Universidade de Aveiro 2018-2019

Departamento de Química

Dissertação apresentada à Universidade de Aveiro para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Biotecnologia, ramo de Industrial e Ambiental, sob a orientação científica do Doutor Jorge Manuel Alexandre Saraiva, investigador auxiliar do departamento de Química da Universidade de Aveiro e da Mestre Margarida Duarte, responsável do laboratório ALGATEC da empresa A4F- Algae for Future.

Ângela Catarina Siopa Peralta

Produção e monitorização de microalgas

o júri

presidente Professora Doutora Sílvia Maria da Rocha Simões Carriço Professora Auxiliar, Universidade de Aveiro

Doutora Elisabete Maria da Cruz Alexandre Investigador Doutorado (nível 1), Universidade de Aveiro Doutor Jorge Manuel Alexandre Saraiva Investigador Auxiliar, Universidade de Aveiro

agradecimentos

Concluindo este importante ciclo torna-se fundamental agradecer a todas as pessoas que sempre me acompanharam e ofereceram apoio. Em primeiro lugar gostaria de agradecer à minha mãe e ao meu pai, que sempre me motivaram a atingir os meus objetivos e sempre me acompanharam, dando apoio e carinho. Obrigada, sem vocês não teria sido possível. Aos meus irmãos, Gonçalo e Filipe, que sempre me deram o ânimo e alegria necessários para superar as adversidades. E ainda aos meus sobrinhos, Joaquim e Henrique. Obrigada por me fazerem sempre sorrir! À minha prima Daniela, a minha irmã mais velha, pelos conselhos e amizade. Ao meu padrinho, por estar sempre presente e disponível para ajudar. Às minhas avós, por todo o carinho. Um muito obrigada a toda a minha família por todo o amor. Ao Francisco. Obrigada por me ajudares a crescer, por me mostrares quando estou errada, por me tornares mais responsável, por me motivares a melhorar continuamente. Obrigada por acreditares em mim. Às minhas amigas de longa data, Andreia e Joana, que embora longe, estiveram presentes em todos os momentos. Obrigada por acreditarem e pelo apoio contínuo e incondicional nesta, e em todas as fases da minha vida. Ao meu quarteto fantástico, Adriana, Catarina, Celina e Daniela, que apesar de longe, foram a minha companhia de todas as horas. Obrigada por me fazerem sentir sempre perto, pelos conselhos, pelas palavras motivadoras, e pelo apoio incansável. Aos meus colegas e amigos, Mónica, Vanessa e João, que me receberam e integraram desde o primeiro momento na Universidade de Aveiro. Obrigada pelo companheirismo, pela ajuda e pela amizade. Foi muito importante ter-vos conhecido. Não podia deixar de agradecer à minha orientadora e amiga, Margarida, pelos ensinamentos, pela ajuda, pela paciência. Obrigada pela dedicação, por acreditares em mim, por me acompanhares e fazeres parte do meu crescimento, pessoal e profissional. Sem a tua orientação nada disto teria sido possível. Gostaria ainda de agradecer a todos os meus colegas da A4F, em especial à Sara, ao Rui e ao Luís pelo apoio e por me proporcionarem aprendizagens importantes durante este percurso. Agradecer também ao meu orientador, Doutor Jorge Saraiva, pela orientação, preocupação e disponibilidade. Por último, e não menos importante, fica o meu agradecimento à Administração da A4F, AlgaFuel S.A, pela oportunidade e confiança na realização desta tese de Mestrado.

Palavras-chave Microalgas, biotecnologia, produção industrial, aplicações

Resumo Integrado no ALGATEC ECO BUSINESS PARK, o presente estágio foi promovido pela empresa A4F – Algae for Future, e teve lugar no laboratório ALGATEC. Este teve como objetivo dar apoio à unidade de produção de microalgas em termos de scale-up, monitorização das culturas e controlo de qualidade do produto. Ao longo do estágio foram desenvolvidas tarefas gerais de laboratório, nomeadamente: desenvolvimento da estrutura documental do laboratório - procedimentos operacionais, de manutenção e calibração; organização, manutenção e preparação de material de modo a assegurar o bom funcionamento do laboratório; atualização e envio de registos e outras tarefas desenvolvidas para dar resposta às necessidades diárias de trabalho. Em termos de monitorização dos cultivos em produção, foram diariamente recolhidas amostras na unidade, para se proceder a análises laboratoriais de refratometria para determinação da salinidade, espectrofotometria para quantificação celular e de nutrientes e de gravimetria para determinação de peso seco. A aplicação destas análises laboratoriais a um caso de estudo com três géneros de microalgas, Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. e Odontella sp. consistiu na determinação da correlação linear entre a densidade ótica e o peso seco para cada uma. Para os dois primeiros géneros referidos foram obtidas retas de correlação com um coeficiente de correlação bastante próximo de 1, e portanto com um elevado grau de confiabilidade. Para Odontella sp. obteve-se uma reta com um coeficiente de correlação mais baixo, sendo necessária a obtenção de mais dados para tornar a reta mais robusta.

Keywords Microalgae, Biotechnology, Industrial production, Applications

Abstract Integrated in the ALGATEC ECO BUSINESS PARK, this internship was promoted by the company A4F - Algae for Future and took place in the ALGATEC laboratory. It aims supporting the production unit of microalgae in terms of scale-up, culture monitorization and product quality control. During the internship, general laboratory tasks were developed, namely: development of the laboratory's documentary structure - operational, maintenance and calibration procedures; organization, maintenance and preparation of laboratory material to ensure the proper function of the laboratory; updating and sending records and other tasks designed to meet daily work needs. In terms of monitorization of the cultures in production, samples were taken daily at the production unit for laboratory analysis of refractometry for salinity determination, spectrophotometry for cell and nutrient quantification and gravimetry for dry weight determination. The application of these laboratory analyzes to a case study of three microalgae genera, Nannochloropsis sp., Tetraselmis and Odontella sp. consisted of determining the linear correlation between optical density and dry weight for each one. For the first two genera, were obtained correlation lines with a correlation coefficient very close to 1, and therefore with a high degree of reliability. For Odontella sp. was obtained a linear correlation with a lower correlation coefficient. It would be needed more data to make the correlation stronger.

Índice Lista de figuras ................................................................................................................... iLista de tabelas ................................................................................................................ iiiLista de equações ............................................................................................................ iiiLista de abreviaturas ......................................................................................................... ivContextualização e Objetivos ............................................................................................ 1

1. A4f – Uma breve descrição: .................................................................................. 12. Sistemas de produção de microalgas ..................................................................... 4

2.1. Sistemas abertos ............................................................................................ 42.1.1. Lagoa convencional ................................................................................... 52.1.2. Lagoa em cascata ...................................................................................... 52.2. Sistemas fechados ......................................................................................... 62.2.1. Fotobiorreatores tubulares ......................................................................... 62.2.2. Fotobiorreatores Planos (FP-PBR) ............................................................ 82.2.3. Fotobiorreator plano de vidro (GP-PBR) .................................................. 92.3. Fermentadores ............................................................................................. 10

3. Algas ................................................................................................................... 103.1. Microalgas ................................................................................................... 113.1.1. Nannochloropsis sp. ................................................................................ 133.1.2. Tetraselmis sp. ......................................................................................... 143.1.3. Odontella sp. ........................................................................................... 15

4. Aplicações ........................................................................................................... 174.1. Ambientais .................................................................................................. 174.2. Produção compostos bioativos .................................................................... 184.3. Saúde humana ............................................................................................. 184.4. Aquacultura e ração animal ......................................................................... 19

Produção de Microalgas .................................................................................................. 211. Lavagem de material ........................................................................................... 212. Esterilização ........................................................................................................ 223. Meio de Cultura ................................................................................................... 24

3.1. Composição ................................................................................................. 253.1.1. Salinidade ................................................................................................ 263.1.2. Nutrientes ................................................................................................ 26

4. Isolamento, obtenção e manutenção de culturas ................................................. 274.1. Métodos de isolamento de espécies de microalgas ..................................... 274.2. Dinâmica de crescimento ............................................................................ 274.3. Condições de cultivo de microalgas ............................................................ 29

4.3.1. Luminosidade .......................................................................................... 294.3.2. Temperatura ............................................................................................ 324.4. pH ................................................................................................................ 324.4.1. Arejamento/agitação ................................................................................ 334.4.2. Dióxido de carbono ................................................................................. 34

5. Crescimento de microalgas ................................................................................. 345.1. Tipos de cultura ........................................................................................... 355.1.1. Cultura batch ........................................................................................... 355.1.2. Cultura semicontínua .............................................................................. 365.1.3. Culturas contínuas ................................................................................... 36

6. Análises quantitativas de culturas de microalgas ................................................ 376.1. Espectrofotometria ...................................................................................... 386.2. Peso seco ..................................................................................................... 39

7. Produção de microalgas: melhorias futuras ........................................................ 408. Objetivos ............................................................................................................. 42

Parte I – Tarefas gerais de laboratório ............................................................................ 441. Estrutura documental .......................................................................................... 442. Registos do laboratório ....................................................................................... 463. Verificação dos equipamentos do laboratório ..................................................... 474. Operação, manutenção e calibração dos equipamentos do laboratório ............... 475. Controlo da água do laboratório .......................................................................... 506. Produção de microalgas no laboratório e unidade de produção .......................... 51

6.1. Metodologia ................................................................................................ 526.1.1. Limpeza de material ................................................................................ 526.1.1. Descontaminação de material .................................................................. 536.1.2. Preparação de material ............................................................................ 536.1.3. Tratamento de meio de cultura no laboratório ........................................ 546.2. Produção de inóculo e scale-up ................................................................... 57

Parte II – Análises laboratoriais ...................................................................................... 601. Densidade ótica ................................................................................................... 602. Nitratos ................................................................................................................ 613. Peso seco ............................................................................................................. 61

Parte III – Caso de estudo ............................................................................................... 64Correlação entre o peso seco e a densidade ótica de três espécies de microalgas .. 64

Conclusão ........................................................................................................................ 72Referências ...................................................................................................................... 73Anexo I ............................................................................................................................ 79

i

Lista de figuras Figura 1 – ALGATEC ECO BUSINESS PARK site - vista rio Tejo, Dezembro 2017

(Website ALGATEC EBP). ............................................................................. 3

Figura 2 – Lagoa convencional (Website A4F). ............................................................... 5

Figura 3 – Lagoa em cascata (Website A4F). ................................................................... 6

Figura 4 – Fotobiorreator tubular (Website A4F). ............................................................ 6

Figura 5 – Fotobiorreator tubular horizontal – MHT (Website A4F). .............................. 7

Figura 6 – Fotobiorreator tubular horizontal – UHT (Website A4F). ............................... 8

Figura 7 – Fotobiorreator plano (Website A4F). ............................................................... 9

Figura 8 – Fermentador (Website A4F). ......................................................................... 10

Figura 9 – Células de Nannochloropsis sp. (Hulatt et al. 2019). ..................................... 14

Figura 10 – Célula de Tetraselmis indica. Barra de escala=5µm. Adaptado de Arora et al,

(2013). ............................................................................................................ 15

Figura 11 – (a) Célula de Odontella sp. onde são visíveis os poros, as valvas (v) e a faixa

de conexão. (b) Odontella aurita onde é visível o processo de conexão de duas

valvas (v). Barra de escala = 10µm. Adaptado de Borowitzka (2013). ......... 16

Figura 12 – Esquema explicativo do papel das microalgas na aquacultura (Coutteau

1996). ............................................................................................................. 20

Figura 13 – Curva de crescimento de uma população de células ao longo do tempo, em

cultura batch. Representação gráfica do logaritmo do número de células por

unidade de volume (células/mL) em função do tempo (h). Lag – fase de

latência, Exponential – fase exponencial. Stacionary – fase estacionária, Death

phase – fase de declínio, Acceleration – aceleração, Deceleration –

desaceleração. Adaptado de Waites et al. (2002). .......................................... 28

Figura 14 – Exemplo dos diferentes sistemas de cultivo de microalgas à escala

laboratorial. À esquerda, cultivos em balões de fundo redondo e à direita, em

tubos de ensaio. .............................................................................................. 29

Figura 15 – Representação esquemática da taxa de fotossíntese em função da radiação. O

declive inicial da curva (a) corresponde à eficiência máxima de utilização da

ii

luz. A interceção da taxa máxima de fotossíntese, Pmax, com o a corresponde á

radiação de saturação da luz (ótima). Para radiações acima do máximo ótimo,

a fotossíntese decai, ocorrendo fotoinibição (Andersen 2013). ..................... 30

Figuras 16 e 17 – Espectro de absorção da clorofila a (chlorophyll a) e b (chlorophyll b).

(Commons 2008); Gama de radiação solar, D65 (luz do dia, 12 horas), a

picotado, e gama da radiação emitida por uma lâmpada fluorescente típica, a

cheio (Wulf and Wulf 2018). ......................................................................... 31

Figura 18 – Impacto de diferentes fotoperíodos no crescimento de uma microalga verde.

Letras diferentes indicam uma diferença significativa entre os tratamentos

(P<0.05). As barras de erro representam o erro padrão (n=3). Adaptado de Qin

(2005). ............................................................................................................ 31

Figura 19 – Representação gráfica da variação do pH em função do dióxido de carbono

dissolvido na água. Adaptado de CO2: A Fish Drug (2011). ....................... 33

Figura 20 – Representação do limite de linearidade da correlação entre a absorvancia e a

concentração. .................................................................................................. 39

Figura 21 – Modelo ficha de segurança Solução padrão de condutividade 1288µS/cm. 46

Figura 22 - Árvore de decisão utilizada no controlo do meio de cultivo recebido pelo

laboratório ALGATEC. .................................................................................. 56

Figura 23 – Esquema representativo análises efetuadas às culturas nos vários estágios de

produção. ........................................................................................................ 60

Figura 24 – Representação esquemática obtenção peso seco. ........................................ 62

Figura 25 – Número de amostras recolhidas por semana (segunda a sexta-feira) de estágio,

sendo o número das semanas indicado correspondente ao número da semana

do ano. A série representada a laranja corresponde ao número de amostras a

que foi realizada análise da densidade ótica (DO) e a série a verde o número

de amostras a que foi realizada análise de determinação de nitratos (NO3). . 64

Figura 26 – Representação gráfica das retas obtidas pela correlação entre a absorvância

(l=600nm) e o peso seco, para a microalga Nannochloropsis sp.. Reta ‘Dados

sem tratamento’: y=0,3791x, R2=0,9537. Reta ‘Dados com tratamento’:

y=0,3649x, R2=0,9602. .................................................................................. 67

iii

Figura 27 - Representação gráfica das retas obtidas pela correlação entre a absorvância

(l=600nm) e o peso seco, para a microalga Tetraselmis sp.. Reta ‘Dados sem

tratamento’: y=0,7989x, R2=0,8889. Reta ‘Dados com tratamento’:

y=0,8103x, R2=0,9469. .................................................................................. 68

Figura 28 – Representação gráfica da reta obtida pela correlação entre a absorvância

(l=600nm) e o peso seco, para a microalga Odontella sp.. Reta ‘Dados sem

tratamento’: y=1,4096x, R2=0,9179. .............................................................. 69

Figura 29 – Histogramas representativos de simulações de 100 medicões. A extensão da

dispersão dos dados (largura do histograma) é a medida de precisão e a linha a

tracejado representa a exatidão dos dados. No gráfico estão representados

conjuntos de medições com: (a) elevada precisão e exatidão (b) imprecisão e

exatidão (c) precisão e inexatidão e (d) imprecisão e inexatidão. Adaptado de

Hughes & Hase (2010). .................................................................................. 79

Lista de tabelas Tabela 1– Tabela resumo sobre os métodos de esterilização, adaptado de Andersen

(2005). ............................................................................................................ 24

Tabela 2 – Tabela resumo dos parâmetros de incerteza e imprecisão determinados pela

marca como admissíveis, utilizados na verificação do estado de calibração,

para cada micropipeta. ................................................................................... 50

Tabela 3 – Condutividade de diferentes tipos de água .................................................... 51

Lista de equações Equação (1) – Conversão de energia luminosa em matéria orgânica. ............................ 29

Equação (2) – Reações de dissolução de dióxido de carbono em água. ......................... 32

Equação (3) – Lei de Lambert-Beer. A – absorvância ε- coeficiente de absorção molar; c-

concentração; l – percurso ótico. .................................................................... 38

Equação (4) – Conversão de massa (m) em volume (V) através da densidade.

rágua=0,9982, a 20ºC. ...................................................................................... 49

Equações (5) e (6) – Cálculo da incerteza e imprecisão. ................................................ 49

Equação (7) – Fórmula utilizada para o cálculo do peso seco. ....................................... 63

iv

Lista de abreviaturas • A4F - Algae for Future • ALGATEC EBP – Algatec Eco Business Park • ARA - Ácido araquidónico • DHA - Ácido docosahexaenóico • DO – Densidade ótica • EPA - Ácido eicosapentaenóico • LA – Laboratório Algatec – LabALGATEC • NO3 - Nitratos • OM – Observação microscópica • PBR – Fotobiorreator • PS – Peso seco

1

Contextualização e Objetivos

Esta dissertação surge no seguimento de um estágio autoproposto, na empresa de

biotecnologia A4F – Algae for Future. Inserido numa unidade de produção de microalgas no

ALGATEC ECO BUSINESS PARK, o estágio teve como objetivo desenvolver

competências específicas inerentes ao contacto com o mercado de trabalho e desempenhar

tarefas laboratoriais necessárias à monitorização de um sistema de produção industrial.

1. A4f – Uma breve descrição:

A4f – Algae for Future S.A é uma empresa de biotecnologia de produção, pesquisa e

desenvolvimento de microalgas, localizada em Portugal. É especializada no design,

construção, operação e transferência (DBOT) de unidades de produção de microalgas à

escala comercial, a partir de diferentes tecnologias que permitem adaptar a produção a

requisitos específicos dos clientes.

A sua metodologia única, aliada à sua vasta experiência na transposição da escala protótipo

para a escala comercial, posiciona a empresa como primeira escolha na implementação de

Unidades de produção industrial. Por outro lado, a A4F dedica-se ao desenvolvimento de

procedimentos operacionais normalizados que garantem a produção otimizada de

microalgas, tendo em conta os objetivos de produção de cada cliente e integrando as

melhores práticas de qualidade. A empresa encontra-se também envolvida em vários

Projetos Europeus de Investigação & Desenvolvimento, que lhe proporcionam uma estreita

relação com as melhores Universidades e Grupos de Investigação, nacionais e internacionais,

na área da Biotecnologia de Microalgas (A4F “Quem Somos” 2019).

Adicionalmente, a empresa apoia a conceção e implementação de estratégias de marketing

para exploração económica e comercialização de produtos e aplicações de microalgas no

mercado global. Por sua vez, a participação em cimeiras, conferências e congressos,

permitem o contacto da empresa com os maiores produtores e distribuidores mundiais,

tornando a A4F uma empresa de referência.

No desenvolvimento da produção de microalgas, a A4F trabalha com diferentes espécies de

microalgas autotróficas, heterotróficas e mixotróficas, sendo estas produzidas em diferentes

meios como água doce, água salgada e hipersalina. São também diversas as tecnologias

2

usadas para a sua produção, apresentando uma vasta variedade de sistemas de produção, de

forma a ir ao encontro dos objetivos e requisitos do cliente, tais como: Fotobiorreatores

tubulares e planos, Fermentadores e Lagoas em cascata e convencionais; estes sistemas de

produção de microalgas permitem o crescimento das microalgas fornecendo-lhes as

melhores condições para o seu desenvolvimento (A4F “O que fazemos” 2019; A4F

“Plataformas tecnológicas” 2019), combinados com avançadas tecnologias de colheita e

processamento.

A A4F encontra-se sediada em Lisboa, onde conta com o Laboratório de Inovação de Lisboa

– LIL, a Unidade Experimental de Lisboa – UEL e uma Algoteca. O laboratório tem como

principais funções dar suporte à produção de microalgas e desenvolver atividades de I&D, à

escala piloto e industrial. Dedica-se a várias áreas distintas, como biologia molecular,

bioquímica analítica e produção e scale-up de microalgas. A sua unidade piloto (UEL)

consiste numa plataforma tecnológica que mimetiza uma unidade industrial integrada para

a produção de microalgas, que tem como objetivos: demonstrar tecnologias de produção

industrialmente escaláveis, dar suporte a projetos de Clientes e a projetos de I&D para

produção à escala piloto, permitindo o desenvolvimento de microalgas desde o inóculo à

obtenção do produto. Com uma área de 200m2/10m3, esta unidade contém uma área

destinada ao aumento de escala, áreas de tecnologias de colheita, desidratação e

processamento de microalgas, contendo ainda sistemas de produção abertos e fechados. Tem

ainda uma área em conformidade para produção de microalgas geneticamente modificadas.

Por fim, a sua algoteca contém cerca de 150 espécies disponíveis, funcionando como um

back-up para projetos industriais, fornecimento de espécies e histórico de microalgas

produzidas (A4F “Recursos” 2019). Através de todas estas ferramentas a A4f coopera com

os Clientes e Parceiros na investigação e desenvolvimento de novos produtos e aplicações

baseados em microalgas.

Em 2016, a empresa LusoAmoreiras investiu num terreno com uma área total de 14,2 ha

com o objetivo de expandir o seu ramo de atuação para projetos de construção sustentáveis

e em imóveis aptos para a exploração de atividades económicas sobretudo no setor primário.

Assim surgiu o projeto ALGATEC ECO BUSINESS PARK, promovido pelo grupo A4F

com o apoio da Solvay, que tem como missão acolher empresas e projetos empreendedores

no setor das Algas e Microalgas. Este projeto conta com a instalação de unidades de

produção de microalgas e de aquacultura nos terrenos das reservas de salmoura, assim como

3

o desenvolvimento de um cluster, integrando unidades de produção de microalgas. A A4F é

responsável pela promoção do parque e pelo fornecimento da tecnologia e apoio científico

aos investidores. A integração com o complexo fabril da Solvay permitiu usufruir de

condições únicas para um arranque rápido do projeto, e a partilha de infraestruturas e

utilidades. Adicionalmente, a instalação do ALGATEC junto da Solvay também tem

vantagens para a produção de microalgas, como: uma elevada radiação solar e longas horas

de sol, disponibilidade de matérias-primas e outras utilidades, acessibilidade a meios de

transporte e logística, e proximidade a Universidades e Institutos de Investigação.

Figura 1 – ALGATEC ECO BUSINESS PARK site - vista rio Tejo, Dezembro 2017 (Website ALGATEC EBP).

De entre as Unidades de produção de microalgas a instalar no ALGATEC ECO BUSINESS

PARK (Figura 1), três estão na base de projetos de investimento denominados, ALGAE

TAGUS (produção economicamente sustentável de várias espécies de microalgas, para

alimentação animal e para a extração de compostos de valor acrescentado), ARA.FARM

(produção do ácido gordo polinsaturado Ómega-6, ácido araquidónico) e BIOFAT.PT

(produção de microalgas para biocombustíveis e produtos de valor acrescentado - EPA e

proteína).

ALGAE TAGUS é uma empresa privada que conta com uma unidade de pequena escala e

de baixo custo para a produção economicamente sustentável de várias espécies de

microalgas, que têm como finalidade a alimentação animal e a extração de compostos de

valor acrescentado. A unidade tem uma área de implantação de 1.000 m2 e investimento

aproximado de 600 mil €.

4

2. Sistemas de produção de microalgas

Existem vários tipos de sistemas de cultivo destinados à produção industrial de microalgas.

De forma a maximizar a produtividade, estes devem ser desenhados, construídos e operados

tendo em conta a espécie a produzir e o objetivo da sua produção (Mata, Martins, and

Caetano 2009; Benemann 2013).

Para uma elevada produção de biomassa é essencial estabelecer os fatores chave da dinâmica

e crescimento da cultura. A luz, a temperatura e a fonte de carbono são essenciais para o

crescimento e produtividade em culturas fotoautotróficas (A. P. Carvalho and Malcata

2003). A luz providência uma fonte de energia à cultura, sendo indispensável a células

fotoautotróficas, tornando o cultivo em massa dependente do uso eficiente desta energia

luminosa. Já a temperatura é um fator importantíssimo uma vez que controla as taxas de

todas as reações bioquímicas na célula da microalga. Por último, a fonte de carbono

condiciona o crescimento das células. Para crescimento em fotoautotrofia é requerida a

existência de dióxido de carbono e para fotoheterotrofia é necessária uma fonte de carbono

orgânico. No caso de estarem disponíveis ambas as fontes de carbono pode haver

crescimento em mixotrofia.

Os sistemas de produção podem ser de dois tipos: abertos e fechados. Enquanto os sistemas

abertos se encontram em contacto direto com o ambiente, os fechados não estabelecem

contato entre a cultura e a atmosfera (Acién et al. 2017). Cada um destes sistemas pode ter

diferentes configurações: lagoas convencionais e lagoas em cascata, no caso dos sistemas

abertos, e fotobiorreatores tubulares, planos e fermentadores, no caso dos fechados (A4F

“Plataformas tecnológicas” 2019).

2.1. Sistemas abertos

Este tipo de sistema consiste na utilização de tanques abertos destinados à produção de

microalgas em larga escala, com custos de construção e manutenção muito mais reduzidos,

quando comparados com os fechados (Kunjapur and Eldridge 2010). As lagoas constituem

o local por onde circula a cultura que, ao receber os nutrientes e radiação necessários,

aumentam a produção de biomassa.

A exposição direta ao sol, a baixa acumulação de oxigénio, a sua fácil limpeza e o facto de

necessitarem de pouca manutenção, são algumas das principais vantagens deste sistema. Por

outro lado, estes apresentam maior risco de contaminação microbiana (aumentando

5

consequentemente o risco de colapso da cultura), elevadas perdas de dióxido de carbono, e

ainda uma necessidade de maiores áreas de instalação, em comparação com os sistemas

fechados. A radiação e temperatura são ainda parâmetros críticos adicionais em sistemas

abertos (Acién et al., 2017).

Por serem sistemas abertos, estão sujeitos às condições climatéricas existentes, tornando o

controlo sobre as condições de cultivo limitadas. Devido a este controlo limitado das

condições de cultivo e à possibilidade de contaminação, o uso de unidades de cultivo abertas

é restrito a um número relativamente reduzido de espécies de microalgas. Tais condições

tornam este sistema indicado para o cultivo de microalgas robustas, de crescimento rápido e

que suportem condições adversas (Acién et al., 2017).

Em alternativa, o uso de sistemas fechados, onde o ambiente é controlado e potencialmente

livre de contaminantes, é vantajoso na produção de uma gama bastante ampla de estirpes.

2.1.1. Lagoa convencional

A lagoa convencional é constituído por um

tanque com paredes de contenção,

revestimento, rodas com pás e sistemas de

controlo opcionais (Figura 2). Tem sido,

durante décadas, o design mais usado nas

instalações industriais e em grandes áreas de

produção, podendo ainda ser utilizado para

aplicações de tratamento de águas residuais.

O seu baixo custo de construção, facilidade de

operação, flexibilidade e capacidade de

aumento de escala tornam este um bom método para produção de grandes quantidades de

biomassa (A4F “Plataformas tecnológicas” 2019).

2.1.2. Lagoa em cascata

A lagoa em cascata é um modelo inovador desenvolvido pela A4F (A4F “Plataformas

tecnológicas” 2019). É constituído por duas rampas paralelas inclinadas, com inclinação

oposta, como ilustrado na Figura 3. Esta configuração permite uma maior eficiência na

mistura e maior controlo de contaminantes. Contém ainda um tanque coberto para o qual a

Figura 2 – Lagoa convencional (Website A4F).

6

cultura flui após percorrer o percurso fotossintético, para depois ser novamente bombeada

para a primeira rampa.

É um sistema bastante rentável tendo em conta os

baixos custos energéticos, o aumento da

produtividade e a exequibilidade em condições de

elevada precipitação. Em situações de elevada

precipitação, é possível armazenar a cultura no

tanque coberto, prevenindo a diluição da cultura ou

um choque de salinidade em culturas de espécies de

água salgada.

Em relação ao convencional, este sistema apresenta

uma coluna de água mais reduzida, permitindo uma

maior produtividade e diminuição nos custos de

colheita. Outra vantagem é a menor necessidade de água e nutrientes inorgânicos, reduzindo

desta forma os custos operacionais. Adicionalmente, existe maior controlo do dióxido de

carbono e menor acumulação de oxigénio.

2.2. Sistemas fechados

2.2.1. Fotobiorreatores tubulares

Os fotobiorreatores tubulares (Figura 4) são

maioritariamente utilizados para produzir produtos de

elevado valor acrescentado e biomassa de alta

qualidade, usada para consumo humano. São também

o método mais adequado para a produção de estirpes

sensíveis (Kunjapur and Eldridge 2010), podendo ser

adaptados a diferentes espécies de microalgas e

diferentes produtos e aplicações.

A versatilidade na disposição dos tubos é ainda uma

vantagem para uma produção otimizada e rentável,

permitindo operar em áreas reduzidas. Os fotobiorreatores tubulares podem ser de dois tipos,

PBRs Tubular Horizontal Unilayer, ideais para aproveitar o máximo da energia solar, ou

Figura 4 – Fotobiorreator tubular (Website A4F).

Figura 3 – Lagoa em cascata (Website A4F).

7

Tubular Horizontal Multilayer PBRs, desenhados para uma superfície mínima de

implementação e de forma a ocupar a maior área fotossintética. Ambos os reatores permitem

o controlo de parâmetros como a velocidade de circulação da cultura, pH, temperatura,

quantidade de O2 e CO2 disponíveis e nutrientes, de modo automatizado.

Porém, os PBRs tubulares são significativamente mais caros que as lagoas, não só a nível de

implementação como de manutenção, uma vez que permitem um maior controlo de vários

fatores de crescimento (Kunjapur and Eldridge, 2010).

• Tubular Horizontal Multilayer (MHT – PBR)

Esta configuração é caracterizada pela implementação de tubos dispostos horizontalmente,

paralelos ao solo, e em várias camadas em altura, como ilustrado pela Figura 5, permitindo

um aumento da razão volume/área (A4F “Plataformas tecnológicas” 2019). Esta

configuração é a mais comum e permite maior flexibilidade para controlar o rácio de

luz/célula e diminuir o efeito de fotoinibição.

É ideal para aplicações com iluminação artificial como fonte de energia única ou adicional,

uma vez que a área disponível para exposição artificial à luz é alta, em comparação com uma

configuração unilayer. A temperatura é facilmente controlada, o que pode representar uma

vantagem em ambientes de calor extremo (Acién et al. 2017).

Figura 5 – Fotobiorreator tubular horizontal – MHT (Website A4F).

8

• Tubular Horizontal Unilayer (UHT – PBR)

Este é um PBR desenvolvido como uma otimização do PBR multilayer. A sua configuração

é constituída por uma única linha de tubos dispostos horizontalmente e paralelos ao solo

(Figura 6), o que maximiza a radiação disponível por célula, possibilitando uma eficiência

fotossintética muito alta. Esta configuração permite uma maximização da produtividade

volumétrica e, consequentemente, maiores concentrações de cultura e uma cultura mais

robusta. Outro impacto direto da sua maior produtividade volumétrica é a diminuição dos

custos de colheita devido ao menor volume total da cultura.

Figura 6 – Fotobiorreator tubular horizontal – UHT (Website A4F).

É um sistema ideal para culturas que crescem exclusivamente com radiação solar. O seu

reduzido volume e área diminuem a necessidade de água e nutrientes inorgânicos e permitem

uma maior concentração da biomassa, aumentando a produtividade.

2.2.2. Fotobiorreatores Planos (FP-PBR)

Dentro dos sistemas fechados, este constitui o mais versátil e económico para a produção de

microalgas, devido à sua fácil operação e possibilidade de produção de diferentes

microalgas, desde espécies robustas a sensíveis. O FP-PBR é constituído por um filme

descartável e transparente dentro de uma estrutura metálica, como ilustrado na Figura 7.

Estes fotobiorreatores fechados oferecem uma solução para melhorar o controlo de

contaminações e atingir maiores produtividades volumétricas. Porém, este sistema pode

levar ao sobreaquecimento da cultura, tornando necessário um sistema de refrigeração (A4F

“Plataformas tecnológicas” 2019).

9

Figura 7 – Fotobiorreator plano (Website A4F).

2.2.3. Fotobiorreator plano de vidro (GP-PBR)

Este é um tipo de reator adaptado pela A4F a partir dos fotobiorreatores referidos

anteriormente, constituídos por vidro e aço inoxidável de alta qualidade, esterilizáveis. Tem

como objetivo a produção de espécies de microalgas sensíveis, que necessitem de um

sistema completamente selado e ambiente estéril. Este fotobiorreator fechado apresenta-se

como uma solução para o controlo de contaminações, reduzindo significativamente a

exposição a organismos contaminantes através da sua configuração selada, e para atingir

maiores produtividades volumétricas e elevados rendimentos. É ainda o sistema mais

indicado para produção de espécies geneticamente modificadas, dificultando a sua

proliferação para o ambiente exterior e reduzindo significativamente a exposição a outros

microrganismos. De forma semelhante aos anteriores, estes birreatores apresentam

facilidade de operação e capacidade de aumento de escala.

10

2.3. Fermentadores

Figura 8 – Fermentador (Website A4F).

Os reatores ditos de fermentação (Figura 8) são um conceito recente e permitem um controlo

quase total sobre as variáveis do processo. Geralmente é utilizada iluminação artificial e

controlo integrado sobre a temperatura e composição do meio, permitindo o estudo do

comportamento das diferentes espécies. Em contrapartida, a relação área/volume é reduzida

e o seu custo é muito elevado.

3. Algas

As algas são um grupo heterogéneo de organismos fotossintéticos oxigénios, na sua maioria

aquáticos, que variam de seres unicelulares a algas marinhas gigantes (Evert and Eichhorn,

2013). Pertencem a diversas linhagens evolutivas, sendo amplamente definidas por

características ecológicas: a maioria são espécies fotossintéticas que produzem oxigénio e

vivem em habitats aquáticos (Rocha, Garcia and Henriques, 2003). Adicionalmente, as algas

diferenciam-se das plantas terrestres por não possuírem órgãos, como raízes, caules e folhas,

nem tecidos diferenciados. O seu zigoto não forma embrião, ocorrendo a sua dispersão pela

coluna de água, e as suas estruturas reprodutoras não possuem células estéreis (Graham et

al. 2016).

As algas incluem ambos seres eucarióticos e procarióticos fotossintéticos, como

cianobactérias. Embora se possa, de uma forma geral, definir as algas como fotossintéticas,

produtoras de oxigénio aquáticas, bactérias ou protistas, há algumas exceções (Evert and

Eichhorn, 2013).

11

Existe um número de protistas não fotossintéticos incluídos entre as algas, devido ao seu

próximo parentesco com espécies fotossintéticas. Há ainda outras exceções, como espécies

que habitam em ambientes não aquáticos, como o solo, rochas e outros habitats terrestres

relativamente secos, como é o caso de espécies capazes de tolerar condições secas e quentes

num estado metabólico de dormência. Ainda assim, é necessária a presença de humidade

para as tornar metabolicamente ativas, o que evidência a dependência das algas a um habitat

com água (Evert and Eichhorn, 2013).

As algas são conhecidas como pioneiras da vida eucariota, estando o seu aparecimento

datado em 2.1 biliões de anos, por um fóssil de Grypania. O oceano e zonas costeiras são o

habitat onde a maioria das algas prevalece, porém, estas também dominam habitats de água

doce como lagoas, riachos e lagos, onde são os maiores contribuidores para a produtividade

destes ecossistemas. Em zonas costeiras rochosas são encontradas as algas mais complexas,

as algas vermelhas (Rhodophyta), castanhas (Phaeophyta) e verdes (Chlorophyta). Estas

distribuem-se pelos mais diversos habitats, consoante a sua capacidade para sobreviver em

determinadas condições adversas. A sua complexa estrutura, composição bioquímica e

história evolutiva permitiram-lhes uma adaptação a parâmetros físicos e biológicos inerentes

ao seu habitat, como flutuações de humidade, temperatura, salinidade e luminosidade,

estando ainda sujeitas aos movimentos abrasivos das águas (Evert and Eichhorn 2013;

Heimann and Huerlimann 2015).

3.1. Microalgas

Em todos os corpos de água, pequenas células fotossintéticas e animais ocorrem sobre a

forma de plâncton. A porção de plâncton composta por algas e cianobactérias, formam o

fitoplâncton e correspondem ao início da cadeia alimentar para os organismos heterotróficos

que vivem tanto em corpos de água salgada, como de água doce. Organismos unicelulares

suspensos como diatomáceas, algas verdes e dinoflagelados são dos organismos mais

importantes que constituem a base da cadeia alimentar em cursos de água doce. Por outro

lado, em água salgada, haptophytas unicelulares ou coloniais, dinoflagelados e diatomáceas

são os membros eucarióticos mais importantes do fitoplâncton marinho, constituindo uma

fonte essencial de alimento para a vida animal marinha (Evert and Eichhorn 2013; Graham

et al. 2016).

O fitoplâncton marinho tem vindo a receber uma importância adicional devido às suas

utilizações como fonte de alimento para a aquacultura de camarão, crustáceos e outro tipo

12

de marisco. As algas marinhas podem ser cultivadas de forma a produzir vários produtos

comestíveis e industrialmente viáveis, sendo o uso comercial de algas um dos maiores

exemplos de maricultura, onde organismos marinhos são cultivados de forma análoga à dos

sistemas agrícolas terrestres (Benemann 2013; Evert and Eichhorn 2013).

As algas verdes são um grupo diversificado compreendido por cerca de 17 000 espécies de

algas. Sendo maioritariamente aquáticas, este tipo de algas pode ser encontrado numa vasta

gama de habitats, desde a superfície da neve, a troncos de árvores, solo e ainda em

associações simbióticas com variados organismos. Apesar da maior parte das algas verdes

ser de água doce, existem ainda vários grupos de marinhas, sendo na sua maioria

microscópicas. Todas as microalgas têm presentes na sua composição clorofila a, contudo

algumas podem conter vários tipos de clorofila. As algas verdes são dos poucos grupos de

organismos que contêm clorofila a e b, e armazenam amido em plasmídeos como reserva

(Evert and Eichhorn 2013).

O termo microalgas é geralmente usado em sentido lato, para referir algas microscópicas

eucariotas. No entanto, as microalgas são organismos fotossintéticos eucariotas ou

procariotas, capazes de crescer de forma rápida e viver em condições extremas devido à sua

estrutura unicelular ou multicelular simples (Neumann et al., 2018). Um exemplo comum

destes organismos procariotas são as Cianobactérias (Cyanophyceae), e como exemplos de

eucariotas existem as algas verdes (Chlorophyta) e as diatomáceas (Bacillariophyta) (Chen

et al., 2013). Estes organismos crescem através da fotossíntese, convertendo a energia solar

em energia química, tendo ciclos de crescimento rápidos.

As microalgas têm a capacidade de se adaptarem a diferentes condições ambientais,

conseguindo crescer de forma (Mata, Martins, and Caetano 2009):

• Fotoautotrófica: usando a luz como a única fonte de energia e convertendo-a, através

de reações fotossintéticas, em energia química;

• Heterotrófica: usando apenas compostos orgânicos como fonte de carbono e energia;

• Mixotrófica: dependendo da concentração de compostos orgânicos e da luz solar

disponível, conseguem adaptar-se sendo ou fotoautotróficas ou heterotróficas;

Graças à sua composição, estas podem ser uma importante fonte de proteínas, ácidos gordos,

açúcares, pigmentos, antioxidantes, compostos bioativos e biomassa (Pratoomyot, Srivilas,

and Noiraksar 2005; Chen et al. 2013; Benemann 2013) podendo ser utilizadas para diversos

fins como alimentação animal e humana, biofertilizantes, biocombustíveis, produtos

13

farmacêuticos e cosméticos, suplementos dietéticos e tratamento de águas (Acién et al.

2017).

Apesar destas serem capazes de crescer numa grande variedade de matérias-primas,

necessitando apenas de luz solar e alguns nutrientes, num contexto de produção industrial, a

sua taxa de crescimento pode ser acelerada pela adição de nutrientes específicos e arejamento

(Renaud, Thinh, and Parry 1999). Entre os principais fatores abióticos que influenciam o

crescimento das microalgas estão: intensidade luminosa, temperatura, concentração de

nutrientes, O2, CO2, pH, salinidade e químicos; sendo os bióticos a presença de bactérias,

fungos e vírus, assim como competição com outras microalgas (Mata, Martins, and Caetano

2009). Com todos estes parâmetros em equilíbrio e com condições climáticas adequadas, as

microalgas conseguem crescer em grandes quantidades, sendo possível em 24 horas duplicar

a sua biomassa. Para além do crescimento, as condições de cultivo também influenciam a

composição nutricional das microalgas, podendo ser manipuladas de forma a favorecer os

produtos que se pretendem obter (Meiser, Schmid-Staiger, and Trösch 2004; Chen et al.

2013).

Combinado com o facto de conseguirem crescer em condições adversas e a sua necessidade

reduzida de nutrientes, as microalgas podem ser cultivadas em áreas inadequadas para a

agricultura, independentemente das alterações climáticas sazonais, não competindo com

solo arável. A sua produção pode ainda ser feita sem recurso a água potável, com a

possibilidade de uso de água de sistemas de tratamento como meio de crescimento (Aslan

and Kapdan 2006).

3.1.1. Nannochloropsis sp.

Nannochloropsis sp. é um género de microalga unicelular fotossintética, pertencente à classe

Eustigmatophyceae, amplamente distribuída por habitats de água doce, salgada e salobra

(Wang et al., 2014). Como as restantes microalgas pertencentes a este grupo,

Nannochloropsis apresenta parede celular polissacarídea, um formato esférico (cocos),

(Wang et al. 2014; Christiaan Hoek et al. 1995) e um tamanho entre 2-4 µm (Figura 9).

14

Figura 9 – Células de Nannochloropsis sp. (Hulatt et al. 2019).

A composição em pigmentos deste género é caracterizada por clorofila a, β-caroteno,

violoxantina e vaucherioxantina que constituem os principais pigmentos, contendo também

carotenoides como cantaxantina e astaxantina, cujo aparecimento é acompanhado pela

mudança de cor da cultura de verde para vermelho alaranjado, aquando o envelhecimento

da cultura acompanhado com o défice de nutrientes.

Este género de microalgas é de grande interesse comercial visto que pode servir de matéria

prima para produção de biocombustíveis e produtos de elevado valor acrescentado, dada a

sua elevada tolerância a diferentes ambientes e condições de cultivo, e crescimento rápido e

robusto.

Recentes estudos demostraram que à escala industrial, esta alga apresenta a capacidade base

de acumular quantidades consideráveis de triglicéridos de forma natural ou induzida e ácidos

gordos polinsaturados (PUFAs) como ómega 3, 6 e ácido eicosapentaenóico (EPA). A

produção deste último composto aumenta o interesse desta microalga uma vez que este é

bastante valorizado por não ser sintetizado pelo corpo humano, devendo ser consumido sob

a forma de gordura, sendo maioritariamente encontrado em peixes como o salmão, o atum e

a sardinha, entre outros (Wang et al. 2014; Sandnes et al. 2005; Gill et al. 2018).

3.1.2. Tetraselmis sp.

Tetraselmis sp. é um género de algas verdes, unicelulares e flageladas, pertencentes à classe

Chlorodendrophyceae, (Norris, Hori, and Chihara 1980) constituída por quatro flagelos e

caracterizada por uma forma ovóide, como é possível visualizar na Figura 10, e um corpo

curvo distinto quando visto de lado, (Arora et al. 2013), possuindo um comprimento de 12-

15

14 μm e 9-10 μm de largura. O seu pirenoide, local onde ocorre a síntese de amido, encontra-

se incorporado no único cloroplasto presente na microalga, que ocupa a maior parte do

volume da célula. (Mohammadi, Kazeroni, and Baboli 2015). Este género é representado

maioritariamente por espécies marinhas, apesar de haver alguns representantes de água doce

(Arora et al. 2013).

Figura 10 – Célula de Tetraselmis indica. Barra de escala=5µm. Adaptado de Arora et al, (2013).

Trata-se de um género bastante produzido industrialmente, em sistemas fechados, por ser

constituído por espécies eurialinas e euritérmicas (Mohammadi, Kazeroni, and Baboli 2015).

Como acontece com a maior parte das microalgas, o seu crescimento é afetado por fatores

como a temperatura, salinidade, pH e luz (Creswell 2010).

Esta espécie constitui uma fonte promissora de compostos com potencial utilização na

produção de biocombustíveis, mais especificamente bioetanol, (Li et al. 2008; Mata,

Martins, and Caetano 2009) devido ao seu alto conteúdo lipídico, produção de amido e

elevada taxa de crescimento. É também frequentemente utilizada em aquacultura, como

fonte natural de ácidos gordos polinsaturados (Alonso et al. 2012; Arora et al. 2013;

Mohammadi, Kazeroni, and Baboli 2015) para moluscos juvenis, larvas de camarão e

rotíferos (Arora et al. 2013; Benemann 2013).

3.1.3. Odontella sp.

As diatomáceas são parte integrante da comunidade do fitoplâncton marinho, filo

Bacillariophyta, sendo também denominadas de algas de ouro devido ao seu característico

pigmento castanho amarelado (fucoxantina), que se sobrepõe à clorofila verde. Os principais

16

pigmentos presentes nestes organismos são a clorofila a e c, betacaroteno, fucoxantina,

diatoxantina e diadinoxantina (Xia, Wang, et al. 2013). Este organismo unicelular encontra-

se distribuído por habitats de água doce e salgada (Hemalatha et al. 2017), tendo um

comprimento geralmente variável entre 5 e 200 μm, (Xia, Wang, et al. 2013), existindo

espécies que podem atingir 1 mm (Sabater 2009).

Cada diatomácea é rodeada por uma parede celular rígida e transparente impregnada com

sílica, formando a frústula, composta pela epiteca, parte exterior, e hipoteca, parte interior.

Cada teca é composta por uma valva (placa achatada) e uma faixa de conexão, na sua

periferia (Figura 11). Esta faixa serve de ligação às duas tecas formando uma cinta (do inglês

girdle bands) (Sabater 2009).

As suas células cocóides de paredes de sílica por vezes permanecem ligadas para formar

cadeias simples ou filamentos. A ligação entre o interior da célula e o ambiente exterior é

feita através de poros complexos, que permitem trocas entre o citoplasma e o ambiente.

Estes organismos são comumente categorizados com base na sua simetria cêntrica ou

penada. No primeiro caso, as diatomáceas contêm valvas que radiam da região central,

enquanto que as penadas contêm valvas simétricas bilateralmente (Andersen 2013).

Figura 11 – (a) Célula de Odontella sp. onde são visíveis os poros, as valvas (v) e a faixa de conexão. (b) Odontella aurita onde é visível o processo de conexão de duas valvas (v). Barra de escala = 10µm. Adaptado de Borowitzka (2013).

O seu volume, aliado à grande área superficial providenciam uma maior exposição à luz

solar e à água, que constitui a sua fonte de gases e nutrientes necessários à fotossíntese e ao

crescimento.

Odontella é um género pertence ao grupo das diatomáceas marinhas, da classe

Mediophyceae (“Taxonomy Browser : Algaebase” 2018). São microalgas sésseis que podem

17

conter elevações apicais elevadas, que normalmente formam longas cadeias de células

(“Odontella C.Agardh, 1832 : Algaebase” 2018). Esta microalga é conhecida por conter

elevadas concentrações de EPA (ácido eicosapentaenóico - 20:5ω3) um ácido gordo

polinsaturado de cadeia longa, correspondendo a cerca de 26% dos seus lípidos totais

(Pasquet et al. 2014; Meskini et al. 2012) e de vários compostos bioativos como pigmentos,

fibras e fitoesteróis com efeitos benéficos na saúde humana. Tem um comprimento

geralmente variável entre 15 e 30 μm, (Xia, Wang, et al. 2013), podendo atingir os 95 μm

(Xia, Wan, et al. 2013). A sua cultura em sistemas abertos tem sido bastante testada (Xia,

Wan, et al. 2013), e a espécie O. aurita é atualmente cultivada em lagoas à escala industrial,

em frança (Pasquet et al. 2014).

4. Aplicações

As microalgas apresentam um vasto potencial biotecnológico como fonte de compostos,

como corantes, antioxidantes, emulsificantes e gelificantes utilizados para diversas

aplicações nas áreas alimentar, cosmética, farmacêutica, ambiental e produção de

biocombustíveis (Alonso et al. 2012; Acién et al. 2017). Seguem-se alguns exemplos das

principais áreas de aplicação de microalgas.

4.1. Ambientais

Com o objetivo de tornar a produção de microalgas um processo tanto sustentável como

viável em termos ambientais, e também mais lucrativo, esta pode ser combinada com

processos ambientais. Existem, cada vez mais, estudos que comprovam a obtenção de

produtos de valor acrescentado a partir de microalgas produzidas com recurso à utilização

de águas residuais (Aslan and Kapdan 2006; Acién et al. 2017; Mata, Martins, and Caetano

2009).

Sistemas de aquacultura envolvendo produção de microalgas e tratamento de águas

residuais, como águas originárias de indústrias enzimáticas, de ácidos gordos ou alimentares,

tendem a ser promissoras do crescimento de microalgas, proporcionando ainda a remediação

biológica das águas. Estes sistemas permitem a suplementação de nutrientes para as

microalgas, já que estas águas são ricas em compostos orgânicos como o azoto e o fósforo.

Por diminuírem a quantidade destes compostos em águas residuais, espécies de microalgas

como Nannochloropsis sp. podem ser uma boa solução para a redução da eutrofização dos

18

ambientes aquáticos. No entanto, para se poderem utilizar, as águas não podem conter metais

pesados nem isótopos radioativos (Acién et al. 2017).

4.2. Produção compostos bioativos

Dependendo da espécie em questão, podem ser extraídos diferentes compostos químicos de

elevado valor comercial. Pigmentos, antioxidantes, β-carotenos, polissacáridos,

triglicéridos, ácidos gordos, vitaminas e biomassa são largamente usados para diferentes fins

e em diferentes setores industriais como a indústria farmacêutica, cosmética, alimentar

(alimentos funcionais e suplementos alimentares) e de biocombustíveis. Este tipo de

produtos exige, normalmente, o uso de monoculturas e condições de cultivo controladas,

para uma maior produtividade e eficiência, sendo a produção com esta finalidade levada a

cabo em fotobiorreatores fechados (Acién et al. 2017; Saleh et al. 1985).

A produção de extratos de EPA a partir de microalgas é uma das aplicações mais promissoras

destes organismos (Adarme-Vega et al. 2012), uma vez que a produção a partir de peixes

tem a desvantagem de ter um sabor desagradável e ser muito poluente, ameaçando o declínio

mundial de peixes. Em contrapartida, as algas constituem uma fonte sustentável de EPA,

podendo ser cultivadas em fotobiorreatores ou fermentadores (Chen et al. 2015). O ácido

eicosapentaenóico é uma substância natural do tipo ómega-3 (ácido gordo), usado como

suplemento alimentar, contendo muitos benefícios para a saúde na prevenção de doenças,

sendo também importante para a estrutura e funcionamento da membrana celular (Chen et

al. 2015). Existem há vários anos no mercado suplementos dietéticos ricos em ómega 3,

comercializados sobre a forma de cápsulas, contendo células liofilizadas de Odontella aurita

(Pasquet et al. 2014).

4.3. Saúde humana

Cada vez mais existe entre os consumidores a preocupação de adotar um estilo de vida

saudável, a fim de melhorar a sua saúde e a sua dieta. Há muito que os benefícios dos

microrganismos aquáticos, como as algas, têm vindo a ser estudados e reconhecidos devido

à sua composição rica em compostos orgânicos e inorgânicos benéficos à saúde humana

(prevenção de colesterol, doenças cardíacas, osteoporose e cancro) aliada com propriedades

biológicas antibacterianas, antifúngicas, antivirais e antioxidantes (Shanab 2007; Evert and

Eichhorn 2013; Alves et al. 2018).

19

O elevado teor proteico das microalgas, em comparação com as outras fontes vegetais,

combinado com o seu poder antioxidante, tornam-nas uma mais valia na nutrição humana,

prevenção de stress oxidativo e tratamento de doenças degenerativas. A Spirulina

(Artrhospira sp.), por exemplo, é bastante cultivada e utilizada na alimentação humana, uma

vez que ajuda o sistema imunitário a prevenir infeções virais, promove um balanço hormonal

saudável em adultos e ainda apresenta um alto valor nutricional devido ao seu elevado

conteúdo proteico (Avigad Vonshak 2002; Borowitzka 1999).

Ácidos gordos polinsaturados de cadeia longa (PUFA), especialmente o ácido

eicosapentaenóico (EPA), docosahexaenóico (DHA) e araquidónico (ARA) são compostos

particularmente importantes a nível farmacológico, para dietéticos e tratamento de

inflamações.

4.4. Aquacultura e ração animal

Têm sido feitos imensos esforços com o objetivo de promover a implementação de

microalgas na alimentação humana. Ainda assim, o elevado custo de produção associado a

esta finalidade, aliado ao elevado risco de contaminação toxicológica, limita o seu consumo.

Assim, torna-se mais simples a sua aplicação em aquacultura, como aditivos alimentares

para moluscos, crustáceos e peixes (Sandnes et al. 2005; Evert and Eichhorn 2013). Esta

fonte de alimento contém um elevado teor de PUFA e vitaminas, conferindo um melhor

desenvolvimento e sobrevivência destes organismos aquáticos (Meiser, Schmid-Staiger, and

Trösch 2004; Mohammadi, Kazeroni, and Baboli 2015). Por constituir a base da cadeia

alimentar do meio marinho, o fitoplâncton é um fonte de alimento essencial ao vários

estágios de desenvolvimento de moluscos bivalves, estados larvares de algumas espécies de

crustáceos e em estágios precoces do crescimento de diversas espécies de peixes, como

ilustrado pela Figura 12. As microalgas podem também ser usadas na produção de

zooplâncton, como rotíferos e camarão, que seguidamente servem de alimento a larvas e

estágios juvenis de crustáceos e peixes.

20

Figura 12 – Esquema explicativo do papel das microalgas na aquacultura (Coutteau 1996).

Com esta finalidade são utilizadas inúmeras espécies dos géneros como Nannochloropsis,

Chlorella, Dunaliella, Haematococcus, Isochrysis, Tetraselmis, entre outras. Em

aquacultura, as microalgas podem ser adicionadas de duas formas: como células não

processadas, isto é, organismos vivos, de forma a construir uma cadeia alimentar estruturada;

ou na forma de biomassa processada, que é adicionada ao meio, enriquecendo-o em

nutrientes, para alimento dos organismos em produção. Para além da finalidade nutritiva, as

microalgas têm um impacto importante na produção de O2 e consumo de CO2 (Masojídek

and Torzillo 2008). Porém, o enriquecimento de culturas naturais de fitoplâncton com

microalgas torna difícil tanto o controlo das contaminações e das espécies em produção

como o consumo dos nutrientes disponíveis por predadores indesejáveis (Mata, Martins, and

Caetano 2009).

21

Produção de Microalgas

O processo de produção de culturas puras de microalgas envolve vários aspetos fulcrais

como o isolamento da espécie que se pretende cultivar, a preparação de um meio de cultura

adequado às necessidades de crescimento das mesmas, a manutenção das culturas à escala

laboratorial, assim como em grande escala, em condições controladas de luz, temperatura e

arejamento. Para se atingir este fim é necessária a utilização de inóculo puro, a esterilização

do biorreator utilizado bem como a esterilização do meio de cultura e de outros componentes

adicionados ao processo, e ainda a manutenção de condições assépticas durante o todo o

processo.

1. Lavagem de material

O cultivo laboratorial de microalgas pode ser feito em recipientes de vários tipos, sendo os

mais indicados os de vidro ou plástico (policarbonato). Apesar de os frascos de vidro serem

mais pesados e frágeis têm a vantagem, em relação aos de plástico, de poder ser autoclavados

sem que se libertem compostos com efeitos nocivos para as microalgas. (Perumal et al. 2015)

De forma a evitar a presença de químicos ou resíduos provenientes da fabricação do produto

que possam ser prejudiciais a células vivas, os recipientes de plástico e vidro, à exceção de

produtos esterilizados prontos a usar, devem ser lavados antes da sua primeira utilização

(Kawachi and Noël 2005).

Os protocolos de lavagem do material podem variar dependendo não só do tipo de material

que o constitui como do seu propósito final. É importante que os materiais se encontrem

devidamente lavados antes de qualquer utilização. Apesar de se poder enxaguar o material

com água proveniente da rede, o enxaguamento final deve ser feito com água destilada, isto

porque, a água de rede pode conter nutrientes e metais vestigiais ou pesados, que poderão

contaminar o conteúdo dos frascos. Por outro lado, o uso de detergentes domésticos pode

deixar resíduos em materiais de vidro, devendo ser usados detergentes industriais

apropriados às necessidades do produto em causa. A utilização de detergente comercial

neutro, próprio para uso laboratorial (por exemplo, Neodisher FT com neutralizador, Dr.

22

Weigert GmbH & Co.), seguido de um enxaguamento e secagem, providenciam uma

lavagem segura (Kawachi and Noël 2005).

2. Esterilização

A esterilização e descontaminação são conceitos importantes a ter em conta aquando do

manuseamento de microrganismos como as microalgas. A esterilização é um processo que

visa estabelecer condições asséticas, isto é, a remoção ou morte de todos os microrganismos,

incluindo endósporos e vírus (Madigan et al. 2012). Trata-se de um processo importante na

produção de estirpes isoladas de microalgas em cultura. Para atingir a esterilidade necessária,

devem ser adotadas técnicas de esterilização combinadas com o uso de equipamentos e

materiais estéreis, que minimizem o aparecimento de contaminantes, originando resultados

mais precisos, livres de variantes causadas pela presença de organismos indesejados. A

manipulação de culturas, nomeadamente a sua inoculação requer técnica de assepsia, uma

série de passos que visam prevenir a contaminação durante manipulações de culturas e de

meio de cultura estéril, essencial ao sucesso em microbiologia.

Os contaminantes transportados pelo ar são dos problemas mais comuns devido à existência

de microrganismos na atmosfera do laboratório. Quando os recipientes são abertos, devem

ser manuseados de forma a que o ar contaminado não entre. A técnica de assepsia visa

prevenir a contaminação de objetos estéreis ou culturas microbianas durante a sua

manipulação (Madigan et al. 2012).

Posteriormente, de forma a evitar focos de contaminação, são também necessários cuidados

quando se trabalha com material estéril, dado que, imediatamente após o processo de

esterilização, os materiais são sujeitos a várias fontes de contaminação pelo ar envolvente,

que pode conter esporos e microrganismos suspensos (Kawachi and Noël 2005).

A desinfeção é normalmente definida pela operação que mata ou reduz o número de

organismos patogénicos num ambiente ou numa superfície, inibindo adicionalmente o seu

crescimento (Madigan et al. 2012). Por exemplo, a limpeza das mãos e superfícies com

etanol a 70% antes do manuseamento de culturas ou de equipamento estéril, é um processo

de desinfeção normalmente incluído como parte da técnica de esterilização.

Existem vários métodos de esterilização, que podem ser classificados em quatro categorias:

esterilização por calor, esterilização por ondas eletromagnéticas, esterilização por filtração

e esterilização química (Tabela 1). A esterilização por calor requer, na maioria dos casos,

temperaturas elevadas (≥100°C), implicando que os materiais a esterilizar sejam resistentes

23

às altas temperaturas impostas (material de vidro, instrumentos metálicos, e folha de

alumínio). Na presença de componentes termolábeis (componentes que são destruídos

quando sujeitos a temperaturas elevadas), os líquidos são normalmente esterilizados com

recurso à filtração. As ondas eletromagnéticas (UV, raios-gama, raios-X e micro-ondas) são

usados como uma alternativa para materiais que não podem ser expostos a altas temperaturas

(produtos de plástico ou líquidos com componentes termolábeis). Por fim, diferentes tipos

de químicos têm sido usados com o intuito de esterilizar materiais, no entanto, vestígios dos

químicos usados podem permanecer após o tratamento de esterilização, o que pode ser

prejudicial não só para os organismos como para o operador (Perumal et al. 2015).

24

Tabela 1– Tabela resumo sobre os métodos de esterilização, adaptado de Andersen (2005).

Categoria Método de esterilização Método efetivo Aplicações Limitações

Cal

or

Incineração /Flamejamento

Calor direto chama (bico Bunsen)

Esterilização de superfícies

(manuseamento de tubos ensaio, loops, pipetas)

Materiais não resistentes ao calor (maioria dos

plásticos)

Calor húmido

2 atm (pressão por vapor), 121ºC, 10-20min

(pequenos vol. de líquido) 1h (grandes vol.)

Soluções aquosas, meios líquidos e agar;

recipientes de vidro e metal; equipamentos

Materiais não resistentes ao calor; alterações pH; Contaminação de/por

metal

Calor seco 250ºC, 3 a 5h; protocolo atual – 150ºC, 3 a 4h

Secagem de material; recipientes de vidro e metal; equipamentos

Materiais não resistentes ao calor; líquidos

Pasteurização 60-80ºC, ³30 min.,

seguido rápido arrefecimento (4-10ºC)

Líquidos com componentes termolábeis

Esterilização não completa

Tindalização

60-80ºC, ³30 min., seguido rápido

arrefecimento (4-10ºC); ciclo rep. 3x em 3 dias

Líquidos com componentes instáveis ao

calor Demorado, requer tempo

Filtr

ação

Filtração Filtros com poros £0.2 µm de tamanho

Líquidos com componentes instáveis ao

calor

Pequenos volumes; líquidos elevada viscosidade; não

elimina vírus

Ond

as

elet

rom

agné

ticas

Micro-ondas

10 min a 700W; 5 min com intervalo a

600W; Secagem de bens: 20 min a

600W com água, 45 min sem água

Líquidos pouco volume; secagem de vidraria e

recipientes

Pequenos volumes de líquidos; secagem de recipientes com água

requerem eliminação da água

Radiação ultravioleta

260nm 5-10min

Descontaminação área de trabalho, superfícies,

materiais e ar

Plásticos sensíveis radiação ultravioleta

Quí

mic

a Hipoclorito de sódio

1-5mL/L água, várias horas

Grandes vol. de água para aquacultura

Cistos podem sobreviver; necessária neutralização

(tiossulfato de sódio)

Etanol Solução 50-70% Desinfeção geral Resistência de alguns microrganismos

3. Meio de Cultura

Um meio de cultura é um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrição e o crescimento

dos microrganismos (bactérias, fungos, algas, parasitas) fora do seu ambiente biológico

natural, ou seja, é uma preparação de nutrientes utilizada para o crescimento de

microrganismos em laboratório.

25

Os meios de cultura podem ser líquidos ou sólidos (agar). Conforme a sua composição

química distinguem-se três tipos de meio de cultura: o meio quimicamente definido ou

sintético, o meio enriquecido e o meio de água e solo (Kawachi and Noël 2005).

No meio sintético são adicionados à água destilada quantidades conhecidas de substâncias

orgânicas e/ou inorgânicas quimicamente puras e bem definidas. Estes meios são,

geralmente, usados na cultura de microrganismos autotróficos, como as algas, ou de

microrganismos heterotróficos pouco exigentes. Podem ser usados para determinar as

necessidades nutricionais precisas de um microrganismo. Adicionando ou retirando um

constituinte a este tipo de meios permite verificar se esse constituinte é essencial ou não para

o crescimento de um determinado microrganismo. O meio enriquecido é obtido pela adição

de nutrientes a água natural (água de lagos, rios, etc.) ou pelo enriquecimento de meios

sintéticos com extratos de solo, plantas, leveduras, etc. Este é um meio quimicamente não

definido. O meio de solo e água é obtido pela adição de solo seco a água, sendo a sua

composição química definida pelo solo (Kawachi and Noël 2005).

Para a produção laboratorial ou industrial de microalgas de ambiente marinho é necessário

fornecer ao microrganismo as condições básicas ao seu crescimento. A sobrevivência e o

crescimento dos microrganismos dependem de um adequado suprimento de nutrientes e de

um ambiente físico favorável. O meio de cultivo constitui um dos componentes base ao

crescimento de microalgas, podendo ser obtido a partir da água do mar ou ser elaborado

artificialmente (J. C. Carvalho et al. 2019; Kawachi and Noël 2005). Dado que podem existir

microrganismos no meio de cultura, este deve ser esterilizado antes de usado. Uma vez

preparado e esterilizado na autoclave, fica pronto para receber o inóculo iniciando-se o

processo de crescimento (Madigan et al. 2012).

3.1. Composição

Os meios de cultura devem conter nutrientes em quantidades e proporções corretas para a

manutenção e multiplicação dos microrganismos. Dependendo da espécie, os

microrganismos têm necessidades nutricionais variáveis, no entanto, há determinadas

substâncias cuja necessidade é comum a todos (Madigan et al. 2012).

A água proveniente diretamente do mar consiste num meio complexo, contendo mais de 50

elementos naturais, em quantidades variáveis. Para a cultura de microalgas, o seu uso direto

raramente é suficiente, sendo necessário a adição de nutrientes e metais vestigiais, caso

26

contrário, o rendimento e crescimento de microalgas é demasiado baixo para a manutenção

da cultura ou para experiências laboratoriais. Em alternativa, para evitar a necessidade de

filtração e tratamento da água de origem natural, a água do mar pode ser obtida de forma

artificial, mimetizando a salinidade e componentes existentes na natural (Kawachi and Noël

2005).

3.1.1. Salinidade

As microalgas são na maioria dos casos extremamente tolerantes a variações de salinidade.

