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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
Óleos essenciais: Influência de métodos de secagem sobre o
rendimento, composição e atividades fungitóxicas
TATIANI PEREIRA DE SOUZA FERREIRA
2013
Trabalho realizado junto ao Programa de Pós Graduação em Produção Vegetal da
Universidade Federal do Tocantins, sob orientação do Professor Dr. Luiz Gustavo de Lima
Guimarães.
BANCA EXAMINADORA:
___________________________________________
Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães
Universidade Federal de São João Del-Rei
(Orientador)
___________________________________________
Prof. Dr Gil Rodrigues dos Santos
Universidade Federal do Tocantins
(Co-orientador)
__________________________________________
Prof. Dr. Ildon Rodrigues do Nascimento
Universidade Federal do Tocantins
(Avaliador)
__________________________________________
Prof. Dr. Gessiel Newton Scheidt
Universidade Federal do Tocantins
(Avaliador)
UNIVERSIDADE FEDERAL DO TOCANTINS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
Óleos essenciais: Influência de métodos de secagem sobre o
rendimento, composição e atividades fungitóxicas
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Tocantins, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Produção Vegetal, para obtenção do título
de “Mestre”.
GURUPI
TOCANTINS - BRASIL
2013
TATIANI PEREIRADE SOUZA FERREIRA
Óleos essenciais: Influência de métodos de secagem sobre o
rendimento, composição e atividades fungitóxicas
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Tocantins, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Produção Vegetal, para obtenção do título
de “Mestre”.
Aprovada em: __/ Dezembro de 2013
Prof. Dr. Luiz Gustavo de Lima Guimarães
(Orientador)
GURUPI
TOCANTINS - BRASIL
2013
Ofereço A Talita Pereira de Souza
Ferreira, por ter contribuído pela
concretização deste trabalho,
Deus vai lhe abençoar de uma
maneira grandiosa, em todas as
áreas da sua vida. Amém. E aos
meus pais Idemar José Ferreira
e Marineth Pereira de Souza,
por serem tudo, so vocês são tudo
para mim. E aos meus irmão e
sobrinhos.
DEDICO Especialmente a todas comunidades tradicionais (índios,
agricultores familiares, ribeirinhos, quilombolas e outros), que
contribuem muito para pesquisa com seus conhecimentos e
sabedoria, adquiridos de gerações a gerações. E aos
pesquisadores da área de plantas medicianais, aromáticas e
condimentares.
AGRADECIMENTOS
Agradeço ao meu Deus, por ter me dado
capacidade de vencer mais está etapa da minha
vida, e perseverança para suportar momentos
ruins, e sempre fortalecer as minhas mãos, e vencer
vários Golias neste período.
Ao Programa de Pós-Graduação em Produção
Vegetal da Universidade Federal do Tocantins por
ter me dado a oportunidade de participar do corpo
discente durante os dois anos, que de forma
holística e multidisciplinar possibilitou que a
pesquisa fosse direcionada ao conhecimento em
‘Plantas Medicinais, aromáticas e condimentares’.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da
bolsa de estudos.
Aos Professores responsáveis pelos Laboratórios e
Viveiros do Campus da Universidade Federal do
Tocantins, onde pude desenvolver a pesquisa,
especialmente no Laboratório de Química
Fitopatologia e viveiro de plantas medicinais.
Também, Tallyta, Ryhára, Raiana, Rayssa e Bruno,
que contribuíram bastante para o desenvolvimento
do projeto e especialmente a minha irmã Talita por
ter me ajudado em todas as etapas.
E o orientador, Dr. Prof. Luiz Gustavo de Lima
Guimarães, pelos conhecimentos passados e pelo
trabalho multidisciplinar, pelo respeito e confiança
e que Deus lhe abençõe ricamente na sua nova
jornada.
“Aprendemos que tudo na vida tem um sentido, que
tudo faz parte do propósito de Deus, que no final
tudo será melhor”.
SUMÁRIO
RESUMO .................................................................................................................. 12
ABSTRACT ............................................................................................................... 13
CAPÍTULO I .............................................................................................................. 14
1 INTRODUÇÃO GERAL.......................................................................................... 15
2 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................ 16
2.1 OS ÓLEOS ESSENCIAIS .................................................................................. 16
2.1.1 Atividades fungitóxicas dos óleos essenciais ........................................... 17
2.1.2 Fatores que influenciam os teores e a composição do óleo essencial .... 19
2.1.3 Influência da secagem na composição dos óleos essenciais .................. 21
2.2 PLANTAS BIOATIVAS ....................................................................................... 23
2.2.1 Gênero Hyptis sp. .......................................................................................... 24
2.2.2 A espécie Lippia Sidoides Cham. ................................................................ 27
2.2.3 A espécie Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. ............................................ 30
2.4 MICRORGANISMOS FITOPATOGÊNICOS DO FEIJÃO .................................. 33
2.4.1 Rhizoctonia solani ......................................................................................... 34
2.4.2 Sclerotium rolfsii ........................................................................................... 35
2.5 BIOCONTROLE ................................................................................................. 36
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 37
CAPITULO II ............................................................................................................. 52
Óleo essencial de Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank: Influência de métodos de
secagem sobre o rendimento e a composição química e atividades fungitóxicas. ... 52
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 52
2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 53
2.1. OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS. ........................................................................................................... 55
2.2 SECAGEM ......................................................................................................... 55
2.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE ....................................................... 55
2.4 EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS ........................................................... 56
2.5 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS ............................... 56
2.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA ....................... 57
2.7 OBTENÇÃO DOS ISOLADOS ........................................................................... 57
2.8 ATIVIDADE FUNGITÓXICA DO ÓLEO ESSEÊNCIAL DE Hyptis glomerata ..... 58
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 59
3.1 Hyptis glomerata ................................................................................................ 59
3.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DAS FOLHAS DE
Hyptis glomerata SUBMETIDAS À DIFERENTES MÉTODOS DE SECAGEM. . 61
3.3 ATIVIDADE FUNGITOXIDADE DO ÓLEO ESSENCIAL DE Hyptis glomerata ... 64
4 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 67
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 67
CAPÍTULO III ............................................................................................................ 73
ATIVIDADE FUNGITÓXICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia sidoides Cham. E
DE Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. NO CONTROLE DA PODRIDÃO DO COLO
DO FEIJOEIRO COMUM. ......................................................................................... 73
1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 74
2 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 76
2.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS. ............................................................................................................ 76
2.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS UTILIZADOS NOS BIOENSAIOS ..................... 76
2.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VIVO PARA INIBIÇÃO DOS MICÉLIOS ............... 77
2.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL................................................................... 78
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................ 79
3.1 AÇÃO FUNGITÁSTICA ....................................................................................... 79
4 CONCLUSÃO ....................................................................................................... 85
5 REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA .......................................................................... 86
ANEXO A .................................................................................................................. 89
Lista de Figuras Figura 1: Aspecto geral de uma planta da espécie Hyptis glomerata Mart. Ex
Schrank no município de Gurupi - Tocantins............................................................. 25
Figura 2: Aspecto Geral de um arbusto de Lippia sidoides, no município de Gurupi -
Tocantins ................................................................................................................... 27
Figura 3: Estruturas químicas do timol (A) e do cravcrol (B) .................................... 28
Figura 4: Aspecto Geral de uma touceira de Cymbopogon citratus (D. C.) Stapf, no
município de Gurupi - Tocantins ................................................................................ 31
Figura 5: Estruturas químicas do neral (A) e do geranial (B). ................................... 32
Figura 6: Efeito das concentrações do óleo essencial C. citratus e seu constituinte
majoritário citral em relação a severidade da podridão do colo, causada por
Sclerotium rolfsii em caule de plantas de feijoeiro comum. ...................................... 80
Figura 7 - Efeito das concentrações do óleo essencial de Lippia sidoides - MG e seu
constituinte majoritário Carvacrol em relação à severidade da doença causada pelo
fungo Sclerotium rolfsii em caule de plantas de feijoeiro comum .............................. 82
Figura 8 - Efeito das concentrações do óleo essencial Lippia sidoides - CE e seu
constituinte majoritário Timol em relação à severidade da podridão do colo, causada
pelo fungo Sclerotium rolfsii em plantas de feijoeiro comum. ................................... 83
Lista de Tabelas
Tabela 1: Valores médios dos rendimentos dos óleos essenciais das folhas de
Hyptis glomerata no município de Gurupi - Tocantins submetidas a diferentes
métodos de secagem, expressos em p/p BLU (base livre de umidade). ................... 60
Tabela 2: Constituintes químicos dos óleos essenciais das folhas frescas e secas de
Hyptis glomerata coletados no município de Gurupi – Tocantins e os seus
respectivos teores expressos em porcentagem ........................................................ 61
Tabela 3: Atividade fungitóxica do óleo essencial de Hyptis glomerata expressa
em relação a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia solani e Sclerotium
rolfsii. ...................................................................................................................... 64
Tabela 4: Critérios de notas para avaliar a severidade . ........................................... 78
Tabela 5: Análise de variância com aplicação do teste F para os valores observados
de rendimentos do óleo essencial das folhas do pau-da-vitória submetidas a
diferentes métodos de secagem. .............................................................................. 89
Tabela 6: Análise de variância com aplicação do teste F para o efeito do óleo
essencial de Hyptis glomerata sobre a inibição do crescimento micelial de
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. ...................................................................... 89
12
RESUMO
FERREIRA, Tatiani Pereira de Souza. Óleos Essenciais: influência de métodos de secagem sobre o rendimento, composição e atividades fungitóxicas. 2013. 89 p. Dissertação (Mestrado em Produção Vegetal) – Universidade Federal do Tocantins, Tocantins, TO. O presente trabalho buscou analisar a aplicação dos óleos essenciais de três plantas medicinais bioativas, como fungicidas alternativos na cultura do Phaseolus vulgaris (feijão comum). Foram analisados a eficiência dos óleos essenciais de Lippia sidoides, quimiotipos timol e carvacrol, do óleo essencial de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf., que possui como constituinte majoritário o citral (mistura iomérica de geranial e neral), bem como de seus constituintes puros, por meio de ensaios in vivo.Este trabalho também teve como objetivo avaliar a influência de alguns métodos de secagem sobre o rendimento e a composição do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata (pau-da-vitória), bem como determinar o potencial fungitóxico do óleo essencial desta espécie, por meio de ensaios in vitro, sobre a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação, utilizando-se o aparelho de Clevenger modificado, para realização das atividades “in vivo”, os ensaios foram dispostos de forma inteiramente casualizada, em esquema fatorial de (8 compostos x 5 doses) e 4 repetições. Em relação ao óleo essencial de H. glomerata, seu rendimento foi observado nas folhas frescas e folhas secas, sendo utilizado quatro métodos de secagem. Os mesmos foram caracterizados por CG-EM e a atividade fungitóxica avaliada por meio de ensaios in vitro, com os tratamentos arranjados em esquema fatorial de 2 x 5 com 3 repetições,sendo constituídos pelas combinações de dois fungos fitopatogênicos e cinco concentrações do óleo essencial. A avaliação do rendimento perante os métodos de secagem, foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, com 3 repetições. Os óleos essenciais de L. sidoides, C. citratus e seus constituintes majoritários, não foram eficazes no controle do progresso dos sintomas causados em plantas de P. vulgares frente a contaminação com S. rolfsii. Em relação aos teores do óleo essencial de H. glomerata, as folhas sobmetidas à secagem na sombra apresentaram o maior rendimento. O método de secagem influenciou na composição do óleo essencial H. glomerata, que apresentou o sesquiterpeno oxigenado, óxido de cariofileno, como constituinte majoritário. O óleo essencial desta espécie apresentou efeito fungitóxico, sendo capaz de causar a inibição do crescimento micelial de R. solani e S. rolfsii, em até 74,40 e 47,34%, respectivamente. As folhas de H. glomerata apresentam teores de óleo essencial, semelhantes aos apresentados por plantas aromáticas, sendo o mesmo influenciado pelo processo de secagem, bem como a sua composição química. Palavras chave: Pau-da-vitória, plantas medicinais, atividade biológica, fungitoxicidade, feijão comum.
13
ABSTRACT
FERREIRA, Tatiani Pereira de Souza. Essential Oils. Influence of Dryng Methods on the Yield, Composition and Fungitoxic Activities. 2013. 89 p. Dissertation (Master's degree in Vegetable Production) - Federal University of the Tocantins, Tocantins, TO.
This study aimed to analyze the application of essential oils from three bioactive medicinal plants, as alternative fungicides in the culture of Phaseolus vulgaris (common bean). The efficienty of essential oils of Lippia sidoides, Carvacrol, Thymol chemotypes and of Cymbopogon citratus (DC) Stapf., that has citral (mixture of iomerica geranial and neral), as main constituent, as well as its pure constituents, were analyzed by testing in vivo. This paper was also carried out to evaluate the influence of some drying methods on yield and composition of essential oil, from the leaves of Hyptis glomerata (“pau-da-vitória”), as well as to determine the potential of fungitoxic essential oil of this specie, by means of essays in vivo, on the inhibition of mycelial growth of phytopathogenic Sclerotium rolfsii and Rhizoctonia solani. The essential oils were extracted by hydrodistillation, using a modified Clevenger apparatus for performing activities “in vivo”. Trials were arranged in completely random factorial scheme (compounds 8 x 5 doses) and 4 replications. Regarding the essential oil H. glomerata, its yield was observed in the fresh and dried leaves, using four drying methods. These ones were characterized by GC-MS and fungitoxic activity was assessed by in vitro tests, with treatments arranged in a factorial scheme 2 x 5, with 3 replications, and constituted by combitanations of two pathogenic fungi and five concentrations of essential oil. The performace evaluation through drying methods, was conducted in a completely randomized design, with 3 replications. The essential oils of L. sidoides, C. citratus and its major constituents, were not effective in controlling the progress of the symptoms caused in plants of P. vulgaris, against contamination with S. rolfsii. Concerning the content of the essential oil of H. glomerata, that showed oxygenated sesquiterpene, caryophyllene oxide as major constituent. The essential oil of this species showed antifungal effect, being able to cause inhibition of mycelial growth of R. solani and S. rolfsii, up to 74,40% and 47,34%, respectively. The leaves of H. glomerata have essential oil levels, similar to those provided by aromatic plants, being influenced by drying process, as well as its chemical composition. Keywords: “Pau-da-vitória”, medicinal plants, biological activity, fungitoxicity, common bean.
14
CAPÍTULO I
15
1 INTRODUÇÃO GERAL
Os produtos da biodiversidade brasileira, são muito abundantes por todo o
país, os chamados produtos não madeireiros, são muito explorados, porém
preocupa-se pela maneira predatória que são retirados da natureza. Dentre estes
produtos encontram-se as plantas medicinais, tendo em vista com a retomada dos
valores naturais e os conhecimentos etnobotânicos vêm sendo valorizados no meio
científico.
