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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA
GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CAMILA RAYANE PEREIRA DA SILVA
ANÁLISES IN SILICO DA SEQUÊNCIA SEC14 DE CANA-DE-AÇÚCAR
PARA FLORAÇÃO
NATAL/RN
2016
CAMILA RAYANE PEREIRA DA SILVA
ANÁLISES IN SILICO DA SEQUÊNCIA SEC14 DE CANA-DE-AÇÚCAR
PARA FLORAÇÃO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à
Banca Examinadora da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte para obtenção do título de bacharel em
Ciências Biológicas, sob a orientação da Prof. Dra. Katia
Castanho Scortecci.
NATAL/RN
2016
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Banca Examinadora da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte para obtenção do título de bacharel em Ciências Biológicas.
AGRADECIMENTOS
A Capes, ao CNPq e UFRN pelo auxílio financeiro e todo suporte durante meus anos
de iniciação científica.
A minha preciosa família, sem o amor incondicional de vocês seria difícil conseguir
alcançar qualquer objetivo. Meu agradecimento eterno.
Aos meus amigos queridos que me incentivaram e dividiram aflições durante todo
curso, sem vocês o caminho teria sido bem mais árduo e menos prazeroso.
A todos do meu laboratório que me ajudaram direta ou indiretamente nesse trabalho.
Agradeço pelos bons momentos e os valiosos ensinamentos.
A minha orientadora Profª Dra. Katia Castanho Scortecci por todos os conhecimentos
passados, por toda paciência e companheirismo ao longo do percurso.
Agradeço a Deus acima de tudo, por ter me concedido forças para finalizar esse
trabalho, sem sua graça, eu nada seria.
“No mesmo instante em que recebemos pedras em nosso caminho, flores estão sendo
plantadas mais longe. Quem desiste não as vê. ”
William Shakespeare
RESUMO
A floração é considerada um processo chave, o meio pelo qual ocorre a reprodução das plantas.
Apesar de amplamente estudada em modelos vegetais, os mecanismos envolvendo a floração
em cana-de-açúcar ainda não são bem conhecidos. Em estudos anteriores, foi identificada por
homologia a sequência de DNA complementar (cDNA) da proteína SEC14, sendo essa um
potencial repressor do processo de floração. Tal proteína é conhecida por sua atuação no tráfego
de fosfatidilinositol e fosfatidilcolina, além de estar associada à formação de vesículas
secretoras. Visando compreender o papel dessa proteína no processo de floração em cana-de-
açúcar, a sequência da proteína SEC14 de cana-de-açúcar foi utilizada para realizar buscas por
sequências homólogas em outros organismos, bem como para a construção de interatomas.
Também houve a busca de potenciais sítios regulados por microRNAs (miRNAs) e fatores de
transcrição, obtenção do padrão de expressão da SEC14 em tecidos vegetais e outras análises
in silico. Os resultados obtidos mostraram identidades superiores a 85% da proteína SEC14 de
cana-de-açúcar com suas homólogas e uma separação de sequências entre as monocotiledôneas
e eudicotiledôneas nas análises filogenéticas. Os interatomas sugerem uma provável atuação
dessa sequência na biossíntese de fosfatidilcolina. Os dados das análises de miRNAs mostraram
que a sequência pode ter regulação por eles, desempenhando assim um papel regulatório em
gramíneas e participando na formação do meristema axilar e desenvolvimento foliar para A.
thaliana. As análises das regiões promotoras apresentaram uma regulação pelos fitormônios,
pelas proteínas PHYA e PHYB, desenvolvimento do gametófito feminino, parede celular,
órgãos florais e relação com o Ácido abscísico (ABA). Todas essas análises in silico e os
resultados de Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real (qPCR) reforçam
o potencial papel dessa sequência no processo de floração em plantas de cana-de-açúcar, sendo
assim um alvo para o melhoramento genético.
Palavras-chave: SECRETION14; Saccharum; Fosfatidilcolina; Bibliotecas subtrativas;
Ferramentas de bioinformática.
ABSTRACT
Flowering is considered a key process for plant reproduction and the seed production (the next
generation). Although this process is well known in plants, it is not in sugarcane. In previous
studies, it was identified a cDNA sequence with homology to SEC14 hence, being a potential
repressor for the flowering process in sugarcane. This protein is known for acting in the traffic
of phosphatidylcholine and phosphatidylinositol, and it is also associated with the secretory
vesicles formation. Then, the aim of the present study was to understand the role of SEC14
sequence in sugarcane flowering. SEC14 protein sequence from sugarcane was used to search
for homologous sequences in other plant organisms, as well as for making an interactome. It
was also made a search for transcription factors and possible microRNAs (miRNAs) regulatory
sites. Furthermore, it was analyzed the expression pattern from SEC14 in plant tissues and other
in silico analysis. The results obtained showed the proteins obtained had more than 85% of
identity between SEC14 from sugarcane and their homologous. Likewise it was observed in
phylogenetic analyses a separation from sequences among the Monocots and Eudicots. The
interactomes suggest a probable role of that sequence in the biosynthesis and transport of
phosphatidylcholine and phosphatidylinositol. The miRNA data has shown that the SEC14
sequence may have regulation by them, which may be playing a regulatory role in grass and it
may be participating in axillary meristem formation as well as in leaf development for A.
thaliana model. The analysis of promoter regions showed a possible regulation by
phytohormones PHYA and PHYB, development of female gametophyte, cell wall, floral organs
and relationship with Abscisic acid (ABA). All these in silico analysis presented here and the
Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) results from a previous work
reinforce the potential role of SEC14 on sugarcane flowering process, therefore, being a target
for genetic improvement.
Key words: SECRETION14; Saccharum; Phosphatidylcholine; Subtractive libraries;
Bioinformatics Tools.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 8
1.1 CANA-DE-AÇÚCAR 8
1.2 FLORAÇÃO 10
1.3 BIBLIOTECA SUBTRATIVA 16
1.3.1 SEC14 16
2 OBJETIVO GERAL 17
2.1 OBETIVOS ESPECÍFICOS 17
3 METODOLOGIA 18
3.1 BUSCA DA SEQUÊNCIA NOS BANCOS DE DADOS 18
3.2 CONSTRUÇÃO DE INTERATOMAS 18
3.3 ALINHAMENTO E ÁRVORE FILOGENÉTICA 19
3.4 ANÁLISE DE miRNAs E PADRÃO DE EXPRESSÃO 19
3.5 CONSTRUÇÃO DOS PRIMERS, PCR E CLONAGEM 20
3.6 LIGAÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS ELETROCOMPETENTES
(DH5α) 20
3.7 EXTRAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL EM PEQUENA ESCALA
(MINIPREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS) 21
3.8 DIGESTÃO DE RESTRIÇÃO 22
4 RESULTADOS 22
4.1 ANÁLISES DAS SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS A SEC14 22
4.2 RELAÇÕES FILOGENÉTICAS 24
4.3 INTERATOMAS 25
4.4 FATORES DE TRANSCRIÇÃO, miRNAs E PADRÃO DE EXPRESSÃO 27
4.5 PCR, PRIMERS E PLASMÍDEO 31
5 DISCUSSÃO 32
6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS 36
7 REFERÊNCIAS 38
8
1 INTRODUÇÃO
1.1 CANA-DE-AÇÚCAR
O Brasil atualmente é o maior produtor de cana-de-açúcar do mundo. Produzindo mais
de 632 milhões de toneladas por ano (safra 2014/2015), dessa forma, liderando o ranking de
maior produtor de açúcar do planeta, cerca de 20% da produção global e 40% da exportação
mundial, de acordo com a União da Indústria de Cana-de-açúcar (UNICA, 2016). A produção
brasileira consegue superar em quase o dobro a Índia, que é o segundo maior produtor, com
352 milhões de toneladas por metro (STATISTA, 2016). A cana-de-açúcar é de extrema
importância para o país, por ser um dos principais constituintes de fonte de renda no Brasil
desde o período colonial, onde a produção do açúcar gerou riquezas para manter a colônia e
contribuiu para o desenvolvimento industrial (MACHADO, 2003). Primeiramente, os engenhos
eram centralizados na Região Nordeste do país. Posteriormente, foram distribuídos pelo
restante do território brasileiro, a partir de então, a produção do açúcar se estabeleceu por todo
o país possibilitando essa nova fase industrial não só para a importação, mas também, para a
exportação. Dessa forma, angariando valores e prestígio a nível global. O impacto gerado pela
produção de cana-de-açúcar moldou a sociedade brasileira desde o período Colonial, segundo,
Mario Lacerda de Melo:
“Dificilmente se encontrarão formas de utilização dos recursos dos
solos que se possam rivalizar com a agroindústria canavieira quanto a
capacidade de condicionar um tipo de sociedade e economia, de modelar um
tipo de paisagem e de estruturar um tipo de arranjo econômico do espaço. No
Nordeste do Brasil temos uma demonstração disso. A agroindústria
canavieira, gerando a chamada civilização do açúcar, imprimiu características
peculiares às áreas onde se implantou. E o fez de um modo definitivo ou pelo
menos, de um modo dificilmente reversível. ” (MELO, 1975. p. 19).