A maior parte das espécies cresce idealmente entre 30 e 35 psu, sendo que algumas não

toleram salinidades reduzidas (Kawachi and Noël 2005). Os meios de cultivo em que a

salinidade é obtida de forma artificial ou sintética são constituídos por duas partes: os sais

basais principais, que formam a água do mar basal, e a solução de enriquecimento. Para a

preparação de meios com salinidades mais baixas, deve ser adicionada água destilada antes

da adição de nutrientes, metais ou vitaminas, para que não sejam adicionados minerais

presentes na água de rede e também evitar a diluição dos componentes do meio nutritivo.

3.1.2. Nutrientes

A produção substancial de biomassa requer o aumento da síntese de proteínas, síntese da

parede celular, a replicação dos ácidos nucleicos e a produção de transportadores de energia.

Estes processos requerem a existência de azoto e fósforo no meio. É ainda necessária a

adição de minerais necessários ao crescimento - magnésio, essencial à clorofila, potássio e

sódio necessários à osmorregulação e potencial celular, e elementos vestigiais que

funcionam como cofatores enzimáticos (J. C. Carvalho et al. 2019).

Torna-se assim necessário enriquecer o meio de cultura em nutrientes, através da preparação

de um meio nutritivo. Um meio de cultura básico contém normalmente macronutrientes

como azoto, fósforo, cálcio, potássio, magnésio, sódio. Os micronutrientes são compostos

por elementos metálicos (ferro, zinco, cobre, manganésio, cobalto) e vitaminas como

vitamina B1 (tiamina), B12 (cobalamina) e por vezes B7 (biotina) (Perumal et al. 2015;

Kawachi and Noël 2005). O carbono necessário ao desenvolvimento de microalgas é

tipicamente inorgânico e pode ser adicionado ao meio sob a forma de carbonatos ou

fornecido como dióxido de carbono (J. C. Carvalho et al. 2019). A preparação deste tipo de

meio requer alguns cuidados na adição de sais como o ferro e o cobre, que podem formar

27

precipitados insolúveis. De forma a evitar a sua precipitação, podem ser adicionados agentes

quelantes, como o EDTA, ácido etilenodiamino tetra-acético (do inglês,

ethylenediaminetetraacetic acid), que forma complexos estáveis com os diversos iões

metálicos.

Existem espécies que requerem nutrientes adicionais, como é o caso das diatomáceas. Para

o seu cultivo é necessário suplementar o meio com silício, uma vez que as diatomáceas

requerem sílica para a síntese da frústula.

4. Isolamento, obtenção e manutenção de culturas

4.1. Métodos de isolamento de espécies de microalgas

A manipulação de culturas, nomeadamente o seu isolamento, requer uma série de passos que

visam prevenir a contaminação de objetos, culturas e meio de cultura estéreis durante

manipulações - técnicas de assepsia, essenciais ao sucesso em microbiologia. Os

contaminantes transportados pelo ar são dos problemas mais comuns devido à existência de

microrganismos na atmosfera do laboratório. Quando os recipientes são abertos, devem ser

manuseados de forma a que o ar contaminado não entre. A técnica de assepsia visa prevenir

a contaminação de objetos estéreis ou culturas microbianas durante a manipulação (Madigan

et al. 2012).

A manutenção de culturas de microalgas, nomeadamente culturas puras, é fundamental para

a produção de biomassa unialgal. Culturas puras podem ser obtidas de coleções de culturas

especializadas ou ser isoladas a partir de uma amostra (Andersen 2013).

O isolamento de espécies microscópicas é um processo complexo devido ao tamanho

reduzido das células e à sua associação com outras espécies epifíticas (Perumal et al. 2015).

Existem várias técnicas laboratoriais que visam o isolamento de células tais como o

plaqueamento em agar, diluições sucessivas da cultura, micromanipulação, isolamento com

micropipeta ou ainda citometria de fluxo (Kawachi and Noël 2005).

4.2. Dinâmica de crescimento

O crescimento de uma cultura axénica de microalgas pode ser caracterizado por 5 fases,

tendo em conta as alterações do comportamento da cultura ao longo do tempo. O seu

28

crescimento descreve normalmente uma curva sigmoide, como ilustrado na Figura 13

(Perumal et al. 2015).

Figura 13 – Curva de crescimento de uma população de células ao longo do tempo, em cultura batch. Representação gráfica do logaritmo do número de células por unidade de volume (células/mL) em função do tempo (h). Lag – fase de latência, Exponential – fase exponencial. Stacionary – fase estacionária, Death phase – fase de declínio, Acceleration – aceleração, Deceleration – desaceleração. Adaptado de Waites et al. (2002).

A primeira fase – fase de latência - ocorre após a adição de inóculo ao meio de cultura, e

caracteriza-se pela invariabilidade temporária da população, observando-se neste período o

aumento das dimensões das células em tamanho, sem que haja divisão celular. A nível

fisiológico as células encontram-se metabolicamente ativas, ocorrendo a adaptação ao meio

(Waites et al. 2002). Após um curto período de aceleração, a taxa de crescimento da

população microbiana torna-se constante, entrando na fase exponencial. Durante esta fase,

em que todos os nutrientes estão presentes em excesso, os microrganismos dividem-se e a

população cresce com uma taxa específica de crescimento máxima que depende do potencial

genético do microrganismo, da composição do meio de cultura e das condições de

crescimento. Após esta fase, ocorre desaceleração devido ao declínio da taxa específica

máxima de crescimento. Na fase estacionária, o esgotamento de um ou vários fatores

essenciais como nutrientes, luz, pH, CO2, começam a limitar a divisão celular. A fase

logarítmica de crescimento decresce gradualmente, seguindo-se um período em que o

número de células permanece constante, como resultado da cessação da divisão celular ou

do balanço entre a taxa de reprodução e morte celular. Nas culturas em batch observa-se

ainda a fase de declínio, em que a taxa de morte celular é superior à de reprodução. O número

de células viáveis na população decresce geometricamente (Perumal et al. 2015).

29

4.3. Condições de cultivo de microalgas

As culturas de microalgas em pequena escala são normalmente mantidas em Erlenmeyers,

tubos de ensaio ou caixas de Petri. Na Figura 14 encontram-se representados exemplos de

dois destes sistemas de cultivo laboratorial. Em laboratório, podem ser providenciadas

condições de temperatura e luminosidade controladas, proporcionadas por estufas ou

câmaras de crescimento. Adicionalmente, deve ser proporcionado arejamento à cultura e,

para a manutenção contínua das culturas é necessária a sua repicagem periodicamente

(Kawachi and Noël 2005).

Figura 14 – Exemplo dos diferentes sistemas de cultivo de microalgas à escala laboratorial. À esquerda,

cultivos em balões de fundo redondo e à direita, em tubos de ensaio.

4.3.1. Luminosidade

As algas têm a capacidade de realizar fotossíntese, através da assimilação e conversão de

carbono em matéria orgânica. A conversão de energia luminosa em energia útil é feita de

acordo com a seguinte equação (Blankenship 2008):

𝑛𝐶𝑂$ + 2𝑛𝐻$𝑂 + 𝑒𝑛𝑒𝑟𝑔𝑖𝑎𝑙𝑢𝑚𝑖𝑛𝑜𝑠𝑎 → (𝐶𝐻$𝑂)𝑛 + 𝑛𝑂$ + 𝑛𝐻$𝑂

Equação (1) – Conversão de energia luminosa em matéria orgânica.

Para uma maior obtenção de biomassa devem ser considerados diferentes aspetos da fonte

de energia luminosa, incluindo a intensidade, qualidade do espectro e fotoperíodo.

A intensidade luminosa é um fator cuja necessidade pode variar consoante a profundidade

da cultura: a maiores profundidades e densidade celular, a intensidade deve ser elevada o

suficiente para penetrar totalmente a cultura. Por outro lado, intensidades luminosas

demasiado altas podem levar ao sobreaquecimento da cultura e à saturação do fotossistema,

30

resultando em fotoinibição, fenómeno que limita a quantidade máxima de radiação que as

células conseguem processar.

Como ilustrado pela Figura 15, o excesso de radiação resulta no decaimento da taxa de

fotossíntese, uma vez que foi ultrapassada a taxa máxima suportada pelas células. Este

fenómeno, conhecido por fotoinibição trata-se de um mecanismo de defesa para prevenir

danos celulares provocados pelo excesso de energia luminosa (Blankenship 2008).

Figura 15 – Representação esquemática da taxa de fotossíntese em função da radiação. O declive inicial da curva (a) corresponde à eficiência máxima de utilização da luz. A interceção da taxa máxima de fotossíntese, Pmax, com o a corresponde á radiação de saturação da luz (ótima). Para radiações acima do máximo ótimo, a fotossíntese decai, ocorrendo fotoinibição (Andersen 2013).

A região do espectro dos 400 aos 700nm é denominada de radiação fotossinteticamente

ativa, sendo válida para organismos que contenham clorofila a na sua constituição, como as

microalgas (Blankenship 2008). De forma a fornecer às microalgas condições à realização

da fotossíntese, pode ser fornecida energia luminosa de origem natural - luz solar, ou

artificial através de lâmpadas fluorescentes, sendo que ambas providenciam energia

suficiente à realização da fotossíntese. Enquanto que em câmaras de cultivo podem ser

instaladas lâmpadas fluorescentes, os sistemas de produção exteriores dependem da luz solar

para iluminação. Tal como demonstrado pelas Figuras 16 e 17, tanto o uso de lâmpadas

fluorescentes como o aproveitamento da luz solar providenciam energia suficiente para a

realização da fotossíntese.

31

Figuras 16 e 17 – Espectro de absorção da clorofila a (chlorophyll a) e b (chlorophyll b). (Commons 2008); Gama de radiação solar, D65 (luz do dia, 12 horas), a picotado, e gama da radiação emitida por uma lâmpada fluorescente típica, a cheio (Wulf and Wulf 2018).

Outro fator que pode influenciar o crescimento das culturas é o fotoperíodo. Em culturas em

pequena escala este pode ser controlado pela regulação da duração da luz artificial, que deve

ser no mínimo de 18h de luz por dia. Um fotoperíodo de 24horas é suportado por algumas

espécies de flagelados que se desenvolvem com iluminação constante (Kawachi and Noël

2005). Já em culturas de diatomáceas, este fotoperíodo pode resultar na diminuição do

tamanho celular e consequentemente em menor quantidade de biomassa. Concluindo, as

algas parecem reagir de diversas formas a diferentes ciclos dia/noite, tal como demonstrado

na Figura 18.

Figura 18 – Impacto de diferentes fotoperíodos no crescimento de uma microalga verde. Letras diferentes indicam uma diferença significativa entre os tratamentos (P<0.05). As barras de erro representam o erro padrão (n=3). Adaptado de Qin (2005).

Pela análise do gráfico da figura acima, ciclos de 4 e 8h apresentam uma taxa de crescimento

mais baixa, enquanto que os ciclos de 12 e 24h mostram uma maior densidade ótica, o que

32

se traduz numa maior produção de biomassa. Entre os ciclos de 12 e 24h não existem

diferenças significativas, o que pode tornar a iluminação contínua dispensável (Qin, 2005).

4.3.2. Temperatura

A temperatura influencia a taxa metabólica dos organismos tornando-se determinante no

crescimento das microalgas. Embora seja difícil prever quais os valores de temperatura

ideais para cada espécie sem experimentação prévia, as espécies de microalgas comummente

cultivadas costumam tolerar uma gama de temperatura ente 16-27º C. Para culturas de

fitoplâncton, a temperatura ótima estimada encontra-se entre os 20 e os 24ºC, embora esta

possa variar consoante a composição do meio de cultura, a espécie e a estirpe cultivada

(Perumal et al. 2015). Abaixo dos 16ºC, o crescimento da microalga tende a desacelerar,

enquanto que acima dos 35ºC, a temperatura torna-se letal para várias espécies.

Culturas sujeitas às condições climatéricas existentes, como cultivos exteriores, se

necessário, podem ser arrefecidas por um fluxo de água fria pela superfície do recipiente que

contém a cultura. Em salas de cultivo, o controlo da temperatura do ar é feito com unidades

de refrigeração por ar condicionado, podendo ser regulada conforme as necessidades da

espécie.

4.4. pH

O pH é definido pela composição do meio e tem uma importância substancial no crescimento

de qualquer microrganismo. As microalgas são geralmente sensíveis a alterações deste

parâmetro, sendo o seu crescimento grandemente influenciado pelo pH do meio. O seu

controlo é feito, geralmente, a partir do aumento ou diminuição da concentração de CO2 no

meio. A dissolução de CO2 na água leva à libertação de iões de hidrogénio, através do

seguinte conjunto de reações:

𝐶𝑂$ + 𝐻$𝑂 ↔ 𝐻$𝐶𝑂7

𝐻$𝐶𝑂7 ↔ 𝐻8 + 𝐻𝐶𝑂79

𝐻𝐶𝑂79 ↔ 𝐻 + 𝐶𝑂79 Equação (2) – Reações de dissolução de dióxido de carbono em água.

33

Figura 19 – Representação gráfica da variação do pH em função do dióxido de carbono dissolvido na água.

Adaptado de CO2: A Fish Drug (2011).

É difícil determinar um valor de pH ótimo que seja universal no cultivo de microalgas, dado

que as necessidades variam de espécie para espécie, com a composição do meio e com o

grau de concentração da cultura.

Para a maioria das espécies de microalgas cultivadas, a gama de pH adequada ao seu

crescimento encontra-se entre 7 e 9. Um pH fora deste intervalo pode resultar no colapso da

cultura como resultado da disrupção de processos celulares (Perumal et al. 2015).

Uma vez que o consumo de CO2 pela fotossíntese torna a cultura mais básica, o método mais

fácil de controlo de pH é através do controlo da concentração de CO2 dissolvido. O aumento

da concentração deste gás acidifica o meio enquanto que o contrário torna o meio mais

básico, permitindo a regulação do pH através do caudal de CO2 injetado na cultura (Figura

19). Dado que o pH tende a aumentar durante o crescimento da cultura, a monitorização

deste parâmetro deve ser feita regularmente de forma a poder ser feito o ajuste ao longo do

crescimento e cultivo da microalga.

4.4.1. Arejamento/agitação

A produção de microalgas em grandes volumes provoca sedimentação considerável da

biomassa, levando à necessidade de agitação da cultura.

O arejamento apresenta diversas vantagens, assegurando: a exposição uniforme das células

à luz evitando uma estratificação termal e ocorrência de fotoinibição; uma melhor

transferência de nutrientes, reforçando ainda as trocas gasosas entre o meio de cultura e o ar.

Existe, porém, a possibilidade da tensão provocada pela agitação do fluido danificar as

células ou provocar a sua morte, caso o sistema usado não seja convenientemente ajustado.

34

Dependendo da escala do sistema de cultivo, a agitação pode ser conseguida agitando

diariamente a cultura manualmente (tubos ensaio, erlenmeyers), pela injeção de ar através

de arejadores (FP-PBR’s) ou através de rodas com pás (lagoas). No entanto deve-se ter em

atenção a sensibilidade da espécie, uma vez que nem todas as espécies conseguem suportar

fortes agitações. A presença ou ausência de parede celular é um dos fatores a ter em conta

quando é adicionada agitação à cultura.

4.4.2. Dióxido de carbono

As trocas gasosas são um processo essencial em sistemas de produção de microalgas. O ar

constitui uma fonte de carbono importante à realização da fotossíntese, sob forma de CO2.

No entanto, para culturas muito densas, o CO2 presente no ar (cerca de 0.03%) torna-se

insuficiente para o crescimento das mesmas, limitando-o. Nestes casos, é necessario fornecer

CO2 puro à cultura através do sistema de arejamento.

O fornecimento de carbono sob a forma de CO2 tende a facilitar o crescimento das

microalgas. Este pode ser fornecido através de gás comprimido armazenado em cilindros,

sendo a quantidade necessária bastante baixa. Normalmente, o gás fornecido deve passar por

um redutor de pressão para assegurar que a quantidade usada manterá o pH da cultura ente

7,5 e 8. O pH a que a cultura se encontra pode ser verificado através de papéis indicadores,

que mudam de cor consoante o pH ou através de um pH meter. Tanto o ar como o dióxido

de carbono devem ser previamente filtrados através de uma unidade de filtros no sistema

(até 0.5 μm porosidade) antes de entrar na cultura, para prevenir contaminações resultantes

da entrada de outros microrganismos. A adição de CO2 funciona ainda como tampão,

impedindo mudanças de pH originadas pelo balanço ente CO2/HCO3- (Coutteau 1996).

5. Crescimento de microalgas

O scale-up é uma das fases mais críticas na produção em massa de microalgas. De acordo

com Borowitzka (2013), neste estádio de desenvolvimento, o inóculo encontra-se mais

suscetível à contaminação por outras espécies de microalgas e por bactérias, devido à

diluição que apresenta. De forma a que o inóculo consiga crescer nas novas condições

impostas, é necessário que este seja suficientemente denso e que estejam reunidas condições

ótimas ao seu crescimento para prevenir o crescimento excessivo por espécies

contaminantes.

35

Dependendo do tipo de sistema escolhido para a produção industrial de microalgas, pode ser

adotado um tipo de scale-up. Para sistemas abertos em tanques, o scale-up deve ser por várias

fases, começando pelo desenvolvimento de inóculo em frascos em laboratório, até se atingir

o volume necessário para se inocular sistemas de maior volume. Alternativamente, pode-se

obter o inóculo a partir de culturas existentes em crescimento em tanques. Neste caso tem

de se ter em conta a presença de possíveis contaminações, sendo uma alternativa apenas

viável para espécies que cresçam em ambientes extremos e seletivos. Embora a maior parte

das espécies requeira um inóculo livre de contaminações, o segundo método é bastante mais

rápido, enquanto que o scale-up, desde a cultura desenvolvida em frascos até atingir o

volume e densidade necessários para poder inocular uma lagoa pode demorar de 8 a 9

semanas. Além do tempo, os custos de produção de inóculo para scale-up deve ser

considerado (Kawachi and Noël 2005).

5.1. Tipos de cultura

As culturas de microalgas podem distinguir-se entre culturas em batch, semi-contínuas e

contínuas (Perumal et al. 2015).

5.1.1. Cultura batch

No sistema batch o cultivo é realizado em sistema fechado, onde toda a cultura em produção

é colhida, podendo ser usada de imediato para diversos fins. Após a colheita, a cultura pode

ser substituída por uma nova. Uma cultura batch é obtida por uma única inoculação de

células, à qual é fornecido meio de cultivo constituído por água salgada e meio nutritivo,

seguido por um período de crescimento de vários dias e culminando na colheita, quando a

cultura atinge a sua densidade máxima. Nestes sistemas os nutrientes do meio de cultura vão

sendo consumidos à medida que a cultura envelhece, o que leva a uma fase de declínio onde

o número de células viáveis diminui drasticamente (Perumal et al. 2015).

Este tipo de cultivo é amplamente aplicado devido à sua simplicidade e flexibilidade,

permitindo a mudança de espécies e a remediação imediata de falhas que possam ocorrer no

sistema. Embora seja considerado o método de cultivo mais confiável, nem sempre é o mais

eficiente. Nestes sistemas, as culturas são colhidas imediatamente antes do início da fase

estacionária e devem ser mantidas por um período substancial além da taxa de crescimento

específica máxima. Outra desvantagem é a qualidade das células colhidas nestes casos ser

menos previsível do que aquelas em sistema contínuo, variando com o tempo de colheita

36

(horário da colheita, fase de crescimento em que se encontra). Ainda, a necessidade de

prevenir a contaminação durante a inoculação inicial e no período de crescimento inicial,

constitui mais uma desvantagem. Sendo a densidade da cultura inoculada inicialmente baixa

e a concentração de nutrientes alta, qualquer contaminante com uma taxa de crescimento

mais elevada que a cultura requerida, é capaz de a superar. Por fim, é um sistema que

necessita de elevado investimento em trabalho na colheita, limpeza, esterilização,

enchimento e inoculação do sistema de produção.

5.1.2. Cultura semicontínua

Sistemas de crescimento semicontínuos são sistemas onde a cultura em inoculação é

parcialmente colhida para obtenção de biomassa, e cujo volume de colheita é reposto com

meio de cultura fresco, podendo este processo ser repetido várias vezes. Decorrido o tempo

necessário ao crescimento e divisão das células adicionadas, o processo pode ser repetido.

Nestes sistemas, as culturas podem ser operadas por 7 a 8 semanas.

Esta técnica permite prolongar o tempo de uso do tanque de crescimento através da colheita

parcial, seguida do perfazimento do volume colhido com nova cultura e da suplementação

com nutrientes a fim de atingir o nível de enriquecimento inicial. A cultura volta a crescer,

até ser novamente parcialmente colhida e assim sucessivamente. Culturas em semicontínuo

podem ser operadas em sistemas indoor e outdoor, tendo uma duração normalmente

imprevisível.

A acumulação de competidores, predadores, contaminantes e metabolitos podem constituir

um problema neste sistema, ao tornar a cultura inadequada para uso futuro. Enquanto a

cultura não for inteiramente colhida, o método semicontínuo apresenta um maior rendimento

de produção do que culturas em batch, para um dado tamanho de tanque.

5.1.3. Culturas contínuas

No método de produção em contínuo, a cultura é constantemente alimentada com meio de

cultivo bombeado para a câmara de crescimento e o excesso de cultura é simultaneamente

escoado, permitindo a manutenção de culturas muito próximas da taxa de crescimento

máxima. Podem ser distinguidas duas categorias do método em contínuo, a cultura

turbiostato e a cultura quimioestato. Na cultura em turbioestato, é adicionado meio de cultivo

fresco à cultura quando a sua densidade celular atinge um ponto predeterminado. A cultura

37

volta a aumentar em densidade celular até o processo ser repetido. Em quimioestato, existe

um fluxo contínuo de meio de cultura fresco, a uma taxa constante. Este meio fornece o

nutriente limitante a uma taxa especifica, permitindo a manutenção da taxa de crescimento

e densidade celular em equilíbrio (Perumal et al. 2015).

