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ALTAMIR BENEDITO DE SOUSA

Avaliação dos efeitos tóxicos do cianeto e

do tiocianato no período perinatal. Estudo

em ratos

São Paulo 2004

ALTAMIR BENEDITO DE SOUSA

Avaliação dos efeitos tóxicos do cianeto e do tiocianato no

período perinatal. Estudo em ratos

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências

Departamento: Patologia

Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada

Orientador: Profa. Dra. Silvana Lima Górniak

São Paulo 2004

Autorizo a reprodução parcial ou total desta obra, para fins acadêmicos, desde que citada a fonte.

DADOS INTERNACIONAIS DE CATALOGAÇÃO-NA-PUBLICAÇÃO

(Biblioteca da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo)

T.1365 Sousa, Altamir Benedito de FMVZ Avaliação dos efeitos tóxicos do cianeto e do tiocianato no

período perinatal. Estudo em ratos / Altamir Benedito de Sousa. - São Paulo : A. B. Sousa, 2004.

224 f. : il.

Tese (doutorado) - Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. Departamento de Patologia, 2004.

Programa de Pós-graduação: Patologia Experimental e

Comparada. Área de concentração: Patologia Experimental e Comparada. Orientador: Profa. Dra. Silvana Lima Górniak.

1. Intoxicação. 2. Ratos. 3. Leite. 4. Toxicologia reprodutiva.

5. Sangue. 6. Líquido aminiótico. I. Título.

FOLHA DE AVALIAÇÃO

Nome do autor: SOUSA, Altamir Benedito de

Título: Avaliação dos efeitos tóxicos do cianeto e do tiocianato no período perinatal. Estudo em ratos

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências

Data: ______/_____/2004

Banca Examinadora

Prof. Dr. _____________________

Assinatura _____________________

Instituição ______________________

Julgamento_____________________

Prof. Dr. _____________________

Assinatura _____________________

Instituição ______________________

Julgamento_____________________

Prof. Dr. _____________________

Assinatura _____________________

Instituição ______________________

Julgamento_____________________

Prof. Dr. _____________________

Assinatura _____________________

Instituição ______________________

Julgamento_____________________

Prof. Dr. _____________________

Assinatura _____________________

Instituição ______________________

Julgamento_____________________

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Esta contribuição a ciência só pode ser concretizada devido

ao grande estímulo, apoio e confiança que recebi de minha

orientadora e amiga, Profa. Dra. Silvana Lima Górniak

AGRADECIMENTOS

Ao Departamento de Patologia Experimental e Comparada da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, pela oportunidade oferecida. Aos funcionários do CEPTOX, em especial a Leonila Estér Raspantini pelo grande auxílio na realização dos experimentos. Ao prof. Dr. Gerson Gonçalves da Silva, pelo grande auxílio na revisão gramatical deste trabalho. Ao prof. Dr. Paulo César Maiorka, pelo auxílio na análise histopatológica dos órgãos estudados. Aos técnicos do laboratório pelo apoio técnico prestado: Magali, Ricardo e Priscila. Às secretárias da pós-graduação; Sandra, Cláudia, Deise e a secretária de pós-graduação do VPT, Sílvia. Aos funcionários do biotério pela colaboração com a manutenção dos animais. Ao Prof. Dr. Jorge Camilo Florio pelo auxílio na estatística. À Dr.a Cristina Massoco pelo auxílio na metodologia (ELISA). Ao Dr. Ricardo Lazarini pelo auxílio na confecção do aparato para a retirada das amostras de leite de ratas. À pós-graduanda Domênica Palomaris, pelo grande auxilio na revisão desta tese. Às bibliotecárias Maria Alice Rebello, Roseli Barboza Campos Mariam e Lucimar da Silva Prado (HU/USP). Às bibliotecárias Pedra Margarete de S. Guidil Pires e Rosa Maria F. Zani (FMVZ/USP). Aos colegas da pós-graduação que de algum modo contribuíram com este trabalho. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo financiamento desta pesquisa.

DEDICO

À minha sobrinha Celeste pelos momentos de felicidade proporcionados com o seu nascimento, e, agora, com seu crescimento.

À memória de minha mãe, Celeste, e meu pai, José, que apesar de não terem tido oportunidade de estudar, sempre estimularam seus filhos nesta tarefa prazerosa.

Aos meus familiares: minha irmã, Flávia, meu cunhado Carlos e ao meu irmão Sidnei, que me apoiaram em momentos difíceis.

À Dra Leila Peron e à Dra Viviane pela atenção e carinho durante todos estes anos.

Aos meus amigos farmacêuticos: Carlos, Cris, Eleni, Eliane, Emília, Fátima, Gustavo, Misae, Mônica, Patrícia, profa. Sílvia, Sandra e Tina.

Aos meus irmãos cientistas: Benito, Breno, Domênica, Helena, Isis e Marcos.

Aos animais de laboratório que utilizei em meus experimentos; espero que suas vidas tenham valido para o bem da humanidade.

Às mães que cederam seu precioso leite materno para a realização de outro estudo, paralelo a esta tese.

À minha “irmã” de convivência, Domênica.

À Deus e à ciência, sem os quais eu não estaria aqui.

The aim of toxicology studies is

not to make the world a safer

place for rats!

Paul Barrow

RESUMO

SOUSA, A. B. Avaliação dos efeitos tóxicos do cianeto e do tiocianato no período perinatal. Estudo em ratos. [Evaluation of toxic effects of cyanide and thiocyanate during perinatal period. Study in rats]. 2004. 224 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004.

O objetivo do presente estudo foi o de determinar os efeitos da exposição prolongada ao KCN e ao KSCN em ratos, no período perinatal. Inicialmente, realizou-se o estudo toxicocinético do tiocianato em ratas, em três estados fisiológicos diferentes: fase estrogênica, gestacional e de lactação. Para tal, estes animais receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose única de 3 mg/kg de KCN. Os resultados obtidos mostraram aumento significante nos níveis séricos, lácteos e no líquido amniótico, de tiocianato, após a administração do KCN. A partir destes dados, foram calculados os parâmetros toxicocinéticos. Na segunda etapa, foram utilizadas ratas, as quais foram divididas em 3 grupos controles e 18 experimentais, que receberam as diferentes doses de KCN (1; 3 e 30 mg/kg) ou KSCN (0,8; 2,4 e 24 mg/kg), na água de bebida, do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 20º dia da gestação ou no 22º dia pós-parto; e do 1º ao 19º dia da lactação, e submetidas à eutanásia no 19º dia deste período. Ao final de cada experimento, os animais foram submetidos à eutanásia, no período apropriado, bem como os fetos e filhotes, coletando-se soro para análise dos níveis de tiocianato, glicose, colesterol, uréia, creatinina, alanina aminotransferase, aspartato aminotransferase, fosfatase alcalina, bem como foram retirados fragmentos do sistema nervoso central, do rim, do pâncreas, da tireóide, do fígado, do pulmão e do baço para estudo histopatológico. Ainda, realizou-se a dosagem de tiocianato no líquido amniótico e no leite, bem como a análise óssea e visceral dos fetos. Dos parâmetros bioquímicos analisados, em relação às mães, verificou-se que os níveis séricos de tiocianato estiveram aumentados, significantemente, em diversos grupos experimentais, no entanto, poucas foram as alterações nas enzimas e outras substâncias avaliadas. O estudo histológico revelou, tanto naquelas gestantes quanto nas lactantes, nefrose, hemorragia e hemossiderose renal; congestão, neuronofagia e gliose no SNC; congestão, vacuolização e proliferação dos ductos biliares e aumento no número de vacúolos de reabsorção no colóide dos folículos tireoidianos, de forma dose-dependente, nos diferentes grupos experimentais. Ratas gestantes, submetidas à eutanásia no 20º dia da gestação apresentaram, ainda, depleção de células das ilhotas de Langerhans. Em relação aos filhotes, tanto aqueles provenientes de fêmeas tratadas durante a gestação quanto da lactação, verificou-se que, embora a avaliação bioquímica tenha revelado alteração apenas no tiocianato sérico de filhotes de mães provenientes dos grupos experimentais, o estudo histológico, nestas proles, mostrou várias lesões, a saber: congestão, neuronofagia e gliose no SNC, congestão renal e hepática, vacuolização e proliferação dos ductos biliares. Por outro lado, não foram detectadas alterações na performance reprodutiva bem como na análise visceral e óssea dos fetos. Portanto, pode-se sugerir que o cianeto e/ou seu metabólito promovam efeito tóxico diretamente sobre o feto, no entanto estas alterações são passíveis de detecção apenas na fase pós-natal. Além disto, verificou-se, que o cianeto e/ou o tiocianato são carreados para o leite, podendo comprometer, também, a saúde do neonato. Palavras-chave: Intoxicação. Ratos. Leite. Toxicologia reprodutiva. Sangue. Líquido

amniótico.

ABSTRACT

SOUSA, A. B. Evaluation of toxic effects of cyanide and thiocyanate during perinatal period. Study in rats. [Avaliação dos efeitos tóxicos do cianeto e do tiocianato no período perinatal. Estudo em ratos]. 2004. 224 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004. The aim of the present study was to determinate the toxic effects of long-term exposure to KCN and KSCN in rats, during perinatal period. Initially, it was achieved the toxicokinetics study of the thiocyanate in female rats, in three different physiological states: estrogenic, gestation and lactation. These animals received, per os, in the drinking water or by gavage, the unique dose of 3.0 mg KCN/kg. The results showed significantly increased in the thiocyanate levels in the serum, milk and amniotic fluid, after the administration of the KCN. The toxicokinetics parameters were calculated based on these data. In a second part, female rats were distributed in 18 experimental and 3 control groups. The experimental groups were dosed with 1, 3 and 30 mg KCN/kg or 0.8; 2.4 and 24 mg KSCN/kg, daily, in the drinking water, from days 6 to 20 of gestation and euthanized on day 20 of gestation or on day 22 postpartum; or received from days 1 to 19 of lactation and euthanized on day 19 of lactation. At the end of each experiment, the animals were euthanized, in the appropriated period, as well as the fetuses and pups. The serum samples were obtained in order to determine the thiocyanate, glucose, cholesterol, urea, creatinine, alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, alkaline phosphatase levels as well as samples of the following organs for the histopathological study: central nervous system, kidney, pancreas, thyroid, liver, lung and spleen. Yet, the levels of thiocyanate were evaluated in the amniotic fluid and milk, from the mothers, as well as the skeletal and visceral analysis of the fetuses. From the biochemical parameters, in relation to the dams, it was verified that the thiocyanate levels were significantly increased, in several experimental groups; otherwise, too few alterations were observed in the enzymes and others substances analyzed. The histopathological study revealed, in the pregnant and lactating rats, nephrosis, hemorrhage and hemosiderosis in the kidneys; congestion, neuronophagia and gliosis in the CNS; vacuolization and proliferation of the biliar ducts in the liver and increase in the number of reabsorption vacuoles in follicular colloid, in a dose-dependent manner, in some experimental groups. At the pregnant rats that were euthanized on day 20 of gestation, it was verified depletion of cells from the islets of Langerhans. In relation to the pups, from mothers exposed during the gestation and lactation, it was verified alteration in the thiocyanate levels from experimental groups and the histopathological study revealed: congestion, neuronophagia and gliosis in the CNS, renal and hepatic congestion, vacuolization and proliferation of biliar ducts. On the other hand, it was verified no alterations in the reproductive performance nor skeletal and visceral analysis of the fetuses. Thus, it was suggested that the cyanide and/or its metabolite promoted toxic effect straight to the fetuses; however, these alterations are susceptible of detection only at postnatal phase. Furthermore, the cyanide and/or thiocyanate are transferred to the breast milk of rats and can also compromise the health of the offspring. Key words: Intoxication. Rats. Milk. Reproductive toxicology. Blood. Amniotic fluid.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Curva de calibração de solução aquosa de tiocianato de potássio (KSCN) nas concentrações de 25, 50, 75, 100, 200 e 300 mcmol/L..............................................................

80

Figura 2 - Consumo médio de cianeto de potássio (KCN), em mg, de ratas, em diferentes fases fisiológicas: estrogênica (A), gestacional (B) e lactacional (C). As avaliações foram realizadas 0,5; 3; 6; 12 e 24 horas após a suspensão da dieta hídrica, contendo 3 mg/kg de KCN.............................

84

Figura 3 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, na fase estrogênica, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN).....................................................................

87

Figura 4 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN).....................................................................

91

Figura 5 - Níveis de tiocianato (mcmol/L) no líquido amniótico de ratas, no 14º dia de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN)...................................................

91

Figura 6 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia da lactação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN).....................................................................

95

Figura 7 - Níveis lácteos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia da lactação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN).....................................................................

95

Figura 8 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L), de ratas, em diferentes fases fisiológicas: estrogênica, gestacional e lactacional, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). As avaliações foram realizadas 0,5; 3; 6; 12 e 24 horas após a suspensão da dieta hídrica, contendo 3 mg/kg de KCN...................................................

100

Figura 9 - Consumo médio de cianeto de potássio (KCN), em mg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de KCN: 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); do 6o ao 20º dia de gestação.................................

113

Figura 10 - Consumo médio de tiocianato de potássio (KSCN) (mg) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de KSCN: 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação..................

113

Figura 11 - Níveis séricos de glicose (mg/dL) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação.........................................................................

116

Figura 12 - Atividade da enzima aspartato aminotransferase (AST) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação........................................................

116

Figura 13 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação.........................................................................

118

Figuras 14A e B -

Fotomicrografia de corte histológico do rim de rata, que recebeu 24 mg/kg/dia de KSCN, na água de bebida, do 6º ao 20º dia da gestação, mostrando congestão (C), hemorragia (H) e nefrose (N) (HE, 20 X).............................

123

Figura 15 - Fotomicrografia de corte histológico do rim de rata, que recebeu 30 mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando hemorragia e hemossiderose (seta) (HE, 20 X).........................................

124

Figura 16 - Fotomicrografia de corte histológico do fígado de rata, que recebeu 24 mg/kg/dia de KSCN, na água de bebida, do 6º ao 20º dia da gestação, mostrando vacuolização de hepatócitos e proliferação de ductos biliares (seta) (HE, 20 X)....................................................................................

125

Figura 17 - Fotomicrografia de corte histológico do fígado de rata, que recebeu 30 mg mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando vacuolização de hepatócitos e congestão (HE, 10 X)....................................

125

Figura 18 A - Fotomicrografia de corte histológico do sistema nervoso central de rata, que recebeu 30 mg mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando necrose neuronal (setas) (HE, 20 X)...................................

126

Figura 18 B - Fotomicrografia de corte histológico do sistema nervoso central de rata, que recebeu 30 mg mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6º ao 20º dia da gestação, mostrando congestão, focos hemorrágicos (seta) e gliose difusa (HE, 10 X)....................................................................................

126

Figura 18 C - Fotomicrografia de corte histológico do sistema nervoso central de rata, que recebeu 30 mg mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando gliose nodular focal e neuronofagia (seta) (HE, 20 X).........

127

Figura 19 - Fotomicrografia de corte histológico do sistema nervoso central de rata, que recebeu 24 mg/kg/dia de KSCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando vacuolização discreta em substância branca do cerebelo e congestão (seta) (HE, 10 X)................................................

127

Figura 20 - Fotomicrografia de corte histológico da tireóide de rata, que recebeu 30 mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando aumento no número de vacúolos de reabsorção no colóide dos folículos tireoideanos (HE, 10 X)........................................................

128

Figura 21 - Fotomicrografia de corte histológico do pâncreas de rata, que recebeu 30 mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando depleção de células nas ilhotas de Langerhans (Ξ) (HE, 20 X)...........................

129

Figura 22 - Fotomicrografia de corte histológico do pâncreas de rata do grupo controle (HE, 20 X)...............................................

129

Figura 23 - Média de consumo de cianeto de potássio (KCN), em mg, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN: 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto...........................................

140

Figura 24 - Média de consumo de tiocianato de potássio (KSCN), em mg, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KSCN: 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto.....................

140

Figura 25 - Níveis séricos de colesterol (A) e uréia (B) (mg/dL) e atividade da enzima ALT (C) (U/L) de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto..

146

Figura 26 - Níveis séricos de tiocianato de ratas, e respectivos filhotes machos e fêmeas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto..................................................................

150

Figura 27 - Consumo médio de cianeto de potássio (KCN), em mg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN: 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19° dia da lactação........................................

163

Figura 28 - Consumo médio de tiocianato de potássio (KSCN), em

mg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KSCN: 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação..................

163

Figura 29 - Produção média de leite (g/10 horas), no 14º dia de lactação de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. Os dados apresentados foram obtidos considerando-se a diferença de peso materno após e antes a mamada (PM), ou considerando-se a diferença de peso dos filhotes após e antes a mamada (PF). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados os pesos corpóreos de 10 animais, lactantes, e a média do peso de 10 ninhadas, em cada grupo...............................................

170

Figura 30 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação................................................................................

172

Figura 31 - Níveis lácteos de tiocianato (mcmol/L) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação................................................................................

172

Figura 32 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de filhotes machos, no 18º dia de vida, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação..................

173

Figura 33 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de filhotes fêmeas,

no 18º dia de vida, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação..................

173

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Coeficiente de variação (CV), expresso em porcentagem, intra e inter dias obtido pela análise dos níveis de tiocianato de amostras do padrão de 100 mcmol/L em água e em um pool de amostras de soro, leite e líquido amniótico. A recuperação (REC) do método, expressa em porcentagem, foi determinada por meio da relação obtida entre as absorbâncias de amostras de soluções padrão de tiocianato de potássio (KSCN) e de amostras de soro, leite e líquido amniótico de ratas do grupo controle adicionadas das soluções padrão de KCN nas concentrações de 25 e 300 mcmol/L..........................................................................

81

Tabela 2 - Consumo médio de cianeto de potássio (KCN), em mg/kg, de ratas, em diferentes fases fisiológicas: estrogênica, gestacional e lactacional. As avaliações foram realizadas 0,5; 3; 6; 12 e 24 horas após a suspensão da dieta hídrica, contendo 3 mg/kg de KCN. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais em cada tempo avaliado.......................................................

83

Tabela 3 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, na fase estrogênica, que receberam, por via oral, na água de bebida ou por gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais por tempo avaliado......................................................................

86

Tabela 4 - Níveis séricos e no líquido amniótico de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais por tempo avaliado....................

90

Tabela 5 - Níveis séricos e lácteos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia da lactação, que receberam, por via oral, na

água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais por tempo avaliado......................................................................

94

Tabela 6 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L), de ratas, em diferentes fases fisiológicas: estrogênica, gestacional e lactacional, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). As avaliações foram realizadas 0,5; 3; 6; 12 e 24 horas após a suspensão da dieta hídrica, contendo 3 mg/kg de KCN. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais por tempo avaliado................................................................

99

Tabela 7 - Dados dos estudos toxicocinéticos do tiocianato em ratos, nas diferentes fases fisiológicas: estrogênica, gestacional e lactacional, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN) (Cmax: concentração máxima; tmax: tempo para atingir a Cmax; ASC: área sob a curva; Kel: constante de eliminação; Cl: clearance; t1/2β: meia-vida de eliminação; Vd: volume aparente de distribuição). Foram utilizados 6 animais por grupo..............................................

101

Tabela 8 - Peso médio corpóreo (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo.................................

108

Tabela 9 - Ganho médio de peso corpóreo (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo..........

109

Tabela 10 - Média de consumo de ração (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4

(FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

110

Tabela 11 - Consumo médio diário de água (mL) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo..........

111

Tabela 12 - Consumo médio de cianeto de potássio (KCN) ou tiocianato de potássio (KSCN), em mg/kg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo..........

112

Tabela 13 - Desempenho reprodutivo médio de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

114

Tabela 14 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L): alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo..........

115

Tabela 15 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de

gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo..........

117

Tabela 16 - Incidência de anomalias e malformações ósseas em fetos de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as freqüências de ocorrência................................................

119

Tabela 17 - Número de centros de ossificação da prole de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram analisados 40 fetos por grupo.............

120

Tabela 18 - Incidência de anomalias e/ou malformações viscerais na prole de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as freqüências de ocorrência................................................

121

Tabela 19 - Intensidade das lesões histológicas observadas em ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6º ao 20º dia de gestação. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas. Foram avaliados 3 fetos por grupo...................................................................

122

Tabela 20 - Peso médio corpóreo (g) de ratas, no período de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

135

Tabela 21 - Ganho médio de peso corpóreo (g) de ratas, no período de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

136

Tabela 22 - Consumo médio de ração (g) de ratas, no período de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

137

Tabela 23 - Consumo médio de água (mL/dia) de ratas, no período de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

138

Tabela 24 - Consumo médio de cianato de potássio (KCN) ou tiocianato de potássio (KSCN), em mg, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN: 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou KSCN: 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo..........

139

Tabela 25 - Avaliação reprodutiva de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo.................................................................

141

Tabela 26 - Peso médio (g) das ninhadas de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo.................................................................

142

Tabela 27 - Ganho médio de peso (g) das ninhadas de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

143

Tabela 28 - Peso médio (g) do cérebro e cerebelo de filhotes de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 20 animais, machos e fêmeas, por grupo...............................................................................

144

Tabela 29 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L) alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST) de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

145

Tabela 30 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L) alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), obtidos por meio de pool sangüíneo de filhotes machos, no 22º dia de vida, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida,

diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 amostras por grupo.................

147

Tabela 31 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L) alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), obtidos por meio de pool sangüíneo de filhotes fêmeas, no 22º dia de vida, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 amostras por grupo.................

148

Tabela 32 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas avaliadas no 22º dia pós-parto, e de suas respectivas proles, e que receberam durante a gestação, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianato de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram analisadas 10 amostras de cada grupo.......................................................................

149

Tabela 33 - Intensidade das lesões histológicas observadas em ratas, que receberam durante a gestação, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2)e 24 mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas Foram avaliados 3 animais por grupo.................................................................

151

Tabela 34 - Intensidade das lesões histológicas observadas em filhotes, no 22º dia de vida, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24

mg/kg (DS3), do 6º ao 20º dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas. Foram analisados 3 animais por grupo. ................

152

Tabela 35 - Peso médio corpóreo de ratas (g) que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo.................................................................

158

Tabela 36 - Ganho de peso médio corpóreo (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

159

Tabela 37 - Consumo médio de ração (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo.................................................................

160

Tabela 38 - Consumo médio de água (mL) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo.................................

161

Tabela 39 - Consumo médio de cianeto de potássio (KCN) ou tiocianato de potássio (KSCN), em mg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes

doses de KCN: 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou KSCN: 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo..........

162

Tabela 40- Peso médio das ninhadas (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram avaliadas 10 ninhadas por grupo...............................................................

164

Tabela 41 - Ganho de peso (g) médio das ninhadas de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram avaliadas 10 ninhadas por grupo.................

165

Tabela 42 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L) alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo....................

166

Tabela 43 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia ( mg/dL) e creatinina ( mg/dL); e atividades das enzimas (U/L) alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), obtidos, no 18º dia de vida, por meio de pool sangüíneo, de filhotes machos de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à

eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizadas 10 amostras por grupo...............................................................

167

Tabela 44 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia ( mg/dL) e creatinina ( mg/dL); e atividades das enzimas (U/L) alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), obtidos, no 18º dia de vida, por meio de pool sangüíneo, de filhotes fêmeas de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizadas 10 amostras por grupo..............................................................

168

Tabela 45 - Produção média de leite (g/10 horas), no 14º dia de lactação de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. Os dados apresentados foram obtidos considerando-se a diferença de peso materno após e antes a mamada (PM), ou considerando-se a diferença de peso dos filhotes após e antes a mamada (PF). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados os pesos corpóreos de 10 animais, lactantes, e a média do peso de 10 ninhadas, em cada grupo................................................

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Tabela 46 - Níveis séricos e lácteos de tiocianato (mcmol/L) de ratas e suas proles, avaliados no 19º e 18º dia da lactação, respectivamente. As mães receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizadas 10 amostras por grupo...............................................................

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Tabela 47 - Intensidade das lesões histológicas observadas em ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes

doses de cianato de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3) do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas. Foram avaliados 3 animais em cada grupo.....................................................................................

174

Tabela 48 - Intensidade das lesões histológicas observadas em filhotes, no 18º dia de vida, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianato de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3) do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas. Foram avaliados 3 animais em cada grupo...........

175

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ALT........................... Aminotransferase

As2O3......................... Trióxido de arsênio

AST........................... Aspartato aminotransferase

ASC........................... Área sob a curva

CL.............................. Número de corpos lúteos

Cl............................... Clearance

Cmax......................... Concentração máxima

CV.............................. Coeficiente de variação ou imprecisão

EUA........................... Estados Unidos da América

FA.............................. Fosfatase alcalina

FV.............................. Número de fetos vivos

g................................ Grama

grau PA...................... Grau para análise

h................................. Hora

HCl............................. Ácido clorídrico

HE.............................. Hematoxilina-eosina

IM............................... Número de implantações

KCN........................... Cianeto e potássio

Kel............................. Constante de eliminação

kg............................... Quilograma

KOH........................... Hidróxido de potássio

KSCN......................... Tiocianato de potássio

L................................. Litro

mcmol........................ Micromol

mg.............................. Miligrama

mL.............................. Mililitro

NaCl........................... Cloreto de sódio

NaOH......................... Hidróxido de sódio

p-FDA ...................... p-fenilenodiamino

r2................................ Coeficiente de determinação

rpm............................ Rotação por minuto

SNC........................... Sistema nervoso central

t1/2β........................ Meia-vida de eliminação

T3............................... Triiodotironina

T4. ............................. Tiroxina

TCA........................... Ácido tricloroacético

tmax........................... Tempo para alcançar a Cmax

UI............................... Unidade internacional

Vd.............................. Volume aparente de distribuição

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .........................................................................33

1.1 A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO TOXICOCINÉTICO ................39

1.2 SOBRE A TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO............ 44

2 OBJETIVOS ............................................................................47

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .....................................................48

3 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................50

3.1 ANIMAIS....................................................................................51

3.2 MATERIAL ................................................................................52

3.2.1 Reagentes e Soluções . ..........................................................52

3.2.2 “Kits” Comerciais para Dosagem Bioquímica. .....................56

3.2.3 Aparelhos . ...............................................................................56

3.2.4 Ração........................................................................................56

3.3 PROCEDIMENTOS...................................................................57

3.3.1 Alimentação dos Animais..................................................... 57

3.3.2 Confirmação da Prenhez. .......................................................57

3.3.3 Administração de Cianeto ou Tiocianato de Potássio aos Animais. ...................................................................................

58

3.3.3.1 Administração de Cianeto ou Tiocianato de Potássio pela

Água de Bebida. ........................................................................

58

3.3.3.2 Administração por Gavage . ......................................................59

3.3.4 Avaliação do Ganho de Peso. ................................................59

3.3.5 Quantificação da Produção de Leite de Ratas.................... 60

3.3.6 Coleta de Leite para a Quantificação de Tiocianato.............60

3.3.7 Cesariana. ................................................................................61

3.3.8 Coleta de Sangue. ...................................................................62

3.3.9 Coleta de Líquido Amniótico ..................................................62

3.3.10 Dosagem. .................................................................................63

3.3.10.1 Dosagem Bioquímica. ...............................................................63

3.3.10.2 Dosagem de Tiocianato no Soro, Líquido Amniótico e Leite

Materno de Ratas. .....................................................................

63

3.3.11 Análise dos Fetos no 20º Dia de Gestação: Avaliação de Malformações Viscerais e Ósseas. ........................................

64

3.3.12 Exame Anátomo – Histológico. ..............................................65

3.4 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL..........................................66

3.4.1 Experimento 1: Validação da Metodologia para a Determinação de Tiocianato, por Espectrofotometria, em Soro, Leite e Líquido Amniótico de Ratos ............................

66

3.4.2 Experimento 2: Estudo Cinético da Transformação do Cianeto em Tiocianato em Ratas ...........................................

68

3.4.2.1 Avaliação em Ratas Fêmeas Virgens na Fase Estrogênica......68

3.4.2.2 Avaliação na Gestação..............................................................69

3.4.2.3 Avaliação na Lactação ..............................................................70

3.4.3 Experimento 3: Efeitos da Administração, em Ratas, de KCN ou KSCN, Durante o Período de Gestação ...................

73

3.4.4 Experimento 4: Efeitos da Administração, em Ratas, de KCN ou KSCN, Durante o Período de Gestação. Avaliação Pós-Natal...............................................................

72

3.4.5 Experimento 5: Efeitos da Administração, em Ratas, de KCN ou KSCN, Durante a Lactação .......................................

74

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA ...........................................................76

4 RESULTADOS..........................................................................78

4.1 EXPERIMENTO 1: VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA

A DETERMINAÇÃO DE TIOCIANATO, POR

ESPECTROFOTOMETRIA, EM SORO, LEITE E LÍQUIDO

AMNIÓTICO DE RATOS...........................................................

79

4.2 EXPERIMENTO 2: ESTUDO CINÉTICO DA

TRANSFORMAÇÃO DO CIANETO EM TIOCIANATO EM

RATAS ......................................................................................

82

4.2.1 Avaliação em Ratas Fêmeas Virgens na Fase Estrogênica ..............................................................................

85

4.2.2 Avaliação na Gestação ...........................................................88

4.2.3 Avaliação na Lactação ............................................................92

4.3 EXPERIMENTO 3: EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO, EM

RATAS, DE KCN OU KSCN, DURANTE O PERÍODO DE

GESTAÇÃO ..............................................................................

102


RATAS, DE KCN OU KSCN, DURANTE O PERÍODO DE

GESTAÇÃO. AVALIAÇÃO PÓS-NATAL............................. ......

130


RATAS, DE KCN OU KSCN, DURANTE A LACTAÇÃO...........

153

5 DISCUSSÃO ...........................................................................176

6 CONCLUSÕES .........................................................................206

REFERÊNCIAS.........................................................................209

Introdução 33

1 INTRODUÇÃO

Introdução 34

1 INTRODUÇÃO

Desde a antigüidade, sabia-se que o consumo em excesso de mandioca,

amêndoas amargas e folhas de cereja silvestre poderia promover um quadro de

intoxicação. Entretanto, somente no século XVIII reconheceu-se que o agente tóxico

comum, presente nestas plantas, era o cianeto. Wepfer, em 1679, e Maddern, em

1731, descreveram o efeito letal causado pela administração de extrato de

amêndoas amargas e água de cereja silvestre, respectivamente. Mas foi Scheele

(1782), quem primeiro isolou o ácido cianídrico (HCN) e por ironia também

experimentou a toxicidade letal, acidentalmente em seu laboratório. A síntese do

HCN ocorreu em 1815, por Gay-Lussac, que o denominou de ácido cianídrico. Em

1817, Magendie sugeriu que o HCN, em doses apropriadas, poderia ser utilizado

terapeuticamente no controle da tosse e em doenças pulmonares. Esta suposição

também foi aceita por um médico inglês, Granville, e, até 1948, a água de cereja

silvestre fazia parte do arsenal terapêutico da Farmacopéia Britânica

(BALLANTYNE, 1987; SYKES, 1981).

O cianeto é uma substância ubíqua no meio ambiente e tanto humanos

quanto animais podem estar expostos às diversas fontes: a água; o produto de

combustão, principalmente de material plástico e acrílico; a fumaça do cigarro;

alguns fumigantes; as soluções fotográficas; alguns medicamentos como o

nitroprussiato de sódio e as plantas cianogênicas. Este ânion pode intoxicar o

homem e os animais por meio de inalação, absorção através da mucosa ou da pele,

Introdução 35

ou ainda por ingestão (SALKOWSKI; PENNEY, 1994).