As plantas medicinais, possuem metabólicos secundários, que servem para a
proteção da planta pela perda de água, defesa contra predadores, microrganismos e
atração a insetos e pássaros para a reprodução. Dentre os metabólicos secundários
se destaca os óleos essenciais, utilizados a milhares de anos, no embalsamento de
cadáveres em cerimônias religiosas e para fins terapêuticos.
Os óleos essenciais são constituídos por misturas de substâncias voláteis,
sendo importantes para as industrias farmacêutica, cosmética e alimentícia. Estes
metabólitos, também possuem propriedades que podem atuar contra
microrganismos patogênicos, na medicina e agropecuária. Porém, há poucos
estudos sobre os mesmos na agropecuária, que utiliza-se de tratamentos
convencionais com os defensivos químicos, que vem causando impactos sobre os
inimigos naturais e promovendo resistência dos insetos e dos microrganismos.
Atualmente, estão sendo buscados produtos alternativos que podem ser
utilizados no manejo de doenças. Estes por sua vez apresentam como vantagens
não poluir o meio ambiente, incluindo a não poluição do lençol freático e a não
agressão ao homem, animais, plantas e microorganismos úteis.
As espécies Hyptis glomerata, Lippia sidoides Cham. e Cymbopogon citratus
(D. C) Stapf. possuem uma grande importância econômica por possuírem óleos
essenciais, tanto para uso cosmético, como condimentar, aromático e/ou medicinal,
possuindo compostos que podem ser utilizados como defensivos naturais ou
associado aos mesmos, tendo em vista suas propriedades ecologicamente
saudáveis, uma vez que os mesmos são constituidos por compostos praticamente
atóxicos.
No Tocantins, o clima é favorável para o aumento da área de cultivo do feijão
(Phaseolus vulgaris L.) o qual ainda não é tradicionalmente cultivado. Conforme os
16
dados da CONAB no Estado do Tocantins na safra 2009/2010 e safra 2010/2011 a
produtividade média de grão foi de 1.051kg ha-1 e 2.139 kg ha-1, respectivamente,
superando a média nacional de 945 kg ha-1 (OLIVEIRA et al., 2012).
Apesar da produtividade do feijoeiro no Tocantins ser economicamente
favorável, o feijoeiro pode ser infectado por vários patógenos habitantes do solo de
importância epidemiológica que dentre os agentes causais encontra-se a mela e
podridão radicular do feijoeiro comum causadas pelo fungo Rhizoctonia solani e a
podridão do colo do feijoeiro comum causada pelo fungo Sclerotium rolfsii.
O presente trabalho teve como objetivos avaliar o rendimento e a composição
química do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank
submetidas a diferentes condições de secagem e a atividade fungitóxica do mesmo
sobre a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos Sclerotium rolfsii e
Rhizoctonia solani. E avaliar a atividade “in vivo”, dos óleos essenciais de Lippia
sidoides Cham. dos acessos de Minas Gerais e Ceará, de Cymbopogon citratus
(D.C.) Stapf. e de seus constituintes majoritários, carvacrol, timol e citral,
respectivamente, sobre os efeitos causados pelo fitopatógeno Sclerotium rolfsii, em
plantas de Phaseolus vulgaris L.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 OS ÓLEOS ESSENCIAIS
Os óleos essenciais são definidos quimicamente como misturas de
substâncias orgânicas voláteis, constituído por fenilpropanóides, monoterpenos e
sesquiterpenos (CARDOSO et al., 2005). Outra designação dado a eles e que são
óleos etéreos ou voláteis que se destacam pelas propriedades organolépticas e
físico-químicas tais como: aroma agradável, lipossolúvel, solubilidade em solventes
orgânicos apolares, quando recém-extraídos são geralmente incolores ou
ligeiramente amarelados, porém, alguns podem apresentar coloração intensa. São
instáveis na presença de luz, umidade, calor e metais, podendo sofrer
polimerizações, ciclizações, dimerizações e oxidações (RADÜNZ, 2004; CARDOSO
et. al, 2005; SIMÕES, 2007; BAKKALI et al., 2008; DUSSAULT et al., 2014).
17
Os óleos essenciais são obtidos por meio de destilação por arraste a vapor ou
hidrodestilação de partes de plantas bem como os produtos obtidos por expressão
dos pericarpos de frutos cítricos. Podem ser encontrados em todas as partes da
planta, como nas flores, folhas, caules, galhos, sementes, frutos, raízes. São
armazenados em estruturas diferenciadas, como células secretoras, cavidades,
canais oleíferos, tricomas glandulares, entre outras (Simões et al., 2007; BAKKALI et
al., 2008).
Na natureza, os óleos essenciais, desempenham um papel importante na
proteção das plantas, podendo atuar como agentes antibacterianos, antivirais, anti-
fúngicos, inseticidas e também contra herbívoros por redução do apetite (BAKKALI
et al., 2008). Eles também podem atrair alguns insetos favorecendo a dispersão de
pólen e sementes, ou repelir outros indesejáveis (TAIZ e ZEIGER, 2009).
Segundo, Bertolucci e Pinheiro (2007) aos óleos essenciais são atribuídas
algumas ações genéricas, como: i) ação eupéptica (digestiva); estimulantes do
apetite e da digestão, por via reflexa, com aumento das secreções; salivar, gástrica
entérica:óleo essencial de orégano, manjericão, sálvia, tomilho, etc.; ii) carminativa:
erva doce, funcho, camomila, melissa; iii) rubefaciente ou hiperemizante local: óleo
essencial de menta, pelo alto conteúdo de mentol ecânfora ; iv) antisséptica: ação
bactericida/bacteriostática (de uso tópico ou sistêmico), anti-séptica das vias
respiratórias, expectorante, diurética: óleo essencial de cravo, devido ao eugenol; de
eucalipto; pela presença de grande quantidade de eucaliptol (1,8-cineol); v) ação
sobre sistema nervoso central: esta ação pode ser estimulante, como dos óleos
essenciais de menta; tomilho, sálvia, e funcho e sedativa ou calmante, como dos
óleos essenciais da camomila; alfazema e melissa.
2.1.1 Atividades fungitóxicas dos óleos essenciais
Os fungos estabelecem grupos numerosos de organismos, bastante
diferenciados filogeneticamente e de grande valor ecológico e econômico
(BERGAMIN FILHO et al., 1995). Sua atual classificação inclui todos os
microrganismos eucariontes, heterotróficos, que se nutrem por absorção, com
desenvolvimento ramificado e que se reproduzem por esporos (KENDRICK, 2000).
18
Na agricultura estes organismos trazem danos severos à produção agrícola,
estudos “in vitro” e “in vivo” realizados por pesquisadores constataram que os óleos
essenciais com suas propriedades antifúngicas são potenciais no controle dos
microrganismos. Aquino et al. (2012) avaliaram o efeito fungitóxico e a composição
química dos óleos essenciais das espécies medicinais, alecrim-pimenta (Lippia
sidoides Cham.), capim-santo (Cymbopogon citratus (D. C.) Stapf.) e de alfavaca-
cravo (Ocimum gratissimum L.), no manejo da antracnose do maracujá, o óleo de C.
citratus proporcionou o menor diâmetro das lesões nos frutos, até a concentração de
6 μL mL-1, na concentração de 8 μL mL-1, todos os óleos inibiram o desenvolvimento
do fungo. O timol (30,24%), o citral (77,74%) e o eugenol (92,89%) foram
componentes majoritários em L. sidoides, C. citratus e O. gratissimum,
respectivamente.
Ainda, em estudos realizados “in vitro” com o fitopatógeno do maracujazeiro,
Colletotrichum gloeosporioides Penz, Silva et al. (2009) constataram que 100 μL
dos óleos essenciais de alecrim de vargem (Família Lamiaceae), alecrim-pimenta
(Lippia sidoides), alfavaca cravo (Ocimum gratissimum), lippia (Lippia citriodora),
goiaba branca (Psidium guajava), capim-santo (Cymbopogon citratus), acrescido no
meio de cultura foram capazes de impedir a germinação deste fungo em até 100%.
Nguefack et al. (2009) demosntraram em seus experimentos que os óleos
essenciais de C. citratus, O. gratissimum e de T. vulgaris apresentaram alta
capacidade de preservação de alimentos contra duas cepas micotoxigênicas de
cada fungo: Aspergillus ochraceus , Penicillium expansum e Penicillum verrucosum .
Sendo o óleo essencial de O. gratissimum o mais ativo, seguido pelos óleos
essenciais de C. citratus e de T. vulgaris. No mesmo trabalho foi observado que os
três óleos essenciais são mais ativos do que o conservante sintético, sorbato de
potássio.
Em outro trabalho, Nguefack et al. (2004) avaliando o efeito do óleo essencial
do C. citratus sobre o crescimento micelial de fungos, por meio de ensaios “in vitro”,
foi observado que o óleo essencial reduziu em 64% o desenvolvimento de Fusarium
moniliforme na concentração de 200 ppm, de Aspergillus flavus em 48% e de
Aspergillus fumigatus em 77% na concentração de 500 ppm. O controle total ocorreu
a 300 ppm para F. moniliforme e 1200 ppm para A. flavus e A. fumigatus. O óleo
essencial de C. citratus e o citral, seu constituinte majoritário, apresentaram efeito
fungitóxico, ocasionando a inibição no crescimento micelial de Rhizoctonia solani e
19
Sclerotium rolfsii fungos fitopatogênicos que atacam a cultura do feijão
(GONÇALVES, 2012).
Estudos de Sarmento-Brun (2012) analisando os efeitos de diferentes
concentrações dos óleos essenciais de C. citratus e C. nardus, sobre a inibição do
crescimento micelial de fungos fitopatogênicos, constataram que ambos os óleos
essenciais foram capazes de inibir o crescimento micelial de Sclerotium rolfsii. No
entanto, sobre a inibição do desenvolvimento de Didymella bryoniae, Rhizoctonia
solani, o óleo essencial de C. citratus foi o mais eficiente, uma vez que os
fitopatógenos apresentaram crescimento micelial somente perante a menor
concentração do mesmo.
Diante destes estudos é possível observar a importância dos óleos essenciais
no controle de doenças causadas por fitopatógenos sobre diversas culturas. Com o
aumento da demanda por produtos de maior qualidade, a busca de novas
tecnologias é necessária para que o manejo fitossanitário possa ser feito de forma
menos agressiva, tanto em termos ambientais quanto econômicos e sociais (DAYAN
et al., 2009).
2.1.2 Fatores que influenciam os teores e a composição dos óleos essenciais
A produção de óleo volátil em plantas é altamente influenciada por fatores
genéticos, ecofisiológicos e ambientais (BROWN Jr 1988; SANGWAN et al., 2001).
Além disso Gobbo-Neto e Lopes (2007) citam outros fatores que podem influenciar
na produção dos óleos voláteis em plantas, sendo estes: i) sazonalidade, ii) índice
pluviométrico, iii) radiação UV, iv) ritmo circadiano, v) composição atmosférica, vi)
herbívora e ataque de patógenos, vii) idade da planta, viii) temperatura, viiii) altitude,
x) temperatura, xi) água micronutrientes e xii) macronutrientes. Desta forma é de
grande importância o reconhecimento e a compreensão dessas variações que
auxiliam na ampliação dos conhecimentos sobre interações ecológicas do vegetal
com seu ambiente.
Botrel et al. (2010), estudaram os rendimentos dos óleos essenciais de Hyptis
marrubioides em relação a dois tipos de plantio, em campo e em casa de vegetação,
observaram o maior teor de óleo volátil nas folhas das plantas cultivadas no campo
do que nas plantas cultivadas em casa de vegetação. De acordo com os autores tal
20
efeito deve-se às condições ambientais a que estas plantas foram submetidas. No
cultivo em casa de vegetação as plantas foram cultivadas em vasos, o que pode ter
limitado o desenvolvimento e crescimento do sistema radicular. No campo, os
fatores que podem ter beneficiado a produção de óleos essenciais, foram o maior
desenvolvimento do sistema radicular, ocasionando maior exploração do solo em
busca de nutrientes, e outro fator poderia ter sido a luminosidade.
Em estudos de Martins et al. (2006) verificaram os fatores ambientais
interferentes na composição química do óleo essencial de plantas de Hyptis
suaveolens provenientes de uma população cultivada em Alfenas, indicaram os
seguintes fatores: i) fatores edáficos; ii) idade da planta, inteirada com a
disponibilidade nutricional e iii) fatores endógenos, que segundo o autor contribuiu
para o polimorfismo químico verificado em H. suaveolens.
Outros estudos demonstraram diferenças na variabilidade do teor e da
composição química do óleo essencial de Hyptis suaveolens (erva-canudo), tais
variações foram atribuídas à origem geográfica das plantas, tendo em vista que as
coletas foram feitas em locais distintos, no país de EL Salvador nas cidades da
região sul, norte e leste. (GRASSI et al., 2005). Porém, populações naturais de
plantas que ocorrem ao longo de um gradiente ambiental variam quanto à
constituição genética e atividade fisiológica, embora pertencendo à mesma espécie,
e podem responder de modo muito diferente às condições ambientais vigentes
(MARTINS et al., 2006).
Sales et al. (2009), enfatizam que o teor e a composição do óleo essencial
das plantas aromáticas, como as pertencentes ao gênero Hyptis, dependem de
diferentes fatores. As condições de cultivo, clima, origem geográfica, época de
colheita, tipo e uso de fertilizantes além da nutrição mineral, podem afetar
consideravelmente a produção e a qualidade do óleo.
Segundo Silva et al. (2003), os teores de óleo essencial podem ser
influenciados pelas diferentes umidades e temperaturas ao longo do dia. Dessa
forma, o conhecimento do horário ideal para colheita das plantas, visando à
obtenção de maiores teores de princípios ativos, é de fundamental importância nas
decisões agronômicas de produção.
Leal et al. (2003) notaram haver apenas uma discreta variação nas
concentrações de timol nas amostras de tintura de Lippia sidoides produzidas a
partir das folhas coletadas antes, durante e depois da floração das plantas. O melhor
21
momento para a coleta da planta é após a sua floração, considerando que o teor
determinado neste momento do desenvolvimento da planta (2,34±0,06 mg/ml) foi
maior do que o encontrado nas demais tinturas da planta antes da floração
(1,97±0,07 mg/ml) e durante a floração (2,00±0,03 mg/ml).
