, 39% na ordem Siluriforme e 3% nos
Gymnotiformes (LOWE-McCONELL, 1987).
A ordem Siluriforme é atualmente dividida em 34 famílias, distribuídas
na Ásia, África, Américas e Europa. Há cerca de 412 gêneros e das 2400 espécies
atuais, aproximadamente 1440 estão no Novo Mundo (NELSON, 1994). Nas águas
doces sul-americanas são encontradas 14 famílias, sendo 12 de ocorrência na
Amazônia brasileira (FERREIRA et al., 1998).
No sistema que compõe o rio Xingu, CAMARGO et al. (2002) listaram
473 espécies pertencentes a 15 ordens e 47 famílias, sendo as ordens mais diversas
em termos de número de espécies: Characiformes (210), Siluriformes (146),
Perciformes (62) e Gymnotiformes (20), e ainda Clupeiformes (10) e Rajiformes (06).
Já ao nível de família, as mais ricas em termos de número de espécies foram:
Characidae (118), Cichlidae (57), Loricariidae (55), Anastomidade (18), Doradidae
(17), Auchenipteridae (16) e Hemiodontidae e Heptapteridae (12 espécies cada).
1.2 CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE A ORDEM SILURIFORMES, COM
ÊNFASE NA FAMÍLIA LORICARIIDAE
A diversidade de formas, tamanho corporal e hábitats nos Siluriformes
sul-americanos, especialmente na superfamília Loricaroidea, é extraordinário. Dentre
as famílias de Siluriformes, apenas uma é exclusivamente marinha e duas famílias
apresentam representantes marinhos e de água doce (RAPP PY-DANIEL, 2000).
A maioria das espécies de Siluriformes pode provocar graves
ferimentos com seus espinhos e injetar um veneno, produzido por células
4
glandulares do tecido epidérmico, localizadas na base desses espinhos. Muitos
destes peixes apresentam o corpo achatado, dorso-ventralmente, adaptados à vida
bentônica. Uma grande parte das espécies é noturna ou crepuscular. Muitas são
carnívoras, mas outras se alimentam principalmente de algas que são raspadas das
folhas, pedras e galhos submersos (NELSON, 1994). Devido a tais hábitos, o estudo
de sua biologia se torna mais difícil (DIAS, 1987). De uma maneira geral, são peixes
mais sedentários e encontram maiores dificuldades para transpor cachoeiras, ou
corredeiras que se interpõem às suas migrações limitadas (BRITSKI, 1981).
Esta ordem agrupa peixes caracterizados pelo corpo sem escama,
coberto por pele nua (lisa) ou por placas ósseas, apresentam barbilhões ao redor da
boca, normalmente em três pares. Os dentes são pequenos e curvos, agrupados em
faixas ou placas semelhantes a uma lixa. As nadadeiras peitorais e dorsais são
geralmente guarnecidas com espinhos providos de serras nas margens (BRITSKI et
al., 1984; FERREIRA et al., 1998).
Este clado inclui desde peixes com mais de 2,5 metros de comprimento
e 200 kg, como a piraíba, até espécies muito pequenas, cujos indivíduos adultos não
passam de três centímetros de comprimento total. Algumas espécies produzem sons
que podem ser ouvidos até fora d’água. A maioria possui a capacidade de respirar ar
na superfície, o que os tornam capazes de habitar ambientes pobres em oxigênio,
não suportados por outros grupos de peixes (FERREIRA et al., 1998).
Nos trópicos, os comedores de detritos aquáticos incluem uma grande
variedade de peixes especializados, o que constitui uma importante ligação na
bioenergética dos ecossistemas (LOWE-McCONNELL, 1987). As famílias
detritívoras mais conhecidas na América do Sul são: Prochilodontidae, Curimatidae e
Loricariidae (DELARIVA & AGOSTINHO, 2001). Como recurso alimentar, algumas
5
espécies de hábitos detritívoros são comuns e muito abundantes em áreas de
várzea da Amazônia central, representando uma significante parcela dos
desembarques da pesca artesanal e comercial (PETRERE JR., 1978; GOULDING,
1980). Constatou-se que algumas espécies de Loricariidae são preferidas por 65%
da população do Alto Juruá (SILVANO et al., 2001), assim como um importante
recurso pesqueiro na bacia do rio Paraná (AGOSTINHO et al. 1989 apud CAMILO,
2004).
A pesca de Loricariidae como peixes ornamentais constitui uma das
mais importantes atividades comerciais no município de Altamira, envolvendo muitas
famílias de ribeirinhos e empresas especializadas em exportação sediadas na
cidade. Esta atividade iniciou quando importadores estrangeiros começaram a visitar
a região regularmente (ZUANON, 1999). De acordo com listas de exportadores, o rio
Xingu é o local de maior importância no Brasil para a captura de acaris, da família
Loricariidae, comercializados como peixes de aquário (TORRES & CARVALHO JR.,
1996 apud SOUZA, 2003).
A família Loricariidae é a maior entre os Siluriformes e está entre as
maiores famílias de peixes, com aproximadamente 700 espécies (ARMBRUSTER &
SABAJ, 2002). Apresenta, cerca de 70 gêneros distribuídos em seis subfamílias:
Lithogeninae (03 espécies), Neoplecostominae (07 espécies.), Loricariinae (209
espécies), Hypoptopomatinae (79 espécies), Ancistrinae (217 espécies) e
Hypostominae (169 espécies) (ALVES et al., 2005), distribuídas exclusivamente na
região Neotropical desde o Panamá até o Uruguai (ISBRÜCKER, 1991), conforme
Figura 01.
Os representantes desta família, comumente chamados de cascudos
ou limpa-vidro, possuem uma boca sempre inferior, com lábios grandes, alimentam-
6
se de algas e microorganismos aderidos a substratos duros ou a lama do fundo.
Geralmente fazem ninhos para desovar no fundo ou nos barrancos dos rios
(SILVANO et al., 2001; BURGESS, 1989 apud SOUZA, 2003). A Figura 02
representa de maneira geral a morfologia externa dos peixes da família Loricariidae,
segundo NELSON (1994), e a Figura 03 destaca a boca circular de Pseudacanthicus
sp.
Os peixes desta família ocupam hábitats variados demonstrando assim
uma grande capacidade adaptativa que pode ser exemplificada pela sua respiração,
que além das brânquias, também é realizada pelas paredes vascularizadas do
estomago, fato que lhe permite ficar fora da água por longo período. Alguns
loricariideos tem habito iliófago. Adicionalmente sua alimentação consiste de
vegetais e pequenos invertebrados. Em geral são caracterizados por uma baixa
fecundidade, ocasionada pela liberação de poucos ovos. Em certos casos observa-
se pronunciado dimorfismo sexual (MENEZES, 1949a e 1949b apud CAMILO,
2004).
7
Figura 01- Distribuição da família Loricariidae (ARMBRUSTER, 1997).
8
Figura 02 - Esquema geral de um Loricariidae (NELSON, 1994).
Figura 03 - Detalhe da boca circular de Pseudacanthicus sp (acari assacu),
mostrando o par de barbilhões (setas maiores) e os dentes bífides (seta menor).
9
1.3 A SUBFAMÍLIA HYPOSTOMINAE
Para ARMBRUSTER (2004), os Hypostominae estão divididos em
cinco tribos: Corymbophanini, Rhinelepini, Pterygoplichthini, Hypostomini e Ancistrini,
sendo as três primeiras tribos novas propostas pelo autor. As informações a respeito
de Corymbophanini, Ancistrini e Pterygoplichthini ainda são consideradas limitadas,
enquanto os Rhinelepini já foram estudados em detalhes (QUEVEDO & REIS, 2002).
As principais sinonímias e tribos incluídas na subfamília Hypostominae, segundo
ARMBRUSTER (2004), estão indicadas na tabela 01, enquanto na tabela 02 estão
sumarizados os principais gêneros e seus sinônimos, distribuídos em suas cinco
tribos.
Com a inclusão de Ancistrinae (e exclusão de alguns gêneros antigos
desta), Hypostominae tornou-se a maior subfamília de Loricariidae em número de
espécies, com 366 válidas (ARMBRUSTER, 2004).
A variação de tamanho nesta subfamília é incrível, pois inclui gêneros
pequenos como Lithoxus (50 mm) e Acanthicus, o maior de todos os loricariideos
com tamanho máximo em torno de um metro. Os Hypostominae são tipicamente
mais volumosos que outros Loricariideos e geralmente tem placas espessas
(ARMBRUSTER, 2004).
10
Tabela 01 - Sinonímias das tribos propostas por ARMBRUSTER (2004) para a subfamília Hypostominae. SUBFAMILIA HYPOSTOMINAE KNER,1853 Sinonimia: Inclue:
Ancistri Kner, 1853 Ancistrini Kner, 1853
Hypostomiden Kner, 1853 Corymbophanini nova tribo
Lictores Kner, 1853 Hypostomini Kner, 1853
Plecostomiformes Bleeker, 1862 Pterygoplichthini nova tribo
Chaetostomidi Fowler, 1958 Rhinelepini nova tribo
Tabela 02 - Tribos e gêneros da subfamília Hypostominae e seus sinônimos (ARMBRUSTER, 2004). Tribo Gêneros
Acanthicus Acanthodemus (= Parancistrus) Ancistomus (= Hemiancistrus) Ancistrus Baryancistrus Chaetostoma Cordylancistrus Dekeyseria Dolichancistrus Exastilithoxus Guyanancistrus (= Pseudancistrus) Hemiancistrus Hemiancistrus landoni Hopliancistrus Hypancistrus Hypocolpterus (= Chaetostoma) Lasiancistrus Leporacanthicus Leptoancistrus Lipopterichthys (= Chaetostoma) Lithoxancistrus (= Pseudancistrus) Lithoxus Megalancistrus Neblinichthys Oligancistrus (= Spectracanthicus)
Ancistrini
Panaquolus (= Panaque)
11
Tribo Gêneros Panaque Paralithoxus (= Lithoxus) Parancistrus Peckoltia Peckoltichthys (= Peckoltia) Pristiancistrus (= Ancistrus) Pseudacanthicus Pseudancistrus Pseudolithoxus Scobinancistrus (= Panaque) Sophiancistrus (= Peckoltia) Spectracanthicus Stoniella (= Pseudacanthicus) Thysanocara (= Ancistrus) Xenocara (= Ancistrus) Zonancistrus (= Dekeyseria)
Corymbophanini Corymbophanes
Aphanotorulus (=. Hypostomus) Cheiridodus (= Hypostomus) Cochliodon (= Hypostomus) Hypostomus Isorineloricaria (= Hypostomus) Squaliforma (= Hypostomus)
Hypostomini
Watawata (= Hypostomus)
Glyptoperichthys (= Pterygoplichthys) Hemiancistrus annectens group Liposarcus (= Pterygoplichthys)
Pterygoplichthini
Pterygoplichthys
Canthopomus (= Pseudorinelepis) Monistiancistrus (= Pseudorinelepis) Pogonopoma Pogonopomoides (= Pogonopoma) Pseudorinelepis
Rhinelepini
Rhinelepis
* NOTA: Os gêneros em negrito referem-se às espécies analisadas no presente trabalho.
12
1.4 - O CONTEXTO TEMPORAL DA DIVERSIFICAÇÃO DOS PEIXES
NEOTROPICAIS
As principais hipóteses propostas para explicar a formação de barreiras
separando populações e causando a diferenciação das espécies vertebradas na
Amazônia são baseadas nos diferentes fatores, como proposto por HAFFER (1997):
(1) Mudanças na distribuição de terra e mar ou na paisagem devido
aos movimentos tectônicos ou flutuações no nível do mar (Hipótese
Paleogeográfica);
(2) O Efeito barreira dos rios amazônicos (Hipótese dos Rios).
