NOVAS TECNOLOGIAS DE EDIÇÃO DE GENES O impacto na sociedade

CRBio2 - XXIII Encontro de Biologia – ENBIO ES - 1/12/2017

Dra. Maria Antonia Malajovich Diretora Científica de ACTE

Biotecnologia: ensino e divulgação maria.antonia@bteduc.bio.br

COMO MODIFICAR UM GENOMA?

▪ Ação de agentes mutagênicos: produtos químicos, radiações (1927)

▪ Engenharia genética: inserção de DNA exógeno (1973)

▪ Opinião pública dividida por argumentos racionais, políticos e religiosos.

▪ Dificuldades: desenvolvimento de um traço novo (13 anos, 135 milhões US$) e aprovação doprocesso regulatório (75 novos estudos, 5 a 7 anos).

▪ Edição gênica ou genômica

▪ Baseada em proteínas ZFNs (Zinc finger nucleases, 2003) e TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases, 2010)

▪ Baseada no RNA: CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats, 2012)

A IMUNIDADE BACTERIANA

Os ataques virais (bacteriófagos) reduzem em 10% a capacidade da indústria de laticínios.

Trás o sequenciamento de Streptococcus thermofilus, descoberta das sequências CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats), que variam em diferentes linhagens e conferem resistência aos fagos (Mojica, 2005; Horvath e Barrangou, Danisco, 2007).

Genes Cas

Sequências espaçadoras

Sequências repetidas

CRISPRs: mecanismos de defesa (5 tipos e 16 subtipos) presentes em 40% das eubactérias e 90% das arqueas sequenciadas.

A IMUNIDADE BACTERIANA

1 – Ataque

2 - Fragmentação do DNA viral pelas enzimas de restrição bacterianas.

3 – Incorporação de algumas sequências de DNA do fago no genoma bacteriano entre os segmentos repetitivos do sistema CRISPR.

4 – Novo ataque

5 – Transcrição e processamento do DNA incorporado como CRISPR RNA, que se associa a Cas 9

6 - Degradação Cas-dependente do DNA do bacteriófago.

SEQUÊNCIA CRISPR

CRISPR EM PROCARIONTES

Streptococcus thermofilus

Cas9

5

CRISPR RNA

4

3

2

1

A IMUNIDADE BACTERIANA

Em 2007 Danisco é comprada por DuPont que registranumerosas patentes e inicia a vacinação das linhagensutilizadas na produção. A partir de 2012, produção dequeijo para pizza mediante linhagens CRISPR. Atualmente,todas as linhagens de DuPont estão CRISPeRizadas.

Não são organismos geneticamente modificados

UMA FERRAMENTA DE EDIÇÃO – CRISPR/Cas9

▪ Cas9 + crRNA (transcrito do lócus CRISPR) + tracrRNA (RNA transativador docrRNA) configuram uma endonuclease cujo sítio de clivagem está definido pelacomplementariedade de bases entre o crRNA e o DNA-alvo (Doudna eCharpentier, 2012).

▪ Para gerar uma nuclease sítio-específica basta sintetizar um RNA guia (gRNA=quimera de crRNA e tracrRNA) que, associado a uma nuclease como Cas9,produzirá um corte sítio-específico (Jinek et al. 2012).

▪ Nucleases sítio-específicas Cas9-gRNA agemtambém em células eucarióticas (levedura,camundongo)

▪ Com algumas pequenas alterações essanuclease pode agir também em célulashumanas eucarióticas, inclusive humanas(Zhang, 2013; Church, 2013)

Introdução da enzima e do RNA-guia nas células mediante vetores (Lentivírus, vírus adenoassociados, plasmídeos, lipídeos) ou diretamente como ribonucleoproteína.

Possibilidade de fugir dos padrões atuais da regulamentação.

CRISPR

A GUERRA DAS PATENTES

▪ CRISPR/Cas9 não pode ser patenteada, porque se trata de um fenômeno natural.

▪ A patente das técnicas de edição gênica está sendo disputada por Doudna, Charpentier(Berkeley, Viena) e Zhang (Broad Institute).

▪ Atualmente, estariam sendo disputadas mais de 1880 famílias de patentes ligadas aCRISPR. Mais de 100 famílias novas, cada uma delas reclamando direitos de propriedadeintelectual são publicadas mensalmente (IPStudies, firma consultora Suiça).

A biotecnologia é um empreendimentomilionário construído sobre pesquisadores,universidades, empreendedores, empresas, einteresses econômicos de grandes capitais.

CRISPR COMO INSTRUMENTO DE PESQUISA

Mutação de ponto

Deleção de um ou de vários genes

Inserção de um transgene

Ativação da transcrição de um gene (Associação de Cas com molécula ativadora)

Repressão da transcrição de um gene (Bloqueio da RNA-polimerase por Cas)

Modificações epigenéticas (Associação de Cas com moléculas capazes de metilar ou acetilar histonas)

Indução de um gene por um estímulo externo (substâncias químicas, luz)

FACILIDADE DE ACESSO

▪ Instituições: Harvard Plasmid Database, DNASU Plasmid Repository, National Institutes of Health’s

PlasmID, Mammalian Gene Collection etc.

▪ Organizações independentes: Addgene - The non profit plasmid repository –

Em 2015, 60.000 plasmídeos enviados a pesquisadores de 80 países. Preço por plasmídeo 65 US$ (2016).

▪ Empresas: Invitrogen/Thermofisher

Ao alcance de todos,

biohackers incluídos

CRISPR NA INDÚSTRIA

Engineering any genome, at any site, in any way

Em bactérias, CRISPR permite remover modificações genéticas para se adequar a critérios de biossegurança ou de proteção da propriedade intelectual

Fermentações industriais

▪ Produção de enzimas, fragrâncias, flavores e novos materiais.

▪ Melhor qualidade e maiores rendimentos em materiais bioterapêuticos (Proteínas recombinantes, vacinas, vetores para terapias gênicas)

CRISPR NA AGRICULTURA

▪ Primeiro produto comercial liberado nos Estados Unidos: cogumelo (Agaricusbisporus) que não escurece. A USDA não considerou necessária sua regulação,assim como em relação a outros eventos anteriores obtidos mediante ZFN ouTALEN.

▪ Trigo com menos gliadinas - Com CRISPR/Cas9 foram deletados 35 dos 45 genesresponsáveis pela síntese dessas proteínas (Barro, 2014). Pequenos testes comcelíacos no México e na Espanha.

▪ Obtenção de linhagens de Gloria da manhã (Ipomoea nil), com flores brancas.

▪ Banana resistente a doenças.

E as grandes empresas?

Monsanto: primeira licença da tecnologia para uso agrícola (CRISPR-Cpf1).

DuPont: testes de campo para lançar em 2020 um milho com menos amilose, editado comCRISPR, de interesse para a indústria de alimentos.

Criação da Coalition for Responsible Gene Editing in Agriculture (The US Pork Board,Monsanto, Syngenta, Bayer)

CRISPR NA CRIAÇÃO DE ANIMAIS

▪ Gado bovino – Obtenção de gado sem chifres. Sexagem de embriões.

▪ Piscicultura - Inativação de genes codificadores de hormônios que assegure sua esterilidade em caso de escapamento (Ictalurus punctatus, Bagre americano ou Peixe gato).

▪ Avicultura – Galinhas poedeiras de ovos hipoalergênicos. Sexagem de embriões.

▪ Controle de doençasSuínos resistentes ao vírus da síndrome respiratória e à Febre Africana (transferência de um gene de javali, que é um animal naturalmente resistente).

Gado resistente ao tripanosoma da doença do sono.

▪ Melhoramento genético de mascotes (peixes, cachorros).

CRISPR NA SAÚDE

▪ Combate a infecções virais (HIV, Hepatite B) ou causadas por linhagens bacterianas altamente patogênicas.

▪ Possibilidade de xenotransplantes.

Inativação de 62 retrovírus endógenos potencialmente patogênicos ao homem e de 20 genes do porco, potencialmente imunogênicos e capazes de induzir rejeição. (Church, 2015).

▪ Obtenção de animais-modelo para o tratamento experimental de doenças (Duchenne, Fibrose cística).

