novos desafios da pesquisa em nutriÇÃo e...

NOVOS DESAFIOS DA PESQUISA EM NUTRIÇÃO E PRODUÇÃO ANIMAL

Edição 2014

Pirassununga – SP2014

NOVOS DESAFIOS DA PESQUISA EM NUTRIÇÃO E PRODUÇÃO ANIMAL

Edição 2014

OrganizadoresProf. Dr. Luis Felipe Prada e Silva

Prof. Dr. Alexandre Augusto de Oliveira GobessoProf. Dr. Augusto Hauber GameiroProf. Dr. Márcio Antonio Brunetto

Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal

ISBN: 978-85-60014-26-2Edição 2014

Os organizadores autorizam a reprodução total ou parcial deste trabalho, para qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

O conteúdo e revisão ortográfica são de inteira responsabilidade de seus autores.

Edição Editora 5DRua Siqueira Campos, 2.090 - 1º andar Pirassununga - SP - CEP: 13630-010Tel.: 19 3562-1514Email: [email protected]

Capa e Editoração EletrônicaAlexandre RaisAna Rios DuranPaula Bertanha IzepomKarina CamachoLuiza Petruz

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca Virginie Buff D’Ápice da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

SUMÁRIO

APRESENTAÇÃO

CAPÍTULO I 009 Suplementação de equinos com coenzima Q10

CAPÍTULO II 026 Puberdade em novilhas zebuínas: manejo e mecanismos para a antecipação

CAPÍTULO III 041 A relação da condição sexual de bovinos com a qualidade da carne

CAPÍTULO IV 054 Impacto de estratégias nutricionais no dejeto de suínos

CAPÍTULO V 076 Protease exógena em dietas para frangos de corte

CAPÍTULO VI 097 Delineamentos experimentais em estudos de nutrição com vacas em lactação

CAPÍTULO VII 114 Fontes de carboidratos não fibrosos na terminação de bovinos de corte

CAPÍTULO VIII 138 Aditivos nutricionais empregados no controle e na melhora da saúde oral de cães e gatos

CAPÍTULO IX 157 Fatores nutricionais e metabólicos de vacas leiteiras em lactação que alteram a composição e a estabilidade do leite

CAPÍTULO X 177 Zooterapia nas escolas: lições do passado e desafios para o futuro

CAPÍTULO XI 195 Limites da redução de proteina dietética com o uso de aminoácidos suplementares na alimentação de monogástricos

CAPÍTULO XII 214 Utilização de biodigestores como alternativa para o tratamento de dejetos oriundos da produção animal

CAPÍTULO XIII 235 Aflatoxinas: consequências sobre o desempenho produtivo e a saúde, e estratégias para combate aos prejuízos em frangos de corte

CAPÍTULO XIV 253 Preparo de meios de cultura para ensaios de degradabilidade in vitro: uma ideia luminosa!

APRESENTAÇÃO

A realização do VIII Simpósio de Pós-Graduação e Pesquisa do Departamento de Nutrição e Produção Animal-VNP é uma iniciativa do VNP e do Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Produção Animal (PPGNPA). O evento tem como objetivos divulgar e discutir os principais projetos de pesquisa desenvolvidos pelos orientadores e colaboradores do programa, e integrar os orientadores, alunos de graduação, pós-graduação e funcionários com as diversas atividades de pesquisas desenvolvidas VNP. Esta é uma oportunidade ímpar para o intercâmbio e a discussão de idéias e para ampliação dos horizontes da pesquisa e do ensino entre docentes, alunos e colaboradores.

OS ORGANIZADORES

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CAPÍTULO 1

SUPLEMENTAÇÃO DE EQUINOS COM COENZIMA Q10

Kátia Feltre¹, Regina de Lima Costa², Gabriela do V. Pombo1, Mayara A. F. Palagi², Alexandre A. O. Gobesso³.

¹Doutoranda em Nutrição e Produção Animal - FMVZ/USP; ²Mestranda em Nutrição e Produção Animal – FMVZ/USP; ³Professor Associado – Departamento de Nutrição e Produção Animal – FMVZ/USP

RESUMO A coenzima Q10 (CoQ10) possui efeitos benéficos no tratamento de doenças do coração, degeneração muscular e demais doenças degenerativas. Os efeitos cardiovasculares de CoQ10 podem ser atribuídos ao seu papel bioenergético, na capacidade de antagonizar a oxidação da lipoproteína de baixa densidade no plasma e no seu efeito sob a melhoria da função endotelial. Apresenta potencial energético, favorecendo a transferência de elétrons na cadeia respiratória oxidativa de mitocôndrias, com função de produção de adenosina trifosfato (ATP), além de aumentar esses níveis de ATP por prevenção da perda do pool de adenina-nucleotídeo das células cardíacas. Como a atividade atlética é uma das principais funções exigidas pelo homem em relação ao cavalo, as exigências de energia devem ser atendidas além da sua manutenção, crescimento e reprodução e dos diversos tipos de atividades funcionais. Embora a importância da CoQ10 em seres humanos e em várias outras espécies tenha sido reconhecida, apenas alguns trabalhos recentes foram publicados sobre a utilização da CoQ10 em equinos. Esse capítulo tem por objetivo apresentar uma revisão sobre os benefícios da coenzima Q10 bem como mostrar dados de pesquisas realizadas com essa enzima no desempenho de equinos submetidos a exercício físico aeróbio.

INTRODUÇÃO O Brasil possui o quinto maior rebanho de equinos do mundo, sendo estimado em 5,4 milhões em 2013, segundo a FAO (2014), mantendo-se praticamente constante nos últimos anos. O rebanho envolve mais de 30 segmentos, distribuídos entre insumos, criação e destinação final e compõe a base do chamado Complexo do Agronegócio Cavalo, responsável pela geração de 3,2 milhões de empregos diretos e indiretos movimentando um valor econômico anual superior a R$ 7,5 bilhões (Confederação..., 2004). As diferentes formas de utilização da espécie como meio de transporte, ferramenta de conquistas, trabalhos, esportes e lazer determinaram

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mudanças na forma de criação e manutenção dos cavalos, sendo as principais delas, a restrição do tamanho das áreas disponíveis ao pastejo, da diversidade de alternativas alimentares com dietas mais elaboradas e do tempo disponibilizado para o cavalo se alimentar durante o dia. Segundo Furtado (2004), em 2002, a produção nacional de rações para equinos foi da ordem de 350 mil toneladas. Em 2012 esse número foi para 560 mil toneladas de rações, segundo o SINDIRAÇÕES, evidenciando o maior uso de rações no setor. O incremento das práticas esportivas nas diversas modalidades hípicas demandam animais de crescimento rápido, precoces, versáteis e fortes o suficiente para suportar o estresse nos treinamentos e nas competições. Para isso, a elaboração de práticas nutricionais corretas para atender às diversas funções do organismo, bem como o conhecimento da fisiologia digestiva do cavalo e a eficiência com que aproveita os nutrientes dos alimentos, são essenciais (Santos et al., 2012). A produção e a utilização apropriada de energia são essenciais para o equino atleta e possuem uma função crítica para o ótimo desempenho (Eaton, 1994). Para isso, diversos suplementos e alimentos alternativos vêm sendo testados no sentido de melhorar o desempenho dos equinos nas práticas esportivas, sendo a Coenzima Q10 uma dessas possibilidades.

CARACTERÍSTICAS DOS EQUINOS Os equinos são herbívoros não ruminantes, com hábito alimentar constante, extremamente seletivos e capazes de suprir grande parte da sua demanda nutricional para mantença através da ingestão de forragens (Lewis, 2000). Estudos a respeito dos padrões de comportamento dos equinos livres em pastagens, de maneira genérica, mostram características similares em relação ao tempo destinado à colheita das forragens, à locomoção, ao descanso e às outras atividades sociais. De acordo com Meyer (1995) e Zanine et al. (2006), os equinos ingerem a forragem em pequenas e frequentes porções, durante o dia e à noite, ocupando diariamente de 12 a 18 horas em pastejo. O mesmo autor salientou que os períodos de pastejo duram de 2 a 3 horas, interrompidos por períodos de descanso, locomoção e atividades sociais ou ócio. O estômago é relativamente pequeno, com capacidade aproximada de 15 litros (9% do total do trato digestório), ajustado para uma recepção contínua de pequenas quantidades de alimentos. O estômago esvazia-se de 6-8 vezes por dia, motivado pela desproporção existente entre a sua capacidade e o volume do alimento ingerido. Outra particularidade é a importância do ceco e cólon (70 % do total) onde ocorrem fermentações que permitem o aproveitamento das fibras. Os cavalos digerem e absorvem alguns alimentos como monogástricos mas processam outros alimentos num modo similar aos ruminantes. (Santos, 1997; Santos et al., 2012).

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O cavalo selvagem se desenvolveu e adaptou para obter o alimento requerido por pastejo e, desta forma, selecionando forragens suculentas com grande quantidade de água, proteínas solúveis, lipídios, açúcares e carboidratos estruturais. Neste sistema natural, períodos curtos de alimentação ocorrem ao longo do dia e da noite, com maior intensidade durante o dia (Frape, 2007). Já o cavalo doméstico consome uma variedade de alimentos com diversas formas físicas, considerando desde a forragem, com alto teor de umidade, até cereais com grandes quantidades de amido. Estudos já realizados sobre nutrição e métodos alimentares baseiam-se em garantir que essas possibilidades supram as necessidades nutricionais variadas dos equinos, sem causar transtornos digestivos e metabólicos (Frape, 2007).

DIGESTIBILIDADE DOS NUTRIENTES Digestível é considerada a parte do alimento que não é eliminada com as fezes, correspondendo, não totalmente, à porção do alimento que ganha o meio interno através da parede do trato digestivo (Meyer, 1995). A espécie equina apresenta dois tipos de processos digestivos: pré-cecal, que se desenvolve no intestino anterior onde os alimentos ingeridos são submetidos à ação das enzimas produzidas pelo próprio animal; e pós-ileal, que se desenvolve no intestino grosso, onde os alimentos não absorvidos na porção intestinal anterior são submetidos à degradação bacteriana (Meyer, 1995; Lewis, 2000). Vários fatores podem afetar a digestão nos equinos tais como a individualidade, composição química dos alimentos, quantidade consumida, tipo de exercício, grau de moagem dos ingredientes que compõem a dieta, processamento da matéria prima, água contida, tempo de trânsito no trato digestivo, quantidade de fibra presente na dieta e procedimentos analíticos utilizados (Hintz,1979). Fenos de gramíneas ou de leguminosas constituem a principal fonte de fibra na formulação de rações destinadas aos equinos. A fibra, além de ser importante para manutenção da população de microrganismos desejáveis no intestino grosso, proporciona aos equinos o efeito psicológico da saciedade e produção de β-endorfinas durante os movimentos de mastigação. A fermentação das fibras pelos microrganismos intestinais produz energia e previne a proliferação de outras bactérias, potencialmente patogênicas (Braga et al., 2008).

O CAVALO DE ESPORTE Como a atividade atlética é uma das principais funções exigidas pelo homem em relação ao cavalo, as exigências de energia devem ser atendidas além da sua manutenção, crescimento e reprodução e dos diversos tipos de atividades funcionais. Independentemente da

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modalidade esportiva ou da raça, a habilidade atlética é originada por quatro principais fatores: a genética, o ambiente, a saúde e o treinamento, sendo este último, um dos mais importantes na determinação do sucesso e na melhora do desempenho (Hodgson & Rose, 1994; Thomassian, 2005). A adaptação da musculatura é essencial para manter o desempenho atlético e reduzir a incidência de lesões induzidas pelo exercício. Condicionamento muscular significa melhorar o desempenho atlético, induzindo mudanças na musculatura que podem ser avaliadas por meio de objetivos e métodos científicos. A adaptação da musculatura do aparelho locomotor de cavalos ao treinamento ocorre em forma contínua baseada na intensidade e duração do exercício (Rivero, 2007). O treinamento de resistência resulta em maior densidade mitocondrial e suprimento capilar, alterações das principais enzimas metabólicas e aumento do consumo máximo de oxigênio, promovendo transição dos tipos de fibras musculares (Thayer et al., 2000). O treinamento consiste no uso de períodos regulares de exercício visando promover modificações estruturais e funcionais no organismo animal, no intuito de capacitá-lo a competir de forma mais efetiva (Evans, 1999). As adaptações induzidas pelo treinamento resultam em maior produção de energia pela via aeróbia e maior capacidade de tamponamento muscular, as quais podem ser representadas pelo aumento do limiar aeróbio, pela produção de menores concentrações de lactato sob intensidades de esforço semelhantes, pela determinação de menores concentrações de lactato ao final de testes de esforço e, ainda, pela ampliação do tempo necessário para o surgimento de fadiga (Eaton, 1999; Gerard et al., 2002; McGowan et al., 2002; Trilk et al., 2002). Em resposta ao exercício ocorrem alterações hematológicas significativas, como as promovidas pela contração esplênica que libera eritrócitos ali armazenados, aumentando a concentração de hemoglobina circulante para otimizar o transporte de oxigênio para os tecidos (Poole & Erickson, 2004). O aumento do hematócrito de 32% a 46% para 60% a 70% e o consequente aumento da hemoglobina, devido à contração esplênica, é uma adaptação específica dos equinos e dos cães, fornecendo aproximadamente 60% mais sítios de ligação para o oxigênio durante o exercício (Persson, 1967). É amplamente reconhecido que o músculo esquelético de mamíferos adultos é um tecido heterogêneo composto de vários tipos de fibras, com plasticidade de comportamento, onde a composição estrutural e formação bioquímica podem ser alteradas em resposta à atividade física, envelhecimento, alterações neurológicas e hormonais. Assim, as fibras musculares são altamente versáteis, capazes de responder a alterações de acordo com as exigências funcionais, alterando o seu perfil fenotípico (Serrano et al., 2000). Para obtenção de máximo desempenho produtivo dos equinos no esporte ou em trabalhos, são necessários conhecimentos que contribuam

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para retardar o início da fadiga muscular. As causas exatas da fadiga muscular não estão bem definidas, entretanto, acredita-se que fatores como baixo nível de glicose sanguínea, esgotamento do glicogênio muscular, aumento de lactato, acúmulo de NH3 na célula, perda de adenosina trifosfato (ATP) muscular e eletrólitos conduzem à fadiga (Hiney & Potter, 1996). Alguns estudos envolvendo a suplementação com Coenzima Q10 (CoQ10), tem demonstrado sua importante atuação em diversas funções bioquímicas, como principal fonte de energia celular, além da participação dessa substância como inibidora da fadiga durante o exercício em humanos (Braun et al., 1991; Mizuno et al., 1997; Weston et al., 1997; Nielsen et al., 1999). Também já foi demonstrado efeito protetor contra a redução excessiva de fosfolipídios na membrana mitocondrial durante exercício prolongado (Barbiroli et al., 1998), melhorando a recuperação muscular pós-exercício (Koyama et al., 1992) e o desempenho (Mizuno et al., 2008). A inclusão de gordura na dieta pode favorecer o desempenho de cavalos exercitados em regiões de clima quente, por diminuir o incremento calórico, visto que aproximadamente 3% a mais de calor é produzido durante a formação de ATP via oxidação da glicose, quando comparado à oxidação dos ácidos graxos (Konh et al., 1996). Assim, Mattos et al. (2006) verificou que a adição de 250 e 500 g de óleo na dieta de equinos submetidos a exercício de média intensidade proporcionou melhora no desempenho hematofisiológico, podendo resultar em melhor desempenho atlético aos cavalos, salientando que, os cavalos que consumiram 500 g de óleo por dia, apresentaram melhor recuperação pós-prova. Embora a importância da CoQ10 em seres humanos e em várias outras espécies tenha sido reconhecida (Bhagavan & Chopra, 2007; Cooke et al., 2008; Littarru & Tiano, 2010), apenas alguns trabalhos recentes foram publicados sobre a utilização da CoQ10 em equinos (Sinatra et al., 2013; Topolovec et al, 2013; Sinatra et al., 2014).

COENZIMA Q10

CARACTERIZAÇÃO Em 1926, Fredrick Crane e sua equipe, descobriram a presença da coenzima Q10 na mitocôndria do coração de bovinos. Neste mesmo ano, a coenzima foi isolada na Universidade de Winsconsin e, somente em 1958, sua síntese e estrutura química foram completamente conhecidas. Este composto é uma quinona lipossolúvel (2,3 dimetoxi-5 metil-6-decaprenil benzoquinona), semelhante a uma vitamina, lipossolúvel, que na sua forma pura apresenta-se como pó cristalino (Bhagavan & Chopra, 2007).

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Figura 1: Estrutura da Coenzima Q10 - Prakash et al 2010

É conhecida como único lipídeo endogenamente sintetizado que apresenta função redox, sendo biossintetizada por todas as células, tornando-se assim o maior constituinte da membrana mitocondrial interna, membrana do complexo de Golgi e membrana dos lisossomos (Lehninger et al.,1995).

Segundo Bank et al. (2011), esta substância trata-se de uma molécula altamente lipofílica e praticamente insolúvel em água. A absorção e transporte da CoQ10 parece ser semelhante a outros compostos lipofílicos tais como a vitamina E. Quando administrada por via oral, é convertida para a forma reduzida (ubiquinol) pelos enterócitos, absorvida pelo intestino delgado, entrando na circulação através do sistema linfático.

FONTES E ORIGEMCoenzima Q10 pode ser obtida por duas vias: por via exógena

pela ingestão de alimentos e por via endógena, pelo ciclo do mevalonato. Os alimentos que contém são brotos de soja, amêndoas, nozes, vegetais verdes como espinafres e brócolis, carnes, aves domésticas e em alguns peixes, como sardinhas. No entanto, a dose da coenzima obtida por via exógena (cerca de 2-5 mg/dia) não é suficiente para suprir as necessidades do organismo, já que apenas 10% é absorvida (Kumar et al., 2009), devido ao seu elevado peso molecular e sua baixa solubilidade em água (Pepe et al., 2007).

No organismo de humanos e animais é encontrada na forma reduzida (ubiquinol 10 – CoQH2), que ocorre predominantemente no coração, rins e fígado, e na forma oxidada (ubiquinona – CoQ10), que é abundante em cérebro e intestino (Nohl et al.,1999).

NÍVEIS PLASMÁTICOSOs níveis de CoQ10 diminuem cerca de 30 a 60% nos órgãos

durante o envelhecimento, principalmente em doenças como cardiomiopatias,

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hipertireoidismo e também em indivíduos que fazem exercício físico, especialmente quando atividade intensa. O tamanho e arranjo estrutural das mitocôndrias também influenciam nos níveis de CoQ10. Algumas deficiências genéticas por envelhecimento ou danos na biossíntese podem abaixar os níveis plasmáticos desta coenzima (Betinger et al., 2010).

A administração dietética deste composto é vista como forma de aumentar a sua concentração plasmática, apesar de haver uma fraca captação do organismo. Em suplementações orais é necessário o monitoramento, fundamental para avaliar este composto, bem como acompanhar a sua dose durante o tratamento. A determinação dos níveis pode ser feita no soro ou no plasma utilizando técnicas como HPLC (Cromatografia líquida de alta eficiência), que é uma técnica usada para fins qualitativos e quantitativos (Prakash et al., 2010).

EFEITOS NO ORGANISMO ANIMALDentre os benefícios da CoQ10 no organismo, principalmente no que

diz respeito aos efeitos cardiovasculares, pode-se citar seu papel bioenergético, na capacidade de antagonizar a oxidação da lipoproteína de baixa densidade no plasma e no seu efeito sob a melhoria da função endotelial (Belardinelli et al., 2006).

Estas coenzimas melhoram o potencial energético, favorecendo a transferência de elétrons na cadeia respiratória oxidativa de mitocôndrias, com função de produção de adenosina trifosfato (ATP), além de aumentar esses níveis de ATP por prevenção da perda do pool de adenina-nucleotídeo das células cardíacas (Singh et al., 2007).

Em seu potencial antioxidante, possui capacidade de proteção de fosfolipídios e proteínas da membrana mitocondrial contra a peroxidação lipídica, resguardando o DNA contra danos oxidativos (Niklowitz et al., 2007). Atua influenciando a estabilidade, fluidez e permeabilidade das membranas, estimulando o crescimento celular e inibindo a apoptose. Quando as membranas celulares são oxidadas, o ubiquinol é o primeiro a ser consumido (Cooke et al., 2008).

Dallner & Sindelar (2001) concluíram que a administração de suplementos de ubiquinona possui efeitos benéficos no tratamento de doenças do coração, degeneração muscular e outras doenças degenerativas.

Em humanos, a CoQ10 foi um achado na melhora da atividade da enzima endotelial extracelular superóxido dismutase (ecSOD) em pacientes portadores de doença arterial coronariana, os quais possuem baixa atividade dessa enzima. A ecSOD protege os vasos sanguíneos inibindo a ação oxidante do O2 reduzindo-o a peróxido de hidrogênio (H2O2). Os pacientes tratados com CoQ10 tiveram melhora significativa na atividade da ecSOD, mais

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pronunciado em pacientes que tiveram baixos valores iniciais de ecSOD e, portanto, provavelmente expostos a um maior estresse oxidativo. Este efeito foi acompanhado por um aumento do consumo máximo de oxigênio e da dilatação mediada pelo fluxo, um índice reconhecido da função endotelial (Littarru & Tiano, 2010).

Em equinos puro-sangue jovens de corrida, as concentrações plasmáticas de CoQ10 são consideradas menores do que aquelas encontradas em humanos ou em outras espécies como suínos, cães, coelhos e ratos. Esse fato pode ser atribuído em parte devido à dieta dos cavalos que é baseada em forragens (Miles et al., 2004; Kon et al., 2007).

Segundo Lamprecht & Williams (2012), o exercício intensivo parece induzir o aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e radicais livres in vivo em várias espécies, incluindo cavalos. Como no caso de outras espécies, nos equinos a produção excessiva de radicais livres pode sobrecarregar os sistemas antioxidantes endógenos, conduzindo ao stress oxidativo.

EXPERIMENTOS REALIZADOS NO LABEQUI (FMVZ – USP)

EFEITO DA SUPLEMENTAÇÃO COM COENZIMA Q10 NA FREQUêNCIA CARDÍACA DE CAVALOS SUBMETIDOS A EXERCÍCIO AERóBIO

Para a realização desse trabalho, foram utilizados dez equinos machos, castrados, da raça Puro Sangue Árabe, com idade aproximada de 4,4±0,5 anos e peso corporal de 421±34,95 kg. O período experimental teve duração de 60 dias. Os animais foram divididos em dois grupos: controle (GC) sem suplementação e grupo suplementado (GS), o qual recebeu aplicações de CoQ10 na dosagem de 0,07 mg/kg do peso corporal, via intramuscular, nos dias 0 e 30.

O consumo individual adotado foi o de 2% do peso corporal em matéria seca, sendo 50% concentrado e 50% volumoso, divididos em duas refeições diárias. As dietas foram compostas por feno de gramínea Cynodon dactylon cv. Tifton-85 e concentrado comercial. A água e o sal mineral foram fornecidos ad libitum, seguindo as recomendações estabelecidas no Nutrient Requeriments of Horses - NRC (2007) para equinos nesta categoria nutricional.

Todos os animais foram exercitados cinco vezes por semana, durante sessenta minutos, em exercitador circular mecânico para cavalos (Equiboard®), controlado eletronicamente, segundo a programação apresentada na tabela 1.

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Tabela 1: Programa de treinamento dos cavalos.

Treinamento Duração (min.) Velocidade (km/h)Aquecimento¹ 10 7

Trabalho¹ 15 10Trabalho¹ 5 12Trabalho² 5 12Trabalho² 15 10

Desaceleração² 10 7 ¹Sentido horário; ²Sentido anti-horário.

Foram realizadas mensurações quinzenais (D0, D15, D30, D45 e D60) da frequência cardíaca de todos os animais, utilizando frequencímetros digitais (Garmin Forerunner305©), com adaptadores para equinos (V-Max©). Para a frequência cardíaca (FC) basal, os animais permaneceram 10 minutos em repouso, sem manipulação humana. Em seguida, os cavalos foram colocados no exercitador, sendo iniciado o trabalho programado. Após o término do mesmo, os equinos permaneceram 20 minutos em repouso com o frequencímetro.

As variáveis estudadas foram FC basal (10 minutos antes do exercício), FC pico (a máxima FC atingida durante o exercício), FC final (imediatamente após o fim do exercício) FC de recuperação com 10 (FC+10) e 20 minutos (FC+20) após o fim do exercício. Os dados foram extraídos dos frequencímetros por meio de gráficos gerados pelo software “Garmin Training Center”.

Foi utilizado o delineamento inteiramente casualizado com medidas repetidas no tempo. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e posteriormente analisados estatisticamente de acordo com a distribuição dos dados. Foi adotado o procedimento dos modelos mistos (PROC MIXED) do programa computacional SAS (Statistical Analysis System).

Como resultado, foi observado efeito significativo da suplementação com CoQ10 na FC de pico (p=0,0222) e a FC final (p=0,0978) cujos valores foram os menores obtidos. Os dados estão apresentados na Tabela 2.

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Tabela 2: Valores médios das frequências cardíacas (FC) mensuradas, erro padrão da média (EPM) e valor de p para o controle e o tratamento com CoQ10 aos 60 dias experimentais (D60).

FC+10 = 10 minutos após o final do exercício; FC+20 = 20 minutos após o final do exercício; *p<0,10.

Nas condições em que foi realizado este estudo, pode-se concluir que a suplementação com coenzima Q10 reduziu a frequência cardíaca final e de pico durante o exercício aeróbio em equinos.

DETERMINAÇÃO DE NÍVEIS PLASMÁTICOS DE COENZIMA Q10 EM EQUINOS SUBMETIDOS A EXERCÍCIO AERóBIO.

Em um experimento piloto realizado nas dependências do Laboratório de Pesquisa em Alimentação e Fisiologia do Exercício em Equinos (LabEqui) no campus administrativo de Pirassununga, para avaliar a dose plasmática da CoQ10 de acordo com o aumento de doses fornecidas de CoQ10, foram suplementados dez equinos machos, castrados, da raça Puro Sangue Árabe, com idade média de 48±8,15 meses e peso médio 473 ± 34,75 de com os tratamentos 0 (controle), 10, 20, 30 e 40 ml de um produto à base de Coenzima Q10 (6%) cujo veículo foi a vitamina A. Os animais foram suplementados durante trinta dias e submetidos a treinamento físico. Os animais receberam 3,5 kg de ração concentrada por dia sendo divididos em duas refeições (à 7h00min; 2 kg e às 16h00min; 1,5 kg). O concentrado foi fornecido em comedouros individuais, em sistema tipo “lanchonete”, e o feno de Cynodon dactylon cv. Tifton 85 foi distribuído em fenil alocado nosz piquetes. A água e o sal mineral foram fornecidos ad libitum. Todos os animais foram exercitados três vezes por semana, durante sessenta minutos, nas velocidades de 7, 10 e 12 km/h, em exercitador circular mecânico para cavalos (Equiboard®), controlado eletronicamente. O protocolo de exercício foi dividido de acordo com os tempos e velocidades apresentados na tabela 3.

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Tabela 3: Programa de treinamento dos cavalos suplementados com CoQ10.




Foram colhidas amostras sanguíneas de todos os animais no dia zero (D0) e trinta (D30) após o início da suplementação, por meio de punção da veia jugular utilizando agulhas 25 x 0,8 mm e tubos em sistema a vácuo (BDVacutainer®), separado o plasma por centrifugação e enviado ao laboratório para dosagem de níveis plasmáticos de CoQ10 pelo método High-performance liquid chromatography (HPLC).

Foi utilizado um delineamento em blocos ao acaso com 2 repetições avaliando-se medidas repetidas no tempo. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e analisados por programa estatístico, comparando-se as médias pelo teste t-Student com nível de significância de 5%.

Nas condições em que esse trabalho foi desenvolvido, pode-se observar que, à medida que houve suplementação com CoQ10, houve aumento linear crescente (Figura 1) nos níveis plasmáticos da enzima, sugerindo que esses níveis aumentam de acordo com o aumento na suplementação. Entretanto, não foi possível observar qual dose seria o limite de absorção pelo organismo dos animais. Para tanto, mais trabalhos devem ser realizados para a determinação da dose máxima absorvida e que não interfira no desempenho dos equinos.

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Figura 1: Níveis plasmáticos (μmol/L) de CoQ10 em equinos submetidos a exercício leve.

Trabalhando com dois níveis de suplementação (1,9 e 3,4 g de CoQ10) e três regimes de treinamento (controle, baixa e alta intensidade) em cavalos, Sinatra et al. (2014) demonstrou a importância da suplementação com CoQ10 para manter o bom estado físico e as defesas antioxidantes em cavalos submetidos a treinamento intenso, já que momentos repetidos de exercícios de alta intensidade podem levar ao estresse oxidativo grave, resultando na depleção dos estoques endógenos de CoQ10 que podendo ser prejudiciais para a saúde e desempenho físico.

Durante o período experimental em que os cavalos foram suplementados, foram observadas alterações em alguns animais tais como, diminuição na ingestão do concentrado, áreas de alopecias no corpo, pelos opacos, apatia e claudicação leve, podendo estar relacionado com a composição do produto utilizado.

Em um segundo experimento, os mesmo animais foram utilizados, entretanto, foram divididos em dois grupos de tratamento: controle (0 ml) e suplementados (10 ml) junto ao concentrado, divididos em duas doses de 5ml ao dia durante 90 dias. A suplementação consistiu de um produto a base de Coenzima Q10 (8%) e o veículo utilizado foi a vitamina E.

O arraçoamento foi individualizado, sendo estabelecido em 0,75% do peso corporal de ração concentrada comercial por dia sendo divididos em duas refeições (à 7h00min e às 16h00min). O concentrado foi fornecido em comedouros individuais, em sistema tipo “lanchonete”, e o feno de Cynodon dactylon cv. Tifton 85 foi distribuído em fenil alocado em nos piquetes. A água e o sal mineral foram fornecidos ad libitum.

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Todos os animais foram exercitados cinco vezes por semana, durante sessenta minutos, nas velocidades de 8, 12 e 15 km/h, em exercitador circular mecânico para cavalos (Equiboard®), controlado eletronicamente. O protocolo de exercício foi dividido de acordo com os tempos e velocidades apresentados na Tabela 4.

Tabela 4: Programa de treinamento dos cavalos suplementados com CoQ10.




Foram colhidas amostras sanguíneas 60 dias após o início da suplementação (D60) de todos os animais através de punção da veia jugular utilizando agulhas 25 x 0,8 mm e tubos em sistema a vácuo (BDVacutainer®), separado o plasma por centrifugação e enviado ao laboratório para dosagem de níveis plasmáticos de Q10 pelo método High-performance liquid chromatography (HPLC). Foi utilizado um delineamento em blocos ao acaso com 5 repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e analisados por programa estatístico, comparando-se as médias pelo teste t-Student com nível de significância de 5%. Os dados de concentração plasmática de CoQ10 nos dois tratamento estão apresentados na tabela 5. Não foram observadas diferenças estatísticas (p>0,05) entre o grupo controle e o suplementado, obtendo-se média de 0,222 μmol/L.

Tabela 5: Concentração plasmática (μmol/L) de CoQ10 em equinos.

Média0 mL 0,218 ± 0,0310 mL 0,226 ± 0,03

Média Geral 0,222 ± 0,06p-valor 0,8531

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Esses valores sugerem que novas pesquisas avaliando-se os benefícios da suplementação com CoQ10 no desempenho de animais atletas devem ser realizados.

CONSIDERAÇÕES FINAIS A inclusão de compostos alternativos na alimentação de equinos é uma possibilidade real e interessante para melhorar o desempenho esportivos dos mesmos. Vale salientar a importância também da continuidade desses estudos, principalmente aqueles que podem agregar benefícios para o setor esportivo.

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CAPÍTULO 2

PUBERDADE EM NOVILHAS ZEBUÍNAS: MANEJO E MECANISMOS PARA A ANTECIPAÇÃO

Marcos Vinicius de Castro Ferraz Júnior1, Marcos Vinicius Biehl2 , Vinicius Nunes de Gouvêa1, Daniel Montanher Polizel1, Angelo Dias Brito Ribeiro3, Marcelo Henrique dos Santos3, Renan Gomes da Silva3, Elizangela Mirian

Moreira1, José Alipio Faleiro Neto1, Alexandre Vaz Pires4.

1 Doutorando – Nutrição e Produção Animal – VNP/FMVZ/USP – Pirassununga – SP.2 Pós doutorando – Ciência Animal e Pastagens. ESALQ/USP – Piracicaba – SP.3 Mestrando – Nutrição e Produção Animal – VNP/FMVZ/USP – Pirassununga – SP.4 Professor Associado III – ESALQ/USP - VNP/FMVZ/USP – Pirassununga – SP.

RESUMO

A cada ano, a participação brasileira vem crescendo no comércio internacional, com destaque para a exportação de carne bovina. Atualmente a pecuária brasileira apresenta um rebanho de 209 milhões de cabeças, sendo a grande maioria destas, criadas à pasto (estima-se que apenas 5% do rebanho brasileiro seja terminado em sistemas intensivos). Segundo Nogueira (2004), o rebanho nacional é formado por 80% de raças zebuínas, sendo que mais de 90 milhões são pertencentes à raça Nelore. Esta escolha por animais zebuínos, é realizada pois estes animais são mais bem adaptados à regiões de clima tropical, quando comparados à raças taurinas, estas por sua vez adaptadas à regiões de climas temperados (Bó, et al., 2003). Novilhas da raça Nelore são consideradas tardias, pois apresentam a primeira ovulação aos 2 anos de idade ou mais, isso é uma consequência fisiológica resultante da pressão ambiental das criações extensivas (Nogueira, 2004). Nos últimos anos a pecuária nacional vem se adaptando as novas exigências de um mercado competitivo, essa adaptação é marcada com a maior utilização de tecnologias que possam aumentar a produtividade por unidade produtora. Práticas como intensificação do manejo (protocolos de indução), seleção genética e alimentação, estão permitindo que as novilhas possam ser colocadas em estação de monta aos 14 meses de idade, aumentando assim o número de bezerros nascidos na vida reprodutiva da fêmea, elimInando categorias improdutivas na propriedade.

INTRODUÇÃO No Brasil, as novilhas apresentam idade avançada ao primeiro parto, sendo este um fator que reduz o retorno econômico da bovinocultura de corte.

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Com o retardo da idade ao primeiro parto, ocorre uma menor produção de bezerros durante a vida produtiva da vaca. Além disso, novilhas com idade avançada à puberdade permanecem na fazenda ocupando áreas de pastagens que poderiam ser destinadas a outras categorias (Ferreira et al., 2012; Eler et al., 2010). Os mecanismos endócrinos da puberdade estão bem estabelecidos em novilhas Bos taurus taurus e a teoria mais aceita para disparar o gatilho que desencadeia a primeira ovulação é a teoria gonadostática, na qual o gatilho chave é a liberação de GnRH. A liberação de GnRH vai causar a liberação pulsátil do LH promovendo a ovulação (Day et al., 1987; Day et al., 2010). Já é sabido que através da nutrição é possível antecipar o disparo desse gatilho, principalmente em novilhas Bos taurus taurus (Gasser et al., 2006a, 2006b, 2006c, 2006d). Contudo, em Bos taurus indicus ainda há lacunas nesta área do conhecimento, principalmente, de como e quando a nutrição pode adiantar a puberdade (Nogueira, 2004).

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

IMPORTâNCIA DA PUBERDADE NA PECUÁRIA DE CORTEDo ponto de vista reprodutivo, a puberdade é definida como a

manifestação da capacidade reprodutiva, que ocorre quando um animal adquire a capacidade de ovular um oócito com a apresentação do comportamento estral, com desenvolvimento e manutenção de um corpo lúteo funcional e com tempo de vida normal (Kinder et al., 1987). Sendo assim, podemos definir puberdade como o início da vida reprodutiva do animal. Do ponto de vista prático, quer dizer que a fêmea, em breve, poderá ser submetida à cobertura e produzir um bezerro. Diante desta definição, a puberdade pode ser vista como um indicador econômico na pecuária de corte. Um trabalho de simulação mostrou que a redução da idade ao primeiro parto de 3 para 2 anos pode aumentar o retorno econômico do sistema em 16%, pois ao se reduzir a idade ao primeiro parto em um ano, reduz-se o custo com a exclusão de um ano de recria (diminui um categoria animal dentro da fazenda) e aumenta de 0,5 a 0,8 bezerros por vaca durante sua vida produtiva (Eler et al., 2010). O início da vida reprodutiva aos 14 meses em novilhas Nelore é uma realidade de poucos sistemas de produção devido, principalmente, a dois fatores: más condições nutricionais encontradas nas propriedades de gado de corte e falta de seleção genética na raça Nelore para precocidade sexual das novilhas (Nepomuceno, 2013; Ferreira et al., 2012).

MECANISMO ENDóCRINO DA PUBERDADE A regulação da secreção de GnRH é essencial para o estabelecimento de ciclos estrais normais em animais pré-púberes. Esta regulação é mediada

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por muito esteróides ovarianos tais como: estrógeno e progesterona, o próprio GnRH e alguns outros hormônios como a leptina, IGF-1, GABA, glutamato, neuropeptídeo Y, ativina, inibina e, recentemente, um novo peptídeo e seus receptores foram identificados como os emergentes possíveis reguladores chave na ativação dos neurônios GnRH (kisspeptin, receptor GPR54) (Clarkson e Herbison, 2006; Ojeda et al., 2010). Porém, a teoria mais aceita para explicar como ocorre a puberdade é denominada hipótese gonadostática, que sugere que o eixo hipotalâmico-hipofisário-ovariano já estaria funcionalmente competente. Mas, devido à baixa secreção de GnRH durante a fase pré-pubere que ocorre pelo feedback negativo feito pelo estrógeno (E2) no eixo hipotálamo-hipofisário, não há o estímulo necessário para aumentar a pulsatibilidade de LH. Assim, com a gradativa redução da sensibilidade do hipotálamo ao feedback negativo do E2, ocorre o aumento da frequência de liberação pulsátil de LH (Day et al., 1987; Day et al., 2010). O LH é considerado o fator endócrino primário para que a novilha se torne púbere, ou seja, faz com que a novilha tenha sua primeira ovulação. Desta forma, a maturação hipotalâmica necessária ao desencadeamento da puberdade ocorrerá a partir da redução do feedback negativo exercido pelo E2, o que é observado na fase peri-púbere, por redução d o número de receptores deste hormônio no hipotálamo e na adeno-hipófise, que ocorre progressivamente com o avançar da idade (Figura 1; Day et al., 1987; Day et al., 2010).

Figura 01. Alterações endócrinas que ocorrem nos períodos pré-pubere peripúbere e púbere em novilhas. O período compreendido na figura é de aproximadamente 50 dias antes da puberdade. Os sinais positivos (+) e negativos (-) representam o feedback do estradiol sobre o LH, bem como a largura das setas representam o grau relativo deste feedback. Adaptado de Day et al. (2010), para novilhas zebuínas de acordo com Nogueira 2004.

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A figura 2 representa o modelo que serve de base para os estudos a campo com o amadurecimento sexual das novilhas taurinas (Bos taurus taurus). A secreção pulsátil de LH é estabelecida nas novilhas por volta de 1 a 2 meses de idade (Anderson et al., 1996) e aumenta por volta do 3º ao 5º meses de idade (Schams et al., 1981). Subsequentemente, a secreção de LH diminui (Schams et al., 1981) e mantem-se relativamente baixa (fase estática) até um novo aumento da secreção de LH (fase peripúbere) que culmina com a puberdade (Day et al., 1987).

Figura 2. Modelo para os estágios da maturação sexual em novilhas. A área sombreada indica a sensibilidade da secreção de GnRH frente ao feedback negativo do estradiol. A mudança dos padrões de secreção de LH, durante o período pré-púbere, é resultado do aumento da secreção de GnRH seguido pela maior produção de estradiol pelos folículos ovarianos. O aumento de LH na peripuberdade é o resultado de um declínio no feedback negativo do estradiol sobre o LH. Adaptado de Day et al. (2010).

A maioria das pesquisas concentra-se na endocrinologia do período de peripuberdade das novilhas (fase estática) e do impacto das condições ambientais para o aparecimento da puberdade. Os fatores mais estudados que afetam a puberdade neste período são: os fatores relacionados ao crescimento como o peso corporal, o ganho de peso e a composição corporal; e os fatores inerentes à dieta e nutrientes específicos como o consumo de dieta, a alimentação em fases e o conteúdo de proteína e gordura da dieta (Day et al., 2010). Sendo assim, podemos dizer que a nutrição é o fator primordial para o estudo da puberdade precoce.

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Uma série de estudos realizados pela equipe do Prof. Michel L. Day para pesquisar os mecanismos ovarianos e endócrinos associados com a puberdade precoce em novilhas chegaram à conclusão que a maturação sexual pode ser substancialmente alterada por meio do manejo e da manipulação nutricional em Bos taurus taurus (Gasser et al., 2006a, 2006b, 2006c, 2006d).

A endocrinologia da puberdade precoce ocorre no período pré-puberdade. As estratégias nutricionais anteciparam o aumento da frequência dos pulsos de LH que ocorrem na fase peripúbere. Essa afirmação pode ser comprovada pela aceleração maturidade ovariana, aumento do diâmetro máximo dos folículos dominantes, aumento da duração das ondas de desenvolvimento folicular e aumento do pico de estradiol durante as ondas de desenvolvimento folicular. Assim, as estratégias nutricionais possibilitaram eliminar a fase estática (Figura 2) durante a pré-puberdade, fazendo com que as novilhas entrem na fase pré-púberes após a fase de desenvolvimento na pré-puberdade, pulando ou encurtando a fase estática (Figura 3; Day et al., 2010; Gasser et al., 2006a, 2006b, 2006c, 2006d).

Os modelos de estudo dos mecanismos que levam a puberdade em novilhas Bos taurus indicus parece ser similares aos descritos em novilhas Bos taurus taurus (Nogueira, 2004) e, aparentemente, as estratégias nutricionais devem ser capazes de acelerar ou até mesmo eliminar a fase estática que antecede o período de peripuberdade de novilhas Bos taurus indicus.

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Figura 3. Modelo ajustado para atingir a puberdade precoce em novilhas. O período pré-puberdade passa para uma idade anterior, eliminando a fase estática que foi mostrada na Figura 2. MaxDF = diâmetro máximo dos folículos dominantes; E2 = concentrações periféricas de estradiol. Adaptado de Day et al. (2010).

Nos trabalhos de Gasser et al. (2006a, 2006b, 2006c, 2006d), foi observado que novilhas Bos taurus taurus alimentadas com alta inclusão de concentrado obtiveram uma taxa média de 84% de puberdade precoce com 262 dias (8,743 meses) de idade. O tratamento controle destes quatro trabalhos obteve um taxa média de 19% de puberdade em 348 dias (11,6 meses) de idade. Esses dados além de comprovarem o efeito da nutrição em adiantar a puberdade também nos permite comprovar que há uma grande diferença genética entre Bos taurus taurus e Bos taurus indicus. Visto que em Bos taurus indicus admite-se puberdade precoce com 14 meses de idade, ou seja, 420 dias (Nogueira, 2004; Nepomuceno, 2013; Ferreira et al., 2012). Isso mostra que há um componente genético forte no aparecimento da puberdade. EFEITO DA NUTRIÇÃO NA PUBERDADE

Como já discutido no tópico anterior, a nutrição é capaz de influenciar a idade à puberdade via secreção das gonadotrofinas. Essa influência se dá por

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um conjunto de vários fatores ou hormônios que são regulados via nutrição (tais como, opióides endógenos, neuropeptídeo Y, leptina, glicose e insulina) que servem como mensageiros (“feedback” positivo ou negativo) modulando a secreção e liberação de GnRH. Essa modulação via GnRH culmina com a estimulação da secreção e liberação de gonadotrofinas, induzindo o início dos eventos reprodutivos que determinam a ovulação e formação de um corpo lúteo (Barb et al., 1999; Willians et al., 2002) (Figura 4).

Figura 4. Representação esquemática do efeito dos mediadores que são influenciados pela nutrição sobre a produção de gonadotrofinas pelo eixo hipotálamo-pituitária em animais. Adaptado de Willians et al. (2002)

O Fator de Crescimento Semelhante à Insulina-1 (IGF-1) apresenta–se também como um candidato metabólico relacionado com a puberdade. O IGF-1 está relacionado com a secreção de GnRH e de gonadotrofina devido sua expressão em neurônios hipotalâmicos e células da glia, que podem regular a secreção e liberação do GnRH (Daftary e Gore, 2004). Outro modo de ação do IGF-1 na reprodução é via aumento da expressão de receptores para as gonadotrofinas, assim aumentando a esteroidogênese (Lucy, 2000). Deste modo, o IGF-1 tem a capacidade de influenciar a manifestação da puberdade, bem como a função reprodutiva na vida adulta. Visto como a nutrição influencia a manifestação da puberdade, é importante caracterizar o estado nutricional dos animais em qualquer estudo com puberdade, principalmente no que diz respeito ao sistema de criação a pasto, que na maioria dos casos não permite uma condição nutricional ótima para o aparecimento da puberdade aos 14 meses de idade em novilhas Nelore. Dados obtidos por nossa equipe, demostram que ao se trabalhar com puberdade precoce há a necessidade de utilização de suplementação

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alimentar. A figura 5 mostra a evolução do peso de novilhas Nelore submetidas a duas condições de recria, uma com confinamento e outra a pasto. O manejo nutricional interferiu na manifestação da puberdade. As novilhas que foram recriadas em confinamento obtiveram uma taxa de puberdade aos 18 meses (final da primeira estação de monta) de 32%, enquanto as novilhas recriadas no pasto obtiveram uma taxa de puberdade de 14% (Nepomuceno, 2013). As taxas de puberdade na primeira estação de monta obtida por Nepomuceno (2013) foram diferentes (32% vs 14%) devido, principalmente, ao desenvolvimento corporal que cada sistema de recria proporcionou às novilhas, cuja figura 5 exemplifica bem o desenvolvimento das novilhas em cada sistema de recria. Então o déficit nutricional das novilhas foi o fator limitante para a manifestação da puberdade precoce, uma vez que os dois grupos eram semelhantes geneticamente.

Figura 5. Peso de bezerras Nelore suplementadas na fase de recria com confinamento (n = 119) ou recriadas a pasto (n = 122). Peso aos 205 dias de idade = 6,7 meses (Desmama e inicio da suplementação no confinamento); Peso aos 320 dias de idade = (10,5 meses) fim do confinamento; Peso aos 440 dias de idade = 14,4 meses (início da estação de monta); Peso aos 560 dias de idade = 18,4 meses (final da estação de monta). *P=0.001. Adaptado de Nepomuceno (2013).

Ao observar na figura 5 o desenvolvimento das novilhas que passaram pelo confinamento, a diferença de peso dos 320 até 440 dias de idade é de apenas 8,8 kg. O pequeno ganho de peso neste período foi proporcionado pela da saída do confinamento e entrada no pasto. Era esperada uma queda no desenvolvimento dessas novilhas, uma vez que não estavam adaptadas ao pastejo. No entanto, ao observarmos o diâmetro do maior folículo das novilhas temos uma boa interpretação da condição nutricional desses animais (Figura 6; Dados não publicados).

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Figura 6. Diâmetro do maior folículo das novilhas pré-púberes que apresentavam mais de 240 Kg dos 10 aos 24 meses de idade. (Dados não publicados).

O tamanho do folículo está relacionado à condição nutricional do animal, como já discutido anteriormente. Assim, ao analisar o diâmetro do maior folículo observa-se que mesmo depois de adaptadas ao pasto, as novilhas não voltaram a ter a condição nutricional que estavam tendo no confinamento. Assim, a taxa de puberdade aos 18 meses de idade (final da primeira estação de monta) encontrada (32%) no tratamento que passou pelo confinamento poderia ser maior se estes animais permanecessem por mais tempo em confinamento. EFEITO DA GENéTICA NA PUBERDADE É consenso entre os autores que o melhoramento genético no Nelore nesses 15 anos foi notório, principalmente em características como ganho de peso, musculosidade, peso a desmama, entre outras. No entanto, no que diz respeito às características reprodutivas, mais especificamente a idade à puberdade, a maioria dos programas genéticos ainda não avançou o que seria possível pela teoria (Eler et al., 2010). Os resultados de trabalhos científicos mostram que o progresso científico poderia ser bem maior se ao invés de utilizarmos o perímetro escrotal fosse utilizada a idade ao primeiro parto (Eler et al., 2010). A idade ao primeiro parto parece ser uma característica promissora para se avaliar a precocidade de novilhas. Essa característica apresenta-se com herdabilidade bastante variável dependendo da conjuntura que essa característica é interpretada. Por exemplo, os valores encontrados na literatura de herdabilidade para a característica idade ao primeiro parto variando de 57% (Eler et al., 2002) a 12% (Silva et al., 2005). Essa variação deve-se ao fato de que quando a herdabilidade é de 57%, as novilhas foram expostas a touro com 14 meses de idade. Ao passo que na

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herdabilidade de 12% as novilhas foram expostas à touro com 24 meses de idade. Nosso grupo de estudo tem dados que confirmam que a puberdade aos 18 meses de idade é influenciada pelo pai da novilha (Figura 7).

Figura 7. Porcentagem de puberdade até os 18 meses de idade (final da primeira estação de monta) de acordo com os touros utilizados. *11 (RM – reprodutores múltiplos com CEIP). Adaptado de Nepomuceno (2013).

A porcentagem de puberdade ao final da primeira estação de monta variou de 58,8% até 0%, evidenciando a necessidade de identificar os touros que tem o potencial de gerar filhas que apresentem puberdade precoce (Nepomuceno, 2013). No entanto, não sabemos como é a interação entre nutrição e genética para a puberdade precoce.

EFEITO INDUÇÃO DA PUBERDADE EM NOVILHAS NELOREO percentual ideal de peso corporal pré-inseminação em novilhas

de corte é em torno de 60-65% do peso adulto (12-14 meses de idade para Taurinos e 21-24 meses para zebuínos), com ganho diário médio 0,5 a 0,8 kg/d entre o desmame e o início da estação de monta. A indústria de gado de corte tem como objetivo que as novilhas tenham seu primeiro bezerro com dois anos de idade, a fim de maximizar a produtividade durante a vida do animal. No entanto, algumas fêmeas não conseguem atingir este objetivo reprodutivo no início da estação de monta continuando pré-púberes e, consequentemente, seu desempenho reprodutivo limitado traz prejuízos econômicos ao produtor (Maquivar e Day, 2011). Tem sido relatado (Nogueira et al., 2004) que as novilhas peripúberes tiveram ciclos estrais curtos, caracterizado por um CL de vida curta (Figura 3). Esta evidência foi relatada anteriormente por Byerley et al. (1987), que sugeriram que a fertilidade é maior no terceiro estro após o início da puberdade. Este processo fisiológico de maturação pós-púbere limita a capacidade da novilha em obter uma prenhez bem sucedida se o animal entra na estação de monta em um estágio pré-púbere. Portanto, além da abordagem nutricional, o uso de progestinas para desencadear a cascata de eventos

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endócrinos e reprodutivos, que levam à puberdade, pode aumentar o número de animais que começam a ciclar antes da estação de monta. Basicamente, para induzir / sincronizar o ciclo estral em novilhas, uma ampla variedade de hormônios têm sido utilizada, no entanto, os resultados são variáveis. Um dos métodos mais comum é a utilização de progesterona natural ou sintética, isoladamente ou em combinação com outros compostos, como o estradiol, GnRH e seus análogos (gonadotropina coriônica eqüina; eCG) e análogos da prostaglandina. No entanto, apesar da variedade de programas de sincronização e protocolos, os resultados são variáveis em termos de eficácia em induzir os animais pré-púberes a ovularem e estabelecerem ciclos estrais normais antes da estação de monta e, finalmente, aumentar a fertilidade após a inseminação. Pfeifer et al. (2009) testaram o efeito de um programa curto de sincronização com CIDR por 5 dias, com ou sem o uso de PGF2α (500 mg de cloprostenol, i.m.) no dia da retirada do implante em novilhas pré-púberes. Foi observado que os animais que foram tratados com progesterona + PGF2α apresentaram uma maior taxa de ovulação em comparação com os animais tratados somente com progesterona e o grupo controle (Figura 8). Além disso, nenhuma das novilhas que foram tratadas apresentaram ciclo estral curto após a ovulação. Os resultados deste experimento sugerem que novilhas tratadas com CIDR, em combinação com PGF2α, ovularam de forma mais eficaz que nos outros tratamentos.

Figura 8. Esquema de sincronização e porcentagem de ovulação em novilhas angus pré-púberes. Adaptado de Pfeifer et al., 2009.

Em termos de indução da puberdade em novilhas Bos indicus (Nelore), estudos são limitados e as condições experimentais variadas. Claro Júnior et al., (2010) avaliaram a eficácia de CIDRs novos (CIDR1) e CIDRs usados previamente por 3 vezes (27 dias de uso; CIDR4) por 12 dias, para induzir a puberdade em 589 novilhas Bos indicus. Durante os primeiros 7 dias após a retirada do implante, as novilhas tratadas com CIDR, sejam eles novos

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ou usados, apresentaram maior incidência de estro (CIDR1, 42,6% - 101/237; CIDR4, 39,3% - 94/239) do que no tratamento controle (CIDR0, 19,5% - 22/113). Além disso, novilhas CIDR4 tiveram maior taxa de concepção em 7 dias (Ovuladas x Prenhas na IATF) (46,8%, 44/94), em comparação com o tratamento CIDR1 (33,7%, 34/101) e CIDR0 (27,3%, 22/06). Porcentagem de estro acumulado em 45 dias foi maior em CIDR1 e CIDR4 do que em CIDR0 (Figura 9). Finalmente, taxa de prenhez aos 90 dias (final da estação de monta) foi maior no CIDR1 (83,5%, 198/237) e CIDR4 (83,7%, 200/239), do que em CIDR0 (72,6%, 82/113). Estes resultados indicam que a utilização do CIDR, seja ele novo ou previamente utilizado, foi mais eficaz para acelerar a puberdade, resultando em aumento da proporção de novilhas detectadas em estro, e maior proporção de fêmeas gestantes. Além disso, observou-se no mesmo estudo, que no dia 0 (dia da retirada do implante), concentração de progesterona foi maior em CIDR1 (2,31 ± 0,11) do que CIDR4 (1,20 ± 0,11) e CIDR0 (0,37 ± 0,16).

Figura 9. Percentual acumulado de novilhas Bos indicus pré-púberes em estro tratadas ou não com implante de progesterona. Sem CIDR (CIDR0) CIDR Novo (CIDR1) ou CIDR usado previamente por três vezes (CIDR4). Adaptado de Claro Júnior et al., 2010.

Ainda em novilhas Nelore, Rodrigues et al. (2014), realizaram um experimento onde tinham o objetivo de testar um protocolo de indução de puberdade, seguido por um protocolo de sincronização do estro em novilhas pré-púberes. O delineamento foi realizado em dois estágios, onde no primeiro todas as novilhas pré-púberes foram expostas por 12 dias, à um dispositivo de progesterona usado (utilizado por 3 vezes = 27 dias), para induzir a primeira ovulação. No segundo estágio, as novilhas foram submetidas à um programa de sincronização do estro e IATF de 9 dias de permanência do dispositivo de progesterona, em 3 períodos após o protocolo de indução (10, 12 e 14 dias

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após). Não houve diferença significativa (P=032) na taxa de ovulação (86,9, 90,9 e 89,9% para os grupos 10, 12 e 14 dias, respectivamente). Já a taxa de concepção foi menor (P=0.04) no grupo 10 dias (38,2%), quando comparados aos grupos 12 e 14 (50,4% e 45,6%, respectivamente) Tabela 1.

Tabela 1. Taxas de ovulação, concepção, prenhez à IATF e prenhez ao final da estação de monta, em novilhas Nelore onde o protocolo de sincronização e IATF, iniciou nos intervalos de 10, 12 e 14 dias após o protocolo de indução da puberdade. Adaptado de Rodrigues et al. 2014.

Grupo 10 dias: protocolo de sincronização e IATF iniciado 10 dias após o protocolo de indução; Grupo 12 dias: protocolo de sincronização e IATF iniciado 12 dias após o protocolo de indução; Grupo 14 dias: protocolo de sincronização e IATF iniciado 14 dias após o protocolo de indução; Ψ Taxa de ovulação; ξ Taxa de concepção; Φ Taxa de prenhez à IATF; Σ Taxa de prenhez ao final da estação de monta; ab Letras diferentes na mesma linha diferem entre si (P<0,05)

Atualmente estão sendo desenvolvidos protocolo de indução da puberdade de novilhas Nelore com 14 meses, sendo a utilização destes, dependente do peso atingido pelas novilhas na referida idade, que deve ser superior a 270 kg.

