Mutações

MECANISMOS DE REPARO DO DNA SÍNDROMES DE INSTABILIDADE

CROMOSSÔMICA

Profa. Dra. Ana Elizabete Silva

Departamento de Biologia

TERMINOLOGIA

Mutagênicos: causam mutações de ponto Clastogênicos: causam alterações na

estrutura cromossômica Carcinogênicos: aumentam o risco de

aparecimento de tumores Turbagênicos (aneugênicos): atuam nos

processos envolvidos no fuso celular (aneuploidias)

Citotóxicos: morte celular

Peróxido de hidrogênio: causa danos ao tecidos e ao DNA.

Corantes: geralmente são carcinogênicos; principalmente os corantes fluorescentes são intercalantes do DNA (mutagênicos e carcinogênicos).

Brometo de etídeo, Diaminobenzidina e 5-Bromo-2`-Deoxyuridine-(BrDu) são carcinogênicos e mutagênicos.

Éter: pode provocar lesões no fígado e afetar o sistema nervoso central

Clorofórmio: causa irritação à pele, olhos e trato respiratório, afeta Sistema Nervoso Central, rins, Sistema Cardiovascular e fígado. Pode causar câncer dependendo do nível e duração de exposição.

Fenol: Corrosivo, irritante das membranas mucosas, causa severas queimaduras, afeta o sistema nervoso central, fígado e rim.

Xilol: Afeta o sistema nervoso central. Causa severas irritações na pele, olhos e trato respiratório. Pode ser danoso se absorvido pela pele.

Metanol: Causa irritação na pele, olhos e trato respiratório. Afeta o sistema nervoso e o fígado.

Acrilamida e Bis-acrilamida: são mutagênicas, causa irritação da pele, olhos e trato respiratório. Pode afetar o sistema nervoso central.

PRODUTOS QUÍMICOS USADOS EM LABORATÓRIO

Rev. Nutr. vol.13 no.2 Campinas May/Aug. 2000

-compostos fenólicos, fibras, clorofila, -caroteno, vitaminas (C e E).

(Vit E)

TIPOS DE LESÕES NO DNA

Estimativa: 100.000 lesões célula/dia (quebras SSB, perdas de bases espontâneas, outras lesões)

Exposição ao sol (UV): induz 100.000 fotoprodutos/queraticócito

Preservação da Integridade do Genoma

Mecanismos para manutenção do genoma:

Sistemas de checkpoint e tolerância

Diversos mecanismos de reparo do DNA

Ativação do câncer e senescência, ou morte celular

LESÕES RETARDAM PROGRESSÃO DO CICLO CELULAR

Danos DNA

Bloqueio do

ciclo celular

(Checkpoint)

Reparo do DNA

Apoptose

Doenças genéticas

Câncer

Síndromes de instabilidade cromossômicaEnvelhecimento

ATM

P53

MECANISMOS DE REPARO DO MECANISMOS DE REPARO DO DNADNAReparar danos no DNA surgidos Reparar danos no DNA surgidos

espontaneamente ou induzidos por espontaneamente ou induzidos por mutágenosmutágenos•Reparo diretoReparo direto

•Reparo de pareamento errôneo Reparo de pareamento errôneo (mismatch repair)(mismatch repair)

• Reparo de excisão de basesReparo de excisão de bases

•Reparo de excisão de nucleotídeosReparo de excisão de nucleotídeos

• Reparo de quebras de fita dupla no Reparo de quebras de fita dupla no DNA:DNA:

- Reparo Homólogo ou - Reparo Homólogo ou RecombinaçãoRecombinação

- Reparo da junção das - Reparo da junção das extremidadesextremidades

• reversão ativa da lesão → sem reversão ativa da lesão → sem retirar a base danificada → muito retirar a base danificada → muito eficienteeficiente

• OO66-metilguanina -metilguanina → transição G:C para → transição G:C para A:TA:T (produzida endogenamente ou (produzida endogenamente ou mutagênicos químicosmutagênicos químicos alquilantes) alquilantes)

•Enzima MGMT (metil guanina Enzima MGMT (metil guanina metiltransferase)metiltransferase) → → remove o grupo remove o grupo metilmetil

• alto custo energético → uma alto custo energético → uma molécula da enzima é inativada para molécula da enzima é inativada para cada lesão corrigidacada lesão corrigida

REPARO DIRETOREPARO DIRETO

O6-metil guaninaO6-etil guaninaE.coli e mamíferos

Reparadas pela O6-metilguanina

DNA metiltransferases

(MGMT) 

Transfere grupo alquil (metila) para uma cisteína da DNA metiltransferaseA proteína é inativada

