nuclÉolo profa. dra. maria tercília vilela de azeredo oliveira pós graduanda priscila pasqüetto...
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NUCLÉOLOProfa. Dra. Maria Tercília Vilela de Azeredo OliveiraPós Graduanda Priscila Pasqüetto Mendonça
- Estrutura + facilmente visível (sem qualquer coloração): ↑ índice de refração
- Descrito por Fontana (1781) e denominado por Valentin (1839)
NUCLÉOLO
- Organela celular, cuja função é a de produzir ribossomos- Geralmente ovalada- Ausência de membrana ao redor (sem barreira de difusão)
Tamanho, forma e númerodepende do estado funcional da
célula- Tamanho - Grandes: glândulas e neurônios
- Pequenos: céls da glia e endotélio
- Número - Normalmente 1 (linfócitos humanos)
- +1: hepatócitos, céls vegetais (tulipas: 6-13)
- Ovócitos de anfíbios: 3000
Composição Química- RNA: 3-17% (pp RNAr) (RNP)
- DNAr: até 17% (seqüências altamente repetidas)
- Proteínas: até 85% - histonas- acídicas: Numatrina,
Nucleolina, Ribogranulina
- enzimas: RNA polimerase I,DNA topoisomerase I e II
Métodos de EstudoMicroscopia de Luz
- Métodos citoquímicos de basofilia (AgNOR, Azul de Toluidina e Variante da Concentração Eletrolítica Crítica)
D1, D2 - T. infestans ♂
←
D3 - T. infestans ♂
↓<
*
Cromatina esverdeada
Nucléolo - azul
Métodos de EstudoMicroscopia de Luz
-Acridina Orange (RNA avermelhado, DNA esverdeado)- Microscopia de contraste de fase
Métodos de EstudoImpregnação por íons prata no cito
diagnóstico do câncer
Nucléolo x Citodiagnóstico
Parâmetros:
• Tamanho• Número• Forma• Razão área N nu
Microscopia Eletrônica - Método de Bernhard → RNA + proteínas: elétrondensos
→ DNA: eletronlúcidos
Métodos de Estudo
Além de...- Análises bioquímicas e microespectrofotometria
- Autorradiografia
- Agentes inibidores do RNAr
- Análises moleculares
Métodos de Estudo
Experimento realizado na região espaçadora ITS-1
Figura 1. (A) e (B) Polimorfismo de tamanho para a região ITS-1 do DNAr de triatomíneos.Os valores aproximados em pares de base são: Ph 600 pb, Pm 800 pb, Tb 850 pb, Ti 750 pb e Tv 1000 pb, Rd e Rn 300 pb, Rr 250 pb. Letra L designa os marcadores de tamanho molecular (1Kb Ladder, Gibco).
L Rd R n Rr Tb Ti Tv L
L Ph Pm Tb Ti Tv Rd Rn Rr L
A
B
2.036163 61018
506
Tartarotti,E & Ceron, C. R, 2002
- Estudaram as regiões espaçadoras
ITS-1 da Região Organizadora
Nucleolar (RON)- Migração das
moléculas de RNAr
No microscópio de luz: simples- ovalada, no máximo
alguns vacúolos No microscópio eletrônico: três
grandes regiões
Morfologia do Nucléolo
Centro Fibrilar (CF)
Componente Fibrilar Denso
(CFD)Componente Granular (CG)
1) Centro Fibrilar (CF)- Conjunto de finas fibrilas (4-8nm)- ↑ atividade transcricional, ↑ n° e
tamanho dos CFs- Composição Química: DNAr, DNA topoisomerase I, RNA polimerase I, RNP, Nucleolina, Numatrina, Fibrilarina
Morfologia do Nucléolo (MET)
Centro Fibrilar (CF)
Morfologia do Nucléolo (MET)2) Componente Fibrilar Denso
(CFD)- Fibrilas densamente empacotadas →
redes- Ao redor dos CFs- Composição Química: DNAr , RNA
polimerase I, Fibrilarina, Nucleolina, Numatrina
Componente Fibrilar Denso
(CFD)
Morfologia do Nucléolo (MET)3) Componente Granular (CG)- Estruturas granulares de 10 a 15nm
de diâmetro- Periferia, ao redor do CFD- Local de armazenamento das pré
unidades ribossômicas- Composição Química: RNP, Fibrilarina,
Nucleolina, RibogranulinaComponente Granular (CG)
Morfologia do Nucléolo
Morfologia do Nucléolo (MET)
Vários Centros Fibrilares
Alta transcrição
Morfologia do Nucléolo (MET)
4) Esqueleto Nucleolar- Região amorfa relacionada com o
esqueleto nuclear- Composição Química: Proteínas
acídicas
5) Vacúolos Nucleolares- Áreas “vazias”????- Dúvidas... Artefatos??? ... Áreas
menos densas???