CONCLUSÕESA idade à puberdade determina diretamente o desempenho

reprodutivo na vida do animal. O estado nutricional expresso pelo peso corporal no início da estação de monta, escore de condição corporal e taxa de crescimento durante à recria, desempenham um papel importante no desenvolvimento da puberdade e/ou indução em novilhas Nelore. A utilização de touros provados, tem impacto direto sobre a puberdade das novilhas, assim devemos utilizar sêmen de touros precoces, quando for realizada a IATF ou IA, já no repasse com monta natural, devemos dar preferência à touros com o Certificado Especial de Identificação e Produção (CEIP), pois estes passaram por um programa de melhoramento genético. Finalmente do ponto de vista prático, é importante para a maior lucratividade da pecuária nacional, que as novilhas sejam inseminadas durante os estágios iniciais da estação de monta, isso influencia principalmente no peso dos bezerros, pois sabe-se que novilhas que parem no final da estação de parição, desmamam bezerros mais leves, e são inseminadas com atraso na próxima estação de monta.

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CAPÍTULO 3

A RELAÇÃO DA CONDIÇÃO SEXUAL DE BOVINOS COM A QUALIDADE DA CARNE

Angélica Simone Cravo Pereira1, Lenise Freitas Mueller2, Adrielle Matias Ferrinho1, Joyce de Jesus Mangini Furlan1, Fernando Baldi3, Julio Cesar

de Carvalho Balieiro1

1Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ-USP2Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos – FZEA-USP3Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista - UNESP

RESUMO

Atualmente, as preocupações que envolvem a criação dos bovinos para produção de carne vão além dos fatores biológicos inerentes ao animal. Há uma grande preocupação sobre como o animal está sendo criado, abrangendo as áreas de bem-estar dos funcionários e dos animais, meio ambiente, responsabilidade social, qualidade do alimento, segurança alimentar, dentre outros. Os consumidores estão mais conscientes em relação à própria saúde, exigindo produtos com padrão superior de qualidade. Ao mesmo tempo, os produtores são conduzidos a produzir mais eficientemente estes produtos, de acordo com as novas exigências dos consumidores. A prática da castração de animais para abate é tradicionalmente realizada por motivos de manejo, econômicos e de aceitação do consumidor, em busca de uma carne macia, suculenta e com coloração adequada. A castração dos bovinos destinados ao abate apresenta constantes questionamentos no meio rural. Entre as dúvidas mais frequentes, pode-se citar a própria necessidade da castração, qual o melhor método a ser utilizado, além da época do ano e idade do animal. O grande desafio da bovinocultura brasileira é aprimorar as técnicas de castração e adequá-las às exigências atuais aliando a produtividade com o bem estar animal. Além disso, é preciso padronizar a qualidade da carne brasileira, tornando-a ainda mais competitiva no mercado interno e externo. É preciso também atender às exigências do consumidor, que está cada vez mais preocupado não só com a qualidade do produto que vai consumir, mas também com as condições de manejo em que o animal foi submetido durante a produção. É preciso padronizar as tabelas de bonificação pagas ao produtor, que hoje em dia possui uma grande variação dentro das parcerias entre associações de criadores e frigoríficos. A decisão pela castração ainda é do produtor e não um fator inerente à pecuária de corte, que beneficia os

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elos da cadeia. Contudo, todo o segmento da cadeia deve ter responsabilidade pela qualidade do produto, seja ele disponível para o mercado interno ou para atingir mercados importadores de carne.

INTRODUÇÃO O crescimento da produção na bovinocultura de corte brasileira

observado nos últimos anos é resultante do processo de modernização e transformações intensas, que permitiram ao setor ganhos extraordinários de volume e produtividade. Tais ganhos foram determinantes para inserir o país em condição de destaque como um grande produtor de carne bovina. Entretanto, para competir igualmente neste mercado, produzir carne de melhor qualidade e de alto valor agregado, além de possibilitar o aumento da produção e o atendimento da crescente demanda mundial por alimentos, o setor ainda deve evoluir em alguns aspectos, buscando alternativas tecnológicas que tornem o sistema de produção mais eficiente e viável economicamente.

A pecuária bovina no Brasil tem preconizado a produção de carcaças bem acabadas, porém com quantidade menor de gordura, seguindo a especificação mínima necessária para o resfriamento, sem o comprometimento da carne nos frigoríficos, mas ao mesmo tempo seguindo a tendência mundial de consumo de carne magra para a manutenção do bem-estar em nível de saúde pública (SCOLLAN et al., 2011). Isto se deve ao fato dos consumidores estarem mais conscientes em relação à própria saúde, exigindo produtos com melhores padrões de qualidade. Ao mesmo tempo, os produtores são conduzidos a produzir mais eficientemente produtos de melhor qualidade de acordo com as novas exigências dos consumidores (Prado et al., 2008a; Prado et al., 2008b).

Segundo Bretschneider (2005) e Mach et al. (2009), a prática da castração de animais para abate é tradicionalmente realizada por motivos de manejo, econômicos e de aceitação do consumidor. Muitos frigoríficos exigem a castração dos animais alegando que esse procedimento favorece a uniformidade e a qualidade da carcaça, além da conservação e do aspecto qualitativo da carne. CASTRAÇÃO EM BOVINOS

A castração de bovinos é uma prática comum em todo o mundo há séculos. Há relatos escritos já a partir do século XVI sobre como executar este procedimento (CAPUCILLE, 2002).

Em tempos remotos esta operação era praticada com a finalidade de facilitar a utilização dos animais machos no trabalho, ou para tornar sociáveis aqueles de comportamento agressivo, ou ainda para impedir a reprodução de indivíduos portadores de taras hereditárias (KOLB, 1987).

Atualmente, pode-se empregar a castração como ferramenta de manejo, visando reduzir a taxa metabólica basal e a energia de manutenção dos

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animais na fase de engorda ou para a obtenção de determinadas características de carcaça, como maior deposição de gordura subcutânea, resultando em qualidade à carne, além de maciez, sabor, textura e proteção durante o processo de resfriamento na indústria frigorífica, ou maior peso dos quartos traseiros, e ainda facilitar o manejo em conjunto machos e fêmeas em engorda, quando a prenhez não é desejada (KOLB, 1987; OLIVEIRA, SILVEIRA & PEDRA, 2006).

Embora esta técnica infrinja dor no animal e provoque um período de crescimento lento e de pior eficiência alimentar, há vantagens. Do ponto de vita do manejo de animais, a castração reduz a agressividade e atividade sexual, diminuindo os níveis de testosterona, e modifica as características de carcaça, diminuindo o número de animais com um pH muscular elevado e proporciona ainda o controle de acasalamentos indesejáveis. Bovinos não castrados tendem a produzir uma carne de pior qualidade, menos consistente e com grau de marmorização inferior (AMERICAN VETERINARY MEDICAL ASSOCIATION`S ANIMAL WELFARE DIVISION, 2009).

A castração pode ser classificada em três grupos principais: castração física, química e imunológica. Esses grupos podem ser divididos de acordo com a técnica. No entanto, no geral, a castração é realizada por meio da remoção dos testículos cirurgicamente, danificando-os irreversivelmente, ou levando-os a atrofia por estenose dos vasos (AMERICAN VETERINARY MEDICAL ASSOCIATION`S ANIMAL WELFARE DIVISION, 2009).

No que diz respeito a época correta para a realização da castração, em geral a melhor época é aquela onde haja mais benefícios do que prejuízos, ou seja, uma relação custo: benefício favorável (FEIJÓ, 1997). Quanto à idade, as consequências da castração dependem do momento em que ela é utilizada.

Antes da puberdade a castração impõe a completa interrupção do desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários, pela falta dos hormônios produzidos pelos testículos, o que torna o novilho bem diferente do touro. O desenvolvimento esquelético e a conformação corporal modificam-se com relação aos animais inteiros. Animais castrados antes da puberdade não apresentam impulso sexual e adquirem um comportamento menos sujeito ao estresse. Realizada após a puberdade, os efeitos são menos pronunciados e a regressão dos caracteres sexuais secundários varia em intensidade. Rapidamente desaparece a libido, assim como se atrofiam as glândulas anexas do trato genital, principalmente as vesículas seminais e a glândula bulbo uretral. Na urina diminui a excreção de andrógenos e pode aumentar a excreção de creatinina (mal utilizada nos animais castrados) e de gonadotrofinas (decorrente da secreção pré-hipofisária aumentada) (KOLB, 1987; FEIJÓ, 1997).

Segundo Oliveira, Silveira & Pedra (2006), a idade recomendada

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varia com a raça, o sistema de criação e plano nutricional adotado pelo produtor. Desta forma, nos sistemas extensivos de engorda a pasto, o ideal é fazer tal procedimento em torno de seis meses. Para animais que serão confinados ou semi-confinados se reduz este tempo em dois ou três meses dependendo da condição corporal em que se encontram os animais por ocasião da castração. Assim os animais podem ser castrados a partir dos 18 a 20 meses de idade até 24 meses.

No entanto, do ponto de vista de bem estar animal, o ideal seria realizar o procedimento, visto que ainda o método mais utilizado é o procedimento cirúrgico, na fase até os primeiros seis meses de idade. Portanto, as idades recomendadas variam desde o nascimento até poucos meses antes do abate. Castrar ao nascimento apresenta como principal desvantagem a não utilização do efeito anabólico dos hormônios produzidos nos testículos. Retardar a castração para a época do desmame coincide com prática estressante, assim como a proximidade da época de restrição alimentar (SOARES, 2005).

Com os objetivos de melhorar o desempenho e tentar minimizar a perda de peso anterior ao confinamento, aproximando o peso dos animais castrados ao dos inteiros, Silva (2005) estudou métodos (burdizzo ou faca) e épocas de castração (15 dias antes ou ao início do confinamento) e verificou que os manejos utilizados não influenciaram o ganho de peso (103 dias de confinamento) e peso de abate dos castrados, sendo estes inferiores aos inteiros. Além disso, animais castrados, independentemente do método, quando castrados 15 dias antes do início do confinamento, tiveram peso de carcaça quente inferior às demais situações de manejo, mas não afetaram o rendimento.

TIPOS DE CASTRAÇÃOExistem diferentes tipos de castração, entre elas, a castração cirúrgica

convencional, a castração química e a castração imunológica, também chamada de imunocastração. Todos esses tipos de castração consistem em impedir que ocorra a produção de hormônios androgênicos, que são os responsáveis pela manifestação das características indesejáveis tais como comportamentos agressivos e de caráter sexual.

CASTRAÇÃO CIRÚRGICA CONVENCIONALA orquiectomia é classificada como um dos métodos físicos mais

utilizados. Moura (1996) definiu a castração convencional como a operação cirúrgica que consiste na ablação testicular ou supressão funcional dos órgãos reprodutores, realizada pela retirada dos mesmos (testículo no macho e ovário na fêmea), geralmente destinada a tornar mais dóceis os animais de trabalho, a facilitar a engorda e melhorar a qualidade da carne nos animais destinados ao corte.

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Apesar de bastante comum, é um procedimento cirúrgico com considerável potencial para complicações, devido à natureza das cirurgias e das condições sob as quais são realizadas (STAINKI, 2006), onde o animal fica suscetível às infecções e miíases e o tempo de recuperação do animal é maior, em especial quando é realizada anterior a entrada dos bovinos em confinamento para engorda e terminação, levando a possíveis queda no desempenho destes animais.

CASTRAÇÃO QUÍMICAA castração química consiste na aplicação de soluções, por exemplo,

aldeído-fórmico juntamente com cloreto de cádmio, a fim de atrofiar os testículos. É uma técnica menos invasiva e de simples execução. No entanto, não é muito utilizada atualmente.

CASTRAÇÃO IMUNOLóGICA OU IMUNOCASTRAÇÃOA imunocastração consiste em uma vacina anti-GnRH que estimula

o sistema imunológico do animal a produzir anticorpos específicos contra o fator liberador de gonadotrofinas (GnRH), inibindo a liberação de hormônios sexuais (OLIVER et al., 2003). O GnRH é secretado pelo hipotálamo e se liga ao seu receptor na hipófise, onde desencadeia a liberação do hormônio luteinizante (LH) e do hormônio folículo estimulante (FSH). O LH e o FSH, por sua vez, estimulam a função dos testículos e dos ovários (JANETT et al., 2012). Assim, pela neutralização do GnRH natural, a vacina bloqueia a liberação de hormônios sexuais e seus efeitos no comportamento animal, na produtividade e na qualidade da carne (HUXSOLL et al., 1998).

Desde 1979 a imunização ativa contra GnRH tem sido proposta como uma alternativa à castração cirúrgica em bovinos (ADAMS e ADAMS, 1992), pois reduz o comportamento agressivo dos bovinos (PRICE et al., 2003) e melhora as características de carcaça e da carne (AMATAYAKUL-CHANTLER et al., 2012).

Um recente estudo foi conduzido por Amatayakul - Chantler et al. (2013), com o objetivo de avaliar o efeito da imunocastração em bovinos Nelore, comparando-se com animais castrados cirurgicamente. Os autores relataram que os animais imunocastrados tiveram área de olho de lombo maior do que os castrados cirurgicamente.

Em estudo realizado por Roça et al. (2011a), com bovinos Nelore ou anelorados criados em pasto, imunocastrados com duas ou três doses de anti-GnRH (três e oito meses de efeito de castração, respectivamente). Os pesquisadores observaram que bovinos vacinados com duas ou três doses de anti-GnRH apresentaram maior área de olho de lombo, quando comparados com bovinos castrados cirurgicamente. Animais que receberam duas doses

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apresentaram maior peso de carcaça quente e menor espessura de gordura subcutânea medida na altura da 12ª costela. Além dessas características, não foram observadas diferenças entre as três condições sexuais para pH final, maciez, coloração da gordura e da carne e perdas totais por cozimento (ROÇA et al., 2011b).

Portanto, de acordo com os pesquisadores, a imunocastração é uma alternativa viável sob a ótica do bem-estar animal, em comparação à castração cirúrgica em bovinos de corte da raça Nelore criados em pasto.

Desta forma, uma vez que a vacinação anti-GnRH exerce efeito num espaço de tempo relativamente curto, a imunocastração pode ser aplicada em bovinos de corte imediatamente antes de transferí-los para o confinamento, ou enquanto já estiverem confinados.

Os resultados de características de carcaça apresentados na literatura, comparando bovinos machos imunocastrados com machos castrados cirurgicamente indicaram que os pesos de carcaça de animais imunocastrados foram maiores do que de animais castrados cirurgicamente (ADAMS e ADAMS, 1992; ADAMS et al., 1996; ASSAÏT et al., 2002; AMATAYAKUL-CHANTLER et al., 2013), assim como os pesos de carcaça de animais imunocastrados e não castrados foram similares (AMATAYAKUL-CHANTLER et al., 2012; ADAMS et al., 1996). Os atributos de qualidade de carne apresentaram-se semelhantes em animais imunocastrados e castrados cirurgicamente (AMATAYAKUL- CHANTLER, 2013).

ANIMAIS NÃO CASTRADOSA maior parte dos bovinos em fase de terminação no Brasil são

animais não castrados, que apresentam qualidade de carcaça e carne muito variáveis. De fato, são muitas as justificativas que levam o sistema de produção a terminar animais sem uso de castração, e a principal delas é que animais não castrados tem produção mais eficiente de carne e, portanto, atende prontamente a necessidade de maiores quantidades de proteína animal para a crescente população mundial (FIELD, 1971).

Euclides Filho et al. (2001) encontraram diferença na área de olho de lombo, sendo os maiores resultados para os animais não castrados. Vaz et al. (2001) estudaram bovinos Nelore, Charolês e seus cruzamentos e encontraram maiores valores de área de lombo em animais não castrados, quando comparados àqueles castrados cirurgicamente.

A decisão de castrar ou não os animais é um assunto muito polêmico, pois enquanto a carne de animais castrados apresenta melhores características de carcaça e melhoria na qualidade da carne (SEIDEMAN et al. 1982), o desempenho dos animais não castrados tem se mostrado mais eficiente. Ademais, para os pecuaristas, a produção de animais castrados significa

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reduzir a eficiência do crescimento do animal (COSTA et al., 2007) sem ser melhor remunerado por tal prática.

Esse fato é facilmente compreendido quando analisado pelo ponto de vista dos elos produtivos da cadeia bovina. Porém, é necessário que as tecnologias visem atender, de forma conciliadora, aos interesses de todos os segmentos, incluindo, o produtor, a indústria e o consumidor final.

ANIMAIS CASTRADOS X INTEIROS: COMPARAÇÕESQuando as carcaças de bovinos inteiros e castrados são comparadas,

de acordo com os resultados, têm-se concluído que àquelas de bovinos inteiros são superiores em peso e conformação, assim como apresentam maior proporção de músculo. Estas vantagens, entretanto, perdem valor comercial pela qualidade da carcaça, principalmente, em função de deficiência na gordura de cobertura nas carcaças (EMBRAPA, 1997).

A deposição de gordura na carcaça é importante porque, enquanto a gordura intramuscular contribui para melhorar a satisfação do provador na degustação da carne, a gordura subcutânea previne as perdas de rendimento da carcaça durante o resfriamento, após o abate.

Com a falta da cobertura de gordura, a carcaça dos bovinos inteiros, durante o resfriamento, desenvolve um escurecimento da parte externa dos músculos, que prejudica o aspecto e, consequentemente, deprecia o valor comercial. Isto Justifica, em parte, o desconto que os frigoríficos costumam impor sobre o valor pago no abate de animais inteiros (EMBRAPA, 1997).

Maiores pesos de abate e carcaça quente e fria em bovinos inteiros em relação aos castrados foram relatados nos estudos de Arthaud et al. (1977), Restle et al. (1994a), Restle et al. (1996), Restle & Vaz (1997), Restle et al. (2000b), Euclides Filho et al. (2001), Padua et al. (2004) e Tullio (2004), quando submetidos a sistemas mais intensivos, onde a condição nutricional não é fator limitante ao desempenho dos animais, como o confinamento a que estes animais foram submetidos. Lee et al. (1990) e Restle et al. (1994b) comentaram que as diferenças no desempenho entre animais inteiros e castrados são mais acentuadas, com melhores resultados para bovinos inteiros. Isto devido à maior ação hormonal proveniente dos hormônios androgênicos, entre eles a testosterona, produzida nos testículos (FIELD, 1971).

No entanto, se por um lado há maior síntese proteica e maior atividade de hormônios beta adrenérgicos em bovinos não castrados, por outro lado, do ponto de vista de qualidade de carne, a ação dos hormônios beta adrenérgicos pode resultar em efeitos negativos na qualidade da carne, em especial para a maciez, pelo aumento da atividade de calpastatina, um inibidor das calpaínas. O grau de alteração depende da espécie, tipo de músculo, em particular de beta agonistas adrenérgicos (Dransfield, 1994).

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Portanto, o sistema das calpaínas, principalmente a calpastatina tem grande importância no processo de amaciamento da carne. As calpastatinas são reguladas via agonistas beta adrenérgicos (BAA), em nível de transcrição gênica ou fosforilação da proteína.

Segundo Morgan et al. (1993), a atividade das calpaínas não foi influenciada pela prática da castração. Contudo, a atividade de calpastatina foi maior, em músculos de bovinos não castrados. Além disso, verificou-se um menor índice de fragmentação miofibrilar, indicando menor proteólise nos músculos dos animais não castrados, quando comparados ao grupo controle, durante os primeiros 7 dias pós-morte. Desta forma, uma maior ativiidade de capalstatina – 24 horas pós-morte pode ser associada com um aumento da força de cisalhamento, resultando em carnes mais duras em bovinos não castrados.

Nos estudos de Field (1971), Bretschneider (2005) e Rotta et al. (2009) os autores descreveram vantagem dos castrados em relação aos não castrados quanto a maciez da carne. No entanto, Seideman et al. (1982) não observaram diferenças na maciez da carne entre castrados e não-castrados. No trabalho de Vaz e Restle (2000), animais não-castrados apresentaram carne mais macia frente os castrados. Ao estudarem as características de carcaças de bovinos castrados e não-castrados, Bretschneider (2005) verificaram que os animais não-castrados apresentaram carcaças mais pesadas, com maior rendimento, maior proporção de tecido muscular, porém com espessura de gordura subcutânea semelhante à de bovinos castrados.

A menor deposição de gordura na carcaça de animais inteiros é amplamente divulgada na literatura. No entanto, esta menor espessura de gordura somente é importante quando apresentar abaixo do mínimo de 3 mm, exigido pelos frigoríficos. A terminação de animais em confinamento, aparentemente resolve o problema, pelo menos em animais de grupos genéticos com precocidade para deposição de gordura. Em machos terminados em confinamento dos 20 aos 24 meses de idade, a espessura de gordura nos animais inteiros foi de 1,06; 3,70; 3,25 e 2,67 mm, respectivamente, para os grupos Charolês (C), Nelore (N), 1/2C1/2N e 1/2N1/2C. Já, nos animais castrados, a espessura de gordura, foi de 2,14; 5,86, 4,00 e 5,17 mm (RESTLE et al., 1999), respectivamente para os grupos (C), (N), 1/2C1/2N e 1/2N1/2C.

QUALIDADE DA CARNE DE ANIMAIS INTEIROS E CASTRADOSNo Brasil, o aumento na incidência de carne escura tem sido atribuído

ao abate crescente de animais inteiros, que seriam mais agitados e agressivos do que os castrados, portanto mais propensos ao estresse pré-abate. Os animais inteiros são mais reativos, montam uns nos outros, brigam, se movimentam muito durante o transporte e repetem esse comportamento inquieto nos currais dos frigoríficos. A prática de castração foi sendo abandonada pelos

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pecuaristas nas duas últimas décadas por questões econômicas. Um dos únicos levantamentos realizados, diagnosticou, em 2005, que animais inteiros representavam apenas 25% dos machos abatidos no País, mas em 2012 já eram 72% (DBO, 2014).

Um levantamento feito em 2013 pela maior empresa processadora de carnes do mundo, JBS/Brasil, mostrou que 47,2% dos animais inteiros apresentavam padrão indesejável para essa indústria: peso inadequado, idade superior a 3,5 anos e acabamento insatisfatório. Apenas 5,1% se classificavam como desejáveis: peso adequado, gordura mediana ou uniforme e até oito dentes definitivos. Já no grupo dos castrados, tais percentuais eram de 11,1% e 33%, respectivamente.

Perdas qualitativas, decorrentes do estresse durante o manejo pré-abate, resultam em alterações metabólicas que comprometem a qualidade na carne. Quando o animal sofre o estresse ou faz esforço físico, ocorre a queima da reserva de glicogênio presente no músculo. Após o abate, o glicogênio é transformado em ácido láctico, através do processo de glicólise anaeróbica. No momento em que o glicogênio passa a ser transformado em ácido láctico, o pH da carne vai decrescendo (LUCHIARI FILHO, 2000). Na ocorrência da depleção total do glicogênio antes do abate, não ocorrerá a queda necessária do pH para transformação de carne em músculo.

De acordo com as exigências impostas pela União Européia, entre outros mercados consumidores estrangeiros, valores de pH aceitos sem restrições alguma são aqueles que variam na faixa de 5,6 a 5,8. Valores superiores a esses, entre 5,8 e 6,0, são descartados para alguns mercados mais exigentes. Animais que apresentam o pH final acima de 6,0 (carne tipo DFD – do inglês Dark, Firm, Dry – Escura, Dura, Seca) são distribuídos apenas para o mercado interno, atingindo valores econômicos menores. De acordo com Kuber et al. (2004), a curva de pH sofreria decréscimo importante até a sexta hora de resfriamento em câmara fria após o abate, sendo que após esse tempo, permanece praticamente estável. A importância que a queda no pH ocorra normalmente, sem o risco de ocorrência de carne tipo DFD é ter um maior cuidado com os animais desde o manejo de embarque até os momentos que antecedem o abate (LUCHIARI FILHO, 2000; DALLA COSTA, 2005). Para que se possa garantir que os animais cheguem ao momento de abate com o menor nível de estresse, no caso específico do transporte rodoviário, deve-se ter em conta as condições do ambiente físico (distância percorrida, tipo e condições dos veículos) e social (densidade e composição do grupo), além das características dos próprios animais (raça, idade, sexo), do manejo no embarque e na condução do veículo.

Por outro lado, animais inteiros podem apresentar carne de coloração normal. Tudo depende da maneira como eles são manejados, porém devido o

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fato do temperamento excitável, principalmente em criações a pasto, estes são mais propensos a carne DFD (DBO, 2014).

CONSIDERAÇÕES FINAIS A produção de carne de bovinos inteiros pode ser produtiva e rentável.

Vale lembrar que a seleção por temperamento dos animais pode ser uma ferramenta importante, que pode refletir na qualidade do produto final carne, assim como o manejo nutricional dos animais. Contudo, ainda é necessário avanço na qualidade de produção da carne de bovinos inteiros. A castração pode ser recomendada em casos nos quais há uma maior remuneração pelo aspecto qualitativo da carcaça, pois confere às carcaças maior espessura de gordura e, conseqüentemente, melhor acabamento.

Segundo os estudos, têm-se demonstrado que a carne de animais castrados apresenta melhor qualidade quando comparados a de animais inteiros. De modo geral, no Brasil, ainda não há um consenso ou padronização da castração principalmente por questões econômicas. A maioria das empresas frigoríficas não realiza bonificação pela qualidade da carcaça e o produtor não vê vantagens em investir na produção de bovinos com qualidade. O fato é que a decisão pela castração é uma ferramenta de manejo na propriedade e diante desta situação, há dúvidas e questionamentos. Mais recentemente, a parceria entre associações de criadores e grupos frigoríficos tem incentivado a produção de carne com qualidade, mas cada empresa possui sua tabela de classificação e exigências. Isso demonstra a carência de estudos e a necessidade de auxílio ao produtor sobre qual método, idade ou época é mais vantajosa realizar a castração.

A carne brasileira tem potencial para se tornar mais competitiva no mercado, com o fortalecimento de características da produção agrícola como selo de certificação, rastreabilidade, tipificação e bonificação pelas características de carcaça e qualidade da carne. No entanto, ainda há dificuldades, que iniciam desde a seleção de animais por temperamento, implantação de Boas Práticas Agropecuárias nas fazendas, perdas econômicas.

Não obstante, avanços tecnológicos no processamento da carne podem realçar a qualidade da carne de bovinos inteiros, como uso de estimulação elétrica nas carcaças pré rigor, que podem melhorar a maciez da carne.

Portanto, a qualidade da carne deve ser analisada do pasto ao prato, como cadeia, envolvendo todos os segmentos desde o produtor, indústria processadora, varejo e consumidor.

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CAPÍTULO 4

IMPACTO DE ESTRATéGIAS NUTRICIONAIS NO DEJETO DE SUÍNOS

Esther Ramalho Afonso1; Julio Cesar Pascale Palhares2 e Augusto Hauber Gameiro1

1 Programa de Pós-graduação em Nutrição e Produção Animal, Faculdade de Medicina veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. Pirassununga, São Paulo.2 Pesquisador em Avaliação de Impactos Ambientais e Manejo de Recursos Hídricos na Pecuária, Embrapa Sudeste, São Carlos, São Paulo.

RESUMOA suinocultura é conhecida como uma atividade com potencial poluidor,

por produzir grandes quantidades de resíduos com alta carga de nutrientes, matéria orgânica, sedimentos, patógenos, metais pesados e antibióticos. Os potenciais impactos ambientais da atividade suinícola são causados, em grande parte, pelo manejo incorreto dos dejetos, oriundos do manejo nutricional. Portanto, a redução do potencial poluidor da atividade inicia-se com a correta nutrição, baseada em conceitos e princípios nutricionais e ambientais, ou seja, quanto mais eficiente à escolha dos ingredientes, balanceamento destes e oferta aos animais, menor o impacto da nutrição, além de beneficiar o manejo ambiental, pela redução da excreção de nutrientes como nitrogênio, fósforo, cobre e zinco. A regulamentação do controle da poluição no meio urbano e rural é feita através de algumas leis, como: Lei dos Crimes Ambientais, Lei do Gerenciamento dos Recursos Hídricos e leis de licenciamento da atividade, que são específicas para cada estado, assim autorizando a implantação e operação de atividades potencialmente poluidoras, como a criação de suínos. O desafio, sob estas condições, consiste no uso de instrumentos capazes de harmonizar a continuidade da atividade com o uso racional dos recursos naturais e a preservação da qualidade ambiental. Para tanto, esse capítulo esclarece alguns instrumentos nutricionais que visam diminuir a excreção de nutrientes pelos suínos e práticas e tecnologias para o manejo de dejetos.

INTRODUÇÃOA carne suína responde por, aproximadamente, 40% do consumo de

carne no mundo. Considerando a demanda global até 2020, que indica rápida expansão do consumo de carne e a projeção de aumento de 20% na produção global de alimento, o setor suinícola terá um papel importante para atender a demanda projetada. Consequentemente, a questão ambiental terá grande foco,

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principalmente para as populações que vivam próximas a criações intensivas de suínos (OCDE, 2007).

O Brasil é o quarto produtor e exportador mundial de carne suína, com 3.370 mil toneladas e 600 mil toneladas, respectivamente, em 2013 (ABIPECS, 2013). A suinocultura brasileira tem como principal característica a grande concentração de animais por área, visando atender o mercado interno e externo de carne e seus derivados a preços competitivos.

A suinocultura também é conhecida como uma atividade de significativo potencial poluidor, por produzir grandes quantidades de resíduos com alta carga de nutrientes (especialmente fósforo e nitrogênio), matéria orgânica, sedimentos, patógenos, metais pesados (principalmente cobre e zinco utilizados nas rações como promotores de crescimento) e antibióticos (USDA; USEPA, 1999). O modelo atual de produção de suínos é caracterizado pela criação intensiva e em confinamento, concentrando, portanto, grande número de animais em áreas reduzidas, aumentando ainda mais os riscos de contaminação ambiental.

Muito se tem discutido sobre os efeitos das criações intensivas sobre o meio ambiente e a saúde humana. A poluição da água e do ar provocada pelo manejo inadequado dos dejetos suínos vem se tornando cada vez mais importante. De acordo com a FAO (2005), as maiores formas de poluição em áreas de concentração de produção animal incluem: i) Eutrofização de corpos d’água superficiais, morte de peixes e de outros organismos aquáticos; ii) Contaminação das águas subterrâneas por nitratos e patógenos e consequente ameaça às fontes de abastecimento humano; iii) Excesso de nutrientes e metais pesados nos solos, depreciando sua qualidade; iv) Contaminação dos solos por patógenos; e v) Liberação de amônia, metano e outros gases na atmosfera.

A redução do potencial poluidor da atividade suinícola inicia-se com a correta nutrição, baseada em conceitos e princípios nutricionais e ambientais. Desta forma, quanto mais eficiente a escolha dos ingredientes, balanceamento destes e oferta aos animais, menor o impacto da nutrição no meio ambiente, além de beneficiar o manejo ambiental, pela redução da excreção de nutrientes como nitrogênio e fósforo.

Várias estratégias nutricionais têm sido estudadas pela constante preocupação dos pesquisadores em busca de alternativas que visam minimizar a emissão de poluentes para o meio ambiente. Algumas dessas estratégias já foram validadas e comprovaram apresentar impacto positivo na redução de metais, fósforo e nitrogênio. Dentre elas, destaca-se a utilização de fitase, minerais orgânicos e redução da proteína bruta da ração (PALHARES et al., 2010). A utilização da enzima fitase tem como finalidade melhorar a eficiência zootécnica na produção pelo aumento da digestão de produtos de qualidade nutricional inferior. Os minerais orgânicos tem a função de tornar minerais

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mais biodisponíveis para os suínos e melhorar o desempenho dos animais. A redução da proteína bruta da ração otimiza a utilização de nutrientes da dieta. Ambas as estratégias têm sido utilizadas visando redução da quantidade de nutrientes nos dejetos.

Em alguns países europeus a utilização de estratégias nutricionais já faz parte das políticas ambientais. Segundo Dourmad et al. (1999) na França e na Dinamarca consumiu-se 80 g de N/kg de suíno produzido; na Holanda este consumo foi de 74 g de N/kg, sendo justificado pelo menor teor de nitrogênio nas dietas. A utilização da fitase foi uma das primeiras regulamentações implementadas na Holanda no início dos anos oitenta, decisão essa que acabou trazendo vários benefícios ambientais (PALHARES et al., 2010).

No Brasil há leis que regulam o controle da poluição no meio urbano e rural: a Lei dos Crimes Ambientais, a Lei do Gerenciamento dos Recursos Hídricos e as leis de licenciamento da atividade que são específicas para cada estado. No Rio Grande do Sul, por exemplo, há a FEPAM (Fundação Estadual de Proteção Ambiental Henrique Luís Roessler), instituição responsável pelo licenciamento ambiental das atividades de impacto local para proteção dos ecossistemas e melhoria na qualidade ambiental, cabendo à mesma autorizar a implantação e operação de atividades potencialmente poluidoras, como a criação de suínos.

IMPACTO AMBIENTAL RELACIONADO AO DEJETO DE SUÍNOSOs elementos que serão considerados nos dejetos de suínos serão:

nitrogênio, fósforo, cobre e zinco.

NITROGêNIO E FóSFOROTanto o nitrogênio quanto o fósforo, na forma orgânica e inorgânica,

aparecem nos dejetos de suínos. Grande parte desses resíduos é utilizada na adubação de plantações em geral. O potencial do fósforo para contaminar a terra e a água é menor do que o nitrogênio, porque o fósforo se adere às partículas do solo, tornando-se assim um contaminante parcial dos rios e lagos, devido à sua translocação ser limitada (COFFEY, 1992). No entanto, uma vez o fosfato em contato com a superfície da água, há o estímulo ao crescimento das algas, processo chamado de eutrofização, o que resulta em decréscimo na qualidade da água fresca. A decomposição destas algas diminui a quantidade de oxigênio na água, criando um meio inadequado para os peixes e outros animais aquáticos (CROMWELL et al., 1993).

O nitrogênio é um dos nutrientes mais importantes, tanto para as plantas quanto para os microrganismos, porém seu uso intensivo na agricultura tem gerado uma série de impactos e danos ao ecossistema e solos, como a contaminação dos lençóis freáticos, a eutrofização das águas superficiais,

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chuva ácida, diminuição da camada de ozônio e a mudança no clima global (RODRIGUES et al., 2007).

O nitrogênio está presente em várias formas e estados de oxidação sendo as de maior relevância: o nitrogênio orgânico dissolvido e particulado, o nitrogênio amoniacal (NH3/NH4+), nitrito (NO2-) e nitrato (NO3-) (DIESEL et al., 2005; KUNZ et al., 2007; OENEMA et al., 2007). O nitrogênio amoniacal apresenta-se tóxico para peixes com alta demanda de oxigênio. O nitrito pode se combinar com aminas secundárias, provenientes da dieta alimentar, formando nitrosaminas que apresentam poder carcinogênico e mutagênico (KUNZ et al., 2007).

Além do fósforo e nitrogênio, os suínos podem excretar de 80% a 95% do total diário consumido de cobre e zinco (Cu e Zn) (NOVAK et al., 2008). Tanto o Cu e Zn podem ser tóxicos para determinadas culturas vegetais e plantas forrageiras, além de aumentar o odor dos dejetos, tornando-se uma preocupação ambiental (JONDREVILLE et al., 2003; NOVAK et al., 2008).

COBRE E ZINCOO cobre e o zinco apresentam propriedades antibacterianas, embora

não sejam classificados como agentes antimicrobianos, aumentando o ganho de peso e melhorando a conversão alimentar nas fases de pós desmame e crescimento, efeito que não é observado durante a fase de terminação, acima de 50 kg na maioria dos experimentos relatados e, desta forma o uso de altos níveis de cobre nesta fase apresenta como desvantagem um alto custo ambiental, pois sua concentração nos dejetos é proporcional ao nível utilizado nas dietas (LÜDKE & LÜDKE, 2005).

Em virtude do baixo custo, esses minerais têm sido largamente utilizados em dietas de suínos, em todas as categorias, muitas vezes sem critérios científicos (LIMA, 2007). A suplementação do Cu e Zn nas dietas de suínos é permitida na Europa com níveis máximos de 170 mg de Cu/kg para animais até 12 semanas e 150 mg de Zn/kg (REVY et al., 2004). Já no Brasil, a indústria de ração costuma usar doses elevadas de Cu (250 mg/kg) e de Zn (3000 mg/kg) na ração de leitões, visando a prevenção de diarreias e estimulante do crescimento, respectivamente (PERDOMO, 2001).

Como mencionado anteriormente, a suinocultura é uma atividade de grande potencial poluidor por produzir grandes quantidades de resíduos, tanto para a atmosfera quanto o escoamento dos elementos para o subsolo e aguas superficiais e subterrâneas. Vários fatores podem influenciar a quantidade de nutriente excretado, destacando-se a qualidade do alimento, digestibilidade, disponibilidade e níveis dos nutrientes presentes na dieta (NRC, 1998).

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MANIPULAÇÃO NUTRICIONAL DA DIETA Os elementos que serão considerados neste capítulo são: enzima

fitase, minerais orgânicos e redução da proteína bruta, com suas propriedades na alimentação de suínos.

ENZIMA FITASEAtualmente, sabe-se que os maiores avanços tecnológicos na nutrição

animal são obtidos pelas opções de uso de novos ingredientes ajustados às exigências nutricionais. Estima-se que 70% do fósforo dos vegetais sejam indisponíveis para não ruminantes (SILVA et al., 2005). De acordo com Lehninger et al. (1993), fósforo fítico é a designação dada ao fósforo que faz parte da molécula do ácido fítico (hexafosfato de inositol) que é encontrado nos vegetais. Por causa do seu grupo ortofosfato, altamente ionizado, este complexa com uma variedade de cátions (Ca, Fe, Cu, Zn, Mn e Mg) e grupo amina de alguns aminoácidos (lisina, arginina, histidina e outros). Este complexo caracteriza o fitato como um fator antinutricional por diminuir, além da disponibilidade de minerais, também a de proteínas (MORRIS, 1986). O ácido fítico é um complexo orgânico que ocorre naturalmente nas plantas para uso durante a germinação, formando uma variedade de sais insolúveis com cátion mono, di e trivalentes (FIALHO et al., 2008).

A enzima fitase (mio-inositol hexafosfato fosfohidrolase) é uma fosfatase que catalisa a hidrólise do ácido fítico a fosfato de inositol, myo-inositol e fósforo inorgânico (JONGBLOED et al., 1994; VATS & BANERJEE, 2004). A fitase é produzida comercialmente pelos fungos do gênero Aspergillus através de técnicas de recombinação de DNA (FIREMAN & FIREMAN, 1998). Este aditivo alimentar tem sido incorporado às rações com a finalidade de melhorar a eficiência de produção dos animais pelo aumento da digestão de produtos de baixa qualidade e redução na perda de nutrientes nas fezes, além de reduzir a suplementação com fósforo inorgânico, diminuindo custos e melhorando a utilização do fósforo e outros nutrientes presentes nos alimentos (SILVA et al., 2005).

Baseado na comprovação de que a fitase tem sido largamente estudada em dietas de suínos e aves, vale frisar que nos vegetais cerca de dois terços do fósforo encontram-se ligados aos fitatos, quantidade suficiente para atender às funções essenciais dos suínos, se não fosse sua baixa disponibilidade, variando de 15% a 50%, dependendo do vegetal. Assim, há necessidade de suplementar fósforo com fontes inorgânicas para atender as exigências visando o máximo desempenho dos animais, fazendo com que os suínos sejam alimentados com quantidades de fósforo acima das necessidades, tendo como consequência a eliminação do excesso através dos dejetos, agravando-se o problema de contaminação ambiental.

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A fitase não está presente no trato gastrointestinal de monogástricos em quantidades suficientes (LÜDKE et al., 2000). Uma vez que os animais não possuem a enzima fitase endógena, o fósforo presente nas ligações não consegue ser hidrolisado para posteriormente ser absorvido pelo trato digestório, sendo eliminado nas excretas quase na sua totalidade. O modo de ação da enzima fitase consiste no mecanismo de transferência do grupo fosfato do substrato para enzima e da enzima para água (FIREMAN & FIREMAN, 1998).

Além de aumentar a disponibilidade do fósforo, a utilização de fitase também melhora a disponibilidade de outros minerais, como magnésio, cobre, ferro e zinco (ADEOLA et al., 1995). Fireman & Fireman (1998) observaram que suínos apresentaram diminuição na quantidade de fezes excretadas quando se adicionou níveis crescentes de fitase. Silva et al. (2005) verificaram que a fitase reduziu de forma linear a excreção fecal de manganês, mas não afetou a excreção de zinco e magnésio nas fezes dos suínos.

Lüdke et al. (2000) trabalharam com suínos na fase de crescimento e avaliaram a quantidade de nitrogênio, fósforo e cálcio consumidos e excretados. Observaram que à medida que os níveis de fitase foram aumentados (0, 300, 600 e 900UF/kg) os níveis de suplemento inorgânico foram reduzidos. Os teores de cálcio foram reduzidos em 10% em relação à dieta controle (sem fitase e com fosfato inorgânico) e foram utilizados níveis de proteína bruta. Os autores concluíram que níveis entre 421 a 466 UF/kg da dieta proporcionam redução nas quantidades de nitrogênio, fósforo e cálcio excretados, amenizando a carga de poluição ambiental. Machinsky et al. (2010) concluíram que a adição da fitase (500 UF/Kg) na ração melhora a retenção de P, reduzindo a excreção fecal e urinária deste elemento para suínos com 24 kg de peso vivo. Resultado diferente foi obtido por Cromwell et al. (1995), em que a suplementação de baixo nível de fósforo com adição de fitase, aumentou a absorção deste elemento, mas não houve redução na excreção pelas fezes.

MINERAIS ORGâNICOSAs exigências nutricionais de minerais exibidas pelo NRC são

criticadas por serem muito baixas para serem recomendadas para as linhagens de suínos atuais. A maior parte destas exigências foi determinada há algumas décadas ou simplesmente estimadas (RUTZ & MURPHY, 2009). Com isso, nutricionistas frequentemente utilizam níveis mais elevados de minerais, grande parte das vezes baseado em seu próprio conhecimento prático. Esta situação pode causar risco de uma interação adversa entre minerais, bem como aumentar os níveis excretados dos mesmos, sendo prejudicial ao meio ambiente (LEESON, 2008).

A partir desta problemática, foram desenvolvidos os minerais orgânicos para propiciar melhor metabolismo e desempenho dos animais.

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A Association American Feed Control Oficial (AAFCO) (2000) define os minerais orgânicos como íons metálicos ligados quimicamente a uma molécula orgânica, formando estruturas com características únicas de estabilidade e de alta biodisponibilidade mineral. Eles são melhor absorvidos, mais passiveis de propiciar um melhor desempenho, qualidade de carcaça, tempo de prateleira de produtos avícolas e suinícolas, entre outros. A sua eficiência, entretanto, pode variar conforme a maneira que é produzida.

Assim, a utilização dos minerais na forma orgânica torna-os mais biodisponíveis, aumentando a sua utilização pelos monogástricos. Além disso, podem garantir a suplementação de microelementos com dosagens inferiores às normalmente utilizadas com os ingredientes inorgânicos, reduzindo os requisitos do nutriente para os animais e consequentemente sua excreção nos dejetos (PEREIRA et al., 2009).

O uso de minerais orgânicos, denominados assim por estarem ligados a certos aminoácidos, permite que sejam absorvidos pelos mesmos transportadores das moléculas orgânicas. Dessa forma, os minerais orgânicos podem ser absorvidos pelo organismo em maiores quantidades, possivelmente por não sofrerem influência competitiva de outros minerais ou elementos que possuam cargas e que estão presentes normalmente no conteúdo do trato gastrointestinal (AMMERMAN et al., 1995).

Em alguns estudos relatou-se que a disponibilidade aparente do quelato de zinco e cobre foi 106 e 120%, quando comparado com fonte inorgânica desses minerais, sulfato de zinco e sulfato de cobre (SECHINATO, 2003). Em contrapartida, Cheng et al. (1998) demonstraram que ZnSO4 e o complexo Zn-lisina foram igualmente eficientes na absorção de Zn e no crescimento em suínos jovens.

Outros benefícios dos minerais orgânicos estão na melhor conversão alimentar, ganho de peso e menor custo na produção (APCS, 2004). De acordo com Close (1999), observou-se que suínos alimentados com Cu orgânico obtiveram desempenho similar aos animais suplementados com Cu inorgânico.

REDUÇÃO DA PROTEÍNA BRUTA DA RAÇÃOA formulação de dietas com níveis reduzidos de proteína bruta tem

sido amplamente preconizada, mediante a suplementação de aminoácidos industriais, uma vez que tem sido associado à otimização na utilização das nutrientes da dieta e consequentemente redução no poder poluidor (ZANGERONIMO et al., 2007).

Segundo Parson & Baker (1994), a utilização de dietas com níveis reduzidos de proteína bruta, ou seja, conceito de proteína ideal é definido como sendo o balanço exato de aminoácidos capaz de prover, sem excesso ou déficit, as exigências de todos os aminoácidos necessários para a manutenção

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e máxima deposição proteica no organismo. Já as rações com níveis proteicos elevados sobrecarregam a digestão, absorção e eliminação do nitrogênio não aproveitável (BERTECHINI, 2006).

Estudo realizado por Kerr & Easter (1995), observaram que cada ponto percentual de redução da proteína bruta da ração diminui em 8% o nitrogênio excretado nos dejetos. A partir da adição de aminoácidos industriais na dieta, estes são absorvidos rapidamente em relação àqueles presentes nos alimentos (PARTRIGDE, 1985). Desse modo, o balanceamento adequado dos aminoácidos na dieta, quando se trabalha com níveis reduzidos de PB e quantidades significativas de aminoácidos industriais na ração, é importante para o melhor aproveitamento do nitrogênio exógeno pelos animais (ZANGERONIMO et al., 2007).

Estudo realizado por Orlando et al (2005) verificaram que a utilização de redução de proteína bruta com suplementação de aminoácidos industriais em leitões machos castrados proporcionou redução da excreção de nitrogênio, além de não prejudicar o desempenho dos animais. Relandeau et al (2000) realizaram uma compilação de trabalhos que utilizaram redução da proteína bruta da ração com suplementação de aminoácidos sintéticos sobre o desempenho de suínos, e observaram que em 21 trabalhos consultados a redução da proteína bruta da ração não prejudicou o desempenho dos animais e relataram que o teor de proteína bruta para suínos na fase de terminação pode ser reduzido para 12%, corroborando com os resultados encontrados por Orlando et al (2005).

LEIS AMBIENTAIS DA SUINOCULTURAA preocupação ambiental é crescente, principalmente nos países

tradicionais na produção de suínos como Holanda, Dinamarca, França, Alemanha, Canadá e Estados Unidos da América, que têm utilizado instrumentos como a legislação ambiental e suas regulações e diretrizes para que haja menor poluição da água e do ar provocada pelo manejo inadequado dos dejetos. Cada país desenvolveu sua legislação de acordo com a sua necessidade local, mas no geral as legislações ambientais que licenciam as produções animais devem apresentar alguns pontos comuns: i) Estipular objetivos realísticos, considerando o equilíbrio ambiental, econômico e social, identificando áreas críticas de conflito entre a realidade socioeconômica e as condições ambientais, identificando políticas para minimizar estes conflitos por meio do delineamento de acordos; ii) Desenvolver indicadores e implementar ações a fim de monitorar a eficácia e eficiência das leis e políticas, detectando os efeitos desejáveis e indesejáveis; iii) Corrigir as leis e políticas que não estejam promovendo a conservação ambiental; e iv) Disponibilizar suporte financeiro (OEDC, 2003).

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Em termos gerais, a resposta inicial da maioria dos governos para resolver as questões ambientais no setor de suínos foi impor regulamentos, desenvolvimento de programas de pesquisa e assistência técnica. Os suinocultores enfrentam uma matriz de regulamentos que foram introduzidos para limitar a fonte de poluição, como por exemplo, proibir ou limitar a descarga direta de dejetos suínos nas águas, limitar e regularizar a quantidade de dejeto produzido por dia. Além disso, alguns países instituíram o recebimento de pagamento aos produtores, com investimento de novas tecnologias e incentivo da utilização do dejeto como fertilizante em lavouras (OEDC, 2004).

Na Holanda a legislação foi elaborada em 1984 e 1987, e prevê que os dejetos sejam utilizados como fertilizantes, mas o produtor recebe uma quota anual de aplicação no solo. Se for aplicado em excesso deve-se pagar uma taxa. Também só é permitida a utilização em algumas épocas do ano; há grande incentivo de manejo nutricional ambientalmente correto, e são estabelecidos incentivos financeiros para a secagem e o transporte de dejetos para outras áreas, bem como premiações para propriedades que diminuírem a poluição ambiental (PALHARES, 2009).

A legislação ambiental holandesa influência a maneira pela qual as unidades de produção de suínos estão sendo projetadas, modificando o arraçoamento dos suínos e a maneira como os dejetos são armazenados e utilizados. Como resultado desses esforços, a emissão de amônia (NH3) por fontes agrícolas no país reduziu-se em 40% entre 1980 e 2001. No final de dezembro de 2003 o governo implementou um novo programa de ação com o objetivo de atender a Diretiva do Nitrato (91/676/EEC). O programa apresenta um conjunto de medidas que já estão vigorando ou que deverão ser implementadas. Para tanto, propõe que a concentração de nitrato na água subterrânea não deve exceder 50 mg NO3 por litro; que a concentração de nitrato na água de superfície, especialmente naquela usada ou com intenção de se usar como água de abastecimento, não deverá exceder a quantidade estabelecida na Diretiva 75/440/EEC; e que a eutrofização da água de lagos e outros corpos de água doce, estuários e águas costeiras deverá ser prevenida.

Na Dinamarca a legislação foi criada em 1987. Os produtores dinamarqueses estão sujeitos a uma série de leis e regras sobre o ambiente. Dentre as regras ambientais, está definido o limite para o número de suínos que cada produtor pode ter. O sistema regulador baseia-se em unidades por animais, ou seja, uma unidade animal equivale a 51 animais em crescimento/terminação ou 5,1 fêmeas incluindo os leitões. Cada granja deve ter um plano de adubação para capacidade de armazenagem para 12 meses, além da utilização dos dejetos preferencialmente em culturas de inverno (OEDC, 2003).

Na França o licenciamento ambiental ou autorização ambiental foi

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criada em 1992 e estabeleceu distâncias mínimas entre as instalações de suínos e de resíduos em relação à fontes, poços, estradas e residências; os sistemas de criação devem estar cercados, não pode haver mistura entre águas de drenagem e efluentes, o tempo de armazenagem dos dejetos deve ser de quatro meses, toda forma de aplicação de resíduos no solo deve estar documentada, a fertilização é feita tendo como referência o nitrogênio e o balanço de nutrientes e a descarga de efluentes em corpos d’água é permitida de acordo com padrões estipulados (PALHARES, 2009).

Dentre as legislações europeias, a que mais se assemelha à legislação brasileira é a francesa, principalmente pelo estabelecimento de distância entre as instalações de suínos e o manejo de dejetos, e a exigência dos padrões de descarga de efluentes em corpos d’água. No Brasil, a avaliação do impacto ambiental e licenciamento de atividades poluidoras constituem instrumentos para execução da Politica Nacional de Meio Ambiente, de 1981, que determina a avaliação do impacto ambiental prevista na Constituição Federal de 1988. A política prevê a realização de estudo de impacto ambiental prévio para instalações de obras ou atividades poluidoras (PALHARES, 2009).

No entanto, quando se compara a legislação europeia e a brasileira, conclui-se que a brasileira ainda é bastante simples e se o país quiser atingir a posição de maior produtor de carne suína, não só com custo competitivo, mas também visando a qualidade ambiental, será necessário o aprimoramento da legislação nacional e estadual (PALHARES, 2009).

No Brasil há leis que regulam o controle da poluição no meio urbano e rural: a Lei dos Crimes Ambientais, a Lei do Gerenciamento dos Recursos Hídricos e as leis de licenciamento da atividade que são específicas para cada estado. O licenciamento ambiental constitui um instrumento que visa o desenvolvimento de uma atividade produtiva com a manutenção da qualidade ambiental. Porém ainda encontramos alguns desafios uma vez que os problemas ambientais se tornam complexos e demandam planejamento com a percepção crítica de fatores múltiplos e difusos, como os sociais, culturais, econômicos, políticos e produtivos.

As leis de licenciamento ambiental para atividade suinícola nos Estados de Santa Catarina, Rio Grande do Sul e Paraná são as mais especificas para o setor, outros Estados também possuem licenciamento, mas normalmente as leis abrangem mais de uma espécie animal, como a do Estado de São Paulo.

Em São Paulo, a Resolução CONAMA n°.237/1997 outorga que atividades agropecuárias, como criação de animais, estão sujeitas ao licenciamento ambiental. O licenciamento deve ser expedido pelo Poder Público, no caso a Companhia de Tecnologia e Saneamento Ambiental – CETESB. Empreendimentos e atividades consideradas efetiva ou potencialmente causadoras de significativa degradação do meio como, por

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exemplo, a atividade suinícola, devem realizar um estudo prévio de impacto ambiental e o respectivo relatório de impacto sobre o meio ambiente (EIA/RIMA).

Segundo a Resolução, o processo de licenciamento ambiental compreende três etapas:

I. Licença Prévia (LP) – concedida na fase preliminar do planejamento do empreendimento ou atividade aprovando sua localização e concepção, atestando a viabilidade ambiental e estabelecendo os requisitos básicos e condicionantes a serem atendidos nas próximas fases de sua implementação. O prazo de validade não deve ser superior a cinco anos.

II. Licença de Instalação (LI) – autoriza a instalação do empreendimento ou atividade de acordo com as especificações constantes dos planos, programas e projetos aprovados, incluindo as medidas de controle ambiental e demais condicionantes, da qual constituem motivo determinante. O prazo de validade não deve ser superior a seis anos;

III. Licença de Operação (LO) – autoriza a operação da atividade ou empreendimento, após a verificação do efetivo cumprimento do que consta das licenças anteriores, com as medidas de controle ambiental e condicionantes determinados para a operação. O prazo de validade não deve ser superior a dez anos.

No Rio Grande do Sul, o licenciamento está dividido em duas esferas, uma estadual com seus instrumentos de fiscalização, normas ambientais e padrões; outra municipal. O órgão ambiental estadual (FEPAM) e municípios são os órgãos fiscalizadores da atividade e definem medidas específicas para cada atividade de acordo com o tipo, característica e ainda fornecem o técnico para conduzir o processo de licenciamento.

A FEPAM considera a suinocultura como uma atividade agropastoril, o potencial poluidor é mensurado de acordo com o sistema de manejo dos dejetos: líquido ou seco. Portanto, as propriedades que manuseiam os dejetos no estado líquido são consideradas de alto potencial poluidor e as propriedades que adotam o sistema de cama sobreposta são classificados como médio potencial poluidor.

O marco inicial do Termo de Compromisso Ambiental (TCA) é a resolução do Conselho Estadual do Meio Ambiente - CONSEMA n° 084/2004, que direciona suas ações para a diminuição e controle da degradação dos recursos hídricos e solo, através do sistema de licenciamento integrado para atividades produtivas que adotem o sistema de integração. O TCA é o instrumento ambiental que busca o desenvolvimento sustentável das atividades suinícolas através da adequação das propriedades produtoras.

Os produtores que tiverem aderido ao TCA terão que obter licença ambiental que consiste em três fases: Licença Previa (LP), emitida na fase

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de planejamento, Licença de Instalação (LI), autoriza o inicio da construção do empreendimento e Licença de Operação (LO), autoriza o funcionamento do empreendimento. As propriedades licenciadas serão as que estiverem ambientalmente adequadas, de acordo com o Decreto Estadual n° 23.430, de 24 de outubro de 1974, que regulamenta a localização das pocilgas, construção de esterqueiras entre outras melhorias.

Em Santa Catarina para obtenção do licenciamento ambiental os produtores deverão encaminhar a Fundação do Meio Ambiente (FATMA) projeto de acordo com a Instrução Normativa IN n° 11.

As fases do licenciamento são: Licença Ambiental Prévia (LAP): declara a viabilidade do projeto e/ou localização de equipamento ou atividade, quanto aos aspectos de impacto e diretrizes de uso do solo; Licença Ambiental de Instalação (LAI): autoriza a implantação da atividade ou instalação de qualquer equipamento, com base no projeto executivo final; Licença Ambiental de Operação (LAO): autoriza o funcionamento do equipamento, atividade ou serviço, com base em vistoria, teste de operação ou qualquer meio técnico de verificação. Existe Autorização Ambiental que é concedida as atividades de porte inferior ao pequeno.