Do ponto de vista histórico, a cana-de-açúcar foi introduzida incialmente no estado de
Pernambuco e se espalhou por todo litoral brasileiro de forma tão eficiente que levou o país a
liderar a produção mundial de açúcar em menos de 20 anos após o estabelecimento do comércio
açucareiro. Para a economia, durante os séculos XVI e XVII, o açúcar foi essencial para mover
a colônia. A exportação do produto, bem como, a construção de meios para transportá-lo dentro
9
do território nacional, permitiu a expansão do comércio e maiores possibilidades para
introdução de novas tecnologias de cultivo. Até os dias atuais, apesar do desenvolvimento
maciço em diversas fontes de renda, a cana-de-açúcar ainda é uma matriz energética
significativa para o comércio brasileiro, contando com relevantes pesquisas biotecnológicas
para potencializar a produção e minimizar prejuízos (VIEIRA et al., 2007). De acordo com o
Centro de Tecnologia Canavieira - CTC, até 2018, as pesquisas para melhoramento da cana-
de-açúcar devem fornecer novos cultivares mais resistentes às pragas, tolerantes a estresses
abióticos como o hídrico e o salino, bem como, novos cultivares contendo maiores teores de
açúcar. Apesar dessas perspectivas, o processo para melhoramento dos cultivares vem
evoluindo um pouco mais lentamente.
Figura 1 - Mapa da distribuição da produção de cana-de-açúcar no Brasil em 2011. Destacando em tons de verde
escuro os estados brasileiros que apresentam maior produção de cana-de-açúcar em milhares de reais. Ficando
claro os destaques para os polos Sudeste-Centro Sul e Nordeste. Fonte: IEA SP <http://ciagri.iea.sp.gov.br/>.
O cultivo de cana-de-açúcar tem destaque em dois locais no país, a Região Sudeste-
Centro Sul e Norte-Nordeste, como apresentado na Figura 1. Notoriamente a Região Sudeste-
Centro Sul apresenta maior produtividade devido as condições climáticas e solo serem mais
favoráveis ao desenvolvimento do vegetal, contudo a Região Nordeste já se estabeleceu como
polo produtor e contribui de forma efetiva na produção nacional. Tendo em vista que o Brasil
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apresenta condições climáticas bem distintas entre suas regiões, se faz necessário o
melhoramento de cultivares para que se adequem e produzam (em quantidade de plantas e
açúcar) o máximo possível onde estão locadas.
A cana-de-açúcar transfundiu nessas regiões de forma efetiva, ainda que as mesmas não
apresentem temperatura ou disponibilidade de água em condições adequadas para a produção.
No polo Sudeste-Centro Sul, os agricultores passaram a utilizar cultivares resistentes às
condições acima citadas, como uma alternativa para maximizar o seu cultivo. Fazendo
investimentos expressivos em pesquisa para o desenvolvimento de novas cultivares melhor
adaptadas àquelas condições (WACLAWOVSKY et al., 2010; SCORTECCI et al., 2012).
Atualmente, a Região Nordeste apresenta a produção em menor proporção do que a Região
Sudeste devido, principalmente, as condições de solo, fotoperíodos de doze horas, chuvas
escassas e cultivares pouco adaptados a essas condições. Os fatores edafoclimáticos agem como
estressores atuando como elementos determinantes sob o tempo de vida do vegetal. Tal
interferência afeta negativamente o desenvolvimento e florescimento da planta remodelando as
respostas metabólicas. Dessa forma, as plantas em resposta ao estresse abiótico, ativam os seus
mecanismos de indução para o florescimento precoce, como medida de sobrevivência às
intempéries. Assim, como efeito do florescimento, ocorre a isoporização, processo
caracterizado pelo deslocamento da sacarose do colmo para o ápice da planta em detrimento da
formação dos órgãos florais (ARALDI et al., 2010; VIEIRA et al., 2007), esse processo reduz
drasticamente o conteúdo de açúcar armazenado no colmo (principal parte usada para retirar o
açúcar), promovendo o secamento interno do colmo.
Nesse contexto, considerando a importância por melhores índices de produtividade,
investindo em novos cultivares mais resistentes aos fatores edafoclimáticos característicos da
Região Nordeste, propomos uma alternativa biotecnológica com base em banco de dados
genômicos que corroborem para maior conhecimento de interação gênica, a fim de obter como
produto final plantas com maior potencial produtivo.
1.2 FLORAÇÃO
A cana-de-açúcar pertencente à família das Poaceae e do gênero Saccharum. A
complexidade em seu genoma surgiu através de várias recombinações gênicas entre as seis
espécies incluídas tradicionalmente ao gênero Saccharum: S. officinarum (x= 10, 2n= 80), S.
11
spontaneum (x= 8, 2n= 40-128), S. robustum (x= 10, 2n= 60, 80), S. edule (2n= 60-80), S.
barberi (2n= 111-120) e S. sinense (2n= 81-124) (TEW et al., 2008), as duas primeiras seriam
as representantes principais do gênero (IRVINE, 1999). As espécies atualmente cultivadas são
híbridas derivadas essencialmente da S. officinarum e S. spontaneum (DILLON et al., 2007;
D'HONT et al., 1996), sendo que essas provavelmente correspondem a cerca de 70%
proveniente da primeira, 20% da segunda e 10% de recombinações (D'HONT et al., 1996),
conferindo, respectivamente, alto teor de sacarose e resistência à estresses abióticos e bióticos
(GRIVET et al., 2001). O resultado desses cruzamentos foi a obtenção de plantas que
demonstram um alto nível de ploidia (cromossomos repetidos) e de variantes de genes elevados.
Essa poliploidia da planta em questão, assim como de outras, é resultado da evolução e
domesticação ao longo de milhares de anos em busca de maior produtividade e adaptações a
diferentes condições de plantio. Em contrapartida, a ploidia dificulta a análise genética que
corroboram para construir mapas genéticos moleculares que possibilitem a localização exata do
gene de interesse nos cromossomos. Em razão desse obstáculo, não é possível compreender de
maneira plena o funcionamento das variantes dos genes presentes nessa espécie
(WACLAWOVSKY et al., 2010; SETTA et al., 2014).
Um dos importantes desafios para realizar o melhoramento genético em cana-de-açúcar,
por exemplo, é identificar as variantes do gene responsável pela floração, no qual, designa uma
característica de interesse agrícola. Nesse seguimento, a floração é um processo essencial nas
angiospermas, por meio do qual ocorre a propagação das espécies. Esse evento é controlado
por diversos sinais que induzem a modificação de meristemas apicais vegetativos em órgãos
reprodutivos (MEDEIROS et al., 2016). A transição para floração caracteriza-se por ser um
processo crítico, uma vez que, a percepção do ambiente e de fatores endógenos, ou seja, a
percepção do estímulo, atrelado a transdução do sinal, indicará à planta o momento mais
propício para florar (resposta fisiológica) e obter o sucesso reprodutivo (WILS et al., 2016;
ARALDI et al., 2010).
A floração no modelo vegetal Arabidopsis thaliana (planta dicotiledônea) é bastante
estudada e com diversos genes bem caracterizados que estão envolvidos em alguma das vias de
florescimento (Figura 2). Geralmente alguns deles atuam em vários tecidos durante a indução
floral (LIU et al., 2009). As seis vias melhor caracterizadas para o processo de floração são: a
do fotoperíodo e vernalização, controlando o florescimento em resposta à mudanças estacionais
de duração do dia e temperatura, respectivamente; a via referente a temperatura ambiental, ou
seja, o aumento de temperatura média diária; a via influenciada pela idade da planta que levará
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em conta regulações internas por fatores de transcrição e outros reguladores; a via da giberelina,
um conhecido hormônio regulador do crescimento que promove a floração no modelo
Arabidopsis e, a via de respostas dos meristemas, que durante o processo de indução floral se
transformam de vegetativos para meristemas de inflorescência para formar as flores (SONG et
al., 2013; FORNARA, 2010; JAEGER et al., 2006; HENDERSON & DEAN, 2004).
