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O que são genes HOX/Homeobox/Homeóticos?

Codificam FATORES DE TRANSCRIÇÃO que causam

HOMEosisHOMEO: similar

Sis: transformação

Propriedades das Proteínas Homeóticas

1. São fatores de transcrição com um domínio ligante a DNA (domínio homeobox ou homeótico)

2. O domínio homeobox tem cerca de 60 aminoácidos conservados

E. B. Lewis, Nature 276, 1978, 565.

2. As proteínas Homeobox estão agrupadas no genoma, i.e. são genes vizinhos

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3.Os genes homeobox/homeóticos definem os segmentos corporais

Mutações homeóticas trocam segmentos corporais

Ultrabithorax

Antennapedia

4. A ordem dos genes homeóticos no cromossomo corresponde à ordem temporal e espacial em que são expressos -> colinearidade

Mudanças no

número de

genes

Mudanças no

padrão de

Expressão

Mudanças

no genes-

alvo

COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?

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Mudanças no

número de

genes

Mudanças no

padrão de

Expressão

Mudanças

no genes-

alvo

COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?

1. QUESTÕES LEVANTADAS: a evolução dos próprios Hox

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Ferrier and Holland, 2001Nat Rev Genet 2001 Jan;2(1):33-8.

1. QUESTÕES LEVANTADAS: a evolução dos Hox no contexto da evolução de planos corporais

FILOGENIAEvolução da sequência

SINTENIAPosição cromossomal

** Evento de duplicação

O problema da classificação filogenética baseada em homologia de sequência é a evolução funcional

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O problema da classificação por sintenia são as inversões... A validação da classificação é realizada por testes funcionais

inter-espécies

Mudanças no

número de

genes

Mudanças no

padrão de

Expressão

Mudanças

no genes-

alvo

COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?

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Mudanças no

número de

genes

Mudanças no

padrão de

Expressão

Mudanças

no genes-

alvo

COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?

O que gera a diferença de asas em Diptera e Lepidoptera?

Normal

T1T1T2

AntpDeleção para Ubx

T2

Antp

Anterior Posterior

T1T1T2

AntpT3

Ubx

Segmentos torácicos

A mutação/ inativação de Ultrabithorax (ubx) extende o limite posterior do segmento torácico

OU, a ausência de Ubx permite crescimento de asas

O que pode ter acontecido em borboletas?

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A mutação/ inativação de Ultrabithorax (ubx) extende o limite posterior do segmento torácico

O que pode ter acontecido em borboletas para que tenham2 asas?

(a) Ausência de Ubx em ambos segmentos torácicos(b) Presença de Ubx em ambos segmentos torácicos(c) Ubx apenas no primeiro segmento torácico(d) Ubx apenas no segundo segmento torático

Como você verificaria a sua hipótese?

(a) Imunofluorescência para Ubx em embriões de borboleta(b) Imunufluorescência para Ubx em borboletas eclodidas(c) qPCR do embrião para Ubx(d) Hibridação in situ para Ubx no embrião

Como você verificaria a sua hipótese?

(a) Imunofluorescência para Ubx em embriões de borboleta(b) Imunufluorescência para Ubx em borboletas eclodidas(c) qPCR do embrião para Ubx(d) Hibridação in situ para Ubx no embrião

Ubx

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A mutação/ inativação de Ultrabithorax (ubx) extende o limite posterior do segmento torácico

O que pode ter acontecido em borboletas para que tenham2 asas?

(a) Ausência de Ubx em ambos segmentos torácicos(b) Presença de Ubx em ambos segmentos torácicos(c) Ubx apenas no primeiro segmento torácico(d) Ubx apenas no segundo segmento torático

Ubx DSRF ASC Wg

Genes-alvo de Ubx na asa

Sean Carroll

A diferença entre as asas está nos genes-alvo regulados por Ubx

Sean Carroll

A diferença entre as asas está nos genes-alvo regulados por Ubx

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ACAGTGA CCTGAGC

HOX

TFTF

TF

Os genes HOX coordenam a expressão de outros fatores de transcrição

ACAGTGA CCTGAGC

HOX

TF

COMO QUE A FUNÇÃO DE UM FATOR DE TRANSCRIÇÃO PODE VARIAR?

1) Alteração na sequencia proteica do fator de transcrição

2) Alteração na região genômica-alvo reconhecida

A diferença estrutural entre o Ubx de Onychophora e de Drosophila afeta a sua capacidade de regulação gênica –GENES ALVOS DIFERENTES

a) O Ubx de Onychophora não transforma torácico em abdominal

b) O Ubx de Onycophora não reprime apêndices torácios (Distal-less)

O domínio repressor de Ubx de insetos surgiu como repetições de ALAninas.

Gallant e Carroll, Nature 2002

Grenier, 2000

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Mas e o Crustáceo (artemia) que tem múltiplos apêndices locomotores?

a) O Ubx de Artemia transforma torácico em abdominalb) O Ubx de Artemia não reprime apêndices torácicos

Espécie Conversão de Toracico para

Abdominal

Repressão de apêndices torácicos

Drosophila SIM SIM

Artemia SIM NÃO

Onychophora NÃO NÃO

A deleção de uma região C-terminal de ArtUbx aumenta a capacidade de repressão de ArtUbx

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A deleção de uma região C-terminal de ArtUbx aumenta a capacidade de repressão de ArtUbxA fusão desta região C-terminal com o DrosUbx reduz a capacidade de repressão da DrosUbx

?a) 5%b) 75%c) 15%d) 100%

E se mantiver a região C-terminal de ArtUbx e adicionar ALAninas nesta região?

O Ubx de crustácoes tem um domínio na região C-terminal que “ameniza” a capacidade repressora

Espécie Conversão de Toracico para

Abdominal

Repressão de apêndices torácicos

Drosophila SIM SIM

Artemia SIM NÃO

Onychophora NÃO NÃO

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COMO QUE A FUNÇÃO DE UM FATOR DE TRANSCRIÇÃO PODE VARIAR?

1) Alteração na proteína

2) Alteração na região genômica-alvo

Hox 6

Hox 10

Hox 6 induzem costelas

e Hox10 reprimem

Myf5/Myf6

Enhancer H1

Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 reprimem expressão de Myf5/Myf6

Myf5/Myf6HOX10

Enhancer H1

Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 reprimem expressão de Myf5/Myf6 ao se ligar no enhancerH1

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Myf5/Myf6HOX10

Enhancer H1

Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 reprimem expressão de Myf5/Myf6 ao se ligar no enhancerH1

A análise comparativa da região H1 de camundongos e cobras revela um nucleotídeo de diferença

Esta diferença está presente em diversas cobras e membros da Paenungulata

Vértebras

torácicas

Paenungulata >19

Esta diferença está presente em diversas cobras e membros da Paenungulata

231 vértebras torácicas

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Myf5/Myf6HOX10

Enhancer H1

Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 reprimem expressão de Myf5/Myf6 ao se ligar no enhancer H1

Myf5/Myf6

HOX10

Enhancer H1

Hox 6 induzem costelas através de Myf5/Myf6 e Hox10 não reprimem expressão de Myf5/Myf6

Mudanças no

número de

genes

Mudanças no

padrão de

Expressão

Mudanças

no genes-

alvo

COMO QUE AS DIVERSIDADES DE PLANO CORPORAL PODEM SER GERADAS?

COMO ISTO PODE GERAR DIVERSIDADE?

O LIMITE ANTERIOR DO DOMÍNIO DE EXPRESSÃO DE UM

CONJUNTO DE HOX DETERMINA O FIM DOS SEGMENTOS ANTERIORES A ESTES

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A combinação de perfis de expressão gênicas resulta na diferenciação dos segmentos corporais

O que determina o número de pataslocomotoras vs. Maxilipídeos?

maxilepídeo Pata locomotora

T1

T1 T2 T3

T1 T2 T3 T4

Mysidium

Perielimenes

Triops

(Averof e Patel, 1997)

Mysidium

T1

T1

T1

T2

T2

T2

T3

T3

T3

Tórax

Perielimenes

Os segmentos torácicos variam na expressão de Ubx+Abd

Averof, 1997

T4

Ubx+abd

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T1

T1 T2 T3

T1 T2 T3 T4

O primeiro segmento a desenvolver uma pata locomotora é a que expressa Ubx+Abd

A segmentação da espécie varia de acordo com a expressão de Ubx e abdA

Hox13 determina o final da extensão axial (crescimento céfalo-caudal)Eé expresso em níveis reduzidos na cobra

COMO É REGULADO A EXPRESSÃO DE GENES HOX?

molecularmente

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HOX

COMO É REGULADA A EXPRESSÃO DOS PRÓPRIOS HOX?