2.1.3 Influência da secagem na composição dos óleos essenciais
A secagem é um processo que consiste na remoção de grande parte da água
inicialmente contida no material vegetal, a um nível máximo de teor de água no qual
possa ser armazenado por longos períodos, sem que ocorram perdas significativas
(MARTINAZZO et al., 2010). O processo de secagem de plantas aromáticas e
medicinais consiste em diminuir o máximo possível a perda de substâncias ativas,
além de retardar a sua deterioração em decorrência da redução da atividade
enzimática. Assim, este procedimento é útil para conservar o material vegetal, já que
permite um aumento do tempo para a sua comercialização e/ou uso (COSTA et al.,
2005). No entanto, a secagem ideal é aquela que não é rápida e nem lenta demais,
porém sua duração depende das características da planta que é colocada para
secar, das condições climáticas durante os dias de secagem, bem como, das boas
condições das instalações de secagem (VON HERTWIG, 1991; SILVA e CASALI,
2000, PINTO et al., 2006). Os fatores que favorecem uma boa secagem são: i)
iniciar a secagem imediatamente após a colheita; ii) ao efetuar a secagem em
recinto sombreado; iii) proporcionar uma boa circulação de ar para as partes
vegetais; iv) o ar que circula por entre as plantas deve conter algum calor para
favorecer a extração da umidade das mesmas e v) dispor de instalações adequadas
para a secagem (PINTO et al., 2006).
A temperatura de secagem deve ser controlada, tendo em vista a
necessidade de estudos que avaliem a influência da mesma, de forma a conhecer a
temperatura de secagem mais apropriada para cada espécie, visando assegurar os
maiores teores de princípios ativos e composição química adequada dos óleos
essenciais (BLANCO et al., 2000).
Quando o processo de secagem ocorrer de forma demasiadamente rápida,
pode ocasionar um endurecimento da camada superficial das células do tecido,
impedido a evaporação da água dentro das células dos órgãos vegetais. Sendo
22
importante ressaltar que teores de umidade acima de 20% permitem que as enzimas
atuem e destruam os princípios ativos, comprometendo a eficácia dos mesmos e a
composição dos óleos essenciais (PINTO et al., 2006).
De acordo com Martins (2000), as pesquisas mais recentes sobre secagem
de plantas medicinais têm oportunizado os seguintes parâmetros: i) temperatura e
velocidade do ar de secagem, ii) umidade relativa do ar dentro e fora do sistema de
secagem, iii) temperatura do material e iv) pressão estática em função da altura da
camada do produto.
Muitos estudos têm sido realizados com o intuito de verificar a influência das
formas de secagem sobre a produção e composição dos óleos essenciais de
diversas plantas aromáticas. Arrigoni-Blank et al. (2010), estudando o horário de
colheita e a influência da secagem sobre o rendimento do óleo essencial das folhas
de Hyptis pectinata L. Poit (Lamiaceae), constataram que a secagem ou não das
folhas em diferentes horários de colheita (8:00, 12:00 e 16:00 horas), não influencia
no teor do óleo essencial, sendo viável a colheita em qualquer horário do dia,
podendo-se utilizar folhas frescas ou secas.
Radüz et al. (2001) estudaram diferentes temperaturas de secagem sobre as
folhas de L. sidoides obtiveram 2,93% de óleo essencial para a planta fresca
(testemunha), entretanto para a amostra seca com ar ambiente ocorreu uma
redução de 8% o teor de óleo essencial, enquanto que a secagem com temperatura
do ar a 40, 50, 60 e 70ºC não apresentaram diferenças notáveis entre si, ocorrendo
2% de decréscimo em relação à testemunha. Na análise qualitativa o percentual de
timol não sofreu variação nas temperaturas estudadas em relação à testemunha,
mas o teor de carvacrol teve pequena redução com o acréscimo na temperatura do
ar de secagem. Entretanto, Raduz et al. (2002) concluíram em outro trabalho que as
temperaturas do ar de secagem de 40, 50, 60 e 70°C não afetaram os rendimentos
de p-cimeno e timol do óleo essencial extraído das folhas de L. sidoides , em relação
ao material fresco, porém o rendimento extrativo de (E)-cariofileno aumentou com o
incremento na temperatura do ar de secagem.
Barbosa et al. (2006) observaram que a secagem de L. alba com temperatura
do ar variando de ambiente até 80 °C resultou em uma redução entre 12 e 17% no
teor de óleo essencial em relação ao obtido para a planta fresca. Nessas condições
o teor de citral (geranial + neral) no óleo essencial obtido das plantas secas foi, em
23
média, 82,63% que é aproximadamente 6,89% maior que o encontrado no óleo
obtido das plantas frescas (75,74%).
Soares et al. (2007), perceberam que a influência da temperatura do ar de
secagem e da velocidade do mesmo sobre a composição química do óleo essencial
das folhas de manjericão (Ocimum basilicum L), foram estudadas as temperaturas
de 40, 50, 60 e 70 ºC, em camada fina, e duas velocidades do ar (0,9 e 1,9 m/s). Por
análise de regressão, estimou-se que a temperatura de 54,4 ºC e a velocidade de
1,9 m/s forneceriam o maior rendimento de linalol, percebendo que a composição
química do óleo essencial do manjericão é afetada tanto pela temperatura como pela
velocidade do ar de secagem.
Mohamed Hanaa et al. (2012), realizaram a secagem das folhas de C citratus
por meio de três métodos diferentes de secagem (secagem ao sol durante 36 horas,
à sombra durante 48 horas e secagem em estufa a 45 °C durante 7 h),
demosntraram diferenças significativas nos teores dos óleos essenciais das folhas
submetidas aos diferentes métodos de secagem. Sendo observado que as folhas
secas em estufa apresentarm o maior percentual de óleo essencial (2,45%) em
comparação aos teores apresentados pelas folhas secas à sombra (2,12%) e ao sol
(2,10%). Chegaram ao seguinte resultados que a secagem de folhas de C. citratus
no forno a 45 ° C durante 7 h. é mais adequado e recomendado para a obtenção de
maior teor de óleo essencial. Considerando que, para as maiores porcentagens de
componentes principais (geranial e neral) secagem à sombra, com fonte de
ventilação para 48 h é mais adequado.
2.2 PLANTAS BIOATIVAS
Algumas plantas possuem dentre seus metabólitos secundários, compostos
que podem ser utilizados para o desenvolvimento de novos defensivos naturais ou
serem precursores de semi-síntese, no desenvolvimento de produtos que não
agridam ao meio ambiente e que não seja tóxico para os consumidores (MORANDI
e BETTIOL, 2009). O Brasil possui uma grande biodiversidade de espécies vegetais,
que se apresentam como uma importante fonte de obtenção destas substâncias
(KORDALI et al., 2008).
24
2.2.1 Gênero Hyptis sp.
O gênero Hyptis pertece ao reino: Plantae, divisão: Magnoliophyta; classe:
Magnoliopsida; família: Lamiaceae. Este gênero é composto por ervas, subarbustos,
arbustos ou raramente árvores pequenas. Os caules geralmente são
quadrangulares, as folhas opostas, simples ou mais raramente partidas, pecioladas
ou sésseis ou curtamente pedunculadas, contendo substâncias aromáticas
(BORDIGNON, 1990). As plantas do gênero Hyptis encontram-se distribuídas nas
regiões tropicais e subtropicais, desde a América do Norte e o Caribe, até o Peru e
Argentina, com apenas algumas espécies presentes no Velho Mundo. A maioria é
encontrada no cerrado, sendo raramente encontradas em áreas úmidas (SILVA-LUZ
et al., 2012).
A espécie Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank (Figura 1) é sublenhosa,
odorífera, apresenta flor lilás possuindo poucos registros sobre a mesma, porém
sabe-se que ela é originária da Ámerica do Sul. No Brasil sua ocorrência é comum
na chapada de Minas Gerais, Tocantins e Goiás (FERREIRA, 2009; SAINT –
HILAIRE, acesso em: 02/12/2013).
Rocha-Coelho et al. (2005) realizando um levantamento etnobotânico na
Comunidade Mumbuca, localizada no Parque Estadual do Jalapão, encontrou a
Hyptis glomerata nesta região, onde é conhecida popularmente como pau-da-vitória.
Nesta região esta planta é de grande interesse medicinal, sendo utilizada como
cadiotônica.
25
Figura 1: Aspecto geral de uma planta da espécie Hyptis glomerata Mart. Ex
Schrank no município de Gurupi - Tocantins (Fonte: própria).
Estudos sobre a composição química de óleos essenciais de algumas
espécies de plantas pertencentes ao gênero Hyptis têm relatado a predominância de
compostos terpênicos nos mesmos. Trabalhos com o óleo essencial das folhas de
Hyptis pectinata, demonstraram a predominância de sesquiterpenos em sua
composição, sendo a calamusenona (24,68%) o constituinte majoritário, seguida
pelo (E)-cariofileno (18,34%) e óxido de cariofileno (18,00%) (SANTOS et al., 2008).
Moreira et al. (2010), estudaram a caracterização química do óleo essencial
de Hyptis suaveolens (L.) e encontraram como constiuintes majoritários 1,8-cineol
(47,64%) seguido pelo γelemeno (8,15%), β-pineno (6,55%), (+)-3-careno (5,16%),
(E)-cariofileno (4,69%) e germacreno D (4,86 %). A avaliação da composição
química dos óleos essenciais das folhas, flores e sementes de Hyptis fruticosa
Salzm. Após o tratamento estatístico dos dados por análise de agrupamento,
26
demonstrou a predominância dos compostos 1,8-cineol, espatulenol, α-pineno, β-
pineno como principais constituintes, havendo a predominância de sesquiterpenos
nas sementes (FRANCO et al., 2011).
Sales et al. (2007) estudando a variabilidade dos principais constituintes
químicos dos óleos essenciais de H. marrubioides, coletadas em duas localidades
do cerrado brasileiro, encontraram a predominância dos compostos cariofila-
4(14),8(15)-dien-5β-ol, eudesma-4(15),7-dien-1β-ol, óxido de cariofleno e (β)-
cariofleno. A caracterização do óleo essencial das folhas, inflorescência e do tronco
de Hyptis glomerata, nativas de Minas Gerais, apresentou um total de 19 compostos,
sendo os principais constituintes β(E)-cariofileno (folha 14,3%; caule 8,6%), γ-
cadinene (cerca de 14% em todas as partes), guaiol (folhas 10,7%; inflorescência
9,4%), s-calameneno (caule, 11,4%) e globulol (inflorescência, 16,8%) (SILVA et al.,
2000).
As atividades biológicas de óleos essenciais de plantas pertencentes ao
gênero Hyptis têm sido relatadas em alguns trabalhos, com substâncias com
potencial farmacológico, principalmente atividades anti-microbiana, antifúngica,
citotóxica, anti-inflamatória, inseticida, antiulcerogênica, nematicida e
antinociceptivo (NOVELO, et al., 1993; URONES et al., 1998; OLIVEIRA et al., 2004;
FACEY et al., 2005; SILVA et al., 2006; SANTOS et al., 2007; ROCHA-COELHO,
2005).
Moreira et al. (2010) avaliaram o efeito inibitório do óleo essencial de Hyptis
suaveolens (L.) sobre alguns fungos patogênicos pertencentes ao gênero
Aspergillus (A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus, A. fumigatus e A. niger)
mostrando que o óleo essencial mostrou atividade de amplo espectro contra as
espécies. Em especial os fungos A. fumigatus e A. parasiticus, o efeito do óleo
essencial das folhas de H. suaveolens a 40 e 80 mL/mL, teve efeito letal de 100%
contra ambos os fungos ao longo de 14 dias de exposição. Também foi constatada a
capacidade deste óleo em causar alterações morfológicas sobre o A. flavus, como
diminuição da conidiação, vazamento do citoplasma, perda de pigmentação e
estrutura celular alterada, sugerindo degeneração da parede fúngica e revelando o
potencial de tal óleo essencial no tratamento de aspergilose.
Malele et al. (2003) relataram uma forte atividade anti-fúngica para o óleo das
folhas de H. Suaveolens a 500 e 1000 μg mL contra Saccharomyces cerevisiae,
Mucor sp. e Fusarium moniliforme. Souza et al. (2003) analisaram a atividade
27
antifúngica de Hyptis ovalifolia sobre 60 dermatófitos, na concentração de 1.000
μg/ml o óleo essencial inibiu 100% de 60 dermatófitos testados.
2.2.2 A espécie Lippia sidoides Cham.
Esta espécie pertence ao reino: Plantae, divisão: Magnoliophyta; classe:
Magnoliopsida; Ordem: Lamilales; Família: Verbanaceae e Gênero: Lippia. Também
é conhecida no nordeste brasileiro como alecrim grande, estrepa cavalo entre
outros. É uma planta aromática, e muito encontrada nas regiões nordeste do Brasil e
norte de Minas Gerais. É um arbusto silvestre (Figura 2), com até 3 m de altura,
folhas simples, compostas, com margens crenadas, pelos esbranquiçados na face
inferior, aromáticas e de sabor picante, daí a denominação alecrim-pimenta.
Apresenta flores de cor branca, em racimos, cálice curto e membranáceo e caule
quebradiço (PINTO et al., 2007).
Figura 2: Aspecto geral de um arbusto de Lippia sidoides Cham no Município de
Gurupi – Tocantins (Fonte: própria).
28
A planta de alecrim pimenta possui um grande potencial para a exploração
comercial devido suas diversas aplicações (LOPES et al., 2011), destacando-se pelo
uso na produção de antissépticos, que têm grande importância na área da farmácia,
medicina, odontologia e saúde pública. Na medicina popular, L. sidoides tem sido
utilizada para tratamento de acnes, sarna infectada, pitiríase versicolor,
dermatomicoses, impinges, pano branco, escabiose, caspa, maus odores nos pés e
axilas, aftas, inflamação de boca e de garganta (MATOS, 2002; MATOS, 2004).
Sendo a principal forma de aproveitamento das substâncias ativas desta planta
ocorrendo por meio da extração do óleo essencial, que possui como constituinte
majoritário o timol (Figura 3), composto responsável pelo alto poder antisséptico do
óleo essencial das folhas desta espécie (MATOS et al., 1999; SOUSA et al., 2004).
Segundo Matos (2000) suas folhas podem apresentar um teor de óleo
essencial de até 4,5%, sendo encontrados compostos como o timol, carvacrol, 1,8-
cinelol, ƿ-cimeno, 4-terpineol, timol-metiléter, (E)-cariofileno, entre outros. De acordo
com Leal et al. (2003) o óleo essencial obtido das folhas de alecrim-pimenta possui
uma ampla diversidade química, tendo como principal constituinte o timol, cujo teor
pode variar entre 34,2 a 95,1% e/ou o carvacrol.
Marco et al. (2012) teve como um dos objetivos de seu trabalho caracterizar
quimicamente o óleo essencial de L. sidoides, cultivadas na região do Cariri
cearense, do qual caracterizaram 97,82% de sua composição química, encontrando
o timol como constituinte principal, com um teor de 84,90%. Por outro lado, Lima et
al. (2011) trabalhando com o óleo essencial das folhas de L. sidoides nativas do sul
de Minas Gerais, caracterizou 92,53% dos constituintes do mesmo, encontrando
como constituinte majoritário o carvacrol (31,68%) (Figura 3),seguido pelo ρ-cimeno
(19,58%), 1,8-cineol (9,26%), γ-terpineno (9,21%) e sabinene (5,26%), em menores
teores foram encontrados timol-metil-éter (2,92%), timol (2,30%) e mirceno (1,97%)
entre outros.