(3) Uma combinação do efeito barreira dos largos rios e mudanças de
vegetação no norte e sul da Amazônia (Hipótese do Refúgio dos
Rios).
(4) O isolamento de blocos florestais próximos na periferia da
Amazônia durante períodos climáticos secos do Terciário e do
Quaternário (Teoria dos Refúgios).
(5) Interações de competição entre espécies e isolamento local de
espécies nas regiões periféricas da Amazônia durante a invasão e
contra-invasão, durante os períodos de quente/frio do Pleistoceno
(Hipótese Distúrbio-Vicariante).
(6) Especiação parapátrica através de rápidos gradientes ambientais
sem separação de populações representativas (Hipótese dos
Gradientes).
A tabela 03 sumariza os principais eventos associados a estas hipóteses
sugeridas.
13
Tabela 03 - Hipóteses da Especiação Geográfica na Amazônia durante o período
Terciário e o Quaternário (Cenozóico), como proposto por vários autores, segundo
HAFFER (1997).
Hipótese
Paleogeográfica Hipótese dos Rios
Hipótese do Refugio dos Rios
Hipótese dos Refúgios
Hipótese dos Distúrbios Vicariantes
Hipótese dos
Gradientes Redução florestal durante períodos climáticos secos do Cenozóico.
Não considerada (irrelevante)
Não considerada (irrelevante)
Enfraquecidas; afetando apenas nas porções periféricas... ao Norte e Sul da Amazônia
Predominante; regiões periféricas Amazônia central afetada.
Enfraquecidas; afetando apenas nas porções periféricas ao Norte e Sul da Amazônia
Não considerada (irrelevante)
Barreiras separando populações.
Mar continental, platôs, planícies inundáveis.
Rios (e suas inundações).
Rios largos na Amazônia central e áreas não florestadas nas regiões de cabeceira
Florestas abertas e Regiões não florestadas; rios regionais.
Florestas Ecologicamente inadequadas
Acentuado gradiente de meio ambiente
Flutuações Climáticas durante o Cenozóico Umidade / períodos secos
Causa da formação de barreiras
Movimentos tectônicos e/ou flutuações no nível do mar
Desenvolvimento de rios ou dispersão de fundadores através de barreiras de riso pré-existentes
Bastante desconhecido
Predominante; atreves do efeito da chuva durante a subida tectônica e/ou descida
Períodos frios / quentes
Zonas ligadas através de ecótones.
Autores
Emsley (1965) Para borboletas
Sick (1967), Capparella (1988), Hershkovitz (1977)
Ayres (1986), Ayres et al., (1992), Capparella (1991)
Haffer (1969,1974), Vanzolini et al., (1970), Vrba (1993)
Colinvaux (1993)
Endler (1982)
Para LUNDBERG et al. (1998) a formulação e o teste de hipóteses
gerais sobre a diversidade e diversificação dos peixes neotropicais requer
conhecimento sobre sua filogenia e distribuição no tempo e no espaço. Evidências
fósseis diretas demonstram que no final do Mioceno Médio (ca. 10 Ma) a fauna de
peixes Neotropicais era essencialmente moderna, tanto taxonômica como
ecologicamente. Estes registros incluem muitos clados pequenos de peixes
neotropicais modernos, classificados como gêneros, grupos de espécies e até
algumas espécies, tais como Hoplias, Anastomídeos semelhantes a Leporinus,
14
Serrasalmineos semelhantes a piranhas, Oxydoras, Loricariideos do grupo
Acanthicus, Ciclideos Ciclineos e Geofagíneos. Colocados em um contexto
filogenético de relações em níveis superiores, alguns destes indicam uma
diversificação simultânea ou ainda mais antiga de linhagens aparentadas.
Existem relativamente poucos fósseis de peixes do inicio do
Cenozóico. Fósseis do Oligoceno tardio revelam linhagens modernas diferenciais de
Characiformes. Fósseis do final do Paleoceno do gênero Corydoras e bagres
altamente derivados indicam uma diversidade de Calictídeos e Loricariideos no inicio
do Cenozóico. Muito da diversificação dos modernos peixes neotropicais ocorreu
durante o período de pelo menos 70 Ma, do final do Cretáceo até o Mioceno. De
qualquer forma, eventos da história da Terra entre o final do Mioceno e o Holoceno
tiveram pouca ou nenhuma importância na criação da grande diversidade de peixes
neotropicais nos níveis de família e gênero. A diversificação dos peixes sem dúvida
prossegue, mas desde o Mioceno isto tem ocorrido em níveis taxonômicos menores
(LUNDBERG et al., 1998).
A resolução da filogenia e taxonomia dos grupos ancestrais marinhos,
ao nível de espécie, poderia ser informativo em relação a uma questão biogeográfica
distinta: a idade da invasão dos ancestrais marinhos nas águas doces sul-
americanas e de sua subseqüente radiação nas águas doces do continente
(MALABARBA et al., 1998).
Para LUNDBERG et al. (1998), o isolamento de sistemas de drenagem
periféricos do sul, oeste e norte do Paraná, Amazonas e Orinoco deram
oportunidades para divergência alopátrica, e foi acompanhada pela extinção local de
várias espécies amplamente distribuída de peixes Neotropicais.
15
A idéia de que o isolamento geográfico pode ter como conseqüência a
diversificação das espécies, faz muito sentido no modelo de evolução darwiniana
(ESTUDOS...,2003). A Teoria dos Refúgios expõe que a principal diversificação dos
organismos Neotropicais ocorreu recentemente e que as forças primárias foram
oscilações climáticas do Pleistoceno (1,8 milhões a 11.000 anos atrás), que
fragmentou e reconectou hábitats várias vezes (MONTOYA-BURGOS, 2003). Mas a
concordância da Teoria dos Refúgios com a Teoria Sintética da Evolução não é
garantia, de que a megadiversidade biológica tenha surgido por esses mecanismos.
Muitos achados desafiam esta teoria, principalmente no que diz respeito à
diversificação da ictiofauna. (ESTUDOS..., 2003).
Estudos baseados em dados morfológicos da biogeografia de peixes
de água doce da América do Sul sustentam uma importante diversificação que
precede o Pleistoceno (MONTOYA-BURGOS, 2003). Os primeiros fósseis dos
peixes atuais da Amazônia datam da época de erguimento dos Andes, no Mioceno
(JÉGU, 1992).
MONTOYA-BURGOS (2003) sugere a hipótese “Hidrogeológica” para
tentar justificar as forças que atuaram na diversificação dos peixes Neotropicais,
segundo a qual todo um conjunto de alterações hidrogeológicas influenciou a grande
diversidade dos peixes de água doce neotropicais. O autor realizou inferências
filogenéticas baseadas na Alça-D (região controle) do DNA mitocondrial de espécies
de Hypostomus coletados em todos os principais sistemas de rios Neotropicais. Os
resultados indicam que os principais episódios geológico-cladogenéticos na história
evolutiva de Hypostomus ocorreram entre 12 e 4 Ma, durante o Mioceno. As
principais alterações hidrogeológicas que teriam influenciado a diversidade dos
peixes de água doce neotropicais estão sumarizados na tabela 04.
16
1.5 ASPECTOS FILOGENÉTICOS DA FAMÍLIA LORICARIIDAE
Os Loricariidae fazem parte da superfamília Loricaroidea junto com
Astroblepidae, Scoloplacidae, Callichthyidae, Trichomycteridae, e Nematogeneidae.
São descritos como mais proximamente dos Astroblepidae, e juntos representam o
grupo irmão de Scoloplacidae, uma família compreendida por quatro espécies
miniaturas. Este clado tem como grupo irmão a família Callichthyidae, que é o grupo
menos conhecido em termos de inter-relações filogenéticas. Estas quatro famílias
formam os “Loricaroidea avançados” e representam o grupo irmão de um clado
formado por Nematogeneidae, representado por uma única espécie do sul do Chile,
mais Trichomycteridae (ARMBRUSTER, 2004). As inter-relações entre a família
Loricariidae e seus grupos irmãos estão representados na Figura 04.
Tabela 04 - Mudanças Hidrogeológicas documentadas que teriam influenciado a
grande diversidade de peixes de água doce nos Neotrópicos (MONTOYA-BURGOS,
2003).
Mudança Hidrogeológica Ma Referências 1. Isolamento do Lago Maracaibo do Paleo Amazonas-Orinoco
8 Hoorn (1993) Hoorn et al.(1995) Días de Gamero (1996)
2. Fronteira limite entre o paleo Amazonas-Orinoco e o sistema Paraná
11,8 – 10 Lundberg et al. (1998)
3. Período de abaixamento do nível do mar (promovendo a colonização rios e a conexão de deltas)
6 – 5 Vail & Handebol (1979) Haq et al.(1987) Wheeler & Ahron (1991)
4. Costa Oeste do rio Paraíba desconecta-se do Paraná
Mioceno médio (16-10)
Riccomini et al. (1990) Riccomini et al. (1991)
5. Fronteira limite entre o Paraná superior e a Bacia do São Francisco
Terciário 65-1,8
Beurlen (1970)
6.O Rio Uruguai desconecta-se do Paraná superior
Mioceno (24 – 5)
Beurlen (1970)
17
Figura 04- Relações Filogenéticas dos Siluriformes (ARMBRUSTER, 2004).
O grupo dos loricariideos foi primeiramente denominado de
Gonyodontes (SPIX & AGASSIZ, 1829, apud MONTOYA-BURGOS et al., 1998).
Posteriormente a primeira divisão do grupo foi feita por KNER (1853a, 1853b, apud
MONTOYA-BURGOS et al., 1998) colocando-os em dois subgrupos: Loricariinae e
Hypostominae.
BLEEKER (1862, apud MONTOYA-BURGOS et al., 1998) identificou
duas subfamílias: Plecostominae e Loricariinae.
EIGENMAM & EIGENMAM (1890, apud MONTOYA-BURGOS et al.,
1998) propuseram três subfamílias: Loricariinae, Hypoptopomatinae e
Plecostominae.
18
REGAN (1904, apud MONTOYA-BURGOS et al., 1998) reconheceu
cinco subfamílias: Plecostominae, Hypoptopomatinae, Loricariinae,
Neoplecostominae e Argiinae.
GOSLINE (1945, 1947, apud MONTOYA-BURGOS et al., 1998) fez a
principal revisão para os Loricariidae, substituindo Argiinae por Astroblepinae e
descreveu uma nova subfamília: os Lithogeninae (= Lithogeneinae), colocando
Astroblepinae como o primeiro grupo divergente seguido por Lithogeneinae,
Neoplecostominae e Plecostominae. Este autor propôs que Loricariinae e
Hypoptopominae formam dois grupos distintos, derivados de Neoplecostominae.
ISBRÜCKER (1980) reconheceu Astroblepinae como uma família e
dividiu Plecostominae em duas subfamílias: Hypostominae e Ancistrinae.
Reconheceu assim seis subfamílias: Lithogeninae, Hypoptopomatinae, Loricariinae,
Neoplecostominae, Hypostominae e Ancistrinae.
HOWES (1983), com estudos de miologia cranial e osteologia, não
encontrou em Ancistrinae e Hypostominae características que as apoiassem como
um grupo natural, conforme a Figura 05.
SCHAEFER (1986, 1987) fez a mais completa filogenia morfológica
para a família Loricariidae, propondo sua divisão em seis subfamílias: Lithogeninae,
Neoplecostominae, Hypoptopomatinae, Loricariinae, Ancistrinae e Hypostominae
(ver Figura 06). O autor encontrou caracteres osteológicos exclusivos que apóiam o
monofiletismo de Ancistrinae, Hypoptopomatinae e Loricariinae, mas suas
evidências sugerem que Hypostominae não formaria um grupo monofilético.
Também foi o primeiro a sugerir que, reconhecendo Ancistrinae como subfamília,
tornaria Hypostominae um grupo parafilético.
19
Figura 05- Filogenia proposta por HOWES (1983) baseada em osteologia e miologia
cranial.
20
Figura 06- Árvore filogenética para os Loricariidae, proposta por SCHAEFER
(1986,1987).
ARMBRUSTER (1997), usando principalmente características
osteológicas, analisou as cinco subfamílias mais Lithogeneinae, a qual considerou
como uma subfamília de Loricariidae. O autor propôs duas novas subfamílias:
Hemipsilichthiinae e Upsilodinae, considerando esta última o grupo mais basal
dentro da família. Sugere ainda que, para evitar o problema com o parafiletismo de
Hypostominae, Ancistrinae deveria torna-se uma tribo da mesma, ficando
Ancistrinae
Hypostominae
Loricariinae
Hypoptopomatinae
Neoplecostominae
Lithogeneinae
Astroblepidae
Scoloplacidae
Callichthydae
Trichomycteridae
Nematogenyidae Loricariidae
21
Hypostominae dividida em cinco tribos: Corymbophanini, Rhinelepini, Hypostomini,
Pterygoplichthini e Ancistrini, conforme mostram as Figuras 07 e 08.
C orydorasD ianem aH oplosternumA strob lepusL ithogenes v illosusD elturus angu illicauda tusU psilodus v ic toriN eop lecostom us m icropsN eop lecostom us paranensisIsbrueckerich thys a lip ion isIsbrueckerich thys dusen iP areiorh ina sp .P areiorh ina rudo lph iK ronich thys sp .1K ronich thys sp .2H em ipsilich thys?H ypoptopom a sp .N annop topom a spec tab ilaO tocinclus vestitu sO tocinclus v itta tusM icro lep idogaster sp .P aro tocinclus britsk iiSch izo lec is guen theriH em ipsilich thys bah ianusH em ipsilich thys sp .H em ipsilich thys cam eroniH em ipsilich thys nudu lusH em ipsilich thys sp lendensC rosso loricaria venezue laeC rosso loricaria sp .L oricaria ca taphrac taL oricariich thys brunneusIx inandria m onte lbe llo iR ine loricaria rupestrisH arttia sp .L am ontich thys llaneroSturisom a festivumSturisom atich thys c itrensisC orym bophanin iR hine lep in iH ypostom in iP terygop lich th in iA ncistrin i
Gru
po e
xter
noN
eopl
ecos
tom
inae
Hy p
opto
mat
inae
Ne o
.Lo
rica
r ii n
aeH
y pos
tom
ina e
Figura 07- Árvore filogenética para os Loricariidae proposta por ARMBRUSTER
(1997) baseado em características osteológicas.
22
Corymbophanes andersoniCorymbophanes kaiei Pogonopoma wertheimeiPogonopomoides parahybaeRhinelepis asperaPseudorinelepis genibarbisAphanotorulus ammophilus 1Aphanotorulus unicolor 1Hypostomus squalinusHypostomus emarginatus2Hypostomus emarginatus1Isorineloricaria spinosissimus 1Cochliodon cochliodon 1Cochliodon hondae 1Cochliodon plecostomoides 1Hypostomus sp.angled jawsHypostomus cordovaeHypostomus micromaculatusHypostomus robiniiHypostomus plecostomusHypostomus plecostomus2Hypostomus sp.round snout2Hypostomus albopunctatusHypostomus francisciHypostomus bolivianusHypostomus sp.round snout1Hypostomus punctatusHypostomus commersoniHypostomus boulengeriHypostomus panamensis 2Hemiancistrus holostictus 2Hemiancistrus maracaiboensis 2Liposarcus multiradiatus 3Liposarcus pardalis 3Pterygoplichthys zuliaensisGlyptoperichthys gibbiceps 3Glyptoperichthys lituratus 3Glyptoperichthys punctatus 3Pterygoplichthys etentaculatusAncistrini
Corymbophanini
Rhinelepini
Hyp
osto
min
iP t
eryg
o plic
hthi
ni
Figura 08- Filogenia das tribos de Hypostominae, proposta por ARMBRUSTER
(1997) baseado em características osteológicas.
23
MONTOYA-BURGOS et al. (1998), baseados em seqüências gênicas
de RNAr mitocondrial 12S e 16S, classificaram a família em dois grupos, os
Loricariidae inferiores e os Loricariidae superiores (Figuras 09 e 10). Os autores
propuseram o monofiletismo para a subfamília Loricariinae, porém não encontraram
evidencias que apóiem o monofiletismo das outras subfamílias.
Figura 09 - Árvore filogenética para os Loricariidae inferiores proposta por
MONTOYA-BURGOS et al.(1998) baseado em seqüências gênicas de RNAr
mitocondrial 12S e 16S.
24
Figura 10- Árvore filogenética para os Loricariidae superiores proposta por
MONTOYA-BURGOS et al. (1998) baseado em seqüências gênicas de RNAr
mitocondrial 12S e 16S.
25
ARMBRUSTER (1997) considera os gêneros Aphanotorulus,
Cochliodon e Isorineloricaria como sinônimos de Hypostomus, e ainda
Glyptoperichthys e Liposarcus como sinônimos de Pterygoplichthys. WEBER &
MONTOYA-BURGOS (2002) e MONTOYA-BURGOS et al. (2002) sugerem, por
meio de dados osteológicos e moleculares, que o gênero Cochliodon também seja
um sinônimo juvenil de Hypostomus.
No entanto, ARMBRUSTER (2000) por meio de revisão dos dados de
ARMBRUSTER (1997), redescreve alguns gêneros, considerando alguns de
validade duvidosa, os quais devem ser colocados dentro de sinonímias, e que outros
grupos monofiléticos representam na verdade gêneros não-descritos. Desconsidera
as duas subfamílias que criara propondo assim, uma nova filogenia para a família
Loricariidae. O autor propõe a divisão de Hypostominae em cinco tribos
denominadas: Corimbophanini, Rhinelepini, Hypostomini, Pterygoplichthini e
Ancistrini, esta última tribo com todos os gêneros da subfamília Ancistrinae. Os
gêneros Delturus, Lithogenes e Upsilodus foram retirados da família Loricariidae,
sugerindo ainda a descrição de Delturus e Upsilodus como uma nova subfamília.
WEBER (1992) sugere que Pterygoplichthys Gill seja um grupamento
parafilético relativamente fechado com Megalancistrus. Para retificar o parafiletismo,
redescreve o gênero Liposarcus Günther e descreve um novo gênero,
Glyptoperichthys, o qual é considerado o irmão de Megalancistrus, como mostra a
Figura 11.
Embora para muitos taxonomistas a origem dos Siluriformes pareça
ser monofilética, o monofiletismo de alguns gêneros como Hypostomus, tem sido
freqüentemente questionada. Isso se deve aos caracteres morfológicos complexos e
confusos e à significativa variabilidade intra-específica encontrada neste gênero e
26
gêneros intimamente relacionados (WEBER & MONTOYA-BURGOS, 2002). Ao
nível de família, a filogenia ainda permanece confusa, talvez necessitando da
associação de dados morfológicos, com análises genéticas e citogenéticas, para se
chegar a uma filogenia mais esclarecedora com relação aos Loricariidae.
Figura 11- Filogenia de Pterygoplichthys e gêneros relatados por WEBER (1992),
baseado em osteologia e características externas.
1.6 CITOGENÉTICA DE PEIXES
As informações sobre os cariótipos dos peixes ainda são bastante
escassas, cobrindo apenas 14% das espécies conhecidas. Uma das causas desta
escassez de dados é o tamanho reduzido dos cromossomos da grande maioria de
peixes e a baixa resolução das técnicas de bandeamento, que em mamíferos são
bastante desenvolvidas (BRUM, 1995). Porém após certas modificações e
adaptações nas diversas técnicas propostas principalmente para mamíferos, pode-
se atualmente obter excelentes resultados, incluindo-se alguns bandeamentos,
aplicação de fluorocromos e hibridizações in situ.
De modo geral, o número cromossômico diplóide dos peixes varia de
2n=12 a 2n=250, e a quantidade de DNA de 0,4 pg a 140 pg, além de polimorfismos
Megalancistrus
Glyptoperichthys
Pterygoplichthys
Liposarcus
Hypostomus
27
intrapopulacionais e intraespecíficos (KIRPICHNIKOV, 1981 apud ANDREATA,
1991). A maioria, entretanto, varia de 2n=44 a 2n=60 (OLIVEIRA & GOSZTONYI,
2000). Esta extensa variabilidade do número de cromossomos fez com que autores
propusessem modelos de distribuição e tamanho populacional que explicam esta
variabilidade em determinados grupos de peixes. Estes modelos seguem uma linha
de raciocínio baseada no fato de que o isolamento de bacias hidrográficas com a
formação de populações alopátricas favorece a especiação (ANDREATA, 1991).
Os estudos citogenéticos em peixes neotropicais iniciaram na década
de 60 por pesquisadores europeus e no inicio da década de 70 por pesquisadores
brasileiros (ARTONI, 1996). Esses estudos, baseados inicialmente em cortes de
tecidos ou esmagamento de embriões, testículos ou tecidos hematopoiéticos tiveram
um notável avanço a partir da década de 70, com a utilização da técnica de
suspensão de células e secagem ao ar (CAMILO, 2004).
Os primeiros estudos cariotípicos em peixes ficaram restritos a
caracterização do número cromossômico das espécies. Tentativas de análise de
modelos evolutivos, utilizando dados genéticos e citogenéticos foram feitas
inicialmente por AVISE & GOLD (1977 apud CASTRO, 2004).
Gradativamente as análises cariotípicas deixaram de ter um caráter
restrito, meramente descritivo, passando a abranger populações. A ocorrência de
variabilidade cariotípica tem sido freqüentemente constatada, fato devido
principalmente à expansão das análises citogenéticas populacionais e a melhoria
qualitativa das técnicas de pesquisa nessa área (FENOCCHIO, 1993).
O levantamento feito por ALMEIDA-VAL et al. (1991) constatou que
nos grupos de peixes da região Amazônica há uma tendência conservativa quanto
ao número e estrutura dos cromossomos das famílias Anastomidae, Curimatidae,
28
Prochilodontidae (Characiformes) e Cichlidae (Perciformes). Entretanto, observa-se
uma diversidade da variabilidade cromossômica nas famílias Erythrinidae
(Characiformes) e Callichthyidae (Siluriformes).
OLIVEIRA et al. (1988) buscaram relacionar números cromossômicos e
filogenia dentro dos Ostariophysi, verificando uma tendência no aumento do número
cromossômico nas linhagens mais derivadas. Por outro lado, foi possível observar
que, enquanto alguns grupos apresentam uma grande variação de número
cromossômico, outros possuem uma constituição cariotípica bastante estável.
ARNASON (1972 apud DE OLIVEIRA, 1996) propõe que essa estrutura cariotípica
parece estar de um modo geral, relacionada à estrutura populacional das espécies.
Assim, grupos caracterizados por uma grande vagilidade e por populações
compostas de grande número de indivíduos mostram uma constituição cariotípica
estável. Em contraste, grupos com baixa vagilidade e pequeno numero de indivíduos
na população apresentam uma grande variabilidade cariotípica interespecífica e
interpopulacional. Um terceiro grupo formado por organismos com baixa vagilidade,
porém com um número elevado de indivíduos na população, apresentam em geral
espécies com diferentes números cromossômicos, como exemplo (OLIVEIRA et al.
1988), Prochilodontidae, Gymnotiformes e Callichthyidae respectivamente.