Na Figura 2 abaixo, notam-se os genes denominados como FMI que correspondem aos
genes para a identidade do meristema floral. Os genes LFY (LEAFY, gene de identificação do
meristema floral), SOC1 (Supressor da superexpressão do CONSTANS 1, promove floração),
FT e FD (interagem para induzir a floração), FLC (FLOWERING LOCUS C, atua como
repressor da floração) e GA (Giberelina, regulador do crescimento que promove floração)
(FORNARA, 2010).
Regulação gênica nas vias da floração em Arabidopsis
As plantas podem ser divididas de acordo com o fotoperíodo em três condições: plantas
de dia longo (fotoperíodos superiores a 12 horas), de dia curto (fotoperíodos inferiores a 12
Figura 2 - Genes presentes na via de floração no modelo vegetal A. thaliana. Interações positivas são
representadas por flechas e interações negativas são representadas por linhas com finalização em T. Nesta figura
são apresentados alguns dos genes que compõe as vias de giberelinas, via autônoma, via de vernalização, via do
fotoperíodo, via de integração e os genes que compõe a identidade meristemática. Esquema adaptado de Komeda
(2004).
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horas) ou de dia neutro (quando não são influenciadas pelo fotoperíodo) (SONG et al., 2015).
O arroz (planta modelo de monocotiledônea) por exemplo, é considerado uma planta de dia
curto, ou seja, precisa de noites longas acima do fotoperíodo crítico para florescer. Entretanto,
já existem cultivares de arroz selecionados artificialmente que obtiveram sucesso no processo
de floração em condições de dias longos (SHRESTHA, 2014). Por ser uma planta modelo para
pesquisas na área de genética em monocotiledôneas, diversos genes que atuam controlando o
processo de florescimento foram identificados, por exemplo, o HEADING DATE 1 (Hd1) regula
positivamente o gene HEADING DATE 3a (Hd3a), gene esse ortólogo ao gene FT de
Arabidopsis thaliana que é o principal ativador floral em dia curto (HOMIYA et al., 2008). Em
síntese, os genes Hd3 e Hd3a exerceriam em arroz (dia curto) o que os genes CO e FT exercem
na planta modelo Arabidopsis thaliana (dia longo) (DU et al., 2016).
Embora haja uma série de diferenças entre as plantas monocotiledôneas e
eudicotiledôneas, não podemos deixar de ressaltar que existe uma alta conservação em seus
genomas, por exemplo, como verificado num trabalho de análise comparativa entre os genomas
de cana-de-açúcar, arroz e Arabidopsis thaliana (VETTORE et al., 2003). Na Figura 3 podemos
observar que as estruturas florais entre esses grupos apresentam certa similaridade quanto à
formação de pétala, estames e carpelo (GREYSON, 1994).
Órgãos florais de monocotiledôneas e eudicotiledônea
O florescimento é um processo minuciosamente regulado nas plantas. Entretanto, em
plantas de cana-de-açúcar esse processo pode ser negativo para a produção de álcool e açúcar.
Como especificado anteriormente, há o deslocamento do açúcar para o ápice (isoporização),
suprindo os gastos energéticos provenientes da formação das estruturas reprodutivas (ARALDI
Figura 3 - (a) Flor característica de monocotiledônea e (b) flor característica de eudicotiledônea.
Similaridades morfológicas na estruturação dos órgãos florais (Figura adaptada de Furtado, 2007).
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et al., 2010). Desta maneira, a floração em cana-de-açúcar é controlada por uma variedade de
aspectos endógenos e exógenos, dentre eles destacam-se, o fotoperíodo, a temperatura, a
umidade e a incidência solar como controladores desse evento vegetal (CASTRO, 2001), além
de hormônios e complexas sinalizações envolvendo florígeno e fatores transcricionais (Figura
4a). O desenvolvimento floral inicia com o meristema vegetativo maduro que origina as novas
folhas, nós e brotos (Figura 4b). Esse processo segue para o início da formação da inflorescência
com o meristema apical crescendo em largura e altura. Durante o desenvolvimento desse
meristema ocorrem duas transições essenciais, sendo a primeira delas a conversão do meristema
vegetativo para meristema de inflorescência e a segunda, a diferenciação celular para formação
dos órgãos florais das flores que constituem a inflorescência. Assim, os primeiros ramos
começam a aparecer, depois os ramos secundários, sendo uma característica da inflorescência
de cana-de-açúcar os ramos secundários múltiplos partindo da base de ramos primários (Figura
4c-d). Aparecem os primórdios da espícula e ocorre a transição desse meristema para o floral.
Inicia-se o desenvolvimento dos órgãos florais (Figura 4e-f) (JULIEN, 1971; MOORE, 1971;
MCSTEEN et al., 2000; GLASSOP, 2014).
O estudo de genes que podem estar envolvidos nas diversas etapas desse complexo
processo de floração vem trazendo significativas informações acerca do desenvolvimento do
meristema e dos órgãos florais nos diferentes modelos vegetais (WILS et al., 2016; IRISH,
2010). Os estudos moleculares na genética de plantas vieram para explorar todo potencial que
um cultivar pode oferecer. A identificação de genes que controlam respostas fisiológicas às
condições adversas do ambiente é essencial, especialmente quando estão envolvidos em
processos tão vitais para as espécies como é o caso da floração. Como explicitado
anteriormente, pouco se compreende molecularmente sobre o processo de florescimento em
cana-de-açúcar, ademais, os processos de florescimento precoce e isoporização apresentam
impactos negativos para a indústria sucroalcooleira (ARALDI et al., 2010). Tendo isso em vista,
a identificação e caracterização de genes que podem atuar como reguladores no processo de
floração são de grande importância biotecnológica e agronômica, sendo genes alvos potenciais
para construção de marcadores a serem utilizados no melhoramento gênico.
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Desenvolvimento dos órgãos florais em cana-de-açúcar
Figura 4 - Estágios do desenvolvimento floral em cana-de-açúcar e os respectivos genes envolvidos em cada etapa;
(a) Meristema vegetativo maduro; (b) Meristema em transição para inflorescência; (c) Ramos meristemáticos
primários; (d) Formação de ramos secundários; (e) Meristema da espícula; (f) Inflorescência madura (Glassop,
2014).
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1.3 BIBLIOTECA SUBTRATIVA
No intuito de identificar genes que possam estar relacionados ao processo de
florescimento, foram construídas anteriormente no Laboratório de Transformação de Plantas e
Análises em Microscopia quatro bibliotecas subtrativas com cDNAs provenientes de cultivares
de cana-de-açúcar contrastantes para este processo. Dentre os cDNAs identificados nessas
bibliotecas subtrativas, encontra-se um cDNA que apresentou homologia a sequência
SECRETION 14 ou PHOSPHATIDYLINOSITOL-PHOSPHATIDYLCHOLINE TRANSFER
PROTEIN (SEC14) (FURTADO, 2007; MEDEIROS et al., 2016).
1.3.1 SEC14
A proteína SEC14 é uma proteína eucariótica que inicialmente foi identificada em
Saccharomyces cerevisiae (NOVICK et al., 1980; AITKEN et al., 1990; BANKAITIS et al.,
1990) e atua, principalmente, no tráfego entre membranas, na formação de vesículas secretoras
e no transporte de lipídeos (BANKAITIS et al., 1989). Essa proteína e suas homólogas parecem
estar associadas a diversas atividades, como por exemplo, na resposta ao estresse osmótico em
O. sativa (DOVE et al., 1997), no aumento da estabilidade de membrana, na tolerância ao
estresse de nitrogênio em plantas de sorgo (GELLI et al., 2014) e na sua alta expressividade no
período de desenvolvimento da flor em A. thaliana (PETERMAN et al., 2004).
As proteínas transportadoras de fosfatidilinositol e fosfatidilcolina, conhecidas como
proteínas PITPs, exercem o papel de transferir esses monômeros através da bicamada da
membrana. Além disso, as moléculas de fosfatidilinositol apresentam funções intrínsecas
relacionadas com sinalização, bem como, podem atuar como potenciais precursores de
mensageiros secundários (TRIPATHI et al., 2014). A proteína SEC14, por sua vez, é proposta
como sendo uma das mais importantes proteínas PITP em levedura e tem sua função mediada
pela ligação com lipídeos secundários, por exemplo a fosfatidilcolina (SCHAAF et al., 2007).
