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Nos eucariotos, os genes que controlam as enzimas de vias metabólicas não estão ligados ouagrupados nos cromossomos; a transcrição ocorre no núcleo e a tradução, no citoplasma (nosprocariotos, ambas ocorrem em grande proximidade física). O RNAm dos eucariotos tambémvaria muito em sua estabilidade, sendo alguns bastante estáveis, o que permite pontos múltiplosde controle.

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Com algumas exceções, pode-se dizer que todas as células de um organismo contêm os mesmosgenes. No entanto, em um determinado tecido ou órgão, apenas um grupo desses genes éexpresso. Na espécie humana, por exemplo, muitos processos celulares e os genes que osdeterminam são comuns a todas as células do nosso corpo, como os genes das proteínasribossômicas, cromossômicas (histonas) e do citoesqueleto, constituindo os chamados genes demanutenção (ou housekeeping). Entretanto, embora teoricamente todas as células tenham osmesmos genes, algumas se diferenciam em células do sangue, outras em células musculares,outras em neurônios, etc, devido a um controle coordenado e diferencial da expressão de genesestruturais, o qual pode ocorrer em diferentes estágios e em diferentes células. Esse controle,em geral, é exercido por um gene denominado gene regulador, que produz uma proteínadiferente das que são codificadas pelos genes estruturais e cuja única função é controlar aexpressão desses últimos genes por meio de sua ligação a sítios particulares do DNA, agindosobretudo na transcrição.

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Figura: Representação esquemática de um gene estrutural eucariótico típico, mostrando aregião flanqueadora à montante (à esquerda), que constitui a região promotora do gene; o sítiode início da transcrição; os éxons e os íntrons; e o sítio de finalização da transcrição. Em genescodificadores de proteínas, os íntrons em geral interrompem a região codificadora. Além disso,também podem ocorrer íntrons que interrompem regiões flanqueadoras (5’-UTR e 3’-UTR), quesão transcritas, mas não são traduzidas (UTR – untranslated region = região não traduzida). Emrazão das sequências nucleotídicas presentes, íntrons eucarióticos, em geral, não adotamestruturas secundárias (por pareamento intercadeia) no contexto de transcritos de RNA. Porsito, dependem de um complexo ribonucleoproteico (spliceossomo) para a sua remoção.

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*As histonas se ligam ao DNA graças à interação de seus radicais amino com os radicais fosfatodo DNA. Nem todos os radicais fosfato estão neutralizados pelas histonas, o que confere àcromatina um caráter ácido (afinidade por corantes básicos).

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Cada cromossomo contém um único duplex de DNA, compactado em uma fibra que se estendecontinuamente ao longo de todo o cromossomo. Assim, no que diz respeito à cromatinainterfásica e ao cromossomo mitótico, podemos explicar a compactação de uma molécula deDNA única e extremamente longa, em uma forma na qual pode ser transcrita e replicada etambém ser ciclicamente mais ou menos comprimida.A disposição da cromatina dentro do núcleo e o seu grau de condensação variam de um tipocelular para outro (são característicos de cada tipo celular). Além disso, a mesma célula podeapresentar a cromatina com vários graus de condensação, de acordo com o estágio funcional ecom o estado de diferenciação em que se encontra.

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Os genes localizados na eucromatina podem se expressar ou não, dependendo do tipo celular ede suas necessidades metabólicas. Existem pelo menos duas formas de eucromatina: cerca de10% na forma de cromatina ativa, que é menos condensada, e o restante na forma de cromatinainativa, que é mais condensada. A heterocromatina constitutiva está sempre condensada.Consiste, na maior parte, de DNA repetitivo e é encontrada nos centrômeros e ao redor deles eem algumas outras regiões. Ela passa pelo ciclo celular com poucas mudanças no seu grau decondensação. Forma uma série de massas discretas, mas, frequentemente, as diversas regiõesde cromatina agregam-se em um cromocentro densamente corado.A heterocromatina facultativa pode existir tanto na forma geneticamente ativa (descondensada)quanto na forma inativa (condensada), como no caso da inativação do cromossomo X emmamíferos.A mesma fibra cromatínica pode apresentar regiões eucromáticas contínuas com regiõesheterocromáticas. Assim, o material genético é organizado de modo que diferentes estados decompactação sejam mantidos lado a lado, possibilitando a ocorrência de alterações cíclicas nonível de compactação da cromatina entre a intérfase e a divisão, e entre as diferentes fases davida da célula.

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Os cromossomos normais têm um só centrômero, o qual é visto ao miscroscópio como uma constrição primária, aregião em que as cromátides-irmãs estão unidas. O centrômero é essencial para a segregação durante a divisãocelular.Funções:-ponto de ligação das fibras de microtúbulos durante a divisão celular;-ponto de reunião de cromátides-irmãs;-motor mecano-químico responsável pelo movimento dos cromossomos para os pólos da célula e conclusão dadivisão celular.Durante a prófase tardia, um par de cinetócoros forma-se em cada centrômero, cada um ligado a uma dascromátides-irmãs. Múltiplos microtúbulos ligam-se a cada cinetócoro, ligando o centrômero de um cromossomo aosdois pólos do fuso. Os cinetócoros desempenham um papel fundamental nesse processo, controlando a reunião e aseparação dos microtúbulos acoplados e, por meio da presença de moléculas motoras, dirigindo o movimentocromossômico.Os telômeros são estruturas especializadas, constituídas por DNA repetitivo (repetições em tandem ou agrupadas) eproteína, que cobrem as extremidades dos cromossomos eucarióticos.Funções prováveis:-manter a integridade estrutural do cromossomo: se um telômero for perdido, a extremidade cromossômicaresultante fica instável, tendendo a fundir-se com as extremidades de outros cromossomos quebrados ou envolver-seem eventos de recombinação ou ser degradada.-garantir a replicação completa das extremidades codificadoras dos cromossomos: durante a replicação do DNA, asíntese da fita atrasada é descontínua e requer a presença de algum DNA à frente para um primer de RNA.-auxiliar o estabelecimento da arquitetura tridimencional do núcleo e/ou do pareamento cromossômico: asextremidades dos cromossomos parecem estar ligadas à membrana nuclear, sugerindo que os telômeros auxiliam noposicionamento dos cromossomos.-auxiliar no reconhecimento entre cromossomos homólogos para pareamento na meiose.Origens de replicação: necessárias para que ocorra a replicação do DNA na fase S da intérfase. São seqüências de DNAcis-ativas, situadas próximas aos pontos onde a síntese de DNA é iniciada, que controlam o início da replicação. Noseucariotos existem várias origens da replicação (replicadores) autônomas (ARS – autonomously replicatingsequences) ao longo de uma única molécula (para cada origem, duas forquilhas de replicaçãobidirecionais).