Além disso, a regulação ambiental define uma série de padrões de armazenamento e uso dos dejetos:

• Os volumes dos dejetos produzidos são calculados pela capacidade máxima das pocilgas;

• A quantidade máxima de dejetos para a utilização em lavouras é de 50 m³ ha-1ano-1, e de acordo com recomendações de adubação indicadas por laudo com base em análise do solo;

• Recomenda-se a instalação de sistemas de calhas e cisternas, visando o aproveitamento das águas pluviais para uso nas pocilgas.

No Paraná, a Resolução da Secretária de Estado do Meio Ambiente (SEMA) nº. 031, de 24 de agosto de 1998, define a classificação feita pelo Instituto Ambiental do Paraná das propriedades suinícolas conforme o sistema de criação: ar livre, confinamento e misto; o sistema de produção. A Unidade de Produção de Leitões, ciclo completo e terminação; porte da propriedade que varia de mínimo à excepcional. Na mesma resolução do SEMA é definido o licenciamento ambiental como um mecanismo para autorizar o funcionamento do empreendimento, sendo estruturado em três etapas: licença prévia (LP), licença de instalação (LI) e licença de operação (LO).

A Resolução nº 031 define padrões de composição dos efluentes líquidos e dos resíduos sólidos. Quando não alcançados, a Resolução estabelece que os dejetos devam receber tratamento prévio e tratamento específico ou secundário, quando usados para aplicação no solo como fertilizante orgânico.

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Após receber o tratamento adequado, os dejetos podem ser utilizados como fertilizante orgânico na lavoura respeitando a época, forma de aplicação e a cultura recomendada, além disso, determina-se a análise das características físicas e químicas do solo com o intuito de verificar a aptidão do solo.

A suinocultura tem potencial impacto ambiental. O desafio, sob estas condições, consiste no uso de instrumentos capazes de harmonizar a continuidade da atividade com o uso racional dos recursos naturais e a preservação da qualidade ambiental. O licenciamento ambiental é um desses instrumentos. Sendo esta competência dos Estados, há diferenças conceituais e técnicas entre legislações. Mesmo no caso de Estados tradicionais na atividade e com histórico de conflitos ambientais.

OUTROS INSTRUMENTOS LEGAISAlém dos instrumentos apresentados acima, existe uma série de outras

ferramentas legais que estão relacionadas ao controle ambiental da atividade suinícola, de caráter voluntário ou de comando e controle:

• Ação civil pública (Lei 7.347 de 24/07/1985): lei de interesses difusos, que trata da ação civil pública de responsabilidade por danos causados ao meio ambiente, ao consumidor e ao patrimônio artístico, turístico ou paisagístico. Pode ser requerida pelo Ministério Público (a pedido de qualquer pessoa) ou por uma entidade constituída há pelo menos um ano.

• Código Florestal (Lei 4.771 de 15/09/1965): determina a proteção de florestas nativas e define como áreas de preservação permanente uma faixa de 30 a 500 metros das margens dos rios (dependendo da largura do curso d’água), de lagos e reservatórios.

• Crimes ambientais: (Lei 9.605 de 12/02/1998): reordena a legislação brasileira no que se refere às infrações e punições. A partir dela, a pessoa jurídica, autora ou coautora da infração ambiental, pode ser penalizada, chegando à liquidação da empresa se ela tiver sido criada ou usada para facilitar ou ocultar crime ambiental.

Recursos hídricos: (Lei 9.433 de 08/01/1997): Em 1992 foram formalizados alguns princípios para o gerenciamento dos recursos hídricos mundiais, que foram denominados Princípios de Dublin e definem os seguintes preceitos sobre a água: deve ser gerenciada de forma conjunta entre Governo, sociedade e empresas; trata-se de um recurso finito e com valor econômico; e as mulheres têm um papel central na sua provisão e proteção. PRÁTICAS E TECNOLOGIAS PARA O MANEJO DE DEJETOS

O dejeto suíno na sua forma mais comum, líquida, possui uma

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quantidade de matéria seca muito baixa. Essa grande quantidade de água inviabiliza o transporte do mesmo a grandes distâncias. Portanto, devem ser estudadas e realizadas formas de tratamento para (DIESEL, et al., 2002):

• Redução da carga poluidora, para aumentar a quantidade de dejeto a ser lançado sobre o solo;

• Aumentar o seu valor nutritivo para uso como adubo, que evite perda de nutrientes por volatilização e lixiviação;

• Eliminação da água presente para viabilizar o transporte do mesmo para outras regiões.

Há várias possibilidades de efetuar este tratamento sendo, entre as três opções anteriormente citadas, a redução da carga orgânica a mais usada e estudada, por exigir menos mão de obra e possibilitar o armazenamento em esterqueiras ou em lagoas e posterior aplicação no solo (KUNZ et al., 2004a). As esterqueiras e lagoas, desde que corretamente dimensionadas e operadas, são uma opção de baixo custo para produtores que possuem áreas de cultivo suficientes para que os resíduos possam ser utilizados como fertilizante orgânico. As recomendações para essa prática devem ser respeitadas levando em conta o balanço de nutrientes, imprescindível para nortear a tomada de decisão e mitigar os impactos ambientais (SEGANFREDO, 1999).

Para esterqueiras, o tempo de armazenamento recomendado para estabilização da matéria orgânica e inativação de patógenos gira em torno de 120 dias (as legislações estaduais apresentam variações com relação à exigência e ao período de retenção). Durante o armazenamento, o dejeto sofre degradação anaeróbia, podendo ocorrer liberação de gases responsáveis pela geração de odores, principalmente nos meses de verão, quando o aumento da temperatura ambiente favorece a atividade biológica e a volatilização de gases. Neste sistema convencional, os dejetos são manejados gerando fertilizante na forma líquida (KUNZ et al., 2005).

Os dejetos de suínos podem ser utilizados na fertilização de lavouras trazendo ganhos econômicos ao produtor rural, sem comprometer a qualidade do solo e do meio ambiente. Para isso, é fundamental a elaboração de um plano técnico de manejo e adubação, considerando a composição química dos dejetos, a área a ser utilizada, a fertilidade e tipo de solo e as exigências da cultura a ser implantada (OLIVEIRA et al., 2006). Porém alguns entraves podem ser observados quando os dejetos são utilizados na lavoura, entre eles o transporte, escassez de área para aplicação.

Apesar do valor agronômico dos dejetos ser inquestionável, sua utilização na agricultura deve ser feita de maneira cuidadosa, de modo a não provocar danos ao ambiente e que seja ao mesmo tempo economicamente viável (SCHERER et al, 1996; SEGANFREDO, 2000).

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A utilização dos dejetos como fertilizante agrícola: O uso de nutrientes provenientes dos dejetos pode reduzir a dependência de fertilizantes derivados das limitadas fontes de suprimento de recursos minerais. Além disso, os dejetos possuem um papel importante como condicionadores de solo e como meio para aumentar os níveis de matéria orgânica (os quais tendem declinar com o cultivo sucessivo). Todavia, para que isso aconteça sem danos ao meio ambiente, deve-se obedecer a um criterioso plano técnico de manejo e adubação, considerando a composição química dos dejetos, a área a ser utilizada, a fertilidade e tipo de solo, as exigências da cultura a ser implantada e a forma de aplicação. Caso contrário, corre-se o risco de que o solo, as águas superficiais e subterrâneas e o ar sejam contaminados pelos dejetos (SCHERER et al., 1996; SEGANFREDO, 2000)

A escassez de área: A intensificação da produção de suínos tem provocado um crescimento desproporcional entre o número de animais mantidos em confinamento e a área total das propriedades (EMBRAPA, 2003). Dessa forma, torna-se fundamental desenvolver no âmbito regional um modelo espacial de balanço de nutrientes que avalie o total da sua importação e exportação. Na avaliação dos nutrientes importados devem-se incluir fertilizantes, ração para os animais e entrada de animais. Por sua vez, em relação aos nutrientes exportados, devem-se considerar perdas para a água de superfície e subterrânea, para a atmosfera e para outras regiões (via exportação de grãos ou animais) (BERTO, 2004).

A utilização de biodigestores é outra alternativa tecnológica para o gerenciamento dos dejetos de suínos, o que permite a agregação de valor ao resíduo mediante a utilização do biogás (SCHULTZ, 2007). O biodigestor é um equipamento muito utilizado para o tratamento de dejetos líquidos dos suínos, formado por um tanque revestido com pedra, alvenaria ou geomembrana de PVC ou PEAD e coberto com uma lona que possibilite a sua expansão para armazenar gazes (DALMAZO et al., 2009). Os dejetos são armazenados por um período de trinta dias, tempo suficiente para que ocorra a fermentação anaeróbica. Desse processo biológico surge o biogás e o biofertilizante (DIESEL et al., 2002). O biodigestor, além produzir o biogás e o biofertilizante, consegue remover carga orgânica dos dejetos, diminuir os odores e eliminar microrganismos potenciais causadores de doenças (DALMAZO et al., 2009).

O tratamento dos dejetos em biodigestores reduz a carga orgânica em 84%, podendo atingir até 96%, quando auxiliados por agentes de bacterianos. Além da carga orgânica, Konzen (2006) observou reduções de fósforo total (40%), cobre total (40%) e zinco total (22%). Com a adição de agentes de bacterianos, as reduções atingiram 91%, 96% e 97%, respectivamente, para fósforo, cobre e zinco.

Atualmente existem vários modelos de biodigestores visando

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aumentar tanto a eficiência quanto a redução de custos de equipamentos (KUNZ et al. 2004b). No entanto, o sistema ainda enfrenta algumas limitações, principalmente no que diz respeito ao entendimento de alguns aspectos microbiológicos básicos, vitais ao adequado funcionamento do sistema.

Alguns estudos propõem diferentes métodos de investigação na utilização de dejetos e o custo dos mesmos como fertilizantes, porém em sua grande maioria, os cenários investigados são nos Estados Unidos, principalmente as áreas de grande concentração de criação de suínos, e alguns países europeus.

O estudo realizado por Fleming et al. (1998) comparam dois tipos de sistema de armazenamento de dejeto de suínos em Iowa, um sendo sistema de armazenagem de dejeto em lagoa anaeróbica, que permite que o nitrogênio escape para atmosfera e o fósforo permaneça no fundo da lagoa e o outro método foi esterqueira que permite que conserve o teor de nutrientes do dejeto. O resultado foi que o dejeto armazenado no sistema de esterco possui maior volume de nutriente e, consequentemente reduz a quantidade a ser comprada de fertilizantes industriais. No caso de Iowa, o fertilizante ideal seria a base de fósforo, por isso o sistema de esterqueira foi mais vantajoso, mas isto não ocorre em todas as áreas dos Estados Unidos. Vale ressaltar que o estudo apenas visou à utilização de dejetos nas plantações sem levar em consideração o custo das normas ambientais.

Estes estudos demonstram que os produtores enfrentam várias barreiras para implementar os programas de tratamento de dejetos, tais como elevados investimentos e custos operacionais para as técnicas de processamento, legislação (por exemplo, licenciamento para construção de instalações de tratamento de dejetos), aceitação pelos agricultores e da sociedade. Estas barreiras limitam a aplicação dos dejetos nas lavouras, mas os criadores de suínos podem e devem adaptar suas práticas de gestão de dejetos, pois em muitos casos irá ajudar a reduzir seus custos de produção devido à redução dos gastos com combustível e eletricidade, além de ganhos ambientais (OENEMA, et al., 2012).

A utilização de biodigestores tem sido retomada, possivelmente pela crise energética que enfrenta o país desde o inicio deste século, e diversas instituições públicas e privadas voltaram a pesquisar, como por exemplo, a EMBRAPA, e a difundi-los como uma alternativa possível de utilização do sistema de manejo dos dejetos, pois ele permite a redução da poluição atmosférica provocada pelo metano e outros gases e possibilita a geração de energia. Além disso, produz um biofertilizante de boa qualidade (MIRANDA, 2005).

A retomada da discussão em torno dos biodigestores apresenta alguns aspectos que são essenciais para que não se cometam os mesmo erros

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do passado. Deve-se atentar para que os biodigestores não sejam divulgados como uma “solução definitiva” e sim como parte de um processo, haja vista que este sistema possui limitações. Além disso, deve-se atentar que o processo de operação de um biodigestor possui uma série de detalhes técnicos que devem ser respeitados para que a produção do biogás seja economicamente viável (KUNZ et al., 2004).

CONSIDERAÇÕESA suinocultura tem potencial impacto ambiental devido à produção de

resíduos com alta carga de nutrientes, matéria orgânica, metais pesados, entre outros. O desafio, sob estas condições, consiste no uso de instrumentos capazes de harmonizar a continuidade da atividade com o uso racional dos recursos naturais e a preservação da qualidade ambiental. O licenciamento ambiental e práticas e tecnologias para o manejo de dejetos são alguns desses instrumentos.

AGRADECIMENTOSÀ FAPESP pela bolsa concedida e à Embrapa.

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http://www.epa.gov/npdes/pubs/finafost.pdf

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CAPÍTULO 5

PROTEASE EXóGENA EM DIETAS PARA FRANGOS DE CORTE

Raphael Fortes de Oliveira1, Cristiane Soares da Silva Araújo2, Alexandre Almeida Murakami3, Jéssica de Souza Vilela1, Carlos Alexandre Granghelli1, Natália Thaís Gonçalves Koiyama4, Pedro Henrique Mota3

1Mestrandos da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo – FMVZ/USP – Departamento de Nutrição e Produção Animal – VNP. Campus de Pirassununga-SP.2Docente da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo – FMVZ/USP – Departamento de Nutrição e Produção Animal – VNP. Campus de Pirassununga-SP.3Aluno de graduação em Medicina Veterinária pela Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo – FMVZ/USP4Doutoranda da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo – FZEA/USP. Campus de Pirassununga – SP.

RESUMO Na área da nutrição animal, um grande número de pesquisas tem sido realizado na busca por estratégias alternativas que possibilitem a formulação de rações mais eficientes e econômicas, considerando que a alimentação representa o fator de maior custo na produção de aves. Levando-se em consideração os preços das matérias primas, torna-se necessária a realização de pesquisas que têm por objetivo prático a redução dos custos de produção, como a utilização de estratégias nutricionais relacionadas à adição de enzimas exógenas nas dietas. O objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho produtivo, a atividade enzimática pancreática e o rendimento de carcaça e cortes de frangos alimentados com rações fareladas e peletizadas com ou sem adição de protease. Foi realizada, também, a análise econômica dos tratamentos experimentais. Para tanto, foram utilizadas 768 aves, criadas de 1 a 42 dias de idade, distribuídas em um delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2x2x2 (formas físicas da ração, níveis nutricionais e inclusão ou não de protease) com oito repetições por tratamento. Os resultados foram analisados por meio do pacote estatístico SAS (2012). A peletização das rações promoveu melhora nos índices zootécnicos de frangos de corte. A adição de protease exógena não exerceu efeito principal sobre o desempenho e rendimento de carcaça e cortes, mas em dietas com redução de proteína bruta e aminoácidos, melhorou os índices econômicos da criação de frangos de corte, assim como o processo de peletização de forma geral. A adição de protease e

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redução dos níveis de proteína e aminoácidos promoveram menor atividade da quimotripsina.Rações peletizadas com níveis nutricionais recomendados e adição de protease apresentaram os maiores custos de produção.

INTRODUÇÃO Nas últimas décadas, notáveis avanços foram observados na avicultura, sendo mundialmente um dos seguimentos mais desenvolvidos da agropecuária. A viabilidade na produção avícola é o fator resultante da integração do melhoramento genético, nutrição, manejo, e sanidade (STRADA et al., 2005). O constante crescimento da avicultura mundialfoi atribuído à eficiência na produção de carne de frango a custos mais competitivos. As linhagens avícolas destinadas à produção de carne são, principalmente, selecionadas para ganho de peso. Aves originadas destas matrizes possuem características típicas de melhor conversão alimentar, melhor conformação corporal e melhor rendimento de carcaça (BORGES et al., 2006).Esta inovação, em geral, tem permitido redução de custos e aumento da produtividade, com o objetivo de manter o ranking competitivo do país em nível mundial (SARCINELLI et al., 2007).

UTILIZAÇÃO DE ENZIMAS EXóGENAS NA NUTRIÇÃO DE FRANGOS DE CORTE As enzimas exógenas utilizadas na nutrição animal são produzidas a partir de culturas de microrganismos, sendo derivadas de fermentação por fungos e bactérias. A produção de enzimas ocorre a partir de um processo de fermentação, como consequência da aplicação de um material inoculado com microrganismos sobre um substrato, sob condições ambientais que favoreçam a fermentação.Após esta fase, é realizada a separação da biomassa com posterior resfriamento, centrifugação e concentração. Ao final, são realizadas as etapas de filtração, padronização e controle de qualidade de acordo com a apresentação do produto final, que pode ser sólido ou líquido (COWAN, 1993). As enzimas exógenas são classificadas como pró-nutrientes alimentares (BUTOLLO, 2002)e atuam principalmente através da ruptura das paredes celulares das fibras, reduzindo a viscosidade da dieta no intestino delgado, degradando as proteínas, reduzindo os efeitos provocados pelos fatores antinutricionais e promovendo maior biodisponibilidade de nutrientes (SOTO-SALONOVA et al., 1996). Deste modo, as enzimas exógenas passaram a ser utilizadas como alternativa para melhorar a qualidade das rações para aves, com o objetivo de reduzir a viscosidade intestinal, promover maior eficiência na utilização de nutrientes e aumento no desempenho produtivo (GARCIA, 2000).

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PROTEASE EM DIETAS DE FRANGOS DE CORTE Animais monogástricos, como suínos e aves, produzem proteases digestivas tais como pepsina, tripsina, quimotripsina e carboxipeptidases, as quais são capazes de digerir proteínas alimentares em um grau elevado. No entanto, uma fração da proteína alimentar é excretada nas fezes após ser ingerida (GLITSØ et al., 2012).Com base em valores de digestibilidade da proteína relatados na literatura, pode-se supor que uma quantidade considerável de proteína passa através do trato gastrintestinal sem ser completamente digerida (LEMME, 2004). Esta fração de proteína não digerida apresenta oportunidade para a adição de proteases exógenas específicas (FREITAS et al., 2011).

Segundo Glitsø et al. (2012), um dos grandes benefícios da inclusão de protease nas dietas de frangos é a melhora na digestibilidade da proteína de uma vasta gama de ingredientes naturais. Com o aumento da utilização da proteína da alimentação, a adição da enzima oferece a possibilidade de reduzir a quantidade de proteína incluída na dieta, e, assim, favorecer a economia de matérias-primas dispendiosas, tais como o farelo de soja. A utilização de protease juntamente com secreções endógenas de peptidases reduzem as exigências de aminoácidos e energia a serem supridas na dieta. Além disso, a protease pode melhorar a hidrólise de proteínas na presença de fatores antinutricionais, tais como lecitinas e inibidores de tripsina (HUO et al., 1993; GHAZI et al., 2002), elevando a eficiência da utilização de aminoácidos nas aves (DOSKOVIĆ et al., 2013). A adição de proteases exógenas na dieta pode favorecer melhora no valor nutricional por meio da hidrólise de certos tipos de proteínas resistentes ao processo digestivo. Deste modo, esta enzima complementa a ação da protease endógena produzidas pelo organismo das aves. Ademais, atua na degradação das proteínas e, na soja atua sobre as proteínas consideradas como sendo de armazenamento, conglicina e beta-conglicina, e sobre seus fatores antinutricionais, como inibidores de tripsina, lectinas e proteínas antigênicas (SOTO-SALONOVA et al., 1996). Segundo Classen (1996) o aproveitamento insuficiente das proteínas, durante a digestão, apresenta como consequência maior excreção de nitrogênio, resultando em desperdício deste nutriente e poluição ambiental. A redução no nível de proteína bruta e utilização de aminoácidos sintéticosna ração são algumas técnicas para minimizar a excreção de nitrogênio pelas aves. Dentre estas estratégias, pode-se destacar o estudo sobre o emprego de proteases com o objetivo de aperfeiçoar o aproveitamento da dieta, evidenciando, desta forma, o conceito de proteína ideal(CAUWENBERGUE& BURNHAM, 2001). A interpretação de resultados de estudos realizados com proteases é, por vezes, dificultada devido ao confundimento decorrente dos efeitos de

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mais do que uma atividade enzimática em um único tratamento experimental. Resultados inconsistentes e variáveis são também frequentemente encontrados devido à diversidade de ingredientes e tipos de proteases, fatores que muitas vezes não são claramente definidos, além da utilização de diferentes metodologias (SIMBAYA et al., 1996; MARSMAN et al., 1997).

ADIÇÃO DE PROTEASE EXóGENA EM RAÇÕES FARELADAS E PELETIZADAS PARA FRANGOS DE CORTE Com o objetivo de avaliar o desempenho zootécnico, atividade enzimática pancreática, rendimento de carcaça e cortes, e os índices econômicos de produção de frangos de corte alimentados com rações fareladas ou peletizadas, com ou sem adição de protease exógena, e dois níveis nutricionais, foi realizado um experimento no Laboratório de Pesquisa em Aves da FMVZ – USP. Foram utilizados 768 pintos machos da linhagem Cobb 500, distribuídos em delineamento inteiramente casualizado em arranjo fatorial 2x2x2 (formas físicas da ração, níveis nutricionas e inclusão ou não de protease) com oito tratamentos (Tabela 1) e oito repetições.

Tabela1. Distribuição dos tratamentos experimentais.

1Adição de 200 g/ton de ração de protease comercial.2Recomendações nutricionais segundo as tabelas brasileiras para aves e suínos: composição de alimentos e exigências nutricionais deRostagno et al. (2011).

As dietas experimentais foram formuladas à base de milho e farelo de soja, sendo que os tratamentos com redução de níveis nutricionais seguiram as exigências nutricionais recomendadas por Rostagno et al. (2011). Para os tratamentos com níveis reduzidos de nutrientes, foi realizada redução de 4%, como média da redução sugerida pelo fabricante, em proteína bruta e aminoácidos (lisina, metionina e treonina) em relação às recomendações de Rostagno et al.(2011). Oprograma de alimentação foi dividido nas seguintes fases: pré-inicial (1 a 7) dias, inicial (8 a 21) dias, crescimento (22 a 35) dias e final (36 a 42) dias.As rações correspondentes aos tratamentos T5, T6, T7 e T8 foram peletizadas à temperatura de 80°C.

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A protease comercial utilizada é produzida por fermentação de Bacillus licheniformis contendo genes transcritos de Nocardiopsis prasina. O produto contém 75.000 unidades de protease (PROT/g). Uma unidade de atividade(PROT) é definido como a quantidade de enzima que libera 1µmol de p-nitroanilida a partir de 1µM de substrato (N-Succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-P-Nitroanilida) por minuto a um pH 9,0 e temperatura de 37°C(GLITSØ et al., 2012). Foram determinadas as variáveis de desempenho zootécnico, atividade enzimática pancreática de tripsina e quimotripsina, rendimento de carcaça e cortes, e análise econômica da produção dos frangos de corte submetidos aos tratamentos experimentais. As características de desempenho zootécnico avaliadas aos 21 e 42 dias de idade foram: consumo de ração,ganho de peso e conversão alimentar. As análises de atividade enzimática pancreática foram realizadas aos 43 dias de idade das aves, em que foram tomadas casualmente cinco aves por tratamento as quais foram abatidas para retirada do pâncreas que foi pesado e rapidamente congelado em nitrogênio líquido a -80°C para posterior análise de atividades da tripsina e quimotripsina. A atividade da tripsina foi determinada segundo Kakade et al. (1974). Para dosagem da atividade da quimotripsina, foi realizada metodologia descrita por Erlanger et al. (1966).Para determinação do rendimento de carcaça e cortes, aos 43 dias de idade, foram abatidas duas aves por repetição, as quais passaram por um período de jejum de oito horas e foram pesadas anteriormente ao abate.O rendimento de carcaça foi obtido pelo peso das carcaças sem pés, pescoço, cabeça e vísceras em relação ao peso vivo da ave antes do abate. O rendimento de cortes foi determinado pelo peso do peito e pernas (coxa e sobrecoxa) em relação ao peso da carcaça, segundo metodologia descrita por Mendes (1990). Para a realização da análise econômica, foram avaliados o custo da ração, receita bruta, lucro operacional, índice de lucratividade e o custo final/ave, segundo método descrito por Lana (2000).Os indicadores de lucratividade utilizados neste estudo foram os considerados por Martin et al. (1997): a receita bruta, que se constitui na multiplicação do quilograma total obtido por tratamento pelo preço unitário médio do frango pago aos produtores; o lucro operacional, referente à diferença entre a receita bruta e o custo total de produção, e o índice de lucratividade, que se refere à proporção da receita bruta, que se constitui em recursos disponíveis, em relação à receita líquida obtida. Os dados obtidos no experimento foram tabulados e analisados com o auxílio do pacote estatístico SAS (2012). Primeiramente foi testada a normalidade dos resíduos e a homogeneidade das variâncias. Posteriormente, foi realizada análise de variância (ANOVA) a 5% de probabilidade. Os dados

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de adição ou não de protease, forma física da ração e níveis nutricionais foram comparados pelo teste F.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

DESEMPENHO Não foram detectadas diferenças estatísticas entre as médias de peso inicial das aves nos tratamentos, que apresentaram o peso médio inicial de 46,89 g. De acordo com os resultados obtidos para o período acumulado de 1 a 21 dias de idade (Tabela 2), houve efeito da forma física da ração sobre todas as variáveis, em que aves alimentadas com rações peletizadas apresentaram melhor desempenho zootécnico em comparação àquelas alimentadas com rações fareladas. Foi verificado efeito de interação entre a forma física da ração e adição de protease sobre as variáveis de consumo de ração e conversão alimentar. Tabela 2. Peso médio final (PMF), ganho de peso médio (GPM), consumo de ração (CRM) e conversão alimentar (CA) de frangos de corte de 21 dias de idade,alimentados com rações em duas formas físicas, com inclusão ou não de protease e com níveis nutricionais reduzidos ou recomendados.

¹Redução em 4% de Proteína Bruta e aminoácidos em relação ás exigências nutricionais descritas por Rostagno et al.(2011).2Erro Padrão da Média.Letras diferentes (a,b) na mesma coluna, dentro de cada fator (Forma Física, Protease e Nível Nutricional) diferem estatisticamente pelo teste F (p <0,05).

Verifica-se que a forma física da ração e a adição de protease para o período de 1 a 21 dias de idade apresentaram diferenças estatísticas (Tabela 3). O consumo de ração farelada com a presença de protease foi menor em relação a ausência de enzima. A ração peletizada com protease obteve um maior consumo comparada a ração farelada com protease.

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Tabela 3. Consumo de ração (CRM) de frangos de corte de 21 dias de idade, de acordo com a presença de protease e da forma física da ração.

1Erro Padrão da Média.Letras minúsculas na mesma linha e maiúsculas na mesma coluna diferem estatísticamente pelo teste F (p <0,05).

Pode – se verificar que as aves alimentadas com rações peletizadas apresentaram melhor conversão alimentar em comparação às aves que receberam rações fareladas, com a adição de protease nas dietas para o período de 1 a 21 dias de idades (Tabela 4).

Tabela 4. Conversão alimentar (CA) de frangos de corte de 21 dias de idade, de acordo com a presença de protease e da forma física da ração.


Os resultados de desempenho zootécnico das aves encontradas para o período acumulado de 1 a 42 dias de idade (Tabela 5), demonstraram que houve efeito da forma física da ração sobre todas as variáveis, em que aves alimentadas com rações peletizadas apresentaram maior desempenho zootécnico em comparação àquelas alimentadas com rações fareladas. Foi verificado efeito dos níveis nutricionais sobre a conversão alimentar, em que aves alimentadas com dietas formuladas segundo recomendações nutricionais de Rostagno et al. (2011), apresentaram melhor resultado desta variável.

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Tabela 5.Peso médio final (PMF), ganho de peso médio (GPM), consumo de ração (CRM) e conversão alimentar (CA) de frangos de corte de 42 dias de idade, alimentados com rações em duas formas físicas, com inclusão ou não de protease e com níveis nutricionais reduzidos ou recomendados.

¹Redução em 4% de Proteína Bruta e aminoácidos em relação às exigências nutricionais descritas por Rostagno et al.(2011).2Erro Padrão da Média.Letras diferentes (a,b) na mesma coluna, dentro de cada fator (Forma Física, Protease e Nível Nutricional) diferem estatisticamente pelo teste F (p <0,05).

Os melhores índices de desempenho zootécnico de aves alimentadas com rações peletizadas podem ser explicados pelos efeitos da peletização, que segundo Silveira et al. (2010), favorecem melhora na digestibilidade e absorção dos nutrientes da dieta. Em rações peletizadas, a digestibilidade dos carboidratos é melhorada devido à desagregação dos grânulos de amilose e amilopectina, facilitando a ação enzimática (MORAN, 1987). Com relação à proteína, o processo de peletização promove alteração das estruturas terciárias, facilitando a digestão destes nutrientes (VARGAS et al., 2001). Segundo Andrews (1991), a peletização também promove aumento do valor energético dos nutrientes.

O melhor resultado de conversão alimentar das aves alimentadas com rações peletizadas contendo protease sugere, indiretamente, que não foi verificado efeito prejudicial do processo de peletização sobre a atividade da enzima adicionada à dieta.

Na presente pesquisa, a temperatura utilizada no processo de peletização (80°C) aparentemente causou pouco ou nenhum efeito de desnaturação enzimática da protease adicionada às rações, por meio da

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observação dos resultados de desempenho zootécnico. Estes resultados podem ser explicados pelo fato de que o produto enzimático avaliado possui a característica de termoestabilidade. Este fator poderia explicar a melhor conversão alimentar das aves que receberam protease em rações peletizadas, efeito que pode ser observado na tabela 4, no entanto, para melhor avaliação dos efeitos do processo de peletização sobre enzimas exógenas, são necessárias futuras pesquisas com o objetivo de avaliar a taxa de recuperação de enzimas termoestáveis, a fim de obter resultados mais precisos, levando em consideração a temperatura do processamento térmico.

O maior consumo de ração pelas aves que receberam ração peletizada no presente experimento, estão de acordo com Vargas et al.(2001), que observaram que frangos de corte machos com idade entre 36 e 42 dias alimentados com ração peletizada apresentaram maior consumo em comparação às aves alimentadas com ração farelada, da mesma forma, Souza (2005) verificou que o fornecimento de ração peletizada a base de milho e farelo de soja, promoveu melhor ganho de peso e conversão alimentar de frangos de corte, no período de 1 a 42 dias de idade,em relação à utilização de rações fareladas.

Para a variável de conversão alimentar nos dois períodos avaliados, os resultados são semelhantes aos encontrados por Silveira et al. (2010), que concluíram que frangos alimentados com rações peletizadas apresentaram melhor conversão alimentar em comparação às aves que receberam ração farelada, independentemente da adição de complexo enzimático (fitase, protease, xilanase, ß-glucanase, celulase, amilase e pectinase). Da mesma forma em que os resultados da presente pesquisa foram encontrados, este efeito pode ser explicado pela maior digestibilidade, com consequente melhora na absorção dos nutrientes da dieta, promovidas pelo processo de peletização.

Nas condições em que este experimento foi realizado, não foi verificado efeito principal do fator protease sobre os índices zootécnicos. Segundo Angel et al. (2011), efeitos de proteases exógenas adicionadas às dietas de frangos de corte sobre o desempenho zootécnico são geralmente inconsistentes na literatura. Diferenças entre o tipo de protease testada, dos diferentes delineamentos experimentais utilizados, e principalmente dos nutrientes presentes nas dietas de controle negativo e da utilização de complexos enzimáticos ao invés do emprego de enzimas isoladas, podem explicar parcialmente os resultados conflitantes e variáveis relatados por trabalhos anteriores(WALK et al., 2011).

Os resultados de ganho de peso das aves, em relação ao fator protease, estão de acordo com Angel et al. (2011), que observaram que adições de protease em níveis de 100, 200, 400 e 800 mg/kg de ração, em dietas com níveis reduzidos de proteína, resultaram em ganhos de peso semelhantes ao tratamento controle positivo utilizado, assim como, Maiorka et al. (2009)

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também não verificaram diferenças significativas no peso corporal entre aves que não receberam protease nas dietas, e frangos de corte alimentados com a enzima (200 g/ton de ração).

Os resultados encontrados de consumo de ração são condizentes com os encontrados por Angel et al. (2011), que não verificaram efeito da adição de diferentes doses de protease sobre o consumo de ração em frangos de corte de 7 a 22 dias de idade. Já os resultados de conversão alimentar são contrários aos encontrados por Freitas et al. (2011), que observaram que a suplementação enzimática com protease em dietas a base de milho, soja e farinha de carne e ossos, promoveu melhora nos índices de conversão alimentar, porém, não exerceu influência sobre as demais variáveis de desempenho. Os melhores índices de conversão alimentar de frangos de corte no período de 1 a 42 dias de idade, alimentados com rações sem redução de proteína e aminoácidos, podem ser explicados pela maior quantidade de proteína e aminoácidos disponíveis nestas dietas para absorção, refletindo em maior deposição destes nutrientes no organismo animal.

Os resultados encontrados em relação aos níveis nutricionais, para o período de 42 diasde idade,estão de acordo com Pucci et al. (2010), que verificaram que o nível nutricional de 100% em relação às recomendações de Rostagno et al. (2011) promoveu melhor conversão alimentar de frangos de corte em relação ao nível de 95% das recomendações, porém, sem diferenças no consumo de ração e ganho de peso.Estes resultados também estão de acordo comKooling et al. (2005), que verificaram que a redução de 2% e 12% de proteína bruta e aminoácidos, respectivamente, em dietas isoenergéticas nas fases inicial e de crescimento de frangos de corte, provocou redução no desempenho dos animais. Segundo estes autores, as aves foram mais sensíveis à deficiência de aminoácidos e proteína durante a fase inicial de criação.

O efeito de interação observado na presente pesquisa (Tabelas 3 e 4) pode ser decorrente do sinergismo resultante da combinação entre os efeitos da protease e da forma física da ração, que, segundo Soto-Salanova et al. (1996), melhora o valor nutricional do alimento por meio da hidrólise de alguns tipos de proteínas resistentes ao processo digestivo, e acarreta em aumento no consumo de ração (CALET, 1965) e na energia líquida de produção (NIR et al., 1994). A partir dos resultados observados na tabela 4, pode-se inferir que o processo de peletização promoveu efeito sobre a conversão alimentar somente em dietas contendo protease.

Os efeitos de interação entre forma física da ração e adição de protease aos 21 dias de idade, para as variáveis de consumo de ração e conversão alimentar (Tabelas 3 e 4, respectivamente),discordam parcialmente de Pucci et al. (2010), que não verificaram este tipo interação ao avaliarem o desempenho de frangos de corte alimentados com rações fareladas ou trituradas, com a

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presença ou não de complexo enzimático (amilase, celulase e protease) e com os níveis de 95% ou 100% das recomendações nutricionais de Rostagno et al. (2011). Porém, estes autores verificaram interação significativa entre os níveis nutricionais e forma física da ração para a variável de conversão alimentar.

RENDIMENTO DE CARCAÇA E CORTES De acordo com os resultados obtidos, não houve efeito principal dos fatores sobre o rendimento de carcaça, peito e pernas das aves (Tabela 6). Foi verificada interação significativa entre a adição de protease e os níveis nutricionais das dietas sobre a variável de rendimento de carcaça (Tabela 7). Também foi verificada interação entre as formas físicas da ração e adição de protease para a variável de rendimento de peito (Tabela 8).

Tabela 6. Rendimentos de carcaça, peito e pernas de frangos de corte aos 43 dias de idade, alimentados com rações em duas formas físicas, com inclusão ou não de protease, com níveis nutricionais reduzidos ou recomendados.

¹Redução em 4% de Proteína Bruta e aminoácidos em relação às exigências nutricionais descritas por Rostagno et al.(2011).2Erro Padrão da Média. Letras diferentes (a,b) na mesma coluna, dentro de cada fator (Forma Física, Protease e Nível Nutricional) diferem estatisticamente pelo teste F (p <0,05).

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Tabela 7. Rendimento de carcaça de frangos de corte de 43 dias de idade, de acordo com a presença de protease e de diferentes níveis nutricionais.

¹Redução em 4% de Proteína Bruta e aminoácidos em relação às exigências nutricionais descritas por Rostagno et al.(2011).2Erro Padrão da Média.Letras minúsculas na mesma linha e maiúsculas na mesma coluna diferem estatísticamente pelo teste F (p <0,05).

Tabela 8. Rendimento de peito de frangos de corte de 43 dias de idade, de acordo com a presença de protease e da forma física da ração.


Os resultados obtidos de rendimento de carcaça, em relação ao fator forma física da ração, estão de acordo com Lecznieski et al. (2001), que não verificaram efeito das formas fareladas e peletizadas das rações sobre o rendimento de carcaça de frangos de corte. Porém, de modo contrário aos resultados verificados na presente pesquisa, estes mesmos autores observaram que houve aumento no rendimento de peito de frangos de corte que receberam ração farelada, em comparação ao grupo alimentado com ração peletizada. Os resultados obtidos para os rendimentos de carcaça e cortes, ao analizar-se o fator adição de protease,corroboram comFreitas et al. (2011), que verificaram que a adição de níveis de protease de 0, 100, 200, 400, 800, e 1,600 mg/Kg de ração não exerceram efeito sobre os rendimentos de carcaça, peito, coxa e sobrecoxa. Da mesma forma, Pucci et al. (2010) observaram que a adição de complexo enzimático (amilase, celulase e protease) em dietas trituradas ou fareladas, com nível nutricional de 95% ou 100% das recomendações de Rostagno et al.(2011), não apresentaram efeito sobre os rendimentos de carcaça, peito, coxa e sobrecoxa, e porcentagem de gordura abdominal em frangos de corte de 22 a 42 dias de idade. Resultados

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semelhantes foram relatados por Carvalho et al. (2009), que avaliaram dietas suplementadas com complexo enzimático para frangos de corte até os 42 dias de idade, e não observaram efeito das enzimas para os rendimentos de carcaça e peito e na porcentagem de gordura abdominal.Pucci et al. (2010) também não observaram efeito dos níveis nutricionais de 95% ou 100% das recomendações nutricionais de Rostagno et al.(2011) sobre rendimento de carcaça, peito e pernas.A interação verificada para a característica de rendimento de carcaça pode ser explicada parcialmente pelo nível nutricional de 100% em relação às exigências em proteína bruta e aminoácidos de Rostagno et al. (2011), que favoreceu maior aporte de aminoácidos para as aves, resultando em maior acúmulo de massa corporal. Os efeitos nutricionais da adição de protease sobre a digestibilidade explicam parte da interação observada, pois promovem melhora no valor nutricional do alimento por meio da hidrólise de proteínas que são resistentes à digestão (SOTO-SALANOVA et al., 1996). Deste modo, possivelmente houve efeito de sinergismo entre a adição de protease e o nível nutricional sem redução de proteína bruta e aminoácidos sobre o rendimento de carcaça. O efeito de interação observado entre adição de protease e nível nutricional para a variável de rendimento de carcaça discorda de Pucci et al. (2010) que não verificaram interação entre adição de complexo enzimático e nível nutricional (95% ou 100% em relação às recomendações de Rostagno et al.(2011) sobre o rendimento de carcaça e cortes. Assim como foi observado nas variáveis de conversão alimentar e consumo de ração aos 21 dias de idade, foi verificada interação significativa entre a forma física da ração e adição de protease para a variável de rendimento de peito (Tabela 8). Este efeito pode ter explicação semelhante ao efeito de interação observado nas características de desempenho zootécnico aos 21 dias de idade. A interação observada se constitui na combinação dos efeitos da peletização, que, segundo Silveira et al. (2010), promovem melhora na digestibilidade e absorção dos nutrientes da dieta, e dos efeitos da adição de protease, que, segundo Huo et al. (1993) promovem melhora na hidrólise de proteínas na presença de fatores antinutricionais,aumentando a eficiência do aproveitamento de aminoácidos nas aves (DOSKOVIĆ et al., 2013).

ATIVIDADE ENZIMÁTICA PANCREÁTICA De acordo com os resultados obtidos, não houve efeito principal nem interação entre os fatores sobre a atividade enzimática da tripsina (Tabela 9). Para a atividade da quimiotripsina, houve efeito principal da adição de protease, dos níveis nutricionais, e interação entre adição de protease e os diferentes níveis nutricionais (Tabela 10). Aves alimentadas com dietas com

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redução de proteína e aminoácidos, e contendo protease, apresentam menor atividade enzimática da quimiotripsina aos 43 dias de idade.

Tabela 9. Atividade enzimática da tripsina e quimotripsina em frangos de corte aos 43 dias de idade, alimentados com rações em duas formas físicas, com inclusão ou não de protease, com níveis nutricionais reduzidos ou recomendados.

¹Redução em 4% de Proteína Bruta e aminoácidos em relação às exigências nutricionais descritas por Rostagno et al.(2011).2Erro Padrão da Média.Letras diferentes (a,b) na mesma coluna, dentro de cada fator (Forma Física, Protease e Nível Nutricional) diferem estatisticamente pelo teste F (p <0,05).

Tabela 10. Atividade enzimática da quimotripsina (U/mg de proteína) em frangos de corte aos 43 dias de idade, de acordo com a presença de protease e do nível nutricional.

¹Redução em 4% de Proteína Bruta e aminoácidos em relação às exigências nutricionais descritas por Rostagno et al.(2011).2Erro Padrão da Média.Letras minúsculas na mesma linha e maiúsculas na mesma coluna diferem estatísticamente pelo teste F (p <0,05).

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Os menores valores de atividade enzimática da quimotripsina em aves alimentadas com dietas contendo protease sugerem que uma resposta fisiológica do organismo animal pode ocorrer em função da menor necessidade da secreção endógena de proteases, em decorrência da disponibilidade de enzimas exógenas que possam suprir parcialmente o processo de digestão de proteínas e peptídeos. A redução da atividade enzimática da quimotripsina em dietas com níveis reduzidos de proteína e aminoácidos pode ter sido resultante da menor necessidade fisiológica de secreção de enzimas endógenas devido à menor presença de proteína na dieta, em comparação com as dietas com maiores níveis protéicos. Deste modo, a presença destes dois fatores podem ter resultado em sinergismo proporcionando maiores efeitos sobre as variáveis quando analisados de maneira conjunta. Os resultados encontrados para atividade enzimática da quimotripsina estão de acordo com Nir (1998), que verificou redução da produção endógena desta enzima em pintos de corte de duas semanas que receberam amilase, tripsina e quimotripsina de forma exógena na dieta. Da mesma forma Malagna et al. (1995), relataram que a suplementação de enzimas (amilase e protease) até os 14 dias de idadede frangos de corte, reduziu a atividade da quimotripsina no pâncreas e a atividade da amilase, tripsina e quimotripsina no intestino delgado.

ANÁLISE ECONôMICA De acordo com os resultados encontrados na análise econômica, dietas peletizadas com os níveis nutricionais recomendados por Rostagno et al. (2011), apresentaram maior custo da ração, em comparação aos demais tratamentos experimentais (Tabela11). A adição de protease resultou em aumento médio de 1,30% no custo da ração, sendo: 1,32% (de R$ 350,61para R$ 355,25); 1,29% (de R$ 359,00para R$ 363,63); 1,31% (de R$ 353,95 para R$ 358,59) e 1,28% (de R$ 362,34para R$ 366,98). A peletização das rações proporcionou aumento médio de 0,93% no custo da ração, sendo: 0,95% (de R$ 350,61para R$ 353,95); 0,94% (de R$ 355,25para R$ 358,59); 0,93% (de R$ 359,00para R$ 362,34) e 0,91% (de R$ 363,63para R$ 366,98). A redução de 4% na proteína bruta e aminoácidos das dietas experimentais, em relação às recomendações de Rostagno et al. (2011), promoveu diminuição média de 2,31% no custo da ração, sendo: 2,34% (de R$ 359,00para R$ 350,61); 2,30% (de R$ 363,63 para R$ 355,25); 2,31% (de R$ 362,34para R$ 353,95) e 2,29% (de R$ 366,98 para R$ 358,59).

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Tabela 11.Análise econômica de acordo com os tratamentos experimentais.

1Pintos de um dia, desinfecção, vacinas e medicamentos, energia elétrica, gás aquecimento, mão de obra e encargos, encargos sociais sobre a produção, manutenção e reparos, que corresponde a aproximadamente 11,20% dos custos com ração + pintinhos (APA, março de 2014).2 Valor obtido através da soma do custo da ração + outros custos.3 Valor obtido através da multiplicação entre o peso final total de cada tratamento e o valor do quilograma do frango vivo pago ao produtor.4Valor obtido através da diferença entre a receita bruta e o custo total.5Valor obtido através da relação entre o lucro operacional e a receita bruta, multiplicados por 100.6Valor obtido através da relação entre o custo total e o número final de aves por tratamento.

Da mesma forma em que houve aumento no custo da ração, a adição de protease, peletização das rações e a formulação das dietas sem redução da proteína bruta e aminoácidos, promoveram elevação na receita bruta e custo final por ave. No entanto, a adição de protease promoveu aumento no lucro operacional e índice de lucratividade somente em dietas com redução de 4% de proteína bruta e aminoácidos, independentemente da forma física da ração (Figura 1). Estes resultados podem ser explicados pelo fato de que as enzimas exógenas promovem efeito mais pronunciado em dietas com níveis nutricionais reduzidos, de modo a favorecer maior disponibilidade de nutrientes para a absorção, suprindo as deficiências nutricionais e, consequentemente, promover maior desempenho zootécnico das aves. Deste modo, os efeitos benéficos da adição de enzimas sobre os índices produtivos podem não ser evidentes em estudos avaliando dietas formuladas sem redução nutricional. Sendo assim, os resultados da presente pesquisa indicam considerável viabilidade no emprego de enzimas em dietas com níveis nutricionais reduzidos, uma vez que possibilita redução de custos com matérias primas das rações. A utilização de dietas peletizadas elevou os valores do índice de lucratividade (Figura 2) e lucro operacional. Estes resultados podem ter sido decorrentes do melhor desempenho zootécnico registrado por aves alimentadas com rações peletizadas. A figura 3 apresenta os valores do índice de lucratividade de acordo

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com os tratamentos experimentais, em que o tratamento 7 (dieta peletizada, com níveis nutricionais segundo Rostagno et al., 2011; sem protease) apresentou o maior resultado desta variável.

Figura 1. Índice de lucratividade (%) de acordo com a adição de protease (g/ton de ração) em dietas com redução de 4% em proteína bruta e aminoácidos

Figura 2. Índice de lucratividade (%) de acordo com a forma física da ração

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Figura 3. Índice de lucratividade (%) de acordo com os tratamentos experimentais

Estes resultados estão de acordo com Yadav & Sah (2006), que relataram que o maior aumento na renda sobre os custos com alimentaçãofoi proporcionado por frangos de corte suplementados com 0,075% de protease na dieta. Segundo estes autores, a suplementação de protease em dietas com redução de proteína bruta levam ao aumento da rentabilidade, em comparação com a dieta basal.Porém, os resultados da presente pesquisa discordam de Luis (1997), que, avaliou três tipos de farelo de soja e adição de carboidrase, enão observou efeito da inclusão de enzima sobre os custos de alimentação de poedeiras. Em relação ao processo de peletização das rações, os resultados da presente pesquisa estão de acordo com Meiners et al. (2001) que relataram que aves alimentadas com rações peletizadas com baixa energia apresentaram maior retorno econômico em comparação com as aves alimentadas com rações fareladas, independentemente do emprego de níveis de alta e baixa energia.

CONCLUSÕES A peletização das rações melhora os índices zootécnicos da criação de frangos de corte. A adição de protease exógenanão promove efeitosobre o desempenho e rendimento de carcaça e cortes de frangos de corte. A adição de protease em dietascom redução de proteína bruta e aminoácidos, assim como o processamento das rações, melhora os índices

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econômicos da criação de frangos de corte. A adição de protease exógena e redução dos níveis de proteína e aminoácidos na dieta promovem menor atividade enzimática pancreática da quimotripsina. Rações peletizadas com níveis nutricionais recomendados e adição de protease apresentam os maiores custos de produção.

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CAPÍTULO 6

DELINEAMENTOS EXPERIMENTAIS EM ESTUDOS DE NUTRIÇÃO COM VACAS EM LACTAÇÃO

Francisco Palma Rennó1*, Tiago Antônio Del Valle1, Elmeson Fereia de Jesus2, Rafael Villela Barlatta1, Pablo Gomes de Paiva2, Vitor Bettero Pereira2, Thiago Henrique da Silva1, Gustavo Delfino Calomeni1, Rodrigo Gardinal1, Filipe Zanferari1, Lenita Camargo Verdurico1, Thiago Aniballe

Vendramine1, Caio Seiti Takyia1, Guilherme Gomes da Silva1

1Departamento de Nutrição e Produção Animal (VNP) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo (USP).2Departamento de Zootecnia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP Jaboticabal).*[email protected]

RESUMOO presente capítulo tem por objetivo discutir os principais aspectos

associados a escolha do delineamento experimental utilizado na pesquisa de nutrição de vacas em lactação. O custo de aquisição e manutenção dos animais é invariavelmente alto e os ensaios rotativos, que maximizam as respostas experimentais pelo número de animais utilizados vem sendo questionados. Questões como a ocorrência de efeito residual, ou carryover, e a adaptação insuficiente dos animais às dietas vem sendo destacados como os principais pontos fracos destes delineamentos. Outro questionamento diz respeito ao efeito do estágio de lactação sobre a condição metabólica do animal. Em experimentos de metabolismo, que envolvem maior investimento na aquisição e manutenção dos animais, os delineamentos rotativos tem sido amplamente utilizados e aceitos. Em experimentos que tem como foco o desempenho, estes delineamentos tem sido mais utilizados, em detrimento dos experimentos em DIC e DBC. Estes delineamentos permitem uma estimativa mais real da variação das variáveis produtivas que se pretende medir e evitam os problemas anteriormente citados, sendo portanto mais indicados para a utilização em estudo meta analíticos. O número de animais a ser utilizado nos ensaios, no entanto, aumenta, assim como a necessidade de homogeneidade. Existem poucos trabalhos que comprovem fisiologicamente a ocorrência de efeito residual e que dão embasamento para reduzir a utilização dos delineamentos em reversão nestes estudos. Portanto até o momento não existe um discussão mais ampla do assunto, com apenas questionamentos pontuais por parte de alguns pesquisadores ou grupos isolados.

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INTRODUÇÃOO planejamento de experimentos de nutrição em vacas em lactação tem

importância fundamental nos orçamentos das pesquisas e no alcance potencial dos resultados. Relativamente às outras espécies animais e experimentos agrícolas o custo de aquisição e manutenção dos animais é elevado.

O pesquisador deve conhecer as particularidades de cada delineamento experimental e as reais necessidades financeiras de seus projetos para que estes não se tornem oneroso em demasia, muito menos de baixa relevância científica. Os principais delineamentos utilizados na pesquisa com vacas em lactação podem grosseiramente ser divididos nos experimentos em reversão (Crossover) ou rotativos (Quadrado Latino), onde diferentes medidas são realizadas sobre o mesmo animal e naqueles que avaliam o efeito de fator(s) em estudo sobre cada animal individualmente (delineamento inteiramente casualizado e delineamento em blocos casualizados).

Os delineamentos em reversão ou rotativos são amplamente utilizados na pesquisa em nutrição animal. Contudo, publicações recentes, tem questionado a efetividades destes delineamento em permitir que o pesquisador obtenha comparações válidas sobre os fatores que pretende estudar. Diversas questões como o período de adaptação dos animais, a ocorrência de efeito residual, ou carryover, a heterogeneidade das condições fisiológicas dos animais ao longo dos ensaios tem sido questionados.

O presente capítulo tem por objetivo apresentar as principais críticas aos diferentes delineamentos rotineiramente utilizados na pesquisa em nutrição de vacas em lactação, buscando apresentar os aspectos fisiológicos, logísticos e estatísticos que possam embasar a opção por um ou outro delineamento.

CONCEITOS BÁSICOS DE EXPERIMENTAÇÃOA conceitualização básica de tratamentos, unidade experimental

e delineamentos experimentais são fundamentais para o início das nossas discussões. Os tratamentos podem ser definidos como condição imposta as unidades experimentais ou objeto que se deseja avaliar em um experimento. Estes podem ser dispostos em ordem como por exemplo doses de nutrientes ou níveis de temperatura e são ditos quantitativos. Os tratamentos não dispostos em ordem são ditos qualitativos, por exemplo, o método de preparo de determinado reagente ou a marca de determinado equipamento (Pimentel Gomes, 2009).

As unidades experimentais ou parcela é o local ou indivíduo os tratamentos são aplicados (Pimentel Gomes, 2009). Pode ser definida também como a menor unidade capaz de fornecer dados das variáveis resposta que se pretende estudar (instruções para autores do Journal of Dairy Science, 2014). As parcelas podem ser compostas de pequenas unidades ou indivíduos ou

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grupos de unidades, dependendo do fenômeno a ser estudado, da forma como o experimento é conduzido e disponibilidade de recursos.

Os delineamentos experimentais podem ser definidos como a forma que os tratamentos são aplicados às unidades experimentais (Pimentel Gomes, 2009). A adoção de um delineamento experimental pode ser traduzido, de forma simplificada, como a aplicação dos princípios básicos da experimentação, a saber: repetição, casualização e controle local. Estes princípios foram propostos inicialmente por Ronald Fisher, no início do século XX, enquanto membro da Estação Experimental de Rothamsted, na Inglaterra. Suas ideias, formalizadas em dois de seus grandes trabalhos, inovaram as técnicas experimentais e representam até hoje a base do pensamento estatístico experimental (Pearce, 1983).

As repetições objetivam, fundamentalmente, permitir a estimação dos efeitos das causas aleatórias e melhorar as estimativas dos efeitos dos tratamentos, como melhorar a estimativa da média (Pimentel Gomes, 2009). Quanto maior o número de repetições, mais precisas serão tais estimativas. Embora esse acréscimo em precisão possa não compensar os custos adicionais advindos de uma elevação excessiva do número de repetições. Uma regra prática para se definir o número de repetições de um experimento recomenda é não usar um número total de parcelas inferior a vinte e nem um número de graus de liberdade inferir a dez para o resíduo (Pimentel Gomes, 2009).

A casualização pode ser entendida como alocação casual dos tratamentos às unidades experimentais disponíveis. A adoção desse princípio reduz possíveis favorecimentos sistemáticos a certos tratamentos em detrimento de outros, no momento da sua distribuição às parcelas (Pimentel Gomes, 2009). Casualizar significa retirar toda influência consciente ou inconsciente que o experimentador possa ter na distribuição dos tratamentos às parcelas. De acordo com Yates e Cochran (1938) essa prática neutraliza o efeito da correlação espacial entre as parcelas, garantindo validade às estimativas do erro e dos efeitos de tratamentos.

O controle local só se justifica quando as parcelas a constituírem o experimento forem heterogêneas entre si. Sua aplicação se faz agrupando unidades experimentais homogêneas em subconjunto denominados blocos, os quais receberão um conjunto de tratamentos (Pimentel Gomes, 2009). O agrupamento é feito de maneira a maximizar a variação entre blocos, deixando o mínimo de variação entre as parcelas dentro de cada bloco. Portanto, o que se busca com o controle local é a aplicação do conjunto dos tratamentos a um grupo de parcelas o mais homogêneas possível, de forma a reduzir os efeitos da heterogeneidade das parcelas na comparação dos tratamentos.

O controle local pode ser também entendido como restrições impostas à livre casualização das unidades experimentais aos tratamentos, visto que ela

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passa a ser feita dentro dos blocos. Dessa forma, o uso do controle local, quando aplicado convenientemente a um conjunto de parcelas heterogêneas, reduz o erro experimental, aumentando a capacidade do experimento de detectar diferenças reais entre os tratamentos (melhoria da precisão experimental). Além disso, com essa prática podem-se reduzir os erros na estimativa da média dos tratamentos (Riboldi, 1995).

Quatro pressuposições compõem a base da análise de variância e são citadas a seguir: aditividade dos efeitos avaliados; independência dos erros; normalidade das distribuições dos erros; homogeneidade das variâncias. Admitir que os efeitos são aditivos é fundamental para particionar a variação observada a componentes conhecidos ou aleatórios (erro) (Cochran e Cox, 1957).

EXPERIMENTAÇÃO AGRÍCOLAA aplicação dos conceitos abordados no item anterior permitiu o

desenvolvimento da experimentação agrícola como ciência e o conhecimento mais aprofundado dos delineamentos experimentais. Os principais delineamentos utilizados nesta área variam principalmente quanto a adoção do controle local.

No delineamento inteiramente casualizado (DIC) é necessário completa homogeneidade das condições ambientais e do material experimental sendo os tratamentos alocados às parcelas de forma inteiramente ao acaso. O DIC possui apenas os princípios da casualização e da repetição, não possuindo controle local (Kalckmann, 1958). Este delineamento possui grande flexibilidade quanto ao número de tratamentos e repetições, sendo dependente, entretanto, da quantidade de material e área experimental disponíveis. Considerando o mesmo número de parcelas e tratamentos avaliados, é o delineamento que possibilita o maior grau de liberdade do erro. Como desvantagem, pode-se citar a exigência de homogeneidade das condições experimentais. Se as condições não forem uniformes, como se espera antes da instalação do experimento, a variação aleatória aumenta, reduzindo a precisão do experimento (Pimentel Gomes, 1984).

O delineamento em blocos casualizados (DBC) é utilizado quando as condições experimentais não são homogêneas. A área heterogênea é subdividida em blocos, de forma que, cada bloco seja o mais homogêneo possível. A exigência de homogeneidade dentro de cada bloco pode limitar o número de tratamentos a serem testados. Neste delineamento, em cada bloco, tem-se ao menos uma repetição de cada tratamento e estes são casualizados dentro de cada bloco. A disposição dos blocos vai depender das condições de heterogeneidade da área experimental. De maneira geral, o bloco deve ser o mais homogêneo possível, podendo haver diferenças marcantes de um

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bloco para o outro (Kalckmann, 1958). Este delineamento permite controlar diferenças nas condições ambientais de um bloco para outro; leva a uma estimativa mais exata da variância residual, uma vez que a variação ambiental entre blocos é isolada. No entanto, há redução no número de graus de liberdade do erro; o número de tratamentos a ser utilizado é limitado pela exigência de homogeneidade dentro dos blocos, não podendo ser muito elevado (Pimentel Gomes, 1984).

No delineamento em Quadrados Latinos (DQL) há a adoção do controle local em duas direções. O DQL é um delineamento bastante utilizado em condições de campo, nas quais duas fontes de variação principais estão presentes e precisam ser controladas. Cada tratamento aparece uma única vez em cada linha (ou bloco horizontal) e em cada coluna (bloco vertical). A principal exigência do Quadrado Latino é que o número de repetições seja igual ao número de tratamentos. Os delineamentos em Quadrado Latino recebem este nome pois o número de parcelas totais do experimento corresponde ao quadrado do número de tratamentos e por terem sido, originalmente, representados por letras latinas. Como vantagens, podemos destacar o controle das diferenças nas condições ambientais de um bloco para outro em duas direções e a estimativa mais exata da variância residual, uma vez que a variação ambiental entre blocos, em duas direções, é isolada (Kalckmann, 1958). Como desvantagens, podemos citar que há uma redução no número dos graus de liberdade do erro e o número de tratamentos a ser utilizado é limitado pela exigência de homogeneidade dentro dos blocos, não podendo ser muito elevado. Em experimentos agrícolas, geralmente, o tamanho máximo de Quadrados Latinos é 8x8 (Pimentel Gomes, 1984).

Ainda, deve-se ressaltar que embora muitas publicações os considerem como delineamentos experimentais, os experimentos fatoriais não são delineamentos e sim um esquema de arranjo de tratamentos que podem ser instalados em quaisquer dos delineamentos experimentais citados acima.

EXPERIMENTAÇÃO ANIMALA maioria dos conceitos aplicados sobre a experimentação agrícola

se aplicam também a experimentação animal. Na experimentação agrícola, no entanto, invariavelmente utiliza-se de pequenas áreas que representam o comportamento dos tratamentos em lavouras comerciais. O custo associado a cada parcela geralmente é baixo e a estreita relação da fisiologia vegetal com as condições solo faz com que o efeito residual do tratamento seja longo.

Na experimentação animal, especialmente com animais de grande porte, o custo de aquisição, instalação e manutenção do animal em condições experimentais é alto e o efeito residual de tratamentos tende a ser baixo. Nestas condições, a muito tempo tem se utilizado as observações dos animais em

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diferentes período de observação, quando expostos a diferentes tratamentos, como as unidades experimentais, no delineamento em quadrado Latino (Lucas, 1957). Estes delineamentos nos quais os animais passam pelos diferentes tratamentos são conhecidos como ensaios rotativos (Sampaio, 2002). Além do delineamento em quadrados Latino citados anteriormente, apresentam estas características também os ensaios em reversão, como os que utilizam delineamentos em cross-over e switch-back.

EXPERIMENTOS EM Crossover E QUADRADOS LATINOS COM ANIMAIS

Delineamentos do tipo quadrado Latino são amplamente difundidos na pesquisa com bovinos leiteiros (Lucas, 1957). O padrão básico destes delineamentos pode ser ilustrado pela tabela a seguinte, em uma configuração para quatro tratamentos.

Figura 1. Padrão básico de um experimento em Quadrado Latino com animais.

Um ou mais animais, normalmente em número igual, são alocadas a cada sequência de tratamentos. Segundo Lucas (1957), uma grande vantagem deste delineamento é que a inclusão do efeito de animal no modelo permite a comparação do efeito de tratamentos, mesmo com o uso de animais com produções diferentes.

Lucas (1957) já destacava a possibilidade da ocorrência do efeito residual, ou carry-over, que nada mais é do que a possibilidade das observações dos resultados observados para um tratamento ser influenciada pelo tratamento administrado imediatamente antes sobre o mesmo animal. O autor sugeriu que a realização das avaliações apenas no final do período experimental, após um período de adaptação, reduziria a ocorrência destes erros.

Cochran et al. (1941) sugeriram a utilização de alguns padrões de sequências que permitissem a estimativa dos efeitos residuais. Estes padrões requerem que cada tratamento deve ser precedido por qualquer outro tratamento de um número igual de vezes e são mencionados como sendo balanceados ou equilibrados.

Padrões de distribuição de tratamentos que tornem os experimentos balanceados, mesmo com seis ou mais tratamentos podem ser facilmente obtidos. No entanto, considerando que cada período experimental deve

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compreender algumas semanas, e que normalmente tem-se interesse em estudar vacas entre o pico da lactação e metade da gestação, são pouco aplicáveis na prática (Sampaio, 2002).

Este efeito natural da evolução dos dias em lactação tem sido uma das principais críticas aos experimentos em quadrado Latinos com vacas em lactação. Se por um lado o aumento da duração dos períodos experimentais reduz o efeito residual e melhora a adaptação dos animais, por outro faz com que as respostas sejam mais heterogêneas, uma vez que são comparados animais com diferentes dias em lactação (Lean et al., 2009). Quando reduz-se a duração do período experimental, no entanto, a adaptação destes fica prejudicada (Rabiee et al., 2012).

O erro experimental associado ao delineamento em quadrado Latino decorre, em grande parte, das variações temporais entre vacas dentro de um mesmo quadrados. Por exemplo, o declínio produtivo de vacas de alta produção geralmente é maior, em valor absoluto, do que é o declínio de vacas de baixa produção. Assim, atribuindo a um determinado quadrado animais tão uniforme quanto possível no que diz respeito ao nível de produção inicial o erro experimental é reduzido. Os grupos de diferentes níveis de produção são então aleatoriamente designados para aos diferentes quadrados, com distribuição aleatória posterior dentro deste para as sequências de tratamentos (Lucas, 1957).

Tem se observado recentemente um cresce número de publicações em revistas de grande impacto, principalmente estudos meta-analíticos, nos quais os delineamentos experimentais em reversão e rotativos vem sendo questionados.

Rabiee at al., (2012), em estudo meta-analítico, estudaram o efeito da adição de lipídeos na dieta de vacas em lactação sobre a produção e a composição do leite. Estes autores, com base nos resultados de Lean et al. (2009) e alegando que os experimentos delineados em Crossover e Quadrado Latino poderiam levar a conclusões equivocadas, em decorrência do carry-over, ou efeito residual, os excluíram das suas análises.

Block e Evans (2010) avaliaram o tempo de suplementação com lipídeos para vacas em lactação. Os autores compararam os resultados de experimentos que avaliavam a suplementação de lipídeos, tendo períodos de avaliação menores ou maiores que 28 dias. Os autores concluíram que a magnitude dos efeitos da suplementação é maior em experimentos com períodos maiores de suplementação em comparação com os resultados de experimentos com período menor de 28 dias e atribuíram estes resultados à ocorrência do carry-over.

Duffield et al., (2008), também em estudo meta-analítico, avaliando os efeitos metabólicos da adição de monensina sódica na dieta de vacas

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leiteiras, também excluíram os estudos conduzidos em cross-over e Quadrado Latino, alegando que estes experimentos tinham um curto período de avaliação e que potenciais problemas com o período de adaptação do rúmen poderiam ocorrer. Rabiee at al., (2012) cita que no estudo de Duffield et al., (2008) foi demonstrado que lipídeos consumido em um período do estudo em quadrado Latino poderiam ser remobilizados em um período subsequente. Esta afirmação, no entanto, é inverídica, pois além de avaliar os efeitos de monensina sódica como aditivo modulador de fermentação ruminal, estes autores não avaliaram a suplementação lipídica e ainda desconsideraram os experimentos em Crossover e quadrado Latino.

Cant at al. (1997) ilustrou o efeito residual em um experimento em quadrado Latino, avaliando a suplementação com óleo de peixe e monensina na dieta de vacas leiteiras. Neste estudo, utilizando um período de avaliação de três semanas, os autores observaram que houve claramente um efeito residual do óleo de peixe sobre o tratamento com monensina sódica, pois duas das quatro vacas alimentadas unicamente com monensina apresentaram ácido docosahexaenóico detectável no perfil de ácidos graxos do leite. Depois de verificar a ordem de tratamento, constatou-se que as duas vacas haviam sido anteriormente alimentadas com dietas contendo óleo de peixe. Lean et al. (2009) afirmam que em trabalhos do seu grupo de pesquisa, ainda não publicados, podem ser observadas diferenças nas análises da produção de proteína no leite das vacas quando as avaliações foram feita em delineamentos em quadrado Latino ou blocos casualizados. Estas diferenças mostram uma menor variação na produção de proteína nos estudos em quadrado Latino.

QUESTÕES FISIOLóGICASAlgumas questões fisiológicas devem ser consideradas na

interpretação das citações acima descritas. Experimentos que visão avaliar os efeitos de determinada dieta ou determinada técnica, em determinada fase do ciclo de produção da vaca leiteira, associados a eventos esporádicos, como a maioria dos eventos reprodutivos, devem necessariamente ser conduzidos em DIC ou DBC.

A fase entre o pico de produção e o terço médio de lactação tem sido a mais utilizada em experimentos de nutrição com vacas leiteiras. Motivos para a utilização desta fase incluem a alta produção de leite, relacionada a uma alta exigência nutricional e alto consumo de matéria seca, e a menor variabilidade das respostas em relação ao início de lactação, que aumentam a sensibilidade experimental. Independentemente do delineamento a ser adotado, a fase da lactação é uma característica importante a ser considerada, tendo correlação direta com a condição metabólica do animal e a produção de leite. O NRC (2001), por exemplo, utiliza-a como parâmetro para estabelecer o consumo de

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matéria seca e o nível nutricional mais adequado para o animal. Os convencionais quadrado Latino 4x4 com 21 dias de período

de avaliação acabam por apresentar uma variabilidade maior destes dias em lactação, visto que entre a primeira e última avaliações de cada animal tem-se uma diferença de 63 dias. Apesar de estatisticamente os efeitos serem considerados na análise, fisiologicamente as análises sobre o mesmo animal estão sendo realizadas em fases distintas do ciclo produtivo. A inclusão de animais que ainda não atingiram o pico de lactação configura situação ainda mais grave e invariavelmente dificulta que os dados atendam as premissas da análise de variância.

Sampaio (2002) destaca ainda que a persistência de lactação, ou seja, o declínio observado na produção de leite após o pico de lactação é uma característica que apresenta grande variação individual e, portanto, é difícil de ser pré-estabelecida. O autor destaca que uma velocidade exacerbada de queda de alguns animais pode prejudicar as avaliações dos últimos tratamentos aplicados a estes animais em ensaios rotativos.

São escassos os dados na literatura avaliando o período residual de dietas. Rohrmoser e Kirchgessner, citados por Cowley et al. (2014) observaram que vacas após serem submetida a quatro semanas de restrição alimentar, quando voltam a dieta ao nível alimentar pré-restrição, voltam rapidamente aos níveis produtivos observados antes da restrição. Os autores afirmam ainda, que vacas no terço médio de lactação não apresentam diferenças significativas após três semanas de realimentação, enquanto que vacas em início de lactação podem ter um comprometimento do pico de produção, reduzindo a produção total da lactação. Cowley et al., (2014), por sua vez, observaram menores produções de leite, proteína, lactose e gordura, três semanas após restrição alimentar.

Uma das principais questões fisiológicas da adaptação às dietas experimentais envolve a adaptação do sistema digestório do animal. Grummer e Kulick (2005), citaram que é notavelmente curiosa a ausência de pesquisas que descrevam mudanças nas populações microbianas no rúmen à medida que a vaca passa pelo período de transição ou que expliquem como essas mudanças poderão ser influenciadas pela dieta. Ainda relata que dados obtidos com bovinos de corte em confinamento e, em menor grau, com vacas leiteiras em lactação, sugerem que populações microbianas requerem três semanas para atingir um nível estacionário após mudanças abruptas na dieta. Segundo Fernando et al. (2010), a dinâmica da população microbiana ruminal durante a fase de adaptação de bovinos de corte a dieta com alto teor de concentrado ainda não é completamente entendida e são excassos os relatos deste na literatura. Obviamente a grande diversidade do ecossistema ruminorreticular dificulta o trabalho de identificação qualitativa de microrganismos.

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Para que a adaptação dos microrganismos ruminais ocorra, a superfície absortiva do epitélio ruminal deve estar suficientemente adaptada para absorver os produtos da fermentação. Segundo Sakata e Tomate (1979), após a infusão de acetato e propionato, o índice mitótico do epitélio ruminal apresenta seu valor máximo entre o terceiro e quarto dias. Resende Júnior et al. (2006), observaram que na transição de uma dieta baseada em feno, para uma dieta contendo concentrado e feno, as papilas do saco cranial do rúmen atingem o seu tamanho máximo 12 dias após a introdução do concentrado.

Bhanugopan et al. (2010) avaliaram o efeito residual da suplementação de potássio na dieta de vacas leiteiras de 6 meses de gestação até 15 dias antes do parto. Houve uma redução da concentração de vitamina D no plasma até dois dias pós parto, mas nenhuma outra diferença foi observada metabolismo do cálcio.

Uma estratégia, costumeiramente utilizada em ensaios clínicos é a implementação de um período washout, no qual os animais não submetidos a uma dieta controle por um período entre o fornecimento dos tratamentos, assim como utilizado por Li et al.(2012). Esta estratégia reduz o risco de efeito residual, embora agrave os problemas relativos ao período de lactação. Há uma limitação quanto ao número de períodos a serem avaliados, sendo uma opção mais viável em ensaios em Crossover. Em ensaios com novilhas e vacas secas, quando a influencia da evolução dos dias é menor, sua utilização é interessante.

EXPERIMENTOS EM DIC E DBCConsiderando-se as limitações destes delineamentos rotativos e em

reversão, tem se pensado em trabalhar com delineamentos mais simples, nos quais cada animal é obsevado apenas quando submetido a um único tratamento. Como discutido anteriormente, no entanto, a adoção do quadrado Latino permite a avaliação de uma quantidade muito maior de unidades experimentais, sem aumentar consideravelmente os custos de infraestrutura e com animais (Lucas, 1957). A possibilidade de alocar animais de diferentes potenciais produtivos em quadrados distintos permite a estimativa do efeito do quadrado, o que, juntamente com a estimativa do efeito aleatório do animal, melhora as estimativas da variação residual, quando os animais não são homogêneos entre si.

Quando se trabalha com quadrado Latino 4x4 replicado, se ponderarmos apenas os efeitos do número de unidades experimentais, seriam necessários quatro vezes mais animais para atingir precisão experimental semelhante em experimento em DIC. Considerando a necessidade da homogeneidade dos animais, dependendo do rebanho em que se está trabalhando, a necessidade de animais pode aumentar de maneira significativa e isso pode dificultar ou até mesmo inviabilizar a condução do experimento.

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Uma possibilidade para contornar tais limitação é a utilização do delineamento em blocos casualizados (DBC), onde o efeito da variação entre os animais pode ser minimizado pela aplicação do controle local. Em condições práticas de pesquisa, a aplicação não contemporânea dos tratamentos aos blocos, reduzindo consideravelmente a necessidade do numero de animais no rebanho base, embora não reduza a importância de se trabalhar com um rebanho o mais homogêneo possível.

PRECISÃO EXPERIMENTALOs experimentos com vacas leiteiras são normalmente delineados

para avaliar a hipótese de nulidade, ou seja, de que as dietas não influenciam as variáveis respostas, como por exemplo, a produção de leite. Ao testa a hipótese de nulidade sujeita-se a cometer erros de dois tipos. O erro do tipo I que advém da conclusão de que as dietas diferem entre si, quando na verdade elas não diferem. O erro do tipo II é concluir que os tratamentos não diferem, quando na verdade eles diferem entre si. Os pesquisadores estão geralmente mais preocupados com o erro do tipo I e por isso a taxa normalmente aceita é de 0,05 (Kononoff e Hanford, 2006). O poder do teste pode ser definido como a probabilidade de evitar o erro do tipo II. Em outras palavras, é a probabilidade de rejeitar corretamente a hipótese de nulidade.

McMillan (2004) estudou os delineamentos para avaliar a equivalência de dietas na alimentação animal e observou que os principais fatores que influenciam no poder do teste, além do delineamento experimental são o número de unidades experimentais, coeficiente de variação e o nível de significância (α) adotado.

Pimentel-Gomes (2009) cita que existem diversas maneiras de se calcular o número necessário de observações, nenhuma, no entanto, satisfatória. O autor ainda cita que na experimentação agrícola e zootécnica, dificilmente tem-se resultados razoáveis com número de observação menores que 20 unidades experimentais e menos de dez graus de liberdade do resíduo. Simulando o efeito do tamanho do número de observações sobre o poder do teste bicaudal, para o teste de DIFF, com desvio padrão de 0,2 e diferenças entre as médias de 0,1, 0,2 ou 0,3, tem-se os resultado apresentados na (Figura 1), a seguir.

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Figura 1. Poder do teste, para o teste de DIFF bicaudal, com desvio padrão de 0.2 e diferenças entre as médias de 0.1, 0.2 ou 0.3. Dados simulados no PROC POWER do SAS 9.0.

Nas condições avaliadas, pode-se observar que para diferenças de 0,3 e 0,2; 7 e 18 animais, respectivamente, são suficientes para permitir um poder do teste de 0,8 (80%). Se a diferença entre os tratamentos forem de 0,1, dificilmente estas diferenças serão identificadas, nem mesmo utilizando-se um número bem maior de animais. Deve-se ressaltar que estas estimativas, realizadas pelo PROC POWER do SAS 9.0 consideram apenas a comparação entre dois tratamentos em um experimento em delineamento inteiramente casualizado. Com o exposto pode-se observar que o número de repetições é, sem dúvida, um dos fatores que mais influenciam no poder do teste.

Tempelman, (2004) avaliou o poder do teste em experimentos em quadrados Latino 4x4 e em Crossover duplicado quando a variação na produção de leite foi de 2 ou 10 (kg/dia)2, a diferença entre os tratamentos de 1, 2, 3 ou 4 kg/dia, em função do número de vacas utilizadas (Figura 2). Os autores citam que em experimento em quadrado Latino, o efeito residual, ou Carryover pode ser estimado como a interação entre efeitos de tratamento e período.

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Figura 2. Poder do teste em função do número de quadrado (em quadrado Latino 4x4) ou do número de vacas (em Crossover replicado) quando a diferença entre os tratamento foi de 1(○), 2 (●), 3 (□), ou 4 kg/d (■) com base na variação entre vacas de 2 ou 10 (kg/d)2. Fonte: Tempelman, (2004).

Os resultados de Tempelman, (2004) sugerem que o poder do teste, utilizando-se a mesma quantidade de animais, em um Crossover duplicado é ligeiramente maior que em um quadrado Latino 4x4. Esta observação está associada às diferenças no número de tratamentos avaliados, que faz com que o número de observações por tratamento em cada período no quadrado Latino seja a metade do observado no Crossover duplicado, dificultando a avaliação do efeito residual.

Sampaio (2002) também destaca que em experimentos com vacas em lactação, ensaios em reversão podem levar a maior sensibilidade experimental que em experimentos rotativos. Além de permitir melhor estimativa do efeito residual, segundo este autor, a realização de medidas sucessivas sobre o mesmo animal, quando submetido ao mesmo tratamento permite corrigir os erros associados as diferenças na persistência de lactação dos animais.

SITUAÇÃO ATUAL DA PESQUISA EM VACAS LEITEIRASPensando-se em revisar os principais delineamentos utilizados na

pesquisa em nutrição de bovinos leiteiros, os autores do presente capítulo

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revisaram os principais delineamentos utilizados, nos trabalhos da área, publicados entre julho de 2011 e junho de 2014, no Journal of Dairy Science, da qual, os resultados são discutidos abaixo.

Foram revisados 146 trabalhos com vacas em lactação, sendo que destes, 27 (18,9%) foram conduzidos em DIC, 32 (22,4%) foram conduzidos em DBC, 66 (46,2%) foram conduzidos em DQL e 18 (12,6%) em Crossover.

Nos experimentos em DIC foram utilizados em média 73 ± 58,2 animais. Destes estudos, 52% foram realizados com vacas no início de lactação e 43% com vacas no terço médio de lactação. Nos experimentos em DBC, foram utilizados em média 67,5 ± 26,1 animais, sendo que 44% e 47% foram realizados com vacas no início e no terço médio de lactação, respectivamente.

Nos experimentos em quadrado Latino, utilizaram-se 11,2 ± 9,9 animais. Vale ressaltar que grande parte desta variação pode ser atribuída aos trabalhos de Rezac et al. (2012), Alstrup et al. (2014), e Vargas-Rodriguez et al. (2014), sendo estes dois últimos conduzidos sobre a supervisão do Professor Barry Bradford, da Universidade do Kansas. Nestes experimentos, cada período experimental foi de 28 dias, sendo 21 de adaptação e as vacas foram mantidas em baias coletivas. Desconsiderando-se estes trabalhos, os demais foram conduzidos utilizando-se 9,4 ± 5,7 animais, sendo que 12 (18%) destes utilizaram apenas quatro vacas. Nos experimentos em Crossover, foram utilizados 16,1 ± 7,1 vacas, sendo que esta quantidade variou de 8 a 32 animais.

Apesar de todas as críticas enumeradas acima aos experimentos rotativos, como foi observado nos dados levantados em um do principais meio de publicação a respeito do assunto, pode-se afirmar que estes ainda são muito utilizados na pesquisa com vacas em lactação, possibilitando a realização de ensaios de metabolismo mais elaborados, com reduzido número de animais sem comprometer consideravelmente as conclusões obtidas.

Os ensaios que tem por objetivo avaliar principalmente desempenho, apresentam escolha crescente pelos delineamento não rotativos, que refletem melhor a variabilidade dos resultados que serão observados em condições práticas. Além disso, estes delineamentos permitem a avaliação de animais mais homogêneos quantos aos dias em lactação e evita questionamentos a cerca da adaptação dos animais.

CONCLUSÃOOs delineamentos utilizados na pesquisa com vacas leiteiras exercem

importante papel nos resultados obtidos nos ensaios a campo. Os ensaios rotativos vêm sendo constantemente questionados quanto a sua efetividade, embora não haja comprovação científica. Os principais argumentos para a contestação baseiam-se em condições experimentais muito específicas, com

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pequeno número de avaliações como no trabalho de Cant et al., (1997). Estudos que forneçam embasamento fisiológico para adoção ou não

dos delineamentos em reversão e rotativos são escassos, provavelmente pela dificuldade de se trabalhar com animais em homeorrese, quando as variáveis mensuradas apresentam alta variabilidade, numa condição em que os estudos devem objetivar a comprovação da bioequivalência no tempo.

Independentemente dos argumentos fisiológicos, a revisão de dados da literatura mostrou que em estudos que objetivam avaliar o desempenho animal, ensaios em DIC e DBC tem sido mais aceitos, demandando uma maior quantidade de animais e recursos, consequentemente. Por outro lado, estudos mais focados em fisiologia e metabolismo, utilizando animais canulados, cateterizados ou mantidos em gaiolas metabólicas, pela dificuldade logística e financeira de obtenção dos dados e manutenção do animal, tem sido realizados principalmente em delineamentos rotativos ou em reversão, possibilitando a avaliação destas varáveis, com a utilização de um pequeno número de animais, em detrimento da críticas apresentadas.

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CAPÍTULO 7

FONTES DE CARBOIDRATOS NÃO FIBROSOS NA TERMINAÇÃO DE BOVINOS DE CORTE

Luis Felipe P. Silva, Viviane B. Ferrari, Nara R. B. Cônsolo, Rafael T. Sousa, Johnny M. Souza, Dannylo O. Sousa, Matheus O. Frasseto e

Juliane Diniz-Magalhães.

Departamento de Nutrição e Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - Universidade de São Paulo.

INTRODUÇÃOA fase de terminação de bovinos de corte em confinamento é parte

importante do processo de intensificação de pecuária de corte brasileira, uma vez que permite maior lotação das pastagens no período de verão. Durante a terminação, os gastos com alimentação representam de 70 a 80% do custo total (Pacheco et al., 2006) e, portanto, o confinador busca a maior eficiência do uso de alimentos que leve ao menor custo de ganho de peso. Apesar do menor valor nutritivo em relação às silagens de milho e sorgo (Andrade et al., 2004), a cana-de-açúcar apresenta características de grande interesse aos bovinocultores, como elevada produção de matéria seca por hectare, facilidade de cultivo e persistência da cultura, boa aceitação pelos animais; elevado teor de carboidratos solúveis e menor custo de produção (Freitas et al., 2006; Landell et al., 2002; Nussio et al., 2002). Ao contrário de outras forrageiras, a cana não reduz seu valor nutritivo de forma expressiva no período de estiagem, e destaca-se pelo aumento no teor de sacarose nesta época do ano (Borges; Pereira, 2003). A cana-de-açúcar colhida diariamente e oferecida fresca aos animais é uma prática tradicional e de amplo conhecimento de pecuaristas. Porém, o manejo industrial de canaviais exige que o corte dos talhões seja realizado de forma concentrada, para aumentar a eficiência dos tratos culturais. Além disso, o corte diário torna-se problemático em razão da dificuldade de sua colheita em dias de chuva, e à perda de seu valor nutritivo durante o verão. O desenvolvimento recente de técnicas de conservação da planta inteira da cana-de-açúcar na forma de silagem permite sua utilização por um número maior de pecuaristas nos mais diversos sistemas de produção (Queiroz et al., 2008; Schmidt et al., 2007). Poucos trabalhos avaliaram diferentes fontes de carboidratos solúveis em dietas tendo a cana-de-açúcar, in natura ou em silagem, como fonte de volumoso (Pereira et al., 2007; Simas et al., 2008), sendo fundamental o entendimento dos efeitos de diferentes fontes energéticas sobre o metabolismo

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ruminal e desempenho animal. Assim, pretende-se com esta revisão, discutir e apresentar resultados sobre o fornecimento de diferentes fontes de carboidrato não estrutural sobre o desempenho e metabolismo ruminal de bovinos de corte.

FONTES DE CARBOIDRATOS NÃO-FIBROSOSOs carboidratos são as biomoléculas mais abundantes da Terra,

apresentam a fórmula (CH2O)n e, nas plantas, sua síntese se dá através da fotossíntese onde, na presença de energia luminosa, o carbono presente no na atmosfera na forma de CO2 é combinado com a água e transformado em carboidratos. Suas principais funções nas células vegetais são: fonte e reserva de energia e manter estrutura das plantas (Lehninger, 1986).

Para os ruminantes, os carboidratos compreendem entre 70 e 80% das rações e são fundamentais para o atendimento das exigências de energia, síntese de proteína microbiana e da saúde animal (Mertens, 1996). Os carboidratos são divididos em dois grandes grupos: os da parede celular (carboidrato estrutural) e os de conteúdo celular (carboidrato não estrutural - CNE), como pode ser observado na Figura 1.

Figura 1. Frações dos carboidratos das plantas. FDA = Fibra em Detergente Ácido, FDN = Fibra em Detergente Neutro, FSDN = Fibra Solúvel em Detergente Neutro (que inclui todos os polissacarídeos não presentes no FDN), CNF = Carboidratos não-fibrosos. Adaptado de Hall (2003).

A fibra é um termo usado para estabelecer um conceito puramente nutricional sendo definida por nutricionistas como a fração indigestível

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ou de lenta digestão do alimento que ocupa espaço no trato gastrointestinal (Berchielli, 2006). Deste modo a parede celular não pode ser levada em conta como uma medida exata de fibra, uma vez que engloba substâncias pécticas que são de alta digestibilidade (Mertens, 1996). Os carboidratos não fibrosos (CNF) é uma fração facilmente e quase completamente digerida pela maioria dos animais que engloba ácidos orgânicos, mono e oligossacarídeos, frutanas, amido, pectina e outros carboidratos exceto a hemicelulose e celulose encontradas na fração da Fibra em Detergente Neutro (FDN) (Van Soest, 1993; Hall 2003).

A pectina, apesar de ser um componente associado à parede celular, é quase completamente digerida no rúmen (90 a 100%) e, além disso, apresenta menor efeito acidogênico ruminal do que o milho (Nocek & Tamminga, 1991). É encontrada em altos níveis em polpa cítrica ou de beterraba, casca de soja e forrageiras leguminosas dicotiledôneas e ausente em gramíneas (Allen & Knowlton, 1995). Já o amido é o carboidrato de reserva encontrado na maioria dos grãos de cereais como milho. A pectina e o amido, por serem altamente digestíveis e energéticos, são geralmente inseridos na dieta em substituição à FDN para atender os requerimentos de energia de animais de alto ganho, principalmente em terminação.

Quando analisados no enfoque da nutrição, os subprodutos agroindustriais podem apresentar-se como fontes nutricionais de excelente qualidade. Outra vantagem na utilização destes alimentos é a possibilidade de uma maior flexibilidade na formulação de dietas, em função da variedade de ingredientes. Além disso, alguns subprodutos podem conter nutrientes especiais ou complementares aos já existentes nas dietas tradicionais (Meneghetti et al., 2008). Dentre as várias possibilidades, três produtos da indústria alimentícia brasileira, a Polpa cítrica, a Casca de Soja e o Farelo de Glúten de Milho despontam como alternativas interessantes para substituir, pelo menos em parte, o milho das dietas de bovinos.

POLPA CÍTRICA PELETIZADA A polpa cítrica peletizada é um subproduto da produção de suco de laranja e vem conquistando cada vez mais espaço no mercado pecuário nacional, principalmente devido a seu preço e suas qualidades nutricionais (Neto et al., 2007). O processo de obtenção da polpa cítrica consiste em três etapas: Inicialmente, se realiza uma desidratação da massa de resíduos cítricos, com posterior adição de melaço e finalmente, a peletização. No início do processo ocorre adição de hidróxido de cálcio para facilitar a desidratação da massa e promover um ajuste de pH (Yamanaka, 2005). A sua época de produção, tem inicio em maio e termina em janeiro, coincidindo com a entressafra de grãos de grãos como o milho e sorgo. Diante disso, os produtores de gado de corte

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podem contar com um importante suplemento energético nos meses em que o milho atinge cotação máxima (Scoton, 2003).

No que diz respeito ao aspecto nutricional, o principal carboidrato da polpa cítrica peletizada é a pectina, sua molécula é formada por uma cadeia linear de ácido galacturônico, interrompida por unidades de ramnose. A cadeia de ácido galacturônico é ligada por ligações α1-4, similar a que acontece no amido, porém difere na ligação axial do carbono 4, não sendo portanto, susceptível a ação da amilase (Van Soest, 1994). Em comparação ao amido, a pectina possui menor propensão em causar queda de pH ruminal, devido a sua fermentação ser realizada por microrganismos celulolíticos, o que favorece a produção de acetato e não de lactato e propionato, como ocorre na fermentação por microrganismos que degradam o amido (Pedroso & Carvalho, 2006). Em função dos seus teores de FDN e Fibra Insolúvel em Detergente Ácido (FDA) e das suas características de fermentação ruminal, a mesma se enquadra como produto intermediário entre volumosos e concentrados. É um alimento rico em cálcio e pobre em fósforo, e sua fração fibrosa apresenta elevada degradabilidade ruminal, que está associada principalmente ao seu baixo teor de lignina (Pedroso & Carvalho, 2006).

Em função da sua rápida degradabilidade ruminal, a polpa cítrica peletizada é um alimento interessante de ser utilizado em dietas com elevadas concentrações de proteína solúvel, o que contribui para o melhor aproveitamento da amônia produzida, reduzindo os seus efeitos tóxicos no rúmen. Isto por que quando a velocidade de síntese da amônia pelos microrganismos excede a sua utilização, há uma elevação nas concentrações de amônia, no rúmen com consequente aumento da excreção de ureia, resultando em perda de proteína (Morrison e Mackie, 1996).

O valor nutricional da polpa cítrica peletizada pode se modificar dependendo da variedade, proporção de casca, sementes ou bagaço das frutas utilizadas e o tipo de processamento. Este alimento apresenta em torno de 85 a 90% do valor energético do milho (NRC, 2001, Tabela 1). Além disso, esse ingrediente possui baixo teor de amido, porém um alto teor de carboidratos solúveis (cerca de 25% da MS) e pectina (Mertens, 1992).

Em um estudo realizado por Prado et al. (2000) para avaliar os níveis de substituição do milho pela polpa cítrica sobre o desempenho e características de carcaça de bovinos mestiços confinados. Observaram que a substituição de diferentes níveis de milho (40, 60, 80 e 100%) pela polpa cítrica peletizada não alterou em ganho de peso, consumo de matéria seca, proteína bruta e fibra em detergente neutro, conversão alimentar da matéria seca e proteína bruta, rendimento de carcaça, gordura de cobertura e área de olho de lombo de bovinos machos inteiros (F1-Nelore x Angus).T

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abela 1. Composição química média da polpa cítrica peletizada comparada com o milho.

Fonte: Mertens (1992).

CASCA DE SOJAA casca de soja é um subproduto obtido da industrialização do grão de

soja (Glycine max). O processamento do grão de soja inicia-se com a obtenção da soja crua e termina com a extração do óleo e outros subprodutos como lecitina e farelo de soja (Restle, 2004). De acordo com Rhee (2000), depois de classificado e limpo, o grão de soja é seco até alcançar cerca de 10% de umidade, fase na qual é submetido a quebra e solta a casca, que corresponde a cerca de 7 a 8% de seu peso. Em razão das suas características nutricionais, a casca de soja pode ser incorporada as dietas tanto como substituto de alimentos concentrados como volumosos. Geralmente, a casca de soja é submetida posteriormente ao processo de moagem, ou peletização, visando reduzir o custo de transporte (Restle, 2004).

Assim como a polpa cítrica peletizada, a casca de soja também apresenta características de um alimento intermediário entre volumoso e concentrado. O seu valor nutricional é determinado inicialmente pela natureza química da casca e por outros fatores como métodos de processamento do grão (Ipharraguerre & Clark, 2003). Ela pode ser classificada como um suplemento energético, tendo em vista que a mesma atinge cerca de 80% do valor energético do milho (Tabela 2).

Tabela 2. Composição química da casca de soja

Fonte: Adaptado de Ipharraguerre & Clark (2003)

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A casca de soja apresenta teores de proteína bruta em torno de 12% e, assim como o farelo de soja, é uma fonte rica de lisina 0,71 a 0,72% da matéria seca (Cunningham et al.,1993). Com relação á sua fração fibrosa, este subproduto possui elevados teores de FDN e FDA, isto se deve principalmente aos baixos valores de lignina e elevados valores de pectina, sendo rápida e extensamente degradada no rúmen (Nakamura & Owen, 1989).

Segundo Ezequiel et al. (2006) a substituição do milho moído por até 70% casca de soja, não altera o consumo de matéria seca, o ganho de peso, a conversão e eficiência alimentar e o rendimento de carcaça de Novilhos Nelore em confinamento. De acordo com Santos et al. (2007) resultados positivos terão mais chances de ocorrer caso a casca de soja substitua não o milho, mas parte do milho e da fonte de forragem da ração para bovinos de corte em confinamento, desde que seja atendido um mínimo de efetividade da FDN.

FARELO DE GLÚTEN DE MILHOO Farelo de Glúten de Milho constitui subproduto do processamento

industrial do milho, obtido pela separação e secagem das fibras dos grãos durante o processo de moagem do cereal úmido. Tecnicamente, é o que sobra do grão de milho após a extração da maior parte do amido, glúten e gérmen, pelos processos de moagem e separação empregados na produção de amido purificado e xarope de milho, sendo 2/3 de conteúdo fibroso e 1/3 de licor concentrado de maceração (Blasi et al., 2001).

No Brasil o farelo de glúten de milho é comercializado principalmente na forma seca, contendo cerca de 20% de proteína bruta com base na matéria seca, apresenta-se na forma farelada, contendo em média 90% de matéria seca. Seu alto teor de proteína, superior a maioria dos suplementos proteicos de origem vegetal, com alta digestibilidade e alto teor de proteína não degradada no rúmen (55%), torna esse produto interessante na composição de dietas de diversas categorias de bovino de corte. Sua proteína é considerada de boa qualidade, com alto teor de metionina, aminoácido limitante em diversos tipos de dietas (Fernandes, 2000). A FDN do farelo de glúten de milho é caracterizada pela rápida degradação (Firkins et al., 1992). Devido principalmente, á sua característica pobre em gordura e rica em amido, e bastante rico em fibra altamente digestível, o farelo de glúten de milho constitui alternativa para inclusão em rações balanceadas em grãos e silagem de milho (Fellner & Belyea, 1991).

PROCESSAMENTO DE FONTES DE CARBOIDRATOS NÃO-FIBROSOS

Uma vez que os ruminantes são capazes de mastigar e ruminar assumiu-se, no passado, que não era necessário o processamento (mecânico,

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térmico ou por cozimento) dos alimentos por eles consumidos. Com o avanço do melhoramento genético e de pesquisas na área de nutrição, tornou-se fundamental o aumento do nível energético da dieta com o incremento da proporção de grãos na dieta e sua digestibilidade por meio do processamento para alcançar o potencial de ganho de animais de alto desempenho. Assim sendo, a formulação de dietas deve levar em conta não somente a quantidade de grãos, mas também a fonte, método de processamento, concentração de fibra e tamanho de partículas da dieta, além do uso de aditivos.

Existem diversos grãos de cereais disponíveis para alimentação de ruminantes, que podem variar em tamanho, textura, formato, maturidade, umidade e digestibilidade justificando, portanto o processamento desses alimentos por permitir melhorar significativamente a forma física e o valor nutritivo de grãos de cereais para gado de corte. Os processamentos físicos mais comuns são laminação e moagem do grão com ou sem adição de umidade e promovem a ruptura do pericarpo e expõem os grânulos de amido a fim de melhorar a digestão (Beauchemin et al., 1994). A natureza da matriz proteica que envolve os grânulos de amido também tem impacto na taxa e extensão da digestão do amido (McAllister & Cheng, 1966). O milho amarelo dentado, tipicamente usado na alimentação de ruminantes nos Estados Unidos, surgiu a partir do cruzamento de genótipos do milho flint com farináceo. O milho flint contém altas concentrações de endosperma vítreo e é mais lentamente digerido no rúmen do que o milho que possui maiores concentrações de endosperma farináceo (Philippeau & Michalet-Doreau, 1997).

As bactérias ruminais colonizam preferencialmente os grânulos de amido que são embebidos na matriz proteica vítrea. Ao decorrer da digestão, elas hidrolisam os grânulos de amido em direção ao interior das células do endosperma deixando, porém, a matriz proteica intacta. Com a prolongada exposição às bactérias ruminais, todos os grânulos de amido são digeridos e apenas a matriz proteica que envolve as células do endosperma permanece (McAllister et al., 2006). Boa parte da diferença na digestão entre grãos lentamente fermentáveis (milho e sorgo) e os mais rapidamente fermentáveis (cevada e trigo), pode ser atribuída a diferenças na propriedade da matriz proteica entre esses grãos (McAllister et al, 1990).

O processamento tanto pela moagem, laminação, peletização ou floculação rompe barreiras à digestão tais como a casca, pericarpo e matriz proteica e permite o acesso microbiano ao amido abrigado no interior das células do endosperma. Além disso, a habilidade da microbiota ruminal em digerir o grão depende, dentre outros fatores, do tamanho da partícula (Galyean, et al., 1981; Beauchemin et al., 1994), portanto partículas processadas mais finas são digeridas mais rapidamente do que partículas grosseiras, devido a maior área de contato para colonização. Em poucos casos, o processamento do

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grão inteiro não é benéfico, mas é exceção e não regra.Em estudos com processamento, notou-se que a digestibilidade do

milho inteiro aumentou em cerca de 25% quando moído (Clark et al., 1975) ou quebrado (Moe et al., 1973). Grande parte da diferença na digestibilidade do milho quebrado ou moído é causada pelo aumento de 7 a 10% da digestão do amido, mas parte desse aumento é prejudicada pela redução na digestibilidade da fibra da dieta. Estudos apontam que a floculação aumenta cerca de 10 a 20% da digestibilidade do amido, mas a digestibilidade da fibra decresce na mesma proporção (Plascencia & Zinn, 1996). Entretanto, o sítio de digestão do amido é mais afetado pela moagem do que pela digestibilidade do amido no trato total. Com base em ensaios in situ, aproximadamente 44% do amido do milho quebrado grosseiramente é digerido no rúmen, comparado com 60 – 65% do milho finamente moído (Cerneau & Michalet-Doreau, 1991; Lykos et al., 1997). A Tabela 3 apresenta o efeito de diferentes processamentos sobre a digestibilidade de alguns nutrientes presentes no milho.

Tabela 3. Efeito do processamento do milho sobre a digestibilidade.

1966. Colorado. (Adaptado de Johnson).

Dietas modernas de terminação contém entre 2,7 a 3,45 Mcal de energia metabolizável (EM)/kg de MS (Krehbiel et al., 2006), sendo o milho e sorgo as principais fontes de energia utilizadas no Brasil (Millen et al., 2009). O aumento da proporção de alimentos concentrados na dieta, com consequente aumento do teor de EM, resulta em maior CMS e maior eficiência alimentar (EA), até certo ponto, a partir do qual o CMS é reduzido mantendo-se o mesmo consumo de energia (Owens et al., 1995; Krehbiel et al., 2006). A relação entre aumento da energia da dieta e EA também não é linear, mostrando que com o aumento da EM da dieta, a EA aumenta de forma quadrática (Krehbiel et al., 2006).

Em estudo com dietas contendo 50% de milho e 20% de semente de algodão inteira, Zinn (1987) concluiu que o milho floculado continha 13,4 e 14,2% mais ELm e ELg, respectivamente, do que o milho laminado a seco. Em outro estudo realizado por Owens et al. (1997) com diferentes formas de processamento do milho, foi avaliada a energia metabolizável (EM) do milho laminado a seco, do milho com alta umidade e do milho floculado.

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Concluiu-se que o milho floculado (processamento com umidade, temperatura e laminação) possui maior EM kg-1 do que o milho com alta umidade, e este maior que laminado a seco, sendo 3,70; 3,44 e 3,22 Mcal kg-1, respectivamente, para cada tipo de processamento. Esses resultados mostram o benefício do nível de processamento no incremento energético do grão, que se espera consequentemente melhoria no desempenho dos animais com eles alimentados.

Dentre os trabalhos desenvolvidos com diferentes formas de processamento, Theurer et al. (1999) avaliaram o efeito da densidade do grão sobre o metabolismo ruminal. Nesse estudo concluiu-se que diminuindo a densidade do floco de 437 para 283g L-1 a proporção de amido digerido no rúmen e no trato total é aumentada. Hales et al. (2009) trabalhou com machos não castrados em terminação alimentados com milho floculado em duas densidades com alfafa como volumoso e observou um aumento na eficiência alimentar de cerca de 4% quando diminuiu a densidade do floco de 386 para 335g L-1.

Em um estudo realizado no Laboratório de Pesquisas em Gado de Corte na FMVZ-USP Pirassununga (Ferrari et al., 20141) foram testadas dietas contendo diferentes fontes energéticas, como milho floculado e polpa cítrica peletizada, em substituição parcial ao milho moído fino no concentrado, e dois níveis de concentrado na dieta (60 e 80%) sobre o desempenho dos animais Nelore em terminação. Os resultados estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4. Ganho de peso e rendimento de carcaça de animais alimentados com diferentes fontes energéticas1.

GMD=ganho médio diário; RC%=rendimento de carcaça; MM=milho moído; MF=milho floculado; PC=polpa cítrica; CHO=efeito de carboidrato; D*C=efeito da interação dieta vs. Carboidrato; EA=eficiência alimentar; CA=conversão alimentar; EPM=erro padrão da média.

Não houve efeito de nível de concentrado na dieta sobre o consumo de matéria seca (CMS) dos animais (P > 0,05), mas houve efeito de fonte de carboidrato. O CMS dos animais alimentados com milho moído fino foi superior ao dos alimentados com milho floculado e este maior que o CMS dos que receberam polpa cítrica na dieta, sendo as médias de 9,73; 9,24 e 8,44 kg.d-1, respectivamente. De forma semelhante, Owens et al. (1997) obervaram menor CMS quando os animais receberam dieta com o milho

1 Tese de doutorado, dados não publicados.

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floculado (8,34 kg.d-1) quando comparado ao fornecimento de milho laminado a seco (9,43 kg.d-1). Ainda nesse trabalho, a floculação e laminação do milho melhorou o ganho de peso dos animais em relação à dieta com milho com alta umidade. Os autores atribuem esses resultados ao aumento de energia metabolizável presente no milho após a floculação, diminuindo o consumo e mantendo alto ganho de peso. Não houve efeito da interação nível de concentrado na dieta vs. tipo de carboidrato (D*C). O mesmo ocorreu para CMS na porcentagem do peso vivo do animal (CMS, %PV), havendo apenas efeito de carboidrato. O milho moído fino promoveu consumo de 2,20% PV, sendo superior ao dos que receberam milho floculado com 2,1 e este maior que o CMS %PV dos alimentado com polpa cítrica. Os níveis de concentrado na dieta tiveram efeito significativo (P < 0,05) sobre a eficiência alimentar (EA) bem como na conversão alimentar (CA). Esses parâmetros foram melhorados quando se aumentou para 80% o nível de concentrado comparado com as dietas com 60%. As médias de EA e CA foram de 0,142 e 7,71 vs. 0,159 e 6,74 para dietas com 60 e 80% de concentrado, respectivamente. Isso sugere que os animais que receberam mais concentrado foram mais eficientes no aproveitamento da dieta e, consequentemente, consumiram menos alimento para cada unidade de peso ganho. Houve efeito significativo do nível de concentrado e tipo de carboidrato na dieta sobre o ganho médio diário (GMD) e rendimento de carcaça (RC%) dos animais (P < 0,05). As dietas que continham 80% de concentrado promoveram GMD de 1,47 vs 1,29 kg.d-1 dos animais que receberam 60% de concentrado, representando um aumento de cerca de 14% quando aumentou-se o nível de concentrado para 80%. Houve diferença estatística no GMD entre os animais que receberam as diferentes fontes energéticas. O GMD dos animais alimentados com milho floculado (1,4 kg.d-1) não diferiram dos que consumiram milho moído fino (1,48 kg.d-1) ou polpa cítrica (1,26 kg.d-1), porém o tratamento com milho foi superior ao tratamento com polpa. Em relação ao RC, a dieta com 80% de concentrado promoveu maior RC (53,14%) em relação à dieta com 60% que apresentou 52,52% para o mesmo parâmetro. O RC dos animais alimentados com o milho floculado e o moído fino não diferiram entre si (53,55 e 52,92%, respectivamente), mas foi superior comparado ao RC dos animais que receberam a polpa cítrica (52,01%). Não houve efeito para interação nível de concentrado e carboidratos.

Dietas com excesso de fermentação ruminal ou com baixos teores de fibra efetiva, podem levar a distúrbios metabólicos prejudiciais, tais como acidose ruminal, ruminites, abscessos hepáticos e broncopneumonias (Krause & Oetzel, 2006). Algumas teorias foram postuladas para explicar o mecanismo pelo qual o excesso de fermentação e acidose subclínica leva à queda no consumo de MS. Pesquisas recentes com gado de corte (Faleiro et al.,

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2011) indicam que a queda do pH per se não é responsável pela queda no CMS. Uma segunda teoria é que o acúmulo de AGCC e glicose promoveria aumento da osmolaridade ruminal, que por sua vez seria responsável direta pela queda no consumo (Owens et al., 1998). A alta osmolaridade, tanto ruminal quanto sanguínea, têm sido relacionadas com controle do consumo em ruminantes (Carter & Grovum, 1990; Langhans et al., 1995), no entanto esta hipótese é de difícil comprovação em experimentos in vivo. Uma terceira hipótese, mais aceita atualmente, é que os produtos da fermentação ruminal, mais precisamente o propionato, são oxidados ou metabolizados à glicose no fígado. Eventualmente, a saturação na taxa de gliconeogênese e excesso de oxidação, com consequente acúmulo de ATP, levaria a um sinal de feedback negativo ao cérebro ativando o centro da saciedade no hipotálamo (Britton & Stock, 1989; Allen et al., 2005). Nesse mesmo experimento realizado no LPGC-USP (Ferrari et al., 20142) também foi feita a medição do pH ruminal dos animais nos tempos 0 (antes da alimentação), 1, 3, 6, 9 e 12 horas após a alimentação (Tabela 5).

Tabela 5. Efeito da fonte de carboidrato sobre o pH ruminal.

MM, milho moído; MF, milho floculado; PC, polpa cítrica; CHO, efeito de carboidrato; CHO*Tempo, efeito da interação carboidrato vs. tempo.

Em ambos os níveis de inclusão de concentrado houve efeito de tempo após alimentação e do tipo de carboidrato na dieta sobre o pH ruminal dos animais (P < 0,05). Na dieta com 80% de concentrado, o fornecimento de polpa cítrica na dieta manteve o pH ruminal mais elevado (6,62) quando comparado ao milho (6,25). A dieta com milho floculado, entretanto, não resultou em diferença estatística em comparação às outras duas dietas (6,41). Para as dietas com 60% de concentrado, a dieta com polpa manteve o pH mais elevado (6,74) que as demais (6,32 e 6,45 para milho floculado e moído, respectivamente). Houve efeito da interação Tempo vs. Carboidrato sobre o pH para as dietas com 60% de concentrado. A Figura 2 demonstra essa interação ao longo do tempo.

2 Tese de doutorado. Dados não publicados.

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Figura 2. Valores de pH ruminal dos animais alimentados com dieta 60% contendo milho floculado (F) ou polpa cítrica (P) em substituição parcial ao milho moído fino (M).

Em experimento de substituição do milho moído fino por polpa cítrica em dietas de tourinhos em terminação recebendo 30% de silagem de cana-de-açúcar e 70% de concentrado, Pereira et al. (2007) observaram queda no consumo de MS e no ganho de peso quando os animais receberam dietas com 75 e 100% de substituição de polpa cítrica por milho no concentrado, em relação à dieta com 50% de substituição. Os autores esperavam efeito positivo da polpa cítrica sobre o consumo de MS, devido ao menor teor de amido e, portanto, melhor manutenção do pH ruminal. Estes resultados sugerem que 30% de silagem de cana-de-açúcar na dieta foi suficiente para manutenção da estabilidade do pH ruminal, mesmo na dieta sem polpa cítrica (55,9% de milho).

FONTES DE CARBOIDRATOS E METABOLISMO RUMINALO desempenho animal está diretamente relacionado ao consumo

de nutrientes, que por sua vez, depende da natureza física e química dos alimentos e da digestibilidade da dieta (Waldo, 1973; Ferrell, 1993). Nesse aspecto, se faz importante a caracterização da digestibilidade dos ingredientes direcionando a formulação das dietas para melhor aproveitamento do alimento e consequentemente aumento no desempenho dos animais. No entanto, além das características intrínsecas do alimento como teor de matéria seca, fibra em detergente neutro e lignina outros fatores interferem na fermentação do alimento, especialmente o ambiente ruminal que pode variar em função do pH e principalmente da concentração e tipo de microrganismos.

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Nesse contexto, Cônsolo et al. (2014)3 avaliaram o efeito de fontes energéticas, no ambiente ruminal sobre a digestibilidade in-vitro da matéria seca (DIVMS) e fibra em detergente neutro (DIVFDN) de diferentes fontes de volumosos e concentrados, incubadas em 30 e 48 horas no meio de cultura. Os autores utilizaram 3 novilhos Nelore, do rebanho do Laboratório de Pesquisa em Gado de Corte (LPGC), castrados e canulados no rúmen. O delineamento experimental foi em quadrado latino 3x3, sendo os três tratamentos as correspondentes fonte energética da dieta: milho moído, milho floculado e polpa cítrica; e três períodos de coleta. Os animais foram alimentados por 13 dias com as dietas correspondestes, sendo que no 14o dia foi coletado líquido ruminal para avaliação DIVMS e DIVFDN de diferentes alimentos comumente utilizados para alimentação de bovinos, tais como: silagem de cana, silagem de milho e feno como alimentos volumosos; farelo de soja, milho moído, milho floculado e polpa cítrica como alimentos concentrados. As amostras de liquido ruminal foram levadas ao Laboratório de Lignina e a análise de digestibilidade in vitro (DIV) foi realizada de acordo com Tilley e Terry (1963).

Os autores não encontraram diferença na digestibilidade dos alimentos volumosos e concentrados em função do tipo de carboidrato presente no líquido ruminal durante 30 horas de incubação. No entanto, quando se avalia 48 horas de incubação, nota-se efeito da fonte de carboidrato no líquido ruminal para DIVMS (P = 0,026) e DIVFDN (P = 0,018) dos alimentos volumosos, sendo que o liquido ruminal provindo de animais alimentados com milho floculado conferiu um menor valor de DIVMS e DIVFDN, diferindo dos demais (Tabela 6). Esse fato se deve ao processamento do milho floculado, afinal como foi dito acima, o amido presente no grão se torna mais rapidamente fermentável em relação ao milho inteiro ou quebrado. Incrementos desse carboidrato dentro do rúmen podem ocasionar queda no pH ruminal com consequente redução da digestibilidade de volumosos (Owens e Goetsch, 1993; Van Soest, 1994).

Tabela 6. Efeito dos tratamentos na DIVMS e DIVFDN dos alimentos volumosos por 30 e 48 horas de incubação.

Tratamentos: Líquido ruminal proveniente de animais alimentados com milho moído (MM), milho floculado (MF) e polpa cítrica (PC). 2Trat: efeito de tratamento; Ali: efeito do alimento e Ali*Trat: interação alimento e tratamento.

3 Dados não publicados

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Como ilustrado na Figura 2, o menor valor de pH ruminal foi encontrado para animais alimentados com milho floculado. Nota-se que os animais alimentados com MF tiveram queda mais abrupta de pH em relação aos demais, fato que pode ter interferido na atividade fibrolítica das bactérias ruminais (Owens e Goetsch, 1993; Van Soest, 1994).

As curvas da degradação das fontes de carboidratos não fibrosos utilizados, bem como do farelo de soja, seguindo a metodologia sugerida por Tilley e Terry (1963), são apresentadas na Figura 3.

Figura 3. Curvas da degradação de alimentos concentrados. Fonte: Cônsolo et al. (2014)4

Os resultados obtidos foram utilizados para calcular as degradabilidades potenciais segundo o modelo proposto por Ørskov e McDonald (1979). Foi observado que o milho moído apresentou uma taxa de degradação entre 2,6 – 3,2 % h-1, sendo em média de 2,9 % h-1, enquanto a taxa de degradação do milho floculado foi de 4,4-5,6 % h-1, sendo em média de 5,0 % h-1. Os resultados apresentados de pH do líquido ruminal e a taxa de degradação ruminal dos carboidratos evidenciam que a fonte de carboidrato da dieta interfere na digestibilidade de alimentos volumosos, e isso deve ser levado em consideração a fim de maximizar o desempenho animal.

FONTES DE CARBOIDRATOS E COMPOSIÇÃO DA MICROBIOTA RUMINAL

Qualquer estratégia de manipulação da fermentação ruminal deve levar em consideração aspectos relacionados à microbiota presente no rúmen, 4 Dados não publicados

128

assim como as características desta câmara fermentativa. Para uma efetiva manipulação da microflora ruminal, com o intuito de melhorias na produção animal, a compreensão da população de microrganismos ruminais é fundamental para o fornecimento de condições necessárias ao melhor aproveitamento do processo de digestão (McSweeney et al., 1994). Tais microrganismos são altamente sensíveis a alterações na dieta, em que quantidades de espécies bacterianas individuais podem alterar em resposta à alimentação (Li et al., 2009; Hernandez-Sanabria et al., 2012), alterando o modo de aproveitamento do alimento ofertado.

Dentre estes microrganismos, as bactérias representam o grupo microbiano mais importante e diversificado no ambiente ruminal, e desempenham um papel importante na degradação biológica de carboidratos. Tais microrganismos são classificados de acordo com sua principal atividade metabólica no ambiente ruminal. Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus albus, Butyrivibrio fibrisolvens e Ruminococcus flavefaciens são reconhecidas como as principais bactérias celulolíticas encontradas no rúmen (Forster et al., 1997; Shinkai & Kobayashi, 2007; Wanapat & Cherdthong, 2009). Além das fibrolíticas, têm-se as bactérias amilolíticas (por exemplo, Selenomonas ruminantium, Streptococcus bovis), proteolíticas (Prevotella spp.), lipolíticas (Anaerovibrio lipolytica), produtoras de lactato (por exemplo, S. bovis e S. ruminantium), e consumidoras de lactato (Megasphaera elsdenii) (Belanche, et al., 2012).

A quantidade e a composição da dieta são variáveis externas que afetam a taxa de digestão, a taxa de passagem e, consequentemente, o turnover do conteúdo ruminal. Nesse contexto, dietas com altos teores de proteína favorecem microrganismos proteolíticos, enquanto que em dietas com alta inclusão de amido, e baixa fibra, estão associadas a uma grande população de bactérias amilolíticas (Van Soest, 1994). Com o aumento da concentração de carboidratos fermentáveis no rúmen, o crescimento microbiano é estimulado, resultando no aumento da taxa de fermentação ruminal. Por outro lado, o aumento da digestibilidade dos carboidratos resulta na queda do pH ruminal muitas vezes para valores abaixo de 6,0, devido a maior produção de AGCC. Nesta situação, ocorre a redução da atividade das bactérias fibrolíticas, prejudicando desta forma a digestibilidade da fibra e, simultaneamente, ocorre estímulo à atividade das bactérias amilolíticas e utilizadoras de lactato no rúmen (Tajima et al., 2001; Nagaraja & Titgemeyer, 2007). Além da inibição direta, na situação de pH abaixo de 6,0, a fixação por parte dos microrganismos ao substrato é reduzida, justificada pela falta de compostos que aumentam esta fixação, como o bicarbonato, ou pela presença de inibidores de fixação, como o amido solúvel, resultando na inibição da digestão da celulose (Owens & Goetsch, 1993).

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Em dietas com alto nível de inclusão de concentrado, bactérias consumidoras de lactato que são sensíveis à ácido, tais como Selenomonas e Veillonella, são substituídas pelas tolerantes à ácido, tais como Anaerovibrio e Megasphaera. As bactérias amilolíticas pertencentes ao gênero Prevotella são substituídas pelas produtoras de lactato, tais como as dos gêneros Lactobacillus, Eubacterium e Streptococcus. A acidose lática, que surge nessas condições, parece ser resultado da incapacidade de aumento das bactérias que utilizam este substrato, ocorrendo o seu acúmulo no rúmen e, consequentemente, a redução no pH ruminal (Owens & Goetsch, 1993). As bactérias celulolíticas, assim como as metanogênicas, são menos tolerantes à queda brusca de pH ruminal.

Tajima et al. (2001) relataram que a prevalência da F. succinogenes em animais recebendo feno caiu 20 vezes no terceiro dia da mudança para uma dieta de alto concentrado, seguida por uma nova diminuição, com 28 dias, apresentando uma redução de 57 vezes no tamanho da população. Já a concentração de DNA para a bactéria R. flavefaciens no dia 3 reduziu em aproximadamente 10% do seu valor inicial para os animais recebendo feno, e permaneceu nesse nível no dia 28. Fernando et al. (2010) avaliaram a dinâmica populacional de bactérias ruminais durante a adaptação à uma dieta de alto grão. Para tanto, utilizaram novilhos de corte canulados, que foram adaptados à dieta de alto grão pelo método de adaptação em escadas (Step-Up), em diferentes proporções de volumoso:concentrado (80:20, 60:40, 40:60, e 20:80). Os autores observaram a prevalência das bactérias Ruminococcus albus e F. succinogenes reduziu gradativamente em animais adaptados à dieta de alto concentrado, e seu número foi até 40 vezes menor que em animais recebendo feno. Esta redução da população de bactérias celulolíticas em resposta ao aumento do nível de inclusão de concentrado na dieta é consistente com dados reportados em estudos anteriores (Singh et al., 2014; Tajima et al., 2001).

O tipo de carboidrato consumido pelo ruminante altera a composição da população microbiana ruminal e, consequentemente, modifica o padrão de fermentação ruminal. A substituição de produtos com alto teor de amido (milho) por alimentos com alto teor de pectina (polpa cítrica), contribui para redução na queda do pH ruminal devido à fermentação acética em substituição à fermentação láctica e pela capacidade de tamponamento ruminal da pectina. Em comparação com o amido, a pectina possui menor propensão em causar queda de pH ruminal, pois sua fermentação ruminal favorece a produção de acetato, ao contrário de lactato e propionato como a fermentação amilolítica (Van Soest, 1987; Broderick et al., 2002). Rocha Filho (1998) relata que a inclusão de polpa cítrica aumentou a proporção molar de acetato e diminuiu a proporção molar de propionato em relação à dieta contendo milho, pelo fato do

130

melhor ambiente ruminal para bactérias celulolíticas. Franzolin et al. (2000), ao avaliar o efeito da substituição do milho por

níveis crescentes de polpa cítrica sobre a degradabilidade e a fauna ruminal em bubalinos, relataram que a substituição do milho em grãos moídos pela polpa cítrica no concentrado promoveu diminuição no número e na concentração total de protozoários (Entodinium). Além disso, a inclusão de polpa cítrica proporcionou melhora na degradabilidade efetiva da FDA e, também, no fornecimento de energia para o crescimento microbiano celulolítico.

Highfill et al. (1987) relataram aumento na produção de proteína bruta microbiana em bovinos recebendo a dieta suplementada com 85% de polpa cítrica mais 12,5% de farelo de soja quando comparado à dieta com 95% de milho mais 5% de farelo de soja, indicando que suplementos energéticos ricos em fibras são menos susceptíveis às interações alimentares negativas, possivelmente devido à redução dos efeitos inibitórios de bactérias amilolíticas, evitando alteração da potencialidade na microflora ruminal.

Hall e Herejk (2001), ao mensurarem a produção da proteína microbiana, in vitro, utilizando diferentes substratos fermentativos (pectina, amido, sacarose ou fibra), observaram que o crescimento microbiano nos estágios iniciais da incubação foi mais rápido com pectina do que com amido. Concomitantemente, o crescimento microbiano com sacarose foi o mais rápido entre todos os substratos testados, e com fibra foi o mais lento.

Abughazaleh et al. (2010) avaliaram a substituição de milho por glicerol em experimento in vitro, e descrevem que as concentrações de DNA para a bactéria Butyrovibrio fibrosolvens e Selenomonas ruminantium foram reduzidas nas dietas com 30 e 45% de substituição. A redução de DNA S. ruminantium em níveis elevados de substituição com glicerol pode ser explicado pela redução de disponibilidade de amido e de açúcares, resultado desta substituição. A concentração de DNA para R. albus e Succinovibrio dextrinosolvens não foi afetada pela substituição do milho pelo glicerol. Com relação à redução na concentração de DNA para R. albus, é possível que o glicerol tenha reduzido a atividade enzimática desta bactéria para a degradação de fibra (Martin, 2002). Os autores descrevem que a concentração de acetato foi reduzida a partir de 30% de substituição, sendo que o propionato aumentou apenas na dieta com 45% de substituição.

Em estudo realizado por Roger et al. (1992), onde se avaliou o efeito do glicerol no crescimento, capacidade de adesão e atividade de duas bactérias celulolíticas (R. flavefaciens e F. succinogenes) e de uma espécie de fungo anaeróbio (Neocallimastix frontalis), o glicerol em concentração acima de 5% contribui para inibição do crescimento e da atividade celulolítica, sem efeitos sobre a adesão. Já em baixas concentrações (0,1 a 1%), não foi observado nenhum efeito sobre estas características descritas. Além disso, na

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concentração de 5%, o glicerol inibiu completamente a atividade celulolítica do fungo N. frontalis, sendo que sua capacidade de crescimento também foi inibida. Paggi et al. (2004) relataram, de maneira semelhante, que o glicerol pode alterar a atividade in vitro da microbiota ruminal, reduzindo a atividade celulolítica em fluído ruminal, quando a concentração de glicerol nas culturas aumentou de 50 a 300 mM.

Em estudo realizado por Golder et al. (2014), cujo objetivo foi avaliar o efeito da combinação de grãos, frutose e histidina em novilhas de leite não-adaptadas para este desafio, sobre a composição da microbiota ruminal, foi observado que a S. bovis se tornou mais prevalente em novilhas alimentadas com frutose, indicando que esta bactéria responde rapidamente à alterações na dieta, pelo fato da exposição brusca à fontes de carboidratos prontamente fermentescíveis, atuando nas alterações iniciais da microbiota ruminal em bovinos que não foram adaptados à este desafio. Os autores citam que a frutose é mais rapidamente metabolizada quando comparado ao amido. Além destes dados, a abundância relativa das famílias Streptococcaceae e Veillonellaceae aumentou nas novilhas que receberam frutose. O autor ainda cita que os bovinos apresentam comunidades bacterianas distintas, que podem influenciar sua capacidade de lidar com as mudanças no tipo e quantidade de substrato.

CONSIDERAÇÕES FINAISOs aspectos levantados nesta revisão podem auxiliar a formulação

de dietas mais eficientes para animais em terminação, difundindo o uso da silagem de cana-de-açúcar aliada à suplementação eficiente de carboidratos não fibrosos.

Ainda, a elucidação dos mecanismos pelos quais o excesso de fermentação ruminal de carboidratos não fibrosos leva a queda da digestibilidade da fibra e a acidose ruminal, bem como das principais populações afetadas, auxiliará no desenvolvimento de técnicas para manutenção da função ruminal, como uso de probióticos, processamento do amido, ionóforos e vacina contra microorganismos ruminais indesejados.

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CAPÍTULO 8

ADITIVOS NUTRICIONAIS EMPREGADOS NO CONTROLE E NA MELHORA DA SAÚDE ORAL DE CÃES E GATOS

Patricia M. Oba1, João Paulo F. Santos1, Laura F. Matheus1, Mariane C. Ernandes1, Fabio A. Teixeira1, Eduardo Z. Braghirolli1, Livia R. Folconi1,

Dóris P. Halfen1, Marcio A. Brunetto1

1 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – FMVZ/USP, Pirassununga/São Paulo - SP - Contato: e-mail: [email protected]

RESUMO A doença periodontal é o problema de saúde oral mais comum

nos gatos adultos, cuja prevalência está estimada em até 85% dos animais. Esta afecção pode levar ao comprometimento sistêmico, redução da expectativa de vida e queda da imunidade. A placa bacteriana é uma entidade estrutural específica, mas altamente variável que resulta da colonização e do crescimento de microrganismos sobre a superfície dos dentes e tecidos moles. Trata-se de uma comunidade de microrganismos organizados num biofilme dentário, embebidos numa matriz orgânica constituída por película aderida de células descamadas, leucócitos, bactérias, glicoproteinas da saliva, substrato alimentar e minerais como cálcio, fósforo e magnésio. A microbiota bucal é diversa e está constituída, predominantemente, por bactérias anaeróbias Gram negativas, que possuem a capacidade de colonizar, invadir, produzir compostos tóxicos e gerar resposta imunológica contra os tecidos do hospedeiro. A introdução de vários alimentos comercias no mercado com o intuito de melhorar a saúde bucal ocorreu ao longo dos últimos anos. O emprego da ação mecânica de raspagem para limpar os dentes compõe a estratégia padrão nesses alimentos, efeito obtido por modificações na textura e no tamanho dos kibbles. Mais recentemente, estudos com o uso dos ômegas-3, polifenóis, polifosfatos e imunoglobulinas estão sendo realizados com o propósito de auxiliar no controle e tratamento da doença periodontal.

Palavras-chave: doença periodontal, cálculo dentário, dieta, canino, felino.

INTRODUÇÃOA doença periodontal e inflamação da gengiva são distúrbios comuns

em cães e gatos (Reichart et al., 1984), com prevalência de até 85% dos animais (Watson, 2006). A gengivite é causada pela formação e persistência da placa na superfície do dente. Sem tratamento, pode evoluir para a doença periodontal, a

mailto:[email protected]

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qual afeta gengiva, ligamento periodontal, cemento e osso alveolar. A doença periodontal esta associada à dor, halitose, ulceração, perda de osso alveolar e dentes. Sendo progressiva com a idade, promove alterações sistêmicas e afeta preferencialmente animais alimentados com dietas úmida (Gawor et al., 2006).

Outros fatores contribuem para o desenvolvimento desta afecção, destaca-se o apinhamento dentário, que ocorre muitas vezes devido a alterações da maxila/mandíbula, como o prognatismo e o braquignatismo, ou a persistência de dentes decíduos, o que aumenta as áreas de retenção de placa bacteriana e predispõe à alterações periodontais (Penman & Harvey, 1992; Klein, 2000; Gioso, 2007). Além disso, outras afecções orais, tais como as neoplasias ou a hiperplasia gengival provocam alterações locais no ambiente do dente e da gengiva, como a formação de pseudobolsas e de massas, situações que culminam em aumento do acúmulo de placa e dificultam a limpeza, predispondo também à doença periodontal (Klein, 2000). Em felinos é importante destacar que as lesões reabsortivas acometem 60,8% dos gatos (Lommer & Verstrate, 2000). Nesta doença, os odontoclastos funcionam de forma anômala reabsorvendo os dentes sem necessidade, cuja disfunção resulta em perda óssea e dor.

MICROBIOTA ORAL E DOENÇA PERIODONTALA placa bacteriana é uma entidade estrutural específica, mas altamente

variável que resulta da colonização e do crescimento de microrganismos sobre a superfície dos dentes e tecidos moles. Trata-se de uma comunidade de microrganismos organizados num biofilme dentário, embebidos numa matriz orgânica constituída por película aderida de células descamadas, leucócitos, bactérias, glicoproteinas da saliva, substrato alimentar e minerais como cálcio, fósforo e magnésio. A microbiota bucal é diversa e está constituída, predominantemente, por bactérias anaeróbias Gram negativas, que possuem a capacidade de colonizar, invadir, produzir produtos tóxicos e gerar resposta imunológica com consequente agressão aos tecidos do hospedeiro (Feng & Weinberg, 2006).

A formação da placa bacteriana é um processo complexo, que envolve a interação entre diversos gêneros e espécies de bactérias. Em estudo que objetivou caracterizar a microbiota oral na doença periodontal de seres humanos, Socransky et al. (1998) revelaram a presença de grupos bacterianos intimamente relacionados com a afecção, de forma geral os autores citam cinco grupos relevantes, dentre eles o complexo vermelho (P. gingivalis, T. forsythia e T. denticola), laranja (F. nucleatum, P. intermedia, P. nigrescens, P. micros, C. showae, C. rectus, C. gracillis, E. nodatum e S. constellatus), verde (E. corrodens, C. gingivalis, C. ochracea, C. sputigena, C. concisus e A. actinomycetemcomitans), amarelo (S. sanguis, S. gordonii, S. intermedius,

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S. oralis e S. mitis) e roxo (V. parvula e A. odontolyticus). Os autores observaram que tais complexos interagem entre si, sendo

que o complexo amarelo parece ser um colonizador primário, seguido pelos complexos verde e roxo, que posteriormente criam condições para colonização do complexo laranja e finalmente pelo complexo vermelho, o qual está bastante relacionado a patogênese da periodontite. Os autores salientam ainda que o complexo laranja e vermelho apresentam forte relação, sendo que com o aumento da colonização pelo complexo laranja há maior colonização pelo complexo vermelho.

De acordo com Kolenbrander & London (1993) os colonizadores primários se ligam a película adquirira, formada por glicoproteínas, lipoproteínas, mucina e enzimas na superfície do dente, para posterior colonização pelos colonizadores secundários. No entanto, entre os colonizadores primários e tardios, destaca-se o papel do gênero Fusobacterium, que atua como uma ponte entre os colonizadores, sendo que os primários agregam ente si e com o Fusobacterium e este por sua vez se coagrega com os secundários, conforme apresentado na Figura 1.

Figura 1. Diagrama de aderência bacteriana na superfície dental

Fonte: Kolenbrander & London (1993)

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Os estudos que caracterizam a microbiota oral em animais de companhia saudáveis e acometidos por afecções clínicas são escassos. Dentre as principais bactérias subgengivais associadas à periodontite são citadas a Porphyromonas spp, Prevotella spp, Peptostreptococcus spp e Fusobacterium spp (Harvey & Emily, 1993; Braga et al., 2005; Carvalho & Cabral, 2007). Em um levantamento realizado na cidade de Jaboticabal, no Estado de São Paulo, Domingues et al. (1999) observaram que os principais gêneros bacterianos associados a doença periodontal espontânea em cães foram Prevotella spp., Bacteroides spp., Propionibacterium spp., Gemella ssp., Actinomyces spp., Eubacterium spp. e Porphyromonas spp. No entanto, apesar da complexa relação existente entre as bactérias, atenção especial tem sido dada a Porphyromonas spp., (Hardham et al., 2005), conforme demonstrado por Socransky et al. (1998) que citam que a P. gingivalis apresenta especial importância na profundidade da bolsa, bem como a T. forsythia e T. denticola que também exibiram forte associação com o sangramento a sondagem.

Um estudo avaliou 109 gatos adultos e constatou que a doença periodontal era comum em 81,6% dos animas, sendo agressiva em 12,8%, onde 98,2% dos felinos apresentaram algum tipo de perda óssea periodontal e, apenas 4% dos animais não apresentaram inflamação gengival (Girard et al., 2009). Ainda que existam muitos fatores que influenciem o desenvolvimento da doença periodontal, o agente etiológico primário é a placa bacteriana (Gorrel, 2004). A microbiota oral dos gatos saudáveis é formada por bactérias anaeróbias, principalmente dos gêneros Bacteroides e Fusobacterium (Love et al., 1990). As bactérias do gênero Porphyromonas spp. foram isoladas a partir da placa dental em gatos com periodontite (Harvey & Emilly, 1993; Norris & Love, 1999, 2000). Em estudo realizado recentemente, 97% dos gatos saudáveis eram positivos para Porphyromonas gingivalis. (Booij-Vrieling et al., 2010). Com relação às bactérias presentes em abcessos subcutâneos, 15 gatos foram avaliados e constatou-se que 80% eram positivos para o gênero Porphyromonas, sendo Porphyromonas gingivalis mais frequentemente isolada em comparação com P. salivosa e P. circumdentaria, também sendo encontrada com maior frequência sem a presença das outras espécies e, em quantidade numericamente superior, o que sugere papel mais ativo no desenvolvimento de abcessos subcutâneos (Norris & Love, 1999). Os mesmos pesquisadores avaliaram outros 40 gatos e observaram a presença do gênero Porphyromonas em 95% dos animais e a Porphyromonas gingivalis foi isolada em 92,5% dos casos. Neste estudo foi realizada análise de regressão das unidades formadoras de colônia (UFC) com a doença periodontal e o mesmo demonstrou que a Porphyromonas gingivalis é um indicador importante do grau de doença periodontal (Norris &; Love, 1999). Um estudo avaliou a presença de Porphyromonas spp em 50 cães acometidos pela doença periodontal e

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50 saudáveis, espécies de Porphyromonas foram encontradas em cães com e sem periodontite, respectivamente, em 92 % e 56 % dos cães (Senhorinho et al., 2011). O papel de bactérias específicas, especialmente Porphyromonas gingivalis nas doenças periodontais tem sido extensivamente estudado. Concentrações elevadas destes microrganismos foram observadas em pessoas com doença periodontal agressiva generalizada em comparação a indivíduos com doença periodontal agressiva localizada e doença periodontal crônica (Ramiro, 2010). Porphyromonas giginvalis é uma bacteria anaeróbica, Gram negativa, de ocorrência natural na cavidade oral (Léon et al., 2007). Também pode ser encontrada em outros sistemas como trato gastrintestinal, respiratório e cardiovascular, responsável por vários danos. Ressalta-se que apesar da importância que têm se dando a P. gingivalis na odontologia humana e veterinária, estudos recentes demonstram que em cães a P. gulae, espécie geneticamente semelhante a P. gingivalis merece atenção e mais estudos de sua prevalência e mecanismos de controle (Senhorinho et al., 2011).

CLÍNICA DA DOENÇA PERIODONTALOs mecanismos patogênicos envolvidos na doença periodontal

incluem a influência direta das bactérias da placa e a influência indireta dessas bactérias no processo inflamatório (Gorrel, 2004). A maioria dos animais com idade superior a dois anos apresenta algum grau de doença periodontal. No entanto, muitos proprietários não percebem qualquer alteração a não ser nos estágios avançados da doença. O sinal mais comum detectado pelo proprietário é a halitose, resultante da necrose dos tecidos e da fermentação bacteriana no sulco gengival ou na bolsa periodontal (Penman & Harvey, 1992; Gorrel, 2004).

A identificação clínica da doença periodontal grave se dá através de sinais clínicos como halitose intensa, salivação espessa, sangramento oral, mobilidade dental, cálculo e gengivite, achados que podem proporcionar suporte para que o clínico veterinário decida encaminhar o paciente para o tratamento adequado junto a um médico veterinário especializado (Gioso, 2003). Esta crescente preocupação com a saúde oral é estimulada pelo fato de que as enfermidades orais interferem na saúde do paciente e estão relacionadas à redução da expectativa de vida (Kowalesky, 2005). As alterações da cavidade oral dos cães e gatos têm sido abordadas com o intuito de promover a redução do incômodo que tais doenças ocasionam aos animais e consequentemente a seus proprietários (Telhado et al., 2004).

A odontologia veterinária encontra-se em evolução na medida em que os proprietários procuram cada vez mais manter ou melhorar a saúde oral de seus animais de estimação. Estes cuidados associados à nutrição ótima, entre outros, contribuem para melhorar e prolongar a qualidade de vida (Colmery, 2005).

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DIETA E DOENÇA PERIODONTALA introdução de vários alimentos comercias no mercado com o intuito

de melhorar a saúde bucal ocorreu ao longo dos últimos anos. O emprego da ação mecânica de raspagem para limpar os dentes compõe a estratégia padrão nesses alimentos, efeito obtido por modificações na textura e no tamanho dos kibbles.

O alimento seco é potencialmente benéfico para a saúde oral se a forma e a textura dos kibbles forem especialmente formuladas para cães e gatos de raças e tamanhos específicos, sendo que para uma adequada ação mecânica de raspagem da superfície dentária durante a mastigação, os dentes devem penetrar no kibble antes de quebra-lo, com isso fatores relacionados ao animal são importantes e influenciam a pressão exercida sobre o kibble no momento da apreensão. Neste sentido, mecanismos tem sido estudados para determinar o limiar de penetração dos dentes antes da fragmentação, o que permite a comparação entre diferentes alimentos (Hennet, 2006 citado por Pinto, 2007). Neste sentido, Hennet et al. (2007) observaram que o aumento de 50% do tamanho do kibble reduziu em 42% o acúmulo de cálculo dentário em cães da raça beagle. No entanto, esta prática pode resultar em benefícios somente nos dentes utilizados durante a mastigação (Cox et al., 2003).

Portanto, apesar da possível remoção de placa e cálculo por estes produtos, há limitações nesta estratégia, pois a abrasão mecânica proveniente de alimentos duros, produtos de mastigação e alimentos especializados ocorrerá somente nos pontos em que o alimento entrar em contato efetivo com a superfície do dente. Nos animais com má oclusão, resultados uniformes não serão obtidos em todos os dentes e, esse mecanismo pode particularmente não trazer benefícios. A estratégia de ação mecânica também apresenta eficácia reduzida em cães que tendem a deglutir com pouca ou nenhuma mastigação (Cox et al., 2003).

Paiva et al. (2007) avaliaram a utilização de coadjuvantes na diminuição da placa bacteriana e formação do cálculo dentário em cães e determinaram que os que apresentavam apenas ação mecânica, apresentaram baixo desempenho, o que se deve provavelmente ao fato destes apresentarem ação apenas nos dentes em que houve contato. Em relação à terapia periodontal, a assistência domiciliar é uma parte muito importante, já que bolsas periodontais são reinfectadas dentro de duas semanas após profilaxia, caso essa prática não seja realizada (Brook, 2008). Um levantamento norte americano realizado com 29702 cães e 9074 gatos, constatou que 22,5% dos cães e 33,7% dos gatos recebiam dieta seca; 57,7% e 57,4% recebiam dieta seca adicionada de úmida e 19,8% e 8,9% recebiam somente dieta úmida. Linfoadenopatia, depósitos dentais e a doença periodontal apresentaram frequências significativamente inferiores em gatos alimentados somente com

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dieta seca em comparação às úmidas. A diferença também foi significativa entre animais alimentados com dieta seca adicionada de úmida e somente dieta úmida. Linfoadenopatia (81,9% contra 54,8%), depósitos dentais (44,3% contra 17,2%) e a doença periodontal (77,8% contra 45,3%) (Gawor et al., 2006). Isso pode ser explicado pelo fato da saliva conter peptídeos que se ligam a hidroxiapatita e assim, inibir Candida albicans, Streptococcus mutans, Porphyromonas gingivalis, Prevotella romonas, e Bacteroides spp. Além de conter IgA e leucócitos, agentes que causam inibição da ligação de bactérias aos tecidos gengivais (Paquette et al., 1997). Animais alimentados com dietas úmidas desenvolveram atrofia das glândulas salivares em poucos dias (Scott et al., 1990). Esta atrofia pode ser rapidamente reversível assim que uma dieta seca é reintroduzida. A saliva secretada por esses animais apresentou redução de 50% no teor de proteína (Johnson, 1984).

Outro estudo empregou 17184 cães e 6371 gatos e constatou que os animais alimentados com dieta seca apresentaram menor incidência de depósitos dentais, alterações dos linfonodos mandibulares e gengivite. O risco de alterações na saúde oral apresentou aumento de 41% para cães e 56% para gatos quando alimentados com dieta caseira em comparação aos 22% e 24% na dieta seca, sendo que 45% e 55% com mais de 02 anos apresentaram alterações significativas nos três índices avaliados. Também foi avaliada a influência da escovação e petiscos voltados à manutenção da saúde oral: os animais que recebiam escovação ou petiscos diariamente, ou a combinação dos dois algumas vezes por semana, apresentaram redução do risco de periodontite em comparação aos animais que recebiam petiscos voltados à saúde oral esporadicamente ou que não recebiam nenhum cuidado com saúde oral em casa. Os animais que recebiam escovação diária apresentaram redução de 16% em cães e 12% em gatos das alterações da saúde oral; os que recebiam petiscos diariamente em 19% e 10% e os gatos que recebiam a combinação dos dois algumas vezes por semana em 14%, quando comparados aos outros dois grupos. Animais que não recebiam nenhum tipo de cuidado com a saúde oral em casa apresentaram aumento de alterações orais de 37% em cães e 44% em gatos (Buckley et al., 2011).

ADITIVOS NUTRICIONAIS E A DOENÇA PERIODONTAL

POLIFENóISOs polifenois possuem atividade antibacteriana contra patógenos orais,

sendo estudados por seu efeito no controle da doença periodontal. Polifenóis da Cranberry previnem formação de placa por Porphyromonas gingivalis e Fusobacterium nucleatum, além de inibir algumas proteases Porphyromonas gingivalis (Yamanaka et al., 2007). Polifenóis do vinho possuem efeito

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antimicrobiano contra Porphyromonas gingivalis e Prevotella intermedia (Ho et al., 2001). Polifenóis do chá verde aplicado localmente na bolsa periodontal, reduziram a profundidade da bolsa e proliferação de bactérias Gram negativas anaeróbicas, e possui efeito antibacteriano in vitro contra Porphyromonas gingivalis e Prevotella spp (Hirasawa et al., 2002). Em cães de raças pequenas e grandes Isogai et al. (1997) observaram que uso de extrato de chá verde na dieta por um período de dois meses reduziu significativamente a porcentagem de Porphyromonas na placa, a inflamação gengival e a halitose, contudo o aditivo não apresentou efeito sobre o índice de cálculo dental. Diversos polifenóis inibem a atividade proteolitica da Porphyromonas gingivalis (Inaba et al., 2005). Além disso, derivados de polifenóis reduzem a produção de prostaglandina E2 induzida pela Porphyromonas gingivalis (Inaba et al., 2008).

OMEGAS-3Os efeitos antinflamatórios dos ômegas-3 estão sendo estudados em

doenças crônicas e câncer, recentemente foi demonstrado efeito benéfico na doença periodontal. Um estudo em ratos com doença periodontal avaliou a expressão do mRNA mediador de citocina no periodonto infectado por P. gingivalis e demonstrou que os ômegas-3 modulam a inflamação causada por citocinas e reduzem a reabsorção do osso alveolar (Kesavalu et al., 2007). Ratos inoculados com P. gingivalis ou com a combinaçao de F. nucleatum e P. gingivalis e alimentados com óleo de atum, exibiram redução da absorção do osso alveolar em 72% e 54%, respectivamente, em comparação com os animais alimentados com óleo de canola (BENDYK et al., 2009).

FOSFATOSA inclusão de fontes minerais nos alimentos de maneira que possam

proporcionar benefícios em todas as superfícies dentárias é outra abordagem empregada no controle da formação de cálculos. Os fosfatos formam complexos solúveis com o cálcio presente na saliva e dessa forma auxiliam na prevenção da mineralização da placa e consequente formação do cálculo dentário. Estes agentes possuem ação em toda a cavidade bucal, inclusive nas superfícies não envolvidas na mastigação. Quando adicionados ao alimento, e com a mastigação, o hexametafostato de sódio é incorporado na placa dentária e forma complexos solúveis com o cálcio, os quais se difundem na saliva, prevenindo a formação de cálculo dental. O hexametafosfato de sódio é convertido a ortofosfato por meio de ácidos presentes no estômago, sendo então assimilado de forma semelhante a outros fosfatos da dieta (Stookey et al.,1996). Os efeitos do tripolifosfato de sódio e hexametafosfato de sódio empregados como cobertura do croquete extrusado e no interior da massa

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foram avaliados na prevenção do desenvolvimento de cálculo dentário em 25 cães. Os resultados demonstraram que o hexametafosfato de sódio incorporado à dieta seca, tanto na sua cobertura como em seu interior, reduziu o acúmulo de calculo dentário, quando comparado à dieta sem adição de fosfatos (Pinto et al., 2008).

O tripolifosfato de sódio incorporado à dieta seca em cobertura foi efetivo quando comparado à dieta sem adição de fosfatos (24,2% de redução). No entanto, quando incorporado no interior da massa da dieta não influenciou o desenvolvimento de cálculo se comparado à dieta sem adição de fosfatos. Neste estudo, o hexametafosfato de sódio foi mais eficiente que o tripolifosfato de sódio na prevenção do desenvolvimento de calculo, pois reduziu seu acúmulo em 34,2% e 47,6% em massa e cobertura, respectivamente (Pinto et al., 2008). O recobrimento dos croquetes com tripolifosfato de sódio levou a redução de 55% de cálculo, porém o efeito diferiu de acordo com a localização dos dentes, sendo mais evidente nos dentes da região caudal utilizados para esmagar o alimento em comparação com incisivos e caninos (Hennet et al., 2007). Outro estudo avaliou a incorporação de polifosfatos na dieta comercial e obteve a redução de 58% dos cálculos e 9,0% da placa bacteriana (COX; LEPINE, 2002).

IMUNOGLOBULINASA utilização de imunoglobulinas contra as gingipaínas surge como

uma nova e promissora alternativa contra a doença periodontal. As gingipaínas são proteases secretadas pela Porphyromonas gingivalis e promovem interrupção da adesão celular e diferenciação dos osteoclastos, levam a perda de osso e ligamentos alveolares, além de bloquear a resposta imune do hospedeiro, contribuindo para destruição de tecido e consequente progressão da doença periodontal. Seu mecanismo de ação ocorre por meio da indução da permeabilidade vascular, ao ativar o sistema da calicreína-cinina, que leva ao aumento do fluxo sanguíneo gengival e progressão da inflamação. Também ativa o sistema de coagulação: a trombina converte o fibrinogênio em fibrina e por consequência gera trombos e consequente perda tecidual. Além de tudo isso, são responsáveis pela estimulação da reabsorção óssea e ativação da liberação de bradicinina que promove a dor. Possui potente ação degradante de fibrinogênio e fibrina, leva a hemorragias na gengiva. Causam degradação de macrófagos e inibem a ativação dos leucócitos, fatores que favorecem a multiplicação e adesão da P. gingivalis (Imamura, 2003).

Dentre as principais vantagens do emprego de IgY obtidas de ovos de galinhas, destacam-se a questão do bem estar aos animais, pois sua obtenção é realizada por um método não invasivo, baseado no simples ato de coletar ovos. O custo de manutenção das poedeiras é reduzido, se comparado a outras

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espécies animais, sendo mais econômico. Além disso, os anticorpos de galinhas não oferecem nenhuma reatividade cruzada com os anticorpos de mamíferos (Schade et al., , 2007).

A imunoterapia com anticorpos específicos de galinha (IgY) tem sido utilizada com sucesso contra doenças infecciosas de origem viral, bacteriana e origem fúngica em humanos e animais (Larsson & Carlander, 2003). O uso oral de IgY é uma abordagem atrativa por não ativar o complemento de mamíferos ou interagir com seus receptores, que podem mediar resposta inflamatória no trato gastrintestinal (Carlander et al., 2000). Recentes estudos relatam que seu uso é efetivo na prevenção de periodontite em pacientes humanos (Yokoyama et al., 2007). Sua eficácia in vitro e in vivo foi comprovada por alguns estudos. Um deles realizado in vitro demonstrou que na presença de IgY-PG, a adição de 62,5; 125 e 250µg/mL reduziu em 60,5; 59,6 e 47,1 ± 1,8% a atividade da protease das gingipaínas, respectivamente. Sendo que as células incubadas com gingipaínas demonstraram relação dose-dependente na perda da atividade de adesão (Yokoyama et al., 2007). Outro estudo empregou IgY contra as hemaglutininas responsáveis pela adesão da PG à mucosa do hospedeiro e constatou que houve neutralização da atividade das hemaglutininas, cujo efeito foi dose dependente (Tezuka, 2006).

Outro estudo realizado com ratos comprovou a eficácia da utilização das IgY para prevenir perda de osso alveolar. Os animais foram divididos em três grupos, todos infectados por PG: o primeiro grupo não recebeu nenhum tipo de IgY (grupo Pg.), o segundo grupo recebeu IgY contra as gengipans da PG (grupo Pg. + IgY-PG) e o terceiro grupo recebeu IgY proveniente de animais não inoculados com PG (grupo Pg. + IgY controle). Os animais que não receberam IgY apresentaram crescimento bacteriano e atividade da tripsina elevados (próximos de 100%); os animais do grupo Pg. + IgY-PG apresentaram crescimento bacteriano de 32,4% e atividade de tripsina de 40,8%, os animais do grupo Pg. + IgY-controle apresentaram crescimento bacteriano de 82,2% e atividade de tripsina de 91,6%. Em relação à perda óssea, os animais do grupo Pg. + IgY-PG apresentaram perda menor em comparação ao grupo Pg., e o grupo Pg. e Pg. + IgY-controle apresentaram perda óssea sem diferença estatística (Hamada & Watanabe, 2010).

Em cães, um estudo conseguiu comprovar a eficácia da utilização de IgY contra as gingipaínas. Este foi dividido em três fases, sendo realizado primeiro in vitro e posteriormente dois estudos in vivo. Os resultados in vitro demonstraram que as IgY-PG reagiram fortemente com P. gingivalis e P.gulae, mas demonstraram fraca atividade cruzada com P. salivosa e não reagiram de forma cruzada com P. circumdentaria e isolados clínicos de P. endodontalis F2 e F5. Foram utilizados três grupos, grupo controle sem IgY, gurpo controle com IgY controle, a qual não reagia com nenhuma das Porphyromonas spp e

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o grupo IgY-PG. A IgY-PG inibiu a atividade proteolítica das preparações de gingipaínas de P. gulae e P. gingivalis em 50% e 60%, respectivamente, levando ao menor dano às células e aumento da sua sobrevivência em comparação ao grupo controle não tratado e o controle que recebeu IgY controle (Shofiqur et al., 2011).

No estudo in vivo com cães, os animais foram divididos em três grupos com cinco cães cada, um controle, sem administração de IgY, um teste que recebeu 35mg de IgY-PG por kg de peso corporal uma vez ao dia e outro que recebeu 17,5 de IgY-PG por kg de peso corporal duas vezes ao dia, sendo o IgY –PG administrado sobre a alimentação comercial. A média de todos os parâmetros analisados, incluindo gengivite, periodontite, índice de saúde bucal, e sangramento à sonda, foram significativamente menores após 08 semanas, em comparação com a linha de base. Não houve mudança significativa em todos os parâmetros do grupo controle. Não houve diferenças notáveis entre os dois grupos teste (Teste 1: 35mg de IgY-PG/kg de peso corporal, uma vez ao dia; Teste 2: 17,5mg de IgY-PG/kg de peso corporal, duas vezes ao dia). Houve diferença significativa na remoção do cálculo dentário entre o grupo Teste 1 e o controle (Shofiqur et al., 2011).

Na segunda parte do estudo foram utilizados cinco cães e selecionados dois pares de dentes pré-molares contralaterais em cada animal, todos com inflamação gengival clara e profundidade de bolsa ≥ 5mm, um dente de cada contralateral foi tratado com 20% de IgY-PG misturada com pomada odontológica (um gel neutro contendo gel de hidrocarboneto, ésteres de sacarose e hidroxipropilmetilcelulose) e os outros dentes foram tratados somente com a pomada odontológica. A pomada foi administrada quatro vezes na semana (200mg/bolsa periodontal/hora) dentro da bolsa periodontal com auxilio de uma seringa. Os parâmetros clínicos foram avaliados semanalmente e a profundidade da bolsa foi avaliada na segunda e quarta semana. Os animais que receberam IgY-PG demonstraram redução significativa da profundidade da bolsa periodontal e o grupo controle não apresentou alteração significativa (Shofiqur et al., 2011).

Não foram localizados estudos publicados que tenham avaliado o efeito de IgY-PG sobre a saúde oral de gatos. Devido a falta de informação, foi conduzida pesquisa que objetivou avaliar os efeitos deste aditivo nutricional na espécie felina, pelo grupo de Estudos em Nutrição de Cães e Gatos do Departamento de Nutrição e Produção Animal da FMVZ-USP, conforme apresentado na Tabela 1.

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Tabela 1. Resultados da inclusão de IgY-PG em alimento para gatos.

Fonte: Oba et al. (2014)

Nota-se que os resultados do estudo evidenciam efeito positivo do aditivo na espécie felina. No entanto mais pesquisas são necessárias com avaliação profunda de sua relação com a microbiota oral, dosagens e manejo alimentar dos animais. Ao se comparar os resultado da utilização da IgY-PG com os verificados pelo uso de outros aditivos para melhoria da saúde oral presentes no mercado (Tabela 2), verifica-se que os sais de fósforo conseguem reduzir significativamente o cálculo dentário, porém não apresentam outros efeitos na profilaxia da doença periodontal, sendo inadequados para prevenir a periodontite, a longo prazo, apesar de reduzir significativamente o cálculo (Cave, 2012). As imunoglobulinas parecem agir tanto na formação da placa como do cálculo, assumindo assim melhor efetividade. No entanto, deve-se ter cautela na interpretação destes resultados, pois todos os estudos listados foram realizados com cães e a maioria com biscoitos, não alimentos completos. Assim, são necessários mais estudos para entender melhor a ação destes aditivos na saúde oral.

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Tabela 2. Compilado de estudos disponíveis na literatura que avaliaram diferentes aditivos coadjuvantes da saúde oral em cães e gatos.

CONSIDERAÇÕES FINAIS A saúde oral trata-se de uma preocupação de médicos veterinários,

nutricionistas e proprietários de cães e gatos, no entanto poucos estudos são localizados na literatura com o objetivo de avaliar a relação existente entre potenciais aditivos nutricionais e saúde oral, sendo que a maioria dos estudos foi conduzido em cães. Com base nas informações disponíveis na literatura, pode-se observar que polifenóis, fosfatos, ômega 3, imunoglobulinas parecem apresentar positivos efeitos sobre a saúde oral, sendo que os polifosfatos e imunoglobulinas podem apresentar efeito complementar. No entanto, novos estudos são necessários especialmente em felinos, dosagens dos aditivos, métodos de aplicação, manejo alimentar e sua inter-relação com a microbiota oral.

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CAPÍTULO 9

FATORES NUTRICIONAIS E METABóLICOS DE VACAS LEITEIRAS EM LACTAÇÃO QUE ALTERAM A COMPOSIÇÃO E A

ESTABILIDADE DO LEITE

Cristian Marlon de Magalhães Rodrigues Martins1, Marcos André Arcari1, Aline Gerato Dibbern1, Juliana Regina Barreiro1, Juliano Leonel

Gonçalves1, Marcos Veiga dos Santos1

1 Departamento de Nutrição e Produção Animal, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. Av. Duque de Caxias Norte, 225. CEP 13635-900. Pirassununga-SP. Brasil. [email protected]

RESUMOA baixa estabilidade das proteínas do leite ao etanol (teste do álcool)

e durante o processamento térmico industrial causa prejuízos econômicos em todos os elas da cadeia agroindustrial do leite. No Brasil, e em demais países que ainda utilizam o teste do álcool como um método de avaliação da qualidade do leite crú, foi relatada alta frequência de leite instável ao etanol, porém sem acidez resultante de ação microbiana (leite instável não ácido – LINA). Na última década, estudos se intensificaram em busca das causas da elevada ocorrência de LINA no Brasil, e fatores ambientais, genéticos, nutricionais e metabólicos das vacas leiteiras foram associados com a ocorrência de LINA. Estudos demonstraram que a deficiência nutricional das vacas leiteiras pode reduzir a estabilidade do leite por meio de alterações na composição da micela de caseína e do aumento do espaço intercelular (junções firmes) do epitélio alveolar mamário. Por outro lado, alterações no equilíbrio ácido-base do sangue, como acidose metabólica resultante da acidose ruminal ou de alterações no balanço cátion-aniônico da dieta, também podem reduzir a estabilidade do leite devido ao aumento das concentrações de cátions bivalentes, principalmente cálcio iônico. Desta forma, estudos sugerem que para prevenir a ocorrência de LINA, a elevada exigência nutricional de vacas leiteiras em lactação deve ser atendida, porém, distúrbios digestivos e metabólicos devem ser prevenidos e controlados.

INTRODUÇÃOO termo “estabilidade do leite” refere-se à resistência relativa das

proteínas em suportar o tratamento térmico industrial e/ou à reação com o etanol (estabilidade do leite ao etanol) sem sofrer coagulação (Singh, 2004). A estabilidade das proteínas é um fator importante para o processamento

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industrial do leite, especialmente para a fabricação de derivados que necessitam tratamentos térmicos intensos, como o leite longa vida (UAT) e leite em pó. Desta forma, em vários países, antes da coleta de leite na fazenda e/ou nas plataformas de recebimento dos laticínios, ainda é utilizada a estabilidade do leite ao etanol (teste do álcool ou alizarol) como uma forma de estimar a estabilidade térmica das proteínas.

A instabilidade das proteínas do leite ao etanol causa prejuízos aos produtores, devido à penalidade no preço e ou rejeição do leite quando o mesmo coagula no teste do álcool, às indústrias, pois o leite de baixa estabilidade tem menor capacidade em resistir o tratamento térmico sem formar coágulos, e aos consumidores, pois o leite de baixa estabilidade após os processamentos térmicos pode ter maior facilidade de formar coágulos durante a estocagem (McMahon, 1995; Fisher et al., 2012; Holt et al., 2013). Em diversas regiões do Brasil (Zanela et al., 2006; Marques et al., 2007; Botaro et al., 2009; Fisher et al., 2012; Oliveira et al., 2013) e em outros países que utilizam a estabilidade do leite ao etanol como um critério de qualidade do leite (Barros et al., 1999; Molina et al., 2001; Negri et al., 2003; Chaves et al., 2004) foi relatada alta frequência de leite de baixa estabilidade, no entanto, sem acidez resultante de ação microbiana. Desta forma, fatores não microbiológicos, como predisposição genética e condições nutricionais e metabólicas das vacas leiteiras, foram relatados como as principais causas da instabilidade do leite ao etanol (Marques et al., 2011; Barbosa et al., 2011; Fisher et al., 2012).

O leite instável ao etanol com valores normais de pH e acidez titulável foi denominado no Brasil como leite instável não ácido (LINA) (Zanela et al., 2006). Tal situação foi associada a alterações nas micelas de caseína, equilíbrio salino e concentração de cátions bivalentes no leite (Marques et al., 2011; Barbosa et al., 2012; Fisher et al., 2013). Ainda há poucos estudos que avaliaram o efeito isolado de cada fator que pode alterar a estabilidade do leite, o que dificulta a implementação de medidas de prevenção e correção do LINA nas fazendas leiteiras. Desta forma, neste capítulo serão apresentadas informações sobre definições e ocorrência de LINA, alterações na composição do leite que facilitam a coagulação das proteínas, fatores que podem alterar a composição e a estabilidade do leite e medidas de prevenção da ocorrência de LINA.

LEITE INSTÁVEL NÃO ÁCIDO: CONCEITO E OCORRêNCIAA crescente demanda por qualidade e segurança dos produtos

de origem animal durante a produção, impôs maior exigência sobre os produtores rurais com relação à produção de leite de alta qualidade. Desta forma, em 2005, entrou em vigor a Instrução Normativa 51 do Ministério da Agricultura (MAPA) (Brasil, 2002), cujo objetivo foi controlar e padronizar a

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qualidade do leite cru no Brasil. Esta normativa estabeleceu padrões mínimos de qualidade do leite cru para o recebimento palas indústrias, com base na composição química (≥3,0% de gordura, ≥2,9% de proteína e ≥8,4% de extrato seco desengordurado) e critérios de higiene, saúde da vaca e de segurança alimentar (contagem de células somáticas - CCS, contagem bacteriana total - CBT, resíduos contaminantes e adulterantes do leite). Os critérios de qualidade higiênica e sanitária do leite (CCS e CBT) foram alterados pela Instrução Normativa MAPA Nº 62 (IN 62/2011), com o objetivo de até o ano de 2017, o leite comercializado no Brasil apresentar limites de CCS ≤ 400 mil Células/mL e de CBT ≤ 100 mil UFC/mL (Brasil, 2011). Outro importante critério de qualidade do leite regulamentado pela IN 62 foi a estabilidade do leite.

O termo “estabilidade do leite” leite refere-se à resistência relativa das proteínas (caseínas) em suportar o tratamento térmico industrial (estabilidade térmica) sem sofrer coagulação, ou então, não formar coágulos durante a reação com o etanol (teste do álcool) utilizado antes da coleta do leite nas fazendas (Brasil, 2011). O teste do álcool ou alizarol ainda é utilizado para estimar a estabilidade térmica do leite antes de ser captado na fazenda ou logo após a chegada na indústria, com o objetivo de destinar o leite para o processamento térmico mais adequado com base no resultado de estabilidade ao etanol. De acordo com a IN MAPA 62/2011, o teste do álcool consiste na mistura das mesmas proporções (v/v) de leite e etanol (mínimo de 72% de etanol), e o resultado é baseado na visualização da formação de coágulos, cujo resultado deve ser negativo para concentração de etanol na mistura ≤ 72% (Figura 1) (Brasil, 2011).

Figura 1 - Leite estável e diferentes níveis de coagulação do LINA ao etanol 72%. Fonte: Martins, C. M. M. R. (2014).

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A utilização do teste do álcool para estimar a estabilidade térmica do leite é baseada na resistência das micelas de caseína em manter-se estável em contato com o etanol. A adição de etanol a uma solução aquosa diminui a constante dielétrica do fluído, favorecendo as interações eletrostáticas (Mikheeva et al., 2003). Desta forma, a adição de etanol no leite resulta em colapso da região C-terminal da κ-caseína, aumento do pKa dos resíduos glutamato e aspartato e redução da solubilidade do cálcio e dos fosfatos da micela, fatores estes que contribuem para reduzir a força de repulsão eletrostática entre as micelas, o que facilita a coagulação. Ao expor o interior hidrofóbico da micela ao contato com a água e com íons, as caseínas se aglomeram formando um tipo de “gel” na superfície do leite, caracterizado como o processo de coagulação (O’Connell et al., 2006).

Problemas com baixa estabilidade do leite ao etanol ocorrem em diversas regiões do Brasil e de demais países que utilizam o teste do álcool como uma forma de estimar a qualidade do leite (Barros et al., 1999; Chaves et al., 2004; Fisher et al., 2012). Primeiramente, problemas de baixa estabilidade do leite foram associados à acidificação do leite resultante de ação microbiana (leite ácido), principalmente devido à deficiência de higiene durante a ordenha e/ou de armazenamento do leite. Neste caso, a baixa estabilidade do leite poderia ser resultante da fermentação bacteriana da lactose do leite, com produção de ácido láctico e redução do pH, resultando em leite ácido. A acidificação reduz a carga e a hidratação das proteínas do leite, o que aumenta a atração eletrostática entre as moléculas de caseína e reduz a distância entre elas, facilitando a coagulação (O’Connell et al., 2006; Santos e Fonseca, 2007). De outra forma, a ação enzimática resultante da elevada contaminação microbiana do leite pode agir sobre a κ-caseína e contribuir para a menor estabilidade do leite (Santos e Fonseca, 2007). A hidrólise enzimática da κ-caseína reduz a estabilização esférica das micelas de caseína, bem como a repulsão eletrostática intermicelar, o que resulta em coagulação do leite (Fox et al., 1996). Adicionalmente, microrganismos psicrotróficos, que se multiplicam no leite sob baixas temperaturas, produzem proteases termoestáveis que agem sobre a κ-caseína, o que reduz o tempo de prateleira do leite pela formação de coágulos proteicos (Fairbairn e Law, 1986).

Estudos realizados no Brasil (Zanela et al., 2006; Marques et al., 2007; Oliveira et al., 2013) relataram alta frequência de leite instável, no entanto sem acidez resultante de ação microbiana. O leite instável com valores normais de pH e acidez titulável foi denominado no Brasil como leite instável não ácido (LINA), e de acordo com Fisher et al. (2012) apresenta qualidade adequada para o consumo humano (Tabela 1), sendo que a única limitação é a baixa capacidade de resistir ao tratamento térmico industrial sem sofrer coagulação, gerando prejuízos em todos os elos da cadeia agroindustrial do leite. Marques

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et al. (2007) avaliaram 9.892 amostras de leite coletadas no período de abril de 2002 a setembro de 2003 e relataram que 58% das amostras avaliadas foram instáveis ao etanol 76%, porém com valores normais de pH e acidez titulável. A alta ocorrência de LINA foi observada em alguns estados do Brasil, como Rio Grande do Sul (Marques et al., 2007; Zanela et al. 2009), Paraná (Marx et al., 2011) e São Paulo (Botaro et al., 2009; Oliveira et al., 2013), resultando em grandes prejuízos aos produtores, pela penalização no preço ou descarte do LINA; às indústrias, uma vez que quando processado o LINA pode coagular durante o processamento e resultar em descarte de leite e gastos adicionais de limpeza; e aos consumidores, pois após os processos de aquecimento, secagem e refrigeração o leite instável pode ter tempo de prateleira reduzido devido a maior facilidade de precipitação durante a estocagem.

Tabela 1 - Composição físico-química do leite normal e instável não ácido*.

*Adaptado de Marques et al. (2007). NS = Não significativo.

No Brasil, durante a última década, a produção de leite e as exigências por qualidade em busca da maior segurança alimentar dos derivados lácteos foram elevadas significativamente. Atualmente, o leite processamento por Ultra Alta Temperatura (UAT) representa a grande maioria do leite fluído comercializado no Brasil, além de ser um dos principais derivados exportados, atrás apenas do leite em pó e do leite concentrado (MDIC, 2014). A produção destes derivados exige alta estabilidade das proteínas do leite, uma vez que ocorrem intensos tratamentos térmicos durante o processo de fabricação. Desta forma, recentes estudos foram desenvolvidos em busca dos fatores associados com a estabilidade do leite não ácido, e das principais medidas de prevenção e correção da instabilidade do leite nas fazendas (Zanela et al., 2006; Marques et al., 2011; Barbosa et al., 2012; Martins et al., 2013a; Martins et al., 2014). Os principais estudos indicam que estabilidade das proteínas esta associada com a composição da micela de caseína, equilíbrio salino e interações iônicas entre cátions bivalentes livres no leite e complexados na micela de caseína.

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FATORES ASSOCIADOS COM A ESTABILIDADE DO LEITE

PROTEÍNAS DO LEITEA função nutricional básica das proteínas do leite é fornecer aminoácidos

essenciais ao neonato e proteínas bioativas (anticorpos). A síntese de proteína nas células secretoras do alvéolo mamário ocorre no retículo endoplasmático rugoso a partir de aminoácidos do sangue. Após a síntese, as proteínas são transportadas para o aparelho de Golgi e posteriormente secretadas na forma de vesículas para o lúmen alveolar. Algumas proteínas presentes no leite são oriundas do sangue, sendo transportadas e secretadas para o lúmen alveolar. De forma semelhante, as imunoglobulinas são transportadas a partir do sangue e vasos linfáticos para o leite. As proteínas do leite podem ser classificadas em dois grupos: as proteínas do soro e as caseínas. A definição para distinguir estes dois grandes grupos é baseada na coagulação e precipitação das proteínas do leite: as caseínas são as proteínas que precipitam em pH= 4,6; enquanto que as proteínas do soro não sofrem esta precipitação. Além destes grupos, o leite apresenta uma fração de compostos nitrogenados não-protéicos (NNP) (principalmente ureia, creatinina e creatina), originários do sangue, que podem representar cerca de 5% da proteína bruta do leite (Santos e Fonseca, 2007).

A caseína é a principal proteína encontrada no leite, pois forma 80% das proteínas lácteas (Cheftel et al., 1989). O leite de vaca contém diferentes subunidades de caseína: α (S1 e S2), β e κ-caseína (Fonseca e Santos, 2000). As subunidades αs1, αs2, β, e κ são encontradas no leite nas proporções 4:1:4:1, respectivamente (Walstra, 1999; Santos e Fonseca, 2007). A caseína é sintetizada na glândula mamária e secretada no leite na forma de micelas (Fonseca e Santos, 2000). Portanto, a caseína do leite é um agrupamento em micelas (associação em coloides) das subunidades proteicas αs1, αs2, β, e κ -caseínas, interligadas por fosfato de cálcio (Walstra, 1999; Oliveira e Timm, 2007). As micelas de caseína variam quanto à composição de submicelas em dois tipos principais: 1) formado por α, β e κ-caseína; e 2) formado por α e κ-caseína. As submicelas são interligadas por íons até formar por completo a micela de caseína propriamente dita. Durante a formação da micela, o arranjo dimensional das ligações entre submicelas aloja a κ-caseína na parte externa da micela, onde o C-terminal da κ-caseína se projeta para fora da micela, o que resulta em aspecto de camada esponjosa (Walstra, 1999). A κ –caseína é projetada na parte externa por ser hidrofílica e estável na presença de íons de cálcio, e, desta forma, protege o interior micelar hidrofóbico e cálcio sensível (composto por α e β-caseína) do contato com a água e da ionização com o cálcio. Adicionalmente, a κ-caseína reage com a água e impede a agregação das micelas por repulsão eletrostática (Creamer et al., 1998; Walstra, 1999). As caseínas α e β são as frações em maior proporção entre as caseínas do

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leite, porém são hidrofóbicas e sensíveis a presença de cálcio, e, portanto, são projetadas no interior da micela de caseína (Figura 2) (Swaisgood, 2003). A β-caseína é considerada a caseína mais hidrofóbica encontrada no leite por apresentar um largo C-terminal hidrofóbico dominante, baseado na estrutura primária (Swaisgood, 2003). Desta forma, a presença de κ-caseína e a concentração de cálcio iônico foram os principais fatores associados com a estabilidade das micelas de caseína, uma vez que a κ-caseína é a única caseína hidrofílica e estável à presença de cálcio livre.

Figura 2 - Figura esquemática da micela de caseína do leite. Fonte: adaptado de Di Martins, A (2009).

O arranjo micelar das subunidades de caseína confere à micela resistência aos tratamentos térmicos industriais e estabilidade aos derivados lácteos durante a armazenagem nas prateleiras do comércio varejista, uma vez que precipitados poderiam ocorrer se houvesse alterações principalmente na concentração de κ –caseína e de cálcio iônico do leite (Fisher et al., 2012). Além de manter as caseínas estáveis ao etanol e ao aquecimento térmico, a organização micela das subunidades de caseína facilita a ação da enzima quimosina para a clivagem na ligação peptídica Phe105 – Met106 da κ-caseína no estômago humano e/ou no abomaso do bezerro, o que contribui para a adequada nutrição e maior aproveitamento dos aminoácidos contidos na caseína durante os processos de digestão e absorção. A estrutura aberta das micelas de caseína, resultantes da clivagem da κ-caseína, permite o acesso de proteinases. Esta clivagem expõe o interior hidrofóbico da micela de caseína, resultando em susceptibilidade das micelas de caseína em formar um gel (coalho). Adicionalmente, o fosfato de cálcio se dissolve a medida que o pH decresce, as caseínas são liberadas para reorganizar-se e formar uma rede mais

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extensa de interações do que era possível na micela, o que aumenta o tempo de retenção da micela no estômago e facilita a digestão das proteínas e absorção dos aminoácidos no intestino (Holt et al., 2013).

As proteínas do soro também podem contribuir para alterar a estabilidade das micelas de caseína. Dentre as 4 principais proteínas do soro, apenas duas são sintetizadas na glândula mamária (β-lactoglobulina e α-lactalbumina), enquanto que as demais são originadas do sangue (albumina sérica e imunoglobulinas). Em condições normais, a β-lactoglobulina é a proteína do soro presente em maior concentração no leite (representa cerca de 50% das proteínas do soro). A função biológica da β-lactoglobulina ainda não é totalmente conhecida, mas está associada com o metabolismo do fosfato na glândula mamária, e no transporte da vitamina A e outras moléculas hidrofóbicas, como os ácidos graxos no trato gastrintestinal de neonatos (Kontopidis; Holt e Sawyer, 2004). A β-lactoglobulina é uma proteína termolábel e apresenta certa capacidade de sequestrar o cálcio em um dado pH; e os níveis de cálcio determinam as interações da β-lactoglobulina com demais proteínas do leite (Singh e Fox, 1987). A β-lactoglobulina apresenta reatividade com a κ-caseína (localizada na região externa da micela), e as interações entre estas duas proteínas pode contribuir para reduzir a estabilidade das micelas (Figura 3) (Martins et al. – submetido para publicação).

Figura 3 - Reação da β-lactoglobulina com a κ-caseína na micela durante o tratamento térmico do leite. Fonte: Adaptado de Bylund, G. (1995).

Alterações nas proteínas κ-caseína e β-lactoglobulina foram sugeridas como fatores que podem contribuir para a ocorrência de LINA. As soroproteínas são desnaturadas durante o tratamento térmico, e, como resultado, reagem com a κ-caseína na micela e podem reduzir a estabilidade do leite. A intensidade de interações da κ-caseína com a β-lactoglobulina depende da concentração de cálcio livre no leite (Martins et al., 2014). Adicionalmente, segundo Jeurnink e De Kruif (1995), a concentração de cálcio livre do leite também determina se o complexo β-lactoglobulina/κ-caseína permanece na superfície da micela ou dissocia-se para o soro; e quando este último ocorre, o interior hidrofóbico

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composto pelas caseínas cálcio-sensíveis (α e β) pode ficar exposto ao contato com a água e a ionização com o cálcio iônico, o que pode facilitar a coagulação da micela.

MINERAIS E CÁTIONS BIVALENTESOs principais elementos minerais encontrados no leite são: cálcio,

fósforo, magnésio, sódio, potássio e cloretos. Normalmente, o potássio é o mineral mais abundante no leite, seguido pelo cálcio. O cálcio (Ca) e o fósforo (P) podem estar ligados às micelas de caseínas e são fatores importantes que interferem na estabilidade do leite. Já o sódio, o potássio e os cloretos, juntamente com a lactose, assumem papel importante na regulação da produção do leite, por meio da pressão osmótica exercida por estes constituintes. Os elementos minerais do leite são originários do sangue, porém, a concentração mineral do leite pode chegar a dez vezes mais do que a do sangue (Santos e Fonseca, 2007).

Os minerais estão presentes no leite na forma coloidal (como os fosfatos de cálcio ligados a micelas de caseínas) ou na fase solúvel. No entanto, na fase solúvel os minerais não estão totalmente “livres”, e diferentes associações iônicas podem ocorrer. Estas associações são dependentes da força eletrostática (catiônica ou aniônica) exercida pelo mineral, e, também, pela solubilidade dos sais iônicos. Globalmente, o cálcio pode ser encontrado no leite na fase iônica (livre), estabilizado com o citrato (como citrato trivalente), complexado com os fosfatos (mistura de H2PO4 e HPO4) e associado aos cloretos (Gaucheron, 2005).

Barros et al. (1999) relacionaram a redução da estabilidade da proteína do leite com o aumento da concentração de cálcio iônico. Da mesma forma, Oliveira e Timm (2007) relataram que amostras de leite com menor estabilidade ao teste do álcool sem acidez adquirida apresentaram diminuição no teor de caseína e aumento das concentrações de íons, particularmente cálcio, em épocas de carência alimentar. Marques et al. (2011) observaram resultados semelhantes, uma vez que com o aumento da concentração de cálcio iônico no leite, a estabilidade ao etanol foi reduzida. As cargas elétricas das micelas dependem da concentração de cálcio ligado e, consequentemente, pelo nível de cálcio livre no leite. Com o aumento da concentração de cálcio total no leite, aumenta a quantidade de cálcio ligado e reduz as cargas negativas das micelas, diminuindo a barreira energética para a coagulação. Inversamente, reduzindo-se o teor de cálcio, aumentam as cargas negativas das micelas, aumentando a repulsão entre elas, dificultando a coagulação (Barros et al., 1999; O’Connell et al., 2006; Marques et al., 2011). Adicionalmente, o aumento na concentração de cálcio iônico no leite pode potencializar a associação da β-lactoglobulina com a κ-caseína na micela, o que pode facilitar a coagulação da micela de

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caseína ao etanol ou durante o aquecimento térmico (Holt et al., 2013; Martins et al., 2013a; Martins et al. – submetido para publicação).

DEMAIS COMPONENTES ASSOCIADOS COM A ESTABILIDADE DO LEITEAlém da concentração de íons e da relação de proteínas no leite, outros fatores foram associados com a estabilidade do leite ao etanol. O nitrogênio ureico do leite pode inibir a formação de ácidos e atuar sobre os grupos tiol das proteínas, contribuindo para dificultar a coagulação do leite ao etanol e/ou durante o aquecimento térmico. Adicionalmente, a uréia pode ser convertida em cianeto, que reage com a proteína e, contrariamente ao cálcio livre, aumenta às cargas negativas das micelas e a força de repulsão entre elas, e, consequentemente, a estabilidade do leite (Sweetsur e Muir, 1981). De forma semelhante, aumento da concentração de citrato também pode contribuir para o aumento da estabilidade do leite (Machado, 2010), pois pode sequestrar o cálcio livre e aumentar a força de repulsão entre as micelas de caseína (Varnam e Sutherland, 1995). Os fosfatos, de forma semelhante ao citrato, também podem atuar para manter a estabilidade do leite (Horne e muir, 1990), pois contribuem para reduzir o cálcio iônico no leite. Porém, o citrato se mantém por mais tempo solúvel no leite, além de ser mais efetivo para reagir com o cálcio livre, em comparação com o fosfato (Singh, 2004). De outra forma, a ação dos fosfatos também está associada ao pH do leite, uma vez que quando o pH do leite é reduzido, o fosfato coloidal passa à fase solúvel e desestabiliza as proteínas do leite (Machado, 2010; Santos e Fonseca, 2007). Desta forma, fatores como o tempo de lactação, mastite, ambiente, genética e nutrição das vacas lactantes estão associados com as alterações nas propriedades físico-químicas e no equilíbrio salino do leite, o que pode alterar a estabilidade do leite durante ao etanol e/ou durante o tratamento térmico.

EFEITO DO TEMPO DE LACTAÇÃO E DA MASTITE SOBRE A COMPOSIÇÃO E A ESTABILIDADE DO LEITE

O leite de vacas acometidas por mastite ou em estágio final de lactação tem três vezes mais probabilidade de ser instáveis do que leites de vacas no início ou meio da lactação. Este efeito é resultante do aumento do pH do leite, devido à maior permeabilidade do epitélio mamário a pequenas partículas e íons (Holt, 2004). O estágio avançado de lactação foi um fator associado com a ocorrência de leite de baixa estabilidade (Marques et al., 2010; Fisher et al., 2012). Da mesma forma, vacas em estágio inicial de lactação também apresentaram maior frequência de leite instável não ácido, em comparação com estágio intermediário de lactação (Tsioulpas et al., 2007). A baixa estabilidade do leite nas fases inicial e final de lactação foi atribuída

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aos elevados teores de cálcio iônico do leite, devido a maior passagem destes íons pelo espaço intercelular (junções firmes) da glândula mamária (Tsioulpas et al, 2007; Lewis, 2011).

De outra forma, segundo Fisher et al. (2012), a mastite subclínica não apresenta efeitos diretos sobre a estabilidade do leite ao etanol. No entanto, ao estudar amostras de leite na região nordeste do estado de São Paulo, Oliveira et al. (2013) verificaram que o leite estável apresentou menor contagem de células somáticas (CCS) que o leite instável. De forma semelhante, Feagan; Griffin e Lloyd (1966) estudaram os efeitos da mastite subclínica sobre a estabilidade do leite durante o aquecimento térmico a 140º C. Os autores coletaram amostras de leite oriundas de quartos mamários saudáveis e infectados de vacas primíparas e multíparas nas diferentes fases de lactação, e, posteriormente, submeteram estas amostras ao aquecimento térmico a 140º C. Como resultado, os autores observaram que o leite coletado de quartos infectados apresentou estabilidade térmica menor do que o leite oriundo dos quartos saudáveis da mesma vaca coletado na mesmo ordenha. Desta forma, a divergência de resultados de estudos sobre os efeitos da mastite subclínica sobre a estabilidade do leite pode ser associado à ausência de identificação dos microrganismos causadores de mastite, uma vez que as espécies de microrganismos podem agir de forma diferente sobre os constituintes do leite, em especial sobre as caseínas.

EFEITOS SAZONAIS, GENéTICOS E NUTRICIONAIS DAS VACAS LEITEIRAS QUE PODEM ALTERAR A ESTABILIDADE DO LEITE Botaro et al. (2009) conduziram estudos na região sudeste do Brasil com um total de 879 amostras de leite de tanque, oriundas de 603 vacas da raça Holandesa e 276 da raça Girolando, coletadas nas estações chuvosas e seca. Neste estudo foi observado frequência dos genótipos AA, AB e BB da κ-caseína de 66,31, 31,84 e 1,33% para vacas da raça Holandês e 71,38, 27,90 e 0,72% para as da raça Girolando, respectivamente. No entanto, os autores não observaram associação entre a estabilidade do leite e os genótipos de κ-caseína, mas as vacas da raça Holandesa apresentaram maior estabilidade do leite ao etanol do que vacas Girolando, e, adicionalmente, o leite foi mais estável na estação chuvosa do que na estação seca. De outra forma, Robitaille (1995) relataram que o polimorfismo da expressão do gene da κ-caseína afeta a estabilidade do leite ao etanol. No estudo de Robitaille (1995), o leite obtido de vacas que apresentaram predominância na expressão do alelo B em relação ao alelo A do gene da κ-caseína precipitou com maiores concentrações de etanol na mistura do que o leite de vacas com expressão similar para os alelos A e B. Botaro et al. (2007) estudaram seis rebanhos leiteiros de vacas da raça Girolando e cinco da raça Holandês localizados na região sudeste do Brasil, dos quais foram coletadas um total de 953 amostras de leite, distribuídas em

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dois períodos do ano: chuvoso e seca. Os autores não observaram efeito do polimorfismo da β-lactoglobulina sobre a estabilidade do leite. Porém, Botaro et al. (2007) relataram que o leite oriundo de vacas da raça Holandês foi menos estável na estação seca. Os efeitos sazonais observados por Botaro et al. (2007) e Botaro et al. (2009) são similares aos resultados relatados por Fisher et al. (2012), que descreveram que os efeitos sazonais sobre a ocorrência de LINA podem ser atribuídos a escassez de alimentos, devido a deficiência de pastagens durante o período de vazio forrageiro, compartilhamento de áreas para a produção de cereais, e deficiência de chuva para a produção de volumoso, no caso das regiões Sudeste, Central e Norte do Brasil. Marques et al. (2007) relataram maior ocorrência de LINA na região sul do Brasil em março (82% das amostras analisadas instáveis ao etanol 76%), e valores mínimos em janeiro (33% das amostras instáveis ao etanol 76%). De forma semelhante, Zanela et al. (2009) também relataram alta ocorrência de LINA (55% das amostras analisadas instáveis ao etanol), sendo que os valores médios de instabilidade variaram de acordo com o tempo de avaliação durante 1 ano. Desta forma, Marques et al. (2007) e Zanela et al. (2009) associaram a alta ocorrência de LINA com épocas de escassez de forragens, devido ao final de ciclo das pastagens de verão, associado à falta de pastagens de inverno (que ainda não se encontraram aptas para utilização), e ao compartilhamento de áreas de pastagem com a semeadura de cereais, como a soja que ocorre no verão, respectivamente. O efeito da deficiência nutricional sobre a estabilidade do leite foi confirmado por Barbosa et al. (2012), pois ao induzir a ocorrência de leite instável não ácido por meio da restrição alimentar, observaram que as amostras instáveis apresentaram maiores concentrações de β-caseína e proteína total, e apresentaram tendência (P= 0,068) em reduzir o teor de κ-caseína do leite. Como resultado, Barbosa et al. (2012) relataram que a deficiência de nutrientes é um fator que reduz a estabilidade do leite ao etanol. Stumpf et al. (2013) conduziram um estudo com o objetivo de avaliar o efeito da restrição alimentar sobre a estabilidade do leite, e descreveram que a deficiência de nutrientes aumentou a permeabilidade das células mamárias “Tight Junctions”, o que resultou em menor estabilidade do leite ao etanol. Desta forma, a deficiência de nutrientes pode reduzir a estabilidade do leite possivelmente por meio de alterações nas subunidades de caseína, e, adicionalmente, por alterações na concentração de cátions bivalentes, como o cálcio, uma vez que o espaço intercelular é aumentado em resposta a restrição alimentar (Barbosa et al., 2012; Stumpf et al., 2013). Além do aporte de nutrientes, alterações digestivas e metabólicas foram relacionadas à ocorrência de leite instável não ácido (Fisher et al., 2012). Fagnani; Beloti e Battaglini (2014) coletaram amostras de sangue e de

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leite de 96 vacas leiteiras em lactação, e observaram distúrbios no equilíbrio ácido-base do sangue em 50 % das vacas estudadas. Como principal resultado, os autores relataram que a frequência de amostras de leite com instabilidade alcoólica foi maior nas vacas que apresentaram algum distúrbio metabólico. Estudos demonstraram que a estabilidade do leite foi reduzida em resposta à acidose metabólica, resultante da acidose ruminal (Ponce e Hernandes, 2005) ou pela adição de sais aniônicos à dieta durante a lactação (Marques et al., 2011; Martins et al., 2013a). Mellau et al. (2004) demonstraram que a adição de sais aniônicos e a alta concentração de carboidratos não fibrosos na dieta estimularam o metabolismo do cálcio de forma semelhante, uma vez que ao induzir hipocalcemia em vacas não lactantes pela infusão intravenosa de EDTA, os autores observaram que a inclusão de carboidratos não fibrosos (10 Kg/vaca/dia de cevada) na dieta ou a suplementação com sais aniônicos (cloreto e sulfato de amônio) recuperaram a homeostase do cálcio de forma semelhante. A acidose metabólica pode aumentar a concentração de cálcio iônico no leite, devido à ação dos hormônios da paratireoide (PTH) e do 1,25 dihidroxicolicalciferol, e reduzir a estabilidade do leite ao etanol e/ou ao aquecimento térmico (Marques et al., 2011; Martins et al., 2013a). A acidose metabólica em vacas leiteiras é um distúrbio bastante comum nos atuais sistemas de produção de leite, pois pode ocorrer por diferentes meios: alta taxa metabólica de vacas lactantes; decorrente da acidose ruminal; e resultante da redução do balanço cátion-aniônico da dieta (BCAD). Martins et al. (submetido para publicação) relataram que a redução do BCAD, de 290 para -71 mEq/Kg de MS, aumenta a concentração de cálcio iônico e de κ-caseína no leite, e, contrariamente, reduz a concentração de β-lactoglobulina e de nitrogênio ureico, o que resulta em redução linear da estabilidade do leite ao etanol e ao aquecimento térmico a 140º C (Figura 4). Portanto, além de atender a demanda nutricional, o controle de alterações metabólicas que ocorrem em vacas leiteiras em lactação para manter o equilíbrio iônico sanguíneo também é um importante fator para manter o leite estável à reação com o etanol e ao aquecimento térmico.

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Figura 4 – Efeito do balanço cátion-aniônico da dieta (BCAD, mEq/Kg de MS) sobre: κ - CN - concentração de κ - caseína no leite: Y= 5,02 (EP= 0,30) – 0,00098 (EP = 0,0004) × BCAD (mEq/Kg de MS); β - LG - concentração de β - Lactoglobulina no leite: Y= 1,46 (EP = 0,15) + 0,00065 (EP = 0,0002) × BCAD (mEq/Kg MD); Cai - concentração de cálcio iônico no leite: Y= 85,78 (EP = 4,98) – 0,08 (EP = 0,01) × BCAD (mEq/Kg de MS) + 0,000237 (EP = 0,00008) × BCAD2 (mEq/Kg MS2); NUL - concentração de nitrogênio ureico no leite: Y= 18,22 (EP = 1,36) + 0,0094 (EP = 0,0026) × BCAD (mEq/Kg de MS); TA - Teste do álcool (nível de etanol na solução alcoólica necessária para provocar coagulação do leite): Y = 74,87 (EP = 0,87) + 0,01174 (EP = 0,0025) × BCAD (mEq/Kg de MS); TC - Tempo de coagulção (tempo necessário para coagular o leite durante o aquecimento a 140º C: Y = 3,95 (EP = 1,02) + 0,01234 (EP = 0,0032) × BCAD (mEq/Kg de MS). Fonte: Martins et al. (submetido para publicação).

Vacas em lactação que consomem altas quantidades de carboidratos não-fibrosos (rapidamente fermentáveis no rúmen) também podem desencadear processo de acidose metabólica em decorrência da acidose ruminal (Mutsvangwa et al., 2004). Desta forma, tanto o excesso, por meio da acidose metabólica decorrente da acidose ruminal, quanto à deficiência de nutrientes podem alterar a estabilidade do leite (Fisher et al., 2012). Portanto, para prevenir a ocorrência de leite de baixa estabilidade sem acidez resultante de ação microbiana, a elevada demanda nutricional das vacas em lactação deve ser atendida com a utilização de alimentos concentrados; porém, medidas como o adequado fornecimento de FDN e/ou uso de tamponantes e/ou alcalinizantes

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na dieta das vacas leiteiras, devem ser considerados para evitar acidificação no fluído ruminal que podem resultar em desequilíbrio do sistema ácido/base do sangue. Adicionalmente, alterações de ingredientes volumosos e/ou concentrados e/ou de suplementos minerais sem adaptação prévia também devem ser evitadas para prevenir problemas digestivos (Fisher et al., 2012), alterações no BCAD, e, consequentemente, problemas de leite instável não ácido.

ASSOCIAÇÃO ENTRE ESTABILIDADE DO LEITE AO ETANOL E AO AQUECIMENTO TéRMICO

De acordo com Molina et al. (2001), Negri et al. (2001), Chavez et al. (2004) e Martins et al. (submetido para publicação) a estabilidade do leite ao etanol apresenta limitada capacidade em estimar a estabilidade do leite durante o tratamento térmico, uma vez que o teste do álcool apresentou baixa ou média correlação com demais métodos de avaliação da estabilidade térmica do leite, como o teste da fervura e o tempo de coagulação a 140º C. Em busca de leite com elevada estabilidade térmica para a crescente produção de derivados lácteos, como o leite UAT e o leite em pó, alguns laticínios aumentam o teor de etanol (de 72 para 78, 80 e até 82%) na solução alcoólica para a seleção de matéria-prima com elevada estabilidade. No entanto, o uso da estabilidade do leite ao etanol para destinar o leite para o processamento térmico mais adequado pode não apresentar resultados satisfatórios, uma vez que o leite que coagula durante a reação com o etanol pode resistir o aquecimento térmico sem formar coágulos, o que apenas aumentaria o descarte de leite e/ou a penalização no preço pago aos produtores pelo leite de “baixa” estabilidade ao etanol (<78 ou até mesmo <82%) (Fisher et al., 2012). Assim, pesquisas são necessárias para estudar e propor métodos acurados e precisos para a estimativa da estabilidade térmica do leite, o que pode melhorar a eficiência da cadeia agroindustrial do leite, uma vez que o leite de baixa estabilidade sem acidez resultante de ação microbiana poderia ser devidamente identificado e destinado a processamentos térmicos menos intensos de aquecimento, como o de pasteurização.

CONSIDERAÇÕES FINAISProblemas com a baixa estabilidade do leite sem acidez resultante

de ação microbiana ocorrem em várias regiões do Brasil e do mundo, mas as causas ainda não estão totalmente elucidadas, o que contribuí com os prejuízos que o leite instável não ácido causa à cadeia agroindustrial do leite. Os resultados dos estudos sugerem que o atendimento da exigência nutricional das vacas leiteiras em lactação é um importante fator para manter o leite estável ao etanol. Nesta situação, em vacas com deficiência nutricional, o aumento do espaço intercelular (junções firmes) e alterações na composição das micelas de

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caseína (alterações na concentração de β e κ-caseína) foram sugeridos como os principais fatores associados com a baixa estabilidade do leite não ácido. No entanto, em busca do atendimento da elevada exigência energética de vacas leiteiras em lactação, o uso de altas quantidades de concentrado associado à deficiência ou inadequado fornecimento de FDN efetivo e de alcalinizantes ou tamponantes na dieta pode resultar em leite instável não ácido por meio da acidose metabólica resultante de acidose ruminal. A acidose metabólica aumenta a concentração de cálcio iônico no leite, que reduz as cargas negativas das micelas de caseína e a força eletrostática de repulsão entre elas, o que facilita a coagulação do leite ao etanol e/ou durante o processamento industrial. Desta forma, o controle de alterações metabólicas que ocorrem em vacas leiteiras em lactação para manter o equilíbrio iônico sanguíneo é um importante fator para manter o leite estável à reação com o etanol e ao aquecimento térmico, pois alterações na concentração de cálcio iônico e nas interações da β-lactoglobulina com a κ-caseína na micela podem ocorrer e reduzir a estabilidade das micelas em vacas acometidas por acidose metabólica.

Problemas metabólicos são bastante comuns em vacas leiteiras, e além da acidose ruminal, fatores como a alta taxa metabólica, o estresse térmico e as alterações no BCAD também podem alterar o equilíbrio ácido-base do sangue. A variação no BCAD pode estar associada com alterações na composição mineral da dieta, como troca do tipo e/ou da quantidade de suplemento mineral fornecido, e alterações na composição química principalmente das forragens devido a alterações nas características do solo e do estágio de desenvolvimento da planta. Alterações de concentração de cátions e/ou ânions implicam na necessidade do metabolismo em se readaptar a cada nova condição de BCAD. Desta forma, alterações na composição mineral da dieta, mesmo que o BCAD permaneça com miliequivalência positiva, devem ser evitadas para prevenir a ocorrência de leite instável não ácido.

Por fim, para uma adequada estimativa da estabilidade térmica do leite ha necessidade de estudos sobre a utilização de testes alternativos ao teste do álcool, uma vez que a estabilidade do leite ao etanol apresenta baixa ou média correlação com o aquecimento térmico. Desta forma, a identificação adequada de leite de baixa estabilidade pode reduzir os prejuízos no setor primário e industrial, contribuindo para maior eficiência econômica e sustentável da cadeia agroindustrial do leite. Adicionalmente, com testes mais acurados e precisos, as tomadas de decisão para implementação de medidas de correção dos problemas de instabilidade do leite poderão ter maiores chances de sucesso.

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CAPÍTULO 10

ZOOTERAPIA NAS ESCOLAS: LIÇÕES DO PASSADO E DESAFIOS PARA O FUTURO

MARTINS, M. F.; BALBINI, N. W.; STANQUINI, C. S.

Departamento de Nutrição e Produção Animal (VNP) da Faculdade de MedicinaVeterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (FMVZ-USP)

A ZOOTERAPIA NO CONTEXTO CULTURAL E EDUCACIONALA Zooterapia é uma ciência incipiente, de caráter transdisciplinar,

abrangente e rica em possibilidades de aplicação, de modo que, em geral, podem ser atribuídas a ela duas vertentes: a Terapia Assistida por Animais, na qual pacientes humanos e até mesmo outros animais são beneficiados nos mais diferentes contextos (educação, socialização e saúde, por exemplo) através da interação com os animais terapeutas; e o uso de biofármacos gerados a partir de substâncias produzidas pelos animais, como o própolis das abelhas ou o muco do escargot, muito utilizado no exterior para a fabricação de cremes rejuvenescedores ou ainda antibióticos. (Martins, 2003; Lutosa, 2008; Marcucci, 2008; Da Silva, 2009; Yokoya, 2010) (Figuras 01 e 02).

Inquestionavelmente, essa segunda vertente está inserida culturalmente na sociedade, devido ao uso tradicional de produtos naturais na saúde humana, como é o caso do exemplo citado (Alves e Rosa, 2013). Ainda, muitas vezes, as pessoas fazem uso dos mesmos sem se darem conta da origem deste fármaco e de sua relação com a ciência Zooterapia. Entretanto, tratando- se da Terapia Assistida por Animais, as pessoas costumam apresentar bastante relutância, seja devido ao descrédito que impõem à atividade por não conhecerem a parte científica que embasa sua aplicação, ou ainda por confundirem-na com outras atividades não- científicas que fazem uso de animais e a preocupação constante com o bem estar dos mesmos. Um exemplo claro disto é o desconhecimento das pessoas sobre o fato dos animais serem rigorosamente selecionados, de acordo com características específicas necessárias para que sejam considerados como potenciais co-terapeutas e co-educadores. Os desafios não param por aí, ao que faz-se mor um amplo entendimento, conhecimento, clareza conceitual, equipe preparada e abrangente quanto à disciplinariedade e um adequado plano de ação para que seja alcançado o sucesso das atividades.

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Figura 01: Abelhas, produtoras do própolis, biofármaco amplamente utilizado pela população. Fonte:http://eric-magnetiseur.com/?p=287

Figura 02: Muco extraído do Escargot Achatina fulica, um potente biofármaco. (Acervo Pessoal)

Para exemplificar melhor, remete-se a duas questões do passado: o Histórico da Zooterapia e a Evolução da Educação Física no Século XX. Sabe-se que no Brasil, a Zooterapia começou a partir dos trabalhos da Dra. Nise da Silveira (Figura 03), médica psiquiatra que, insatisfeita com os métodos convencionais para tratamento da esquizofrenia (eletrochoque), desenvolveu a Terapia Assistida por Animais com o uso de cães, em caráter experimental, ainda que a mesma não tenha sido reconhecida cientificamente devido ao fato de não ter feito publicações com suas descobertas, ao que o crédito ficou com o Dr. Boris Levinson (Figura 04) em 1962, nos

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Estados Unidos, como o percursor dessa ciência (Pereira et al., 2007; Silveira, 1981; Dotti, 2005), evidenciando a necessidade de um rigor científico, uma vez que é assim que as pesquisas são desenvolvidas. Já a Educação Física, uma disciplina tão complexa e interdisciplinar quanto a própria Zooterapia, tem uma história de desenvolvimento interessante no Brasil, influenciada por eventos históricos. Na década de 1930, predominava uma ideologia militarista e higienista (seleção de indivíduos perfeitos e exclusão dos incapacitados), sendo ela, na época, uma disciplina essencialmente prática, sem suporte teórico. No mesmo período, o movimento da Escola Nova, que pregava o desenvolvendo integral da criança, esboçava a tentativa de melhorar a educação em geral, deixando-a com um caráter mais dinâmico, voltada à formação do indivíduo, contrapondo-se ao pensamento geral. Infelizmente, o Regime Militar atrasou os processos de mudança, mantendo o modelo esportivista, transformando a Educação Física no que era chamado de “Ginástica”. Foi apenas na década de 1980 em que ocorreu o rompimento – ao menos, a nível de discurso – da excessiva valorização do desempenho no sistema educacional como um todo (Darido, 1999).

Figura 03: Dra. Nise da Silveira, Médica Psiquiátrica que desenvolveu a Terapia Assistida por Animais no Brasil na década de 1960 como tratamento alternativo à esquizofrenia. Fonte: http://www.jblog.com.br/hojenahistoria. php?itemid=3492&catid=144

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Figura 04: Dr. Boris Levinson, reconhecido mundialmente como o percursor da Zooterapia. Fonte: http://www.koineonlus.org/bau/img/BLev inson.jpg

A Educação Física aplicada nas escolas não deve ser, em sua essência, um ensino restritamente esportivo, mas também abranger conceitos de aprendizagem sobre saúde, fisiologia, biologia e, acima de tudo, cidadania, embora, ainda hoje, comumente tem sido distorcida. A prática da Zooterapia nas escolas deve ser fundamentada de modo a conscientizar os alunos e a própria equipe para que ela não caia em contradição, assim como o ensino da Educação Física, como exemplificado. À adequação da pratica da Zooterapia, tendo em vista a sua eficácia, demanda-se especial atenção quanto à linguagem e, de modo geral, abordagem que se utiliza na prática zooterapêutica. O planejamento e o esclarecimento devem sobrepor-se às expectativas à moda das que os alunos apresentam, por exemplo, quando, no Ensino da Educação Física, querem apenas a prática esportiva, evitando-se a euforia. O aluno deve ser estimulado a analisar, interpretar e criar novos significados sobre os conteúdos, sabendo diferenciar as atividades de simples brincadeiras, garantindo à Zooterapia o caráter de ensino e não de entretenimento. Para o intento de conquistar o uso de uma linguagem e abordagem adequadas, para além da própria habilidade do profissional zooterapeuta, reveste de importância a aquisição de conhecimentos multi, inter e transdisciplinares.

Tem-se, atualmente, um contexto de maiores preocupações quanto a temas extra- curriculares, formando não apenas estudantes, mas também cidadãos. Segundo Albuquerque & Carvalho (2008), a educação é um fenômeno aliado à cultura, não podendo dissociar suas práticas do contexto social e cotidiano, de modo que as possibilidades de expressão, percepção e imaginação

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propiciam a liberdade e o respeito às diversidades. Na própria lei de diretrizes e bases da educação nacional, de 1996, consta que a educação, dever da família e do Estado, inspirada nos princípios de liberdade e nos ideais de solidariedade humana, tem por finalidade o pleno desenvolvimento do educando, seu preparo para o exercício da cidadania e qualificação para o trabalho (Albuquerque & Carvalho, 2008 apud Lei de Diretrizes e Bases da Educação Nacional, 1996). Tendo em vista tais pensamentos correntes, a Zooterapia busca o seu lugar como prática pedagógica, tendo como um importante argumento o fato de ir de encontro com tendências e o próprio objetivo da educação. As escolas buscam a modernidade através da aplicação de tendências de sucesso, novas verdades e novos caminhos. Os profissionais da área de Zooterapia devem atentar-se a isso e estarem cientes da necessidade de transmitir segurança e valorizar seu trabalho, fazendo com que as pessoas saibam reconhecer a importância dessas atividades no meio acadêmico e social.

Em geral, o pensamento predominante quanto à aplicação da prática zooterapêutica é relacionado aos benefícios que tal pratica venha a gerar, atrelado ao conservadorismo que marca

o sistema educacional no Brasil. Entretanto, ainda que, talvez, de desconhecimento das escolas de caráter conservador, elas mesmas são praticantes de “novas” propostas pedagógicas, e como exemplificação para tal afirmação, pode-se citar a pedagogia Freinet, que prega uma educação com o foco na relação professor-aluno, sendo do professor o papel de organizador e cooperador ao objetivo da construção do conhecimento do aluno, objetivando a aprendizagem, sendo a ideia da quantificação do desempenho constituinte de um sério erro, e aulas de campo, mecanismos de auto-avaliação, práticas como o “Jornal da Escola” e projetos e atividades em grupos fazem parte do hall de características positivas abordadas por esta pedagogia. Deve-se atentar para o fato de que a Zooterapia se encaixa nos anseios da escola atual, necessitando apenas corresponder com boas práticas, uma vez em que está em jogo a imagem da ciência e também a das escolas que, por ventura, venham a se tornar pioneiras nessa prática.

OS ANIMAIS ZOOTERAPEUTASA Zooterapia, como ciência, deve ser fomentada por bases sólidas que

garantam seus critérios de eficiência naquilo que deseja-se executar. Para tal, é de extrema importância que os animais sejam adequados para as atividades propostas e não simplesmente pets que promovam a diversão das crianças. Acima disso, deve-se garantir a segurança dos procedimentos e evitar-se surpresas no decorrer das atividades.

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Figura 05: Animal zooterapeuta manifestando comportamento tranquilo, dócil e permitindo interação com as crianças. (Acervo Pessoal).

No Brasil, são muito comuns os usos de cães e gatos para as atividades nas escolas, embora até hoje apenas a equoterapia seja reconhecida cientificamente como prática zooterapêutica (Martins M.F. et al 2014), especialmente correlacionada à área da saúde. Ainda assim, as mais diversas espécies animais podem ser utilizadas para tal fim, desde que correspondam às características necessárias à interação com as crianças, uma vez que a criança exacerba a necessidade do contato. Assim sendo, o animal zooterapeuta deve ser calmo, estar adaptado ao convívio e à interação com as pessoas e outros animais, permitir o toque e o manejo, não manifestar reações inesperadas, não se estressar facilmente, dentre outros (Figura 05). Além disso, ele deve passar por um controle microbiológico, evitando a transmissão de zoonoses, estar sadio e higienizado e manter acompanhamento veterinário periódico (Caetano, 2010 apud Dotti, 2005).

Deve-se atentar ao fato de que as necessidades do animal quanto ao seu bem estar não devem ser ignoradas, uma vez que o sucesso da prática dá-se de acordo com a participação do mesmo. Sendo assim, é de suma importância cuidados com o animal em questões como alimentação, fornecimento de água e descanso, quando necessário e respeitar as necessidades fisiológicas do animal, administrando para que o mesmo não precise conter-se durante as práticas e permaneça a vontade durante os procedimentos (Figuras 06 e 07).

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Figuras 06 e 07: A importância do fornecimento de descanso e condições básicas ao bem estar do animal zooterapeuta. (Acervo Pessoal).

OS BENEFÍCIOS DA ZOOTERAPIA NO CONTEXTO ESCOLARToda prática zooterapêutica agrega fatores psicológicos, físicos e

sociais aos seus beneficiados. Em sua prática pedagógica, pode-se destacar a melhora da socialização dentro e fora do ambiente escolar, a redução da depressão, da ansiedade e da solidão, o desenvolvimento da concentração, motivação para a realização de atividades, inclusão, melhora nas capacidades motora, sensorial e cognitiva, auxílio no ensino-aprendizagem de disciplinas curriculares,

educação humanitária, desenvolvimento de senso de responsabilidade e respeito, incentivo à curiosidade e à criatividade (aspectos inerentes ao desenvolvimento da criança), dentre inúmeros outros, que dependerão também da atividade a ser realizada, fato que justifica a importância do planejamento prévio de acordo com o público a ser atendido e os resultados que se buscam alcançar (Silva et al., 2009; Flôres, 2009; Caetano, 2010; Samfira & Petroman,

2011). Para isso, também o animal utilizado deve ser, como anteriormente mencionado, criteriosamente selecionado, não apenas em questões comportamentais, mas também função da atividade que será desenvolvida, faixa etária do público-alvo, empatia com a espécie animal, local onde será realizada a atividade, objetivo, temática, entre outros.

VIVêNCIAS NA PRÁTICA DA ZOOTERAPIA NAS ESCOLASA primeira lição que se obtém a partir da realização de atividades com

as crianças e jovens em escolas, sobretudo no ensino fundamental, é referente à psicolinguística própria de tal público. Objetiva-se, em outras palavras, compreender como os alunos apreendem aquilo que é dito pelos coordenadores das atividades, bem como o que está por trás, a nível de pensamento, do que é passado pelo aluno à equipe zooterapêutica. Se é almejado maior compreensão a respeito dos dados passíveis de serem obtidos quando da realização de uma atividade zooterapêutica, surge como opção de interesse a aplicação de oficinas

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de interação pedagógicas e psicopedagógicas (Figura 08), uma vez que podem estas intensificar a experiência e suas manifestações no ambiente escolar e, ao mesmo tempo, subsidiar a produção científica que, no caso de uma equipe acadêmica de Zooterapia, advirá das atividades realizadas.

Figura 08: Oficina realizada com a temática de peixes em atividade zooterapêutica nas escolas. (Acervo Pessoal).

Para tal finalidade, é importante o preparo de materiais e propostas didáticas, atrativas e direcionadas à idade dos escolares (Figuras 09 a 11), bem como ao meio sociocultural em

que vivem, que facilitem o entendimento e a possibilidade de interação com a equipe, os animais e com as demais crianças e professor da turma (Figuras 12 a 17). Além disso, as crianças devem ser orientadas sobre como realizar as atividades, sobretudo, como interagir com os animais, respeitando-os e despertando o senso de responsabilidade, respeito às formas de vida e fortalecendo sentimentos humanitários (Figuras 18 a 21).

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Figuras 09, 10 e 11: Materiais confeccionados de acordo com a faixa etária do público alvo para uma aula sobre biologia, fisiologia e comportamento dos peixes Betta splendens como parte de uma atividade zooterapêutica nas escolas. (Acervo Pessoal).

Figuras 12 e 13: Interação promovida entre professor e alunos através do contato com o Escargot, molusco utilizado na prática de Zooterapia pela Equipe da FMVZ-USP, na cidade de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

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Figuras 14, 15, 16 e 17: Interação promovida entre alunos através do contato com o Escargot, peixe Betta splendens e jabuti na prática de Zooterapia pela Equipe da FMVZ- USP, na cidade de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

Figuras 18 e 19: Alunos sendo orientados sobre como devem agir com os animais zooterapeutas, bem como recebendo informações sobre sua biologia, fisiologia e comportamento. (Acervo Pessoal).

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Figura 20: Criança observando o peixe Betta splendens durante atividade zooterapêutica em sua escola, respeitando o comportamento natural do peixe em seu aquário. (Acervo Pessoal).

Figura 21: Criança alimentando o peixe Betta splendens segundo a didática da atividade zooterapêutica promovida, despertando seu senso de responsabilidade e afeição pelas formas de vida. (Acervo Pessoal).

As Oficinas Pedagógicas e Psicopedagógicas (Figuras 22 a 34) são um material de grande valia para a Zooterapia realizada no ambiente escolar, pois, a partir dela, a equipe consegue realizar a socialização das crianças e a fixação dos conteúdos abordados em sala de aula, de forma didática,

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obtendo também informações de suma importância para a atividade, através de análise comportamental, possibilidade de expressão, liberdade para manifestarem seus sentimentos e estímulo à criatividade da criança, mantendo correlações com o momento da vida de cada uma delas bem como com sua personalidade e vivências fora do ambiente escolar. Através dessas atividades, em práticas promovidas pela Equipe de Zooterapia da FMVZ-USP, na cidade de Pirassununga/SP, obteve-se dados correlacionados ao modo como as crianças enfrentavam o luto (tanto no aspecto familiar quanto em relação a seus animais de estimação), dificuldades de aprendizado, dificuldades de socialização, bullying, violência familiar, entre outros, além de estimular às crianças ao senso crítico, ao respeito, à busca por informações, e aplicar conceitos de sustentabilidade e educação humanitária, consistindo assim em uma ferramenta de auxílio à escola e ao professor, conferindo aos mesmos e aos coordenadores pedagógicos pistas valiosas para o acompanhamento preciso da evolução de cada aluno. Ainda, apresenta-se como oportunidade de exercício da expressão e criatividade, em contexto essencialmente distante do usual, propiciando ao aluno a descoberta de novos gostos e habilidades, podendo ser alvo de desenvolvimento futuro.

Figura 22: Oficina realizada com a temática dos peixes Betta splendens em atividade zooterapêutica nas escolas promovida pela Equipe da FMVZ-USP na cidade de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

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Figura 23: Oficina realizada com a temática do jabuti em atividade zooterapêutica nas escolas promovida pela Equipe da FMVZ-USP na cidade de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

Figura 24: Oficina realizada com a temática do escargot em atividade zooterapêutica nas escolas promovida pela Equipe da FMVZ-USP na cidade de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

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Figuras 25, 26 e 27: Oficina realizada com a temática da Páscoa e a figura do coelho em atividade zooterapêutica nas escolas promovida pela Equipe da FMVZ-USP na cidade de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

Figura 28: Oficina realizada com a temática da Violência na Interação Humano-Animal em atividade zooterapêutica nas escolas promovida pela Equipe da FMVZ-USP na cidade de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

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Figura 29: “Aquário dos Sonhos” – Oficina Psicopedagógica realizada em atividade zooterapêutica nas escolas promovida pela Equipe da FMVZ-USP na cidade de Pirassununga/SP, na qual os alunos expunham suas ideias para um mundo mais sustentável. Também foi promovido o aprendizado da redação para que participassem da atividade. (Acervo Pessoal).

Figuras 30, 31, 32 e 33: Atividades complementares às Oficinas realizadas em prática zooterapêutica nas escolas promovida pela Equipe da FMVZ-USP no município de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

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Figura 34: Oficina de Interação com o animal (jabuti) realizada em atividade zooterapêutica nas escolas promovida pela Equipe da FMVZ-USP no município de Pirassununga/SP. (Acervo Pessoal).

CONSIDERAÇÕES FINAISA Zooterapia, na busca por seu espaço merecido, mesmo com seus

inúmeros benefícios comprovados cientificamente, ainda encontra obstáculos quanto a entrada de animais nas escolas. Dado aos resultados promissores obtidos até o momento, aliados ao entusiasmo, e como forma de aprendizado através dos animais, pode ser uma alternativa eficaz para a utilização dos mesmos como coeducadores, novas pesquisas se fazem necessárias, ressaltando a importância da inter, multi e transdisciplinaridade entre os envolvidos, pós-graduandos, alunos de iniciação cientifica e acadêmicos de diferentes cursos, que possam vir a contribuir para o desenvolvimento de protocolo educacionais reforçando e validando o uso de animais de maneira eficiente e segura no cotidiano escolar e também fortalecendo a atuação do profissional de ciências agrárias no cotidiano escolar. Nesse contexto, a zooterapia, tem na extensão um importante potencial disseminador e enriquecedor na formação de graduandos pós graduandos e também alunos de ensino médio, fundamental e profissionais como pedagogos, psicólogos entre outros, sendo fundamental que se propaguem de forma clara e objetiva os resultados obtidos. E para isso foi criado uma webpage (facebook/zooterapiaUSP) para divulgação nas atividades zooterapêuticas.

AGRADECIMENTOSÀ Ccex pela concessão de bolsas aos acadêmicos envolvidos em

projetos zooterapêuticos sob nossa orientação. Aos estagiários Joyce Carolyne Moraes e Lucas Pires Herker.

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CAPÍTULO 11

LIMITES DA REDUÇÃO DE PROTEINA DIETéTICA COM O USO DE AMINOÁCIDOS SUPLEMENTARES NA ALIMENTAÇÃO DE

MONOGÁSTRICOS

Connie Gallardo, Julio Cezar Dadalt, Gisele Dela Ricci, Janaina Cristina da Silva Maciel de Souza.

Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da Universidade de São Paulo (USP), Departamento de Nutrição e Produção Animal.

RESUMOA eficiência no aproveitamento dos ingredientes proteicos pelos

monogástricos depende da quantidade, da composição e da digestibilidade dos aminoácidos, de modo que as especificidades do aporte desses nutrientes sejam supridas. Durante muitos anos as dietas formuladas para monogástricos consideraram o conceito de proteína bruta (PB), resultando frequentemente em dietas com maior conteúdo de aminoácidos, aos níveis exigidos pelos animais. Assim, todo excedente de aminoácidos (AA) é catabolizado e utilizado na produção de energia, modo esse, inapropriado para suprir calorias, Por outra parte, o nitrogênio (N) produto desse catabolismo deve ser excretado pelos representando alto gasto energético para o corpo, além da sobrecarga hepática e renal, demandando maior ingestão de água para minimizar tais efeitos.

A formulação de dietas baseada em níveis de PB, normalmente resulta em valores altos de alguns aminoácidos, sobretudo, com a adoção prática de margens de segurança para garantir a suplementação de alguns aminoácidos essências. É sabido que os monogástricos não têm exigências nutricionais para PB e sim para cada um dos aminoácidos essenciais que formam parte das proteínas e atendem quantidade de nitrogênio para a biossíntese dos aminoácidos não essenciais. Assim a presente revisão aborda aspectos relacionados com os limites da manipulação do teor protéico das dietas para monogástricos, bem como os limites da suplementação dos aminoácidos que se tornam limitantes nas dietas com baixos teores proteicos destinadas a aves e suínos.

INTRODUÇÃO Nos últimos anos aconteceram grandes mudanças genéticas nas

aves e suínos, aumentando, principalmente, o desempenho e a produção de proteína. Esses avanços genéticos demandam maiores conhecimentos dos aspectos nutricionais, buscando-se suprir as reais necessidades para mantença

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e produção. Além disso, atualmente os nutricionistas não se preocupam somente em minimizar os custos, também consideram as questões ambientais e os impactos que a ração possa causar na saúde do animal.

As rações para aves e suínos, geralmente são formuladas para cobrir as demandas nutricionais, a exemplo dos aminoácidos totais e digestíveis, sem considerar que as dietas formuladas podem ter excessos ou déficit de alguns desses, induzindo desbalanços nutricionais e maior excreção de nitrogênio para o meio ambiente.

A redução do conteúdo protéico e a suplementação da ração com aminoácidos industriais são os principais recursos para redução da excreção de nitrogênio (WAIBEL et al., 2000) e otimização do custo com alimentação. Além disso, a carência dos aminoácidos pode implicar na redução no desempenho animal ou potencializar o catabolismo de outros aminoácidos, razão da maior excreção de nitrogênio (BERTECHINI, 2006).

No Brasil as rações destinadas às aves e suínos são, predominantemente, a base de farelo soja e milho. Dessa combinação, visa-se atender as exigências dos aminoácidos, entretanto, a ajuste das demandas de proteína, normalmente, implica em quantidades excedentes de outros aminoácidos e também se aumenta a poluição ambiental (PARSONS & BAKER, 1994). Ao aumento do teor de proteína dietética gera custo maior na produção que se soma aos danos ao ambiente (DI CAMPOS et al., 2004) e a melhor estratégia seria conhecer limites para a suplementação de aminoácidos.

PROTEINAS E AMINOÁCIDOS Em sua composição química, a proteína é um conjunto de nutrientes

importante para as aves e suínos, como também é relevante na composição custo da formulação das rações e influencia diretamente a conversão alimentar, qualidade de carcaça e ganho de peso dos animais. A utilização do nitrogênio a partir de proteína microbiana não é tão eficiente em monogástricos quanto em ruminantes, uma vez que nos monogástricos, a produção de proteína com origem na microflora intestinal ocorre após o estômago e quase toda extensão do intestino delgado. Nessas condições, se torna impossível a digestão química da dieta, condição necessária para a absorção de aminoácidos e peptídeos no intestino delgado; uma vez que a dieta é a fonte principal de nitrogênio dos monogástricos (BERGEN & WU, 2009).

O valor nutritivo da proteína de um alimento depende de sua composição em aminoácidos, de sua digestibilidade e disponibilidade. Os ensaios experimentais para estimar exigências de aminoácidos basearam-se, principalmente, nas avaliações de desempenho, com níveis e respostas. Esse critério de avaliação apresenta limitações, exigindo avaliações com duração maior de tempo e, normalmente, avalia-se um aminoácido por

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ensaio, por isso, a determinação da digestibilidade dos aminoácidos digestíveis se torna mais efetivo e viável (NRC, 1998, 2012, ROSTAGNO et al., 2007).

São vários e interdependentes os processos digestivos, desde a degradação da proteína da dieta, ao longo do trânsito no trato gastro-intestinal, e a absorção dos seus produtos hidrolisados, fornecendo, assim, os aminoácidos (AA) necessários ao processo anabólico proteico (VAN et al., 2002). Na determinação da digestibilidade dos aminoácidos procura-se avaliar a diferença entre a quantidade dos aminoácidos ingeridos e suas frações que não foram digeridas e absorvidas ao término do intestino delgado. Tal procedimento permite estimar a digestibilidade dos aminoácidos na porção terminal do íleo, cujo conteúdo ainda não sofreu interferência da flora intestinal. Os valores são expressos em digestibilidade ileal verdadeira dos aminoácidos, com a correção pelas perdas endógenas de aminoácidos, provenientes das enzimas, mucinas e células intestinais de descamação (ROSTAGNO et al., 2007).

IMPORTâNCIA E CLASSIFICAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS Os aminoácidos têm grande importância fisiológica, servindo como

blocos de construção para proteínas e substratos para a síntese de substâncias de baixo peso molecular. Animais em crescimento (como suínos e aves) precisam de aminoácidos para construir o tecido muscular (proteína corporal). Assim além da construção de blocos de proteínas, os aminoácidos também são necessários para diversas funções corporais, como o desenvolvimento de órgãos e ótimo funcionamento do sistema imunológico. Logo, o conteúdo de proteína e aminoácidos deve ser considerado em formulações alimentares para melhorar a eficiência de utilização dos nutrientes, crescimento, desenvolvimento, reprodução, lactação e bem-estar dos animais (WU et al., 2014).

No total, 20 aminoácidos formam os blocos de construção para a proteína. Os AA essenciais (AAE) não podem ser sintetizados pelos animais e deve ser fornecidos pela alimentação, entre eles se encontram: arginina (Arg), lisina (Lis), histidina (His), leucina (Leu), isoleucina (Iso), valina (Val), metionina (Met), treonina (Tre), triptófano (Trp) y fenilalanina (Fen). Os semi essenciais são sintetizados a partir de aminoácidos essenciais durante o metabolismo dos animais: tirosina (Tir) e cistina (Cis). Os outros AA podem ser sintetizados pelo animal a partir da proteína dietética: alanina (Ala), ácido aspártico (Asp), ácido glutâmico (Glu), glicina (Gli), serina (Ser) e prolina (Pro) (WALLACE & CHESSON, 2008).

Quando o fornecimento de certo aminoácido não supre as demandas metabólicas do animal e o animal não tem capacidade de sintetizá-lo a partir de outro, esse se torna limitante. Uma vez limitante nas demandas do metabolismo, o efeito refletirá no potencial de crescimento ou produtivo

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do animal. Sua limitação deve ser suprida através da ração, todavia, deve-se atentar se um aminoácido tornar-se limitante, quando ajustado a relação ideal entre aqueles considerados essenciais. Em desbalanço, a quantidade dos aminoácidos não limitantes e os considerados não essenciais não atenderão a demanda equilibrada do “pool” de aminoácidos para cumprir as atividades de síntese e reposição celular do organismo. Em dietas práticas, normalmente lisina é o primeiro aminoácido limitante, por isso, sua exigência torna-se referência para os demais aminoácidos, estabelecendo-se a razão desses com a lisina (KIDD et al., 2000, WU et al., 2014).

Um mesmo aminoácido pode ser considerado essencial e não essencial para um determinado grupo de animais, dependendo de suas condições fisiológicas (WATFORD, 2011). Muitos estudos mostram que os AANE, particularmente a glutamina, glutamato, arginina, glicina, cisteina e prolina regulam as funções fisiológicas através de vias de sinalização celular, como em mamíferos a rapamicina, a proteína quinase ativada por AMP ou por mitogenio, a Kinase relacionada com sinais extracelulares, a Jun Kinase e AANE derivados de moléculas gasosas (óxido nítrico, monóxido de carbono e sulfureto de hidrogênio). Segundo REZAEI et al. (2013) estes AA são considerados como condicionalmente essenciais, por serem sintetizados pelos animais em quantidades insuficientes em determinadas fases do desenvolvimento ou sob certas condições de alimentação.

EXIGêNCIAS DE PROTEINA E AMINOÁCIDOS EM MONOGÁSTRICOS

A exigência de um nutriente pode ser definida pela quantidade do mesmo a ser fornecida na dieta para atender as necessidades do animal, que variam nas condições ambientais adversas. Suas necessidades podem ser interpretadas como as quantidades de um nutriente para atender um determinado nível de produção (SAKOMURA & ROSTAGNO, 2007).

Uma das preocupações na produção moderna de proteína animal é a excreção de nitrogênio, devido ao aporte de proteína na dieta dos animais, principalmente aves e suínos, acima da capacidade de síntese de proteína corporal (ROTZ, 2004). A eficiência de utilização do nitrogênio depende do conjunto de aminoácidos e as alterações decorrentes da deficiência de lisina resultam no catabolismo de outros aminoácidos (SALTER et al., 1990).

O fator mais importante que afeta a eficiência da utilização da proteína é o perfil de aminoácidos essenciais digestíveis. As aves não apresentam uma alta exigência em proteína bruta (PB), mas precisam de qualidade que assegure uma reserva de nitrogênio para a síntese de aminoácidos não essenciais. Durante muitos anos as dietas eram baseadas no conceito de proteína bruta o que resultou em dietas com níveis de AA acima do exigido pelos animais.

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Em excesso, os aminoácidos sofrem desaminação e o nitrogênio é excretado na forma de uréia pelos mamíferos e ácido úrico pelas aves. Este processo reflete em gasto energético para o animal, portanto, o excesso de AA não contribui para melhorar o desempenho dos animais.

Com o surgimento da produção de AA industriais nos últimos anos, as dietas podem ser formuladas com menor nível protéico e com níveis de AA mais próximos das necessidades de aves e suínos. Isso faz com que a formulação das dietas seja mais precisa, diminuindo-se o desequilíbrio entre os AA (KIDD et al., 2000).

Torna-se difícil, também, definir as exigências de AA para aves e suínos, pois são influenciadas pela densidade calórica da dieta, condições ambientais, densidade populacional, estado sanitário, sexo, idade, linhagem. O melhor conhecimento das demandas nutricionais dos aminoácidos individuais permite a nutrição mais precisa, possibilitando substituir parcialmente a necessidade da proteína por níveis mínimos de aminoácidos, reduzindo-se custos e a emissão de poluentes no ambiente. As necessidades são maiores para maior eficiência alimentar do que para o máximo crescimento e podem ser mais altas, quando se busca o rendimento em cortes nobres (ZANELLA et al., 2004).

Sobre o desequilíbrio dietético dos aminoácidos, D’MELLO (2003) destacou que no tecido (sítio de síntese) isso ocorre quando o aminoácido suplementar é absorvido mais rapidamente que os demais ligados à proteína do ingrediente. Nesse caso, a concentração de lisina plasmática livre aumenta 1 a 2 horas após a ingestão da dieta com o aminoácido puro, enquanto, com os outros aminoácidos provenientes da proteína, o pico ocorre entre 2 e 6 horas da alimentação.

REDUÇÃO DO TEOR PROTéICO NAS DIETAS DE MONOGÁSTRICOSDurante muito tempo as formulações se baseavam na proteína bruta

dos alimentos e os erros nesse procedimento se deviam as quantidades de aminoácidos exigidos pelos animais. Aminoácidos com níveis acima das exigências devem ser catabolisados o que implica na maior atividade do fígado e dos rins, pois o nitrogênio precisa ser eliminado e isso representa gasto energético (CHIARADIA, 2008). De acordo com FIGUEROA et al. (2000), para que a excreção de nitrogênio sofra queda, é necessário que a quantidade de proteína da dieta seja alterada, concomitantemente, haverá a suplementação de aminoácidos para que seja atendida toda a exigências para a síntese protéica, fazendo com que haja melhor aproveitamento pelos animais. Os mesmos autores afirmam que o declínio abrupto no nível de proteína numa dieta de crescimento prejudica o desempenho do animal, uma vez que a quantidade de aminoácidos não essenciais não seja fornecida.

