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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO

NÚCLEO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

NANOCÁPSULAS DE POLI--CAPROLACTONA

CONTENDO HALOFANTRINO:

DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E

ESTUDO DA CARDIOTOXICIDADE.

Autora: Elaine Amaral Leite

Orientadora: Profa. Dra. Vanessa Carla Furtado Mosqueira

Co-Orientadora: Profa. Dra. Andréa Grabe Guimarães

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação de Ciências Biológicas do Núcleo de

Pesquisas em Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Ouro Preto, como parte

integrante dos requisitos para a obtenção do

Título de Mestre em Ciências Biológicas, área

de concentração Imunobiologia de Protozoários.

Ouro Preto, fevereiro de 2006

Catalogação: [email protected]

L533n Leite, Elaine Amaral

Nanocápsulas de Poli--caprolactona contendo Halofantrino:

desenvolvimento, caracterização e estudo da cardiotoxicidade

[manuscrito] / \ Elaine Amaral Leite. – 2006.

xxxiii, 140f.: il., color; graf., tabs., mapas.

Orientador: Dra. Vanessa Carla Furtado Mosqueira.

Co-orientadora: Prof. Dra. Andréa Grabe Guimarães.

Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto

de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências

Biológicas.

1. Liberação controlada - fármacos - Teses. 2. Nanopartículas –

caracterização - Teses. 3. Malária – Teses. 4. Sistema cardiovascular – efeito

das drogas - Teses. 5. Polímeros na medicina – Teses. I.Universidade Federal

de Ouro Preto. Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas

em Ciências Biológicas. II. Título.

CDU: 593.1

CDU: 669.162.16

mailto:[email protected]

Elaine Amaral Leite ii

Trabalho desenvolvido no Laboratório de

Desenvolvimento Galênico e Nanotecnologia e

no Laboratório de Farmacologia Experimental

da Escola de Farmácia da Universidade

Federal de Ouro Preto.

Elaine Amaral Leite iii

Este trabalho contou com a colaboração de:

Prof. Dr. Homero Nogueira Guimarães

Departamento de Engenharia Elétrica, UFMG

Dr. José Mário Carneiro Vilela

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC-MG

Dra. Margareth Spangler de Andrade

Fundação Centro Tecnológico de Minas Gerais, CETEC-MG

Prof. Dr. George Luiz Lins Machado-Coelho

Departamento de Farmácia, UFOP

Dedicatória

Elaine Amaral Leite iv

Dedico esse trabalho:

Aos meus pais, Lázaro e Diná, pelo

apoio constante e amor incondicional.

Ao meu irmão, Leonardo, pelo apoio,

respeito e compreensão em tantos momentos de

ausência.

Elaine Amaral Leite v

“A única limitação real em suas

habilidades está no nível de seus desejos.

Se desejar algo com a força suficiente,

não haverá limites para o que possa conseguir.”

(Brian Tracy)

Agradecimentos

Elaine Amaral Leite vi

AGRADECIMENTOS

Às Professoras:

Vanessa e Andréa

Orgulho-me pela oportunidade que tive de trabalhar com grandes e admiráveis

pessoas. Obrigada pela atenção e presença marcantes no decorrer desse projeto. Durante

todos esses anos de convivência sempre me incentivaram, transmitiram ensinamentos e

sobretudo, concederam-me diversas oportunidades.

Saibam que:

Com simplicidade, me ensinaram a gostar da ciência e acima de tudo a

agir com a ética, a ter senso crítico...

No dia-a-dia, aprendi com vocês a arte de planejar, de coordenar, de

desenvolver o trabalho com persistência e coragem.

Em muitos momentos, quando a falta de confiança persistia, me

incentivaram e fizeram com que eu acreditasse em meu potencial,

ensinando-me que ensinar era possível,

que arriscar muitas vezes valia a pena...

Agradeço de maneira especial pela confiança, por terem me recebido

com respeito e profissionalismo em seus laboratórios, pela amizade, companheirismo,

pelo amor “maternal”, pela compreensão nas horas difíceis, ...

Agradecimentos

Elaine Amaral Leite vii

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que direta ou indiretamente colaboraram para a realização

desse trabalho, em especial:

Ao Prof. Homero Nogueira Guimarães pela valiosa colaboração, pelas

importantes conversas e ensinamentos transmitidos no decorrer desse trabalho.

Agradeço de maneira especial, pelo desenvolvimento do sistema de aquisição e de

análise de dados.

Ao Prof. George Lins Machado-Coelho pelo grande auxílio nas análises

estatísticas.

À Margareth Spangler pela grande receptividade no Centro Tecnológico de

Minas gerais (CETEC), pela disponibilização dos equipamentos para realização das

análises de microscopia de força atômica.

Ao Vilela, pela execução dos ensaios de MFA, pela convivência e

disponibilidade em ajudar. Suas sugestões, idéias, nossas conversas, o apoio nas

“loucuras” em tentar identificar minhas partículas, muito contribuíram para o

desenvolvimento desse trabalho.

À Prof. Mônica de Oliveira por disponibilizar o laboratório de Tecnologia

Farmacêutica e o Zetasizer para realização das análises de tamanho e medidas de

potencial zeta das partículas.

Às professoras da Escola de Farmácia, pela convivência durante esses anos, pelo

incentivo, apoio e pelas palavras de otimismo em momentos necessários. Em especial, à

Profa. Célia por ter disponibilizado o laboratório de Química Farmacêutica, os

equipamentos e alguns reagentes essenciais para o desenvolvimento inicial desse

trabalho.

Agradecimentos

Elaine Amaral Leite viii

Aos professores Érica Braga e Oscar Romero da UFMG pelo fornecimento dos

parasitas, diferentes espécies de Plasmodium.

Aos professores do Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas pelos

ensinamentos dispensados.

Aos técnicos administrativos da Escola de Farmácia, em especial, ao Wilson

pela responsabilidade em transportar os animais do Biotério Central para a Escola e pela

manutenção e cuidado dispensado com os animais na Escola de Fármacia.

Aos amigos do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da UFMG, em especial,

ao Guilherme, pela atenção, amizade e ajuda na execução dos ensaios no Zetasizer.

Aos amigos do Laboratório de Desenvolvimento Galênico e Nanotecnologia:

Cristina, Polly, Carina, Diego e Juliana pela ótima convivência, amizade,

companheirismo, confiança, pela colaboração em algum momento de realização desse

trabalho e pelos bons momentos vividos no dia-a-dia.

Às amigas do Laboratório de Farmacologia Experimental: Luciana, Náira,

Alessandra, Lorena, Suzana, Jóice, Mariana, Patrícia, Priscila, Francielle, Ariane,

Gabriela e Daniele pelo companheirismo, amizade, respeito, ótima convivência e pelas

valiosas contribuições em todos os momentos.

Aos colegas de Pós-graduação, pela amizade e aprendizado.

Às amigas Helen, Ju e Valéria, pela grande amizade, pelo apoio,

companheirismo, pelas horas e horas de conversas, desabafos... e acima de tudo pelos

bons e cômicos momentos vividos. Saudades...

À Cida, pela dedicação e disponibilidade em ajudar sempre que necessário.

Agradecimentos

Elaine Amaral Leite ix

À FAPEMIG, pelo auxílio dispensado para o desenvolvimento desse projeto

(Projeto CDS 217/02).

À Rede NANOBIOTEC pelo apoio financeiro e pelos encontros patrocinados.

A Deus...

.

RESUMO

Resumo

Elaine Amaral Leite xi

RESUMO

A malária é uma das infecções parasitárias mais importantes do mundo. A

malária severa é uma forma complicada de infecção pelo Plasmodium falciparum onde

administração intravenosa de agentes antimaláricos é necessária. O halofantrino (Hf)

poderia ser uma alternativa para o tratamento da malária porque é um fármaco ativo

contra cepas de P. falciparum resistentes à cloroquina. Porém, é freqüentemente

associado com o prolongamento do intervalo QT do eletrocardiograma. No presente

trabalho, o Hf base foi associado a carreadores coloidais nanoestruturados, conhecidos

como nanocápsulas (NCs), as quais são constituídas por um núcleo oleoso envolvido

por polímero biodegradável, a poli--caprolactona. O índice de polidispersão e o

diâmetro médio das partículas foram determinados por espectroscopia de correlação de

fótons (PCS) e a medida do potencial zeta por mobilidade eletroforética. A morfologia e

a organização estrutural foram avaliadas pela técnica de microscopia de força atômica

(MFA), buscando analisar e entender possíveis alterações induzidas pela associação do

fármaco a essas nanoestruturas. O principal objetivo desse trabalho foi avaliar as

alterações eletrocardiográficas, principalmente o prolongamento do intervalo QT e as

alterações de pressão arterial, em ratos Wistar sadios ou infectados com Plasmodium

berghei, após a administração i.v. de uma dose única, especialmente alta (100 e

150 mg/kg) de halofantrino associado às nanocápsulas (NC-Hf) ou solução de cloridrato

de halofantrino (Hf.HCl). O diâmetro médio das NCs brancas obtido por MFA variou

de 222 a 550 nm, enquanto o diâmetro médio dessa mesma amostra determinado por

PCS foi de 245 nm. O diâmetro médio das NC-Hf, determinado por MFA, foi

475 153 nm e 309 97 nm para 0,1 e 1,0 mg Hf/mL de suspensão coloidal. A análise

dos dados mostrou que o diâmetro das NCs é muito maior que a altura, apresentando

uma relação diâmetro/altura de aproximadamente 10. A dose aguda letal (DL100)

observada experimentalmente foi de 200 mg/kg para o grupo que recebeu Hf.HCl

enquanto a DL50 calculada foi 154 mg/kg. A DL100 para NC-Hf foi 300 mg/kg, e os

animais morreram em tempos superiores quando comparados com Hf.HC e a DL50

calculada para NC-Hf foi 249 mg/kg. Foi observado, nos experimentos de avaliação da

cardiotoxicidade a curto prazo, que o Hf induziu um prolongamento dose-dependente

Resumo

Elaine Amaral Leite xii

dos intervalos QT e PR do ECG, porém, este efeito foi significativamente reduzido

(P < 0,001) quando o Hf foi administrado associado às nanocápsulas. O Hf.HCl induziu

uma bradicardia pronunciada, seguida por uma redução contínua da freqüência cardíaca

e hipotensão severa que levaram os animais à morte. Nenhuma alteração nos parâmetros

cardiovasculares foi observada nos animais que receberam as soluções controle: veículo

do Hf livre ou excipientes das NCs em intervalos de tempo e volumes equivalentes. O

Hf associado às NCs reduziu o prolongamento do intervalo QT de 77% e 85%, 5 min

após a administração de 100 e 150 mg/kg, respectivamente. A avaliação a longo prazo

demonstrou aumentos equivalentes para o intervalo QT e QTc quando Hf foi

administrado como NC-Hf na dose de 150 mg/kg comparada com a mesma dose do Hf

livre até 30 minutos, observando uma alteração máxima somente 2 horas depois da

injeção. Entretanto, as NC-Hf induziram uma toxicidade menos pronunciada, uma vez

que todos os animais sobreviveram durante todo o período experimental. Por outro lado,

o Hf.HCl induziu morte em 83% dos animais, 30 min após a administração. Foi

observada alteração do intervalo QT, 24 horas após a administração de NC-Hf a qual

poderia ser atribuída ao Hf acumulado nas células do sistema fagocítico mononuclear. A

avaliação da cardiotoxicidade em ratos infectados com Plasmodium berghei demonstrou

que a NC-Hf induziu variações dos parâmetros cardiovasculares semelhante ao Hf.HCl,

indicando que em animais infectados, as NC estariam disponibilizando o fármaco para

interação com as células cardíacas de maneira semelhante à solução de Hf.HCl. Porém,

em todos os experimentos realizados, em animais sadios ou infectados foi observado

que, provavelmente, a encapsulação do Hf alterou sua distribuição no organismo, pois a

resposta farmacológica foi alterada.

ABSTRACT

Abstract

Elaine Amaral Leite xiv

ABSTRACT

Malaria is one of the world’s most important parasitic infections. Severe malaria is

one of complicated form of Plasmodium falciparum infection which intravenous

antimalarial drug administration is always necessary. In this case, the halofantrine (Hf)

could be a good alternative for treatment of severe malaria because it is highly active

against drug resistant P. falciparum. However, it is an antimalarial drug frequently

associated with QT interval prolongation in electrocardiogram. In this study, the more

lipophilic Hf free base was entrapped in nanostructured oil-filled colloidal carrier,

named nanocapsules (NCs), composed by biodegradable polymer such as poly--

caprolactone. The polydispersity index of the population and nanoparticles mean size

were determined by photon correlation spectroscopy (PCS) and nanoparticles zeta

potential by electrophoretic mobility. The morphology and structural organization of

NCs were evaluated by atomic force microscopy (AFM) technique, searching to

analysed and understand possible alterations induced by the drug inclusion in these

nanostructures. The main goal of the present work was to assess and evaluate

electrocardiographic and arterial blood pressure changes, particularly QT interval

prolongation, in anaesthetized Wistar rats healthy or rats infected with Plasmodium

berghei, followed by i.v. administration of a single high dose (100 and 150 mg/kg) of

halofantrine base loaded-nanocapsules (Hf-NC) or halofantrine chlorhydrate (Hf.HCl)

solution. The mean diameter for NC unloaded, obtained by AFM, was between 222 and

550 nm, however, the mean diameter of this same sample determined by PCS was

245 nm. The mean diameter of Hf-NC determined by AFM was 475 153 nm and

309 97 nm for 0.1 e 1.0 mg base Hf/mL colloidal suspension. The analysis of the data

showed that the diameter of NC is much larger than their height, with diameter/height

mean ratio around 10. The acute lethal dose (LD100) of Hf.HCl experimentally observed

was 200 mg/kg and the calculated LD50 was 154 mg/kg. In contrast, the LD100 for Hf-

NC was 300 mg/kg with a longer mean time to death than Hf.HCl and the calculated

LD50 was 249 mg/kg for Hf-NC. It was observed, in short term experiments of

cardiotoxicity studies, that Hf caused a dose-dependent prolongation of the QT and PR

intervals of the ECG, however, this effect was significantly (P < 0.001) reduced when

Abstract

Elaine Amaral Leite xv

Hf was administered entrapped in nanocapsules. The treatment with Hf.HCl induced a

pronounced bradycardia, followed by a continuous decrease of heart rate and severe

hypotension leading the animals to death. No changes in any of these parameters were

observed in animals that received Hf solution vehicle and NCs excipients at equivalent

time intervals and volume. Hf associated with NCs reduced the QT prolongation by

77% and 85% at 5 min after the injection of 100 and 150 mg/kg, respectively. The

evaluation of long term showed equivalent increases for the interval QT and QTc when

Hf was administered as Hf-NC (150 mg/kg) compared with the same dose of the free Hf

up to 30 minutes, but the maximum alteration was observed only 2 hours after the

injection. However, the toxicity induced by Hf-NC was less pronounced because all the

animals survived during all experimental period (48 h). On the other hand, the Hf.HCl

provokes death in 83% of the animals, 30 min after administration. It was observed a

alteration of QT interval in 24 hours after the administration of Hf-NC that could be

attributed to the Hf amount accumulated in the cells of mononuclear phagocytic system.

The evaluation of the cardiotoxicity in Plasmodium berghei infected rats demonstrated

that Hf-NC induced variations of the cardiovascular parameters similar to Hf.HCl,

indicating that in infected animals, the Hf associated to the NCs is available for

interaction with the heart cells of the same way that the Hf in solution. However, in all

experiments performed with healthy or parasitized animals, it was observed that

encapsulation of Hf altered its biological response, probably by modulating the

distribution of the drug in the body.

Lista de Figuras

Elaine Amaral Leite xvi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Distribuição global da Malária…………………………………………….. 4

Figura 2: Mapas de risco de transmissão da malária na Amazônia Legal…………… 5

Figura 3: Ciclo biológico do Plasmodium…………………………………………… 7

Figura 4: Fórmula estrutural do cloridrato de halofantrino…………………………..10

Figura 5: Figura 5: Registro eletrocardiográfico normal, mostrando todos os seus componentes e

suas respectivas designações (A). Potencial de ação de uma célula miocárdica

ventricular (B) registrado simultaneamente...……….…………………………….…..14

Figura 6: Diagrama mostrando o efeito induzido por um fármaco bloqueador de

canais de potássio na duração do potencial de ação e no eletrocardiograma …...........16

Figura 7: Representação esquemática de nanoesferas com presença da matriz

polimérica, e nanocápsulas, constituídas por um núcleo óleo envolvido por uma

membrana polimérica……............................................................................................20

Figura 8: Representação das condições em uma superfície negativa com uma camada

de íons positivos adsorvidos na camada de Stern.………………………….…………26

Figura 9: Esquema de funcionamento da técnica de MFA, mostrando os componentes

gerais do microscópio e suas respectivas funções…………………….........…………29

Figura 10: Preparação de Halofantrino base livre a partir de Hf.HCl………….…….34

Figura 11: Etapas de Preparação de Nanocápsulas……………………………….….35

Figura 12: Representação esquemática da metodologia para separação do Hf

encapsulado nas NCs do Hf não encapsulado...............................................................38

Figura 13: Sistema de Aquisição de ECG e PA...........................................................41

Figura 14: Espectro na região do UV apresentando o pico de absorção máxima do Hf

em acetonitrila (20 g/mL)............................................................................................52

Figura 15: Curva de Calibração do Hf em acetonitrila em comprimento de onda igual

a 258 nm........................................................................................................................53

Lista de Figuras

Elaine Amaral Leite xvii

Figura 16: Diâmetro das diferentes formulações de NCs obtido por equipamentos

distintos. A a D: Zetasizer 3000 HS; E e F: Nanosizer N4 plus....................................56

Figura 17: Nanocápsulas obtidas como suspensão coloidal de aspecto leitoso, pelo

método de nanoprecipitação..........................................................................................58

Figura 18: Imagens de nanocápsulas não carregadas obtidas por MFA......................59

Figura 19: Imagem topográfica (A) e fase (B) obtidas por MFA e perfil topográfico

(C) de nanocápsulas brancas..........................................................................................61

Figura 20: Imagem de altura (A) e fase (B) de poloxamer188 obtidas por MFA........62

Figura 21: Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de

nanocápsulas brancas de PCL........................................................................................63

Figura 22: Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de nanoesferas

brancas de PLA..............................................................................................................64

Figura 23: Imagens topográficas (A e B) de nanoemulsão obtidas em diferentes

campos por MFA. .........................................................................................................65

Figura 24: Esquema representativo dos possíveis fenômenos que contribuem para o

aumento do diâmetro das partículas..............................................................................66

Figura 25: Imagens topográficas (A) e de contraste de fase (B) de nanocápsulas

brancas mostrando diferentes formas: antes (1 e 3) e após (2 e 4) variação da força de

interação sonda-amostra (set point = 0).........................................................................68

Figura 26: Imagem tridimensional de NC contendo 0,1mg de Hf/mL de suspensão

coloidal..........................................................................................................................69

Figura 27: Imagens de nanocápsulas contendo halofantrino 0,1 mg/mL (A) e

1,0 mg/mL (B) mostrando presença de material ao redor das partículas......................71

Figura 28: Dose letal aguda (DL50) determinada após administração i.v. de

halofantrino livre (Hf.HCl) e encapsulado (NC-Hf) em ratos Wistar machos..............75

Figura 29: Traçado do ECG e PA de um rato Wistar, obtido durante o período

controle, apresentando os parâmetros analisados (QT, PR, RR, QRS, PAS e

PAD)..............................................................................................................................76

Lista de Figuras

Elaine Amaral Leite xviii

Figura 30: Registro do ECG e da PA, de animais representativos dos grupos que

receberam 150 mg/kg de Hf.HCl (A) e NC-Hf (B), obtidos antes e após administração

do fármaco.....................................................................................................................77

Figura 31: Cinética de variação do intervalo QT (A) do ECG e do QT corrigido pelo

intervalo RR (QTc) (B) de ratos Wistar machos anestesiados com tiopental sódico,

após administração i.v. Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 e 150 mg/kg e dos veículos

(NC branca e DMA/PEG) em volumes correspondentes à dose de 150 mg/kg............81

Figura 32: Cinética de variação do intervalo PR (A) e do complexo QRS (B) de ratos

Wistar machos anestesiados com tiopental sódico, após administração i.v. Hf.HCl e

NC-Hf nas doses de 100 e 150 mg/kg e dos veículos (NC branca e DMA/PEG) em

volumes correspondentes à dose de 150 mg/kg.............................................................85

Figura 33: Cinética de variação da pressão arterial sistólica (A) e diastólica (B) e da

freqüência cardíaca (C) de ratos Wistar machos anestesiados com tiopental sódico,

após administração i.v. Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 e 150 mg/kg e dos veículos

(NC branca e DMA/PEG) em volumes correspondentes à dose de

150 mg/kg......................................................................................................................88

Figura 34: Comparação da porcentagem de variação máxima dos intervalos QT, PR,

QRS e QTc (A), PAS, PAD e FC (B) até 30 min após a administração de 100 ou

150 mg/kg de halofantrino livre e encapsulado, em ratos Wistar machos anestesiados

com tiopental sódico......................................................................................................89

Figura 35: Cinética de variação do intervalo QT de ratos Wistar machos anestesiados

pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de

Hf.HCl (B).....................................................................................................................94

Figura 36: Cinética de variação do intervalo QT corrigido pelo intervalo RR (QTc) de

ratos Wistar machos anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de

NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B).....................................................................95

Figura 37: Cinética de variação do intervalo PR de ratos Wistar machos anestesiados

pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de

Hf.HCl (B).....................................................................................................................96

Figura 38: Cinética de variação do intervalo QRS de ratos Wistar machos

anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou

150 mg/kg de Hf.HCl (B)..............................................................................................97

Lista de Figuras

Elaine Amaral Leite xix

Figura 39: Cinética de variação da pressão arterial sistólica (I) e diastólica (II) de ratos

Wistar machos anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf

(A), ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B)..................................................................................98

Figura 40: Cinética de variação da freqüência cardíaca de ratos Wistar machos

anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou

150 mg/kg de Hf.HCl (B)............................................................................................100

Figura 41: Curva de parasitemia média (A) e acompanhamento do peso médio (B)

corporal de ratos Wistar macho após imunossupressão com ciclofosfamida e infecção

pelo P. berghei.............................................................................................................106

Figura 42: Cinética de variação do intervalo QT (A) e do QTc (B) de ratos Wistar

machos infectados pelo P. berghei e anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de

100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf.................................................................................109

Figura 43: Cinética de variação do intervalo PR (A) e QRS (B) de ratos Wistar



Figura 44: Cinética de variação da PAS (A), PAD (B) e da FC (C) de ratos Wistar



Lista de Quadros e Tabelas

Elaine Amaral Leite xx

LISTA DE QUADROS

Quadro 1: Classe e Mecanismo de Ação dos Agentes Antimaláricos………………...8

Quadro 2: Principais antimaláricos associados a sistemas vetorizados e testados in

vivo.……………........................................................................................................... 22

Quadro 3: Padronização dos protocolos de imunossupressão......................................42

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Valores de Absorbância utilizados para a construção da curva de calibração

da solução de Hf em acetonitrila...................................................................................52

Tabela 2: Características físico-químicas de formulações de NC contendo diferentes

concentrações de halofantrino.......................................................................................54

Tabela 3: Alterações comportamentais e morte observadas nos animais tratados com

as diferentes formulações de Halofantrino....................................................................74

Tabela 4: Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e

parâmetros eletrocardiográficos avaliados, em diferentes tempos, antes e após a

administração i.v. de halofantrino livre ou encapsulado...............................................79

Tabela 5: Variação percentual dos parâmetros do ECG e PA 30 min após a

administração de NC-Hf (150 mg/kg) em animais anestesiados pelo tiopental sódico

ou pelo éter etílico.........................................................................................................91



administração i.v. de150 mg/kg de halofantrino encapsulado.......................................93

Tabela 7: Resultados dos protocolos de imunossupressão.........................................105



administração i.v. de100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf em ratos Wistar infectados pelo

P. berghei....................................................................................................................107

Lista de Abreviaturas

Elaine Amaral Leite xxi

LISTA DE ABREVIATURAS

Potencial zeta

Da Dalton

DL100 Dose letal para 100% dos animais

DL50 Dose letal para 50% dos animais

DMA dimetilacetamida

DMT Dose Máxima Tolerada

ECG Eletrocardiograma

HDL Lipoproteína de alta densidade

HERG Human Ether a-go-go Related Gene

Hf Halofantrino base

Hf.HCl Cloridrato de Halofantrino

i.v. intravenosa

ICa Corrente de cálcio

IKr Corrente de potássio

INa Corrente de sódio

Ito Correntes transientes de potássio

LDL Lipoproteínas de baixa densidade

MFA Microscopia de força atômica

NC Nanocápsulas

NC-Hf Nanocápsulas de Halofantrino

PAD Pressão Arterial Diastólica

PAS Pressão Arterial Sistólica

PCL Poli--caprolactona

PCS Espectroscopia de Correlação de Fótons

PEG Polietilenoglicol

PLA Poli(ácido-lático)

PLG Poli(ácido-glicólico)

PLGA Poli(ácido-lático-co-glicólico)

QTc Intervalo QT corrigido pelo intervalo RR

SFM Sistema Fagocítico Mononuclear

Sumário

Elaine Amaral Leite xxii

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS E QUADROS

LISTA DE ABREVIATURAS

INTRODUÇÃO...........................................................................................................1

1. INTRODUÇÃO GERAL ..........................................................................................2

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................................4

2.1. Malária .............................................................................................................4

2.2. Halofantrino ...................................................................................................10

2.3. Eletrofisiologia Cardíaca ................................................................................12

2.4. Cardiotoxicidade de Fármacos ........................................................................17

2.5. Sistemas Nanoestruturados para a Vetorização de Fármacos ...........................19

2.6. Nanocápsulas..................................................................................................23

2.6.1. Características Físico-Químicas das Nanocápsulas.......................................24

2.6.1.1. Distribuição do Tamanho das Nanocápsulas..............................................24

2.6.1.2. Potencial Zeta () das Nanocápsulas .........................................................25

2.6.1.3. Avaliação Morfológica..............................................................................27

3. JUSTIFICATIVA DO TRABALHO........................................................................30

OBJETIVOS..............................................................................................................31

1. OBJETIVO GERAL................................................................................................32

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................32

MATERIAIS E MÉTODOS .....................................................................................33

1. METODOLOGIA DE OBTENÇÃO DE NANOCÁPSULAS .................................34

1.1. Preparação do Halofantrino Base ....................................................................34

1.2. Preparação das Nanocápsulas..........................................................................34

2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOCÁPSULAS .....................36

2.1. Distribuição de Tamanho e Potencial Zeta ......................................................36

2.2. Determinação do Teor de Halofantrino por Espectrofotometria no Ultravioleta36

2.3. Teste da Porcentagem de Encapsulação ..........................................................37

2.4. Análise da Morfologia das Nanocápsulas ........................................................38

3. EXPERIMENTAÇÃO “IN VIVO” .........................................................................39

3.1. Animais Experimentais ...................................................................................39

3.2. Confecção de Cateteres para Implantação Intra-Vascular ................................39

Sumário

Elaine Amaral Leite xxiii

3.3. Procedimentos Cirúrgicos ...............................................................................39

3.4. Obtenção dos Sinais de Eletrocardiograma e Pressão Arterial .........................40

3.5. Preparo das Soluções de Halofantrino para Administração Endovenosa ..........42

3.6. Infecção dos Animais......................................................................................42

3.7. Avaliação da Parasitemia ................................................................................43

3.8. Protocolos Experimentais ...............................................................................44

3.9. Análise dos Registros .....................................................................................46

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................................47

5. MATERIAIS...........................................................................................................48

RESULTADOS E DISCUSSÃO ...............................................................................49

PARTE 1: CARACTERIZAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS .......................................50

1. Caracterização Fisico-Química ................................................................................51

2. Análise Morfológica............................................... Erro! Indicador não definido.59

PARTE 2: AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE A CURTO PRAZO ..............72

1. Determinação da Dose Letal Aguda (DL50) .............................................................73

2. Avaliação da Cardiotoxicidade até 30 minutos após a Administração das Formulações de

Halofantrino ..........................................................................................................75

PARTE 3: AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE A LONGO PRAZO..............90

PARTE 4: AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE EM ANIMAIS INFECTADOS

PELO Plasmodium berghei .................................................................................103

DISCUSSÃO GERAL.............................................................................................115

CONCLUSÃO.........................................................................................................122

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................125

ANEXOS……………………………………………………………………………...136

de

INFECTADOS PELO Plasmodium berghei

..............................................................................................

....

4

3

43

INTRODUÇÃO

Introdução

Elaine Amaral Leite 2

1. INTRODUÇÃO GERAL

A malária é a infecção parasitária que mais acomete o ser humano, sendo

considerada a segunda causa de mortalidade no mundo, principalmente em países de

clima tropical e subtropical, com índice de mortalidade superior a um milhão de pessoas

por ano (Greenwood et al., 2005). A malária humana é causada por quatro espécies do

parasita do gênero Plasmodium. Altos índices de morbi-mortalidade são detectados em

decorrência da infecção pelo Plasmodium falciparum (Guerin et al., 2002). Essa mesma

espécie é responsável pelo desenvolvimento da forma complicada da malária, conhecida

como malária severa, a qual é caracterizada por falência renal aguda, comprometimento

do sistema cardiovascular, seguida por coma e morte (Warrel et al., 1990). Na malária

severa, observa-se um quadro de anóxia cerebral, a qual é provocada pela adesão dos

eritrócitos parasitados à parede endotelial dos capilares venosos cerebrais gerando

bloqueio da circulação sanguínea nestes vasos (Deitsch & Wellems, 1996). Nesses

casos, a administração intravenosa (i.v.) de um agente antimalárico é necessária e

realizada em ambiente hospitalar.

Estudos anteriores mostraram que muitas cepas de P. falciparum têm

desenvolvido resistência a drogas antimaláricas, principalmente à cloroquina e, em

menor proporção, à quinina. Em populações com multiresistência, uma alternativa para

o tratamento de malária severa poderia ser a administração intravenosa de halofantrino

(Hf), uma vez que o mesmo apresenta ação rápida contra as formas eritrocíticas

sanguíneas do Plasmodium (Bryson & Goa, 1992). Entretanto, o Hf apresenta baixa

biodisponibilidade quando administrado por via oral e tem potencial efeito

arritmogênico, levando ao prolongamento do intervalo QT do eletrocardiograma (ECG),

como demonstrado em humanos (Krishna et al., 1993; Matson et al., 1996; Olivier et

al., 1999; Abernethy et al., 2001) e outros mamíferos (Batey et al., 1997; Lightbown et

al., 2001; Batey & Cooker, 2002). O prolongamento do intervalo QT é um fator preditor

de arritmias cardíacas associado a episódios de torsade de pointes e morte súbita (Tan et

al., 1995). Krishna et al. (1993) demonstraram em ensaios clínicos utilizando uma

preparação de halofantrino livre administrada por i.v em infusão lenta, o aparecimento

de efeitos tóxicos locais e alteração moderada do intervalo QT do eletrocardiograma,

em pacientes com malária aguda e em convalescência.