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As histonas H3 e H4 apresentam seqüências idênticas em organismos tão distintos quanto aervilha e o boi, sugerindo que elas desempenham funções idênticas em todos os eucariontes. Ostipos H2A e H2B possuem também seqüências idênticas, com algumas variações espécie-específicas.Em alguns tecidos, a H1 é substituída por histonas especiais. Por exemplo, em eritrócitosnucleados de aves, a histona H5 é encontrada em substituição à H1.

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A porção enovelada da molécula das histonas contém alta percentagem de aminoácidoshidrofóbicos, e sua associação com o DNA deve-se à interações hidrofóbicas. Pode-se separar,por processos químicos, a molécula de DNA das moléculas de histonas. Mas quando o DNA e ashistonas são colocados juntos em condições favoráveis, ocorre novamente a formaçãoespontânea de nucleossomos.

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O nucleossomo é uma partícula de forma cilíndrica achatada, com 10 nm de diâmetro e 6 nm dealtura. Cada nucleossomo é constituído por 200 pb de DNA associados a um octâmero dehistonas e a uma molécula de histona H1. O octâmero é formado por duas moléculas de cadauma das histonas H2A, H2B, H3 e H4. A molécula de H1 se associa externamente ao DNA queenvolve o octâmero. Cada nucleossomo é formado por um centro ou cerne, constituído pelooctâmero de histonas H2A, H2B, H3 e H4, em torno do qual se enrola um segmento de DNA deaproximadamente 146 pb. Conectando um centro de nucleossomo a outro, encontra-se umsegmento de DNA não associado a proteínas com 15 até 100 pb, chamado DNA de ligação.

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Dois tipos de fibras cromatínicas são encontradas no núcleo interfásico: a fibra de 10 nm dediâmetro ou nucleofilamento e a fibra de 30 nm ou solenoide.A fibra de 10 nm constitui o primeiro nível de compactação da cromatina e é formada pelaassociação de nucleossomos adjacentes. A organização dessa fibra depende da interação entreas histonas H1 de nucleossomos vizinhos. A histona H1 de um nucleossomo liga-se através desua extremidade amino-terminal, à extremidade carboxi-terminal da H1 do nucleossomoadjacente, em um arranjo “cabeça-cauda”. Com essa organização, o DNA de ligação não é maisobservado na fibra de 10 nm.A fibra de 30 nm constitui o segundo nível de organização da cromatina e é formada peloenovelamento da fibra de 10 nm em uma estrutura helicoidal. Cada volta da espiral contém 6nucleossomos organizados radialmente, ficando a histona H1 localizada no interior da fibra. Ahistona H1, juntamente com íons Mg2+ em concentração adequada, tem papel preponderantena formação e estabilização dessa fibra.Durante a intérfase, a cromatina que contém os genes ativamente transcritos é formada, em suamaioria, por fibras de 30 nm, enquanto cerca de 10% estão na forma de fibras de 10 nm,permitindo o acesso às enzimas envolvidas na transcrição.

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Ainda no núcleo interfásico, as fibras de 30 nm podem se organizar em grandes alças que seprendem ao envoltório nuclear através da lâmina nuclear. Cerca de 10% da cromatina interfásicatambém se encontra em um estado altamente condensado – a heterocromatina.Níveis superiores de compactação da cromatina parecem envolver, principalmente, as proteínasnão-histônicas. A histona H1 parece, no máximo, participar também do processo decompactação, uma vez que a sua fosforilação, durante a prófase, determina a condensação doscromossomos.

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As histonas são suscetíveis a uma grande variedade de modificações pós-traducionais, tais comoacetilação, fosforilação, metilação e ubiquitinação. A maioria dessas modificações acontece nodomínio N-terminal das histonas, que é rico nos aminoácidos básicos lisina e arginina (mastambém podem ocorrer nos domínios globulares).Enzimas como a acetiltransferase, as quinases e as metiltransferases, que depositammarcadores químicos nas histonas (acetil, fosfato e metil, respectivamente), são reguladoresimportantes da atividade gênica, da dinâmica dos cromossomos, da regulação do ciclo celular eda organização do genoma.

As necessidades regulatórias dos organismos superiores podem ser divididas em dois tipos: (a)regulação com efeitos de longo prazo, que envolve a diferenciaçãomorfológica e funcional permanente; (b) regulação com efeitos de curto prazo, que resulta emrespostas imediatas, porém transitórias, a um dado estímulo.

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A diferenciação celular, durante o desenvolvimento ontogenético(*), depende da regulação daexpressão dos genes que as células contêm. No início do desenvolvimento embrionário demuitas espécies, a diferenciação está controlada por fatores de origem materna encontrados nocitoplasma do ovo. Depois de algum tempo, entretanto, os próprios genes do embrião começama se tornar ativos.

(*) Desenvolvimento ontogenético corresponde ao conjunto de transformações que ocorremem um organismo, desde que se forma o zigoto, passando por todas as fases embrionárias, atéque se complete a sua formação.