Proteínas SEC14-like têm sido associadas com o processo de floração. UPADHYAYA
et al. (2015) propõem que o gene SEC14-like 3 atue como um dos 8 potenciais genes candidatos
para a regulação do florescimento, junto os genes clássicos FLOWERING LOCUS D (FLD) e
GIGANTEA (GI). A fosfatidilcolina (1-palmitoil-2-oleil fosfatidilcolina) está relacionada com
a proteína SEC14, uma vez que essa proteína faz o transporte desse fosfolipídio, também
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interage in vitro ligando-se à proteína FT (ou florígeno, como é conhecido). Sendo assim, foi
observado que quando se reduz os níveis de fosfatidilcolina o processo de floração atrasa,
inferindo-se que os níveis desse fosfolipídio podem ser correlacionados com a regulação do
tempo de florescimento (NAKAMURA et al., 2014). É importante ressaltar que os dados
obtidos pelo nosso grupo de pesquisa mostraram altos níveis de expressão desta sequência nos
meristemas apicais de cana-de-açúcar no cultivar com florescimento tardio sugerindo assim
uma potencial função de inibidor à floração (MEDEIROS et al., 2016).
Desta forma, a caracterização de genes que são fortes candidatos a participarem da
floração, seja inibindo ou ativando, vão permitir que possamos encontrar mecanismos que
contornem processos como o de isoporização, ou retarde o processo de floração em condições
de campo de cultivo para produção, permitindo assim obter novas cultivares (por melhoramento
clássico ou transgenia) mais rentáveis para a indústria, minimizando assim as perdas na
produção. Tendo em vista que a sequência de cDNA SEC14 estava expressa nas bibliotecas de
florescimento tardio (MEDEIROS et al., 2016), esta sequência foi escolhida como alvo para
futuras pesquisas. Assim, esse estudo visou inicialmente reunir um embasamento in silico para
futuros trabalhos in vivo com esta sequência que apresenta grande potencial biotecnológico.
2 OBJETIVO GERAL
Entender o papel da proteína SEC 14 em cana-de-açúcar.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Analisar in silico a interação proteína-proteína da SEC14 em bancos de dados de plantas
modelo;
Analisar in silico perfil de expressão, possíveis reguladores e promotores para SEC14;
Construir in silico relações filogenéticas para SEC14 em cana-de-açúcar e em outros
organismos;
Amplificação da sequência de SEC14 para clonagem em plasmídeo.
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3 METODOLOGIA
3.1 BUSCA DA SEQUÊNCIA NOS BANCOS DE DADOS
As análises in silico foram realizadas com sequências que apresentaram valores de
identidade maiores que 85% com a sequência SEC14 de cana-de-açúcar, estas correspondem
aos organismos seguintes, Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea Mays, Sorghum bicolor e
Brachypodium distachyon, tendo sido obtidas através do banco de dados The National Center
for Biotechnology Information (NCBI: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) por meio da ferramenta
Blastx (ALTSCHUL et al., 1997).
Os domínios funcionais foram vistos utilizando a ferramenta para domínio conservado
do NCBI (CDD), também se utilizou o ExPASy Translate Tool (http://www.expasy.org/) para
obter sequência proteica, além do ORF Finder do NCBI para busca de Open Reading Frame
(ORF). Outros bancos de dados foram utilizados na busca de sequências, como o TAIR
(https://www.arabidopsis.org/), Phytozome (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html) e
PDB (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do). Com o intuito de verificar a provável
localização subcelular da proteína, submetemos a maior OFR da sequência SEC14 ao WoLF
PSORT Server (http://www.genscript.com/tools/wolf-psort) (HORTON et al., 2007).
3.2 CONSTRUÇÃO DE INTERATOMAS
Para visualizar as interações entre a SEC14 e outras proteínas, bem como, sua co-
expressão, conservação entre grupos diversos e domínios proteicos compartilhados, utilizou-se
os bancos de dados STRING 10 (http://string-db.org/) (FRANCESCHINI et al., 2013) e
GeneMANIA (http://www.genemania.org/) (WARDE-FARLEY et al., 2010; MONTOJO et
al., 2014). Analisou-se as proteínas que interagem com a SEC14 de modo a observar as
possíveis funções, bem como, vias bioquímicas as quais a sequência estudada estaria atuando,
para desse modo poder inferir a ação da proteína SEC14 in vivo.
O banco de dados STRING10 foi utilizado para buscar a sequência de aminoácidos
contendo a maior ORF da sequência SEC14 selecionando do organismo A. thaliana como
modelo. Assim a sequência foi escolhida pelo melhor bitscore e e-value sugerido pelo site,
usando confiança média (0.400) e alta (0.700) no score de interação. No banco de dados do
GeneMANIA, a busca foi feita também no modelo A. thaliana, buscando pelo ID do gene. A
19
ponderação da rede foi selecionada automaticamente e a rede foi estabelecida com os
parâmetros de Interações físicas, Predições, Co-Expressão, Interações genéticas, Domínios
proteicos compartilhados, Co-localização e Função (transporte de lipídeos).
3.3 ALINHAMENTO E ÁRVORE FILOGENÉTICA
A partir das sequências dos organismos com maior identidade obtidas no banco de dados
Phytozome utilizando o Blastp, fez-se o alinhamento utilizando o algoritmo Clustal W
disponível no Software MEGA 7.0 (KUMAR et al., 2016). Os dados foram salvos em formato
“.meg” para gerar a árvore filogenética seguindo, os seguintes parâmetros sugeridos pelo
programa: história evolutiva inferida usando o método de Neighbor-Joining (SAITOU & NEI,
1987) no modelo JTT, com distribuição Gamma (YANG, 1994) e bootstrap (FELSENSTEIN,
1985) com 1000 replicatas. Foram analisadas 9 sequências de aminoácidos. As posições foram
delimitadas pelo cutoff de 95%, ou seja, menos de 5% dos gaps de alinhamento, dados ambíguos
ou perdidos, foram inclusos. Tendo sido os dados tratados com Pairwise deletion e bootstrap
maior que 70%.
3.4 ANÁLISE DE miRNAs E PADRÃO DE EXPRESSÃO
Através do banco de dados PlantPAN (http://plantpan.mbc.nctu.edu.tw/) pode-se
analisar a região promotora da sequência nucleotídica que foi introduzida em formato “.fasta”,
selecionando o organismo Arabidopsis thaliana, milho e arroz para análise dos miRNA. Assim,
possibilitando a observação de sítios alvos para miRNAs e quais seus possíveis mecanismos
regulatórios.
O padrão de expressão foi outro aspecto analisado, para isso, utilizou-se o The Bio-
Analytic Resource for Plant Biology (BAR: http://bar.utoronto.ca/) (AUSTIN et al., 2016) com
sequências homólogas a SEC14 para A. thaliana e O. sativa. Para observar a expressividade, as
ferramentas Arabidopsis Interactions Viewer e Rice Interactions Viewer foram usadas, com a
opção e-FP (eletronic flourescent pictographic) (WINTER et al., 2007) para obter a
representatividade a expressão espaço-temporal.
20
3.5 CONSTRUÇÃO DOS PRIMERS, PCR E CLONAGEM
O fluxograma abaixo (Figura 5) descreve de forma resumida o processo de construção
dos primers, PCR e clonagem. Vale salientar que o vetor escolhido foi o pGEM T- Easy da
PROMEGA por ser o mais conveniente para clonagem de produtos de PCR.
Fluxograma das etapas de construção dos primers, PCR e clonagem
Figura 5 - Etapas do processo de desenho de primers, PCR e clonagem de DNA plasmidial. Fonte: Autoria própria.