Introdução


Diante disso, estratégias que visam otimizar a ação de medicamentos, já

utilizados no tratamento da malária, tais como o aumento dos índices terapêuticos, por

meio de redução de seus efeitos adversos, precisam ser desenvolvidas. Uma delas

consiste na modificação do perfil de distribuição do fármaco, sem contudo, alterar a

estrutura química da molécula, transportando-a associada a um vetor nanométrico

capsular como, por exemplo, as nanocápsulas (Barratt, 2000). As nanocápsulas (NCs)

apresentam um núcleo oleoso, no qual drogas lipofílicas podem estar dissolvidas ou

dispersas, sendo esse envolvido por um filme de polímero biodegradável. Elas fazem

parte de uma família de dispositivos nanométricos capazes de controlar e modificar a

distribuição de uma substância ativa para locais específicos do corpo, protegendo ao

mesmo tempo, órgãos vitais de efeitos tóxicos (Lasic, 1998). Visando o tratamento da

malária severa, o Hf base livre foi anteriormente encapsulado em NCs (Mosqueira et al.,

2004). Desse modo, uma forma nanodispersa do fármaco insolúvel pode ser obtida em

um meio aquoso e isotônico, adequada para a administração in bolus por via i.v.

Estudos anteriores, utilizando uma formulação semelhante de nanocápsulas de Hf (NC-

Hf) em camundongos, demonstraram melhoria da eficácia do antimalárico com redução

concomitante da toxicidade geral (Mosqueira et al., 2004).

O principal objetivo do presente trabalho foi desenvolver e caracterizar em nosso

laboratório uma formulação de nanocápsulas de poli--caprolactona contendo Hf e

avaliar o eletrocardiograma e a pressão arterial de ratos Wistar machos, normais ou

infectados pelo Plasmodium berghei, após a administração intravenosa de altas doses de

Hf em diferentes formulações: solução de halofantrino livre (Hf.HCl) ou suspensão

coloidal de halofantrino encapsulado em nanocápsulas (NC-Hf).

Introdução


2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1. MALÁRIA

Entre as doenças infecciosas, a malária é a segunda causa de mortalidade,

atingindo principalmente países de clima tropical e subtropical (Figura 1). De acordo

com a Organização Mundial de Saúde (OMS, 1999), estima-se que aproximadamente

300 milhões de pessoas são afetadas por malária e o índice de mortalidade da doença

atinge cerca de um milhão de mortes a cada ano. Deste número alarmante, 90% se

concentram na África Tropical e 10% estão distribuídos no Sudeste Asiático, Oceania e

Américas Central e do Sul (OMS, 1999). Depois dos países africanos, Índia e Brasil são

as regiões de mais alta endemicidade no mundo. Nos últimos anos, vários programas de

saúde, como Roll Back Malaria, liderados pela OMS reafirmaram ser esta doença

questão prioritária no mundo, reconhecendo que a sua situação na África ao sul do

Saara deteriorou assustadoramente durante a última década (OMS, 1999).

FIGURA 1- Distribuição global da Malária. Nota do mapa: Este mapa mostra países com

malária endêmica. Em muitos desses países, o risco de malária é limitado em

determinadas áreas.

Fonte: Center for Disease Control and Prevention, 2003.

Ausência de Malária

Países sob risco de Malária

Introdução


No Brasil, segundo dados do Programa Nacional de Prevenção e Controle da

Malária (FUNASA, 2005), 99,5% dos casos ocorrem na Amazônia Legal, destacando os

estados do Amazonas, Pará, Maranhão e Rondônia. Isto reflete o declínio sócio-

econômico com conseqüente migração de trabalhadores para minas e projetos agrícolas

no norte do Brasil, expondo a população nestes locais ao maior risco de contrair a

doença. Além disso, observa-se que a migração da população da região amazônica para

outras regiões do Brasil levou ao surgimento de novos focos de transmissão, como por

exemplo, 14 novos focos foram registrados nas últimas décadas no estado de Minas

Gerais.

FIGURA 2 – Mapas de risco de transmissão da malária na Amazônia Legal em 1999 (A) e

2004 (B).

Fonte: FUNASA, 2005 <http://www.portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/bl_malaria_01_2005>.

Atualmente, são conhecidas cerca de 150 espécies causadoras de malária e

dessas, somente quatro espécies infectam o homem: Plasmodium falciparum,

Plasmodium vivax, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale (Greenwood et al.,

2005), os quais apresentam padrões morfológicos distintos em esfregaços sanguíneos,

além de provocar infecções com periodicidade e patogenicidade também distintas.

Estudos sócio-epidemiológicos mostraram que a malária está relacionada à redução da

freqüência à escola e ao declínio da produtividade no trabalho, além de prejudicar o

desenvolvimento intelectual, variando qualitativa e quantitativamente de lugar para

lugar (Fernando et al., 2003).

Incidência Parasitária Anual

Por 1000 habitantes

Estados da Amazônia Legal

Ausência de casos

> 0,1 – 9,9 (baixo risco)

> 9,9 – 49,9 (médio risco)

> 49,9 (alto risco)

A B

Introdução


A malária é considerada uma doença sistêmica que provoca alterações na

maioria dos órgãos, variando desde formas benignas até as muito graves e fatais. De

modo geral, o predomínio de casos graves ocorre com o P. falciparum, causador da

malária severa ou cerebral (Winstanley, 2000), cujas formas complicadas são

observadas em pessoas não-imunes, principalmente em crianças menores de cinco anos.

A malária severa é caracterizada por convulsão evoluindo para um quadro de coma em

decorrência da adesão de eritrócitos parasitados na rede capilar periférica (Deitsch &

Wellems, 1996) e requer uma terapia imediata com a administração intravenosa (i.v.) de

antimaláricos com alta atividade parasiticida.

A infecção ocorre através da inoculação de esporozoítos no tecido subcutâneo e

na circulação sanguínea do homem, em decorrência da picada do inseto vetor fêmea

infectado (gênero Anopheles) durante o repasto sanguíneo. Os parasitas migram em

direção ao fígado, por mecanismos ainda não identificados (Krettli & Miller, 2001)

alcançando vários hepatócitos, onde alojam-se, multiplicam-se e transformam-se em

esquizontes teciduais (ciclo exo-eritrocítico). Os esquizontes então se rompem,

liberando milhares de merozoítos, muitos destes são fagocitados pelas células do

sistema fagocítico mononuclear (SFM), enquanto outros chegam à circulação sanguínea

e invadem os eritrócitos. Após o rompimento do esquizonte tissular, em infecções por

P. falciparum e P. malariae, nenhuma forma do parasita permanece no fígado;

entretanto, nas infecções por P. vivax alguns parasitas, chamados hipnozoítas, persistem

e podem produzir recaídas, meses ou anos após a primeira infecção. O desenvolvimento

assexuado, ciclo eritrocítico, é caracterizado pela presença do trofozoíto jovem (em

anel), passando a trofozoíto maduro e finalmente a esquizonte maduro. Os eritrócitos

contendo esquizontes se rompem liberando vários merozoítos, que invadem novas

células sanguíneas dando continuidade ao ciclo até a morte do hospedeiro ou modulação

da infecção através de fármacos ou pela imunidade adquirida. Após algumas gerações

de merozoítos sanguíneos ocorre a diferenciação em estágios sexuados, os gametócitos

masculino e feminino, os quais são ingeridos pelo inseto vetor fêmea durante o repasto

sanguíneo. No intestino do anofelino, ocorre a exflagelação dos gametócitos seguida de

gametogênese e fertilização do gameta feminino, originando o zigoto. Esse por sua vez

fixa-se na parede do intestino e inicia um processo de multiplicação dando origem ao

esporozoíto infectante (Rey, 2001). Todo o ciclo está representado na Figura 3.

Introdução


FIGURA 3 – Ciclo biológico do Plasmodium, agente causador da malária. Fonte: Center for Disease Control and Prevention, 2003.

<http://www.cdc.gov/malaria/biology/life_cycle.htm>

A parasitemia é um fator determinante da mortalidade associada à doença.

Durante o processo de invasão, fatores genéticos e idade celular têm papéis importantes

na susceptibilidade do eritrócito à invasão pelo parasita, visto que P. vivax e P. ovale

infectam apenas células jovens, P. malarie infecta apenas eritrócitos maduros, e já o

P. falciparum infecta eritrócitos de qualquer idade, sendo que nesse caso, uma alta

porcentagem de eritrócitos pode tornar-se parasitada, o que resulta em maior

patogenicidade do P. falciparum (Bryson & Goa, 1992). Esse fato implica em doenças

distintas provocadas por cada espécie, o que requer muitas vezes o estabelecimento de

diagnóstico específico e diferencial para o tratamento adequado dos pacientes

(FUNASA, 2001).

Introdução


Entre os agentes antimaláricos mais eficazes incluem a cloroquina (Nivaquina®),

quinina (Quinimax®), mefloquina (Lariam

®), artemisinina e seus derivados,

pirimetamina combinada com sulfadoxina (Fansidar®), primaquina e halofantrino

(Halfan®) (Winstanley, 2001), não sendo esse comercializado no Brasil. Estes podem

ser classificados de acordo com o estágio do parasita em que atuam ou com o

mecanismo de ação que apresentam (Quadro 1).

Quadro 1: Classe e Mecanismo de Ação dos Agentes Antimaláricos

Modo de

Ação Classe Sítio de Ação

Anti

met

abóli

tos

1) Sulfonamidas e Sulfonas: sulfadoxina

Esquizonticida sangüíneo de ação lenta.

Inibidores da diidropteroato sintase.

2) Diaminopiridinas: Pirimetamina

Biguanidas: proganil, clorproganil

Ação esporonticida, esquizonticida tecidual e

sangüíneo. Inibidores da diidrofolato

desidrogenase.

3) Hidroxinaftoquinonas: atovaquona

Esquizonticida sangüíneo. Freqüentemente

administrado em associação com o proguanil.

4) 8-Aminoquinoleínas: Primaquina

Ação gametocitocida, apresenta pequena

atividade sobre os outros estágios do ciclo do

parasita

Lis

oss

om

otr

ópic

os

1) Aminoálcoois: quinina,

mefloquina, halofantrino,

lumefantrine (co-artemeter®)

Esquizonticida sangüíneo. Concentram-se nos

vacúolos alimentares ácidos do Plasmodium,

inibindo a atividade enzimática.

2) 4-Aminoquinoleínas: Cloroquina, hidroxicloroquina,

amodiaquina

Esquizonticida sangüíneo de rápida ação.

Alguma esporonticida. Atuam nos vacúolos

digestivos inibindo a atividade enzimática.

3) Lactonas Sesquiterpênicas: artemisinina e derivados (artesunato,

artemeter, arteeter)

Esquizonticida sangüíneo de ação rápida. Atuam

através da liberação de radicais livres nos

vacúolos digestivos.

Fonte: Goodman & Gilman, 2001.

Introdução


Em função do grande impacto causado pela malária no mundo, das dificuldades

de obtenção de vacinas 100% eficazes e sendo a quimioterapia o principal meio de

reduzir rapidamente a morbi-mortalidade relacionada à doença (Kremsner & Krishna,

2004), torna-se indispensável que medicamentos adequados para o tratamento estejam

acessíveis à população atingida. No entanto, apesar do arsenal terapêutico existente

hoje, é sabido que nem todas as espécies de plasmódios são igualmente sensíveis aos

fármacos antimaláricos, já existindo relatos, para a malária falciparum, de resistência a

cloroquina, mefloquina, quinina e sulfadoxina-pirimetamina (Wongrsichanalai et al.,

2002; Hastings, 2004). Muitos dos compostos disponíveis tais como cloroquina e

pirimetamina combinada com sulfadoxina são de fácil distribuição e eficazes,

entretanto, devido ao problema da resistência, a sua utilização tem se mostrado

ineficiente (Brockman et al., 2000). O mais preocupante é que em muitas áreas

endêmicas, o P. falciparum apresenta fenótipos de resistência a dois ou mais fármacos

simultaneamente, um fenômeno conhecido como multiresistência à drogas. A

resistência parece ser ocasionada por mutações pontuais em genes codificadores de

transportadores de membrana bem como por mutações em determinadas enzimas

(Wongrsichanalai et al., 2002).

Atualmente, a ausência de um tratamento único e efetivo contra todas as

espécies de plasmódio leva à necessidade de estabelecer um medicamento ou

associações de medicamentos específicos em dosagens adequadas a cada situação em

particular (FUNASA, 2001). Muitas vezes são requeridas altas doses dos fármacos

utilizados, aumentando conseqüentemente o risco de toxicidade.

Segundo Kremsner & Krishna (2004) em função da multiresistência adquirida, a

implementação de estratégias racionais no desenvolvimento de novos fármacos e na

reestruturação de compostos já existentes é necessária, uma vez que a quimioterapia

representa atualmente a alternativa mais eficaz no controle da malária. Em regiões de

multiresistência, portanto, o Hf poderia ser uma alternativa viável para o tratamento da

doença, pois apresenta meia vida longa e alta eficácia. O Hf apresenta características

que o torna um candidato adequado à reestruturação, levando a melhoria de sua

segurança terapêutica.

Introdução


2.2. HALOFANTRINO

O cloridrato de halofantrino é um 9-fenantrenometanol, avaliado, na década de

60, pelo Water Reed Institute e desenvolvido comercialmente como Halfan® pela Smith

Kline Beecham (Inglaterra).

Quimicamente, o halofantrino (Figura 4) é o cloridrato de 1,3-dicloro--

[2(dibutilamino)etil]-6-(trifluorometil)-9-fenantrenometanol. Estudos prévios

demonstraram que esse composto é altamente lipofílico e apresenta um coeficiente de

partição octanol/água estimado de 8,5 (Humberstone et al., 1996). Sua solubilidade em

diferentes solventes foi determinada por Babalola et al. (2003), sendo 0,67% p/v em

metanol; 0,4% p/v em octanol e acetonitrila. A solubilidade do halofantrino em água a

50 °C foi menor que 0,02 g/mL sendo praticamente insolúvel em água à temperatura

ambiente e PBS pH 7,4.

FIGURA 4 – Fórmula Estrutural do Cloridrato de Halofantrino. O asterisco(*) determina o

centro quiral.

O halofantrino é um composto quiral, administrado como mistura racêmica e,

segundo Bryson & Goa (1992) seus enantiômeros apresentaram atividade antimalárica

in vitro equivalente contra cepas de P. falciparum multiresistentes. Entretanto, in vivo,

diferenças foram registradas em relação à atividade terapêutica dos enântiomeros devido

à estereoseletividade em concentrações plasmáticas. Em humanos, a concentração

plasmática da forma (+)-Hf é aproximadamente 2-3 vezes maior que a (-)-Hf (Brocks &

Toni, 1999).

Introdução


Estudos anteriores mostraram que o Hf sofre metabolização hepática

convertendo-se no produto ativo N-desbutil-halofantrino, sugerindo que parte da

atividade antimalárica ocorre por ação desse metabólito (Bryson & Goa, 1992;

Karbwang & Bangchang, 1994). O Hf atua contra formas eritrocíticas assexuadas,

porém o mecanismo de ação ainda não foi completamente elucidado (Karbwang &

Bangchang, 1994). Acredita-se que, assim como a quinina, a cloroquina e a mefloquina,

o halofantrino interfere no mecanismo de digestão da hemoglobina, formando

complexos tóxicos com o grupo heme (ferriprotoporfirina IX), os quais danificam a

membrana celular causando lise e morte do parasita (Karbwang & Bangchang, 1994).

Entretanto, estudo recente demonstrou que o Hf provoca distúrbios na organização das

bicamadas lipídicas, fato que poderia explicar parcialmente seu mecanismo de ação

(Lim & Go, 1999).

Três formas farmacêuticas para administração oral do Hf estão disponíveis para

uso humano em vários países do mundo: comprimidos, cápsulas e suspensão (Halfan®).

Geralmente, o Hf é bem tolerado e apresenta meia vida de eliminação longa (1,3 a 6,6

dias), possibilitando intervalos maiores de administração e doses menores. No entanto,

apresenta baixa e variável absorção por via oral, o que segundo ter-Kuile et al., (1993)

pode estar associado às falhas observadas na terapêutica após utilização do Hf. Além

disso, foi demonstrado por Brocks & Wasan (2002) que o Hf livre se associa a

lipoproteínas plasmáticas de baixa (LDL) e alta (HDL) densidade, o que pode resultar

em alteração da biodistribuição do fármaco, com conseqüente aumento da toxicidade,

uma vez que o fármaco associado à LDL seria facilmente transportado ao tecido

cardíaco via receptores de LDL.

Algumas características físico-químicas tais como alta lipofilia e baixa

solubilidade em água dificultam a preparação de formulações de Hf para uso parenteral,

necessária ao tratamento das formas severas de malária. Uma única formulação

intravenosa, testada clinicamente em humanos, é apresentada na literatura,

demonstrando vários efeitos adversos, a saber: irritação local severa com aparecimento

de eritemas, provavelmente relacionado à toxicidade dos solventes utilizados na

preparação, bem como efeito arritmogênico, levando inicialmente ao prolongamento do

intervalo QT do eletrocardiograma (ECG) (Krishna et al., 1993).

Introdução


Segundo Wesche et al. (2000), o mecanismo de cardiotoxicidade do halofantrino

ocorre através de bloqueio de canais de potássio, os quais são responsáveis pelo início

do processo de repolarização e determinam o intervalo QT do ECG. Esses achados estão

de acordo com resultados obtidos por Tie et al. (2000) que sugerem que o bloqueio dos

canais de potássio HERG (Human Ether a-go-go Related Gene) esteja

predominantemente relacionado à alta afinidade do halofantrino em se ligar aos canais

abertos, inativando-os, com uma pequena contribuição da ligação aos canais fechados

de potássio. O prolongamento do intervalo QT tem sido significantivamente

correlacionado aos níveis plasmáticos do fármaco livre, mais especificamente com o

(+)-Hf, mas não com seu metabólito, N-desbutil-halofantrino (Touze et al., 1996). Essa

diferença na resposta indica que o efeito eletrofisiológico do Hf é, portanto,

estereoespecífico. Além disso, se comparado a outros fármacos potencialmente capazes

de alterar o intervalo QT, o halofantrino é um inibidor pouco potente, uma vez que a

concentração de Hf ou (+)-Hf necessária para bloquear aproximadamente 40% dos

canais de potássio foi 100 vezes maior que a observada para quinidina e terfenadina

(Wesche et al., 2000). Entretanto, o Hf é considerado o mais cardiotóxico dos

antimaláricos utilizados (Touze et al., 2002).

2.3. ELETROFISIOLOGIA CARDÍACA

O eletrocardiograma é um exame importante em clínica médica, de fácil

manuseio, reprodutível e de baixo custo operacional. O ECG convencional pode ser

definido como um registro extracelular das variações do potencial elétrico do músculo

cardíaco em atividade, evento que precede a atividade mecânica cardíaca, obtido por

meio de eletrodos aplicados à superfície corporal.

O potencial de ação cardíaco, caracterizado por sua longa duração, reflete o

perfil de atividade elétrica associado às células excitáveis cardíacas. É o resultado de

correntes iônicas, distintas e ativadas sucessivamente através da passagem de íons de

Na+, Ca

++ e/ou K

+ por estruturas de membrana especializadas tais como bombas iônicas

e canais iônicos voltagem-dependente. Basicamente, o potencial de ação do músculo

cardíaco pode ser dividido em cinco fases distintas (Figura 5).

Introdução


A fase 0, ou limiar do potencial de ação, é gerada pelo influxo rápido de íons

Na+ para o interior dos miócitos, através de canais de Na

+ (INa). A fase 2, ou platô do

potencial de ação, é causada essencialmente pela entrada de Ca++

extracelular para o

interior das células cardíacas através de canais de Ca++

tipo L (ICa). As fases 1 e 3

descritas, respectivamente, como o início e o fim do processo de repolarização, são

mediadas pelo efluxo de íons K+ para o exterior da célula através da abertura de vários e

distintos canais de K+. A corrente transiente (Ito), presente em grande densidade no rato,

apresenta um componente ativado por despolarização e inativação dependente de

voltagem e de tempo, e contribui para o fim do limiar de ação, causando o início do

processo de repolarização (fase 1). Canais de K+ distintos contribuem para a fase 3 ou

fase final da repolarização, apresentando papel fundamental na determinação da duração

do potencial de ação, sendo IKr , corrente retardada de efluxo de ativação rápida, a

principal responsável pela condução adequada em condições de variações de freqüência

cardíaca. Por fim, os canais IK1 têm um papel predominante na etapa final do processo

de repolarização (fase 4) em muitas espécies, sendo responsáveis pela manutenção desse

estágio. Todas as correntes descritas para o potencial de ação ventricular em humanos

estão também presentes nos átrios, embora sua distribuição e amplitude sejam

características específicas para cada tecido. A forma e a duração do potencial de ação

cardíaco, também são específicas para cada espécie animal, refletindo diferenças no

tipo, estrutura e distribuição celular (Crumb & Cavero, 1999; Silva, 1999).

A ativação ou despolarização cardíaca, em condições normais, tem origem no

nódulo sinusal, região do marcapasso cardíaco, localizado no átrio direito, sendo esta a

primeira área do coração a se despolarizar. O estímulo alcança em seguida o átrio

esquerdo, o nódulo atrioventricular, o feixe de His e seus ramos, a rede de Purkinje, os

ventrículos e, por fim, se extingue. Durante o ciclo cardíaco, eventos elétricos são

originados na despolarização e repolarização, em função do potencial de ação de células

cardíacas descrito acima, e suas alterações assumem um aspecto característico,

composto de inúmeras deflexões que oscilam acima e abaixo da linha de base (nível

isoelétrico) podendo ser registradas. O estudo minucioso e a análise detalhada das

ondas, dos intervalos e dos segmentos formam a base para a interpretação do

eletrocardiograma normal, em doenças cardiovasculares e em condições extracardíacas

Introdução


que modificam seu traçado. A figura 5 apresenta os elementos de um eletrocardiograma

em condições de normalidade ou em ritmo sinusal.

FIGURA 5 – Registro eletrocardiográfico normal, mostrando todos os seus componentes e

suas respectivas designações (A). Potencial de ação de uma célula miocárdica

ventricular (B) registrado simultaneamente.

Fonte: Adaptação de Tan et al., 1995, p.702.

A onda P representa a ativação elétrica dos átrios ou despolarização atrial,

apresentando-se como uma onda arredondada, simétrica e de pequena amplitude. A

ausência de onda P caracteriza a ocorrência de arritmias, como, por exemplo, bloqueio

do ritmo juncional.

Fase 0

Fase 4

Fase 1 Fase 2

Fase 3

Introdução


O intervalo RR é o intervalo entre duas ondas R consecutivas e permite

determinar o ritmo cardíaco.

O intervalo PR representa o tempo entre o início da despolarização atrial,

passando pela condução do impulso através do nódulo atrioventricular, potencial não

detectado em derivações periféricas, e o início da despolarização ventricular. É o

intervalo de tempo entre o início da onda P e o início do complexo QRS. Em geral, esse

intervalo diminui com o aumento da freqüência cardíaca, aumentando com a diminuição

da freqüência. O prolongamento desse parâmetro sugere bloqueio atrioventricular.

O complexo QRS representa a despolarização ventricular, processo contínuo,

mas possível de ser dividido em momentos ou fases arbitrárias, de acordo com os

pontos atingidos pela seqüência de ativação ventricular: septo, ápice direito, ápice

esquerdo e paredes livres e finalmente as bases dos ventrículos. Alterações do QRS são

geralmente associadas a hipertrofias ventriculares e bloqueio de ramo.

O segmento ST é o intervalo de registro isoelétrico que acompanha a fase de

platô após o término da despolarização ventricular.

A onda T representa a repolarização ventricular.

O intervalo QT representa o tempo necessário para despolarização e

repolarização dos ventrículos. É o intervalo medido entre o início do QRS e o final da

onda T. O prolongamento do intervalo QT pode ser classificado como hereditário ou

adquirido, ambos associados a um tipo característico de taquicardia ventricular

polimórfica conhecida como torsade de pointes. A forma hereditária parece ocorrer

como conseqüência de alterações genéticas nos canais iônicos ou resultar de uma

resposta anormal à estimulação simpática ou adrenérgica; enquanto a forma adquirida

pode ser causada por vários fármacos ou condições que reduzam a atividade das

correntes de K+ no processo de repolarização ou aumentem o influxo de íons Na

+ ou

Ca++

durante o processo de despolarização (Tan et al., 1995).

O prolongamento do intervalo QT do ECG é um fator preditor de arritmias

cardíacas e morte súbita (Tan et al., 1995). Vários estudos têm sugerido que fármacos

potencialmente capazes de induzir alterações no intervalo QT do ECG podem ser

conseqüentemente pro-arrítmicos, levando à taquiarritmia ventricular fatal, conhecida

como torsade de pointes (Shah, 2002). A causa mais provável do torsade de pointes

está relacionada à ação direta dos medicamentos sobre o bloqueio de canais de potássio

Introdução


ou sua interação com outros fármacos (Al-Khatib et al., 2003). A figura 6 mostra o

efeito de fármacos bloqueadores de canais de K+

na duração do potencial de ação

cardíaco e no eletrocardiograma.

FIGURA 6 – Diagrama mostrando o efeito induzido por um fármaco bloqueador de canais de

potássio (B) na duração do potencial de ação e no eletrocardiograma. Este

fármaco pode produzir prolongamento do potencial de ação, prolongamento do

intervalo QT e torsades de pointes.

Fonte: Crumb & Cavero, 1999, p.273.

Alterações do intervalo QT foram inicialmente observadas como efeito adverso

da quinidina e estudos prévios relacionando os efeitos cardiotóxicos de agentes

antimaláricos consideraram medidas do intervalo QT do ECG como um importante

marcador para a avaliação de fatores e condições clínicas que predispõem à ocorrência

de toxicidade. Entre os antimaláricos que agem diretamente bloqueando os canais de

potássio encontra-se o halofantrino, objeto de estudo do nosso trabalho. Como

Bloqueador de Canais

de K+

Prolongamento da Duração do

Potencial de Ação (DPA)

Extracelular

Intracelular

Prolongamento do

Intervalo QT

Intervalo QT Intervalo QT

Torsades de pointes

Bloqueador de Canais

de K+

Prolongamento da Duração do

Potencial de Ação (DPA)

Extracelular

Intracelular

Prolongamento do

Intervalo QT

Intervalo QT Intervalo QT

Torsades de pointes

Introdução


mencionado anteriormente, Wesche et al. (2000) demonstraram que o Hf bloqueia

canais IK em miócitos isolados de felino, indicando que esse fármaco é similar aos

antiarrítmicos pertencentes à classe III em sua capacidade de prolongar a repolarização

de maneira dose-dependente. A freqüência de prolongamento do intervalo de QT varia

com a classe de fármacos, sendo predominantemente mais alta com os antiarrítmicos da

classe III. Entretanto, para fármacos não-cardíacos, a freqüência é desconhecida,

podendo variar de 1:100 pessoas para o halofantrino à 1:50.000 para terfenadina,

dependendo das circunstâncias clínicas (Shah, 2002).

2.4. CARDIOTOXICIDADE DE FÁRMACOS

A cardiotoxicidade pode ser caracterizada pela presença de um ou mais fatores

tais como hipertensão arterial, cardiomiopatia, bradiarritmia, além do prolongamento do

intervalo QT do ECG (Youssef & Links, 2005). Efeitos cardiotóxicos são comumente

descritos após a utilização de agentes quimioterápicos (Youssef & Links, 2005; Guerra

et al., 2005; Yeh et al., 2004), antipsicóticos (Testai et al., 2004; Brown et al., 2004,

Harrigan et al., 2004), antidepressivos (Pohl et al., 2003), antiarrítmicos (Lin et al.,

2005), antifúngicos (Owens, 2004) dentre outros. Além disso, efeitos adversos

cardíacos têm sido reportados com fármacos utilizados no tratamento de malária

falciparum tais como cloroquina (Bakshi et al., 2000), quinina (Martin et al., 1997),

mefloquina (Fonteyne et al., 1996; Cooker et al., 2000; Touze et al., 2002) e Hf

(Krishna et al., 1993). Estudos clínicos têm relatado a ocorrência de arritmia ventricular

severa e morte súbita em pacientes tratados com Hf associado à alterações do intervalo

QT (Nosten et al., 1993; Gundersen et al., 1997). Pacientes tratados com Hf após falha

terapêutica da mefloquina apresentaram alterações mais significativas do ECG

comparados àqueles que receberam o fármaco como tratamento primário (Nosten et al.,

1993).

A avaliação da cardiotoxicidade por análise de alterações do ECG está bem

documentada na literatura. Estudos pré-clínicos de fármacos foram realizados através da

análise in vivo em diferentes modelos animais incluindo cães, guinea-pig, coelhos e

ratos, dentre outros (Park et al., 2005; Batey et al., 1997; Batey & Coker, 2002;

Demirag et al., 2005). Segundo revisão feita por Crumb & Cavero (1999) tais análises

Introdução


incluem medidas de freqüência cardíaca, pressão arterial e análise detalhada do ECG.

Estudos in vitro utilizando fibras de Purkinje ou músculos papilares cardíacos de

espécies como, coelho, guinea-pig e cão são considerados adequados, uma vez que as

correntes iônicas responsáveis pelo potencial de ação dessas estruturas se assemelham

ao ser humano.

Dados da literatura relatam o estudo da cardiotoxicidade do halofantrino tanto

em modelos in vivo como em modelos in vitro. Batey et al. (1997) avaliaram o efeito do

halofantrino in vivo e in vitro em guinea-pigs anestesiados através de análise do ECG.

Esses autores verificaram a capacidade do Hf em prolongar o QTc in vivo sem alterar o

período refratário, sugerindo que, provavelmente, os efeitos in vivo do Hf na

repolarização cardíaca, são indiretos, uma vez que nenhuma alteração in vitro foi

observada. Batey & Coker (2002), utilizando coelhos machos, demonstraram pela

primeira vez no modelo in vivo, que o halofantrino pode causar torsade de pointes.