Uma fonte importante de exposição ao cianeto são os vegetais. Este íon é

encontrado principalmente na forma de glicosídeos cianogênicos, os quais são

derivados de aminoácidos. São conhecidos mais de vinte e cinco glicosídeos

cianogênicos em 2050 espécies de plantas superiores, distribuídas em 110 famílias

diferentes, destacando-se a Rosaceaea, a Leguminosae, a Gramineae, a Aracea, a

Compositaea, a Euphorbiaceae e a Passifloracea com 150, 125, 100, 50, 50, 50 e 30

espécies, respectivamente (POULTON, 1983).

Dos glicosídeos cianogênicos que são reconhecidamente tóxicos para os

humanos e animais, destacam-se a linamarina e a lotaustralina presentes na

Manihot sp. (mandioca); a amidalina e a prunasina, as quais são encontradas nas

sementes de damasco, nas folhas de cereja selvagem, no mogno da montanha e

nas amêndoas amargas; a sambunigrina, encontrada na Sambucus nigra e na

Acacia cunninghamii; a durrina, encontrada no sorgo; a taxifilina, no bambú, no

Trifolium repens (trevo branco), no Linum sp (linho), no Lotus sp e no Phaseolus

lunatus (sementes de lima) e a triglochinina no Triglochin sp. (CONN, 1978). De

maneira geral, os glicosídeos cianogênicos estão inseridos nos vacúolos das células

dos vegetais (CONN, 1978). Sua liberação ocorre por processos físicos, tais como

mastigação, congelação e secagem. Estes processos permitem o contato dos

vacúolos, contendo o glicosídeo, com uma enzima, encontrada no citossol,

denominada ß-glicosidase, que proporciona seu desdobramento em açúcar e

aglicona, sendo que este último composto sofrerá ainda a ação de mais uma enzima

denominada hidroxinitrila-liase, que por sua vez formará o íon cianeto e um

composto aldeído ou cetônico (CONN, 1978; OKE, 1980).

Após a absorção, o cianeto, por apresentar alta afinidade pela forma

Introdução 36

heme férrica da enzima citocromo oxidase, se liga a esta enzima, inibindo a etapa

citocromo-a-citocromo-a3; assim, não há a transferência do elétron do citocromo a3

para o oxigênio molecular e, conseqüentemente, a cadeia respiratória é paralisada.

Neste processo, forma-se um complexo relativamente estável, portanto, verifica-se

anóxia histotóxica; como a oxihemoglobina não pode liberar o oxigênio para o

transporte de elétrons, o sangue venoso torna-se arteriolizado (ONG, 1989;

PANIGRAHI et al., 1992; POULTON, 1983).

A morte pode ocorrer com a ingestão de pequenas quantidades dos sais

de sódio ou potássio em questão de minutos ou horas, dependendo da dose, via e

tempo de exposição. Entretanto, não seria correto referir-se às “concentrações letais

no sangue” e sim às “concentrações de cianeto que são compatíveis com a morte

pela intoxicação aguda”, pois pode-se encontrar concentrações sangüíneas

superiores de cianeto em indivíduos, que receberam antídotos e não vieram a óbito,

com aqueles achados nos quais se verificou a morte, em concentrações mais

baixas, em indivíduos que não receberam antídotos (TROUP; BALLANTYNE, 1987).

Em geral, o íon cianeto difunde-se livremente entre o plasma, o líquido

intersticial e intracelular. Entretanto, os eritrócitos possuem alta afinidade pelo

cianeto, seqüestrando-o da circulação sangüínea, e sendo esta forma também uma

maneira de proteção do organismo contra os efeitos tóxicos do cianeto. Contudo,

nestas células não ocorre nenhuma transformação do cianeto em um composto

menos tóxico (BALLANTYNE, 1987).

Os mamíferos possuem um eficiente mecanismo de detoxificação do

cianeto, o qual é realizado, principalmente, por uma enzima denominada rodanase

ou acetilsulfotransferase. Esta enzima, presente principalmente em mitocôndrias de

células hepáticas e renais, catalisa a transferência de um átomo de enxofre de um

Introdução 37

doador, por exemplo, o tiossulfato, para o cianeto, formando, principalmente, o

tiocianato, reação considerada irreversível. O tiocianato, principal metabólito do

cianeto, não tem a capacidade de se ligar a citocromo oxidase, sendo eliminado por

meio da urina (BALLANTYNE, 1987; UNITED STATES ARMY, 1999).

Ainda, o cianeto pode ser eliminado, através dos pulmões, na forma de

ácido cianídrico (HCN); reagindo com a cisteína e eliminado pela urina ou reagindo

com a hidroxicobalamina, formando a cianocobalamina, que também é excretada na

urina e bile (BALLANTYNE, 1987). Portanto, a intoxicação aguda pelo cianeto

ocorrerá somente quando as reações de detoxificação forem excedidas

(BALLANTYNE, 1987; GUZMÁN; OCHOA; GIL, 1977; ONG, 1989; PARKINSON,

1996; WAY, 1984).

Por outro lado, há trabalhos na literatura relatando que a exposição

prolongada ao cianeto, em baixas concentrações, pode ocasionar um quadro de

toxicidade crônica. De fato, diversos estudos relacionam neuropatias, como por

exemplo, a neuropatia atáxica tropical - NAT (OSUNTOKUN, 1981) e a paraparesia

espástica ou “konzo” (TYLLESKÄR et al., 1995), ao alto consumo de mandioca, um

alimento que pode conter altos níveis de cianeto, na forma de glicosídeo

cianogênico, a linamarina, presente tanto nas raízes, como em suas folhas

(POULTON, 1983). A exposição prolongada ao cianeto tem sido correlacionada,

também, em decorrência do alto consumo de mandioca e cigarro, às doenças

oculares como a ambliopia por tabaco – álcool (PETTIGREW; FELL, 1972; POTTS,

1973; SOLBERG; ROSNER; BELKIN, 1998); neuropatia retrobulbar da anemia

perniciosa (FREEMAN, 1988); neuropatia óptica hereditária de Leber (SYME et al.,

1983; TSAO et al., 1999); ambliopia do oeste indiano (CREWS, 1963; MACKENZIE;

PHILLIPS, 1968); neuropatia óptica jamaicense (CARROLL, 1971); ambliopia

Introdução 38

tropical (OSUNTOKUN; OSUNTOKUN, 1971); neuropatia óptica cubana (THE

CUBAN OPTIC NEUROPATHY FIELD INVESTIGATION TEAM, 1995; TUCKER;

HEDGES, 1993).

Vários trabalhos correlacionam a ingestão de plantas cianogênicas à

alteração da função tireoideana, tanto em humanos (GAITAN et al., 1994) como em

diferentes espécies de animais (GUTZWILLER, 1993; RATNAKUMAR; RAJAN,

1992; TEWE et al.,1984). Assim, sabe-se que o tiocianato, principal metabólito do

cianeto, compete com a captação do iodo na tireóide, e, conseqüentemente, inibe a

produção dos hormônios tireoidianos, triiodotironina (T3) e tiroxina (T4). Portanto, as

baixas concentrações destes hormônios, causam os sintomas característicos do

hipotireoidismo. Além disto, haverá, devido ao mecanismo de feed back negativo, o

aumento da produção do hormônio tireotrófico, o qual, por sua vez, produz aumento

da tireóide, resultando em uma doença denominada de bócio. Sabe-se que os

hormônios tireoidianos agem no metabolismo energético e celular, no crescimento e

na diferenciação celular; desta maneira, é de se supor que todas estas funções

estejam comprometidas neste tipo de intoxicação (DOHAN; DE LA VIEJA;

CARRASCO, 2000; OKE, 1980; ONG, 1989; TEWE et al., 1984).

Ainda, tem-se correlacionado a diabetes pancreática e a diabetes tropical

em humanos à ingestão prolongada de plantas cianogênicas, em especial à

mandioca (ASSAN et al., 1988; KAMALU, 1995; MCMILLAN; GEEVARGHESE,

1979; PITCHUMONI et al., 1988). McMillan e Geevarghese (1979) sugeriram que

esta doença seria causada por meio da liberação do cianeto pela mandioca,

afetando a porção endócrina do pâncreas. Entretanto, não há modelos

experimentais, utilizando o cianeto, que reproduzam este quadro de diabetes.

Introdução 39

1.1 A IMPORTÂNCIA DO ESTUDO TOXICOCINÉTICO

O estudo da cinética das substâncias químicas foi inicialmente realizada

com os fármacos e, conseqüentemente, denominou-se farmacocinética. A seguir,

avaliações desta natureza foram realizadas também para os xenobióticos, sendo

este estudo denominado, então, de toxicocinético que se refere à descrição

matemática, de modelagem e do curso do tempo na disposição dos agentes tóxicos

e/ou seus metabólitos, em um organismo, que envolve a absorção, a distribuição, a

biotransformação e a excreção (MEDINSKY; VALENTINE, 2001).

A toxicologia em Medicina Veterinária difere da humana, pois a primeira

envolve diferentes espécies animais com características próprias. Neste sentido,

embora o mecanismo de ação de um dado xenobiótico, alvo de estudo da

toxicodinâmica, ser, geralmente, o mesmo nas diferentes espécies animais, sabe-se

que a intensidade e duração dos efeitos deletérios normalmente variam, e podem,

em parte, ser atribuídas às oscilações, de maneira geral, no comportamento

toxicocinético (BAGGOT, 1992). Desta forma, a extrapolação de uma determinada

dose de exposição de uma espécie para outra, pode resultar em conseqüências

catastróficas (GÓRNIAK; SPINOSA, 2003).

A relação entre a dose de um agente tóxico e os efeitos observados

podem ser complexos, pois esta relação depende do comportamento toxicocinético e

da informação da atividade da toxicodinâmica. Os modelos toxicodinâmicos e

toxicocinéticos compartilham a concentração do xenobiótico como característica em

Introdução 40

comum. O conhecimento da toxicocinética é a maneira mais segura e eficaz, com a

menor relação custo versus benefício, para responder a respeito da margem de

segurança de exposição a um determinado agente tóxico (GREGUS; KLAASSEN,

2001).

O efeito tóxico está relacionado à concentração do xenobiótico em seu

sítio de ação, assim, é de grande valia monitorar esta concentração. Entretanto, os

sítios de ação são, geralmente, inacessíveis ou são amplamente distribuídos pelo

organismo em estudo, desta forma a mensuração deste parâmetro, nestes sítios, é

quase impossível de se realizar. O método menos invasivo para a detecção do

agente tóxico ou de um metabólito seria a coleta de amostras de líquidos orgânicos,

como o sangue, durante um determinado intervalo de tempo. Assumindo que a

concentração de qualquer agente tóxico ou de um metabólito, no sangue, está em

equilíbrio com os tecidos, então mudanças na concentração sangüínea refletirão

mudanças na concentração destas substâncias nos tecidos (MEDINSKY;

VALENTINE, 2001).

Estudos mostram que o organismo pode ser geralmente representado por

compartimentos, os quais podem ser descritos matematicamente. Os modelos

matemáticos podem ser de um, dois ou mais compartimentos. O primeiro destes

consiste em um compartimento central, representando o plasma e os tecidos que,

rapidamente, entram em equilíbrio com o agente tóxico ou metabólito, como rins,

fígado, pulmões e coração. Os modelos de dois ou mais compartimentos, por sua

vez, estão conectados a um ou mais compartimentos periféricos, que representam

os tecidos os quais entram em equilíbrio mais vagarosamente, por exemplo, o tecido

adiposo (MEDINSKY; VALENTINE, 2001; RENWICH, 2000).

A absorção e o clearance das substâncias podem ser medidos

Introdução 41

diretamente, com metodologia analítica apropriada, e são classificados como

parâmetros independentes de modelagem. A absorção, em toxicologia, refere-se ao

transporte do xenobiótico de seu local de exposição até a circulação sangüínea

envolvendo a difusão deste agente tóxico através de membranas para o sangue

(VRIES, 1996).

A eliminação de uma determinada substância de um organismo inclui a

biotransformação, a exalação e a excreção. A eliminação é de primeira ordem

quando a velocidade da eliminação é proporcional a quantidade de substrato

presente. Por outro lado, na cinética de ordem zero a eliminação é constante e

independe da concentração do agente no organismo.

O clearance (Cl) ou depuração descreve a velocidade que uma

substância é eliminada do organismo, ou seja, o volume do líquido biológico

contendo a substância que foi depurado por unidade de tempo (volume/tempo). O

clearance pode ser estimado utilizando-se a seguinte relação (VRIES, 1996):

Cl = velocidade de eliminação/concentração plasmática = dose/ASC = Vd

x Kel (mono) ou Vd x β (dois compartimentos)

As substâncias que se comportam como no modelo mono compartimental

equilibram-se rapidamente entre o sangue e os tecidos e em conjunto com o

processo de eliminação. Não significa que a concentração seja igual em todo o

organismo, mas assume que mudanças que ocorram na concentração plasmática

reflitam mudanças proporcionais aos dos tecidos. No modelo mono compartimental a

eliminação ocorre por meio do processo de 1a ordem, isto é, a velocidade de

eliminação em qualquer tempo é proporcional à concentração da substância no

organismo (SHARGEL; YU, 1993; VRIES, 1996).

A equação matemática que exprime esta condição pode ser simplificada

Introdução 42

em:

C = C0 . e – Kel . t

Onde:

C = concentração do agente tóxico no sangue, em um determinado tempo

(t)

C0 = concentração inicial do agente tóxico no sangue no tempo zero

Kel = constante de eliminação

Em contrapartida, no modelo de dois compartimentos, o agente tóxico

necessita de um tempo maior para que a concentração nos tecidos alcance o

equilíbrio com os níveis plasmáticos. A equação matemática que caracteriza esta

condição é dada por (SHARGEL; YU, 1993; VRIES, 1996):

C = A . e –α t + B . e –βt

Onde:

A e B = constantes

α = constante de distribuição

β = constante de eliminação

A partir da caracterização do modelo, pode-se avaliar os diversos

parâmetros toxicocinéticos, descritos a seguir. A partir da curva de concentração do

xenobiótico versus o tempo, podemos calcular a área sob a curva (ASC) pelo

método dos trapezóides lineares. A concentração máxima (Cmax) e seu respectivo

tempo (tmax) podem ser obtidos diretamente do gráfico, sem interpolação dos dados

(SHARGEL; YU, 1993; VRIES, 1996).

A Kel representa a fração da substância removida por unidade de tempo

(t-1), e pode ser obtida por meio do cálculo do slope da curva acima descrita

(SHARGEL; YU, 1993; VRIES, 1996).

Introdução 43

O volume aparente de distribuição (Vd) é uma constante de

proporcionalidade que relaciona a quantidade total da substância no organismo à

concentração no plasma. O Vd é um espaço aparente no qual a concentração de

uma determinada substância está distribuída no organismo e que resulta em uma

dada concentração plasmática. O Vd não se refere ao volume biológico real, mas

representa a extensão da distribuição da substância fora do plasma e dentro de

outros tecidos. Portanto, um valor de Vd pequeno pode significar que a substância

permanece em maior extensão no plasma e um valor de Vd grande pode representar

maior penetração nos tecidos. O Vd pode ser calculado utilizando-se a fórmula

(SHARGEL; YU, 1993; VRIES, 1996):

Vd = Cl/Kel

A meia vida de eliminação (t1/2β) é o tempo necessário para que a

concentração sangüínea do agente em estudo caia pela metade (SHARGEL; YU,

1993; VRIES, 1996), e pode ser calculada pela equação:

t1/2β = 0.693 / Kel

Introdução 44

1.2 SOBRE A TOXICOLOGIA DO DESENVOLVIMENTO

A toxicologia do desenvolvimento abrange o estudo da cinética,

mecanismo de ação tóxica, patogênese e as conseqüências da exposição aos

agentes tóxicos ou condições que levam ao desenvolvimento anormal do animal

(ROGERS; KAVLOCK, 2001). As manifestações da toxicidade no desenvolvimento

incluem malformações estruturais, retardo no crescimento, dano no desenvolvimento

e a morte do organismo. O termo toxicologia do desenvolvimento é recente e refere-

se a uma área do conhecimento relativamente nova, mas tem suas raízes

firmemente relacionadas à teratologia que foi antigamente relacionada às alterações

apenas de ordem estrutural. Atualmente, a toxicologia do desenvolvimento tem como

sinônimo a teratologia. Wilson (1977) definiu a teratologia como “a ciência

interessada em determinar as causas, mecanismos e as manifestações dos erros no

desenvolvimento, sejam eles estruturais ou funcionais e podem ser iniciados em

qualquer período entre a fertilização e a maturação pós-natal”.

O desenvolvimento de mamíferos pode ser dividido em quatro períodos:

de implantação, que compreende desde a fusão do óvulo e do espermatozóide até o

implante do blastocisto no útero. A exposição a um agente tóxico nesta fase pode

levar a embrioletalidade, sendo rara a ocorrência de teratogênese. O de

organogênese, organogenético ou embriogênico abrange desde a proliferação e

migração celular até a formação de órgãos rudimentares. Neste período, poderá

ocorrer a teratogênese, se as lesões produzidas por um agente tóxico forem

Introdução 45

compatíveis à vida; por outro lado, se não forem, haverá embrioletalidade.

Finalmente, o fetal e o neonatal, no qual todos os tecidos estão formados, e ocorre o

crescimento e maturação fisiológica do animal e humanos (BERNARDI, 2002;

ROGERS; KALVLOCK, 2001). No rato, o período de implantação compreende o 5º e

6º dia após a fecundação, a organogênese do 6º ao 15º dia, e o período de

desenvolvimento fetal do 16º ao 21º dia (ROGERS; KALVLOCK, 2001; BERNARDI,

2002).

O protocolo para avaliação da toxicidade da reprodução, que é

amplamente aceito pelas diversas agências regulamentárias de avaliação de

toxicidade, consiste na administração da substância a ser avaliada, para fêmeas

gestantes desde a implantação até o final do período gestacional (1 dia antes do dia

do parto), quando os fetos são analisados quanto às formações esqueléticas e

viscerais antes do nascimento. No entanto, sua grande limitação se refere ao fato de

que estes estudos não expõem, nem examinam, os animais experimentais, em

nenhum período pós-natal. Deve-se ressaltar que, embora algumas agências, como

o Environmental Protection Agency Health Effects Test Guidelines dos Estados

Unidos, inclua outro teste durante o desenvolvimento pós-natal, a avaliação pós–

natal não é obrigatória ou não é solicitada, e geralmente não é conduzida pelas

indústrias (CLAUDIO; BEARER; WALLINGA, 1999).

Portanto, a presente pesquisa objetiva verificar não só os efeitos do

cianeto e do seu principal metabólito, o tiocianato, durante o período perinatal,

observando-se o perfil toxicocinético de transformação do cianeto em tiocianato mas

também avaliar os efeitos, nas proles, de mães submetidas à exposição ao cianeto

de potássio (KCN) e ao tiocianato de potássio (KSCN) durante a gestação e a

lactação. E ainda, pretende-se confrontar aqueles protocolos de avaliação de risco,

Introdução 46

tradicionalmente utilizados pela indústria para avaliação de agentes químicos e

alimentos, com uma nova proposta aqui estabelecida, na qual procura-se verificar os

possíveis efeitos do cianeto e do tiocianato nestas proles após o nascimento.

Objetivos 47

2 OBJETIVOS

Objetivos 48

2 OBJETIVOS

Avaliar os efeitos tóxicos do cianeto e de seu principal metabólito, o

tiocianato, em ratas e em suas respectivas proles no período perinatal.

2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

- Padronizar a técnica para a determinação de tiocianato nos meios

biológicos: sangue, leite e líquido amniótico, em ratos.

- Estudar a toxicocinética do cianeto administrado na água de bebida e

por gavage, em ratas, na fase de estro, gestação e lactação, utilizando o tiocianato

como indicador biológico da exposição ao cianeto.

- Estudar os possíveis efeitos tóxicos promovidos pela exposição ao

cianeto e ao seu principal metabólito, o tiocianato, em ratas expostas durante o

período de gestação.

- Estudar os possíveis efeitos fetotóxicos promovidos pela exposição ao


período de gestação.

- Avaliar o desenvolvimento da prole de ratas expostas ao cianeto e ao

seu principal metabólito, o tiocianato, durante o período de gestação.

Objetivos 49

- Estudar os possíveis efeitos tóxicos promovidos pela exposição ao


período de lactação.

- Avaliar o desenvolvimento da prole de ratas expostas ao cianeto e ao

seu principal metabólito, o tiocianato, durante o período de lactação.

Material e Métodos 50

3 MATERIAL E MÉTODOS


3 MATERIAL E MÉTODOS

Para a execução desta tese foram utilizados os seguintes materiais e

métodos.

3.1 ANIMAIS

Foram utilizadas ratas fêmeas virgens da linhagem Wistar (Ratus

norvegicus), pesando cerca de 220 g no início dos experimentos, provenientes do

biotério da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São

Paulo (FMVZ-USP) e machos da mesma linhagem para o acasalamento.

Os animais foram alojados em gaiolas de polietileno com tampas

metálicas de dimensões 40 x 50 x 20 cm, com cama de maravalha e acondicionadas

em salas do mesmo biotério, com temperatura controlada entre 22 e 24°C por meio

de aparelho de ar condicionado e ciclo de claro e escuro de 12 horas cada. Água e

ração foram fornecidas ad libitum durante todo o período de permanência dos

animais no biotério.

Para o acasalamento, machos e fêmeas foram colocados nas gaiolas

acima descritas, sempre no final da tarde, na proporção de 1:2, respectivamente.

Este procedimento foi repetido até que o número desejado de ratas prenhes fosse


alcançado. Constatada a prenhez, as fêmeas foram mantidas individualmente nestas

mesmas gaiolas até o final de cada experimento.

3.2 MATERIAL

Para a realização dos diversos experimentos foram utilizados os materiais

descritos abaixo.

3.2.1 Reagentes e Soluções

• acetona 99,5% (Dinâmica®);

• água de bromo saturada (Haloquímica®);

• álcool benzílico 99,5% (Synth®);

• álcool etílico 96º GL (Dinâmica®);

• glicerina 99,5% (Dinâmica®);

• ocitocina (União Química®) ampola contendo 5UI / 1 mL;

• p-fenilenodiamino (p-FDA) (Sigma®): o pFDA (grau PA) apresenta-se

como cristais brancos ou ligeiramente avermelhados, os quais

escurecem quando expostos ao ar. Neste caso, é necessário realizar a

recristalização que consistiu em: 5 g de pFDA foram dissolvidos em

aproximadamente 20 mL de água destilada quente contendo 0,5 g de


carvão ativo e 0,2 g de bissulfito de sódio (Reagen®) e esta solução

foi filtrada a quente. O filtrado foi resfriado em banho de gelo e os

cristais formados foram filtrados e lavados com 2 mL de água destilada

gelada e secados em dessecador, ao abrigo da luz. Para se obter a

solução de pFDA na concentração de 2 mg / 1 mL, foram dissolvidos 2

g de pFDA em HCl (0,5 M) e completou-se até 1 L, procedimento este

realizado na capela. Filtrou-se e armazenou-se esta solução em frasco

âmbar previamente identificado, sob refrigeração (2 - 8°C);

• solução clareadora: foram misturados etanol, álcool benzílico e

glicerina nas proporções 2:1:2, em volume, respectivamente, e a

solução resultante foi armazenada em frasco previamente identificado;

• solução de ácido tricloroacético (TCA) (Vetec®) 10%: foram

dissolvidos 100 g de TCA (grau PA) e completou-se para 1 L com

água destilada; a solução resultante foi filtrada e armazenada em

frasco previamente identificado;

• solução de alizarina (Synth®): foram dissolvidos 6 g de alizarina e

completou-se para 1 L com solução de KOH a 0,8%; a solução

resultante de cor roxa foi filtrada e armazenada em frasco previamente

identificado;

• solução de cianeto de potássio (KCN) (Merck®) 10 mg/mL: 1,0 g de

KCN (grau PA) foi dissolvido com água destilada e completado para

100 mL com este mesmo solvente. A solução resultante foi filtrada e

armazenada em frasco previamente identificado. Esta solução foi

preparada no momento do uso;

• solução de Harrison: etanol 95%, glicerol, solução de formol 40% e


solução salina 9% foram misturados nas proporções 8:1:2:7,5, em

volume, respectivamente, e a solução resultante foi armazenada em

frasco previamente identificado;

• solução de HCl 1 M: diluiu-se 84,8 mL de HCl concentrado (Ecibra®)

em água destilada e completou-se para 1 L em balão volumétrico. Esta

diluição foi preparada em banho de gelo e em capela; filtrou-se e

armazenou-se esta solução em frasco âmbar previamente identificado.

A solução de HCl 0,5 M foi preparada a partir da diluição da solução

de HCl 1 M;

• solução de hidróxido de sódio 1,0 N (NaOH) (Merck®): dissolveu-se 4

g de hidróxido de sódio (grau PA) em água destilada e completou-se

para 1 L. A solução resultante foi filtrada e armazenada em frasco

plástico previamente identificado. As soluções de NaOH a 0,8 N e 0,1

N foram preparadas a partir da diluição da solução a 1,0 N;

• solução de piridina: misturou-se HCl concentrado, solução de piridina e

água destilada na proporção 1:6:4, em volume, respectivamente. Esta

solução foi preparada na capela e em banho de gelo; filtrou-se e

armazenou-se em frasco âmbar previamente identificado;

• solução de piridina-pFDA (Synth®): misturou-se solução de piridina e

solução de pFDA na proporção 3:1, em volume, respectivamente. Esta

mistura foi preparada no momento do uso;

• solução de tiocianato de potássio (KSCN) 10 mg/mL: dissolveu-se 1,0

g de KSCN (Farmitália Carlo Erba®) (grau PA) e completou-se para

100 mL com água destilada; em seguida, esta solução foi filtrada e

armazenada em frasco previamente identificado. Esta solução foi


preparada no momento do uso;

• solução de tiocianato de potássio na concentração de 300 mcmol/L:

dissolveu-se 29,1 mg de KSCN (Farmitália Carlo Erba®) e completou-

se até 1L com água destilada; em seguida, esta solução foi filtrada e

armazenada em frasco previamente identificado. A partir desta solução

foram preparadas as soluções de KSCN nas concentrações 25, 50, 75,

100 e 200 mcmol/L;

• solução de trióxido de arsênio: dissolveu-se 20 g de trióxido de arsênio

(As2O3) (Sigma®) (grau PA) em solução aquecida de NaOH 0,1 N e

completou-se para 1L. O pH desta solução foi ajustado para o valor 7

com HCl concentrado; em seguida esta solução foi filtrada e

armazenada em frasco plástico previamente identificado;

• solução de formol 36,5 % em peso ou 40% em volume (Synth®);

• solução de cloreto de sódio (NaCl) a 9%: dissolveu-se 90 g de NaCl

(grau PA) (Synth®) e completou-se para 1 L com água destilada; em

seguida, esta solução foi filtrada e armazenada em frasco previamente

identificado.

• solução de sulfeto de amônio a 25%: dissolveu-se 25 g de sulfeto de

amônio (grau PA) (Synth®) e completou-se para 100 mL com água

destilada; em seguida, esta solução foi filtrada e armazenada em

frasco previamente identificado. Estes procedimentos foram realizados

em capela.


3.2.2 “Kits” Comerciais para Dosagem Bioquímica

Enzimas: alanina aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase

(AST) e fosfatase alcalina (FA) (Celm®);

Uréia, creatinina, glicose e colesterol (Celm®).

3.2.3 Aparelhos

CELM SBA-200 utilizado para as determinações bioquímicas;

Multiskan MCC340 Titertek® utilizado para a dosagem do tiocianato;

Centrifugador Fanem® Excelsa Baby.

3.2.4 Ração

Durante todos os experimentos utilizou-se ração para ratos (Nuvilab®

CR1).


3.3 PROCEDIMENTOS

Para a execução dos diversos experimentos foram realizados os

seguintes procedimentos.

3.3.1 Alimentação dos Animais

Durante todo o período experimental, os animais receberam ração

comercial (Nuvilab® CR1) e água potável ad libitum, contendo ou não KCN ou

KSCN dependendo do grupo experimental.

3.3.2 Confirmação da Prenhez

Na manhã seguinte ao acasalamento, sempre no horário compreendido

entre 7 h e 9 h, procedia-se ao lavado vaginal e, ao se confirmar a presença de

espermatozóides neste lavado, por meio de análise microscópica, conforme técnica

descrita por Vickery e Bennet (1970), considerava-se, então, o dia zero da gestação.


3.3.3 Administração de Cianeto ou Tiocianato de Potássio aos Animais

Para a execução dos diversos experimentos realizou-se os procedimentos

de administração do KCN e do KSCN, conforme descrição abaixo.

3.3.3.1. Administração de Cianeto ou Tiocianato de Potássio pela Água de Bebida

O cálculo da quantidade de KCN ou KSCN a ser adicionada na água do

bebedouro foi baseado no peso e no grupo experimental ao qual os animais

pertenciam. Primeiramente, pesou-se os animais individualmente. A partir deste

dado, calculou-se a quantidade de KCN ou KSCN a ser adicionada no bebedouro de

cada animal pertencente aos diversos grupos experimentais, por meio da relação

dose de KCN ou KSCN (mg)/peso dos animais (g). Em seguida, a partir de uma

solução de concentração de KCN ou KSCN a 10 mg/mL, preparada diariamente,

calculou-se o volume desta solução a ser adicionado na água de beber

correspondente a dose a ser administrada para cada animal.

Com a finalidade de aumentar a estabilidade do KCN em água, adicionou-

se 0,05 mL de KOH 1 N em todos os bebedouros. Um estudo conduzido por este

laboratório mostrou que esta solução de KCN é estável por até 24 horas após seu

preparo (SOUSA et al., 2002). O consumo de água foi verificado diariamente e a


partir da estimativa da quantidade de água a ser ingerida por estes animais,

oferecia-se sempre o dobro deste volume, para evitar a privação de água, caso

ocorresse, por algum motivo, o aumento do consumo hídrico.

A pesagem dos animais foi realizada em diferentes dias, de acordo com o

delineamento experimental, para a correção da quantidade de KCN ou KSCN a ser

adicionada na água de bebida.

3.3.3.2 Administração por Gavage

Nos estudos de cinética de transformação do cianeto em tiocianato,

conforme descrito no item 3.4.2, utilizou-se o método de gavage que consistiu na

administração da solução de KCN, para os grupos experimentais, ou somente água

destilada, para os grupos controles, através de uma cânula, que foi introduzida até o

estômago do animal, administrando-se o líquido em um volume nunca superior a 1

ml.

3.3.4 Avaliação do Ganho de Peso

Os animais dos grupos experimentais e controle foram pesados em

balança semi analítica, em horários e freqüências estabelecidas de acordo com o

delineamento experimental.


3.3.5 Quantificação da Produção de Leite de Ratas

A quantificação da produção de leite de ratas baseou-se nas técnicas

propostas por Otha (2002) e Pavelka et al. (2002), com algumas modificações, como

descrita a seguir: no 13° dia da lactação (21:00 h), as mães foram separadas de

suas ninhadas por 10 h. Após este período, no 14° dia da lactação, as mães e os

filhotes foram pesados. Em seguida, colocou-se as ninhadas com suas respectivas

mães, permitindo-se que os filhotes mamassem por 60 minutos. Imediatamente, as

mães e suas respectivas ninhadas foram pesadas. A diferença de peso das mães e

das ninhadas, antes e após a mamada, permitiu calcular a quantidade de leite, em

gramas, produzida no período de 10 h.

3.3.6 Coleta de Leite para a Quantificação de Tiocianato

A coleta de leite de ratas baseou-se na técnica proposta por Benes et al.