Dados indicam a descrição de cariótipos para cerca de 2.600 espécies
de peixes em todo o mundo (OZOUF-COSTAZ & FORESTI, 1992 apud CAMILO,
2004), do montante da ictiofauna neotropical, são conhecidos dados citogenéticos
(números haplóides/diplóides) de cerca de 921 espécies, distribuídas em 252
gêneros e 44 famílias (OLIVEIRA et al., 2000).
Cromossomos sexuais são verificados para 40 espécies e 29 possuem
cromossomos supranumerários; o conteúdo de DNA nuclear de 56 espécies varia de
29
1,04±0,09 pg em Corydoras cf. simulatus (2n=62), a 8,75±1,50 pg, em Corydoras
metae (2n=92). Considerando que a ictiofauna de água doce dos neotrópicos pode
atingir até 5.000 espécies, tem-se que o numero de espécies citogeneticamente
investigadas é bastante diminuto, frente à diversidade encontrada nesta região
(ARTONI et al., 1999).
Na família Loricariidae constata-se a existência de uma ampla
variedade cariotípica numérica, com números entre 2n=36 cromossomos em
Rinelocaria latirostris (GIULINAO-CAETANO, 1998) a 2n=80 cromossomos em
Hypostomus sp. (ARTONI, 1996).
1.6.1 HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA
O termo heterocromatina constitutiva foi proposto por HEITZ (1928,
apud SUMNER, 2003) para denominar regiões do cromossomo que permanecem
condensadas durante todo o ciclo celular. BROWN (1966 apud DE OLIVEIRA, 1996)
reconheceu dois tipos de heterocromatina: A heterocromatina constitutiva que
permanece condensada durante todo o ciclo celular e em todas as células do
individuo, concentrando-se geralmente em blocos nos cromossomos. Aparece em
ambos os homólogos, na mesma posição, e não contem genes estruturais. O
segundo tipo, a heterocromatina facultativa é por definição um tipo de
heterocromatina que ora se comporta como heterocromatina (mantendo-se
condensada durante a interfase), ora como uma típica eucromatina. Alem disso,
aparece em apenas um dos homólogos de cada par, envolvem cromossomos
inteiros, não aparecem em blocos, e não possui nenhuma particularidade quanto a
composição do DNA.
30
A função da heterocromatina constitutiva ainda é obscura. Inúmeras
propriedades lhe são atribuídas, tais como facilitar a ocorrência de rearranjos,
manter a estrutura do núcleo celular, favorecer o pareamento na meiose e proteger
regiões geneticamente ativas. Freqüentemente, a mesma caracteriza-se por
apresentar-se em estado condensado, com replicação tardia, composta em grandes
extensões por seqüências curtas e altamente repetitivas de nucleotídeos, chamadas
de DNA satélite. Essas seqüências não transcrevem, sendo por isso geneticamente
inativas, localizam-se em regiões especificas do cromossomo, com tendência a
associar-se com outras regiões heterocromáticas (HSU et al., 1975; BIANCHI, 1978;
BABU & VERMA, 1986 apud DE OLIVEIRA, 1996).
A heterocromatina classificada como constitutiva é universalmente
detectada pela técnica de bandeamento C, de SUMNER (1972), com adaptações
locais. Nesta técnica, o pré-tratamento modifica a estrutura do cromossomo. Sabe-
se também que o bandeamento C não revela todos os tipos de heterocromatina,
utilizando-se alternativamente o tratamento com fluorocromos Cromomicina A3
(CMA3), Mitramicina (MM) e 4,6-diamidino-2-phenyllindole (DAPI), que tem sido
comumente usados para localizar heterocromatinas ricas em G-C e A-T, que são
aparentemente homogêneas pelo tratamento com Banda C e Giemsa (SWARÇA et
al., 2003).
Fluorocromos base específicos tem sido utilizados em peixes, mais
freqüentemente para a análise das regiões organizadoras de nucléolos (NORs). O
uso de fluorocromos, no estudo de regiões heterocromáticas, tem sido menos
abrangente (ARTONI, 1996). No entanto, estas têm se mostrado freqüentemente
ricas em GC, em resposta a Cromomicina A3. MAYR et al. (1988), estudando três
espécies de Salmonideos, constataram a presença de vários blocos
31
heterocromáticos centroméricos ricos em bases A-T, quando tratados com
DAPI/Actinomicina D.
1.6.2 AS REGIÕES ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS (NORs)
As regiões organizadoras de nucléolos são segmentos de DNA onde
se localizam os genes responsáveis pela síntese de RNAr 18S e 28S. Esses genes
podem estar concentrados em único sitio cromossômico do genoma ou ocorrer em
múltiplos sítios, apresentando distribuição distinta para cada espécie (HSU, 1975
apud DE OLIVEIRA, 1996)
A identificação das NORs em cromossomos metafásicos por meio da
técnica de impregnação com nitrato de prata (GOODPASTURE & BLOOM, 1975;
HOWELL & BLACK, 1980) tem sido uma metodologia simples e eficaz, amplamente
empregada em vertebrados.
Apenas as NORs que estiverem ativas na interfase anterior a mitose
durante a qual a célula foi fixada e corada por nitrato de prata são marcadas,
podendo variar a nível inter e intra-especifico, e mesmo inter e intraindividual quanto
ao número, localização, intensidade e tamanho (GOODPASTURE & BLOOM, 1975).
Essas diferenças são atribuídas tanto as atividades funcionais quanto ao número de
cístrons ribossomais (CHEUNG et al., 1989 apud DE OLIVEIRA, 1996).
A ocorrência de NORs simples tem se mostrado muito freqüente,
embora variações intraespecificas e intraindividuais sejam freqüentemente
observadas (ANDREATA, 1991; ARTONI, 1996; FENOCCHIO, 1993; KAVALCO,
2003; SOUZA, 2003; CASTRO, 2004, entre outros). Situações de heteromorfismos
de tamanho das NORs em relação aos seus homólogos são freqüentes (ARTONI,
1996; CASTRO, 2004; KAVALCO et al.,2005). Segundo GOLD (1979 apud ARTONI,
32
1996) a diferença de tamanho das NORs entre cromossomos homólogos pode ser
em decorrência não apenas do crossing-over desigual, mas também devido a
duplicação acidental do DNA ou distúrbios regionais na replicação do DNA.
1.7 ASPECTOS CITOGENÉTICOS DOS SILURIFORMES.
Estudos citogenéticos em Siluriformes mostram que o número modal é
2n= 58. A ampla dispersão do número diplóide em diversas modas entre seus
membros sugere que rearranjos cromossômicos foram freqüentemente associados
com os processos de especiação neste grupo. Além disso, a alta freqüência de
números diplóides maiores que 2n=58 (24% das espécies cariotipadas) sugere que
eventos de especiação entre os Siluriformes foram relacionados a um aumento no
número cromossômico. Algumas famílias, tais como Callichthyidae e Loricariidae,
além do incremento no número de cromossomos, também tiveram um aumento no
DNA, sugerindo que eventos de poliploidia podem ter estado presente na história
evolutiva destas famílias (OLIVEIRA et al., 1988). De acordo com LEGRANDE
(1981), o ancestral dos bagres provavelmente tinha 2n=58 cromossomos.
Em Siluriformes, vários estudos citogenéticos foram conduzidos nas
subordens Gimnotoidei e Siluroidei. Na subordem Siluroidei, a estrutura cariotípica
parece ser conservada, sendo que 2n= 56±2 deve representar o numero basal.
Contudo, mesmo neste grupo existem exemplos de intensa diversificação cariotípica,
como em Loricariidae com número cromossômico diplóide variando de 2n=44 a 80
(ARTONI et al., 1999).
A ocorrência de polimorfismos devido à ocorrência de cromossomos
supranumerários, pode ser exemplificado na subfamília Loricariinae (SCAVONE &
JÚLIO JR., 1995).
33
A determinação de um sistema de cromossomos sexuais, do tipo
ZZ/ZW, com heterogametia feminina, foi encontrado em algumas espécies dos
gêneros Loricariichthys (SCAVONE & JÚLIO JR., 1995), Hypostomus (ARTONI et
al., 1998), e Microlepdogaster (ANDREATA et al., 1993), evidenciando-se nestes
casos uma heterocromatização e alteração de tamanho do cromossomo W e
resultando numa diferenciação dos cromossomos sexuais (ARTONI et al., 1999). O
sistema XX/XY foi descrito em Pseudotocinclus tietensis (Loricariidae) (ANDREATA
et al., 1992).
1.7.1 DADOS CITOGENÉTICOS NA FAMÍLIA LORICARIIDAE
Apesar da grande importância que os Loricariidae representam para a
região Amazônica, poucos têm sido os trabalhos científicos referentes a eles. As
análises citogenéticas feitas até agora sugerem que os principais eventos de
diversificação cariotípica foram os rearranjos Robertsonianos (fissões e fusões),
inversões pericêntricas e poliploidia (MICHELE et al., 1977; ANDREATA, 1991,
1993; ARTONI & BERTOLLO, 1996; SOUZA, 2003; CASTRO, 2004).
Dentro da família Loricariidae, a subfamília Hypostominae é o grupo de
peixes com maior número de espécies cariotipadas, principalmente as pertencentes
ao gênero Hypostomus. Apesar da relevância dos seus dados citogenéticos, existe
pouca concordância dos resultados obtidos entre os vários trabalhos. Isto se deve
ao fato de que esta subfamília apresenta enorme variedade de espécies,
amplamente distribuídas, com seus representantes habitando quase todos os rios e
lagos da América do Sul (CASTRO, 2004).
Um dos marcos do inicio dos trabalhos da citogenética de Loricariidae,
está em MICHELE et al. (1977), que descreveram pela primeira vez o cariótipo de
34
cinco espécies: Plecostomus paulinus com 2n=74, P. ancistroides com 2n=68, P.
strigaticeps com 2n=74, P. macrops com 2n=68 e Loricaria macrodon com 2n=58.
Estes autores sugeriram que os exemplares do gênero Plecostomus tiveram uma
origem tetraplóide e Loricaria uma origem triplóide. Para as espécies de P.
ancistroides e P. macrops foi encontrado um par heteromórfico, possivelmente de
natureza sexual.
ANDREATA (1991) comparou citogeneticamente oito espécies da
subfamília Hypoptopomatinae, Otocinclus affinis com 2n= 54, Microlepdogaster
leucofrenatus com 2n variando entre 54, 55 e 56, M. depressicauda com 2n=54,
Microlepdogaster sp. com 2n=54, Pseudotocinclus tietensis com 2n=54,
Pseudotithyris obtusa com 2n=54 e Parotocinclus maculicauda com 2n=54 e
Otocinus aff. vetitus, com 2n=72. Em M. leucofrenatus foi identificada a presença de
um sistema de diferenciação sexual do tipo ZZ/ZW e de zero a dois cromossomos
supernumerários. As espécies com 2n=54 apresentaram variabilidade na
constituição cariotípica, localização das NORs e padrões de heterocromatina
constitutiva. Todas as espécies apresentaram um único par de NORs. Segundo o
autor, a variabilidade cariotípica encontrada nas espécies e populações com 2n=54
devem estar relacionadas com a ocorrência de rearranjos do tipo inversão
pericêntrica. Já os rearranjos do tipo fissão/fusão cromossômica parecem estar
envolvidos nas relações cariotípicas entre Otocinus aff. vetitus e as demais
espécies.
SCAVONE & JÚLIO JR. (1994) analisaram peixes do gênero Loricaria
provenientes do rio Paraná, encontrando em Loricaria prolixa um número modal
2n=62 e NF= 84, as NORs situadas em apenas um par de cromossomos e a
heterocromatina constitutiva localizada nas regiões centroméricas e nos braços
35
longos de um par cromossômico acrocêntrico, sendo esse mesmo padrão descrito
para Loricaria sp.. Esses autores encontraram ainda de zero a cinco cromossomos
supernumerários em fêmeas de Loricaria prolixa e Loricaria sp.