As desvantagens do sistema em contínuo passam pelo seu alto custo e complexidade. É

necessário manter iluminação e temperatura constantes, restringindo estes sistemas a

cultivos indoor, sendo este apenas exequível para escalas de produção relativamente

pequenas. No entanto, culturas em contínuo apresentam a vantagem de produzir algas de

qualidade mais previsível. Adicionalmente, permitem controlo tecnológico e automação,

aumentando a confiabilidade do sistema e reduzindo a necessidade de manutenção.

A sua principal vantagem reside no facto de o crescimento microbiano ser influenciado pela

taxa de diluição, que controla a taxa de crescimento microbiano através da concentração do

nutriente limitante no meio. O estado de equilíbrio da densidade celular é caracterizado pela

constante dos parâmetros metabólicos e de crescimento. Por outro lado, se a taxa de diluição

exceder a taxa de divisão celular máxima, as células são removidas mais depressa do que as

que são produzidas, levando assim ao escoamento de toda a cultura em produção.

O regime de produção em contínuo e semicontínuo é comummente preferido, por razões

económicas, melhor aproveitamento do sistema de produção utilizado e menor necessidade

de manutenção. Em ambos os casos, o colapso da cultura pode ser causado por vários fatores,

sendo o esgotamento de um nutriente, a deficiência em oxigénio, o sobreaquecimento,

perturbações do pH ou a ocorrência de contaminações alguns exemplos. A chave para um

elevado rendimento na produção de microalgas consiste em manter as culturas na sua fase

exponencial de crescimento. Adicionalmente, o valor nutricional das microalgas produzidas

tende a diminuir a partir da fase estacionária, devido principalmente à produção de

metabolitos tóxicos (Perumal et al. 2015).

6. Análises quantitativas de culturas de microalgas

O estudo do crescimento de microalgas em cultura requer a determinação do número de

células presentes na mesma. Tal pode ser obtido por contagem direta em câmara, pela

quantificação da biomassa (pelo método do peso seco) ou por medição da absorvância

(Kawachi and Noël 2005).

38

O uso do microscópio e hemocitómetro (câmara de contagem) é dos métodos mais viáveis

visto que possibilita a contagem de células numa determinada amostra, permitindo o controlo

de qualidade das culturas e revelando a presença de contaminantes biológicos. A partir daqui

podem ser determinados alguns parâmetros, tais como a taxa específica de crescimento e a

densidade celular máxima.

6.1. Espectrofotometria

A densidade ótica (DO), também conhecida como absorvância ou turbidez, permite uma

quantificação rápida e não destrutiva da densidade celular em culturas de bactérias e outros

microrganismos unicelulares (Griffiths et al. 2011). De forma a estimar a concentração de

uma dada amostra, por espectrofotometria, é utilizada uma equação que relaciona a

absorvância da solução e a sua concentração – Lei de Lambert-Beer (Equação 3).

𝐴 = 𝜀𝑐𝑙 Equação (3) – Lei de Lambert-Beer. A – absorvância ε- coeficiente de absorção molar; c- concentração; l –

percurso ótico.

Segundo a lei de Lambert-Beer, a quantidade de luz absorvida ou transmitida por uma

determinada solução depende da concentração da substância e da espessura da camada do

meio absorvente (Voet, Voet, and Pratt 2016). Assumindo uma relação linear entre a

absorvância e a concentração da amostra e, aplicando a lei à espectrofotometria, é possível

acompanhar a evolução do crescimento de uma dada cultura. Todavia, tem de se ter em conta

o limite de linearidade para o qual a lei de Lambert-Beer é válida, significando que as leituras

têm de se situar no intervalo de absorvância de 0,1 a 1. Para concentrações superiores ao

limite de linearidade deixa de existir a proporcionalidade linear entre concentração e

absorvância, como se observa pela Figura 20.

39

Figura 20 – Representação do limite de linearidade da correlação entre a absorvancia e a concentração.

A lei de Lambert-beer aplica-se tanto melhor aos dados experimentais quanto menor for a

concentração das soluções. Em concentrações elevadas, a distribuição das cargas das

partículas do soluto e a capacidade para absorver as radiações de um determinado

comprimento de onda alteram-se, desviando o valor da absorvância obtida. (Skoog et al.

1968)

Por outro lado, esta análise não permite diferenciar células viáveis de células mortas e, caso

a cultura contenha partículas insolúveis, estas podem interferir com a medição e adulterar os

resultados. Adicionalmente, esta medição não fornece valores absolutos da concentração de

biomassa, sendo a absorvância posteriormente correlacionada com o peso seco para este fim

(Sarrafzadeh et al. 2015).

A quantidade de luz que atravessa a suspensão celular depende do tamanho das células em

suspensão, do comprimento de onda, da intensidade da luz incidente e da espessura da

cuvette que contém a suspensão celular. O material da cuvette utilizada é dependente do

comprimento de onda selecionado. No caso de medições na região ultravioleta do espectro

(185 - 400 nm) são utilizadas cuvettes em quartzo ou plástico, enquanto que, para

comprimentos de onda na região do visível (400 - 700 nm), podem ser utilizadas cuvettes de

vidro (Pereira 2015).

6.2. Peso seco

A pesagem direta da biomassa de uma amostra de cultura é uma técnica simples e fidedigna

utilizada para quantificar a concentração de biomassa presente. O peso seco pode ser

determinado para amostras de cultura líquida de microalgas (amostra líquida) ou de

biomassa centrifugada (amostra sólida). Apesar de, nesta técnica, toda a água presente na

amostra ser removida, nem sempre é possível remover os sais e outros componentes

40

presentes, resultando num peso seco que contém massa celular e não celular, influenciando

a medição do peso seco (Zhu and Lee 1997).

Em amostras líquidas, as células podem ser separadas do meio através de técnicas de

filtração a vácuo e pesadas após a sua secagem (Sarrafzadeh et al. 2015). Para culturas de

microalgas marinhas, o sal adsorvido na superfície celular e presente na água intercelular

pode ser dissolvido pela adição de uma solução de lavagem durante a filtração da amostra

de cultura, para que atravesse o filtro e não interfira no peso seco. Outro fator a considerar é

a porosidade dos filtros e a perda de cultura durante o processo. Poros de dimensão superior

à microalga não permitem reter a biomassa, permitindo que esta atravesse os poros e fique

contida no permeado. Esta técnica, apesar de simples requer alguma sensibilidade na

montagem do sistema de filtração, de forma a que não haja a rotura dos filtros devido a

pressões induzidas pela bomba de vácuo durante a filtração e para que a cultura não verta,

caso o sistema de filtração não se encontre devidamente isolado.

Quando se trata de amostras sólidas, obtidas após a colheita, estas estão sobre a forma de

pasta de microalga, em que a biomassa é separada do meio de cultura por centrifugação. Este

é dos métodos mais usados devido à sua rapidez e por apresentar melhores resultados na

concentração da biomassa para obtenção de pasta de microalga, contudo, requer o dispêndio

de muita energia e a qualidade da recuperação por centrifugação depende das características

de sedimentação das células, do tempo de permanência das células na centrífuga e da

profundidade da mesma. Para além do método usado e da espécie de microalga, a qualidade

da pasta depende do estado das células e dos parâmetros microbiológicos do cultivo a ser

concentrado (Molina Grima et al. 2003).

7. Produção de microalgas: melhorias futuras

A produção e comercialização de microalgas continua a ser uma indústria em crescimento.

Nos últimos anos têm sido feitos avanços não só a nível dos sistemas de produção, como a

nível da engenharia genética em microalgas. Atualmente, a produção industrial de

microalgas consiste num processo com rendimentos cada vez mais elevados a nível

económico e produtivo, porém, são ainda necessárias melhorias de forma a tornar todo o

sistema mais sustentável.

Uma das maiores restrições à produção em massa de microalgas são os elevados custos de

implementação e operação dos sistemas de produção. Apesar de haver grande diversidade

41

de fotobiorreatores, a sua configuração deve ser escolhida considerando o processo como

um todo. Para tal, deve-se ter em conta não só a espécie de microalga a produzir, como o

produto final que se pretende obter, avaliando qual a melhor metodologia para a obtenção

do produto, seja este a biomassa ou a extração de compostos a partir da mesma. Por exemplo,

se se pretende extrair o conteúdo lipídico da microalga, torna-se importante ter em conta não

só a acumulação de óleo nas células durante a sua produção, como o desenvolvimento de

processos eficientes de extração e processamento do mesmo. Contudo, ainda não existe um

processo ideal para a produção e extração otimizada dos compostos provindos de microalgas,

uma vez que todos os tipos de fotobiorreatores apresentam vantagens e desvantagens em

relação a outros.

Por outro lado, cada vez mais tem aumentado a exigência a nível da biomassa com aplicações

específicas em subsetores industriais, que requerem novas espécies com melhor qualidade

nutricional e/ou características de crescimento, que são compatíveis com as tentativas de

melhorar a eficiência e o rendimento da produção.

A engenharia genética é um método em ascensão no que diz respeito à área das microalgas.

Esta tem sido bastante abordada em ensaios de produção de biocombustíveis a partir de

microalgas. Kunjapur e Eldrige consideraram a engenharia genética como um bom meio

para aumentar a eficiência de produção de biocombustíveis, de várias formas possíveis:

aumento da eficiência fotossintética; aumento da produção de biomassa; aumento do

conteúdo lipídico celular e aumento da tolerância das algas a temperaturas mais altas,

diminuindo a necessidade de sistemas de arrefecimento da cultura. Adicionalmente, a

engenharia genética pode aumentar a tolerância das células à fotoinibição e foto-oxidação.

Contudo, ainda não existem dados suficientes que permitam considerar esta técnica aplicável

à escala industrial, uma vez que os resultados obtidos se referem à escala laboratorial

(Kunjapur and Eldridge 2010). Em adição, a engenharia genética é uma boa forma de

melhorar a produtividade e a economia, mas carece de pesquisa e financiamento a longo

prazo, bem como de regulamentações que permitam a utilização de organismos

geneticamente modificados e o estudo detalhado das funções celulares que esta modificação

pode provocar.

O cultivo de microalgas para produção de biocombustíveis e produtos de elevado valor

acrescentado requer altos níveis de produtividade de biomassa por área e custos mínimos de

produção. Se não se considerarem os custos de implementação, manutenção e operação, os

42

fotobiorreatores fechados tendem a apresentar um desempenho melhor do que os abertos,

pois mantêm condições de crescimento favoráveis e são menos vulneráveis a contaminações.

Ultimamente, têm-se experimentado combinações de reatores abertos e fechados, que

apresentam resultados promissores do ponto de vista da produtividade. No entanto, a nível

económico, não existem informações suficientes para avaliar se o aumento da produtividade

compensa o investimento capital extra necessário, particularmente no que diz respeito a

aplicações de biocombustíveis (Masojídek and Torzillo 2008; Benemann 2013).

De forma a tornar a produção de microalgas um processo ambientalmente sustentável, torna-

se ainda necessário diminuir o desperdício de água inerente a esta prática. Por outro lado,

existe também a necessidade de reduzir o consumo de água em aquacultura, através do

desenvolvimento de sistemas de recirculação. No entanto, a pesquisa e o desenvolvimento

atuais que abrangem a reutilização de água da aquacultura, são amplamente dedicados a

sistemas baseados em bactérias utilizadas para consumir os nutrientes disponíveis na água,

não havendo reutilização da mesma. Para além disso, um sistema de reutilização de água

baseado em microalgas, pode ser usado para produzir uma segunda colheita. A principal

dificuldade enfrentada no desenvolvimento de sistemas de reutilização de água baseados em

microalgas é a incapacidade de manter as espécies de microalgas, pretendidas para o efeito,

em sistema aberto, tornando o efluente uma matéria prima sustentável (Guedes and Malcata

2012).

A produção de biocombustível a partir de microalgas é das aplicações que tem merecido

mais atenção nos últimos tempos, conduzindo inúmeras entidades à investigação da

tecnologia inerente à sua produção. Desta forma, espera-se que com o desenvolvimento

tecnológico integrado que suporta toda a cadeia de sistemas de produção de microalgas,

incluindo fisiologia de microalgas, genética, biologia de sistemas, engenharia metabólica e

engenharia de bioprocessos, se consigam atingir avanços que permitam uma produção de

microalgas economicamente mais rentável, não só na obtenção de biocombustíveis

fotossintéticos como de outros produtos de elevado valor acrescentado (Aidinopoulou and

Sampson 2017).

8. Objetivos O presente estágio, com a duração de sete meses, foi desenvolvido com o intuito de alcançar

os seguintes objetivos:

43

ü Desenvolver competências necessárias para a realização das tarefas num Laboratório

de Biotecnologia associado à produção de microalgas;

ü Desenvolver competências transversais em contexto empresarial;

ü Desenvolver mindset e postura pró-ativa, detetando eventuais problemas e

necessidades, e procurando soluções e melhorias;

ü Acompanhar o crescimento de microalgas em produção no ALGATEC EBP,

realizando análises de controlo do estado da cultura e qualidade do produto.

Com o objetivo de atingir rendimentos elevados na produção industrial de microalgas e

promover a máxima qualidade do produto obtido, foi necessária não só uma monitorização

regular das culturas em produção como da biomassa obtida destas. De forma a produzir

microalgas em larga escala foi necessário o desenvolvimento de inóculo da espécie

pretendida, fazendo o scale-up da mesma, desde a escala laboratorial à escala industrial.

Sendo um estágio profissionalizante, não foi realizado um ensaio científico, tendo sido

desenvolvidas várias tarefas enquadradas na rotina de um laboratório focado no seguimento

rotineiro da produção de espécies de microalgas em fotobiorreatores. A fim de avaliar o

crescimento da cultura foram realizadas técnicas de quantificação da densidade celular, para

inferir a concentração da cultura e também a concentração de nutrientes presentes no meio.

Seguidamente, foi necessário determinar o estado da cultura, isto é, a viabilidade geral das

células, se a cultura se encontrava em condições de stress, e a presença ou ausência de

contaminações microbianas. Após a avaliação da sua viabilidade, procedeu-se à colheita. No

fim de colhida a cultura, foi efetuado um controlo de qualidade da biomassa obtida, através

da realização de novos métodos de determinação da sua concentração e estado biológico. Ao

longo deste trabalho são explorados os vários métodos de controlo de qualidade utilizados

durante o estágio assim como as restantes tarefas desempenhadas no laboratório.

44

Parte I – Tarefas gerais de laboratório

De modo a assegurar o bom funcionamento do laboratório e resposta às necessidades

diárias de trabalho, no período de estágio foram desenvolvidas atividades de diferentes

âmbitos segundo o plano de tarefas semanal estabelecido pela responsável de laboratório.

1. Estrutura documental

O laboratório ALGATEC possui uma estrutura documental que engloba o desenvolvimento

de documentos necessários às atividades do Laboratório, como procedimentos de operação,

manutenção e calibração de todos os equipamentos presentes no laboratório e ainda

procedimentos de controlo e análise das culturas. Foi ainda desenvolvida documentação

como Fichas de Segurança de reagentes e foram preenchidas folhas de registo de gestão de

stocks.

Para ser possível uma melhor compreensão do tipo de documentação desenvolvida ao longo

do estágio, encontra-se abaixo listado todos os documentos desenvolvidos e a explicação dos

mesmos:

o Procedimentos operacionais

Desenvolvimento de um documento operacional com base na informação presente nos

manuais de instruções do equipamento, nas informações fornecidas pelo técnico aquando a

instalação do mesmo e na experiência adquirida ao funcionar com o equipamento. Estes

procedimentos apresentam uma breve descrição de como operar e selecionar programas de

forma simples e organizada permitindo a qualquer utilizador compreender o modo de

funcionamento do equipamento em questão. Todas as semanas foram revistos

procedimentos já existentes e foram realizados outros para equipamentos adquiridos durante

o período de estágio. Esta tarefa era realizada após a execução das tarefas diárias prioritárias

e, por vezes, a correção e atualização dos procedimentos era feita à medida que eram testados

e utilizados os equipamentos. Estes documentos foram desenvolvidos.

o Procedimentos de manutenção e procedimentos de calibração

45

Desenvolvimento de um documento explicativo de cada manutenção ou verificação de

calibração para cada um dos equipamentos e qual a sua periodicidade. Estes procedimentos

foram redigidos a partir de informações fornecidas pela marca e pelo técnico aquando a

instalação dos equipamentos. Permite a qualquer utilizador o conhecimento de todas as

manutenções necessárias a realizar e como proceder às mesmas. Este tipo de documento é

de extrema utilidade uma vez que permite acompanhar a manutenção de cada equipamento.

o Gestão de stocks

Consiste num documento de registo de todos os produtos (consumíveis, reagentes, vidros) e

equipamentos presentes no laboratório. Permite ao utilizador saber todos os produtos e

equipamentos que se encontram no seu local de trabalho, e verificar a necessidade ou não de

adquirir mais material. Sempre que foram adquiridos novos materiais ou foram utilizados

consumíveis, foi efetuado o seu registo na versão impressa existente no laboratório, que era

posteriormente atualizado semanalmente no formato digital.

o Fichas de Segurança

As fichas de segurança são um documento de apoio ao manuseamento de reagentes do

Laboratório e consistem num resumo, elaborado internamente a partir da ficha do produto,

que compreende informações sobre o reagente, permitindo ao utilizador uma melhor

compreensão dos riscos e medidas preventivas a praticar aquando da manipulação do

reagente. Este documento tem também informações relevantes quanto à necessidade de

utilização de equipamentos de proteção individual tendo em conta o reagente a manipular,

nomeadamente a utilização de máscara respiratória, óculos de proteção, luvas, entre outros.

Durante o estágio foram realizadas fichas de segurança (FDS) de alguns reagentes, contendo

informações necessárias ao manuseamento dos produtos químicos utilizados. Segue-se a

lista de produtos para os quais foram desenvolvidos FDS:

• Solução de lavagem de células 97% (1Kg);

• Detergente máquina lavar vidraria LaboClean NeodisherA – Dr. Weigert;

• Neutralizador máquina lavar vidraria LaboClean Neodisher Z – Dr. Weigert;

• Buffer solution pH10;

• Buffer solution pH7;

46

• Buffer solution pH4;

• Standard Condutivity (1288 µS/cm).

Segue-se a título de exemplo a ficha de segurança desenvolvida para a solução padrão de

condutividade 1288µS/cm (Figura 21).

Figura 21 – Modelo ficha de segurança Solução padrão de condutividade 1288µS/cm.

2. Registos do laboratório

O laboratório ALGATEC possui documentos de registo para facilitar a organização e gestão

do laboratório, sendo eles:

• Registo de manutenção dos equipamentos;

• Registo de calibração;

• Registo de matérias primas;

• Registo de controlo das águas;

• Registo de produção de culturas;

• Registo de pH de culturas;

• Registo de análises;

• Registo de ocorrências.

47

Os registos do laboratório são atualizados ao longo da semana, sendo o seu principal objetivo

permitir a compilação e o rastreio da informação. Os registos são enviados no final de cada

semana para as chefias de forma a assegurar a partilha de informação e possibilitar o trabalho

conjunto e uma boa gestão empresarial.

Folha de cálculo das tarefas diárias

Para além dos registos anteriormente referidos, foi realizado um registo diário que permitiu

sintetizar todos os resultados obtidos das análises efetuadas diariamente às culturas de

microalgas em produção, tendo em conta o planeamento diário de amostragens e análises

definido pelo responsável de produção. Esta folha foi preenchida e enviada todos os dias,

tendo sido completada à medida que as análises foram realizadas e foi enviada no final de

cada dia, de forma a que todos os envolvidos tivessem conhecimento do estado de produção

das culturas, para que o trabalho do dia seguinte pudesse ser planeado da melhor forma.

3. Verificação dos equipamentos do laboratório

Diariamente, de manhã e à tarde, foi feita uma verificação de todos os equipamentos

existentes no laboratório, de acordo com a lista existente para o efeito. Esta tarefa rotineira

teve como objetivo certificar que o laboratório se encontrava nas devidas condições,

incluindo os equipamentos, e que as culturas em produção estão em bom estado. Desta

forma, foi possível averiguar, na verificação da manhã, se ocorreu algum problema durante

a noite e que, ao final do dia, o laboratório se encontrava arrumado, com todos os

equipamentos desligados da tomada, quando aplicável, e se as culturas em produção se

encontravam com as condições de cultivo corretas. Semanalmente, foi enviado o documento

que contém a lista de verificação do laboratório, onde foi registado o nome do responsável

pela mesma.

4. Operação, manutenção e calibração dos equipamentos do laboratório

De modo a que qualquer utilizador possa compreender e operar os equipamentos do

laboratório, cada um deles contém um procedimento operacional e, quando aplicável,

procedimento de manutenção e procedimento de calibração.

A maioria dos equipamentos existentes no LabALGATEC carece de manutenções semanais,

mensais ou pontuais. Esta manutenção pode envolver a limpeza do equipamento e seus

48

acessórios, descontaminação, testes ao seu correto funcionamento, substituição de peças,

verificação do seu estado ou outras tarefas que visem o prolongamento das boas condições

de laboração do equipamento, prevenindo erros nos resultados das análises laboratoriais.

Caso se verifique um desvio do funcionamento do equipamento, o erro é reportado à marca.

No final de cada manutenção, a mesma é registada no ficheiro Excel existente para o efeito

- Registo de manutenção dos equipamentos - no qual são indicadas as datas de realização, o

operador, o equipamento envolvido e qual a manutenção efetuada, de forma a rastrear a data

da última manutenção e verificar quando deve ser realizada a próxima. À semelhança dos

restantes registos, este é enviado à pessoa responsável pelo laboratório, semanalmente.

O estado de calibração dos equipamentos de medição é um fator importante a ter em conta

nas tarefas laboratoriais uma vez que a imprecisão de volumes e massas podem gerar erros

e afetar os resultados das análises efetuadas. As micropipetas e multipette são diariamente

utilizadas para efetuar análises das culturas de microalgas para controlo de parâmetros

cruciais na sua produção, como a avaliação do seu crescimento e necessidade de nutrientes.

Devido à sua importância, a calibração destes equipamentos é efetuada regularmente e de

forma rigorosa respeitando a norma ISO8655-6 (International Organization for

Standardization 2002).