(2002), com algumas modificações, como descrita a seguir: no período da manhã, os

filhotes das mães dos grupos experimentais e controle foram separados de suas

progenitoras por 6 horas. Decorrido este tempo, as lactantes receberam, por via

intraperitoneal, 2 UI de ocitocina. Após 20 minutos desta administração, retirou-se o

leite adaptando o teto em um tubo cônico de plástico que por sua vez foi conectado


em uma bomba a vácuo. As amostras de leite foram acondicionadas em tubos

plásticos, previamente identificados, e congeladas a -20°C até o processamento

para a quantificação de tiocianato, o qual foi realizado dentro de um período nunca

superior a 15 dias.

3.3.7 Cesariana

De acordo com o delineamento experimental realizou-se a técnica

cirúrgica cesariana, após 8 h de jejum. As ratas prenhes foram anestesiadas por

inalação com éter etílico e, em seguida, procedeu-se a laparotomia exploratória, com

exposição dos cornos uterinos, para a contagem de pontos de implantações, de

reabsorção e de fetos vivos e mortos. Os ovários foram retirados e, com o auxílio de

uma lupa (16/12 x 1,25), foram contados o número de corpos lúteos para avaliação

da quantidade de óvulos eliminados. Para melhor visualização dos pontos de

implantação, mergulhou-se o útero em solução de sulfeto de amônio a 25% por 10

minutos e em seguida, lavou-se o útero em água corrente, tendo os pontos de

implantação corados de preto.

As perdas embrionárias, no período de pré-implantação e no período de

pós-implantação, foram calculadas por meio da seguinte proporção:

% perda pré-implantação = (CL – IM) x 100 / CL

% perda pós-implantação = (IM – FV) x 100 / IM

onde:

CL = número de corpos lúteos;


IM = número de implantações;

FV = número de fetos vivos.

3.3.8 Coleta de Sangue

Para a coleta de sangue, os ratos foram anestesiados em cuba com éter,

fixados em decúbito dorsal em uma prancha de parafina e realizou-se um corte

longitudinal, desde a região pélvica até a cartilagem xifóide, coletando-se em

seguida o sangue da veia hepática em seringas descartáveis não heparinizadas.

Após este procedimento, este material biológico foi centrifugado por 15 minutos a

5.000 rpm em centrifugadora refrigerada e o sobrenadante, o soro, acondicionado

individualmente em tubos plásticos devidamente identificados e estocados em

freezer a -20 ºC até o processamento.

3.3.9 Coleta de Líquido Amniótico

Para a coleta de líquido amniótico, as ratas prenhes foram anestesiadas

em cuba com éter, fixadas em decúbito dorsal em uma prancha de parafina e

realizou-se um corte longitudinal, desde a região pélvica até a cartilagem xifóide,

coletando-se em seguida o líquido amniótico de vários sacos embrionários até obter

3 mL deste meio biológico. Após este procedimento, o líquido amniótico foi


acondicionado individualmente em tubos plásticos devidamente identificados e

estocados em freezer a -20 ºC até o processamento.

3.3.10 Dosagem

Para a execução dos diversos experimentos realizou-se os procedimentos

de dosagem das diversas substâncias, conforme descrição abaixo.

3.3.10.1 Dosagem Bioquímica

As atividades das enzimas alanina aminotransferase (ALT), aspartato

aminotransferase (AST), fosfatase alcalina (FA) e os níveis séricos da uréia,

creatinina, glicose e colesterol dos animais experimentais e controle foram dosados

por meio de sistema automatizado, utilizando o aparelho CELM SBA-200.

3.3.10.2 Dosagem de Tiocianato no Soro, Líquido Amniótico e Leite Materno de

Ratas

Em um tubo de ensaio, pipetou-se 0,2 mL de soro, líquido amniótico ou


leite materno e 1,8 mL de solução de ácido tricloroacético a 10%. Logo após a

homogeneização, este material foi centrifugado a 10.000 rpm por 20 minutos.

Posteriormente, pipetou-se 0,5 mL do sobrenadante em outro tubo de ensaio e

adicionou-se, com agitação mecânica: 0,25 mL de HCl 1 M; 0,05 mL de água de

bromo saturada; 0,10 mL de solução de trióxido de arsênico e por último 0,90 mL da

mistura de piridina-pFDA. Após 15 minutos, 0,20 mL da solução obtida foi transferida

para placas de fundo chato (Corning-Costar®) com 96 poços e realizou-se a leitura

no aparelho Multiskan MCC340 (Titertek®) com filtro de 540 nm contra o branco de

reativo.

3.3.11 Análise dos Fetos no 20º Dia de Gestação: Avaliação de Malformações

Viscerais e Ósseas

Após a cesariana, os fetos foram contados no útero e, marcadas suas

posições. Em seguida, o útero foi extraído inteiro e pesado. Posteriormente, os

filhotes foram retirados do útero e examinados. Logo após, os fetos e suas

respectivas placentas, após secagem em papel toalha, foram pesados

individualmente e os filhotes diferenciados quanto ao sexo. Ainda, foram medidos

em cm, desde o crânio até o início da cauda.

Após o procedimento acima descrito, realizou-se a análise visceral sendo

que 4 fetos, 2 machos e 2 fêmeas, de cada ninhada foram colocados em 220 mL da

solução de Harrison para fixação das estruturas viscerais e descalcificação dos

ossos por um período de 4 dias. Os frascos foram tampados e identificados. Em


seguida, os fetos foram colocados em álcool 80° por 2 dias e, posteriormente, em

álcool 90° por no mínimo 4 dias até a leitura. Empregou-se o método de seções

seriadas de Wilson (1965) para análise de malformações e anomalias internas.

Para a análise óssea, 4 filhotes de cada ninhada, foram colocados em

acetona, permanecendo nesta solução por uma noite. No dia seguinte o palato de

cada animal foi examinado e procedeu-se a evisceração. Em seguida, foi realizado o

procedimento de diafanização que consistiu em colocar os fetos em uma solução de

KOH 0,8%, preparada diariamente com água destilada e alizarina, conforme o

método proposto por Staples e Schenell (1964), e trocou-se diariamente esta

solução por 4 dias. Posteriormente, os fetos foram conservados em solução

clareadora até o dia da análise esquelética, segundo Taylor (1986). O restante dos

fetos foram submetidos à eutanásia, colocando-os em cuba com éter por tempo

prolongado.

3.3.12 Exame Anátomo – Histológico

Após a retirada do sangue, 3 animais de cada grupo, foram submetidos à

eutanásia, colocando estes animais em tempo prolongado em cuba com éter e, em

seguida, foi realizada a necropsia. Após a inspeção macroscópica, foram retirados

fragmentos representativos de fígado, pâncreas, baço, rins, tireóides, pulmões e

sistema nervoso central. Em seguida, os fragmentos foram conservados em formol a

10%, até o momento do processamento. Depois deste procedimento, todos os

fragmentos foram incluídos em parafina, realizando-se cortes histológicos de 5 mcm


de espessura e corados pelo método de hematoxilina-eosina (HE), para análise de

possíveis lesões microscópicas.

No final do Experimento 3.4.4, também foram coletados e pesados o

encéfalo e o cerebelo de 4 filhotes: 2 machos e 2 fêmeas de cada ninhada.

A intensidade das lesões observadas pelo estudo histopatológico dos

diversos experimentos, foi caracterizada por meio de escores, a saber: (-) sem lesão;

(+) lesões leves, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas.

3.4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Para a realização dos diversos experimentos, estes foram delineados

conforme descrição abaixo.

3.4.1 Experimento 1: Validação da Metodologia para a Determinação de

Tiocianato, por Espectrofotometria, em Soro, Leite e Líquido Amniótico

de Ratos

A determinação dos níveis de tiocianato no soro, leite e líquido amniótico

de ratos foi realizada de acordo com o método de Pettigrew e Fell (1972), modificado

por este laboratório. A validação desta metodologia procedeu-se ao estudo da

linearidade da resposta, confecção da curva de calibração, determinação da


precisão e recuperação do tiocianato.

A linearidade da resposta, que é o intervalo de concentração no qual o

valor da absorbância é diretamente proporcional à concentração da amostra, foi

verificada por meio da utilização de soluções padrão de KSCN e submetidas ao

processo analítico. Para isto, foram preparadas seis soluções de KSCN de

concentrações: 25, 50, 75, 100, 200 e 300 mcmol/L, conforme descrito no item 3.2.1.

Estas foram processadas 10 vezes cada, conforme descrito no item 3.3.10.2. Em

seguida calculou-se a média e o erro-padrão das absorbâncias de cada

concentração em estudo. As correlações entre as concentrações de tiocianato nas

soluções padrão e os valores das absorbâncias obtidos foram utilizados para a

construção da curva de calibração.

Para a determinação da precisão da metodologia intra laboratorial,

realizou-se a análise dos níveis de tiocianato, conforme descrito no item 3.3.10.2, da

solução padrão de 100 mcmol/L de tiocianato e de um pool de amostras de soro,

leite e líquido amniótico, por seis vezes cada, em um mesmo dia; e em seguida, em

três dias diferentes. Calculou-se o coeficiente de variação ou imprecisão pela

fórmula:

CV = S . 100/ X

Onde:

CV: coeficiente de variação;

S: desvio padrão;

X: média das replicatas.

A porcentagem de recuperação do tiocianato, pelo método empregado, foi

determinada por meio da relação obtida entre as médias das absorbâncias de 6

amostras das soluções padrão de 25 e 300 mcmol/L de KSCN e as médias das


absorbâncias de 6 amostras de soro, leite ou líquido amniótico de ratas do grupo

controle, contendo as soluções padrão de 25 e 300 mcmol/L de KSCN. Estas

amostras foram submetidas ao processo analítico, conforme descrito no item

3.3.10.2, contra o branco dos reativos e das amostras dos meios biológicos

descritos. Para o cálculo utilizou-se a seguinte fórmula:

R = X . 100/ Y

Onde:

R: porcentagem de recuperação;

X: média da concentração da solução padrão;

Y: média da concentração do meio biológico estudado adicionado do

analito.

3.4.2 Experimento 2: Estudo Cinético de Transformação do Cianeto em

Tiocianato em Ratas

O estudo cinético de transformação do cianeto em tiocianato,

compreendeu os experimentos abaixo descritos.

3.4.2.1 Avaliação em Ratas Fêmeas Virgens na Fase Estrogênica

Para a determinação da cinética de transformação do cianeto em


tiocianato em ratas fêmeas virgens e na fase de estro, foram utilizadas 72 ratas,

pesando cerca de 200 g, divididas em 2 grupos iguais: um grupo recebeu o KCN na

água de bebida e outro por gavage. Os animais do estudo na água de bebida

receberam, conforme descrito no item 3.3.3.1, 3 mg/kg de KCN, das 20 h até às 8 h

do dia seguinte. A partir deste horário, coletou-se sangue destes animais, para a

obtenção de soro, conforme descrito no item 3.3.8, nos seguintes tempos: 30

minutos, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração de KCN.

Para o estudo por gavage, ratas fêmeas virgens e na fase de estro

receberam, conforme descrito no item 3.3.3.2, 3 mg/kg de KCN, às 8 h, por esta via.

Então, coletou-se sangue destes animais, para a obtenção de soro, conforme

descrito no item 3.3.8, nos seguintes tempos: 30 minutos, 3, 6, 12 e 24 horas após a

administração de KCN.

Os grupos controles receberam somente água potável (tempo = zero).

Para cada tempo estudado, na água de bebida e por gavage, foram utilizadas 6

ratas cujas amostras de sangue foram processadas para a dosagem de tiocianato,

conforme descrito no item 3.3.10.2. Todos os animais, experimentais e controle,

permaneceram em jejum de 12 h, no estudo por gavage, ou durante todo o tempo da

ingestão hídrica, contendo ou não o KCN, no estudo pela água de bebida.

3.4.2.2 Avaliação na Gestação


tiocianato em ratas no 14° dia de gestação, foram utilizadas 72 ratas prenhes,


divididas em 2 grupos iguais: um grupo recebeu o KCN na água de bebida e outro

por gavage. Para o estudo na água de bebida, ratas no 13° dia de gestação

receberam, conforme descrito no item 3.3.3.1, 3 mg/kg de KCN das 20 h até às 8 h

do dia seguinte. A partir deste horário, coletou-se sangue, para a obtenção de soro,

e líquido amniótico, conforme descrito nos itens 3.3.8 e 3.3.9, respectivamente, nos

seguintes tempos: 30 minutos, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração de KCN.

Para o estudo por gavage, ratas no 14° dia de gestação receberam,

conforme descrito no item 3.3.3.2, 3 mg/kg de KCN, às 8 h, por esta via. Coletou-se

sangue destes animais, para a obtenção de soro, e líquido amniótico, conforme

descrito nos itens 3.3.8 e 3.3.9, respectivamente, nos seguintes tempos: 30 minutos,

3, 6, 12 e 24 horas após a administração de KCN.



ratas cujas amostras de sangue e líquido amniótico foram processadas para a

dosagem de tiocianato, conforme descrito no item 3.3.10.2. Todos os animais,

experimentais e controle, permaneceram em jejum de 12 h, no estudo por gavage,

ou durante todo o tempo da ingestão hídrica, contendo ou não o KCN, no estudo

pela água de bebida.

3.4.2.3 Avaliação na Lactação


tiocianato em ratas no 14° dia de lactação, foram utilizadas 72 ratas lactantes,


divididas em 2 grupos iguais: um grupo recebeu o KCN na água de bebida e outro

por gavage. Para o estudo na água de bebida, ratas no 13° dia de lactação foram

separadas de seus filhotes no período noturno e receberam, conforme descrito no

item 3.3.3.1, 3 mg/kg de KCN das 20 h até às 8 h do dia seguinte. A partir deste

horário, coletou-se sangue, para a obtenção de soro, e leite, conforme descrito no

itens 3.3.8 e 3.3.6, respectivamente, nos seguintes tempos: 30 minutos, 3, 6, 12 e 24

horas após a administração de KCN.

Para o estudo por gavage, ratas no 13° dia de lactação foram separadas

de seus filhotes no período noturno e receberam no 14° dia de lactação, conforme

descrito no item 3.3.3.2, 3 mg/kg de KCN, às 8 h, por esta forma de administração.

Coletou-se sangue destes animais, para a obtenção de soro, e leite, conforme

descrito nos itens 3.3.8 e 3.3.6, respectivamente, nos seguintes tempos: 30 minutos,

3, 6, 12 e 24 horas após a administração de KCN.



ratas cujas amostras de sangue e leite foram processadas para a dosagem de

tiocianato, conforme descrito no item 3.3.10.2. Todos os animais, experimentais e

controle, permaneceram em jejum de 12 h, no estudo por gavage, ou durante todo o

tempo da ingestão hídrica, contendo ou não o KCN, no estudo pela água de bebida.


3.4.3 Experimento 3: Efeitos da Administração, em Ratas, de KCN ou KSCN,

Durante o Período de Gestação

Para a verificação dos efeitos da administração de KCN ou KSCN em

ratas durante o período de prenhez, e nos respectivos fetos, foram utilizadas 70

ratas prenhes divididas em 7 grupos, com 10 animais cada, sendo 6 grupos

experimentais que receberam diariamente, do 6° ao 20° dia da prenhez, na água do

bebedouro, conforme descrito no item 3.3.3.1, KCN nas doses de 1,0 (FEC1); 3,0

(FEC2) e 30,0 mg/kg/dia (FEC3) ou KSCN nas doses de 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e

24,0 mg/kg (FES3) e um grupo controle (FC) que recebeu somente água potável.

Durante este período, verificou-se o estado geral dos animais e a

ocorrência de abortos. O peso das mães foi verificado nos dias 0, 6, 8, 10, 12, 14,

16, 18, 20 e o consumo de ração foi verificado nos períodos, em dias, de 6-9, 9-12,

12-15, 15-18 da gestação. Durante o período de gestação, verificou-se o consumo

de água das gestantes diariamente.

No 19° dia de prenhez, a ração foi retirada no período noturno, e no 20°

dia, pela manhã, as mães foram anestesiadas, realizando-se a cesariana, conforme

descrito no item 3.3.7, e a coleta de sangue conforme descrito no item 3.3.8. O

sangue foi processado para a realização das dosagens bioquímicas e de tiocianato,

conforme descrito nos itens 3.3.10.1 e 3.3.10.2, respectivamente. A seguir, estas

ratas foram submetidas à eutanásia para a coleta de material para o estudo

histopatológico, conforme descrito no item 3.3.12.


A avaliação fetal de malformações e anomalias viscerais e ósseas foi

realizada, conforme descrito no item 3.3.11.


Durante o Período de Gestação. Avaliação Pós-Natal

Para a verificação dos efeitos em filhotes de ratas expostas ao KCN ou

KSCN durante a gestação, foram utilizadas 70 ratas prenhes divididas em 7 grupos,

com 10 animais cada, sendo 6 grupos experimentais que receberam diariamente, do

6° ao 20° dia da gestação, na água do bebedouro, conforme descrito no item 3.3.3.1,

KCN nas doses de 1,0 (DC1); 3,0 (DC2) e 30,0 mg/kg/dia (DC3) ou KSCN nas doses

de 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24,0 mg/kg (DS3) e um grupo controle (DC) que recebeu

somente água potável.

Durante este período, verificou-se o estado geral dos animais e a

ocorrência de abortos. O peso das mães foi verificado nos dias 0, 6, 8, 10, 12, 14,

16, 18 e 20 da gestação e o consumo de ração foi verificado nos períodos, em dias,

de 6-9, 9-12, 12-15, 15-18, 18-20 da gestação. Durante o período de gestação,

verificou-se o consumo de água diariamente.

No dia seguinte ao nascimento dos animais, dia 1, foi realizada a

padronização de cada ninhada permanecendo 4 machos e 4 fêmeas para cada

progenitora e, caso não fosse possível, foi realizado o cross fostering para que esta

relação fosse mantida. Em seguida, as ninhadas foram pesadas. Os demais filhotes

da ninhada foram submetidos à eutanásia. Durante a lactação, o peso das ninhadas


foi verificado nos dias 1, 7, 14 e 21, deste período.

No 22° dia da lactação, coletou-se amostra de sangue dos filhotes, como

descrito no item 3.3.8, para a análise bioquímica e dos níveis séricos de tiocianato,

conforme descrito nos itens 3.3.10.1 e 3.3.10.2, respectivamente. Contudo, por ser a

amostra de sangue de cada filhote insuficiente para as várias análises bioquímicas,

optou-se por formar dois pools de amostras de soro de cada ninhada, formando-se

um para machos e outro para fêmeas. A coleta de órgãos para análise

histopatológica seguiu como descrito no item 3.3.12 e ainda foram coletados e

pesados o encéfalo e o cerebelo de 2 filhotes, machos e fêmeas, de cada ninhada.

Em relação às progenitoras no 21º dia da lactação, foi retirada a ração no

período noturno, e, no 22º dia, estas foram anestesiadas, realizando-se a coleta de

sangue, conforme descrito 3.3.8. Este material foi processado para a realização das

dosagens bioquímicas e de tiocianato, conforme descrito nos itens 3.3.10.1 e

3.3.10.2, respectivamente. A seguir, estas ratas foram submetidas à eutanásia para

a coleta de material para estudo histopatológico, conforme descrito no item 3.3.12.


Durante a Lactação

Para a verificação dos efeitos da administração de KCN ou KSCN em

ratas e suas respectivas proles, durante o período de lactação, foram utilizadas 70

ratas prenhes, divididas em 7 grupos, com 10 animais cada, sendo 6 grupos

experimentais que receberam na água de bebida, do 1° ao 18° dia da lactação,


conforme descrito no item 3.3.3.1, KCN nas doses de 1,0 (FCL1); 3,0 (FCL2) e 30,0

mg/kg/dia (FCL3) ou KSCN nas doses de 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24,0 mg/kg

(FSL3) e um grupo controle (LC) que recebeu somente água potável. Durante o

período de gestação, verificou-se o estado geral dos animais e a ocorrência de

aborto.

No dia seguinte do nascimento, pesou-se as mães, os filhotes foram

contados e verificado o sexo, as ninhadas foram pesadas e, em seguida, as mesmas

foram homogeneizadas permanecendo 4 filhotes machos e 4 fêmeas para cada mãe

e, caso não fosse possível, foi realizado o cross fostering para que esta relação

fosse mantida. Os demais filhotes da ninhada foram submetidos à eutanásia.

Durante o período de lactação, verificou-se o consumo de água das

lactantes diariamente. O consumo de ração das mesmas foi realizado nos dias 4, 8,

12, 16 e 18. O peso das mães e das ninhadas foi verificado nos dias 1, 7, 14 e 18 da

lactação.

No 14° dia da lactação, quantificou-se a produção de leite, como descrito

no item 3.3.5. No 18° dia da lactação, retirou-se amostras de leite das mães,

conforme descrito no item 3.3.6, que foram processadas, conforme descrito no item

3.3.10.2.

No 18° dia de lactação, no período noturno, a ração das mães de todos os

grupos foi retirada. No 19° dia de lactação, no período da manhã, estas foram

anestesiadas para a coleta de sangue conforme descrito no item 3.3.8. Este material

foi processado para a realização das dosagens bioquímicas e de tiocianato,

conforme descrito nos itens 3.3.10.1 e 3.3.10.2, respectivamente. A seguir, estas

ratas foram submetidas à eutanásia para a coleta de material para estudo

histopatológico, conforme descrito no item 3.3.12.


No 18° dia da lactação, coletou-se amostra de sangue dos filhotes, como

descrito no item 3.3.8, para a análise bioquímica e dos níveis séricos de tiocianato,

como descrito no itens 3.3.10.1 e 3.3.10.2, respectivamente. Contudo, por ser a

amostra de sangue de cada filhote insuficiente para as várias análises bioquímicas,

optou-se por formar dois pools de amostras de soro de cada ninhada, formando-se

um para machos e outro para fêmeas. A coleta de órgãos para análise

histopatológica seguiu como descrito no item 3.3.12.

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA

As curvas de calibração e da concentração de tiocianato, nos diversos

líquidos biológicos, versus o tempo, obtidas após cada tratamento, foram

confeccionadas utilizando o programa GraphPad Prism 3.00 para Windows 95

(GRAPHAD PRISM, 1999).

Em relação aos dados toxicocinéticos, o pico de concentração máxima

(Cmax) do tiocianato nos diferentes meios biológicos estudados e o tempo para

atingir este pico (tmax) foram obtidos diretamente dos dados experimentais sem

interpolação dos mesmos. A área sob a curva (ASC) foi calculada pelo método dos

trapezóides lineares. Todos os outros parâmetros toxicocinéticos foram calculados

como descrito por Shargel e Yu (1993).

A avaliação da homocedasticidade dos dados, entre os diferentes grupos,

foi realizada pelo teste de Bartlett, diferenciando os dados paramétricos daqueles

não paramétricos (SPIEGEL, 1985). Para os dados paramétricos, empregou-se a


análise de variância ANOVA, proposta por Snedecor (1946), seguido pelo teste de

Dunnett, para comparação entre os diversos grupos experimentais e o grupo

controle; para as múltiplas comparações empregou-se o teste de Tukey, ou ainda, o

teste t para comparações entre dois grupos. Para a análise de contingência, foi

realizado o teste exato de Fisher.

A probabilidade de p< 0,05 foi considerada capaz de revelar diferença

significante entre os grupos. Para a análise estatística, empregou-se o programa

GraphPad Instat versão 3.00 para Windows 95 (GRAPHPAD INSTAT, 1998). Para a

estatística descritiva, são apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão

para os dados paramétricos.

Resultados 78

4 RESULTADOS

Resultados 79

4 RESULTADOS

4.1 EXPERIMENTO 1: VALIDAÇÃO DA METODOLOGIA PARA A DETERMINAÇÃO

DE TIOCIANATO, POR ESPECTROFOTOMETRIA, EM SORO, LEITE E

LÍQUIDO AMNIÓTICO DE RATOS

A linearidade do procedimento analítico foi testada nas concentrações de

25, 50, 75, 100, 200 e 300 mcmol/L de tiocianato de potássio (KSCN), em 10

amostras para cada concentração. O coeficiente de determinação (r2) obtido foi de

0,9947, a inclinação (slope) de 6,347 x 10 -4 e a interceptação do eixo y em 6,17 x

10-5 (figura 1).

A precisão intra laboratorial dos resultados obtidos pela metodologia

empregada, expressa pelo coeficiente de variação ou imprecisão (CV) intra e inter

dias, foi obtida pela análise dos níveis de tiocianato em amostras do padrão de 100

mcmol/L em água e em um pool de amostras de soro, leite e líquido amniótico,

processados seis vezes cada e em três dias diferentes. O CV variou de 1,2 a 3,7 %

intra dia e de 2,6 a 7,2 % inter dias (tabela 1). A recuperação do analito, o tiocianato,

pela metodologia empregada, conforme descrito no item 3.4.1, expressa em

porcentagem, foi de 99,7 e 97,5; 89,7 e 83,4; 98,0 e 82,1 para os meios biológicos

soro, leite e líquido amniótico, adicionados de solução padrão de KSCN nas

concentrações de 300 e 25 mcmol/L, respectivamente (tabela 1).

Resultados 80

y = 6,347 .10-4 x + 6,17 .10–-5 r2 = 0,9947

0 50 100 150 200 250 300 3500.0

0.1

0.2

0.3

concentração de tiocianato (mcmol/L)

abso

rbân

cia

(cor

rigi

da c

om b

ranc

o)

Figura 1 - Curva de calibração de solução aquosa de tiocianato de potássio (KSCN) nas concentrações de 25, 50, 75, 100, 200 e 300 mcmol/L

Resultados 81

Tabela 1 - Coeficientes de variação (CV), expresso em porcentagem, intra e inter dias

obtidos pela análise dos níveis de tiocianato de amostras do padrão de 100

mcmol/L em água e em um pool de amostras de soro, leite e líquido amniótico. A

recuperação (REC) do método, expressa em porcentagem, determinada por

meio da relação obtida entre as absorbâncias de amostras de soluções padrão

de tiocianato de potássio (KSCN) e de amostras de soro, leite e líquido amniótico

de ratas do grupo controle adicionadas das soluções padrão de KSCN nas

concentrações de 25 e 300 mcmol/L

Padrão de 100

mcmol/L de

tiocianato

Soro Leite Líquido

amniótico

CV intra dia 1,2 1,7 2,1 3,7

CV inter dias 2,6 4,8 3,6 7,2

REC

(300 mcmol/L) - 99,7 89,7 98,0

REC

(25 mcmol/L) - 97,5 83,4 82,1

Resultados 82

4.2 EXPERIMENTO 2: ESTUDO CINÉTICO DA TRANSFORMAÇÃO DO CIANETO

EM TIOCIANATO EM RATAS

Nenhum dos animais apresentou sinais de intoxicação com a dose

administrada de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN), em todos os experimentos

do estudo toxicocinético.

A tabela 2 mostra e a figura 2 ilustra o consumo médio de KCN por ratas

na fase de estro, no 14º dia de gestação e no 14º dia de lactação que receberam,

por via oral, na água de bebida, 3 mg/kg de KCN. A análise das variâncias revelou

não haver diferenças significantes (p>0,05), no consumo de KCN, nos diversos

tempos avaliados, em um mesmo grupo experimental, bem como entre a fase de

estro, no 14º dia de gestação e no 14º dia de lactação, em um mesmo horário.

Resultados 83

Tabela 2 - Consumo médio de cianeto de potássio (KCN), em mg, de ratas, em

diferentes fases fisiológicas: estrogênica, gestação e lactação. As

avaliações foram realizadas 0,5; 3; 6; 12 e 24 horas após a suspensão

da dieta hídrica, contendo 3 mg/kg de KCN. São apresentadas as

médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais em

cada tempo avaliado

Consumo de KCN (mg) Fases

Tempo da avaliação (h)

Estro Gestação Lactação

0,5 3,10 ± 0,22 3,02 ± 0,48 3,73 ± 0,21

3 2,88 ± 0,23 2,98 ± 0,20 2,85 ± 0,37

6 3,33 ± 0,20 3,40 ± 0,42 3,27 ± 0,43

12 3,13 ± 0,24 3,25 ± 0,35 3,04 ± 0,63

24 3,01 ± 0,17 3,08 ± 0,38 3,22 ± 0,74

Resultados 84

0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 40

3

6

A

t e m p o ( h )

cons

umo

de K

CN

(mg)

0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 40

3

6 B

t e m p o ( h )

cons

umo

de K

CN

(mg)

0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 40

3

6C

t e m p o ( h )

cons

umo

de K

CN

(mg)

Resultados 85

4.2.1 Avaliação em Ratas Fêmeas Virgens na Fase Estrogênica

A tabela 3 mostra e a figura 3 ilustra os níveis séricos de tiocianato

(mcmol/L) de ratas na fase de estro que receberam, por via oral, na água de bebida

ou gavage, 3 mg/kg de KCN, e cujas amostras de sangue foram coletadas nos

tempos zero e 30 minutos, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração de KCN. A

análise das variâncias revelou haver diferenças significantes (p<0,05) nos níveis

séricos de tiocianato. A aplicação do teste de Dunnett revelou que os níveis de

tiocianato se elevaram (p< 0,05) a partir do tempo 3 h e permaneceram elevados até

a última dosagem, 24 horas, por gavage (F = 48,24; df = 5/30) e água de bebida (F =

39,98; df = 5/30) quando comparados aos níveis antes da administração de KCN. A

concentração máxima (Cmax), por gavage, (162,05 ± 7,45 mcmol/L) e pela água de

bebida (139,55 ± 8,35 mcmol/l) foi observada em 3 e 6 horas (tmax),

respectivamente.

Ainda, a análise das variâncias revelou haver diferenças significantes

(p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato comparando-se a gavage à água de

bebida. A aplicação do teste t revelou aumento significativo (p<0,05) nos níveis

séricos de tiocianato no grupo que recebeu por gavage, nos tempos 3 e 24 h

(F=1,63; F=1,05, respectivamente).

Resultados 86

Tabela 3 – Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, na fase estrogênica, que receberam, por via oral, na água de bebida ou por gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais por tempo avaliado

Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L)

Tempo da avaliação (h)

Gavage Água de bebida

0 33,93 ± 3,70 33,93 ± 3,70

0,5 42,70 ± 7,51 45,00 ± 4,10

3,0 162,05 ± 7,45*; # 130,10 ± 9,50*

6,0 159,35 ± 10,15* 139,55 ± 8,35*

12,0 140,95 ± 9,55* 138,15 ± 8,45*

24,0 125,00 ± 9,70*; # 74,95 ± 9,45*

* p< 0,05 em relação aos valores antes da administração do KCN # p< 0,05 em relação aos valores da água de bebida, no mesmo tempo de avaliação

Resultados 87

0 3 6 9 1 2 1 5 1 8 2 1 2 40

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0 a g u a d e b e b id a

g a v a g e

* ** *

te m p o (h )

níve

is d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)

Figura 3 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, na fase estrogênica, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN)

*p<0,05 em relação aos valores antes da administração do KCN

Resultados 88

4.2.2 Avaliação na Gestação

A tabela 4 mostra e as figuras 4 e 5 ilustram os níveis de tiocianato sérico

e no líquido amniótico (mcmol/L), respectivamente, de ratas no 14º dia de gestação,

que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, 3 mg/kg de KCN, e cujas

amostras de sangue e líquido amniótico foram coletadas nos tempos zero e 30

minutos, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração de KCN. A análise das variâncias

revelou haver diferenças significantes (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato. A

aplicação do teste de Dunnett revelou que os níveis de tiocianato se elevaram (p<

0,05) a partir do tempo 3 h e permaneceram elevados até a penúltima dosagem, 12

horas, pela gavage (F = 23,16; df = 5/30) e água de bebida (F = 3,97; df = 5/30)

quando comparados aos níveis antes da administração de KCN.