Segundo tais autores, há uma correlação entre os efeitos do Hf nos IKr in vivo e os

efeitos adversos cardíacos observados em humanos, sendo também verificado aumento

do intervalo QT e redução da freqüência cardíaca após administração do Hf. Além

desses, o estudo de avaliação do mecanismo de cardiotoxicidade do halofantrino

descrito por Wesche et al. (2000) foi conduzido in vitro em miócitos de felino. Os

autores utilizaram esse modelo com o objetivo de verificar se o Hf era o principal

responsável pelo prolongamento do intervalo QT ou se esse efeito poderia ser

decorrente de seu metabólito ativo. Foi demonstrado ainda que o Hf prolongou o

intervalo QT de maneira dose-dependente, quando altas concentrações do fármaco

foram avaliadas. Por outro lado, o N-desbutilhalofantrino provocou um efeito mínimo

no intervalo QT. Entretanto, a cardiotoxicidade do halofantrino avaliada no modelo rato

foi realizada pela primeira vez no presente trabalho.

Considerando-se a atividade do halofantrino no tratamento de casos de malária

resistentes à cloroquina e também objetivando-se reduzir os efeitos adversos do Hf, é

possível vislumbrar que uma formulação vetorizada capaz de reduzir a associação do

fármaco livre com o tecido cardíaco seja potencialmente interessante, visto que a

mesma poderia aumentar o tempo de residência do fármaco no compartimento

intravascular aumentando o contato com as hemácias infectadas pelo parasita.

Introdução


2.5. SISTEMAS NANOESTRUTURADOS PARA A VETORIZAÇÃO DE

FÁRMACOS

A pesquisa científica que busca o direcionamento de fármacos especificamente

para o seu alvo de ação é realizada há algumas décadas. Entretanto, a chamada

vetorização de fármacos que consiste na associação de moléculas a vetores sintéticos

específicos, permite que as propriedades físico-químicas da molécula sejam mascaradas

e que as propriedades do vetor sejam então predominantes na determinação da

distribuição do fármaco pelo organismo.

A utilização clínica de alguns agentes terapêuticos pode ser restrita em função de

suas propriedades físico-químicas, bem como, de seus efeitos colaterais. Sabe-se que a

resposta farmacológica está diretamente relacionada à concentração do fármaco no sítio

de ação desejado. No entanto, a distribuição dos princípios ativos no organismo é,

essencialmente, determinada por suas características físico-químicas. O fármaco livre

por sua vez é, geralmente, distribuído indistintamente, entre as diversas células, tecidos

ou órgãos do corpo, levando ao aparecimento de inúmeros efeitos adversos nos locais

outros que não o sítio de ação desejado (Couvreur et al., 2002). Isto tem incentivado o

desenvolvimento de diferentes estratégias capazes de otimizar a ação do fármaco como,

por exemplo, modificar sua distribuição, através de sua associação a sistemas

carreadores. Estes sistemas podem ser classificados em microparticulados quando

possuem diâmetro superior a 1 m ou nanoparticulados se apresentarem diâmetro na

ordem nanométrica (entre 10 a 1000 nm) (Couvreur et al., 2002). Dentre os principais

sistemas nanoestruturados encontram-se os lipossomas e as nanopartículas

(nanocápsulas e nanoesferas).

Segundo revisão feita por Schaffazick et al. (2003), as nanopartículas,

constituídas de polímeros biodegradáveis, têm atraído grande atenção dos pesquisadores

em função de suas potencialidades como vetores, por serem mais estáveis nos fluidos

biológicos e durante o armazenamento. Diferem entre si, segundo a composição e

organização estrutural (Figura 7), podendo se dividir entre matriciais dotadas de uma

matriz polimérica (nanoesfera) ou reservatórios no qual um núcleo oleoso é envolvido

por uma membrana polimérica (nanocápsula) (Kreuter, 1994), ambos suspensos

coloidalmente em meio externo aquoso.

Introdução


FIGURA 7 – Representação esquemática de nanoesferas com presença da matriz polimérica,

e nanocápsulas, constituídas por um núcleo óleo envolvido por uma membrana

polimérica.

O desenvolvimento dos nanossistemas poliméricos tem visado diversas

aplicações terapêuticas, sendo planejados principalmente para a administração

parenteral (intravenosa, subcutânea ou intramuscular), oral ou oftálmica. As possíveis

vantagens terapêuticas dos carreadores coloidais dependem de sua distribuição no

organismo (Barratt, 2000). De modo geral, pode-se dizer que as principais vantagens

dos sistemas nanoestruturados são: redução das dosagens empregadas, bem como da

freqüência de administração, aumento do índice terapêutico de fármacos muito tóxicos,

redução da toxicidade geral, proteção do fármaco contra inativação química ou

enzimática e direcionamento para o alvo de ação.

Os polímeros utilizados na encapsulação consistem geralmente de materiais

biocompatíveis e biodegradáveis, os quais são degradados in vivo em fragmentos

menores, facilmente excretados pelo organismo, ou mesmo em metabólitos naturais do

organismo. Podem ser de origem natural, semi-sintética ou, mais comumente, sintética,

destacando-se os poliésteres como poli--caprolactona (PCL), poli(ácido-lático) (PLA),

poli(ácido glicólico) (PLG) e seus co-polímeros (Laurencin & Elgendy, 1994).

Tensioativos de superfície

Polímeros

Tensioativos para dispersãode fases oleosas

nanoesferas nanocápsulas

Núcleo Oleoso

Tensioativos de superfície

Polímeros

Tensioativos para dispersãode fases oleosas

nanoesferas nanocápsulas

Núcleo Oleoso

Introdução


Estudos recentes, realizados em modelos animais, têm demonstrado a utilização

de vetores coloidais como carreadores de fármacos antimaláricos para o tratamento de

malária (Quadro 2) e de vacinas. Chimanuka et al. (2002) prepararam lipossomas

contendo arteméter, apresentando 100% de eficiência de encapsulação e 100% de

eficácia no tratamento de camundongos infectados pelo Plasmodium chabaudi

chabaudi. Mosqueira et al. (2004) avaliaram a eficácia e farmacocinética do

halofantrino encapsulado em diferentes tipos de nanocápsulas em camundongos

infectados pelo Plasmodium berghei, demonstrando que a atividade das NCs foi similar

ou maior quando comparada ao fármaco livre administrado como solução.

Um vetor escolhido deve permitir a encapsulação de altas concentrações do

fármaco como também permitir que o princípio ativo seja liberado de forma controlada

em condições fisiológicas. As nanocápsulas foram os vetores utilizados na realização do

presente estudo uma vez que as características do fármaco (alta lipofilia, log P = 8,5) e

alta solubilidade em óleos (Mosqueira, 2000a) favorecem sua encapsulação no núcleo

oleoso, objetivando-se um alto rendimento de encapsulação nas nanocápsulas. Além

disso, Mosqueira et al. (2004) demonstraram que em camundongos infectados pelo

Plasmodium berghei o perfil farmacocinético é semelhante para NC convencionais e

furtivas. Esses autores sugerem que o SFM, em animais infectados, é saturado pela

captura dos eritrócitos parasitados e provavelmente as NC convencionais e furtivas

passariam a ter um comportamento similar em termos de permanência na corrente

circulatória.

Introdução


Quadro 2: Principais antimaláricos associados a sistemas vetorizados e testados in vivo.

Fármaco Vetor Eficácia Referência

Sulfato de

Quinina

Microesferas Eficácia inferior ao fármaco livre, após

administração subcutânea, em

camundongos infectados pelo P. berghei.

Pimentel, 2004

Halofantrino Nanocápsulas Atividade antimalárica semelhante ou

superior ao fármaco livre. Estudo

realizado após a administração de dose

única em animais severamente infectados

pelo P. berghei.

Mosqueira et al.,

2004

Arteméter Lipossomas Eficácia superior ao fármaco livre com

100% de cura dos animais infectados

com Plasmodium chabaudi chabaudi

Chimanuka et al.,

2002

Arteeter Lipossomas Aumento da biodisponibilidade (97,91%)

do arteeter comparado com a suspensão

(31,38%) após administração oral em

coelhos. Aumento do tempo de meia vida

após administração i.v. do arteeter

encapsulado em relação aos outros

derivados de artemisinina.

Bayomi et al., 1998

Cloroquina Lipossomas

modificados

por anticorpos

anti-eritrócitos

Cura de 75-90% dos animais infectados

pelo P. berghei resistente a cloroquina,

utilizando doses baixas do fármaco

(5 mg/kg).

Owais et al., 1995

Primaquina Nanoesferas Aumento do tempo de sobrevida de

camundongos infectados pelo P. berghei

se comparado ao fármaco livre.

Mbela et al., 1992

Pirimetamina Microesferas Atividade terapêutica não foi adequada

para tratamentos por períodos

prolongados.

Tsakala et al., 1990

Cloroquina Lipossomas Aumento na eficácia terapêutica e

profilática com 100% de eficácia

avaliada em camundongos infectados

pelo P. berghei após administração de

dose única de cloroquina encapsulada.

Peeters et al., 1989

Primaquina Lipossomas Aumento do tempo de meia vida da

primaquina em lipossomas comparado ao

fármaco livre, após administração i.v

Pirson et al., 1982

Introdução


2.6. NANOCÁPSULAS

As nanocápsulas são nanopartículas poliméricas caracterizadas como

reservatórios vesiculares constituídos por uma parede polimérica que envolve uma

cavidade preenchida com óleo ou emulsão, na qual o princípio ativo encontra-se

disperso (Kreuter, 1994). NCs são carreadores de escolha para a administração

intravenosa de fármacos altamente lipofílicos, pois são constituídas por polímeros

estáveis, com baixa toxicidade e capacidade de degradação no organismo. Consideradas

vetores de segunda geração, as NCs possibilitam a aplicação sistêmica de injeções

intravenosas in bolus, sem diluição prévia, direcionando o fármaco de forma passiva

para células definidas do organismo.

Podem ser classificadas como convencionais ou furtivas. As NCs convencionais

concentram os fármacos encapsulados nos órgãos e células do sistema fagocítico

mononuclear (Juliano, 1988). Por outro lado, as NCs furtivas ou com a superfície

modificada, representam um tipo especial de partículas com cadeias de polietilenoglicol

(PEG) ligadas covalentemente à superfície. Essa modificação permite que as partículas,

quando injetadas por via i.v., escapem do reconhecimento e da captura rápida pelas

células do SFM, (Gref et al., 1994), prolongando assim o tempo de circulação sangüínea

e liberando lentamente, no compartimento plasmático, os princípios ativos encapsulados

no seu interior (Mosqueira et al., 1999). As NCs, em especial, as furtivas são

potencialmente capazes de restringir a captação de fármacos por certos tecidos ou

órgãos que apresentam epitélios endoteliais contínuos, como o coração e os rins,

preservando-os da toxicidade do princípio ativo.

Segundo revisão feita por Schaffazick et al. (2003), existem vários métodos para

preparação de nanopartículas poliméricas, que podem ser divididos em duas classes

principais: a primeira engloba a maioria dos métodos, os quais são baseados em reação

de polimerização, enquanto a segunda baseia-se na deposição interfacial de polímeros

pré-formados, sendo também conhecida como nanoprecipitação (Fessi et al., 1989).

As formulações do presente estudo foram preparadas pelo método de

nanoprecipitação, visto que é uma técnica de simples execução e facilmente

transponível para a escala industrial. Esse método é baseado na precipitação e formação,

cineticamente controlada, de vesículas de tamanho coloidal constituídas por uma fase

Introdução


oleosa na qual o fármaco encontra-se disperso e revestida por uma camada polimérica

em um ambiente externo aquoso. A técnica consiste na mistura de uma fase orgânica

(contendo um solvente orgânico, óleo, tensioativo hidrofóbico e polímeros insolúveis no

óleo e na água) miscível em uma fase aquosa (contendo tensioativos hidrofílicos). Após

a mistura da fase orgânica com a fase aquosa, o polímero precipita na interface pela

redução da sua solubilidade na mistura de solventes, sendo que a difusão mútua dos

solventes fornece uma energia favorável para formação de nanogotas de óleo que

servem como núcleo para a precipitação do polímero. Observa-se, imediatamente, o

surgimento de uma suspensão leitosa, com elevada opalescência, resultado da formação

das nanocápsulas. Em seguida, o solvente é removido sob pressão reduzida e a

suspensão concentrada através da evaporação da água (Fessi et al., 1989). Os polímeros

mais utilizados para a preparação de NCs por esse método são os poliésteres

biodegradáveis, PLA, PLGA e PCL.

2.6.1. CARACTERÍSTICAS FÍSICO-QUÍMICAS DAS NANOCÁPSULAS

Em função de sua natureza coloidal e da complexidade de constituintes que

compõem as formulações de nanocápsulas, a caracterização dessas nanoestruturas é

tecnicamente complexa de ser realizada. Geralmente, a avaliação físico-química

envolve: análise morfológica, distribuição do tamanho das partículas, determinação do

potencial zeta () ou carga superficial das partículas, determinação do pH, determinação

da concentração de fármaco associado às nanopartículas e cinética de liberação do

fármaco a partir das nanocápsulas (Legrand et al., 1999; Schaffazick et al., 2003).

2.6.1.1. DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DAS NANOCÁPSULAS

A distribuição do diâmetro das partículas é uma das mais importantes

características físico-químicas das suspensões coloidais, uma vez que a tendência à

sedimentação das partículas contendo o fármaco bem como estudos de sua estabilidade

podem ser monitorados através de mudanças na distribuição de diâmetro das partículas

(Magenheim & Benita, 1991). Além disso, essa característica é de extrema importância

para a definição do perfil de distribuição e das interações das nanoestruturas com as

células do SFM após administração i.v. (Barratt, 2000).

Introdução


Geralmente, o diâmetro das NCs preparadas pela técnica de nanoprecipitação

varia entre 100 e 500 nm, sendo influenciado por diversos fatores tais como: natureza e

concentração do polímero e do fármaco, concentração de surfactantes, proporção entre

solvente e água, concentração do óleo, além da velocidade de difusão da fase orgânica

na aquosa (Legrand et al., 1999; Mosqueira et al., 2000 b; Schaffazick et al., 2003).

Os métodos mais comumente utilizados para determinar a distribuição de

tamanho e o índice de polidispersão das amostras são espectroscopia de correlação de

fótons (PCS), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia eletrônica de

varredura (MEV), sendo que as últimas permitem analisar a morfologia das

nanoestruturas (Legrand et al., 1999). Recentemente, a microscopia de força atômica

(MFA) também vem sendo utilizada para determinação de tamanho e estudo da

morfologia das nanopartículas.

No presente trabalho, a técnica utilizada para avaliar a distribuição de tamanho

foi a PCS e a MFA. A técnica de PCS baseia-se na análise do movimento browniano

das partículas, ou seja, na capacidade de deslocamento constante das partículas

presentes num determinado sistema fazendo com que a intensidade da luz espalhada por

elas forme um padrão de movimento. Através da dispersão da luz torna-se possível

determinar o diâmetro médio das partículas. Portanto, a adsorção de tensioativos e a

camada de hidratação móvel podem afetar o diâmetro das nanopartículas, o qual é

determinado como raio hidrodinâmico.

2.6.1.2. POTENCIAL ZETA () DAS NANOCÁPSULAS

A medida de potencial zeta é o método mais utilizado para estimar a carga

superficial de nanocápsulas (Washington, 1996). O potencial pode ser definido como

o potencial existente na fronteira entre um partícula individual e seus íons associados,

ou seja, no plano de cisalhamento (Figura 8). Esse parâmetro reflete, portanto, o

potencial de superfície das partículas, o qual é influenciado por mudanças na interface

com o meio externo, decorrente da dissociação de grupos funcionais presentes na

superfície ou da adsorção de espécies iônicas do meio de dispersão (Florence &

Attwood, 2003). Forças repulsivas entre as partículas são originadas devido à interação

de duplas camadas elétricas nas partículas adjacentes. Pode-se, portanto, determinar a

Introdução


grandeza da carga elétrica através de medidas de mobilidade eletroforética das

partículas submetidas à aplicação de um campo elétrico.

FIGURA 8 – Representação das condições em uma superfície negativa com uma camada de

íons positivos adsorvidos na camada de Stern. São apresentados o potencial de

superfície 0 e o potencial na camada de Stern .. No plano de cisalhamento é

localizado o potencial zeta, Fonte: Florence & Attwood, 2003, p.352.

As lecitinas, o poloxamer e os polímeros são os principais componentes que

podem afetar o potencial , por estarem envolvidos na formação da cápsula e adsorvidos

a ela. Enquanto polímeros e lecitinas favorecem uma carga negativa na interface, o

poloxamer, um surfactante não-iônico tende a reduzir, em valor absoluto, o potencial

(Legrand et al., 1999). Como descrito por Benita & Levy (1993) é possível modular o

Introdução


potencial pela escolha de lecitinas com diferentes graus de pureza, uma vez que a

carga negativa é decorrente da presença de determinados tipos de fosfolípides.

Legrand et al., (1999) afirmam que formulações constituídas por partículas com

altos valores de potencial zeta (acima de 30 mV) apresentam maior estabilidade, visto

que grandes forças repulsivas tendem a evitar a agregação entre as partículas. O

potencial de superfície também pode influenciar a resposta biológica do fármaco,

portanto, após a administração i.v., as partículas convencionais são rapidamente

capturadas pelas células do SFM quando o diâmetro e a carga superficial são

aumentados (Juliano, 1988).

Além disso, alterações do potencial permitem elucidar mecanismos de

associação fármaco-vetor e avaliar a influência da composição nas características físico-

químicas da nanoestrutura. Calvo et al., (1996) observaram os efeitos da composição de

diferentes carreadores nanoestruturados sobre os valores do potencial zeta e verificaram

que a fase oleosa das nanocápsulas e nanoemulsões conferiu um potencial mais negativo

(aproximadamente = -42 mV) quando comparado às nanoesferas (aproximadamente

= -16 mV). Em função da semelhança do potencial de nanocápsulas e nanoemulsões,

os autores sugeriram que a camada polimérica ao redor da gotícula de óleo seria um

filme delgado. Por outro lado, Mosqueira et al. (2000 b) sugeriram que o óleo

constituinte das nanocápsulas está completamente encapsulado pelo polímero pois

nenhuma alteração significativa no potencial de NC foi observada em formulações

preparadas com óleos de diferente natureza.

2.6.1.3. AVALIAÇÃO MORFOLÓGICA

A microscopia eletrônica de transmissão é a técnica mais utilizada para

avaliação morfológica e estrutural das nanocápsulas (Schaffazick et al., 2003). A

associação dessa técnica à criofratura tem fornecido informações úteis sobre a estrutura

das NCs (Mosqueira et al., 2001 b; Rübe et al., 2005). Estudo recente realizado por

Rube et al. (2005) demonstrou que a técnica de espalhamento de nêutrons a baixo

ângulo fornece informações importantes sobre a espessura da parede polimérica, cujo

Introdução


valor estimado foi de 17 nm, permitindo elucidar e comprovar o modelo reservatório

proposto para as NCs.

Entretanto, nos últimos anos, a MFA tem sido uma ferramenta muito utilizada

para caracterização de nanossistemas, principalmente lipossomas (Li & Palmer, 2004) e

nanoesferas (Gref et al., 1994). A MFA fornece informações com alta resolução em três

dimensões, em escala nanométrica sendo capaz ainda de resolver detalhes de superfície

ao nível atômico (Neves et al., 1998).

A análise morfológica das nanocápsulas no presente estudo foi realizada por

MFA, cujo princípio básico envolve a força de interação entre a sonda utilizada e a

amostra, fornecendo importantes informações tais como organização estrutural,

distribuição de diâmetro, dentre outras. À medida que uma sonda extremamente fina

(~100 Å de diâmetro), montada sob a extremidade de uma alavanca, se aproxima da

superfície de uma determinada amostra, surgem forças de interação sonda-amostra as

quais fazem a alavanca defletir. Essa deflexão é detectada por um sistema laser-

fotodetector e todo o sistema monitorado digitalmente, convertendo os dados em um

mapa topográfico da superfície da amostra (Neves et al., 1998). A figura 9 apresenta os

componentes do microscópio de MFA e o esquema de funcionamento da técnica.

Forças de interação sonda-amostra, atrativas ou repulsivas, tão pequenas como

nano-Newtons (nN = 10-9

N) podem ser medidas (Birdi et al., 1997). A longas

distâncias, essa interação praticamente não existe. À medida que a sonda se aproxima da

amostra, forças atrativas (tipicamente forças de Van der Waals) passam a atuar,

aumentando com a aproximação da sonda até que a separação seja de ordem inter-

atômica. Nesse ponto, surgem forças eletrostáticas repulsivas sugerindo contato físico

entre a sonda e a superfície da amostra (Neves et al., 1998). A interação real entre sonda

e amostra tem caráter mais complexo; porém, as características básicas da interação são

as mesmas: atração à longa distância e repulsão em distâncias menores, conforme

proposto por Lennard-Jones (Jean et al., 1999).

Introdução


FIGURA 9 – Esquema de funcionamento da técnica de MFA, mostrando os componentes

gerais do microscópio e suas respectivas funções.

Fonte:www.web.mit.Edu/cortiz/www/afm

Baseando nessas forças interativas, pode-se definir alguns modos de operação na

técnica de MFA, a saber: 1) contato, onde a interação por forças repulsivas permite

obter imagens com alta resolução, ao nível atômico. Neste modo, o atrito sonda-amostra

pode danificar a superfície, produzindo imagem distorcida; 2) não contato, onde a

interação é atrativa, apresenta resolução limitada apesar de apresentar a vantagem de

não danificar a amostra; 3) contato intermitente, com regime alternando em atrativo e

repulsivo; reúne vantagens dos dois modos, conseguindo altas resoluções sem

deformação da amostra (Neves et al., 1998).

Além das grandes ampliações, algumas vantagens da MFA incluem: a obtenção

de informações nas três dimensões espaciais; utilização de amostras condutoras e/ou

isolantes, além da simplicidade de preparo da amostra, permitindo a análise na amostra

hidratada, sem necessidade de utilização de vácuo. Assim, amostras biológicas podem

ser preparadas, por exemplo, pela deposição de uma gota em uma lâmina ou outro

substrato, como por exemplo, a mica (Neves et al., 1998).

Introdução


3. JUSTIFICATIVA DO TRABALHO

Em trabalhos anteriores, os carreadores coloidais do tipo NCs, da ordem de

200 nm foram obtidos a partir de derivados anfifílicos de PLA, destinadas à

administração i.v. de fármacos lipofílicos. Estes vetores permitiram um aumento da

concentração plasmática x tempo da ordem de 16 vezes do halofantrino, quando

comparado com a concentração plasmática do fármaco administrado como solução

(Mosqueira et al., 2004). Entretanto, o efeito mais surpreendente foi à redução

extremamente significativa da toxicidade em camundongos com um aumento da dose

máxima tolerada de 30 para 100mg/kg/dose do halofantrino quando administrado por

via i.v. sob forma vetorizada. O trabalho supracitado não permitiu, no entanto, verificar

se a redução da toxicidade teria como foco o sistema cardiovascular, uma vez que

diversos trabalhos na literatura descrevem efeitos cardiotóxicos em pacientes tratados

com halofantrino (Nosten et al., 1993; Malvy et al., 2000; Abernethy et al., 2001).

Os carreadores coloidais nanoparticulados, particularmente as nanocápsulas, são

potencialmente capazes de reduzir a toxicidade geral e também a dose eficaz de alguns

fármacos, por alterarem sua farmacocinética e biodistribuição, considerando que a

molécula associada ao vetor teria uma associação reduzida com órgãos vitais tais como

coração, cérebro e rins.

Diante do exposto, neste trabalho o estudo mais aprofundado das NCs de poli--

caprolactona contendo Hf foi realizado, objetivando sua caracterização e investigação

dos efeitos da nanoencapsulação sobre alguns parâmetros cardiovasculares extraídos de

registro de ECG e PA, em animais sadios e infectados pelo Plasmodium berghei.

OBJETIVOS

Objetivos


1. OBJETIVO GERAL

Este trabalho tem como objetivo desenvolver e caracterizar uma formulação de

nanocápsulas contendo halofantrino base e avaliar, experimentalmente, a redução da

toxicidade geral, mais especificamente da cardiotoxicidade, obtida com o uso desse

sistema em ratos Wistar sadios e infectados.

2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Em âmbito mais específico este trabalho tem como objetivos principais:

o desenvolvimento farmacotécnico (formulação e caracterização) de

nanocápsulas de poli--caprolactona contendo halofantrino;

a caracterização físico-química das nanopartículas pela análise do tamanho e da

carga superficial (potencial zeta) por espectroscopia de correlação de fótons e

mobilidade eletroforética, respectivamente;

a análise da morfologia, estrutura, características de organização e da

distribuição de tamanho das nanocápsulas por microscopia de força atômica (MFA);

a análise da associação do fármaco às NC por MFA;

a determinação da dose letal aguda (DL100 e DL50) após administração

intrvaneosa do halofantrino livre (Hf.HCl) e encapsulado (NC-Hf) em ratos Wistar;

comparação das alterações dos intervalos QT, PR, QRS e QTc do ECG de ratos

Wistar, indicativas de cardiotoxicidade, advindas da administração intravenosa de

diferentes doses e formulações contendo halofantrino, a curto e a longo prazo;

a análise das alterações de pressão arterial e freqüência cardíaca em ratos Wistar

tratados com Hf.HCl ou NC-Hf,

o estudo da contribuição da doença, no caso a malária, sobre os efeitos

cardiotóxicos do halofantrino através do uso de ratos infectados pelo P. berghei.

MATERIAIS E

MÉTODOS

Materiais e Métodos


1. METODOLOGIA DE OBTENÇÃO DE NANOCÁPSULAS

1.1. PREPARAÇÃO DO HALOFANTRINO BASE

Essa técnica consistiu em uma reação química de transformação do Hf.HCl,

utilizado na produção do medicamento HALFAN®, em sua base livre mais solúvel na

fase oleosa, posteriormente utilizada na preparação de nanocápsulas, como apresentado

na figura 10.

FIGURA 10 – Preparação de Halofantrino base livre a partir de Hf.HCl, como descrito por

Porter et al., 1996.

A reação ocorreu a partir da dissolução de 1,0 g de Hf.HCl em 50 mL de álcool

etílico, seguida pela alcalinização com hidróxido de sódio até obtenção de pH = 10.

Foram adicionados 50 mL de água para precipitação da base livre e a extração da base

livre foi feita num funil de separação com diclorometano. Foram realizadas duas

extrações com 25 mL de diclorometano cada. À solução orgânica foi acrescentado

sulfato de magnésio para remoção do restante de água, filtrada, e o solvente foi

evaporado sob pressão reduzida em um rotavapor (Heidolph Instruments, Alemanha)

até secura. O Hf base livre foi armazenado ao abrigo da luz em dessecador até o seu uso

posterior ou dissolvido em Miglyol 810 (40 mg/mL) para posterior utilização.

1.2. PREPARAÇÃO DAS NANOCÁPSULAS

A preparação das nanocápsulas foi realizada pelo método de deposição

interfacial de um polímero pré-formado, método também conhecido como

nanoprecipitação, descrito anteriormente por Fessi et al. (1989).



Primeiramente, 6 mg/mL de polímero poli--caprolactona foram dissolvidos em

uma solução de acetona (1 mL) contendo 0,75% de lecitina (Epikuron®

170) e 2,5% de

Miglyol 810. Essa dissolução ocorreu por meio de agitação com o auxílio de um

agitador magnético e com aquecimento até 40 °C. Em seguida, a solução orgânica foi

vertida em uma solução externa aquosa (2 mL) contendo 0,75% de Poloxamer 188

(Pluronic F68), mantendo a mesma agitação por 10 min, a fim de promover a formação

das nanocápsulas. Posteriormente, essa suspensão foi levada ao rotavapor (Heidolph

Instruments, Alemanha), mantendo-se a temperatura do banho em torno de 50 °C para

evaporação do solvente à pressão reduzida. As formulações de NC contendo fármaco

foram preparadas adicionando-se halofantrino base livre em diferentes concentrações

(0,1; 1; 5; 10 e 12 mg/mL) na fase orgânica, seguindo as mesmas condições descritas

acima. As etapas do preparo da NCs estão apresentadas na figura 11.

FIGURA 11 – Etapas da Preparação de Nanocápsulas.

1) preparação das fases aquosa e oleosa,

2) preparação das nanocápsulas,

3) agitação após preparação,

4) evaporação do solvente.

1

2 3

41

2 3

4



2. CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA DAS NANOCÁPSULAS

2.1. DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO E POTENCIAL ZETA

A análise do diâmetro das partículas, o índice de polidispersão das amostras e o

potencial zeta foram determinados por espectroscopia de correlação de fótons e

mobilidade eletroforética, respectivamente, utilizando um equipamento Zetasizer

3000 HS (Malvern Instruments, UK).

Para a realização dessas medidas, 20 L de suspensão coloidal de nanocápsulas

(não carregadas ou contendo Hf) foram diluídos em 4980 L de uma solução de NaCl

1 mM com o objetivo de se obter suspensões com condutividades constantes (1,2 ± 0,2

mS/cm2) e resultados comparativos em relação as modificações de carga superficial

introduzidas pelo fármaco encapsulado em diferentes concentrações. As medidas foram

efetuadas à temperatura ambiente utilizando-se um ângulo de incidência do laser em

relação à amostra de 90°. As medidas do tamanho e do potencial zeta foram realizadas

na mesma amostra. Todas as determinações foram realizadas em triplicata e os

resultados apresentados foram expressos como a média ± desvio padrão.

O índice de polidispersão, calculado pelo equipamento, reflete o perfil de

homogeneidade no diâmetro das partículas da amostra. Amostras que apresentaram

índice de polidispersão inferior a 0,3 foram consideradas monodispersas.

A análise de tamanho de algumas amostras foi realizada seguindo o mesmo

protocolo acima, porém em um equipamento diferente, Nanosizer N4 Plus (Coulter

Electronics Inc., Hialeah, FL, USA) em colaboração com a Dra. Gillian Barratt na

Université Paris XI, França.

2.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE HALOFANTRINO POR

ESPECTROFOTOMETRIA NO ULTRAVIOLETA

A determinação do pico de absorção máxima do Hf foi realizada por

espectofotometria no ultravioleta, utilizando um espectofotômeto Hélios . A partir de

uma solução de 20 g/mL de Hf.HCl em acetonitrila, foi realizado uma varredura em

comprimentos de onda definidos entre 200 e 300 nm, sendo então obtido o espectro da

amostra na região do ultravioleta.



Posteriormente, a partir de uma solução estoque (200 g/mL) de Hf em

acetonitrila, foram preparadas diferentes diluições correspondentes às concentrações de

0,5 a 20,0 g de Hf/mL. Essas preparações foram utilizadas para determinação da curva

padrão do Hf. Os testes foram realizados em triplicata e o comprimento de onda

determinado para a leitura do Hf foi 258 nm.

2.3. TESTE DA PORCENTAGEM DE ENCAPSULAÇÃO

A porcentagem de encapsulação visa determinar o teor de fármaco associado

intimamente à nanopartícula em relação ao total de fármaco na preparação. Portanto,

esse índice foi calculado pela diferença entre a quantidade de fármaco na suspensão

(medida por dissolução da suspensão total em acetonitrila) e o fármaco livre no meio

externo aquoso (ultrafiltrado) obtido após a ultrafiltração da amostra em unidades

MICROCON com membrana de 100.000Da (AMICON, Millipore®). No interior do

filtro, foram adicionados 400 L, centrifugados por 15 min a 450 x g. Retirou-se 50 L

do ultrafiltrado e adicionou-se 300 L de acetonitrila. A mistura foi agitada no vórtex,

centrifugada novamente e a determinação do Hf livre foi realizada por

espectrofotometria no ultravioleta. A % de encapsulação foi calculada segundo a

seguinte fórmula:

% encapsulação = ([ ] fármaco total (400 L) - [ ] fármaco 400 L de filtrado) x 100

[ ] fármaco total (400 L)

Após a ultrafiltração dos 400 l de 1, 5 ou 10 mg/mL NC-Hf, a quantidade de

halofantrino adsorvida à membrana de ultrafiltração da unidade MICROCOM também

foi determinada. A unidade MICROCON (Millipore®) foi quebrada e a membrana

retirada foi lavada com água Milli-Q, seca em papel de filtro e imersa em 500 L de

acetonitrila. A preparação foi agitada no vórtex, centrifugada e a quantidade de Hf

determinada por espectrofotometria no ultravioleta. A quantidade de Hf retido na

membrana não excedeu 0,034% (n = 6). A metodologia para determinação do teor de Hf

livre e encapsulado ou associado à membrana de ultrafiltração está esquematizada na

figura 12.



FIGURA 12 – Representação esquemática da metodologia para separação do Hf

encapsulado nas NCs do Hf não encapsulado.

2.4. ANÁLISE DA MORFOLOGIA DAS NANOCÁPSULAS

A análise morfológica das nanocápsulas foi realizada por microscopia de

varredura por sonda mecânica, utilizando a técnica de força atômica.

Para realização destes experimentos, foram utilizados os equipamentos

Multimode e Dimension 300, ambos monitorados por controlador Nanoscope IIIa

(Digital Instruments, Santa Bárbara, EUA), da Fundação Centro Tecnológico de Minas

Gerais (CETEC, MG). As imagens foram obtidas no modo de contato intermitente

(tapping mode) utilizando sondas de silício de comprimento de 228 m, com uma

freqüência de ressonância de 75-98 kHz, força constante de 29-61 N/m e raio de

curvatura de 5 nm a 10 nm. Aproximadamente 5 L das amostras foram depositados em

placas de mica clivadas no momento do uso. A mica foi utilizada como suporte para as

amostras, uma vez que trata-se de um mineral com plano basal e com clivagem muito

fácil apresentando superfície atomicamente plana. A superfície exposta é hidrofílica e

apresenta cargas negativas. Após a deposição das amostras na superfície da mica, essas

foram, imediatamente, secas utilizando-se jato de argônio. A varredura foi efetuada com

velocidade de 1 Hz e resolução de 512 x 512 pixels. A análise das amostras foi realizada

100000 Da

Hf base NC-Hf

Centrifugação, 15min, 450g

Extração em

acetonitrila

Diluição em

acetonitrila

Agitação, 15min

Centrifugação,

15min, 450g

Dosagem do

Sobrenadante

(258 nm)

Agitação, 15min

Centrifugação,

15min, 450g

Dosagem do

Sobrenadante

(258 nm)

100000 Da

Hf base NC-Hf

Centrifugação, 15min, 450g

Extração em

acetonitrila

Diluição em

acetonitrila

Agitação, 15min

Centrifugação,

15min, 450g

Dosagem do

Sobrenadante

(258 nm)

Agitação, 15min

Centrifugação,

15min, 450g

Dosagem do

Sobrenadante

(258 nm)



utilizando o programa de análise do sistema (Section Analysis). Um mínimo de dez

imagens de cada amostra foi analisado para assegurar reprodutibilidade dos resultados.

Os resultados foram apresentados como a média ± desvio padrão de aproximadamente

50 partículas analisadas.

3. EXPERIMENTAÇÃO “IN VIVO”

3.1. ANIMAIS EXPERIMENTAIS

Foram utilizados 140 ratos Wistar machos adultos (250 ± 50 g) provenientes do

Biotério da Universidade Federal de Ouro Preto. Os animais foram mantidos no

Biotério da Escola de Farmácia da Universidade Federal de Ouro Preto até a realização

dos experimentos e tiveram livre acesso à comida e água. Todos os procedimentos

relativos à manutenção dos animais e à experimentação seguiram as normas do

Conselho Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).

3.2. CONFECÇÃO DE CATETERES PARA IMPLANTAÇÃO INTRA-

VASCULAR

Os cateteres foram preparados utilizando-se 15 cm de tubo de polietileno PE50

(Sonda Hemo Técnico, Brasil) e 4,5 cm de tubo de polietileno PE10 (Intramedic

Polyethylene Tubing Clay Adams, EUA), soldados sob a ação do calor, utilizando-se

um fio de aço para impedir a oclusão da luz. Os cateteres foram preenchidos com

solução salina (NaCl 0,9%) heparinizada (10 U/mL) e ocluídos com pinos metálicos na

extremidade PE50 antes de sua implantação.

3.3. PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS

Para os protocolos I, III e IV os animais foram anestesiados com éter etílico por

via inalatória. Para o protocolo II, os animais foram anestesiados pelo tiopental sódico

(70 mg/kg) por via intraperitoneal (i.p.).

Após a anestesia ter alcançado a profundidade adequada, os animais foram

submetidos ao procedimento cirúrgico que consistiu na implantação de cateteres

intravenoso e intra-arterial e sua posterior exteriorização no tecido subcutâneo, 24 horas

antes da realização dos experimentos (protocolos I, III, IV). Para o protocolo II, os



animais foram traqueostomizados, utilizando-se uma cânula de polietileno, para permitir

respiração espontânea adequada e em seguida, tiveram os cateteres intravasculares

implantados. Após tricotomia, assepsia e incisão na região inguinal, o feixe vásculo-

nervoso foi, então, localizado, exposto e, em seguida, a artéria e a veia femorais foram

isoladas por um fio duplo de algodão. Após pequena incisão no vaso, a extremidade

PE10 do cateter foi introduzida na artéria, ficando localizada na aorta abdominal, abaixo

das artérias renais. O mesmo procedimento foi realizado na veia, ficando a porção PE10

localizada na veia cava inferior. Os animais (protocolo I, III e IV) tiveram a parte PE50

do cateter conduzida, com a ajuda de um trocárter, através do tecido subcutâneo, até à

região cervical onde foi feita uma pequena incisão na pele para exteriorização do

mesmo, possibilitando a injeção de drogas nos animais acordados.

3.4. OBTENÇÃO DOS SINAIS DE ELETROCARDIOGRAMA E PRESSÃO

ARTERIAL

O sinal do ECG foi obtido utilizando agulhas hipodérmicas de aço inoxidável

como sensores. As agulhas foram inseridas no tecido subcutâneo do membro superior

direito e inferior esquerdo, objetivando medir a diferença de potencial relativa à

derivação DII. O sensor inserido no membro inferior direito foi ligado à blindagem do

aparelho, para minimizar o “ruído”.

O registro da pressão arterial foi realizado utilizando um transdutor de pressão

modelo P23XL (Spectramed, EUA). Esse transdutor foi conectado ao cateter

introduzido na artéria femoral do animal. Os sensores de ECG e o transdutor de pressão

arterial foram, então, conectados a um sistema condicionador de sinais (desenvolvidos

no Departamento de Engenharia Elétrica da Universidade Federal de Minas Gerais).

Para os dados da fase inicial do trabalho (referentes ao protocolo II), os sinais

obtidos foram amostrados a uma freqüência de 600 Hz por uma placa conversora

analógico-digital de 12 bits de resolução (modelo DI 200, DATAQ Instruments, EUA).

Em uma fase posterior (dados referentes aos protocolos III e IV), os sinais obtidos

foram amostrados a uma freqüência de 2000 Hz, por uma placa conversora analógico-

digital Windaq Board (modelo DI 200, USA). Os registros foram armazenados em disco

rígido e gravados em compact discs (CD).



FIGURA 13 – Sistema de Aquisição de ECG e PA. 1) Visão geral do sistema; 2) Visão de um animal com os eletrodos inseridos no tecido

subcutâneo, indicados pela seta; 3) Registro de ECG e PA obtidos a partir do animal em experimentação.

1

2 3

1

2 3



3.5. PREPARO DAS SOLUÇÕES DE HALOFANTRINO PARA

ADMINISTRAÇÃO ENDOVENOSA

A solução de Hf.HCl foi preparada a partir da dissolução de 100 mg de Hf.HCl

em 0,8 mL de dimetilacetamida (DMA) e 1,2 mL de polietilenoglicol 300 (PEG 300),

adaptada de uma preparação descrita anteriormente por Krishna et al. (1993), a qual foi

administrada e testada clinicamente em humanos. Esta preparação foi diluída cinco

vezes em solução de glicose hipertônica, antes da injeção, para evitar possíveis efeitos

tóxicos do solvente. A solução de DMA e PEG 300 sem o halofantrino foi preparada

nas mesmas condições descritas acima, sendo então utilizada como controle.

A preparação da suspensão coloidal de NC com e sem Hf foi realizada como

descrito no item 1.2. Todas as preparações antes da administração foram isotonizadas

com glicose e filtradas em filtro Millipore 0,45 m para garantir a administração de

partículas inferiores a 5 m, reduzindo-se a possibilidade de formação de êmbolos.

3.6. INFECÇÃO DOS ANIMAIS

Diferentes protocolos foram utilizados para imunossupressão dos animais,

conforme descrito na tabela abaixo:

Quadro 3 – Padronização dos protocolos de imunossupressão.

N° do

Protocolo

Ciclofosfamida

Dose/dia

(mg/kg)

Regime de Dose Dose Total

(mg/kg)

Dia da

Infecçãoa,b

P 1 50 - 50 mg/kg, 4 dias consecutivos 200 D4

P 2 50 - 50 mg/kg, 4 dias consecutivos 200 D7

P 3 50

- 50 mg/kg, 4 dias consecutivos

- pausa de 3 dias;


400 D13

P 4 50/40


- pausa de 3 dias;


320 D12

P 5 100 - 100 mg/kg, dose única 100 D4

P 6 50


- pausa de 3 dias;


400 D4

P 7 50/25 - 50 mg/kg, 2 dias consecutivos

- 25 mg/kg, 2 dias consecutivos 150 D7

a após início da imunossupressão;

b Administração intraperitoneal de 2x10

7 hemácias de camundongo

Swiss parasitadas com Plasmodium berghei por animal; D0 = início da imunossupressão; Peso dos

animais = 250 + 50g.



Dos protocolos acima, o esquema que permitiu a imunossupressão associada a

infecção com 100% de sobrevida e parasitemia foi P 7. Portanto, para a obtenção de

ratos Wistar infectados pelo Plasmodium berghei foi utilizado o tratamento padronizado

com ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha) por via intraperitoneal na dose de

50 mg/kg/dia por dois dias consecutivos, seguido da dose de 25 mg/kg/dia por mais dois

dias consecutivos. No oitavo dia após o início do tratamento com ciclofosfamida, ou

seja, no quarto dia após o término do tratamento, os animais receberam por via i.p.

solução salina 0,9% contendo 2x107 hemácias de camundongos Swiss infectadas pelo

P. berghei. O inóculo foi obtido a partir de camundongos albinos infectados entre a 21 e

26ª passagens, realizadas semanalmente.

No décimo primeiro dia após a infecção e estando confirmado a presença do

parasita por esfregaço sanguíneo, os animais foram então submetidos à experimentação

para a avaliação da cardiotoxicidade.

3.7. AVALIAÇÃO DA PARASITEMIA

A parasitemia foi confirmada através de esfregaço sanguíneo confeccionados a

partir da coleta de amostras de sangue dos animais recolhidas da veia caudal. Os

esfregaços foram fixados em metanol e corados pelo Giemsa. O nível de parasitemia (%

de hemácias infectadas) foi determinado microscopicamente, utilizando-se um

microscópio óptico (Olympus, Brasil), num aumento de 1000x pela análise de 3000

células, em diferentes campos. Os esfregaços foram confeccionados no 10° dia após

infecção para confirmação da mesma e no 11° dia para avaliação da % de parasitemia

no dia experimental. Durante todo o período experimental, os animais foram pesados e

o peso registrado em uma planilha para avaliar a variação do mesmo.

3.8. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS

3.8.1. PROTOCOLO I – Determinação da Dose Máxima Tolerada (DMT) e

DL50 para o Halofantrino em diferentes formulações

Esse protocolo foi realizado em animais acordados, com livre

movimentação, submetidos à cirurgia 24 horas antes. Diferentes grupos de animais

receberam por via endovenosa diferentes doses de halofantrino livre (100, 150,



200 mg/kg) ou encapsulado (100, 150, 200, 225, 250 e 300 mg/kg), e foram observados

por um período de 24 horas quanto à ocorrência de grooming, tremores, ataxia,

convulsão e morte.

3.8.2. PROTOCOLO II – Avaliação da Cardiotoxicidade até 30 minutos

após a administração de diferentes formulações de Halofantrino

Esses experimentos foram realizados em animais anestesiados pelo tiopental

sódico, mantendo-se a anestesia durante o período experimental com a administração do

anestésico i.v. sempre que necessário.

Os animais foram conectados ao sistema e deixados por 5 min para estabilização

antes do início do experimento. Foram obtidos então 10 min de registro controle após o

qual os diferentes grupos de animais receberam Hf.HCl ou NC-Hf nas doses de 100 ou

150 mg/kg ou volume de NC branca ou solvente (DMA/PEG 40:60) equivalentes à dose

de 150 mg/kg. Procedeu-se o registro dos parâmetros cardiovasculares continuamente

por 15 min, seguido por registros de aproximadamente 30 s a cada 5 min até 30 min

após a administração das soluções.

0 24 48 (horas)

Adm

inis

traçã

o d

a

Solu

ção d

e H

f

Pro

cess

o C

irúrg

ico

Período de Recuperação

Observação do animal

0 24 48 (horas)

Adm

inis

traçã

o d

a

Solu

ção d

e H

f

Pro

cess

o C

irúrg

ico


Observação do animal

0 10 25 40 (minutos)

Adm

inis

traçã

o d

a

Solu

ção d

e H

f

Registro a cada 5 minutos

Registro contínuo

Registro controle

0 10 25 40 (minutos)

Adm

inis

traçã

o d

a

Solu

ção d

e H

f

Registro a cada 5 minutos

Registro contínuo

Registro controle



3.8.3. PROTOCOLO III – Avaliação da Cardiotoxicidade 30 min, 1, 2, 4, 8,

24 ou 48 horas após a administração de Nanocápsulas contendo Halofantrino

Esses experimentos foram realizados em animais anestesiados pelo éter etílico,

submetidos à cirurgia e, logo após foram conectados ao sistema para obtenção do

registro controle durante 10 min. Posteriormente, os animais foram mantidos no

laboratório com livre movimentação e alimentação ad libitum e, após 24 horas os

animais acordados receberam NC-Hf na dose de 150 mg/kg. Foram então subdivididos

em diferentes grupos que tiveram os sinais de PA e ECG obtidos continuamente por um

período mínimo de 5 min sob a anestesia pelo éter etílico nos diferentes tempos após a

administração da formulação, a saber, 30 min, 1, 2, 4, 8, 24 ou 48 horas.

3.8.4. PROTOCOLO IV – Avaliação da Cardiotoxicidade do Halofantrino

nos animais infectados com Plasmodium berghei

Esses experimentos foram realizados em animais imunossuprimidos e,

posteriormente, infectados com P. berghei, como descrito no item 4.3.6.

No décimo primeiro dia após infecção, os animais foram anestesiados pelo éter

etílico, submetidos à cirurgia e, logo após foram conectados ao sistema para obtenção

do registro controle por 10 min. Posteriormente, os animais foram mantidos no

0 10min 24 h 10min

Ad

min

istr

açã

o d

a

So

luçã

o d

e H

f

Pro

cess

o C

irú

rgic

o

Registro contínuo por ~10min em diferentes tempos

(30min, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas)


Registro controle

0 10min 24 h 10min

Ad

min

istr

açã

o d

a

So

luçã

o d

e H

f

Pro

cess

o C

irú

rgic

o


(30min, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas)


Registro controle


(30min, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas)


Registro controle



laboratório com livre movimentação e alimentação ad libitum e, após 24 horas, ou seja,

no décimo segundo dia após a infecção, os animais acordados receberam Hf.HCl ou

NC-Hf na dose de 100 mg/kg. Os sinais de PA e ECG foram obtidos continuamente por

um período mínimo de 5 min sob a anestesia pelo éter etílico nos diferentes tempos após

a administração da formulação, a saber, 10 e 30 min, 1 ou 2 h, 8 e 24 horas.

3.9. ANÁLISE DOS REGISTROS

Os experimentos foram inicialmente analisados por inspeção visual do registro

com auxílio do software Win/Daq, utilizando-se diversos fatores de compressão para os

sinais. Posteriormente foram selecionados segmentos em janelas de 120 s em instantes

pré-determinados pelos protocolos experimentais permitindo a análise de 4 a 8 ciclos

cardíacos completos, dependendo da freqüência cardíaca.

Os registros armazenados foram analisados off-line e incluíram medidas do

intervalo QT (intervalo entre o início de uma onda Q e o término de uma onda T do

ECG), do intervalo RR (intervalo entre duas ondas R do ECG), do intervalo PR

(intervalo entre o início da onda P e o término da onda R), do complexo QRS (inclui

três ondas: Q, R e S; medido do início da onda Q até o término da onda S), pressão

Ad

min

istr

açã

o d

a

So

luçã

o d

e H

f

Cirurgia e registro controle por 10 min

Inóculo de 2 x107 células parasitadas

Administração do Imunossupressor

0 4 7 8 19 20 (dias)

Registro contínuo por ~10 min em diferentes tempos

(10 e 30 min, 1, 2, 8 e 24 horas)

Tempo necessário para estabelecimento da infecção

Tempo necessário para estabelecimento da

imunossupressão Ad

min

istr

açã

o d

a

So

luçã

o d

e H

f

Cirurgia e registro controle por 10 min

Inóculo de 2 x107 células parasitadas

Administração do Imunossupressor

0 4 7 8 19 20 (dias)

Registro contínuo por ~10 min em diferentes tempos

(10 e 30 min, 1, 2, 8 e 24 horas)

Tempo necessário para estabelecimento da infecção

Tempo necessário para estabelecimento da

imunossupressão



arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD). Todos os parâmetros foram analisados antes

e após a administração das formulações.

O intervalo QT foi posteriormente corrigido em função da freqüência cardíaca

usando a fórmula de Fridericia (QTc = QT/(RR)1/3

). De acordo com Abernethy et al.,

(2000), o QTc pode ser corrigido pela fórmula de Fridericia para RR<500 ms ou pela

fórmula de Bazzett para RR>500 ms. No presente trabalho sempre foram encontrados

valores de RR menores que 500 sugerindo que a fórmula de Fridericia representa

melhor os dados no modelo rato, utilizado no presente estudo.

A taxa de proteção cardíaca conferida pela encapsulação foi determinada

segundo a fórmula abaixo:

onde P representa o parâmetro do ECG analisado.

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA

O diâmetro médio e o potencial zeta das NC sem e com Hf foram comparados

utilizando-se o teste t de Student através do programa de análise EpiInfo versão 6.04.

Todos os resultados de análise de cardiotoxicidade avaliada até 30 min e nos

animais infectados foram expressos como a média ± erro padrão da média (e.p.m.). Os

resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA). A diferença entre grupos

experimentais foi testada por análise de covariância, considerando o valor de cada

parâmetro antes de administração de droga como a covariável. A porcentagem de

variação observada em cada tempo foi analisada pelo teste Kruskal-Wallis, pois os

dados não apresentaram distribuição normal.

Os resultados dos experimentos de avaliação da cardiotoxicidade a longo prazo,

também foram expressos como a média ± erro padrão da média. A diferença entre o

período controle e o tempo após administração foi testada pelo teste t de Student.

Para todas as análises adotou-se intervalo de confiança de 95%, sendo que as

diferenças foram registradas quando o valor de P foi menor ou igual a 0,05 (P ≤ 0,05).

% PNC-Hf

% PHf.HCl

% Proteção Cardíaca = 100% - x 100% PNC-Hf

% PHf.HCl

% Proteção Cardíaca = 100% - x 100



5. MATERIAIS

No presente trabalho, foram utilizados os seguintes fármacos e reagentes:

cloridrato de halofantrino (Smith Kline Beecham, UK), tiopental sódico (Cristália,

Brasil), Ciclofosfamida (Baxter Oncology, Alemanha) Poly--caprolactona (PCL),

Poloxamer 188 Mw 42.5 kDa e dimetilacetamida (DMA) (Sigma-Aldrich, USA),

Epikuron 170 (Lucas Meyer, França). Miglyol 810N (Hulls, Alemanha), PEG 300,

acetona, acetonitrila, diclorometano, sulfato de magnésio, cloreto de sódio, glicose, éter

etílico (Synth, Brasil). Todos os solventes utilizados foram de grau analítico e a água foi

purificada por osmose reversa em um sistema Symplicity (Millipore, USA).

Resultados e Discussão: Parte 1


RESULTADOS E

DISCUSSÃO



PARTE 1:

Caracterização das

Nanocápsulas



1. CARACTERIZAÇÃO FISICO-QUÍMICA

Embora vários sistemas coloidais tais como nanoemulsões, lipossomas e

nanoesferas possam ser utilizados como carreadores para o halofantrino, no presente

trabalho, as nanocápsulas foram os vetores de escolha, objetivando obter níveis ótimos

de estabilidade e alta taxa de encapsulação. Trabalhos anteriores, utilizando esse mesmo

sistema para veicular o Hf mostraram um teor de encapsulação de aproximadamente

99%, enquanto os lipossomas contendo Hf foram instáveis (Mosqueira, 2000 a). Além

disso, as NCs são vetores de escolha para a administração intravenosa de fármacos

altamente lipofílicos e solúveis na fase oleosa interna, característica marcante do Hf. As

NCs são também interessantes vetores em função de sua biodegradabilidade,

estabilidade em meio biológico e da baixa toxicidade dos polímeros pré-formados

utilizados, como por exemplo, o ácido polilático utilizado previamente, e a poli--

caprolactona, polímero usado no presente estudo. A escolha de um determinado vetor

bem como de seus constituintes deve ser bastante criteriosa, pois a retenção de um

fármaco dentro do carreador é amplamente determinada por sua lipofilicidade e sua

capacidade de se difundir entre o sistema e o meio biológico.

A solubilidade do Hf base livre em óleos foi descrita como sendo

consideravelmente maior que o sal Hf.HCl. Segundo Porter et al. (1996),

aproximadamente, 1 mg de Hf.HCl foi solúvel em 1 mL de óleo enquanto, a forma

amorfa da Hf base livre permitiu solubilizar 200 mg/mL no mesmo óleo.

Mosqueira, (2000 a) avaliando a solubilidade do Hf em diferentes óleos, determinou ser

esta igual a 180 mg/mL em Miglyol, um triglicerídeo de cadeia média que apresenta

como propriedades físico-químicas, baixa viscosidade e baixa tensão interfacial, que

favorecem sua utilização para a preparação de NC. Diante disso, a base livre foi

preparada, com rendimento de 93%, para se obter maior solubilidade do fármaco na fase

oleosa das NCs.

No presente trabalho, a quantificação do Hf nas preparações de nanocápsulas foi

realizada por espectofotometria no ultravioleta. Para tanto, inicialmente foi determinado

o espectro de UV do Hf em acetonitrila como apresentado na figura 14. Foi observado

um pico de absorção máxima em 258 nm, sendo esse, o comprimento de onda escolhido

para realização dos ensaios posteriores.



FIGURA 14 – Espectro na região do UV apresentando o pico de absorção máxima do Hf em

acetonitrila (20 g/mL).

Além disso, foi construída uma curva de calibração do Hf em acetonitrila

(Figura 15) a partir das medidas de absorbância, realizada em 258 nm, apresentadas na

tabela 1.

Tabela 1 – Valores de Absorbância utilizados para a construção da

curva de calibração da solução de Hf em acetonitrila

a n = 3; DP = desvio padrão; CV= coeficiente de variação, dado por :(DP/média)*100

Hf (g/mL) Absorbância Média (a 258 nm)a DP

CV (%)

0,5 0,05 0,001 1,7

1,0 0,09 0,004 2,6

1,25 0,11 0,001 0,6

2,5 0,21 0,002 1,1

5,0 0,41 0,002 0,6

7,5 0,64 0,005 0,8

10,0 0,85 0,003 0,4

20,0 1,60 0,013 0,8

0

0,5

1

1,5

2

2,5

200 220 240 260 280 300

Comprimento de Onda (nm)

Ab

so

rbân

cia



FIGURA 15 – Curva de Calibração do Hf em acetonitrila em comprimento de onda igual a

258 nm; R2 = coeficiente de correlação.

O coeficiente de correlação (R2) demonstra que 99% dos dados estão inseridos

na curva, sugerindo, portanto, uma correlação linear entre as concentrações de Hf e as

absorbâncias obtidas. Esses resultados permitiram utilizar a curva acima nos ensaios de

determinação do teor de Hf encapsulado.

A técnica utilizada para determinar o teor de encapsulação foi a ultrafiltração-

centrifugação e indicou que 99,80 0,02% do Hf adicionado na preparação associou-se

ao sistema coloidal, ou seja, às nanocápsulas, quando concentrações altas de fármaco

(10 mg de Hf/mL de suspensão coloidal) foram utilizadas. De acordo com a revisão

feita por Schaffazick et al. (2003), diversos fatores podem influenciar a quantidade de

fármaco associada aos sistemas nanoestruturados, tais como as características físico-

químicas do fármaco, o pH do meio, as características de superfície das partículas ou a

natureza do polímero, a quantidade de fármaco adicionada à formulação, a natureza do

óleo utilizado, bem como o tensioativo adsorvido à superfície polimérica.

A tabela 2 apresenta várias formulações de NCs contendo diferentes

concentrações de halofantrino e seu efeito no diâmetro médio, índice de polidispersão e

y = 0,0801x + 0,0166

R2 = 0,9987

0

0,3

0,6

0,9

1,2

1,5

1,8

0 5 10 15 20

Concentração (g/mL)

Ab

so

rbân

cia

(n

m)



potencial zeta das partículas. Todas as formulações foram preparadas com a mesma

composição quali-quantitativa, exceto a concentração do Hf.

Tabela 2 – Características físico-químicas de formulações de NC contendo

diferentes concentrações de Halofantrino

Formulações de

Nanocápsulas a

Hf base

(mg/mL)

Diâmetro Médio

das Partículas +

DPb (nm)

Índice de

Polidispersãoc

Potencial +

DP (mV)d

NC-0 - 245 118,7 0,193 -26,7 0,8

NC-1 1,0 191 56,6 0,250 -25,7 3,0

NC-5 5,0 504 158,0* 0,630 -1,6 1,4*

NC-10

10,0 228 140,0 0,008 +10,9 1,2*

NC-10#

10,0 268 174,2 0,109 nd

NC-12# 12,0 365 211,5 0,457 nd

a Formulações de nanocápsulas constituídas por PCL = poly--caprolactona (6 mg de polímero/mL

de suspensão coloidal); b

Desvio Padrão (n=3) das populações definidas pelo equipamento;

cAmostras monodispersas (<0.3);

d n=3, medidas realizadas após diluição da amostra (1:250) em

NaCl 1mM (condutividade, 120 S/cm); * indica diferença significativa (P < 0,05) quando

comparada com a formulação NC-0; # Formulações caracterizadas no equipamento Nanosizer N4

Plus, Coulter Electronics Inc., Hialeah, FL, USA na Université Paris XI, França; nd = não

determinado.

Como apresentado na tabela, o diâmetro médio das NCs variou de 191 a 504 nm,

e foi observado aumento gradativo no tamanho das partículas a medida que

concentrações crescentes de Hf foram associadas ao sistema. O maior diâmetro

observado nas diferentes formulações, significativamente diferente da formulação

NC-0, correspondeu a NC-5, preparada com 5 mg Hf/mL de solução coloidal. Essa

observação coincide com a redução do potencial zeta (-1,6 mV) sugerindo um estado

inicial de agregação e desestabilização do sistema, provavelmente devido à

neutralização de cargas interfaciais. O aspecto visual (turbidez) da preparação e o

aumento no índice de polidispersão (0,630), reforçam a hipótese de um possível



fenômeno de agregação entre as partículas coloidais, devido à redução da repulsão e ao

aumento das forças de Van der Waals.

As amostras NC-0, NC-1 e NC-10 apresentaram baixos índices de polidispersão

(0,008 a 0,250), caracterizando populações homogêneas de partículas, com distribuição

unimodal (Figura 16). Entretanto, NC-5 e NC-12 apresentaram-se como amostras

polidispersas, com índices de polidispersão superior a 0,3 impossibilitando sua

utilização para a administração intravenosa, devido à provável presença de agregados

com tamanho superior a 5 m.

Como apresentado na tabela 2, não existe diferença entre o tamanho das

formulações NC-10 (P = 0,57). Apesar das medidas terem sido efetuadas em

equipamentos distintos, pôde-se verificar uma reprodutibilidade dos resultados com

presença de populações homogêneas em ambas as amostras (Figura 16 D e E). Esses

resultados mostraram que existe uma boa correlação entre os diferentes equipamentos

utilizados para a realização da técnica de PCS.



FIGURA 16 – Tamanho das diferentes formulações de NCs obtido por equipamentos

distintos: A a D: Zetasizer 3000 HS; E e F: Nanosizer N4 plus. A:

formulação NC-0, sem o halofantrino; B: formulação NC-1, contendo 1 mg

de Hf/mL de suspensão; C: formulação NC-5, contendo 5 mg de Hf/mL de

suspensão; D e E: formulações NC-10, contendo de 10 mg de Hf/mL de

suspensão; F: formulação NC-12, contendo 12 mg de Hf/mL de suspensão.

A B

C D

F

Diâmetro (nm)

Diâmetro (nm)

Diâmetro (nm)

Diâmetro (nm)

Inte

nsi

dad

e

Diâmetro (nm)

Inte

nsi

dad

e

Diâmetro (nm)

Size distribution(s)

5 10 50 100 500 1000Diameter (nm)

5

10

15

% i

n c

lass


5 10 50 100 500 1000Diameter (nm)

5

10

15

% i

n c

lass


5 10 50 100 500 1000Diameter (nm)

10

20

% i

n c

lass

Size d istribution(s)

5 10 50 100 500 1000Diameter (nm)

10

20

30

40

% i

n c

lass

E



O potencial foi utilizado com o objetivo de detectar alterações na carga

superficial das partículas devido à adição de Hf ao sistema. Foram observados valores

altamente negativos para as formulações NC-0 e NC-1, enquanto NC-10 apresentou

valor de positivo (Tabela 2). Os valores de potencial idênticos (P = 0,34), em torno

de 26 mV,para NC-0 e NC-1 sugerem que a superfície das nanocápsulas com

halofantrino (1 mg/mL) tem a mesma composição das NCs brancas, ou seja, nessa

condição parece que a maior parte do fármaco encontra-se encapsulado no núcleo

oleoso, sem influenciar a interface. Esse potencial negativo é provavelmente decorrente

da ionização de grupos carboxílicos presentes no polímero os quais se dissociam no

meio dispersante e também dos fosfolipídios utilizados. Uma variação significativa

(P = 0,000) do potencial -26,7 para + 10,9 mV, foi observada quando 10 mg/mL de

Hf foram adicionados ao sistema. Esse fato pode ser explicado por uma provável

influência do fármaco sobre a carga elétrica superficial da partícula, sugerindo que uma

parte do fármaco carregado positivamente esteja adsorvido na superfície do vetor, visto

que o Hf base apresenta um grupo amino ionizável que tenderia a aumentar a

positividade da interface. Estudos anteriores demonstraram que o Hf interage

fortemente com fosfatidilcolina (Lim & Go, 1999) e que o fármaco apresenta uma clara

influência na superfície de carreadores que contém lecitina tais como nanocápsulas e

nanoemulsões (Mosqueira, 2000 a), sugerindo que o halofantrino interage com

fosfolipídios da lecitina e que, em altas concentrações, parte do fármaco se encontra na

interface com o meio externo. Do mesmo modo, Calvo et al. (1997) analisaram a

interação entre lisozima, uma enzima carregada positivamente, com dois diferentes

sistemas carreadores, nanocápsulas e nanoesferas. Os autores observaram uma redução

significativa dos valores do potencial das NCs, sugerindo que a enzima se associa

mais a sistemas que apresentem carga superficial mais negativa.

Os dados da tabela 2 permitem ainda sugerir que as preparações contendo Hf

mais favoráveis para utilização por via i.v. seriam NC-1 e NC-10, uma vez que

apresentam populações homogêneas e monodispersas com tamanho inferior a 500 nm.

Sabe-se que o tamanho e a carga superficial são importantes fatores que influenciam na

distribuição dos sistemas carreadores no organismo, quando administrado pela via i.v..

Partículas grandes são rapidamente reconhecidas pelas células do SFM, assim como



partículas carregadas positivamente tendem a se acumular principalmente nos pulmões e

no baço, enquanto partículas negativamente carregadas concentram-se mais no fígado e

no baço (Juliano, 1988).

Todas as formulações foram obtidas como suspensões coloidais e apresentaram

um aspecto leitoso característico das nanocápsulas como pode ser observado na

Figura 17. Essas preparações apresentaram boa estabilidade e nenhuma alteração

macroscópica foi observada durante o período de 3 meses, tais como cremagem,

sedimentação ou floculação. Entretanto, no presente trabalho, não foi realizado um

estudo detalhado da estabilidade das NCs, visto que as formulações foram utilizadas, in

vivo, logo após a preparação. Além disso, estudos anteriores utilizando NC de PLA

contendo Hf demonstraram que as mesmas são estáveis por um período de 8 meses

(Mosqueira, 2000 a).

FIGURA 17 – Nanocápsulas obtidas como suspensão coloidal de aspecto leitoso, pelo

método de nanoprecipitação. A) NCs sem fármaco, B) NC contendo 1 mg de

Hf/mL de suspensão coloidal e C) NC contendo 10 mg de Hf/mL de

suspensão coloidal.



2. ANÁLISE MORFOLÓGICA

A análise morfológica das NCs foi realizada por microscopia de força atômica

(MFA). Foram analisadas formulações de nanocápsulas não carregadas (brancas), NCs

contendo diferentes concentrações de Hf bem como os constituintes isolados e suas

combinações.

Diferentes amostras de NCs brancas foram analisadas em diferentes campos e

foi observado uma homogeneidade das mesmas em relação ao formato e estruturas,

apresentando partículas com estruturas esféricas e formato regular como pode ser

visualizado nas figuras 18 A e 18 B.

FIGURA 18 – Imagens de nanocápsulas não carregadas obtidas por MFA. Em A) vista do

topo e em B) visão tridimensional das partículas.

A

B



O diâmetro das NCs brancas obtido por MFA variou de 222 a 550 nm,

apresentando populações heterogêneas de partículas, enquanto, o diâmetro médio dessa

mesma amostra determinado por PCS foi de 245 nm (Tabela 2), podendo-se atribuir a

diferença entre as medidas à maneira em que as mesmas são efetuadas por MFA, ou a

uma possível agregação das NCs na superfície da mica ou ainda ao achatamento das

NCs quando depositadas sobre a superfície da mica. No entanto, resultados contrários

eram esperados, uma vez que a técnica de PCS mede o raio hidrodinâmico das

partículas, enquanto a MFA produz imagens de um sistema desidratado e também

afetadas pelo formato da sonda de varredura utilizada.

Em todos os experimentos realizados por MFA, a amostra foi submetida a um

processo de secagem com jato de argônio. Foi observado que, apesar do processo de

secagem manter a amostra recoberta com uma camada de água, a secagem levou a uma

alteração das “condições naturais” das partículas, resultando num possível fenômeno de

agregação ou ruptura. Essa hipótese foi formulada com base nas imagens topográficas

(Figura 19 A) e de fase (Figura 19 B) de formulações de NCs brancas apresentadas

abaixo. Nessas imagens é possível observar a presença de canalículos irregulares, com

altura em torno de 2 nm (indicadas em A pelas setas vermelhas), os quais parecem ser

responsáveis por um processo de fusão das partículas. É possível observar ainda a

presença de camadas finas e descontínuas de aproximadamente 6-8 nm de altura

(indicadas em B pelas setas em negrito), nas quais as NCs estão depositadas em todas as

imagens obtidas. Essas camadas provavelmente são formadas por excesso de tensioativo

não-iônico utilizado, Poloxamer 188.



FIGURA 19 – Imagem topográfica (A) e fase (B) obtidas por MFA e perfil topográfico (C) de

nanocápsulas brancas. Área: 2,7m x 2,7m. As setas em negrito mostram

camadas de poloxamer com altura entre 6 e 8 nm.

O poloxamer foi então analisado separadamente, e as imagens obtidas mostram

estruturas altamente organizadas com camadas entre 5 e 7 nm, ou seja, com altura

bastante semelhante à observada na figura anterior, as quais parecem diferir apenas

morfologicamente das anteriores, uma vez que essa estrutura é mais arredondada

(Figura 20).

A B

C

A B

C



FIGURA 20 – Imagem de altura (A) e fase (B) de poloxamer188 obtidas por MFA.

Área: 40 m x 40 m.

Estudos da relação diâmetro/altura dessas partículas foi realizado, demonstrando

uma relação de 10 ± 3,2 (Figura 21). Esses dados sugerem a existência de formas mais

achatadas ou partículas em forma de disco provavelmente devido a estrutura interna das

NCs ser preenchida de óleo envolvida por uma membrana polimérica flexível. Estudos

anteriores (Montasser et al., 2002) demostraram uma relação diâmetro/altura de 12 para

as nanocápsulas preparadas com um co-polímero, dicloroftaloil-co-dietilenotriamina,

estabilizado pelo poloxamer 188. Portanto, nossos dados estão em acordo com esses

autores e mostram que as NCs apresentam uma natureza diferente podendo se deformar

quando comparadas às nanoesferas cuja estrutura é bastante rígida (Leite et al., 2005).

As nanoesferas, como apresentado na figura 22, mostraram uma relação diâmetro/altura

próxima de 1. Esta capacidade de deformação é uma importante propriedade das NCs,

visto que um dos objetivos desses sistemas é transpor espaços intercelulares, in vivo,

como endotélio vascular descontínuo no corpo humano. Além disso, essa propriedade é

uma evidência física da presença de um núcleo oleoso fluido envolvido por uma

membrana. Recentemente, Rübe et al. (2005) evidenciaram a presença de núcleo oleoso

pela técnica de espalhamento de nêutron a baixo ângulo, indicando que a membrana

A

B



polimérica possui em torno de 17 nm de espessura, utilizando-se o PLA como polímero

e composição geral do sistema praticamente idêntica ao utilizado no presente trabalho.

FIGURA 21 – Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de nanocápsulas

brancas de PCL, apresentando a relação diâmetro/altura das partículas

(~10). Área: 2,5 m x 2,5m.

A

B

C

D



FIGURA 22 – Imagens topográficas (A e B) e perfis topográficos (C e D) de nanoesferas

brancas de PLA, apresentando a relação diâmetro/altura das partículas (~1).

Área: 2,5 m x 2,5m.

Como exemplo da associação dos constituintes das NCs foram analisadas

também "nanocápsulas sem membrana polimérica", denominadas nanoemulsões.

Nesses experimentos foi detectada grande dificuldade na obtenção das imagens, as quais

apresentaram-se normalmente muito ruidosas (Figura 23), sugerindo que o contato com

a sonda “arrasta” as nanoestruturas sobre a mica desencadeando um processo de fusão

com formação de grandes partículas. Essas análises sugerem que a parede polimérica

das NCs confere maior estabilidade ao sistema, possuindo portanto uma estrutura mais

rígida e estável, comparada à emulsão submicrométrica, e uma organização mais

flexível e permeável comparada às nanoesferas poliméricas.

A

B

C

D



FIGURA 23 – Imagens topográficas (A e B) de nanoemulsão obtidas em diferentes campos

por MFA. Área: 20 m x 20 m.

Podemos, então sugerir algumas hipóteses que possam estar contribuindo para o

fenômeno de aumento do diâmetro médio das NCs obtido pela técnica de MFA. O

primeiro, estaria relacionado com a desidratação das partículas durante o processo de

secagem, que induziria posteriormente à agregação das mesmas. É conhecido da

literatura que o processo de desidratação das NCs pela técnica de liofilização,

geralmente leva à ruptura da membrana polimérica das NCs (Chasteigner et al., 1995).

Esse fenômeno, portanto, pode estar também ocorrendo em amostras submetidas a

análise por MFA com maior nível de desidratação. Além disso, em função da espessura

e da continuidade da parede polimérica, as NCs podem apresentar maior ou menor

estabilidade quando depositadas sobre a superfície da mica, ou seja, diferente

capacidade de achatamento em função dessas variações apresentadas pela membrana. O

esquema abaixo (Figura 24) representa os possíveis fenômenos de achatamento, que

poderiam explicar o aumento do diâmetro observado por MFA em nanoemulsão,

nanocápsula e nanoesfera.

A BA B



FIGURA 24 – Esquema representativo dos possíveis fenômenos que contribuem para o

aumento do tamanho das partículas. A: nanoemulsão (NE) que equivalem a

NC “sem membrana polimérica. Essas partículas quando depositadas sobre

a superfície da mica tendem a se agregar. B: Nanocápsulas constituídas por

um núcleo oleoso envolvido por membrana polimérica com diferentes

espessuras. B 1: parede polimérica descontínua, o que faz com que as

estruturas se comportem como NE. B 2: parede polimérica contínua porém

de espessura fina. B 3: parede polimérica contínua com membrana espessa;

Nas três situações representadas para NC as partículas se deformam,

entretanto, B 2: tendem a se achatar mais se comparada a B 3. C: nanoesfera

com presença de matriz polimérica que confere às partículas maior rigidez,

ausência de deformação e relação diâmetro/altura próxima de 1.



Confirmada a presença de NCs nas preparações, uma fase posterior do estudo

consistiu na realização de experimentos que permitissem evidenciar diferenças entre o

núcleo oleoso e a parede polimérica. A figura 25 (1-4) mostra imagens topográficas (A)

e de contraste de fase (B) de nanocápsulas antes (1 e 3) e após serem submetidas à

pressão da sonda (2 e 4). As nanocápsulas foram analisadas em detalhes e foi observada

uma diferença marcante entre as duas regiões como pode ser visualizado nas figuras. As

nanocápsulas são normalmente estruturas muito estáveis quando submetidas à alta

pressão ou à variação da força de interação sonda-amostra (set point = 0). Nessas

situações, algumas partículas apenas se deformaram (Figura 25-2) curiosamente aquelas

que apresentaram parede polimérica mais espessa, enquanto outras, com parede mais

fina se romperam liberando o material oleoso para o meio externo (Figura 25-4).



1

2

3

4

FIGURA 25 - Imagens topográficas (A) e de contraste de fase (B) de nanocápsulas brancas

mostrando diferentes formas: antes (1 e 3) e após (2 e 4) variação da força de

interação sonda-amostra (set point = 0). Área: 1,5m x 1,5m.

A B



Experimentos realizados com nanocápsulas contendo halofantrino em diferentes

concentrações mostraram que a associação do fármaco não altera a estrutura

arredondada das partículas (Figura 26), entretanto, as amostras apresentaram populações

de partículas com maior polidispersidade se comparada às NC brancas. O diâmetro

médio obtido foi 475 ± 153 nm para as preparações contendo 0,1 mg de Hf e

309 ± 97 nm para as formulações contendo 1,0 mg de Hf/mL de suspensão coloidal. Foi

observado que quanto maior a concentração de halofantrino mais difícil se torna a

aquisição das imagens, as quais são geralmente mais ruidosas. Portanto, no presente

estudo, não foi possível obter imagens de NC contendo 5 ou 10 mg de Hf/mL de

suspensão.

FIGURA 26 - Imagem tridimensional de NC contendo 0,1 mg de Hf/mL de suspensão

coloidal.



De modo geral, as formulações de NC-Hf apresentaram grandes aglomerados,

porém não foi possível afirmar se tais estruturas já estavam presentes na amostra ou se

as mesmas foram decorrentes da possível agregação induzida pelo processo de secagem.

Além disso, pode-se dizer que a natureza fluida das nanocápsulas, responsável

por sua capacidade de deformação, não foi alterada pela presença do Hf, uma vez que

NC-Hf também se achatam quando depositadas sobre a superfície da mica apresentando

uma relação diâmetro/altura de aproximadamente 10. A maior diferença observada entre

NC-Hf e NC brancas foi a presença de um material ao redor das nanoestruturas,

formando camadas de aproximadamente 10 nm, o que poderia ser atribuído à formas

especiais de organização de Hf ou ao seu excesso na forma de estruturas amorfas

(Figuras 27 A e 27 B). Embora as camadas observadas ao redor das NC sejam

semelhantes àquelas formadas pelo poloxamer (6-8 nm de altura), pode-se sugerir que,

quando misturas complexas dos componentes da formulação (polímero, tensioativo,

fármaco, óleo, etc.) estão presentes, o fármaco pode se associar a elas formando

camadas com alturas variadas, o que torna a visualização ainda mais complexa. Essa

hipótese pode ser ainda suportada por algumas evidências de medidas potencial zeta

(Tabela 2) que sugerem uma provável associação do Hf à superfície de NC

( = +10,9 mV para 10,0 mg/mL) quando comparado com potencial zeta de NC branca

( = -26,7 mV), devido a contribuição de moléculas positivamente carregadas de Hf

base livre.



FIGURA 27 – Imagens de nanocápsulas contendo halofantrino 0,1 mg/mL (A) e 1,0 mg/mL

(B) mostrando a presença do material ao redor das partículas.

Área: 10 m x 10 m.

A

B

PARTE 2:

Avaliação da

Cardiotoxicidade

a curto prazo



1. DETERMINAÇÃO DA DOSE LETAL AGUDA (DL50)

Inicialmente, os experimentos in vivo realizados no presente estudo foram

conduzidos para a determinação da dose máxima tolerada (DMT) por via i.v. utilizando-

se doses iniciais de 100 mg/kg de Hf livre ou encapsulado. Estudos anteriores

demonstraram que a dose letal de Hf para 50% dos animais (DL50) administrada por via

oral e intraperitoneal foi respectivamente 3,40 e 2,05 g/kg para o modelo rato e 2,80 e

2,50 g/kg para o modelo murino (Karbwang & Bangchang, 1994). Brocks & Toni

(1999) avaliando a farmacocinética do Hf em ratos verificaram que a concentração

máxima do fármaco na corrente sanguínea, após a administração oral de 14,0 mg/kg, foi

1,420 g/mL (cerca de 0,03%). Mosqueira et al. (2004) avaliando o Hf na forma

vetorizada em modelo murino, observou um aumento da DMT de 30 para

100 mg/kg/dia quando o Hf se encontra na forma encapsulada.

Nesse estudo, durante o período experimental (24 h), os efeitos avaliados foram

grooming, ataxia, alterações da freqüência respiratória, tremores, alterações de postura e

locomoção, convulsão e morte (Tabela 3). O grupo de animais que recebeu por via i.v. a

solução de Hf.HCl apresentou alteração de freqüência respiratória, ataxia intensa com

dificuldade de locomoção e, nas doses superiores a 150 mg/kg/dia, convulsão e morte.

Entretanto, no grupo que recebeu NC-Hf foi observado apenas efeitos de grooming,

movimentos de coceira e tremores pouco intensos, mesmo para as doses mais altas

avaliadas (300 mg/kg), sugerindo uma redução dos efeitos tóxicos do Hf após

encapsulação. Para os animais que receberam NC e DMA/PEG foram observados

efeitos de grooming e tremores de curta duração logo após a aplicação i.v. das soluções,

em todos os volumes administrados, sugerindo que a ocorrência de tais efeitos, de

toxicidade pouco relevante, não se deve ao Hf, mas provavelmente aos veículos

utilizados. Como grupo controle absoluto do presente estudo, foram utilizados animais

submetidos às mesmas condições, que receberam volumes de solução salina 0,9%

equivalentes àqueles administrados para as soluções de Hf. Nenhuma alteração

comportamental ou morte foi observada nesses animais.



Tabela 3- Alterações comportamentais e morte observadas nos animais tratados com

as diferentes formulações de Halofantrino.

Dose

(mg/kg) Hf.HCl NC-Hf

100 1 (+), 2 (+), 3 (++), 4 (++), 5 (-), † (0/6) 1 (+), 2 (+), 3 (-), 4 (-), 5 (-), † (0/6)

150 1 (+), 2 (+), 3 (++), 4 (++), 5 (++), † (3/8) 1 (+), 2 (+), 3 (-), 4 (-), 5 (-), † (0/6)

200 1 (+), 2 (+), 3 (++), 4 (++), 5 (+++), † (8/8) 1 (+), 2 (+), 3 (+), 4 (-), 5 (-), † (0/8)

225 nd 1 (++), 2 (++), 3 (+), 4 (-), 5 (+), † (1/6)

250 nd 1 (+), 2 (++), 3 (+), 4 (+), 5 (++), † (5/8)

300 nd 1 (+), 2 (+), 3 (++), 4 (++), 5 (++), †(6/6)

1- grooming; 2- tremor/coceira; 3- freqüência respiratória; 4- ataxia; 5- convulsão; † morte; nd = não

determinado, (-) ausência de efeito; (+) efeito leve; (++) efeito moderado; (+++) efeito intenso.

No grupo de animais que recebeu Hf.HCl foi observado 100% de morte (DL100)

com a dose de 200 mg/kg e o tempo médio de morte observado foi de 30 min. A DL100

para o grupo de animais que recebeu NC-Hf foi de 300 mg/kg, com um tempo médio de

morte de 1 h e 30 min. Utilizando-se as doses administradas de Hf.HCl e de NC-Hf

(Tabela 3) versus o número de óbitos para cada dose foi construída a curva de DMT, a

partir da qual foi obtida a reta de regressão linear e a equação que permitiu calcular a

dose letal para 50% dos animais (Figura 28). A DL50 calculada para o grupo Hf.HCl foi

de 154,0 mg/kg e para o grupo NC-Hf foi de 249,0 mg/kg. Os resultados indicaram que

ocorre um aumento da taxa de mortalidade de maneira dose-dependente para todas as

formulações de Hf avaliadas. Entretanto, a encapsulação do Hf levou à redução da

toxicidade do fármaco in vivo, uma vez que a DL50 foi aumentada em mais de 60%.



FIGURA 28 – Dose letal aguda (DL50) determinada após administração i.v. de halofantrino

livre (Hf.HCl) e encapsulado (NC-Hf) em ratos Wistar machos (n = 6 ou 8

animais, conforme identificado na tabela 3).

2. AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE ATÉ 30 MINUTOS APÓS A

ADMINISTRAÇÃO DAS FORMULAÇÕES DE HALOFANTRINO

A primeira avaliação das alterações dos parâmetros cardiovasculares, indicativas

de cardiotoxicidade, foi realizada em animais anestesiados pelo tiopental sódico por um

período de 30 min após a administração i.v. do Hf em diferentes formulações. Os

parâmetros extraídos do traçado do ECG incluíram os intervalos QT, RR, PR, QRS e

foram analisados conforme apresentado na figura abaixo (Figura 29). Valores de

pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) também foram obtidos a partir do

sinal de PA.

y = 1,0417x - 209,04

R2 = 0,9665

y = x - 104,03

R2 = 0,9809

0

25

50

75

100

50 100 150 200 250 300

Dose (mg/kg)

Po

rcen

tag

em

de m

orte

em

24

ho

ra

s Hf-HCl

NC-Hf

y = 1,0417x - 209,04

R2 = 0,9665

y = x - 104,03

R2 = 0,9809

0

25

50

75

100

50 100 150 200 250 300

Dose (mg/kg)

Po

rcen

tag

em

de m

orte

em

24

ho

ra

s Hf-HCl

NC-Hf



FIGURA 29 – Traçado do ECG e PA de um rato Wistar, obtido durante o período controle,

apresentando os parâmetros analisados (QT, PR, RR, QRS, PAS e PAD).

O registro do ECG e PA, antes e após administração i.v. das formulações em um

animal representativo do grupo que recebeu 150 mg/kg de Hf livre e em um animal que

recebeu a mesma dose de Hf encapsulado está apresentado na figura 30 (A e B,

respectivamente). O fármaco livre induziu a alterações mais pronunciadas do ECG, com

bradicardia intensa, bem como alterações da PA quando comparado à mesma dose do

fármaco encapsulado. Os valores absolutos dos parâmetros analisados em todos os

tempos de observação de um animal representativo do grupo Hf.HCl submetido a

administração i.v. de 150 mg/kg do Hf, estão apresentados em anexo (no anexo I). Tais

análises foram realizadas para todos os animais de todos os grupos.



FIGURA 30 – Registro do ECG e da PA, de animais representativos dos grupos que

receberam 150 mg/kg de Hf.HCl (A) e NC-Hf (B), obtidos antes e após

administração do fármaco.

Hf.HCl

Antes Depois

NC-Hf

Antes Depois

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

60

120

180

Tempo (s)

PA

(m

mH

g)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

60

120

180

Tempo (s)

PA

(m

mH

g)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

60

120

180

Tempo (s)

PA

(m

mH

g)

0.0 0.2 0.4 0.6 0.80

60

120

180

Tempo (s)

PA

(m

mH

g)

A

B



Os resultados demonstraram que o Hf.HCl, administrado em ambas as doses

(100 e 150 mg/kg) induziu a alterações significativas dos parâmetros analisados

(Tabela 4). As respostas avaliadas estão apresentadas na Tabela 4 como a média dos

valores absolutos dos respectivos parâmetros analisados. Os intervalos QT e PR do

ECG e a freqüência cardíaca foram os parâmetros que sofreram maiores alterações

com a administração do Hf em diferentes formulações.



Tabela 4 – Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e


administração i.v. de halofantrino livre ou encapsulado.

100mg/kga

150mg/kgb

Parâmetros Tempo (min)

Hf.HCl NC-Hf Hf.HCl NC-Hf

Frequência Cardíaca (bpm)

0 5 15 25

376 14,7 258 18,3 210 21,1 204 17,7

359 21,2 312 19,1** 280 17,3** 261 16,2**

289 21,3 168 8,9 107 8,7 091 5,3

247 17,0 221 19,5** 194 24,7** 174 29,1**

PA Sistólica (mmHg)

0 5 15 25

116 4,8 072 3,4 081 3,2 085 2,5

122 7,5 094 5,8* 094 3,8* 095 4,0

124 8,8 069 5,5 068 6,2 073 6,1

130 11,9 113 15,0** 099 16,0* 098 17,7

PA Diastólica (mmHg)

0 5 15 25

082 3,5 027 2,4 038 3,3 043 1,9

083 4,8 050 4,0** 051 2,8* 053 3,4*

089 8,2 018 2,0 017 3,1 018 1,3

091 7,9 068 14,2**

061 13,8**

057 13,8*

QT (ms) 0 5 15 25

072 1,7 089 2,8 090 3,1 091 3,1

073 0,9 077 1,1** 079 1,0**

080 0,9**

082 4,4 114 7,8 122 8,7 122 14,2

070 2,7 074 3,6**

075 3,6** 075 3,9**

QTc (ms) 0 5 15 25

132 2,7 144 3,4 136 3,4 135 2,6

133 2,3 134 2,8** 134 3,5 131 3,0

148 6.6 171 9.3 158 9.0 159 10.4

127 3.7 130 5.2 124 4.8 119 5.3

PR (ms) 0 5 15 25

052 2,1 072 4,3 074 4,6 074 5,5

053 3,1 060 2,7**

063 1,8** 067 4,2**

058 3,0 081 7,9 097 12,2 114 19,2

051 3,0 058 3,9** 061 4,6** 063 5,5**

QRS (ms) 0

5 15 25

030 1,1 038 1,8 036 1,2 034 1,1

028 1,8 028 1,1** 030 1,3** 030 1,2**

027 1,2 037 1,6 035 2,1 033 13,0

023 1,1 025 1,1**

025 1,1* 025 1,0**

Os valores representam a média + erro padrão da média. a (n=6) e b (n=8) indicam o número de

animais viáveis nos diferentes grupos. * e ** indicam diferenças significativas P < 0,05 e P < 0,001,

respectivamente, entre grupos de Hf livre e encapsulado nas mesmas doses.



Os dados apresentados na figura 31 A mostram que ambas as doses de Hf.HCl

administradas induziram a aumentos imediatos e significativos do intervalo QT em

relação ao período controle, com alteração máxima de 28%, 10 min após injeção, para a

dose de 100 mg/kg, e de 54%, 30 min após a administração da dose de 150 mg/kg. No

entanto, nos animais que receberam NC-Hf, a alteração máxima observada para o

intervalo QT foi da ordem de 9% em ambas as doses administradas. Não foi observada

alteração significativa do intervalo QT nos grupos controle (NC branca e DMA/PEG)

após a administração, durante os 30 minutos analisados. Diante disso, pode-se dizer que

o Hf.HCl livre induziu ao prolongamento dose-dependente do intervalo QT, nas doses

estudadas, sendo observados aumentos crescentes durante o período analisado para

ambas as doses (100 e 150 mg/kg). Entretanto, este prolongamento foi

significativamente (P < 0,002) reduzido quando o Hf foi administrado como NC-Hf,

observando-se 77% e 86% de proteção cardíaca, avaliada por variação do interalo QT,

5 min após a administração do fármaco encapsulado nas doses de 100 e 150 mg/kg,

respectivamente. Dessa forma, os resultados sugerem que quanto maior a dose utilizada

maior a proteção conferida pela encapsulação. A administração de NC-Hf além de

alterar significativamente o perfil de resposta comparado ao fármaco livre, não induziu

ao prolongamento do intervalo QT de maneira dose-dependente, para as doses

estudadas. (Figura 31 A e Tabela 4).



FIGURA 31 - Cinética de variação do intervalo QT (A) do ECG e do QT corrigido pelo

intervalo RR (QTc) (B) de ratos Wistar machos anestesiados com tiopental

sódico, após administração i.v. Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 (n = 6) e

150 mg/kg (n = 8) e dos veículos (NC branca e DMA/PEG; n = 6) em volumes

correspondentes à dose de 150 mg/kg.

-15

-5

5

15

25

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

çã

o d

o Q

Tc (

%)

Hf-HCl (100mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60

NC-Hf (100mg/kg) NC-Hf (150 mg/kg) NC branca

-20

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

do

In

terv

alo

QT

(%

) .

A

B

-15

-5

5

15

25

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

çã

o d

o Q

Tc (

%)

Hf-HCl (100mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60

NC-Hf (100mg/kg) NC-Hf (150 mg/kg) NC branca

-20

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

do

In

terv

alo

QT

(%

) .

A

B



Estudos anteriores utilizando outros modelos animais, como cobaias e coelhos,

demonstraram claramente a capacidade do Hf em induzir ao prolongamento do intervalo

QT in vivo em animais anestesiados e in vitro em coração isolado de cobaia (Batey et

al., 1997). Embora o modelo rato já tenha sido utilizado para estudos da toxicidade

geral e dos parâmetros farmacocinéticos do Hf (Karbwang & Bangchang, 1994; Brocks

& Toni, 1999; Brocks et al., 2000), a avaliação específica das alterações do intervalo

QT do ECG induzido por esse fármaco neste mesmo modelo foi apresentado pela

primeira vez no presente trabalho.

O intervalo QT do ECG é um índice bastante utilizado em clínica e representa o

tempo necessário para a despolarização e repolarização dos ventrículos. Seu

prolongamento é considerado um fator predisponente para a ocorrência de arritmias

cardíacas associadas ao risco de morte súbita (Tan et al., 1995). Desde 1993, vários

estudos têm demonstrado alterações eletrocardiográficas e arritmias ventriculares

severas em pacientes tratados com Hf (Nosten et al., 1993, Krishna et al., 1993; Matson

et al., 1996; Olivier et al., 1999; Abernethy et al., 2001; Bindschedler, et al., 2002).

Recentemente, estudos realizados em miócitos ventriculares isolados de felinos

demonstraram que o mecanismo de cardiotoxicidade do Hf é baseado na inibição dos

canais de potássio, responsáveis pelo processo de repolarização ventricular.

Provavelmente, o Hf retarda a ativação dos canais rápidos de K+ (IKr) (Wesche et al.,

2000), induzindo à arritmias ventriculares e ao prolongamento do intervalo QT. Tie et

al. (2000) também observaram que o Hf bloqueia um canal correspondente aos canais

rápidos dos felinos, os canais de K+ do tipo HERG, expresso em células de ovário de

hamster.