A norma ISO8655-6, Métodos gravimétricos para a determinação do erro de medição, atende

às necessidades de fornecedores de aparelhos de medição para o controlo de qualidade e a

certificação independente e dos operadores dos equipamentos, permitindo a verificação de

rotina para avaliar parâmetros como a exatidão e precisão (Anexo I) do equipamento.

Para além dos desvios ao estado de calibração resultantes da habitual utilização das

micropipetas, deve ter-se em conta que a exatidão e precisão das pipetagens podem depender

da sensibilidade e experiência do operador e da influência que a temperatura tem no volume

ocupado por um líquido, tornando necessário relacionar as medidas volumétricas a uma

temperatura-padrão, normalmente 20°C.

Em equipamentos que requerem calibração periódica, como as balanças, as micropipetas e

multipette, sondas de pH e condutividade ou o refratómetro, foi verificada a necessidade de

calibração, a fim de estabelecer se o ajuste efetuado internamente é suficiente ou se os

equipamentos terão de ser enviados para laboratórios especializados para a sua calibração.

No caso das micropipetas, o seu estado de calibração foi verificado de duas em duas semanas

durante todo o período de estágio.

49

Micropipetas

Para efeitos de controlo, durante o estágio foram realizadas verificações bissemanais ao

estado de calibração das micropipetas (Digipet MC 900909, MG 921002, MG 916022 e ML

946868), tendo em conta a incerteza e imprecisão das medições realizadas com as mesmas.

Os volumes de teste e intervalos de aceitação ou rejeição da verificação da calibração são

fornecidos pela marca das micropipetas. Quando necessário, foi realizado o ajuste de

volumes para os intervalos de incerteza e precisão definidos, dentro dos parâmetros

estipulados na Tabela 2. Se, após o ajuste, a incerteza e imprecisão ainda fossem superiores

às permitidas, o equipamento fica inutilizável até ser enviado para calibração externa.

Para verificar o estado de calibração das micropipetas foram realizadas 10 medições de 3

volumes diferentes, para cada uma das micropipetas, como presente na Tabela 2. Os volumes

pipetados, de água destilada a 20 ± 0,5 ºC, foram pesados, em miligramas (mg) na balança

analítica Mettler AT250 com proteção de vidro, e registados numa folha Excel para a

realização dos cálculos de imprecisão e incerteza.

Os valores obtidos foram convertidos para microlitros (µL) segundo a seguinte equação:

𝜌 = ?@↔ 0.9982 = ?(?E)

@(µG)

Equação (4) – Conversão de massa (m) em volume (V) através da densidade. rágua=0,9982, a 20ºC.

Os valores de incerteza e imprecisão foram obtidos através das seguintes equações:

𝐼𝑛𝑐𝑒𝑟𝑡𝑒𝑧𝑎(%) = LéNOPQRST?U?UNONR(VG)9@RST?UWUXWU(VG)@RST?UWUXWPNR(VG)

× 100 (5)

𝐼𝑚𝑝𝑟𝑒𝑐𝑖𝑠ã𝑜(%) = ]UQOR^PN_ãRNRXQRST?UX?UNONRXLéNOPQRST?U?UNONR(VG)

× 100 (6)

Equações (5) e (6) – Cálculo da incerteza e imprecisão.

50

Tabela 2 – Tabela resumo dos parâmetros de incerteza e imprecisão determinados pela marca como admissíveis, utilizados na verificação do estado de calibração, para cada micropipeta.

Volume (µL) Incerteza Imprecisão

Micropipeta 0,5 – 10 µL

1 ±2,50 ±1,50

5 ±2,00 ±1,00

10 ±1,00 ±0,80

Micropipeta 10 – 100 µL

10 ±3,00 ±1,50

50 ±1,00 ±0,50

100 ±0,80 ±0,15

Micropipeta 100 – 1000 µL

100 ±2,00 ±0,70

500 ±1,00 ±0,40

1000 ±0,60 ±0,20

Micropipeta 500 – 10 000 µL

1 000 ±3,00 ±0,60

5000 ±1,20 ±0,30

10 000 ±0,60 ±0,20

Medidor de pH e condutividade

Antes de cada utilização do medidor de pH e condutividade de bancada (HI 2020-02, Hanna

instruments) foi verificado se este se encontrava calibrado através da medição de uma

solução padrão de pH 4, 7 ou 10 (Buffer solution pH 4.0 33643-1L, Buffer solution pH 7.0,

33646-1L – Honeywell Fluka; Buffer solution pH 10.0 NX3SO018-1L – NORMAX). Era

ainda usada uma solução padrão de condutividade 12880 µS/cm (Standard for Conductivity

12880 µS/cm CH2973 500mL – Carlo Erba) para confirmar a calibração da sonda de

condutividade. As sondas foram ajustadas internamente, todas as semanas, através do

programa de calibração intrínseco ao medidor, utilizando as soluções padrão anteriormente

referidas.

5. Controlo da água do laboratório

Semanalmente, foi realizada a medição do pH e da condutividade das águas correntes

existentes no laboratório - água de rede (municipal) e água desmineralizada – para verificar

se os valores habituais se mantêm. Estes dados foram preenchidos no Registo de controlo

das águas anteriormente referido, que permite identificar de uma forma rápida se houve

51

alguma alteração nas águas sem aviso prévio que poderá comprometer o trabalho

desenvolvido no laboratório.

Caso os valores obtidos apresentassem uma diferença significativa comparativamente aos

valores registados anteriormente, o sucedido era reportado ao responsável do Laboratório

ALGATEC, para que se averiguasse a causa.

A medição da condutividade baseia-se na capacidade de uma solução conduzir corrente

elétrica e por isso depende da sua concentração iónica (Tabela 3). Este método é

comummente utilizado para verificar a pureza da água destilada (desprovida de iões).

Tabela 3 – Condutividade de diferentes tipos de água

Soluções Condutividade elétrica

Água de elevada pureza 0,05 µS/cm

Água destilada 1 µS/cm

Água de rede pública 100 µS/cm

Por sua vez, o pH é uma grandeza que mede a concentração de iões H3O+ de uma solução,

de modo a classificar a sua acidez ou alcalinidade. As águas usadas no laboratório devem

conter um pH próximo do valor neutro.

6. Produção de microalgas no laboratório e unidade de produção

No decorrer deste estágio foram realizadas várias tarefas inerentes ao acompanhamento e

produção de essencialmente três espécies de microalgas, Tetraselmis sp., Nannochloropsis

sp. e Odontella sp.. As atividades realizadas durante o estágio tiveram lugar em dois locais

distintos:

• Unidade de produção, onde foi realizada a amostragem das culturas em produção e

onde foram esporadicamente desenvolvidas tarefas de medição de temperatura e pH

das mesmas;

• Laboratório Algatec, onde foram realizadas análises rotineiras de avaliação do

crescimento das culturas e de controlo de qualidade, como medição da absorvância

(DO), nitratos e PS. Adicionalmente, foi realizado o scale-up de cultivos de forma a

obter cultura suficiente para produção de inóculos para envio para a Unidade de

Produção, e inoculação de FP-PBR’s.

52

6.1. Metodologia

Sistema de cultivo em laboratório

Como recipiente de cultivo foram utilizados frascos de vidro. Para fechar o sistema, foi

utilizada uma rosca que consiste em duas entradas que ligam o exterior e o interior do frasco.

Numa conexão, é unida uma mangueira e um filtro de membrana, no orifício virado para o

exterior do frasco e no interior é acoplada uma tubuladura de vidro desde a abertura até ao

fundo do frasco. Este circuito é utilizado como entrada de ar enriquecido com dióxido de

carbono, proporcionando agitação e fornecendo carbono à cultura, respetivamente. Na

segunda abertura, é colocada uma mangueira e um filtro na parte exterior. Desta forma, o ar

que sai da cultura é filtrado, evitando a ocorrência de contaminações cruzadas. Foram

utilizadas mangueiras de silicone, com cerca de 15cm comprimento e filtros de membrana

com 0,2 µm de porosidade (Midisart® 2000).

Todas as culturas em produção no LabALGATEC encontram-se numa divisão anexa ao

laboratório - sala de cultivos, em ambiente controlado, onde as culturas, bem como todos

os materiais e líquidos necessários aos processos de produção, são esterilizados em calor

húmido (autoclave) e manuseados à chama, segundo as técnicas de microbiologia clássica

que se iniciou com o processo de autoclavagem. Esta sala é limpa regularmente, sendo

utilizada lixívia a 10% para limpeza do local e etanol a 70% para desinfeção.

6.1.1. Limpeza de material

Num laboratório, a limpeza e esterilização do material são fundamentais para a obtenção de

bons resultados. Uma limpeza imperfeita ou inadequada dos materiais pode ter efeitos

negativos nas tarefas laboratoriais, como a errada medição de volumes e massas em materiais

de medição volumétrica devido à existência de sujidade ou gordura, que afetam a

uniformidade do líquido e a observação do volume; a existência de resíduos de sais que

possam adulterar a medição da salinidade; ou risco de contaminação por restos de cultura

nos recipientes. Quando se trabalha com microrganismos, qualquer recipiente utilizado deve

ser devidamente lavado e esterilizado, de modo a evitar contaminações que alterem os

resultados ou que prejudiquem a continuidade dos cultivos. Para a realização de scale-up é

necessária a preparação dos vários materiais inerentes ao sistema de cultivo.

53

O material utilizado foi habitualmente lavado na máquina de lavar material Miele PG8504,

tendo sido, por vezes, lavado de forma manual, dependendo da sua finalidade. Os frascos

Schott foram sempre lavados na máquina, contendo o módulo de injetores A300/1, com uma

pré-lavagem de 3 minutos, com água destilada, seguida de lavagem em programa longo (44

minutos a uma temperatura máxima de 70ºC). O restante material foi lavado em programa

de lavagem médio (25 minutos a uma temperatura máxima de 65ºC). Por lavagem, foi

utilizada uma dose de detergente Dr. Weigert (Neodisher – Laboclean A8). Por defeito, a

máquina dispensa em cada lavagem uma porção de Neutralizador ‘Neodisher Z’.

Na lavagem à mão, o material sem resíduos de cultura foi enxaguado com água de rede para

remover os resíduos e, quando necessário, com detergente diluído. Após a lavagem, o

material foi enxaguado com água destilada. Material com resíduos de cultura foi lavado com

água e lixívia e enxaguado em abundância, sendo a lavagem finalizada com enxaguamento

com água destilada. Para secar, o material foi colocado na estufa de secagem, ou no

escorredor.

6.1.1. Descontaminação de material

O material que contenha resíduos de cultura é descontaminado com uma solução de

hipoclorito de sódio a 0,5%, ou utilizando a autoclave antes da sua eliminação. Para

descontaminação com hipoclorito de sódio, o material e restos de cultura foram colocados

num recipiente com uma solução deste composto. O material a descontaminar por

esterilização foi colocado em sacos de descontaminação biológica, tendo sido esterilizado a

123 ºC durante 40 min.

6.1.2. Preparação de material

O cultivo de microalgas a nível laboratorial requer a preparação e esterilização de material

necessário para o efeito.

Para a preparação de material lavado para esterilização, é colocada fita indicadora de

esterilização em todo o material a autoclavar. A fita permite identificar o conteúdo ou

finalidade dos materiais e demonstra que o material completou o ciclo de esterilização.

54

Frascos de cultivo em Laboratório

De forma a facilitar o processo os frascos de vidro foram preparados contendo o volume

requerido de meio de cultura. Os frascos foram identificados com fita de esterilização onde

foi escrito o conteúdo do mesmo.. As roscas dos frascos nunca são fechadas hermeticamente,

existindo alguma folga para aliviar a pressão, aquando a autoclavagem.

Esterilização por calor húmido Antes de qualquer esterilização foi verificado o nível de água desmineralizada na câmara de

esterilização, que tem de se encontrar acima da resistência, de acordo com o definido no

protocolo de utilização do equipamento.

Os recipientes com conteúdo foram inequivocamente identificados, na fita de autoclave.

Estes devem estar tapados com tampa própria ou papel de alumínio, porém, não podem estar

fechados hermeticamente. O material é colocado na autoclave, e esta é fechada e

programada. A esterilização é realizada por calor húmido, a 121ºC, durante 20 minutos para

material geral de laboratório e durante 40 minutos para material contendo líquidos (água

salgada, meio nutritivo, etc.), na autoclave Uniclave 77 (157L), AJCosta.

Terminado o ciclo, a autoclave é aberta quando a pressão e a temperatura baixam

completamente. Imediatamente após a mesma ser aberta, as roscas dos frascos foram

fechadas completamente e o material foi retirado e arrumado, tendo sido, quando necessário,

colocado na estufa a secar (60-70ºC).

6.1.3. Tratamento de meio de cultura no laboratório

Um dos principais problemas encontrados na produção microalgas é a contaminação da

cultura por bactérias, fungos, protozoários e outras espécies de microalgas, sendo uma das

fontes de contaminação o meio de cultura (água e nutrientes).

Desta forma, foi necessário proceder à esterilização do meio, antes da sua utilização para

eliminar quaisquer organismos que possam competir com a microalga a cultivar ou possam

ser incompatíveis com a utilização dada à cultura. Para a produção industrial de microalgas

foi necessário um meio de cultura que providencie as condições necessárias a um rápido

crescimento. O meio de cultura utilizado para o cultivo de microalgas no LabALGATEC foi

elaborado artificialmente, tendo duas componentes: água salgada formulada e meio

nutritivo.

55

Para mimetizar a salinidade da água do mar foi utilizada água proveniente do furo à qual foi

adicionada uma solução aquosa concentrada de NaCl, para atingir uma concentração final

de NaCl de 30 g/L. Sempre que necessário, o acerto da salinidade foi feito com recurso a

água destilada de forma a não serem adicionados minerais presentes na água do furo em

excesso.

Os meios de enriquecimento, também denominados de meios nutritivos, utilizados para os

cultivos da unidade de produção são um meio produzido industrialmente. Foram utilizadas

duas formulações diferentes dependendo da espécie a cultivar: Nannochloropsis sp.,

Tetraselmis sp., ou Odontella sp., de forma a que cada formulação vá de encontro as

necessidades especificas para o crescimento da microalga. Para as duas primeiras espécies

foi utilizado o mesmo meio de enriquecimento. Este meio foi adicionado à água salgada de

forma a ser obtida a concentração final pretendida, originando o meio de cultura.

Os meios de cultivo de microalgas utilizados foram preparados no reservatório existente para

o efeito, na unidade de produção, e transferidos para o laboratório em recipientes de 60,0 L

já com a sua composição final. Aquando a chegada do meio ao laboratório, foram realizadas

análises de controlo de salinidade, controlo nutritivo e controlo químico das matérias primas,

cujos resultados foram anotados no Registo de matérias primas acima referido. Juntamente

com estes dados foram registados o volume, a data de receção, a origem do meio de cultivo

e o lote correspondente. Para além de permitir acesso a informações relativas às análises,

este registo permite gerir as necessidades semanais de meio de cultivo dentro da empresa,

aplicando-se este registo para todas as matérias primas que são recebidas no laboratório.

Segue a árvore de decisão utilizada no controlo de meios de cultivo recebidos no

LabALGATEC (Figura 22).

56

Controlo de salinidade

A salinidade do meio, em gramas por litro (g/L), foi medida com o refratómetro de água

salgada – Refratómetro ORA 1SA, Kern. Caso a salinidade fosse diferente do valor

estipulado em ± 2 g/L, esta foi ajustada através da adição de água desionizada.

Controlo nutritivo

O controlo de meio nutritivo presente no meio de cultivo foi realizado pela análise de

nitratos, tendo-se procedido ao seu acerto, caso os valores se encontrassem fora da gama

pretendida.

Controlo químico

O meio formulado na unidade de produção é desinfetado quimicamente através da adição de

hipoclorito de sódio. No laboratório, de forma a confirmar a presença ou ausência de cloro

no meio de cultura, sempre que este era elaborado na unidade de produção e transferido para

o laboratório, foi realizado um teste com um reagente que altera a coloração da solução na

presença de hipoclorito de sódio.

Foi retirada uma amostra de 10 mL de meio, à qual foram adicionadas 2 gotas de reagente.

A concentração de cloro no meio foi inferida através da coloração do meio pela adição do

reagente, que apresenta uma cor diferente dependendo da concentração. Para a neutralização

de cloro no meio foi utilizado uma solução de sal que remove de forma rápida o cloro

Receção do meio de cultivo no laboratório

Controlo de salinidade (refratometria)

Dentro dos parâmetros

Meio pronto a utilizar

Défice ou excesso

Acerto da salinidade

Controlo nutritivo (espectrofotometria)

Dentro dos parâmetros

Meio pronto a utilizar

Défice ou excesso

Acerto do meio

nutritivo

Controlo químico (método colorimétrico para verificação da presença de

desinfetante)

Negativo

Meio pronto a utilizar

Positivo

Neutralização do agente desinfetate

Figura 22 - Árvore de decisão utilizada no controlo do meio de cultivo recebido pelo laboratório ALGATEC.

57

presente no meio. O volume de sal adicionado variou consoante a concentração de cloro

presente.

Para o cultivo de microalgas, a esterilização do meio de cultura foi realizada à temperatura

de 121 °C, durante 40 min, à pressão de 1 atm de forma a garantir uma correta esterilização,

independentemente do volume ou da quantidade de sais dissolvidos que estavam a ser

esterilizados.

6.2. Produção de inóculo e scale-up

As culturas em produção no laboratório Algatec tiveram origem no Laboratório de Inovação

de Lisboa, onde se encontra o repositório e é realizada a manutenção de culturas stock das

espécies utilizadas.

A produção de culturas a nível industrial exige a sua cultura primária em laboratório.

Inicialmente, as culturas puras de microalgas foram mantidas na sala de cultivo do

laboratório Algatec, em condições controladas. Para cada espécie foi fornecida uma cultura

stock, a partir do qual se iniciou a subcultura em vários frascos de 2L e foi desenvolvido o

inóculo para produção industrial. As culturas em produção foram mantidas com um

fotoperíodo de 24h luminosidade, uma temperatura de 25 ±1ºC, com humidade e arejamento

controlado, de forma a manter o pH dentro do intervalo de 7 a 8. Após atingir a concentração

necessária à inoculação de um fotobiorreator, foram transferidos, todas as semanas, dois

inóculos para a unidade de produção. Todo o processo de manipulação de culturas, materiais

e meios necessários à sua produção é realizado em condições de assepsia, segundo as

técnicas de microbiologia clássica.

Envio de inóculo p/ unidade de produção

As culturas produzidas em laboratório foram utilizadas para o fornecimento de inóculo dos

fotobiorreatores da unidade de produção. De forma a possibilitar o transporte de cultura em

condições estéreis, foi necessária a preparação do recipiente de inoculação. O primeiro passo

consistiu na preparação e esterilização do recipiente, por calor húmido, na autoclave (20 min.

a 121ºC). Para a preparação, foram fechadas todas as entradas do mesmo e este foi colocado

dentro de um saco de autoclave (33L) fechado. Os acessórios inerentes ao recipiente foram

colocados num saco de esterilização de 9L. No fim de esterilizado, todo o material foi levado

para a sala de cultivo e foi montado o sistema de inoculação à chama. Seguidamente, o

conteúdo dos frascos de cultura foi homogeneizado e vertido para o recipiente. O processo

58

foi efetuado em condições estéreis, dentro da área de assepsia proporcionada pelos bicos de

Bunsen. Finalizada a inoculação, foram retiradas 2 amostras, em falcons de 50mL cada, para

análises de controlo (OM; PS; DO; Salinidade) para ser emitido o certificado de inóculo.

Medição salinidade

A salinidade, em gramas por litro (g/L), dos inóculos em cultivo foi medida periodicamente

com o refratómetro de água salgada – Refratómetro ORA 1SA, Kern, e foi ajustada através

da adição de água desionizada estéril, quando necessário.

Funcionamento unidade de produção

A unidade de produção encontra-se equipada com fotobiorreatores de inoculação, de menor

volume, destinados ao cultivo do inóculo proveniente do laboratório, de modo a

proporcionar o aumento da densidade celular do mesmo, a fim de servir de inóculo a

fotobiorreatores de pré-produção, que posteriormente podem ser utilizados para a inoculação

de outros fotobiorreatores de produção.

A inoculação foi efetuada através da introdução do inóculo no fotobiorreator. Desde a sua

inoculação até à colheita foram retiradas amostras às culturas presentes na unidade para

avaliar o seu crescimento, a presença de nutrientes e de contaminantes nas várias fases de

crescimento das mesmas. Finalmente, quando são atingidas as concentrações pretendidas, é

realizada a colheita, parcial ou total, das culturas em produção. Nesta fase, foram sempre

retiradas amostras da cultura líquida, para análise em laboratório. No fim da centrifugação

da cultura colhida, foi obtida biomassa em forma de pasta, após a separação do meio de

cultivo das células. A pasta obtida é armazenada em sacos apropriados, devidamente

rotulados e conservada por refrigeração.

Amostragem culturas na unidade produção

A amostragem das culturas em produção nos fotobiorreatores planos foi efetuada através de

um circuito composto por uma tubuladura presente no interior do saco, contendo uma

extremidade no fundo do mesmo e outra extremidade no exterior do saco, ligada a uma

seringa, que permite a recolha de uma amostra até 60mL. Cada amostra foi retirada para um

tubo falcon 50mL, previamente identificado com a nomenclatura do FT-PBR. Antes de se

iniciar a amostragem foi necessário pulverizar as mãos e a interface entre a tubuladura e a

seringa com etanol a 70%. Seguidamente, o êmbolo da seringa foi puxado até ao seu máximo

de forma a ficar cheio com cultura, que foi depois empurrada novamente para dentro do

59

fotobiorreator. Este passo serviu para homogeneizar a cultura, de forma a que a amostragem

fosse representativa da mesma, eliminando erros devido à deposição da cultura no fundo do

saco, por exemplo. O êmbolo da seringa foi novamente puxado até atingir um volume de 30

a 40ml, seguindo-se a separação entre o tubo e a seringa, tornando possível a passagem da

cultura para o falcon, sem que a ponta da seringa tocasse no mesmo. Este passo foi realizado

o mais rapidamente possível, evitando a exposição ao ar, para que fosse evitada a entrada de

microrganismos contaminantes na cultura em produção. Após a recolha de amostras pela

seringa, esta e a tubuladura foram novamente borrifadas com álcool e, só depois, conectadas.

