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OCUPAÇÃO CIENTIFICA NAS FÉRIAS12 - 23 JULHO 2010
Influência dos miRNAs na activação da microgliaCoordenação : Doutora Ana Luísa Cardoso
Juliana Simões
Beatriz Corte Real Martins
ÍNDICE
Introdução Actividades laboratoriais realizadas:
Plaqueamento de células Transfecção Western Blot Alamar Blue: Viabilidade Teste de Griess qRT-PCR: Extracção de RNA e Transcrição
Conclusão
INTRODUÇÃO
Durante estas duas semanas, realizámos experiências no âmbito do estudo da microglia. Este tipo de células, juntamente com os astrócitos e os neurónios, constituem os tipos celulares presentes no cérebro. A microglia é o conjunto celular responsável pela protecção do cérebro e desempenha funções de suporte, protecção e eliminação de possíveis ameaças.
Leg.1: Activação da Microglia
☺PLAQUEAMENTO DE CÉLULAS☺
Leg.2. Observação do hemocitómetro ao microscópio
Leg.3. Visualização de células ao microscópio
☺TRANSFECÇÃO ☺
* Objectivo: Introduzir um plasmídeo para expressar algo ( no nosso caso, proteína GFP)
* Procedimento:
1º Preparar os complexos de lipossomas+folatos+DNA
2º Distribuir os complexos pelos poços e aguardar 4 horas
3º Mudar o meio celular para o mesmo não se tornar tóxico
Leg.4: Introdução de lipossomas nas células
Leg.5: Troca de meio às células
☺ ALAMAR BLUE ☺
* Objectivo: Determinar a viabilidade celular e averiguar se a transfecção foi tóxica para as células.
* Procedimento: 1º: Preparar a mistura de resazurina com o meio das células
2º: Pôr um 1ml de meio nas células
3º: Ir avaliando a mudança de cor do meio
4º: Retirar uma amostra e ler a absorvância
5º: Calcular a percentagem de viabilidade em função do controlo
Leg.6:Mudança de cor do meio celular
☺ TESTE DE GRIESS☺
* Objectivo: Determinar a produção de óxido nítrico e nitratos pelas células
* Procedimento: 1º Tirar uma amostra de meio após o estímulo com LPS
2º Adicionar sulfanamide e posteriormente NED
3º Ler a absorvância do meio
4º Comparar a absorvância com uma curva de calibração
5ª Determinar a concentração de nitritos na amostra
Leg.7: Obtenção de resultados do Teste de Griess
☺ WESTERN BLOT ☺
* Objectivo: Determinar a presença e a quantidade de uma dada proteína em amostras de células ou tecido.
Leg.8: Proteínas a correr no gel
Leg.9: Western Blot
☺QRT-PCR ☺
* Objectivo: Quantificar o RNA mensageiro de um determinado gene.
* Procedimento: 1º Fazer a extracção do RNA a partir das células
2º Quantificar o RNA
3ºFazer a transcrição com o Transcriptazer Reverser
4º Quantificar o cDNA com uma sonda fluorescente
Leg.10: Termociclador
Leg.11: Procedimento do qRT-PCR
CONCLUSÃONo final deste estágio, compreendemos um pouco
mais acerca do objecto e método de estudo da bioquímica. Foi deveras aliciante e enriquecedor uma vez que, além de aprendermos mais e vivenciarmos uma experiência universitária também convivemos e estabelecemos relações com outras pessoas.
Leg. : Grupo “O papel dos miRNAs na activação da microglia