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No início do desenvolvimento embrionário de muitas espécies, a diferenciação está controladapor fatores de origem materna encontrados no citoplasma do ovo. Depois de algum tempo,entretanto, os próprios genes do embrião começam a se tornar ativos.

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Em mamíferos, por exemplo, a síntese do mRNA inicia-se no estágio de quatro células, emboraos embriões continuem a usar o mRNA de origem materna por bom período de tempo.Normalmente, os genes estão cuidadosamente regulados para se tornarem ativos no momentoespecífico em que um dado produto gênico é necessário.

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Os genes reguladores podem ser distinguidos dos estruturais pelos efeitos das mutações. Umamutação em um gene estrutural modifica uma proteína específica codificada por esse gene. Jáuma mutação em um gene regulador influi na expressão de todos os genes estruturais que eleregula. A natureza dessa influência revela o tipo de regulação: negativa ou positiva.

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Na regulação dita negativa, os genes são transcritos, a menos que sejam desativados pelaproteína reguladora. Assim, uma mutação que inative o regulador faz com que os genesestruturais permaneçam se expressando. Visto que a função do regulador, nesse caso, é impedira expressão dos genes estruturais, ele é denominado repressor.

Por outro lado, na regulação positiva, os genes estruturais só são transcritos se os genesreguladores os ativarem. Na ausência do regulador, os genes não se expressam.

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Os mecanismos e as moléculas que executam os vários tipos de controle ainda não sãototalmente conhecidos, mas alguns deles já foram descritos.A regulação da expressão gênica nos eucariotos pode ocorrer em qualquer uma das etapas quevão do DNA aos produtos proteicos. A Figura mostra os principais modos de regulação e osmomentos em que podem ocorrer, todos afetando o grau da expressão dos genes. Certascaracterísticas das células eucarióticas possibilitam-lhes a utilização de vários modos deregulação:(a) o alto conteúdo de DNA associado com as histonas e outras proteínas, formando estruturascompactas de cromatina, que são modificadas durante a expressão gênica, no interior donúcleo; (b) antes de serem transportados para o citoplasma, os mRNAs são encadeados,capeados (CAP) e poliadenilados, e cada um desses processos pode ser regulado de modo ainfluir na quantidade e nos tipos de mRNAs disponíveis para a tradução; (c) depois datranscrição, o transporte dos mRNAs para o citoplasma também pode ser regulado para modulara disponibilidade desses RNAs à tradução; (d) os mRNAs têm meias-vidas variáveis, podendo serregulados para retardar sua degradação; (e) as taxas de tradução podem ser moduladas, bemcomo o processamento, as modificações e a degradação das proteínas.

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O DNA eucariótico combina-se com histonas e outras proteínas, formando a cromatina, queintegra e forma os cromossomos. O maior grau de compactação da cromatina pode inibir areplicação, a transcrição e o reparo, do DNA. A capacidade de ser alterada a associação entre oDNA e outros componentes da cromatina é essencial para permitir o acesso das proteínasreguladoras do DNA; por isso o remodelamento (ou remodelagem) da cromatina é importantena regulação gênica.

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Epigenética: estudo de mudanças na função gênica, herdáveis mitoticamente e/oumeioticamente e não vinculadas a mudanças na sequência do DNA.O remodelamento pode ocorrer de várias maneiras, por exemplo: alteração da composição oudo posicionamento dos nucleossomos (unidades básicas da cromatina), facilitando a transcriçãogênica; modificações das histonas, relaxando sua associação com o DNA; metilação do DNA, istoé, adição de grupamentos metila às suas bases (com mais frequência à citosina), reprimindo atranscrição mediante inibição da ligação dos fatores de transcrição ao DNA. Há uma relaçãoinversa entre o grau de metilação e o grau de expressão gênica, ou seja, os genes que sãotranscritos ativamente estão desmetilados ou com baixo nível de metilação.

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In vivo, os resíduos de lisina podem ser mono, di ou trimetilados, enquanto os de arginina, monoou bimetilados.

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Em 1993, Alan Wolffe mostrou que acetilases/desacetilases formam complexos com fatores detranscrição que ligam/desligam os genes.Em 1998 Adrian Bird et al. mostraram que as desacetilases podem funcionar em conjunto commetilases: se a desacetilase for inibida, a metilação não inativa os genes.

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Formas ubiquitiladas de histonas H2A e H2B foram associadas especificamentecom genes ativos, tornando a ubiquitilação de histona um dos primeirosmarcadores de cromatina transcricionalmente activo a ser reconhecidoA ubiquitilatição da histona H2B, mediada pela enzima ubiquitina-conjugante(Ubc) Rad6, é implicada na repressão transcricional do gene argininosuccinatosintase (ARG1) e manutenção do silenciamento telomérico em Saccharomycescerevisiae. A ubiquitilação de da histona H2B (uH2B) é necessária para ametilação da histona H3 nos resíduos de lisina 4 (K4) e 79 (K79). A metilaçãohistona H3, por sua vez, é necessária para o silenciamento do gene-telomérico.

Figura: A histona H2B é reconhecida pela Rad6 e suas proteínas auxiliares e éubiquitilada na sua lisina 123. Esta ubiquitinação serve como um sinal dereconhecimento direto ou indireto para COMPASS, que catalisa a metilação daquarta lisina da histona H3, resultando no silenciamento transcriptinal de geneslocalizados perto do telômero.COMPASS: a metilação de lisina 4 na cauda amino-terminal da histona H3,mediada por um complexo multiproteico chamdo compass, é necessária parasilenciar a expressão de genes localizados perto dos telômeros cromossômicos edentro do rDNA.

