ocorrÊncia da infecÇÃo por toxoplasma gondii e … · obrigada por me ensinar a viver com...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

ANDREA DANTAS DE MEDEIROS

OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR TOXOPLASMA

GONDII E AVALIAÇÃO DA IMUNIZAÇÃO EM CAPRINOS

DO SERTÃO DO CABUGI, RIO GRANDE DO NORTE.

NATAL/RN

OUTUBRO/2010

II

ANDREA DANTAS DE MEDEIROS

OCORRÊNCIA DA INFECÇÃO POR TOXOPLASMA

GONDII E AVALIAÇÃO DA IMUNIZAÇÃO EM CAPRINOS

DO SERTÃO DO CABUGI, RIO GRANDE DO NORTE.

Dissertação de Mestrado apresentada

ao Programa de Pós-Graduação em

Ciências Biológicas do Centro de

Biociências, da Universidade Federal

do Rio Grande do Norte, como parte

dos requisitos para obtenção do título

de Mestre em Ciências Biológicas.

ORIENTADOR: Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Ne to

DMP/ CB / UFRN

NATAL / RN

2010

III

AAAA DEUSDEUSDEUSDEUS

Por nunca me deixar desanimar, por me dar coragem para continuar seguindo a trilha da vida e pela oportunidade de conviver ao lado de pessoas maravilhosas. Pela presença real em minha vida, capacitando-me em tempos difíceis e revelando sua infinita graça e misericórdia nas horas de alegria.

À Minha mãe, minha rosa preciosa, Maria DalvaÀ Minha mãe, minha rosa preciosa, Maria DalvaÀ Minha mãe, minha rosa preciosa, Maria DalvaÀ Minha mãe, minha rosa preciosa, Maria Dalva

Minha amada, o presente mais precioso que ganhei de DEUS ao nascer. Obrigada por me ensinar a viver com dignidade, mesmo passando por tantas batalhas em teu caminho. Você é todo o exemplo que eu preciso carregar para toda minha vida. Muito obrigada por tudo que sacrificaste por mim, para me fazer a pessoa que sou hoje.

AAAA Meu pai, meu ídoloMeu pai, meu ídoloMeu pai, meu ídoloMeu pai, meu ídolo, João Medeiros , João Medeiros , João Medeiros , João Medeiros (In memórian(In memórian(In memórian(In memórian))))

Pai, o pouco tempo que passou comigo, me ensinou diversas experiências belas, transmitidas nos poucos e intensos anos em que convivemos. Sei que sempre esteve presente ainda que eu nunca pudesse ver cada momento em que te aproximavas para cuidar de mim, sempre senti tuas palavras no meu coração. Pai, de onde estás me impulsiona a continuar adiante e a triunfar, a me olhar no espelho e saber que tu me apóias. Meu pai, apesar de meus lábios não poderem mais te afirmar o quanto te amo olhando em seus olhos, meu coração sabe dizer e sentir: “COMO É GRANDE O MEU AMOR POR VOCÊ”!!!! SEMPRE TE AMAREI PAIZÃO!!!

Aos meus irmãosAos meus irmãosAos meus irmãosAos meus irmãos

Por me aceitar como sou, por me amar, mesmo sabendo de minhas falhas e de meus erros. Obrigado por sempre estarem abertos para mim e por me dar força. Obrigada por me oferecer sempre um lugar de apoio, de encorajamento e consolo nas horas difíceis.

Ào meu companheiro, amor de minha vida, WidnesÀo meu companheiro, amor de minha vida, WidnesÀo meu companheiro, amor de minha vida, WidnesÀo meu companheiro, amor de minha vida, Widnes

Muito obrigada por ter me aceitado com meus defeitos e por saber também elogiar minhas virtudes. Por me ensinar que a cada dia podemos recomeçar. Por me fazer sentir um alguém diferente. E por eu saber que sempre poderei contar contigo

Ao mestre, ValterAo mestre, ValterAo mestre, ValterAo mestre, Valter

Por me servir de exemplo de alguém que venceu na vida por seus

estudos, obrigada pelas lições ensinadas, pela coragem em ajudar pessoas nunca antes vistas. Nunca lembra que existe cansaço, tempo ou preocupação, tornando tudo, como você mesmo diz, simples ou fácil.

A vocês.............dedico!!!

IV

AGRADECIMENTOS

A Deus, por dar sentido à vida, por ter me abençoado grandemente durante toda a minha jornada, por ter sido sempre tão generoso comigo. À minha família, por permitir que eu pudesse chegar até aqui com tranquilidade. Obrigada acima de tudo, pelas orações, amor, carinho, atenção, compreensão e dedicação incansável. Obrigada por contribuírem para mais esta vitória – ela também é de vocês. Ao meu marido Widnes, pelo seu amor, compreensão, paciência e também por estar sempre ao meu lado em todos os momentos. Desculpa pelos momentos em que não pude dedicar o meu tempo. A minha eterna gratidão ao meu orientador Prof. Dr. Valter Ferreira de Andrade Neto, por toda paciência e orientação nesse projeto, quem sempre me deu apoio e incentivo. Nunca vou esquecer a forma carinhosa com que abriu as portas de seu laboratório para que eu crescesse não só como profissional mas também como ser humano. Aos meus sogro, sogra e cunhados: por todo apoio e carinho por mim, pela contribuição positiva a realização deste curso! Às minhas sobrinhas: Giordana e Alexia, pelos momentos agradáveis. Quantas vezes tentei estudar e vocês não deixaram!!!! Titia ama vocês. Ao Técnico em Laboratório Edson Santana, mais que um amigo, um pai que não dá mesada aos filhos, mas sim “puxões de orelha”, estando sempre preocupado em oferecer as melhores condições de trabalho no laboratório. Muito obrigada pela agradável companhia e serviços prestados em nossas viagens, pela ajuda e paciência demonstrada nas coletas dos materiais utilizados nas análises. À Otani pela amizade e ajuda em tudo o que estivesse a seu alcance, sempre pronta para nos fornecer material de expediente para o LaBMaT. À Drª. Antônia Cláudia, pelo incentivo e pelas dicas importantes dadas ao longo dos anos. À Drª. Janeusa Trindade e à Drª. Selma Jerônimo, pelos empréstimos do laboratório e de alguns aparelhos utilizados neste projeto. Ao Dr. Ricardo Vitor (Depto. Parasitologia/UFMG) e ao Dr. Oscar Romero (Depto. Microbiologia), pela colaboração no projeto, dicas e sugestões dadas. Aos professores Dr. Alexandre Vasconcelos, Dr. Gilberto Corso e Dr. Umberto pelas orientações quanto às análises estatísticas.

V

À minha amiga-irmã Magaly Mota, pelas longas horas de conversa, pela ajuda, dedicação, paciência, compreensão, pelas lágrimas derramadas juntas, por me trazer tranqüilidade nos momentos mais difíceis desta jornada. À Lis Tavares, a Flor do laboratório que com sua meiguice e simplicidade soube cativar a todos. Obrigada pelas conversas agradáveis, pelas ajudas e pela preocupação a mim dispensada sempre. À Milena Clementino, “companheira de batalhas”, obrigada pela amizade, confiança e pela oportunidade de trabalhar em conjunto em alguns projetos. Aos meus amigos do LaBMaT: Aline, Norma, Ywlliane, Valéria, Thales, Samira, Cláudio Bruno pelos momentos de descontração e pelas “gargalhadas nossas de cada dia”, e pelas ajudas nos momentos em que mais precisei. Obrigada por tornar nosso ambiente de trabalho tão agradável. À Elainne Potter, Louise da Matta e Juliane, pela amizade e por sempre ajudar na parte burocrática dos processos relacionados ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Ao Senhor Idalécio, Presidente da Associação de Criadores de Caprinos e Ovinos do Sertão do Cabugi, por tornar viável o nosso estudo nessa região e por sua dedicação e empenho. Às professoras Fátima Ximenes, Cecília Holanda, Louisianne Guerra, Antônia Cláudia e Adriana Uchôa pelas sugestões e orientações no nosso trabalho. A Raimundo (Depto. de Biofísica e Farmacologia) pelo fornecimento dos camundongos utilizados na rotina do labmat. À direção, funcionários e professores do Centro de Biociências, que efetivamente se preocupam em construírem pessoas mais solidárias, autênticas e felizes; se preocupam com todos os passos que percorremos e como trilhamos nossos caminhos. Agradeço pela cooperação, confiança e dedicação. À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, pela qualidade de professores e pela estrutura e apoio aos estudantes. Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pela colaboração em meu aperfeiçoamento profissional. À FAPERN pelo apoio financeiro. Enfim, a todos que de alguma forma contribuíram para que este trabalho fosse concluído... o meu muito obrigada!

VI

Aprender é a única coisa de que a mente

nunca se cansa, nunca tem medo e

nunca se arrepende.

(Leonardo da Vinci)

VII

RESUMO

A toxoplasmose é uma zoonose causada pelo protozoário Toxoplasma

gondii. Os caprinos, dentre os animais de produção, são uma das espécies

mais suscetíveis a este parasito, sendo um dos principais agentes envolvidos

no abortamento de ovinos e caprinos, determinando grandes perdas

econômicas e tendo implicações para saúde pública, já que a presença do

parasita nos produtos de origem caprina, constituem-se em uma das principais

fontes de infecção para o homem.

Neste estudo foram coletadas 244 amostras de sangue em 8 fazendas

situadas em 4 municípios da região do Sertão do Cabugi, Estado do Rio

Grande do Norte, região Nordeste do Brasil e testadas através do Ensaio

Imunoenzimático (ELISA). Os resultados obtidos mostraram uma prevalência

de 47,13% para anticorpos anti-T. gondii e uma associação significativa entre

positividade e as variáveis avaliadas tais como idade, localidade e propriedade.

Foi realizado o ensaio IgG de avidez em 115 amostras positivas com o intuito

de discriminar infecção aguda e crônica. Doze amostras (10,4%) apresentaram

anticorpos de baixa avidez enquanto 103 (89,6%) anticorpos de alta avidez;

indicando que a maior parte dos animais foi exposto ao parasita precocemente.

Foi verificada diferença estatística significativa apenas para a variável sexo.

Avaliamos também a capacidade de adenovírus recombinantes

codificando SAG1, SAG2, SAG3 e CMV em induzir ativação de resposta imune

em caprinos. Estes animais receberam 109 pfu de AdSAG1, AdSAG2,

AdSAG3, AdCMV ou PBS em protocolo vacinal com 3 imunizações. Amostras

de soro obtidas dos animais, antes e após cada imunização, foram submetidas

ao ELISA. Os resultados demonstram que as imunizações induziram a

produção anticorpos IgG específicos contra as proteínas de T. gondii.

Palavras-chave: Toxoplasma gondii, caprinos, ELISA, vetores virais

recombinantes, SAG, vacinas.

VIII

ABSTRACT

Toxoplasmosis is one zoonosis caused by Toxoplasma gondii protozoan.

Goats, amongst the production animals, are one of the species most

susceptible to this parasite, being one them main involved agents in ovine and

goat abortions, determining great economic losses and implications for public

health, since the presence it parasite in the products of goat origin, consist in

one of the main sources of infection for the man.

In this study 244 blood samples in 8 farms situated in 4 cities from the

Sertão do Cabugi region, Rio Grande do Norte State, northeast of Brazil and,

tested by ELISA assay. The results had shown a prevalence of 47.13% for anti-

T. gondii antibodies and a significant association between positivity and variable

evaluated as age, locality and property. The IgG avidity assay evaluated in 115

positive samples was carried to discriminate acute and chronic infection. Twelve

samples (10.4%) had presented antibodies of low avidity while 103 (89.6%)

presented high avidity antibodies; indicating that most of the animals was

precocious exposure to the parasite. Significant difference was verified only for

the variable sex.

We also evaluate the capacity of recombinant adenoviruses codifying

SAG1, SAG2, SAG3 and CMV in inducing activation of specific immune

response in goat. These 109 animals received 109 pfu of the AdSAG1,

AdSAG2, AdSAG3, AdCMV or PBS in vaccine protocol with 3 immunizations.

Serum samples of the each animal, before and after mmunization, had been

submitted to the ELISA. The results demonstrate that the immunizations had

induced the production of IgG antibodies specific against T. gondii proteins.

Keywords : Toxoplasma gondii, goats, ELISA, recombinant viruses,

SAG, vaccines.

IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Taquizíoto do T. gondii. Adaptada de: Ajioka et.al., (2001)............... 10

Figura 2- Ciclo de vida do T. gondii com várias fontes de infecção ................. 11

Figura 3- Ruptura da parede do cisto, liberando bradizoítos ........................... 14

Figura 4- Avidez de IgG em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com

sorologia positiva para Toxoplasma gondii, com relação ao sexo.................... 41


sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação a idade...................... 41


sorologia positiva para Toxoplasma gondii, com relação a raça...................... 42


sorologia positiva para Toxoplasma gondii, com relação as fazendas............. 42


sorologia positiva para Toxoplasma gondii, com relação a cidade................... 43

Figura 9- Média de Absorbâncias de IgG em soro de caprinos da Fazenda DI,

imunizados pela via intramuscular com a vacina AdSAG1 (expressando o

adenovírus recombinante proteína SAG1 do Toxoplasma gondii, após três

séries de imunização com intervalos de 15-20 dias. [(A) Absorbância dos soros

na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na diluição 1:100 até 1:12.800].45






X







imunizados pela via intramuscular com a vacina AdCMV (expressando o

adenovírus recombinante proteína CMV do Toxoplasma gondii, após três séries

de imunização com intervalos de 15-20 dias. [(A) Absorbância dos soros na

diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na diluição 1:100 até 1:12.800]..... 48


imunizados pela via intramuscular com a solução de PBS usado como controle

negativo, após três séries de imunização com intervalos de 15-20 dias. [(A)

Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na diluição

1:100 até 1:12.800]........................................................................................... 49

XI

LISTA DE TABELAS

Tabela 1- Distribuição da soropositividade de IgG anti-Toxoplasma gondii em

caprinos oriundos da região do Sertão do Cabugi no Rio Grande do Norte, em

comparação com as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade.... 38

Tabela 2- Distribuição da avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em

caprinos oriundos da região do Sertão do Cabugi no Rio Grande do Norte, em

comparação com as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade.... 40

XII

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ACOSC

Ad

Associação de Criadores de Caprinos e Ovinos do Sertão do Cabugi Adenov

AIDS/SIDA

CMV

Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (Acquired Immunodeficiency Syndrome) Adenovírus recombinante codofocando SAG1, SAG2 e SAG3

ELISA Ensaio imunoenzimático (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) FAO Organização das Nações Unidas sobre alimentação e Agricultura

(Food and Agriculture Organization on the United States) HAI

IFN- γ IgA IgG IgM

Hemaglutinação Indireta Interferon gama Imunoglobulina A Imunoglobulina G Imunoglobulina M

IR Índice de Reatividade LaBMaT Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose

NK OPD PBS SAG

Células de morte natural (Natural Killer) Orto-fenilenodiamina (σ-phenylinediamine) Solução Salina Fosfatada (Phosphate Saline Solution) Antígeno de Superfície Geneticamente Modificado (Genetically Modified Surface Antigens)

SRD Sem Raça Definida Tween Mono-laurato de polioxietileno sorbitano (Polyoxyethylene sorbitan

mono-laurate)

XIII

SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS IX

LISTA DE TABELAS XI

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS XII

1 – INTRODUÇÃO 1

2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3

2.1- Caprinocultura 3

2.2 - Toxoplasmose e a Ovinocaprinocultura 5

2.3 - O Agente Etiológico 8

2.3.1 – Taxonomia 8

2.3.2 - Características Biológicas 9

2.3.3 – Morfologia 9

2.4 - Ciclo Evolutivo 11

2.5 - Diversidade biológica do Toxoplasma gondii 15

2.6 - Mecanismos de Invasão da Célula Hospedeira pelo T. gondii 17

2.7 - Resposta imune ao Toxoplasma gondii 19

2.8 - Vacinas contra Toxoplasmose 21

3 - JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS 28

3.1 - Objetivo Geral 30

3.2 - Objetivos Específicos 30

4 – METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO 31

4.1 – Área de Estudo 31

4.2 – Amostragem 32

4.3 – Coleta do Sangue 32

4.4 – Antígeno 32

4.5 – Testes sorológicos 32

4.5.1 – ELISA 33

4.5.2- ELISA para avaliação da avidez de anticorpos IgG 34

4.5.3- ELISA de Titulação 35

4.6 - Imunização de caprinos 36

4.7– Processamento e análise de dados 36

XIV

5 – RESULTADOS 38

5.1 - Prevalência de anticorpos anti-Toxoplasma gondii no rebanho caprino 38

5.2 - Determinação da avidez de anticorpos anti-T. gondii, da classe IgG em

soros de caprinos naturalmente infectados, avaliados pelo ELISA 40

5.3 - Avaliação da imunogenicidade em grupos de caprinos imunizados com

vacina de adenovírus recombinantes expressando SAG1, SAG2, SAG3 e

CMV. 45

5.3.1 - Vacina AdSAG1 47



5.3.4 - Vacina AdCMV 50

5.3.5 - PBS 1x 51

6 – DISCUSSÃO 52

6.1 - ELISA para determinação da avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii em

soros de caprinos naturalmente infectados. 57

6.2 - Avaliação da imunogenicidade após imunizações com vacinas de

adenovírus recombinantes expressando SAG1, SAG2, SAG3 e CMV em

soros de caprinos. 60

7 – CONCLUSÂO 66

8 - PERSPECTIVAS 66

9 - REFERÊNCIAS 67

1

1. INTRODUÇÃO

A toxoplasmose é uma zoonose de distribuição geográfica mundial,

causada por Toxoplasma gondii, um protozoário intracelular obrigatório,

podendo apresentar, em determinadas regiões, grande impacto médico-

veterinário (APPLEFORD & SMITH, 2000); sendo considerada uma das

enfermidades infecciosas mais difundidas dentre as transmissíveis.