OH
OH
A B
Figura 3: Estruturas químicas do timol (A) e do cravcrol (B) (Fonte: própria).
29
De acordo com Cavalcanti et al. (2010), o óleo essencial de L. sidoides pode
ser utilizado como um pesticida alternativo ecologicamente seguro contra
Tetranychus urticae. Tais autores afirmam a possibilidade da atividade acaricida
deste óleo essencial ser devido a provável sinergia entre os seus principais
constituintes, timol, carvacrol e (E)-cariofileno. Oliveira et al. (2006) avaliaram a
atividade óleo essencial da L. sidoides na inibição do crescimento de cepas de
Staphylococcus aureus observando halos de inibição do crescimento bacteriano
entre 15-21 mm.
Botelho et al. (2007) avaliaram a atividade antibacteriana e antifúngica do óleo
essencial da L. sidoides sobre microrganismos da cavidade bucal e os resultados
mostraram atividade antimicrobiana frente Steptococcus mutans, S. mitis S.salivaris,
S.sanguis e Candida albicans, com halo de inibição entre 8,5 e 34 mm. Girão et al.
(2003) avaliando atividade de um creme dental preparado com óleo essencial desta
espécie em cães que apresentavam doenças gengivais, demonstraram redução
significativa nos parâmetros avaliados, como placa bacteriana, calculo dental,
gengivite e infiltrado inflamatório em relação ao grupo controle. Alburqueque et al.
(2013), observaram que a atividade antiaderente da folha da L. sidoides por meio de
uma simulação “in vitro”, de um biofilme dental com as linhagens bacterianas
Streptococcus mutans, Streptococcus sanguinis e Lactobacillus, mostrou-se efetiva
na inibição de aderência das bactérias ensaiadas até uma concentração de 1:16. O
seu efeito sobre Streptococcus mutans foi semelhante ao da clorexidina,
demonstrando o efeito antiaderente de extrato de L. sidoides sobre os principais
microrganismos responsáveis pela consolidação do biofilme dental.
Ultee, Kets e Smid (1999), estudaram o mecanismo de ação do carvacrol
sobre Bacillus cereus, demonstraram a capacidade do mesmo em interagir com a
membrana desse microrganismo, alterando sua permeabilidade para cátions H+ e K+
e diminuindo a concentração intracelular de ATP. Para esses autores, a dissipação
do gradiente de íons leva ao comprometimento dos processos essenciais na célula
e, finalmente, à morte celular.
Grupos polares e apolares presentes no anel aromático de compostos
presentes nos óleos essenciais, ou nos compostos isolados, podem influenciar suas
atividades biológicas. Segundo Sikkema, Bont e Poolman (1995), a presença de
grupos hidroxilas presentes no eugenol e carvacrol podem aumentar a solubilidade
30
dessas moléculas na suspensão aquosa e, consequentemente, sua capacidade de
passar através da porção hidrofílica da membrana celular.
Gustafson et al. (1998), examinaram células de Escherichia coli expostas ao
óleo essencial de melaleuca, com microscopia eletrônica de transmissão,
confirmaram as alterações na membrana celular causadas pelos compostos
presentes nesse óleo essencial, demonstrando a perda de material eletro-denso
pela membrana e coagulação de alguns constituintes citoplasmáticos.
Lambert et al. (2001), avaliaram a influência do óleo essencial de orégano e
de seus constituintes majoritários timol e carvacrol sobre a integridade da
membrana, demonstraram a perda de íons e a diminuição do pH interno das células
de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus. De acordo com esses
mesmos autores, tanto o óleo essencial quanto seus constituintes majoritários
causam danos à membrana celular, atuam sobre os ácidos nucléicos intracelulares e
causam a perda de potássio e fosfato das células desses microrganismos.
O timol tem sido encontrado em formulações de cremes e antissépticos
bucais (Euthymol® e Listerine®), pomadas descongestionantes (Vick®), pastilhas
que aliviam tosse e irritação da garganta (Valda®), adesivos antiinflamatórios
(Salonpas®) e como anti-séptico para higienização bucal de cães e gatos (Gelsept®)
(VERAS, 2011). O que confirma o potencial comercial deste composto e de suas
fontes, principalmente aquelas de origem natural, como o óleo essencial de L.
sidoides. Por outro lado deixa claro o potencial deste óleo essencial no controle de
microrganismos, e a possibilidade de substituição de compostos sintéticos na
agricultura.
2.2.3 A espécie Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf.
O capim-limão (Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf) (Figura 4) esta inserido no
Reino: Plantae; Divisão: Magnoliophyta; Classe: Liliopsida; Ordem: Poales; Família:
Poaceae; Gênero: Cymbopogon. É uma erva aromática, originária da Índia, de ciclo
anual, bianual, ou perene, podendo chegar a até 2 m de altura, possui rizoma curto e
horizontal com raízes fortes e finas, formando touceiras compactas. Suas folhas são
eretas ou com curvas invaginantes, medindo aproximadamente 1 m de comprimento
por 1,5 cm de largura, apresentando bainha de cor roxa na base e branco
31
esverdeado na parte interna. Suas flores são hermafroditas e seu fruto do tipo
aquênio. Trata-se de planta bastante odorífera, que produz um óleo essencial de
aroma semelhante ao da erva-cidreira ou do limão. (PINTO et al., 2007).
Figura 4: Aspecto Geral de uma touceira de Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf, no
município de Gurupi - Tocantins (Fonte: própria).
O componente mais importante do óleo essencial do Cymbopogon citratus é o
citral (que pode variar de 47% a 85%). Este é constituindo por uma mistura dos
isômeros, geranial (α-citral) e neral (β-citral) (Figura 5) (SIDIBE et al., 2001).
Brito (2007) observou que o óleo essencial do C. citratus extraído de folhas
frescas apresentou como compostos majoritários geranial (α – citral) com 40,55%,
neral (β – citral) com 28,36% e mirceno com 24,21%.
Poonpaiboonpipat et al. (2013), identificaram por GC- MS seis compostos do
C. citratus, que representaram 92,59 % que indicou o citral monoterpeno como uma
mistura dos isomeros geranial ( 41,94 % ) e neral ( 34,06 % ) , bem como β -
mirceno ( 10,39 % ) , Z - β - ocimeno (0,22 %) e geraniol ( 4,63% ) como principais
compostos. Ainda, Bassolé et al. (2011), analisando a composição quimica do C.
32
citratus, constatou que foram identificados o geranial (48,1%) , neral (34,6%) e
mirceno (11,0%).
CHO OHC
A B Figura 5: Estruturas químicas do geranial (A) e do neral (B) (Fonte: própria).
O óleo essencial de C. citratus, têm apresentado vários efeitos biológicos
sobre diversos microrganismos fitopatogênicos. Neste intuito, Medeiros et al. (2011),
objetivaram em seu trabalho desenvolver sachês incorporados com óleos essenciais
de orégano (Origanum vulgaris) e capim-limão (C. citratus), onde suas atividades
antimicrobianas foram testadas sobre os fungos Colletotrichum gloeosporides,
Lasiodiplodia theobromae, Xanthomonas campestris pv. mangiferae indica,
Alternaria alternata. Frutos de manga „Tommy Atkins‟ foram acondicionados
individualmente em sacos de papel contendo em seu interior um sachê
antimicrobiano e mantidos a 25 °C ± 2 °C e UR 80% ± 5% por nove dias. Os sachês
ativos incorporados com óleos essenciais de orégano e capim-limão apresentaram
controle no crescimento dos microrganismos testados, sendo o capim-limão mais
eficiente, reduzindo em aproximadamente 2 ciclos Log a contagem de mesóflos
aeróbios, fungos filamentosos e leveduras em relação ao tratamento do controle
empregado.
Santos e Vogel (2012), examinando seis diluições do óleo de C. citratus (1; 5;
10; 25; 50 e 100%) em uma população de carrapatos resistentes a amidínicos e
piretróides sintéticos. Notou que a inibição de postura foi de 3; 23; 46; 66; 46 e 46%,
a eclosão larval foi de 83; 58; 31; 0; 38 e 25% e a eficácia do tratamento foi de 32;
64; 83; 100; 88 e 82%, respectivamente. O óleo de C. citratus apresentou controle
parcial em teleóginas ingurgitadas de R. microplus em ensaios in vitro.
Ahmad Khan e Ahmad (2012), verificaram a inibição de biofilme devido a
presença dos óleos essenciais de C. citratus e Syzygium aromaticum em cepas de
Candida albicans, constataram que não houve nenhuma tolerância aumentada para
33
C. citratus mostrando efeito mais inibitório sobre a formação de biofilme em 0,5 × e
0,25 × MIC seguido de Syzygium aromaticum. Antifúngicos testados foram menos
eficazes na prevenção da formação de biofilmes. Os resultados evidenciaram a forte
atividade inibitória de C. citratus seguido de Syzygium aromaticum contra células
planctônicas de Candida para formar biofilmes.
Machado et al. (2012), para contribuir na busca de novas drogas contra a
leishmaniose, estudaram a susceptibilidade de Leishmania infantum , Leishmania
tropica e Leishmania major frente ao óleo essencial de C. citratus e seus compostos
principais, mirceno e citral. A partir dos resultados, constataram que o citral foi o
mais ativo inibindo L. Infantum para IC50 entre 25-52 mg/ml, para Leishmanioses L.
tropica e L. major com valores de 34-42 mg/ml.
Tzortzakis e Economakis (2007), testando o óleo essencial C. citratus nas
concentrações entre 25 e 500 ppm para atividade antifúngica contra Coccodes
Colletotrichum, Botrytis cinerea, Cladosporium, Rhizopus stolonifer herbarum e
Aspergillus niger, por meio de ensaios in vitro. Observaram uma redução significativa
(P<0,05) sobre o desenvolvimento da colônia para os patógenos analisados.
Millezi et al. (2012), pesquisaram os óleos essenciais das plantas
Thymus vulgaris (tomilho), C. (capim-limão) e Laurus nobilis (louro), e verificaram
que o óleo essencial de C. citratus demonstrou atividade bacteriana em todas as
concentrações testadas ( 0,5 , 1,5 , 2,5 , 5,0 , 10,0 , 15,0 , 25,0 , e 50,0 %),sobre as
bactérias Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Listeria monocytogenes,
Salmonella enterica enteritidis e Pseudomonas aeruginosa.
2.4 MICRORGANISMOS FITOPATOGÊNICOS DO FEIJÃO
As leguminosas desempenham um papel importante na agricultura e na
alimentação e o feijão destaca-se por ser um componente alimentar básico na dieta
da população brasileira (YOKOYAMA et al., 2000).
Entre as principais doenças, cujos agentes causais apresentam capacidade
de sobreviver no solo encontram-se: i) Mela e a podridão radicular do feijoeiro
comum causadas pelo fungo Rhizoctonia solani e ii) Podridão do colo do feijoeiro
comum causada pelo fungo Sclerotium rolfsii. (MAPA, acesso: 27/11/2012).
34
2.4.1 Rhizoctonia solani
Pertencente à classe dos basidiomicetos, o fungo Rhizoctonia solani é
habitante do solo e grande causador de doenças em culturas economicamente
importantes (CAMPOS e CARESINI, 2006). Afeta principalmente a cultura do feijão
comum (Phaseolus vulgaris) causando a mela ou podridão radicular incluindo
também o tombamento das plântulas na primeira fase de crescimento em
praticamente todas as regiões do Brasil onde a cultura é produzida (TOLÊDO-
SOUZA et al., 2009).
O micologista francês De Candolle, no início do século XIX, descreveu o
gênero Rhizoctonia pela primeira vez ao dizer que se trata de um fungo não
esporulante, que sintetiza escleródios a partir dos quais são produzidos os
filamentos de hifas (SNEH et al., 1991). Os micélios de Rhizoctonia solani são
caracterizados por uma ramificação em ângulo reto com septação no ramo e após o
mesmo. Este fungo, quando em fase sexuada, teleomófica, é identificado como
Thanatephorus cucumeris (DOMSCH et al., 1980; ADAMS, 1988).
Sobrevive no solo como saprófita, causando infecções em plantas nativas.
Seus propágulos são visualizados com facilidade e encontrados nos primeiros 10 cm
da camada superficial do perfil do solo pela presença, ainda, de oxigênio
(CARDOSO, 1994). Sua elevada proliferação depende de fatores ambientais como
altas temperaturas e chuvas frequentes determinando umidade também alta, em
torno de 95 % (ZAUMEYER e THOMAZ, 1957). Polífago, pode permanecer nas
plantas de um ano para o outro, além de sobreviver em restos de culturas. Quando
no solo, ele atravessa a parede celular das raízes por meio de seus micélios
(KRUGNER, 1980).
O gênero Rhizoctonia é bastante heterogêneo, sendo que são divididos em
grupos de anastomoses (fusão de hifas) para que uma caracterização morfológica
específica seja realizada com sucesso. Conforme Carling et al. (2002) existem 13
grupos de anastomoses (GA) reconhecidos. Assim, estas reações de anastomoses
entre hifas de isolados pareados de Rhizoctonia solani podem ser identificados
como fusão perfeita, fusão imperfeita, fusão por contato e sem reação (YANG e LI,
2012).
Trata-se de um fitopatógeno de difícil controle devido a presença dos
escleródios, além da sua sobrevivência em condições ambientais adversas (FALTIN
35
et al., 2004). Apesar do tratamento químico (na maioria das vezes poluente), do uso
de fumigantes e o tratamento de sementes com fungicidas as perdas podem ser
relativamente altas (LUCON et al. 2009).
2.4.2 Sclerotium rolfsii
Identificado pela primeira vez em 1892 por Rolfs, em tomate (Solanum
lycopersicum), Sclerotium rolfsii é um fungo fitopatogênico e habitante natural do
solo (PUNJA, 1985). Na maioria das vezes, ataca dicotiledôneas, podendo também
agredir algumas espécies de monocotiledôneas (PUNJA, 1993). Athelia rolfsii é o
nome dado ao fungo S. rolfsii quando em forma sexuada, o que ocorre raramente
(SARM e SINGH, 2002), entretanto, seus basidiósporos podem provocar uma
infecção inicial.
De diversidade geográfica ampla é encontrado nos trópicos, subtrópicos,
regiões temperadas como África, Japão, Índia, América do Sul, América Central, sul
dos Estados Unidos, Filipinas e Havaí (KOKUB et al., 2007).
No feijão comum (Phaseolus vulgaris), as infecções podem ocorrer na
superfície do solo, em qualquer fase de crescimento da planta, sendo que os
sintomas incluem tombamento, lesões no tronco inferior e tecidos da raiz,
amarelecimento progressivo, murchamento e desfolha prematura (ABAWI e
PASTOR-CORRALES, 1990).