Morfologia do Nucléolo (MET)6) Cromatina associada ao
Nucléolo- Ao redor – envia ramificações
intranucleolares- Cromatina perinucleolar – não faz
parte do nucléolo- Segmentos cromossômicos específicos
- RONs
a) Nucléolos Reticulados (nucleolonemas)
- Região granular periférica + Região fibrilar central
b) Compactos- Essencialmente
granulosos (massa celular compacta e anastomosada)
c) Em anelCamadas concêntricas:
- central filamentosa
- cortical granulosa
Tipos de Nucléolo
EX: Triatoma infestans
EX: Anfíbios
EX: Allium cepa
Fisiologia do Nucléolo- Biogênese dos RIBOSSOMOS- Função bem estabelecida com
observações de Brown em 1964 (Xenopus laevis)
- Defeito cromossômico: formação dos nucléolos (perda de DNAr)
- Número de nucléolos: 2 (AA), 1 (Aa), e nenhum (aa)
Aa X Aa¼ AA: ½ Aa: ¼ aa
Experimento de Miller e Beatty (1967)- Ovócitos de Triturus viridescens
- Choque osmótico – separação das regiões nucleolares
- CF: filamento axial de DNA recoberto, a intervalos regulares, por RNA 45S transcrito
- CG: moléculas de RNA precursor da grande subunidade 32S
Experimento de Miller e Beatty (1967)
Experimento de Miller e Beatty (1967)- DNAr em tandem
- Muitas moléculas de RNAr transcritas
- Regiões de DNA espaçador
- “Árvore de Natal”
Experimento de Miller e Beatty (1967)- Cada RNA polimerase se associa ao
promotor , e se move ao longo do DNAr
RON: motivo genético altamente redundanteDNA Espaçador; ITS: Segmentos intercalares transcritos; ETS: Seqüência externa transcrita
Metabolismo Nucleolar
Metabolismo Nucleolar
Subunidade maior (60S): RNAr 28S + RNAr 5,8S + RNAr 5S + proteínas
nucleolaresSubunidade menor (40S): RNAr 18S + proteínas
nucleolaresProteínas nuleolares: Importadas do citoplasma
Metabolismo Nucleolar
S = Unidade de Sweedberg – é a unidade que se utiliza na medida da velocidade com a qual se
sedimentam as partículas no campo de centrifugação. Ocorre influência do tamanho,
densidade e forma da partícula e também do meio no qual as partículas estão suspensas.
Metabolismo NucleolarProcessamento do
RNA:RNA 45 S
RNA 5,8 S
RNA 32 S RNA 20 S
RNA 28 S RNA 18 S+
+RNA 5 S
Subunidade menorSubunid
ade maior
Metabolismo NucleolarAs proteínas nucleolares (ou ribossomais) são
importadas para o nucléolo a partir do citoplasma e começam a unir-se ao pré-RNAr (RNA 45 S) antes de sua clivagem. Enquanto o pré-RNAr é processado,
proteínas nucleolares adicionais e o RNAr 5 S (transcrito de uma outra região que não pertence à
RON) unem-se para formar partículas pré-ribossomais. Os passos finais da maturação seguem a exportação de
partículas pré-ribossomais para o citoplasma, produzindo as subunidades ribossomais 40 S e 60 S
Regiões Organizadoras Nucleolares (RONs)- Moldes de DNA relacionados com a
síntese de estruturas nucleolares – zonas de constricções secundárias que apresentam regiões satélites
- RONs: local do cromossomo responsável pela codificação do RNA 45S
Cromossomos Humanos
- zonas de constricções secundárias (ativamente transcritos)- regiões satélites
Representação esquemática da metade
do cariótipo
- Como o nucléolo se organiza??!!
- Presente durante intérfase e início da prófase
- “Desaparece”: final da prófase (mitose) e no diplóteno (meiose)
- “Reaparece” na telófase
Biogênese do Nucléolo
No Homem: após a mitose, dez pequenos nucléolos são formados, que rapidamente se fundem, formando um único e grande nucléolo
Biogênese do Nucléolo
Dez pontinhos, representando os dez
cromossomos portadores das RONs
A aparência do nucléolo muda dramaticamente durante as diferentes fases do ciclo celular
1)Reconstrução do nucléolo a partir dos corpúsculos pré-nucleolares que estão agrupados junto as RONs
2) Reconstrução a partir de uma Matriz pré-existente
3) Formação de estrutura totalmente nova a partir da RON
Biogênese do NucléoloTrês hipóteses: