noções de biossegurança e regulamentação da...

I Curso de Seqüenciamento

Noções de Biossegurançae e

Regulamentação da CTNbio

MSc. Michely C.Diniz

Fortaleza Fevereiro-2008

BiossegurançaBiossegurança

1970 A il / C lifó i‐1970: Asilomar / Califórnia

‐1993: WHO definiu como:‐1993: WHO definiu como:"práticas preventivas para o trabalho com agentes patogênicos para o homem".g p g p

“A Biossegurança é o conjunto de ações voltadas para a prevenção minimização ou eliminação depara a prevenção, minimização ou eliminação de

riscos inerentes às atividades de pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e

prestação de serviços, visando à saúde do homem, dos animais, a preservação do meio

bi t lid d d lt d "ambiente e a qualidade dos resultados"(TEIXEIRA e VALLE, 1996)

Risco biológicoRisco biológico

Microorganismos e Grupos de risco

Grupo 1 (NB‐1): Microrganismos que, até op ( ) g q ,momento, não causam doenças para ohomem (baixo risco individual e coletivo) eque não representam riscos para o ambiente(Lactobacillus, Lactococcus, Saccharomyces,Bacillus polymyxa cepas não patogênicas deBacillus polymyxa, cepas não patogênicas deE. coli, dentre outros);


Grupo 2 (NB‐2): Microrganismos que podemcausar doenças no homem, mas a exposiçãolaboratorial raramente produz doença. Mesmo

i d i t didassim, para essas doenças existem medidasprofiláticas e terapêuticas eficientes (Espécies deSalmonella (exceto S. typhi), E. coli patogênicas,Salmonella (exceto S. typhi), E. coli patogênicas,Proteus, Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria,Listeria, dentre outros);


Grupo 3 (NB‐3): Microrganismos que podemcausar doenças graves no homem e apresentamrisco elevado para os laboratoristas. Eles podemapresentar riscos de serem disseminados para aapresentar riscos de serem disseminados para apopulação, mas para as doenças causadasexistem medidas profiláticas e terapêuticasp peficazes (Mycobacterium tuberculosis, Coxiellaburnetti);


Grupo 4 (NB‐4): Microrganismos que causamdoenças humanas severas e apresentam riscoelevado para os laboratoristas e para a população

l El ã t lt t i f iem geral. Eles são agentes altamente infecciososque se propagam facilmente, podendo causar amorte das pessoas infectadas, pois não existemmorte das pessoas infectadas, pois não existematualmente medidas profiláticas ou tratamentosefetivos (Vírus Ebóla).

Risco químicoRisco químico

Rotas de entradaRotas de entrada

INALAÇÃOINGESTÃO

OCULAR

ABSORÇÃO

INJEÇÃOINJEÇÃO

Risco físicoRisco físico

Boas práticas de laboratóriolaboratório

• Observância de práticas e técnicas• Observância de práticas e técnicas microbiológicas padronizadas.

• Conhecimento prévio dos riscos.

• Treinamento de segurança apropriado.g ç p p

• Manual de biossegurança/POP• Manual de biossegurança/POP (identificação dos riscos, especificação das práticas procedimentos para eliminação depráticas, procedimentos para eliminação de

riscos).

Prevenindo Acidentes em laboratório

CONDUTAS:


EQUIPAMENTOS (EPIs):


EQUIPAMENTOS DE PROTEÇÃO COLETIVA (EPC):( )

Medidas de controle em ambiente e equipamentos

CONCEITOS:

‐Assepsia: é o conjunto de medidas adotadas paraimpedir que determinado meio seja contaminado.

‐ Anti‐sepsia: é a eliminação das formas vegetativasde bactérias patogênicas de um tecido vivode bactérias patogênicas de um tecido vivo.

‐ Limpeza: é a remoção da sujidade de qualquerp ç j q qsuperfície, reduzindo o número de microrganismospresentes. Esse procedimento deve obrigatoriamente

li d d d i f ã / ili ãser realizado antes da desinfecção e/ou esterilização.


Bico de Bunsen/Flambagem


‐ Desinfecção: é um processo que eliminamicrorganismos patogênicos de seresinanimados, sem atingir necessariamente osesporosesporos.

‐ Esterilização: é um processo que elimina todosEsterilização: é um processo que elimina todosos microrganismos: esporos, bactérias, fungos eprotozoários. Os meios de esterilização podemser físicos ou químicos.