Do ponto de vista epidemiológico, a toxoplasmose é uma enfermidade

cosmopolita sendo a sua distribuição influenciada por diversos fatores, entre os

quais se podem incluir: os climáticos, os sócio-econômicos, contato com

animais domésticos, em especial o gato, e o consumo de carne crua ou mal

cozida (CORCUERA, LOZANO & LOPEZ, 1981). Sendo, a toxoplasmose,

citada como a terceira causa mais freqüentemente diagnosticada de mortes

relacionadas à alimentação nos Estados Unidos (MEAD et al, 1999)

A cada ano, o T. gondii infecta mais de um bilhão de pessoas em todo o

mundo (EL-ON & PEISER, 2003), sendo a sua infecção normalmente

assintomática, em adultos saudáveis, com o parasito persistindo por toda a

vida do hospedeiro. Em recém-nascidos infectados congenitamente e em

indivíduos imunocomprometidos, a infecção se manifesta de maneira mais

grave, provocando doenças oculares e psiquiátricas (DUBEY, 1996; PASSOS

et. al, 2000; SORRENTINO, 2005).

Diversos aspectos desta parasitose contribuem para a elevação de sua

prevalência e morbidade. As conseqüências da infecção intra-uterina pelo T.

gondii estão ganhando reconhecimento e a toxoplasmose vem sendo

diagnosticada em um número crescente de pacientes com imunossupressão

decorrente de várias causas, tais como doenças malignas, transplantes de

órgãos e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Clinicamente, a

encefalite toxoplásmica aparente tem sido relatada em 30 a 40 % dos

pacientes com AIDS (KOSKINIEMI et. al., 1989).

A incidência mundial da toxoplasmose congênita é estimada variando de

0,3 a 1,0 para cada mil nascimentos vivos (TROJOVSKY, 1998) e, segundo

2

Kawazoe (2005), cerca de 40% dos fetos humanos podem adquirir o T. gondii

durante a gravidez, estando a gestante na fase aguda da doença (ou se houver

reativação de cistos da fase crônica da doença; o que se percebe mais raro).

O Toxoplasma gondii tem a capacidade de invadir vários tecidos,

células (exceto hemácias) e líquidos orgânicos, sendo uma parasitose de

considerável importância médica e veterinária, apresentando um grande

impacto na pecuária caprina e ovina podendo levar a abortos, má-formações

fetais e mortalidade neo-natal. Entre os animais de produção, os caprinos são

os mais susceptíveis ao T. gondii (DUBEY & ADAMS, 1990), justificando a

necessidade de estudos nesses rebanhos no Sertão do Cabugi que é a maior

região produtora desses animais no Rio Grande do Norte.

O impacto econômico anual da toxoplasmose nos Estados Unidos é

estimado em 7,7 bilhões de dólares, sendo a toxoplasmose a terceira maior

causa de morte causada por alimentos nesse país (JONES et al., 2001). Em

1993, os Estados Unidos tiveram um custo anual de 5,3 bilhões de dólares

devido às perdas com cuidados médicos, baixa na produtividade e custos com

educação especial para a toxoplasmose congênita (ROBERTS et al., 1994),

constituindo-se um sério problema de Saúde Pública em vários países, sendo o

seu diagnóstico crucial para programas de assistência a gestantes (SPALDING

et al., 2005). No Brasil não existem dados sistematizados quanto ao impacto

econômico dessa parasitose.

Este parasito é estudado mundialmente no que se refere ao seu

controle, no entanto, nenhuma vacina segura contra a infecção encontra-se

disponível. Uma vacina para a toxoplasmose deverá utilizar antígenos do

parasito associado com uma via e um adjuvante adequados.

3

2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1- Caprinocultura:

A caprinocultura é uma atividade explorada em todos os continentes,

estando presente em áreas sob as mais diversas características climáticas,

edáficas e botânicas. Os caprinos estão mais concentrados em áreas secas

tropicais e subtropicais,com terras pobres, pouco voltadas à agricultura

(MORAND-FEHR & BOYAZOGLU, 1999).

Nos anos em que as estiagens arrasam as plantações, as cabras estão

entre as únicas alternativas alimentares e, ao mesmo tempo, constituem a

única fonte de renda dos agricultores mais pobres, sendo de fundamental

importância sócio-econômica para o Nordeste brasileiro, por representar uma

alternativa na oferta de carne, leite e derivados, favorecendo o aspecto

alimentar, especialmente da população rural, sendo responsável pelo

fornecimento de cerca de 40% de toda proteína animal consumida pela

população rural (ALVES, 2005).

Segundo a FAO (2007), as exportações de carnes e de derivados

lácteos deverão dobrar até 2015, com deslocamento da oferta exportadora de

commodities competitivas dos países ricos para os emergentes. Este

comportamento é esperado também para o mercado interno brasileiro, o que

gerará uma demanda por alimentos que pode ser atendida parcialmente com a

carne e o leite de pequenos ruminantes. Neste cenário, podem-se projetar

significativas oportunidades para os produtos da caprinocultura, tanto na

dimensão econômica, quanto na social. No caso dos produtos da

caprinocultura, destacam-se a carne e o leite por suas características

nutricionais, que lhes conferem importante potencial de mercado em virtude do

crescimento do consumo de alimentos saudáveis e funcionais (EMBRAPA,

2008).

O interesse pela caprinocultura de corte tomou proporção jamais vista

no cenário mundial e esse efeito pode ser claramente percebido no Brasil.

4

Combinada à capacidade de resistir às adversidades climáticas, aos baixos

custos de manutenção, a cabra apresenta uma grande virtude que, aos

poucos, foi sendo percebida pela população do semi-árido: a sintonia com a

atividade de subsistência praticada na região. Uma das vantagens é que a

dieta alimentar do animal não rivaliza com a humana, principalmente no que se

refere ao consumo de grãos. Assim, não há dependência das safras incertas

que, por vezes, são incapazes de suprir até mesmo as necessidades da

população. Outra vantagem é que caprinos e bovinos podem ser criados em

regime de consórcio, já que nesse caso também não existe competição pela

alimentação, pois as dietas são diferentes.

Alia-se a esse fato a característica reprodutiva de poliestria contínua,

isto é, apresentam cio (estro) e ovulam ao longo de todos os meses do ano,

onde o fotoperíodo não constitui fator limitante para a reprodução, uma vez

atendidas as necessidades de alimentação, nutrição e saúde dos rebanhos

(SIMPLÍCIO, 2006). Só nas décadas mais recentes a caprinocultura passou a ser objeto de

atenção oficial. Isso quando se percebeu que o animal, adaptado às condições

inóspitas da caatinga, poderia contribuir com o desenvolvimento da região,

gerando empregos e oportunidades de negócios para as famílias mais pobres,

colaborando para evitar os fluxos migratórios contribuindo de forma significativa

para fixação do homem no campo e constituindo-se importante fonte de

proteína animal numa região em que a segurança alimentar ainda é um

desafio, além de gerar divisas para o Estado e para o País. Nos últimos anos,

esta atividade pecuária tem recebido bastante incentivos dos governos,

chegando até a ter programas próprios e exclusivos destinados ao seu

desenvolvimento (LEITE, 2005).

Segundo o IBGE (2007), o rebanho mundial de caprinos no ano de 2007

era de 830.391.683 cabeças. O rebanho da América do Sul é de 29.191.834,

ou seja, 3,5% do rebanho mundial. O efetivo de caprinos do Brasil é da ordem

de 9.450.312 (1,1% do rebanho mundial e 32,3% do rebanho da América do

Sul). Deste total, o Nordeste concentra 8.633.722 cabeças, sendo responsável

5

por 91,3% do efetivo nacional de caprinos, enquanto que as regiões Sul,

Sudeste, Norte e Centro-Oeste, detêm 2,96%, 2,68%, 1,77% e 1,22%

respectivamente . Do total do rebanho nordestino, 401.510 cabeças (4,65%)

pertencem ao Rio Grande do Norte, 39,92% à Bahia, 18,47% à Pernambuco,

15,88% ao Piauí, 11,31% ao Ceará, 7,37% à Paraíba, 4,39% ao Maranhão,

0,78% às Alagoas, e 0,20% a Sergipe. A importância dos caprinos não pode ser mensurada somente pelo

número de animais ou pelo valor da produção. Em várias fazendas, os animais

e produtos não são vendidos, fazendo parte da subsistência familiar, ao

contrário do que acontece com os produtos da espécie bovina, cuja função

principal é a comercialização (PINHEIRO et al., 2000).

Por outro lado, a produção e a produtividade desses animais ainda

apresentam limitações que envolvem problemas sanitários e nutricionais,

manejo inadequado no sistema de criação, o que contribui para o aumento da

incidência e da gravidade das doenças que afetam os animais. Destacamos,

neste contexto, as parasitoses que apresentam importante impacto para a

saúde animal, repercutindo em elevadas perdas econômicas em virtude da

diminuição do crescimento do animal, do peso, do consumo de alimentos e

aumento nos abortos, infecções maciças, e taxas de mortalidade.

2.2 - Toxoplasmose e a Ovinocaprinocultura

Dentre as parasitoses, a toxoplasmose, uma doença por vezes

negligenciada, apresenta repercussões sanitárias importantes, uma vez que

pode induzir ao aborto, má-formação fetal e mortalidade neonatal em caprinos

e ovinos (DUBEY & THULLIEZ, 1993). Feldman & Miller (1956) estudaram

rebanhos caprinos nos Estados Unidos encontraram a primeira prova da

toxoplasmose nesta espécie. Munday & Mason (1979), na Austrália, foram os

primeiros a descrever a toxoplasmose como uma importante causa para os

problemas reprodutivos em caprinos. Os cistos teciduais viáveis de

Toxoplasma gondii têm sido freqüentemente encontrados nesses animais

6

(GARCIA-VASQUEZ et al., 1993), comprometendo enormemente o setor

pecuário e de agronegócios, ocasionando com isso grandes perdas

econômicas (DUBEY & THULLIEZ., 1989; BUXTON, 1990), bem como, com

potencial risco para a saúde humana.

Em vários locais do mundo a prevalência da toxoplasmose caprina, em

rebanhos experimentalmente ou naturalmente infectados, vem sendo estudada

utilizando-se de várias técnicas de sorodiagnóstico, e os dados variam entre

0% e 92,4% de soropositividade (CHIARI et al., 1987; TENTER et al., 2000).

Os levantamentos sorológicos mostram que a prevalência da toxoplasmose em

caprinos é maior entre os animais mais velhos, atingindo igualmente machos e

fêmeas, com maior freqüência nos rebanhos leiteiros em relação aos de

exploração mista, sendo este parasito mais patogênico para animais jovens do

que para animais adultos (DUBEY et al., 1985; DUBEY, 1987; DUBEY, 1989;

DUBEY, 1990; DUBEY & ADAMS, 1990; OPEL et al., 1991; PANDEY & van

KNAPEN, 1992).

A patogenia da toxoplasmose em caprinos adultos está bastante

relacionada com o sistema reprodutor, podendo ocasionar esterilidade, abortos,

morte embrionária precoce e reabsorção fetal, fetos mumificados ou

macerados, nascimento de filhotes prematuros e fracos; podendo inclusive

causar a morte de cabras jovens e adultas devido às complicações recorrentes

(DUBEY, 1987; DUBEY & ADAMS, 1990).

Dentre os sintomas comuns da toxoplasmose caprina estão a encefalite,

nefrite, hepatite, abomasite necrosante, enterite, cistite e pneumonia (MEDHI et

al.,1983; DUBEY, 1987). Cabras gestantes desenvolvem quadro clínico

inespecífico apresentando hipertemia, hiporexia e apatia (CHHABRA et al.,

1981; DUBEY, 1988). A infecção, na primeira metade da gestação, causa

maiores prejuízos, porém, ainda há risco de transmissão transplacentária em

fases mais tardias causando menor acometimento do feto (DUBEY, 1988;

VITOR et al., 1991). As alterações mais comumente encontradas são: necrose

placentária, encefalomielite, lesões no fígado e no miocárdio do feto (DUBEY,

1988).

7

Embora pouco freqüente, a morte por toxoplasmose aguda disseminada

é relatada em caprinos adultos, sendo descritas encefalite, febre, diarréia

dispnéia, apatia, edema e congestão pulmonar, infarto renal, vários focos

necróticos no fígado e baço, enterite, cistite e abomastite (MEHDI et al., 1983;

DUBEY, 1987). A morte dos animais está associada a lesões fibro-necróticas,

congestão e edema em tecido intestinal e pulmonar, enfarto e necrose focal de

linfonodos mesentéricos, encefalite, hepatite, e comprometimento renal, sendo

a gravidade do quadro diretamente proporcional ao tamanho do inóculo

utilizado experimentalmente (DUBEY et al., 1980; DUBEY, 1989).

No Brasil, a soro-prevalência da toxoplasmose em rebanhos caprinos é

muito variável (AMARAL et al, 1978; CHIARI et al, 1987; SELLA et al, 1994).

Na Bahia, Amaral et al, (1978) encontrou uma soro-reatividade de 10%. Araujo

et al., (1984) no Rio Grande do Sul encontraram 16,1 % dos animais reativos a

T. gondii. Em Minas Gerais, Chiari et al., (1987) descobriram uma prevalência

de 92,4%. Serra-Freire (1994), no Rio de Janeiro encontrou 15,84% e no

Paraná, Sella et al. (1994), verificaram uma prevalência de 30,71% em

caprinos leiteiros da região de Londrina, norte do Estado.

Tenter et. al. (2000) descreveram que os animais domésticos que mais

comumente estão envolvidos no ciclo de T. gondii como hospedeiros

intermediários, onde só haverá a reprodução assexuada do parasito (formação

de cistos), são os suínos, ovinos e caprinos, seguidos em menor frequência

dos cães, coelhos, aves silvestres, equinos, aves domésticas e, por fim, em

muito menor grau, bovinos e bubalinos.

A eliminação de T. gondii pelo leite (RIEMANN et al, 1975; DUBEY et al.,

1980; VITOR et al., 1991; DUBEY, 1994) e a persistência de cistos na

musculatura dos caprinos (DUBEY, 1980), revelaram a importância desta

espécie na transmissão da toxoplasmose ao homem (SACKS et al., 1982;

PEPIN et al., 1997). Desta forma, a carne e leite destes animais

persistentemente infectados, quando inadequadamente preparados, é uma das

fontes potenciais mais importantes da toxoplasmose humana (LUNDÉN e

UGGLA, 1992; TENTER et. al., 2000; CLEMENTINO et. al, 2009), aliando-se a

8

isto a tendência ao aumento no número destes rebanhos em nossa região e as

significantes perdas econômicas, o que torna essencial a investigação da

prevalência da infecção por T. gondii entre estes animais.