3.6 LIGAÇÃO E TRANSFORMAÇÃO DE CÉLULAS
ELETROCOMPETENTES (DH5α)
A clonagem das construções foi feita utilizando 50 ng de DNA plasmidial, 7 pmol de
cada primer e 2,5 U de taq DNA polimerase (Invitrogen). Esse material foi amplificado
utilizando o termociclador de PCR (Eppendorf - Mastercycler Personal) com o ciclo um a 94ºC
por 2 minutos, ciclo dois a 94ºC por 45 segundos, ciclo 3 a 55ºC por 45 segundos, ciclo quatro
21
a 72ºC por 5 minutos, repetição dos ciclos 2 ao 4 por 35 vezes, seguido pelo ciclo 5 a 72ºC por
10 minutos e ciclo seis a 4ºC até término do processo. Em seguida esse material foi verificado
em gel de agarose 1 %. Com este material foi realizado a etapa de ligação do DNA amplificado
ao vetor pGEM-T easy (Promega). Para isto, foi adicionando 12,5 ng/μL do plasmídeo, 50 ng
das amostras de PCR (1 vetor : 4 partes inserto), 1X de tampão 10X T4 DNA ligase e 400
unidades/μL da enzima T4 DNA ligase (Fermentas) no volume final de 20 μL. Após adição,
incubou-se o preparado a 16 °C durante 12 horas.
Passado o tempo de duração da ligação, o produto foi utilizado para transformação em
bactérias competentes DH5α (Invitrogen Cat. No. 18265-017) através de choque térmico
conforme protocolo indicado pelo fabricante. Incubou-se as células transformadas a 37 ºC e 180
rpm por 1 hora em incubadora shaker (Tecnal – TE 421). Em seguida, as células foram
plaqueadas em placas de Petri de 15 cm de diâmetro, contendo meio Luria-Bertani (LB) sólido
acrescido do antibiótico específico de seleção 100 μg/mL de ampicilina e 40 μL de solução de
X-gal (40 μg/mL). As placas foram incubadas em estufa para cultura bacteriológica a 37 °C
durante 16 horas e, posteriormente, mantidas a 4 ºC até a extração de DNA plasmidial.
3.7 EXTRAÇÃO DO DNA PLASMIDIAL EM PEQUENA ESCALA
(MINIPREPARAÇÃO DE PLASMÍDEOS)
Para se extrair o DNA plasmidial utilizou-se o protocolo convencional de lise alcalina
(SAMBROOK e RUSSEL, 2001) e análise dos potenciais clones positivos. Três soluções foram
usadas nesse protocolo: a solução I é composta por hidroximetilaminometano-ácido clorídrico
(Tris-HCl) 50 mM em pH 8,0, EDTA 10mM em pH 8,0 e RNAse 10 µg/mL; a solução II é
composta por hidróxido de sódio (NaOH) 200 mM e SDS 1%; a solução III é composta por
acetato de potássio (CH3CO2K) 5 M em pH 5,5. Os seguintes procedimentos foram realizados:
uma colônia de bactérias foi inoculada em tubo falcon de 15 mL contendo 5 mL de meio LB
líquido com antibiótico correspondente e incubada por 16 horas sob agitação a 37 ºC em
incubadora (Tecnal – TE 421). O conteúdo foi transferido para microtubos de 1,5 mL e
centrifugados (centrífuga MIKRO 220/220R Hettich) a 14.000 rpm por 5 minutos em
temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado e essa etapa foi repetida até que todo o
volume do inóculo fosse centrifugado. As células que se sedimentaram no tubo (pellet) foram
ressuspendidas em 300 µL da solução I em agitador tipo vortex (AP59 - Phoenix Luferco). Em
seguida foi adicionado 300 µL da solução II e os tubos foram incubados por 5 minutos em
22
temperatura ambiente. Após isso, foi adicionado 300 µL da solução III, feita agitação manual
por inversão e mantido no gelo por 5 minutos, em seguida os tubos foram centrifugados
(centrífuga MIKRO 220/220R Hettich) por 15 minutos, 14.000 rpm a 4 ºC. O sobrenadante foi
transferido para outro microtubo, foi adicionado 400 µL de isopropanol, passados 5 minutos e
centrifugado durante 10 minutos, 14.000 rpm a temperatura ambiente (centrífuga MIKRO
220/220R Hettich). O precipitado foi lavado com 300 µL de etanol 70% por 5 minutos,
centrifugou-se (centrífuga MIKRO 220/220R Hettich) por 5 min em 14.000 rpm a temperatura
ambiente, em seguida colocado para secar a temperatura ambiente e, após seco, foi
ressuspendido em 50 µL de água destilada estéril.
3.8 DIGESTÃO DE RESTRIÇÃO
Com o intuito de confirmar se houve a ligação correta do inserto no plasmídeo, foi
realizado uma reação de PCR com os potenciais plasmídeos contendo o inserto. Para isso, foi
utilizado aproximadamente 100-300 ng de DNA plasmidial, 7 pmol de cada primer e 2,5 U de
taq DNA polimerase (Invitrogen). Esse material foi amplificado utilizando o termociclador de
PCR (Eppendorf - Mastercycler Personal) com o ciclo um a 94ºC por 2 minutos, ciclo dois a
94ºC por 45 segundos, ciclo 3 a 55ºC por 45 segundos, ciclo quatro a 72ºC por 5 minutos,
repetição dos ciclos 2 ao 4 por 35 vezes, seguido pelo ciclo 5 a 72ºC por 10 minutos e ciclo seis
a 4ºC até término do processo. O produto da PCR foi separado em gel de agarose 0,7%.
4 RESULTADOS
4.1 ANÁLISES DAS SEQUÊNCIAS HOMÓLOGAS A SEC14
A sequência de SEC14 de cana-de-açúcar utilizada como alvo deste trabalho foi
encontrada em um trabalho anterior em nosso grupo de pesquisa de prospecção de sequências
associadas ao processo de floração utilizando bibliotecas subtrativas de ápices meristemáticos
(FURTADO, 2007; MEDEIROS et al., 2016). Foi observado nessas bibliotecas subtrativas que
a sequência SEC14 se encontrou representada 35 vezes nas bibliotecas associadas aos cultivares
com florescimento tardio, sugerindo assim um potencial papel como inibidor do processo de
florescimento em cana-de-açúcar (MEDEIROS et al., 2016).
A partir da sequência de cDNA SEC14 (740 nucleotídeos e maior ORF com 179
aminoácidos) buscamos sequências homólogas que apresentavam alta identidade entre os
23
organismos A. thaliana, O. sativa, Z. mays, S. bicolor e B. distachyon. As sequências homólogas
utilizadas nesse trabalho apresentaram identidade em média superior a 85% (melhor visualizado
na Tabela 1) e grandes domínios conservados.
Tabela 1 – Valores de identidade, cobertura e tamanho da sequência de aminoácidos
(aa) de cada organismo
Organismo Gene ID Identidade Tamanho da
sequência
Cobertura da
sequência
S. bicolor KXG35232.1 98% 317 aa 53%
Z. mays NP_001136689.1 97% 336 aa 57%
B. distachyon XP_003576972.1 87% 333 aa 57%
O. sativa XP_015612037.1 86% 335 aa 55%
A. thaliana NP_001077724.1 79% 298 aa 59%
A partir dessa identidade, buscamos ver se a potencial proteína SEC14 de cana-de-açúcar
poderia ter algum direcionamento para membrana de alguma organela celular. Para isso,
utilizamos o programa PSORT que permite inferir este direcionamento. Os dados obtidos
revelaram que a previsão de localização da proteína foram vesículas do sistema secretório. Esse
resultado corrobora com o esperado, visto que a proteína auxilia na formação de vesículas
secretoras e transporte de lipídeos através da membrana. Os resultados seguem explicitados na
Tabela 2. Salientando que apesar de não haver um direcionamento em particular para uma
organela em específico, os valores normalizados apontam maiores presenças no cloroplasto
e/ou citoplasma.
Tabela 2 – Possível direcionamento subcelular da proteína SEC14.
Direcionamento
Porcentagem (%)
Vesículas do sistema secretório 48
Membrana plasmática 36
Citoesqueleto 16
Valor normalizado de
ocorrência
Organelas
Cloroplasto 4
Citoplasma 4
Núcleo 2
Complexo de Golgi 2
Retículo Endoplasmático 1
24
4.2 RELAÇÕES FILOGENÉTICAS
Os dados obtidos mostram uma conservação dessas sequências, entretanto, em relação
a localização de expressão foi observado uma variação quando comparado ao modelo arroz e
Arabidopsis. Com isso, um dendograma foi gerado com o intuito de traçar essa possível relação
filogenética da proteína nos organismos que tiveram maior identidade com a sequência
homóloga a SEC14 de cana-de-açúcar, bem como, com organismos modelos de outros grupos
mais distantes para obter uma árvore mais completa. Segue abaixo a Figura 6 gerada pelo
MEGA 7 com a árvore gerada através do método de Neihbor-Joining como supracitado no item
3.3 da metodologia.