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O grupo fosfato é fortemente negativo, então sua adição induz forças na cadeiaprotéica que podem levar a uma radical alteração em sua conformação. Dessemodo, uma proteína pode expor os aminoácidos antes escondidos em seu centroe mudar muito suas características. Por exemplo, uma proteína apolar ehidrofóbica pode se tornar polar e hidrofílica.Figura de cima: após a estimulação pelo fator de crescimento, a via da MAPquinase é ativada, resultando na fosforilação da histona H3 em dois resíduosespecíficos de serina (S10 e S28). Estes eventos de fosforilação correlacionamcom a ativação da transcrição de genes.MAP quinase (Mitogen Activated Protein Kinases): Proteínas-quinase ativadaspor mitógenos. É uma subfamília de proteínas-quinase específicas deserina/treonina que respondem a estímulos extracelulares (mitógenos) eregulam várias atividades celulares, como expressão gênica, mitose,diferenciação, sobrevivência celular e apoptose (morte celular).Figura de baixo: a fosforilação de H3 promove também a acetilação da mesmahistona e estas modificações funcionam em conjunto para ativar a expressão dogene.A desfosforilação é realizada pelas fosfatases.

SAH: S-adenosil-homocisteína, produzida por desmetilação da SAM.A natureza das desmetilases é desconhecida.A metilação consiste em uma modificação covalente do DNA na qual umgrupamento metil (CH3) é transferido da S-adenosilmetionina para o carbono 5de uma citosina (5-Mec ou 5-metil-citosina) que geralmente precede umaguanina (dinucleotídeo CpG), pela ação de uma família de enzimas que recebe onome de DNA metiltransferases (DNMT).

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As DNA metiltransferases estão divididas em duas classes de representantes:aquelas envolvidas na metilação de fitas hemimetiladas do DNA (fitas de DNA emprocesso de replicação), conhecidas como metilases de manutenção como aDNMT1; e outro grupo, responsável pela maioria dos processos de metilação denovo, que ocorre em sítios com nenhum tipo de indicação de metilação, ou seja,sem a presença de metilação prévia, como as DNMT2, DNMT3A e DNMT3B.Os doadores de radical metil são obtidos pela dieta e são principalmente ametionina, seguido do folato, colina e vitamina B12.

A desmetilação pode ocorrer na ausência de DNMT1 com rodadas contínuas dereplicação do DNA (desmetilação passiva), bem como ativamente (sem areplicação do DNA). O processo denominado de desmetilação ativa envolve asdesmetilases e parece ser necessário para ativar genes específicos ou apagar amarca epigenética durante o desenvolvimento ou em respostas a perturbaçõesambientais. A desmetilação ainda pode ser passiva quando não há envolvimentode desmetilases e ocorre quando a manutenção pelas metiltransferases éinativada durante o ciclo celular. Assim, o nível e o padrão de 5-Mec sãodeterminados por ambos os processos de metilação e desmetilação, e asenzimas envolvidas nesses processos devem estar altamente reguladas.

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Os dinucleotídeos CpG aparecem esparsos pelos genomas eucariotos ouagrupados em regiões definidas como ilhas CpG. Essas ilhas são frequentes emregiões promotoras de certos genes, incluindo genes housekeeping. A transcriçãogênica pode ser fortemente inibida pela adição de radical metil. A presença deum “capuz” metil sobre uma citosina que precede a uma guanina pode inibir aligação de fatores de transcrição a essas regiões. A não ligação de fatores detranscrição aos seus sítios específicos resulta na ausência de transcrição gênica.Ao contrário, a desmetilação leva ao aumento da transcrição gênica. Assim, CpGsmetilados estão associados com DNA silenciados (transposons, genesimprintados), enquanto CpGs não-metilados estão associados a genes ativos.

Definindo: “ilhas CpG” são regiões do DNA com mais de 200 pares de bases (pb),contendo aproximadamente 50% de bases C e G e com uma presença esperadade proximadamente 60% de dinucleotídeos CG.

Em células embrionárias indiferenciadas, a porcentagem de metilação em CpA,CpT ou CpC é alta e isso poderia estar relacionado com a pluripotência dessascélulas.

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Imprinting genômico: processo normal, no qual genes específicos são geralmentemarcados por metilação (imprinting), seguindo um padrão (materno ou paterno)durante a gametogênese. Progenitores podem contribuir com genes exatamenteiguais aos seus descendentes, mas se estes genes forem marcadosdiferentemente (imprinting), não terão efeitos idênticos. Sua expressão irádepender da origem (materna ou paterna) desse gene.

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Exemplos na natureza:égua + jumento = mula ( ) ou burro ( )égua + cavalo = égua ( ) ou cavalo ( )jumenta + jumento = jumenta ( ) ou jumento ( )

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Ambas síndromes são mais frequentemente causadas por microdeleções naregião cromossômica 15q11-q13 que é sujeita a impressão genômica. Por causada impressão genômica, há expressão monoalélica diferencial de genes noscromossomos homólogos 15 paterno e materno, e assim as microdeleçõesresultam em completa deficiência de expressão de genes críticos.

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O produto de XIST (TsiX) é um RNA com 15 Kb não-codificante transcrito a partir da fita anti-senso do gene Xist, que fica associado ao X inativo, envolvendo-o. Esse RNAm é apenastranscrito, não sendo traduzido em proteína. A expressão do gene XIST determina osilenciamento dos outros genes do cromossomo X. O gene XIST não age sozinho na iniciação dainativação, sofrendo influência de outros genes.Cerca de 16 genes do cromossomo X inativado escapam à inativação: 12 deles têm homólogosno cromossomo Y. Além disso, alguns genes apresentam inativação variável entre diferentesindivíduos.Em células embrionárias após o 13º-16º a não inativação de um dos cromossomos X, isto é, apermanência de dois cromossomos X ativos, é um evento letal. Em células somáticas é umevento raro, podendo ocorrer em células normais ou neoplásicas.X inativado tem replicação tardia.

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A regulação da transcrição do DNA em uma molécula de mRNA envolve vários tipos diferentesde sequências de DNA, a interação de muitas proteínas, o remodelamento da cromatina e aformação de alças e dobramentos de sequências de DNA.