▪ Terapias gênicas somáticas e luta contra o câncer.

Primeiros testes na China. Possibilidade de aperfeiçoamento da imunoterapiaCAR-T (Chimeric Antigen Receptor T-cell therapy) para o tratamento daleucemia linfoblástica aguda.

CRISPR NA SAÚDE - ASPECTOS CONTROVERSOS

▪ Suécia, Reino Unido e China já liberaram o uso da tecnologia em embriões humanosque não serão implantados.

Grupos chineses realizaram os primeiros estudos de reparação do gene HBB, responsável pela β-talassemia,e de incorporação de uma mutação no gene CCR5 para impedir a invasão pelo HIV. Pouca eficiência emutações off-target. CRISPR é uma tecnologia muito recente que ainda deve ser aperfeiçoada antes de seraplicada ao ser humano.

▪ A comunidade científica de vários países começa a vislumbrar a possibilidade de ediçãogenética de embriões para terapias gênicas da linhagem germinal, uma fronteira até agora

técnica e moralmente intransponível.

Qual será o posicionamento da sociedade ?

CRISPR, SAÚDE E MEIO AMBIENTE: ASPECTOS CONTROVERSOS

Erradicação de espécies invasoras ou de vetores dedoenças (Anopheles) mediante a inserção de genes quereduzam a viabilidade ou a fertilidade.

Normas estritas de segurança em função do risco dosgenes se espalhar em lugares onde a espécie não éinvasiva.

Gene drives

Um gene Cas9-gRNA inserido no seu sítio decorte irá reparar o cromossomo homólogo,transformando o heterozigoto em homozigoto ese espalhando rapidamente na população (Esvelt,2014).

BIOSSEGURANÇA E REGULAÇÃO

▪ As normas da legislação brasileira estão de acordo com o Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança

e as diretrizes do Codex Alimentarius e da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento

Econômico (OCDE). A principal norma reguladora brasileira sobre as atividades com organismos

geneticamente modificados é a Lei de Biossegurança (Lei n0 11.105, de 24 de março de 2005). A

palavra final sobre as questões técnicas corresponde à Comissão Nacional Técnica de Biotecnologia

(CTNBio).

▪ Qual o status de um organismo editado? Em primeira aproximação, seria um organismo

geneticamente modificado. Porém, diferentemente dos OGMs que estão no mercado, um organismo

editado não carrega necessariamente genes de outras espécies. A edição pode inativar um gene, gerar

uma versão mais favorável de um gene existente ou transferir uma variante da mesma espécie, tal

como ocorreria na natureza por mutação espontânea ou por melhoramento.

▪ A análise terá que ser caso a caso.

BIBLIOGRAFIA

▪ ADDGENE. https://www.addgene.org▪ CRISPR-Cas9 Animation. You Tube http://bit.ly/2zN5ANU▪ CRISPR Update – CRISPR Updates, News and Articles http://www.crisprupdate.com/▪ DOUDNA J., STERNBERG S.H. A Crack in Creation: Gene editing and the unthinkable power to control

evolution. Boston, Houghton Mifflin Harcourt, 2017.▪ GRENS K. There is CRISPR in your yoghurt. The Scientist January 2015. https://www.the-

scientist.com/?articles.view/articleNo/41676/title/There-s-CRISPR-in-Your-Yogurt/▪ INVITROGEN/THERMOFISHER. https://corporate.thermofisher.com/en/about-us/invitrogen.html▪ MOJICA F.M. Sistemas CRISPR-Cas, una revolución biotecnológica con origen bacteriano, 2016

https://www.youtube.com/watch?v=GOK6FkfmHdQ

▪ NATIONAL ACADEMIES OF SCIENCES, ENGINEERING, AND MEDICINE. Human Genome Editing: Science, Ethics, and Governance. Washington, DC: The National Academies Press, 2017. https://doi.org/10.17226/24623.

▪ Nature News – http://nature.com/news▪ Top Science News – ScienceDaily - https://www.sciencedaily.com/news/top/science

MUITO OBRIGADA!

maria.antonia@bteduc.bio.br