SCAVONE & JÚLIO JR. (1995), analisando 26 espécimes de
Loricariichthys platymetopon, encontraram 2n= 54 cromossomos e NF = 84 em
machos e fêmeas, com um heteromorfismo sexual do tipo ZZ/ZW. A
heterocromatina constitutiva marcou apenas as regiões centroméricas dos
cromossomos sexuais, como ocorre no restante dos cromossomos do cariótipo,
além de todo o braço menor de um par submetacêntrico, onde é coincidente com a
NOR.
ARTONI & BERTOLLO (1996) analisaram o cariótipo de dez espécies
da subfamília Hypostominae: Hypostomus ancistroides com 2n=68, Hypostomus
sp.A com 2n=70, Hypostomus sp.B com 2n=72, Hypostomus regani com 2n=72,
Hypostomus sp.C com 2n=72, Hypostomus sp.D(1) com 2n=72, Hypostomus sp.D(2)
com 2n=72, Hypostomus albopunctatus com 2n=74, Hypostomus aff. auroguttatus
com 2n= 76 e Hypostomus sp.E com 2n=80. Diferenças marcantes no número de
cromossomos metacêntricos, submetacêntricos, subtelocêntricos e acrocêntricos
foram observadas. Algumas espécies apresentaram apenas um par portador de
NOR, com diferenças de tamanho entre os homólogos, enquanto em outras
espécies foram encontradas até seis marcações.
ARTONI & BERTOLLO (1999) analisaram o aspecto e a estrutura da
heterocromatina constitutiva de 30 espécies do gênero Hypostomus. O número
diplóide variou de 2n=68 até 2n=80. Foi observada uma grande variação na fórmula
cariotípica, a qual é evidente neste grupo. Dois tipos de heterocromatina, ricas em
G-C e A-T, foram identificadas com o uso de fluorocromos CMA3 e DAPI. Em
36
algumas espécies as bandas C marcaram principalmente regiões teloméricas e
centroméricas dos cromossomos; em outras espécies, foram observadas marcações
intersticiais.
SOUZA (2003) fez uma descrição cariotípica de peixes dos gêneros
Baryancistrus, Parancistrus, Peckoltia e Ancistrus, usando coloração convencional,
identificação de NORs, bandeamento C e cromomicina A3. O autor considerou
2n=52 como o número cromossômico basal para a subfamília Ancistrinae. Ele
observou que os principais mecanismos de rearranjos cromossômicos nesta
subfamília são as inversões, sendo que no gênero Ancistrus foi sugerida a
ocorrência de rearranjos Robertsonianos, o que o torna o mais derivado
cariotipicamente, por apresentar uma redução no seu número diplóide para 2n=48.
Na espécie Baryancistrus aff. niveatus foi observada a presença de blocos
heterocromáticos, ricos em pares de bases G-C, demonstrando ser a espécie mais
derivada do gênero, pois as outras espécies apresentaram poucos cromossomos
marcados pelo Ba(OH)2 restringindo-se principalmente ao centrômero. Ainda, os
dados cromossômicos identificaram uma maior proximidade cariotípica entre os
gêneros Baryancistrus e Parancistrus.
KAVALCO et al. (2004) analisaram a estrutura cariotípica e a
composição e distribuição da heterocromatina no cariótipo de quatro espécies da
família Loricariidae: Neoplecostomus microps (Neoplecostominae) com 2n=54,
Harttia loricariformis (Loricariinae) com 2n=56, Hypostomus affinis (Hypostominae)
com 2n=66 e Upsilodus sp. (Upsilodinae) com 2n=96. A quantidade e composição
da heterocromatina foram completamente desproporcionais entre as espécies
estudadas, com uma ocorrência abundante e, sobretudo rica em GC em Upsilodus
sp. e escasso e balanceado em H. loricariformis. Todos os cromossomos de H.
37
affinis são ricos em heterocromatina, ricas em GC e relacionados com NORs. N.
microps apresentou baixa quantidade de heterocromatina intersticial e rica em GC.
KAVALCO et al. (2005) reanalisaram essas quatro espécies,
adicionando dados da localização do rDNA 18s, obtidos por impregnação de nitrato
de prata e por FISH. N. microps apresentou 2n=54, fórmula cariotípica 24M
20SM 10ST e número fundamental de 108, apenas um par portador de NOR foi
encontrado usando nitrato de prata e FISH, numa posição intersticial no braço longo
do cromossomo submetacêntrico do par 14. H. loricariformis apresentou 2n=56,
fórmula cariotípica 16M 22SM 10ST 8A e NF = 106. A NOR do tipo simples foi
localizada na região terminal do braço longo do par cromossômico acrocêntrico 25.
H. affinis apresentou 2n=66, com fórmula cariotípica 14M 14SM 12ST 26A e NF =
106. Observou-se de dois a cinco cromossomos portadores de NOR, com uma
moda igual a 4; com o uso de FISH, cinco regiões rDNA 18S foram observadas.
Upsilodus sp apresentou o maior número diplóide observado em Loricariideos,
2n=96, com uma formula cariotípica 16M 8SM 72A e um NF = 120. As marcações
por nitrato de prata e 18S-FISH indicaram a presença de uma NOR simples,
localizada na região média do par cromossômico metacêntrico 4, na região terminal
do braço longo.
Na subfamília Hypostominae há uma larga variação no numero diplóide
com valores em torno de 2n= 52 em Liposarcus anisitsi a 2n= 80 em Hypostomus
sp. Em consideração ao alto número de espécies de Loricariidae, o número de
espécies cariotipadas, pode ser considerado como baixa e o ponto mais importante
é que apenas espécies de uns poucos gêneros foram bem estudados (ALVES et al.,
2005).
38
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral.
Caracterizar citogeneticamente, através de técnicas de citogenética
clássica e aplicação de fluorocromos, as espécies Glyptoperichthys xinguensis
(Weber, 1991), Pseudacanthicus sp. (Bleeker, 1862) e Scobinancistrus aureatus
(Isbrüker & Nijssen, 1989), pertencentes à família Loricariidae, subfamília
Hypostominae, sendo as duas espécies primeiramente citadas pertencente à tribo
Pterygoplichthini e as duas últimas à tribo Ancistrini, coletados no rio Xingú, no
Estado do Pará.
2.2 Objetivos específicos.
• Determinar o número diplóide, número fundamental e morfologia cromossômica
das espécies: Glyptoperichthys xinguensis, Pseudacanthicus sp. e
Scobinancistrus aureatus.
• Analisar a distribuição de blocos heterocromáticos nos cariótipos, através da
aplicação de técnicas de bandeamento C.
• Analisar o número e localização das Regiões Organizadoras de Nucléolos
(NORs).
• Estabelecer o padrão de coloração pelos fluorocromo DAPI.
• Inferir sobre possíveis mecanismos da evolução, com base na análise de dados
cromossômicos.
• Fornecer dados adicionais para a identificação taxonômica das espécies e sua
filogenia.
39
3 MATERIAL E MÉTODOS
3 . 1 E S P É C I E S A N A L I S A D A S
No presente trabalho estudamos as características citogenéticas de
três espécies de peixes da família Loricariidae, conhecidos popularmente como
“cascudos”, “acari”, “limpa-vidros” ou “bodós”, coletadas no rio Xingu, município de
Altamira - PA.
Os espécimes foram processados no Laboratório de Citogenética
Animal, do Departamento de Genética da UFPA, e protocolados da seguinte forma:
- Glyptoperichthys xinguensis. – (Figura 12)
Protocolo Nº P 504 P 529 P 611 P 630_02; P 630_03; P 630_04
- Scobinancistrus aureatus. - (Figuras 13,14 e 15).
Protocolo Nº P 842
P 843
P 851
- Pseudacanthicus sp – (Figuras 16 e 17). Protocolo Nº P 841
P 844
P 858
P 870
P 971
P 972
40
Figura 12- Vista lateral de Glyptoperichthys xinguensis (Acari). (disponível em:http://www.homeklbauter.de)
FIGURA 13. Vista lateral de Scobinancistrus aureatus. (Picota-ouro)
FIGURA 14. Vista dorsal de Scobinancistrus aureatus (Picota-ouro).
41
FIGURA 15. Vista ventral-lateral de Scobinancistrus aureatus (Picota-ouro)
FIGURA 16. Vista lateral de Pseudacanthicus sp. (Assacu)
FIGURA 17. Vista ventral de Pseudacanthicus sp. (Assacu)
42
3. 2 T É C N I C A S U T I L I Z A D A S
3.2.1 Técnica de Indução de Mitoses.
Com a intenção de se obter um melhor resultado no índice mitótico, foi
aplicada a técnica de indução de mitoses por fermento, descrita por COLE &
LEAVENS (1971) para anfíbios e répteis, modificada por BERTOLLO et al., (1986),
para peixes, com o seguinte procedimento:
1. Preparar uma solução de fermento biológico (Fleischmann) na seguinte
proporção: 0,5g de fermento, 0,5g de açúcar e 7ml de água destilada;
2. Incubar a solução em estufa (37º C) por cerca de 20 minutos;
3. Injetar a solução intramuscular na região dorso-lateral do peixe, na proporção
de 1ml para 100g de peso do animal;
4. Deixar o peixe em aquário com sistema de aeração e iluminado, por 24 a 36
horas, antes de ser sacrificado.
3.2.2 Obtenção dos Cromossomos Mitóticos.
No estudo dos cromossomos mitóticos foi utilizada a porção anterior do
rim (rim cefálico), que é o órgão hematopoiético nos peixes, preparado segundo a
técnica de “air drying” modificada, para peixes, por BERTOLLO et al. (1978) que
consiste em:
1. Injetar, intraperitonialmente, uma solução aquosa de colchicina 0,025% na
proporção de 1ml/100g de peso do animal;
2. Manter o peixe em tanque aerado por um período de 45 a 60 minutos, em
seguida sacrificar o animal e retirar o rim;
43
3. Colocar o rim em uma pequena cuba de vidro contendo 10 ml de solução
hipotônica de cloreto de potássio a 0,075M;
4. Dissociar bem o material. Para melhor separação dos blocos celulares, utilizar
uma seringa de vidro desprovida de agulha, aspirando e expirando suavemente
o material;
5. Levar a suspensão obtida para estufa a 37oC por 30 minutos;
6. Ressuspender, cuidadosamente, o material com auxilio de uma pipeta Pasteur
em seguida transferi-lo para um tubo de centrífuga e adicionar quatro gotas de
fixador Carnoy, recém preparado e gelado a uma temperatura de 4ºC;
7. Centrifugar durante 10 min. a 900 rpm, descartando o sobrenadante;
8. Adicionar, com cuidado, 8ml do fixador Carnoy, deixando escorrer através da
parede do tubo;
9. Ressuspender cuidadosamente o material com auxilio de uma pipeta Pasteur;
10. Repetir os itens 7 a 9 por mais duas vezes. Após a última centrifugação e
eliminação do sobrenadante, adicionar fixador em quantidade suficiente para
obter uma suspensão celular de boa concentração (cerca de 1ml de fixador para
cada 0,5 ml de sedimento).
11. Ressuspender com cuidado e guardar em tubos de ependorff no freezer (-18ºC)
ou trabalhar.