Com capacidade de produzir uma grande quantidade de escleródios, os quais
podem permanecer no solo por pelo menos um ano, o fungo sobrevive na ausência
de hospedeiros, sendo disseminado principalmente, por meio do transporte de solo
infestado (MARTINS et al., 2003). Assim, muitas culturas podem ficar
comprometidas.
Os escleródios são esféricos podendo atingir um tamanho entre 1,0 e 3,5 mm
de diâmetro. Quando imaturos são brancos e quando maturos são marrons
aparecendo sobre os micélios (PEREIRA NETO e BLUM, 2010).
A identificação de S. rolfsii pode ser realizada pela cor, tamanho e estrutura
dos escleródios. Devido a este fungo ser encontrado em variadas regiões e em
distintas espécies vegetais, suas características morfológicas também variam desde
36
a compatibilidade micelial até as diferenças genéticas observadas (KOKUB et al.,
2007).
Este fungo destaca-se por atuar tanto no período de pré-emergência das
mudas, ou seja, quando concorre para a morte das sementes, quanto no período de
pós-emergência, onde o coleto se anela, a planta murcha e tomba (MAFIA et al.,
2007). Dessa forma, é extremamente relevante buscar métodos alternativos de
controle desta praga sem a utilização de produtos químicos que degradam o meio
ambiente. A baixa tecnologia e o manejo inadequado das doenças não é capaz de
auxiliar no controle do fitopatógeno estudado. Portanto, novos métodos mais
eficientes devem ser estudados e experimentados no campo (MAFIA et al., 2007).
2.5 BIOCONTROLE
A utilização de produtos naturais no controle de doenças de plantas pode - se
tornar um meio eficiente para a redução do uso indiscriminado de defensivos
sintéticos. Segundo Bizzo e Rezende (2009), os apelos de políticas de preservação
ambiental são instrumentos de marketing muito eficientes, particularmente no
mercado europeu, sendo esta uma ótima oportunidade para o desenvolvimento de
processos sustentáveis de exploração da biodiversidade.
Este ano o Governo Federal, em busca de fomentar a agriculta agroecológica
e orgânica, lançou o Plano Nacional de Agroecologia e Produção Orgânica – Brasil
Agroecológico - PNAPO, para ampliar a produção e o consumo de alimentos
orgânicos e agroecológicos no País. O objetivo deste plano é promover a transição
agroecológica e a produção Orgânica como base do desenvolvimento rural
sustentável, possibilitando à população a melhoria de qualidade de vida por meio da
oferta de alimentos saudáveis e do uso sustentável dos recursos naturais (BRASIL,
acesso em: 16/11/2013).
A utilização de produtos naturais de origem vegetal no controle alternativo de
pragas e doenças de plantas vai de encontro com os objetivos do PNAPO, e vem
ganhando espaço no meio científico. Uma vez que, a sociedade vem pressionando
as autoridades para uma possível redução no uso indiscriminado de defensivos
agrícolas, numa tentativa de mudança no modo de viver, com a busca por produtos
37
mais saudáveis e livres de substâncias químicas que causam problemas de saúde e
ao meio ambiente (MAIRESSE e COSTA, 2009).
Ainda Morandi e Bettiol (2009) enfatizam que a sociedade preocupada com o
impacto das práticas agrícolas no ambiente e a contaminação com pesticidas vem
alterando o cenário agrícola resultando na presença de segmentos de mercado que
visam à aquisição de produtos diferenciados. Essas pressões têm levado ao
desenvolvimento de sistemas de cultivo mais sustentáveis e, portanto menos
dependentes do uso de pesticidas.
Proveniente disto deve-se buscar alternativas sustentáveis que mesmo pouco
explorada no Brasil, encontram-se presentes em extratos vegetais ou em óleos
essenciais de plantas medicinais, para desempenharem funções importantes em
interações planta-patógeno, através de ação antimicrobiana direta ou ativando
mecanismos de defesa de outras plantas que venham ser tratadas com esses
compostos (SCHWAN-ESTRADA e STANGARLIN, 2003).
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52
CAPITULO II
Óleo essencial de Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank: Influência de métodos de
secagem sobre o rendimento e a composição química e atividades fungitóxicas.
53
1 INTRODUÇÃO
O gênero Hyptis é composto por ervas, subarbustos, arbustos ou raramente
árvores pequenas. Este gênero apresenta uma grande diversidade morfológica,
principalmente na região do cerrado brasileiro, com cerca de 300 a 400 espécies
(HARLEY 1988; BORDIGNON, 1990). As espécies de Hyptis são encontradas nas
regiões tropicais e subtropicais, distribuindo-se desde a América do Norte e o Caribe
até o Peru e Argentina, com apenas algumas espécies presentes no Velho Mundo.
A maioria destas espécies são nativas do cerrado, raramente encontradas em áreas
úmidas. (HARLEY 1988, 1992, 2006).
As plantas pertencentes a este gênero se caracterizam pela presença de
substâncias com potencial farmacológico, apresentando uma composição muito
diversificada, além de grande parte delas serem aromáticas, apresentando altos
teores de óleos essenciais (FALCÃO e MENEZES, 2003).
A espécie Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank é um arbusto de folhas
odoríferas, apresenta flores lilás. É uma planta originária da Ámerica do Sul, no
Brasil se localiza na chapada de Minas Gerais, Tocantins e Goiás (FERREIRA,
2009; SAINT – HILAIRE, acesso em: 02/12/2013). Rocha-Coelho et al. (2009)
realizando um levantamento etnobotânico na Comunidade Mumbuca, localizada no
Parque Estadual do Jalapão, encontraram a H. glomerata nesta região, onde é
conhecida popularmente como pau-da-vitória, esta planta é de grande interesse
medicinal, sendo utilizada como cadiotônica. No entanto, a composição e teor dos
constituintes majoritários dos óleos essenciais de plantas do gênero Hyptis tem
apresentado elevada variabilidade, sendo estas variações atribuídas à origem
geográfica das mesmas. Porém, populações naturais de plantas que ocorrem ao
longo de um gradiente ambiental variam quanto a constituição genética e atividade
fisiológica. Embora pertencendo à mesma espécie, podem responder de modo muito
diferente às condições ambientais vigentes (MARTINS et al., 2006). Outro fator que
pode influenciar estas variações é o processo de secagem.
Soares et al. (2007), examinaram a influência de quatro temperaturas do ar de
secagem (40, 50, 60 e 70 ºC), verificaram que os maiores rendimentos de óleos
essenciais de manjericão (Ocimum basilicum L) foram obtidos no processo de
secagem com temperatura do ar igual a 40 ºC e 1,9 m/s de velocidade do mesmo.
Os maiores rendimentos de linalol foram obtidos com temperatura do ar de secagem
54
na faixa de 50 a 60 ºC e 1,9 m/s de velocidade (2,23 e 2,47 ppm, respectivamente) e
que a composição química do óleo essencial do manjericão é afetada tanto pela
temperatura como pela velocidade do ar de secagem.
Oliveira e Berbert (2011), avaliaram o efeito da temperatura do ar de secagem
sobre o teor e a composição química do óleo essencial de Pectis brevipedunculata,
das folhas e capítulos das flores que foram submetidos a quatro temperaturas de
secagem ( 40, 50 e 60 ° C) e temperatura ambiente (≅30°C). A secagem por
convecção, tanto em temperatura ambiente (≅30°C) quanto em altas temperaturas
(50 e 60º C), teve efeito deletério sobre o teor de óleo essencial de folhas e capítulos
florais desta espécie. A melhor temperatura para a secagem desta espécie foi de 40
°C. Desta forma torna-se evidente a importância de estudos que visam determinar o
método de secagem mais adequado para a obtenção de compostos ou extratos
bioativos.
Tendo em vista os problemas ocasionados por produtos químicos à saúde
dos consumidores e ao meio ambiente, e o potencial biológico apresentado pelos
óleos essenciais, estes tornam-se uma possível alternativa para o controle de
agentes fitopatogênicos, pragas agrícolas e plantas infestantes (OOTANI, et al.,
2013).
Entende-se também no trabalho do Salgado et al. (2003) que analisaram três
diferentes espécies de Eucalyptus: E. camaldulensis Dehnh., E. citriodora Hook. e E.
urophylla Blake., extraídos de suas folhas sobre os fitopatogenos, Fusarium
oxysporum, Botrytis cinerea e Bipolaris sorokiniana. As concentrações utilizadas
foram (5, 50 e 500 mg/Kg). Nas concentrações de 500 mg/Kg dos óleos, foram
observadas inibições significativas no crescimento micelial das espécies fúngicas.
Porém, o óleo essencial de Eucalyptus urophylla foi o que apresentou maior ação
fungitóxica, que foi atribuída à presença do composto denominado globulol, ausente
no E.camaldulensis e no E. citriodora.
O presente trabalho teve como objetivo avaliar o rendimento e a composição
química do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata Mart. Ex Schrank
submetidas a diferentes condições de secagem e a atividade fungitóxica do mesmo
sobre a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos Sclerotium rolfsii e
Rhizoctonia solani.
55
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS.
As folhas de H. glomerata Mart. Ex Schrank foram coletadas no período da
manhã, no município de Gurupi, Tocantins/Brasil. A colheita foi realizada no mês de
abril (estação chuvosa), entre 8-10 horas da manhã. O material foi encaminhado
para o laboratório de Química do Campus Universitário de Gurupi - UFT. Em
seguida, o mesmo foi submetido às operações de separação e seleção das folhas
sadias, sendo descartadas aquelas atacadas por praga ou doenças. Para a
confirmação da autenticidade da espécie coletada, uma exsicata foi preparada e
encaminhada para o Herbário Municipal de São Paulo. A espécie foi devidamente
identificada pela biológa Graça Maria do referido herbário e uma exsicata da mesma
encontra-se registrada com o número de registro PMSP 14700.
2.2 SECAGEM
As folhas frescas de H. glomerata foram submetidas aos seguintes processos
de secagem: i) Secagem ao ar livre, onde as folhas foram colocadas sobre uma tela
situada a trinta centímetros do solo e expostas ao sol e à temperatura ambiente; ii)
Secagem ao ar livre e à sombra, as folhas foram colocadas sobre uma tela situada a
trinta centímetros do solo e localizada á sombra e a temperatura ambiente iii)
secagem em estufa ventilada na temperatura de 40ºC. Em todos os processos as
folhas foram secas até peso constante.
2.3 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE
A umidade dos materiais vegetais frescos e secos, foi realizada de acordo
com o método oficial da AOCS, adaptado por Pimentel et al. (2006). Foram
utilizados 5 gramas das folhas frescas e secas. Este material foi inserido em um
56
balão volumétrico de 250 mL, em seguida adicionou-se 50 mL de cicloexano (C6H12)
sobre o material vegetal, acoplou-se ao balão um “Dean starck” graduado e neste
um condensador de bolas. O aquecimento foi realizado por meio de manta
aquecedora, permanecendo em ebulição por 2 horas, para posterior verificação do
volume de água contido no material vegetal (AAOCS, 1994; PIMENTEL et al., 2006).
2.4 EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
Foi empregado a metodologia de hidrodestilação, utilizando-se o aparelho de
Clevenger modificado. As folhas frescas e secas de Hyptis glomerata foram picadas
e colocadas em um balão de 1 litro de capacidade, recobertas com água destilada,
sendo o processo de extração realizado em um período de 2 horas mantendo a
solução em ebulição (GUIMARÃES et al., 2008). Terminada a extração, o hidrolato
coletado foi centrifugado a 1000 x g por 10 minutos. Após, o óleo essencial foi
retirado com o auxílio de uma pipeta de Pasteur e inserido em pequenos frascos
envoltos com papel laminado e bem vedados e acondicionados em refrigerador. Os
rendimentos dos óleos essenciais foram calculados e expressos em peso de óleo
por peso de folhas com base livre de umidade (% p/p BLU). Todas as extrações
foram realizadas em triplicada.
2.5 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
A análise qualitativa e quantitativas dos óleos essenciais foram realizadas no
Departamento de Química da Universidade Federal de Sergipe (UFS) – Aracaju –
SE, por Cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa CG-
EM. O cromatógrafo utilizado foi o modelo Shimadzu G-17A equipado com detector
seletivo de massa modelo QP5050A. O equipamento foi operado nas seguintes
condições: coluna capilar de 30 m x 0,25 mm x 0,25 DI com fase ligada DB-5MS
(Folsom, CA, USA); temperatura da fonte de íons de 280 ºC; programação da coluna
com temperatura inicial de 50 °C por 2 min, com um aumento de 4 °C/min., até 200
°C , depois 10 °C/min até 300 °C , finalizando com uma temperatura de 300 °C por
10 min; gás carreador hélio (1mL min-1); pressão inicial na coluna de 100,2 KPa; taxa
57
de split 1:83 e volume injetado de 0,5 µL (1% de solução em diclorometano). Para o
espectrômetro de massas (EM), foram utilizadas as seguintes condições: energia de
impacto de 70 eV; velocidade de decomposição 1000; intervalo de decomposição de
0,50; e fragmentos de 40 Da e 550 Da decompostos. A identificação dos compostos
foi realizada por meio da comparação dos espectros obtidos com o banco de dados
da biblioteca Wiley 229, e as análises quantitativas foram realizadas por
normalização interna (expressas em porcentagens relativas das áreas dos picos
correspondentes a cada constituinte, assumindo o mesmo fator de resposta do
detector para todos os constituintes).
2.6 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA
O experimento foi conduzido no delineamento inteiramente casualizado, com
3 repetições. A variável analisada foi o rendimento de óleo essencial (gramas/100
gramas da matéria-prima em base seca). Os dados obtidos foram submetidos às
análises de variâncias e aos testes de comparações múltiplas de médias (Tukey),
utilizando o programa SISVAR ( FERREIRA, 2011).
2.7 OBTENÇÃO DOS ISOLADOS
Os fungos fitopatogênicos Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani foram
isolados de plantas de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) afetadas pelas doenças,
podridão do colo e podridão radicular, respectivamente. Partes das plantas que
visivelmente apresentavam lesões necróticas causadas pelos fungos foram retiradas
e levadas para o laboratório. Estes fragmentos vegetais foram lavados
superficialmente em água corrente e cortados em partes menores de
aproximadamente 5 cm nos locais lesionados. Em seguida, os mesmos foram
levados para uma câmara asséptica de fluxo laminar. As amostras vegetais
passaram por uma assepsia para eliminação de microrganismos saprófitas
colocando-se 5 Placas de Petri na câmara de fluxo laminar, uma ao lado da outra.