Figura 6 – Análise filogenética molecular das sequências SEC14 (destacada em rosa) e suas homólogas (Z. mays,
S. bicolor, H. vulgare, O. sativa, B. distachyon, C. sativus, A. thaliana e V. carteri) pelo método de Neighbor-
Joining, bootstrap de 1000 replicatas e 95% Cutoff. Análise conduzida pelo MEGA 7.
Pode-se perceber que na base da árvore, como grupo externo, se encontra o organismo
unicelular da família Viridiplantae, o Volvox. O outro subgrupo presente é o das angiospermas,
onde a sequência da proteína SEC14 de cana-de-açúcar foi agrupada com outros membros das
Poaceae, apresentaram maior identidade (milho e sorgo). O ramo das monocotiledôneas e
eudicotiledôneas se separam com valor de bootstrap 93, mostrando confiabilidade da presença
das sequências nesses organismos, além de valor 97 para milho e sorgo, que são as duas
25
sequências com mais alta identidade em relação a de cana-de-açúcar, com respectivamente, 97
e 98% (Tabela 1).
É pertinente observar, que na busca por sequências homólogas, em cana-de-açúcar foi
encontrada apenas uma sequência para cada planta analisada. Dessa maneira, como para o
modelo vegetal de A. thaliana o genoma foi sequenciado totalmente, buscou-se a possível
presença de variantes do RNAm por meio de splicing alternativo. Para isso foi utilizado a
sequência AT1G55840.2 homóloga a de SEC14 do banco de dados Tair
(http://www.arabidopsis.org/). Verificou-se a ocorrência de splicing alternativo, devido à
ausência de éxons no início do gene em um dos RNAm produzidos. Desse modo, nesse modelo
vegetal foi encontrado apenas um gene de SEC14 com duas variantes de RNAm.
4.3 INTERATOMAS
Tendo os dados bibliográficos mostrado uma possível atuação dessa proteína em S.
cerevisiae acerca de vários processos metabólicos supracitados, foi importante tentar
compreender os eventuais parceiros dessa proteína em plantas. Será que essa sequência poderia
interagir com proteínas associadas diretamente com genes relativos as vias de florescimento?
Desse modo, com o intuito de traçar alguma relação entre a proteína em estudo e outras
que tivessem alguma participação na floração, direta ou indiretamente, foram feitas as análises
dos interatomas pelas ferramentas STRING 10 e GeneMANIA mostrando uma rede de
interações entre a proteína SEC14 de A. thaliana e algumas formas da proteína Fosfolipase D
(PLD). Evidencia-se que os bancos de dados associados com sequências de plantas apresentam
informações apenas relacionadas às plantas modelo como Arabidopsis ou arroz. Dessa forma,
para esse interatoma foi utilizado o modelo vegetal Arabidopsis por apresentar-se como
principal organismo modelo para estudos com plantas, dispondo de mais pesquisas e dados,
sendo assim, um organismo bem caracterizado.
O interatoma do STRING 10 mostrou as interações que foram estabelecidas com
proteínas do grupo das PLD, que possivelmente estão relacionadas a proteína SEC14 por suas
funcionalidades similares. As proteínas PLDs são também conhecidas como proteínas
Fosfolipase D, atuando na hidrólise de fosfolipídeos formando assim, uma porção hidrofílica e
26
ácido fosfatídico. Em plantas, essas PLDs foram relacionadas com diversos processos celulares
(WANG & WANG, 2001).
No interatoma do GeneMANIA obteve-se uma rede mais ampla de proteínas, contudo
todas elas se caracterizam dentro do grande grupo das proteínas SEC14-like, excetuando uma
que ainda é desconhecida e o grupo das PATL que exercem funções homólogas a SEC14. A
família das proteínas PATTELIN (PATL) possuem o domínio SEC14, isso implica que
exercem funções parecidas como no tráfego entre membranas, metabolismo de lipídeos e
funções reguladas por eles (PEIRO et al., 2014). A proteína PATL1 presente na interação
mostrada no interatoma, por exemplo, é caracterizada pelo domínio N-terminal seguido por
domínio da SEC14, essa proteína se liga a importantes fosfatidilinositóis reguladores do tráfego
de membranas (PETERMAN et al., 2004).
Foram feitos interatomas em diferentes ferramentas na tentativa de abarcar uma rede de
proteínas maior, contudo, ambos apresentaram interação com um grupo de proteínas em
particular, sendo as PATL uma família característica de plantas e as PLDs que apresentam uma
ligação com estágios do florescimento como será discutido mais adiante.
Visando mostrar se haveria conservação das interações mostradas no interatoma entre
os grupos de plantas, foi gerado este gráfico (Figura 7) da ocorrência das proteínas presentes
no interatoma no demais organismos. Assim, por meio do banco de dados do STRING 10,
observamos na Figura 7 o padrão de conservação das proteínas ligadas ao interatoma da SEC14
em diversos organismos. Vale salientar a alta expressividade das proteínas PLD em espécies da
família Brassicaceae, como em A. thaliana, bem como no grupo das gramíneas. Quanto mais
escuro o tom de vermelho, mais conservada está a proteína na espécie apresentada. A
conservação das proteínas PLDs em grupos como o das gramíneas nos mostra que
provavelmente essa interação também está conservada em cana-de-açúcar.
27
Padrão de conservação de proteína SEC14-like de Arabidopsis entre os organismos
Figura 7 – Perfil de ocorrência da SEC14 entre os organismos. Na escala de similaridade vista na parte inferior
esquerda da imagem observa-se que tons mais escuros remetem a maior porcentagem de conservação da sequência,
enquanto tons de rosa claro seria pouca similaridade e o branco representa nenhuma similaridade detectada. No
lado direito da figura podemos ver outros agrupamentos por domínios e divisões, notar a divisão Streptophyta
dentro do domínio Eukaryota, onde se encontram os organismos principais para o presente estudo. Feito através
do STRING 10.
4.4 FATORES DE TRANSCRIÇÃO, miRNAs E PADRÃO DE EXPRESSÃO
Tendo em vista alguns trabalhos que mostraram a regulação de genes e vias do
florescimento por miRNAs (SPANUDAKIS et al., 2014; WANG, et al., 2009), resolveu-se
então buscar se a sequência SEC14 apresentava também regulação por miRNAs e quais
possíveis fatores transcricionais estariam envolvidos.
28
Os dados do PlantPAN mostraram que a sequência pode ter regulação por miRNAs, nas
gramíneas eles apresentariam um papel regulatório similar, em A. thaliana, participariam da
formação de um meristema axilar e do desenvolvimento foliar (RODRIGUEZ, et al. 2010).
Pode-se perceber que os fatores de transcrição relacionados a sequência de SEC14 estão
envolvidos em funções diversas, mas igualmente importantes para o desenvolvimento da planta
em todos os seus estágios. Salientando o AINTEGUMENTE (ANT) responsável pelo
desenvolvimento do óvulo e gametófito feminino, o PHYTOCHROME INTERACTING
FACTOR 3 (PIF3) que possui interação com fotorreceptores PHYA e PHYB e, o RELATED
TO ABI3/VP1 1 (RAV1) que regula o desenvolvimento foliar e de outras estruturas. A maioria
dos fatores de transcrição apresentam funcionalidade descrita em mais de duas espécies
podendo exercer variadas ações dentre esses organismos.
Para inferir onde as sequências SEC14-like estariam mais expressas na planta e para
saber se possivelmente teriam relação com órgãos florais, foi feita a análise do padrão de
expressão absoluta e relativa pelo The Bio-Analytic Resource for Plant Biology (BAR) para
Oryza e Arabidopsis, que eram os dois organismos mais utilizados disponíveis nessa
ferramenta.
29
Diagrama do padrão de expressão relativo de genes homólogos a SEC14 em Oryza
sativa
Figura 8 –Nível de expressão relativa ao seu valor controle de genes homólogos a SEC14 exibidos em O. sativa,
mostrando onde o gene está mais expresso. Fonte: BAR.
30
Diagrama do padrão de expressão relativo de genes homólogos a SEC14 em
Arabidopsis thaliana
Figura 9 –Nível de expressão relativa ao seu valor controle de genes homólogos a SEC14 exibidos em A thaliana,
mostrando onde o gene está mais expresso. Fonte: BAR.
Pelos dados de expressão absoluta podemos observar que em arroz, a SEC14-like está
mais expressa nas sementes e nas folhas jovens. Para A. thaliana, os dados acima mostraram
maior expressividade de SEC14-like nas pétalas das flores em estágio 12, no primeiro nó, nos
pedicelos das flores em estágio 15, nos estames de flores em estágio 12 e também em sementes
no estágio 7, podemos dizer então, que os genes homólogos da SEC14 foram expressos em
algumas estruturas que fazem parte diretamente da reprodução, como os estames.
Os dados de expressão relativa, que levam em consideração o valor controle do gene,
referentes as Figuras 8 e 9 mostram-se um pouco distintos dos dados de expressão absoluta,
especialmente em arroz, onde a expressão foi mais alta nas sementes no estágio 1, na
inflorescência de estágio 5 e jovem, além da folha madura. Para Arabidopsis, entretanto, os
resultados foram similares aos valores absolutos, apresentando-se mais expressos nos mesmos
locais, ou seja, nas pétalas das flores em estágio 12, no primeiro nó e nos pedicelos das flores
em estágio 15. Notabiliza-se que para os dois organismos analisados, há de modo geral, um
aumento de expressão na inflorescência, fortificando a hipótese da ligação entre a proteína
SEC14 e o florescimento.
31
4.5 PCR, PRIMERS E PLASMÍDEO
Os resultados da Figura 10 mostram o início dos experimentos in vitro do trabalho. A
parte A remete à construção dos primers que foi esquematizada na Figura 5. Ressaltando que
os 30 pb (pares de bases) adicionados antes e após a sequência codante são deixados por
garantia para que a ORF contendo o cDNA da SEC14 não tenha porções perdidas. Na parte
B da Figura 12 é observado o fragmento obtido após a PCR. Os dois primeiros poços
correspondem ao material amplificado para a construção em orientação Senso e os outros dois
poços, referem-se ao material amplificado a ser utilizado para a construção Anti-Senso. Essas
duas orientações correspondem a direção do cDNA amplificado, junto com o promotor que
será utilizado para montagem do cassete de superexpressão. A parte C da figura abaixo
corresponde ao esquema do DNA plasmidial do vetor pGEM - T Easy (Promega) que foi
utilizado nessa primeira etapa após a amplificação do cDNA completo via metodologia de
PCR. Com a construção dos cassetes de superexpressão, pretende-se utilizá-los no futuro para
transformação de plantas e com isso realizar a caracterização funcional dessa sequência em
plantas.
Primers, amplificação e vetor de clonagem
Figura 10 – (A) Uma das etapas do desenho de primers, contendo o tamanho da ORF onde provavelmente está o
cDNA da proteína SEC14. (B) Gel de agarose 0,8% referente a PCR para amplificação do material contendo o
gene da SEC14 de cana-de-açúcar, os dois primeiros poços referem-se ao material para a construção em orientação
Senso e os dois seguintes, ao material a ser utilizado na construção Anti-Senso. (C) Vetor de clonagem utilizado,
salientando as enzimas de restrição utilizadas. Fonte: Autoria própria.
32
5 DISCUSSÃO
A floração é sem dúvida o meio natural pelo qual ocorre a reprodução e continuidade
da vida das angiospermas. As mudanças fisiológicas e de expressividade gênica são cruciais e
minuciosamente reguladas por mecanismos intrínsecos, bem como, influenciadas por condições
do meio (WILS et al., 2016; SONG et al., 2015; KHAN et al., 2014; MATSOUKAS et al.,
2012; ARALDI et al., 2010). Apesar de amplamente conhecido, esse processo em gramíneas,
particularmente em cana-de-açúcar, ainda não foi totalmente desvendado e faltam muitos
estudos moleculares para que isso ocorra (ARALDI et al., 2010; MEDEIROS et al., 2016).
Em situações críticas, há uma tendência evolutiva de qualquer espécie a se reproduzir e
gerar descendentes para sua continuidade genética. Em detrimento dessas situações, para
transpor barreiras ambientais, os cultivares precisam fornecer uma resposta adequada, no
momento certo. Quando se trata da floração, essa sinalização envolve a percepção do meio e o
disparo de cascatas, que irão por fim atingir o ápice meristemático onde ocorrerá a formação
dos órgãos florais para permitir que a espécie consiga se propagar (WILS et al., 2016;
MATSOUKAS et al., 2012). O tempo apropriado para ocorrer a transição para floração envolve
variados sinais que atuam como gatilho para início do processo, como por exemplo, a
temperatura para a via de vernalização, a duração da luminosidade para via do fotoperíodo,
ademais, a multiplicidade de fatores transcricionais existentes (Figura 2) (KOMEDA, 2004;
SONG et al., 2013; HANANO et al., 2011; HENDERSON et al., 2004).
Quando analisadas as relações filogenéticas, pode-se dizer que os organismos começam
a acumular mutações desde o momento que divergem de seu ancestral comum. Para tornar a
árvore enraizada, foi escolhido um organismo conhecidamente afastado dos demais, formando
o grupo externo. Nota-se que os grupos das monocotiledôneas e eudicotiledôneas estão
fielmente separados (Figura 6). Observou-se a proximidade das sequências, estando a SEC14
de cana-de-açúcar no mesmo grupo com outras Poaceae que apresentaram alta identidade nos
alinhamentos. Relembrando que existem dados que relatam a ocorrência de um evento de
duplicação de todo o genoma em plantas (um processo conhecido como WDG). Esse evento de
duplicação ocorreu em momentos diferentes, no ancestral que deu origem as plantas, e depois
na separação em eudicotiledôneas e monocotiledôneas. Todos esses eventos são considerados
processos evolutivos importantes, conferindo assim, variabilidade entre os vegetais (JIAO et
33
al., 2011). Em algumas espécies este processo de duplicação foi mantido, e em outras houve a
perda de sequências. Todo esse processo levou a um aumento do tamanho do genoma e
corrobora para sua complexidade. Em algumas ocasiões, essas duplicações conferiram a
neofuncionalizações dos genes, sendo assim, de caráter adaptativo (PANCHY et al., 2016).
Outro ponto importante a ser enfatizado nas espécies com valor agronômico é o processo de
poliploidia, ou duplicação completa do genoma, que está difundido de forma ubíqua entre as
angiospermas (RENNY-BYFIELD et al., 2014). Entretanto, da mesma forma em que novas
funcionalidades podem ser adquiridas pelos genes (neofuncionalização), o silenciamento dos
mesmos pode ocorrer, havendo a seleção para permanência de apenas uma cópia de cada gene
(JIAO et al., 2011), ou ainda, a subfuncionalização de genes, que não os excluem, mas
comprometem sua função. Além de duplicações no genoma, a diversidade gênica também pode
ser atribuída aos eventos de splicing alternativo. Em A. thaliana, foi reportado splicing
alternativos na regulação da expressão gênica, funcionalidade do meristema e na transição para
floração (ECKARDT, 2002). As pesquisas acerca dos genes em cultivares poliploides como a
cana-de-açúcar, facilitam o melhoramento dos cultivares, tendo em vista que, a flutuação
genômica pode se relacionar com reduções da produtividade de cultivares comerciais
(BALESTRAZZI et al., 2011). Os processos de duplicação, sub e neofuncionalização e
silenciamento de genes são importantes aspectos a serem levados em consideração para o
melhoramento genético, assim, é significante aprofundar as pesquisas sobre esses.
Para o gene SEC14 foi encontrado apenas uma cópia, ou seja, para essa sequência não
se observou nenhum processo de duplicação entre as espécies analisadas, apesar da divergência
entre monocotiledôneas e eudicotiledôneas com 93% como mostra o dendograma (Figura 6).
Além disso, no gene SEC14 em A. thaliana observou-se eventos de splicing alternativo
conferindo variantes gênicas. Faz-se necessário estudos mais profundos para buscar a
funcionalidade desse splicing alternativo, bem como, se há ocorrência desse evento no gene
SEC14 em outras plantas.