44
3.2.3 Preparação Citológica das Lâminas
A preparação das lâminas para análise seguiu o procedimento abaixo:
1. Retirar o sobrenadante, separado da suspensão celular por sedimentação
provocada por centrifugação a 1000 rpm por 10 min., com uma pipeta
Pasteur,
2. Acrescentar cerca de 2 ml de fixador Carnoy novo e gelado em cada tubo,
ressuspendendo em seguida. Manter metade do tubo imerso em gelo;
3. Colocar uma lâmina limpa imersa dentro de um Becker pequeno, contendo
água destilada, e aquecer em forno microondas por 45 segundos;
4. Pingar 1-2 gotas da suspensão celular, com uma pipeta Pasteur, sobre uma
lâmina levemente inclinada contendo uma película de água de
aproximadamente 60° - 70°C, de forma que a diferença de temperaturas e a
película de água ajudem a melhor espalhar os cromossomos metafásicos;
5. Deixar o material sobre a lâmina secar em temperatura ambiente ou sobre
uma chapa quente (50°-60°);
6. As lâminas são então guardadas em caixas plásticas apropriadas e mantidas
em temperatura ambiente até o momento de utilização.
3.2.4 Técnica de Coloração Convencional
Para a análise convencional das lâminas em microscópio, o material
citológico é corado com Eosina Azul de Metileno, segundo Giemsa (Merck):
1. Diluir, para cada lâmina, 0,3 ml de corante em 3 ml de Tampão Fosfato pH 6,8
(solução final a 10%);
45
2. Despejar sobre a lâmina a solução e deixar corar por 10 minutos;
3. Lavar com água destilada e deixar secar.
3.2.5 Técnica para o bandeamento C.
A técnica utilizada para a caracterização da heterocromatina
constitutiva (Banda C), foi basicamente aquela descrita por SUMNER (1972), com
algumas alterações.
1. Pingar duas gotas da suspensão celular em uma lâmina e deixar secar;
2. Imergir a lâmina com pelo menos dois dias de envelhecimento numa cubeta
contendo HCl 0,2 N à temperatura ambiente, por 15mim;
3. Lavar em água destilada e deixar secar ao ar;
4. Incubar a lâmina em uma solução de 2xSSC a 60oC por 15mim;
5. Lavar em água destilada e deixar secar;
6. Incubar a lâmina em solução de hidróxido de bário a 2%, filtrada, a 46° por
alguns segundos;
7. Lavar em HCl 0,2N, para interromper a ação do bário;
8. Incubar a lâmina em uma solução de 2xSSC a 60oC por 30mim;
9. Lavar em água destilada e deixar secar;
10. Corar com Giemsa a 10% por 20min.
11. Lavar com água destilada e deixar secar;
12. Observar ao microscópio e fotografar as melhores metáfases.
46
3.2.6 Técnica para detecção da região organizadora do nucléolo (NOR).
A técnica utilizada para a caracterização das regiões organizadoras de
nucléolo (NOR) foi aquela descrita por HOWELL & BLACK (1980), com algumas
modificações.
1. Adicionar sobre uma lâmina já com material, uma gota de gelatina aquosa a 2%;
2. Adicionar sobre a gota anterior, duas gotas de solução aquosa de nitrato de
prata a 25%. Misturar levemente e cobrir com lamínula de vidro;
3. Incubar numa câmara úmida em banho-maria a 60oC, por alguns minutos,
dependendo do monitoramento da coloração da lâmina;
4. Após o tempo apropriado, lavar em água destilada, possibilitando que a lamínula
seja retirada pela própria água.
5. Corar com Giemsa a 2%, diluído em tampão fosfato pH 6,8, durante 30
segundos
6. Lavar com água destilada e deixar secar ao ar;
7. Levar ao microscópio e fotografar as melhores metáfases.
3.2.7 Técnica de marcação com DAPI
O fluorocromo DAPI (4’-6-diamidino –2-phenylindole) marca
preferencialmente regiões ricas nos pares A-T. O protocolo seguido foi de
SCHWEIZER (1980) com modificações:
1. Desidratar a lâmina envelhecida em uma bateria de álcoois (Etanol), da seguinte
maneira:
2 min. – álcool 70% (2x)
2 min. – álcool 90% (2x)
4 min. – álcool 100% (1x)
47
2. Armazenar a lâmina em estufa a 37º C por 2h30min.
3. Mergulhar a lâmina em Formamida 70% a 65ºC, por 45 segundos.
4. Passar a lâmina novamente pela bateria de álcoois (Etanol), da seguinte
maneira:
4 min. – álcool 70% (gelado)
2 min. – álcool 70%
2 min. – álcool 90% (2x)
4 min. – álcool 100%
5. Aquecer a solução de uso do DAPI a 37ºC, por 18 minutos, colocando-se o
recipiente em banho-maria, com a lâmina mergulhada;
6. Adicionar uma gota de antifade sobre o material;
7. Cobrir o material com lamínula de vidro 24x50mm, e gentilmente pressionar em
papel filtro, para saída do excesso de soluções;
8. Aplicar esmalte ao redor da lamínula, e a armazenar em câmara escura, na
geladeira, até o momento da análise.
3.2.8 Análise Cromossômica e Captura de Imagens
Para a caracterização cromossômica foram analisados pelo menos 30
metáfases por indivíduo.
Para estabelecer o número modal de NORs, foram analisadas 15
metáfases completas (com número de cromossomos igual à moda para o
espécime).
Metáfases em coloração convencional foram fotografadas em
microscópio Zeiss, em campo claro e com objetiva de imersão, sendo utilizado o
filme Imagelink Kodak e revelador de papel Dektol, que depois foi copiado em papel
48
F3 da Kodak. As imagens das preparações de banda C, NOR e DAPI foram
capturadas digitalmente com o auxílio de câmera Zeiss AxioCam MRm por meio do
programa Axio Vision 3.1 (controlador da câmera de vídeo e de captura digital de
imagens). No caso da preparação com fluorescência foi feita uma pseudocoloração
das imagens no próprio programa Axio Vision. Na edição final das imagens, foi
utilizado o programa Adobe Photoshop 6.0.
3.2.9 Técnica de Revelação Fotográfica
Os filmes negativos foram revelados com solução reveladora Kodak
D-76 por 10 minutos e fixados em fixador fotográfico Kodak por também 10 minutos.
Os filmes foram lavados em água corrente por aproximadamente 1 hora.
As cópias fotográficas foram feitas por meio de um ampliador
fotográfico, provido de exposímetro, em papel Kodabrome F3 Print RC Kodak,
esmaltado, reveladas em solução reveladora Kodak Dektol por cerca de 30
segundos, lavadas em solução interruptora (1 ml de ácido acético em 1 l de água) e
fixadas em fixador fotográfico Kodak por 15-30 minutos. Todas as soluções foram
feitas segundo as instruções das embalagens.
As fotografias foram deixadas lavando em água corrente por uma hora
e, posteriormente, foram deixadas em temperatura ambiente para secar.
49
3.3 M E D I D A S CR O M O S S Ô M I C A S
As melhores fotografias foram recortadas e os cariótipos montados e
organizados aos pares e em ordem decrescente de tamanho em uma folha de papel
ou no próprio ambiente do Adobe Photoshop 6.0.
Para determinar o número de braços (número fundamental -NF), foram
considerados os cromossomos Metacêntricos e Submetacêntricos como tendo dois
braços e os Subtelocêntricos/Acrocêntricos como tendo um.
Os cromossomos foram classificados em três grupos (Metacêntricos,
Submetacêntricos e Subtelocêntricos/Acrocêntricos), em ordem decrescente de
tamanho (LEVAN et al., 1964), de acordo com procedimentos adaptados para este
grupo de peixes (ARTONI & BERTOLLO, 1996).
50
4 R E S U L T A D OS
4.1 O Cariótipo de Glyptoperichthys xinguensis
Analisou-se seis exemplares de Glyptoperichthys xinguensis (Figura
12), sem considerar a tipagem sexual. A análise cariotípica por coloração
convencional mostrou 2n=52 e NF = 84. O cariótipo é constituído por 05 pares
cromossômicos metacêntricos, 11 pares submetacêntricos e 10 pares
subtelocêntricos, conforme a Figura 18.
Blocos evidentes de heterocromatina constitutiva foram encontrados
nas regiões proximal, distal e pericentromérica em vários pares cromossômicos, já
as regiões centroméricas não apresentaram marcações pelo bandeamento C (Figura
19).
As NORs foram detectadas na posição terminal do braço longo de um
único par cromossômico submetacêntrico (Figura 20).
A coloração pelo fluorocromo DAPI evidenciou regiões concordantes
com alguns blocos heterocromáticos revelados no bandeamento C, como indicado
pelas setas na Figura 21.
51
Figura 18. Cariótipo por coloração convencional de Glyptoperichthys xinguensis.
Figura 19. Metáfase com bandeamento C de Glyptoperichthys xinguensis, as setas indicam cromossomos ricos em heterocromatina constitutiva.
1 2 3 4 5 6 7 8 9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
19 20 21 22 23 24 25 26
52
Figura 20. Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o cromossomo portador da NOR em Glyptoperichthys xinguensis.
Figura 21. Metáfase de Glyptoperichthys xinguensis corada com DAPI, as setas
indicam os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas.
53
4.2 O Cariótipo de Scobinancistrus aureatus
Foram analisados três exemplares de Scobinancistrus aureatus, sem
considerar a tipagem sexual (Figuras 13, 14 e 15). A análise cromossômica por
coloração convencional mostrou 2n=52 e NF = 78. O cariótipo é constituído por 02
pares cromossômicos metacêntricos, 11 pares submetacêntricos e 13 pares
subtelocêntricos, conforme a Figura 22.
Blocos evidentes de heterocromatina constitutiva foram encontrados
nas regiões proximal e distal em vários pares cromossômicos, já as regiões
centroméricas não apresentaram marcações pelo bandeamento C (Figura 23).
As NORs foram detectadas na posição terminal do braço longo de um
par cromossômico subtelocêntrico (Figura 24).
A coloração pelo fluorocromo DAPI evidenciou regiões concordantes
com alguns blocos heterocromáticos revelados no bandeamento C, como indicado
pelas setas na Figura 25.
54
Figura 22- Cariótipo por coloração convencional de Scobinancistrus aureatus.
Figura 23- Metáfase com bandeamento C de Scobinancistrus aureatus, as setas indicam pares ricos em heterocromatina constitutiva.
1 2 3 4 5 6
7 8 9 10 11
12 13 14 15 16 17
18 19 20 21 22 23
24 25 26
55
Figura 24- Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o cromossomo portador da NOR em Scobinancistrus aureatus.
Figura 25- Metáfase de Scobinancistrus aureatus , corada com DAPI, as setas indicam os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas.
56
4.3 O Cariótipo de Pseudacanthicus sp. Foram analisados quatro exemplares de Pseudacanthicus sp., sem
considerar a tipagem sexual (Figuras 16 e 17). A análise cromossômica por
coloração convencional mostrou 2n=52 e NF = 86. O cariótipo é constituído por 06
pares cromossômicos metacêntricos, 12 pares submetacêntricos e 08 pares
subtelocêntrico/acrocêntricos (Figura 26).
Blocos evidentes de heterocromatina constitutiva foram encontrados
nas regiões proximal e distal em alguns pares cromossômicos, enquanto as regiões
centroméricas não apresentaram marcações pelo bandeamento C (Figura 27).
As NORs foram detectadas na posição terminal do braço longo de um
par cromossômico submetacêntrico (Figura 28).
A coloração pelo fluorocromo DAPI evidenciou regiões concordantes
com alguns blocos heterocromáticos revelados no bandeamento C, como indicado
pelas setas na Figura 29.
57
Figura 26- Cariótipo por coloração convencional de Pseudacanthicus sp..
Figura 27- Metáfase com bandeamento C de Pseudacanthicus sp., as setas
indicam pares ricos em heterocromatina constitutiva.