Assim, os fragmentos doentes foram colocados na primeira placa que continha
Álcool 70 % e mantidos imersos por 30 segundos, em seguida eram retirados por
58
meio de pinça e colocados numa segunda placa que continha hipoclorito de Sódio
1% por 45 segundos. Em seguida, os fragmentos foram repassados para três placas
contendo água destilada esterilizada, retirados e colocados em papel filtro para
remoção do excesso de água. Placas de Petri de 9 cm de diâmetro com meio de
cultura BDA (batata, dextrose e ágar), anteriormente preparadas, foram utilizadas
para incubação dos fragmentos de forma a permitir que os fungos se
desenvolvessem com outra fonte nutritiva. Foram colocados em cada placa
contendo meio de cultura 5 fragmentos, em seguida as mesmas foram vedadas com
plástico "film". Posteriormente, as placas foram mantidas em câmara BOD, a 24 ºC
(± 1 ºC) e fotoperíodo de 12 horas, sob luz fluorescente. Após observação do
crescimento micelial dos referidos fungos, discos de micélio-ágar de 5 mm foram
retirados e transferidos para outra placa contendo BDA e incubados nas mesmas
condições anteriormente descritas (VALADARES et al, 2008).
2.8 ATIVIDADE FUNGITÓXICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Hyptis glomerata
Culturas puras dos dois fungos fitopatogênicos S. rolfsii e R. solani foram
testados separadamente para avaliação da atividade fungitóxica do óleo essencial
Hyptis glomerata em diferentes concentrações. Foram utilizados os óleos essenciais
desta planta medicinal extraídos a partir de folhas secas à sombra. Em seguida o
óleo essencial foi diluído em éter etílico dentro de câmara asséptica de fluxo laminar
para obtenção das cinco concentrações selecionadas 50, 250, 500, 750 e 1000 µg
mL-1. As mesmas foram elaboradas para placas de Petri de 8 cm de diâmetro, sendo
preenchidas com meio de cultura BDA com 15 mL. Como emulsificante, água
destilada foi mistura ao leite em pó até atingir a concentração de 10 mg mL-1. Assim,
em proveta esterilizada, adicionou-se a solução de leite em pó, em seguida uma das
concentrações do óleo essencial estudado e posteriormente, o meio de cultura foi
fundido sob temperatura de aproximadamente 45 ºC. Agitação manual foi necessária
para a completa homogeneização do meio. Para cada concentração, três repetições
foram efetuadas, bem como para a testemunha absoluta. Dos dois fungos testados,
discos de micélio-ágar eram repicados para o centro de cada placa já com meio
solidificado e vedada com filme plástico. A temperatura de incubação foi mantida em
24 ºC (± 1 ºC), fotoperíodo de 12 horas. A avaliação foi verificada no momento em
59
que a testemunha atingiu completamente a borda da placa. Dessa forma, as placas
que continham as concentrações foram medidas com paquímetro digital em
diâmetros perpendicularmente opostos. Para os cálculos dos percentuais de inibição
do crescimento (PIC) micelial, utilizou-se a seguinte fórmula de acordo com
(BASTOS 1997);
PIC= crescimento da Testemunha – crescimento tratamento x 100 , em que:
Crescimeto testemunha
Os tratamentos foram dispostos em esquema fatorial de 2 x 5 para avaliação
da atividade antifúngica sendo constituídos por dois fungos fitopatogênicos e cinco
concentrações de óleo essencial, sendo as análises realizadas em triplicadas. Foi
feita a análise de variância para verificação dos efeitos dos tratamentos, aplicando o
teste de Scott-Knott para agrupamento das médias, referentes à porcentagem de
inibição do crescimento micelilal dos fitopatógenos avaliados. utilizando o programa
estatístico SISVAR (FERREIRA, 2011).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Hyptis glomerata.
O estudo do método de secagem sobre o rendimento do óleo essencial das
folhas de Hyptis glomerata, demonstrou influência significativa do método de
secagem sobre o rendimento do mesmo. Observou-se que o melhor método de
secagem foi a secagem à sombra na temperatura ambiente. O menor rendimento foi
observado na extração das folhas frescas, enquanto que os rendimentos das folhas
secas ao sol e em estufa a 40°C não diferiram significativamente, e foram superiores
aqueles apresentados pelas folhas frescas, como demonstrado na Tabela 1.
60
Tabela 1 - Valores médios dos rendimentos dos óleos essenciais das folhas de
Hyptis glomerata no município de Gurupi/Tocantins submetidas a diferentes
métodos de secagem, expressos em p/p BLU (base livre de umidade).
Método de secagem Rendimentos
(%)
Folhas frescas 0,672ª
Secagem ao sol 1,090b
Secagem em estufa 1,123b
Secagem à sombra 1,560c
Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem significativamente pelo teste de Scott-
Knott, com CV: 9,42.
Estudo realizado por Mohamed Hanaa et al., (2012), avaliaram os teores de
óleos essenciais nas folhas de Cymbopogon citratus, submetidas à secagem ao sol
durante 36 horas, à sombra durante 48 horas e em estufa a 45 °C durante 7 h,
tembém demonstraram a influência do procedimento de secagem sobre o
rendimento de óleo essencial, sendo observado rendimentos de 2,45% nas folhas
secas em estufa, de 2,12% nas folhas secas à sombra e de 2,10% nas folhas secas
ao sol. Corrêa et al. (2004), estudando o rendimento de óleo essencial do assa-peixe
(Vernonia polyanthes), constataram que dentre os métodos de secagem utilizados, o
que mostrou maior teor de óleo essencial e conservação das características
organolépticas foi a secagem à sombra.
Em outro estudo, no qual verificou-se o rendimento dos óleos essenciais das
folhas frescas que foram coletadas do Horto de Plantas Medicinais do Departamento
de Agricultura da UFLA e secas, adquiridas no comércio da cidade de Lavras, de
alfavaca (Ocimum gratissimum L.), orégano (Origanum vulgare L.) e de tomilho
(Thymus vulgaris L.), observou-se rendimento de 0,13% de óleo essencial nas folhas
frescas de alfavaca e 1,02% para as folhas secas, para o óleo essencial de orégano
foram encontrados teores de 0,77% nas folhas frescas e 0,62% nas folhas secas, e
as folhas frescas de tomilho apresentaram rendimento de 0,64% enquanto que nas
folhas secas foi encontrado teor de 0,80% (BORGES et al., 2012). Diante destes
resultados, percebe-se que a alfavaca e o tomilho tiveram o rendimento de folhas
frescas menor, resultados que corroboram com os encontrados para Hyptis
glomerata. Resultado semelhante foi encontrado para o óleo essencial das folhas de
61
erva-baleeira (Cordia verbenacea), o qual apresentou rendimento de 0,47% nas
folhas frescas e de 1,92% para as folhas secas (RODRIGUES et al., 2011).
Tais resultados demonstram a importância de se realizar estudos para
determinar os melhores métodos de secagem, para que se possa extrair óleos
essenciais com melhores rendimentos, tendo em vista a possibilidade de variações
de acordo com as espécies vegetais (RADÜNZ et al. 2002; OLIVEIRA et al., 2011).
3.2 CARACTERIZAÇÃO QUÍMICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DAS FOLHAS DE
Hyptis Glomerata SUBMETIDAS A DIFERENTES MÉTODOS DE SECAGEM.
Os constituintes químicos do óleo essencial das folhas frescas e secas, por
diferentes métodos de secagem, de Hyptis glomerata, seguidos pelos seus tempos
de retenção e seus teores expressos em porcentagem (calculados por normalização
de áreas) encontram-se na Tabela 2.
Tabela 2 - Constituintes químicos dos óleos essenciais das folhas frescas e secas
de Hyptis glomerata coletados no Município de Gurupi/TO e os seus respectivos
teores expressos em porcentagem.
Compostos TRa
Folhas
frescas
Métodos de secagem
Sombra Sol 40°C
α-tujeno 9,01 -b 0.25346 t
c T
α-pineno 9,26 1.86684 12.47242 6.94917 10.91275 Canfeno 9,76 - t 0.12976 T
Sabineno 10,51 0.31253 0.86713 0.60051 0.90995 β-pineno 10,66 1.73532 6.16174 3.59829 4.71356
ο-cimeno 12,18 T 0.13913 0.15303 0.17628 Limoneno 12,31 0.90257 1.94610 1.17529 1.39963 1,8-cineol 12,44 5.28614 5.14905 4.59500 6.52935
cis-sabineno hidratado
13,63 T 0.30524 0.21974 0.50190
Linalol 14,59 0.66587 0.95921 0.78709 0.73929 Óxido de α-pineno 14,72 0.75503 - T 0.95767 Acetato de octen-1-ol 14.87 0.37695 0.37648 0.28649 0.36601
óxido de limoneno 14,99 1.25994 0.24397 0.45867 0.92125 α-canfoleno aldeído 15,57 0.33855 t T 0.18995
trans-pinocarveol 16,09 1.08660 0.36115 0.89051 1.02681 Verbenol 16,27 T - 1.02989 0.62380 Pinocarvona 16,85 0.23614 0.13066 0.31779 0.29020
1-borneol 17,03 T t T 0.12866 4-terpineol 17,28 T 0.70499 0.74005 0.20947
62
α-terpineol 17,70 T t T T (1R)-(-)-mirtenal 17,93 T t 0.37036 0.35426 Verbenona 18,36 0.54732 t 0.26257 0.32171 Pulegona 19,25 T t 0.59691 T
trans-pinocarveol 21,34 0.49405 t 0.25346 0.59603 cis-verbenol 21,46 0.53071 - T 0.52754
Mirtenol 21,74 0.46711 - 0.18910 0.36032 Bicicloelemeno 22,14 - 0.78775 - -
Copaeno 23.32 T 0.38872 0.16741 0.18654
β-borboneno 23,61 T 0.11138 T T
β-elemeno 23.68 T 0.24965 T T
E-cariofileno 24,64 - 17.86032 4.37426 1.42799 α-bergamoteno 24,87 T 0.41205 0.31706 0.16792 Aromadendrene 25,19 T 0.14626 0.18766 T
α-humuleno 25.59 - 2.54872 1.05183 0.46363 Germacreno D 26,32 - 0.57449 - -
Torreiol 26,66 1.18879 5.31537 1.81830 1.23761 Selin-6-en-4-ol 27,23 4.36442 3.97515 4.59826 3.77550
Spatulenol 28.94 9.93065 7.81652 10.41720 10.06864 Óxido de cariofileno 29,13 43.97890 18.70067 38.46165 37.08471 Óxido de humuleno 29,76 3.41370 1.33059 3.02556 1.23761
β-eudesmol 30,77 5.46847 4.15146 5.29845 3.25279
Total 92,03 98,66 99,35 99,15 aTR = Tempo de retenção (minutos),
b - = não detectado e
cTraços (valores < 0,1%).
Os constituintes majoritários do óleo essencial das folhas frescas de Hyptis
glomerata foram óxido de cariofileno (43,98%), spatulenol (9,93%), β-eudesmol
(5,47%), 1,8-cineol (5,29%) e selin-6en-4-ol (4,36%), observa-se a predominância de
sesquiterpenos oxigenados. O óleo essencial das folhas submetidas à secagem ao
sol, também apresentou como constituinte majoritário o óxido de cariofileno
(38,46%) seguido pelo spatulenol (10,42%) e em menores teores os compostos α-
pineno (6,95%), β-eudesmol (5,29%), 1,8-cineol (4,59%) e selin-6-en-4-ol (4,59%) e
o (E)-cariofileno (4,37%). O óxido de cariofileno foi o constituinte majoritário
(37,08%) do óleo essencial das folhas secas em estufa a 40°C, seguido pelo α-
pineno (10,91%), spatulenol (10,07%), 1,8-cineol (6,53%) e β-pineno (4,71%). Por
outro lado, o óleo essencial das folhas secas à sombra apresentou como
constituintes majoritários, com teores próximos o óxido de cariofileno (18,70%) e o
(E)-cariofileno (17,86%) seguidos pelo α-pineno (12,47%), spatulenol (7,81%), β-
pineno (6,16%), torreiol (5,31%) e o 1,8-cineol (5,14%).
Em todos os óleos essenciais independente da secagem, ou do modo como a
mesma foi realizada, observa-se a predominância do óxido de cariofileno. No
entanto, verificou-se algumas variações em relação aos teores de alguns compostos
em decorrência da mesma. Nos óleos essenciais obtidos das folhas secas constatou
63
um aumento nos teores do α-pineno, β-pineno, limoneno e o aparecimento do (E)-
cariofileno, com um teor semelhante ao constituinte majoritário do óleo essencial
seco à sombra, e do α-humuleno que apresentou teores iguais a 2,55, 1,05 e 1,43
nos óleos obtidos das folhas secas à sombra, ao sol e em estufa a 40°C,
respectivamente. Por outro lado os teores de alguns compostos que se encontram
entre os majoritários dos óleos essenciais, como o β-eudesmol, spatulenol, selin-6-
em-4-ol e 1,8-cineol, não sofreram variações consideráveis perante os
procedimentos de sacagem.
Entre as variações observadas, a mais proeminente foi a grande diminuição
do teor do óxido de cariofileno, que passou de 43,98% no óleo essencial das folhas
frescas para 18,70% no óleo essencial obtido das folhas secas à sombra. No
entanto, esta diminuição coincide com o aparecimento do (E)-cariofileno neste óleo
essencial, em um teor próximo aquele de óxido de cariofileno que foi perdido, em
relação ao óleo essencial das folhas frescas. Nos óleos essenciais obtidos das
folhas secas ao sol e em estufa a 40°C, também observa-se o aparecimento do (E)-
cariofileno, no entanto em tores muito menores, mas que também se encontram
próximos aos teores de óxido de cariofileno que foram perdidos em relação ao óleos
essencial das folhas frescas. Tal fato pode ser um indicativo de que o óxido de
cariofileno foi convertido a (E)-cariofileno nos processos de secagem. O maior teor
(E)-cariofileno encontrado no óleo essencial seco à sombra pode estar relacionado
ao tempo de secagem, tendo em vista que este método é o mais demorado.
Estes resultados não corroboram com os encontrados por Silva et al. (2000)
que realizaram a caracterização do óleo essencial das folhas, inflorescência e do
troco de Hyptis glomerata, nativas de Minas Gerais, onde foram identificados um
total de 19 compostos, encontrando o (E)-cariofileno (folha 14,3%; caule 8,6%), γ-
cadinene (cerca de 14% em todas as partes), guaiol (folhas 10,7%; inflorescência
9,4%), s-calameneno (caule, 11,4%) e globulol (inflorescência, 16,8%) foram os
constituintes majoritários.
Rahimmalek e Goli (2013), fizeram a avaliação de seis tipos de secagem em
relação ao rendimento de óleo, composição e cores características essenciais do
Thymys daenensis subsp. daenensis, (sol, sombra , forno de 50 ° C , 70 ° C forno,
microondas e liofilização). Constatou-se que a secagem ao ar à temperatura
ambiente, aumentou significativamente o rendimento do óleo essencial. As
64
temperaturas mais elevadas (microondas e forno 70°C) aumentou o timol, carvacrol
e conteúdo β –cariofileno.