No presente estudo, entretanto, o principal objetivo foi estudar os efeitos

farmacológicos do Hf após encapsulação em nanocápsulas sobre o coração em geral,

presumindo-se que o mecanismo de cardiotoxicidade não tenha sido alterado, uma vez

que a molécula do Hf não foi alterada, mas apenas o perfil de distribuição do Hf tenha

sido modificado pela encapsulação. Os resultados aqui apresentados demonstraram

claramente os efeitos de Hf livre comparado ao NC-Hf em ratos, observando-se uma

redução significativa das alterações dos parâmetros do ECG, indicativos de

cardiotoxicidade, com o uso da formulação encapsulada dentro do período de

observação de 30 minutos.



Segundo Jayasinghe & Kovoor (2002) vários fatores podem influenciar o

intervalo QT tais como o sexo, a idade, a freqüência cardíaca, a atividade simpática e a

derivação do ECG avaliada. No entanto, a fim de minimizar tais influências, em todos

os experimentos foram utilizados animais do sexo masculino, com idade entre 12 e 16

semanas, peso médio de 250 g e, todos os registros foram obtidos na derivação DII.

Comumente, é necessário corrigir o efeito da freqüência cardíaca para possibilitar uma

comparação desse parâmetro entre ciclos cardíacos com valores de RR diferentes. Para

isso, têm sido utilizadas equações matemáticas que permitam corrigir o intervalo QT.

Segundo Abernethy et al. (2001), o QT pode ser corrigido pela fórmula de Fridericia

(QTc = QT/RR1/3

) para RR<500 ms ou pela fórmula de Bazzett (QTc = QT/RR1/2

) para

RR>500 ms. Touze et al. (2002) afirmaram que embora a fórmula de Bazzett seja

comumente utilizada, o intervalo QT pode ser superestimado ou subestimado em ciclos

cardíacos curtos e longos, respectivamente. Portanto, como no presente trabalho, sempre

foram encontrados valores de RR menores que 500 ms utilizou-se a fórmula de

Fridericia para correção do intervalo QT.

A análise dos dados corrigidos pela fórmula de Fridericia (QTc) mostrou que o

Hf livre administrado na dose de 100 mg/kg induziu a alterações do QTc

estatisticamente significativas (P < 0,05) de 0,5 a 2 min e de 4 a 15 min após injeção,

quando comparada à mesma dose de NC-Hf (Figura 31 B). O NC-Hf não induziu a

nenhuma alteração do QTc durante os 30 min experimentais, quando comparada à

formulação controle. As alterações observadas no grupo de animais que recebeu o

fármaco livre se devem, provavelmente, à acentuada bradicardia induzida por altas

doses do Hf. O efeito de bradicardia foi anteriormente relatado em pacientes com

malária que receberam Hf por via parenteral por Krishna et al. (1993).

Em relação ao intervalo PR, parâmetro que representa o tempo necessário para a

despolarização atrial e a condução do impulso através do nódulo atrioventricular, foi

observado que o Hf.HCl induziu a alterações semelhantes às verificadas para o intervalo

QT. A análise demonstrou uma variação máxima do intervalo PR, em relação ao

período controle, de 38% em 30 min e 87% em 25 min após a administração de

100 mg/kg e de 150 mg/kg Hf.HCl, respectivamente. No grupo de animais que recebeu

NC-Hf foi observada uma redução significativa (P < 0,05) das alterações do intervalo

PR, sendo da ordem de 23% e 21%, para as doses de 100 mg/kg e 150 mg/kg,



respectivamente, ambos verificados 25 minutos após a administração do fármaco. O

grupo de animais que recebeu o fármaco encapsulado não apresentou diferença

significativa em relação ao grupo controle, cujas alterações observadas também foram

da ordem de 9% (Figura 32 A). Os resultados demonstraram que, em relação ao PR, a

proteção cardíaca conferida, 5 min após a administração de 100 e 150 mg/kg de NC-Hf

foi de 67% e 71%, respectivamente.

Batey et al. (1997) avaliando os efeitos do Hf em cobaias observou variações do

intervalo PR, 2 horas após a administração de 30 mg/kg, sugerindo bloqueio de canais

de Ca2+

. Entretanto, em um estudo realizado em coelhos com o objetivo de avaliar a

atividade pro-arrítmica do Hf, Batey & Coker (2002) não encontraram alterações

significativas do intervalo PR quando esse fármaco foi administrado nas doses de 6 a

60 mol/kg. Krishna et al. (1993), em estudo clínico de uma formulação parenteral de

Hf também não observou alterações significativas do intervalo PR do ECG. Contudo, os

resultados do presente estudo demonstraram aumentos significativos do intervalo PR

imediatamente após a administração do fármaco livre quando comparado ao veículo.

Provavelmente, esse efeito observado em nossos experimentos é decorrente das altas

doses utilizadas, muito próximas às doses letais, as quais objetivaram uma melhor

visualização dos efeitos tóxicos do fármaco e sua possível redução após associá-lo a

carreadores coloidais como as nanocápsulas.

À análise do complexo QRS, representado na figura 32 B, foi verificado um

aumento desse intervalo, imediatamente após injeção, com um pico de variação máxima

de 29% em 7 min e de 43% em 6 min nos animais submetidos à administração de

100 mg/kg e 150 mg/kg de Hf.HCl, respectivamente. Já nos animais submetidos à

administração de NC-Hf esse aumento foi significativamente diferente (P < 0,001) com

um pico de variação máxima de 10% em 30 min e de 8% em 15 min após a

administração de 100 mg/kg e 150 mg/kg, respectivamente. Não houve diferença

significativa do complexo QRS após administração de NC contendo Hf comparada com

ao grupo controle. Entretanto, o QRS do grupo que recebeu Hf.HCl quando comparado

ao veículo DMA/PEG foi significativamente diferente, sugerindo, portanto, que o

prolongamento do QRS é conseqüência do Hf e não dos solventes utilizados.



Segundo Batey & Coker (2002) aumentos significativos nos intervalos PR e

QRS podem sugerir redução das correntes de Na+ e Ca

2+ através dos respectivos canais

iônicos. Pode-se inferir, portanto, que o Hf, administrado em altas doses também

induziu ao bloqueio de tais canais em ratos, uma vez que as alterações dos parâmetros

acima mencionados foram significativas.

FIGURA 32 - Cinética de variação do intervalo PR (A) e do complexo QRS (B) de ratos

Wistar machos anestesiados com tiopental sódico, após administração i.v.

Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 (n = 6) e 150 mg/kg (n = 8) e dos veículos

(NC branca e DMA/PEG; n = 6) em volumes correspondentes à dose de

150 mg/kg.

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Varia

ção d

o I

nte

rvalo

PR

(%

) .

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

çã

o d

o I

nte

rv

alo

QR

S (

%)

Hf-HCl (100 mg/kg) Hf-HCl (150 mg/kg) DMA/PEG 40:60

NC-Hf (100 mg/kg) NC-Hf (150mg/kg) NC branca

A

B

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Varia

ção d

o I

nte

rvalo

PR

(%

) .

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

çã

o d

o I

nte

rv

alo

QR

S (

%)



A

B



As duas doses de Hf livre utilizadas, induziram à redução marcante, imediata e

significativa da pressão arterial (PAS e PAD) em relação ao grupo controle, sendo

menor a redução observada com 100 mg/kg (Figura 33 A e B). Os níveis pressóricos

atingidos se mantiveram reduzidos, observando-se ligeira recuperação após 10 min,

entretanto sem a completa recuperação aos níveis basais até 30 min de observação. Não

foi observada diferença significativa desses parâmetros entre os grupos que receberam o

fármaco livre nas doses de 100 e 150 mg/kg. A administração de NC-Hf também

induziu à redução da PAS e da PAD, entretanto a redução ocorreu gradualmente,

mantendo níveis pressóricos compatíveis com a sobrevivência do animal. Ao analisar os

grupos de animais que receberam 100 mg/kg de Hf.HCl ou 100 mg/kg de NC-Hf pôde-

se observar uma alteração significativa (P < 0,01) da PAS até 8 min após a

administração do fármaco, enquanto que para a PAD houve diferença significativa até

25 min após a administração. Já os grupos que receberam 150 mg/kg de Hf.HCl ou NC-

Hf pôde-se verificar que os valores de PAS mostraram-se significativamente diferentes

até 15 min após a administração, enquanto para a PAD essa diferença (P < 0,001) se

manteve até os 30 min após injeção. A proteção conferida pela encapsulação, 5 min

após a administração de 100 e 150 mg/kg, foi cerca de 40% e 70% para a PAS e de 41%

e 68% para a PAD.

Em relação à FC, o perfil apresentado na figura 32 C demonstra que todas as

formulações de Hf induziram à bradicardia significativa, sendo essa mais intensa para o

grupo que recebeu o fármaco livre na dose de 150 mg/kg. A redução da FC foi

progressiva ao longo do período experimental de 30 min, sem retornar aos valores

basais. Comparando os grupos que receberam a mesma dose de diferentes formulações

foi observada diferença significativa (P < 0,01) em todos os pontos analisados e a

proteção conferida pelas nanocápsulas em relação à FC foi de 58% e 75% para as doses

de 100 e 150 mg/kg, respectivamente.

Nossos resultados estão em acordo com Batey et al. (1997) que também

demonstraram o aparecimento de uma bradicardia progressiva, entretanto

diferentemente dos nossos dados, tais autores não observaram nenhuma alteração na

pressão arterial sistólica e diastólica. Uma resposta diferente em relação à FC era

esperada em nossos experimentos, uma vez que a queda da pressão arterial induziria à

taquicardia reflexa, pelo menos num primeiro momento, e não bradicardia como foi



observado ao longo dos 30 min de experimentação. Esse efeito é provavelmente

causado pela toxicidade do Hf ao nível do nódulo sinoatrial, a qual pode ser reforçada

pelo efeito observado no intervalo PR. Pode-se sugerir, portanto, que essa toxicidade

esteja mascarando o efeito reflexo de taquicardia. Além disso, cabe ressaltar ainda que o

presente estudo foi conduzido utilizando-se altas doses do fármaco e sendo o Hf, um

fármaco altamente lipofílico, poderíamos supor que estaria atuando tanto no controle

periférico como ao nível central do controle da PA. Dessa forma a hipotensão e a

bradicardia observadas podem estar relacionadas às altas doses de Hf administradas.



FIGURA 33 - Cinética de variação da pressão arterial sistólica (A) e diastólica (B) e da

freqüência cardíaca (C) de ratos Wistar machos anestesiados com tiopental

sódico, após administração i.v. Hf.HCl e NC-Hf nas doses de 100 (n = 6) e

150 mg/kg (n = 8) e dos veículos (NC branca e DMA/PEG; n = 6) em volumes

correspondentes à dose de 150 mg/kg.

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

çã

o P

AD

(%

)

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

0 5 10 15 20 25 30 35Tempo (min)

Varia

ção d

a F

req

uên

cia

Card

íaca

(%)



-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Varia

ção d

a P

AS

(%

)

A

B

C

-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

çã

o P

AD

(%

)

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

0 5 10 15 20 25 30 35Tempo (min)

Varia

ção d

a F

req

uên

cia

Card

íaca

(%)



-100

-80

-60

-40

-20

0

20

40

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Varia

ção d

a P

AS

(%

)

A

B

C



As alterações máximas de todos os parâmetros avaliados, induzidas pelo Hf

livre ou encapsulado, durante os 30 min de avaliação, estão representadas na figura 34.

FIGURA 34 - Comparação da porcentagem de variação máxima dos intervalos QT, PR, QRS

e QTc (A), PAS, PAD e FC (B) até 30 min após a administração de 100 ou

150 mg/kg de halofantrino livre e encapsulado, em ratos Wistar machos

anestesiados com tiopental sódico.

-20

0

20

40

60

80

100

QT PR QRS QTc

% V

aria

ção

-100

-80

-60

-40

-20

0

PAS PAD FC

% V

ari

açã

o

Hf.HCl 100mg/kg NC-Hf 100mg/kg

Hf.HCl 150mg/kg NC-Hf 150mg/kg

A

B



PARTE 3:

Avaliação da

Cardiotoxicidade

a longo prazo



1. AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE A LONGO PRAZO

Posteriormente à avaliação da cardiotoxicidade em 30 min após a administração

de Hf, conforme apresentado no capítulo anterior, foram realizados experimentos com o

objetivo de avaliar se as alterações cardiovasculares observadas para o Hf livre neste

período, seriam observadas num tempo superior a 30 min após a administração do

fármaco encapsulado, ou seja, se a encapsulação continuaria conferindo a mesma

proteção cardiovascular observada durante 30 min, mesmo porque o Hf é um fármaco

que apresenta um tempo de meia vida longo.

Para isso, os experimentos foram conduzidos em diferentes grupos

experimentais, sob anestesia pelo éter etílico. Os sinais do ECG e PA foram obtidos em

grupos de animais e em tempos distintos, a saber, 30 min, 1, 2, 4, 8, 24 e 48 horas, além

da obtenção dos mesmos sinais antes da administração da NC-Hf para todos os animais

(período controle). A análise em 30 min após a administração foi realizada novamente

com o objetivo de verificar a homogeneidade dos resultados obtidos entre os animais

que receberam diferentes anestésicos, ou seja, éter etílico ou tiopental sódico. A

comparação entre os grupos de animais que receberam 150 mg/kg de NC-Hf sob o

efeito dos diferentes anestésicos está apresentada na tabela 5.

Tabela 5: Variação percentual dos parâmetros do ECG e PA 30 min após a

administração de NC-Hf (150 mg/kg) em animais anestesiados pelo tiopental

sódico ou pelo éter etílico

% Variação

Parâmetros Tiopental sódicoa

Éter etílicob

Valor de P

QT 9,3 2,4 13,1 1,6 0,322

PR 21,1 5,9 -0,3 1,2 0,038*

QRS 9,8 1,6 18,7 5,8 0,095

QTc -6,6 4,0 -1,3 2,9 0,227

FC -40,9 7,5 -27,9 4,8 0,294

PAS -28,3 6,1 -9,9 5,6 0,150

PAD -46,4 9,0 -14,3 0,4 0,009*

Os dados estão apresentados como a média erro padrão da média. a n=8 e

b n=4. * indica

diferença significativa entre os grupos (t Student).



Os resultados demonstraram que as alterações dos parâmetros cardiovasculares

analisadas frente aos diferentes anestésicos utilizados não foram significativamente

diferentes, exceto para o intervalo PR e PAD. Considerando que o intervalo PR

representa a despolarização atrial, podemos supor que o tiopental sódico, fármaco

barbitúrico e que induz à depressão geral do sistema nervoso central (Goodman &

Gilman, 2001), induziu, quando associado ao halofantrino à depressão da atividade

marcapasso cardíaca, o que não foi observado com o éter etílico.

Tal resultado, no entanto, não compromete os resultados descritos no capítulo

anterior, visto que foram observadas diferenças significativas entre as respostas

induzidas pelas diferentes formulações de Hf administradas (Hf.HCl e NC-Hf). Além

disso, as variações dos parâmetros foram calculadas para cada animal com relação ao

período antes e após administração do fármaco, período no qual os animais se

encontravam sob a mesma anestesia. Sendo assim a influência do anestésico no cálculo

da variação pode ser excluída. Para os outros parâmetros avaliados, os resultados

apresentados na tabela acima se mostraram estatisticamente equivalentes entre os dois

grupos. Deste modo, consideramos que não houve influência do anestésico nos

resultados analisados a curto prazo e a longo prazo. Assim sendo, seguiu-se a avaliação

dos demais tempos após a administração, sob a anestesia pelo éter etílico, pois desta

maneira, foram conduzidos os experimentos sem que fosse necessário a traqueostomia

dos animais e utilizando-se da anestesia apenas nos momentos de cirurgia e de registro,

ou seja, com menor tempo de ação do anestésico. A literatura sobre os efeitos do éter

etílico é muito escassa e sua utilização é geralmente restrita à eutanásia de animais em

decorrência de ser um produto inflamável (Hedenqvist & Hellebrekers, 2003)

As respostas dos parâmetros nos diferentes grupos estão apresentadas abaixo em

valores absolutos (Tabela 6). O intervalo QT e a freqüência cardíaca foram os

parâmetros que apresentaram maiores variações no período de 48 horas.



Tabela 6 - Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e parâmetros eletrocardiográficos

avaliados, em diferentes tempos, antes e após a administração i.v. de150 mg/kg de halofantrino encapsulado.

Tempo

(horas)

QT

(ms)

PR

(ms)

QRS

(ms)

QTc

(ms)

FC

(bpm)

PAS

(mmHg)

PAD

(mmHg)

0,5 A 80 3 60 4 40 1 143 5 343 9 126 8 84 4

B 91 3* 57 3 43 2 145 1 247 17* 114 14 72 3

1 A 80 3 60 4 40 1 143 5 343 9* 126 8 84 4

B 106 2*** 60 4 45 2* 164 6 221 28* 96 11 63 6

2 A 76 3 54 1 33 2 143 5 408 7 125 3 85 2

B 120 11* 65 2*** 39 1*** 189 18* 233 8* 109 5 68 5***

4 A 88 7 59 2 34 1 156 12 341 11 119 5 82 2

B 109 8 65 3 37 2 173 12 241 6*** 115 2 79 7

8 A 75 3 59 2 34 1 139 4 386 15 122 4 82 3

B 86 2** 54 1 34 1 156 3* 363 13 130 4 95 3*

24 A 87 7 57 1 34 1 160 10 377 18 129 4 88 4

B 110 5* 57 2 43 2 193 6 324 17 115 3 75 3

48 A 82 3 59 1 35 1*** 150 5* 370 15* 123 4* 85 4*

B 93 5 54 1* 48 4** 171 7* 387 20 117 5 78 5

Os valores estão apresentados como a média erro padrão. * (P < 0,05), ** (P < 0,01) e ***(P < 0,001) indicam diferença significativa dos valores

absolutos entre o período controle e o tempo analisado. A e B representam período controle e tempo após administração do fármaco respectivamente.



O intervalo QT apresentou aumento significativo em relação ao período controle

(P < 0,05) nos tempos 30 min, 1, 2, 8 e 24 horas após a administração de 150 mg/kg de

NC-Hf (Tabela 6). O aumento observado em 4 e em 48 horas após a administração não

foi significativo, produzindo um perfil de resposta em duas fases, como pode ser

visualizado mais claramente no gráfico da variação percentual do prolongamento do

intervalo QT (Figura 35). A variação máxima observada inicialmente foi de 58%,

2 horas após a administração, enquanto na segunda fase de aumento significativo esta

foi de 28% em 24 horas. Entretanto, como apresentado na parte 2 de resultados e

discussão, a alteração máxima induzida em 30 min após a administração de Hf.HCl na

dose de 150 mg/kg foi de 54%. Os resultados demonstraram que mesmo após 2 horas,

quando foi o observado o maior aumento do intervalo QT para a administração das

NC-Hf, esse foi equivalente àquele induzido pelo fármaco livre. Os dados

demonstraram ainda que a toxicidade geral induzida pelo Hf encapsulado foi menos

pronunciada, uma vez que os animais se mantiveram vivos durante todo o período de

avaliação (48 horas), ao contrário do observado para o fármaco livre que provocou

morte em 83% dos animais até 30 min após a sua administração.

FIGURA 35 – Cinética de variação do intervalo QT de ratos Wistar machos anestesiados

pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg

de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min até 48h e B em minutos até 30 minutos.

0

20

40

60

80

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Va

ria

ção

do

In

terv

alo

QT

(%

)

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

do

In

terv

alo

QT

(%

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48

NC-Hf (150mg/kg) Hf.HCl (150mg/kg)

0

20

40

60

80

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Va

ria

ção

do

In

terv

alo

QT

(%

)

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

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ção

do

In

terv

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QT

(%

)

0

20

40

60

80

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Va

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ção

do

In

terv

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QT

(%

)

0

20

40

60

80

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

do

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QT

(%

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


A B

A B



Resposta semelhante àquela observada para o intervalo QT foi também

verificada para o QTc, o qual apresentou aumento significativo em relação ao período

controle (P < 0,05) nos tempos 2, 8, 24 e 48 horas após a administração de NC-Hf na

dose de 150 mg/kg (Tabela 6). Entretanto, o aumento observado 4 horas após a

administração não foi significativo, produzindo, de maneira semelhante ao intervalo

QT, um perfil de resposta em duas fases, como apresentado na figura 36. O aumento

máximo do QTc induzido pelo Hf encapsulado foi superior àquele induzido pelo

fármaco livre (17%) 7 min após a administração nos animais anestesiados pelo tiopental

(dados apresentados em resultados e discussão, parte 2). Provavelmente, essa maior

variação em relação ao fármaco livre possa ser explicada pela menor bradicardia

induzida pelas NC-Hf. Sabe-se que o índice de Fridericia é inversamente proporcional

ao intervalo RR1/3

, portanto, quanto menor o intervalo RR, maior a variação do QTc. Os

resultados sugerem ainda que as alterações observadas no intervalo QT e QTc a longo

prazo, após administração do Hf encapsulado, são decorrentes da modificação

verificada no perfil de distribuição do fármaco após a encapsulação, uma vez que,

trabalhos anteriores demonstraram que as NC aumentam o tempo de residência do Hf

no compartimento sanguíneo (Mosqueira et al., 2004).

FIGURA 36 – Cinética de variação do intervalo QT corrigido pelo intervalo RR (QTc) de

ratos Wistar machos anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de

150 mg/kg de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min

até 48h e B em minutos até 30 minutos.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


0

20

40

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0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Va

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çã

o d

o Q

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%)

-5

5

15

25

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

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ção

do

QT

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)

0

5

10

15

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35

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45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


0

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0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Va

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o d

o Q

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%)

-5

5

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Tempo (min)

Va

ria

ção

do

QT

c (%

)

0

20

40

60

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Va

ria

çã

o d

o Q

Tc (

%)

-5

5

15

25

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

do

QT

c (%

)

A B



Em relação ao intervalo PR, aumentos significativos em relação ao período

controle foram observados nos tempos 2 e 48 horas (Tabela 6). Como observado na

figura 37, o perfil da curva é bastante semelhante aos anteriores (Figuras 35 e 36),

demonstrando uma resposta em duas fases. A variação máxima verificada inicialmente

foi de 20%, no tempo de 2 horas após a administração. Os resultados demonstraram que

para o intervalo PR, a alteração máxima obtida após a administração do fármaco

encapsulado foi inferior àquela induzida pelo fármaco livre, cuja variação máxima foi

de 86% em 25 min após a administração (dados apresentados em resultados e discussão,

parte 2).

FIGURA 37 – Cinética de variação do intervalo PR de ratos Wistar machos anestesiados



0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Vari

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o d

o I

nte

rvalo

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(%

) .

0

20

40

60

80

100

120

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

do

In

terv

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PR

(%

) .

0

5

10

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25

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35

40

45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Vari

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o d

o I

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PR

(%

) .

0

20

40

60

80

100

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0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

do

In

terv

alo

PR

(%

) .A

B



Por outro lado, o intervalo QRS apresentou aumento significativo (P < 0,05) em

relação ao período controle nos tempos 1, 2, 24 e 48 horas, conforme apresentado na

tabela 6. As alterações verificadas nos tempos 4 e 8 horas não foram diferentes em

relação ao período controle. A figura 38 mostra a variação do intervalo QRS durante o

período experimental, podendo ser visualizado inicialmente uma alteração máxima de

20%, 2 horas após a administração e uma segunda fase de aumento significativo, em

24 horas, com uma variação máxima de 26%, atingindo 30% de variação 48 horas após

a administração. Apesar dos aumentos observados para o intervalo QRS, eles também

foram menores quando comparados à alteração de 43% induzida pelo fármaco livre

6 min após sua administração (dados apresentados em resultados e discussão, parte 2).

FIGURA 38 – Cinética de variação do intervalo QRS de ratos Wistar machos anestesiados



0

5

10

15

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25

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-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


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0 5 10 15 20 25 30 35

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0

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Tempo (horas)

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.

0

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50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


0

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0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

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%)

0

15

30

45

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0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Va

ria

ção

do

In

terv

alo

QR

S (

%)

.

A B



Em relação à pressão arterial, foi observada hipotensão inicial, entretanto,

diferenças significativas em relação ao período controle foram verificadas em 2, 8 e

24 horas para a PAD e apenas em 24 horas para PAS. A variação máxima observada foi

de 24% para PAS e 26% para PAD, 1 hora após a administração de 150 mg/kg de NC-

Hf (Figura 39 A e B). Imediatamente após, foi observado aumento gradual e, em 4

horas, os valores pressóricos já tinham se aproximado àqueles observado no período

controle, com variação da PAD de apenas 3%. Os resultados demonstraram que, mesmo

após 1 hora, tempo em que foi observada a alteração máxima, a hipotensão induzida

pelo fármaco encapsulado foi menor que àquela observada para o fármaco livre, cujo

máximo de alteração para PAS foi de 47%, imediatamente após a administração e de

83% para PAD, aproximadamente 12 min após a administração do fármaco (dados

apresentados em resultados e discussão, parte 2). Foi observado ainda que, 24 horas

após a administração de 150 mg/kg de NC-Hf ocorreu uma segunda fase de redução

significativa da PA com alteração de 10 % para PAS e de 15 % para PAD.



FIGURA 39 – Cinética de variação da pressão arterial sistólica (I) e diastólica (II) de ratos

Wistar machos anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg

de NC-Hf (A), ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min até 48h e B

em minutos até 30 minutos.

-30

-15

0

15

30

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Vari

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o d

a P

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.

-100

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Tempo (min)

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Tempo (horas)

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.

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Tempo (min)

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Tempo (horas)

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.

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Tempo (min)

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-30

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15

30

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Var

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(%

)

.

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0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

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D (

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0

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10

15

20

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30

35

40

45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


I

II

A B



Na análise da FC foi observado bradicardia intensa e significativa em relação ao

período controle nos tempos de 30 min, 1, 2, 4, 24 e 48 horas (Tabela 6). O aumento

observado em 8 horas após a administração de NC-Hf não apresentou diferença

significativa e, um perfil de resposta em duas fases foi novamente observado

(Figura 40). Assim, a alteração máxima inicial foi de -43% em 2 horas após a

administração do fármaco, enquanto na segunda fase, redução significativa de 14% foi

observada. A alteração máxima induzida pelo Hf.HCl foi de 66%, 30 min após a

administração de 150 mg/kg do fármaco (dados apresentados em resultados e discussão,

parte 2), demonstrando que mesmo 2 horas após a administração de NC-Hf, tempo em

que foi verificado o maior aumento da FC, esse foi inferior ao induzido pelo fármaco

livre.

FIGURA 40 – Cinética de variação da freqüência cardíaca de ratos Wistar machos

anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de 150 mg/kg de NC-Hf (A),

ou 150 mg/kg de Hf.HCl (B). A em horas de 30 min até 48h e B em minutos

até 30 minutos.

-50

-25

0

25

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Vari

açã

o d

a F

C (

%)

.

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

da

FC

(%

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


-50

-25

0

25

0 8 16 24 32 40 48

Tempo (horas)

Vari

açã

o d

a F

C (

%)

.

-70

-60

-50

-40

-30

-20

-10

0

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (min)

Va

ria

ção

da

FC

(%

)

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

-4 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48


A

B



Apesar de ter sido verificado aumentos equivalentes para o intervalo QT e QTc

quando o Hf foi administrado como NC-Hf na dose de 150 mg/kg comparado à mesma

dose do fármaco livre até 30 min, foi observado que a alteração máxima ocorreu

somente 2 horas após a administração. No entanto, a toxicidade induzida foi menos

acentuada com o uso das nanocápsulas, uma vez que todos os animais sobreviveram

durante as 48 horas de avaliação, enquanto, os animais que receberam o fármaco livre

morreram durante os 30 min experimentais. Provavelmente, altas doses de Hf como

foram utilizadas no presente estudo, induziram ao bloqueio imediato dos canais de

potássio, o que poderia explicar a variação do intervalo QT. Porém, quando o fármaco é

administrado na forma encapsulada, uma pequena fração se encontra livre na corrente

sanguínea e disponível para associação imediata ao tecido cardíaco. Apenas 2 horas

após, uma maior parte do fármaco é liberada tornando-se disponível para essa

associação, o que resultaria no efeito de prolongamento do QT. Em relação aos outros

parâmetros foi observado que a encapsulação continuou conferindo proteção cardíaca,

uma vez que todas as alterações foram inferiores àquelas induzidas pelo fármaco livre

até 30 minutos. Esse fato poderia explicar a menor toxicidade induzida pelo Hf

encapsulado, observando menor alteração dos parâmetros hemodinâmicos avaliados, ou

seja, pressão arterial sistólica e diastólica. Possivelmente, as variações observadas para a

PAS e PAD, após administração de Hf.HCl, atingem níveis tão baixos que levam o

animal ao choque cardiovascular irreversível, enquanto o mesmo não foi observado com

o uso das NC-Hf.

Além disso, na análise do ECG e da PA foi verificado que em todos os

parâmetros há uma alteração máxima em 1 e em 2 horas e uma segunda fase de aumento

em torno de 24 horas. Esses dados sugerem que provavelmente a alteração inicial é

conseqüência do fármaco liberado das partículas logo após a administração. Essa fração

livre estaria disponível para a associação com lipoproteínas, sendo transportadas para o

tecido cardíaco via receptores de LDL. Como observado por Porter et al., (1996) a

concentração de Hf diminui biexponencialmente após administração, sendo o tempo de

meia-vida de eliminação do fármaco, em ratos, de 11,4 1,4 horas. Possivelmente, a

associação do Hf com o coração ocorre de maneira reversível e, à medida que o fármaco

é metabolizado, a toxicidade cardíaca tende a reduzir como foi observado em nossos

experimentos. Entretanto, sabe-se que as NC convencionais são rapidamente



fagocitadas pelas células do sistema fagocítico mononuclear (Juliano, 1988). Essas

células poderiam estar funcionando como um compartimento “reservatório” para o

fármaco. A liberação do fármaco a partir deste “depósito” poderia explicar o novo

aumento observado em 24 horas para a maioria dos parâmetros analisados. A

farmacocinética do halofantrino encapsulado sugere que o modelo de análise dos dados

seja multicompartimental, o que implica em uma análise dos dados muito complexa e

uma resposta farmacológica também bastante complexa. Na realidade, existem poucos

dados disponíveis sobre a influência da encapsulação sobre a farmacocinética e sobre a

atividade farmacológica dos fármacos para que possamos comparar. Entretanto, estudos

realizados por Mosqueira et al. (2004) para o halofantrino associado à NCs

demonstraram um aumento de aproximadamente seis vezes da área sob a curva AUC

em relação ao fármaco livre, indicando que há realmente um aumento dos níveis

plasmáticos do fármaco no sangue, seja livre ou associado às NC. Este poderia ser o

fator diferencial para a obtenção da resposta farmacológica observada em nossos

experimentos.