2.3- O Agente Etiológico

2.3.1- Taxonomia:

O Toxoplasma gondii está classificado segundo Levine et. al., (1980) da

seguinte forma:

REINO Protista

SUBREINO Protozoa

FILO Apicomplexa

CLASSE Sporozoea

SUBCLASSE Coccidia

ORDEM Eucoccidiida

SUBORDEM Eimeriina

FAMÍLIA Sarcocystidae

SUB-FAMÍLIA Toxoplasmatinae

GÊNERO Toxoplasma

ESPÉCIE Toxoplasma gondii

9

2.3.2- Características Biológicas:

O Toxoplasma gondii é um parasito intracelular obrigatório de baixa

especificidade, como a maior parte dos apicomplexas, pois tem a capacidade

de infectar quaisquer animais homeotérmicos (DUBEY et al., 1970; HASHEMI-

FESHARKI, 1996; ESTEBAN-REDONDO & INNES, 1997; INNES, 1997;

DUBEY et al., 1998; DUBRUMETZ, 1999). Os protozoários que pertencem a

este Filo possuem como principal característica, o complexo apical, permitindo-

o invadir células nucleadas, vários tecidos e líquidos orgânicos. É prevalente na

maioria das áreas do mundo e tem uma significativa importância médica e

veterinária, por causar aborto ou doença congênita em seus hospedeiros

intermediários (TENTER et. al., 2000).

Em algumas circunstâncias a toxoplasmose pode ocorrer em graus

variáveis de morbidade que podem ocasionar seqüelas graves e fatais como

acontece com cepas de maior virulência, uma carga infectante maior, uma via

de penetração mais favorável e um hospedeiro com suas defesas orgânicas

deficitárias. Os grupos de indivíduos mais susceptíveis incluem receptores de

órgãos transplantados, pacientes com certos tipos de câncer e pacientes

portadores da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). Segundo

Dubey (1987), a idade do animal, o gênero e a espécie também influenciam na

susceptibilidade a T. gondii.

2.3.3- Morfologia

Toxoplasma gondii é encontrado sob três formas evolutivas importantes

do ponto de vista da infecção e transmissibilidade:

a) taquizoítos : forma de multiplicação rápida produzida pelo ciclo

assexuado do parasito em células nucleadas dos hospedeiros intermediários

(GROSS et al., 1996; MONTOYA & LIESENFELD, 2004), característica da

infecção aguda. Apresenta a forma de arco com o extremo posterior

arredondado e o anterior afilado. Constitui a forma menos resistente do

10

parasito, sendo facilmente destruída pelas condições ambientais adversas,

pela desidratação, variáveis osmóticas e pela tripsina ou pepsina (JACOBS et

al., 1996). É encontrada na maioria das células e tecidos do hospedeiro e

facilmente em líquidos biológicos, facilitando assim, sua manutenção no

hospedeiro (PARK et al., 1993). Possuem importância epidemiológica por

serem as formas transmitidas verticalmente, via gestação, constituindo um

problema em Saúde Pública (TENTER et al., 2000), e do ponto de vista

médico, esta fase é importante, porque o parasito fica vulnerável aos fármacos

(ACHA & SZYFRES, 1977).

FIGURA 1- Taquizoíto do Toxoplasma gondii. Esquema adaptado de Ajioka et.

al., 2001.

b) bradizoítos: estão contidos no interior dos cistos e caracteriza a

forma de multiplicação lenta, nas infecções crônicas ou assintomáticas. São

resistentes às enzimas proteolíticas e ao esfriamento à 4ºC por 30 dias

(JACOBS et al., 1996; FRENKEL, 1997). Possuem grande tropismo pelo

cérebro, retina, músculos esqueléticos e cardíacos, órgãos ricos em células

estáveis, sendo encontrado com menor intensidade em órgãos como pulmão,

fígado e rins (DUBEY et al., 1998).

c) oocistos/esporozoítos: encontrados nas fezes de felídeos,

resultantes do ciclo enteroepitelial do parasito que ocorre apenas no intestino

de membros da família Felidae (ACHA & SZYFRES, 1987; DUBEY, 1987;

LAPPIN, 1994; DUBEY et. al., 1998; DUBEY, 2004; MONTOYA &

11

LIESENFELD, 2004). Sobrevivem por longos períodos em condições

ambientais adversas, podendo sobreviver por meses a anos em solo úmido

(DUBEY & BEATTIE, 1988) e ser transportado mecanicamente por moscas,

baratas, besouros e outros artrópodes. Sendo, portanto uma forma de

resistência e de disseminação ambiental dessa parasitose.

2.4- Ciclo Evolutivo

O ciclo de vida do T. gondii está bem estabelecido (Fig. 5). É heteroxeno

facultativo, tendo como hospedeiros definitivos representantes da família

Felidae, entre eles o gato doméstico. Os caprinos e outros animais, bem como

os homens são os hospedeiros intermediários (ESTEBAN-REDONDO &

INNES, 1997; DUNCANSON et al., 2001). No hospedeiro definitivo ocorre a

fase sexuada e assexuada, enquanto que no hospedeiro intermediário, passa

por duas fases de desenvolvimento assexuado (BENESON et al., 1982;

BOWIE et al., 1997).

FIGURA 2: Ciclo de vida do T. gondii (Fonte: MEIRELES, 2001).

12

A fase assexuada ou extra-intestinal pode ocorrer em todos

hospedeiros, incluindo felídeos e o homem, contaminando-se através de uma

das três formas do parasito. Ao ingerir as formas infectantes, estas penetram

nas células do hospedeiro, localizando-se no interior do vacúolo parasitóforo,

iniciando o processo de reprodução assexuada por endodiogenia em vários

tipos diferentes de células hospedeiras. A multiplicação ocorre repetidamente

levando ao rompimento das células, sendo os taquizoítos levados pela corrente

sanguínea ou linfática e penetrando em novas células. Após ingerirem oocistos

maduro, da água ou comida contaminada, ocorre a ruptura do oocisto no

intestino liberando os oito esporozoítos, que se multiplicam nas células

intestinais e nódulos linfáticos, e são formados os taquizoítos, que se

multiplicam rapidamente, continuando o processo já descrito anteriormente.

Esse processo de intensa e rápida multiplicação caracteriza a fase aguda da

doença, onde é observada a sintomatologia, em geral aparecendo após os

primeiros 5-15 dias de infecção (DUBEY et al., 1998).

Após esse período de intensa multiplicação, o sistema imune atua nesse

protozoário e o mesmo se refugia dentro do tecido, multiplicando-se

lentamente, formando cistos teciduais com bradizoítos (ou cistozoítos) em seu

interior, caracterizando a fase crônica da doença (DUBEY et al., 1998). Estes

se multiplicam por endodiogenia permanecendo em um estado de latência.

Alguns bradizoítos diferenciam-se em taquizoítos, no intestino delgado, 18

horas após a ingestão de cistos.

Nos hospedeiros intermediários também pode ocorrer transmissão

vertical pelos taquizoítos e a invasão dos tecidos do feto. Um hospedeiro

susceptível pode, durante a amamentação, ingerir taquizoítos eliminados no

leite, com as formas de taquizoítos que chegam ao estômago, algumas serão

destruídas, mas as outras penetram na mucosa oral e poderão evoluir do

mesmo modo que os cistos e oocistos (KAWAZOE, 2005).

Se houver a administração de agentes quimioterápicos ou ocorrência de

moléstias debilitantes, pode levar a reativação da multiplicação e os bradizoítos

diferenciam-se em taquizoítos, proliferando-se.

13

A fase sexuada ou enteroepitelial (Ciclo coccidiano) ocorre apenas no

intestino de membros da família Felidae, após a injestão de alguma das formas

infectantes. De acordo com MOURA (2008), o ciclo intracelular do parasito

parece ser dependente da carga parasitoria induzindo ao ciclo lítico, a

cistogênese ou ao ciclo sexuado do parasito em células epiteliais intestinais

dos felinos, sugerindo ainda que o ciclo do T. gondii nos felinos deve ser

modulado por moléculas presentes nos enterócitos destes animais, tendo em

vista o alto grau de especificidade do parasito por esse único hospedeiro

definitivo.

Após a injestão de qualquer uma das formas infectantes, ocorre no

interior do epitélio intestinal a multiplicação por endodiogenia, seguida de

esquizogonia, produzindo esquizonte maduro ou meronte. As células epiteliais

rompem-se, liberando merozoítos e estes penetram em outras células, dando

início à formação de gametócitos e da fase sexuada. Após maturação dos

gametócitos, o macrogameta (gameta feminino) e o microgameta (gameta

masculino) unem-se formando ovo ou zigoto, seguindo-se a formação de uma

parede dupla, dando origem ao oocisto imaturo não esporulados, que são

eliminados nas fezes de felinos (DUBEY, 2004). Ao encontrar condições

ambientais favoráveis (aeração e temperaturas ideais) ao seu desenvolvimento

se tornam infectantes.

A ingestão de cistos pelo hospedeiro definitivo caracteriza o fechamento

do ciclo evolutivo do parasito. Quando os felídeos ingerem o cisto tecidual, a

parede do cisto é dissolvida por enzimas proteolíticas no estômago e intestino

delgado, liberando os bradizoítos (Figura 3) que infectam as células epiteliais

do intestino delgado dos felinos, se multiplicam por esquizogonia, diferenciam-

se em gametas e formam oocistos (DUBEY, 1994; DUBEY, 1998b). Alguns

parasitos disseminam-se para os tecidos extra-intestinais (DUBEY, 2004). Os

oocistos não esporulados são liberados no lúmen intestinal e eliminados no

meio ambiente junto com as fezes. A esporogonia ocorre fora do hospedeiro e

resulta no desenvolvimento de oocistos infecciosos, contendo dois

14

esporocistos, cada um com quatro esporozoítos (DUBEY & THULLIEZ,1993;

FRENKEL, 2000).

Os felídeos excretam oocistos de T. gondii em fezes 3 a 10 dias depois

de ingerir bradizoítos, 11-17 dias depois de ingerir taquizoítos, e 18 dias depois

de ingerir oocistos esporulados (DUBEY, 2006).

Figura 3- Ruptura da parede do cisto, liberando bradizoítos. Fonte:

LabMaT/UFRN

Os oocistos como são formas ambientais resistentes, podem

permanecer por meses ou anos no ambiente e ao se aderirem ao pasto,

contaminam a água ou vegetais, infectando novos hospedeiros definitivos ou

intermediários.

15

2.5- Diversidade biológica do Toxoplasma gondii

A partir da década de 80 diversos estudos foram realizados usando

diferentes técnicas biológicas, bioquímicas e moleculares, com a finalidade de

caracterizar as cepas deste parasito. Esses estudos forneceram evidências de

que este organismo possui duas linhagens clonais, compostas de cepas

virulentas e de baixa virulência (JONHSON, 1997).

Entende-se por virulência a capacidade apresentada por determinados

organismos para causarem infecção grave em determinadas circunstâncias,

mas os organismos podem ser patogênicos ou não (CLARK & DIAMOND,

1994).

A virulência de cepas de T. gondii é observada pela mortalidade de

camundongos infectados com inóculos graduais de parasitos e o tempo de

sobrevivência daqueles que resistiram à infecção. A classificação das cepas,

em virulentas e avirulentas, tem como base o seguinte critério: (a) Virulentas

são aquelas que causam sintomas agudos e morte em camundongos em uma

semana; (b) Baixa virulência são aquelas que não causam sintomas evidentes

nos camundongos, que se tornam, cronicamente afetados, apresentando cistos

teciduais no cérebro (JONHSON, 1997).

Utilizando este critério, Ferreira (2004), realizou estudo de

caracterização de oito cepas de T. gondii isoladas no Brasil, concluindo que

existe heterogeneidade de virulência entre elas.

De acordo com Literák et. al., (1998) o modo de circulação de cepas

virulentas de T. gondii na natureza é pouco conhecido. É conhecido apenas

que cepas de alta virulência que circulam no meio ambiente não produzem

oocistos, sendo a produção de cistos teciduais em camundongos infectados

experimentalmente induzida pela administração de sulfadiazina (DARDÉ et al.,

1992; DARDÉ, 1996)

Diversos estudos têm mostrado que as linhagens do T. gondii podem ser

classificadas em três grandes grupos clonais genotipicamente distintos, tipo I

(virulenta), II e III (não-virulentas ou com baixa virulência), podendo infectar

16

animais e humanos e, aparentemente, diferem em sua virulência,

comportamento biológicos e padrões epidemiológicos de ocorrência. Existe

uma predominância de cepas do tipo II na toxoplasmose humana e a

freqüência do tipo III foi mais elevada em animais. (HOWE & SIBLEY, 1995;

GRIGG et al., 2001; DIANA et al., 2004; VILLENA et al., 2004).

A possibilidade do genótipo influenciar a gravidade da doença no

humano é observada experimentalmente pela virulência em animais. As

linhagens de T. gondii tipo I são extremamente virulentas, produzindo altos

níveis de parasitemia, com aumento do risco de transmissão transplacentária e

aumento da morbi-mortalidade em fetos em desenvolvimento; as linhagens dos

tipos II e III levam a cronificação da infecção e produção de cistos teciduais

(HOWE & SIBLEY, 1995).

Com relação ao comportamento biológico, as cepas I e II têm sido

associadas à infecção congênita e a cepa III à infecção animal. Essas

observações têm implicações importantes na epidemiologia, gravidade da

doença, manifestações clínicas e eficácia ao tratamento (BOOTHROYD &

GRIGG, 2002).

Dentre as cepas de T. gondii que já foram descobertas, a cepa RH (tipo

I), é a mais virulenta (LEVINE et al, 1980). A cepa P-Br altamente cistogênica

apresenta genótipo híbrido tipo I/III, constituindo-se na primeira cepa de T.

gondii naturalmente híbrida descrita no Brasil (FUX et al., 2003).

Em seus estudos, Ferreira (2004), demonstrou que as cepas brasileiras

apresentam genótipos recombinantes (mistura dos genes dominantes), com

alelos típicos de cepas dos tipos I, II e III na maioria dos loci examinados.

17

2.6- Mecanismos de Invasão da Célula Hospedeira pel o T. gondii

Diversos estudos mostram que o T. gondii é capaz de expressar

diferentes antígenos de superfície (SAG) localizados na membrana do parasito,

os quais são codificados por genes de cópia única e que tem um importante

papel nos mecanismos imune, patogênico e de invasão do parasito (TOMAVO

et al., 1991; AUBERT et al.; 2000). O SAG1 e o SAG2 são agrupados com

genes de cópia única, sendo conhecidos como genes codificadores de

antígenos, nestes se incluem os principais antígenos de superfície de

taquizoítos (PRINCE et al., 1990). O SAG3 e o SAG4 foram encontrados na

superfície de bradizoítos, não tendo sido observado a presença de SAG1 e

SAG2 nesse estágio de desenvolvimento (KASPER et al., 1985; ODBERG-

FERRAGUT et al. 1996). Além desses genes, outros têm sido utilizado na

realização de estudos moleculares, como B1; cB21-4; cS10-A6; GRA1, GRA2,

GRA4, GRA6 e GRA7 (compartimentalizados nos dos grânulos densos); L363

e ROP1 e ROP2 (compartimentalizados nas roptrias) (MARTIN et al., 1998;

AUBERT et al., 2000; FUX et al., 2003).

A invasão da célula pelos taquizoítos é extremamente rápida, durando

de 15 a 40 segundos, sofrendo influências da concentração de íons

extracelulares, da motilidade do taquizoíto e de seus produtos secretados

(SAFFER & SCHWARTZMAN, 1991; MORISAKY et al., 1995; McLEOD, et al.,

1991). A existência do parasito na célula do hospedeiro depende do processo

de invasão celular que é extremamente complexo e coordenado (SAFFER et

al., 1992; DUBREMETZ & SCHWARTZMAN, 1993; CARRUTHERS & SIBLEY,

1997). Os mecanismos que permitem a entrada do parasito na célula do

hospedeiro são movimentos de contração do conóide e as secreções liberadas

pelas organelas presentes no complexo apical, ocorrendo penetração de forma

ativa ou por fagocitose (NICHOLS & CHIAPPINO, 1987; PACHECO-SOARES

& DE SOUZA, 2000).