Métodos de esterilização

⇒Calor Úmido (Autoclave): vapor sob pressão (1 à 2( ) p p (atmosferas). Tempo de 15 à 30 minutos. Temperaturade 121 à 132 °C.

⇒Calor Seco (Estufa): tempo de 1 hora à 170°C ou 2horas à 160°C sem a abertura da mesma durante ohoras à 160 C, sem a abertura da mesma durante oprocesso.

=> Processos Químicos: óxido de etileno por 4 horas;glutaraldeído 2% por 10 horas e solução def ld íd 38% 18 hformaldeído 38% por 18 horas.

Como tratar ?

VIDRARIAS

Como tratar ?

• VIDRARIAS

‐Lavagem com água e sabão

‐Enxágüe com água destilada

‐Secagem em estufa

Como tratar ?Como tratar ?

MATERIAL PLÁSTICO• MATERIAL PLÁSTICO

‐ Ponteiras e tubos sem fenol/clorofórmio:Lavagem com hipoclorito de sódio , águacorrente e água destilada

‐ Ponteiras e tubos com fenol/clorofórmio:

Descarte em recipiente separado

‐Tubos de PCR

Como tratar ?

Outros materiais

Como tratar ?

- Instrumentos cortantes- Culturas de bactériasCulturas de bactérias- Resíduos de Fenol/Clorofórmio- Resíduos de géis agarose/poliacrilamida- Resíduos de géis agarose/poliacrilamida- Resíduos de AgNO3

Como tratar ?

• EQUIPAMENTOS BANCADAS E PIAS

Como tratar ?

• EQUIPAMENTOS, BANCADAS E PIAS

Observar manual de cada equipamento‐Observar manual de cada equipamento

‐Dependendo do procedimentos isolar p pbancadas

Á‐Álcool 70% ‐ 90%

Principais símbolos

Reagentes que merecem destaque em lbm ...

• ACRILAMIDA(2‐propenamide; ethylene carboxamide; acrylic amide; vinyl

amide; acrylamide)amide; acrylamide)

‐Produzida desde 1950

Obtida da hidratação da acrilonitrila‐Obtida da hidratação da acrilonitrila


USO ACRILAMIDA

‐ Gel de eletroforese

• USO ACRILAMIDA

‐Tratamento de esgotos e efluentes

‐Agente selante em construções civis

‐Indústria de papel

‐Cosméticos e artigos de higiene


‐Desastre ambiental na Escandinávia, Suécia (1997), ( )

‐Mortandade de peixes , paralisia do gado

‐ Trabalhadores com dormência e formigamento

‐Formação de ACM em alimentos, derivados de cocção, e em queima de cigarrosç q g

‐ Não foi confirmado ser cancerígeno a humanos a i d lipartir de alimentos

‐Neurotoxidade em camudongos e em humanos‐Neurotoxidade em camudongos e em humanos expostos no trabalho (SFC, 2002)


Acrilamida é suspeita de ser carcinogênica, severamente neurotóxica causar irritaçãoseveramente neurotóxica, causar irritação dos olhos, pele (é imediatamente absorvida)

e trato respiratório.e trato respiratório.

- Cuidado ao pesar acrilamida e bis-acrilamida

Poliacrilamida teoricamente não é prejudicial- Poliacrilamida teoricamente não é prejudicial

-Descarte em recipiente apropriado


Í• BROMETO DE ETÍDEO(homidium bromide; dromilac; 3,8‐diamino‐5ethyl‐6‐phenyl

phenanthridinium bromide; ethidium bromide)phenanthridinium bromide; ethidium bromide)


EtB• EtBr

“…é reconhecido que os etídeos e seus análogos não sãoq gaptos para coloração de ácidos nucléicos em células vivas nosquais a membrana está intacta, exceto para célulaspermeabilizadas ou com grandes concentrações de corantepermeabilizadas ou com grandes concentrações de corante.Conseqüentemente o EtBr ((Tanke, et al., J. IMMUNOL. METH.52, 91 (1982)) , o idodeto de propídeo ((U.S. Pat. No.5 057 413 to Terstappen et al Oct 15 1991 U S Pat No5,057,413 to Terstappen et al. Oct. 15, 1991 U.S. Pat. No.5,314,805)) e seus homodímeros de etídeo (Live/Dead.RTM.kit, U.S. Ser. No. 07/783,182 to Haugland, et al., filed Oct. 26,1991) U S P N 5 314 805 ê id d1991) U.S. Pat. No. 5,314,805, têm sido usadosextensivamente para detectar e quantificar célulascomprometidas ou mortas” Phenanthridium dye staining ofnucleic acids in living cells US Patent Issued on August 1, 1995.


EtB

Dynamical Change of Mitochondrial DNA Induced in

• EtBr

the Living Cell by Perturbing the ElectrochemicalGradient Biophysical Journal Volume 71 November 1996

“Ethidium bromide was shown to enter into li i ll d i l bl iliving cells and to intercalate stably into

mitochondrial DNA (mtDNA), giving rise to high fluorescence”high fluorescence .

CUIDADO AO MANIPULAR O BROMETO DE ETÍDEO!!!!! PROVÁVEL AÇÃODE ETÍDEO!!!!! PROVÁVEL AÇÃO

CANCÊRÍGENA!!!!


• Descontaminação EtBr• Descontaminação EtBr

1.Descontaminação para soluções contendo >0,5 mg/ml

‐Baseado no método descrito por Lunn e Sansone (1987) ‐ reduçãoem 200 vezes a atividade mutagênica confirmada em ensaio deem 200 vezes a atividade mutagênica confirmada em ensaio demicrossomo com Salmonella – Ácido hipofosforoso e nitrito de sódio

Quillardet e Hofnung (1987) redução em 3000 vezes a atividade‐ Quillardet e Hofnung (1987) ‐ redução em 3000 vezes a atividade mutagênica – KMnO4


• Descontaminação EtBr• Descontaminação EtBr2. Descontaminação de soluções diluídas (tampão do gel

contendo 0 5 µg/ml)contendo 0,5 µg/ml)

‐ Baseado no método descrito por Lunn e Sansone (1987): resina amberlite XAD‐16 (absorvente polimérico não‐iônico)

‐ Baseado no método descrito por Bensaude (1988): carvão ativado

‐ Alternativa: SYBER GREEN

Espaço Físico ideal para laboratório de biologia laboratório de biologia

molecular

1) Preparação das amostras (extração RNA e DNA)

2) Sala de pré‐PCR (preparação do “mix” da reação)

3) Sala de PCR

4) Pós‐ PCR (eletroforese e fotodocumentação)

Evitando contaminações das çamostras

Sempre usar luvas trocando as freqüentemente‐Sempre usar luvas, trocando‐as freqüentemente.

‐Material livre de DNases e RNases (microtubos, ponteiras).( , p )

‐DNA: Usar ponteiras com barreiras.

‐Minimizar a geração de aerossóis pela rápida centrifugação dos microtubos antes de abri los (spin)centrifugação dos microtubos antes de abri‐los (spin).

‐ Reagentes e buffers ‐ usar sempre uma alíquota novag ff p q(fracionar os reagentes).

‐Especial atenção com a água utilizada (ultra‐pura)

Evitando contaminações das

RNA

Evitando contaminações das amostras

RNA

•Trabalhos com RNA devem ser realizados em área•Trabalhos com RNA devem ser realizados em áreaisolada no laboratório (micropipetadores,ponteiras, microtubos, solução tampão e demaisreagentes).

RNA Vid i i h f 180°C d t•RNA: Vidraria: cozinhar em forno a 180°C durantevárias horas ou lavar com DEPC a 0,1% (em água ouem etanol) por 1 horaem etanol) por 1 hora.

http://www.ctnbio.gov.br/

Lei N°11.105, DE 24 DE MARÇO DE 2005.

LEI DE BIOSSEGURANÇA

“Art. 1o Esta Lei estabelece normas de segurança emecanismos de fiscalização sobre a construção, o cultivo, aprodução, a manipulação, o transporte, a transferência, aimportação, a exportação, o armazenamento, a pesquisa, a

i li ã lib ã i bi tcomercialização, o consumo, a liberação no meio ambiente eo descarte de organismos geneticamente modificados –OGM e seus derivados, tendo como diretrizes o estímulo aoavanço científico na área de biossegurança e biotecnologiaavanço científico na área de biossegurança e biotecnologia,a proteção à vida e à saúde humana, animal e vegetal, e aobservância do princípio da precaução para a proteção domeio ambiente ”meio ambiente.