A concentração máxima (Cmax), por gavage, (119,87 ± 4,30 mcmol/L), e

pela água de bebida (78,45 ± 10,39 mcmol/L) foi observada em 3 e 6 horas (tmax),

respectivamente. Ainda, a análise das variâncias revelou haver diferenças

significantes (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato, comparando-se a gavage à

água de bebida. A aplicação do teste t revelou aumento significativo (p<0,05) nos

níveis séricos de tiocianato no grupo que recebeu por gavage nos tempos 3 e 6 h

(F=3,98; F=2,70, respectivamente).

Em relação ao líquido amniótico, a análise das variâncias revelou haver

diferenças significantes (p<0,05) nos níveis de tiocianato neste meio biológico. A

aplicação do teste de Dunnett revelou que o nível de tiocianato se elevou (p< 0,05)

Resultados 89

no tempo 3 h, por gavage (F = 6,37; df = 5/30). A Cmax pela gavage (48,07 ± 5,31

mcmol/L) foi observada 3 horas após a administração do KCN. Ainda, a análise das

variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) nos níveis séricos de

tiocianato pela água de bebida e também comparando-se a gavage à água de

bebida.

Resultados 90

Tabela 4 – Níveis séricos e no líquido amniótico de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais por tempo avaliado

Níveis séricos de tiocianato

(mcmol/L)

Níveis no líquido amniótico de tiocianato

(mcmol/L)

Tempo da

avaliação (h)

Gavage Água de bebida Gavage Água de bebida

0 31,97 ± 7,24 31,97 ± 7,24 26,16 ± 1,94 26,16 ± 1,94

0,5 43,18 ± 6,88 36,93 ± 4,39 35,26 ± 3,23 28,61 ± 4,15

3 119,87 ± 4,30*; # 62,84 ± 8,58* 48,07 ± 5,31* 32,65 ± 4,97

6 111,86 ± 6,32*; # 78,45 ± 10,39* 27,60 ± 2,00 28,71 ± 3,04

12 70,90 ± 8,16* 66,12 ± 4,60* 27,30 ± 3,26 26,08 ± 2,00

24 50,07 ± 11,28 49,12 ± 11,30 28,27 ± 3,23 27,34 ± 3,96

*p< 0,05 em relação aos valores antes da administração do KCN # p< 0,05 em relação aos valores da água de bebida, no mesmo tempo e meio biológico avaliado

Resultados

91

0 3 6 9 12 15 18 21 240

50

100

150

gavage

água de bebida* *

*

tempo (h)

níve

is d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)

Figura 4 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN)

*p<0,05 em relação aos dados antes da administração do KCN

0 3 6 9 12 15 18 21 240

10

20

30

40

50

60

70

80

água de bebidagavage

*

tempo (h)

níve

is d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)

Resultados 92

4.2.3 Avaliação na Lactação

A tabela 5 mostra e as figuras 6 e 7 ilustram os níveis séricos e lácteos de

tiocianato (mcmol/L) de ratas lactantes, no 14º dia da lactação, que receberam, por

via oral, na água de bebida ou gavage, 3 mg/kg de KCN, e cujas amostras de

sangue e leite foram coletadas nos tempos zero e 30 minutos, 3, 6, 12 e 24 horas

após a administração de KCN. A análise das variâncias revelou haver diferenças

significantes (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato. A aplicação do teste de

Dunnett revelou que os níveis de tiocianato se elevaram (p< 0,05) a partir do tempo

3 h e permaneceram elevados até a última dosagem, 24 horas, pela gavage (F =

90,08; df =5/30) e pela água de bebida (F = 60,97; df = 5/30) quando comparados

aos níveis antes da administração de KCN. A Cmax pela gavage (145,41 ± 6,02

mcmol), e pela água de bebida (118,26 ± 5,23 mcmol) foi observada 6 e 12 horas

após a administração do KCN, respectivamente. Ainda, a análise das variâncias

revelou haver diferenças significantes (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato

comparando-se a gavage à água de bebida. A aplicação do teste t revelou aumento

significativo (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato no grupo que recebeu KCN por

gavage, nos tempos 3h e 6 h (F=3,13; F=1,83, respectivamente).

Em relação aos níveis lácteos, a análise das variâncias revelou haver

diferenças significantes (p<0,05) nos níveis de tiocianato neste meio biológico. A

aplicação do teste de Dunnett revelou que os níveis de tiocianato se elevaram de

forma significante (p< 0,05) a partir do tempo 0,5 h e permaneceram elevados até a

Resultados 93

última dosagem, 24 horas, tanto pela água de bebida quanto pela gavage (F =

33,68; F = 142,57 respectivamente; df = 5/30) quando comparados aos níveis antes

da administração de KCN. Ainda, a análise das variâncias revelou haver diferenças

significantes (p<0,05) nos níveis lácteos de tiocianato comparando-se a gavage à

água de bebida. A aplicação do teste t revelou aumento significativo (p<0,05) nos

níveis lácteos de tiocianato no grupo que recebeu pela água de bebida no tempo de

12 h (F = 1,27).

Resultados 94 Tabela 5 – Níveis séricos e lácteos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia da lactação, que receberam, por via oral, na água de

bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais por tempo avaliado

Níveis séricos de tiocianato

(mcmol/L)

Níveis lácteos de tiocianato

(mcmol/L

Tempo da

avaliação (h)

Gavage

Água de bebida

Gavage

Água de bebida

0 31,20 ± 2,21 31,20 ± 2,21 48,20 ± 2,20 48,20 ± 2,20

0,5 45,36 ± 3,25 38,80 ± 3,33 119,63 ± 6,57* 112,80 ± 2,20*

3 119,37 ± 5,27*; # 54,00 ± 2,98* 148,98 ± 8,26* 149,30 ± 3,32*

6 145,41 ± 6,02*; # 64,00 ± 4,45* 129,57 ± 5,25* 143,00 ± 4,45*

12 121,59 ± 5,98* 118,26 ± 5,23* 130,00 ± 4,78* 148,90 ± 4,25*; @

24 64,89 ± 5,58* 63,00 ± 4,57* 118,54 ± 7,08* 115,67 ± 2,03*

*p< 0,05 em relação aos valores antes da administração do KCN # p< 0,05 em relação aos valores da ág*ua de bebida, no mesmo tempo e meio biológico avaliado @p<0,05 em relação aos valores da gavage, no mesmo tempo e meio biológico avaliado

Resultados 95

Figura 6 – Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia da lactação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN)

*p<0,05 em relação aos dados obtidos antes da administração do KCN

0 3 6 9 12 15 18 21 240

50

100

150

200 gavage

água de bebida

tempo (h)

níve

is d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

) **

*

*

0 3 6 9 12 15 18 21 240

50

100

150

200gavage

água de bebida

** * *

*

te m po (h)

níve

is d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)

Figura 7 – Níveis lácteos de tiocianato (mcmol/L) de ratas, no 14º dia da lactação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN)

*p<0,05 em relação aos dados obtidos antes da administração do KCN

Resultados 96

A tabela 6 mostra e a figura 8 ilustra os níveis séricos de tiocianato

(mcmol/L) de ratas na fase de estro, no 14º dia de gestação e no 14º dia da

lactação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, 3 mg/kg de

KCN, e cujas amostras de sangue foram coletadas nos tempos zero e 30 minutos, 3,

6, 12 e 24 horas após a administração de KCN. A análise das variâncias revelou

haver diferenças significantes (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato. A aplicação

do teste de Tukey-Kramer revelou que os níveis de tiocianato, na forma de gavage,

foram superiores (p<0,05) nos tempo 3, 6, 12 e 24 h na fase de estro em relação às

gestantes (F = 17,69; F = 9,98; F = 20,28; F = 20,18; respectivamente; df = 2/15) e

em relação às lactentes nos tempos 3 e 24 h (F = 17,69; F = 20,18; respectivamente;

df = 2/15). As lactantes apresentaram níveis séricos superiores (p<0,05) em relação

às gestantes nos tempos 6 e 12 h (F = 9,98; F = 20,28; respectivamente; df = 2/15).

Em relação ao grupo que recebeu KCN pela água de bebida, a análise

das variâncias revelou haver diferenças significantes (p<0,05) nos níveis séricos de

tiocianato. A aplicação do teste de Tukey-Kramer revelou que os níveis de tiocianato

foram superiores (p<0,05) nos tempos 3, 6 e 12 h, na fase de estro em relação às

gestantes (F = 30,08; F = 24,43; F = 34,62; respectivamente; df = 2/15) e em relação

às lactantes nos tempos 3 e 6 h (F = 30,08; F = 24,43; respectivamente; df = 2/15).

As lactantes apresentaram níveis séricos superiores em relação às gestantes

(p<0,05) no tempo 12 h (F = 34,62; df = 2/15).

A tabela 7 mostra os parâmetros toxicocinéticos de ratas, calculados para

o tiocianato nos diferentes grupos estudados: na fase de estro, no 14º dia de

gestação e no 14º dia da lactação. Estes animais receberam, por via oral, na água

Resultados 97

de bebida ou gavage, 3 mg/kg de KCN, e cujas amostras de sangue foram coletadas

nos tempos zero e 30 minutos, 3, 6, 12 e 24 horas após a administração de KCN.

Os valores da Cmax de tiocianato, em mcmol/L, foram inferiores pela

água de bebida, nos experimentos em que ratas estavam na fase de estro (139,55),

na gestação (78,45) e na lactação (118,26) em relação à gavage: estro (162,05),

gestação (119,78) e lactação (145,00).

Os valores do tempo para atingir a Cmax (tmax), em horas, foram

superiores, pela água de bebida, nos experimentos em que ratas estavam na fase

de estro (6), gestação (6) e lactação (12) em relação à gavage: estro (3), gestação

(3) e lactação (6).

Os valores da área sob a curva (ASC), em mcmol.h/L, foram inferiores,

pela água de bebida, nos experimentos em que ratas estavam na fase de estro

(2393,43), gestação (1485,31) e lactação (1944,84) em relação à gavage: estro

(3257,39), gestação (1844,30) e lactação (2540,77).

Os valores da constante de eliminação (Kel), em h -1, foram superiores,

pela água de bebida, nos experimentos em que ratas estavam na fase de estro

(0,030), gestação (0,040) e lactação (0,055) em relação à gavage: estro (0,010),

gestação (0,010) e lactação (0,045).

O valor do clearance (Cl), em L.kg / h, foi superior, pela água de bebida,

no experimento em que ratas estavam na fase de estro (0,02) em relação à gavage

(0,01), e iguais nos experimentos da gestação e da lactação (0,01).

Os valores da meia vida de eliminação (t1/2 β), em horas, foram

inferiores, pela água de bebida, nos experimentos em que ratas estavam na fase de

estro (23,10), gestação (16,62) e lactação (12,60) em relação à gavage: estro

(49,50), gestação (69,3) e lactação (15,40).

Resultados 98

O valor do volume aparente de distribuição (Vd), em L/kg, foi inferior, pela

água de bebida, nos experimentos em que ratas estavam na fase de estro (0,64),

gestação (0,25) e lactação (0,18) em relação à gavage: estro e gestação (1,00) e

lactação (0,22).

Resultados 99Tabela 6 – Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L), de ratas, em diferentes fases fisiológicas: estrogênica, gestação e lactação, que

receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). As avaliações foram realizadas 0,5; 3; 6; 12 e 24 horas após a suspensão da dieta hídrica, contendo 3 mg/kg de KCN. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 6 animais por tempo avaliado

Tempo da

avaliação (h)


Estro

Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) Gestação

Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) Lactação

Gavage

Água de bebida

Gavage

Água de bebida

Gavage

Água de bebida

0 33,93 ± 3,70 33,93 ± 3,70 31,97 ± 7,24 31,97 ± 7,24 31,20 ± 2,21 31,20 ± 2,21

0,5 42,70 ± 7,51 45,00 ± 4,10 43,18 ± 6,88 36,93 ± 4,39 45,36 ± 3,25 38,80 ± 3,33

3 162,05 ± 7,45*; # 130,10 ± 9,50*; # 119,87 ± 4,30 62,84 ± 8,58 119,37 ± 5,27 54,00 ± 2,98

6 159,35 ± 10,15* 139,55 ± 8,35*; # 111,86 ± 6,32 78,45 ± 10,39 145,41 ± 6,02* 64,00 ± 4,45

12 140,95 ± 9,55* 138,15 ± 8,45* 70,90 ± 8,16 66,12 ± 4,60 121,59 ± 5,98* 118,26 ± 5,23*

24 125,00 ± 9,70*; # 74,95 ± 9,45 50,07 ± 11,28 49,12 ± 11,30 64,89 ± 5,58 63,00 ± 4,57

*p< 0,05 em relação ao grupo de ratas gestantes, pela mesma forma de administração #p< 0,05 em relação ao grupo de ratas lactantes, pela mesma forma de administração

Resultados 100

0 3 6 9 12 15 18 21 2410

100

1000 lactação

estro

gestação

GAVAGE

tempo (h)

log

níve

is s

éric

os d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)

0 3 6 9 12 15 18 21 2410

100

1000

gestação

lactação

estro

ÁGUA DE BEBIDA

tempo (h)

log

níve

is s

éric

os d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)

Figura 8 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L), de ratas, em diferentes fases fisiológicas: estrogênica, gestação e lactação, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN). As avaliações foram realizadas 0,5; 3; 6; 12 e 24 horas após a suspensão da dieta hídrica, contendo 3 mg/kg de KCN

Resultados 101Tabela 7 – Dados dos estudos toxicocinéticos do tiocianato em ratos, nas diferentes fases fisiológicas: estrogênica, gestacional e

lactacional, que receberam, por via oral, na água de bebida ou gavage, a dose de 3 mg/kg de cianeto de potássio (KCN) (Cmax: concentração máxima; tmax: tempo para atingir a Cmax; ASC: área sob a curva; Kel: constante de eliminação; Cl: clearance; t1/2β: meia-vida de eliminação; Vd: volume aparente de distribuição). Foram utilizados 6 animais por grupo

Fases

Estro Gestação Lactação

Parâmetros Água de bebida



Gavage

Cmax (mcmol/L) 139,55 162,05 78,45 119,87 118,26 145,00

tmax (h) 6 3 6 3 12 6

ASC0-24h(mcmol.h/L) 2393,43 3257,39 1485,31 1844,30 1944,84 2540,77

Kel (h-1) 0,030 0,010 0,040 0,010 0,055 0,045

Cl (L . kg/h) 0,02 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01

t1/2β (h) 23,10 49,50 16,62 69,30 12,60 15,40

Vd (L/kg) 0,64 1,00 0,25 1,00 0,18 0,22

Resultados 102

4.3 EXPERIMENTO 3: EFEITOS DA ADMINISTRAÇÃO, EM RATAS, DE KCN OU

KSCN, DURANTE O PERÍODO GESTACIONAL

As tabelas 8 e 9 mostram o peso médio e o ganho médio de peso (g)

corpóreo, respectivamente, de ratas gestantes que receberam, por via oral, na água

de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do

grupo controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período. A análise das

variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) entre os diversos

grupos experimentais comparados ao grupo controle.

A tabela 10 mostra o consumo médio de ração (g), nos diversos períodos

avaliados, de ratas gestantes que receberam, por via oral, na água de bebida,

diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo

controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período. A análise das



A tabela 11 mostra o consumo médio diário de água (mL) de ratas

gestantes que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN

ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo controle que recebeu somente

água filtrada no mesmo período. A análise das variâncias revelou não haver

diferenças significantes (p>0,05) entre os diversos grupos experimentais

comparados ao grupo controle.

A tabela 12 mostra e as figuras 9 e 10 ilustram o consumo médio de KCN

Resultados 103

ou KSCN (mg) de ratas gestantes que receberam, por via oral, na água de bebida,



variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) no consumo das

substâncias estudadas nos diversos dias analisados, em um mesmo grupo

experimental.

A tabela 13 mostra o desempenho reprodutivo de ratas gestantes que

receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do

6o ao 20o dia de gestação e do grupo controle que recebeu somente água filtrada no

mesmo período. A análise das variâncias revelou não haver diferenças significantes

(p>0,05) entre os diversos grupos experimentais comparados ao grupo controle em

relação aos seguintes parâmetros: peso médio materno no 20º dia de gestação,

peso médio do útero gravídico, peso materno sem o útero, peso médio das

placentas, peso dos fetos e das ninhadas, número de fetos vivos e mortos, sexo,

comprimento dos fetos, número de corpos lúteos, número de implantações e

reabsorções. Entretanto, houve maior porcentagem de perda pós-implantação nos

grupos que receberam 3 e 30 mg de KCN, com 15,43% e 18,28%, respectivamente,

em comparação ao grupo controle, com 8,08%.

A tabela 14 mostra e as figuras 11 e 12 ilustram os resultados das

dosagens bioquímicas de ratas gestantes que receberam, por via oral, na água de

bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo


variâncias revelou haver diferenças significantes (p<0,05) na concentração sérica de

glicose, e na atividade da enzima AST no grupo que recebeu a dose de 30 mg/kg/dia

de KCN (F=5,09; F=2,22, respectivamente, df=6/63, p<0,05). A aplicação do teste de

Resultados 104

Dunnett revelou aumento significante (p<0,05) nos níveis séricos de glicose e na

atividade da enzima AST dos animais do grupo acima descrito em relação ao grupo

controle. Em relação às concentrações de colesterol, uréia, creatinina e das

atividades das enzimas ALT e FA, a análise das variâncias revelou não haver

diferenças significantes (p>0,05) nos diversos grupos experimentais comparados ao

grupo controle.

A tabela 15 mostra e a figura 13 ilustra os níveis séricos de tiocianato de

ratas gestantes que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de

KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo controle que recebeu

somente água filtrada no mesmo período. A análise das variâncias revelou haver

diferenças significantes (p<0,05) nas concentrações séricas de tiocianato em todos

os grupos experimentais em comparação ao grupo controle. A aplicação do teste de

Dunnett revelou aumento significante (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato dos

animais dos grupos experimentais em relação ao grupo controle (F=70,19; df = 6/63,

p<0,05). Entretanto, não houve diferença significante (p>0,05), segundo o teste

estatístico de Tukey, comparando-se os grupos que receberam 1 e 0,8; 3 e 2,4; e 30

e 24 mg/kg/dia de KCN e KSCN, respectivamente.

A tabela 16 mostra a incidência de anomalias e malformações ósseas em

fetos de ratas gestantes que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes

doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo controle que

recebeu somente água filtrada no mesmo período. O teste exato de Fischer revelou

não haver diferenças significantes entre os diversos grupos experimentais quando

comparados ao grupo controle (p>0,05).

A tabela 17 mostra a avaliação do grau de desenvolvimento fetal, medido

pelo número dos centros de ossificação, de ratas gestantes que receberam, por via

Resultados 105

oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de

gestação e do grupo controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período.

A análise das variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) entre os

diversos grupos experimentais comparados ao grupo controle.

A tabela 18 mostra a incidência de anomalias e malformações viscerais

na prole de ratas gestantes que receberam, por via oral, na água de bebida,


controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período. Os resultados

mostraram que não foram verificadas malformações viscerais em nenhum grupo do

estudo. Com relação às anomalias viscerais, o teste exato de Fischer revelou haver

diferenças significantes (p<0,05) no número de fetos afetados no grupo experimental

que recebeu a maior dose de KCN, 30 mg/kg/dia, em relação ao grupo controle.

Entretanto, não houve aumento significativo no número de ninhadas afetadas.

A tabela 19 mostra a intensidade das lesões histológicas observadas em

ratas gestantes que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de

KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo controle que recebeu

somente água filtrada no mesmo período. A intensidade das lesões foi caracterizada

por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas,

(+++) lesões severas. A seguir, estão descritas as lesões encontradas.

As figuras 14 A e 14 B mostram fotomicrografia do corte histológico de rim

de rata gestante que recebeu, por via oral, na água de bebida, a dose de 24

mg/kg/dia de KSCN. O estudo histopatológico revelou congestão e hemorragia renal,

e nefrose. A figura 15 mostra fotomicrografia do corte histológico de rim de rata

gestante que recebeu, por via oral, na água de bebida, a dose de 30 mg/kg/dia de

KCN. O estudo histopatológico revelou hemorragia e hemossiderose no tecido renal.

Resultados 106

A congestão renal também foi verificada nos grupos que receberam 1 e 3 mg/kg/dia

de KCN e 2,4 mg/kg/dia de KSCN de forma branda e de forma moderada no grupo

que recebeu 30 mg/kg/dia de KCN e 24 mg/kg/dia de KSCN. No grupo controle e

naquele que recebeu 0,8 mg/kg/dia de KSCN, não foram observadas alterações

histológicas dignas de nota.

A figura 16 mostra fotomicrografia do corte histológico de fígado de rata


KSCN. O estudo histopatológico revelou congestão hepática, vacuolização de

hepatócitos e proliferação dos ductos biliares. A figura 17 mostra fotomicrografia do

corte histológico de fígado de rata gestante que recebeu, por via oral, na água de

bebida, a dose de 30 mg/kg/dia de KCN. O estudo histopatológico revelou congestão

e vacuolização de hepatócitos. Nos grupos que receberam a dose de 1 e 3

mg/kg/dia de KCN e 2,4 mg/kg/dia de KSCN observou-se congestão hepática de

forma branda; no grupo que recebeu 3 mg/kg/dia de KCN, verificou-se também

vacuolização de hepatócitos de forma branda. Nos grupos controle e aquele que

recebeu a menor dose de KSCN, 0,8 mg/kg/dia, não foram observadas alterações

histológicas dignas de nota.

As figuras 18 A, 18 B e 18 C mostram fotomicrografia do corte histológico

do SNC de ratas gestantes que receberam, por via oral, na água de bebida, a dose

de 30 mg/kg/dia de KCN. O estudo histopatológico revelou congestão e áreas

hemorrágicas, neuronofagia, gliose difusa e necrose. A figura 19 mostra

fotomicrografia do corte histológico do SNC de rata gestante que recebeu, por via

oral, na água de bebida, a dose de 24 mg/kg/dia de KSCN. O estudo histopatológico

revelou congestão, vacuolização discreta em substância branca do cerebelo. No

grupo que recebeu 3 mg/kg/dia de KCN, verificou-se congestão e no grupo que

Resultados 107

recebeu 2,4 mg/kg/dia de KSCN, gliose neste tecido. No grupo controle e nos grupos

que receberam a menor dose de KCN, 1,0 mg/kg/dia, e KSCN, 0,8 mg/kg/dia, não

foram observadas alterações histológicas dignas de nota.

A figura 20 mostra fotomicrografia do corte histológico de tireóide de rata


KCN. O estudo histopatológico deste órgão revelou grande aumento na quantidade

de vacúolos de reabsorção no colóide dos folículos tireoidianos. Nos animais dos

demais grupos experimentais, estas alterações também foram encontradas de forma

dose dependente. No grupo controle não foram observadas alterações histológicas

dignas de nota.

A figura 21 mostra fotomicrografia do corte histológico de pâncreas de

rata gestante que recebeu, por via oral, na água de bebida, a dose de 30 mg/kg/dia

de KCN e a figura 22 mostra fotomicrografia do corte histológico de pâncreas de rata

gestante do grupo controle, para comparação. O estudo histopatológico deste órgão

revelou perda de células nas ilhotas de Langerhans. Nos demais grupos

experimentais e no grupo controle, não foram observadas alterações histológicas

dignas de nota.

O estudo histopatológico do baço e dos pulmões dos grupos

experimentais e controle não revelou alteração significante nestes órgãos.

Resultados 108Tabela 8 – Peso médio corpóreo (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio

(KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação

Controle FEC 1 FEC2 FEC3 FES1 FES2 FES3

0 232,11 ± 6,52 228,60 ± 7,31 225,80 ± 7,31 224,13 ± 6,41 230,80 ± 6,19 234,11 ± 5,63 226,00 ± 8,30

6 241,56 ± 6,37 238,70 ± 7,95 235,70 ± 8,71 234,13 ± 7,28 240,10 ± 7,37 245,22 ± 6,45 236,44 ± 8,47

8 242,22 ± 6,18 242,00 ± 8,60 239,90 ± 8,90 236,25 ± 7,07 241,50 ± 7,84 247,44 ± 7,35 237,44 ± 8,44

10 249,22 ± 7,77 248,30 ± 8,28 244,00 ± 9,11 241,75 ± 7,56 244,60 ± 8,67 251,78 ± 7,83 241,56 ± 8,15

12 255,33 ± 7,51 253,40 ± 8,50 249,40 ± 9,74 248,38 ± 7,62 253,70 ± 8,63 256,44 ± 6,62 246,33 ± 7,66

14 257,22 ± 7,90 258,20 ± 8,18 254,20 ± 8,57 254,75 ± 7,65 259,80 ± 9,29 263,33 ± 8,41 256,56 ± 8,53

16 271,44 ± 8,60 269,90 ± 8,59 265,10 ± 8,40 267,13 ± 8,06 268,70 ± 8,45 272,67 ± 10,10 264,78 ± 8,18

18 289,00 ± 9,62 287,60 ± 9,14 280,40 ± 9,01 283,75 ± 8,35 284,90 ± 9,63 291,11 ± 11,84 281,22 ± 8,71

20 307,00 ± 12,17 300,10 ± 11,34

296,70 ± 12,31

300,38 ± 10,15 295,70 ± 9,66 307,11 ±

10,78 295,00 ± 9,31

Resultados 109

Tabela 9 – Ganho médio de peso corpóreo (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Período da avaliação

Controle

FEC 1

FEC2

FEC3

FES1

FES2

FES3

00 H 06 9,00 ± 1,70 10,10 ± 1,93 9,90 ± 2,65 10,00 ± 1,63 9,30 ± 2,01 11,11 ± 1,79 10,44 ± 1,17

06 H 14 19,22 ± 2,63 19,50 ± 1,62 18,50 ± 1,40 20,00 ± 1,55 19,70 ± 2,89 17,78 ± 3,12 18,67 ± 1,26

14 H 20 46,67 ± 5,59 41,90 ± 7,76 42,50 ± 5,36 46,25 ± 4,68 35,90 ± 3,80 44,11 ± 3,48 39,89 ± 2,03

00 H 20 74,89 ± 8,38 71,50 ± 7,12 70,90 ± 8,06 76,25 ± 5,84 64,90 ± 5,63 73,00 ± 6,88 69,00 ± 3,39

Resultados 110

Tabela 10 - Consumo médio de ração (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo


Controle

FEC1

FEC2

FEC3

FES1

FES2

FES3

06 H 09 60,33 ± 4,26 58,70 ± 2,63 49,60 ± 2,73 49,00 ± 3,20 45,50 ± 4,73 50,11 ± 3,41 51,89 ± 4,32

09 H 12 56,33 ± 1,53 57,80 ± 2,02 55,30 ± 2,48 58,25 ± 2,48 58,90 ± 3,51 59,89 ± 2,19 59,11 ± 3,84

12 H 15 65,44 ± 3,10 64,00 ± 2,39 60,10 ± 2,28 61,38 ± 3,00 68,90 ± 6,57 67,22 ± 2,74 64,67 ± 2,68

15 H 18 68,33 ± 4,58 71,00 ± 3,65 71,20 ± 3,18 70,00 ± 2,99 63,80 ± 5,65 67,78 ± 6,13 73,33 ± 4,45

06 H 18 60,76 ± 2,39 59,58 ± 2,24 58,90 ± 2,82 60,40 ± 3,15 57,66 ± 2,55 60,04 ± 2,34 59,44 ± 2,60

Resultados 111

Tabela 11 - Consumo médio diário de água (mL) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação

Controle

FEC 1

FEC2

FEC3

FES1

FES2

FES3

7 33,33 ± 4,09 37,00 ± 5,22 30,70 ± 3,02 28,50 ± 4,20 29,00 ± 2,19 31,22 ± 2,41 32,10 ± 4,90

8 33,56 ± 4,24 30,90 ± 5,10 28,50 ± 2,78 24,50 ± 1,35 29,80 ± 3,19 32,78 ± 3,57 29,70 ± 4,81

9 32,44 ± 2,80 37,20 ± 7,03 28,40 ± 2,38 26,63 ± 1,40 33,20 ± 4,77 36,11 ± 3,63 29,90 ± 4,06

10 38,89 ± 3,39 41,00 ± 6,74 29,80 ± 1,24 31,00 ± 4,04 34,80 ± 3,84 35,22 ± 3,22 27,90 ± 3,56

11 37,11 ± 2,71 41,20 ± 8,32 38,20 ± 3,17 32,63 ± 2,66 41,10 ± 3,13 47,22 ± 7,28 32,80 ± 5,14

12 41,11 ± 3,94 39,10 ± 3,35 43,60 ± 4,75 33,63 ± 3,76 46,30 ± 6,34 44,78 ± 4,54 39,20 ± 7,04

13 47,33 ± 3,63 45,00 ± 7,50 44,40 ± 5,14 26,50 ± 2,40 52,30 ± 9,49 47,67 ± 5,39 33,20 ± 4,94

14 42,33 ± 3,13 44,70 ± 5,16 42,50 ± 3,28 32,13 ± 1,55 44,50 ± 5,90 52,22 ± 6,52 42,30 ± 7,74

15 49,78 ± 6,15 50,00 ± 5,11 50,20 ± 4,24 36,50 ± 2,84 45,90 ± 4,80 51,89 ± 6,27 55,80 ± 11,11

16 51,22 ± 4,19 55,60 ± 5,94 50,30 ± 5,93 41,25 ± 3,91 51,20 ± 7,26 51,33 ± 5,04 45,20 ± 6,33

17 48,22 ± 4,50 53,50 ± 5,62 49,90 ± 3,14 40,25 ± 4,26 51,40 ± 3,89 61,00 ± 10,29 52,90 ± 8,84

18 47,44 ± 3,53 54,10 ± 9,62 49,20 ± 4,26 43,63 ± 3,85 55,80 ± 4,43 68,33 ± 10,45 56,20 ± 9,45

19 49,78 ± 4,08 49,10 ± 5,05 57,80 ± 8,87 46,13 ± 4,72 51,60 ± 4,34 52,33 ± 3,05 55,10 ± 9,34

20 36,33 ± 5,29 41,50 ± 5,27 39,10 ± 8,19 40,63 ± 5,10 32,10 ± 4,79 32,51 ± 3,60 38,30 ± 6,20

Resultados 112Tabela 12 – Consumo médio diário de cianeto de potássio (KCN) ou tiocianato de potássio (KSCN) (mg) de ratas que receberam, por via

oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação

FEC 1

FEC2

FEC3

FES1

FES2

FES3

7 1,11 ± 0,12 3,82 ± 0,28 33,72 ± 3,21 0,81 ± 0,09 2,60 ± 0,18 30,90 ± 3,41

8 0,89 ± 0,13 2,80 ± 0,20 29,45 ± 3,33 0,84 ± 0,09 2,55 ± 0,25 22,98 ± 1,95

9 1,33 ± 0,15 3,60 ± 0,32 33,37 ± 2,43 0,93 ± 0,08 2,70 ± 0,20 26,94 ± 3,20

10 1,13 ± 0,14 3,35 ± 0,33 34,84 ± 3,68 0,95 ± 0,09 2,43 ± 0,22 22,65 ± 2,86

11 1,01 ± 0,11 3,88 ± 0,31 33,52 ± 2,84 1,00 ± 0,09 2,13 ± 0,24 28,10 ± 2,32

12 1,10 ± 0,11 3,57 ± 0,32 32,73 ± 3,37 0,88 ± 0,07 2,45 ± 0,22 28,62 ± 2,43

13 1,12 ± 0,09 3,14 ± 0,29 25,29 ± 3,02 0,91 ± 0,09 2,61 ± 0,23 21,83 ± 1,93

14 1,04 ± 0,09 3,04 ± 0,25 39,74 ± 3,67 0,75 ± 0,06 2,62 ± 0,20 30,13 ± 2,02

15 1,18 ± 0,10 3,71 ± 0,25 33,87 ± 1,41 0,86 ± 0,06 2,42 ± 0,21 31,40 ± 1,92

16 1,13 ± 0,09 3,01 ± 0,25 34,44 ± 2,90 0,91 ± 0,09 2,43 ± 0,28 22,25 ± 2,67

17 0,97 ± 0,09 3,20 ± 0,26 30,43 ± 3,37 0,89 ± 0,09 2,76 ± 0,22 28,83 ± 3,18

18 0,98 ± 0,09 2,95 ± 0,28 34,78 ± 3,62 0,88 ± 0,06 2,76 ± 0,19 26,75 ± 3,48

19 0,91 ± 0,11 3,46 ±0,26 32,33 ± 2,89 0,75 ± 0,08 2,09 ± 0,22 25,35 ± 2,87

20 0,83 ± 0,09 3,42 ± 0,29 26,23 ± 3,50 0,88 ± 0,09 1,99 ± 0,24 17,49 ± 1,97

Resultados 113

Figura 9 - Consumo médio de cianeto de potássio (KCN), em mg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de KCN: 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); do 6o ao 20o dia de gestação