Inicialmente ocorre o reconhecimento e junção da porção anterior do

parasito na membrana da célula hospedeira, formando uma área de aderência

18

bastante firme. Em seguida ocorre a protrusão do conóide que dá a força

mecânica para a motilidade dos taquizoítos e a secreção de organelas do

parasito que irão facilitar a penetração para o interior da célula (CARRUTHERS

& SIBLEY, 1997). Logo em seguida ocorrem os eventos de secreção das

micronemas, e estas secreções não são transferidas ao vacúolo parasitóforo,

indicando que são importantes para o mecanismo de adesão. Logo após, na

fase de penetração, as roptrias descarregam seus produtos (que estão

associados a eventos precoces na formação do vacúolo parasitóforo), e após 6

horas de invasão esses produtos das roptrias diminuem drasticamente da

membrana do vacúolo.

Após a invasão, os parasitos colidem ao acaso com as células do

hospedeiro e a penetração ocorre só quando há a reorientação da porção

anterior do parasito com a superfície da célula parasitada (PERKINS, 1992),

formando o vacúolo parasitóforo que não se une ao lisossomo e não é

acidificado, permitindo a multiplicação do parasito no vacúolo (SADAK et al.,

1988; BONHOMME et al., 1990; LECORDIER et al, 1999).

Quando o parasito já está dentro do vacúolo, ocorrem as secreções dos

grânulos densos, com um pico máximo 20 minutos após a invasão, estando

envolvidas na sobrevivência intracelular do T. gondii (CARRUTHERS &

SIBLEY, 1997). Com o advento da resposta imune, os taquizoítos formam os

bradizoítos, enquanto o vacúolo parasitóforo dá origem ao cisto tecidual

(CAMUS et al., 1995).

Os mecanismos pelos quais o parasito evita a sua destruição no vacúolo

parasitóforo ainda não estão totalmente esclarecidos (CAMUS et al., 1995).

Afinal, considera-se que a patogênese da toxoplasmose seja resultado direto

de efeito citopático. As características relevantes do parasito na patogenicidade

incluem: capacidade de invadir células, habilidade de utilizar substratos da

célula hospedeira para sobrevivência e multiplicação, e persistência

proliferativa ou cística infectante (FRENKEL, 1961).

19

2.7- Resposta imune ao Toxoplasma gondii

A imunidade protetora contra o T. gondii é específica e ocorre através

dos mecanismos humoral e celular; sendo suas formas extracelulares

diretamente afetadas por anticorpos, o que não acontece como as formas

intracelulares do parasito.

De acordo com Denkers & Gazzinelli (1998) o T. gondii caracteriza-se

por ativar uma marcante resposta imune celular. Uma característica dessa

resposta é que praticamente não existe imunopatologia associada à mesma,

sendo os sintomas mais comuns febre e linfoadenopatia. A resposta imune

induz a elevação da temperatura corpórea, um sinal para a formação dos cistos

teciduais (DUBEY et al., 1998).

Algumas espécies, tais como ratos e galinhas, exibem um alto grau de

resistência natural. A idade também se constitui em um fator importante para a

resistência natural, sendo que os animais jovens, nas diferentes espécies,

apresentam-se mais susceptíveis ao T. gondii (DUBEY, 1993).

O controle da infecção aguda causada pelo Toxoplasma, inicialmente,

deflagra resposta inata, seguida por resposta adquirida antígeno-específica,

que é particularmente crítica para a resolução da infecção por taquizoítos. A

imunidade inata inclui macrófagos, polimorfonucleares, monócitos, células

citotóxicas naturais (Natural Killer), complemento, lisoenzimas e interferon.

Enquanto que a imunidade adquirida-específica caracteriza-se pela presença

de linfócitos T, B, e imunoglobulinas. As células do sistema imune que freiam o

parasito num primeiro momento, são monócitos/macrófagos com o auxílio de

anticorpos específicos da classe imunoglobulinas M (IgM) e imunoglobulinas A

(IgA), e posteriormente, os linfócitos T sensibilizados (CAMARGO, 1995). Após

a fase aguda o hospedeiro desenvolve uma imunidade duradoura e protetora

para re-infecções.

Altos títulos de anticorpos específicos e a citotoxicidade dependente de

anticorpos podem lisar os parasitos extracelulares, bloqueando a invasão da

célula do hospedeiro uma vez que a produção máxima de anticorpos coincide

20

com o desaparecimento de taquizoítos viáveis (FRENKEL, 1990; WASTUNG et

al., 1995)

Sob ação da imunidade celular, o T. gondii, que, na fase aguda da

toxoplasmose, se encontram principalmente na forma de taquizoítos, alguns

são destruídos devido ao rompimento de sua membrana celular, enquanto

outros, na forma de bradizoítos, formam cistos teciduais. Esses cistos,

localizados dentro das células hospedeiras, ficam protegidos da ação do

sistema imune durante a fase crônica da doença (FRENKEL, 1985). Quando,

circunstancialmente, se liberam desses locais, são prontamente eliminados

pela imunidade do hospedeiro (GAZZINELLI et al., 1993).

Os taquizoítos ativam células como macrófagos e células Natural Killer

(NK). No estágio precoce da infecção, os macrófagos produzem citocinas pro-

inflamatórias, induzindo a produção, pelas células NK, de interferon-gama (INF-

γ), as quais promovem ativação macrofágica e aquisição da atividade

microbiostática e a diferenciação das células Th1, que induzem a imunidade

celular protetora contra patógenos intracelulares (GAZZINELLI et al., 1993).

O INF-γ ativa o macrófago para que ocorra a destruição do T. gondii e

ainda inibe o processo alimentar dos taquizoítos, induzindo a diferenciação

desses em bradizoítos, e estimula o afluxo de macrófagos e outras células

defensivas, mantendo os bradizoítos em latência, permanecendo o paciente na

fase crônica (DUBEY et al., 1998, KAWAZOE, 2005).

Quanto aos mecanismos humorais, inicialmente ocorre produção de IgM

e IgA, o que caracteriza a fase aguda da doença, seguida da produção de IgG

em pequenas quantidades e são de baixa avidez. Aumentos nos títulos de IgM

duram um curto período, e a IgA, que não possui capacidade protetora,

servindo apenas como indicadores da doença, desaparece antes dos

anticorpos IgM. As IgG podem persistir com altos títulos e com alta afinidade

por um longo tempo, caracterizando a fase crônica, onde os taquizoítos

intracelulares e bradizoítos persistem, podendo durar por toda a vida do

hospedeiro (CAMARGO, 1995). A IgM e IgA são incapazes de atravessar a

placenta e por esta razão são utilizadas para o diagnóstico da toxoplasmose

21

congênita. A IgG aparece cerca de 8 dias após a infecção, podendo ser

detectada nos testes sorológicos, permanecendo detectáveis enquanto durar a

infecção (KAWAZOE, 2005).

Os taquizoítos de T. gondii podem persistir por longo tempo no cordão

espinhal e cerebral e como cistos viscerais porque a imunidade é pouco efetiva

nos órgãos neuronais (DUBEY, 1998).

A resposta imunológica dos organismos ao T. gondii é complexa e faz

com que o hospedeiro imunocompetente desenvolva imunidade contra o

parasito durante toda a sua vida, tornando-se este hospedeiro muito resistente

a uma reinfecção, uma vez que foi gerada uma memória imunológica de longa

duração (DENKERS et al., 1994).

2.8 – Vacinas contra Toxoplasmose

A infecção por T. gondii raramente apresenta sinais clínicos no

hospedeiro, entretanto, a severidade da doença, quando esta ocorre, está

relacionada à espécie, idade do hospedeiro, prenhes, condições imunológicas

ou nutricionais, virulência do parasito, estágio do parasito e infecções

concomitantes (LUFT & REMINGTON, 1992; DUBEY, 1994; DUBEY et al.,

1994; LIESENFELD et al., 2001; DUBEY & JONES, 2008).

Atualmente o controle desta parasitose depende basicamente do

tratamento curativo dos casos agudos e de medidas profiláticas que impeçam a

disseminação de oocistos esporulados. Entretanto, existe uma crescente

preocupação com o desenvolvimento da resistência as drogas por animais

destinados a alimentação humana. Além disso, não existe nenhuma droga

disponível que possa agir contra o estágio de cisto tecidual do T. gondii e assim

curar pessoas ou animais nesta fase da infecção.

Como este parasito é intracelular obrigatório, os mecanismos imunes

mediados pelas células são componentes importantes para a proteção do

hospedeiro. Por isso o desenvolvimento de vacinas se mostra uma estratégia

promissora para o controle da toxoplasmose. Algumas estratégias bem

22

sucedidas usando vacinas experimentais com parasitos atenuados permitem o

processamento e apresentação correta dos antígenos ao sistema imunológico

do hospedeiro estimulando uma resposta imune eficiente. Contudo vacinas

vivas podem apresentar problemas relacionados com a segurança, a reduzida

vida-útil, e a produção em larga escala; conseqüentemente existe um interesse

continuado em planejar vacinas novas usando antígenos recombinantes

definidos (INNES & VERMEULEN, 2006).

As vacinas são classificadas em três grupos: as vivas (virulentas ou

atenuadas), as de subunidades e as genéticas. As vacinas vivas normalmente

estimulam tanto a resposta imune humoral quanto a celular. As vacinas

constituídas por vírus atenuados preservam os mecanismos de que os vírus

dispõem para se ligar às células hospedeiras, introduzir seu material genético e

comandar a síntese de proteínas virais, ou de antígenos, que serão mostrados

pelas células infectadas. Dessa maneira, essas vacinas estimulam o ataque

pelos linfócitos T e pelos anticorpos sintetizados pelos linfócitos B. Essa dupla

atividade é essencial para o bloqueio da infecção viral e para assegurar a

imunidade. Outra vantagem importante é que essas vacinas freqüentemente

conferem imunidade para o resto da vida e não necessitam de adição de

adjuvantes. São as que mimetizam melhor uma infecção real.

As vacinas de subunidades apresentam, ainda, a incapacidade de se

replicar no hospedeiro ou de reverter à virulência, não sendo transmissíveis

para os indivíduos receptores, o que representa enorme vantagem, do ponto de

vista, de viabilidade como protótipo vacinal. Além disso, elas conferem um

direcionamento da resposta imunológica para o antígeno de interesse vacinal,

oferecendo uma boa indução da resposta imune celular e humoral. Elas

também contêm pouco ou nenhum material estranho e por isso tendem a

produzir menos efeitos adversos ao organismo.

Já as vacinas genéticas, além da imunidade humoral e celular

específica, oferecem vantagens adicionais em relação às vacinas clássicas.

Não causam infecções, pois não possuem os genes necessários para a

replicação do patógeno. Podem ser produzidas em grandes quantidades,

23

utilizando a tecnologia do DNA recombinante, o que diminui os custos da

produção, podem ser construídas para transportar genes de diferentes

linhagens de vírus e bactérias, fornecendo imunidade contra vários patógenos

ao mesmo tempo. Além de tudo, os genes transferidos por essas vacinas

resultam em antígenos específicos, contra os quais a resposta imunológica é

desejada, resultando numa resposta imunitária mais específica por parte do

organismo. O custo de produção das vacinas gênicas em larga escala é

significativamente menor do que o custo de produção das vacinas

recombinantes, peptídeos sintéticos e outras. O controle de qualidade é mais

fácil, e a comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, pois

estas vacinas são estáveis à temperatura ambiente. Estes fatores facilitam o

transporte, a distribuição e o estabelecimento de amplos programas de

imunizações em regiões de difícil acesso.

O desenvolvimento de vacinas para o T. gondii é baseado na

observação de que a exposição ao parasito pode produzir resposta imune de

vida longa, capaz de proteger o hospedeiro contra o desafio secundário com o

parasito (DENKERS & GAZZINELI, 1998). A vacinação tem como objetivo

reduzir as lesões fetais, o número de cistos teciduais, além de prevenir a

formação de oocistos em felinos (DUBEY, 1996). Atualmente não existem

vacinas comerciais para a toxoplasmose humana, que previna a infecção

congênita, ou a formação e reativação de cistos (GOTTSTEIN, 1995).

As tentativas iniciais para induzir proteção contra a toxoplasmose em

camundongos envolveu o uso de taquizoítos vivos atenuados de cepas

mutantes de T. gondii, tais como a cepa ts-4 sensível a temperatura

(GAZZINELLI et al.,1991; HIRAMOTO et al., 2002). Devido à elevada eficiência

em termos de ativação de células T CD4+ e CD8+ e a eficácia de proteção,

vacinas baseadas em taquizoítos vivos não são aplicáveis a humanos, por

causa do risco de efeitos colaterais patogênicos. Portanto, a maioria dos

protocolos mais recentes tem focado no desenvolvimento de vacinas

recombinantes (CAETANO et al., 2006).

24

Como antígeno alvo é grande o interesse em proteínas de superfície

abundantes no taquizoíto, tais como SAG1, SAG2 e SAG3, ancoradas na

membrana do parasito por estruturas de GPI (glicosilfosfatidilinositol) e que

estão envolvidas no processo de invasão da célula hospedeira, sendo suas

seqüências altamente conservadas nas diferentes cepas de T. gondii,

compartilhando um elevado grau de homologia entre cepas tipo I (patogênica e

letal em camundongos) e o tipo II/III (cistogênica) (CAETANO et al., 2006).

De acordo com Montoya & Liesenfeld (2004) uma vacina humana contra

a toxoplasmose é muito desejável, porém, ainda está longe da realidade. Neste

sentido, diversos estudos estão sendo conduzidos na tentativa de desenvolver

uma vacina que ofereça proteção eficaz contra esta parasitose. Em algumas

pesquisas, por exemplo, o objetivo é de induzir a proteção por linfócito T (Th1)

e por respostas humorais, para que a imunidade dure por toda a vida.

Entretanto, hoje isso só ocorre quando existe a infecção natural.

Em 1988, começou a ser comercializada na Nova Zelândia e na Grã-

Bretanha, a vacina viva (TOXOVAX) para o controle de abortos provocados

pelo T. gondii em ovinos, e utiliza taquizoítos da cepa S-48, que não persistem

nos tecidos dos animais, reduzindo a perda de fetos e evitando a formação de

cistos na carne que será usada para consumo. Ela é capaz, ainda, de reduzir a

infecção em ovinos, que em pastejo livre são expostos a contaminação por

oocistos. Se a vacina for usada com este fim, os filhotes (machos e fêmeas)

deverão ser vacinados ao nascimento. (BUXTON et al., 1993; McALLISTER,

2005).

Segundo Parmley et al. (2002), muitas vacinas vivas atenuadas com

cepas de T. gondii tem sido desenvolvidas para serem utilizadas em gatos,

suínos e ovinos, contudo uma vacina recombinante seria mais segura e

eficiente para a saúde humana e animal. Os melhores antígenos para uso em

vacinas seriam os de superfície e os secretores, pois são os melhores alvos da

resposta imune em infecção natural.

25

Nos últimos anos vem se trabalhando experimentalmente com a

utilização de vacinas de DNA para várias doenças como a malária,

criptosporidiose, leishmaniose e toxoplasmose.

As vacinas de DNA contra o T. gondii têm evoluído no uso de vários

tipos de antígenos, principalmente em vacinações estratégica de mucosas,

com focos em vacinações intranasais com antígenos de superfícies de T.

gondii (SAG1). As administrações de SAG1, purificado de lisado do parasito

adicionado, utilizando como adjuvantes a toxina colérica (BOURGUIN et al.,

1993; DEBARD et al., 1996; VELGE-ROUSSEL et al., 2000) ou as

enterotoxinas (BONENFANT et al., 2001) vem proporcionando as induções de

linfócitos T-auxiliar do tipo 1 nas respostas imunológicas.