Este processo foi repetido para todas as amostragens. As amostras recolhidas foram depois

levadas para o laboratório para se proceder à sua análise.

Medição pH e temperatura

Para a medição do pH e temperatura das culturas em PBR’s, foi utilizado o Medidor de pH

– Hi 98130, Hanna instruments. Cada medição foi realizada a uma amostra de cultura em

produção em fotobiorreatores, imediatamente após a recolha da mesma. Seguido da

descontaminação das mãos, da seringa e da tubuladura, e da homogeneização da cultura, o

êmbolo da seringa foi cheio de cultura até ao seu máximo. Parte da cultura foi recolhida para

o falcon de amostragem, e o restante volume foi utilizado para medir o pH. Após fechar o

circuito, a medição do pH foi realizada de imediato, colocando o pH meter, calibrado, dentro

da amostra e verificando se as sondas de pH e temperatura se encontravam completamente

submersas e sem bolhas de ar na periferia. Os resultados foram anotados no registo diário.

Caso os valores de pH se encontrassem fora do intervalo determinado, era informado o

responsável pela unidade de produção de forma a que o caudal de CO2 fornecido fosse

ajustado.

60

Parte II – Análises laboratoriais

Em laboratório foram realizadas análises de controlo de crescimento e de qualidade às várias

culturas em produção, de acordo com o representado no seguinte esquema:

Figura 23 – Esquema representativo análises efetuadas às culturas nos vários estágios de produção.

1. Densidade ótica

A absorvância foi determinada em duplicado por espectrofotometria (Espectrofotómetro

Genesys 10S UV-Vis, Thermo Scientific) a um comprimento de onda de 600 nm (ʎ=600nm),

em cuvettes de plástico com 1 cm de percurso ótico. De forma a obter valores de absorvância

dentro do limite de linearidade da lei de Lambert-Beer, as amostras são diluídas em solução

de NaCl a 30g/L idêntica à utilizada no meio de cultivo. Esta solução foi utilizada como

branco. No caso de culturas com baixa densidade, a leitura foi realizada sem diluição.

Antes da utilização da amostra, tanto para a preparação da sua diluição como para a sua

utilização imediatamente antes da distribuição para as cuvettes de medição, as amostras

foram devidamente homogeneizadas de forma a distribuir as células que pudessem estar

depositadas no fundo do recipiente. O valor de DO foi obtido através da média das réplicas

da amostra, multiplicadas pelo fator de diluição utilizado.

O espectrofotómetro Genesys UV-VIS 10S possui um carrossel com 6 posições incluindo a

posição do branco. Para as espécies Nannochloropsis e Tetraselmis sp. a medição da DO,

culturasemscale-up

Análises

pH

DO

OM

Salinidade

ProduçãoInóculo CulturaPBR's

CulturaColhidaPSPasta

OM

Amostragem

DO

OM

Nitratos

Análiseinóculo(OM,PS,DO,Sal.)

Inoculação GW

61

nos casos em que existiam várias amostras para analisar, foram utilizadas 4 posições do

carrossel (2 amostras com 2 réplicas cada) e as medições foram efetuadas todas de seguida.

Para a espécie Odontella apenas foram utilizadas as 2 primeiras posições do carrossel, para

evitar sedimentação das amostras durante a leitura. Sempre que foram medidas absorvâncias,

foi realizada a correção da absorvância com todas as cuvettes contendo a solução utilizada

como branco. Este parâmetro permite eliminar diferenças ou interferências existentes entre

cuvettes, como riscos, dedadas ou outras sujidades. Entre cada medição, foi efetuada a

lavagem das cuvettes com a nova amostra a analisar e as faces de leitura das mesmas foram

limpas antes da leitura.

2. Nitratos

Para a monotorização de nutrientes presentes no meio das culturas em produção, foi

realizada, por espectrofotometria, a quantificação de NO3 presente no meio de cultura. Para

tal, procedeu-se à centrifugação de uma amostra de 10mL de cultura, durante 15 minutos a

4500 rpm na Centrifuga Digicen 21 (Ortoalresa) de forma a separar as células em suspensão

do meio de cultivo e impedir a quantificação de nutrientes contidos nas reservas celulares.

Desta amostra, foi utilizado o sobrenadante para preparar a diluição de duas réplicas. Nesta

diluição, além de se utilizar o mesmo meio de cultivo da microalga em análise, é também

adicionado HCl para eliminar a interferência da matéria orgânica durante a leitura no

espectrofotómetro.

No fim de preparada a diluição, foi medida a absorvância de cada amostra a 220 e 275 nm,

no programa de multiwavelenght do espectrofotómetro Genesys. Nesta análise, foram

utilizadas cuvettes de quartzo, por serem as indicadas para a gama UV, onde se inserem os

comprimentos de onda referidos anteriormente. Este processo é usado de forma semelhante

para as análises de amostras de meio de cultivo.

3. Peso seco

Amostras líquidas

O peso seco de cada cultura de microalga foi obtido pelo método gravimétrico, através da

filtração de uma amostra, de volume variável, dependendo da espécie e concentração da

cultura. Foram utilizados filtros de microfibra de vidro de 0,7 µm de porosidade, para

espécies de Nannochloropsis sp. e de 1,2 µm de porosidade (VWR) para as restantes espécies

em estudo. Foram utilizados, para cada PS, três filtros previamente tarados, na balança de

62

humidade DBS 60-3, Kern a 180º C até se obter peso constante (desvio máximo de ±0,5

mg). Os filtros usados para cada medição de peso seco foram dispostos nas rampas de

filtração Sterifil®, 47 mm da Millipore, e filtrados por vácuo (bomba de vácuo Comecta

Ivymen, máx. 15 in Hg / 0,5 kPa x 100 bar). Os filtros e o prato e alumínio utilizado para a

sua pesagem e transporte foram manuseados com uma pinça para evitar a deposição de

partículas indesejadas que possam influenciar a determinação do peso seco. Para esta técnica

foram realizados triplicados de forma a existir uma maior precisão. Os filtros foram aderidos

à base da rampa de filtração com água destilada, antes do início da filtração. Seguidamente,

a cultura foi adicionada em igual volume a cada rampa, até se verificar a saturação dos filtros.

Após a filtração da cultura em análise, foi adicionada a solução de lavagem, correspondente

ao volume total de amostra colocada nessa mesma rampa, de forma a permeabilizar os sais

existentes no meio de cultura, impedindo que estes sejam contabilizados no peso seco. Após

a filtração de toda a solução, seguiu-se a recolha dos filtros com uma espátula para o prato

de alumínio utilizado anteriormente e a sua pesagem na balança de humidade a 180 °C até a

massa medida estabilizar (±0,5 mg). O peso da biomassa seca obtido é expresso por volume

de amostra filtrado. Na Figura 24 estão representados os vários passos para a obtenção do

PS de uma cultura.

Figura 24 – Representação esquemática obtenção peso seco.

Filtrostaradosnabalançadehumidade

Filtraçãodeamostradeculturademicroalganasrampasdefiltração

Recolhadefiltrossaturadoscomcultura

Secagemdosfiltroscombiomassaaté

estabilizaçãopeso

Recolhafiltrossecos

63

Após a obtenção dos valores necessários, o peso seco foi calculado através da seguinte

equação:

𝑃𝑆(𝑔 𝐿⁄ ) =d𝑚e −𝑚gh(𝑚𝑔)

𝑉(𝑚𝐿)

Equação (7) – Fórmula utilizada para o cálculo do peso seco.

Onde (m0) corresponde a massa inicial dos filtros, (V) ao volume total de cultura filtrado e

(mf) à massa dos filtros após filtração.

Amostras sólidas – controlo de qualidade do produto

Após a centrifugação da cultura colhida na unidade de produção, a biomassa é recuperada

sobre a forma de pasta de microalga e são recolhidas amostras para análise de peso seco.

As amostras de pasta são conservadas a uma temperatura de -24ºC, e descongeladas a

temperatura ambiente aquando a realização das análises laboratoriais.

Para a análise do peso seco, foi retirada uma porção de pasta com quantidade suficiente para

ser espalhada de forma uniforme num prato de alumínio, previamente pesado. O prato

contendo a pasta foi colocado a secar na balança de humidade a 105ºC, até a massa medida

estabilizar (±0,5 mg). No fim da secagem da amostra, o valor obtido corresponde à biomassa

seca contendo sal. De forma a determinar a quantidade de NaCl presente na amostra de pasta,

esta é ressuspendida num volume conhecido de água destilada, e posteriormente é medida a

salinidade (g/L) por refratometria. A partir da determinação do PS e posterior medição da

salinidade das amostras é possível obter a percentagem de biomassa, de humidade e de sal

presente na pasta, de forma a conhecer o peso seco sem sal.

64

Parte III – Caso de estudo

Correlação entre o peso seco e a densidade ótica de três espécies de microalgas

Neste trabalho, enquadrado no âmbito da monitorização de culturas de microalgas

produzidas a nível industrial, foi acompanhado o crescimento de microalgas em produção

na Unidade de produção, a partir de análises de controlo como a determinação da densidade

ótica, da concentração de nutrientes no meio e da determinação do peso seco.

A monitorização trata-se de uma tarefa fundamental no processo de produção de microalgas

à escala industrial, sendo necessário uniformizar o processo de produção dos cultivos, de

forma a aliar o seu rápido crescimento com o normal funcionamento da unidade de produção.

Durante o estágio foram recolhidas, em média, nove amostras por dia, de culturas em

produção nos FT-PBRs existentes, resultando num total de 1254 amostras analisadas. Segue

a representação gráfica do número de amostras recolhidas ao longo de cada semana (Figura

25). Para todas as amostras recolhidas foi determinada a sua densidade ótica. Pontualmente,

foi realizada a análise de determinação de nitratos.

Figura 25 – Número de amostras recolhidas por semana (segunda a sexta-feira) de estágio, sendo o número das semanas indicado correspondente ao número da semana do ano. A série representada a laranja corresponde ao número de amostras a que foi realizada análise da densidade ótica (DO) e a série a verde o número de amostras a que foi realizada análise de determinação de nitratos (NO3).

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Sem.38

Sem.39

Sem.40

Sem.41

Sem.42

Sem.43

Sem.44

Sem.45

Sem.46

Sem.47

Sem.48

Sem.49

Sem.50

Sem.51

Sem.52

Sem.1

Sem.2

Sem.3

Sem.4

Sem.5

Sem.6

Sem.7

Sem.8

Sem.9

Sem.10

Sem.11

Sem.12

Sem.13

Núm

erodeamostras

Númeroamostrassemanais

NúmeroAmostrasDO NúmeroAmostrasNO3

65

Paralelamente a esta monitorização, foram realizadas análises de DO e PS às culturas em

produção no Laboratório ALGATEC, para fornecimento de inóculo aos FP-PBR’s da

unidade e ainda às amostras de cultura colhidas, para obtenção da biomassa.

A absorção por espectrofotometria consiste num método indireto que relaciona a densidade

de uma amostra com a absorção de luz, a comprimentos de onda específicos, indicado para

sistemas de monitorização devido à sua confiabilidade e simplicidade (Rodrigues et al.

2011). No entanto, esta é uma análise meramente indicativa, da qual não resultam dados

relativos à quantidade de biomassa presente, em gramas.

Na quantificação de concentração de soluções por espectrofotometria, é comummente

selecionado o comprimento de onda para o qual a absorção é máxima, por providenciar a

maior gama de sensibilidade. No entanto, para amostras pigmentadas como as microalgas, a

escolha destes comprimentos de onda pode desviar a absorvância, uma vez que a absorção

dos pigmentos é maior em regiões particulares do espectro eletromagnético e podem ocorrer

alterações no conteúdo dos pigmentos celulares. Nestes casos, o erro de medição associado

é maior, já que a medição a um comprimento de onda dentro do intervalo onde a absorvância

do pigmento é máxima pode resultar em absorvâncias mais elevadas, sem que estas se

traduzam numa maior concentração celular. No entanto, o uso de comprimentos de onda

dentro da gama de absorvância máxima da clorofila a (400-460 nm e 650-680 nm) tem sido

frequentemente relatado. (Griffiths et al. 2011) Neste trabalho a absorvância das culturas foi

medida a 600nm, que apesar de não corresponder ao pico máximo de absorção da clorofila,

tem a vantagem de não ser tão sensível a mudanças das condições da cultura.

Para a determinação da concentração em nitratos das amostras, foi medida a quantidade de

luz absorvida pelas mesmas a 220nm para quantificação de nitratos e 275nm para

quantificação de interferências como resíduos de matéria orgânica (Clescerl, Greenberg, and

Eaton 1999). Para o cálculo da concentração de nitratos a partir das absorvâncias obtidas,

foi utilizada uma reta de calibração, obtida por regressão linear (previamente elaborada fora

do contexto do presente estágio) a partir de uma solução padrão de NO3- com uma

concentração conhecida de 1 g/L, diluída em água salgada a 30 g/L utilizando água do furo,

e HCl (1 M). Esta reta encontra-se válida apenas para os comprimentos de onda usados nas

determinações e para o intervalo de concentrações definido pelo padrão. O uso do HCl na

construção da reta de calibração permitiu eliminar ou minimizar a interferência da matéria

orgânica.

66

A correção da absorvância, utilizada para eliminar possíveis diferenças entre as cuvettes,

permitiu minimizar a possível ocorrência de erros sistemáticos.

O método utilizado para a quantificação direta da biomassa foi a análise de peso seco. Tal

como referido anteriormente, para microalgas marinhas, como é o caso das espécies em

estudo, é necessário proceder à lavagem das células para remoção dos sais, o que torna a

filtração mais morosa. De forma a reduzir o consumo de tempo necessário para determinar

a biomassa de uma cultura, torna-se útil a obtenção de uma correlação entre o peso seco e a

densidade ótica, uma vez que a absorvância é um método de leitura fácil para análises de

rotina rápidas (Rocha, Garcia, and Henriques 2003).

Para estudar a correlação entre o PS e a DO de cada espécie foram utilizadas amostras de

culturas em produção à escala industrial, geralmente em dias diferentes e sem espaço de dias

determinado. Foram também incluídas amostras de culturas em produção no Laboratório

ALGATEC. Para além destas determinações, as culturas foram observadas ao microscópio

pela equipa do LabALGATEC, para averiguar a presença de contaminantes e avaliar o

estado das microalgas. As culturas em análise foram as microalgas que se encontravam em

produção, Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. e Odontella sp..

Com recurso ao histórico de dados recolhidos das análises aos cultivos, foi realizada uma

correlação para estimar a densidade de uma cultura de microalgas, usando valores de

absorvância espectrofotométrica com valores da quantificação da biomassa pelo método

gravimétrico do peso seco. Com base nesta correlação, obteve-se a equação da reta que

permitiu depois inferir o peso seco de culturas conhecendo apenas a sua absorvância. O

objetivo deste trabalho assenta na necessidade de acompanhar o crescimento das culturas,

com base no conhecimento da biomassa que esta apresenta (em gramas), sem que seja

necessário realizar o método gravimétrico do peso seco. Além de ser uma técnica morosa,

este método requer também dispêndio de consumíveis para a sua realização, e ainda um

maior volume de amostra quando comparado com o método da espetrofotometria.

Foi assim obtida uma regressão linear para cada uma das espécies em produção durante o

período do estudo, Nannochloropsis sp., Tetraselmis sp. e Odontella sp., ilustradas pelas

Figuras 26, 27 e 28 respetivamente.

Para ser possível determinar se as retas obtidas apresentam um bom ajuste entre as variáveis

em estudo, foi calculado o coeficiente de correlação simples (R), obtido a partir do

67

coeficiente de determinação (R2), através dr 𝑅 = √𝑅2. Quanto mais próximo este coeficiente

se encontrar de 1, maior a relação de associação entre as duas variáveis (Zar 2010).

Figura 26 – Representação gráfica das retas obtidas pela correlação entre a absorvância (l=600nm) e o peso seco, para a microalga Nannochloropsis sp.. Reta ‘Dados sem tratamento’: y=0,3791x, R2=0,9537. Reta ‘Dados com tratamento’: y=0,3649x, R2=0,9602.

Na figura estão apresentadas duas regressões, uma ajustada aos ‘Dados sem tratamento’ onde

foram integrados os dados de todas as amostras analisadas (n=34), e outra ajustada aos

‘Dados com tratamento’ (n=28) em que foram eliminados alguns dados, devido à possível

ocorrência de erros durante a análise. A primeira reta referida, obtida por correlação, tem

como equação y=0,3791x e apresenta um coeficiente de correlação R=0,9766 (R²=0,9537).

A segunda reta tem como equação y=0,3649x e apresenta um coeficiente de correlação

R=0,9799 (R²=0,9602).

Comparando as duas retas é possível perceber que a eliminação de pontos levou a um

aumento do coeficiente de correlação entre as duas técnicas analisadas, no entanto, reduziu

a gama de valores para os quais a reta é aplicável, isto é, a reta de ‘Dados com tratamento’

apenas é aplicável para valores em que a DO é aproximadamente igual ou menor que 9,5

(correspondente a valores de peso seco de aproximadamente 3 g/L), enquanto que a reta de

‘Dados sem tratamento’ poderá ser aplicada para resultados de DO até 15 (correspondente a

valores de peso seco de aproximadamente 5,5 g/L). Apesar da última correlação referida

poder ser aparentemente utilizada para amostras com valores de PS até »5 g/L, não existem

y = 0,3791xR² = 0,9537

y = 0,3649xR² = 0,9602

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

0,000 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 16,000

Peso

Sec

o g/

L

Absorvância (600nm)

Correlação absorvância vs. peso seco de Nannochloropsis sp.

Dados sem tratamento Dados com tratamento

Linear (Dados sem tratamento) Linear (Dados com tratamento)

68

valores entre o ponto (9,5; 3,9) e o (14,6; 5,5). A existência de outros pontos dentro do

referido intervalo seria benéfica de forma a tornar a reta mais robusta para valores de DO

acima dos 10. Desta forma, estaria assegurada a linearidade esperada para esse intervalo de

concentrações e seriam reduzidos erros de extrapolação, ocorridos pela previsão de valores

de PS a partir de um valor de DO fora da gama de valores descritos pela reta (Zar 2010). Por

outro lado, o ponto (14,6; 5,5) pode resultar de uma DO com um elevado valor de erro

associado, uma vez que os valores de absorvância obtidos (0,978 e 0,973) foram bastante

próximos do limite de linearidade da lei de Lambert-Beer, diminuindo a confiabilidade dos

mesmos. Foram ainda desprezados outros pontos da reta, por se encontrarem muito afastados

da linha de tendência dos dados, resultando no desvio da reta e consequentemente do

coeficiente de correlação, o que pode levar a inferir resultados afastados do valor real.

Figura 27 - Representação gráfica das retas obtidas pela correlação entre a absorvância (l=600nm) e o peso seco, para a microalga Tetraselmis sp.. Reta ‘Dados sem tratamento’: y=0,7989x, R2=0,8889. Reta ‘Dados com tratamento’: y=0,8103x, R2=0,9469.

Na Figura 27 está representado o gráfico referente a Tetraselmis sp. e,

à semelhança do que foi feito para Nannochloropsis sp., na reta ‘Dados sem tratamento’

foram integrados os dados de todas as amostras analisadas (n=58), tendo como equação y =

0,7989x e coeficiente de correlação R=0,9428 (R²=0,8889) e para os ‘Dados com

tratamento’ foram desprezados 7 dados (n=51) e tem como equação y = 0,8103x e R=0,9731

y=0,7989xR²=0,8889

y=0,8103xR²=0,9469

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

0,000 0,500 1,000 1,500 2,000 2,500 3,000 3,500

PesoSecog/L

Absorvância (600nm)

Correlação absorvância vs. peso seco de Tetraselmis sp.

Dadossemtratamento Dadoscomtratamento

Linear(Dadossemtratamento) Linear(Dadoscomtratamento)

69

(R²=0,9469). A espécie Tetraselmis, por ser uma microalga móvel, pode originar maiores

margens de erro na medição da sua absorvância.

Figura 28 – Representação gráfica da reta obtida pela correlação entre a absorvância (l=600nm) e o peso seco, para a microalga Odontella sp.. Reta ‘Dados sem tratamento’: y=1,4096x, R2=0,9179.

Na Figura 28 está representado o gráfico referente a Odontella sp.

na reta ‘Dados sem tratamento’ foram integrados os dados de todas as amostras analisadas

(n=15), tendo como equação y = 1,4096x e coeficiente de correlação R=0,9179 (R²=0,9581).

Neste caso, não foi realizado o tratamento de dados, tendo sido considerado o número total

de amostras analisadas, n=15, por ser uma reta ainda em construção e com poucos dados

devido à fase inicial de produção. De forma a tornar a reta mais fidedigna e abrangente,

seriam necessários mais dados de análises a culturas de maior densidade celular para

aumentar a gama de valores da correlação. Ainda que com uma menor confiança, é possível

estimar valores de PS para esta microalga a partir de DO’s até »1,2.

Em Odontella sp. a análise DO está sujeita a um maior erro que nas restantes microalgas

uma vez que as suas células depositam muito rapidamente. Em diatomáceas, variações no

teor em sílica da sua parede celular pode alterar a sua flutuabilidade e consequentemente a

velocidade de sedimentação. De forma a diminuir erros na medição, foi medida uma amostra

de cada vez, para impedir que as células tivessem tempo de sedimentar.

y=1,4096xR²=0,9179

0

0,5

1

1,5

2

2,5

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4

PesoSecog/L

Absorvância (600nm)

Correlação absorvância vs. peso seco de Odontella sp.

Dadossemtratamento Linear(Dadossemtratamento)

70

A existência de pontos mais afastados da reta de correlação obtida pode dever-se a inúmeros

fatores decorrentes da sua produção, amostragem ou análise. Fatores abióticos tais como o

défice de nutrientes, diminuição do tempo de exposição à luz, aumento da salinidade do

meio, pH desfavorável, agitação insuficiente, entre outros, podem desencadear alterações na

estrutura e conteúdo celular, resultando em valores de DO e/ou do PS diferentes do esperado.