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 210

1

FEC1

FEC2

FEC3

3579

20304050

d ia d a avaliação

dose

de

cian

eto

(mg)

Figura 10 - Consumo médio de tiocianato de potássio (KSCN), em mg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de KSCN: 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 210 .0

0 .8

1 .6

F E S 3

F E S 2

F E S 1

2 .4

4 .4

24

34

44

d ia d a a va lia çã o

dose

de

tioci

anat

o (m

g)

Resultados 114Tabela 13 – Desempenho reprodutivo médio de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de

potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Parâmetro Controle FEC1 FEC2 FEC3 FES1 FES2 FES3

Peso médio materno (g) no 20° dia

de gestação 307,00 ± 12,17 300,10 ± 11,34 296,70 ± 12,31 300,38 ± 10,15 295,70 ± 9,66 307,11 ± 10,78 295,00 9,31

Peso médio do útero gravídico (g) 63,06 ± 6,54 74,612 ± 4,04 58,54 ± 7,26 60,81 ± 8,38 58,89 ± 5,47 69,08 ± 4,53 60,60 ± 7,13

Peso médio materno sem o útero (g) 239,33 ± 6,57 224,50 ± 8,21 239,10 ± 10,6 222,90 ± 5,08 229,30 ± 5,87 232,70 ± 8,02 221,80 ± 6,79

Peso médio da placenta (g) 0,57 ± 0,03 0,51 ± 0,03 0,51 ± 0,03 0,54 ± 0,03 0,52 ± 0,02 0,54 ± 0,01 0,57 ± 0,01

Peso médio fetal (g) 4,61 ± 0,13 4,80 ± 0,10 4,88 ± 0,10 4,74 ± 0,09 4,57 ± 0,13 4,69 ± 0,07 4,65 ± 0,09

Peso médio da ninhada (g) 53,66 ± 3,27 51,85 ± 5,22 43,67 ± 2,98 45,21 ± 3,59 43,06 ± 3,19 45,91 ± 3,19 44,93 ± 2,78

N° de fetos vivos 9,10 ± 1,01 10,33 ± 0,55 8,88 ± 0,75 8,63 ± 0,59 9,70 ± 0,88 9,70 ± 0,64 9,70 ± 0,63

N° fetos mortos 0 0 0 0 0 0 0

N° de fetos machos 3,90 ± 0,65 4,66 ± 0,57 5,22 ± 0,40 4,87 ± 0,44 4,10 ± 0,45 4,77 ± 0,57 4,1 ± 0,58

N° de fetos fêmeas 5,20 ± 0,80 5,66 ± 0,66 3,67 ± 0,50 3,75 ± 0,88 4,60 ± 0,60 5,00 ± 0,74 5,60 ± 0,70

Comprimento dos fetos (cm) 3,93 ± 0,08 4,00 ± 0,03 3,93 ± 0,04 4,00 ± 0,03 3,91 ± 0,04 3,96 ± 0,04 3,86 ± 0,05

N° de corpos lúteos 11,10 ± 0,64 12,67 ± 1,24 12,04 ± 1,12 11,11 ± 0,87 11,70 ± 0,91 11,67 ± 1,16 11,50 ± 0,81

N° de implantações 9,90 ± 1,04 11,33 ± 0,55 10,50 ± 1,12 10,56 ± 1,26 10,80 ± 0,59 10,78 ± 0,72 10,80 ± 0,42

N° de reabsorções 0,90 ± 0,23 1,00 ± 0,53 1,40 ± 0,43 0,89 ± 0,34 1,50 ± 0,52 2,22 ± 0,94 1,10 ± 0,43

% de perda pré-implantação 10,81 10,58 12,79 4,95 7,69 7,63 6,09

% de perda pós-implantação 8,08 8,83 15,43 18,28 10,19 10,02 10,18

Resultados 115

Tabela 14 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L): alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Glicose Colesterol Uréia Creatinina ALT FA AST

Controle 81,38 ± 7,04 63,85 ± 15,98 16,73 ± 3,69 0,84 ± 0,12 31,86 ± 5,66 159,20 ± 23,28 105,16 ± 27,59

FEC1 84,57 ± 9,49 65,94 ± 14,66 11,26 ± 3,09 0,58 ± 0,08 35,03 ± 6,41 130,48 ± 26,02 114,23 ± 32,36

FEC2 84,11 ± 7,29 62,77 ± 14,95 18,41 ± 3,57 0,73 ± 0,13 37,67 ± 4,43 162,43 ± 24,58 134,80 ± 33,26

FEC3 112,13 ± 7,56* 60,08 ± 13,28 18,87 ± 3,12 1,00 ± 0,10 32,33 ± 8,12 155,60 ± 27,27 159,58 ± 33,97*

FES1 70,57 ± 7,10 61,97 ± 12,47 16,83 ± 3,48 0,97 ± 0,09 38,68 ± 4,92 202,25 ± 22,16 110,41 ± 36,43

FES2 61,71 ± 6,11 62,42 ± 15,48 19,46 ± 3,35 0,86 ± 0,09 31,28 ± 7,69 175,82 ± 23,30 141,73 ± 34,84

FES3 67,59 ± 6,37 69,58 ± 11,09 18,93 ± 3,14 0,90 ± 0,10 30,90 ± 4,76 196,15 ± 25,33 144,35 ± 35,33

*p<0,05 em relação ao grupo controle (ANOVA seguido por Dunnettt)

Resultados 116

Figura 12 - Atividade da enzima aspartato aminotransferase (AST) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação

*p<0,05 em relação ao grupo controle

Controle FEC1 FEC2 FEC3 FES1 FES2 FES30

25

50

75

10 0

12 5 *

níve

is s

éric

os d

e gl

icos

e(m

g/dL

)

Figura 11 - Níveis séricos de glicose (mg/dL) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação



5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

*

AST

(U/L

)

Resultados 117

Tabela 15 – Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas que receberam, por via

oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Grupos


Controle 32,71 ± 3,98

FEC1 81,43 ± 9,20*

FEC2 167,90 ± 9,37*

FEC3 262,50 ± 9,61*

FES1 96,09 ± 10,02*

FES2 141,88 ± 11,00*

FES3 228,50 ± 12,99*

*p<0,05 em relação ao grupo controle (ANOVA seguido por Dunnettt)

Resultados 118


100

200

300

*

*

*

*

*

*

*

níve

is s

éric

os d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)

Resultados 119 Tabela 16 – Incidência de anomalias e malformações ósseas em fetos de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes

doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as freqüências de ocorrência


Malformações esqueléticas

Fetos afetados Ninhadas afetadas

0/40 0/10

0/40 0/10

0/40 0/10

0/40 0/10

0/40 0/10

0/40 0/10

0/40 0/10

Anomalias esqueléticas

Fetos afetados

Ninhadas afetadas

23/40

6/10

20/40

5/10

28/40

5/10

26/40

6/10

27/40

6/10

21/40

6/10

23/40

5/10

Ossificação craniana reduzida

8/40

8/40

8/40

11/40

5/40

5/40

10/40

Anomalias do esterno 10/40 12/40 12/40 12/40 11/40 13/40 13/40

Anomalias vertebrais 6/40 8/40 9/40 7/40 13/40 8/40 6/40

Anomalias das costelas 0/40 0/40 2/40 2/40 0/40 0/40 0/40

Resultados 120

Tabela 17 – Número de centros de ossificação da prole de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram analisados 40 fetos por grupo

Centros de ossificação


Metacarpo direito 3,99 ± 0,01 3,99 ± 0,01 3,95 ± 0,25 3,99 ± 0,01 3,99 ± 0,01 3,99 ± 0,01 3,99 ± 0,01

Metacarpo esquerdo 3,99 ± 0,01 3,99 ± 0,01 3,95 ± 0,26 3,99 ± 0,01 3,99 ± 0,01 3,99 ± 0,01 3,99 ± 0,01

Falange anterior direita 3,43 ± 0,88 3,94 ± 0,35 3,87 ± 0,47 3,78 ± 0,57 3,80 ± 0,57 3,94 ± 0,25 3,76 ± 0,65

Falange anterior esquerda 3,47 ± 0,88 3,94 ± 0,35 3,88 ± 0,45 3,78 ± 0,35 3,77 ± 0,63 3,85 ± 0,53 3,70 ± 0,84

Metatarso direito 4,91 ± 0,30 4,99 ± 0,01 4,97 ± 0,18 4,96 ± 0,19 4,89 ± 0,30 4,97 ± 0,18 4,91 ± 0,28

Metatarso esquerdo 4,91 ± 0,30 4,94 ± 0,35 4,96 ± 0,80 4,92 ± 0,27 4,92 ± 0,27 4,85 ± 0,53 4,94 ± 0,25

Abertura cervical 1,79 ± 0,19 1,87 ± 0,16 1,77 ± 0,165 1,86 ± 0,14 1,84 ± 0,13 1,86 ± 0,13 1,84 ± 0,13

Resultados 121

Tabela 18 - Incidência de anomalias e/ou malformações viscerais na prole de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as freqüências de ocorrência


Malformações viscerais

Fetos afetados 0/40 0/40 0/40 0/40 0/40 0/40 0/40 Ninhadas afetadas 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 Anomalias viscerais

Fetos afetados 10/40 18/40 6/40 20/40* 6/40 15/40 12/40 Ninhadas afetadas

6/10 7/10 5/10 6/10 5/10 6/10 5/10

Ureteres dilatados 1/40 7/40 3/40 5/40 2/40 3/40 5/40

Ureteres sinuosos 7/40 11/40 5/40 6/40 3/40 8/40 8/40

Hemorragia peritoneal 2/40 2/40 1/40 4/40 2/40 3/40 2/40

Hipertrofia do esôfago 2/40 0/40 0/40 7/40 1/40 4/40 2/40

* p< 0,05 (Teste exato de Fischer)

Resultados 122Tabela 19 – Intensidade das lesões histológicas observadas em ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, as diferentes doses de

cianeto de potássio (KCN): 1 (FEC1); 3 (FEC2) e 30 mg/kg (FEC3); ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FES1); 2,4 (FES2) e 24 mg/kg (FES3); do 6o ao 20o dia de gestação. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas. Foram avaliados 3 fetos por grupo


Tecido renal

Congestão renal - + + ++ - + ++

Nefrose - - - - - - ++

Hemorragia renal - - - + - - +

Hemossiderose - - - + - - -

Tecido hepático

Congestão hepática - + + ++ - + -

Vacuolização de hepatócitos - - + + - - +

Proliferação dos ductos biliares - - - - - - +

Tecido nervoso

Congestão no SNC - - + ++ - - +

Neuronofagia - - - + - - +

Áreas hemorrágicas no SNC - - - + - - -

Gliose - - - ++ - + ++

Necrose - - - + - - -

Tecido pancreático

Depleção de células das ilhotas de Langerhans - - - ++ - - - Tireóide Aumento de reabsorção no colóide dos folículos - + ++ +++ + ++ +++

Resultados 123

A

B

Figuras 14A e 14B - Fotomicrografia de corte histológico do rim de rata, que recebeu 24 mg/kg/dia de KSCN, na água de bebida, do 6º ao 20º dia da gestação, mostrando congestão (C), hemorragia (H) e nefrose (N) (HE, 20 X)

N

H

C

Resultados 124

Figura 15- Fotomicrografia de corte histológico do rim de rata, que recebeu 30

mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando hemorragia e hemossiderose (seta) (HE, 20 X)

Resultados 125

Figura 16 - Fotomicrografia de corte histológico do fígado de rata, que recebeu 24

mg/kg/dia de KSCN, na água de bebida, do 6º ao 20º dia da gestação, mostrando vacuolização de hepatócitos e proliferação de ductos biliares (seta) (HE, 20 X)

Figura 17 - Fotomicrografia de corte histológico do fígado de rata, que recebeu 30 mg

mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando vacuolização de hepatócitos e congestão (HE, 10 X)

Resultados 126

Figura 18A - Fotomicrografia de corte histológico do sistema nervoso central de rata,

que recebeu 30 mg mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando necrose neuronal (setas) (HE, 20 X)

Figura 18B - Fotomicrografia de corte histológico do sistema nervoso central de rata,

que recebeu 30 mg mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6º ao 20º dia da gestação, mostrando congestão, focos hemorrágicos (seta) e gliose difusa (HE, 10 X)

Resultados 127

Figura 18C - Fotomicrografia de corte histológico do sistema nervoso central de rata,

que recebeu 30 mg mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando gliose nodular focal e neuronofagia (seta) (HE, 20 X)

Figura 19 - Fotomicrografia de corte histológico do sistema nervoso central de rata, que recebeu 24 mg/kg/dia de KSCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando vacuolização discreta em substância branca do cerebelo e congestão (seta) (HE, 10 X)

Resultados 128

Figura 20 - Fotomicrografia de corte histológico da tireóide de rata, que recebeu 30

mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando aumento no número de vacúolos de reabsorção no colóide dos folículos tireoideanos (HE, 10 X)

Resultados 129

Figura 21 - Fotomicrografia de corte histológico do pâncreas de rata, que recebeu 30

mg/kg/dia de KCN, na água de bebida, do 6° ao 20º dia da gestação, mostrando depleção de células nas ilhotas de Langerhans (Ξ) (HE, 20 X)

Figura 22 - Fotomicrografia de corte histológico do pâncreas de rata do grupo controle

(HE, 20 X)

Resultados 130


KSCN DURANTE O PERÍODO GESTACIONAL. AVALIAÇÃO PÓS-NATAL

As tabelas 20 e 21 mostram o peso médio e o ganho médio de peso

corpóreo (g), respectivamente, de ratas que receberam, por via oral, na água de

bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação, e do grupo

controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período, e submetidas à

eutanásia no 22º dia pós-parto. A análise das variâncias revelou não haver




avaliados, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses

de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação, e do grupo controle que recebeu

somente água filtrada no mesmo período, e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-

parto. A análise das variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05)

entre os diversos grupos experimentais comparados ao grupo controle.

A tabela 23 mostra o consumo médio diário de água (mL) de ratas que

receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do

6o ao 20o dia de gestação e do grupo controle que recebeu somente água filtrada no

mesmo período, e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. A análise das



Resultados 131

A tabela 24 mostra e as figuras 23 e 24 ilustram o consumo médio de

KCN ou KSCN (mg), respectivamente, de ratas que receberam, por via oral, na água

de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do

grupo controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período, e submetidas

à eutanásia no 22º dia pós-parto. A análise das variâncias revelou não haver

diferenças significantes (p>0,05) no consumo das substâncias estudadas nos

diversos dias analisados, em um mesmo grupo experimental.

A tabela 25 mostra o desempenho reprodutivo de ratas que receberam,

por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia

de gestação e do grupo controle que recebeu somente água filtrada no mesmo

período, e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. A análise das variâncias

revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) entre os diversos grupos

experimentais comparados ao grupo controle em relação aos seguintes parâmetros:

número de fetos vivos e mortos, sexo e peso da ninhada.

As tabelas 26 e 27 mostram o peso médio corpóreo e o ganho de peso

(g), respectivamente, de ninhadas de ratas que receberam, por via oral, na água de

bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo





A tabela 28 mostra o peso médio do cérebro e do cerebelo de filhotes,

com 22 dias de idade, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida,



Resultados 132




A tabela 29 mostra e a figura 25 ilustra os resultados das dosagens

bioquímicas de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes

doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo controle que

recebeu somente água filtrada no mesmo período, e submetidas à eutanásia no 22º

dia pós-parto. A análise das variâncias revelou haver diferenças significantes

(p<0,05) nas concentrações séricas de uréia e na atividade da enzima alanina

aminotransferase. A aplicação do teste de Dunnett revelou aumento significante

(p<0,05) nos níveis séricos da uréia dos animais do grupo que recebeu a dose de 30

mg/kg/dia de KCN (F=10,485; df=6/63) em relação ao grupo controle. Também, a

aplicação do teste de Dunnett revelou aumento significante (p<0,05) na atividade da

enzima alanina aminotransferase do grupo que recebeu a dose de 30 mg/kg/dia de

KCN (F=3,46; df=6/63) em relação ao grupo controle. Nas demais dosagens não

houve diferenças significantes (p>0,05).

As tabelas 30 e 31 mostram os resultados das dosagens bioquímicas de

filhotes machos e fêmeas, respectivamente, com 22 dias de idade, de ratas que

receberam de ratas, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN ou

KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e do grupo controle que recebeu somente água

filtrada no mesmo período, e submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto. A análise

das variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) nas diversas

análises bioquímicas.

A tabela 32 mostra e a figura 26 ilustra os níveis séricos de tiocianato de

ratas, e suas respectivas proles, que receberam, por via oral, na água de bebida,

Resultados 133




diferenças significantes (p>0,05) nas concentrações séricas de tiocianato dentro de

um mesmo grupo experimental e no grupo controle. Em contrapartida, a análise das

variâncias revelou haver diferenças significantes (p<0,05) nas concentrações séricas

de tiocianato comparando-se os grupos das progenitores e seus respectivos filhotes.

A aplicação do teste de Tukey-Kramer revelou aumento significante (p<0,05) nos

níveis séricos de tiocianato dos filhotes, tanto de machos quanto de fêmeas nos

grupos: controle (F=25,64; df=2/27); DC1 (F=23,10; df=2/27); DC2 (F=37,37;

df=2/27); DC3 (F=21,95; df=2/27); DS1 (F=14,40; df=2/27); DS2 (F=23,35; df=2/27);

DS3 (F=12,05; df=2/27) em relação às lactantes. Também, a análise das variâncias

revelou haver diferenças significantes (p<0,05) nas concentrações séricas de

tiocianato de filhotes machos e fêmeas. A aplicação do teste t revelou aumento

significante (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato de filhotes machos, em relação

às fêmeas, dos grupos de mães que receberam a dose de 3 e 30 mg/kg/dia de KCN

(F=1,63; F=1,77) em relação ao grupo controle. Nas demais dosagens não houve

diferenças significantes (p>0,05).

As tabelas 33 e 34 mostram a intensidade das lesões histológicas

observadas em ratas, e suas respectivas proles, que receberam, por via oral, na

água de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN, do 6o ao 20o dia de gestação e

do grupo controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período, e

submetidas à eutanásia no 22º dia pós-parto A intensidade das lesões foi

caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões

moderadas, (+++) lesões severas. As lesões encontradas neste experimento são

Resultados 134

bastante semelhantes às encontradas no experimento anterior, experimento 3,

exceto aquelas lesões encontradas no pâncreas, que aqui não foram evidenciadas.

Em relação aos filhotes, o estudo histopatológico revelou congestão renal,

hepática e no SNC, dos grupos de mães que receberam a dose de 3 mg/kg/dia de

KCN e 2,4 mg/kg/dia de KSCN, de forma branda, e de forma moderada no grupo

que recebeu 30 mg/kg/dia de KCN e 24 mg/kg/dia de KSCN. A vacuolização de

hepatócitos, proliferação dos ductos biliares e a neuronofagia foram evidenciadas de

forma branda e a gliose, de forma moderada, somente nos filhotes dos grupos de

mães expostas as maiores doses de KCN e KSCN, ou seja, 30 e 24 mg/kg/dia,

respectivamente. No grupo controle e nos demais grupos experimentais, não foram

observadas alterações histológicas dignas de nota.

As figuras anteriormente descritas, no experimento 3, também ilustram as

lesões encontradas no presente experimento.

Resultados 135

Tabela 20 – Peso médio corpóreo (g) de ratas, no período de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação

Controle DC1 DC2 DC3 DS1 DS2 DS3

0 227,90 ± 14,42 224,90 ± 18,00 220,20 ± 15,43 222,10 ± 17,07 177,00 ± 18,16 203,00 ± 15,23 222,80 ± 16,63

6 238,50 ± 3,78 231,30 ± 8,21 227,70 ± 6,26 232,20 ± 6,54 228,13 ± 7,33 235,00 ± 11,96 232,60 ± 6,55

8 240,20 ± 3,33 235,30 ± 9,03 234,80 ± 6,55 239,40 ± 6,46 231,00 ± 6,88 242,75 ± 11,45 231,90 ± 6,11

10 252,30 ± 3,59 240,80 ± 8,77 240,60 ± 7,37 243,60 ± 6,41 240,13 ± 6,24 251,38 ± 11,48 236,90 ± 7,30

12 257,90 ± 4,35 243,10 ± 9,20 247,10 ± 7,14 250,60 ± 6,39 247,38 ± 7,23 254,25 ± 11,30 242,60 ± 6,77

14 268,70 ± 4,80 251,10 ± 8,58 255,70 ± 6,71 260,50 ± 6,66 257,00 ± 6,95 266,50 ± 11,83 246,50 ± 7,13

16 284,20 ± 5,85 261,40 ± 9,28 276,20 ± 7,00 280,50 ± 7,84 273,13 ± 6,59 287,63 ± 11,18 260,50 ± 7,35

18 305,78 ± 6,03 281,60 ± 9,93 293,10 ± 7,21 299,00 ± 8,02 291,50 ± 6,73 309,63 ± 12,48 279,40 ± 7,74

20 312,80 ± 6,69 312,90 ± 11,02 302,70 ± 7,09 309,40 ± 8,11 301,75 ± 7,25 323,75 ± 13,65 306,60 ±10,64

Resultados 136

Tabela 21 - Ganho médio de peso corpóreo (g) de ratas, no período de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida,

diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo



00 H 06 10,60 ± 2,62 6,40 ± 2,32 7,50 ± 2,51 10,10 ± 2,94 9,44 ± 2,36 8,10 ± 2,80 9,80 ± 1,59

06 H 14 19,40 ± 2,45 19,80 ± 1,83 18,60 ± 1,94 18,40 ± 0,64 18,00 ± 0,96 18,60 ± 3,34 13,90 ± 2,34

14 H 20 54,90 ± 4,89 61,80 ± 3,59 56,40 ± 3,08 58,80 ± 3,09 56,78 ± 2,76 67,20 ± 3,76 60,10 ± 4,36

00 H 20 84,90 ± 5,58 88,00 ± 4,20 82,50 ± 3,99 87,30 ± 2,77 84,22 ± 3,43 93,90 ± 4,84 83,80 ± 6,07

Resultados 137

Tabela 22 – Consumo médio de ração (g) de ratas, no período de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo



06 H 09 75,50 ± 8,21 55,70 ± 13,06 70,80 ± 10,90 77,80 ± 10,73 46,44 ± 13,77 53,00 ± 10,40 56,10 ± 14,72

09 H 12 65,50 ± 5,69 54,80 ± 5,70 74,20 ± 5,89 75,80 ± 5,47 59,11 ± 5,95 54,70 ± 5,96 53,80 ± 5,65

12 H 15 64,90 ± 8,66 74,20 ± 8,37 77,70 ± 7,11 81,30 ± 8,81 61,33 ± 8,58 60,80 ± 8,47 62,70 ± 8,80

15 H 18 71,70 ± 8,58 71,30 ± 8,41 76,80 ± 8,76 92,80 ± 8,19 66,78 ± 8,54 71,80 ± 8,68 69,90 ± 8,73

18 H 20 73,00 ± 6,30 73,00 ± 4,06 80,80 ± 3,70 84,40 ± 3,87 68,78 ± 3,24 71,30 ± 2,85 72,50 ± 4,24

06 H 20 74,00 ± 4,78 65,80 ± 3,63 76,06 ± 14,99 82,42 ± 18,71 63,70 ± 3,18 62,47 ± 1,88 66,80 ± 3,15

Resultados 138

Tabela 23 - Consumo médio de água (mL/dia) de ratas, no período de gestação, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação


7 29,50 ± 1,68 30,30 ± 1,40 32,50 ± 3,38 30,00 ± 3,76 29,44 ± 1,61 26,70 ± 2,38 27,30 ± 2,81 8 34,50 ± 2,17 29,60 ± 2,90 30,10 ± 3,80 23,70 ± 3,35 32,33 ± 2,48 28,60 ± 1,59 30,10 ± 1,77 9 33,00 ± 3,38 33,00 ± 5,06 35,40 ± 5,77 34,00 ± 5,74 33,33 ± 3,48 30,60 ± 5,57 34,60 ± 3,88 10 40,70 ± 5,22 32,20 ± 5,05 40,40 ± 5,11 27,00 ± 5,78 28,67 ± 5,29 32,10 ± 5,14 28,40 ± 5,91 11 33,10 ± 2,84 33,50 ± 3,81 33,50 ± 4,48 29,40 ± 3,40 34,22 ± 2,21 30,60 ± 1,71 36,50 ± 3,13 12 46,30 ± 3,00 41,20 ± 7,71 36,70 ± 4,48 26,50 ± 2,87 31,00 ± 3,10 34,90 ± 2,93 40,80 ± 4,28 13 36,50 ± 5,73 44,70 ± 4,53 33,20 ± 3,71 34,10 ± 2,97 41,89 ± 3,95 36,40 ± 3,29 45,50 ± 5,04 14 45,20 ± 3,39 36,80 ± 3,67 40,50 ± 4,03 33,30 ± 4,54 40,67 ± 4,38 37,10 ± 4,88 51,10 ± 5,27 15 52,40 ± 4,97 46,80 ± 7,48 39,00 ± 3,08 39,00 ± 4,53 37,56 ± 2,57 39,60 ± 3,88 50,60 ± 5,42 16 48,90 ± 3,37 51,90 ± 4,96 49,10 ± 4,64 44,60 ± 4,63 55,56 ± 4,81 45,10 ± 3,93 46,30 ± 5,25 17 54,70 ± 6,55 48,90 ± 6,61 59,80 ± 6,67 40,90 ± 4,36 45,33 ± 6,61 49,30 ± 6,41 51,10 ± 5,09 18 57,50 ± 5,54 48,90 ± 5,74 54,10 ± 5,97 46,30 ± 4,80 48,78 ± 5,36 54,90 ± 6,90 47,60 ± 6,08 19 58,60 ± 4,49 68,00 ± 4,31 46,50 ± 4,68 47,70 ± 5,15 56,67 ± 4,34 53,60 ± 4,87 47,10 ± 5,30 20 54,70 ± 4,02 56,00 ± 3,72 43,50 ± 3,81 38,60 ± 3,57 51,89 ± 5,18 57,50 ± 5,79 68,00 ± 5,88

Resultados 139

Tabela 24 - Consumo médio de cianato de potássio (KCN) ou tiocianato de potássio (KSCN), em mg/kg, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN: 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou KSCN: 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação

DC1 DC2 DC3 DS1 DS2 DS3

7 0,98 ± 0,10 2,98 ± 0,46 23,36 ± 1,72 0,89 ± 0,06 2,93 ± 0,21 25,89 ± 2,84

8 1,12 ± 0,12 3,97 ± 0,49 32,28 ± 4,17 0,86 ± 0,07 2,60 ± 0,22 27,10 ± 2,41

9 1,15 ± 0,10 3,32 ± 0,50 28,71 ± 4,58 0,75 ± 0,07 2,58 ± 0,21 21,58 ± 2,45

10 1,04 ± 0,10 3,31 ± 0,50 37,79 ± 5,09 0,97 ± 0,07 2,35 ± 0,27 21,37 ± 2,48

11 1,20 ± 0,13 3,85 ± 0,54 27,87 ± 4,86 0,74 ± 0,08 2,74 ± 0,28 23,34 ± 2,52

12 1,23 ± 0,13 2,79 ± 0,42 41,12 ± 4,11 1,06 ± 0,09 2,59 ± 0,23 26,27 ± 2,43

13 0,86 ± 0,12 4,02 ± 0,43 29,63 ± 3,16 0,95 ± 0,09 2,70 ± 0,24 30,10 ± 2,21

14 1,23 ± 0,10 3,01 ± 0,45 38,20 ± 4,37 0,78 ± 0,06 3,12 ± 0,23 22,10 ± 2,27

15 1,15 ± 0,10 3,76 ± 0,47 34,69 ± 4,34 0,96 ± 0,09 2,84 ± 0,26 27,16 ± 2,69

16 1,02 ± 0,10 3,65 ± 0,44 30,07 ± 4,43 0,81 ± 0,06 2,66 ± 0,28 28,19 ± 2,50

17 1,02 ± 0,12 2,77 ± 0,46 37,50 ± 4,68 0,87 ± 0,07 2,79 ± 0,21 22,11 ± 2,24 18 1,45 ± 0,12 2,70 ± 0,47 32,46 ± 4,54 0,97 ± 0,07 2,52 ± 0,22 27,88 ± 2,88

19 0,95 ± 0,10 2,86 ± 0,45 25,03 ± 4,31 0,74 ± 0,09 2,79 ± 0,20 28,55 ± 2,53

20 1,02 ± 0,10 3,11 ± 0,40 38,41 ± 4,86 0,76 ± 0,09 2,09 ± 0,21 20,69 ± 2,35

Resultados 140

Figura 23 - Média de consumo de cianeto de potássio (KCN), em mg, de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN: 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21012345

DC1

DC2

2030405060

DC3

dia da avaliação

dose

de

cian

eto

(mg)

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 210.0

0.8

1.6

DS3

DS2DS1

2.43.44.4

24

34

dia da avaliação

dose

de

tioci

anat

o (m

g)

Resultados 141

Tabela 25 – Avaliação reprodutiva de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Parâmetro


N° de fetos vivos 8,50 ± 0,31 8,30 ± 0,59 7,30 ± 1,03 8,10 ± 0,67 8,44 ± 0,63 9,70 ± 0,47 7,50 ± 0,79

N° fetos mortos 0 0,20 ± 0,13 0,30 ± 0,15 0 0,22 ± 0,14 0 0,60 ± 0,33

N° de fetos machos 4,00 ± 0,53 4,60 ± 0,60 3,70 ± 0,68 4,90 ± 0,58 4,11 ± 0,51 4,60 ± 0,58 2,50 ± 0,45

N° de fetos fêmeas 4,50 ± 0,37 3,70 ± 0,45 3,80 ± 0,59 3,80 ± 0,89 4,33 ± 0,74 5,10 ± 0,53 4,90 ± 0,55

Peso da ninhada (g) 57,09 ± 3,31 53,46 ± 3,67 47,60 ± 3,66 56,30 ± 4,17 55,68 ± 3,57 65,23 ± 3,61 50,94 ± 3,70

Resultados 142

Tabela 26 – Peso médio (g) das ninhadas de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da

avaliação


1 51,77 ± 3,30 46,62 ± 3,10 42,20 ± 3,40 50,97 ± 3,10 46,90 ± 3,50 53,73 ± 3,70 46,16 ± 3,10

7 103,50 ± 5,02 98,60 ± 5,80 88,13 ± 5,07 98,08 ± 5,20 94,75 ± 5,90 108,10 ± 5,70 93,50 ± 5,10

14 180,00 ± 8,60 173,10± 9,30 150,80 ± 11,18 170,00 ± 5,10 167,40 ± 6,30 189,30 ± 5,20 161,20 ± 11,16