Os genes codificando os antígenos de superfície do T. gondii, SAG1 e

SAG2, têm sido clonados e expressos em sistemas recombinantes de

organismos procariotos e eucariotos, e tanto proteínas recombinantes como

moléculas de DNA plasmidial tem sido usadas para imunizar camundongos e

outras espécies de roedores. Observou-se que proteínas recombinantes

geralmente induz altos títulos de anticorpos IgG1, que respondem fracamente

ao desafio com cepas patogênicas de T. gondii, e que a melhoria da resposta

depende da combinação com adjuvantes adequados. Por outro lado, vacinas

baseadas em plasmídeos codificando SAG1 e SAG2, foram capazes em

muitos casos dependendo da rota de administração e formulação, de induzir

uma resposta imune celular, com um perfil Th1, induzindo a uma melhor

proteção.

Neste contexto, vetores virais tais como os adenovírus, podem melhorar

a resposta imune em comparação com vacinas sem plasmídeo porque eles são

mais eficientes em transferir as seqüências genéticas e induzir a expressão da

proteína; apresentam baixa patogenicidade o que permite o desenvolvimento

de vetores de imunização praticamente inócuos aos hospedeiros; suas

estratégias de replicação e genoma já são caracterizados, sendo o material

genético viral incapaz de integrar-se ao da célula hospedeira; infectam uma

grande variedade de células, incluindo células chave do sistema imunológico,

26

como as células dendríticas, que pode ser a razão de sua elevada

imunogenicidade quando comparado com outros vírus; são de fácil

propagação, podendo ser obtidos em altos títulos (>109 unidades formadoras

de placas/mL (PFU)), o que permite sua produção em larga escala (BABIUK &

TIKOO, 2000; MERCIER et al., 2002; WORGALL et al., 2004; SOUZA et. al.,

2005). Devido a essas características, adenovírus são ativadores eficiente de

células T CD4+ e CD8+ e são capazes de conduzir a resposta imune para o

perfil Th1 desejado (CAETANO et al., 2006).

Vercammem et. al. (2000) vacinaram camundongos com plasmídeos

liberando antígenos de GRA1, GRA7, e ROP2 e verificaram um estímulo

específico de células T e secreção de IFN-γ, em cultura de baços de animais

vacinados. A taxa de sobrevivência dos animais foi maior no grupo vacinado

(variando de 10 a 90 %) que no controle e o número de cistos cerebrais foi

significativamente menor no grupo vacinado.

Freire et. al. (2003) imunizaram suínos com uma vacina utilizando-se de

um lisado de taquizoítos do T. gondii incorporados ao ISCOM (antígenos

incorporados em complexos de imunoestimulação) e, após o desafio

verificaram que a vacina foi capaz de estimular uma forte resposta imune

humoral.

Garcia et al. (2005) estudaram o uso de proteínas de roptrias do T.

gondii incorporadas ao ISCOM para proteger suínos desafiados com oocistos,

e verificaram a proteção parcial do grupo vacinado, quando comparado ao

grupo controle positivo, contra a formação de cistos teciduais, observando

ainda que, a imunização sistêmica pela via subcutânea, não foi eficaz para

estimular a proteção da mucosa intestinal.

O uso de vacinas pela via nasal associadas a adjuvantes apropriados

pode induzir resposta imune tanto local como sistêmica. Esta via requer menos

antígenos para promover a imunidade do que a via oral, pois a atividade

proteolítica na via nasal é muito menor do que na via oral (VELGE-ROUSSEL

et al., 2000).

27

A imunização de mucosa foi estudada por Debard et al. (1996) através

do uso de vacina aplicada pela via nasal em camundongos utilizando a SAG1

adicionada de toxina colérica, e induziram uma imunidade local e sistêmica que

assegurou proteção parcial e persistente contra a infecção crônica.

Velge-Roussel et al. (2000) verificaram a transferência passiva de

células linfóides de camundongos doadores, imunizados com SAG1 pela via

nasal associada à toxina colérica, foi capaz de reduzir o número de cistos

cerebrais quando comparados ao grupo controle.

Bonenfant et al. (2001) obtiveram proteção contra a formação de cistos

cerebrais do T. gondii em camundongos vacinados pela via nasal e desafiados

com cistos pela via oral. Eles relacionaram esta imunidade aos altos títulos de

anticorpos IgG anti-T. gondii obtidos pela vacinação da SAG1 associada à

enterotoxinas como adjuvante.

Igarashi (2006) verificou a indução de resposta imune humoral e celular

e uma proteção contra a formação de cistos teciduais em camundongos

vacinados pela via nasal com as proteínas recombinantes ROP2, GRA5 e

GRA7 associados à toxina colérica e desafiados com cistos teciduais da cepa

VEG de T. gondii por via oral.

O protótipo de vacina utilizada neste estudo foi fornecido pelo Prof. Dr.

Oscar Bruña-Romero (ICB/UFMG), sendo construída com adenovírus

recombinante deficiente de replicação para expressar SAG1, SAG2, SAG3 e

CMV de T. gondii capaz de induzir uma resposta imune protetora contra um

desafio com o parasito vivo em camundongos. Os resultados mostraram que

todos os adenovírus recombinantes expressando os vários antígenos de

superfície do taquizoíto foram imunogênicos, induzindo altos níveis de IgG2a

antígeno-específico bem como IFN-γ que leva a redução da formação de cistos

cerebrais em camundongos desafiados com a cepa P-Br.

28

3 - JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS

Devido à grande importância da ovinocaprinocultura para o Nordeste, e

em especial para o Rio Grande do Norte, sendo uma atividade que favorece o

aspecto alimentar e econômico, há urgência e necessidade de estudos que

visem contribuir para a identificação do Toxoplasma gondii. Essa parasitose em

determinadas circunstâncias, pode acarretar complicações e mortes em

pequenos ruminantes.

Este trabalho visa produzir conhecimento científico que possa subsidiar

programas de controle de doenças parasitárias, contribuindo desta forma para

a otimização do manejo e da produtividade dos rebanhos, seu bem-estar e

conseqüentemente a saúde humana. A detecção e combate a toxoplasmose,

uma doença bastante negligenciada em nosso meio, terá conseqüências

diretas na ovinocaprinocultura, com à obtenção de melhores níveis produtivos,

melhor qualidade dos produtos e da saúde animal e humana.

Parasitoses como esta se encontram de forma direta, afetando

negativamente a produção de caprinos e ovinos, seja por perdas ocasionadas

devido a distúrbios nas condições fisiológicas dos animais, ou devido à

mortalidade e abortos. Esses fatores estão diretamente relacionados às perdas

ou redução no ganho de peso, queda na produção de leite e baixa na

qualidade e no rendimento das carcaças, além de estarem relacionadas à

baixa reprodução. Indiretamente, com a necessidade de mão de obra

capacitada, custos com o tratamento, baixo preço final com venda de animais

e/ou seus produtos, devendo-se este último fator as restrições impostas pelas

barreiras comerciais existentes, esta doença trás prejuízos econômicos à

cultura.

O leite de cabra é amplamente utilizado na alimentação de crianças que

são alérgicas ao leite de vaca (FIGUEIREDO et al., 2001), portanto, a

necessidade de saber a prevalência desta doença nos rebanhos caprinos, por

meio de teste sorológico rápido, viável, sensível e específico.

29

Uma vez que inexistem dados epidemiológicos sistematizados a respeito

da toxoplasmose caprina nas fazendas da Associação de Criadores de

Caprinos e Ovinos do Sertão do Cabugi e também programas oficiais de

assistência aos pecuaristas, este trabalho é de grande importância já que

propicia a avaliação indireta dos impactos negativos desta parasitose sobre os

rebanhos. A determinação da real prevalência da toxoplasmose em caprinos e

suas implicações epidemiológicas gerando informações cientificas

consistentes, podem subsidiar programas de controle de doenças parasitárias

e contribuir para a otimização da produtividade dos rebanhos quantitativa e

qualitativamente.

A escolha da técnica sorológica Elisa para este estudo de soro-

prevalência deve-se ao fato de que esta é considerada uma das mais sensíveis

para o estudo da toxoplasmose em caprinos (SAWADOGO, 2005), sua

aceitação universal, grande utilização, e ao custo reduzido da técnica. Nas

amostras positivas, foi feito o teste de Elisa de avidez de anticorpos para

detectar se o animal está na fase crônica ou aguda.

Por isso, desenvolver novas estratégias de vacinas contra toxoplasmose

através da construção de adenovírus vacinal recombinante contendo epítopos

protetores de toxoplasmose prevê avanços significativos na geração de novas

ferramentas para o controle dessa parasitose em ovinos e caprinos, dentre os

quais podemos citar: (i) dados epidemiológicos importantes; (ii) bases para o

desenvolvimento de novos fármacos com ação antitoxoplásmica; (iii) alvos

potenciais para fármacos e vacinas; (iv) técnicas de diagnóstico.

A vacinação e a avaliação de imunogenicidade preliminar nos rebanhos,

uma segunda abordagem deste projeto, permitirá abrir nova linha de pesquisa

no LABMAT no que se refere a vacinas e resposta imune, de modo a criar

perspectivas para limitar, a médio e longo prazo, a parasitemia aguda e

proteger os rebanhos caprinos contra a toxoplasmose congênita garantindo

assim uma melhoria nos rebanhos da região central do Cabugi dada a criação

recente de uma Incubadora de Empresas de Agronegócios (INEAGRO

30

CABUGI) voltada para a implementação e criação de rebanhos caprinos e

ovinos.

Por isso, em colaboração com o Prof. Dr. Oscar Bruña Romero,

Professor do Departamento de Microbiologia da UFMG, foram produzidas e

testadas vacinas contra T. gondii. As proteínas de superfície SAG1, SAG2 e

SAG3 encontrada nos taquizoítos do Toxoplasma gondii são moléculas

imunodominantes e vem sendo utilizadas para a produção de vacinas. Estes

antígenos de T. gondii são extensivamente estudados e altamente indutor das

respostas imunes do tipo Th1 e Th2 (KHAN, SMITH e KASPAR, 1988; MINEO

et al, 1993). Assim sendo, esta vacina pretende limitar a parasitemia aguda e

proteger contra a toxoplasmose congênita, protegendo contra a doença fetal

em rebanhos caprinos e ovinos. Além disso, pretendemos fornecer dados

confirmatórios acerca da imunogenicidade desse protótipo de vacina.

3.1 - Objetivo Geral:

Determinar à prevalência de Toxoplasma gondii em caprinos na região

de atuação da Associação de Criadores de Ovinos e Caprinos do Sertão do

Cabugi, validando a eficiência de imunização, visando contribuir para a

melhoria do rebanho.

3.2 - Objetivos Específicos:

● Estudar a ocorrência do Toxoplasma gondii em caprinos.

● Determinar a ocorrência das fases aguda e crônica nesses animais.

• Avaliar a imunogenicidade de diferentes formas de apresentação do

adenovírus vacinal recombinante (protótipo de vacina) contra

toxoplasmose caprina.

31

4.0 - METODOLOGIA E ESTRATÉGIA DE AÇÃO

4.1 – Área de Estudo

O Estado do Rio Grande do Norte, situado na Região Nordeste do

Brasil, apresenta uma extensão territorial de 53.077,3 Km2, o que representa

3,41% de área da Região Nordeste e cerca de 0,62% do território nacional. A

temperatura média anual do estado é em torno de 25,5 0C, com máxima de

31,3 0C e mínima de 21,1 0C, sendo sua pluviometria bastante irregular. Em

cerca de 60% do Estado predominam o clima semi-árido, caracterizado por sua

baixa precipitação pluviométrica, em torno de 400 a 600 mm por ano,

distribuídas as chuvas nos meses de janeiro a abril (IDEMA, 2007). O Estado é

dividido em quatro mesorregiões geográficas: Agreste Potiguar, Leste Potiguar,

Central Potiguar e Oeste Potiguar. (IBGE, 2007).

Os animais testados neste estudo foram provenientes da mesorregião

Central Potiguar, nos municípios de Lajes, Angicos, Pedro Avelino e Afonso

Bezerra. Estes municípios têm em comum clima muito quente e semi-árido,

temperatura média anual de 27,2º C, umidade relativa média anual em torno de

70% e vegetação de caatinga (IDEMA, 2007).

O município de Lajes tem área de 676,42 km², altitude de 199 metros,

precipitação pluviométrica anual média de 414,7 mm. Angicos tem as seguintes

características físicas: área de 741,65 km², altitude de 110 metros, precipitação

pluviométrica anual média de 402,6 mm. O município de Pedro Avelino tem

área de 874,4 km², altitude de 95 metros, precipitação pluviométrica anual

média de 449,5 mm. Afonso Bezerra tem área de 576,2 km², altitude de 62

metros, precipitação pluviométrica anual média de 485,0 mm (IDEMA, 2007).

Este trabalho foi realizado em propriedades incluídas na Associação dos

Criadores de Ovinos e Caprinos do Sertão do Cabugi (ACOSC), Estado do Rio

Grande do Norte. As propriedades estudadas receberam códigos de

identificação para que os respectivos nomes não fossem divulgados garantindo

a isenção durante a realização do estudo.

32

4.2 – Amostragem Amostras de sangue de caprinos de diferentes raças, de ambos os

sexos e com idade entre 5 meses e 7 anos, foram coletadas de agosto de 2007

a outubro de 2008, totalizando 244 animais em 8 fazendas. Estas amostras

foram retiradas de animais destinados à produção leiteira e ao corte. Estes

animais foram marcados com etiquetas e registrados em fichas individuais

contendo as seguintes informações: número do animal, idade, raça e sexo.

4.3 – Coleta do Sangue

Foi retirado sangue através da veia jugular com o auxilio de tubos de

coleta a vácuo tipo vacutainer ® sem anticoagulante estéreis. Estes tubos foram

acondicionado numa caixa de isopor contendo gelo em gel e transportada até o

Laboratório de Biologia da Malária e Toxoplasmose (LaBMaT), do

Departamento de Microbiologia e Parasitologia da Universidade Federal do Rio

Grande do Norte.

4.4 – Antígeno

O antígeno foi preparado por ressuspensão de taquizoítos (cepa RH) em

PBS, pH 7.2 e sonicado em água gelada de acordo com o protocolo de Elsaid

et. al., (1995). Apenas o sobrenadante (200 x g por 10 min) foi considerado

como estrato antigênico do Toxoplasma gondii (AET). A concentração de

proteína foi determinada pelo método de Lowry (1951).

4.5 – Testes sorológicos

No laboratório os tubos foram centrifugados a 2000 r.p.m durante 5

minutos para a obtenção do soro, o qual foi aliquotado, devidamente

identificado e armazenado a -200C até a realização do testes laboratoriais. Em

33

seguida estas amostras foram testadas pelo ELISA - Ensaio Imunoenzimático -

para a detecção de anticorpos IgG específicos para Toxoplasma gondii.

4.5.1 - ELISA

Neste estudo o ELISA foi realizado segundo Clementino et. al. (2007)

com modificações. Desse modo, antes da utilização do ensaio nas amostras

de soros a serem testadas, realizou-se uma padronização como descrito a

seguir. Microplacas de 96 cavidades com fundo chato (Corning Incorporated -

USA) foram utilizadas para testar diferentes concentrações de antígeno

(0,5µg/cavidade e 0,1µg/cavidade de proteína por cavidade), de soros (1:400,

1:100, 1:200) e de conjugado (1:7500, 1:5000) e de peróxido de hidrogênio

(pura e 30 volumes). Os controles negativos também foram testados por

diversas vezes. Após o processo de padronização a técnica foi realizada de

acordo com protocolo abaixo.

As microplacas de poliestireno de 96 cavidades com fundo chato foram

sensibilizadas com 100µL do antígeno em cada cavidade na concentração de

1µg/ml diluído em tampão carbonato/bicarbonato (pH 9,6), seguindo-se

incubação overnight a 4oC. No momento do uso a solução de antígeno foi

desprezada e a placa lavada quatro vezes com solução salina contendo

Tween-20 a 0,05% (PBS-T).

Após secagem das placas por inversão sobre papel de filtro absorvente,

os soros foram diluídos em PBS-T (Tween-20 a 0,05% em PBS pH 7,2), na

diluição de 1:100, e distribuídos 100µL por cavidade da placa, seguida da

incubação a 37oC por 45 minutos. Os soros foram ensaiados em duplicada.

Após este período de incubação, foi realizada uma série de quatro lavagens

com PBS.

Em cada cavidade da placa foram adicionados 100µL de conjugado

imunoglobulinas anti-caprinos IgG, marcado com peroxidase (SIGMA, produto

no A-5420) diluída a 1:5000 em PBS-Tween 20, e posteriormente incubada por

45 minutos a 37oC. Após este período, foram lavadas em uma série de quatro

34

lavagens com PBS. A reação foi revelada por adição de 100µL do substrato

(3µg de σ-phenylinediamine (SIGMA) em 15 mL de solução de ácido cítrico e

3µL de peróxido de hidrogênio – 30volumes) por orifício.

A reação foi interrompida após 20 minutos com 30µL de H2SO4 (4 N) por

cavidade e a leitura realizada em leitor de ELISA (BIO RAD Modelo 3550 com

filtro de 490nm). Foram utilizados como os “controles brancos”, cavidades de

cada placa em número de quatro, com antígeno, conjugado e substrato, sem

soro.

O ponto de corte para o ELISA foi a média de absorbância de três

amostras de soro de ovinos negativos para T. gondii mais três desvios padrão

testados em cada placa. A média dos soros testados em duplicata foi dividida

pelo valor do ponto de corte da placa com o objetivo de determinar o índice de

reatividade (IR). Soros com valores de IR ≥ 1 foram considerados positivos.

4.5.2- ELISA para avaliação da avidez de anticorpos IgG

Paralelamente ao ELISA convencional foi realizado um ELISA para

avaliação da avidez de anticorpo IgG, nas amostras positivas previamente

testadas pelo ELISA convencional, utilizando a uréia como agente dissociante

da ligação antígeno-anticorpo.

A técnica foi realizada de acordo com protocolo descrito por Clementino

et. al. (2007), sendo adotado como pontos de corte os valores citados por

Suarez-Aranda et al. (2000), onde avidez com valores iguais ou maiores que

50% indicam toxoplasmose crônica e valores menores que 50% indicam

infecção aguda ou recente.

As placas foram sensibilizadas e lavadas como descrito anteriormente.

Após secagem das placas, os soros foram diluídos em PBS-T, na diluição de

1:100, e distribuídos nas cavidades da placa, seguida da incubação a 37oC por

45 minutos. Os soros foram ensaiados em duas séries duplicadas na mesma

placa, de tal forma que nas colunas 1 a 6 de cada placa, foram processados os

35

mesmos soros trabalhados nas colunas de 7 a 12, de tal forma que uma

metade da placa era uma réplica idêntica da outra metade.

Após este período de incubação uma série de três lavagens foi

realizada. Na primeira lavagem uma das séries (coluna de 1 a 6) foi lavada com

PBS-T (100µL /cavidade) e a outra série (colunas 7 a 12) com uréia 6M em

PBS-T (100µl/cavidade) sob agitação por 5 minutos. As outras duas lavagens

foram feitas com PBS-T (100µL /cavidade) sob agitação, também em dois

ciclos de cinco minutos. Foi adicionado então, a cada orifício da placa, 100µL

de conjugado na diluição de 1:5000 em PBS-T. A partir da adição do conjugado

o procedimento será idêntico ao descrito para o ELISA convencional.

A avidez de anticorpos IgG será calculada como a razão entre a

absorbância média para cada soro obtida nas cavidades tratadas com uréia

(AU) pela absorbância média de cavidade não tratados (A) expressos em

percentagem: AU/A X 100 (COZON et al., 1998).

4.5.3- ELISA de Titulação

No que se refere à avaliação da efetividade da imunização do rebanho

foi realizado paralelamente ao ELISA convencional, um ELISA de titulação para

detectar até que diluição encontrava-se os anticorpos IgG específicos para T.

gondii. Soros foram diluídos a partir de 1:100 até 1:12.800.

As placas foram sensibilizadas e lavadas como descrito anteriormente.

Após secagem das placas, os soros foram diluídos em PBS-T, nas diluições de

1:100; 1:200; 1:400; 1:800; 1:1600; 1:3200; 1:6400; 1:12800 e distribuídos nas

cavidades da placa, seguida da incubação a 37oC por 45 minutos. Os soros

foram ensaiados em séries duplicadas na mesma placa, de tal forma que uma

coluna era uma réplica idêntica da coluna seguinte, sendo as diluições feitas da

linha 1 (diluição 1:100) em direção a linha 8 (diluição 1:12800) de cada placa.

Após este período de incubação, foi realizada uma série de quatro lavagens

com PBS. Os procedimentos seguintes foram idênticos ao descrito para o

ELISA convencional.

36

O ponto de corte para o ELISA foi a média de absorbância de três

amostras de soro de caprinos negativos para T. gondii mais três desvios

padrão testados em cada placa. A média dos soros testados em duplicata foi

dividida pelo valor do ponto de corte da placa com o objetivo de determinar o

índice de reatividade (IR). Soros com valores de IR ≥ 1 foram considerados

positivos.

4.6 - Imunização de caprinos

Para a realização da imunização, 24 caprinos tiveram seu sangue

coletado, como descrito anteriormente, antes da primeira imunização, com a

finalidade de descobrir se tais animais apresentavam anticorpos IgG

específicos para o T. gondii. Em seguida, os animais foram separados

aleatoriamente grupos de 5 caprinos (com exceção do grupo controle que

contava com apenas 4 animais) que receberam três doses (109 PFU –

quantidade de partículas infecciosas individuais – cada dose) do protótipo de

vacina com adenovírus recombinante deficiente de replicação, com cerca de 25

dias de intervalo de acordo com protocolo cedido pelo Prof. Dr. Oscar Bruña-

Romero. Antes de cada imunização amostras de sangue destes caprinos foram

coletadas e o soro armazenado a – 20º C até a realização do teste de ELISA.

O grupo 1 recebeu a AdSAG1, o grupo 2 recebeu AdSAG2, o grupo 3

recebeu AdSAG3, o grupo 4 recebeu AdCMV e o grupo 5 recebeu PBS 1X pH,

7.2, atuando como grupo controle. A partir daí foram avaliados os níveis de

anticorpos IgG anti-T. gondii antes e depois do esquema de imunização.

4.7 – Processamento e análise de dados

Os dados obtidos foram tabulados e analisados por programas

estatísticos. O teste Qui-quadrado foi utiliz!do para avaliar as diferenças entre

as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade e a absorbância nos

grupos de animais estudados. O teste t de Student ANOVA foi utilizado para

37

averiguar as diferenças estatísticas na quantificação de anticorpos IgG antes e

após a imunização. Para todos os testes o nível de significância foi de 5%.

38

5 – RESULTADOS

5.1 – Prevalência de anticorpos anti- Toxoplasma gondii no rebanho

caprino

Observou-se que a melhor concentração do antígeno capaz de distinguir

os soros reativos dos não reativos testados em diferentes diluições foi a de 0,1

µg de proteína por cavidade, com o soro diluído a 1:100. Em relação ao

conjugado e o peróxido de hidrogênio, optou-se por utilizar a diluição 1:5000 e

30 volumes respectivamente.

Das 244 amostras de soros de caprinos analisados, 47,13% (115/244)

foram considerados reativos para o Toxoplasma gondii pelo teste de ELISA

(Tabela 1).

Com relação ao sexo, as maiores prevalências foram observadas nas

fêmeas, sendo 92,2% (106/115) animais reagentes para IgG anti-toxoplasma

gondii, enquanto que 7,8% (9/115) animais eram machos, não sendo esta

diferença significativa pelo teste do Qui-quadrado (p>0,05).

De acordo com a faixa etária, do total dos 115 animais sororeativos,

26,9% (31/115) estavam entre 0 e 12 meses; 14,8% (17/115) entre 13 e 24

meses; 8,7% (10/115) entre 25 e 36 meses e 49,6% (57/115) mais de 37

meses. A avaliação estatística desta variável pelo Qui-quadrado mostrou existir

diferença significativa (p<0,05).

Em relação à raça, 44,3% (51) dos animais eram Sâanen, 10,4% (12)

Moxotó, 16,7% (18) Pardo, 14,8% (17) Anglo, 14,8% (17) Sem Raça Definida.

A análise dos resultados para esta variável, pelo Qui-quadrado, mostrou que

não houve diferença significativa (p>0,05).

No que se refere à localidade das fazendas, 17,2% dos animais (42)

sororeativos encontravam-se em Lajes; 10,2% (25) em Angicos; 7,8% (19) em

Pedro Avelino e 11,9% (29) em Afonso Bezerra. O teste Qui-quadrado mostra

que para esta variável estas diferenças foram estatisticamente significativas.

39

Em relação à propriedade estudada, a fazenda BV encontrava-se com

1,64% (4); SG com 5% (12); DI 5,7% (14); SR1 5% (12); BN 10,2% (25); RF

3,7% (9); AF 4,1% (10); SR2 8,6% (21); UN 3,3% (8). O teste do Qui-quadrado

mostrou que houve diferença estatística significativa para esta variável. A

tabela 2 resume todas as variáveis analisadas, bem como a prevalência

observada.

TABELA 1- Distribuição da soro-reatividade para IgG anti-Toxoplasma gondii em caprinos da região do Sertão do Cabugi no Rio Grande do Norte, em comparação com as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade.

ELISA

REATIVO

(%) NÃO-REATIVO

(%) X² P TOTAL (%)

SEXO MACHO 09(3,7) 11(4,5) 0,04 0,84 20(8,2)

(%) FÊMEA 106(43,4) 118(48,4) 224(91,8)

≤12 31(12,7) 23 (9,4) 54(22,1)

IDADE EM 13 – 24 17(7) 36(14,7) 17,04 0.0007 53(21,7)

MESES (%) 25 – 36 10(4,1) 27(11,1) 37(15,2)

≥37 57(23,4) 43(17,6) 100(41)

PURA 98(40,1) 118(48,4) 216(88,5)

RAÇA (%) SRD 17(7) 11(4,5) 2,34 0,12 28(11,5)

LJ 42(17,2) 82(33,7) 124(50,8)

LOCALIDADE AG 25(10,2) 11(4,5) 19,68 0,0002 36(14,8)

(%) PA 19(7, 8) 12(4,9) 31(12,7)

AB 29(11,9) 24(9,8) 53(21,7)

BV 4(1,64) 9(3,7) 13(5,3)

SG 12(5) 2(0,8) 14(5,7)

DI 14(5,7) 48(19,7) 62(25,4)

PROPRIEDADE SR1 12(5) 23(9,4) 45,2 0,0000 35(14,3)

(%) BN 25(10,2) 11(4,5) 36(14,8)

RF 9(3,7) 7(2,9) 15(6,2)

AF 10(4,1) 5(2) 16(6,6)

SR2 21(8,6) 9(3,7) 30(12,3)

UM 8(3,3) 15(6,1) 23(9,4) SRD = Sem Raça Definida; LJ = Lajes; AG = Angicos; PA = Pedro Avelino; AB = Afonso Bezerra

40

5.2 – Determinação da avidez de anticorpos anti- T. gondii, da classe IgG

em soros de caprinos naturalmente infectados, avali ados pelo ELISA

Foi realizado o ELISA de avidez de anticorpos IgG como indicativo de

infecção recente ou crônica pelo T. gondii nos soros de 115 caprinos reativos

pelo ELISA tradicional. Destes, 103 (89,6%) soros apresentaram anticorpos

IgG de alta avidez (infecção crônica) e 12 (10,4%) possuíam anticorpos IgG de

baixa avidez (infecção aguda). Comparando com o total dos soros estudados

(244), 42,2% dos animais estavam provavelmente na fase crônica, 4,9% na

fase aguda e 52,9% não tinham anticorpos IgG anti-T. gondii.

Ao analisar a correlação de anticorpos IgG anti- T. gondii com as

variáveis idade, raça, sexo, localidade e propriedade pelo teste do Qui-

quadrado (Tabela 2) foi encontrado diferença estisticamente significativa para a

variável sexo (p<0,05). Para todas as outras variáveis estudadas foi

demonstrado não existir diferença estatística significativa (p>0,05).

Nas figuras 4, 5, 6, 7 e 8 são apresentados os percentuais de anticorpos

IgG de alta e baixa avidez para o T. gondii, para as variáveis sexo, idade, raça,

fazenda e cidade respectivamente. Em todas as figuras observa-se que o

percentual de animais apresentando anticorpos IgG de alta avidez é mais

elevado quando comparado com os resultados obtidos para anticorpos de

baixa avidez na maioria das variáveis estudadas, com exceção da variável

fazenda.

41

TABELA 2- Distribuição da avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em caprinos da região do Sertão do Cabugi no Rio Grande do Norte, em comparação com as variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade.

AVIDEZ IgG

ALTA (%) BAIXA(%) X² P TOTAL (%)

SEXO MACHO (%) 5(4,35) 4(3,48) 12,08 0,0005 9(7,8)

FÊMEA (%) 98(85,22) 8(6,95) 106(92,2)

≤12 28(24,35) 3 (2,62) 31(26,96)

IDADE EM 13 – 24 15(13,04) 2(1,74) 4,19 0,24 17(14,78)

MESES (%) 25 – 36 7(6,08) 3(2,62) 10(8,69)

≥37 53(46,08) 4 (3,48) 57(49,57)

PURA 89(77,4) 9(7,8) 98(85,22)

RAÇA (%) SRD 14(12,2) 3(2,6) 1,11 0,29 17(14,78)

LJ 35(30,43) 7(6,09) 42(36,52)

LOCALIDADE AG 24(20,87) 1(0,87) 2,65 0,45 25(21,74)

(%) PA 17(14,78) 2(1,74) 19(16,52)

AB 27(23,48) 2 (1,74) 29(25,22)

BV 2(1,74) 2(1,74) 4(3,48)

SG 11(9,56) 1(0,87) 12(10,43)

DI 13(11,3) 1(0,87) 14(12,17)

PROPRIEDADE SR1 9(7,8) 3(2,6) 8,38 0,29 12(10,43)

(%) BN 24(20,87) 1 (0,87) 25(21,74)

RF 8(6,95) 1(0,87) 9(7,8)

AF 9(7,8) 1(0,87) 10(8,69)

SR2 20(17,4) 1(0,87) 21(18,26)

UM 7(6,1) 1(0,87) 8(6,95) SRD = Sem Raça Definida; LJ = Lajes; AG = Angicos; PA = Pedro Avelino; AB = Afonso Bezerra

42

Alta Avidez Baixa AvidezMachos Fêmeas

Sexo

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sor

os T

esta

dos

(%)

55,6

44,4

92,5

7,5

Figura 4. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação ao sexo.

Alta Avidez Baixa Avidez

=12 13-I24 25-I36 =37

Idade (meses)

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

So

ros

Tes

tad

os

(%)

90,3

9,7

88,2

70

93

11,8

30

7

Figura 5. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação a idade.

43

Alta Avidez Baixa AvidezPura SRD

Raça

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Sor

os T

esta

dos

(%)

88

914

3

Figura 6. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação a raça (SRD = Sem Raça Definida).

Alta Avidez Baixa AvidezBN SG DI SRL BN RF AF SR UN

Fazenda

0

20

40

60

80

100

Sor

os T

esta

dos

5050

8,3

91,7

83,3

96

88,9

7,2

92,8

16,7

4

11,1

95,2

87,5

12,5

4,8

10

90

Figura 7. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação as fazendas.

44

Alta Avidez Baixa Avidez

LG AG PA AB

Cidade

0

20

40

60

80

100S

oros

Tes

tado

s (%

)

16,7

4

89,5

6,9

88,388,3

96

10,5

93,1

Figura 8. Avidez de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii em 115 soros caprinos do Sertão do Cabugi, com sorologia positiva para Toxoplasma gondii, em relação a cidade.

45

5.3 – Avaliação da imunogenicidade em grupos de cap rinos imunizados

com vacina de adenovírus recombinantes expressando SAG1, SAG2,

SAG3 e CMV.

Os adenovírus recombinates codificando as preteinas SAG1 (AdSAG1),

SAG2 (AdSAG2), SAG3 (AdSAG3) e CMV (AdCMV) foram usados em

vacinação de caprinos de acordo com o protocolo descrito anteriormente.