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Os genes eucarióticos têm diversos tipos de sequências reguladoras, como os promotores,silenciadores e reforçadores.

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Os promotores são sequências de DNA que funcionam como sítios de reconhecimento para amaquinaria da transcrição, com localização adjacente aos genes por eles regulados. Geralmentetêm centenas de nucleotídeos e especificam o início e a direção da transcrição ao longo do DNA.

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As sequências mais conhecidas (chamadas boxes) incluem: (1) TATA box, que frequentementecontém 7 a 8 pb na sequência-consenso TATAAAA, localizando-se cerca de 25 a 30 pb 5' àmontante ou à esquerda do sítio de início da transcrição; mutações nessas sequências reduzema transcrição e deleções podem alterar o sítio de início da transcrição.O elemento TATA é o sítio onde se liga o fator de transcrição TFIID. A proteína de ligação a TATAé uma das subunidades de TFIID, e se liga primeiro ao elemento TATA.

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(2) CAT (CAAT ou CCAAT) box, sequência-consenso localizada aproximadamente 70 a 8 pb 5'acima ou à esquerda do sítio de início da transcrição, sendo menos presente do que o TATA box;quando presente, contribui para uma transcrição quantitativamente mais eficiente.As sequências reguladoras localizadas no promotor são consideradas de atuação cis, quandoafetam apenas a expressão do gene adjacente, e de atuação trans, quando atuam sobre genesdistantes, geralmente sobre ambas as cópias de um gene em cada cromossomo. Em algunsgenes humanos, como o da distrofia muscular Duchenne, existem vários promotores, situadosem diferentes regiões do gene. Dessa forma, a transcrição gênica pode começar em pontosdistintos, produzindo proteínas também diferentes. Isso permite que a mesma sequência gênicacodifique variantes de uma proteína em tecidos diferentes (p. ex., no tecido muscular versustecido cerebral).

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(3) GC box ou GGGCGGG, sequência-consenso particularmente presente na região promotorados genes de manutenção, alguns dos quais não possuem os TATA e CAT boxes, mas sãoextremamente ricos em GC na região promotora. Os elementos CAAT e GC ligam-se aos fatoresde transcrição e funcionam também aproximadamente como reforçadores.

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As sequências reguladoras localizadas no promotor são consideradas de atuação cis, quandoafetam apenas a expressão do gene adjacente, e de atuação trans, quando atuam sobre genesdistantes, geralmente sobre ambas as cópias de um gene em cada cromossomo.

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Em alguns genes humanos, como o da distrofina (distrofia muscular Duchenne), existem váriospromotores, situados em diferentes regiões do gene. Dessa forma, a transcrição gênica podecomeçar em pontos distintos, produzindo proteínas também diferentes. Isso permite que amesma sequência gênica codifique variantes de uma proteína em tecidos diferentes (p. ex., notecido muscular versus tecido cerebral).

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Os reforçadores (também chamados acentuadores ou enhancers) são sequências de DNAsituadas a uma distância variável dos genes estruturais, que aumentam o nível da transcrição degenes que lhes estão próximos ou distantes, e interagem com os promotores. Essas sequênciaspodem estar localizadas acima (5’, upstream, à montante ou à esquerda), abaixo (3’,downstream, à jusante ou à direita) ou dentro do gene a ser transcrito e podem também estardistantes muitos milhares de pares de base deste, e em qualquer uma das fitas. São sítios deligação de proteínas ativadoras, que são colocados em proximidade ao gene pelo dobramentodo DNA.Exemplos: os primeiros reforçadores descobertos foram os de certos vírus de DNA, como oSV40, capazes de aumentar a transcrição de um grande número de genes em praticamentetodos os tecidos testados. Mais recentemente, foram descobertos reforçadores específicos paraalguns tecidos ou células, como, por exemplo, o reforçador localizado no gene daimunoglobulina, o qual é funcional nas linfócitos B, mas não em outros tipos de células.

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Uma vez que os reforçadores se situam a distâncias variáveis dos promotores, existe ummecanismo de dobramento ou inversão do DNA, que permite a interação simultânea de várioselementos reguladores, pela formação de uma ou mais alças ou laços complexos do DNA. Ainteração reforçador-promotor também pode ocorrer quando uma proteína reguladora se ligaprimeiramente ao reforçador e depois desliza no DNA até se ligar a um promotor. Acredita-seque as proteínas que se ligam a enhancers causem uma curvatura no DNA e permitam umacesso mais fácil das proteínas da maquinaria de transcrição a um determinado promotor.

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Os silenciadores são sequências curtas de DNA, também de atuação cis, que reprimem o nível datranscrição. Frequentemente agem de modo tecido-específico ou cromossomo-específico paracontrolar a expressão gênica. Um exemplo de silenciador é o do gene da tireotropina humana,que codifica uma subunidade do hormônio tireotropina e só se expressa nas células produtorasde tireotropina (os tireotrofos) da glândula hipófise. Sua transcrição restringe-se aos tireotrofos,por efeito do silenciador, situado a 140 pb a montante do sítio de início da transcrição. Essesilenciador liga-se ao fator celular Oct-1 que, no âmbito do promotor do gene da tireotropina ,reprime a transcrição em todos os tipos celulares, exceto os tireotrofos. Nestes, a ação dosilenciador é suplantada pela ação do reforçador localizado a mais de 1,2 kb acima do promotor.