21 263,30 ± 11,38 254,80 ± 11,48 219,20 ± 11,77 262,00 ± 8,30 253,98 ± 11,30 285,10 ± 9,90 244,46 ± 11,11

Resultados 143

Tabela 27 – Ganho médio de peso (g) dos filhotes de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Período da

avaliação


01 H 07 51,73 ± 4,70 52,00 ± 4,80 45,93 ± 4,80 47,18 ± 4,61 43,11 ± 4,17 54,37 ± 4,15 47,34 ± 4,16

07 H 14 76,50 ± 5,72 74,50 ± 7,07 62,67 ± 8,06 71,92 ± 6,31 72,70 ± 5,82 81,21 ± 5,57 67,79 ± 7,89

14 H 21 83,30 ± 10,03 81,70 ± 10,11 68,40 ± 10,04 92,00 ± 7,28 84,20 ± 8,58 95,80 ± 6,43 83,20 ± 8,36

01 H 21 211,53 ± 11,31 208,20 ± 11,22 177,33 ± 11,77 211,10 ± 8,14 225,17 ± 11,33 231,32 ± 9,00 198,24 ± 11,06

Resultados 144

Tabela 28 – Peso médio (g) do cérebro e cerebelo de filhotes, no 22º dia de vida, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 20 animais, machos e fêmeas, por grupo

Peso do cérebro Peso do cerebelo Peso do cérebro Peso do cerebelo

filhotes machos filhotes fêmeas

Controle 1,05 ± 0,15 0,171 ± 0,04 1,02 ± 0,16 0,169 ± 0,01

DC1 1,16 ± 0,17 0,187 ± 0,02 1,11 ± 0,16 0,174 ± 0,02

DC2 1,11 ± 0,17 0,186 ± 0,02 1,15 ± 0,17 0,181 ± 0,02

DC3 1,07 ± 0,15 0,176 ± 0,02 1,02 ± 0,17 0,168 ± 0,02

DS1 1,07 ± 0,14 0,177 ± 0,02 1,02 ± 0,15 0,168 ± 0,02

DS2 1,06 ± 0,14 0,185 ± 0,01 1,04 ± 0,16 0,176 ± 0,01

DS3 1,03 ± 0,17 0,184 ± 0,02 1,05 ± 0,12 0,179 ± 0,01

Resultados 145

Tabela 29 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L)

alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST) de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo


Controle 79,20 ± 7,25 68,34 ± 8,66 12,02 ± 1,55 0,60 ± 0,03 34,80 ± 3,97 125,30 ± 12,50 84,48 ± 9,64

DC1 75,57 ± 10,32 69,31 ± 7,84 10,62 ± 1,61 0,62 ± 0,03 31,61 ± 3,43 126,78 ± 10,00 87,77 ± 9,17

DC2 73,88 ± 10,59 69,61 ± 9,53 11,10 ± 1,51 0,72 ± 0,05 36,52 ± 3,04 115,90 ± 12,68 80,23 ± 9,62

DC3 70,62 ± 7,34 60,41 ± 9,39 18,17 ± 1,10* 0,66 ± 0,04 50,08 ± 3,14* 140,87 ± 13,64 86,65 ± 9,91

DS1 68,71 ± 9,63 62,50 ± 9,22 11,96 ± 1,74 0,65 ± 0,05 36,55 ± 3,62 122,20 ± 14,63 81,23 ± 9,16

DS2 65,83 ± 11,89 62,93 ± 8,85 10,35 ± 1,57 0,66 ± 0,03 41,00 ± 3,29 117,90 ± 11,20 82,04 ± 9,09

DS3 68,33 ± 7,29 60,44 ± 8,16 10,03 ± 1,00 0,69 ± 0,03 33,73 ± 3,75 111,40 ± 12,40 89,17 ± 9,89

*p<0,05 em relação ao grupo controle (ANOVA seguido por Dunnett)

Resultados 146

Figura 25 - Níveis séricos de uréia (A) (mg/dL) e atividade da enzima ALT (B) (U/L) de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto



5

1 0

1 5

2 0 *ní

veis

sér

icos

de

uré

ia (m

g/dL

)


1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0*

ativ

idad

e da

ALT

(U/L

)

A

B

Resultados 147Tabela 30 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L)

alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), obtidos por meio de pool sangüíneo de filhotes machos de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 amostras por grupo


Controle 121,00 ± 6,69 58,33 ± 8,58 14,47 ± 4,22 0,38 ± 0,03 40,62 ± 8,93 154,78 ± 13,38 74,78 ± 3,38

DC1 121,83 ± 8,09 57,86 ± 4,76 18,00 ± 3,39 0,38 ± 0,01 35,84 ± 5,42 142,73 ± 19,66 72,73 ± 3,66

DC2 123,13 ± 8,99 51,36 ± 7,02 18,25 ± 3,03 0,34 ± 0,02 36,60 ± 6,40 167,54 ± 16,92 87,54 ± 3,92

DC3 131,10 ± 13,01 52,05 ± 4,68 14,15 ± 4,80 0,37 ± 0,03 37,57 ± 9,12 154,53 ± 16,75 74,53 ± 3,75

DS1 116,63 ± 6,79 52,86 ± 4,17 19,41 ± 4,44 0,35 ± 0,02 33,85 ± 4,36 137,78± 9,91 77,78± 3,91

DS2 121,14 ± 5,99 56,37 ± 12,62 11,61 ± 2,96 0,35 ± 0,02 36,87 ± 6,02 153,26 ± 12,24 73,26 ± 3,24

DS3 115,00 ± 4,76 59,92 ± 8,96 10,12 ± 3,85 0,34 ± 0,01 32,26 ± 3,78 161,32 ± 14,75 81,32 ± 4,75

Resultados 148

Tabela 31 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L) alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), obtidos por meio de pool sangüíneo de filhotes fêmeas de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 amostras por grupo


Controle 101,01 ± 5,54 58,03 ± 8,85 15,00 ± 3,99 0,38 ± 0,01 40,00 ± 7,99 158,77 ± 17,28 74,01 ± 4,24

DC1 111,66 ± 7,07 59,44 ± 5,23 14,79 ± 4,47 0,38 ± 0,01 39,04 ± 6,00 148,03 ± 17,00 78,55 ± 4,99

DC2 103,12 ± 6,23 54,41 ± 6,13 13,71 ± 4,01 0,33 ± 0,02 37,60 ± 6,55 161,02 ± 15,00 73,47 ± 4,75

DC3 100,08 ± 6,53 59,05 ± 8,28 15,15 ± 6,01 0,38 ± 0,03 39,07 ± 8,02 154,53 ± 16,89 74,03 ± 3,87

DS1 117,09 ± 5,39 52,49 ± 7,26 16,01 ± 5,45 0,35 ± 0,02 41,05 ± 6,36 149,22± 14,99 79,01± 3,09

DS2 107,14 ± 8,00 56,74 ± 9,12 14,37 ± 4,06 0,35 ± 0,02 40,87 ± 7,02 150,00 ± 16,54 74,06 ± 4,52

DS3 100,00 ± 7,44 54,92 ± 7,77 12,12 ± 3,87 0,34 ± 0,01 42,26 ± 6,00 148,22 ± 17,75 72,12 ± 5,03

Resultados 149 Tabela 32 – Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de ratas avaliadas no 22º dia pós-parto, e de suas respectivas proles, e que receberam

durante a gestação, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianato de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram analisadas 10 amostras de cada grupo

Grupos Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L)

Mães Níveis séricos de tiocianato (mcmol/l)

Filhotes machos Níveis séricos de tiocianato (mcmol/l)

Filhotes fêmeas

Controle 26,63 ± 2,77 69,14 ± 4,77* 60,80 ± 5,38*

DC1 35,11 ± 2,87 64,14 ± 4,41* 63,55 ± 2,84*

DC2 36,05 ± 2,83 77,21 ± 4,19*; # 65,25 ± 3,28*

DC3 36,73 ± 3,72 74,14 ± 4,75*; # 60,83 ± 3,57*

DS1 37,85 ± 3,25 71,12 ± 6,45* 64,50 ± 3,53*

DS2 36,95 ± 3,57 68,00 ± 3,14* 63,63 ± 3,70*

DS3 34,20 ± 4,29 66,42 ± 5,88* 54,50 ± 3,62* *p<0,05 em relação ao grupo das mães (ANOVA seguido por Tukey-Kramer)

#p<0,05 em relação ao grupo dos filhotes fêmeas (teste t)

Resultados 150

Figura 26 - Níveis séricos de tiocianato de ratas, e respectivos filhotes machos e

fêmeas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto

*p<0,05 em relação ao grupo das mães

CONTROLE DC1 DC2 DC3 DS1 DS2 DS30

25

50

75

100

mãe

filhote macho

filhote fêmea

* *

*

**

**** ***

*

*

níve

is s

éric

os d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)

Resultados 151

Tabela 33 – Intensidade das lesões histológicas observadas em ratas, que receberam durante a gestação, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2)e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas Foram avaliados 3 animais por grupo


Tecido renal


Nefrose - - - - - - ++



Tecido hepático




Tecido nervoso




Gliose - - - ++ - + ++

Necrose - - - + - - - Tireóide Aumento de reabsorção no colóide dos folículos - + ++ +++ + ++ +++

Resultados 152 Tabela 34 – Intensidade das lesões histológicas observadas em filhotes, no 22º dia de vida, de ratas, que receberam, por via oral, na água de

bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (DC1); 3 (DC2) e 30 mg/kg (DC3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (DS1); 2,4 (DS2) e 24 mg/kg (DS3), do 6o ao 20o dia de gestação e submetidas à eutanásia no 22o dia pós-parto. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas. Foram analisados 3 animais por grupo


Tecido renal

Congestão renal - - + ++ - + ++

Tecido hepático

Congestão hepática - - + ++ - + ++

Vacuolização de hepatócitos - - - + - - +

Proliferação dos ductos biliares - - - + - - +

Tecido nervoso

Congestão no SNC - - + ++ - + ++


Gliose - - - ++ - - ++

Resultados 153


KSCN, DURANTE A LACTAÇÃO

As tabelas 35 e 36 mostram o peso médio e o ganho médio de peso (g)

corpóreo, respectivamente, de ratas lactantes que receberam, por via oral, na água

de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN do 1° ao 18° dia de lactação, e do

grupo controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período, e submetidas

à eutanásia no 19o dia da lactação. A análise das variâncias revelou não haver




avaliados, de ratas lactantes que receberam, por via oral, na água de bebida,

diferentes doses de KCN ou KSCN do 1° ao 18° dia de lactação, e do grupo controle

que recebeu somente água filtrada no mesmo período, e submetidas à eutanásia no

19o dia da lactação. A análise das variâncias revelou não haver diferenças

significantes (p>0,05) entre os diversos grupos experimentais comparados ao grupo

controle.

A tabela 38 mostra o consumo médio diário de água (mL) de ratas

lactantes que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN

ou KSCN do 1° ao 18° dia de lactação, e do grupo controle que recebeu somente

água filtrada no mesmo período, e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. A

análise das variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) entre os

Resultados 154

diversos grupos experimentais comparados ao grupo controle.

A tabela 39 mostra e as figuras 27 e 28 ilustram o consumo médio de

KCN ou KSCN (mg) de ratas lactantes que receberam, por via oral, na água de

bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN do 1° ao 18° dia de lactação, e do grupo


eutanásia no 19o dia da lactação. A análise das variâncias revelou não haver

diferenças significantes (p>0,05) no consumo das substâncias estudadas nos

diversos dias analisados, em um mesmo grupo experimental.

As tabelas 40 e 41 mostram o peso médio corpóreo e o ganho de peso

(g), respectivamente, das ninhadas de ratas lactantes que receberam, por via oral,

na água de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN do 1° ao 18° dia de lactação,

e do grupo controle que recebeu somente água filtrada no mesmo período, e

submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. A análise das variâncias revelou não

haver diferenças significantes (p>0,05) entre os diversos grupos experimentais


A tabela 42 mostra os resultados das dosagens bioquímicas de ratas

lactantes que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN



análise das variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) nas

diversas análises.

As tabelas 43 e 44 mostram os resultados das dosagens bioquímicas de

filhotes machos e fêmeas, respectivamente, com 18 dias de idade, de ratas lactantes

que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN

do 1° ao 18° dia de lactação, e do grupo controle que recebeu somente água filtrada

Resultados 155

no mesmo período, e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. A análise das

variâncias revelou não haver diferenças significantes (p>0,05) nas diversas análises.

A tabela 45 mostra e a figura 29 ilustra a produção média de leite (g/ 10

horas) de ratas lactantes, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes

doses de KCN ou KSCN do 1° ao 18° dia de lactação, e do grupo controle que

recebeu somente água filtrada no mesmo período, e submetidas à eutanásia no 19o

dia da lactação. A análise das variâncias revelou não haver diferenças significantes

(p>0,05) na produção de leite nos diversos grupos experimentais em relação ao

grupo controle. Entretanto, a análise das variâncias revelou haver diferenças

significantes (p<0,05) na produção de leite comparando-se as duas metodologias. A

aplicação do teste t revelou aumento significante (p<0,05) na produção de leite

quando utilizou-se o peso das mães em comparação ao peso das ninhadas, dos

animais pertencentes aos grupos controle (F=2,273); FCL1 (F=2,998); FCL2

(F=3,168); FCL3 (F=1,947); FSL1 (F=1,108). Nos demais grupos não houve

diferenças significantes.

A tabela 46 mostra e as figuras 30, 31, 32 e 33 ilustram os níveis séricos

de tiocianato, das lactantes e dos lactentes, e os níveis lácteos de tiocianato, das

lactantes, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN



análise das variâncias revelou haver diferenças significantes (p<0,05) nas

concentrações séricas e lácteas de tiocianato dentro de um mesmo grupo

experimental em relação ao grupo controle. A aplicação do teste de Dunnett revelou

aumento significante (p<0,05) nos níveis séricos de tiocianato das progenitoras nos

animais dos grupos que receberam as doses de 3 e 30 mg/kg/dia de KCN e nos

Resultados 156

grupos que receberam as doses de 2,4 e 24 mg/kg/dia de KSCN (F=131,90,

df=6/63) em relação ao grupo controle. Também verificou-se aumento significante

(p<0,05) nos níveis lácteos dos animais dos grupos que receberam as doses de 1, 3

e 30 mg/kg/dia de KCN e nos grupos que receberam as doses de 2,4 e 24 mg/kg/dia

de KSCN (F=82,820, df=6/63) em relação ao grupo controle.

Em relação aos lactentes, a análise das variâncias revelou haver

diferenças significantes (p<0,05) nas concentrações séricas de tiocianato dentro de

um mesmo grupo experimental em relação ao grupo controle, nos filhotes machos e

fêmeas. A aplicação do teste de Dunnett revelou aumento significante (p<0,05) nos

níveis séricos de tiocianato nos filhotes machos das progenitoras de todos os grupos

experimentais (F=10,623, df=6/63) em relação ao grupo controle. Ainda, verificou-se

aumento significante (p<0,05) nos níveis séricos dos filhotes fêmeas das

progenitoras dos grupos que receberam as doses de 3 e 30 mg/kg/dia de KCN e nos

grupos que receberam as doses de 2,4 e 24 mg/kg/dia de KSCN (F=13,325, df=6/63,

p<0,05) em relação ao grupo controle. Não foram verificadas diferenças entre

filhotes machos e fêmeas, em relação a este parâmetro. Em contrapartida, a análise

das variâncias revelou haver diferenças significantes (p<0,05) nas concentrações

séricas de tiocianato comparando-se o grupo das progenitores e seus respectivos

filhotes. A aplicação do teste de Tukey-Kramer revelou aumento significante (p<0,05)

nos níveis séricos de tiocianato dos filhotes, tanto de machos quanto de fêmeas no

grupo controle (F=28,848; df=2/27); FCL1 (F=19,25; df=2/27); FCL3 (F=20,73;

df=2/27); FSL1 (F=20,298; df=2/27) e FSL3 (F=25,835; df=2/27). Nos demais grupos

não houve diferenças significantes.

A tabela 47 e 48 mostram a intensidade das lesões histológicas

observadas em ratas lactantes, e em suas proles, respectivamente, e que

Resultados 157

receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN ou KSCN do

1° ao 18° dia de lactação, e do grupo controle que recebeu somente água filtrada no

mesmo período, e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. A intensidade das

lesões foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++)

lesões moderadas, (+++) lesões severas. As lesões encontradas neste experimento

são bastante semelhantes às encontradas no experimento anterior, experimento 4,

tanto nas lactantes como nos lactentes. No grupo controle e nos demais grupos

experimentais, não foram observadas alterações histológicas dignas de nota.

As figuras anteriormente descritas, no experimento 3, também ilustram as

lesões encontradas no presente experimento.

Resultados 158Tabela 35 – Peso médio corpóreo de ratas (g) que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio

(KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação

1o 7 o 14 o 18 o

Controle 252,56 ± 5,27 268,11 ± 7,08 281,22 ± 7,66 295,78 ± 11,94

FCL1 253,50 ± 5,59 260,78 ± 7,60 280,00 ± 4,90 289,56 ± 4,97

FCL2 252,44 ± 6,25 265,44 ± 6,82 279,89 ± 6,75 280,56 ± 7,15

FCL3 255,22 ± 5,82 261,56 ± 5,95 280,00 ± 5,09 286,78 ± 6,08

FSL1 254,00 ± 5,42 271,11 ± 5,07 278,67 ± 4,79 283,67 ± 6,95

FSL2 253,00 ± 7,36 260,33 ± 7,69 276,44 ± 8,00 280,33 ± 7,55

FSL3 253,22 ± 3,57 271,78 ± 4,18 284,67 ± 5,60 289,56 ± 5,98

Resultados 159

Tabela 36 - Ganho de peso médio corpóreo (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de

potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo


ntrole CL1 CL2 CL3 SL1 SL2 SL3

01 H 07 15,56 ± 2,87 8,70 ± 3,65 11,80 ± 2,72 6,80 ± 3,63 17,20 ± 3,61 8,00 ± 2,87 17,90 ± 3,05

07 H 14 13,11 ± 3,58 19,20 ± 5,70 14,20 ± 3,01 18,30 ± 5,05 8,20 ± 3,55 15,30 ± 4,86 12,60 ± 4,42

14 H 18 14,56 ± 6,00 8,90 ± 6,61 0,30 ± 3,56 7,30 ± 3,56 5,00 ± 3,93 3,30 ± 2,49 5,80 ± 3,86

01 H 18 43,22 ± 5,35 36,80 ± 2,78 26,30 ± 3,70 32,40 ± 4,50 30,40 ± 5,50 26,60 ± 3,96 36,30 ± 4,54

Resultados 160

Tabela 37 – Consumo médio de ração (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo


ntrole CL1 CL2 CL3 SL1 SL2 SL3

01 H 04 75,11 ± 6,82 70,00 ± 5,19 71,20 ± 5,46 70,70 ± 4,80 69,30 ± 3,80 73,90 ± 5,74 81,10 ± 3,52

04 H 08 137,11 ± 13,48 141,90 ± 14,67 150,20 ± 11,52 141,00 ± 13,30 149,80 ± 6,90 128,50 ± 8,69 160,10 ± 15,81

08 H 12 189,11 ± 7,11 189,70 ± 6,19 165,30 ± 9,78 190,80 ± 4,90 174,90 ± 5,90 181,00 ± 4,96 191,50 ± 7,01

12 H 16 204,41 ± 6,16 210,80 ± 3,58 208,70 ± 3,01 202,30 ± 5,80 191,90 ± 9,99 201,80 ± 6,88 216,10 ± 8,20

16H 18 123,78 ± 5,44 120,80 ± 4,65 121,40 ± 8,83 107,50 ± 5,90 108,90 ± 4,18 118,10 ± 4,17 117,70 ± 2,90

01 H 18 145,91 ± 7,80 146,64 ± 6,96 143,36 ± 7,72 142,36 ± 6,94 138,96 ± 6,15 140,66 ± 6,09 153,30 ± 7,49

Resultados 161

Tabela 38 – Consumo médio de água (mL) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação

Controle FCL1 FCL2 FCL3 FSL1 FSL2 FSL3

1 51,22 ± 4,29 49,10 ± 2,93 49,00 ± 3,47 53,20 ± 1,76 47,60 ± 2,92 49,20 ± 5,39 37,80 ± 4,77 2 52,20 ± 2,28 52,30 ± 4,10 50,20 ± 4,03 50,20 ± 3,26 54,80 ± 6,83 55,40 ± 7,09 56,50 ± 3,80 3 59,56 ± 5,35 52,00 ± 4,60 45,00 ± 4,03 49,20 ± 3,00 50,80 ± 2,37 60,50 ± 6,52 54,30 ± 3,86 4 57,22 ± 2,86 58,10 ± 5,47 62,30 ± 5,56 51,70 ± 4,18 56,10 ± 8,43 61,10 ± 5,39 57,70 ± 3,75 5 57,22 ± 4,51 58,10 ± 6,04 59,05 ± 7,76 53,20 ± 6,44 65,60 ± 7,74 63,40 ± 3,64 57,90 ± 3,89 6 64,44 ± 7,05 59,80 ± 4,45 59,50 ± 4,51 62,00 ± 7,74 59,00 ± 4,80 68,90 ± 7,48 62,80 ± 4,48 7 66,00 ± 8,90 61,50 ± 4,86 58,60 ± 5,41 60,40 ± 6,32 66,20 ± 5,63 59,70 ± 8,51 67,70 ± 5,84 8 77,22 ± 6,36 76,60 ± 10,48 60,50 ± 6,33 62,10 ± 4,98 60,50 ± 8,34 75,40 ± 8,26 73,00 ± 6,63 9 73,78 ± 5,16 76,40 ± 9,17 68,50 ± 7,00 71,40 ± 10,42 66,50 ± 8,59 73,00 ± 5,18 79,50 ± 6,47 10 69,44 ± 4,93 74,70 ± 4,03 74,10 ± 4,00 64,80 ± 4,65 73,50 ± 6,53 69,10 ± 6,42 73,00 ± 5,32 11 77,33 ± 6,03 83,50 ± 8,48 73,50 ± 6,98 73,90 ± 8,62 76,20 ± 8,31 74,00 ± 4,60 73,50 ± 4,83 12 73,11 ± 5,23 82,60 ± 5,35 87,00 ± 9,00 67,60 ± 9,86 80,50 ± 7,16 78,60 ± 4,24 73,50 ± 4,83 13 85,78 ± 6,36 82,60 ± 5,35 77,50 ± 5,44 69,40 ± 4,46 78,20 ± 5,27 84,80 ± 5,06 88,50 ± 5,92 14 95,44 ± 6,37 92,80 ± 6,25 75,60 ± 7,00 87,10 ± 8,87 84,00 ± 5,36 95,50 ± 8,80 79,00 ± 6,23 15 83,30 ± 5,65 90,00 ± 5,24 87,20 ± 5,11 96,50 ± 9,95 91,40 ± 5,97 94,80 ± 9,62 96,10 ± 7,33 16 93,30 ± 7,06 88,20 ± 6,05 88,20 ± 4,94 91,10 ± 4,95 93,40 ± 6,43 93,40 ± 5,70 95,70 ± 5,49 17 95,56 ± 8,08 89,10 ± 8,04 91,10 ± 5,65 93,40 ± 5,32 82,60 ± 5,04 97,10 ± 8,83 91,60 ± 5,53 18 76,67 ± 9,62 75,00 ± 9,79 89,00 ± 10,49 72,00 ± 10,31 89,00 ± 10,68 62,00 ± 8,54 63,00 ± 9,73

Resultados 162

Tabela 39 – Consumo médio de cianeto de potássio (KCN) ou tiocianato de potássio (KSCN), em mg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KCN: 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou KSCN: 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo

Dia da avaliação

FCL1 FCL2 FCL3 FSL1 FSL2 FSL3

1 1,21 ± 0,10 3,53 ± 0,29 29,52 ± 1,69 0,86 ± 0,08 2,86 ± 0,20 30,96 ± 2,98 2 1,00 ± 0,09 2,78 ± 0,23 30,44 ± 2,94 0,87 ± 0,08 2,99 ± 0,40 24,20 ± 2,16 3 1,13 ± 0,09 3,99 ± 0,31 31,77 ± 2,26 0,95 ± 0,10 2,65 ± 0,43 25,27 ± 2,45 4 1,00 ± 0,08 3,91 ± 0,31 33,13 ± 3,81 0,89 ± 0,06 3,37 ± 0,37 25,08 ± 2,92 5 1,09 ± 0,05 2,92 ± 0,35 36,87 ± 2,01 0,77 ± 0,07 2,72 ± 0,27 27,13 ± 2,21 6 1,07 ± 0,05 3,07 ± 0,21 27,89 ± 1,53 0,95 ± 0,07 2,50 ± 0,27 27,38 ± 2,80 7 1,18 ± 0,08 3,03 ± 0,28 34,34 ± 2,44 0,73 ± 0,11 2,53 ± 0,21 25,49 ± 2,74 8 1,07 ± 0,10 3,51 ± 0,31 33,42 ± 2,53 0,86 ± 0,05 2,62 ± 0,26 28,11 ± 2,31 9 1,03 ± 0,10 3,30 ± 0,35 28,85 ± 2,31 0,94 ± 0,08 2,26 ± 0,24 22,75 ± 2,50 10 1,11 ± 0,06 3,07 ± 0,28 36,09 ± 3,01 0,71 ± 0,06 2,74 ± 0,21 21,83 ± 2,14 11 1,08 ± 0,06 3,78 ± 0,26 33,62 ± 3,26 0,97 ± 0,09 2,71 ± 0,15 31,92 ± 2,75 12 1,06 ± 0,11 2,80 ± 0,29 30,87 ± 3,98 0,80 ± 0,04 2,76 ± 0,29 26,07 ± 2,96 13 1,03 ± 0,06 2,87 ± 0,23 37,75 ± 3,58 0,89 ± 0,06 2,46 ± 0,15 24,09 ± 2,78 14 0,99 ± 0,05 4,39 ± 1,23 32,22 ± 3,11 0,88 ± 0,08 2,82 ± 0,28 29,01 ± 2,98 15 1,10 ± 0,09 3,14 ± 0,27 32,06 ± 3,96 0,85 ± 0,08 2,42 ± 0,29 24,00 ± 2,17 16 0,79 ± 0,11 3,08 ± 0,25 29,94 ± 3,74 0,76 ± 0,05 2,27 ± 0,20 24,02 ± 2,21 17 0,87 ± 0,10 2,67 ± 0,32 23,73 ± 3,17 0,47 ± 0,17 2,71 ± 0,19 26,84 ± 2,50 18 1,05 ± 0,08 3,28 ± 0,26 31,91 ± 3,24 0,84 ± 0,09 2,61 ± 0,25 25,54 ± 2,15

Resultados 163

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19012345

20

30

40

50 FCL3FCL2FCL1

dia da avaliação

dose

de

cian

eto

(mg)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 190.00.81.62.43.24.0

FSL1

FSL2

FSL3

14

24

34

44

dia da avaliação

dose

de

tioci

anat

o (m

g)

Figura 28 - Consumo médio de tiocianato de potássio (KSCN), em mg, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de KSCN: 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação

Resultados 164Tabela 40 – Peso médio das ninhadas (g) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de

potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram avaliadas 10 ninhadas por grupo

Dia da avaliação

1 7 14 18

Controle 53,67 ± 0,79 119,11 ± 4,53 221,22 ± 6,69 255,00 ± 8,42

FCL1 53,30 ± 0,88 122,10 ± 5,80 230,50 ± 6,40 279,70 ± 14,26

FCL2 50,20 ± 1,13 109,11 ± 5,08 216,20 ± 3,24 265,10 ± 10,21

FCL3 54,70 ± 0,82 117,60 ± 2,80 216,60 ± 5,71 262,20 ± 8,38

FSL1 53,20 ± 1,13 123,60 ± 4,54 226,10 ± 6,66 272,70 ± 8,97

FSL2 53,50 ± 0,70 121,30 ± 5,72 219,20 ± 3,06 271,80 ± 12,12

FSL3 54,70 ± 1,22 131,70 ± 4,88 233,20 ± 6,44 291,80 ± 11,13

Resultados 165

Tabela 41 – Ganho de peso (g) médio das ninhadas de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de

cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram avaliadas 10 ninhadas por grupo

Período

da

avaliação


01 H 07 65,44 ± 4,64 68,80 ± 5,30 48,00 ± 5,56 62,10 ± 2,47 70,00 ± 4,66 67,80 ± 6,50 77,00 ± 4,69

07 H 14 102,11 ± 7,65 108,40 ± 7,65 118,00 ± 8,18 99,90 ± 4,77 102,00 ± 3,41 97,90 ± 12,03 111,50 ± 5,64

14 H 18 44,89 ± 9,32 49,20 ± 4,42 48,90 ± 4,22 45,16 ± 3,53 46,60 ± 5,50 52,60 ± 8,63 48,60 ± 5,05

01 H 18 216,17 ± 12,86 226,40 ± 13,64 214,90 ± 9,58 207,00 ± 7,97 219,50 ± 9,48 218,30 ± 12,40 237,10 ± 11,05

Resultados 166


alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1º ao 18º dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados 10 animais por grupo


Controle 77,31 ± 10,01 60,8 ± 12,42 10,12 ± 1,25 0,66 ± 0,03 31,20 ± 3,97 126,30 ± 12,45 81,45 ± 9,54

FCL1 77,75 ± 9,54 64,99 ± 13,21 10,13 ± 1,41 0,65 ± 0,03 32,41 ± 3,43 125,75 ± 10,12 82,73 ± 9,27

FCL2 74,08 ± 10,12 69,22 ± 9,54 11,11 ± 1,81 0,61 ± 0,05 36,62 ± 3,04 119,93 ± 12,00 80,20 ± 9,00

FCL3 70,00± 10,52 69,56 ± 9,77 10,17 ± 1,10 0,66 ± 0,04 30,08 ± 3,14 127,8 ± 13,00 85,60 ± 9,00

FSL1 69,45 ± 9,39 62,40 ± 9,51 10,66 ± 1,54 0,65 ± 0,02 34,55 ± 3,72 129,29 ± 14,12 86,20 ± 9,21

FSL2 67,87 ± 10,22 62,11 ± 9,85 10,35 ± 1,57 0,66 ± 0,02 31,00 ± 3,39 119,97 ± 11,23 83,05 ± 9,00

FSL3 70,03 ± 7,69 60,33 ± 9,16 10,33 ± 1,22 0,66 ± 0,05 33,73 ± 3,45 119,46 ± 12,44 81,19 ± 9,87

Resultados 167


alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), obtidos, no 18º dia de vida, por meio de pool sangüíneo, de filhotes machos de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram analisadas 10 amostras por grupo


Controle 131,01 ± 6,79 59,38 ± 8,58 18,17 ± 2,02 0,35 ± 0,02 37,12 ± 5,03 164,70 ± 14,34 84,00 ± 3,45