Cunha et al. (2012), estudando folhas secas a sombra da erva-cidreira (Lippia
alba), verificou que em sua constituição química, obteve o geranial (E-citral) (27,9%),
seguido de neral (Z-citral) (17,4%) e óxido de cariofileno (17,4%).
3.3 ATIVIDADE FUNGITÓXICA DO ÓLEO ESSENCIAL DE Hyptis glomerata.
De acordo com os resultados obtidos na avaliação in vitro do efeito do óleo
essencial de Hyptis glomerata sobre a inibição do crescimento micelial de
Rhizoctonia solani e Sclerotium rolfsii., verificou-se efeito significativo dos fatores
concentração, fitopatógeno e também da interação desses fatores sobre as inibições
dos crescimentos miceliais de ambos fitopatógenos, devido ao óleo essencial de
Hyptis glomerata. Por meio dessa interação, observou-se a existência da variação
da atividade fungitóxica, dependendo da concentração do óleo essencial e do
fitopatógeno.
As porcentagens de inibição do crescimento micelial dos fungos estudados,
causadas pelas diferentes concentrações do óleo essencial de Hyptis glomerata,
encontra-se na Tabela 3.
Tabela 3 – Atividade fungitóxica do óleo essencial de Hyptis glomerata expressa em
relação a inibição do crescimento micelial dos fitopatógenos Rhizoctonia solani e
Sclerotium rolfsii.
Concentrações (μg mL1)
Inibição micelial (%)
S. rolfsii R. solani
50 26,3aA 59,0aB 250 35,1bA 62,9aB 500 37,5bA 68,8bB 750 41,8cA 73,9bB 1000 47,3cA 74,4bB
Médias seguidas pela mesma letra minúscula na mesma coluna e pela mesma letra maiúscula na mesma linha não diferem significativamente pelo teste de agrupamento Scott-Knott (p = 0,05) com CV% 8,6.
O óleo essencial de H. glomerata, apresentou efeito fungitóxico sobre o
crescimento micelial dos dois fitopatógenos estudados. No entanto, para a mesma
concentração de óleo essencial, pode-se observar diferença significativa entre as
65
porcentagens de inibição apresentadas sobre cada fitopatógeno. O fungo
fitopatogênico R. solani, foi mais sensível ao óleo essencial de H. glomerata em
todas as concentrações utilizadas, apresentado os maiores valores de inibição, em
comparação as inibições apresentadas sobre o crescimento micelial de S. rolfsii. A
maior inibição do crescimento micelial dos dois microrganismos ocorreu perante a
maior concentração utilizada do óleo essencial (1000 μg mL-1). Sendo de 74,40%
sobre o R. solani e de 47,34% sobre o S. rolfsii. No entanto, sobre a inibição do
crescimento micelial do R. solani observa-se que a partir da concentração de 500 μg
mL-1 não observa-se diferença significativa sobre as porcentagens de inibição. Já
sobre o fitopatógeno S. rolfsii, observa-se que as inibições causadas pelas
concentrações de 750 e 1000 μg mL-1 não apresentam diferenças significativas.
Outras espécies de Hyptis, também possuem esta propriedade
antimicrobiana, Malele et al., (2003), mostraram uma forte atividade anti-fúngica para
o óleo essencial das folhas de H. Suaveolens nas concentrações de 500 e 1000 μg /
mL contra Saccharomyces cerevisiae, Mucor sp. e Fusarium moniliforme. Da mesma
forma Moreira et al., (2010) relatam o efeito fungitóxico do óleo essencial Hyptis
suaveolens (L.) sobre o crescimento micelial de algumas espécies de Aspergillus
potencialmente patogênicos (A. flavus, A. parasiticus, A. ochraceus, A . fumigatus e
A. niger). Tais autores observaram que este óleo essencial nas concentrações de 40
e 80 μg/mL inibiu o crescimento micelial das espéceis A. fumigatus e A. parasiticus
em 100% ao longo de 14 dias. Em menores concentrações, 10 e 20 μg/mL, este
óleo essencial causou alterações morfológicas nos micélios de A. Flavus, como
diminuição da conidiação, vazamento de citoplasma, perda de pigmentação e
rompimento da estrutura celular, ocasionando a degeneração da parede fúngica.
Linde et al. (2010) estudaram a atividade antifúngica in vitro do óleo essencial
de Lippia rehmannii comparando-a com as atividades apresentadas pelo óleo de
Cympopogon citratus e seu constituinte majoritário, citral, sobre o crescimento
micelial de Fusarium oxysporum e Rhizoctonia solani. Na concentração de 3000
µL/L, o óleo de C. citratus e o citral, causaram inibição total do crescimento dos
fitopatógenos utilizados. O óleo essencial de Lippia rehmannii, foi eficaz nesta
mesma concentração inibindo em com 63 e 69 % de inibição de R. solani e F.
oxysporum obtidos, respectivamente. Hillen et al. (2012) ao analisarem os efeitos
dos óleos essenciais de alecrim, candeia e palmarosa utilizados em diferentes
alíquotas, verificaram que houve inibição do crescimento micelial de Alternaria
66
carthami, Alternaria sp. e Rhizoctonia solani. As maiores taxas de inibição do
crescimento micelial de todos os patógenos (100%) foram observadas quando se
adicionou o óleo essencial de palmarosa ao meio de cultura a partir da concentração
de 20 μL. O óleo essencial de candeia e de alecrim proporcionou 100% de inibição
do crescimento micelial de todos os fitopatógenos a partir da concentração de 200
μL.
Zellner et al. (2009) avaliaram uma espécie rara do cerrado brasileiro, Hyptis
passerina Mart., quanto a composição química do óleo essencial e atividade
antibacteriana das folhas de flores, contra as bactérias Gram-positivas
Staphylococcus aureus e Staphylococcus epidermidis, bactéria Gram-negativa
Pseudomonas aeruginosa, e a levedura Candida albicans, constataram que o óleo
essencial derivado da folha nas concentrações de 500 mg e 250 mg inibiu o
crescimento de S. aureus e P. aeruginosa em proporção idêntica. O óleo derivado
da flor foi apenas na concentração de 500 mg e de 250 mg mais ativo no P.
aeruginosa. A levedura, foi mais susceptível à óleo derivado de flor, com uma
resposta mais ou menos constante, o óleo derivado de folha não foi muito ativa
contra C. albicans .
Sharma e Tripathi (2008) pesquisando o controle integrado de pós-colheita da
podridão de Fusarium (Fusarium oxysporum f. Sp.) de rebentos de gladíolo
(Gladiolus spp. (Tourn.) L.), utilizando água quente, UV-C e óleo essencial de Hyptis
suaveolens (L.) Poit., verificaram que para controlar o crescimento da população do
patógeno após o armazenamento de 4 e 12 semanas. O tratamento com água
quente a 55 °C durante 25 min, ou um tratamento com UV- C com uma dose de 3,63
kJ m-2 foi suficiente para inibir germinação de conídios. Em relação ao óleo
essencial, observou-se que na concentração de 0,6 μL/cm-3 o óleo foi capaz de inibir
completamente o crescimento dos fungos e na concentração de 0,4 μL/cm-3 o óleo
inibiu completamente a germinação dos esporos.Santos et al. (2008), analisando a
concentração mínima inibitória (MIC) e concentração microbicida mínima (CMM) do
óleo essencial de Hyptis pectinata frente a diversas leveduras e bactérias,
Observaram que os valores de CIM negativos foram mantidos para as leveduras e
as bactérias gram ( + ). O mais sensível leveduras foram C. albicans (CIM = 0,58 mg
mL- 1), C. neoformans (CIM = 1,17 mg mL- 1) E C. dubliniensis ( CIM = 3,12 mg mL-1).
para Gram (+) bactéria ( S. aureus , S. epidermidis , B. subtilis e E.faecalis )
testados, o óleo essencial apresentou valores de CIM entre 12,5 e 50 mg mL- 1. S.
67
aureus e B. subtilis apresentados menores CIM (12,5 mg mL- 1) , e E. faecalis o
maior MIC (50 mg mL- 1).
4 CONCLUSÕES
Os teores do óleo essencial das folhas de Hyptis glomerata que foram
submetidas a secagem, teve o melhor rendimento à secagem a sombra.
Os métodos de secagem (sombra, sol e estufa), influenciou na composição do
óleo essencial Hyptis glomerata.
O óleo essencial desta espécie apresentou efeito fungitóxico, sendo capaz de
causar a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia solani e Sclerotium
rolfsii. No entanto, em relação a sua atividade fungitóxica, os valores observados
não faz com que futuras avaliações in vivo sejam realizadas.
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73
CAPÍTULO III
ATIVIDADE FUNGITÓXICA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS DE Lippia sidoides Cham. E DE Cymbopogon citratus (D.C.) Stapf. NO CONTROLE DA PODRIDÃO DO COLO
DO FEIJOEIRO COMUM.
74
1 INTRODUÇÃO
As leguminosas desempenham um papel importante na agricultura e na
alimentação, e o feijão (Phaseolus vulgaris) destaca-se por ser um componente
alimentar básico na dieta da população brasileira (YOKOYAMA et al., 2000).
Salgado et al. (2011), estudando o comportamento de genótipos de feijão, no
período da entressafra, no Sul do Estado do Tocantins, verificaram que o Estado
possui grande potencialidade para o cultivo no período da entressafra. Entre os
problemas da cultura as doenças se destacam por afetar diariamente a
produtividade. Entre as principais doenças, cujos agentes causais apresentam
capacidade de sobreviver no solo encontram-se: i) Mela e podridão radicular do
feijoeiro comum causadas pelo fungo Rhizoctonia solani e ii) Podridão do colo do
feijoeiro comum causada pelo fungo Sclerotium rolfsii. (MAPA, acesso: 27/11/2012).
Atualmente para o controle das pragas e doenças normalmente são utilizados
vários pesticidas, sendo necessárias pulverizações preventivas de inseticidas e
fungicidas para a diminuição destes problemas fitossanitários. Porém, o uso
indiscriminado desses produtos vem causando impactos em inimigos naturais e
promovendo resistência dos insetos e dos microrganismos (ALMEIDA et al., 2008).A
Lippia sidoides, conhecida como alecrim-pimenta, é uma planta medicinal da família
Verbenaceae, encontrada principalmente no nordeste brasileiro (LORENZI e
MATOS, 2008). O seu óleo essencial é rico em timol ou carvacrol, compostos com
grande potencial biológico.
Outra planta que é produtora de óleo essencial de importância econômica e o
capim-limão (Cymbopogon citratus (D. C.) Stapf), pertencente a família das
Poaceae, é uma planta aromática cultivada para produção comercial de óleo
essencial, o qual possui como constituintes majoritários o citral (mistura isomérica de
neral e geranial) e o mirceno (PRINS et al., 2008).Verifica-se que vários estudos têm
atribuído diversas atividades biológicas para o óleo essencial de Cymbopogon
citratus, por conter compostos voláteis, por apresentarem componentes naturais,
evitando-se o uso de aditivos sintéticos, deteriorações, oxidações e o ataque de
microrganismos, apresentando eficiência nas funções antioxidantes, antirradicais e
antimicrobianas em alimentos (SACCHETTI et al., 2005).
75
Nguefack et al. (2004), porém avaliando o efeito do óleo essencial do C.
citratus sobre o crescimento micelial de fungos, por meio de ensaios “in vitro”, foi
observado que o óleo essencial reduziu em 64% o desenvolvimento de Fusarium.
moniliforme na concentração de 200 ppm, de Aspergillus flavus em 48% e de
Aspergillus fumigatus em 77% na concentração de 500 ppm. O controle total ocorreu
a 300 ppm para F. moniliforme e 1200 ppm para A. flavus e A. fumigatus.Cimanga et
al. (2002) verificaram que o óleo de Cympobogon citratus foi efetivo no controle de
cepas de bactérias Citrobacter diversus, mostrando-se eficiente no controle de 77%
de 22 cepas avaliadas. Silva et al. (2008) demonstraram a atividade antifúngica do
óleo essencial de capim-limão e de seu constituinte majoritário citral sobre espécies
de candida spp, quando empregados 8.0 µL de cada composto, encontrando halos
de inibição maiores que 40 mm de diâmetro, sendo a espécie C. albicans a mais
sensível diante ao efeito fungitoxico do óleo essencial utilizado. Guimarães et al.
(2011) verificaram a inibição do crescimento micelial, do óleo essencial de C. citratus
e o citral, sobre os fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum cubense,
Colletotrichum gloeosporioides, Bipolaris sp. e Alternaria alternata, com valores de
IC50 variando entre 75,0 e 162,18 μg mL-1 para o óleo essencial e entre 58,24 a
126,97 μg mL-1 para o citral. As novas alternativas devem ser estudadas, visando à
conservação do meio ambiente e à qualidade de vida dos consumidores e
trabalhadores, com práticas de controle de doenças com uso de produtos ou
substâncias naturais, objetivando otimizar a produção de alimentos saudáveis, de
alta qualidade e menor impacto ao meio ambiente.
O objetivo do trabalho foi avaliar a atividade “in vivo”, dos óleos essenciais de
Lippia sidoides Cham. dos acessos de Minas Gerais e Ceará, de Cymbopogon
citratus (D.C.) Stapf. e de seus constituintes majoritários, carvacrol, timol e citral,
respectivamente, sobre os efeitos causados pelos fitopatógeno e Sclerotium rolfsii,
em plantas de Phaseolus vulgaris L.
76
2 MATERIAL E MÉTODOS
2.1 OBTENÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS
ESSENCIAIS.
As folhas de Lippia sidoides Cham. e de Cymbopogon citratus (D.C) Stapf
foram coletadas no período matutino, no município de Gurupi, Tocantins/Brasil. Os
óleos essenciais utilizados foram extraídos no Laboratório de Química - UFT-
Campus de Gurupi. Foi empregado a metodologia de hidrodestilação, utilizando-se o
aparelho de Clevenger modificado. As folhas frescas de cada espécie vegetal foram
picadas e colocadas em um balão de 1 litro de capacidade, recobertas com água
destilada, sendo o processo de extração realizado em um período de 2 horas
mantendo a solução em ebulição. (GUIMARÃES et al., 2008). Terminada a extração,
o hidrolato coletado foi centrifugado a 1000 x g por 10 minutos. Após, o óleo
essencial foi retirado com o auxílio por meio de uma pipeta de Pasteur e inserido em
pequenos frascos envoltos com papel laminado, bem vedados e acondicionados em
refrigerador.