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Resumindo, os promotores, reforçadores e silenciadores influem no início da transcrição, porconsistirem em sítios de ligação para proteínas conhecidas como fatores de transcrição, que seligam ao DNA e podem ter efeitos variados sobre a transcrição, aumentando, diminuindo oumodulando o nível da expressão gênica. Esses fatores de transcrição são produzidos por genesque controlam a transcrição do DNA para o RNA e, ativados por sinais extracelulares, ligam-se aopromotor, formando complexos que iniciam a transcrição, com o auxílio da RNA-polimerase. AFigura apresenta de forma esquemática o complexo de iniciação da transcrição, mostrando osprincipais elementos reguladores.Figura: Representação esquemática da formação do complexo de iniciação da transcrição. A -Uma proteína de ligação TATA liga-se ao TATA box no promotor de um determinado gene. B -Proteínas coativadoras reúnem-se em torno da proteína referida no item A. C - Proteínasativadoras e repressoras ligam-se ao conjunto assim formado, para controlar o ritmo datranscrição, e sua presença é transmitida ao gene que deverá ser expresso, pelas proteínascoativadoras referidas no item B e unidas à proteína de ligação TATA. D - Finalmente, proteínasdenominadas fatores basais ou gerais de transcrição unem-se à proteína de ligação TATA, demodo a fazerem espaço para a RNA-polimerase ligar-se ao promotor.

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A regulação pós-transcricional se dá durante o processamento do hnRNA ou pré-mRNA emmRNA, que inclui a remoção dos íntrons, o encadeamento dos éxons e a adição de cap àextremidade 5' do mRNA e da cauda poli-A à sua extremidade 3'. Depois, o mRNA é enviado aocitoplasma, onde é traduzido e degradado. Cada passo desse processamento pode ser reguladopara controlar a quantidade de mRNA funcional disponível para sintetizar o produto proteico,com consequências para a velocidade de tradução e a estabilidade e atividade desse produto.

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Os principais mecanismos de regulação pós-transcricional são o encadeamento (splicing)alternativo, o controle da estabilidade do mRNA e o silenciamento mediado pelo RNA.

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O encadeamento (splicing) alternativo produz diferentes moléculas de mRNA a partir do mesmopré-mRNA, gerando maior número de produtos proteicos por gene, com funções similares oudiferentes. Esse tipo de encadeamento é bastante comum em vertebrados, inclusive oshumanos.Há muitas formas de recombinar os exons, desde que mantida a ordem em que aparecem nasequência de DNA.Figura: Variedade de eventos básicos de splicing alternativo. Em amarelo estão os exons quesempre permanecem na sequência final do mRNA; em laranja os exons que podem ser retirados(e, neste caso, são considerados introns pela maquinaria de splicing) ou não; e em linha preta osíntrons. Os padrões de splicing estão indicados pelas linhas tracejadas. Um dos mecanismosalternativos possíveis é a excisão de um exon interno à sequência do gene, como mostrado em(a). Neste caso, ele se comporta como um intron, e a proteína resultante será mais curta. Outraforma comum é a presença de sítios 5' (mostrado em b) ou 3' (mostrado em c) alternativos desplicing, que levam à inclusão ou não de um exon. Empregando diferentes sítios 5' aceptores desplicing é possível também trocar o promotor de um gene (d). Analogamente, empregando sítiosalternativos 3‘ de splicing podemos mudar o sítio de poliadenilação do mensageiro final (e).Exons internos podem ser incluídos ou não na sequência final do mRNA, independente dosdemais exons (f). Alternativamente, exons mutuamente excludentes podem permutar de lugarna forma madura mo mRNA (g).Múltiplos sítios de poliadenilação: o processamento diferencial da extremidade 3’ é uma formade gerar diferentes mRNA maduros por splicing alternativo, podendo ocorrer a adição da caudapoli(A) em dois ou mais sítios, de acordo com o sítio de poliadenilação do éxon incluído nosplicing alternativo.

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As modificações no encadeamento (splicing) podem alterar a atividade enzimática, a capacidadede ligação com o receptor ou a localização de uma proteína na célula. Por isso, constituemeventos reguladores importantes que ajudam a controlar diversos aspectos como, por exemplo,o desenvolvimento pluricelular, a apoptose e a conexão entre os neurônios.

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O controle da estabilidade do mRNA relaciona-se com a quantidade de um mRNA na célula, queé determinada pela combinação entre a taxa de transcrição do gene e a taxa de degradaçãodesse mRNA. A duração de um mRNA, definida em termos de meia-vida, pode variar bastante epode ser regulada em resposta às necessidades da célula. Por exemplo, a grande quantidade dealgumas proteínas envolvidas na regulação da transcrição gênica, no crescimento e nadiferenciação celulares é determinada mais pelo controle da taxa de degradação dos mRNAsdessas proteínas do que pela regulação da taxa de transcrição gênica.

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A degradação do mRNA pode dar-se por três vias gerais, cada uma sujeita à regulação: (a)enzimas que encurtam a cauda de poli-A; em mRNAs recém-sintetizados, essa cauda tem cercade 200 nucleotídeos e se liga a uma proteína de ligação à poli-A, que ajuda a estabilizar o mRNA,mas se a cauda for encurtada para menos de 30 nucleotídeos, esse mRNA se torna instável e élogo degradado pelas exonucleases; (b) enzimas que removem o cap, tornando instável o mRNA;(c) clivagem interna do mRNA por uma endonuclease, expondo extremidades desprotegidas, pormeio das quais a degradação pode continuar. Como um mRNA normal pode tornar-se alvo dedegradação? Um modo de alterar sua meia-vida é por intermédio do elemento rico emadenosina-uracil (ARE, de adenosine-uracil rich element), uma sequência de ribonucleotídeos A eU, localizada geralmente nas regiões 3' não traduzidas dos mRNAs que têm meias-vidas curtas ereguladas. Esses mRNAs codificam proteínas envolvidas no crescimento celular ou no controleda transcrição, que precisam ser moduladas rápida e abundantemente.Em células com baixos níveis de expressão gênica, as sequências ARE do mRNA se ligam acomplexos específicos que realizam o encurtamento da cauda de poli-A e a rápida degradaçãodo mRNA. As doenças autoimunes, algumas condições inflamatórias e certos tipos de câncerparecem estar associados a defeitos no controle da estabilidade do mRNA por meio dassequências ARE.