Em relação aos fatores de transcrição observados para a sequência estudada mostraram
atuação em diversos processos. A seguir descreve-se a funcionalidade dos mesmos: o fator
AGAMOUS-LIKE 3 (AGL3) pertence à família dos genes SEPALLATA, envolvidos do
desenvolvimento de sépalas, pétalas, estames e carpelos, além de exercer uma função central
na determinação do meristema floral e identidade dos órgãos florais. O AINTEGUMENTA
(ANT) requerido na proliferação celular e desenvolvimento floral está envolvido em processos
como manutenção da identidade do ápice meristemático, importante no desenvolvimento do
34
óvulo e gametófito feminino. O ARABIDOPSIS THALIANA HOMEOBOX 1 (ATHB1)
envolvido do desenvolvimento de folhas e hipocótilo, bem como na elongação da parede celular
e crescimento. O CELL DIVISION CYCLE 5 (CDC5) é essencial para a imunidade das plantas,
para o crescimento e diferenciação celular. O RELATED TO ABI3/VP1 1 (RAV1) é um
regulador negativo do desenvolvimento floral, também atuando no desenvolvimento da folha e
raiz lateral. O PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 3 (PIF3) interage com os
fotorreceptores PHYA e PHYB, estando também envolvido da via de sinalização mediada por
giberelina. O HOMEOBOX PROTEIN 5 (ATBH-5) regula positivamente a responsividade da
ABA, mediando o efeito inibidor desse hormônio no crescimento durante a estabilização da
semente. O fator DOF ZINC FINGER PROTEIN 1 (DOF1) em milho se relaciona com o
metabolismo do carbono, e nas plantas superiores de modo geral está envolvido em respostas a
luz e fitormônios, além de maturação e germinação de sementes. E por fim, o gene OPAQUE-
2, que no milho está envolvido no armazenamento do endosperma e no desenvolvimento do
grão.
Enfatiza-se os genes ANT que é necessário para o desenvolvimento do óvulo e
gametófito feminino e está relacionado com a floração por meio de genes como o APETALA2
(KLUCHER et al., 1996; NOLE-WILSON & KRIZEK, 2000). Ressalta-se também o PIF3 que
modula os níveis de PHYA e PHYB (LEIVAR et al., 2008) que são vitais para os processos
fotodependentes ao longo da vida da planta. O PHYTOCHROME INTERACTING FACTOR 4
(PIF4) homólogo ao PIF3 tem a função de indutor do FT (KUMAR et al., 2012). E o gene
RAV1 que modula respostas ao estresse (FU et al., 2014) e promove senescência foliar.
O padrão de expressão visto através do BAR (Figuras 8 e 9), mostrou em suas análises
relativas a maior expressividade em estruturas usadas nos estágios reprodutivos, agregando
informações a nossa hipótese de que a SEC14 se relaciona com a floração.
Muitos genes conhecidos estão envolvidos em diversas etapas do florescimento, o FT,
por exemplo, é um importante indutor floral que sinaliza a floração para o ápice meristemático
(TAOKA et al., 2013). Algumas variações em regiões específicas podem mudar a
funcionalidade do FT conferindo papel oposto, de inibidor do florescimento (HARIG et al.,
2012). Para que possa promover a floração, a proteína FT com função indutora precisa chegar
até o floema para ser transportado ao ápice meristemático, local onde interage com a proteína
FD formando um complexo e induzindo o gatilho para o processo de florescimento
(NAKAMURA et al., 2014). Durante todo o processo há vários fatores de transcrição que
influenciam de algum modo a proteína FT, além disso, Nakamura e colaboradores (2014)
35
relataram que a proteína FT in vitro se liga especificamente a fosfatidilcolina, o aumento desse
fosfolipídio in vivo acelerou o florescimento e sua redução, consequentemente, o atrasou.
Embora tenha sido associada inicialmente como promotor floral, a proteína FT atua como
inibidor, inclusive há sugestões de que a proteína ancestral FT fosse repressora floral (HARIG
et al., 2012). Em cana-de-açúcar, Coelho e colaboradores (2014) relataram que existem
proteínas FT homólogas com função repressora. Assim, como proposto por Medeiros e
colaboradores (2016), visamos aprofundar os conhecimentos acerca da possível ligação da
SEC14 com esse tipo de proteína FT, com papel inibidor.
Sabendo que a proteína SEC14 pode ser relacionada ao transporte da fosfatidilcolina
(MOUSLEY et al., 2007), e que, possivelmente, há uma ligação entre a mesma e a proteína FT
homóloga inibitória, podemos inferir que uma superexpressão da proteína SEC14 ocasionaria,
por conseguinte, a repressão floral. Visto que a proteína FT pode apresentar funções
antagônicas, enfatiza-se que a variante aqui sugerida no estudo seria a da proteína FT com papel
inibitório, assim como o papel de repressor floral da SEC14 (MEDEIROS et al., 2016).
Ademais, evidencia-se que ainda não está explícito a real conexão entre as proteínas SEC14,
FT e os fosfolipídeos.
O interatoma mostrou interações com fosfolipases da família das PLDs. Em Arabidopsis
já foram caracterizados vários tipos de PLDs, dentre eles estão a alfa, beta, gama e delta, a
última inclusive foi associada fortemente com a membrana plasmática e tendo níveis de
expressão em tecidos como estames, flores e folhas velhas (WANG & WANG, 2001). Entre
as proteínas identificadas dessa família, encontram-se: a PLDALPHA1, uma fosfolipase que
possui papel importante em vários processos celulares, incluindo ativação de fitormônios (ácido
abscísico e etileno), degradação de membrana e respostas ao estresse (FAN et al., 1997); a
PLDBETA2, fosfolipase que atua no metabolismo de fosfatidilcolina, no tráfego de vesículas,
secreção, meiose, promoção de tumor e senescência; PLDBETA1, envolvido em processos de
crescimento, estágios da floração e de desenvolvimento de folhas, pétalas, estame e outras
porções da flor (SCHMID et al., 2005), além de estar relacionada com a germinação das
sementes mediando a transdução de sinal do ácido abscísico (LI et al., 2007); e a PLDDELTA,
fosfolipase que pode estar envolvida na acumulação de ácido fosfatídico em resposta ao estresse
hídrico e na transdução hormonal e de sinais ambientais para os microtúbulos do citoesqueleto,
além de estar expressa durante estágios da floração e no desenvolvimento de estruturas florais
(SCHMID et al., 2005), bem como, envolvida do metabolismo de fosfatidilcolina (KATAGIRI
et al., 2001). No tocante aos fitormônios ativados pelas fosfolipases mencionadas
36
anteriormente, notabiliza-se as vias do florescimento que são mediadas direta ou indiretamente
por hormônios vegetais, como a via das giberelina mediada diretamente pela giberelina, que
por sua vez é capaz de promover a formação dos primórdios florais (ARTECA, 1996 apud
ARALDI et al., 2010). As proteínas com maiores interações com a SEC14 apresentam
expressividade em órgãos florais e estágios da floração, além de estarem com alta conservação
entre as gramíneas e algumas eudicotiledôneas. A rede de interações mostrada pelo
GeneMANIA destacou a proteína PATL (PATELLIN) que se localiza na placa celular durante
os últimos estágios da citocinese, além de estar associada ao tráfego de vesículas (PETERMAN
et al., 2006). Além disso, a Figura 7 mostrou o padrão de conservação de uma proteína SEC14-
like em A. thaliana e pode-se ver que há uma ampla representatividade da mesma entre os
organismos, estando especialmente bem conservada nas gramíneas, inferindo estar bem
conservada em cana-de-açúcar.
6 CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Em síntese, os dados provenientes das análises in silico foram realizados com
sequências homólogas bem conservadas, que apresentaram em sua filogenia uma separação
clara entre monocotiledôneas e eudicotiledôneas. Evidenciou-se com as análises de expressão
em tecidos vegetais, bem como através dos fatores de transcrição, que essa sequência apresenta
envolvimento com processos ligados a floração, além de estar expressa em diversas partes dos
órgãos florais.
A vinculação entre fosfolipídeos e as proteínas SEC14 e FT não foi absolutamente
desvendada, contudo propõe-se que haja uma correspondência entre a proteína homóloga FT
com papel inibitório e a proteína SEC14. Portanto, os dados obtidos nesse estudo e em pesquisas
anteriores reforçam o possível papel da SEC14 como repressor da via de florescimento em
cana-de-açúcar. Dessa forma, agregando novas informações aos escassos conhecimentos sobre
genes envolvidos no processo de floração em cana-de-açúcar.
Por fim, esse trabalho tem como perspectivas futuras a construção dos cassetes de
superexpressão e a transformação de plantas transgênicas contendo esses cassetes, para dessa
maneira caracterizar funcionalmente a proteína SEC14 na espécie trabalhada. Estudos in silico
mais complexos devem ser feitos para compreender melhor as interações da proteína na via
floral, traçando novas relações ainda não observadas. O presente estudo ajudará no melhor
37
entendimento da reprodução desse cultivar, possibilitando identificar genes que exerçam papel
importante tanto econômico quanto biologicamente.
38
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