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A boa oferta de proteínas deve cobrir todas as necessidades do animal, por outro lado, os nutricionistas buscam formular dietas com níveis de proteína bruta tão baixos quanto possível, suplementando aminoácidos a fim de garantir o desempenho e a saúde ideal para o animal. Esses aminoácidos livres permitem fornecer a quantidade exata de cada aminoácido, a fim de cobrir as necessidades do animal em cada fase da vida. A proteína bruta pode ser mantida em nível muito baixo, o que é ideal para o animal e benéfico para o meio ambiente (WALLACE & CHESSON, 2008). Para WAIBEL et al. (2000, citado por RIZZO et al., 2010) a redução do conteúdo protéico e a suplementação da ração com aminoácidos industriais são os principais recursos para redução da excreção de nitrogênio e otimização do custo com alimentação. O balanceamento correto de aminoácidos na dieta é importante, uma vez que diminui o consumo voluntário de alimento pelos animais.

É possível assim, reduzir o nível de proteína bruta da ração de aves e de suínos, diminuindo o consumo de fontes proteicas como o farelo de soja, por aminoácidos industriais, sem prejudicar o desempenho animal. Em média, a suplementação de aminoácidos em formulações para aves e suínos diminui a excreção de nitrogênio em 8,5% por unidade percentual de proteína bruta reduzida na ração (Sindicato Nacional da Indústria de Alimentação Animal - SINDIRAÇÕES, 2011). Na suinocultura, a excreção de nitrogênio pode cair até 25%, quando os animais recebem rações contendo 15% de proteína bruta suplementadas com aminoácidos, em comparação àqueles alimenta dos com 18% de PB, sem a suplementação (ZANELLA et al., 2004).

GANDRA (2012), relata que os animais não são capazes de sintetizar alguns aminoácidos para que sejam satisfeitas suas exigências, por isso a necessidade de fornecê-los via dieta. A partir disso o conceito de aminoácidos limitantes e essênciais foram adotados e ao formular uma nova dieta não resultariam em perdas e nem excessos de aminoácidos.

Já, dietas com porcentagens proteicas elevadas sobrecarregam a digestão, a absorção e a eliminação do nitrogênio não aproveitável (BERTECHINI, 2006). Outra influência da porcentagem de proteína bruta refere-se ao incremento calórico que representa toda perda de energia durante os processos de digestão, absorção e metabolismo de nutrientes (SAKOMURA E ROSTAGNO, 2007). A dieta com maior teor proteico representa maior incremento calórico em relação às dietas com reduzida porcentagem de proteína bruta. A elevação do incremento calórico reduz a energia líquida que poderia ser utilizada para deposição de tecido muscular e, consequentemente, diminuiria a eficiência alimentar.

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Tabela 1. Composição de aminoácidos nas proteínas do corpo de frangos e suínos

Frangos1 Suínos2 Milho3

Farelo soja4

Aminoácidosmg AA/gproteína

% lisina

mg AA/g proteína

% lisina AA/100g

AA/100g

Alanina 66.30 108.00 65.70 109.00 0.71 1.95Arginina 68.50 111.00 67.70 112.00 0.38 3.18Asparagina 36.50 59.30 36.00 59.70 0.35 2.10Aspartato 43.10 70.10 42.80 71.00 0.43 3.14Cistina 15.00 24.40 13.20 21.90 0.20 0.70Glutamina 50.50 82.10 51.20 84.90 1.02 3.80Glutamato 82.90 135.00 84.60 140.00 0.64 4.17Glicina 115.00 187.00 117.00 19.40 0.40 2.30

Histidina 21.10 34.30 20.80 34.50 0.23 1.13Isoleucina 35.90 58.40 35.30 58.50 0.34 2.03Leucina 69.20 113.00 68.30 113.00 1.13 3.44Lisina 61.50 100.00 60.30 100.00 0.25 2.80Metionina 18.90 30.70 18.70 31.00 0.21 0.60Fenilalanina 34.80 56.60 34.30 56.90 0.46 2.21Prolina 85.30 139.00 86.10 143.00 1.06 2.40Hidoxi prolina 34.80 56.60 37.90 62.90 0.00 0.09Serina 45.00 73.20 44.30 73.50 0.45 2.12Treonina 36.30 59.00 35.10 58.20 0.31 1.76Triptofano 11.60 18.90 11.10 18.40 0.07 0.62

Tirosina 26.60 43.30 27.20 45.10 0.43 1.66Valina 41.80 68.00 42.20 70.00 0.44 2.09

Fonte: Wu 2014 (Adaptado de Wu et al., 2013)Exceto para a glicina, os aminoácidos são todos L-isómeros. Os cálculos foram baseados nos pesos moleculares dos aminoácidos intactos.1 frangos (10-dias de idade). O teor de proteína no corpo é de 14,3 g / 100 g de tecido úmido.2 Suínos (30-dias de idade). O teor de proteína no corpo é de 14,1 g / 100 g de tecido úmido.3 Ração 89,0% de matéria seca. Milho em grão contém 9,3% de PB (base na matéria natural)4 Ração 89,0% de matéria seca. O farelo de soja contém 43,6% de PB (base na matéria natural)

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FORNECIMENTO DE AMINOÁCIDOS SUPLEMENTARES EM DIETAS COM BAIXOS TEORES PROTéICOS EM AVES

A proteína é o componente da ração que mais interfere no crescimento do animal, tendo influência direta sobre o ganho de peso, a conversão alimentar e a composição da carcaça, mas, elevado teor proteico na ração não é garantia de melhoria no desempenho das aves. Na formulação da dieta busca-se combinar ingredientes para atender exigências da proteína e dos aminoácidos. Dependendo da quantidade e composição dos ingredientes, a formulação resultante pode conter valor de proteína ou de aminoácido(s) superior aos níveis recomendado para as aves, alterando, assim, a relação desses aminoácidos na dieta. Isso pode resultar no desequilíbrio de aminoácidos e prejudicar o desempenho dos animais. Logo, a dieta suplementada de aminoácidos permite maior eficiência do seu aproveitamento na produção de carne magra, reduzindo a ingestão de alimento e gasto energético para suprimir o excesso de aminoácidos (ZANELLA et al., 2004).

O controle do consumo de ração não decorrente somente da quantidade de proteína bruta, mas também de sua qualidade, isto é, do balanceamento entre os aminoácidos (GONZALES (2002). O grau de deficiência ou desbalanceamento de aminoácidos na ração resulta em reações variadas por parte das aves, fazendo com que o consumo de ração seja alterado (ALBINO et al., 1999). Avaliando rações de diferentes níveis protéicos com metionina e lisina, LISBOA & SILVA (1999) não observaram influência significativa da proteína no consumo de ração. Por sua vez, DIAMBRA & MCCARTNEY (1995) observaram que aves submetidas a rações deficientes em proteína tendem aumentar o consumo para compensar tal deficiência.

Em dietas frangos de corte, a redução de 1% no conteúdo de proteína bruta na dieta, com suplementação de aminoácidos reduziu a excreção de nitrogênio entre 10 a 27 %, enquanto que em dietas de poedeiras, esta redução alcançou valores entre 18 a 35 % (ROTZ, 2004). Segundo BREGENDAHL et al. (2002) o uso de aminoácidos industriais para baixar os níveis de proteína nas dietas de frangos de corte foi eficaz na excreção do nitrogênio, com pequena redução na taxa e eficiência do crescimento, quando houve decréscimo de 3% da proteína preconizada. KESHAVARZ & AUSTIC (2004) observaram que dietas com 13% de proteína bruta, suplementada de metionina, lisina e triptofano, segundo o NRC (1994), proporcionaram resultados semelhantes aos da dieta convencional com 16% de proteína bruta. Porém, quando houve redução acentuada de proteína, as suplementações dos aminoácidos não propiciaram as aves desempenho semelhantes aquelas submetidas a dietas com níveis protéicos mais elevados (SUMMERS et al., 1991).

O ajuste dos níveis de proteína pode trazer ganhos produtivos e econômicos importantes, obtidos com a melhoria do desempenho e da

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qualidade de carcaça de frangos. A composição corporal dos frangos é afetada tanto pela quantidade, como pela qualidade da proteína da ração, demonstrando que o aminoácido em menor proporção, comparado à exigência, torna-se primeiro limitante e restringe o valor da proteína. A composição de proteínas e aminoácidos da ração também pode influenciar a deposição de proteína da carcaça, afetando principalmente o rendimento de carne de peito (KIDD et al., 1998).

Ao determinar o efeito dos níveis de proteína bruta na ração sobre o desempenho e rendimento de carcaça de frangos de corte Ross, machos e fêmeas, nas fases inicial e crescimento, COSTA et al. (2001) estimaram em 22,4 e 22,5% de PB para a fase inicial e 19,5 e 18,5% de PB para fase de crescimento, respectivamente, para machos e fêmeas. DARI et al. (2005) observaram maior deposição de gordura abdominal nas aves alimentadas com rações contendo 18,2% de PB, em relação às aves alimentadas com 20% de PB, em rações formuladas com base em aminoácidos totais. VIOLA et al. (2008) concluíram que as aves alimentadas com rações formuladas com base em aminoácidos totais tiveram menor ganho em peso e rendimento de coxa e peito com o decréscimo da PB da ração, comparadas àquelas alimentadas com rações formuladas com aminoácidos digestíveis. GOULART et al. (2009) avaliaram o rendimento de frangos de corte sometidos a dietas com redução proteica suplementadas com valina, isoleucina e glicina, além da metionina, lisina e a treonina. A redução de 2 pontos percentuais da PB dietética, em relação com o tratamento controle, obtida através da suplementação dos Aas L-Valina e L-Isoleucina, manteve o peso dos frangos, os quais tiveram ganho de peso e conversão alimentar semelhantes ao grupo de frangos alimentados com dieta de alto nível de PB. A suplementação da glicina não melhorou o desempenho das aves, mostrando que na redução proteica estudada não houve problemas de deficiência deste AA.

No caso das poedeiras, níveis altos de proteína na dieta influenciam positivamente o peso dos ovos, pois as poedeiras não são capazes de reservar proteína eficientemente para a sua mantença, sendo dependentes do consumo diário (RIZZO et al., 2010). Dietas com baixos níveis de proteína podem afetar o desempenho das poedeiras, mas o desempenho pode ser recuperado quando as dietas recebem aminoácidos suplementares (HARMS & RUSSELL, 1993). CALDERON & JENSEN (2006) não encontraram diferenças significativas para a produção de ovos, assim como para o consumo de ração e para a qualidade dos ovos de poedeiras alimentadas com diferentes níveis de proteína (12, 14, 16, 18%) e de lisina (0,85 e 1,0%) na ração, estudando níveis de proteína bruta. Segundo MURAMATSU et al. (1987), as poedeiras alimentadas com níveis ótimos de proteína na ração apresentam maiores taxas de síntese protéica da gema no fígado e do albúmen no oviduto, principais órgãos de síntese das

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proteínas do ovo, em comparação a poedeiras alimentadas com nível subótimo.A resposta das aves à redução da proteína da ração parece estar

condicionada à extensão em que este nutriente é reduzido na ração. A redução do conteúdo protéico e a suplementação da ração com aminoácidos industriais são os principais recursos para redução da excreção de nitrogênio (WAIBEL et al., 2000) e otimização do custo com alimentação. Todavia, o retorno econômico da criação de poedeiras não está associado apenas ao menor consumo de proteína, mas à manutenção da ingestão dos aminoácidos essenciais.

DIETAS COM BAIXO TEOR PROTéICO EM SUÍNOS E FORNECIMENTO DE AMINOÁCIDOS SUPLEMENTARES

As crescentes preocupações ambientais relacionadas às concentrações de nitrogênio de dejetos de suínos tem gerado interesse no uso de AA sintéticos para diminuir o conteúdo de proteína bruta nas dietas de suínos. KERR & EASTER (1995) estimaram que reduzir uma unidade percentual de PB representa 8% a menos de nitrogênio excretado nas fezes. No entanto, existem algumas inconsistências na literatura quanto à extensão da PB que pode ser reduzida sem afetar o desempenho e características de carcaça. A maioria dos relatórios sugerem redução de PB em mais de 3 a 4% leva a redução na taxa e eficiência de crescimento, mesmo quando todas as necessidades de nutrientes conhecidos são atendidas (GOMEZ et al., 2002). Além disso, rações com reduções excessivas de proteína bruta e com adição de aminoácidos sintéticos pode levar a deposição de gordura (FIGUEROA et al., 2002).

Uma das principais razões para redução da proteína dietética é econômica, mas a suplementação de alguns aminoácidos se faz necessária para que o balanço ideal entre esses seja garantido, devendo ser adicionados na dieta de modo a minimizar a excreção de nitrogênio na produção de suínos (TRINDADE et al., 2009).

Os suínos têm absorção mais rápida de aminoácidos suplementares, comparado a absorção de aminoácidos contidos nas proteínas dos alimentos. Quando os suínos receberam quantidade superior de aminoácidos suplementados, houve maior retenção de nitrogênio pelos animais, isso ocorre por haver melhoria no equilíbrio nos sítios da síntese de proteína. A quantidade de nitrogênio excretado via urina sofreu uma queda de 40%, quando houve redução de 4,5% de PB na ração PARTRIDGE et al. (1985). LIU et al. (2001) relataram que uma dieta de milho com 9,55% de PB enriquecido com aminoácidos como Lys, Thr, Trp, Met, Ile e Val pode levar a um crescimento e composição da carcaça igualada a de leitoas alimentadas com 15,17% PB sem adição de aminoácidos sintéticos. Estes autores também relataram que a supressão da isoleucina ou da Valina reduz o desempenho do crescimento de leitoas. SHELTON et al. (2001) avaliaram nove diferentes fontes de proteína

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para suínos em crescimento e terminação, assim, dietas com 9,35% de PB, as quais suplementou-se aminoácidos, diminuiu o desempenho durante o crescimento, mas não na fase de terminação.

A suplementação de aminoácidos permite redução no percentual de proteína bruta na dieta. Em suínos, foi verificado que a redução de 1% de proteína bruta com suplementação de aminoácidos reduziu entre 3 a 62% a excreção de nitrogênio (ROTZ, 2004). Embora CHIBA (1994), afirmou que os suínos não são afetados devido à variações diminutas no balanço de aminoácidos, portanto não influem nas características de carcaça dos suínos.

STAHLY et al. (1991) avaliando as implicações da redução de proteína em dietas para suínos mantidos em ambiente com altas temperaturas concluíram que em animais alimentados com teor de 19,8% de PB (alto), o ganho de peso foi inferior aos que foram submetidos a dietas com 16% de PB (baixo) suplementadas com L-lisina-HCl. Entretanto, na fase de 29 a 112 kg, foi demostrado que aumento da densidade da dieta, a partir da suplementação de aminoácidos prejudicou o desempenho de animais submetidos a temperaturas entre 21 e 32 ºC, no verão (MYER et al., 1998).

A necessidade de aminoácidos para os leitões é, por exemplo, diferente do crescimento de suínos ou a porcas em lactação (HENRY et al., 1992). Segundo OLIVEIRA et al. (2007) os aminoácidos essenciais precisam ser suplementados para impedir deficiências nutricionais, sobretudo em suínos machos inteiros.

Diferentes níveis de lisina são recomendados para suínos em fase inicial de 15 a 30 kg. Reunindo trabalhos compilando dados de dez empresas atuantes no Brasil, o valor médio de lisina total encontrado foi de 1,15% (BENATI, 1996). A exigência de lisina total para machos castrados de baixo e alto potencial genético de 0,80 e 1,10%, em dietas com nível de 14% de proteína foi definida em dietas formuladas de acordo com o conceito de proteína ideal (FRAGA, 2002).

A redução de 2 a 3% no teor de PB em dietas com adição de aminoácidos industriais não diminuiu o desempenho de suínos em crescimento e terminação (LOPEZ et al., 1994; TUITOEK et al., 1997; LIU et al., 1999). Contudo, a eficiência alimentar e o ganho de peso, consecutivamente, são prejudicados quando a concentração de proteína é reduzida por mais de três unidades percentuais (TUITOEK et al., 1997; LIU et al., 1999).

OLIVEIRA et al. (2002) e ZANGERONIMO (2006), avaliaram rações que foram formuladas de acordo com o conceito de balanço de aminoácidos, e notaram que havia proporção, em relação aos aminoácidos totais e os essenciais, e, mantendo tal proporção, resultaria no melhor uso dos aminoácidos e queda no desperdício na síntese de proteína.

De acordo com TRINDADE et al. (2009), a diminuição da proteína

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dietética, cerca de 4,0%, não influenciou o desempenho dos suínos, desde que fossem adicionados os aminoácidos limitantes, a redução do comprimento de caraça dos suínos foi influenciada com a redução da proteína, bem como o ganho de gordura corporal dos suínos.

DI CAMPOS et al. (2004), constataram que ao reduzir o nível de proteína bruta da ração de 18% para 14%, em animais machos castrados com cerca de 30 kg de peso vivo, não houve mudança no desempenho dos suínos, quando as rações eram suplementadas com os aminoácidos essências, o que também foi evidenciado em (FERREIRA et al., 2003) que por sua vez não verificaram resultados negativos ao reduzir o nível de PB. Contudo, tais resultados contrastam com o que foi relatado por FIGUEROA et al. (2000), que ao reduzir o nível de PB da dieta acima de 4%, notaram que prejudicou a eficiência alimentar e o ganho de peso dos suínos.

A lisina é considerada o primeiro AA limitante em rações a base de milho e farelo de soja para suínos em crescimento, sendo responsável por respostas de desempenho e composição de carcaça. Isto se deve à sua alta presença na proteína corporal e seu destino metabólico preferencial para a deposição de tecido muscular. As exigências diárias de lisina necessitam ser estabelecidas com base no ganho diário de proteína ou tecido muscular, uma vez que existe certa dissociação entre o consumo de lisina e energia e seus efeitos sobre as deposições de proteína e lipídios (KESSLER, 1998). Para SALDANA et al. (1994) a treonina é o segundo ou terceiro aminoácido limitante em rações de suínos e pode tornar-se o primeiro quando é feita a suplementação com lisina sintética.

Considerado um dos primeiros aminoácidos limitantes para aves e suínos em rações à base de milho e farelo de soja, a metionina é um importante mediador em diversas funções metabólicas, sobretudo como “primer” na síntese proteica. Rações com déficit de metionina aumentam o catabolismo proteico colaborando para a deposição de gordura (SOLBERG et al., 1971). Para BAKER (1991) na forma de S-adenosimetionina, a metionina se torna um importante doador de radicais metil, primordial para a biossíntese de substâncias importantes envolvidas no crescimento dos animais, como creatina, carnitina, poliaminas, epinefrina, colina e melatonina.

O triptofano também é importante para a deposição proteica, uma vez que, rações deficientes em triptofano diminuem a eficiência de utilização dos primeiros aminoácidos limitantes, além de ser importante no sistema imunológico e ter nos seus metabólitos os principais produtos envolvidos na regulação do consumo e do estresse (HENRY et al., 1992). É precursor da serotonina, ácido nicotínico e melatonina. Estudos relatam que a serotonina é um metabólito importante na regulação do apetite. Contudo, recentemente, foi percebido que este aminoácido estimula a produção do hormônio grelina no

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plasma e sua expressão no duodeno e estômago, ocasionando um aumento no consumo de ração (ZHANG et al., 2006).

Em processos inflamatórios a exigência de triptofano é maior, devido ao seu desempenho intermediário no sistema imunológico. Entre as hipóteses que podem ser consideradas uma delas é que o aumento do catabolismo do triptofano seja induzido pelas citocinas, especialmente o interferón, e outra é que o fígado aumenta a demanda de triptofano para gluconeogênese e síntese de proteínas na fase aguda (AJINOMOTO, 2003).

A valina é um aminoácido codificado pelo código genético, alifático, de cadeia ramificada e semelhante à leucina e a isoleucina, tanto em estrutura como em função. Seu papel é determinar a estrutura tridimensional das proteínas, representando cerca de 5% das proteínas do organismo. As rações suplementadas com lisina, treonina, metionina, e triptofano industriais, quatro primeiros aminoácidos limitantes, terá o nível de proteína bruta ajustada pela exigência de valina, próximo aminoácido limitante, o qual deve ser fornecido na forma de proteína integra do alimento ou pela valina industrial (AJINOMOTO, 2003).

Para FERREIRA et al. (2007) a fenilalanina, segundo as características químicas de essencialidade e de direção no catabolismo, é classificado como aromático de caráter hidrofóbico e com catabolismo tanto glicogênico como cetogênico. Precursor na síntese da tirosina que transfere seu anel aromático para a síntese dos hormônios como a tiroxina, adrenalina e noradrenalina, essenciais na adaptação do animal às mudanças ambientais.

A histidina é classificada como um aminoácido essencial, básico, de caráter hidrofílico e com catabolismo exclusivamente glicogênico (LEHNINGER et al., 1995). Assim como a fenilalanina, é constituinte de tecidos e estruturas protetoras, pele, plumas, matriz óssea, ligamentos, bem como órgãos e músculos (NRC, 1994). Esse aminoácido é reconhecido como precursor do hormônio histamina que tem como função principal o desencadeamento dos sintomas alérgicos. Já foi muito estudada por seu papel na estimulação da resposta inflamatória da pele e das membranas mucosas, tendo uma ação essencial na proteção e como barreira durante uma infecção (LEHNINGER et al., 1995). Estimula a secreção digestiva de gastrina, hormônio que ativa a produção de ácido clorídrico e pepsinogênio, indispensáveis para a digestão da proteína da dieta e que é requerida para regular o uso de microminerais como cobre, zinco, ferro, manganês e molibdênio (BERDANIER, 1998).

Considerado um aminoácido glucogênico, a arginina tem função importante em dietas de leitões dos 3 aos 20 dias de idade (FULLER, 1994). Para WU, et al. (1995) este aminoácido é o mais abundante carreador de nitrogênio no tecido muscular, sendo o regulador do máximo crescimento em jovens mamíferos.

208

CONSIDERAÇÕES FINAIS Os aminoácidos industriais possibilitam a redução do conteúdo

proteico da dieta sem comprometer o rendimento dos animais e permitem redução na excreção de nitrogênio para o meio ambiente. Suprir as exigências nutricionais, através de dietas suplementadas com aminoácidos, permite-se aos animais a caracterização do seu potencial genético, benefícios econômicos e ambientais na produção.

AGRADECIMENTOS

Á Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Programa de Estudantes-Convênio de Pós-Graduação (PEC-PG).

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214

CAPÍTULO 12

UTILIZAÇÃO DE BIODIGESTORES COMO ALTERNATIVA PARA O TRATAMENTO DE DEJETOS ORIUNDOS DA PRODUÇÃO

ANIMAL

Tainá Silvestre Moreira1, Roberta Ferreira Carvalho1, Eduardo Cuelar Orlandi Cassiano1, Diana Carolina Zapata Vazquez1, Ricardo Galbiatti Sandoval Nogueira1, Lizbeth Collazos Paucar2, Flavio Perna Junior1,

Paulo Henrique Mazza Rodrigues3

1Alunos de pós-graduação do Departamento de Nutrição e Produção Animal - FMVZ/USP, Av. Duque de Caxias Norte, 225, CEP:13635-900, Campus de Pirassununga-SP.2 Aluna de Doutorado da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos FZEA/USP, Av. Duque de Caxias Norte, 225, CEP:13635-900, Campus de Pirassununga-SP3Professor do Departamento de Nutrição e Produção Animal e Bolsista em Produtividade de Pesquisa do CNPq – VNP/FMVZ/USP, Av. Duque de Caxias Norte, 225, CEP:13635-900, Campus de Pirassununga-SP.

INTRODUÇÃO O Brasil ocupa posição de destaque na produção pecuária, sendo importante fornecedor de proteína animal para a população mundial. Apesar de sua importância, a pecuária brasileira, vem sendo criticada por emitir quantidades significativas de gases de efeito estufa (GEE). Grande parte dessa emissão é oriunda da fermentação entérica e dos dejetos gerados durante o processo de produção, sendo responsáveis pela emissão principalmente de metano (CH4), óxido nitroso (N2O) e dióxido de carbono (CO2) Em sistemas de produção intensiva, além do impacto ambiental gerado pela emissão dos GEE outros fatores são relacionados ao acúmulo de dejetos, como a geração de resíduos líquidos com altas concentrações de carga orgânica. A pecuária também exerce um papel importante no sequestro de carbono, por parte das pastagens bem manejadas e a integração lavoura pecuária, aumentando a eficiência na utilização de insumos e redução das emissões de metano dos animais em pastejo, em função dos ganhos em termos de quantidade e qualidade da forragem em comparação ao sistema convencional. Vários fatores podem interferir sobre a produção de metano dos dejetos, destacando a qualidade dos sólidos voláteis contidos nos dejetos. Segundo Moller et al. (2004), a produção de metano é dependente da composição química dos compostos orgânicos (carboidratos, lipídios e proteínas) contidos nas fezes, urina, palhas e camas, que podem fazer parte do resíduo total. Há uma grande variação na composição dos resíduos

215

de origem animal devido a alguns fatores, como: a espécie e categoria animal, tipo da dieta, uso de cama e a taxa de degradação dos resíduos. Técnicas nutricionais, como o uso de ionóforos, tanino, saponinas, óleos essências, lipídios, vacinas, anticorpos policlonais, técnicas de manejo de pastagens e melhoramento genético, assim como a busca por fontes renováveis e limpas, como os biodigestores, esterqueiras, tanques ou lagoas de retenção, lagoas de sedimentação, canais de drenagem, surgem como alternativas para reverterem, controlar e mitigar os problemas causados pelos GEE. A utilização de biodigestores é uma alternativa tecnológica para o gerenciamento dos dejetos, que permite a agregação de valor ao resíduo mediante a utilização de biofertilizantes e de biogás produzido em sistemas de geração de energia e calor (Perdomo et al., 2003). São classificados em dois tipos: contínuos e batelada, dentre os contínuos tem-se os modelos Chinês e Indiano, neste tipo de sistema a matéria-prima é colocada continuamente e quase sempre diretamente, tendo uma produção continua de biogás e biofertilizante, onde a produção só cessa quando falta matéria prima, provocando parada no sistema. Os modelos podem ser divididos de acordo com seu posicionamento sobre o solo: vertical ou horizontal (Comastri Filho, 1981). O tipo batelada é abastecido uma única vez, é mantido em fermentação por um período desejado, após o término da produção de biogás o material é descarregado. O biogás é gerado através da fermentação anaeróbia, de dejetos animais e resíduos vegetais, dentro de condições adequadas, resultando em uma mistura gasosa de CH4 e N2O, este produto se torna muito interessante, pois se trata da conversão de algo poluente em uma fonte de energia. Seu potencial energético pode ser aproveitado por intermédio da queima e obtenção de energia térmica. A geração do biogás trás aos produtores uma opção energética renovável de ótimo rendimento, custeando os gastos em energia elétrica externa e proporcionando energia limpa e distribuição correta dos efluentes gerados. Segundo Castanon (2002), o potencial energético do biogás está em função da quantidade de metano contida no gás que determina o seu poder calorífico. Grande parte dos nutrientes, ingeridos na dieta, são eliminados via fezes e urina e não são degradados, após a biodigestão 50% do nitrogênio presente se transforma na forma de amônia dissolvida, prontamente assimilável pelas plantas (Nogueira, 1986). A biomassa resultante do processo de biodigestão conhecida como biofertilizante possui alto poder fertilizante. De acordo com Kiehl (1985), para o dejeto se tornar um fertilizante orgânico humificado deve sofrer um processo de fermentação microbiológica. A finalidade da fermentação é produzir um material humificado semelhante à matéria orgânica natural do solo (Malavolta, 1979). Os biofertilizantes podem ser utilizados em substituição aos fertilizantes convencionais, proporcionando aos produtores uma redução nos custos de produção, além de contribuir com a sustentabilidade ambiental.

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Esta revisão tem o objetivo de apresentar a utilização de biodigestores, como uma ferramenta para a redução na produção de metano, óxido nitroso e dióxido de carbono em busca de uma produção animal economicamente viável e sustentável.

IMPACTO AMBIENTAL DE DEJETOSNo Brasil, grande parte das emissões de metano de origem entérica

é decorrente de bovinos criados em sistemas extensivos, em pastagens que se encontram abaixo de seu potencial produtivo, acarretando assim ineficiência ao processo produtivo, gerando maiores emissões de metano por unidade de produto, seja carne ou leite. (Guimarães Jr. et al., 2010; Lima 2002; Machado et al., 2011).

Dentre os GEEs, o dióxido de carbono (CO2), o metano (CH4) e o óxido nitroso (N2O) são os mais importantes no âmbito da atividade agropecuária. Apesar das concentrações de metano e óxido nitroso na atmosfera serem menores que a de CO2, esses gases apresentam potencial de aquecimento 23 e 296 vezes maior em relação ao CO2, respectivamente (Snyder et al., 2008).

Com sua taxa de crescimento anual de 7%, o gás metano apresenta potencial de aquecimento global 23-25 vezes maior que o CO2 e seu tempo de vida na atmosfera varia de 9 a 15 anos (IPCC, 2006).

Dentre as fontes antrópicas de emissão de CH4, a fermentação entérica dos ruminantes contribui com 22% da produção mundial, correspondendo a 3,3% dos GEE (USEPA, 2000). Já a emissão de metano pela fermentação das fezes no ambiente quando comparada à produção entérica é bem inferior, representando 1,6% dos GEE. A emissão de metano pela excreção fecal é variável em função do manejo do dejeto, com maiores taxas de emissão para dejeto oriundo de confinamento em relação ao dejeto depositado diretamente nas pastagens. (Brasil, 2009; Chizzotti et al., 2012)

Estima-se que no Brasil as áreas de pastagens degradadas ocupem entre 20 a 60 milhões de hectares, o que representa um grande potencial de sequestro de carbono (Bernedet, 2010). A partir do ano de 2010, o governo brasileiro instituiu o Programa para Agricultura de Baixa Emissão de Carbono (Programa ABC), por meio do qual são destinados recursos para financiar práticas adequadas, tecnologias adaptadas e sistemas produtivos eficientes que contribuam para a mitigação da emissão de GEEs na agropecuária (Brasil, 2010). Com a recuperação das pastagens degradadas e um manejo adequado, observa-se um sequestro de carbono pelas pastagens no solo, em função do crescimento radicular que é um dos drenos de carbono com grande potencial no Brasil. Portanto, ao invés de reduzir nossa produção, temos que intensificá-la, apenas com o cuidado de agregar eficiência aos sistemas de produção (Almeida & Medeiros, 2013).

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Recentemente, a integração Lavoura-Pecuária (iLP) têm sido reconhecida como estratégia para redução das emissões de GEE pela agropecuária. Entre os fatores positivos decorrentes da adoção da iLP podem ser citados: a redução do avanço da fronteira agrícola (efeito poupa-terra), mitigação das emissões de carbono devido ao aumento no teor de matéria orgânica no solo, aumento na eficiência no uso de insumos e redução das emissões de metano dos animais em pastejo, em função dos ganhos em termos de quantidade e qualidade da forragem em comparação ao sistema convencional (Martha Jr. et al., 2006; Machado et al., 2011; Vilela et al., 2011; Vilela et al., 2012).

Já o óxido nitroso, considerado um potente GEE é gerado naturalmente nos solos pelo processo de nitrificação e desnitrificação. As emissões de óxido nitroso pela agropecuária representam 90,6% das emissões nacionais deste gás e são provenientes principalmente da emissão dos solos. Apesar da baixa emissão por unidade de área, como a área de pastagens no país é muito grande, a emissão pelas pastagens representa cerca de 39,4% das emissões de óxido nitroso pelas atividades agropecuárias. A entrada de nitrogênio (N) no sistema solo-atmosfera agregada a outros fatores estimula a produção deste gás, e por isso, a grande quantidade de N contido nas excretas dos bovinos, tanto na urina quanto nas fezes, faz com que os dejetos resultem como a mais importante fonte de N2O em pastagens. Sua emissão via decomposição de dejetos é altamente variável e dependente do manejo aplicado ao dejeto (Lessa, 2011; Oliveira et al., 2011).

Para gado de leite, de 20 a 30% do nitrogênio consumido diariamente encontram-se na proteína do leite e na carne produzida, sendo o restante excretado pelas fezes e urina. Para gado de corte a eficiência de uso do nitrogênio é ainda menor, cerca de 10%. Dessa forma, dietas com excesso de proteína resultará em maiores custos com alimentação além do aumento na excreção de N e assim como maiores quantidades de óxido nitroso serão emitidas, contribuindo negativamente para o aquecimento global (Chizzotti et al., 2012; Dou et al., 1996; Kohn et al., 1997; Oenema et al., 2001; Hutchings et al., 1996).

Para emissão de GEE a partir de suínos e aves, há escassez de estudos no Brasil. Entre os poucos trabalhos existentes na área de suínos, podem ser citados alguns estudos de emissão de gás carbônico em solos adubados com dejetos de suínos (Giacomini & Aita, 2008) e avaliações de potencial de redução de emissão através do uso de sistemas de tratamentos, tais como biodigestores (Angonese et al., 2007).

Na área de avicultura, as pesquisas se limitam às avaliações de teores de amônia, a qual não é diretamente causadora de efeito estufa, em ambientes confinados de aviários visando a questão do bem estar animal (Owada et al.,

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2007) e estudos de aditivos com potencial mitigador da volatilização desse gás em aviários (Medeiros et al., 2008). Neste sentido, é evidente a carência que existe no país de informações consistentes, sobre a real colaboração da produção intensiva de suínos e aves na emissão de GEE e também do potencial de mitigação da emissão destes gases, quando são adotadas ações para tratamento alternativo de dejetos (Oliveira et al., 2011).

BIODIGESTÃO ANAEROBIAAtualmente a tendência na produção animal é promover sua

sustentabilidade, buscando o máximo rendimento com o mínimo desperdício, objetivando assim, reduzir os impactos ambientais e melhorar a eficiência. Uma alternativa para minimizar os impactos causados pela grande geração de resíduos são os processos biológicos de reciclagem de nutrientes. Estes processos utilizam os resíduos provenientes da produção animal como matéria prima para a geração de subprodutos de valor agregado, tornando a atividade técnica e economicamente viável. A biodigestão anaeróbia é um processo fermentativo, causado por microrganismos especializados que atuam em reações específicas, decompondo a matéria orgânica na ausência de oxigênio, ocorrendo uma complexa interação de microrganismos (Craveiro et al., 1982). As bactérias são responsáveis pela digestão de diversos componentes orgânicos, gerando biogás e biofertilizante (Chernicharo, 2007; Rizzoni, 2012). Biodigestão anaeróbia é um processo sensível, podendo ser dividido em quatro fases:

1. Hidrólise enzimática - materiais orgânicos complexos são hidrolisados e convertidos em moléculas menores por meio da fermentação;

2. Acidogênese - moléculas menores resultantes da hidrólise são metabolizadas por bactérias, convertendo-se em diversos compostos simples;

3. Acetogênese - microrganismos acetogênicos convertem os produtos da acidogênese, resultando em hidrogênio, dióxido de carbono e acetato;

4. Metanogênese - processo das arqueas metanogênicas, convertem os substratos que produzem metano a partir dos acetatos, hidrogênio e dióxido de carbono.

Esses processos necessitam de alguns fatores para melhor aproveitamento do sistema como: temperatura, tempo de retenção, tipo de resíduo, pH, relação carbono/nitrogênio e qualidade de água (Chernicharo, 2007; Rizzoni, 2012; Leite, 2003; Fisher et al., 1979; Lucas Jr, 1998, Madigan, 2010).

O valor do pH é um fator que influencia o desempenho do processo de biodigestão anaeróbia. Alguns estudos mostram o pH de 6,0 a 8,0 como sendo a faixa ótima para a fermentação anaeróbia (Batista, 1981).

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Porém, a faixa ótima de pH para digestão anaeróbia de dejetos de bovinos é de 6,7 a 7,4. (Ruiz, 1992; Bryant, 1979). O acréscimo de resíduos de origem animal ao processo de biodigestão anaeróbia promove aumento na produção de biogás em relação ao uso de resíduos de origem vegetal (Al-Masri, 2001). Segundo Lucas Jr (1994), o potencial de produção de biogás a partir dos dejetos de ruminantes deve sofrer variações em função da qualidade nutricional dos alimentos fornecidos aos animais, encontrando-se diferenças entre dejetos coletados a partir de animais que são criados em pastagens em relação aos de animais que recebem alimento concentrado. O potencial de produção de biogás de dejeto ovino, encontrado por Jain et al. (1981), foi de 0,0452 m3 kg -1de biogás. Segundo Nogueira et al. (2013), a partir de dejetos de bovinos de corte confinado foi de 0,056 m3 de biogás, com o teor médio de 79,6% de metano, resultando em um potencial de produção diário de metano de 0,043m3 deste gás por quilograma de dejeto in natura. Lucas Jr (1987) encontrou maior eficiência na conversão de dejetos de bovinos em biogás (0,048m3 kg -1 de dejetos). Segundo Hardoin et al. (2004), em um confinamento de 100 vacas, um biodigestor pode produzir um volume de 118 m3 de biogás, volume suficiente para atender com energia elétrica a demanda da ordenhadeira, do resfriador de leite, do triturador, do desintegrador, do misturador de ração e da bomba de água., Nascimento (1991) encontrou potencial de produção de biogás de 0,08692 m3 kg -1 em biodigestores com dejetos de ovinos e capacidade de carga de três litros. Misi & Forster (2001) avaliaram biodigestores com misturas à base de dejetos de caprinos, ovinos e bovinos (70%) e resíduos do processamento de frutas e cama de frangos (30%), encontrando valores de produção total de 4.189,50 mL de CH4 em 35 dias de retenção em biodigestores com capacidade de 1.000 mL.

BIODIGESTORESUm biodigestor compõe-se, basicamente, de uma câmara fechada na

qual uma biomassa (em geral detritos de animais) é fermentada anaerobiamente. É possível, portanto, definir biodigestor como um equipamento destinado a conter a biomassa e seu produto, o biogás. A função dos biodigestores é fornecer as condições propícias para que um grupo especial de bactérias, as metanogênicas, degrade o material orgânico, com a consequente liberação do gás metano (Dotto et al. 2012).

O biodigestor torna-se uma alternativa para o tratamento de dejetos, pois além de possibilitar a redução do potencial poluidor e dos riscos sanitários dos dejetos, promove a geração do biogás, que pode ser utilizado como fonte de energia renovável e permite a reciclagem do efluente, podendo ser utilizado como biofertilizante (Júnior, 2009).

Existem vários tipos de biodigestores, entre eles os contínuos, que

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proporcionam permanente fornecimento de gás e biofertilizante, como exemplo os modelos indiano (Figura 1 e 2) e chinês (Figura 3 e 4), e o modelo batelada, que o fornecimento de gás é interrompido para descarga do material digerido e nova carga do material a digerir (Figura 5) (Deganutti et al. 2002).

Em geral, os biodigestores são compostos, basicamente, de duas partes: um recipiente (tanque) para abrigar e permitir a digestão da biomassa, e o gasômetro (campânula), para armazenar o biogás. Dentro do biodigestor em total ausência de oxigênio e luz, as bactérias anaeróbias digerem a biomassa (Farret, 1999).

O tipo de biodigestor a construir vai depender dos seguintes parâmetros; quantidade e tipo de dejetos disponíveis, necessidade de energia, necessidade de fertilizante e necessidade de tratamento de dejetos. A construção de um biodigestor tem vantagens, por ser um processo natural para tratar rejeitos orgânicos, por requerer menos espaço que aterros sanitários, diminuir o volume de resíduo a ser descartado, ser uma fonte de energia renovável, produzir um combustível de alta qualidade e ecologicamente correto, entre outras.

MODELO INDIANOO modelo indiano caracteriza-se por possuir uma campânula, uma

espécie de tampa, como gasômetro, a qual pode estar mergulhada sobre a biomassa em fermentação, ou em um selo de água externo, e uma parede central que divide o tanque de fermentação em duas câmaras. A função da parede divisória faz com que o material circule por todo o interior da câmara de fermentação. Este modelo possui pressão de operação constante, ou seja, à medida que o volume de gás produzido não é consumido de imediato, o gasômetro tende a deslocar-se verticalmente, aumentando o volume deste, portanto, mantendo a pressão no interior constante (Deganutti et al., 2002). O resíduo a ser utilizado para alimentar o biodigestor indiano, deverá apresentar uma concentração de sólidos totais (ST) não superior a 8%, para facilitar a circulação do resíduo pelo interior da câmara de fermentação e evitar entupimentos dos canos de entrada e saída do material. O abastecimento também deverá ser contínuo, ou seja, geralmente é alimentado por dejetos bovinos e/ou suínos, que apresentam certa regularidade no fornecimento de dejetos.

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Figura 1. Processos do biodigestor

Figura 2. Representação tridimensional em corte do biodigestor modelo indiano

MODELO CHINêSO modelo chinês é constituído por uma câmara cilíndrica em

alvenaria para a fermentação, com teto abobado, impermeável, destinado ao armazenamento do biogás. Este tipo de biodigestor funciona com base no princípio de prensa hidráulica, portanto, há aumento da pressão do gás no interior do biodigestor, deslocando a biomassa, em sentido contrário, da câmara de fermentação para a caixa de saída, quando há descompressão. Neste tipo de biodigestor, uma parcela de gás formado na caixa de saída é liberada para a atmosfera, reduzindo parcialmente a pressão interna do gás. Por este motivo as construções de biodigestores modelo Chinês não são utilizadas para instalações de grande porte. O substrato deverá ser fornecido continuamente, com a concentração de sólidos totais em torno de 8%, para evitar entupimentos do sistema de entrada e facilitar a circulação do material (Deganutti et. al, 2002).

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Figura 3. Processos do biodigestor modelo Chinês

Figura 4. Representação tridimensional em corte do biodigestor modelo chinês

MODELO BATELADA Modelo batelada é um sistema simples de ser construído, composto

apenas pela câmara de biodigestão cilíndrica, e pelo gasômetro móvel, com formato cilíndrico. Este tipo de biodigestor é abastecido de uma única vez, portanto não é um biodigestor contínuo, como os modelos chinês e indiano, mantendo-se em fermentação por um período conveniente, sendo o material descarregado posteriormente após o término do período efetivo de produção de biogás. Enquanto, que os modelos chinês e indiano são usados para atender propriedades em que a disponibilidade de biomassa ocorre em períodos curtos, um exemplo seria aquelas que recolhem o gado duas vezes ao dia para ordenha, permitindo coleta diária de biomassa, que deve ser encaminhada ao biodigestor,

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o modelo em batelada adapta-se melhor quando essa disponibilidade ocorre em períodos mais longos, como ocorre em granjas avícolas de corte, cuja biomassa fica a disposição após a venda dos animais e limpeza do galpão (Deganutti et. al, 2002).

Figura 5. Representação tridimensional em corte do biodigestor modelo batelada

BIOGÁSDe acordo com Paula (2006), um dos benefícios do processo de

biodigestão anaeróbia, que logo contribuiu para o crescente interesse por esta tecnologia, reside na conversão da maior parte da carga poluente do efluente numa fonte de energia: o biogás. Atribui-se o nome de biogás à mistura gasosa (combustível), resultante da fermentação anaeróbia da biomassa dentro de determinados limites de temperatura, teor de umidade e acidez. O biogás é inflamável e inodoro, porém, se houver presença de ácido sulfídrico, pode possuir odor desagradável, semelhante a ovo podre.

A geração de biogás a partir de resíduos animais é dependente, além da temperatura, pH, alcalinidade, também da própria característica do resíduo, que é o substrato para o crescimento dos microrganismos no biodigestor. Essa diferença na produção de biogás esta associada a vários fatores como, dieta dos animais, sistema digestivo, que fazem com que sejam produzidos resíduos de características distintas com potencialidades distintas na produção de biogás (Tabela 1) (Kunz & Oliveira, 2013).

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Tabela 1. Potencial de geração de biogás a partir de resíduos de diferentes animais.

Fonte: Oliveira (1993). SV=sólidos voláteis.Mesquita (2009) identificou as quantidades de biomassa necessária para produzir 1m3 de biogás (Tabela 2).

Tabela 2. Quantidade de biomassa necessária para a produção de 1m3 de biogás.

Fonte: Mesquita (2009)

Segundo Castanon (2002), o potencial energético do biogás está em função da quantidade de metano contida no gás, que determina o seu poder calorífico. O teor de metano varia, de 40 a 75%, dependendo da fonte geradora.

Tabela 3. Composição média do biogás proveniente de diferentes resíduos orgânicos.

Fonte: Castanon (2002).

O biogás, por ser extremamente inflamável, pode ser simplesmente queimado para reduzir o efeito estufa (o metano apresenta um poder estufa cerca de 21 vezes maior que o CO2) ou aproveitado para uso doméstico, motores de combustão interna, sistemas de geração de energia elétrica ou térmica (Oliveira et al., 2000). Guyot (1997) descreveu uma relação comparativa do biogás com outras fontes convencionais de energia (Tabela 4).

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Tabela 4. Relação comparativa de 1m3 de biogás com outras fontes de energia.

Fonte: Guyut (1997).

Para transformação do biogás em energia elétrica é necessária a utilização de geradores, para obtenção de energia térmica faz-se necessário o uso de fornos para que ocorra a queima e sua transformação em energia térmica (Avellar et al., 2004). Em propriedades familiares, o principal benefício da utilização do biogás é a substituição da querosene, lenha ou GLP, principalmente por meio da cocção direta e iluminação (Rodriguez et al., 1998). De acordo com Werner et al.(1989) a produção de biogás de um biodigestor simples com volume de 8 a 10 m3 é da ordem de 1,5 a 2 m3/dia, usando os dejetos de 3 a 5 vacas ou de 8 a 12 suínos. Essa quantidade é suficiente para que uma família de 6 a 8 membros possa cozinhar 2 a 3 refeições ou operar uma geladeira por todo dia e duas lambadas por 3 horas. Oliveira & Hirashi (2006) desenvolveram um trabalho em uma granja de suínos e aves, no qual, a granja possuía 400 suínos na fase de crescimento e terminação e 14.400 aves. A propriedade possuía um biodigestor para tratamento dos dejetos suínos. Substituiu-se todo o sistema de aquecimento de GLP das aves por biogás. Os autores concluíram que os dejetos produzidos diariamente por 400 suínos foram suficientes para gerar biogás como fonte de aquecimento para 14.400 aves. Esperancini et al. (2007) avaliaram o uso do biogás gerado pelos dejetos de suínos na substituição de fontes de energia num assentamento rural. No uso domiciliar, o biogás foi aproveitado na cocção, aquecimento de água e iluminação. A economia anual foi de R$ 3.698,00, e a recuperação do investimento ocorreu em 2,5 anos. Na produção, a energia foi utilizada em diversos equipamentos. A economia anual foi de R$ 9.080,57, e o investimento foi recuperado em 11 meses. Oliveira & Martins (2007) estudaram a viabilidade econômica do uso de um gerador disponibilizando 40 kWh, utilizando biogás da suinocultura, e concluíram que esta alternativa é viável à medida que aumentam a demanda e o preço da energia. Com uma tarifa de R$ 200,00 MWh-1, o tempo de retorno do investimento, considerando desconto da taxa de juros, foi de 39; 26 e 19 meses para tempos de geração diária de 10; 14 e 18 horas, respectivamente.

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O resfriamento do leite geralmente requer de 100 a 120 MJ de energia elétrica por tonelada de produto, incluindo o processo de bombeamento do leite e da água para lavar os recipientes e equipamentos (Riva, 1992). O pré-resfriamento do leite produzido por uma só vaca requer apenas 15% do potencial de geração de biogás dessa mesma vaca (Mears, 2001). Segundo Zicari (2003), com a utilização do biogás em uma fazenda leiteira com 300 vacas, pode-se economizar pelo menos US$ 2.000,00, enquanto que para uma fazenda com 1.000 cabeças essa economia pode chegar a US$ 7.000,00. A respeito da capacidade de produção de biogás, Souza et al. (2004) afirmam que, o tamanho das propriedades de suinocultura influi no volume de produção do biogás, sendo que estas podem variar de pequenas propriedades, com capacidade de 100 matrizes, até grandes propriedades, com mais de 2.500 matrizes. Dado que o índice teórico de produção de resíduo é de 72 litros dia-1 suíno-1, resultando em 0,775 média-1suíno-1 de biogás. Almeida et al. (2008), cita para uma eficiência do processo de 60,5%, tem-se a produção de metano em função da carga orgânica de 0,504 m3dia-1suíno-1. Noronha & Gimenes (2008) afirmam que em granja suinocultura operando em ciclo completo, com 200 matrizes, a produção de dejeto chega a 4.146,3 m³ano-1, gerando uma produção média de 1.762,18 m³ de biogás, cerca de 0,025 m3dia-1suíno-1. Este volume permitiria que o sistema gerador de energia elétrica funcionasse por um período de 6 horas diárias.

BIOFERTILIZANTESNos últimos anos, a utilização de adubos orgânicos, sólidos ou líquidos,

na produção agrícola teve um crescimento acelerado no Brasil, em função dos seguintes aspectos: altos custos dos fertilizantes químicos, conservação dos recursos do meio ambiente, a prática de uma agricultura ecológica, melhoria da qualidade dos produtos colhidos, redução de contaminações do solo, água, planta, homem e todos os organismos vivos componentes dos agroecossistemas (Araújo et al., 2007; Alves et al., 2001).

Após todo o processo de produção do biogás, é gerada a biomassa, que podemos denominar de biofertilizante. Esse biofertilizante poderá ser utilizado como adubo orgânico de várias formas, seja ele aplicado diretamente no solo, pleiteando a melhora dos nutrientes no solo, ou como adubo foliar. O biofertilizante é a designação dada ao efluente líquido obtido da fermentação metanogênica da matéria orgânica e água (Santos, 2001). Alves et al. (2001), o definem como resíduo final da fermentação de compostos orgânicos que contêm células vivas ou latentes de microrganismos (bactérias, leveduras, algas e fungos filamentosos) e seus metabólicos. Tais microrganismos auxiliam o cultivo de plantas, na absorção de nutrientes pelas suas interações na rizosfera, sejam quando aplicados em sementes ou solo (Mishra & Dadlich,

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2010). Aceleram certos processos microbianos no solo, que aumentam o grau de disponibilidade de nutrientes, em uma forma facilmente assimilável pelas plantas, e também mobilizando elementos nutritivos da forma não-utilizáveis para a forma utilizável, por meio de processos biológicos (Tnau, 2008).

Os dejetos orgânicos são descartados no ambiente, podendo contaminar água e solo, uma vez que possuem alto teor energético e quantidades expressivas de macro e micronutrientes, e por oferecerem água, abrigo e temperatura a inúmeros micros e macrovetores de grande importância sanitária acabam sendo preferidos como nicho ecológico (Amaral et al., 2004). Neste contexto, a utilização de biofertilizantes, produzidos em biodigestores anaeróbios, pode ser uma alternativa interessante ao se reaproveitar dejetos orgânicos.

Qualquer material, de origem orgânica, submetido a processos de biodigestão anaeróbia, produz biogás e biofertilizante (Vilella Jr. et al., 2003). Os biofertilizantes são fáceis de serem obtidos, em decorrência de que geralmente são compostos de excrementos de animais e encontrados sem dificuldade, podendo, esses produtos, serem produzidos pelo próprio agricultor, gerando economia com insumos importados e, ainda, promovendo melhorias no saneamento ambiental (Medeiros et al., 2007).

A matéria orgânica, adicionada ao solo, promove modificações na fertilidade através de alterações, provocadas em suas propriedades químicas e físicas, como, densidade do solo, estado de agregação das partículas, aeração, capacidade de retenção de água e condutividade hidráulica e elétrica do solo (Nobile, 2006). As áreas degradadas são melhor recuperadas quando há a incorporação de matéria orgânica ao solo, pois melhora a estrutura e a retenção de umidade e fornece macro e micronutrientes (Santos & Rodella, 2007).

De forma indireta, as propriedades físicas do solo podem ser melhoradas através de um efeito floculante, próprio da matéria orgânica, que melhora o movimento do ar, da água e dos nutrientes, o que permite incrementar o crescimento e a penetração de raízes no solo (Chaimsohn et al., 2007). A matéria orgânica, fornecida a partir de esterco animal e compostos orgânicos, além de melhorar características físicas e químicas do solo, tem sido utilizada a fim de reduzir a aplicação de adubos químicos (Galbiatti et al., 2007).

A digestão anaeróbia utiliza carbono, hidrogênio e oxigênio da matéria prima. Enquanto isso, os nutrientes essenciais de plantas (nitrogênio (N), fósforo (P) e potássio (K)) permanecem na biomassa dos biodigestores (Igboro, 2011). A disponibilidade de nutrientes é maior do que em digestores de lixo orgânico não tratado. Por exemplo, digestores apresentam disponibilidade 25% superior de nitrogênio inorgânico (N-NH4) e um valor de pH mais elevado do que o estrume líquido não tratado (Monnet, 2003). A qualidade e composição do sólido proveniente da digestão dependem da matéria prima e o

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do processo de digestão (Mata-Alvarez et al., 2003). Além do que, o material digerido é separado em duas frações: a fibra e o efluente líquido. A fibra, porção volumosa, possui um baixo nível de nutrientes para as plantas, portanto, pode ser usado como um fertilizante de baixa qualidade e como condicionador do solo, embora o tratamento posterior da fibra, tal como através da compostagem possa produzir um composto de boa qualidade. Já a fração do efluente líquido contém uma grande proporção de nutrientes e pode ser utilizado como adubo. O elevado teor de água deste efluente facilita a sua aplicação por meio de métodos convencionais de irrigação.

Apesar do grande benefício dos digestores anaeróbicos para a melhoria da fertilidade do solo, e consequentemente para a produção agrícola, tem-se uma preocupação quanto a concentração de patógenos presentes neste material e a segurança que este método oferece aos usuários finais (Mata-Alvarez et al., 2003). Os agentes patogênicos tais como Salmonella spp., Escherichia coli, Shigella spp., Klebsiella spp., entre outros, podem contaminar a lama dos biodigestores. Algumas das bactérias são resistentes e não são destruídas durante o período de digestão. Alguns agentes patogênicos sobrevivem melhor em condição úmida e estes organismos podem ainda estar presentes neste material, mesmo após a digestão (Karki et al., 2005). A disponibilidade de biofertilizante líquido no mercado tem aumentado como uma das alternativas para a utilização de fertilizantes químicos e pesticidas, um de seus benefícios é a população de microrganismos benéficos presentes (Hasarin & Viyada, 2008). Técnicas ineficientes de gestão agrícola e uso indevido de agrotóxicos resultaram em piora da qualidade do solo e degradação ambiental (Setboonsarng & Gilman, 1999). Portanto, o objetivo da utilização de biofertilizante é fornecer benefícios socioeconômicos e ecológicos, entre os quais está a melhoria da qualidade do solo, que contribui imensamente para a qualidade e segurança alimentar, saúde humana e animal, bem como a qualidade do meio ambiente (Park et al., 2002).

CONCLUSÃOCom a intensificação da produção animal e a crescente preocupação

pelo meio ambiente, tanto por parte do consumidor como por parte do produtor, torna-se importante o desenvolvimento de novas tecnologias para se aumentar a sustentabilidade da cadeia de produção.

A biodigestão anaeróbia dos dejetos atende as atuais exigências dos consumidores, que exigem a produção de alimentos ambientalmente corretos, assim como aos produtores, em função de seus produtos (biogás e biofertilizante), oferecendo soluções quanto ao fornecimento de energia elétrica e correção do solo, diminuindo os custos.

A eficiência do biodigestor em produzir biogás e biofertilizantes

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é dependente de vários fatores, como dito anteriormente, o que abre oportunidades de pesquisas na área de nutrição, manejo animal e de dejetos para estudar formas de melhorar a eficiência dos biodigestores.

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CAPÍTULO 13

AFLATOXINAS: CONSEQUêNCIAS SOBRE O DESEMPENHO PRODUTIVO E A SAÚDE, E ESTRATéGIAS PARA COMBATE AOS

PREJUÍZOS EM FRANGOS DE CORTE

Ágatha Cristina de Pinho Carão1; Diane Valganon de Neeff2; Gustavo do Valle Polycarpo1; Maria Fernanda de Castro Burbarelli1; Carlos Eduardo Bellinghausen Merseguel3; Pedro de Assunção Pimenta Ribeiro4; Rômulo Antunes1; Carlos Augusto Fernandes de Oliveira5; Ricardo de

Albuquerque6.