FCL1 121,45 ± 8,49 57,56 ± 8,26 18,09 ± 2,30 0,34 ± 0,02 36,88 ± 5,45 162,76 ± 15,60 82,05 ± 3,77

FCL2 128,45 ± 8,56 51,56 ± 7,92 18,52 ± 2,09 0,34 ± 0,03 35,00 ± 6,45 167,50 ± 16,00 87,03 ± 3,95

FCL3 131,22 ± 8,29 52,55 ± 5,52 18,10 ± 2,88 0,37 ± 0,03 36,17 ± 6,02 164,00 ± 16,00 84,08 ± 3,78

FSL1 126,03 ± 8,54 52,16 ± 6,52 17,79 ± 2,01 0,35 ± 0,03 37,00 ± 6,53 167,00 ± 16,42 87,77 ± 3,01

FSL2 121,04 ± 8,56 56,27 ± 8,66 17,60 ± 2,81 0,35 ± 0,02 37,08 ± 6,45 159,21 ± 16,21 83,12 ± 3,24

FSL3 125,00 ± 7,52 54,00 ± 8,06 17,02 ± 2,81 0,35 ± 0,03 38,01 ± 6,73 162,85 ± 15,00 81,54 ± 3,75

Resultados 168

Tabela 44 - Níveis séricos de glicose (mg/dL); colesterol (mg/dL); uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL); e atividades das enzimas (U/L) alanina aminotransferase (ALT); fosfatase alcalina (FA) e aspartato aminotransferase (AST), obtidos, no 18º dia de vida, por meio de pool sangüíneo, de filhotes fêmeas de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram analisadas 10 amostras por grupo


Controle 89,00 ± 7,85 52,41 ± 9,45 18,22 ± 5,41 0,35 ± 0,01 35,01 ± 4,53 160,87 ± 16,47 83,08 ± 4,27

FCL1 141,58 ± 9,22 54,22 ± 9,52 18,00 ± 4,27 0,36 ± 0,01 35,04 ± 5,00 162,05 ± 16,06 82,04 ± 4,06

FCL2 123,13 ± 8,99 50,01 ± 9,12 18,05 ± 4,83 0,35 ± 0,03 35,06 ± 5,40 167,00 ± 16,04 80,52 ± 4,00

FCL3 101,82 ± 10,01 59,41 ± 8,72 18,01 ± 5,54 0,38 ± 0,01 35,75 ± 5,13 164,35 ± 16,00 87,27 ± 4,12

FSL1 118,63 ± 6,79 52,21 ± 9,18 18,00 ± 5,44 0,35 ± 0,02 35,00 ± 5,04 167,14 ± 16,85 85,51 ± 4,19

FSL2 121,63 ± 8,87 56,74 ± 10,06 18,07 ± 5,87 0,35 ± 0,02 35,47 ± 5,04 162,21 ± 16,24 85,00 ± 4,54

FSL3 125,00 ± 9,47 56,45 ± 8,54 18,54 ± 5,52 0,35 ± 0,01 34,78 ± 4,97 160,45 ± 15,78 88,54 ± 4,81

Resultados 169

Tabela 45 – Produção média de leite (g/10 horas), no 14º dia de lactação de ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. Os dados apresentados foram obtidos considerando-se a diferença de peso materno antes e após a mamada (PM), ou considerando-se a diferença de peso dos filhotes após e antes a mamada (PF). São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizados os pesos corpóreos de 10 animais, lactantes, e a média do peso de 10 ninhadas, em cada grupo

Produção láctea (g/10 horas)

Grupos PM PF

Controle 14,56 ± 0,98* 11,44 ± 0,65

FCL1 15,70 ± 1,16* 12,40 ± 0,67

FCL2 14,00 ± 0,89* 10,40 ± 0,50

FCL3 15,50 ± 1,20* 11,30 ± 0,86

FSL1 15,70 ± 1,00* 11,90 ± 0,95

FSL2 14,90 ± 1,52 11,80 ± 1,11

FSL3 13,40 ± 1,39 11,00 ± 1,10

*p<0,05 em relação à produção de leite comparando-se com o peso das ninhadas (PF), em um

mesmo grupo

Resultados 170

Figura 29 - Produção média de leite (g/10 horas), no 14º dia de lactação de ratas,

que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. Os dados apresentados foram obtidos considerando-se a diferença de peso materno antes e após a mamada (PM), ou considerando-se a diferença de peso dos filhotes após e antes a mamada (PF). Foram utilizados os pesos corpóreos de 10 animais, lactantes, e a média do peso de 10 ninhadas, em cada grupo

*p<0,05 em relação à produção de leite comparando-se ao peso das ninhadas (PF), em um mesmo

grupo

CONTROLEFCL1

FCL2FCL3

FSL1FSL2

FSL30

5

10

15

20

PMPF

prod

ução

de

leite

(g/1

0 h)

** *

* * * *

Resultados 171Tabela 46 – Níveis séricos e lácteos de tiocianato (mcmol/L) de ratas e suas proles, avaliados no 19º e 18º dia da lactação, respectivamente. As

mães receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação. São apresentadas as médias e os respectivos erros-padrão. Foram utilizadas 10 amostras por grupo

Níveis de tiocianato (mcmol/L)

Mães

Prole

Machos Fêmeas

Leite Soro Soro Soro

Controle 45,22 ± 4,48 29,14 ± 5,90 69,40 ± 5,71# 71,43 ± 4,26#

FCL1 83,28 ± 8,17* 44,24 ± 6,71 102,97 ± 6,57*; # 98,27 ± 8,82#

FCL2 124,89 ± 9,47* 105,18 ± 8,31* 116,16 ± 8,71* 112,08 ± 12,61*

FCL3 240,51 ± 7,32* 225,16 ± 9,47* 143,27 ± 12,34*; # 140,33 ± 9,67*; #

FSL1 59,44 ± 10,09 49,31 ± 5,30 119,68 ± 8,81*; # 106,35 ± 10,04#

FSL2 182,39 ± 7,81* 84,55 ± 10,07* 106,53 ± 6,03* 111,73 ± 10,07*

FSL3 203,39 ± 9,72* 272,11 ± 10,69* 159,18 ± 11,64*; # 183,70 ± 10,64*; # *p< 0,05 em relação ao grupo controle #p<0,05 em relação às mães, em um mesmo grupo e meio biológico avaliado

Resultados 172


100

200

300

**

**

níve

is s

éric

os d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

)


100

200

300

***

**

níve

is lá

cteo

s de

tioc

iana

to(m

cmol

/L)

Figura 31 - Níveis lácteos de tiocianato (mcmol/L) de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação


Resultados 173


5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

****

**ní

veis

sér

icos

de

tioci

anat

o(m

cmol

/L) (

mac

ho)


5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

*

***

níve

is s

éric

os d

e tio

cian

ato

(mcm

ol/L

) (fê

mea

s)

Figura 32 - Níveis séricos de tiocianato (mcmol/L) de filhotes machos, no 18º dia de vida, de ratas que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianeto de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3), do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19o dia da lactação


Resultados 174

Tabela 47 – Intensidade das lesões histológicas observadas em ratas, que receberam, por via oral, na água de bebida, diferentes doses de cianato de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3) do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas. Foram avaliados 3 animais em cada grupo


Tecido renal


Nefrose - - - - - - ++



Tecido hepático




Tecido nervoso




Gliose - - - ++ - + ++

Necrose - - - + - - - Tireóide Aumento de reabsorção no colóide dos folículos - + ++ +++ + ++ +++

Resultados 175

Tabela 48 – Intensidade das lesões histológicas observadas em filhotes, no 18º dia de vida, de ratas, que receberam, por via oral, na água de

bebida, diferentes doses de cianato de potássio (KCN): 1 (FCL1); 3 (FCL2) e 30 mg/kg (FCL3) ou tiocianato de potássio (KSCN): 0,8 (FSL1); 2,4 (FSL2) e 24 mg/kg (FSL3) do 1° ao 18° dia de lactação e submetidas à eutanásia no 19º dia da lactação. A intensidade foi caracterizada por meio de escores: (-) sem lesão; (+) lesões brandas, (++) lesões moderadas, (+++) lesões severas. Foram avaliados 3 animais em cada grupo


Tecido renal

Congestão renal - - + ++ - + ++

Tecido hepático

Congestão hepática - - + ++ - + ++

Vacuolização de hepatócitos - - - + - - +

Proliferação dos ductos biliares - - - + - - +

Tecido nervoso

Congestão no SNC - - + ++ - + ++


Gliose - - - ++ - - ++

Discussão 176

5 DISCUSSÃO

Discussão 177

5 DISCUSSÃO

O cianeto é um íon muito estudado em toxicologia e tem sido associado a

vários episódios de intoxicação, como: ingestão de alimentos e água contaminados,

guerra química, suicídios, homicídios, nível ocupacional e utilização em

determinados medicamentos (EL GHAWABJ et al., 1975.; MA; PRITSOS, 1997;

SOLDAN et al., 2001; SHULZ; BONN; KINDLER, 1979; WATTS, 1998; WAY, 1984).

Nos animais, as principais fontes de exposição ao cianeto são de origem vegetal e

em efluentes nas proximidades de indústrias que utilizam-no em alguma etapa de

seu processo (SAAD, CAMARGO, 1967). Somente os Estados Unidos produzem

300.000 toneladas desta substância, por ano, para alimentar suas indústrias de

eletroplatinação, de papel e plástico, e na extração de ouro (UNITED STATES

ARMY, 1999).

Além da intoxicação aguda pelo cianeto, vários estudos apontam, cada

vez mais, o risco dos efeitos tóxicos produzido por este íon, quando da exposição

prolongada (MCMILLAN; GEEVARGHESE, 1979; OKOLIE; OSAGIE, 1999;

RAGOOBIRSINGH; ROBINSON; MORISON, 1993; SPENCER, 1999). De fato,

pesquisas realizadas com esta substância, em diferentes espécies animais, mostram

a sua grande relevância tanto no que se refere à saúde pública quanto à animal,

podendo, neste último caso, acarretar também em significantes prejuízos

econômicos (DOHERTY; FERM; SMITH, 1982; SOTO-BLANCO, 1999; TEWE;

MANNER; GOMES, 1977).

Discussão 178

O presente estudo dá continuidade à pesquisa que vem sendo realizada

neste mesmo laboratório, avaliando os efeitos tóxicos da exposição prolongada do

cianeto em ratos (SOUSA, 2000), verificando-se, agora, a possível toxicidade deste

íon, e de seu principal metabólito, o tiocianato, em ratas e em suas proles, durante o

período perinatal. A primeira etapa deste estudo visou verificar os níveis séricos de

tiocianato, pois estes são utilizados como referência para o monitoramento da

exposição prolongada ao cianeto (CARLSSON et al., 1999; POTTER et al., 2001;

SOUSA et al., 2003; SPENCER, 1999; THORNE, 2001).

Procurou-se, inicialmente, escolher e padronizar uma técnica de

determinação de tiocianato no soro, no líquido amniótico e no leite de ratas que

melhor se adequasse às condições deste laboratório, pois, na literatura, são

descritas diversas metodologias empregadas para a determinação deste ânion nos

vários líquidos biológicos, em diferentes espécies animais (BRUCE et al., 1955;

CHEN et al., 1996; KAGE; NAGATA; KUDO, 1996). Dentre estas metodologias, está

a técnica de espectrofotometria, inicialmente elaborada por Pettigrew e Fell (1972) e,

posteriormente, modificada por Siqueira et al. (1996) e Tominaga e Mídio (1990,

1991) que utilizaram a cromatografia de troca iônica associada à espectrofotometria.

Esta técnica está bem padronizada para a determinação da concentração de

tiocianato na urina e no plasma tanto de humanos (SIQUEIRA et al., 1996;

TOMINAGA; MÍDIO, 1990, 1991), como no plasma de caprinos, suínos e ratos

(MANZANO, 2001; SOTO-BLANCO, 1999; SOUSA, 2000). Assim, foi necessário,

nesta etapa, aprimorar a metodologia que utiliza a espectrofotometria, para a

determinação do tiocianato, agora também no leite e líquido amniótico de ratas, e

suas características definidas, pois a validação de qualquer metodologia analítica é

primordial para garantir a qualidade e a confiabilidade dos dados (CHANSIN et al.,

Discussão 179

1998). Para tal, esta técnica, de espectrofotometria, já implantada neste laboratório,

foi, no presente estudo, otimizada, substituindo-se a técnica manual para aquela

semi-automática e validada para os diversos líquidos biológicos estudados. Com

isto, diminui-se o consumo de reagentes e, conseqüentemente, os gastos e a

demanda de tempo para estas análises, implementando o estudo com os materiais

biológicos anteriormente citados.

A validação da metodologia compreendeu o estudo da linearidade da

resposta, a confecção da curva de calibração e a determinação da precisão e

recuperação do tiocianato. De acordo com os resultados obtidos, a metodologia foi

considerada adequada, pois apresentou linearidade de resposta, obtendo-se como

valores do coeficiente de variação de 1,2 a 3,7 % intra dia, e de 2,6 a 7,2 % inter

dias. Deve-se ressaltar que estes valores aqui obtidos estão no limite inferior em

relação àquele preconizado para as metodologias analíticas, que é de no máximo

15% (CHASIN; SALVADORI, 1994). A recuperação média do tiocianato foi de 99,7 e

97,5; 89,7 e 83,4; 98,0 e 82,1 para os meios biológicos, a saber: soro, leite e líquido

amniótico, adicionados de solução padrão nas concentrações de 25 e 300 mcmol/L,

respectivamente. A título de exemplo e para comparar com os dados disponíveis na

literatura, verifica-se que Bruce et al. (1955); Imanari, Tanabe e Toida (1982);

Siqueira et al. (1996); Toida et al. (1984) e Tominaga e Mídio (1991) obtiveram

100%, 97,7%, 92,8%, 98,3% e 96,3%, respectivamente, de recuperação do

tiocianato, em sangue. Portanto, os valores obtidos na presente pesquisa

mostraram-se adequados para todos os materiais biológicos analisados.

Sabe-se que os níveis plasmáticos constantemente elevados do

tiocianato é fundamental para o desenvolvimento das patologias associadas à

exposição prolongada ao cianeto (SPENCER, 1999). Embora haja vários estudos

Discussão 180

em diferentes espécies animais, relatando os efeitos tóxicos devido à exposição

prolongada ao cianeto, as informações sobre a toxicocinética do cianeto e de seu

principal metabólito, o tiocianato, são bastante limitadas, o que torna muito difícil

interpretar os achados toxicológicos e avaliar os riscos de exposição que estas

substâncias possam causar; e, embora a absorção, a transformação e a eliminação

deste íon e de seu metabólito, têm sido estudadas em várias espécies de animais, o

perfil da cinética de transformação do cianeto em tiocianato tem recebido muito

pouca atenção. De fato, não há na literatura, descrição da avaliação comparativa

entre a fase de estro, na gestação e na lactação, em relação ao perfil toxicocinético

destas substâncias, em nenhuma espécie animal. Desta forma, partiu-se, numa

próxima etapa, para o estudo da cinética de transformação do cianeto em tiocianato.

A dose de KCN utilizada em tal estudo foi de 3,0 mg/kg, pois pesquisas anteriores

em porcos, caprinos e ratos (MANZANO, 2001; SOTO-BLANCO; GÓRNIAK;

KIMURA, 2001; SOUSA et al. 2003) mostraram que esta dose, administrada, mesmo

de uma só vez, não promoveu os sinais e sintomas típicos, nem letalidade, reportada

na intoxicação aguda pelo cianeto. Além disto, aquelas pesquisas prévias revelaram

que a administração de 3,0 mg/kg de KCN gerou concentrações detectáveis de

tiocianato no sangue dos animais tratados.

A administração pela via oral foi a de eleição, já que é esta a principal via

de exposição ao cianeto, tanto para humanos como para os animais (WAY, 1984).

Além disto, a propagação de xenobióticos se faz, preferencialmente, por via oral, por

meio da água de bebida e do alimento, e estas formas de administração têm sido

amplamente utilizadas em estudos de toxicologia, devido à conveniência, baixo

custo e mínimo estresse ao animal (YUAN, 1993). Por outro lado, a administração do

agente tóxico, por via oral, veiculada na alimentação ou na água de bebida,

Discussão 181

apresenta inconvenientes, sendo um deles, a dificuldade na padronização da

concentração em um meio biológico em relação a uma determinada dose do agente

tóxico em estudo, pois há grandes flutuações no consumo de água ou alimento.

Neste sentido, por exemplo, estudos conduzidos pelo The National Toxicology

Program, EUA, indicam que a incidência de mortes, quando se administra um

determinado agente tóxico, por água de bebida ou alimento é, geralmente, muito

menor do que aquela quando os animais recebem este toxicante, na mesma dose,

através de gavage (YUAN, 1993). Por outro lado, a utilização da gavage apresenta

também desvantagens; assim, tem sido demonstrado, em alguns estudos

toxicológicos, que a administração, por via oral, de uma só vez, de um determinado

agente tóxico, pode promover a saturação, tanto dos processos de

biotransformação, quanto os de eliminação de xenobióticos (YUAN et al., 1995).

Em relação aos parâmetros toxicocinéticos avaliados, estes devem ser

comparados entre os experimentos, com formas diferentes de administração, pois os

processos de absorção, biotransformação e eliminação poderão comportar-se

diferentemente. De fato, foi demonstrado que o alcalóide xantínico, cafeína, quando

administrado, por gavage, às ratas gestantes, produz proles com ectodactilia; no

entanto, este efeito não foi observado quando as mães receberam este alcalóide, na

mesma dose, veiculado à água de bebida. Esta discrepância de efeitos, segundo os

autores, estaria vinculado, diretamente, às diferenças na toxicocinética entre uma e

outra forma de administração (SMITH; CLARK, 1987). Em um outro estudo, Yuan et

al. (1995) observaram em ratos, que os efeitos carcinogênicos da exposição ao

composto benzil acetato por gavage são mais pronunciados, que aqueles em que se

administra esta substância veiculada ao alimento. Estes autores atribuem o efeito

carcinogênico, quando da administração por via intra esofágica, do composto,

Discussão 182

devido à maior formação de um metabólito intermediário, o qual possui a ação

carcinogênica de fato. Portanto, pode-se inferir que a forma de administração de um

determinado agente tóxico são passíveis de interferência significante na

toxicodinâmica. Além disto, deve-se considerar que a formação de metabólitos

podem ser, em alguns casos, a responsável pela toxicidade.

Vale ressaltar que, neste estudo, não foram realizadas administrações do

cianeto pelo alimento, pois este íon é bastante volátil, não sendo, portanto,

tecnicamente possível a incorporação do cianeto à ração. De fato, estudos

anteriores, conduzidos neste laboratório, identificaram grandes perdas quando da

peletização da ração contendo o KCN.

A cinética de uma substância química em um organismo, seja fármaco ou

toxicante, pode ser bastante complexa, já que vários processos, tais como a

absorção, a distribuição e a eliminação, atuam alterando as concentrações nos

tecidos e líquidos. Desta forma, são necessárias simplificações para predizer o

comportamento das substâncias no organismo. Um modo de se obter estas

simplificações é aplicar modelos matemáticos para os vários processos (DIPIRO et

al., 1996). Um tipo clássico de modelo utilizado em toxicocinética é o modelo

compartimental e, geralmente, utiliza-se modelos que melhor descrevem as

flutuações na concentração do xenobiótico, ao longo do tempo. Por exemplo, os

aminoglicosídeos, que não se distribuem extensivamente nos tecidos

extravasculares, devido, principalmente, ao caráter polar, são descritos no modelo

mono compartimental. Já os benzodiazepínicos, que são moléculas apolares, são

melhores descritos por modelos mais complexos (DIPIRO et al., 1996). Portanto,

pelas características da molécula do tiocianato, ou seja, polar, bem como pelo tipo

de gráfico da concentração versus o tempo, pode-se caracterizar a cinética de

Discussão 183

transformação do cianeto em tiocianato como um modelo mono compartimental.

Neste modelo assume-se que, após a administração de uma dose, ocorre uma

distribuição instantânea por todo o organismo, embora os processos de absorção e

eliminação sejam bastante dinâmicos.

Os resultados obtidos, neste estudo, mostraram o aumento significante

nos níveis plasmáticos de tiocianato da 3ª até a 24ª hora, após o tratamento com o

KCN, em ambas as formas de administração, em ratas, tanto na fase estrogênica

como na de lactação. Por outro lado, ratas gestantes apresentaram níveis

plasmáticos elevados do metabólito do cianeto somente da 3ª até a 12ª hora, após a

administração do KCN, tanto por gavage, como na água de bebida. Este dado

mostra, portanto, que os níveis séricos de tiocianato materno foram mais fugazes

que aqueles encontrados nas ratas virgens e lactantes. Por outro lado, deve-se

considerar que nas fêmeas gestantes o xenobiótico, o seu metabólito, ou ambos

podem atingir outros locais, como o líquido amniótico e o feto. Portanto, a hipótese

mais provável para explicar esta peculiaridade nas gestantes seria de que o

tiocianato não estaria restrito somente ao organismo materno, mas também ao fetal,

bem como no líquido amniótico.

Um outro achado interessante nesta avaliação foi a observação de que

aquelas fêmeas que receberam o KCN por gavage, apresentaram, de maneira geral,

níveis de tiocianato superiores, quando comparados com aqueles de fêmeas

tratadas com o agente tóxico na água de bebida. Deve-se ressaltar que estas

alterações foram verificadas nos três estados fisiológicos avaliados: fase

estrogênica, de gestação e de lactação. Como a quantidade de KCN administrado

na água de bebida não diferiu significantemente daquela administrada por gavage,

nos diferentes estados fisiológicos avaliados, uma possível explicação para tal fato

Discussão 184

poderia estar relacionada à quantidade de KCN ingerida, considerando-se o período

de tempo para o consumo da dose total do KCN, ou seja, de uma só vez, por

gavage, ou em quantidades pequenas, durante até 12 horas, na água de bebida.

Estas diferenças poderiam alterar o tempo necessário para a excreção do

metabólito. Neste sentido, verifica-se que a t1/2β do tiocianato de fêmeas, que

receberam o KCN por gavage, é maior quando o KCN é administrado por água de

bebida; portanto, pode-se supor que haverá, relativamente, maior tempo para a

excreção do metabólito e, conseqüentemente, maior concentração sangüínea de

tiocianato nos diferentes tempos avaliados, até 24 horas, naqueles animais que

receberam o KCN por gavage. Reforça esta hipótese os dados da Cmax e do tmax.

Assim, o parâmetro Cmax indica o pico da concentração sérica de qualquer

substância, neste caso do tiocianato, e o tmax refere-se ao tempo em que ocorre

este pico. Portanto, quanto maior o valor da Cmax, maior será a taxa de

transformação do cianeto em tiocianato. Assim, a análise dos dados relativos aos

parâmetros toxicocinéticos, comparando-se as duas vias, os valores de Cmax do

tiocianato foram maiores, quando administrou-se o KCN por gavage em um tmax

menor, em relação à água de bebida. Desta maneira, a transformação do cianeto em

tiocianato é mais rápida quando a administração é realizada pela via gavage.

Um outro importante dado obtido neste estudo toxicocinético foi aquele

que mostrou que os níveis séricos de tiocianato de ratas na fase estrogênica foram

sempre superiores àqueles obtidos tanto de fêmeas gestantes quanto de lactantes, a

partir da 3ª hora após a administração do cianeto, tanto por gavage quanto na água

de bebida, até o final da avaliação. Uma possível explicação para este fato poderia

estar relacionado à redistribuição do tiocianato, em outros órgãos ou líquidos

corporais, naquelas fêmeas gestantes e na fase de lactação. Reforça esta hipótese

Discussão 185

aqueles achados relativos à dosagem dos níveis de tiocianato no leite e no líquido

amniótico. Assim, foram observados aumentos nos níveis lácteos do tiocianato nas

fêmeas, tanto as tratadas com o KCN por gavage quanto na água de bebida, a partir

da primeira dosagem, ou seja, já aos 30 minutos após a administração de KCN,

sendo que estes níveis elevados persistiram até a 24ª hora desta avaliação. Neste

sentido, um estudo conduzido por Pavelka et al. (2002) mostrou que o iodeto

ingerido concentra-se também na glândula mamaria. Uma vez que é amplamente

conhecido que o tiocianato compete com o iodeto na glândula tireóide (DOHAN; DE

LA VIEJA; CARRASCO, 2000), o aumento da concentração do metabólito do cianeto

na glândula mamaria poderia estar também relacionado à competição deste íon com

o iodeto e, desta maneira, acumulando-se neste local.

Em relação ao líquido amniótico, embora a diferença significante nos

níveis de tiocianato tenha sido observado somente na 3ª hora e apenas naquelas

fêmeas tratadas com KCN por gavage, em todas as avaliações subsequentes, deste

meio biológico, verificou-se que, tanto por gavage quanto na água de bebida, foram

detectados níveis superiores de tiocianato, quando comparados ao tempo zero.

Além do líquido amniótico, deve-se considerar, também, a passagem do cianeto

para o compartimento fetal. De fato, segundo Dencker e Danielsson (1987) e

Schwartz (2001), substâncias aniônicas, tais como os ácidos fracos, neste estudo, o

ácido cianídrico, podem acumular no embrião de rato, possivelmente devido ao

gradiente de pH entre o plasma materno, que é mais ácido em relação ao pH do

feto, tornando este composto na forma ionizável no embrião. Portanto, nesta

situação, haverá o “aprisionamento” deste íon no organismo fetal (SCOTT; NAU,

1987). Ainda, como em ratos, tanto na placenta como no feto, existe a enzima

rodanase (TEWE et al., 1977), responsável pela transformação do cianeto em

Discussão 186

tiocianato, pode-se teorizar que o cianeto “aprisionado” poderá ser transformado em

seu metabólito.

Vale ressaltar que a inclusão na análise da redistribuição do tiocianato no

leite e no líquido amniótico foi de fundamental importância para a interpretação

correta dos dados obtidos no estudo toxicocinético, pois se levar em consideração

somente os parâmetros Cmax e tmax de ratas que receberam o KCN, tanto na água

de bebida quanto por gavage, poder-se-ia concluir, erroneamente, que as fêmeas

gestantes biotransformam menos o cianeto, quando comparadas às ratas lactantes e

àquelas em fase de estro.

Estima-se que aproximadamente 80% do cianeto absorvido é

transformado em tiocianato, o qual é quase completamente eliminado pelos rins

(ANSELL; LEWIS, 1970). Portanto, a eficiência da excreção renal é um fator

determinante para a eliminação e o estágio fisiológico no qual o animal se encontra

deve ser um fator que afeta consideravelmente a sua eficiência. Sabe-se que quanto

maior for o valor do clearence, maior será a eliminação do xenobiótico (VRIES,

1996). No entanto, deve-se considerar que a t1/2β de uma determinada substância é

dependente, não só da taxa de eliminação mas também da distribuição. Por

conseguinte, se uma substância apresenta uma t1/2β longa, esta não estaria

necessariamente relacionada somente ao clearance baixo, mas também a um alto

valor do Vd (BIRKETT, 1988; NAU, 1987). De fato, os dados obtidos na presente

pesquisa mostraram que o clearance do tiocianato foi superior naquelas fêmeas na

fase de estro, que receberam o KCN na água de bebida, quando comparou-se este

parâmetro com aqueles dos outros grupos de animais, nas diferentes fases

fisiológicas, que receberam o KCN de ambas as formas. No entanto, de todos os

grupos de ratas avaliadas, foram aquelas gestantes, que receberam o KCN por

Discussão 187

gavage, que apresentaram t1/2β maior. Como o Vd destes animais mostrou-se como

um dos mais alto, pode-se concluir que, de fato, este parâmetro tem papel

fundamental para a melhor interpretação da t1/2β.

O parâmetro ASC está relacionado ao clearance, por exemplo, de um

agente tóxico em estudo, e quanto maior seu valor, menor o clearance e, portanto,

maior a exposição ao xenobiótico (VRIES, 1996). Os resultados aqui obtidos

mostraram que os maiores valores de ASC foram verificados em ratas na fase

estrogênica. Portanto, pode-se hipotetizar que os animais neste estado fisiológico

estão mais expostos ao tiocianato e, conseqüentemente, mais susceptíveis aos

efeitos tóxicos desta substância. Ainda, considerando-se este parâmetro, ao

comparar as duas formas de administração do cianeto: gavage e água de bebida,

verifica-se que os valores de ASC são menores quando da administração do KCN na

água de bebida. Uma possível justificativa para este achado estaria relacionada à

ingestão que, pela água de bebida, ocorre de maneira gradual, o que mimetizaria

pequenas seções de gavage. Portanto, a transformação do cianeto em tiocianato e a

eliminação deste último podem estar ocorrendo de maneira simultânea a cada

seção; enquanto que na administração do KCN intra esofagiano este fato não

ocorre.

Partindo de dados disponíveis na literatura de que ratos toleram até 30

mg/kg/dia de KCN, quando administrados de maneira fracionada e que a dose letal

de KCN para ratos (DL50) é de 10 mg/kg/dose (BALLANTYNE, 1987) optou-se, nesta

pesquisa, por administrar nas fêmeas, gestantes ou lactantes, as doses de 1, 3 e 30

mg/kg/dia de KCN. Como já mencionado, uma vez que a grande maioria do cianeto

é biotransformado em tiocianato - cerca de 80% - (ANSELL e LEWIS, 1970), foram

Discussão 188

escolhidas as doses de 0,8; 2,4 e 24 mg/kg/dia de KSCN, o que eqüivaleria,

respectivamente, à menor, intermediária e maior dose do KCN aqui utilizado.

Optou-se por realizar a administração prolongada do KCN e do KSCN, por

via oral, na água de bebida, uma vez que o método por gavage poderia produzir,

grande estresse nos animais, e este acarretar em abortamentos. Além disto, o

método de administração intra esofagiano não permitiria submeter os animais a

administrações de doses superiores a 10 mg/kg de KCN, pois esta sabidamente

produz sinais claros de intoxicação aguda em ratos (SOUSA, 2000). Para maior

confiabilidade neste procedimento, foi necessário avaliar o consumo da água

contendo KCN e KSCN, pois a adição destas substâncias poderiam alterar a

palatabilidade, causando maior ou menor consumo de água. No entanto, os

resultados obtidos revelaram não haver queda no consumo de água pelos animais

destes grupos, permitindo concluir, portanto, que este procedimento de

administração mostrou-se adequado.

Uma vez que a implantação embrionária em ratos ocorre até o 5o dia de

gestação (SZABO, 1988), e como o presente estudo não objetivava avaliar as

alterações na pré-implantação, escolheu-se por administrar o KCN e o KSCN na

água de bebida, do 6o ao 20º dia de prenhez. Assim, neste estudo, as gestantes

foram expostas às diferentes doses dos toxicantes por 14 dias.

O peso corporal é um dos principais parâmetros de avaliação toxicológica,

apresentando para o investigador um aviso, muitas vezes precoce, do aparecimento

dos efeitos tóxicos de uma determinada substância nos animais (STEVENS; GALLO,

1989). Vários são os trabalhos que associaram a intoxicação prolongada do cianeto

à queda do ganho de peso. Assim, Panigrahi et al. (1992) verificaram queda no

ganho de peso em frangos de corte; Doherty, Ferman e Smith (1982) em hamsters;

Discussão 189

Aletor (1993) e Guzmán, Ochoa e Gil (1977) em ratos; Soto-Blanco (2002) em

caprinos e Manzano (2001) em suínos. Ainda, Blanc et al. (1985) verificaram este

efeito em humanos expostos ocupacionalmente ao cianeto. No presente estudo não

foram evidenciados queda no ganho de peso das gestantes e no consumo de ração,

nas ratas dos diversos grupos experimentais que receberam as diferentes doses de

KCN ou KSCN. Por outro lado, um estudo realizado, neste laboratório, utilizando-se

ratos machos, nos quais se administrou o KCN, também na água de bebida, durante

este mesmo período, 14 dias, na dose de 9,0 e 12,0 mg/kg, ou seja, quase 1/3

menor do que a dose máxima aqui utilizada, revelou haver alteração no ganho de

peso (SOUSA, 2000). Desta maneira, pode-se inferir que o estado fisiológico ou o

sexo, ou ambas variáveis, alteram a toxicidade ao cianeto, considerando-se o

parâmetro peso.