Por outro lado, fatores bióticos como a presença de microrganismos contaminantes e a

competição entre diferentes espécies de microalgas pode não só afetar o crescimento das

culturas como ser contabilizados nas análises, desviando os resultados do valor real.

Adicionalmente, podem ocorrer erros aleatórios relacionados com o operador. A recolha de

amostras constitui uma etapa critica na monitorização das culturas em produção, sendo uma

tarefa que requer cuidados para evitar contaminações durante a mesma. Por outro lado, a

amostra recolhida deve ser representativa da cultura, e uma incorreta homogeneização da

mesma antes da recolha da amostra ou um arejamento inadequado podem levar a erros de

amostragem. Já durante a análise DO podem ocorrer erros relacionados com o operador,

como erros na pipetagem aquando a preparação de diluições, a ausência de homogeneização

da amostra antes da medição, ou uma má limpeza das cuvettes. No entanto estes erros são

diminuídos uma vez que a DO é medida em duplicado e, como referido anteriormente, é

realizada a correção da absorvância das cuvettes. Em termos de peso seco, os filtros são

manuseados de forma cuidadosa para evitar a adesão de partículas aos mesmos. Já durante a

filtração, a solução de lavagem é colocada nas paredes dos funis de forma a limpar resíduos

de cultura que pudessem ter ficado adsorvidos.

A utilização de dados provenientes de amostras tanto de culturas em crescimento no

laboratório, culturas limpas e monoalgais, com condições de temperatura, pH, e

luminosidade controladas, como de culturas em produção na unidade de produção, aumenta

a robustez da correlação obtida, uma vez que a aproxima da realidade. Como se pretende

estimar o peso seco das culturas em produção, é importante que na correlação sejam

incluídos dados provenientes de amostras produzidas na unidade, pois apesar de não haver

microrganismos contaminantes nas culturas do laboratório, as provenientes da unidade

encontram-se nas mesmas condições de cultivo que aquelas que se pretendem estimar

futuramente. Embora tenham sido excluídas algumas amostras em que se verificou a

presença de outra espécie de microalga na cultura, não foram desprezadas amostras nos casos

em que a contaminação consistia na existência de protozoários para a obtenção das

71

correlações entre DO e PS, apesar da sua influência nestes métodos de quantificação celular.

A sua inclusão na reta é importante de forma a construir uma correlação enquadrada na

realidade verificada durante a produção, pois por mais medidas preventivas que se apliquem,

as contaminações são uma realidade.

72

Conclusão

Com o presente trabalho foi possível perceber e desenvolver competências inerentes ao

funcionamento rotineiro de um laboratório de biotecnologia associado à produção de

microalgas e a sua relação e importância no acompanhamento dos cultivos de uma unidade

de produção.

Por se tratar de um laboratório, existem tarefas transversais ao bom funcionamento e

manutenção dos equipamentos do mesmo. A manutenção, calibração e limpeza dos materiais

e equipamentos deve ser rigorosa e efetuada regularmente para assegurar o bom

funcionamento do laboratório e prevenir erros que possam comprometer a confiabilidade

dos resultados nas análises das microalgas e prejudicar a sua produção.

Por se tratar de um laboratório associado a uma unidade de produção, onde se pretende um

elevado rendimento, torna-se essencial a rentabilização de recursos e tempo. A existência de

uma correlação entre a densidade ótica e o peso seco permitiu posteriormente estimar

rapidamente valores de peso seco de uma cultura sem que fosse necessário efetuar esta

análise. A obtenção do valor em peso seco apenas pelo conhecimento da densidade ótica,

tornou o controlo do crescimento das culturas mais rápido e simples. Foi ainda fulcral que a

correlação tenha tido em conta a existência de culturas contaminadas, uma vez que estas

fazem parte da realidade observada durante a produção de microalgas.

Em relação às correlações realizadas, é possível concluir que, para a microalga

Nannochloropsis sp. ambas as retas obtidas apresentaram um coeficiente de correlação

próximo de 1, apresentando um elevado grau de confiança. No entanto, é recomendado o

uso da reta de ‘Dados com tratamento’. Para Tetraselmis sp., ambas as retas apresentaram

um coeficiente de correlação elevado, e um fator de correlação próximo entre si, não

existindo diferenças significativas entre eles. Como a produção de Odontella sp., foi iniciada

posteriormente às outras espécies, seria necessário obter mais dados de forma a aumentar a

robustez da reta e garantindo um fator de correlação mais aproximado da realidade. Contudo,

é possível concluir que a utilização do fator de correlação para obter uma aproximação em

termos de peso seco das culturas em produção e assim inferir a sua concentração apresenta

inúmeras vantagens, facilitando as tarefas rotineiras do Laboratório.

73

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Xia, Song, Linglin Wan, Aifen Li, Min Sang, and Chengwu Zhang. 2013. “Effects of Nutrients and Light Intensity on the Growth and Biochemical Composition of a Marine Microalga Odontella Aurita.” Chinese Journal of Oceanology and Limnology 31 (6): 1163–73. https://doi.org/10.1007/s00343-013-2092-4.

Xia, Song, Ke Wang, Linglin Wan, Aifen Li, Qiang Hu, and Chengwu Zhang. 2013. “Production, Characterization, and Antioxidant Activity of Fucoxanthin from the Marine Diatom Odontella Aurita.” Marine Drugs 11 (7): 2667–81. https://doi.org/10.3390/md11072667.

Zar, Jerrold H. 2010. “Simple Linear Correlation.” In Bioestatistical Analysis, 328–61. Zhu, C. J., and Y. K. Lee. 1997. “Determination of Biomass Dry Weight of Marine

Microalgae.” Journal of Applied Phycology 9 (2): 189–94. https://doi.org/10.1023/A:1007914806640.

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Anexo I Precisão e exatidão Durante uma experiência, objetivo da análise de erros consiste na quantificação e registo dos

erros associados com a sua inevitável propagação num conjunto de medições e,

posteriormente, determinar a forma de a melhorar. Todas as medições efetuadas com o

intuito de determinar um dado valor quantitativo têm um erro associado, devido à incerteza

experimental. Apesar de não se poder afirmar com certeza o valor exato, o erro associado ao

mesmo pode ser determinado para se obter o intervalo específico no qual reside o valor

correto. Desta forma, obtém-se um intervalo de valores no qual reside, com uma determinada

probabilidade, o valor exato (Hughes and Hase 2010).

Neste contexto, podemos distinguir dois conceitos, a precisão e a exatidão. A precisão de

uma série de medições consiste no grau de concordância entre determinações repetidas,

como representado na Figura 29 (a) e (c). Uma medição exata é aquela em que os resultados

da experiência vão de encontro com o valor esperado, ou aceite, como descrito pelos gráficos

(a) e (b) da Figura 29. Note-se que este último caso é apenas válido para experiências em

que o objetivo é a comparação com valores de referência, de experiências anteriores ou

cálculos teóricos. À distância entre o valor obtido e o valor teórico dá-se o nome de erro

experimental.

Figura 29 – Histogramas representativos de simulações de 100 medicões. A extensão da dispersão dos dados (largura do histograma) é a medida de precisão e a linha a tracejado representa a exatidão dos dados. No gráfico

Exatidão

Precisão de medições

Existem certas medidas sem dispersão estatística, em que repetir a experiência não gera informações mais úteis. Se seis medições sucessivas da quantidade de ácido titulado são 25,0, 25,0, 25,0, 25,0, 25,0 e 25,0 cm3, é desnecessário realizar outra medição semelhante. Neste caso, a precisão da medição é limitada pela resolução finita da escala do aparelho de titulação.

Exatidão das medições

A exatidão de uma experiência é determinada pelos erros sistemáticos. Para um conjunto impreciso de medições, haverá uma diferença entre os valores medidos e os aceites, como nas Figuras X (c) e (d), em que as medições são sempre menores que o valor previsto. Ao contrário dos erros aleatórios, não existem técnicas estatísticas padrão para quantificar erros sistemáticos. Três das fontes mais comuns de erro sistemático são o erro zero, erros de calibração e inserção. A precisão é ainda limitada pela resolução finita da escala do aparelho de medição. Nos casos em que os resultados obtidos ultrapassam a precisão do dispositivo de medição, pode ser calculada a incerteza. Alguns instrumentos digitais são compostos com especificações do fabricante acerca da sua incerteza.

A analise estatística das flutuacoes esta fora do ambito da LFEB, mas importa referir que, habitualmente, considera-se o valor medio dos erros aleatorios como zero. Isto e importante pois, ao repetirem-se as medicoes e fazendo a media aos !resultados, os erros aleatorios compensam-se, reduzindo-se assim a contribuicao aleatoria. Os erros aleatorios podem e devem ser sempre caracterizados, mas dado o seu caracter estocastico, nao podem ser eliminados totalmente, pelo que qualquer medicao tem associada uma Incerteza experimental2.

1.2 Uncertainties in measurement 3

1.2.1 TerminologyYou should note that despite many attempts to standardise the notation, thewords ‘error’ and ‘uncertainty’ are often used interchangeably in this context—this is not ideal—but you have to get used to it! (A discussion of the Interna-tional Standardisation Organisation’s Guide to the Expression of Uncertaintyin Measurement (GUM) is presented in Chapter 9.)

Fig. 1.2 Terminology used in error analy-sis. Simulations of 100 measurements areshown in histograms of constant bin-width.The extent of the scatter of the data (the widthof the histogram) is a measure of the preci-sion, and the position of the centre of the his-togram relative to the dashed line representsthe accuracy. The histograms show (a) pre-cise and accurate, (b) imprecise and accurate,(c) precise and inaccurate and (d) impreciseand inaccurate sets of measurements.

There are two terms that have very different meanings when analysingexperimental data. We need to distinguish between an accurate and a precisemeasurement. A precise measurement is one where the spread of results is‘small’, either relative to the average result or in absolute magnitude. Anaccurate measurement is one in which the results of the experiment are inagreement with the ‘accepted’ value. Note that the concept of accuracy is onlyvalid in experiments where comparison with a known value (from previousmeasurements, or a theoretical calculation) is the goal—measuring the speedof light, for example.

Figure 1.2 shows simulations of 100 measurements of a variable. The dashedvertical line in the histogram shows the accepted value. The scatter of the datais encapsulated in the width of the histogram. Figures 1.2(a) and (c) showexamples of precise measurements as the histogram is relatively narrow. InFig. 1.2(a) the centre of the histogram is close to the dashed line, hence we callthis an accurate measurement. The histograms in Fig. 1.2 show the four possi-ble combinations of precise and accurate measurements: Fig. 1.2(a) representsan accurate and precise data set; Fig. 1.2(b) an accurate and imprecise data set;Fig. 1.2(c) an inaccurate but precise data set; and finally Fig. 1.2(d) both aninaccurate and imprecise data set.

Based on the discussion of precision and accuracy, we can produce thefollowing taxonomy of errors, each of which is discussed in detail below:

• random errors—these influence precision;• systematic errors—these influence the accuracy of a result;• mistakes—bad data points.

1.2.2 Random errorsMuch of experimental physics is concerned with reducing random errors.The signature of random errors in an experiment is that repeated measure-ments are scattered over a range, seen in Fig. 1.1. The smaller the randomuncertainty, the smaller the scattered range of the data, and hence the moreprecise the measurement becomes. The best estimate of the measured quantityis the mean of the distributed data, and as we have indicated, the error isassociated with the distribution of values around this mean. The distributionthat describes the spread of the data is defined by a statistical term knownas the standard deviation. We will describe these terms in greater detail inChapters 2 and 3.

Having quantified the uncertainty in a measurement, the good experi-mentalist will also ask about the origin of the scatter of data. There are twocategories of scatter in experiments: (1) technical, and (2) fundamental noise.

1.2 Uncertainties in measurement 3

1.2.1 TerminologyYou should note that despite many attempts to standardise the notation, thewords ‘error’ and ‘uncertainty’ are often used interchangeably in this context—this is not ideal—but you have to get used to it! (A discussion of the Interna-tional Standardisation Organisation’s Guide to the Expression of Uncertaintyin Measurement (GUM) is presented in Chapter 9.)

Fig. 1.2 Terminology used in error analy-sis. Simulations of 100 measurements areshown in histograms of constant bin-width.The extent of the scatter of the data (the widthof the histogram) is a measure of the preci-sion, and the position of the centre of the his-togram relative to the dashed line representsthe accuracy. The histograms show (a) pre-cise and accurate, (b) imprecise and accurate,(c) precise and inaccurate and (d) impreciseand inaccurate sets of measurements.

There are two terms that have very different meanings when analysingexperimental data. We need to distinguish between an accurate and a precisemeasurement. A precise measurement is one where the spread of results is‘small’, either relative to the average result or in absolute magnitude. Anaccurate measurement is one in which the results of the experiment are inagreement with the ‘accepted’ value. Note that the concept of accuracy is onlyvalid in experiments where comparison with a known value (from previousmeasurements, or a theoretical calculation) is the goal—measuring the speedof light, for example.

Figure 1.2 shows simulations of 100 measurements of a variable. The dashedvertical line in the histogram shows the accepted value. The scatter of the datais encapsulated in the width of the histogram. Figures 1.2(a) and (c) showexamples of precise measurements as the histogram is relatively narrow. InFig. 1.2(a) the centre of the histogram is close to the dashed line, hence we callthis an accurate measurement. The histograms in Fig. 1.2 show the four possi-ble combinations of precise and accurate measurements: Fig. 1.2(a) representsan accurate and precise data set; Fig. 1.2(b) an accurate and imprecise data set;Fig. 1.2(c) an inaccurate but precise data set; and finally Fig. 1.2(d) both aninaccurate and imprecise data set.

Based on the discussion of precision and accuracy, we can produce thefollowing taxonomy of errors, each of which is discussed in detail below:

• random errors—these influence precision;• systematic errors—these influence the accuracy of a result;• mistakes—bad data points.

1.2.2 Random errorsMuch of experimental physics is concerned with reducing random errors.The signature of random errors in an experiment is that repeated measure-ments are scattered over a range, seen in Fig. 1.1. The smaller the randomuncertainty, the smaller the scattered range of the data, and hence the moreprecise the measurement becomes. The best estimate of the measured quantityis the mean of the distributed data, and as we have indicated, the error isassociated with the distribution of values around this mean. The distributionthat describes the spread of the data is defined by a statistical term knownas the standard deviation. We will describe these terms in greater detail inChapters 2 and 3.

Having quantified the uncertainty in a measurement, the good experi-mentalist will also ask about the origin of the scatter of data. There are twocategories of scatter in experiments: (1) technical, and (2) fundamental noise.

1.2 Uncertainties in measurement 3

1.2.1 TerminologyYou should note that despite many attempts to standardise the notation, thewords ‘error’ and ‘uncertainty’ are often used interchangeably in this context—this is not ideal—but you have to get used to it! (A discussion of the Interna-tional Standardisation Organisation’s Guide to the Expression of Uncertaintyin Measurement (GUM) is presented in Chapter 9.)

Fig. 1.2 Terminology used in error analy-sis. Simulations of 100 measurements areshown in histograms of constant bin-width.The extent of the scatter of the data (the widthof the histogram) is a measure of the preci-sion, and the position of the centre of the his-togram relative to the dashed line representsthe accuracy. The histograms show (a) pre-cise and accurate, (b) imprecise and accurate,(c) precise and inaccurate and (d) impreciseand inaccurate sets of measurements.

There are two terms that have very different meanings when analysingexperimental data. We need to distinguish between an accurate and a precisemeasurement. A precise measurement is one where the spread of results is‘small’, either relative to the average result or in absolute magnitude. Anaccurate measurement is one in which the results of the experiment are inagreement with the ‘accepted’ value. Note that the concept of accuracy is onlyvalid in experiments where comparison with a known value (from previousmeasurements, or a theoretical calculation) is the goal—measuring the speedof light, for example.

Figure 1.2 shows simulations of 100 measurements of a variable. The dashedvertical line in the histogram shows the accepted value. The scatter of the datais encapsulated in the width of the histogram. Figures 1.2(a) and (c) showexamples of precise measurements as the histogram is relatively narrow. InFig. 1.2(a) the centre of the histogram is close to the dashed line, hence we callthis an accurate measurement. The histograms in Fig. 1.2 show the four possi-ble combinations of precise and accurate measurements: Fig. 1.2(a) representsan accurate and precise data set; Fig. 1.2(b) an accurate and imprecise data set;Fig. 1.2(c) an inaccurate but precise data set; and finally Fig. 1.2(d) both aninaccurate and imprecise data set.

Based on the discussion of precision and accuracy, we can produce thefollowing taxonomy of errors, each of which is discussed in detail below:

• random errors—these influence precision;• systematic errors—these influence the accuracy of a result;• mistakes—bad data points.

1.2.2 Random errorsMuch of experimental physics is concerned with reducing random errors.The signature of random errors in an experiment is that repeated measure-ments are scattered over a range, seen in Fig. 1.1. The smaller the randomuncertainty, the smaller the scattered range of the data, and hence the moreprecise the measurement becomes. The best estimate of the measured quantityis the mean of the distributed data, and as we have indicated, the error isassociated with the distribution of values around this mean. The distributionthat describes the spread of the data is defined by a statistical term knownas the standard deviation. We will describe these terms in greater detail inChapters 2 and 3.

Having quantified the uncertainty in a measurement, the good experi-mentalist will also ask about the origin of the scatter of data. There are twocategories of scatter in experiments: (1) technical, and (2) fundamental noise.

1.2 Uncertainties in measurement 3

1.2.1 TerminologyYou should note that despite many attempts to standardise the notation, thewords ‘error’ and ‘uncertainty’ are often used interchangeably in this context—this is not ideal—but you have to get used to it! (A discussion of the Interna-tional Standardisation Organisation’s Guide to the Expression of Uncertaintyin Measurement (GUM) is presented in Chapter 9.)

Fig. 1.2 Terminology used in error analy-sis. Simulations of 100 measurements areshown in histograms of constant bin-width.The extent of the scatter of the data (the widthof the histogram) is a measure of the preci-sion, and the position of the centre of the his-togram relative to the dashed line representsthe accuracy. The histograms show (a) pre-cise and accurate, (b) imprecise and accurate,(c) precise and inaccurate and (d) impreciseand inaccurate sets of measurements.

There are two terms that have very different meanings when analysingexperimental data. We need to distinguish between an accurate and a precisemeasurement. A precise measurement is one where the spread of results is‘small’, either relative to the average result or in absolute magnitude. Anaccurate measurement is one in which the results of the experiment are inagreement with the ‘accepted’ value. Note that the concept of accuracy is onlyvalid in experiments where comparison with a known value (from previousmeasurements, or a theoretical calculation) is the goal—measuring the speedof light, for example.

Figure 1.2 shows simulations of 100 measurements of a variable. The dashedvertical line in the histogram shows the accepted value. The scatter of the datais encapsulated in the width of the histogram. Figures 1.2(a) and (c) showexamples of precise measurements as the histogram is relatively narrow. InFig. 1.2(a) the centre of the histogram is close to the dashed line, hence we callthis an accurate measurement. The histograms in Fig. 1.2 show the four possi-ble combinations of precise and accurate measurements: Fig. 1.2(a) representsan accurate and precise data set; Fig. 1.2(b) an accurate and imprecise data set;Fig. 1.2(c) an inaccurate but precise data set; and finally Fig. 1.2(d) both aninaccurate and imprecise data set.

Based on the discussion of precision and accuracy, we can produce thefollowing taxonomy of errors, each of which is discussed in detail below:

• random errors—these influence precision;• systematic errors—these influence the accuracy of a result;• mistakes—bad data points.

1.2.2 Random errorsMuch of experimental physics is concerned with reducing random errors.The signature of random errors in an experiment is that repeated measure-ments are scattered over a range, seen in Fig. 1.1. The smaller the randomuncertainty, the smaller the scattered range of the data, and hence the moreprecise the measurement becomes. The best estimate of the measured quantityis the mean of the distributed data, and as we have indicated, the error isassociated with the distribution of values around this mean. The distributionthat describes the spread of the data is defined by a statistical term knownas the standard deviation. We will describe these terms in greater detail inChapters 2 and 3.

Having quantified the uncertainty in a measurement, the good experi-mentalist will also ask about the origin of the scatter of data. There are twocategories of scatter in experiments: (1) technical, and (2) fundamental noise.

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estão representados conjuntos de medições com: (a) elevada precisão e exatidão (b) imprecisão e exatidão (c) precisão e inexatidão e (d) imprecisão e inexatidão. Adaptado de Hughes & Hase (2010).

Existem duas grandes contribuições para o erro experimental, uma de natureza sistemática

(que influencia a precisão dos resultados) e outra aleatória (que influencia a exatidão dos

resultados). Existe ainda a possibilidade de ocorrerem enganos, que originam dados

incorretos.

Numa experiência, os erros aleatórios são identificados, quando em medições repetidas,

existam flutuações aleatórias nos resultados. Quanto menor a incerteza aleatória, menor o

alcance da dispersão dos dados e mais precisa será a medição. Estes erros podem ter origem

na falta de sensibilidade do equipamento e do observador, em leituras incorretas não

sistemáticas e por ruído (vibrações mecânicas ou elétricas). A melhor estimativa da

quantidade medida é a média dos dados distribuídos e o erro associado à distribuição dos

valores em torno dessa média, o desvio padrão. A forma a diminuir estes erros consiste na

repetição das medições, no entanto, não é possível eliminá-los totalmente.

Os erros sistemáticos conduzem geralmente a valores sistematicamente desviados do valor

aceite ou previsto. As medidas em que esse deslocamento é pequeno (em relação ao erro)

são descritas como precisas. Estes erros podem resultar de más condições de calibração dos

instrumentos de medida, do seu uso em condições diferentes das recomendadas e de leituras

sistematicamente incorretas do observador. Sempre que possível, estes erros devem ser

corrigidos e minimizados. Só a comparação dos resultados obtidos com outros instrumentos

de referência (calibração) pode elucidar se os erros foram suficientemente reduzidos.

(Hughes and Hase 2010)