1Doutoranda(o) do Departamento de Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. 2Doutoranda do Departamento de Zootecnia da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo. 3Mestrando do Departamento de Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. 4Ex-aluno de Doutorado do Departamento de Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo. 5Docente do Departamento de Engenharia de Alimentos da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo. 6Docente do Departamento de Nutrição e Produção Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo.

RESUMO Micotoxinas são toxinas produzidas por fungos contaminantes

naturais de cereais e oleaginosas, que têm sua proliferação atrelada a condições ambientais como as do Brasil. As aflatoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos toxigênicos do gênero Aspergillus, como as espécies Aspergillus flavus, A. parasiticus e A. nomius. São amplamente encontradas em matérias-primas de alimentos para animais, em especial nos cereais, como milho, e têm a capacidade de levar a quadros clínicos agudos ou crônicos de aflatoxicose, caracterizados por, desde a morte por hepatite aguda até a diminuição do desempenho zootécnico por diminuição de peso ou consumo de ração. A aflatoxina B1 tem sido considerada o metabólito mais perigoso, uma vez que possui alto poder hepatotóxico, além de ser mutagênica e carcinogênica. É primordial que os profissionais envolvidos na produção de aves comerciais destinem especial atenção à qualidade da matéria-prima utilizada para a produção das rações utilizadas nas granjas; porém, é de suma importância que os mesmos não somente saibam reconhecer

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as alterações produtivas, mas que saibam claramente quais são as alterações de saúde causadas pelas aflatoxinas. Sendo assim, o objetivo deste capítulo é elucidar as principais alterações causadas à produção e à saúde das aves, bem como apresentar alternativa passível de ser usada para diminuição da absorção de aflatoxinas pelo trato digestório e o uso de antioxidante natural que visa abrandar os efeitos negativos causados pelas mesmas.

INTRODUÇÃO A avicultura é uma atividade pecuária muito importante para o Brasil, uma vez que é grande geradora de empregos à população e renda para a indústria nacional. Em destaque encontra-se a avicultura de corte, responsável pela maior parte das divisas geradas pela criação de aves industriais. O Brasil encontra-se na terceira posição no ranking mundial de produção de carne de frangos, situando-se na liderança da exportação de cortes para o globo. A situação sanitária das aves é um ponto crucial para o sucesso da atividade, uma vez que um animal saudável pode expressar todo o seu potencial genético para crescimento. Colaborando enormemente para o status sanitário dos animais está a nutrição, ferramenta que, quando bem utilizada, auxilia os frangos a produzirem carne por meio do aproveitamento máximo dos nutrientes constituintes das rações. As dietas das aves comerciais compõem-se basicamente de grãos, como o milho e o farelo de soja. Para que não haja perda financeira devido ao mal aproveitamento da ração, é preciso que a mesma tenha alto grau de inocuidade. As micotoxinas (toxinas produzidas por fungos) constituem-se problema corriqueiro para a produção animal, uma vez que os grãos são extremamente susceptíveis à contaminação fúngica, podendo levar à produção de compostos toxigênicos. A micotoxina com maior poder deletério à saúde dos animais é a Aflatoxina B1 (AFB1). Embora nunca encontrada isoladamente em dietas contaminadas, quando ingerida em pequenas doses há longo prazo leva a quadros de infecção crônica, com consequente queda de desempenho zootécnico e bem-estar devido a diminuição na qualidade de vida. Sob esta ótica, é importante estabelecer quais as principais consequências para a saúde avícola e para a indústria produtora de aves; bem como mostrar as principais alternativas de combate aos efeitos deletérios causados pela aflatoxicose crônica. Este capítulo tem por objetivo apresentar as principais consequências da intoxicação por aflatoxinas sobre a saúde das aves e o desempenho zootécnico, como também algumas alternativas que visam diminuir a perda econômica decorrente da contaminação.

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CONCEITOS GERAIS SOBRE MICOTOXINAS E SEUS EFEITOS SOBRE O DESEMPENHO ZOOTéCNICO Micotoxinas são metabólitos secundários produzidos por fungos que podem entrar na dieta de seres humanos e animais através da contaminação direta ou indireta de cereais e grãos. Uma vez ingeridas, as micotoxinas são difíceis de diagnosticar, induzindo, em muitos casos, síndromes brandas que podem facilmente ser confundidas com doenças causadas por outros microorganismos. De acordo com suas propriedades físico-químicas e a espécie animal envolvida, cada micotoxina pode afetar especificamente um órgão ou sistema, levando a manifestações clínicas específicas de natureza aguda ou crônica (Pier et al., 1973). As aflatoxinas são produzidas por fungos do gênero Aspergillus, como as espécies A. flavus, A. parasiticus e A. nominus, descobertas em 1960, após provocarem um surto tóxico em perus na Inglaterra (Turkey-X-disease). Neste surto, milhares de aves morreram após consumirem torta de amendoim na ração, e as aves doentes apresentaram necrose do tecido hepático (Asao et al.; 1963; Leeson et al., 1995). A produção de aflatoxinas é favorecida por vários fatores, especialmente pela umidade relativa do ar (superior a 80%), temperatura ambiental e condições de integridade e teor de umidade do substrato. O Aspergillus flavus e o A. parasiticus proliferam em temperaturas entre 32oC e 33oC. As aflatoxinas geralmente são produzidas entre 13oC e 42oC, embora entre 25oC a 30oC seja considerada temperatura ótima para sua síntese (Batatinha; Simas; Górniak, 2008). São conhecidos, atualmente, 17 compostos similares designados pelo termo aflatoxina, porém, os principais tipos de interesse médico-sanitário são identificados como B1, G1, B2 e G2 (Figura 1); sendo que a AFB1, além de ser a mais frequentemente encontrada em cereais, é que apresenta maior poder toxigênico (Leeson et al., 1995). As aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 foram classificadas como agentes carcinogênicos (grupo 1), para humanos, pela International Agency for Research on Cancer (IARC, 2002). A toxicidade das aflatoxinas depende de diferentes fatores, incluindo sua concentração, a duração da exposição, a espécie, o sexo, a idade e a condição de saúde dos animais (Jewers, 1990). Os animais jovens são mais susceptíveis aos efeitos das aflatoxinas, uma vez que seus sistemas enzimáticos hepáticos ainda não estão completamente desenvolvidos. De maneira geral, as aves são mais susceptíveis que os mamíferos, sendo animais adultos os mais resistentes (Batatinha; Simas; Górniak, 2008). A toxicidade (DL50) da aflatoxina em frangos é de 6,5-16,5 mg/kg (Spinosa et al, 2008).

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Figura 1. Estruturas químicas das aflatoxinas B1, B2, G1 e G2 (Fonte: Rawal et al., 2010).

Na aflatoxicose crônica, o sinal clínico mais evidente é a diminuição da taxa de crescimento de animais jovens (Leeson et al., 1995); porém, a síndrome tóxica aguda ocorre pela ingestão de alimento com alta concentração de aflatoxina, sendo os efeitos observados em curto espaço de tempo. Esta caracteriza-se principalmente pela rápida deterioração do estado geral do animal, perda de apetite, hepatite aguda, icterícia, hemorragias e morte (Osweiler, 1990). A síntese hepática de gorduras, bem como seu transporte para outras áreas do organismo, é seriamente afetada. A cor desse órgão varia de normal a amarelo pálido, podendo verificar-se o aparecimento de petéquias e grandes áreas hemorrágicas. Ocorre uma infiltração gordurosa no fígado, sendo que o grau de infiltração depende da dose e do tempo de intoxicação por aflatoxina, chegando a 68% de aumento em frangos de corte (Santurio, 2000). Na aflatoxicose não ocorrem erosões de moela, apesar de muitas aves com lesões características desta micotoxicose também apresentarem esse tipo de alteração. Isso parece ser um paradoxo, mas de acordo com Wyatt (1991), cerca de 36% das linhagens de Aspergillus flavus, além de produzirem aflatoxinas, também produzem outra micotoxina, o ácido ciclopiazônico, responsável por erosões na mucosa da moela. As aflatoxinas induzem a vários efeitos, tais como doenças hepáticas, alterações na taxa de crescimento, mudanças nos mecanismos imunogênicos, e efeitos carcinogênicos e mutagênicos em diferentes espécies animais, especialmente em aves domésticas (Pier et al., 1973). A aflatoxicose, envenenamento que ocorre da ingestão de aflatoxinas, é caracterizada em frangos pelo decréscimo de consumo de ração e de

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taxa de crescimento, além de pobre utilização de alimentos e mortalidade (Tedesco et al., 2004). Denli et al. (2009), após trabalhar com rações experimentalmente contaminadas com AFB1 também relataram haver redução do consumo de ração, do ganho de peso e aumento da conversão alimentar em aves ingerindo 1000mg/kg de AFB1, quando comparadas a aves não contaminadas. Resultados semelhantes são apresentados por Aravind et al (2003), os quais observaram diminuição no consumo de ração, no ganho de peso, além de piora na conversão alimentar de frangos alimentados com dieta naturalmente contaminada com micotoxinas (168µg de AFB1/kg de ração). Em decorrência da sua lipossolubilidade, as aflatoxinas são facilmente absorvidas no trato gastrintestinal, sendo então, distribuídas aos diferentes órgãos como músculos, rins, tecido adiposo e, principalmente, fígado, em que as maiores concentrações podem ser encontradas. Nesse órgão, tais toxinas são biotransformadas pelo sistema enzimático das oxidases de função mista (Batatinha; Simas; Górniak, 2008). A biotransformação das aflatoxinas constitui um processo complexo, com múltiplas vias, tais como epoxidação, hidroxilação, desmetilação e redução. Nas reações de primeira fase, as moléculas tornam-se mais hidrofílicas; na segunda fase, os compostos produzidos inicialmente são conjugados a substâncias endógenas (sulfatos, glutationa, grupos metil e acil) e, em seguida, excretados. Produtos resultantes do metabolismo das aflatoxinas são considerados responsáveis pelos seus efeitos tóxicos (Batatinha; Simas; Górniak, 2008).

EFEITOS DAS AFLATOXINAS SOBRE A FUNÇÃO HEPÁTICA DAS AVES

A determinação dos efeitos das aflatoxinas sobre a bioquímica hepática sérica é importante para o diagnóstico de aflatoxicose em frangos de corte (Rosa et al., 2001). Um dos principais efeitos da AFB1 é a inibição da síntese proteica, uma vez que a maioria das proteínas plasmáticas (albumina e globulinas) é sintetizada pelos hepatócitos (Stockham & Scott, 2011), causando assim, uma queda em seus níveis (Santin, 2000). Este efeito da aflatoxicose é devido a uma marcante inibição da enzima RNA-polimerase. Após a toxina entrar no núcleo do hepatócito, une-se ao DNA e desse modo inibe a RNA-polimerase, reduzindo a síntese de RNA-mensageiro, com consequente acentuada redução na produção de proteínas (Cliford & Rees, 1966). A AFB1 é biotransformada no fígado por monoxigenases, e então transformada pela citocromo P450 em aflatoxina 8,9-epóxido, um composto eletrofílico altamente ativo que é inativado por conjugação com a glutationa e excretado através da urina e da bile (Emerole et al., 1979). Tessari et al. (2005) afirmam que 200µg de AFB1/kg de ração, com ou sem associação de fumonisina B1, determinam uma redução nos níveis séricos de proteínas totais após 20 dias de exposição

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contínua através da ração. Ghosh et al. (1990) observaram que 300µg de AFB1/kg de ração de frangos de corte levou a diminuição significativa de linfócitos T, albuminas e globulinas nos animas intoxicados.

A lesão hepática causada pelas micotoxinas leva a alteração das enzimas existentes nas células do fígado. A Alanina Aminotransferase (ALT) é uma enzima presente em grande quantidade no citoplasma dos hepatócitos e dos miócitos esqueléticos. É uma enzima de liberação, que catalisa uma reação reversível envolvida na desaminação de alanina para formar piruvato, que pode entrar na via da gliconeogênese ou no ciclo de Krebs (Ciclo do Ácido Cítrico). Uma lesão de hepatócito, reversível ou irreversível, ocorrendo por variadas causas (inflamação, hipóxia, substâncias tóxicas, traumatismo...), além de casos de regeneração de doença hepática, liberam ALT para o sangue (Stockham & Scott, 2011). Aravind et al. (2003) observaram diminuição precoce da atividade da ALT em frangos de corte submetidos a dieta naturalmente contaminada com micotoxinas (168µg de AFB1/kg de ração). Diminuição significativa da atividade da ALT foi encontrada em frangos de corte submetidos a 800µg de AFB1/kg de ração durante 35 dias de tratamento (Tedesco et al., 2004).

A Aspartato Aminotransferase (AST) é uma enzima encontrada em altas concentrações no citoplasma dos hepatócitos e em suas mitocôndrias, além de outros tecidos como os músculos cardíaco e esquelético, além dos eritrócitos. É uma enzima de liberação, que catalisa uma reação reversível envolvida na desaminação de aspartato para formar oxaloacetato, que pode entrar no ciclo de Krebs (Ciclo do Ácido Cítrico) (Stockham & Scott, 2011). Baseado em estudos em humanos, aproximadamente 60 a 80% da AST do interior do hepatócito está associado às mitocôndrias, e o restante em forma solúvel no citosol (Meyer et al., 1992). Da mesma forma, uma lesão de hepatócito, reversível ou irreversível, ocorrendo por variadas causas (inflamação, hipóxia, substâncias tóxicas, traumatismo...), além de casos de regeneração de doença hepática, liberam AST para o sangue (Stockham & Scott, 2011). Porém, é necessário um insulto mais severo do que aquele que altera a permeabilidade da membrana celular para provocar a liberação da forma mitocondrial de AST. Uma lesão à membrana, por toxina ou hipóxia, por exemplo, resulta num aumento da ALT sérica, e nas doenças hepáticas crônicas, principalmente em estado final (cirrose), os valores da ALT e do AST séricos podem estar normais ou somente um pouco aumentados (Meyer et al., 1992). Uma diminuição significativa da concentração sérica da AST foi constatada por Franciscato (2006) em frangos de corte submetidos a dieta contendo 3000µg de AFB1/kg de ração, quando em comparação a aves não contaminadas. Um aumento significativo da ação da AST em frangos de 41 dias de idade foi constatada por Tessari et al. (2005) em intoxicação experimental por 50 e 200µg de AFB1/kg de ração.

A Lactato Desidrogenase (LD ou LDH) é uma enzima citosólica

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localizada em diversos tecidos, incluindo os hepatócitos e a musculatura esquelética e cardíaca; além de eritrócitos; a qual catalisa uma reação reversível que converte piruvato em lactato no final da glicólise anaeróbica (Meyer et al., 1992; Stockham & Scott, 2011). Sendo assim, a atividade sérica total da LD não traz vantagens diagnósticas sobre os AST. Porém, a LD é composta de 5 isoenzimas, das quais a LD5 pode ser mensurada por espectrofotometria e está localizada primariamente nos hepatócitos e musculatura esquelética (Meyer et al, 1992). Devido ao seu grande tamanho e a meia-vida longa, a atividade de LD fica elevada por algum tempo após a lesão inicial e, às vezes, pode ser útil no diagnóstico retrospectivo (Kerr, 2003). Aos 21 dias de idade, 5000µg de aflatoxina (60,69% de AFB1) por quilograma de ração foi capaz de reduzir a média de ação da enzima LD em frangos de corte com aflatoxicose aguda experimental (Borsa et al., 1998).

A Gama-Glutamiltransferase (GGT) é uma enzima associada à colestase e membranas celulares. Ela catalisa a transferência de grupos glutamil entre peptídeos e está envolvida em reações da glutationa. Muitas células têm atividade de GGT, mas as células epiteliais biliares, as células acinares pancreáticas e as células epiteliais tubulares renais são consideradas classicamente as de maior atividade (Meyer et al, 1992; Stockham & Scott, 2011). Concentrações elevadas de ácidos biliares no fígado e no plasma são esperadas na ocorrência de colestase. O aumento dos ácidos biliares ou de outros constituintes da bile pode estimular a síntese e a liberação de GGT. Aravind et al. (2003) relataram aumento na concentração de GGT no soro de frangos de corte aos 21 e aos 42 dias de idade submetidos a dieta naturalmente contaminada com aflatoxina (169µg/kg de ração). Resultados semelhantes foram encontrados por Borsa et al. (1998) em frangos de corte com 42 dias de idade alimentados com dieta com 5000µg/kg de ração de aflatoxinas (69,9% de AFB1).

EFEITOS DAS AFLATOXINAS SOBRE A FUNÇÃO RENAL DAS AVESA intoxicação por micotoxinas também afeta a função renal das

aves. Sendo assim, a avaliação desta pode ser feita tomando-se parâmetros sanguíneos clássicos, como a determinação das concentrações de ácido úrico e de uréia. O ácido úrico é um metabólito que pode ser usado como parâmetro importante da função renal, além da função hepática. Ele é o maior produto final do metabolismo de nitrogênio, constituindo cerca de 60 a 80% do nitrogênio total excretado na urina das aves. É sintetizado no fígado e nos rins, e 90% são excretados via secreção tubular, independentemente da taxa de formação de urina (Skadhauge apud Stockham & Scott, 2011). Concentrações sanguíneas acima de 15 mg/dL sugerem alterações da função renal, que podem ser causadas por diversos fatores, como nefrotoxinas (Schimidt et al., 2007).

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Batina (2004) mostrou haver diminuição significativa na concentração de ácido úrico sanguíneo de frangos de corte aos 42 dias de idade submetidos a dieta contendo 5000µg de aflatoxina/kg de ração.

A uréia é resultante do metabolismo do nitrogênio. É produzida pelo fígado e excretada pelos rins. Sua concentração sanguínea é influenciada pela ingestão de proteínas, pela taxa de excreção renal (que podem aumentar a concentração sanguínea da uréia) e pelo estado do fígado, que é o órgão responsável pela sua síntese. Como as aves são uricotélicas, pequenas quantidades de uréia estão presentes no plasma. A concentração normal de uréia de aves não-carnívoras é de 0 a 5 mg/dL (Campbell apud Schimidt et al, 2007). Diminuição na concentração sérica de uréia foi encontrada por Batina (2004) em frangos de corte com 42 dias intoxicados com 500mg de aflatoxina/kg de ração. Resultados semelhantes foram apontados por Aravind et al. (2003) para frangos de corte com 21 e 35 dias alimentados com dieta naturalmente contaminada com micotoxinas (168µg de aflatoxina/kg de ração).

EFEITOS DAS AFLATOXINAS SOBRE OS PARâMETROS HEMATOLóGICOS DAS AVES

As micotoxinas também podem afetar os parâmetros hematológicos das aves contaminadas, mesmo em pequenas doses, as quais levam a micotoxicoses sub-clínicas. Tessari et al. (2006), trabalhando com 0, 50 e 200µg de AFB1/kg de ração, em associação ou não com 0, 50 ou 200µg de fumonisina B1/kg, não observaram alteração no estado clínico geral dos frangos durante o período experimental; porém constataram que em todos os tratamentos houve redução nos valores de hematócrito, concentração de hemoglobina e número de hemácias, caracterizando um quadro de anemia, sendo que os grupos mais afetados foram os que receberam as maiores concentrações das toxinas em associação. Também observou-se um menor número de leucócitos em todos os tratamentos, porém esta redução foi mais intensa nos grupos tratados com 200µg de AFB1/kg de ração, com ou sem fumonisina. Aravind et al. (2003) trabalharam com dieta naturalmente contaminada com várias micotoxinas (168µg de AFB1/kg de ração) observaram diminuição no hematócrito das aves intoxicadas aos 21 e aos 35 dias de idade. Além disso, nas aves com 35 dias de idade, houve uma aparente redução na concentração de hemoglobina e na contagem de hemácias em relação ao grupo controle. Diminuição na porcentagem de heterófilos em aves se alimentando de 2450µg de AFB1/kg de alimento, além de aumento na porcentagem de linfócitos no plasma de aves ingerindo 350 e 2450µg de AFB1/kg de ração foram encontradas por Del Bianchi et al. (2005). Tung apud Tessariet al. (2006) alimentaram frangos com 5000 e 10000µg de AFB1/kg de ração e observaram que os efeitos sobre os parâmetros hematológicos foram mais pronunciados quanto maior o nível de aflatoxina.

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EFEITOS DAS AFLATOXINAS SOBRE O METABOLISMO DE CÁLCIO E FóSFORO DAS AVES

Estudos também têm demonstrado que as aflatoxinas afetam direta ou indiretamente o metabolismo do cálcio e do fósforo nas aves (Glahn et al, 1991). O cálcio é o mineral mais abundante no organismo da ave. É considerado um dos principais constituintes dos ossos e tem ainda um papel fundamental no controle das funções celulares dos tecidos nervoso e muscular, bem como de atividades hormonais e de coagulação sanguínea (Maiorka & Macari, 2002). Cerca de metade do cálcio plasmático está livre e esta é a porção ativa do cálcio, enquanto a outra metade encontra-se inativa, ligada à albumina (Keer apud Schimidt et al., 2007), e também à cátions não-protéicos. O cálcio sérico ou plasmático está distribuído em três frações principais. Todo o cálcio nos líquidos corporais está ionizado (Ca+2), mas parte (cerca de 50%) encontra-se livre e parte está ligada a moléculas aniônicas (proteínas (80% albumina e 20% globulina) – 40-45%; e ânions não-protéicos (citrato, fosfato, lactato e outros ânions pequenos e difusíveis) – 5-10%). A porção do cálcio livre no plasma é regulada por hormônios e contribui para estados patológicos (Stockham & Scott, 2011). Os distúrbios renais causam diminuição do cálcio sérico pela perda de proteínas (levando a hipoalbuminemia) ou pela diminuição da reabsorção do cálcio (Lewandoswik apud Schimidt et al., 2007). Como as concentrações séricas de Ca+2 em perfis bioquímicos comuns representam a concentração total de Ca+2, uma diminuição na concentração sérica de proteínas (especialmente hipoalbuminemia) diminui o Ca+2 ligado às mesmas, e, portanto pode causar hipocalcemia, chamada de pseudo-hipocalcemia (Stockham & Scott, 2011). A pseudo-hipocalcemia não resulta em sinais clínicos nas aves, uma vez que o Ca+2 livre que é o mobilizado para as funções celulares. Sendo assim, há constatação da concentração sérica total de cálcio, porém, sem sinais clínicos. Diminuição da concentração de cálcio sérico total foi observada em frangos de corte de 42 dias de idade submetidos a dieta contendo 5000µg de aflatoxinas/kg de alimento (80% AFB1, 12% AFB2, 5% AFG1 e 3% AFG2) e argila clinoptilonita natural (Maciel et al., 2007).

O fósforo está presente predominantemente na forma de hidroxiapatita (90%) na matriz mineralizada dos ossos, e os 10% restantes estão nos tecidos moles intracelularmente, sendo o principal ânion intracelular e faz parte de vários processos metabólicos como metabolismo de energia, contração muscular e integridade do esqueleto (Dennis apud Franciscato, 2006). O fósforo inorgânico, maneira pela qual é referido o fósforo nos organismos vivos, também encontra-se no líquido extracelular. O fosfato inorgânico encontra-se na circulação como monohidrogeniofosfato (HPO4

-2), que é divalente, e como dihidrogeniofosfato (H2PO4-), que é monovalente (Maiorka & Macari, 2002). No plasma, 55% do fósforo inorgânico encontra-se livre,

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enquanto os outros 45% estão ligados a ânions (10% a proteínas catiônicas e 35% a cátions não-protéicos). Assim como ocorre com o cálcio, a parte livre no plasma é que é regulada por hormônios (Stockham & Scott, 2011). Fernandez et al. (1994) trabalharam com intoxicação experimental de poedeiras comerciais com 2500µg de AFB1/kg relataram presença de hipofosfatemia quando em comparação ao grupo controle negativo.

Ambos minerais são regulados pela função do hormônio paratireóideo (PTH), produzido pelas glândulas paratireóides e inativado ou degradado pelo fígado e pelos rins. O PTH é um hormônio polipeptídico (84% aminoácidos) secretado em resposta a uma diminuição na concentração sérica de cálcio livre, enquanto que a vitamina D ativa e o aumento na concentração sérica de cálcio livre inibem sua síntese. O PTH promove aumento na absorção de cálcio pelo intestino (na presença de vitamina D ativa) e maior reabsorção nos túbulos renais; mobilização de cálcio e fósforo inorgânico dos ossos; e excreção renal de fósforo inorgânico por inibir a reabsorção do mesmo pelos túbulos (ação fosfatúrica potente). Glahn et al. (1991) explicam que os efeitos das aflatoxinas sobre os minerais citados podem estar relacionados com alterações no metabolismo da vitamina D e do PTH, pois estas micotoxinas podem diminuir a síntese de PTH endógeno ou alterar a sensibilidade renal a este hormônio, podendo ainda, reduzir a síntese de vitamina D ativa, causando assim, diminuição da excreção de fósforo e aumento na excreção de cálcio. Estes efeitos resultariam em hipocalcemia verdadeira (por diminuição na concentração de cálcio sérico livre) associada a pesudo-hipocalcemia (por hipoalbuminemia); além de hipofosfatemia devido à baixa na concentração de vitamina D ativa, que estimula a absorção de fósforo no intestino e a mobilização de fósforo dos ossos.

USO DE ALUMINOSILICATO DE CÁLCIO E SóDIO HIDRATADO (HSCAS) COMO ADSORVENTE DE AFLATOXINAS

É sabido que a indústria avícola se utiliza de vários métodos que objetivam a redução de prejuízos causados à saúde e ao desempenho zootécnico devidos às micotoxinas. Os métodos que objetivam eliminar ou reduzir os níveis de contaminação por micotoxinas nos alimentos levam em consideração estratégias de descontaminação e detoxificação. Isto inclui métodos químicos, físicos e biológicos, desde que estes métodos apresentem efetividade na remoção, destruição e inativação das micotoxinas; ausência de efeitos tóxicos ou carcinogênicos; não alterem as propriedades nutritivas nem a palatabilidade dos alimentos e sejam econômica e tecnologicamente viáveis, não alterando o preço final do produto (Diaz & Smith, 2005). Um caminho para o problema tem sido usar materiais absortivos não-nutritivos na alimentação, com objetivo de redução na absorção das aflatoxinas pelo trato digestório (Kubena et al.,

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1990b). Dentre todos os meios, o mais comumente utilizado é a ligação irreversível da micotoxina a um adsorvente (Diaz & Smirh, 2005).

A utilização de aluminosilicato de cálcio e sódio hidratado (HSCAS), um tipo de zeólita comercial, em dietas de aves domésticas tem mostrado resultados satisfatórios devidos à sua capacidade em adsorver toxinas (Kubena et al, 1990a), tornando-as menos disponíveis para adsorção pelo trato gastrointestinal (Kubena et al, 1990b). O HSCAS é uma classificação geral que inclui diferentes adsorventes, não sendo uma substância específica. Pode ser definido como todo material de aluminosilicato puro, que contenha mistura de água zeolítica e menores quantidades de cálcio e sódio na forma de cátions ou seus sais solúveis.

O HSCAS na concentração de 0,5% na dieta diminuiu significativamente os efeitos adversos no peso corporal e nas mudanças hepáticas principais causados por 7500µg de AFB1/kg de dieta em poedeiras Leghorn e frangos de corte (Phillips et al., 1988). Neeff et al. (2013) também relatam redução dos efeitos deletérios sobre o peso relativo de fígado e rim e redução dos resíduos de AFB1 e também de produtos de biotransformação de AFB1 (AFB2, Aflatoxicol e AFG1) em fígado de frangos de corte ao final da fase inicial de criação (21 dias), com uso de 0,5% de HSCAS e administração de 2500µg de AFB1/kg de ração.

TéCNICA COM POSSÍVEL APLICAÇÃO FUTURA: USO DE CÚRCUMA COMO ANTIOXIDANTE NATURAL NA ATENUAÇÃO DOS EFEITOS DELETéRIOS DAS AFLATOXINAS

O consumo de oxigênio relativo ao crescimento de células e ao seu metabolismo normal conduz à geração de uma categoria de substâncias conhecidas como radicais livres. De maneira simples, o termo radical livre refere-se ao átomo ou molécula altamente reativo, que contém número ímpar de elétrons em sua última camada eletrônica. É este não emparelhamento de elétrons da última camada que confere alta reatividade a esses átomos ou moléculas. Como nem sempre os radicais livres possuem elétrons desemparelhados na última camada, o termo mais adequado é “Espécies Reativas do Metabolismo de Oxigênio” (ERMO), e estas são encontradas em todos os sistemas biológicos (Ferreira & Matsubara, 1997). As ERMO são produzidas continuamente pelo uso normal de oxigênio do corpo, tal como a respiração e algumas funções imunes mediadas por células. ERMO incluem radicais livres, tais como radicais ânion superóxido (O2−), radicais hidroxila (OH-), radical hidroperoxila (HO2-) e espécies radicais não livres como o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o oxigênio singlete (1O2) (Ak & Gülçin, 2008). Algumas, como o ânion superóxido e o óxido nítrico, produzidos dentro da célula ou por fagócitos ativados presentes durante a inflamação, têm sido

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propostas por desempenhar um papel importante no processo multicelular da carcinogênese, provavelmente por danificar e alterar células alvo (Abel & Gelderblom, 1998).

O estresse oxidativo é o evento decorrente da existência de um desequilíbrio entre compostos oxidantes e antioxidantes, em favor da geração excessiva de radicais livres ou em detrimento da velocidade de remoção destes. Tal processo conduz à oxidação de biomoléculas, com consequente perda de suas funções biológicas e/ou desequilíbrio homeostático, cuja manifestação é o dano oxidativo potencial contra células e tecidos (Halliwell & Whiteman, 2004). Além do estresse oxidativo, como as ERMO são produzidas continuamente durante eventos fisiológicos normais, estas podem, facilmente, dar início à peroxidação de lipídios da membrana, conduzindo ao acúmulo de hidroperóxidos lipídicos.

Todos os organismos aeróbios possuem defesas antioxidantes, incluindo enzimas e componentes alimentares antioxidantes, para remover ou reparar as moléculas danificadas. Os compostos antioxidantes podem eliminar os radicais livres e aumentar a vida de prateleira de produtos alimentícios, retardando o processo de peroxidação lipídica, sendo uma das principais razões para a deterioração de alimentos e compostos farmacêuticos durante o processamento e armazenamento (Ak & Gülçin, 2008). Substâncias naturais que podem prevenir a toxicidade da AFB1 seriam úteis para a saúde humana e animal, com um custo mínimo em alimentos e rações.

Recentemente, uma especiaria, conhecida como cúrcuma ou açafrão-da-terra, vem sendo estudada para que seja avaliada a sua eficiência como antioxidante, podendo ser incluída a baixo custo em dietas de aves comerciais, objetivando a atenuação dos efeitos oxidantes deletérios causados pelas aflatoxinas. A cúrcuma é uma planta medicinal nativa do subcontinente asiático e é preparada a partir da raiz e rizoma secos da planta Curcuma longa, um membro da família do gengibre. A curcumina é um dos constituintes encontrados na cúrcuma, sendo um dos principais ingredientes da especiaria em pó. O ingrediente ativo presente na curcumina é o diferuloimetano, um polifenol hidrofóbico, que apresenta cor amarela característica. Mesmo embora o efeito antioxidante principal seja devido à curcumina, esta encontra-se junto a um conjunto de compostos denominados curcuminóides totais, representados por demetóxicurcumina e bisdemetóxicurcumina (Gowda et al., 2009; Epstein et al., 2010; Nayak & Sashidhar, 2010). A curcumina vem sendo utilizada, por seus benefícios medicinais, há séculos, porém o primeiro caso documentado de seu uso como uma droga surgiu apenas em 1937, quando foi utilizada para tratar doença biliar (Srivastava et al., 2011). Desde então seu potencial terapêutico vem sendo explorado em doenças inflamatórias, neoplásicas, cardiovasculares,

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neurodegenerativas, diabetes, fibrose cística e outros distúrbios (Maheshwari et al., 2006; Srivastava et al., 2011). Os efeitos negativos causados pela AFB1 incluem dano celular, liberação de radicais livres e peroxidação lipídica (Surai, 2002). Os curcuminóides totais apresentaram efeitos antioxidantes e protetores contra a AFB1, e como a peroxidação lipídica desempenha um papel importante na toxicidade pela aflatoxina, um efeito protetor através do uso de antioxidantes é possível de ser conseguido (Soni et al., 1997; Galvano et al., 2001). Compostos de plantas como as cumarinas, flavonóides e curcuminóides possuem ação inibitória na biotransformação da aflatoxina aos seus derivados epóxido ativos (Lee et al., 2001). Gowda et al. (2008) avaliaram que houve aumento na ingestão de alimento, dos níveis séricos de proteína total e colesterol, e melhora significativa no ganho de peso de frangos de corte alimentados com 0,5% de cúrcuma em pó e 1000µg de AFB1/kg, quando comparados com os frangos alimentados somente com AFB1. Em estudo conduzido por Yarru et al. (2009), verificou-se que a adição de 0,5% de cúrcuma em pó, contendo 74mg/kg de curcuminóides totais, à dieta com adição de 1000µg de AFB1/kg, melhorou significativamente os efeitos negativos da AFB1 no desempenho zootécnico e no peso do fígado de frangos de corte. Gowda et al. (2009) verificaram que a adição de 74 e 222mg/kg de curcuminóides totais na dieta contendo 1000µg de AFB1/kg não teve efeito significativo na ingestão de alimento, porém apresentou aumento significativo no ganho de peso e melhor conversão alimentar quando comparado com frangos de corte alimentados somente com AFB1. Também verificaram que a suplementação de 222mg de curcuminóides totais/kg de dieta contendo 1000µg de AFB1/kg proporcionou melhora significativa nos valores séricos de proteína total, albumina, globulina, GGT e AST, quando comparado com aves alimentadas somente com AFB1.

PESQUISA EXPERIMENTAL DESENVOLVIDA PELO LABORATóRIO DE AVICULTURA (FMVZ/USP)

Em uma pesquisa realizada pelo Laboratório de Avicultura, o qual pertence ao Departamento de Nutrição e Produção Animal, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, utilizou-se 240 pintos de um dia, machos, da linhagem comercial Cobb® 500, com peso inicial de 42,8 gramas e que foram submetidos a quatro diferentes tipos de dietas experimentais.

As dietas foram elaboradas de acordo com as recomendações nutricionais de Rostagno (2011) para cada fase de crescimento (inicial, crescimento e terminação), e tiveram como base o milho e o farelo de soja.

Os tratamentos experimentais foram: Dieta 1 = Controle negativo (Ração Basal); Dieta 2 = Dieta 1 + 0,5% de adsorvente experimental (HSCAS

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– Aluminosilicato de Cálcio e Sódio Hidratado); Dieta 3 = Dieta 2 + 500µg de AFB1/kg de ração e; Dieta 4 = Dieta 1 + 500µg de AFB1/kg de ração. As aves passaram a receber as dietas contaminadas somente a partir do oitavo dia de criação, uma vez que antes deste período as mesmas são muito sensíveis à contaminação.

A AFB1 utilizada para a contaminação das dietas foi produzida no Laboratório de Microbiologia e Micotoxicologia de Alimentos (LMMA) do Departamento de Engenharia de Alimentos da Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da USP, a partir do cultivo de cepa toxigênica de Aspergillus parasiticus NRRL2999 em arroz, seguindo a metodologia científica de Shotwell et al. (1996). A confirmação dos níveis de aflatoxinas nas rações foi feita por meio do método de Vicam (1999), com auxílio de aparelho de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).

Foi feita a análise de desempenho zootécnico, considerando as seguintes características: peso médio, ganho de peso médio, consumo de ração médio, conversão alimentar e viabilidade criatória de frangos de corte aos 42 dias de criação. Os resultados obtidos são apresentados na Tabela 1 a seguir:

Tabela 1. Valores de Peso Médio (PM), Ganho de Peso Médio (GPM), Consumo de Ração Médio (CRM), Conversão Alimentar (CA) e Viabilidade Criatória (VC) de frangos de corte para o período total de criação (42 dias).

CaracterísticaDietas Experimentais Valor

de PControle Adsorvente1 Adsorvente + AFB12 AFB13

PM (g) 2993a 3079a 2665b 2602b <0,001GPM (g) 2946a 3037a 2622b 2509b <0,001CRM (g) 3661ab 3947a 3438bc 3176c <0,001CA (g/g) 1,24 1,30 1,31 1,27 0,074VC (%) 96,66 100 100 100 0,089

10,5% de Aluminosilicato de Cálcio e Sódio Hidratado (HSCAS); 20,5% de HSCAS + 0,05µg/kg de ração de Aflatoxina B1 (AFB1); 30,05µg/kg de ração de AFB1. Valores com letras diferentes na mesma linha apresentam diferença significativa sob o Teste de Tukey a 5% de probabilidade.

Como é possível observar, o peso corporal médio e o ganho de peso

médio foram afetados negativamente pela ingestão de alimento contaminado pelas aves, uma vez que grande parte da energia e dos nutrientes absorvidos é recrutada para reparar os danos causados pelas aflatoxinas. Além disso, a diminuição no consumo de ração culmina com um menor aporte nutricional, o que colabora para queda no crescimento dos animais e aumento na taxa de refugos. É importante observar que as aves ingerindo toxina com adsorvente

249

apresentaram consumo de ração estatisticamente igual às do grupo controle. As concentrações de HSCAS e AFB1 utilizadas neste experimento não foram suficientes para exercer influência sobre a conversão alimentar e a viabilidade criatória, mas bastaram para que, ao exame necroscópico, fossem observados fígados lipêmicos e edemaciados, além de dificuldade no processo de coagulação do sangue por parte das aves, visto por meio de punções venosas que não estancavam e leves hemorragias.

CONSIDERAÇÕES FINAIS Em vista do conteúdo exposto, é possível perceber a dimensão dos

efeitos deletérios causados à avicultura e às saúdes animal e humana, além da importância da prevenção e controle dos mesmos ao longo da cadeia produtiva de carne. Atualmente existem algumas alternativas disponíveis comercialmente e outras ainda não consolidadas, que permitem diminuir a toxicidade das micotoxinas em questão. O uso de adsorventes por meio da indústria avícola comprova a real eficácia desta técnica, a qual permite a diminuição do prejuízo financeiro causado aos produtores. Futuramente, o uso concomitante de substâncias antioxidantes possibilitará melhores desempenho e bem-estar aos animais, além de garantir produtos confiáveis aos olhos do consumidor final. Porém, mais estudos são necessários para validar o uso de substâncias que exerçam os mesmos ou, até outros, bons efeitos frente às micotoxinas.

AGRADECIMENTOS Sinceros agradecimentos à Fundação de Amparo à Pesquisa do

Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro (Projeto Temático no2010/20895-4; Bolsa de Doutorado no2012/07726-4).

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CAPÍTULO 14

PREPARO DE MEIOS DE CULTURA PARA ENSAIOS DE DEGRADABILIDADE IN VITRO: UMA IDEIA LUMINOSA!

Romualdo S. Fukushima1*, Paul J. Weimer2, Daniel A. Kunz3

1Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP, Brasil. 2U.S. Dairy Forage Research Center, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service, and Department of Bacteriology, University of Wisconsin - Madison, Madison, Wisconsin, United States of America. 3Department of Biological Sciences, University of North Texas, Denton, Texas, United States of America.*Autor correspondente: [email protected]

RESUMOO meio de cultura para o cultivo de microrganismos estritamente

anaeróbios, incluindo-se os da flora do trato gastrointestinal de animais domésticos, deve ser anaeróbio. Esta condição é altamente desejável nos ensaios de degradabilidade ruminal. O aminoácido cisteína é um dos agentes redutores mais empregados para a obtenção da anaerobiose no meio de cultura, por sua ausência de toxicidade, baixo custo e facilidade de manipulação. Entretanto, a ação da cisteína é muito lenta (2-3 horas para reduzir o meio de cultura), o que torna inconveniente quando o meio é necessário com urgência ou em grandes quantidades. O tempo necessário para completa redução de meio de cultura contendo resazurina (um indicador colorido da condição redox) foi substancialmente menor quando o meio foi artificialmente iluminado com uma lâmpada incandescente. A intensidade da luz teve impacto no tempo de redução: tubos contendo meio de cultura mantidos no escuro nunca atingiram nível desejado de anaerobiose (avaliado por espectroscopia pela descoloração da resazurina) enquanto que tubos sujeitos à iluminação ordinária de laboratório foram reduzidos em cerca de 2 horas. Quando os tubos foram submetidos a alta intensidade luminosa (equivalente a uma lâmpada de 100 watts), a anaerobiose foi alcançada em menos de 20 minutos. A cisteína continuou a ser elemento necessário para a descoloração da resazurina. Evidências de que a anaerobiose foi atingida com sucesso foi a constatação de que cinco cepas de bactérias ruminais, quatro espécies de Clostridium e uma de Thermoanaerobacter exibiram semelhante crescimento (em termos de lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo) em meio de cultura reduzido através de alta iluminação ou em meio reduzido da maneira convencional.

mailto:[email protected]

254

Foi demonstrada direta correlação entre o efeito fotocatalítico e decréscimo no teor de oxigênio dissolvido no meio de cultura.

Palavras-chave: anaerobiose, cisteína, luz, meio de cultura, resazurina

INTRODUÇÃOO cenário mais provável para a origem e evolução da vida, aponta para

uma atmosfera ausente de oxigênio. Portanto, os primeiros microrganismos seriam anaeróbios (Wächtershäuser, 2000). Após o aparecimento de O2, vários ambientes anaeróbios foram preservados, o que permitiu a sobrevivência de microrganismos capazes de utilizarem substratos através das vias fermentativas e processos de respiração anaeróbia (Huber & Wächtershäuser, 1998). Nos dias atuais, ecosistemas anaeróbios continuam largamente distribuídos no mundo e incluem estuários, pântanos, e ambientes controlados pelo homem (aterros sanitários, tonéis de fermentação – etanol, digestores de resíduos animais) bem como o trato gastrointestinal do homem e animais domésticos (Hobson, 1988; Hungate, 1950). Ainda, muitos microrganismos anaeróbios são patógenos, com sérias implicações nas saúdes humana e animal.

Enquanto que algumas espécies de microrganismos toleram breves exposições ao oxigênio (anaeróbios facultativos), outras espécies podem ser mortas apenas por breve exposição. Cultivo destas cepas requerem, portanto, meios de cultura com total ausência de oxigênio. Preparo de meios para anaeróbios estritos tipicamente envolve extenso borbulhamento com gás carbônico (CO2) para deslocar o O2 dissolvido e rígido selamento com rolhas de borracha especiais (Hungate, 1950; Balch & Wolfe, 1976). Além disso, muitas cepas bacterianas requerem agentes redutores; alguns, como o ditionito de sódio, agem rapidamente, mas geram produtos tóxicos. Outros, como o sulfito de sódio, precipitam metais essenciais e são relativamente tóxicos para muitas bactérias ruminais. Sais de titânio (III) são tidos como atóxicos, mas são caros e de difícil manuseio. O aminoácido cisteína (Cys) é frequentemente utilizado como agente redutor pelo seu baixo custo, baixa toxicidade e ausência de efeitos colaterais indesejáveis. Entretanto, a velocidade com que ela reduz o meio de cultura é muito baixa, várias horas (tipicamente, 2-3 horas). Para auxiliar na detecção da condição anaeróbia, um indicador colorido, a resazurina (RNO), é usado.

Uma observação empírica que uma técnica de laboratório de microrganismos ruminais (P. A. Tirabasso) fez ao autor correspondente deste artigo, de que o preparo de meios eram mais rápidos em dias ensolarados do que em dias nublados, inspirou-nos a examinar os efeitos da luz no preparo de meios de cultura dependentes de Cys e usando RNO como indicador (Fukushima et al., 2002; 2003). Muito embora há trabalhos na literatura descrevendo ações da RNO em algumas situações (Prütz et al., 1996; Rasmussen & Nicolaisen,

255

1999), não há nenhuma descrição de ação fotolítica da Cys sobre a RNO em promover anaerobiose e assim, acelerar a confecção de meios de cultura para microrganismos anaeróbios.

MATERIAL E MéTODOSOs materiais e métodos que foram empregados nos trabalhos de

Fukushima et al. (2002; 2003) são descritos a seguir:

EFEITO DA INTENSIDADE LUMINOSA No experimento que avaliou o efeito da intensidade luminosa, os

meios de cultura foram acondicionados em tubos de vidro e hermeticamente selados com rolhas de borracha próprios para o cultivo de microrganismos anaeróbios. Foi empregado o meio de cultura proposto por Scott & Dehority (1965) – 10 mL. Como indicador redox, foi usado RNO na concentração de 2,0 mg/L. Cada tubo foi inoculado com 0,4 mL de uma solução estoque de cloridrato de cisteína (2,5% m/v). Os meios basais continham ainda minerais e ácidos graxos voláteis, além de outros nutrientes.

A iluminação dos tubos foi realizada com duas lâmpadas de halogênio (500 W cada), montadas em um suporte, posicionando as lâmpadas em ângulo de 45° e a 40 cm da bancada, em um laboratório totalmente desprovido de luz. Os tubos foram iluminados com seis intensidades de luz (seis tratamentos, quatro tubos cada tratamento); a intensidade luminosa, controlada através de um reostato e um fotodetector, variou de 0 (escuro), 10, 45, 90, 180 a 360 μE/m2 × s (E = Einstein, unidade de intensidade luminosa). Borbulhamento com CO2 foi de 90 minutos para todos tubos, antes da exposição luminosa. As leituras de absorbâncias (540 nm) foram realizadas a cada dois minutos, em um espectrofotômetro.

EFEITO DO TEMPO DE GASEAMENTO COM CO2No experimento avaliando o efeito do tempo de borbulhamento com

gás CO2 no meio de cultura, os tempos foram de 15, 30, 45, 60, 75 ou 90 minutos. Note-se que o CO2 deve ser isento de O2, o que é obtido pela passagem forçada do gás CO2 através de uma coluna de vidro contendo filamentos de cobre arranjados em uma resistência elétrica, sendo então aquecidos a alta temperatura. Neste experimento, os tubos foram submetidos a duas situações de exposição de luz: 360 μE/m2 × s (alta intensidade luminosa) ou zero de luz (escuro). Leituras de absorbância foram registradas a cada dois minutos para os tubos da alta luminosidade e a cada 30 minutos para os tubos mantidos no escuro.

256

MONITORAMENTO DE OXIGêNIO DISSOLVIDOObjetivando verificar se a redução do meio de cultura contend Cys e

RNO, catalizada pela irradiação luminosa, foi acompanhada pelo concomitante desaparecimento do oxigênio dissolvido, o teor de oxigênio foi mensurado através de um eletrodo, na presença e ausência de iluminação.

CRESCIMENTO MICROBIANONos meios de cultura experimentais, foram cultivados microrganismos

tipicamente da flora ruminal (Lachnospira multipara, Prevotella ruminicola, Ruminococcus flavefaciens, Selenomonas ruminantium e Streptococcus bovis), bactérias do grupo Clostridium (Clostridium butyricum, Clostridium pasteurianum e Clostridium perfringens) e uma bactéria encontrada em sedimentos de gêisers (Thermoanaerobacter saccharolyticum). O meio de cultura para o cultivo de bactérias ruminais foi um meio celulolítico (Weimer et al., 1984); para o experimento com o grupo de bactérias dos gêneros Clostridium e Thermoanaerobacter, foi empregado o meio de cultura proposto por Scott & Dehority (1965).

Duas condições experimentais foram testadas: após a adição de todos reagentes, incluindo Cys, os tubos foram expostos a alta intensidade luminosa (370-380 μE/m2 × s) ou baixa intensidade luminosa, cerca de 10 μE/m2 × s, que foi o valor detectado na bancada de um laboratório convencional com lâmpadas fluorescents no teto. Após o tratamento luminoso, um inóculo microbiano de 0,3 mL, proveniente de uma cultura estoque, foi injetado em cada tubo, aquecido a 39°C. Os conteúdos dos tubos foram misturados por inversão antes das leituras de absorbância a 540 nm. Os parâmetros relativos ao desenvolvimento microbiano, lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo foram calculados a partir dos valores de absorbância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

EFEITO DA INTENSIDADE LUMINOSAA luz teve substancial efeito na redução dos meios de cultura

(Fig. 1). Nas duas maiores intensidades (360 e 180 μE/m2 × s) virtualmente total redução ocorreu em menos de 20 minutos. Para fins de comparação, uma lâmpada incandescente de 100 W irá produzir uma intensidade luminosa de cerca de 370 μE/m2 × s, medido a 11 cm da fonte luminosa. Os tubos mantidos no escuro ou aqueles que receberam 10 μE/m2 × s (que é a típica iluminação de um laboratório convencional), nunca alcançaram redução durante o periodo de avaliação, constatação que comprova a observação rotineira de que os tubos só alcançam o necessário grau de anaerobiose após 2-3 horas de gaseamento com CO2. Rasmussen & Nicolaisen (1999) observaram insignificante aumento

257

nos níveis de RNO reduzido nos meios de cultura de células de mamíferos mantidos durante dois dias no escuro.

Figura 1. Efeito da intensidade da luz (μE/m2 × s no tempo da redução fotocatalítica da resazurina pela cisteína.

O tempo necessário para totalmente reduzir a RNO foi diretamente proporcional à intensidade da luz (Fig. 2). Em outras palavras, até o limite testado, quanto maior foi a intensidade luminosa, mais rápida foi a reação fotocatalítica.

Figura 2. Efeito da intensidade da luz no tempo necessário para totalmente reduzir a resazurina.

Não houve diferenças quanto ao tipo de luz empregada para reduzir a RNO. Tanto a lâmpada incandescente como a fluorescente, na intensidade de 10 μE/m2 × s, tiveram o mesmo comportamento (Fig. 3). Desta maneira, a hipótese de influência do calor irradiado da lâmpada incandescente é infundada. Entretanto, a presença do agente catalílico Cys foi essencial, para ambos tipos de lâmpadas. A redução do meio é resultante da doação de elétrons que ocorre

258

quando da união covalente de duas moléculas de Cys para formar a cistina. Entretanto, o papel mediado pela luz e o mecanismo pela qual ela acelera a redução da RNO pela Cys, ainda é desconhecido.

Figura 3. Influências do tipo de lâmpada e presença do agente redutor cisteína.

Observe-se que a intensidade de luz testada foi de 10 μE/m2 × s, o que explica que redução total não foi alcançada nas duas horas que durou o experimento. Rasmussen & Nicolaisen (1999) observaram que a redução da RNO em meio de cultura de células mamíferas foi significativamente aumentada pela exposição à luz fluorescente, 8 horas por dia, portanto estes autores recomendaram que tais meios de cultura sejam minimamente expostos à luz. Foi demonstrado que a RNO catalizou eficientemente a fotoxidação de outros agentes redutores, tais como NADH, GSH, e dopamina (Prütz et al., 1996). Polímeros produzidos ao aquecer aminoácidos em um meio marinho modificado catalizaram a reação entre desidrogenação do NADH e redução da RNO, e esta reação foi também acelerada pela luz (Okihana, 1982).

EFEITO DO TEMPO DE BORBULHAMENTOO borbulhamento do meio de cultura com CO2 é feito objetivando

o deslocamento do O2 dissolvido, e a concentração de CO2 dissolvido é dependente do tempo de gaseificação, até alcançar um plateau de saturação. Quando os tubos foram mantidos no escuro, o tempo de borbulhamento não teve influência na redução da RNO pela Cys (Fig. 4, painel superior) e nunca alcançaram redução, mesmo após 20 horas de monitoramento. Entretanto, sob alta intensidade luminosa, a redução da RNO foi mais rápida (10 min) nos tubos gaseificados por 75 min do que naqueles borbulhados por 45 ou 15 min (20 e 30 min, respectivamente) (Fig. 4, painel inferior).

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Figura 4. Efeito do tempo de gaseificação com CO2 no tempo de redução dos meios de cultura. Painel superior: tubos mantidos no escuro; painel inferior: tubos que foram expostos à luz.

Sumarizando, houve efeito positivo do tempo de borbulhamento de CO2 na redução do meio. Entretanto, o tempo menor de borbulhamento, 15 minutos, foi rapidamente compensado no tempo de estabelecimento da anaerobiose, de apenas 20 minutos. Estabelece-se nesta observação não apenas a vantagem do tempo como também economia no consumo do gás CO2.

Prütz et al. (1996) observaram que com a iluminação de uma solução saturada de N2, a RNO foi eficazmente descolorida, com concomitante aumento de sua forma oxidada e perda de NADH. Estes autores também reportaram que adição de O2 ao tampão causou drástica queda na reação fotocatalítica, particularmente nas taxas de redução da RNO.

MONITORAMENTO DO DESAPARECIMENTO DE O2Objetivando estabelecer se a aceleração da redução do meio de cultura

catalizada pela exposição a alta intensidade luminosa, na presença de Cys e RNO, era acompanhada pela concomitante queda no teor de O2 dissolvido, foi conduzido um ensaio onde o efeito da luz no consumo de O2 foi avaliado através de um eletrodo. O raciocínio simples implicava que poderia ocorrer redução no meio de cultura e o teor de O2 dissolvido mudar pouco, fato que inviabilizaria o crescimento de microrganismos anaeróbios. Na Fig. 5 pode-se visualizar que inicialmente a luz não teve efeito na redução, provavelmente porque o meio de cultura fora previamente saturado com ar comprimido, portanto, o meio estava com alta concentração de O2 dissolvido. Destaque-se que esta fora uma situação artificial, objetivando apenas avaliar uma situação extrema, que não seria o rotineiro em um laboratório. Esta constatação, entretanto, enfatiza a importância de parcial redução do meio, que é facilmente obtida com apenas 15 min de borbulhamento com CO2 (Fig. 4). Após parcial redução ser atingida, o consumo de O2 foi fortemente influenciado pela luz, de tal maneira que são visíveis os efeitos de “luz acesa” e “luz apagada” (Fig. 5). Esta observação encontra respaldo na resposta redutora à iluminação (Fig. 1).

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Em outras palavras, de fato ocorre redução no teor de O2 dissolvido quando o meio de cultura é iluminado.

Figura 5. Efeito da incidência da luz no consumo de O2 dissolvido no meio de cultura.

CRESCIMENTO MICROBIANOEnquanto que os experimentos anteriores estabeleceram claramente

a efetividade da luz na redução da RNO, na presença de Cys, e concomitante desaparecimento do O2 dissolvido no meio, ainda era necessário provar que microrganismos anaeróbios poderiam crescer tão bem em meio exposto à alta radiação luminosa como no meio preparado de maneira convencional. Portanto, em um experimento (Fukushima et al., 2002) cinco cepas de bactérias ruminais foram cultivadas em meio reduzido a alta (360 μE/m2 × s) ou baixa intensidade luminosa (laboratório convencional - 10 μE/m2 × s). Em um outro experimento (Fukushima et al., 2003) três cepas de Clostridium e uma de Thermoanaerobacter foram testados.

Para todas as cepas ensaiadas, não houve diferenças significativas entre as duas intensidades de luz em termos de lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo (Tab. 1). Os dados indicam que os benefícios advindos de iluminar o meio de cultura com uma lâmpada para acelerar o seu preparo não comprometem a utilidade do meio. Este mesmo procedimento pode ser generalizado e empregado em outras situações onde há cultivo de microrganismos anaeróbios (ou anaeróbios facultativos) fermentadores, tais como ensaios de degrabilidade ruminal, estudos em saneamento básico, produção de etanol de primeira geração, cervejarias, indústrias vinícolas, etc., onde se deseja processos fermentativos mais rápidos e otimização dos processos industriais.

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Tabela 1. Crescimento de bactérias anaeróbias em meios de cultura preparados de maneira convencional (Baixa intensidade luminosa) ou alta intensidade luminosa (Alta).

CONCLUSÕESIntensa iluminação (por exemplo, com uma ordinária lâmpada de

100W) de meio de cultura para microrganismos anaeróbios contendo Cys como agente redutor e RNO como indicador redox conduz a rápida obtenção da anaerobiose. Ao lado do tempo economizado (2-3 horas pelo método convencional versus 20-25 minutos usando a lâmpada), outras vantagens incluem redução do tempo de gaseificação do meio de cultura com CO2 e eliminação da purga de O2 contido no gás CO2 pela passagem forçada de CO2 através de filamentos de cobre superaquecidos. Esta aceleração no preparo do meio de cultura não resulta na formação de compostos inibitórios, pois o crescimento (medido em termos de lag time, taxa de crescimento e crescimento máximo) de bactérias estritamente anaeróbias foi o mesmo do obtido com o meio de cultura preparado de maneira convencional, sob baixa intensidade luminosa. Desta forma, nós sugerimos a utilização desta simples técnica, que em nada afeta a rotina do laboratório, para acelerar o preparo de meios de cultura para bactérias anaeróbias.

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novos desafios da pesquisa em nutriÇÃo e...

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