A figura 9 mostra que nos soros testados dos animais imunizados com

AdSAG1. Após a aplicação da primeira imunização houve um aumento

significativo (p ≤ 0,05) nos níveis séricos de IgG com posterior diminuição após

a aplicação da segunda e terceira imunização. Percebe-se que houve uma

pequena variação individual verificada pela diminuição do desvio padrão. No

que se refere as diluições dos soros, percebe-se também esta diminuição nos

níveis de anticorpos séricos após as sucessivas imunizações até a diluição

1:800.

Com relação aos soros testados dos animais imunizados com AdSAG2 a

figura 10 mostra que existiu uma grande variação individual, verificada pelo

aumento no desvio padrão, entretanto isto é compreensível uma vez que não

estamos trabalhando com camundongos isogênicos. Percebemos que ocorreu

um incremento significativo nos níveis séricos de IgG após a terceira

imunização. Isto também se verifica até a diluição do soro de 1:800.

Já os soros dos animais imunizados com AdSAG3 a figura 11 mostra

que os indivíduos tiveram uma grande variabilidade individual. Houve

diminuição na produção de anticorpos após a aplicação da primeira imunização

com quedas subseqüentes após a segunda e terceira imunizações. Essa

diminuição foi verificada até a diluição de 1:800. Estes animais apresentaram

altos títulos de anticorpos IgG. Na imunização com AdSAG3, apesar de haver

uma tendência de crescimento da absorbância, nota-se que após a primeira

imunização houve queda na absorbância.

No que se refere às imunizações com AdCMV, observa-se pela figura

12, que houve grande variabilidade individual. Percebe-se que, após a primeira

46

e segunda imunização se mantém a média na produção de anticorpos, com

queda após a terceira imunização. Na imunização com AdCMV existe uma

tendência à manter um platô.

Com relação ao grupo controle (que recebeu apenas solução salina

PBS), os níveis séricos de anticorpos IgG se mantém numa média até após a

segunda imunização, com queda nesses níveis após a terceira imunização,

como mostrado na figura 13. O nível de positividade inicial já era elevado, mas

não houve melhora com a imunização. Houve uma tendência a um platô, com a

manutenção ou diminuição de absorbância.

47

5.3.1- Vacina AdSAG1

A)

B)

Figura 9. Média de Absorbâncias de anticorpos IgG anti-Toxoplasma gondii

nos soros de caprinos da Fazenda DI, imunizados pela via intramuscular com a

vacina AdSAG1 (expressando o adenovírus recombinante proteína SAG1 do

Toxoplasma gondii, após três séries de imunização com intervalo de 25 dias.

(A) Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B) Absorbância dos soros na

diluição 1:100 até 1:12.800.

48


A)

B)






diluição 1:100 até 1:12.800.

49


A)

B)






diluição 1:100 até 1:12.800.

50

5.3.4- Vacina AdCMV

A)

B)



vacina AdCMV (expressando o adenovírus recombinante proteína CMV do



diluição 1:100 até 1:12.800.

51

5.3.5- PBS 1x

A)

B)



solução de PBS usado como controle negativo, após três séries de imunização

com intervalo de 25 dias. (A) Absorbância dos soros na diluição 1:100; (B)

Absorbância dos soros na diluição 1:100 até 1:12.800.

52

6 - DISCUSSÃO

A toxoplasmose é uma relevante zoonose mundial, sendo os pequenos

ruminantes bastante importantes na cadeia epidemiológica, como é o caso dos

caprinos. Por serem importante fonte de alimentação humana, os produtos de

origem caprina, quando contaminados pelo protozoário Toxoplasma gondii e

inadequadamente preparados podem acarretar problemas de saúde pública,

sendo a toxoplasmose, comumente, negligenciada em países em

desenvolvimento, o que acarreta perdas reprodutivas e econômicas nos

rebanhos, principalmente em áreas rurais e peri-urbanas.

O seu diagnóstico é bastante complexo, podendo ser feito por métodos

parasitológicos e/ou sorológicos. Como esta infecção pode assumir quadros

clínicos facilmente confundidos com várias infecções, além da grande maioria

ser assintomática, tanto em humanos como em animais; por isso a detecção de

anticorpos através da sorologia, é fundamental para o tratamento e controle da

toxoplasmose (FIGUEIREDO et al., 2001; SILVA et al., 2002).

A escolha do ELISA – Ensaio Imunoenzimático – para este estudo se

deve ao fato desta técnica ser considerada sensível, específica, simples,

pratica, rápida, de boa reprodutibilidade e de leitura automatizada (GARCIA-

VAZQUEZ et al., 1993; SILVA et al., 2002), além de oferecer informações

adicionais sobre a evolução dos níveis de anticorpos específicos da

toxoplasmose (CONDE et al., 2001).

A soro-prevalência da toxoplasmose caprina é bastante variável,

mostrando uma freqüência de reações positivas, variando de 0 a 100% em

diferentes regiões do mundo (TENTER et al., 2000; OLIVIER et al., 2007). Esta

variabilidade nas taxas de infecção da toxoplasmose caprina é multifatorial e se

deve provavelmente a diferenças entre testes sorológicos utilizados, idade,

sexo, habito alimentar e manejo dos animais, fatores epidemiológicos,

localização geográfica, condições ambientais, tipos de fauna, hábitos culturais,

grau de desenvolvimento do país, infra-estrutura hídrica e sanitária (DUBEY,

1990; TENTER et al., 2000; SILVA et al., 2003).

53

Neste trabalho realizamos o segundo estudo da toxoplasmose caprina

no Estado do Rio Grande do Norte, sendo o primeiro estudo realizado por Neto

et al. (2008) na região Seridó Oriental utilizando a técnica de

imunofluorescência (RIFI). No presente estudo, através do ELISA, avaliou-se a

frequência de anticorpos IgG anti-T. gondii no soro de caprinos de diferentes

municípios pertencentes a Associação de Criadores de Ovinos e Caprinos de

Sertão do Cabugi (ASCOC).

No mundo, os inquéritos sorológicos realizados em diferentes países,

mostram uma freqüência bastante variável, sendo demonstrado por alguns

estudos feitos por Karaca et al. (2007) na Turquia (80,61%), Rodríguez-Ponce

et al. (1995) na Espanha (63,3%), Prelezov et al. (2008) na Bulgária (59.8%),

Bisson et al. (2000) na Uganda (31%), Jittapalapong et al. (2005) na Tailândia

(27,9%), Van der Puije et al. (2000) em Ghana (26,8%), Hamzavi et al. (2007)

no Iran (23,7%), Hashemi-Fesharki (1996) no Irã (19,2%), Massala et al. (2003)

em Sardínea, Itália (12,3%), Garcia-Vazquez et al. (1993) no México (3,2%).

No Brasil, esta variação na soro-prevalência também ocorre, como foi

demonstrado pelos estudos feitos por Chiari et al. (1987) em Minas Gerais

(92.4%), Carneiro (2006) em Minas Gerais (43%), Silva et al. (2003) em

Pernambuco (40,4%), Sella et al. (1994) em Londrina (30,7%), Pita-Gondim et

al. (1999) na Bahia (28.9%), Figliuolo et al. (2004) em São Paulo (28,7%),

Cavalcante (2004) no Ceará (25,1%), Uzêda et al. (2004) na Bahia (16,4%),

Serra-Freire et al. (1994) no Rio de Janeiro (15,8%), Mainardi et al. (2003) em

São Paulo (14,5%). Em estudos recentes realizado por Modolo et al. (2008) em

cidades do Estado de São Paulo, foi encontrado uma prevalência de 78,20%

em São Paulo, Mogi-Guaçu 68,57%, Piquete 81,25%, São José dos Campos

41,86%.

A soro-prevalência da toxoplasmose observada por Neto et al. (2008)

em caprinos da microrregião Seridó Oriental no Rio Grande do Norte (30,6%)

foi mais baixa do que a encontrada neste estudo (47,13%). Essas diferenças

encontradas dentro do mesmo Estado podem ser devido a vários fatores como,

por exemplo, as características dos animais amostrados, a presença ou não de

54

gatos, diferentes condições climáticas, tipos de manejo e principalmente em

relação às diferenças nas técnicas utilizadas, uma vez que nesse estudo atual,

foi usado o ELISA, bem mais sensível que o RIFI anteriormente usado.

Assim sendo, algumas variáveis observadas neste estudo foram

confrontadas com os dados de soro-reatividade buscando correlacioná-los com

a prevalência. Deste modo, a reatividade e o sexo foi avaliada neste estudo. O

rebanho era constituído por 20 machos sendo 3,7% reativos ao T. gondii e 224

fêmeas, das quais 43,4% eram reativas, não apresentando diferença estatística

significativa (p>0,05), indicando que na região estudada, a taxa de soro-

positividade não esta relacionada ao sexo dos caprinos. Entretanto, é

importante atentar para o fato que o número de machos estudados foi

pequeno, para que se pudessem fazer comparações.

Estes dados são corroborados com os encontrados por Chiari et al.

(1987), Bisson et al. (2000), Cavalcante (2004), Carneiro (2006), que também

não encontraram associação significativa entre o sexo e a presença de

anticorpos anti-T. gondii. Alguns estudos sugerem que as fêmeas são mais

susceptíveis ao T. gondii do que os machos (ALEXANDER et al., 1988; VAN

DER PIUJE et al., 2000; SILVA et al., 2003; UZÊDA et al., 2004;

JITTAPALAPONG et al., 2005; NTAFIS et al., 2007; ACICI et al., 2008). Isto

ocorre provavelmente devido a possível imunossupressão relacionada a

gestação e lactação (UZÊDA et al., 2004), e ao tipo de manejo, uma vez que as

fêmeas destinadas a exploração leiteira encontram-se em manejo intensivo de

criação (SILVA et al., 2003).

Em relação à idade, observou-se que houve diferença estatisticamente

significativa (p<0,05). Os animais com idade superior aos 37 meses

apresentaram índice de reatividade significativamente maior do que os animais

mais jovens. Provavelmente este fato está relacionado à maior probabilidade

de infecção uma vez que permanecem por mais tempo expostos ao agente

etiológico e aos fatores de risco, corroborando com diversos outros estudos

(CHIARI et al., 1987; RUPPANNER et al., 1978; MACHADO & LIMA, 1987,

SELLA et al., 1994; FIGUEIREDO et al., 2001; FIGLIUOLO et al., 2004;

55

CAVALCANTE, 2004; JITTAPALAPONG et al., 2005; CARNEIRO, 2006).

Nossos resultados, contudo vão de encontro aos resultados obtidos por Garcia-

Vazquez et al. (1993) e Uzêda et al (2004) que não encontraram diferença

significativa para a variável idade.

Nos animais incluídos no grupo etário ≤12 meses que tinham idade

superior a cinco meses, verificou-se uma porcentagem de 12,7% de animais

positivos, indicando infecção recente, porém não é possível afirmar que a

contaminação ocorreu passivamente pelo colostro ou de outra forma, uma vez

que a presença de anticorpos no leite materno é verificada até os sete meses,

não podendo ser descartada a infecção congênita.

Outra variável estudada foi a raça dos animais analisados. Os animais

foram agrupados em duas categorias: raça pura e sem raça definida (SRD).

Neste caso, não houve diferença estatística entre os animais com raça pura e

os animais sem raça definida no tocante a prevalência de anticorpos anti-T.

gondii. Este resultado foi similar aos estudos realizados por Van der Puije et al.

(2000), Cavalcante (2004) e Uzêda et al. (2004). Em contrapartida,

Jittapalapong et al. (2005), Borde et al. (2006) e Carneiro (2006) observaram

em seus estudos, uma associação significativa entre as raças e a presença do

T. gondii. Este fato pode estar relacionado às diferenças no manejo dos

animais nestas áreas, onde os animais de raça pura são cuidados em

condições diferenciadas dos animais sem raça definida, levando a um aumento

nas taxas de positividade dessa parasitose em diferentes regiões e países

(SILVA et al., 2003; JITTAPALAPONG et al., 2005). Isto não foi observado em

nosso trabalho, uma vez que os animais em todas as propriedades estudadas

são submetidos a um mesmo manejo, sendo confinados juntos e alimentados

da mesma maneira, não importando a raça.

Em relação à variável localidade, verificou-se uma diferença significativa

entre as quatro cidades estudadas. Esta diferença, contudo, deve ser avaliada

com cautela devido ao pequeno número de amostras analisadas em Angicos,

Pedro Avelino e Afonso Bezerra comparados ao número de amostras de Lajes.

56

Com relação as nove fazendas avaliadas, observou-se que houve

diferença estatisticamente significativa no que se refere a presença de

anticorpos específicos para T. gondii. Essa estratégia foi aventada, pois a

maioria dos estudos realizados para identificar a prevalência da toxoplasmose

em caprinos não abordam estes dois parâmetros citados acima. O que se tem

observado é que alguns estudos relacionam a soro-reatividade com

mesorregiões diferentes (CAVALCANTE, 2004; CARNEIRO, 2006).

O manejo, exploração, clima, temperatura, umidade relativa e a

precipitação pluviométrica média anual nos municípios são similares. Diversos

estudos demonstram que existe relação entre fatores ambientais e a presença

de T. gondii (RODRIGUEZ-PONCE et. al., 1995; PITA-GONDIM et. al., 1999;

BISSON et. al., 2000; VAN DER PUINJE et. al., 2000; SILVA et. al., 2003;

JITTAPALAPONG et. al., 2005). Sabe-se que animais de um mesmo rebanho

reagem de forma homogênea quando são mantidos em condições

semelhantes, enquanto a dispersão da toxoplasmose pode variar entre os

animais de diferentes procedências (CARNEIRO, 2006).

O elevado percentual de caprinos reativos para T. gondii nestes

municípios pode ser explicada entre outros fatores pela própria resistência dos

oocistos no ambiente. A temperatura média anual e a precipitação

pluviométrica dos municípios estudados, apesar de ser bem diferente dos

locais onde os oocistos permanecem viáveis por mais de um ano, também se

mostram favoráveis ao desenvolvimento e manutenção dos oocistos de T.

gondii no meio ambiente (DUBEY & BEATTIE, 1988). A temperatura de 25 º C

é considerada como a temperatura ideal para o desenvolvimento dos oocistos.

Também tem sido observado que em regiões que apresentam temperaturas

mais baixas, as proporções de caprinos positivos para T. gondii, são menores

quando comparadas com regiões de temperaturas mais elevadas (FRENKEL &

DUBEY, 1973; RODRÍGUEZ-PONCE et al. 1995).

Chiari et al. (1987), avaliaram a soro-epidemiologia da toxoplasmose

caprina em Minas Gerais em função da origem dos rebanhos (urbanos, peri-

urbanos e rurais), bem como consideraram as diferenças climáticas e

57

geográficas e encontraram diferença significativa no tocante a procedência do

rebanho, onde observou-se um percentual de soro-reativos de 92,4% para os

rebanhos urbanos, 70% para os rebanhos peri-urbanos e 32% para os

rebanhos rurais.

6.1- Avidez de anticorpos IgG anti- T. gondii em soros de caprinos

naturalmente infectados.

Nas reações imunológicas, a interação de um anticorpo com um

antígeno multivalente é feito por meio de ligações químicas, e o termo que

define a força destas ligações é denominado avidez. Na resposta imunológica

primária, os anticorpos desencadeados por um estímulo antigênico

apresentam, inicialmente, baixa avidez. À medida que a resposta imunológica

se torna amadurecida, os anticorpos da classe IgG também aumentam sua

avidez. Desta forma a determinação de avidez de anticorpos IgG anti-T. gondii

é utilizada como marcador de infecção recente ou tardia na toxoplasmose.

Tradicionalmente, se o percentual da avidez de IgG for maior que 60%, é

provável que a infecção tenha ocorrido há mais de 4 meses e que o anticorpo

IgM presente possa ser apenas anticorpo residual, geralmente associado com

baixos índices nos imunoensaios (CAMARGO et al., 1991; EISEN & SISKIND,

1964).

De acordo com Camargo et al. (1991), no início da infecção

toxoplásmica, existem elevados níveis de anticorpos IgG com baixa avidez

para antígenos correspondentes e posteriormente após meses, os anticorpos

IgG apresentam alta avidez, indicando infecções crônicas. Entretanto Figliuolo

et al. (2004) afirmam que os altos títulos de anticorpos em soros de caprinos

não é o bastante para se associar com a fase clínica da infecção nem para

confirmar a fase aguda nos animais, pois os títulos podem permanecer altos

por longo período.