1 2 3 4 5
6 7 8 9 10
11 1 2 13 14 15
16 17 18 19 20
21 22 23 24 25
26
58
Figura 28- Metáfase submetida à impregnação por Nitrato de Prata. A seta indica o
cromossomo portador da NOR em Pseudacanthicus sp.
Figura 29- Metáfase de Pseudacanthicus sp., corada com DAPI, as setas indicam os cromossomos que apresentam regiões DAPI positivas.
59
5 D I S C U S S Ã O
Um dos grandes problemas encontrados no estudo de Loricariidae é a
dificuldade de se identificar os animais ao nível de espécie. ARTONI (1996)
considera que a identificação dos gêneros de Hypostomus ao nível de espécie,
assim como sua sistemática se apresenta problemática. WEBER & MONTOYA-
BURGOS (2002) consideram que isto se deve aos caracteres morfológicos
complexos e confusos e à significante variabilidade intra-especifica encontrada neste
gênero e gêneros intimamente relacionados. Estudos citogenéticos nesta família
poderiam contribuir enormemente para a Sistemática Filogenética e a Taxonomia.
Dentre os Loricariidae, a subfamília Hypostominae apresenta uma
indiscutível variabilidade cariotípica, seja no numero diplóide, variando de 2n=52 a
2n=96, seja na fórmula cariotípica, nos padrões de bandeamentos ou no numero e
distribuição das NORs (CASTRO, 2004). Também apresentam uma ampla
distribuição geográfica neotropical, constituindo um dos grupos de peixes com maior
numero de espécies (ARTONI, 1996). Graças a estas particularidades esta
subfamília torna-se de grande interesse para estudos citogenéticos, através dos
quais pode-se inferir mecanismos evolutivos.
O cariótipo das espécies analisadas no presente trabalho, pertencentes
à subfamília Hypostominae, ainda não haviam sido descritos, e evidenciam a
ocorrência do número cromossômico diplóide igual a 52 em todas elas. Entretanto,
por outro lado, observou-se variabilidade na morfologia cromossômica, localização
das NORs e padrão de heterocromatina constitutiva nas diferentes espécies.
60
5.1 ANÁLISE CROMOSSÔMICA E FÓ R M U L A CARIOT ÍP ICA
Os estudos cromossômicos em peixes vêm, cada vez mais, fornecendo
informações sobre a variabilidade de cariótipos encontrados inter e
intraespecificamente. Esta variabilidade cromossômica intraespecifica é o que define
o polimorfismo cromossômico, ou seja, diferentes números e/ou fórmulas
cromossômicas para uma mesma espécie. A ocorrência desse polimorfismo deve-se
a rearranjos cromossômicos, que podem levar a mudanças no número diplóide da
espécie (fissão e fusão) ou apenas a mudanças na estrutura do cromossomo
(inversões, deleções, duplicações e translocações) (WHITE, 1977; JOHN, 1980;
GUERRA, 1988 apud CENTOFANE, 2000).
As diferenças existentes entre cariótipos de diferentes espécies e,
quando presentes, de diferentes indivíduos em espécies cromossomicamente
polimórficas, dependem de rearranjos cromossômicos que ocorreram em um
passado recente ou mais remoto, e estes, podem envolver um, dois ou mais
cromossomos simultaneamente, parecendo depender de dois eventos: quebra dos
cromossomos e inserção do segmento de maneira a diferir da posição original (DE
OLIVEIRA, 1996).
Hoje se sabe que a diversidade cromossômica pode ter implicações
filogenéticas, do mesmo modo que outras características morfológicas, dessa forma,
informações cariotípicas como associações e seqüências gênicas, posição do
centrômero e distribuição da eucromatina e da heterocromatina dentro do genoma,
dentre outras, podem ser utilizadas para a elucidação de problemas taxonômicos e,
conseqüente, fazer inferências filogenéticas (BENAZZI, 1973; PIECZARKA, 1995
apud SOUZA, 2003).
61
Fazendo uma comparação entre o cariótipo hipotético ancestral dos
Siluriformes que provavelmente apresentava 2n=58 (LEGRANDE, 1981), com o
número cromossômico variando de 2n=44 a 80 para a família Loricariidae (ARTONI
et al., 1999), juntamente com o proposto para a subfamília Hypostominae que
apresenta variação de 2n=52 a 80 (ARTONI, 1996), pode-se supor que esta
subfamília deve ser conservada em sua macroestrutura cariotípica, já que na visão
de ARTONI (1996) a subfamília Ancistrinae é uma das mais conservadas e que esta,
segundo ARMBRUSTER (1997) faz parte da subfamília Hypostominae como tribo
Ancistrini.
Segundo ARTONI & BERTOLO (1996) nas espécies com números
diplóides menores predominam cromossomos com dois braços (metacêntricos e
submetacêntricos), situação que de modo geral se inverte nas espécies com maiores
números diplóides, onde predominam subtelo e acrocêntricos, sendo que os
cariótipos com menor número diplóide são considerados os mais conservados,
enquanto que, os cariótipos com números diplóides maiores são tidos como
derivados, sendo a base principal dessas alterações cromossômicas os rearranjos
Robertsonianos, principalmente fissões cêntricas, que teriam incidido com maior
relevância durante a evolução desse grupo, não implicando, contudo, que as
espécies cariotipicamente mais conservadas sejam consideradas menos evoluídas
que as demais.
Esses dados reforçam a idéia de que rearranjos cromossômicos
sucessivos, possivelmente do tipo fissão cêntrica, poderiam estar envolvidos no
processo evolutivo desse grupo e, dessa maneira, pode-se sugerir que um alto
numero diplóide represente um caráter derivado na família Loricariidae (ALVES et
al., 2005). Dados disponíveis para os gêneros Hypostomus, Liposarcus, Rhinelepis,
62
Pognopoma e Pterygoplichthys, indicam que tanto rearranjos robertsonianos, quanto
inversões pericêntricas atuaram no processo de diversificação cariotípica dos
Hypostominae (KAVALCO, 2003). Entretanto, é possível que esta diversidade
cromossômica seja também reflexo de uma possível origem polifilética dos
Hypostominae, como indicado pelos estudos de filogenia morfológica (SCHAEFER,
1987). Por outro lado, também são encontradas nesta subfamília variações quanto
aos tipos cromossômicos (ARTONI, 1996), o mesmo podendo ser observados em
outras subfamílias e mesmo intrapopulacionalmente, como em Loricariinae
(GIULIANO-CAETANO, 1998).
Os dados cariotípicos obtidos pelo presente estudo, e demonstrados
na Tabela 05, pertinentes às espécies analisadas mostram uma boa semelhança na
macroestrutura cariotípica, com mesmo número diplóide, porém esta semelhança
cariotípica, segundo ARTONI (1996), não indica similaridade genética obrigatória,
podendo indicar um rearranjo Robertsoniano de fissão/fusão cêntrica em
Hypostominae e Loricariinae, sem alterações na macroestrutura do cariótipo, sugere
ainda uma evolução cariotípica nesta subfamília, acontecendo de forma mais ou
menos homogênea, e mantendo conservada a macroestrutura cariotípica. Nota-se
também pequenas diferenças na morfologia cromossômica, CAMILO (2004)
considera que essas diferenças se apresentam apenas na classificação
cromossômica, não inferindo qualquer alteração significativa quanto à configuração
cromossômica, já MARQUES (2002 apud CAMILO, 2004) considera que populações
de espécies com o mesmo número cromossômico, porém coletadas em localidades
diferentes, podem apresentar variações na estrutura cariotípica, devido a diferenças
nas medidas cromossômicas adotadas entre os diferentes autores, devido a classes
cromossômicas muito próximas ou podem mesmo ser resultado de rearranjos
63
cromossômicos não Robertsonianos, como inversões e translocações, alem da
adição de heterocromatina, caracterizando citótipos distintos.
Tabela 05- Número Cromossômico e Fórmula Cariotípica das espécies estudadas.
Espécie (2n) Fórmula Cariotípica
Glyptoperichthys xinguensis 2n=52 05 M + 11 SM + 10 ST
Scobinancistrus aureatus 2n=52 02 M + 11 SM + 13 ST
Pseudacanthicus sp. 2n=52 06 M + 12 SM + 08 ST/A
5.2 HETEROCROMATINA CONSTITUTIVA E FLUOROCROMO A-T ESPECÍFICO.
Nos gêneros estudados neste trabalho, observou-se a presença de
poucas marcações bem evidentes e outras mais pálidas, nos cromossomos tratados
pela técnica de bandeamento C. Estas marcações já foram descritas em outros
grupos de peixes (SWARÇA et al. 2003; SOUZA et al., 2003; MILHOMEM et al. 2003
apud CASTRO, 2004). ARTONI (1996) cita a ocorrência destas marcações em
Hypostomus e em outros grupos e considera que espécies com 2n menores
mostram heterocromatina centromérica ricas em G-C e as heterocromatinas
associadas as NORs ricas em A-T, e que espécies com 2n mais elevados, possuem
a totalidade da heterocromatina rica em G-C. No entanto, CASTRO (2004)
analisando Hypostomus plecostomus (2n=52) do Rio Xingu, encontrou a totalidade
da heterocromatina rica em G-C, enquanto outras espécies de Hypostomus, também
analisadas, mostraram heterocromatina rica em A-T (com exceção dos
centrômeros).
64
Os cromossomos das espécies estudados neste trabalho apresentaram
heterocromatina constitutiva distribuída somente em alguns pares, e na maioria dos
casos nas regiões próximas ao centrômero, pode-se notar também sua ocorrência
na porção distal do braço longo em alguns cromossomos.
Com o tratamento com o fluorocromo DAPI, nota-se que em alguns
pares as marcações banda C/DAPI são coincidentes, indicando a presença de
regiões ricas em bases A-T, porém em outro pares não ocorre esta coincidência, ou
a marcação não se tornou tão evidente a ponto de caracterizá-la. Esta variabilidade
na composição e distribuição da heterocromatina, observada nestes gêneros
estudados, foi observada de modo semelhante em GORNUNG et al. (1997 apud
MORELLI, 1998), estudando Danio rerio, onde também se observaram regiões
bandas C positivas, que também podiam ser notadas com DAPI. Esses dados
sugerem a ocorrência, nas espécies estudadas, de pelo menos dois tipos diferentes
de heterocromatina: as evidenciadas somente com banda C, e um segundo grupo
das evidenciadas com banda C/DAPI. Provavelmente, os blocos heterocromáticos
evidenciados somente por bandeamento C que não foram marcados com o DAPI
correspondem a regiões ricas em bases C-G.
Os exemplares analisados neste trabalho apresentaram padrões de
distribuição heterocromática muito semelhante. Entretanto, através da análise da
distribuição da heterocromatina é possível inferir que esta característica pode ser
utilizada como marcador populacional para o gênero Glyptoperichthys.
5.3 AS REGIÕES ORGANIZADORAS DE NUCLÉOLOS (NORS)
Os exemplares aqui estudados apresentaram NORs simples (ver
Figura 30). A ocorrência de NORs simples tem se mostrado muito freqüente entre os
65
peixes, embora variações intraespecificas e intraindividuais sejam freqüentemente
observadas (ANDREATA, 1991; ARTONI, 1996; FENOCCHIO, 1993; KAVALCO,
2003; SOUZA, 2003; CASTRO, 2004, entre outros). ALMEIDA-TOLEDO & FORESTI
(1985) sugerem que a presença de NORs simples ou NORs múltiplas caracterizam
determinados grupos de peixes.