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O silenciamento mediado pelo RNA, também conhecido como interferência por RNA (RNAi), é aregulação da expressão gênica exercida por pequenas moléculas de RNA de fita dupla (compouco mais de 20 nucleotídeos) no citoplasma, por meio de repressão da tradução e indução dadegradação do mRNA, quando esse tem uma sequência complementar a uma das fitas do RNAde fita dupla. Bastam poucas moléculas de fita dupla para realizar a degradação de grandesquantidades de mRNA. Recentemente, foi demonstrado que esses pequenos RNAs (pequenoRNA interferente [siRNA], microRNA [miRNA] e o RNA associado à proteína Piwi [piRNA]) agemtambém no núcleo, alterando a estrutura da cromatina e reprimindo a transcrição.Aparentemente, os mecanismos de RNAi se conservaram em todos os eucariotos, inclusive oshumanos, nos quais constituem um mecanismo de defesa natural contra infecções virais.

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O RNAi é sistêmico em plantas e nematóides, espalhando-se de célula para célula. Em C.elegans, o RNAi é também hereditário: o silenciamento pode ser transferido para a progênie doverme que foi originalmente injetado com o dsRNA.

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As características que definem os pequenos RNAs de silenciamento são o seu pequeno tamanho(~20–30 nucleotides) e a sua associação com os membros da família de proteínas argonautas,que os guiam para seus alvos de regulação, tipicamente resultando em expressão reduzida degenes-alvo. Além dessas características definidoras, diferentes classes de pequenos RNAorientam esquemas diversos e complexos de regulação gênica. Alguns pequenos RNAs desilenciamento, tais como os pequenos RNAs de interferência (siRNAs), derivam de dsRNA,enquanto outros, como os RNAs de interação com proteínas Piwi (piRNAs), não o fazem.

Proteínas argonautas: componentes fundamentais de um complexo ribonucleoprotéicochamado RISC (complexo de silenciamento induzido por RNA, do inglês RNA-induced silencingcomplex), cujos alvos são moléculas de RNA mensageiro, onde atuam impedindo o processo detradução.

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Proteínas argonautas: componentes fundamentais de um complexo ribonucleoprotéicochamado RISC, cujos alvos são moléculas de RNA mensageiro, onde atuam impedindo oprocesso de tradução.

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A presença RNA de fita dupla (dsRNA) pode induzir a degradação de RNAs mensageiros (mRNA)homólogos por dois tipos de moléculas distintas (siRNA e miRNA), um processo conhecido comosilenciamento gênico pós-transcricional (Post transcriptional gene silencing, PTGS) em plantas e RNAde interferência (RNA interference, RNAi) em animais. O destino do mRNA alvo nem sempre é adegradação. Está só ocorrerá se a hibridização com a cadeia anti-senso do siRNA com o mRNA for perfeita.Se existirem zonas despareadas, ocorrerá o bloqueio da tradução.

siRNA: pequenos RNAs de interferência, do inglês small interfering RNAs. São produzidos a partir daclivagem de longas moléculas de dsRNA de origem exógena (como aquelas provenientes de vírus de RNA)ou endógena – endo-siRNA (originados, por exemplo, de transposons ou de elementos repetitivos emtandem tais como genes de RNA ribossomal 5S, entre outros). Estão envolvidos na degradação de RNAviral, interferindo ou mesmo bloqueando o ciclo de infecção.

miRNAs: micro RNAs. São produtos naturais da transcrição em muitos eucariotos e se originam a partir demRNA primários (pré-mRNA) de cadeia simples que formam uma estrutura secundária tipo “grampo decabelo” de ~70 nucleotídeos. Uma vez processados a miRNAs, seu tamanho é similar aos siRNAs. Emmoscas, vermes e mamíferos, alguns pré-miRNAs são produzidos pela via de splicing nuclear pré-mRNA.Regulam a expressão gênica negativamente por meio do pareamento de bases específicos a mRNAs alvo,resultando na clivagem do mRNA ou na repressão de sua tradução. miRNAs regulam diversas viasbioquímicas celulares e é acreditado que regulam a maioria dos processos em plantas e animais, desdefunções housekeeping (responsáveis pela fisiologia fundamental da célula) até respostas ao estresseambiental.

stRNAs: pequenos RNA temporais, do inglês small temporal RNA. São miRNAs envolvidos no controle dotempo do desenvolvimento do estágio larval (controle de expressão temporal) de C. Elegans.Mamíferos e C. elegans possuem uma única Dicer, que produz ambos, os microRNAs (miRNAs) e siRNAs,enquanto as espécies de Drosophila têm duas Dicers: DCR-1, que produz miRNAs, eDCR-2, especializadana produção de siRNA.

RISC: complexo de silenciamento induzido por RNA (do inglês, RNA-induced silencing complex). Omecanismo de RNA de interferência envolve a formação de um complexo denominado RISC (complexo desilenciamento induzido por RNA) no qual ocorre o pareamento da sequência do RNA mensageiro e a fitade RNA complementar do siRNA (denominada fita guia). A enzima Argonauta catalisa a degradação doRNA mensageiro, mediando o silenciamento gênico.

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A tradução pode ser regulada por intermédio dos níveis intracelulares de proteínas, o que éconhecido como autorregulação, também conhecida como regulação autógena. Um de seusexemplos mais conhecidos é o das tubulinas e , componentes das subunidades dosmicrotúbulos de eucariotos, que inibem a tradução do mRNA da tubulina. O tratamento de umacélula com colchicina causa rápida desagregação de seus microtúbulos e aumento daconcentração de subunidades e livres; nessas condições, a síntese de tubulinas e diminuiconsideravelmente. No entanto, quando a célula é tratada com vimblastina, uma substância quetambém causa desagregação dos microtúbulos, e a síntese de tubulinas aumenta. Apesar deambas as substâncias causarem desagregação dos microtúbulos, a vimblastina precipita assubunidades que não estão em solução, reduzindo as concentrações das subunidades e p livres.A síntese das tubulinas é estimulada nas baixas concentrações de subunidades livres e inibidanas altas concentrações.