58

A avidez de anticorpos para um dado antígeno é um fenômeno biológico

e, por esta razão, variações individuais da resposta imunológica podem,

naturalmente, ser encontradas. Alta avidez de IgG possui um bom valor de

predição de que a infecção aguda ocorreu há não menos que 4 meses. Por

outro lado, nada se pode afirmar nos casos de avidez baixa ou intermediária, já

que há grande variação interindividual para o tempo máximo de persistência de

baixa avidez. Em outras palavras, o teste de avidez é mais uma ferramenta

auxiliar utilizada para definir o período mínimo decorrido desde o

estabelecimento da infecção, caso os valores estejam elevados (HEDMAN et

al., 1989; CAMARGO et al., 1991).

Desta forma, nos animais positivos observados neste estudo foi

realizada a determinação da avidez de IgG, no intuito de sugerir o tempo de

infecção. Os resultados mostram que a maioria dos soros avaliados tinham

anticorpos de alta avidez, indicando nesses rebanhos, que um considerável

percentual de animais eram portadores de infecção crônica. O elevado

percentual de animais apresentando anticorpos de alta avidez, provavelmente

deve-se a um maior tempo de infecção, superior a 100 dias (SUAREZ-

ARANDA et al., 2000). Estes resultados são similares aos encontrados por

Cavalcante (2004) que estudou o rebanho caprino no Ceará e Carneiro (2006)

que analisou o rebanho caprino de Minas Gerais.

As variáveis sexo, idade, raça, localidade e propriedade foram

analisadas em relação aos anticorpos de avidez. Foi encontrado associação

estatisticamente significativa apenas para a variável sexo (p<0,05), diferindo

dos resultados encontrados por Cavalcante (2004) e Carneiro (2006) que não

encontraram associação entre o sexo e a presença de anticorpos IgG anti-T.

gondii. Além disso, as fêmeas apresentaram elevados percentuais de

anticorpos de alta avidez quando comparados aos machos. Entretanto, com

relação aos anticorpos de baixa avidez, as fêmeas apresentaram percentuais

inferiores aos dos encontrados para os machos. Isto provavelmente se deve ao

fato do pequeno número de machos analisados.

59

A ocorrência de animais com anticorpos de baixa avidez nas faixas

etárias de 25-36 meses e maior ou igual a 37 meses apontam para ocorrência

de fêmeas em idade reprodutiva, em fase aguda da toxoplasmose. Isto

provavelmente permitirá casos de transmissão congênita do parasito, com

possibilidade de perdas por abortos ou má-formação fetal.

Os animais de raça pura apresentaram maiores percentuais de

anticorpos de alta avidez (77,4%) do que os animais sem raça definida

(12,2%). De acordo com Jittapalapong et al. (2005) e Borde et al. (2006)

animais de raça pura são mais susceptíveis a infecção por T. gondii. Além

disso, neste estudo o número de animais de raça pura analisados e reativos

para o T. gondii era superior aos animais sem raça definida.

Com relação à localidade, altos percentuais de anticorpos de alta avidez

foram encontrados em todos os municípios, indicando que os animais do

Sertão do Cabugi foram expostos precocemente ao parasito. No que diz

respeito às propriedades estudadas, apenas na fazenda BN, os animais

apresentaram percentuais iguais para anticorpos com alta e baixa avidez (50%

para cada). Nas demais fazendas, a porcentagem de alta avidez nos rebanhos

foi superior a porcentagem de baixa avidez, sugerindo que nestas propriedades

os animais são expostos mais cedo ao parasito do que na fazenda BN.

Em contrapartida, o sistema de criação de caprinos de extensiva/semi-

intensiva, manejo muito comum na região, leva a uma grande probabilidade do

contato destes animais com oocistos esporulados no pasto, possivelmente

decorrentes da eliminação por felídeos selvagens e/ou gatos domésticos.

60

6.2 - Avaliação da imunogenicidade após imunizações com vacinas de

adenovírus recombinantes expressando SAG1, SAG2, SA G3 e CMV em

soros de caprinos.

O desenvolvimento de uma vacina contra o T. gondii é uma

possibilidade viável já que indivíduos naturalmente infectados desenvolvem

imunidade intensa e duradoura contra o agente, sendo capaz de protegê-los

contra subseqüentes re-infecções, já tendo sido demonstrado que o mesmo

grau de resposta pode ser obtido com a administração de formas atenuadas do

parasito. O uso de vacinas atenuadas em humanos é improvável, uma vez que

é composta por taquizoítos vivos, podendo estabelecer infecções crônicas ou

reverter a um estado patogênico e causar doença aguda. Desta forma, para

desenvolver uma vacina contra a toxoplasmose é essencial a identificação de

imunógenos e delineamento de protocolos de imunização que utilizem somente

estes componentes (MENDES, 2006).

Para que uma vacina possa ser considerada excelente, deve-se sempre

levar em conta alguns fatores como custo, período de proteção, riscos de

infecção humana acidentais, efeitos colaterais, e principalmente a imunidade

conferida pela mesma. Atualmente as pesquisas concentram-se na tentativa de

identificar antígenos capazes de gerar resposta imune protetora, para o

desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o Toxoplasma gondii.

Segundo Mendes (2006), diversos modelos experimentais têm sido

gerados na tentativa de se obter um protocolo de imunização eficiente e seguro

contra a toxoplasmose, sendo que alguns desses propõem a utilização de

vetores plasmidiais ou proteínas do T. gondii expressas de forma

recombinante. Esses modelos são capazes de gerar níveis significativos de

proteção contra a infecção, no entanto, muitos desses protocolos possuem

determinados inconvenientes que limitam sua utilização. Com relação às

vacinas de DNA, existe a possibilidade de integração do mesmo no genoma do

hospedeiro ou o desenvolvimento de doenças auto-imunes devido à indução

de resposta anti-DNA. Por outro lado, as proteínas recombinantes têm

61

capacidade limitada de indução de respostas imunes, e a maioria dos

protocolos que as empregam necessitam de adjuvantes para a ativação do

sistema imune em níveis significativos.

Nesse contexto, em que se procura aliar a alta imunogenicidade com

utilização segura, os adenovírus recombinantes aparecem como uma

alternativa viável para desenvolvimento de uma vacina contra toxoplasmose,

uma vez que são capazes de ativar uma forte resposta mediada por células T

CD8+ com atividade citotóxica, são modificados para se tornarem deficientes

em replicação e incapazes de se propagarem em células de mamíferos, seu

genoma não se integra ao genoma celular, as infecções provocadas por

adenovírus podem ser eliminadas em até 30 dias, são capazes de induzir alta

expressão do transgene, superando os níveis de expressão dos transgenes se

comparados com outros métodos de vacinação, como as plasmídiais

(MENDES, 2006).

Diversos grupos de pesquisas em vacinas utilizam os adenovírus

codificando antígenos de superfície dos taquizoítos, denominados SAGs ,

dentre os quais SAG1, SAG2, SAG3 que são os mais abundantes expressos

na superfície dos taquizoítos. Acredita-se que estas proteínas atuam

interagindo com a célula hospedeira, mediando os processos de adesão,

invasão/penetração. Diversos estudos relacionados à vacinas contra

toxoplasmose, utilizando as proteínas SAGs, possuem resultados animadores,

na medida em que demonstram a possibilidade de se obter uma proteção

significativa contra a doença em modelos animais (PARMLEY et. al., 1994;

DEBARD et. al., 1996; LETSCHER-BRU et. al., 1998; PETERSEN et. al., 1998;

NIELSEN et. al., 1998; DZIERSZINSKI et. al., 2000; BONENFANT et. al., 2001;

COUPER et. al., 2003).

Neste estudo, o adenovírus codificando as proteínas de T. gondii SAG1,

SAG2, SAG3, e a combinação destas três proteínas, a CMV, foram

empregados para vacinação de caprinos. A avaliação dos ensaios mostraram

que a maioria dos animais utilizados eram reativos ao Toxoplasma gondii (por

isso que as médias de absorbâncias demonstradas nos gráficos começam

62

acima de zero, em níveis mais altos). Vimos ainda nesse trabalho, que as

vacinas recombinates expressando SAG1 (AdSAG1), SAG2 (AdSAG2), SAG3

(AdSAG3) e CMV (AdCMV) foram capazes de gerar resposta imune humoral,

com produção de IgG em todos os animais analisados, indicando que 100%

deles apresentaram reatividade. É importante frisar que a presença de

anticorpos pode auxiliar no controle da toxoplasmose em sua fase crônica,

atuando na opsonização das formas do parasito que são liberados a partir dos

cistos teciduais (KANG et al., 2000).

As vacinas AdSAG1, AdSAG3 e CMV tiveram níveis semelhantes na

produção de anticorpos IgG, com a elevação destes níveis após a aplicação da

primeira imunização, seguida por diminuição gradual na produção de IgG até

após a aplicação da terceira imunização. Existem diversas possíveis razões

para que após a 3ª imunização os títulos sejam menores, dentre elas: a vacina

desta 3ª imunização se degradou um pouco mais durante a obtenção e/ou

transporte, ou então durante o congelamento e descongelamento no

laboratório. Além disso, existe um fenômeno que se chama Immune

Exhaustion, segundo o qual repetir as imunizações pode acabar com os clones

de linfócitos B específicos para o antígeno (respondem demais e morrem por

apoptose); três imunizações podem causar anergia (falta de resposta por

tolerização ao antígeno ou ainda, passou tempo demais desde a 3ª imunização

e a coleta do soro e então os níveis de anticorpos caíram, esta última

possibilidade, entretanto, pode ser descartada uma vez que o tempo entre a

imunização e a coleta do soro foi de apenas 25 dias. Outro ponto importante a

ser considerado é que a proteção pode está correlacionado com a presença ou

ausência de determinadas citocinas produzidas pelos perfis de resposta Th1 ou

Th2, células T regulatórias e ainda citocinas relacionadas à reposta Th17

(GADDI & YAP, 2007; PASSOS et al., 2010).

A vacina AdSAG2 apresentou diferença na indução do padrão de

produção de IgG, mostrando elevada produção após a aplicação da primeira

imunização e mantendo-se crescente após a 2ª e 3ª imunizações. De acordo

com Mendes (2006), a indução de anticorpos específicos não parece ser um

63

mecanismo essencial para proteção contra a toxoplasmose aguda, tendo em

vista que, em vários estudos de vacinação, a presença de anticorpos

específicos contra proteínas de T. gondii não se correlaciona com a proteção

contra a infecção com a cepa RH – que causa infecções agudas com alto nível

de proliferação de taquizoítos. Existem muitas hipóteses quanto às funções da

SAG2, contudo, está claro que ela está associada com o processo de

adesão/invasão na célula hospedeira, agindo sinergicamente com SAG 1 e 3

(PARMLEY et al., 1994; CRAWFORD et al., 2010). Entretanto, diversos

estudos mostram que estes antígenos de superfície são capazes de induzir

aumento da resposta imune tanto celular quanto humoral. Caetano et. al.

(2006) observaram que a vacinação usando adenovírus recombinantes, foi

capaz de induzir resposta imune e redução significativa entre 50-70% na carga

de cistos cerebrais em camundongos BALB/c desafiados com a cepa P-Br.

Angus et. al. (2000), vacinaram camundongos com cDNA codificando a

proteína de superfície SAG1, verificando a presença de altos títulos de

anticorpos para SAG1 através do teste de ELISA.

A imunização intranasal de camundongos CBA/J com uma combinação

de SAG1 e toxina colérica levou a uma diminuição significante de cisto

cerebrais após infecção oral com a cepa de T. gondii 76k, desenvolvendo ainda

elevados níveis de anticorpos IgG anti-SAG1, bem como aumento na resposta

celular, com aumento de IL-2 e IL-5 (DEBARD et. al., 1996).

De acordo com Couper et. al. (2003), a vacinação de camundongos

BALB / c com DNA codificando SAG1 do taquizoíto de T. gondii, induziu uma

resposta imune Th-1 mediada pela produção de anticorpos IgG2a e aumentou

produção de IFN- γ.

Em seu estudo, Mendes et. al. (2006), avaliaram a capacidade de

adenovírus recombinantes codificando SAG1, SAG2 e SAG3 em induzir

ativação de resposta imune humoral e celular, além de imunidade protetora

contra cepas cistogênicas do parasito imunizando camundongos BALB/c e

C57BL/6 e verificaram que a imunização gerou anticorpos IgG específicos

contra as três proteínas, AdSAG1 levou a ativação de células T CD8+

64

produtoras de IFN- γ e proteção parcial em camundongos vacinados com

AdSAG1, os quais apresentaram maior taxa de sobrevivência e menor número

de cistos cerebrais se comparado ao grupo controle. Evidentemente, em nosso

estudo, foi feito um ensaio de campo, onde foram imunizados caprinos e não

camundongos, além disso, existe a variabilidade individual desses animais

criados no pasto, que podem exibir uma resposta bem diferente do que ocorre

em modelos murinos isogênicos. Outro fato importante a ser levado em

consideração é que não sabemos que tipo de cepa do T. gondii circulante entre

estes ruminantes no Rio Grande do Norte. Este fato, contudo, deverá ser

esclarecido em breve, através dos estudos de avaliação genotípica conduzidos

por nosso grupo em colaboração com o Departamento de Parasitologia da

UFMG (Projeto de Tese em andamento). Além disso, este é o primeiro estudo

com uma vacina que combina os três antígenos de superfície (SAGs 1, 2 e 3),

o que faz desse trabalho pioneiro na tentativa de imunização com a AdCMV.

É importante ressaltar que todos os modelos discutidos aqui utilizam

cepas diferentes e linhagens de camundongos o que difere dos caprinos

utilizados neste estudo. Além disso, estes animais foram imunizados de

maneira aleatória, não foram infectados experimentalmente. Pelo contrário,

verificamos a ocorrência da toxoplasmose crônica em quase sua totalidade. O

que torna difícil uma comparação, em parte, com os resultados de outros

estudos, principalmente, no que se refere aos níveis de anticorpos. Contudo, os

nossos resultados, corroborados com os dados existentes na literatura mundial,

indicam que, adenovírus recombinantes juntamente com as proteínas de

superfície SAG1, SAG2, SAG3, bem como sua associação a estas três

proteínas combinadas, apresentam um grande potencial para futura utilização

como uma vacina contra o Toxoplasma gondii. Entretanto, diversos estudos

ainda precisam ser feitos para que se possam elucidar algumas questões, tais

como, que adenovírus utilizar, para que os indivíduos que o recebam não

apresentem altos índices de anticorpos neutralizantes contra o mesmo,

entender melhor a imunidade anti-vetor que é induzida após a primeira

imunização, dentre outros fatores como avaliação das citocinas de perfil Th1

65

que representa de fato a efetividade destes regimes de imunizações testados,

uma vez que a resposta efetiva contra o T. gondii e a resposta celular.

66

7 - CONCLUSÃO

Os resultados obtidos neste trabalho permitiram as seguintes

conclusões:

• Foi verificada a freqüência de anticorpos anti-T. gondii em caprinos da

região Sertão do Cabugi; bem como, pela primeira vez no Estado do Rio

Grande do Norte, se avaliou neste animais, a toxoplasmose no tocante a

fase aguda e crônica;

• Pela primeira vez no Nordeste foram avaliados os esquemas de

imunizações em caprinos criados de maneira extensiva/semi-intensiva

utilizando protótipo de vacinas expressando SAGs 1, 2 e 3; sendo todos

os esquemas de imunizações bastante promissores;

• A utilização de adenovírus recombinantes como vetor vacinal se mostrou

eficiente no sentido de proporcionar uma indução na imunogenicidade,

sendo capaz de ativar a resposta imune humoral específica.

8 – PERSPECTIVAS

Pretende-se continuar a avaliação desta vacina, verificando outros

protocolos de imunização, bem como comparar a resposta imune celular e

humoral.

67

9 - REFERÊNCIAS

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ocorrÊncia da infecÇÃo por toxoplasma gondii e … · obrigada por me ensinar a viver com...

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