Diversos sistemas do organismo são afetados na intoxicação prolongada

pelo cianeto (SPENCER, 1999), razão pela qual vários parâmetros devem ser

utilizados para avaliar estes efeitos. Entre estas principais manifestações tóxicas

está o bócio. De fato, vários trabalhos, em diferentes espécies de animais, tais como

em ratos (TEWE; MANNER; GOMES, 1977), cães (KAMALU; AGHARANYA, 1991),

suínos (MANZANO, 2001; OKE, 1984; ONG, 1989; TEWE et al., 1984), e também no

homem (ADEWUSI; AKINDAHUNSI, 1994), apontam o efeito tireotóxico produzido

pela exposição contínua e prolongada ao cianeto. O mecanismo desta ação tóxica

está bem estabelecido, sendo este a competição do tiocianato com o iodeto na

proteína transportadora deste íon, na tireóide, diminuindo, portanto, a captação de

iodeto por esta glândula (CARRASCO, 1993; DELANGE; ERMANS, 1996; KONDE

et al., 1994; PHILBRICK et al., 1979).

Discussão 190

A presente pesquisa revelou no estudo histopatológico das tireóides das

gestantes, que receberam as maiores doses de KCN e KSCN, a presença de grande

quantidade de vacúolos de reabsorção no colóide dos folículos tireoideanos. Vale

ressaltar que, embora em menor quantidade, estes vacúolos também foram

encontrados nos demais animais prenhes dos diferentes grupos experimentais.

Segundo Kaneko (1989), há dois tipos de bócio, aquele não tóxico, o qual é, ainda,

subdividido em bócio simples e hipotireoidismo, e o tóxico. No bócio simples, os

níveis dos hormônios tireoideanos estão na faixa de normalidade, pois há o aumento

compensatório na massa glandular da tireóide, maximizando a captura de iodeto e

secretando quantidades normais dos hormônios tireoideanos. Caso o estímulo

prossiga, o bócio simples pode evoluir para o hipotireoidismo, quando os níveis dos

hormônios tireoideanos estão diminuídos, evidenciando, desta forma, os sinais

clínicos como a obesidade, o mixedema, a pele seca, perdas de pelos e cabelos e,

na forma mais grave, o aparecimento do cretinismo. Portanto, pode-se sugerir que o

aparecimento de grande quantidade de vacúolos de reabsorção caracterize o bócio

simples nestes animais. Reforça esta hipótese, o estudo conduzido por Carcangiu

(1997), o qual associou estes vacúolos ao aumento da atividade secretora da

glândula tireóide.

Por outro lado, a avaliação bioquímica destas mães, mostraram, ao

contrário do que se supunha, não haver alterações nos níveis de colesterol, um

parâmetro utilizado para a avaliação da função da tireóide (TANIS; WESTENDORP;

SMELT, 1996). Assim, sabe-se que a concentração desta substância é inversamente

proporcional àquelas dos hormônios tireoideanos. Portanto, no hipotireoidismo, os

níveis sangüíneos de colesterol apresentam-se elevados, em qualquer espécie

animal estudada (KANEKO, 1989). Pouco poderia ser especulado, neste momento

Discussão 191

sobre este resultado. Uma conjetura seria que a alteração da função hepática

poderia acarretar num défice na produção de colesterol por este órgão. De fato,

apesar da avaliação bioquímica mostrar somente alteração da enzima AST, o estudo

histopatológico do fígado, nos diferentes grupos experimentais, revelou a presença

de congestão hepática, vacuolização dos hepatócitos e proliferação dos ductos

biliares, o que poderia estar promovendo o comprometimento das funções deste

órgão. Fortalece esta suposição os dados obtidos por Kamalu (1993), em cães,

expostos prolongadamente ao cianeto, nos quais também foram verificadas lesões

no parênquima hepático.

Um importante efeito produzido pela exposição prolongada pelo cianeto é

o neurotóxico. Em seres humanos, as principais manifestações neurológicas são a

neuropatia atáxica tropical, o konzo, a ambliopia por tabaco, a neurite retrolobular e

a atrofia óptica (BANEA; TYLLESKÄR; ROSLING, 1997; FREEMAN, 1988; NJOH,

1990; OSUNTOKUN, 1979; TYLLESKÄR et al., 1995).

Na presente pesquisa, o estudo histopatológico do SNC das ratas

gestantes que receberam as maiores doses, tanto de KCN, quanto de KSCN

revelaram significantes alterações neste nível. Estes achados têm significante

contribuição para aquelas pesquisas que objetivam determinar o mecanismo de

ação neurotóxico produzido pelo cianeto no SNC. Desta maneira, embora existam

várias teorias procurando explicar quais seriam os mecanismos que levariam à

neurotoxicidade (BOROWITZ et al., 1994; ISOM; BOROWITZ, 1995; KANTHASAMY

et al. 1997; MILLS et al., 1996), a grande maioria destas exclui a possibilidade do

tiocianato ser o responsável ou, pelo menos, o coadjuvante neste efeito tóxico.

Entretanto, uma vez que este estudo claramente evidenciou que a administração do

KSCN, nas fêmeas, produziu lesões no SNC, semelhantes àquelas verificadas

Discussão 192

quando da administração do KCN, e, sabendo-se que a transformação de tiocianato

para cianeto não ocorre (BALLANTYNE, 1987; UNITED STATES ARMY, 1999),

pode-se supor que o metabólito do cianeto tem participação na neurotoxicidade

produzida por esta exposição contínua. Reforça esta teoria, aquela sugerida por

Spencer (1999), o qual verificou, em ratos, que o tiocianato modula a função dos

receptores dl-alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-isoxazol-4-propionato (AMPA), uma

subclasse dos receptores glutaminérgicos, no tecido do SNC. Assim, este

pesquisador propõe que o tiocianato potencializaria a resposta mediada por estes

receptores, resultando em danos aos neurônios ricos neste tipo de receptor.

O levantamento dos trabalhos encontrados na literatura, referentes aos

efeitos tóxicos prolongados produzidos pelo cianeto, mostra ser a alteração da

função tireoidiana e as lesões no SNC os principais efeitos tóxicos descritos nesta

exposição, nas diferentes espécies animais estudadas. Por outro lado, pesquisas

conduzidas por Kamalu (1993), em cães; Okolie e Osagie (1999), em coelhos; e,

mais recentemente, Manzano (2001), em suínos, revelam que a intoxicação

prolongada por KCN pode, também, causar lesão no parênquima renal. Da mesma

maneira, o estudo histopatológico realizado, neste laboratório, no tecido renal de

ratos machos, tratados por 14 dias com KCN, revelaram, também, alterações neste

órgão (SOUSA et al., 2002). No presente experimento, estas lesões foram também

verificadas, nas gestantes tratadas com o KCN e com o KSCN.

Existem algumas hipóteses que tentam explicar o mecanismo de ação

nefrotóxico produzido pela exposição prolongada ao cianeto. Uma delas seria a de

que os rins, por possuírem também a enzima rodanase, quando da exposição

crônica ao cianeto, haveria o comprometimento da função desta enzima, e,

conseqüentemente, a formação de radicais livres, promovendo a peroxidação das

Discussão 193

membranas de células renais (ALETOR, 1993). Uma outra teoria estaria relacionada

ao fato de o tiocianato ser um vasodilatador, podendo este, então, por este

mecanismo, acarretar em nefrose. De fato, o tiocianato já foi utilizado, na clínica de

humanos, como medicamento anti-hipertensivo, por sua potente atividade

vasodilatadora (CARRASCO, 1993). Uma vez que esta pesquisa revelou que

aquelas fêmeas tratadas com o KSCN, também apresentaram lesões ao nível renal,

entre os prováveis mecanismos de ação nefrotóxica na exposição prolongada ao

cianeto, descartar-se a hipótese na qual se propõe a inibição da enzima rodanase,

sendo, portanto, a segunda teoria a mais factível.

Uma patologia que também vem sendo associada à exposição

prolongada ao cianeto é a diabetes pancreática e do tipo J (MCMILLAN;

GEEVARGHESE, 1979). Estas formas de diabetes são encontradas principalmente

em regiões tropicais, onde os indivíduos acometidos possuem antecedentes de

desnutrição, são insulino-dependentes e resistentes à cetose, e, de maneira geral,

são adolescentes ou adultos jovens. A diabetes do tipo J seria a forma branda e a

pancreática a mais severa (MCMILLAN; GEEVARGHESE, 1979). McMillan e

Geevarghese (1979) encontraram hiperglicemia em ratos expostos prolongadamente

ao cianeto; além disto, Kamalu (1991) observou, em cães, aumento na

gliconeogênese, hipoinsulinemia e fibrose nas ilhotas de Langerhans.

Os resultados obtidos neste estudo revelaram depleção de células das

ilhotas de Langerhans, naquelas ratas gestantes que receberam a maior dose de

KCN. Ainda, a análise bioquímica mostrou que estas fêmeas possuíam níveis

maiores de glicose de forma significante. Segundo Kamalu (1991), o aumento dos

níveis de glicose nesta intoxicação seria causado pela ação direta tanto dos íons

cianeto quanto do tiocianato no pâncreas, promovendo lesão neste órgão e,

Discussão 194

conseqüentemente, a diminuição da secreção de insulina. Uma vez que, no presente

estudo não foi observado qualquer alteração, histopatológica ou bioquímica,

naquelas gestantes tratadas mesmo com a maior dose de KSCN, inabilita o

tiocianato como um possível candidato a produzir a toxicidade no pâncreas

endócrino. Portanto, pode-se inferir que a alteração no tecido pancreático é devido

ao cianeto, e não ao seu metabólito, o tiocianato.

Ainda, em relação à toxicidade do cianeto no pâncreas, uma comparação

interessante é aquela entre os dados obtidos neste laboratório, quando se

administrou a ratos machos, durante o mesmo período, o KCN, e os dados agora

obtidos em ratas gestantes. Assim, no estudo com os machos, ao contrário do

verificado nesta pesquisa, não foi encontrada nenhuma alteração que indicasse

qualquer comprometimento do tecido pancreático endócrino. Portanto, a gestação,

de alguma maneira, contribuiu para o desencadeamento do efeito tóxico no

pâncreas endócrino, produzido pelo cianeto.

Um dado relevante neste estudo foi aquele obtido, quando da avaliação

histopatológica, no qual se verificou que fêmeas que receberam o KCN e o KSCN,

durante a gestação, continuaram a apresentar alterações histológicas, em todos os

tecidos, exceto o pancreático, 22 dias após a última administração dos agentes

tóxicos. Como os níveis do tiocianato destas fêmeas experimentais não diferiram

daqueles das ratas do grupo controle, pode-se supor que as lesões encontradas

foram produzidas na época da exposição a estas substâncias, ou seja, durante a

gestação. Reforçam estes dados provenientes da histopatologia aqueles da análise

bioquímica, na qual se verificou que as ratas submetidas à maior dose de KCN

apresentaram níveis elevados de ALT e uréia. Assim sendo, pode-se hipotetizar que

estas lesões produzidas pelo cianeto e/ou tiocianato não são transitórias.

Discussão 195

O interesse pelas malformações congênitas datam da antigüidade da

civilização. Naquele tempo, a explicação para tal fato seria que estas “teras”

estavam relacionadas a um evento mitológico ou, principalmente, à punição dos

pecados (GILDEN; BODEWITZ, 1991). No entanto, as malformações nunca

despertaram interesse pela comunidade científica, até o começo do século passado,

quando os cientistas se atinham, praticamente, à incidência de malformações em

condições de laboratório e, só esporadicamente, estas alterações eram associadas

às situações cotidianas, por exemplo, com a exposição ao vírus da rubéola e à

radiação. Foi o desastre com a talidomida, na década de 60, aquele que alterou o

curso destas pesquisas e, deste então são muitos os laboratórios e pesquisadores

mobilizados no estudo destes efeitos tóxicos (ROGERS; KAVLOCK, 2001).

Atualmente, esta área da ciência está bem desenvolvida, sendo a mesma

denominada de toxicologia do desenvolvimento, a qual é parte da toxicologia

reprodutiva, e que é, ainda, subdividida em toxicologia pré e pós-natal (PETERS,

1998). Por outro lado, enquanto hoje em dia, muitas novas informações estão

disponíveis sobre a origem das desordens do desenvolvimento, resultante da

exposição perinatal de substâncias químicas, há uma grande preocupação dos

pesquisadores, relativa à acurácia dos protocolos existentes para aferir

adequadamente os potenciais riscos da exposição às diversas substâncias

químicas, durante o desenvolvimento. Neste sentido, embora existam pequenas

variações nos protocolos de avaliação de risco de toxicologia pré-natal, entre as

agências de regulamentação, de maneira geral, estas requerem, para o teste, um

grupo de animais controle e, no mínimo, outros três, nos quais os animais receberão

as diferentes doses da substância química a ser avaliada. Em geral, a escolha

destas doses são baseadas nos seguintes critérios: uma que produza efeitos

Discussão 196

tóxicos, uma outra em que os animais não manifestem qualquer alteração de

toxicidade e a outra, intermediária entre estas. Esta substância a ser testada deverá

ser administrada, no mínimo, da implantação à cesariana. Um dia antes do parto, as

fêmeas são submetidas à cesariana, avaliando-se o número de corpos lúteos

implantados, sendo os fetos e as placentas pesados e, a seguir, metade da prole

utilizada para avaliação esquelética e a outra metade para pesquisa de

anormalidades viscerais (OECD, 1996; USEPA, 1991; WHO, 1967).

Segundo Claudio et al. (1999), a maior limitação destes protocolos de

avaliação de toxicidade é que não há o exame dos filhotes, em nenhuma fase pós-

natal, o que, na maioria das vezes, poderá levar a erros no julgamento sobre o efeito

teratogênico da substância testada. De fato, por exemplo, o heptacloro, pode causar

aumento de morte pós-natal, depois do 6º dia do nascimento. Ainda, esta substância

pode produzir catarata, que se manifesta somente após o 21º dia de vida

(NAROTSKY; KAVLOCK, 1995). Além desta, uma outra crítica bastante procedente,

destes mesmos autores, aos protocolos de avaliação de toxicidade do

desenvolvimento, refere-se à carência de dados toxicocinéticos, antes de se realizar

estes testes, ficando bastante subjetiva a escolha das três doses do xenobiótico a

ser avaliado, bem como do comportamento cinético da substância em estudo.

Portanto, a presente pesquisa visou verificar os possíveis efeitos

teratogênicos quando da exposição ao cianeto, avaliando-se o efeito desta

substância na prole, não só por meio do protocolo convencional mas também após o

nascimento.

Escassos são os trabalhos na literatura, relatando os efeitos tóxicos

perinatais produzidos pelo cianeto e seu principal metabólito, o tiocianato, nas

diferentes espécies animais e, mesmo nestas pesquisas existentes, os dados são

Discussão 197

bastante controversos. Assim, Tewe, Manner e Gomez (1977) verificaram que,

embora houvesse aumento dos níveis de tiocianato na urina, no soro, no líquido

amniótico de ratas gestantes, cujas dietas continham cianeto, mandioca fresca ou

processada, não foi observada qualquer alteração em suas proles. Por outro lado,

Singh (1981) relatou um alto índice de malformações, tais como retardo no

crescimento, bem como defeitos em membros de fetos de ratas cuja dieta básica

durante a prenhez consistia em 80% de farinha de mandioca. Uma possível

explicação para esta divergência nos achados, entre as duas pesquisas, poderia

estar relacionada aos níveis de KCN ingeridos pelas mães, nestes estudos. Além

disto, uma crítica a estas pesquisas anteriores seria relativa à quantidade de farinha

de mandioca adicionada à ração das gestantes, que poderia causar total

desbalanceamento da ração e, conseqüentemente, desnutrição, o que, sabidamente

acarreta em efeitos teratogênicos (ROGERS; KAVLOCK, 2001). Portanto, no

presente estudo, optou-se por utilizar o KCN, adicionado na água de bebida, com a

finalidade de não produzir o desbalanceamento da ração.

A avaliação da performance reprodutiva materna é um dos principais

parâmetros utilizados nos protocolos convencionais de avaliação de toxicidade do

desenvolvimento. Esta avaliação permitiria verificar com maior precisão e

profundidade, se o cianeto e o seu principal metabólito produziria efeitos tóxicos, não

só diretamente no organismo fetal, mas também na fisiologia reprodutiva da fêmea,

o que poderia levar aos efeitos tóxicos no feto. O presente estudo revelou que, de

todos os parâmetros pesquisados, a porcentagem de perda pós-implantação foi o

único que se apresentou aumentado, e somente naquelas gestantes que receberam

3 e 30 mg/kg/dia de KCN. Quanto às análises óssea e visceral dos fetos, estas

revelaram significância apenas no número de fetos com anomalias viscerais, mas

Discussão 198

não no número de ninhadas afetadas, e somente naqueles fetos de mães expostas

a maior dose de KCN.

Por outro lado, embora não fossem detectadas alterações bioquímicas ou

no peso médio do cérebro e cerebelo, a avaliação histológica de filhotes, no 22º dia

de vida, de mães tratadas somente durante a gestação, com as maiores doses tanto

de KCN, quanto de KSCN, mostraram evidentes as alterações, principalmente ao

nível de tecido renal, hepático e SNC. Este dado tem importante contribuição, não só

evidenciando os efeitos tóxicos da administração pré-natal do cianeto, mas também

reforçando a importância da avaliação pós-natal dos filhotes.

Vale ressaltar que não foram evidenciadas diferenças significantes no

ganho de peso e consumo de água entre fêmeas do grupo controle e experimental,

durante a fase de gestação, portanto, pode-se descartar a possibilidade de que as

alterações aqui encontradas nos filhotes, provenientes de mães que receberam as

maiores doses de KCN ou KSCN seriam devido à toxicidade materna, o que,

sabidamente, poderia levar, indiretamente à toxicidade fetal (BARROW, 2000;

JONG-CHOON KIM et al., 2001; KRAVER, 1987).

Um dado que merece ser melhor explorado em futuras pesquisas é

aquele concernente à semelhança e intensidade de lesões produzidas tanto pela

administração pelo KCN quanto pelo KSCN, nos filhotes experimentais. Assim, como

no organismo não há transformação de tiocianato para cianeto (BALLANTYNE,

1987; UNITED STATES ARMY, 1999), reforça-se a hipótese de que as lesões

observadas nos diferentes sistemas, inclusive no SNC, quando da exposição

prolongada ao cianeto não estaria relacionada diretamente a esta substância e sim

ao seu principal metabólito.

Discussão 199

O leite materno é uma mistura complexa cuja composição é dependente

das atividades de secreção da glândula mamaria e dos processos de transporte nela

existente, refletindo as necessidades nutricionais dos neonatos mamíferos

(MCMANAMAN; NEVILLE, 2003). No entanto, o leite pode também ser uma via de

excreção materna de substâncias tóxicas (BEGG et al., 2002; OSKARSSON;

HALLÉN; SUNDBERG, 1995). De fato, diversas substâncias químicas são capazes

de serem transferidas pelo leite, representando uma importante fonte de intoxicação

para o neonato. Como exemplos, estão algumas toxinas encontradas em plantas,

como alcalóides pirrolizidínicos e ptaquilosídeos (ALONSO-AMELOT, 1997;

MEDEIROS; GÓRNIAK; GUERRA, 1999) e alguns contaminantes ambientais como

o mercúrio e o chumbo (OSKARSSON; HALLÉN; SUNDBERG, 1995; ROZMAN;

KLAASSEN, 2001).

Deve-se ressaltar que a lactação é um período no qual os recém-nascidos

são mais sensíveis que os adultos aos efeitos tóxicos das substâncias químicas, já

que se sabe que o neonato tem baixa capacidade de biotransformar os xenobióticos

pela imaturidade dos sistemas enzimáticos (ALCORN; MCNAMARA, 2003.).

Acrescente-se, também, que certos sistemas irão se desenvolver completamente

somente no período pós-natal. Por exemplo, o SNC no rato se forma completamente

ao redor do 21º dia de vida (KAUFMANN, 2000) e, neste caso, existem claras

evidências que este sistema em desenvolvimento é muito mais sensível, em relação

ao SNC de ratos adultos, aos vários toxicantes (TILSON, 2000).

Por outro lado, a despeito da grande importância da excreção de vários

xenobióticos no leite e suas prováveis conseqüências na saúde do neonato,

surpreendentemente, muito pouca atenção tem sido dada à toxicologia do

desenvolvimento pós-natal e a exposição aos diferentes agentes tóxicos pelo leite

Discussão 200

(FLEISHAKER, 2002). De fato, Loebstein, Lalkin e Koren (1997) apontam que há

grandes lacunas nas informações sobre a transferência para o leite, em humanos e

animais, de substâncias químicas, bem como a extensão da exposição do lactente

aos xenobióticos. Portanto, foi também objetivo da presente pesquisa, avaliar os

possíveis efeitos tóxicos na prole de ratas expostas ao KCN e ao KSCN, durante o

período de lactação.

Partindo-se do conhecimento que ratos neonatos não acessam a água de

bebida antes do 18º dia de vida (PAVELKA, et al., 2002), optou-se por administrar o

KCN e o KSCN, até esta data, já que este procedimento permitiria que apenas as

lactantes ingerissem a dieta hídrica, impossibilitando, assim, que os filhotes se

expusessem diretamente a estes xenobióticos. Portanto, os possíveis efeitos tóxicos

observados nos filhotes seriam mediados exclusivamente pela ingestão do leite

materno.

Esta pesquisa revelou que lactantes, tratadas com as maiores doses de

KCN ou KSCN, apresentaram níveis séricos de tiocianato significantemente maiores

que aquelas do grupo controle; e, da mesma maneira que o ocorrido com aquelas

fêmeas gestantes, embora a avaliação relativa tanto ao consumo de ração e peso,

bem como à bioquímica não revelasse qualquer alteração nos parâmetros

pesquisados, o estudo histopatológico mostrou lesões no tecido nervoso, hepático e

renal e, ainda, foram verificados aumento de reabsorção no colóide dos folículos

tireoideanos. No entanto, este mesmo experimento não mostrou qualquer alteração

no pâncreas endócrino, como o verificado naquelas ratas tratadas com os agentes

tóxicos durante a prenhez. A ausência de alteração neste último órgão pode reforçar

a suposição, aqui levantada, que, de alguma maneira, este estado fisiológico, ou

seja, a gestação, contribui para a depleção de células das ilhotas de Langerhans.

Discussão 201

Ainda, em relação à dosagem de tiocianato destas mães lactantes, este

estudo evidenciou o aumento nos níveis desta substância no leite de todas as

lactantes dos diferentes grupos experimentais que receberam o KCN, bem como

naquelas tratadas com as maiores doses de KSCN. Este achado corrobora com

outros estudos, os quais verificaram que a concentração láctea do tiocianato é

diretamente influenciada pela dieta (GARG; GUPTA, 1987; MOATE et al., 1996;

SAHA; SINGHAL, 1993; SUBUH et al., 1995;).

O leite é composto por três frações: aquosa, lipídica e protéica.

Dependendo de suas características físico-químicas, os xenobióticos podem estar

presentes em quaisquer destas porções. Há fortes indícios de que o tiocianato fique,

em grande parte, ligado às proteínas do leite (LUNDQUIST et al., 1985). Entretanto,

pouco poderia ser especulado sobre a maneira pela qual há a passagem do

tiocianato para a glândula mamaria, já que, no presente momento, há poucas

informações disponíveis na literatura a respeito dos mecanismos e fatores que

regulam a entrada de substâncias químicas no leite. Dentre estas poucas

informações, existe aquela teoria a qual propõe ser a difusão passiva o principal

meio de transferência para a glândula mamaria da maioria dos xenobióticos

(LOEBSTEIN; LALKIN; KOREN, 1997).

No entanto, o acúmulo de certos fármacos como a cimetidina e a

ranitidina, no leite de ratas, em níveis superiores àqueles esperados pela simples

difusão passiva, sugerem, também, a presença de processos de transporte ativo,

mediado por transportadores ou carregadores na glândula mamaria (MCNAMRA;

MEECE; PAXTON, 1996). Neste sentido, existem estudos que mostram que o

epitélio mamário pode expressar certas proteínas transportadoras de xenobióticos,

as quais são, também, encontradas no epitélio renal e hepático (ITO; ALCORN,

Discussão 202

2003). Estes transportadores de xenobióticos, como por exemplo, a P-glicoproteína

que media o efluxo de toxicantes, através do epitélio, podem ter a única finalidade

de eliminação de agentes tóxicos. Ainda, existem as proteínas que transportam tanto

substâncias fisiológicas essenciais, como glicose, proteínas e peptídeos, como

também xenobióticos. Por exemplo, os polipepitídeos transportadores de ânions

orgânicos (OATPs), os quais são encontrados no epitélio da glândula mamaria, tanto

de humanos como de ratos, e estão envolvidos no transporte, por exemplo de

hormônios tireoideanos, prostaglandinas e bilirrubina, e também dos fármacos

digoxina, benzilpenicilina e lovastatina (DOHAN et al., 2000; ITO; ALCORN, 2003).

Recentemente, foi descoberta na glândula mamaria, a proteína, Na+I-

symporter (NIS), com a mesma função apresentada na tireóide, ou seja, a de

transferir o iodeto para o leite (SPITZWEG et al., 1998). Supõe-se que a existência

desta proteína, nas células na glândula produtora de leite, teria como finalidade

suprir o neonato com o iodeto, pois sabe-se que os estoques deste íon na tireóide

de neonatos são muito baixos e a sua principal fonte é o leite materno. Suporta esta

conjetura um estudo conduzido por Cho et al. (2000), o qual mostram que há

significante aumento da recaptura de iodo e dos níveis de NIS no tecido mamário de

ratas após o parto. Portanto, pode-se supor que o aumento dos níveis lácteos de

tiocianato nas fêmeas, aqui verificados, dos diferentes grupos experimentais, tenha

ocorrido por este mecanismo, ou seja, às custas da inibição da captura do iodeto

nesta glândula. Corrobora com esta suposição uma pesquisa conduzida por Clewell

e Gearhart (2002), que verificaram aumento dos níveis de perclorato, em ratas

lactantes, substância que compete com o iodeto pelo NIS.

A comparação entre os níveis séricos de tiocianato, entre as lactantes e

as suas respectivas proles, mesmo aquelas que não foram expostas ao KCN ou ao

Discussão 203

KSCN, permite concluir que os filhotes apresentam, de maneira geral, maiores

concentrações sangüíneas de tiocianato. De fato, sabe-se que o tiocianato é um

componente normal do leite, participando no sistema lactoperoxidase, um sistema

inespecífico de inibição do crescimento antimicrobiano (REITER, 1985). No entanto,

ao se realizar uma outra comparação, entre os níveis de tiocianato sérico de filhotes,

machos e fêmeas, de mães tratadas com o KCN ou o KSCN e aqueles de seus

respectivos controles, verifica-se que, exceto naquela prole de fêmeas provenientes

de lactantes tratadas com as menores doses de KCN e KSCN, todos os filhotes dos

diferentes grupos experimentais apresentaram níveis sangüíneos de tiocianato

significantemente maiores. Este dado sugere que o período de lactação também

poderia expor as proles, dos diferentes grupos experimentais, aos efeitos tóxicos do

tiocianato. De fato, embora o estudo bioquímico, e o ganho de peso, nada tenham

mostrado nestes animais que indicasse algum efeito tóxico, a avaliação

histopatológica claramente evidenciou alterações no parênquima hepático, renal,

bem como no SNC, sobretudo naqueles filhotes de ratas tratadas com a maior dose

de KCN ou KSCN.

Um questionamento que poderia ser levantado, neste momento, seria

sobre a possibilidade de que tanto a quantidade como a qualidade do leite produzido

por estas mães, dos diferentes grupos experimentais, poderiam ser os responsáveis

pelos efeitos observados nas suas proles. Assim, com o objetivo de esclarecer esta

dúvida, realizou-se o experimento no qual se avaliou a quantidade de leite produzida

por estas fêmeas, tomando-se como referência ou o peso corpóreo das mães ou o

de seus filhotes, antes e após a mamada. Os dados mostraram que, embora

houvesse diferenças nas quantidades de leite produzido, considerando-se este

cálculo por um ou por outro método, ou seja, tomando-se como referência o peso

Discussão 204

corpóreo das mães ou das proles, não foram detectadas alterações significantes na

quantidade de leite entre lactantes dos grupos controle e experimentais. Portanto,

pode-se concluir que não houve a ingestão de menor quantidade de leite pelo

filhotes de ratas pertencentes aos grupos experimentais.

A avaliação, tanto do consumo de ração como do peso corpóreo destas

ratas durante a lactação, também não apontou qualquer alteração entre os

diferentes grupos. Deste modo, considerando-se, agora, a qualidade do leite,

embora neste estudo não tenha sido realizada a análise bromatológica deste

alimento, pode-se inferir que como as ratas pertencentes aos diferentes grupos

experimentais não apresentaram menor consumo, não deve ter havido alteração na

quantidade dos constituintes normais do leite. Portanto, também a qualidade do leite,

produzido por aquelas fêmeas expostas tanto ao KCN como ao KSCN, não foi

afetada .

Os dados aqui apresentados, referentes à avaliação da intoxicação

durante a lactação têm importância, pois corrobora com outros tantos estudos, nos

quais se evidenciaram a importância da exposição pela via láctea aos vários agentes

tóxicos (ROZMAN; KLAASSEN, 2001). Além disto, mostra que, embora o tiocianato

seja um componente natural do leite, níveis mais elevados do que aqueles normais

podem comprometer a saúde do neonato.

Concluindo, a realização desta pesquisa não só gerou vários dados

importantes, relativos aos efeitos da exposição prolongada ao cianeto, como,

também, permitiu substancial melhoria na técnica para a dosagem do tiocianato em

diferentes líquidos biológicos: sangue, líquido amniótico e leite. O aperfeiçoamento

desta técnica possibilitou, conseqüentemente, a realização do estudo toxicocinético

do principal metabólito do cianeto. Este trabalho também contribuiu, sobremaneira,

Discussão 205

para a toxicologia do desenvolvimento, já que os dados aqui obtidos expuseram,

claramente, a necessidade de se rever os protocolos de avaliação de

teratogenicidade atualmente utilizados.

Conclusões 206

6 CONCLUSÕES

Conclusões 207

6 CONCLUSÕES

• A metodologia, aqui aprimorada, de dosagem do tiocianato sérico,

lácteo e no líquido amniótico é eficaz para o monitoramento da exposição

ao cianeto em ratos.

• A administração dos agentes tóxicos, cianeto e tiocianato, pela água de

bebida não alterou a palatabilidade da mesma.

• O estudo da transformação do cianeto em tiocianato possibilitou

verificar que os diversos parâmetros toxicocinéticos diferem quando se

administra o cianeto pela via oral, por gavage ou pela água de bebida, nos

três estados fisiológicos estudados. Ainda, analisando-se os parâmetros

toxicocinéticos permitiram inferir que as ratas lactantes ficaram menos

expostas ao tiocianato e àquelas na fase estrogênica, as mais expostas.

• Os efeitos antitireoideanos, bem como a toxicidade no SNC, renal e

hepática em ratas, gestantes e lactantes, foram, provavelmente,

promovidos pelo tiocianato e não pelo cianeto, enquanto que aquele no

pâncreas endócrino, possivelmente, esteja vinculado ao cianeto.

Conclusões 208

• A toxicidade do cianeto é dependente do sexo e do estado fisiológico

de ratas, em relação ao parâmetro ganho de peso.

• Não foram verificados efeitos fetotóxicos importantes em fetos de ratas

gestantes expostas ao cianeto e ao tiocianato, quando da avaliação pelo

protocolo convencional.

• O estudo histopatológico mostrou alterações evidentes, principalmente

ao nível de tecido renal, hepático e SNC em filhotes de ratas expostas

durante a gestação e a lactação, e avaliados no 22º ou 18º dia de vida,

respectivamente.

• O tiocianato exógeno foi capaz de ser transferido das mães para a

prole por meio do leite.

Referência 209

REFERÊNCIAS

Referência 210

REFERÊNCIAS

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