Tradução Degradação do RNAm

REGULAÇÃO A NÍVEL DE TRANSCRIÇÃO

GCR= Região de controle globalEnhancer Inicial(contém elementos sensíveis a Ac. Retinoico)

O modelo atual para controle da transcrição no grupamento Hox:

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( (Modificações epigenéticas determinam a expressão gênica

Jacqueline Deschamps* and Johan van Nes 2005

As modificações epigenéticas resultam em mudanças estruturais na cromatina

)Ocorre mudanças epigenéticas consistentes com a colinearilidade de expressão dos Hox

Montavon e Doboule, 2013

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A diferenciação celular gera/é gerada por áreas de interação de Domínios Topologicamente Associados (TAD) que mudam

A evolução no desenvolvimento pode ser mediada por elementos novos em um TAD

QUE FATORES DE TRANSCRIÇÃO SE LIGAM AOS ENHANCERS QUE CONTROLAM A TRANSCRIÇÃO DE HOX?

O fator de transcrição Oct4 e a proteína extracelular Gdf11* regulariam a expressão de regiões diferentes dos grupamentos Hox

*possivelmente pelo fator de transcrição Smad

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Oct4 e Gdf11* atuam em domínios genômicos topologicamente associados (TADs) distintos

*possivelmente pelo fator de transcrição Smad

Ou seja, Ocg4 e Gdf11 estaria hierarquicamente acima de Hox

PORQUÊ AS COBRAS NÃO TÊM PERNAS?

Hoxc6

Hoxc8

Hoxc8 DETERMINA A REGIÃO DO FLANCO

PORQUÊ SEU PADRÃO DE EXPRESSÃO VARIOU NA

EVOLUÇÃO?

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O HOXC8 em aves tem um domínio de expressão mais curto

Belting et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1998)

Comparação do Enhancer Imediato de camudongo e galinha

O Enhancer imediato de Camudongo confere ao gene LacZ (sob seu controle) uma expressão mais anterior

COMPARAÇÃO DO CONTROLE ESPACIAL DE ENCHANCER IMEDIATO DE CAMUDONGO X AVES

PNAS 100 (26): 15666-9, 2003Anand et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Dec 23;100(26):15666-9.

Comparação do Enhancer Inicial de Hoxc8 entre diferentes espécies

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HOX

COMO É REGULADA A EXPRESSÃO DOS PRÓPRIOS HOX?miRNA e RNA antisenso

Nature Review Genetics. Outubro 2002

O miRNA é gerado pela transcrição de uma região não-codificante e interfere na expressão do gene-alvo

Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, 827-835 (October 2004

O Anelamento de miRNA a região 3´não-traduzida do RNAm pode interferir na sua tradução

O RNAm para Ubx tem regiões passíveis de regulação por miRNA

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No estádio 10:1)o miRNA e o Ubx estão em células diferentes 2)3´UTR do Ubx tem poucos sítios para miRNA

No estádio 15:1) o miRNA e o Ubx estão nas mesma células2)E o Ubx contém um 3´UTR com mais sítios para miRNA PORTANTO o miRNA pode modular a tradução de Ubx

Nature Review Genetics, Outubro 2008

Existem sítios para regulação por miRNA nos Hox de vertebrados também A região genômica de Hox contém sequências precursoras de miRNA

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ELEMENTOS DE REGULAÇÃO PÓS-TRANSCRICIONAL DE HOX:miRNARNA antisenso

HOX

COMO É REGULADA A EXPRESSÃO DOS PRÓPRIOS HOX?Ribossomos

Ribossomos são constituídos de rRNA+ proteínas

A proteína Ribosomal RPL38:

1)tem expressão restrita em alguns segmentos

2)Controla a expressão de alguns genes Hox

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Camudongos Heterozigotos para a deleção da proteína ribossomal RPL38 apresentam transformações homeóticas

Modificado deThe Shape of Life Rudolf A. Raff

•Modificação de enhancers dos Hox•Sítios-alvo de microRNA•Disponibilidade de proteína ribossomal (!)

Duplicação genômica

ANCESTRAL

Hox novos Hox conservados

Padrão modificado Padrão conservado

•Modificação de sítios-alvo reconhecidos por Hox

•Modificação de domínios proteicos