PARTE 4:

Avaliação da

Cardiotoxicidade

em animais infectados



6.3. AVALIAÇÃO DA CARDIOTOXICIDADE EM ANIMAIS INFECTADOS PELO

Plasmodium berghei

Após avaliar a cardiotoxicidade em animais sadios, foram realizados

experimentos com o objetivo de verificar a contribuição da doença, mais

especificamente a malária, sobre os efeitos cardiotóxicos do Hf, utilizando a mesma

espécie animal, ou seja, ratos Wistar infectados pelo P. berghei.

Dados da literatura demonstraram infecção letal em ratos Fischer de quatro

semanas de idade, quando 107 hemácias parasitadas pelo P. berghei foram inoculadas.

Entretanto, animais de 12 a 16 semanas foram menos sensíveis e desenvolveram

parasitemia primária entre o 12° e 15° dia após infecção, após os quais os níveis de

parasitemia declinaram e a infecção foi eliminada até o 23° dia, sem tratamento (Pierrot

et al., 2003). No presente trabalho, inicialmente, os experimentos foram conduzidos em

ratos Wistar machos, em idade adulta (entre 12 e 16 semanas), objetivando padronizar

um protocolo de infecção nesses animais. Diferentes grupos de animais receberam por

via i.p. diferentes inóculos (106, 10

7, 10

8 e 2 x 10

8 hemácias parasitadas pelo

P. berghei). Os animais foram avaliados por um período mínimo de 15 dias após

infecção e os resultados demonstraram ausência de parasitemia em todos os animais.

Portanto, foi necessário administrar, anteriormente ao inóculo, um agente

imunossupressor, a ciclofosfamida (Oncoly Baxter), com o objetivo de reduzir a

resposta imunológica do animal para permitir que a infecção se estabeleça.

Diferentes protocolos foram utilizados para a padronização da imunossupressão,

uma vez que o objetivo era definir um protocolo que permitisse a imunossupressão

associada à infecção com 100% de sobrevida dos animais, para a posterior realização

dos experimentos. A infecção foi confirmada por esfregaço sanguíneo verificando a

presença do parasita e os níveis de parasitemia.Os resultados dos protocolos utilizados

estão apresentados na tabela 7.



Tabela 7 – Resultados dos protocolos de imunossupressão.

N° do

Protocolo

Infecção Parasitemia

Média (%)a

N° de Animais

Sobreviventes

Tempo Médio de

Sobrevida (dias)

P 1 - - 0/4 Todos mortos no

D5

P 2 - - 0/4 4 (3-5)

P 3 + (1/4) 2,5 0/4 16 (14-19)

P 4 + (2/4) 4,4 0/4 20 (15-25)

P 5 - - 4/4 >30

P 6 - - 0/4 12 (11-14)

P 7 + (4/4) 3,1 4/4 >30

a Valores de parasitemia determinado no 10° dia após infecção. n = 4 em todos os grupos

experimentais. Peso dos animais = 250 50g. O dia da infecção e as doses de ciclofosfamida

administradas estão definidos em “Materiais e métodos”, item 4.3.6.

Provavelmente, os animais dos grupos P 1, P 2 e P 6 que não apresentaram

parasitemia, morreram por causa dos efeitos provocados pela ciclofosfamida, uma vez

que a infecção pelo P. berghei não estava estabelecida a ponto de provocar a morte pelo

aumento da parasitemia. Na determinação do protocolo experimental, quando doses

altas de ciclofosfamida foram utilizadas, em regimes antes e após a infecção,

impediram o estabelecimento da infecção. Entretanto, a utilização de doses mais baixas

e administradas apenas antes da administração do inóculo permitiram o estabelecimento

da infecção em 100% dos animais acompanhada de 100% de sobrevida,

correspondendo, portanto, ao protocolo P 7, ou seja, protocolo de escolha para a

realização dos experimentos posteriores. Os resultados dos parâmetros avaliados nesse

grupo foram a taxa de parasitemia e a alteração do peso corporal e estão representados

na figura 42. A curva de parasitemia apresentou um aumento gradativo nos primeiros

dias após infecção, atingindo um pico máximo de aproximadamente 5% de parasitemia

no 15° dia após infecção (Figura 42 A). Posteriormente, os níveis de parasitemia

reduziram e, a partir do 21° dia após infecção, não foi observada a presença do parasita

no esfregaço sanguíneo. Embora, a linhagem de ratos utilizada e o protocolo do

presente estudo tenham sido diferentes do realizado por Pierrot et al. (2003), os

resultados obtidos em relação a parasitemia foram semelhantes, pois esses autores



observaram picos de parasitemia entre o 12° e o 15° dia após infecção. Sugiro fazer

uma figura só com dois eixos Y

FIGURA 41 – Curva de parasitemia média (A) e acompanhamento do peso médio (B)

corporal de ratos Wistar macho após imunossupressão com ciclofosfamida e

infecção pelo P. berghei, utilizando o protocolo P 7 com inóculo de 2x107

hemácias de camundongo Swiss, infectado pelo P. berghei. Os resultados

estão apresentados como a média erro padrão da média (n = 4).

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (dias)

Parasi

tem

ia (

%)

Inócu

lo

Adm

inis

traçã

o d

e C

iclo

fosf

am

ida

Inócu

lo

Adm

inis

traçã

o d

e

Cic

lofo

sfam

ida

280

290

300

310

320

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (dias)

Peso

(g)

0

1

2

3

4

5

6

7

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (dias)

Parasi

tem

ia (

%)

Inócu

lo

Adm

inis

traçã

o d

e C

iclo

fosf

am

ida

Inócu

lo

Adm

inis

traçã

o d

e

Cic

lofo

sfam

ida

280

290

300

310

320

0 5 10 15 20 25 30 35

Tempo (dias)

Peso

(g)

A

B



Diante dos resultados obtidos, os estudos posteriores para a avaliação da

cardiotoxicidade foram realizados 12° dia após infecção, período em que a parasitemia

estava aumentando, porém, sem atingir o seu máximo.

A parasitemia foi determinada no dia da administração do tratamento com Hf e

os animais do grupo Hf.HCl apresentaram níveis de parasitemia de 4,2% 2,3%, e os

animais do grupo NC-Hf, níveis de 4,8% 2,7%, os quais não foram significativamente

diferentes.

A resposta para os parâmetros avaliados nos diferentes grupos está apresentada

abaixo em valores absolutos, os quais não apresentaram diferenças significativas

quando o Hf foi administrado na forma livre ou encapsulada (Tabela 8).

Tabela 8- Médias dos valores absolutos de pressão arterial, freqüência cardíaca e


administração i.v. de100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf em ratos Wistar infectados pelo

P. berghei.

Tempo

(horas)

QT

(ms)

PR

(ms)

QRS

(ms)

QTc

(ms)

FC

(bpm)

PAS

(mmHg)

PAD

(mmHg)

0,16 A 104 2 51 1 40 1 177 2 296 13 125 5 56 5

B 91 8 53 3 40 3 165 15 351 20 120 3 64 1

0,5 A 112 13 60 4 44 4 193 11 324 62 123 10 65 2

B 104 6 57 1 41 1 177 9 299 18 108 9 54 7

1 A 110 3 53 2 42 1 180 2 264 18 121 9 56 1

B 108 1 53 1 45 3 185 3 296 15 101 9 54 3

2 A 112 14 56 3 45 4 230 52 324 35 118 6 63 4

B 116 10 68 3 44 1 189 11 259 16 105 7 50 2

8 A 96 7 42 8 41 2 183 15 414 15 121 4 71 2

B 100 4 54 3 43 1 183 7 363 14 121 1 67 3

24 A 97 5 45 4 38 13 182 7 398 14 136 6 87 11

B 91 4 50 3 42 1 169 7 391 16 125 3 76 8

Os valores estão apresentados como a média erro padrão. A e B representam grupos que receberam o

fármaco livre e encapsulado, respectivamente, na dose de 100 mg/kg. n = 4 animais por grupo.



Os dados apresentados na figura 42 A mostram que ambas as formulações de Hf,

Hf.HCl e NC-Hf, induziram a aumentos imediatos e significativos do intervalo QT após

a administração em animais infectados pelo P. berghei. Diferenças significativas

(P < 0,05) entre as formulações foram observadas nos tempos de 10 min e 2 horas. A

variação máxima observada no grupo que recebeu Hf.HCl foi de 36%, 1 horas após a

administração, enquanto a variação máxima observada no grupo que recebeu NC-Hf foi

de 40%, 2 horas após a administração. Embora o prolongamento do intervalo QT

observado em 8 e 24 horas após a administração de NC-Hf tenha sido mais pronunciado

que aquele induzido pelo fármaco livre, provavelmente, nesse período, o fármaco livre

está sendo metabolizado e conseqüentemente eliminado do compartimento sanguíneo.

Apesar das NC convencionais serem rapidamente fagocitadas pelas células do SFM,

segundo Mosqueira et al. (2004), provavelmente, em animais infectados, o SFM é

saturado pela captura dos eritrócitos parasitados e NC convencionais permanecem maior

tempo na corrente circulatória. Esse fato poderia, portanto, explicar o aumento das

variações do intervalo QT induzido pelo NC-Hf, uma vez que as mesmas estariam

liberando mais tardiamente o fármaco no compartimento sanguíneo.

Em relação ao QTc, não foram observadas diferenças significativas entre as duas

formulações administradas. Entretanto, a alteração máxima observada para o grupo que

recebeu Hf.HCl foi de 25%, 2 horas após a administração enquanto para o grupo que

recebeu NC-Hf essa alteração foi de 27%, 8 horas após a administração do fármaco.



FIGURA 42 – Cinética de variação do intervalo QT (A) e do QTc (B) de ratos Wistar machos

infectados pelo P. berghei e anestesiados pelo éter etílico, após injeção i.v. de

100 mg/kg de Hf.HCl ou NC-Hf.

0

15

30

45

60

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Vari

açã

o d

o I

nte

rvalo

QT

(%

) .

0

15

30

45

60

0 4 8 12 16 20 24Tempo (horas)

Vari

açã

o d

o Q

Tc

(%)

.

Hf.HCl NC-Hf

0

15

30

45

60

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Vari

açã

o d

o I

nte

rvalo

QT

(%

) .

0

15

30

45

60

0 4 8 12 16 20 24Tempo (horas)

Vari

açã

o d

o Q

Tc

(%)

.

Hf.HCl NC-Hf

A

B



A análise do intervalo PR demonstrou uma redução desse parâmetro quando o

Hf foi administrado na forma livre, entretanto, quando o fármaco foi administrado na

forma encapsulada, foi observado um perfil de resposta diferente, verificando aumentos

significativos desse parâmetro. A variação máxima verificada foi de -22%, 8 horas após

a administração de Hf.HCl e de 18%, 2 horas após a administração de NC-Hf (Figura

43 A).

Por outro lado, ambas as formulações de Hf induziram a aumentos imediatos do

intervalo QRS. As alterações máximas verificadas foram de 11%, 1 hora após a

administração do Hf.HCl e de 12%, 8 horas após a administração do NC-Hf (Figura

43 B). Um perfil de resposta semelhante ao intervalo QT foi observado para o QRS, ou

seja, foi observado uma maior variação do intervalo QRS, no tempo de 8 horas, para o

grupo que recebeu NC-Hf em comparação àquele que recebeu Hf.HCl. Esse resultado

sugere que as NC aumentam o tempo de residência do fármaco no compartimento

sanguíneo o que leva à alterações mais pronunciadas em tempos mais tardios.



FIGURA 43 – Cinética de variação do intervalo PR (A) e QRS (B) de ratos Wistar machos



-30

-15

0

15

30

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção

do I

nte

rva

lo P

R (

%)

.

0

5

10

15

20

25

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção

do I

nte

rva

lo Q

RS

(%

)

Hf.HCl NC-Hf

-30

-15

0

15

30

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção

do I

nte

rva

lo P

R (

%)

.

0

5

10

15

20

25

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção

do I

nte

rva

lo Q

RS

(%

)

Hf.HCl NC-Hf

A

B



Em relação à pressão arterial, foi observada redução, com variação máxima de

5% para PAS e 30% para PAD, 2 horas e 0,5 hora após a administração de 100 mg/kg

de Hf.HCl, respectivamente. Entretanto, foi observado que a redução máxima induzida

após a administração da mesma dose de NC-Hf, foi de 12% para PAS e 31% para PAD,

2 horas após a administração (Figura 44 A e B). Embora tenham apresentado valores

diferentes, essas alterações foram estatisticamente equivalentes. As alterações

observadas na PAD, 8 e 24 horas após a administração de NC-Hf também foram

superiores àquelas induzidas por Hf.HCl, entretanto as mesmas não apresentaram

diferença significativa.

Na análise da FC foi observado bradicardia intensa imediatamente após a

administração do Hf em ambas as formulações avaliadas, as quais foram

significativamente equivalentes (Figura 44 C). A alteração máxima induzida por Hf.HCl

foi de -19%, 10 min após a administração enquanto, a alteração máxima observada após

a administração de NC-Hf foi de -32%, 2 horas após a administração. Novamente, as

alterações observadas 8 horas após a administração de NC-Hf foram superiores àquelas

induzidas por Hf.HCl.



FIGURA 44 – Cinética de variação da PAS (A), PAD (B) e da FC (C) de ratos Wistar machos



-20

-10

0

10

20

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção

da P

AS

(%

)

-40

-30

-20

-10

0

10

20

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção d

a P

AD

(%

)

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção

da

FC

(%

)

Hf.HCl NC-Hf

-20

-10

0

10

20

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção

da P

AS

(%

)

-40

-30

-20

-10

0

10

20

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção d

a P

AD

(%

)

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 4 8 12 16 20 24

Tempo (horas)

Va

ria

ção

da

FC

(%

)

Hf.HCl NC-Hf

A

B

C



Em resumo, observa-se que houve um retardo na resposta farmacológica para

muitos parâmetros após a administração do Hf encapsulado, tanto no animal sadio

quanto no infectado. Entretanto, em termos de variação percentual dos parâmetros

analisados, os valores são muito semelhantes o que indica que no animal infectado as

NC estariam disponibilizando o fármaco para interação com as células cardíacas de

maneira muito semelhante à solução de Hf livre.

Se em teoria, a diferença entre as respostas para as formulações no animal sadio

fosse atribuída à acumulação do Hf nanoparticulado em células e órgãos do SFM, a

saturação do SFM seria uma explicação plausível para a ausência de diferença entre as

formulações no animal infectado. Por outro lado, não há como demonstrar, no presente

trabalho, se o fármaco é liberado das NC com velocidades diferentes no animal sadio e

no infectado, o que também poderia ser outra hipótese sugerida para explicar esses

efeitos.

DISCUSSÃO

GERAL

Discussão Geral


DISCUSSÃO GERAL

No presente trabalho, todas as formulações de NC brancas e NC contendo Hf

foram preparadas segundo método descrito por Fessi et al. (1989), um método simples e

de fácil execução. O polímero pré-formado, poli--caprolactona, foi escolhido para

preparação das NC-Hf, uma vez que consiste em um produto estável, de baixo custo e

comercialmente disponível apresentando alto grau de pureza. Essas características

permitem, portanto, que a formulação seja facilmente transposta para a escala industrial.

O principal objetivo de utilizar o Hf na forma vetorizada em nanocápsulas foi

evitar complicações previamente observadas após administração parenteral da solução

de Hf.HCl (Krishna et al., 1993). Com base no trabalho desenvolvido por esses autores,

a dose usada em humanos, para tratamento de malária falciparum, é de 1 mg/kg

administrada por infusão durante 1 hora por via i.v. De acordo com a caracterização

realizada no nosso estudo, as formulações mais adequadas para a administração

parenteral seriam aquelas contendo 1 e 10 mg de Hf/mL de suspensão coloidal. A

primeira formulação poderia ser administrada por infusão utilizando-se um volume de

70 mL para um adulto, enquanto para NC contendo 10 mg de Hf/mL de suspensão

colodial o volume correspondente a dose de 1 mg/kg seria 7 mL, o qual poderia ser

administrado in bolus por via i.v. Portanto, a formulação de escolha para a avaliação in

vivo foi a de 10 mg/mL visto que, em ratos seria possível administrar volumes baixos

por via i.v., prevenindo quaisquer influências nos parâmetros cardiovasculares

analisados.

Em todos os experimentos foram utilizadas NCs contendo Hf com a mesma

carga superficial, ou seja, carregadas positivamente. No entanto, não foi possível

analisar a influência de tal característica na resposta farmacológica. Embora as

formulações controles (sem o fármaco) tenham sido administradas em volumes

correspondentes às doses utilizadas, nenhuma alteração foi observada após sua

administração. Entretanto, deve-se considerar que o potencial de superfície foi

modificado, uma vez que as mesmas apresentaram-se negativamente carregadas.

Um dos principais problemas associado com Hf é sua baixa solubilidade em

água. O Hf é uma substância extremamente lipofílica e embora possa ser dissolvido em

Discussão Geral


diversos solventes orgânicos, após a administração i.v. o fármaco tende a precipitar no

meio fisiológico (Batey et al., 1997). Na formulação para administração intravenosa

preparada por Krishna et al. (1993) o Hf.HCl foi dissolvido em

dimetilacetamida/polietilenoglicol (40/60 v/v), diluído posteriormente em glicose 5%,

entretanto essa preparação precipitava rapidamente o que requeria o preparo

imediatamente antes da administração. Além disso, os autores relataram uma

significativa toxicidade local, onde observaram o aparecimento de eritemas associado

ao solvente utilizado. Estudos anteriores demonstraram ainda uma grande variação

interindividual após a administração do Hf por via oral, obtendo-se baixas

concentrações do fármaco e de seu metabólito ativo na corrente sanguínea, as quais

estariam provavelmente relacionadas à causa do insucesso terapêutico observado em

alguns pacientes (ter-Kuile et al., 1993). Diante disso, o desenvolvimento de uma

formulação adequada e segura para a administração i.v. em pacientes com malária

severa é extremamente necessário. Brocks e Betageri (2002) desenvolveram uma

formulação prolipossomal de Hf para administração oral em ratos, obtendo aumentos de

47% da área sob a curva tempo versus concentração plasmática. Mosqueira et al. (2004)

demonstraram em estudos realizados in vivo, em modelo murino, que o Hf encapsulado

em NC mantém sua atividade biológica e quando comparado ao fármaco livre observou-

se um aumento de 6 vezes da área sob a curva. Além disso, Mosqueira et al. (1999)

sugeriu várias evidências (potencial zeta, teor de encapsulação, perfil de liberação) para

confirmar que o Hf estaria verdadeiramente associado às NCs. Nossos resultados

corroboram tais estudos, visto que, apesar de utilizar técnicas distintas para

quantificação de Hf associado às NCs, os resultados foram semelhantes, demonstrando

que aproximadamente 99,8% de fármaco encontra-se associado as partículas,

descartando portanto a necessidade de técnicas de purificação para eliminar a substância

ativa que se encontra livre em solução. Foram encontradas ainda alterações

significativas na carga superficial quando altas concentrações foram associadas ao

sistema, pressupondo que tais alterações sejam decorrentes da presença do Hf

positivamente carregado. A análise por MFA permitiu também distinguir uma nítida

diferença entre NC branca e NC contendo o Hf, através da visualização de um material

ao redor das estruturas.

Discussão Geral


Mosqueira et al. (2004) relataram aumento da dose letal do Hf de 30 mg/kg para

100 mg/kg quando o Hf foi administrado como suspensão coloidal de NC em

camundongo infectados pelo Plasmodium berghei, sugerindo uma redução da

toxicidade geral do Hf após encapsulação. Como no presente estudo, as partículas

preparadas foram muito semelhantes às descritas por Mosqueira et al. (2004) esperava-

se uma resposta também similar. Nossos resultados de DL50 demonstraram a redução da

toxicidade. Entretanto, não existiam, até o momento, relatos na literatura que

demonstrasse se essa redução de toxicidade teria como foco o sistema cardiovascular, o

qual foi objeto de estudo do nosso trabalho.

O presente estudo demonstrou claramente que o Hf.HCl provoca um

prolongamento do intervalo QT de ratos e foi reportado aqui, pela primeira vez, que

uma formulação de nanocarreadores poliméricos do tipo NC foi capaz de reduzir a

toxicidade cardíaca induzida pelo fármaco. Segundo Touze et al. (2002), dentre os

antimaláricos eficazes no tratamento de malária, o halofantrino é o mais cardiotóxico

deles. Vários estudos já têm relatado sua capacidade de induzir prolongamento do

intervalo QT em cobaias e coelhos (Batey et al., 1997; Lightbown et al., 2001),

entretanto o prolongamento do intervalo QT induzido pelo Hf no modelo rato foi

observado pela primeira vez nesse estudo.

Nas altas doses estudadas o modelo rato se mostrou adequado, pois possibilitou

observar as diferenças de variação dos parâmetros entre o fármaco livre e encapsulado,

embora animais mais sensíveis para as variações do intervalo QT sejam também

utilizados para estudo da cardiotoxicidade de drogas, em experimentação pré-clínica.

(Crumb & Cavero, 1999). Além disso, não há relatos na literatura de infecção de

cobaias pelo P. berghei o que impossibilitaria o estudo da contribuição da doença

(malária) na cardiotoxicidade do halofantrino na mesma espécie animal. Janse et al.

(1989) demonstraram que eritrócitos de coelhos e cobaias são resistentes à infecção pelo

P. berghei.

Os experimentos para avaliação da cardiotoxicidade em curto período de tempo,

realizados em animais sadios anestesiados, demonstraram a ocorrência de um efeito

dose-dependente sobre o intervalo QT do ECG quando altas doses de Hf foram

utilizadas, confirmando achados de trabalhos anteriores (Batey et al., 1997).

Provavelmente, como observado em cobaias anestesiados, no rato altas doses de Hf

Discussão Geral


levaram ao bloqueio de canais de K+, responsáveis pelo processo de repolarização

cardíaca. Entretanto, a encapsulação reduziu significativamente as alterações do QT em

ambas as doses utilizadas, demonstrando a capacidade das NCs em reduzir a

cardiotoxicidade, conferindo maior proteção cardíaca. Foi verificado que, até 30 min

após a administração do fármaco, quanto maior a dose utilizada, maior a proteção

conferida pela encapsulação. Entretanto, avaliando um efeito mais tardio, até 24 horas

após administração de NC-Hf em altas doses (150 mg/kg), foi demonstrado uma maior

variação do intervalo QT, atingindo níveis semelhantes aos induzidos pelo fármaco livre

até 30 min. Isso sugere que as NCs aumentam o tempo de residência do fármaco no

compartimento sanguíneo e que, mesmo a longo prazo, continuam conferindo proteção

cardíaca, induzindo uma toxicidade menos pronunciada, uma vez que todos os animais

sobrevivem durante as 48 horas experimentais.

Em relação aos outros parâmetros do ECG analisados, alterações

significativamente menores foram induzidas pelo Hf associado à NC quando comparado

ao Hf livre. Além disso, variações significativas da pressão arterial e freqüência

cardíaca foram induzidas por todas as formulações de Hf, tanto na avaliação a curto

prazo como na avaliação por períodos mais prolongados. Entretanto, foi interessante

observar, que a administração de 150 mg/kg de NC-Hf mesmo induzindo a alterações na

freqüência cardíaca e PA em tempos prolongados, não levou à morte de nenhum animal

durante o período experimental, diferentemente do que foi observado para o fármaco

livre. Esse fato confirma, mais uma vez, a redução da toxicidade observada após a

encapsulação do Hf, sugerindo que a toxicidade do Hf livre é decorrente da associação

das alterações nos canais de potássio, verificadas pelo prolongamento do intervalo QT,

bem como das alterações hemodinâmicas induzidas pelo Hf, as quais atingem níveis

incompatíveis com a sobrevivência do animal, induzindo possivelmente um choque

irreversível.

Diante disso, pode-se sugerir que as NC-Hf alteram a resposta quantitativa dos

parâmetros cardiovasculares em relação ao Hf livre, mas também alteram a resposta

qualitativa dos mesmos, tanto a curto prazo quanto a longo prazo, e isso pode ser

observado pelo perfil das curvas de resposta farmacológica das NC-Hf em relação ao

fármaco livre. Provavelmente, a modificação do perfil das curvas se dá pelas alterações

da distribuição do fármaco no organismo, inclusive pela captura maciça das

Discussão Geral


nanocápsulas pelo SFM o que acarreta em acúmulo de partículas no interior das células

fagocitárias em órgãos específicos, tais como fígado, baço, medula óssea (Mosqueira et

al., 2001 a)

Por outro lado, no animal infectado, a situação parece ser bastante distinta, uma

vez que observamos um perfil de resposta oposto ao do fármaco livre. Se investigarmos

as razões deste comportamento, a possibilidade de saturação do SPM parece sinalizar

que a malária poderia influenciar na capacidade de fagocitose destas células. Dados da

literatura demonstraram que, em pacientes com malária severa, os níveis de

lipoproteínas LDL foram significativamente reduzidos quando comparado a pacientes

sadios (Mohanty et al., 1992). Segundo McIntosh et al. (1999), mudanças no perfil de

lipoproteínas plasmáticas teriam uma provável influência na ligação do Hf, o que

possivelmente influenciaria seus efeitos tóxicos. Seriam necessários, experimentos

posteriores, investigando se há influência dos parâmetros hematológicos e bioquímicos

atribuídos à doença que interfeririam na velocidade e na quantidade do fármaco liberado

pelas NCs na circulação sanguínea.

A redução das alterações cardiovasculares observadas após a administração de

NC-Hf em relação à administração do fármaco livre está provavelmente relacionada à

capacidade da nanocápsula em modificar a distribuição da droga no organismo,

prolongando seu tempo de permanência no compartimento vascular como demonstrado

anteriormente por Mosqueira et al. (2004). Além disso, a redução dos efeitos tóxicos do

fármaco quando encapsulado poderia ser atribuída à fração do que se encontra livre para

a associação ao tecido cardíaco, se comparado à administração do fármaco em solução.

Estudos demonstram que o Hf livre se associa extensivamente a lipoproteínas

plasmáticas, principalmente lipoproteínas de baixa e de alta densidade (Brocks &

Wasan, 2002). Provavelmente, a associação do Hf ao núcleo oleoso das nanocápsulas

reduz a concentração do fármaco livre que se associa a lipoproteínas no sangue,

reduzindo, conseqüentemente, a fração que seria transportada ao tecido cardíaco via

receptores de LDL.

Diante disso, os resultados deste trabalho demonstraram a capacidade dos

carreadores poliméricos, nanocápsulas, em reduzir a cardiotoxicidade do Hf quando

comparado ao fármaco livre. Sabe-se que altas doses de Hf são necessárias para o

tratamento de pacientes com malária em determinadas áreas do mundo, aumentando

Discussão Geral


conseqüentemente o risco de efeitos adversos cardíacos. Portanto, o desenvolvimento e

a avaliação de nanoestruturas capazes de reduzir tais efeitos é de grande interesse, uma

vez que pode levar a tratamentos mais seguros e eficazes.

CONCLUSÃO

Conclusão


CONCLUSÕES

A microscopia de força atômica permitiu observar a morfologia das NCs e

avaliar propriedades físicas das partículas tais como estabilidade após aplicação

de uma determinada “força” (set point = 0) e flexibilidade do filme polimérico.

Essa característica confere às partículas a capacidade de se adaptar para

atravessar espaços intercelulares in vivo.

A deformação das NCs quando depositadas sobre a superfície da mica evidencia

a presença de um núcleo oleoso envolvido por uma membrana polimérica,

constituindo sistemas de liberação do tipo reservatório.

A nanoencapsulação do Hf modificou a resposta farmacológica e a sua duração

no tempo, no modelo rato, reduzindo a toxicidade (DL50) e as alterações

eletrofisiológicas cardíacas em animais sadios. Provavelmente, em animais

sadios, as nanocápsulas causam uma proteção significativa do coração,

reduzindo a cardiotoxicidade. Esse fato foi atribuído, nesse trabalho, à

capacidade das nanocápsulas de restringirem a captação de fármacos por tecidos

e órgãos que apresentem epitélios endoteliais contínuos, causando uma proteção

significativa dos mesmos com conseqüente redução dos efeitos adversos.

A toxicidade induzida pelo Hf veiculado em nanocápsulas, tanto a curto como a

longo prazo, foi menos pronunciada que a induzida pelo fármaco livre,

sugerindo que as NCs alteram a resposta qualitativa e quantitativa dos

parâmetros cardiovasculares analisados.

A encapsulação do Hf provocou uma alteração mais tardia dos parâmetros

cardiovasculares analisados, tanto em animais sadios como em animais

infectados pelo P. berghei.

Em animais infectados as alterações induzidas pelo fármaco encapsulado foram

semelhantes àquelas induzidas pelo fármaco livre, sugerindo que a malária

Conclusão


experimental em ratos também influencia o perfil de distribuição do fármaco no

organismo.

O presente trabalho demonstra a importância da avaliação da toxicidade de

fármacos na fase pré-clínica em modelos animais infectados, uma vez que, a

doença pode alterar significativamente a biodisponibilidade do fármaco no

organismo.

REFERÊNCIAS

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n. 4

ANEXOS

Resultados e Discussão: Capítulo 1


ANEXO I

Parâmetros cardiovasculares de um animal representativo do grupo Hf.HCl até

30 minutos após administração i.v. de 150 mg/kg do fármaco.