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A tradução pode ser regulada por intermédio dos níveis intracelulares de proteínas, o que éconhecido como autorregulação, também conhecida como regulação autógena. Um de seusexemplos mais conhecidos é o das tubulinas e , componentes das subunidades dosmicrotúbulos de eucariotos, que inibem a tradução do mRNA da tubulina. O tratamento de umacélula com colchicina causa rápida desagregação de seus microtúbulos e aumento daconcentração de subunidades e livres; nessas condições, a síntese de tubulinas e diminuiconsideravelmente. No entanto, quando a célula é tratada com vimblastina, uma substância quetambém causa desagregação dos microtúbulos, e a síntese de tubulinas aumenta. Apesar deambas as substâncias causarem desagregação dos microtúbulos, a vimblastina precipita assubunidades que não estão em solução, reduzindo as concentrações das subunidades e p livres.A síntese das tubulinas é estimulada nas baixas concentrações de subunidades livres e inibidanas altas concentrações.

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O ponto final da expressão gênica é a presença ou a atividade do produto proteico do gene. Emalguns casos, a tradução de um mRNA pode ser regulada pelo grau de demanda da proteína pelacélula. Um bom exemplo desse tipo de regulação pós-traducional é o controle da tradução domRNA dos receptores de ferritina e de transferrina. Para o funcionamento de muitas enzimascelulares são necessários átomos de ferro solúvel, mas o excesso de ferro é tóxico para ascélulas.Por não existir fisiologicamente um mecanismo de excreção do ferro, a absorção diária éaltamente regulada para fornecer apenas o necessário e para evitar a toxicidade, uma vez que oexcesso de ferro pode levar à geração de espécies reativas de oxigênio (ERO), enquanto adiminuição dos níveis de ferro pode levar à anemia.

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No interior do corpo, o ferro está ligado a uma proteína chamada transferrina. As moléculasreceptoras de transferrina situam-se na superfície celular e interagem com o complexotransferrina/ferro, transportando-o para o citoplasma, onde o ferro é liberado. Para seprotegerem dos altos níveis de ferro intracelular, as células sintetizam a proteína ferritina, quese liga aos átomos de ferro, inativando-os no citoplasma (armazenamento).

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Assim, os níveis de ferritina precisam estar bem sintonizados para responder aos níveis de ferroe para garantir a quantidade necessária de átomos de ferro livres para o metabolismo celular.Igualmente, os níveis de receptores de transferrina precisam estar regulados para fornecerferro intracelular suficiente. Essa dupla regulação é atingida pela modulação da capacidade detradução dos mRNAs dos receptores de transferrina e de ferritina.

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A Figura 1.28 ilustra esse exemplo de regulação da expressão gênica. Na região 5' não traduzida do mRNAda ferritina há uma sequência de 30 nucleotídeos conhecida como elemento de resposta ao ferro (IRE, deiron response element). Esse elemento dobra-se em uma estrutura de alça-haste que se liga à proteínareguladora de ferro. Quando não há excesso de ferro na célula, essa proteína reguladora se liga ao IRE domRNA da ferritina, bloqueando o início da tradução do mRNA da ferritina. Havendo excesso de ferro, suasmoléculas se ligam à proteína reguladora de ferro, o que faz com que essa se dissocie do IRE. Assim, omRNA da ferritina fica disponível para a tradução.O IRE também está presente na região 3’ não traduzida do mRNA do receptor de transferrina. Quandonão há excesso de ferro, o IRE se liga à proteína reguladora de ferro. Essa ligação não afeta diretamente atradução, como ocorria com o mRNA da ferritina; ao contrário, a presença da proteína reguladora de ferroaumenta a estabilidade do mRNA do receptor de transferrina, resultando em aumento dos níveis demRNA, que se traduz em aumento dos níveis desse receptor. A presença de mais receptores acelera otransporte de ferro para a célula. Quando há excesso de ferro, suas moléculas se ligam à proteínareguladora de ferro, dissociando-a do mRNA do receptor de transferrina e tornando instáveis esse mRNA.Nesse caso, é transportado menos ferro para a célula.Legenda Figura 1.28: Regulação da expressão gênica de (A) ferritina e (B) receptor de transferrina. Aproteína reguladora de ferro liga-se à estrutura em alça-haste dos mRNAs da ferritina e do receptor datransferrina. A - Em ausência de ferro livre, a proteína reguladora de ferro inibe a tradução do mRNA daferritina, mas estabiliza o mRNA do receptor de transferrina. B - Em presença de ferro livre (representadopor círculos vermelhos), a proteína reguladora de ferro se dissocia do IRE, resultando em aumento datradução da ferritina e desestabilização do mRNA do receptor da transferrina.

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Em outros casos, ocorrem modificações posteriores nas proteínas, incluindo clivagem e ligaçãocovalente a carboidratos e lipídeos, que são importantes para a função e a localização corretadas proteínas no interior da célula. Além disso, a regulação da função proteica, como a daatividade enzimática, exerce um papel-chave no controle do comportamento celular.

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Em geral, o nível das proteínas reguladoras pode ser modificado por diferentes fatores: (a)velocidade da transcrição do gene em RNA; (b) processamento desse RNA; (c) transporte domRNA do núcleo para o citoplasma; (d) velocidade da tradução do mRNA em cadeiapolipeptídica; (e) velocidade de degradação do mRNA; (f) processamento pós-traducional dopolipeptídeo; e (g) velocidade de degradação da proteína.Todos esses mecanismos de controle correspondem a situações específicas. Entretanto, talvez ométodo de controle mais econômico e mais difundido nos eucariotos seja o de controlar aprodução da proteína no nível da transcrição do gene.

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