“Art. 8o Fica criado o Conselho Nacional de Biossegurança – CNBS,vinculado à Presidência da República, órgão de assessoramento superiordo Presidente da República para a formulação e implementação dado Presidente da República para a formulação e implementação daPolítica Nacional de Biossegurança – PNB.§ 1o Compete ao CNBS:I – fixar princípios e diretrizes para a ação administrativa dos órgãos eI – fixar princípios e diretrizes para a ação administrativa dos órgãos eentidades federais com competências sobre a matéria;II – analisar, a pedido da CTNBio, quanto aos aspectos da conveniência eoportunidade socioeconômicas e do interesse nacional os pedidos deoportunidade socioeconômicas e do interesse nacional, os pedidos deliberação para uso comercial de OGM e seus derivados;III – avocar e decidir, em última e definitiva instância, com base emmanifestação da CTNBio e, quando julgar necessário, dos órgãos eç , q j g , gentidades referidos no art. 16 desta Lei, no âmbito de suascompetências, sobre os processos relativos a atividades que envolvam ouso comercial de OGM e seus derivados;”

“Art 11 A CTNBio composta de membrosArt. 11. A CTNBio, composta de membrostitulares e suplentes, designados pelo Ministro deEstado da Ciência e Tecnologia, será constituídag ,por 27 (vinte e sete) cidadãos brasileiros dereconhecida competência técnica, de notóriaatuação e saber científicos, com grau acadêmicode doutor e com destacada atividade profissionalnas áreas de biossegurança biotecnologianas áreas de biossegurança, biotecnologia,biologia, saúde humana e animal ou meioambiente; “;

“Art. 3o Para os efeitos desta Lei, considera‐se:

I – organismo: toda entidade biológica capaz de reproduzir outransferir material genético, inclusive vírus e outras classesque venham a ser conhecidas;

V – organismo geneticamente modificado ‐ OGM: organismocujo material genético – ADN/ARN tenha sido modificado porj g / pqualquer técnica de engenharia genética;

VI – derivado de OGM: produto obtido de OGM e que nãoVI derivado de OGM: produto obtido de OGM e que nãopossua capacidade autônoma de replicação ou que nãocontenha forma viável de OGM; “

MMesma espécie

Espécie diferente

Todo transgênico é um OGM, mas nem todo OGM é transgênico!g

C íti L i d BiCríticas a Lei de Biossegurança

‐ Contaminação por agroquímicosContaminação por agroquímicos‐ Definições obscuras: Proteína heteróloga

“§ 2o Não se inclui na categoria de derivado de OGM a substância pura, quimicamente definida, obtida por meio de processos biológicos e que não contenha OGM proteínaprocessos biológicos e que não contenha OGM, proteína

heteróloga ou ADN recombinante.”

“VI – derivado de OGM: produto obtido de OGM e que nãoVI – derivado de OGM: produto obtido de OGM e que não possua capacidade autônoma de replicação ou que não

contenha forma viável de OGM;”

Caso da Insulina

f à l‐ Não faz menção às tecnologias convergentes

- Nanotecnologia

-Tecnologia da informação

- Tecnologia das ciências cognitivas

"Situação Global de Comercialização del d f d "lavouras geneticamente modificadas: 2007",elaborado pelo Serviço Internacional para

i i ã d li õ bi l iAquisição de Aplicações em Agrobiotecnologia(ISAAA, na sigla em inglês)

“O Brasil foi o país que mais avançou no mundo em área plantada com transgênicos em 2007. Foram 3,5 milhões de hectares acima do ano anterior,

s perando o crescimento na Índia na China e nossuperando o crescimento na Índia, na China e nos Estados Unidos.”

"O Brasil foi o que mais cresceu e será um líder mundial de transgênicos", diz Clive James, presidente do conselho diretor do ISAAA”presidente do conselho diretor do ISAAA”

Soja e Algodão

GLOBAL AREA OF BIOTECH CROPSMillion Hectares (1996 to 2007)

23 Biotech Crop Countries140

TotalIndustrial

120

140 IndustrialDeveloping

80

100

40

60

20

40

01996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

Increase of 12%, 12.3 million hectares (30 million acres), between 2006 and 2007.

Source: Clive James, 2007.

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