HALO 14 Dose: 150 mg/kg

Tempo Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo 5 Ciclo 6 Ciclo 7 Ciclo 8 Ciclo 9 Ciclo 10 Média %variação

Controle

QT 0,0983 0,0983 0,1 0,0983 0,0983 0,1 0,1017 0,1033 0,1017 0,0983 0,09982

RR 0,1866 0,1866 0,185 0,185 0,185 0,185 0,1866 0,1866 0,185 0,1866 0,1858

PR 0,0667 0,0633 0,065 0,065 0,065 0,0667 0,063 0,0667 0,065 0,0667 0,0633

QRS 0,0283 0,03 0,0283 0,03 0,03 0,03 0,03 0,0283 0,0283 0,0283 0,02915

PAS 110,48 111,41 114,98 118,2 119,07 116,99 113,08 108,58 110,6 114,06 113,745

PAD 75,23 72,7 74,19 76,32 78,86 78,63 76,09 73,39 71,95 72,64 75

QTc 0,1300374 0,1300374 0,1324763 0,1302242 0,1302242 0,1324763 0,1345351 0,1366517 0,1347284 0,1300374 0,13214282

FC 321,54341 321,54341 324,32432 324,32432 324,32432 324,32432 321,54341 321,54341 324,32432 321,54341 322,933866

30 segundos

QT 0,1283 0,1233 0,1217 0,1283 0,13 0,1233 0,1233 0,125 0,1254 25,6

RR 0,23 0,23 0,2283 0,2283 0,23 0,23 0,23 0,2283 0,2293625 23,4

PR 0,0817 0,0833 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0783 0,08 0,08125 28,4

QRS 0,0417 0,0417 0,04 0,04 0,0383 0,0367 0,04 0,04 0,0398 36,5

PAS 49,42 49,25 49,6 49,19 48,44 48,33 49,48 49,25 49,12 -56,8

PAD 19,99 20,1 20,33 20,05 19,82 19,95 19,82 20,05 20,01375 -73,3

QTc 0,16391 0,1575222 0,1556705 0,1641128 0,1660818 0,1575222 0,1575222 0,1598916 0,16027915 21,3

FC 260,86957 260,86957 262,81209 262,81209 260,86957 260,86957 260,86957 262,81209 261,598012 -19,0

1 minuto

QT 0,1333 0,1317 0,1317 0,13 0,1333 0,1317 0,135 0,135 0,1327125 33,0

RR 0,2383 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,24 0,2372375 27,7

PR 0,08 0,085 0,0833 0,0833 0,0817 0,08 0,0833 0,0817 0,0822875 30,0

QRS 0,0417 0,0417 0,0417 0,0433 0,04 0,04 0,0383 0,04 0,0408375 40,1

PAS 46,2 47,87 47,64 47,98 47,58 47,64 46,26 47,41 47,3225 -58,4

PAD 18,89 19,12 19,24 19,41 19,41 19,24 18,84 19,12 19,15875 -74,5

QTc 0,1692945 0,1674621 0,1674621 0,1653005 0,1694966 0,1674621 0,1716582 0,1712505 0,16867335 27,6

FC 251,78347 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 250 252,917354 -21,7

1min30s

QT 0,1317 0,1317 0,1333 0,135 0,1333 0,1317 0,135 0,1317 0,132925 33,2

RR 0,2466 0,245 0,2466 0,2483 0,2466 0,25 0,2483 0,245 0,24705 33,0

PR 0,08 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0833 0,085 0,0833 0,0822875 30,0

QRS 0,0433 0,0433 0,0417 0,04 0,0383 0,0383 0,0417 0,0433 0,0412375 41,5

PAS 46,08 45,91 46,08 45,79 44,82 45,33 45,97 45,79 45,72125 -59,8

PAD 18,49 18,61 18,43 18,49 18,15 18,32 18,26 18,49 18,405 -75,5

QTc 0,1663107 0,1664913 0,1683312 0,1702829 0,1683312 0,1659316 0,1702829 0,1664913 0,16780663 27,0

FC 243,309 244,89796 243,309 241,64317 243,309 240 241,64317 244,89796 242,876159 -24,8

2 minutos

QT 0,135 0,1317 0,1367 0,1333 0,1367 0,1317 0,1317 0,13382857 34,1

RR 0,255 0,255 0,2583 0,2566 0,2566 0,2583 0,2566 0,25662857 38,1

PR 0,085 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0833 0,085 0,08285714 30,9

QRS 0,04 0,0383 0,0417 0,0417 0,0383 0,0383 0,0433 0,04022857 38,0

PAS 45,33 45,62 45,33 45,39 43,89 45,16 45,33 45,15 -60,3

PAD 17,86 18,15 18,26 17,8 17,63 17,74 17,86 17,9 -76,1

QTc 0,1695289 0,1653849 0,1712962 0,1672197 0,1714848 0,1650308 0,1652125 0,16787969 27,0

FC 235,29412 235,29412 232,28804 233,82697 233,82697 232,28804 233,82697 233,806459 -27,6

3 minutos

QT 0,1383 0,14 0,1433 0,1417 0,1433 0,1483 0,145 0,14284286 43,1

RR 0,2783 0,2766 0,2766 0,2766 0,2783 0,2766 0,28 0,27757143 49,4

PR 0,0867 0,0933 0,09 0,0933 0,0917 0,0883 0,09 0,09047143 42,9

QRS 0,0417 0,0433 0,0433 0,0417 0,0433 0,04 0,0417 0,04214286 44,6

PAS 46,31 46,49 46,54 46,49 46,49 44,93 46,08 46,19 -59,4

PAD 17,05 17,05 17,11 17,51 17,11 16,76 17,11 17,1 -77,2

QTc 0,1711604 0,1734414 0,1775296 0,1755474 0,1773484 0,183724 0,1792703 0,17686021 33,8

FC 215,59468 216,91974 216,91974 216,91974 215,59468 216,91974 214,28571 216,164862 -33,1

4 minutos

QT 0,1433 0,1467 0,1467 0,1467 0,1483 0,1433 0,14583333 46,1

RR 0,2983 0,2966 0,3 0,2966 0,3 0,2983 0,2983 60,5

PR 0,0917 0,095 0,0933 0,095 0,0967 0,0917 0,0939 48,3

QRS 0,0433 0,04 0,04 0,0433 0,0417 0,045 0,04221667 44,8

PAS 48,27 46,72 47,93 48,27 48,44 48,33 47,9933333 -57,8

PAD 17,05 16,76 16,99 16,94 16,99 17,11 16,9733333 -77,4

QTc 0,1753089 0,1796394 0,1792985 0,1796394 0,181254 0,1753089 0,17840818 35,0

FC 201,13979 202,29265 200 202,29265 200 201,13979 201,144147 -37,7

5 minutos

QT 0,1467 0,1467 0,1433 0,1417 0,1417 0,1417 0,14363333 43,9

RR 0,3216 0,3183 0,3216 0,3216 0,3166 0,32 0,31995 72,2

PR 0,0933 0,0917 0,0967 0,0967 0,0967 0,0967 0,0953 50,6

QRS 0,045 0,0433 0,04 0,045 0,0467 0,0433 0,04388333 50,5

PAS 51,5 51,21 49,94 51,5 51,67 51,73 51,2583333 -54,9

PAD 17,63 17,53 17,11 17,51 17,58 17,74 17,5166667 -76,6

QTc 0,1772328 0,1775377 0,1731252 0,1711921 0,1716398 0,1713345 0,17367703 31,4

HALO 14 Dose: 150 mg/kg

Tempo Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4 Ciclo 5 Ciclo 6 Ciclo 7 Ciclo 8 Ciclo 9 Ciclo 10 Média %variação

Controle

QT 0,0983 0,0983 0,1 0,0983 0,0983 0,1 0,1017 0,1033 0,1017 0,0983 0,09982

RR 0,1866 0,1866 0,185 0,185 0,185 0,185 0,1866 0,1866 0,185 0,1866 0,1858

PR 0,0667 0,0633 0,065 0,065 0,065 0,0667 0,063 0,0667 0,065 0,0667 0,0633

QRS 0,0283 0,03 0,0283 0,03 0,03 0,03 0,03 0,0283 0,0283 0,0283 0,02915

PAS 110,48 111,41 114,98 118,2 119,07 116,99 113,08 108,58 110,6 114,06 113,745

PAD 75,23 72,7 74,19 76,32 78,86 78,63 76,09 73,39 71,95 72,64 75

QTc 0,1300374 0,1300374 0,1324763 0,1302242 0,1302242 0,1324763 0,1345351 0,1366517 0,1347284 0,1300374 0,13214282

FC 321,54341 321,54341 324,32432 324,32432 324,32432 324,32432 321,54341 321,54341 324,32432 321,54341 322,933866

30 segundos

QT 0,1283 0,1233 0,1217 0,1283 0,13 0,1233 0,1233 0,125 0,1254 25,6

RR 0,23 0,23 0,2283 0,2283 0,23 0,23 0,23 0,2283 0,2293625 23,4

PR 0,0817 0,0833 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0783 0,08 0,08125 28,4

QRS 0,0417 0,0417 0,04 0,04 0,0383 0,0367 0,04 0,04 0,0398 36,5

PAS 49,42 49,25 49,6 49,19 48,44 48,33 49,48 49,25 49,12 -56,8

PAD 19,99 20,1 20,33 20,05 19,82 19,95 19,82 20,05 20,01375 -73,3

QTc 0,16391 0,1575222 0,1556705 0,1641128 0,1660818 0,1575222 0,1575222 0,1598916 0,16027915 21,3

FC 260,86957 260,86957 262,81209 262,81209 260,86957 260,86957 260,86957 262,81209 261,598012 -19,0

1 minuto

QT 0,1333 0,1317 0,1317 0,13 0,1333 0,1317 0,135 0,135 0,1327125 33,0

RR 0,2383 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,2366 0,24 0,2372375 27,7

PR 0,08 0,085 0,0833 0,0833 0,0817 0,08 0,0833 0,0817 0,0822875 30,0

QRS 0,0417 0,0417 0,0417 0,0433 0,04 0,04 0,0383 0,04 0,0408375 40,1

PAS 46,2 47,87 47,64 47,98 47,58 47,64 46,26 47,41 47,3225 -58,4

PAD 18,89 19,12 19,24 19,41 19,41 19,24 18,84 19,12 19,15875 -74,5

QTc 0,1692945 0,1674621 0,1674621 0,1653005 0,1694966 0,1674621 0,1716582 0,1712505 0,16867335 27,6

FC 251,78347 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 253,59256 250 252,917354 -21,7

1min30s

QT 0,1317 0,1317 0,1333 0,135 0,1333 0,1317 0,135 0,1317 0,132925 33,2

RR 0,2466 0,245 0,2466 0,2483 0,2466 0,25 0,2483 0,245 0,24705 33,0

PR 0,08 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0833 0,085 0,0833 0,0822875 30,0

QRS 0,0433 0,0433 0,0417 0,04 0,0383 0,0383 0,0417 0,0433 0,0412375 41,5

PAS 46,08 45,91 46,08 45,79 44,82 45,33 45,97 45,79 45,72125 -59,8

PAD 18,49 18,61 18,43 18,49 18,15 18,32 18,26 18,49 18,405 -75,5

QTc 0,1663107 0,1664913 0,1683312 0,1702829 0,1683312 0,1659316 0,1702829 0,1664913 0,16780663 27,0

FC 243,309 244,89796 243,309 241,64317 243,309 240 241,64317 244,89796 242,876159 -24,8

2 minutos

QT 0,135 0,1317 0,1367 0,1333 0,1367 0,1317 0,1317 0,13382857 34,1

RR 0,255 0,255 0,2583 0,2566 0,2566 0,2583 0,2566 0,25662857 38,1

PR 0,085 0,0817 0,0817 0,08 0,0833 0,0833 0,085 0,08285714 30,9

QRS 0,04 0,0383 0,0417 0,0417 0,0383 0,0383 0,0433 0,04022857 38,0

PAS 45,33 45,62 45,33 45,39 43,89 45,16 45,33 45,15 -60,3

PAD 17,86 18,15 18,26 17,8 17,63 17,74 17,86 17,9 -76,1

QTc 0,1695289 0,1653849 0,1712962 0,1672197 0,1714848 0,1650308 0,1652125 0,16787969 27,0

FC 235,29412 235,29412 232,28804 233,82697 233,82697 232,28804 233,82697 233,806459 -27,6

3 minutos

QT 0,1383 0,14 0,1433 0,1417 0,1433 0,1483 0,145 0,14284286 43,1

RR 0,2783 0,2766 0,2766 0,2766 0,2783 0,2766 0,28 0,27757143 49,4

PR 0,0867 0,0933 0,09 0,0933 0,0917 0,0883 0,09 0,09047143 42,9

QRS 0,0417 0,0433 0,0433 0,0417 0,0433 0,04 0,0417 0,04214286 44,6

PAS 46,31 46,49 46,54 46,49 46,49 44,93 46,08 46,19 -59,4

PAD 17,05 17,05 17,11 17,51 17,11 16,76 17,11 17,1 -77,2

QTc 0,1711604 0,1734414 0,1775296 0,1755474 0,1773484 0,183724 0,1792703 0,17686021 33,8

FC 215,59468 216,91974 216,91974 216,91974 215,59468 216,91974 214,28571 216,164862 -33,1

4 minutos

QT 0,1433 0,1467 0,1467 0,1467 0,1483 0,1433 0,14583333 46,1

RR 0,2983 0,2966 0,3 0,2966 0,3 0,2983 0,2983 60,5

PR 0,0917 0,095 0,0933 0,095 0,0967 0,0917 0,0939 48,3

QRS 0,0433 0,04 0,04 0,0433 0,0417 0,045 0,04221667 44,8

PAS 48,27 46,72 47,93 48,27 48,44 48,33 47,9933333 -57,8

PAD 17,05 16,76 16,99 16,94 16,99 17,11 16,9733333 -77,4

QTc 0,1753089 0,1796394 0,1792985 0,1796394 0,181254 0,1753089 0,17840818 35,0

FC 201,13979 202,29265 200 202,29265 200 201,13979 201,144147 -37,7

5 minutos

QT 0,1467 0,1467 0,1433 0,1417 0,1417 0,1417 0,14363333 43,9

RR 0,3216 0,3183 0,3216 0,3216 0,3166 0,32 0,31995 72,2

PR 0,0933 0,0917 0,0967 0,0967 0,0967 0,0967 0,0953 50,6

QRS 0,045 0,0433 0,04 0,045 0,0467 0,0433 0,04388333 50,5

PAS 51,5 51,21 49,94 51,5 51,67 51,73 51,2583333 -54,9

PAD 17,63 17,53 17,11 17,51 17,58 17,74 17,5166667 -76,6

QTc 0,1772328 0,1775377 0,1731252 0,1711921 0,1716398 0,1713345 0,17367703 31,4



6 minutos

QT 0,1417 0,1417 0,145 0,1433 0,1433 0,145 0,14333333 43,6

RR 0,345 0,345 0,34 0,3433 0,3416 0,3433 0,34303333 84,6

PR 0,0917 0,095 0,1 0,0967 0,0967 0,095 0,09585 51,4

QRS 0,04 0,0417 0,0417 0,045 0,045 0,0417 0,04251667 45,9

PAS 53,05 53,86 54,61 54,72 54,09 53,51 53,9733333 -52,5

PAD 17,63 18,38 18,08 18,26 18,2 17,8 18,0583333 -75,9

QTc 0,1691999 0,1691999 0,1735621 0,1712513 0,1713931 0,1732829 0,17131484 29,6

FC 173,91304 173,91304 176,47059 174,77425 175,64403 174,77425 174,914867 -45,8

7 minutos

QT 0,1517 0,1533 0,1533 0,1517 0,155 0,153 53,3

RR 0,3683 0,3666 0,37 0,3716 0,3683 0,36896 98,6

PR 0,0983 0,0983 0,095 0,1 0,0967 0,09766 54,3

QRS 0,0383 0,0417 0,045 0,04 0,0383 0,04066 39,5

PAS 52,3 55,53 55,65 54,55 51,09 53,824 -52,7

PAD 17,28 17,28 17,51 17,22 17,17 17,292 -76,9

QTc 0,1791783 0,1812077 0,1809291 0,1789121 0,183076 0,18066064 36,7

FC 162,91067 163,66612 162,16216 161,46394 162,91067 162,622713 -49,6

8 minutos

QT 0,155 0,1533 0,1517 0,1533 0,155 0,15366 53,9

RR 0,3983 0,4 0,3933 0,3933 0,3966 0,3963 113,3

PR 0,1017 0,105 0,1083 0,105 0,1033 0,10466 65,3

QRS 0,0433 0,0417 0,0417 0,045 0,045 0,04334 48,7

PAS 55,53 54,03 53,92 55,24 55,47 54,838 -51,8

PAD 16,65 16,24 17,11 16,65 16,65 16,66 -77,8

QTc 0,1807021 0,1785934 0,1772277 0,1790969 0,180831 0,17929025 35,7

FC 150,64022 150 152,5553 152,5553 151,28593 151,407351 -53,1

9 minutos

QT 0,1517 0,15 0,1517 0,15 0,1533 0,15134 51,6

RR 0,4066 0,4066 0,4116 0,4166 0,4166 0,4116 121,5

PR 0,11 0,1067 0,1083 0,1067 0,11 0,10834 71,2

QRS 0,04 0,0433 0,0433 0,045 0,04 0,04232 45,2

PAS 53,34 55,41 55,7 55,18 53,86 54,698 -51,9

PAD 16,24 16,42 16,42 16,36 16,07 16,302 -78,3

QTc 0,1762481 0,174273 0,1758894 0,1735687 0,1773872 0,17547327 32,8

FC 147,56517 147,56517 145,77259 144,02304 144,02304 145,789806 -54,9

10 minutos

QT 0,1517 0,15 0,1533 0,15 0,1567 0,15234 52,6

RR 0,44 0,4383 0,4366 0,4383 0,435 0,43764 135,5

PR 0,1133 0,1133 0,115 0,11 0,1133 0,11298 78,5

QRS 0,04 0,0417 0,045 0,0417 0,04 0,04168 43,0

PAS 53,74 55,93 56,11 54,84 54,15 54,954 -51,7

PAD 15,55 15,9 16,07 15,73 16,3 15,91 -78,8

QTc 0,1739443 0,172106 0,1760063 0,172106 0,18002 0,17483652 32,3

FC 136,36364 136,89254 137,42556 136,89254 137,93103 137,101062 -57,5

12min30s

QT 0,155 0,1517 0,1583 0,155 0,155 55,3

RR 0,4933 0,4933 0,4883 0,4916 0,491625 164,6

PR 0,12 0,12 0,1183 0,12 0,119575 88,9

QRS 0,0433 0,0433 0,0383 0,0417 0,04165 42,9

PAS 57,55 57,66 55,18 57,55 56,985 -49,9

PAD 15,44 15,67 15,44 15,67 15,555 -79,3

QTc 0,1743732 0,1706608 0,1783883 0,1744736 0,17447399 32,0

FC 121,62984 121,62984 122,87528 122,05045 122,046352 -62,2

15 minutos

QT 0,1533 0,1533 0,1567 0,1517 0,15375 54,0

RR 0,5449 0,5416 0,5433 0,5449 0,543675 192,6

PR 0,1183 0,1233 0,125 0,125 0,1229 94,2

QRS 0,0417 0,0383 0,04 0,0417 0,040425 38,7

PAS 57,6 56,45 58,18 57,32 57,3875 -49,5

PAD 15,32 16,01 15,21 15,26 15,45 -79,4

QTc 0,1696248 0,1697966 0,1734719 0,1678544 0,17018693 28,8

FC 110,11195 110,78287 110,43622 110,11195 110,360746 -65,8

20 minutos

QT 0,1533 0,155 0,1533 0,15386667 54,1

RR 0,6266 0,6333 0,6333 0,63106667 239,6

PR 0,135 0,1317 0,1317 0,1328 109,8

QRS 0,0333 0,0383 0,0367 0,0361 23,8

PAS 55,93 58,58 57,89 57,4666667 -49,5

PAD 15,38 14,63 15,03 15,0133333 -80,0

QTc 0,1657208 0,1672618 0,1654273 0,16613665 25,7

FC 95,754868 94,741829 94,741829 95,0795082 -70,6

25 minutos

QT 0,1517 0,1567 0,155 0,15446667 54,7RR 0,7433 0,7433 0,7299 0,73883333 297,6

PR 0,14 0,1367 0,14 0,1389 119,4

QRS 0,0383 0,0367 0,0317 0,03556667 22,0

PAS 54,78 54,84 52,76 54,1266667 -52,4

PAD 12,73 13,02 13,31 13,02 -82,6

QTc 0,159389 0,1646424 0,1633508 0,1624607 22,9

FC 80,721109 80,721109 82,203042 81,2150862 -74,9

30 minutos

QT

RR

PR

QRS

PAS

PAD

QTc

FC

6 minutos

QT 0,1417 0,1417 0,145 0,1433 0,1433 0,145 0,14333333 43,6

RR 0,345 0,345 0,34 0,3433 0,3416 0,3433 0,34303333 84,6

PR 0,0917 0,095 0,1 0,0967 0,0967 0,095 0,09585 51,4

QRS 0,04 0,0417 0,0417 0,045 0,045 0,0417 0,04251667 45,9

PAS 53,05 53,86 54,61 54,72 54,09 53,51 53,9733333 -52,5

PAD 17,63 18,38 18,08 18,26 18,2 17,8 18,0583333 -75,9

QTc 0,1691999 0,1691999 0,1735621 0,1712513 0,1713931 0,1732829 0,17131484 29,6

FC 173,91304 173,91304 176,47059 174,77425 175,64403 174,77425 174,914867 -45,8

7 minutos

QT 0,1517 0,1533 0,1533 0,1517 0,155 0,153 53,3

RR 0,3683 0,3666 0,37 0,3716 0,3683 0,36896 98,6

PR 0,0983 0,0983 0,095 0,1 0,0967 0,09766 54,3

QRS 0,0383 0,0417 0,045 0,04 0,0383 0,04066 39,5

PAS 52,3 55,53 55,65 54,55 51,09 53,824 -52,7

PAD 17,28 17,28 17,51 17,22 17,17 17,292 -76,9

QTc 0,1791783 0,1812077 0,1809291 0,1789121 0,183076 0,18066064 36,7

FC 162,91067 163,66612 162,16216 161,46394 162,91067 162,622713 -49,6

8 minutos

QT 0,155 0,1533 0,1517 0,1533 0,155 0,15366 53,9

RR 0,3983 0,4 0,3933 0,3933 0,3966 0,3963 113,3

PR 0,1017 0,105 0,1083 0,105 0,1033 0,10466 65,3

QRS 0,0433 0,0417 0,0417 0,045 0,045 0,04334 48,7

PAS 55,53 54,03 53,92 55,24 55,47 54,838 -51,8

PAD 16,65 16,24 17,11 16,65 16,65 16,66 -77,8

QTc 0,1807021 0,1785934 0,1772277 0,1790969 0,180831 0,17929025 35,7

FC 150,64022 150 152,5553 152,5553 151,28593 151,407351 -53,1

9 minutos

QT 0,1517 0,15 0,1517 0,15 0,1533 0,15134 51,6

RR 0,4066 0,4066 0,4116 0,4166 0,4166 0,4116 121,5

PR 0,11 0,1067 0,1083 0,1067 0,11 0,10834 71,2

QRS 0,04 0,0433 0,0433 0,045 0,04 0,04232 45,2

PAS 53,34 55,41 55,7 55,18 53,86 54,698 -51,9

PAD 16,24 16,42 16,42 16,36 16,07 16,302 -78,3

QTc 0,1762481 0,174273 0,1758894 0,1735687 0,1773872 0,17547327 32,8

FC 147,56517 147,56517 145,77259 144,02304 144,02304 145,789806 -54,9

10 minutos

QT 0,1517 0,15 0,1533 0,15 0,1567 0,15234 52,6

RR 0,44 0,4383 0,4366 0,4383 0,435 0,43764 135,5

PR 0,1133 0,1133 0,115 0,11 0,1133 0,11298 78,5

QRS 0,04 0,0417 0,045 0,0417 0,04 0,04168 43,0

PAS 53,74 55,93 56,11 54,84 54,15 54,954 -51,7

PAD 15,55 15,9 16,07 15,73 16,3 15,91 -78,8

QTc 0,1739443 0,172106 0,1760063 0,172106 0,18002 0,17483652 32,3

FC 136,36364 136,89254 137,42556 136,89254 137,93103 137,101062 -57,5

12min30s

QT 0,155 0,1517 0,1583 0,155 0,155 55,3

RR 0,4933 0,4933 0,4883 0,4916 0,491625 164,6

PR 0,12 0,12 0,1183 0,12 0,119575 88,9

QRS 0,0433 0,0433 0,0383 0,0417 0,04165 42,9

PAS 57,55 57,66 55,18 57,55 56,985 -49,9

PAD 15,44 15,67 15,44 15,67 15,555 -79,3

QTc 0,1743732 0,1706608 0,1783883 0,1744736 0,17447399 32,0

FC 121,62984 121,62984 122,87528 122,05045 122,046352 -62,2

15 minutos

QT 0,1533 0,1533 0,1567 0,1517 0,15375 54,0

RR 0,5449 0,5416 0,5433 0,5449 0,543675 192,6

PR 0,1183 0,1233 0,125 0,125 0,1229 94,2

QRS 0,0417 0,0383 0,04 0,0417 0,040425 38,7

PAS 57,6 56,45 58,18 57,32 57,3875 -49,5

PAD 15,32 16,01 15,21 15,26 15,45 -79,4

QTc 0,1696248 0,1697966 0,1734719 0,1678544 0,17018693 28,8

FC 110,11195 110,78287 110,43622 110,11195 110,360746 -65,8

20 minutos

QT 0,1533 0,155 0,1533 0,15386667 54,1

RR 0,6266 0,6333 0,6333 0,63106667 239,6

PR 0,135 0,1317 0,1317 0,1328 109,8

QRS 0,0333 0,0383 0,0367 0,0361 23,8

PAS 55,93 58,58 57,89 57,4666667 -49,5

PAD 15,38 14,63 15,03 15,0133333 -80,0

QTc 0,1657208 0,1672618 0,1654273 0,16613665 25,7

FC 95,754868 94,741829 94,741829 95,0795082 -70,6

25 minutos

QT 0,1517 0,1567 0,155 0,15446667 54,7RR 0,7433 0,7433 0,7299 0,73883333 297,6

PR 0,14 0,1367 0,14 0,1389 119,4

QRS 0,0383 0,0367 0,0317 0,03556667 22,0

PAS 54,78 54,84 52,76 54,1266667 -52,4

PAD 12,73 13,02 13,31 13,02 -82,6

QTc 0,159389 0,1646424 0,1633508 0,1624607 22,9

FC 80,721109 80,721109 82,203042 81,2150862 -74,9

30 minutos

QT

RR

PR

QRS

PAS

PAD

QTc

FC



ANEXO II – PRODUÇÃO CIENTÍFICA ASSOCIADA A ESSA DISSERTAÇÃO

Artigos completos publicados em periódicos:

1. MOSQUEIRA, V. C. F.; LEITE, E. A.; BARROS, C. M.; VILELA, J. M. C.;

ANDRADE, M. S. Polymeric Nanostructures For Drug Delivery: Characterization By

Atomic Force Microscopy. Microscopy & Microanalysis, Inglaterra, v. 11, n. supp 3, p.

36-39, 2005.

2. LEITE, E. A.; VILELA, J. M. C.; MOSQUEIRA, V. C. F.; ANDRADE, M. S. Poly-

Caprolactone Nanocapsules Morphological Features by Atomic Force Microscopy.

Microscopy & Microanalysis, Inglaterra, v. 11, n. supp 3, p. 48-51, 2005.

3. LEITE, E. A. ; GRABE-GUIMARÃES, A.; GUIMARÃES, H. N., MACHADO-

COELHO, G. L. L., BARRAT, G., MOSQUEIRA, V. C. F. Cardiotoxicity reduction

induced by halofantrine entrapped in nanocapsules devices. (Submetido)

Trabalhos completos publicados em eventos nacionais e internacionais

1. LEITE, E. A.; VILELA, J. M. C.; MOSQUEIRA, V. C. F.; ANDRADE, M. S. Poly-

caprolactone nanocapsules morphological features by atomic force microscopy. In:

Third Latin American Symposium on Scanning Probe Microscopy (III LASPM), Ouro

Preto, Minas Gerais, v. 3., p. nn-oo, 2005.

2. LEITE, E. A.; VILELA, J. M. C.; GRABE-GUIMARÃES, A.; MOSQUEIRA, V. C.

F.; ANDRADE, M. S. Poly-epsilon-caprolactone nanocapsules characterization by

atomic force microscopy. In: III Encontro da REDE de Nanobiotecnologia Nacional

(NANOBIOTEC), Águas de São Pedro, São Paulo, v. 3, p. 25-26, 2005.

3. LEITE, E. A.; GRABE-GUIMARÃES, A.; GUIMARÃES, H. N.; MOSQUEIRA, V.

C. F. No dose-dependece response is observed in QT-interval prolongation induced by

halofantrine loaded nanocapsules. In: II Reunião da Rede de Nanotecnologia,

Campinas, São Paulo, v. 2, p. 113-114, 2003.


C. F. Nanoencapsulation reduces QT-interval prolongation of ECG provoked by

Halofantrine in a rat model. In: VI PHARMATECH - Internacional Conference on

Pharmaceutics and Pharmaceutical Technology, 2001, Recife. Proceedings of the VI

Pharmatech and APGI Symposium on Membrane Transport. v. 6, p. 113-114, 2001.


C. F. Entrapment of antimalarial drug in biodegradable nanocapsules reduces side effect

of heart damage. In: II Latin Americam Congress of Artificial Organs and Biomaterial,

2001, Belo Horizonte. Proceedings of the II Latin Americam Congress of Artificial

Organs and Biomaterial. v. 2, 2001.



Resumos apresentados em eventos nacionais

1. LEITE, E. A.; VILELA, J. M. C.; GRABE-GUIMARAES, A.; MOSQUEIRA, V. C.

F., ANDRADE, Margareth Spangler. Halofantrine-Nanocapsules Characterization by

Atomic Force Microscopy. In: 4° Seminário de Encerramento das Atividades da

Segunda Fase da Rede de Nanobiotecnologia, Campinas, São Paulo. Anais do 4°

Seminário de Encerramento das Atividades da Segunda Fase da Rede de

Nanobiotecnologia, p.14, 2005.


C. F. Redução da Cardiotoxicidade do Halofantrino veiculado em Nanocápsulas. In:

XXXVI Congresso Brasileiro de Farmacologia e Terapêutica Experimental, Águas de

Lindóia - SP. Anais do XXXVI Congresso da SBFTE. v. 36, p. 179, 2004.


C. F. Efeitos da nanoencapsulação do halofantrino sobre as alterações do ECG. In:

Congresso da Sociedade Brasileira de Farmacologia e Terapêutica Experimental

(SBFTE), Águas de Lindóias, São Paulo. Anais do Congresso da Sociedade Brasileira

de Farmacologia e Terapêutica Experimental (SBFTE), 2002.

4. GRABE-GUIMARÃES, Andrea; LEITE, E. A.; GUIMARÂES, H. N.;

MOSQUEIRA, Vanessa Carla Furtado. Determinação de Variações do Intervalo QT do

ECG de ratos tratados com diferentes formulações de Halofantrino. In: XVI Reunião

Anual da Federação das Sociedades de Biologia Experimental, Caxambu, Minas

Gerais. Anais da XVI FeSBE. v. 16, p. 176, 2001.

nanocÁpsulas de poli- -caprolactona contendo …‡Ão... · ao prof. homero nogueira guimarães...

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