Situações de heteromorfismos de tamanho das NORs em relação aos
seus homólogos são freqüentes (ARTONI, 1996; CASTRO, 2004; KAVALCO et
al.,2005). Porém nos espécimes aqui analisados, não se pode evidenciar a
ocorrência ou não de heteromorfismo, pois a marcação das NORs evidenciaram um
único cromossomo do par, como portador. GOODPASTURE & BLOOM (1975)
considera a ocorrência deste evento, sugerindo que, somente as NORs que
estiverem ativas na interfase anterior à mitose durante a qual a célula foi fixada e
corada por nitrato de prata são marcadas, podendo variar a nível inter e intra-
especifico, e mesmo inter e intraindividual quanto ao numero, localização,
intensidade e tamanho. Essas diferenças entre as NORs são atribuídas tanto a
atividades funcionais, quanto ao número de cístrons ribossomais (CHEUNG et al.,
1989 apud DE OLIVEIRA,1996).
ARTONI (1996) sugere que a maioria das espécies de Hypostominae
com NORs simples apresenta heteromorfismo de tamanho entre os homólogos,
essas diferenças de tamanho das NORs entre cromossomos homólogos pode ser
em decorrência não apenas do crossing-over desigual, mas também devido a
duplicação acidental do DNA ou distúrbios regionais na replicação do DNA.
Observou-se que os espécimes analisados neste trabalho
apresentaram uma distribuição de NORs semelhante, localizados no braço longo de
um cromossomo subtelocêntrico, com exceção de Glyptoperichthys xinguensis, que
66
apresentou marcação num cromossomo submetacêntrico, conforme mostra a Figura
30, sugerindo-se a ocorrência de mecanismos de fissão/fusão cêntrica no cariótipo
desta espécie
Figura 30- Comparação entre os cromossomos de NORs entre os
espécimes (a) Glyptoperichthys xinguensis, (b) Pseudacanthicus sp. (c)
Scobinancistrus aureatus.
É interessante notar que além das semelhanças cariotípicas quanto ao
número e tipos cromossômicos, há a presença de uma região organizadora de
nucléolo típico em cromossomos relativamente semelhantes, e em posição definida
nas espécies estudadas. Assim sendo, esses dados sugerem que a evolução
cariotípica no grupo, apresenta-se de certa forma homogênea, mantendo a
macroestrutura do cariótipo relativamente conservada.
5.4 O USO DE DADOS CITOGENÉTICOS NA IDENTIF ICAÇÃO DE ESPÉCIES .
Enquanto diversos países vêm investindo e se destacando na
piscicultura, o Brasil se mantém no mercado quase que exclusivamente à custa da
pesca extrativista. O investimento em alguns estudos, como por exemplo, uma
análise detalhada do patrimônio genético das espécies passíveis de serem
exploradas economicamente, ou mesmo de espécies interessantes quanto aos
a b c
67
aspectos ecológicos, entre outros, teria uma importância não apenas cientifica, mas
também social.
Cromossomos mitóticos oferecem uma oportunidade única de se
observar o genoma nuclear de forma microscópica, além de explorar seus
componentes tanto individualmente como globalmente (o cariótipo). Dessa forma,
dados cromossômicos vêm sendo usados para entendimento de relações
sistemáticas e filogenéticas entre as espécies, assim como para providenciar idéias
sobre os possíveis mecanismos de especiação (DOBIGNY et al., 2004). Em muitos
grupos, eles podem ser usados para comparação entre espécimes de diferentes
populações ou diferentes espécies, e são conseqüentemente, muito úteis para
estabelecer a morfologia primária a nível cromossômico. Além do mais, técnicas de
bandeamento permitem o acesso a informações envolvendo padrões estruturais
(bandeamento GTG-, RHG-, e CBG-) e funcionais (replicação do bandeamento
RBG-) (VIEGAS-PÉQUIGNOT & DUTRILLAUX, 1978).
De acordo com ARTONI (1996) é possível caracterizar individualmente
diferentes espécies, podendo-se considerar como caracteres diagnósticos alguns
dados cromossômicos tais como: numero diplóide, formula cariotípica, número e
posição das NORs, alem da quantidade e distribuição de heterocromatina
constitutiva. Além disso, podem-se observar diferentes tendências evolutivas dentro
de um mesmo grupo fazendo uso dessas informações.
Já foi dito que há uma grande dificuldade em classificar as espécies da
subfamília Hypostominae ao nível de espécie. ARTONI (1996) sugeriu dados
citogenéticos na identificação de espécies do gênero Hypostomus. Nota-se que
apesar da importância dos dados citogenéticos na definição das espécies, poucos
foram os estudos realizados com peixes da Amazônia. Os resultados já obtidos
68
deixam claro que o grau de variação entre os cariótipos das diversas espécies é
muito grande, o que facilita seu uso para fins sistemáticos.
Apesar de esforços dos órgãos de fiscalização para regulamentar a
pesca de peixes ornamentais, como os da subfamília Hypostominae, o controle
ainda encontra uma grande dificuldade, pois na comercialização dos espécimes de
peixes emprega-se com freqüência o nome comercial para identificar uma
determinada espécie ou variedade. Este muitas vezes imita o nome vulgar que é
dado à mesma a nível regional, ou seja, ele não se baseia na nomenclatura
cientifica e, portanto, acaba causando dúvidas ou interpretações errôneas dos
dados que compõem as estatísticas de exportação dos peixes ornamentais. É
preciso considerar ainda que o valor alcançado por uma determinada espécie será
tanto maior quanto mais exótica e mais rara ela se apresentar, devido aos custos
envolvidos na captura e transporte (TORRES & CARVALHO JR., 1994).
Um exemplo da importância do uso de marcadores cromossômicos na
diferenciação de espécies morfologicamente semelhantes fica bem ilustrado pelos
exemplares pertencentes ao gênero Glyptoperichthys, Scobinancistrus e
Pseudacanthicus. Onde, cujos cariótipos mostraram diferenças na estrutura
cromossômica, apesar do mesmo número diplóide. Por coloração convencional,
observaram-se diferenças entre a morfologia de alguns pares cromossômicos. Além
disso, as diferenças cariotípicas foram ressaltadas ao aplicar-se a marcação das
NORs, que mostraram padrões claramente distintos entre as espécies.
A similaridade cariotípica identificada entre as espécies analisadas
reforça as idéias de ARMBRUSTER (2004) que Hypostominae compõe um grupo
primitivo e conservado dentro da família Loricariidae. Análises citogenéticas em
espécies adicionais, e novas análises morfológicas, juntamente com dados
69
moleculares podem ser muito importantes para um melhor entendimento das
relações entre os diversos gêneros de Loricariidae, assim como entre suas
subfamílias e mesmo a nível específico.
70
6 C O N C L U S Õ E S
Por meios dos resultados obtidos no presente trabalho, pode-se
concluir que:
a) O número diplóide para os espécimes analisados é 2n=52,
mantendo uma macroestrutura relativamente conservada, embora seja
necessária a análise de um maior número de exemplares de cada
espécie;
b) Não se evidenciou nenhum mecanismo cromossômico de
determinação sexual, ao nível das análises efetuadas;
c) Apesar da constância do número diplóide verificado nas espécies, a
macroestrutura do cariótipo apresenta alguma variabilidade, sugerindo-
se a ocorrência de eventos que alteraram a morfologia e não o número
de cromossomos, como inversões e translocações, poderiam estar
relacionadas;
d) O padrão de distribuição e posição da heterocromatina constitutiva
foi, de certo modo, similar em todas as espécies. Alguns blocos
heterocromáticos mostraram-se ricos em bases A-T, na região
pericentromérica e distal em alguns cromossomos das espécies
analisadas;
e) Os exemplares do gênero Glyptoperichthys analisados neste
trabalho apresentaram variações nos padrões de distribuição da
heterocromatina constitutiva e das NORs, quando comparadas aos
outros dois gêneros, sendo possível afirmar que estas características
71
podem ser utilizada como marcadores para diferenciação destas
espécies, do rio Xingu;
f) As regiões organizadoras de nucléolo foram localizadas em apenas
um par cromossômico subtelocêntrico e subtelo/acrocêntrico, com
exceção de Glyptoperichthys xinguensis, cujo cromossomo portador é
submetacêntrico, sendo que todas as marcações foram localizadas na
mesma posição.
g) A marcação de um único cromossômico do par pelo Nitrato de
Prata, pode indicar algum mecanismo de controle gênico, que somente
uma análise molecular mais detalhada poderia demonstrar;
h) Em Glyptoperichthys xinguensis, a localização da NOR em um
cromossomo submetacêntrico, sugere a ocorrência de uma inversão.
i) O número e a localização das NORs nos cariótipos das espécies
estudadas pode se constituir em uma característica de importância
taxonômica e evolutiva para esta subfamília.
72
7 R E F E R Ê N C I A S
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82
8 ANEXO : PREPARO DE SOLUÇÔES
A) OBTENÇÃO DOS CROMOSSOMOS MITÓTICOS
A1- Solução Hipotônica de KCl 0,075 M
Dissolver 5,59g de KCl e, água deionizada até atingir o volume de um litro
(1000ml).
A2- Solução de Colchicina 0,025%
Solução Mãe: dissolver 0,05 g de colchicina em água deionizada até o volume
total de 100 ml em um frasco totalmente protegido da luz.
Solução de Uso: diluir 10 ml da solução mãe em 10 ml de água deionizada
em um frasco totalmente protegido da luz.
A3- Fixador Carnoy
Dissolver 3 partes de Metanol para 1 parte de Ácido Acético.
B) COLORAÇÃO CONVENCIONAL
B1- Tampão Fosfato Sörense pH 6,8
Solução A: dissolver 8,1652 g de Fosfato de Potássio Monobásico
(KH2PO4) em água deionizada até o volume de 1 litro, pH 5,6;
Solução B: dissolver 10,6794 g de Fosfato de Sódio Bihidratado
(Na2HPO4.2H2O) em água deionizada até o volume de 1 litro, pH 9,8;
Solução de Uso: misturar volumes iguais de cada solução, ajustando o
pH 6,8 com as próprias soluções A e B.
83
C) BANDEAMENTO C
C1- Solução de HCl 0,2 N
Solução de HCl 1 N: diluir aproximadamente 83 ml (82,8 ml) de HCl 37% em
água destilada até o volume final de 1 litro.
Solução de HCl 0,2 N: diluir 20 ml da solução de HCl 1N em 80 ml de água
destilada.
C2- Solução Salina 2x Concentrada (2xSSC)
Dissolver 17,532 g de Cloreto de Sódio (NaCl) e 8,82 g de Citrato de Sódio
(Na3C6H5O7.H2O) em 1 litro de água deionizada.
C3- Solução de Hidróxido de Bário (Ba(OH)2 2%:
Dissolver 2 g de Hidróxido de Bário em 100 ml de água destilada a 60° C em
um frasco escuro. Deixar em agitador automático por 20-30 minutos. Filtrar a
solução em papel de filtro para o frasco de uso.
C4- Solução de Giemsa 10%
Diluir 0,3 ml de corante Eosina Azul de Metileno em 3 ml de Tampão Fosfato pH
6,8.
C5- Formamida a 70%
Dissolver 70 ml de Formamida em 30 ml de 2xSSC.
84
D) Ag-NOR
D1- Solução de Gelatina a 2%
Dissolver 0,1 g de gelatina, em pó, incolor e insípida, em 10 ml de água
deionizada e acrescentar ácido fórmico na proporção de 1ml para cada 100ml de
solução.
D2- Solução de Nitrato de Prata (AgNO3) 25%
Dissolver 0,25 g de nitrato de prata em 1 ml de água deionizada.
E) DAPI (4-6-diamidino-2-fenilindol)
Solução Mãe: diluir 0,1 mg de DAPI em 10 ml de água deionizada.
Solução de Uso: diluir 0,5 ml desta solução em 50 ml de uma
solução 1:1 de Tampão MclIvaine pH 5,6 e água deionizada.
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