2.2 ISOLAMENTO DOS FUNGOS UTILIZADOS NOS BIOENSAIOS
Os fungos fitopatogênicos Sclerotium rolfsii e Rhizoctonia solani foram
isolados de plantas de feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris) acometidas pelas
doenças, podridão do colo e podridão radicular, respectivamente. Partes das plantas
que visivelmente apresentavam necroses causadas pelos fungos foram retiradas e
levadas para o laboratório. Estes fragmentos vegetais foram lavados
superficialmente em água corrente e cortados em partes menores de
aproximadamente 5 cm nos locais lesionados. Em seguida, os mesmos foram
levados para uma câmara asséptica de fluxo laminar. As amostras vegetais
passaram por uma assepsia para eliminação de microrganismos saprófitas
colocando-se 5 Placas de Petri na câmara de fluxo laminar, uma ao lado da outra.
Assim, os fragmentos doentes foram colocados na primeira placa que continha
77
Álcool 70 % e mantidos por 30 segundos, em seguida foram retirados por meio de
pinça e colocados numa segunda placa que continha Hipoclorito de Sódio 1% por 45
segundos. Em seguida, os fragmentos foram repassados para três placas contendo
água destilada esterilizada, retirados e colocados em papel filtro para retirada do
excesso de água. Placas de Petri de 9 cm de diâmetro com meio de cultura BDA
(Batata Dextrose Ágar), anteriormente preparadas, foram colocadas para incubação
dos fragmentos e permitir que os fungos se desenvolvessem com outra fonte
nutritiva. Foram colocados em cada placa com meio de cultura 5 fragmentos e
vedadas com plástico "film". Posteriormente, as placas foram deixadas em câmara
BOD, a 24 ºC (± 1 ºC) e fotoperíodo de 12 horas, sob luz fluorescente. Após
observação do crescimento micelial dos referidos fungos, discos de micélio-ágar de
5 mm foram retirados e transferidos para outra placa contendo BDA e incubados nas
mesmas condições anteriormente descritas (VALADARES et al, 2008).
2.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA IN VIVO PARA INIBIÇÃO DOS MICÉLIOS
O experimento foi realizado em casa de vegetação na Universidade Federal
do Tocantins, Campus de Gurupi. Para a correta semeadura, ao solo foi adicionado
uma mistura de esterco bovino e areia (proporção 1:1:1). As sementes de P. vulgaris
foram adquiridas em supermercados e semeadas em vasos de polietileno furados
com capacidade de 7 kg. Decorridos 13 dias, durante o estágio vegetativo, os óleos
essenciais de Lippia sidoides (quimiotipo carvacrol), Lippia sidoides (quimiotipo
timol), Cimbopogon citratus e seus respectivos compostos majoritários, timol,
carvacrol e citral foram aplicados de acordo com os seguintes períodos: 5 dias antes
de inocular os fungos (A), 5 dias antes e 5 dias depois da inoculação dos fungos
(AD) e 5 dias depois da inoculação. As concentrações utilizadas foram de 50, 300,
400, 500, 1000 e µg mL-1, cada uma com três repetições. Em bancada de
laboratório, seis erlenmeyers de 1L foram utilizados para obtenção das soluções
estoque (500 mL com concentração de 1000 µg mL-1). Foram necessários 200 mL
de cada solução para borrifar as plantas até o ponto de escorrimento da solução
pelas folhas. Assim, vasos foram separados como testemunha absoluta, sendo
borrifado apenas água destilada. Também foi preparada uma testemunha relativa,
na qual foi borrifada uma solução de água e leite em pó. Para os outros tratamentos,
78
500 mg de cada óleo ou composto eram pesados e emulsificados em 500 mL de
uma solução de leite em pó e água destilada (4 mg mL-1). A partir desta solução
estoque foram preparadas as demais dosagens. A irrigação das plantas era
realizada duas vezes ao dia afim de manter o solo sempre úmido.
A inoculação dos micélios de S. rolfsii foi realizada, prendendo discos de 5
mm de diâmetros, contendo micélios de culturas com 7 dias de inoculação, nos
caules das plantas. Para a fixação dos discos, utilizou-se adesivos de papel.
2.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O delineamento foi inteiramente casualizado em esquema fatorial de (8
compostos x 5 doses) e 4 repetições. Utilizou as seguintes formula:
Severidade = [(número de plantas na classe 1 de severidade) + (número de plantas
na classe 2 x 2) + (número de plantas na classe 3 x 3) + (número de plantas na
classe 4 x 4) + (número de plantas na classe 5 x 5)+ (número de plantas na classe 6
x 6) ]/21. Portanto, os valores finais médios de severidade foram de 0,190cm a
1,142cm. Os critérios de nota utilizados estão apresentados na Tabela 4.
Tabela 4: Critérios de notas para avaliar a severidade.
NOTAS % SINTOMAS
0 0% sem infecção
1 1 a
25%
Lesão com presença de micélio na região do colo ou caule da
planta. Micélio claro começa a surgir
2 26 a
50%
Lesões de infecto aquoso marrons sobre o colo que circunda o
caule, amarelecimento das folhas baixeiras e superiores.
3 51 a
75%
Colo totalmente colonizado acarretando a murcha na parte área e
consequentemente seca e queda das folhas,
4 76 a
90% Destruição do córtex
5 91 a
100% Destruição da raiz principal e morte da planta
79
Após a coleta dos dados realizou-se a análise de variância e compararam-se
as médias de incidência (%) ou severidade de cada pelo teste de Tukey (5%).
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 AÇÃO FUNGITÁSTICA
As avaliações da severidade da doença foram realizadas a cada dois dias,
havendo um total de 5 avaliações realizado mediante o progresso temporal (avanço
da doença em relação ao tempo). Foram utilizados os valores finais médios de
severidade que variaram de 0,190 cm a 1,142 cm de acordo com o aumento da
doença nos diferentes tratamentos, sendo concentrações de todos os óleos e
compostos utilizados em relação aos três períodos de aplicação, cinco dias antes da
inoculação, cinco dias depois e cinco dias antes e cinco dias depois.
Os resultados obtidos para avaliação “in vivo” do efeito dos óleos essenciais
das plantas medicinais de L. sidoides (dois acessos Minas Gerais e Ceará) C.
citratus, bem como de seus constituintes majoritários Carvacrol, Timol e Citral,
respectivamente, sobre a infecção de S. rolfsii inoculado em plantas de P. vulgaris
(feijão comum) encontram-se nas Figuras 6,7 e 8.
80
Figura 6: Efeito das concentrações do óleo essencial C. citratus e seu constituinte
majoritário citral em relação a severidade da podridão do colo, causada por
Sclerotium rolfsii em caule de plantas de feijoeiro comum.
81
De acordo com os resultados apresentados graficamente na Figura 6,
observa-se que o comprimento da lesão (cm) no caule do feijoeiro submetido ao
tratamento preventivo com o óleo essencial de C. citratus foi de 0,8 cm, na dosagem
de 50 μgmL-1. Para o tratamento com o Citral, o tamanho da lesão foi de 0,9 cm na
dosagem de 300 e 1000 μgmL-1. Este resultado obtido em comparação com a
testemunha absoluta demonstra que a severidade foi controlada em 34% e 24%
respectivamente. Na aplicação curativa (depois da inoculação do S. rolfsii) as
plantas tratadas com o óleo essencial de C. citratus apresentaram lesão de 0,9 cm,
nas dosagens de 50, 500 e 1000 μgmL-1. Já as plantas tratadas com o citral
também apresentaram comprimento da lesão no caule de 0,9 cm nas mesmas
dosagens citadas anteriormente, onde obteve-se em ambos tratamentos o controle
de 24% em relação a testemunha absoluta. Com relação à aplicação 5 dias antes e
5 dias depois do óleo de C. citratus também verificou-se lesão dede 0,9 cm, na
dosagem de 400 μg mL-1, sendo que com relação ao Citral o comprimento da lesão
foi de 0,7 cm, resultando desta forma, em respectivo controle de 24% e 44% em
relação à testemunha.
82
Figura 7 - Efeito das concentrações do óleo essencial de Lippia sidoides - MG e seu
constituinte majoritário Carvacrol em relação à severidade da doença causada pelo
fungo Sclerotium rolfsii em caule de plantas de feijoeiro comum.
De acordo com os resultados apresentados graficamente na Figura 8,
observa-se que as plantas tratadas com o óleo essencial de L. sidoides – MG na
aplicação preventiva apresentaram comprimento de lesão (cm) no caule de 0,9 cm,
na dosagem de 500 μgmL-1. Já na aplicação preventiva do composto e o Carvacrol,
foi verificada lesão de 0,8 cm, nas dosagens de 500 e 1000 μgmL-1, sendo que com
a relação à testemunha absoluta ficou demonstrado que a severidade foi controlada
em 24% e 34% respectivamente. Na aplicação dos óleos de forma curativa (depois
da inoculação do S. rolfsii aplicou-se o óleo essencial de L. sidoides – MG) foi obtido
um tamanho de lesão de 0,8 cm, na dosagem de 50 μgmL1; e de 0,7 cm, para o
composto Carvacrol, na dosagem de 400 μg mL-1, sendo obtido o controle de 34 e
44%, respectivamente, em relação à testemunha absoluta. Com relação à aplicação
com 5 dias antes e 5 dias depois de L. sidoides – MG foi medido uma lesão de 0,9
cm tanto para dosagem de 400 μg mL-1 como também para o Carvacrol nas
dosagens de 50 e 500 e 1000 que tiveram um percentual de 24% de controle em
relação à testemunha.
83
Figura 8 - Efeito das concentrações do óleo essencial Lippia sidoides - CE e seu
constituinte majoritário Timol em relação à severidade da podridão do colo, causada
pelo fungo Sclerotium rolfsii em plantas de feijoeiro comum.
84
De acordo com os resultados apresentados na Figura 9, observa-se que o
tratamento do feijoeiro com o óleo essencial de L. sidoides – CE em aplicação
preventiva (antes da inoculação do fungo) teve lesão no caule de 0,8cm, na
dosagem de 1000 μgmL-1. Com relação ao Timol aplicado da mesma forma, foi
observada lesão de 0,9 cm, nas dosagens de 500 e 1000 μg mL-1, sendo que com a
relação à testemunha absoluta demonstra que a severidade foi controlada em 34% e
24% respectivamente. Na aplicação curativa das plantas com o óleo essencial de L.
sidoides – CE foi obtida lesão de 0,8cm, tanto para a dosagem de 1000μg mL-1 como
também para o tratamento com o Timol na dosagem de 1000 μg mL-1, onde ambos
os tratamentos tiveram o controle de 34%, em relação à testemunha absoluta. E na
aplicação 5 dias antes e 5 dias depois no L. sidoides – CE foi de 0,8 cm na dosagem
de 50 μgmL-1 e o Timol nas dosagens de 300 que tiveram o controle de 34% em
relação a testemunha absoluta.
As dosagens observadas das Figuras (6, 7 e 8), foram os melhores resultados
em comparação com as demais doses, mas todos os tratamentos não foram
satisfatórios, uma vez que houve pouca eficiência dos óleos essenciais e de seus
constituintes majoritários sobre o controle da podridão do colo do feijoeiro causada
pelo fungo S. rolfisii em plantas de feijoeiro comum. Uma possível justificativa para
os resultados encontrados pode estar relacionada com a metodologia utilizada, pois
os óleos essenciais e seus constituintes podem ter evaporado com o decorrer do
tempo, tendo em vista as suas altas volatilidades, diminuindo as suas concentrações
junto as plantas, acarretando a menor atividade dos mesmos.
Em outros estudos avaliando a atividade in vivo de outros óleos essenciais
sobre fungos fitopatogênicos, é possível observar efeitos significativos dos mesmos
no controle dos sintomas causados pelas respectivas doenças. Bastos e
Albuquerque (2004), estudando o efeito do óleo essencial de pimenta de macaco
(Piper aduncum) sobre a podridão de frutos de banana (Musa spp.) causada por
Colletotrichum musae no período de pós-colheita, observaram o controle de
podridões nos frutos de banana, com o óleo essencial presente na concentração de
1%
Carnelossi et al. (2009), por meio de ensaio in vivo, utilizaram os óleos
essenciais Cympobogon citratus (1%) e Eucalyptus citriodora (1%), observaram o
controle do progresso da doença causado por Colletotrichum gloeosporioides em
frutos de mamão (Carica papaya). Também foi observado influência do período de
85
aplicação dos óleos essenciais em relação a inoculação do fitopatógeno,
constatando uma maior AACPD (Área Abaixo da Curva do Progresso da Doença)
nos frutos tratados imediatamente após a inoculação. Porém, frutos tratados e
inoculados 24h após os tratamentos apresentaram maior controle da doença,
confirmando o potencial dos óleos essenciais avaliados.
Resultados contrários aos observados pelos óleos essenciais estudados
foram encontrados por Aquino et al. (2012), que avaliando o efeito fungitóxico dos
óleos essenciais Lippia sidoides, Cymbopogon citratus e Ocimum gratissimum no
manejo da antracnose do maracujá, demonstraram a inibição total do
desenvolvimento do fungo a partir da concentração de 6 μL mL-1 dos óleos
essenciais. Fungicidas naturais à base de óleos essenciais de L. sidoides, Mentha
arvensis, O. gratissimum, Eucalyptus terenticornis apresentaram resultados
satisfatórios no tratamento pós-colheita do pedúnculo do melão, sendo observado a
influência do período de aplicação, tendo em vista a maior eficiência dos mesmos
perante o tratamento preventivo em relação ao curativo. Entre os óleos avaliados o
mais efetivo foi o de L. sidoides que inibiu a incidência de Fusarium subglutinans,
quando aplicado antes da inoculação, em 100%, na concentração de (Gadelha et al.,
2003). Além da baixa atividade dos compostos avaliados sobre o controle da
podridão do colo do feijoeiro, deve-se ressaltar o difícil controle do fitopatógeno S.
rolfisii devido a sua alta capacidade de sobrevivência no solo (BLUM et al., 2003). O
que ocasiona dificuldades de controle dessa doença.
4 CONCLUSÃO
São necessários a utilização de novas metodologias para averiguar o
potencial fungitóxico, por meio de ensaios in vivo, dos óleos essenciais de Lippia
sidoides, Cymbopogon citratus e seus constituintes majoritários para o controle de
fitopatógenos.
86
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89
ANEXO A
Tabela 5 - Análise de variância com aplicação do teste F para os valores observados de
rendimentos do óleo essencial das folhas do Hyptis glomerata submetidas a
diferentes métodos de secagem.
FV GL SQ QM FC Pr>Fc
Método secagem 3 1,18 0,39 36,11 0,00
Erro 11 0,08 0,01
CV (%) 9,42
Média geral 1,11
Tabela 6 - Análise de variância com aplicação do teste F para o efeito do óleo essencial de
Hyptis glomerata sobre a inibição do crescimento micelial de Rhizoctonia solani e
Sclerotium rolfsii.
FV GL SQ QM FC Pr>Fc
Fungo 1 6838,48 6838,48 329,09 0,00
Concentração 4 1001,27 250,31 12,04 0,00
Concentração*fungo 4 278,39 69,59 3,34 0,02
Erro 20 415,58 20,77
CV (%) 8,64
Média geral 52,75