REPARO DIRETOREPARO DIRETO

GG

CC

Agente Agente alquilaalquilantente

GG

CC

CHCH33

O6-Metilguanina

GG

CC

MGMMGMTT

CHCH33

DNA DNA restaurado e restaurado e

enzima enzima inativainativa

GG

CC

CHCH33Reconhecimento Reconhecimento

da base alterada e da base alterada e transferência do transferência do grupo metil para grupo metil para

resíduo de resíduo de cisteína da MGMTcisteína da MGMT

Reparo Reparo DiretoDireto

MGMMGMTT

• reparo pós-replicação: bases incorporadas erroneamente no DNA durante a replicação (DNA pol: 1 base errada na cadeia filha/10 milhões pb)REVISÃO DE PROVA “PROOFREADING”: DNA pol com atividade exonuclease 3’ 5’: corrige 99,9% dos erros de replicação

• eliminação de bases mau pareadas e alças de deleção/inserção• atua na cadeia recém-

sintetizada → →

logo após a replicação do DNAlogo após a replicação do DNA

•Genes em humanos: MSH, MLH e PMS → → as proteínas formam complexos as proteínas formam complexos (heterodímeros)(heterodímeros)

•Genes em procariotos: MutS, MutL e MutH

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO

MISMATCH REPAIR - MMRMISMATCH REPAIR - MMR

Deslizamentos da DNA Deslizamentos da DNA

Polimerase em regiões de Polimerase em regiões de microssatélite microssatélite sofre sofre deslocamento e produz deslocamento e produz filamento de DNA com bases filamento de DNA com bases extras extras formam alças formam alças

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO

MISMATCH REPAIR - MMRMISMATCH REPAIR - MMR

Câncer de cólon não-poliposo Câncer de cólon não-poliposo familial: instabilidade de familial: instabilidade de microssatélitesmicrossatélites-70 a 85% de risco70 a 85% de risco- mutações em mutações em MLH1 e MLH2MLH1 e MLH2 são mais comunssão mais comuns

Mutações em genes MMR segregam com a síndrome de predisposição ao câncer colorretal não polipose (HNPCC) maioria dos pacientes são heterozigotos para mutações recessivas na linhagem germinativa em genes MMR (MLH, MSH, PMS)

células tumorais sofrem perda do alelo normal e exibem instabilidade de microssatélites números variáveis de repetições de microssatélites nas células tumorais

REPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEOREPARO DE PAREAMENTO ERRÔNEO

GG

AA

5’ 3’

Cadeia filhaCadeia filha

Cadeia Cadeia parentalparental

Base errada

MSH3

Reconhecimento Reconhecimento do dano e corte do dano e corte na cadeia filhana cadeia filha

GG

AAMSH2MSH2

MSH6

AA

GG Excisão de Excisão de fragmento de 100 fragmento de 100

a 1000pb a 1000pb contendo a base contendo a base

incorretaincorreta

Fita reparadaFita reparadaTT

AA

MLH2 PMS2

Síntese de DNA e Síntese de DNA e ligação da fita ligação da fita reparadareparada

AA

DNA pol DNA pol //

DNA ligase

ETAPAS COMUNS

etapa 1 = incisão (endonuclease) e excisão (exonuclease)

etapa 2 = ressíntese do DNA (DNA polimerases β, δ, ε)

etapa 3 = ligação das extremidades (DNA ligases)

REPAROS DE EXCISÃO:

Reparo de excisão de bases

Reparo de excisão de nucleotídeos

REPARO POR EXCISÃO DE BASES - REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBER

• reparo de danos causados por agentes endógenos (danos oxidativos (ROS) oxigênio reativo,radicais livres H2O2, hidrólises) que modificam a estrutura das bases

• reparo de danos induzidos por radiação ionizante e agentes alquilantes

• rrealizado pelas DNA glicosilases: cada DNA glicosilase (~ 8 genes diferentes) reconhece uma base alterada no DNA e catalisa sua remoção por hidrólise

•Ex.: uracila-DNA-glicosilase remove a uracila do DNA remove a uracila do DNA (desaminação da C (desaminação da C U) U) transição GC transição GC AT AT

- quebram ligações base-açúcar

- liberam as bases gerando sítios apurínicos ou apirimidínicos (sítios AP)

- sítio reparado por endonucleases específica

REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBASES - BER

•Etapas:

• remoção da base danificada (DNA glicosilase) sítio AP

• incisão do sítio AP na porção 5’ (endonuclease)

• excisão do terminal 5’ e remoção (exonuclease) gerando lacuna de 1 nucleotídeo (via curta) ou 2-12 nucleotídeos (via longa)

• síntese DNA (DNA polimerase)

• ligação da cadeia (DNA ligase)

REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE BASES - BERBASES - BER

*

Base danificada

DNA DNA glicosilasglicosilas

ee

ReconhecimenReconhecimento e formação to e formação

do sítio APdo sítio AP

APE1

ReconhecimenReconhecimento e incisão 5’ to e incisão 5’

do sítio APdo sítio AP

XRCCXRCC11

DNA DNA polpol

Excisão da Excisão da porção açúcar-porção açúcar-P e síntese de P e síntese de

DNADNA

XRCCXRCC11

DNA DNA ligase ligase

IIIIII

Ligação da Ligação da cadeiacadeia

Short-patch Short-patch

Quebra de cadeia simples

XRCCXRCC11

PARPPARPReconhecimReconhecim

ento da ento da quebraquebra

PNKPNK Incisão 5’Incisão 5’

PCNPCNAA

DNA polDNA pol

FENFEN11 Síntese Síntese

DNA e DNA e excisãoexcisão

DNA DNA ligase Iligase I

Long-patchLong-patch

Ligação Ligação da da

cadeiacadeia1 nucleotídeo

2-13 nucleotídeos

REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NERNER• remoção de adutos no DNA remoção de adutos no DNA distorção da distorção da

dupla hélicedupla hélice

• dímeros de pirimidina (radiação UV) , HAP, dímeros de pirimidina (radiação UV) , HAP, cisplatinacisplatina

• fatores ambientaisfatores ambientais

• principal mecanismo de reparoprincipal mecanismo de reparo

• deficiência: doenças genéticasdeficiência: doenças genéticas

•realizado pelo complexo multienzimático XPA-XPG (humanos)

•Bactérias: complexo UVrA, UVrB, UVrC e UVrD

• remove 22-30 nucleotídeos

Xeroderma Pigmentoso Xeroderma Pigmentoso

-Mutações em XPA-XPGMutações em XPA-XPG

- 1000 a 4000X o risco de câncer de pele 1000 a 4000X o risco de câncer de pele exposição solar ou irradiação UV exposição solar ou irradiação UV

Etapas: Reconhecimento da lesão no DNA (complexo XPA-XPC)

ligam-se ao DNA danificado abertura da dupla hélice atividade de helicase

XPB e XPD Dupla incisão na cadeia danificada: 3’ (XPG) e 5’ (XPF) Excisão remoção do segmento de DNA Síntese de DNA DNA polimerase Ligação da cadeia DNA ligase

REPARO POR EXCISÃO DE REPARO POR EXCISÃO DE NUCLEOTÍDEOS - NUCLEOTÍDEOS - NERNER

Reparo por excisão de nucleotídeos (NER)

Reconhecimento dano (XPA-XPC)→ interação com TFIIH →atividade de helicase

ERCC1-XPF: endonuclease que corta a fita em 5’

XPG: endonuclease que corta a fita em 3’

DNA pol, PCNA, RPA e RFC: síntese da fita nova

Ligase

Fragmento 26-27 nucleotídeos

SÍNDROMES ASSOCIADAS A DEFEITOS NO NER

Reconhecimento da lesão

Incisão

Excisão: remoção dano

Síntese reparo

http://www.uenf.br/Uenf/Downloads/LBT_4516_1187792657.pdf

COMPARAÇÃO ENTRE OS REPAROS BER E NER

REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA DUPLA

• DSB (quebra fita dupla):DSB (quebra fita dupla): lesão espontânea lesão espontânea induzida por radicais de Oinduzida por radicais de O22 livres, replicação do livres, replicação do DNA e agentes genotóxicos como a radiação DNA e agentes genotóxicos como a radiação ionizanteionizante

• causa de aberrações cromossômicascausa de aberrações cromossômicas

• Duas vias principais em mamíferos:Duas vias principais em mamíferos:

•Reparo recombinação homóloga (RH)Reparo recombinação homóloga (RH)

pareamento com o cromossomo homólogo intacto

• Reparo de ligação das extremidades não- Reparo de ligação das extremidades não- homóloga (NHEJ)homóloga (NHEJ) religação direta das extremidades quebradas

REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA REPARO DE QUEBRAS NO DNA FITA DUPLA DUPLA •Reparo homólogo (RH) Reparo homólogo (RH) Etapas

•Reconhecimento da quebra e pareamento do cromossomo homólogo intacto com o cromossomo que apresenta a quebra dupla

•Degradação das extremidades danificadas

•Deslocamento da cromátide-irmã intacta para o sítio a ser reparado

•A cromátide-irmã serve como molde para síntese de DNA restaura a sequência original

•Ligação das extremidades

REPARO HOMÓLOGOREPARO HOMÓLOGO

Radiação ionizante

CromátidCromátides irmãses irmãs

Quebra de Quebra de cadeia cadeia dupladupla

Degradação Degradação 5’-3’5’-3’Rad5Rad522

Rad

50 MRE1

1NBS1

BRCA1BRCA1 Rad54Rad54

Invasão Invasão da cadeiada cadeia

BRCABRCA22 Rad51Rad51

DNA DNA polpol

DNA DNA ligaseligase

Síntese de Síntese de DNA e ligação DNA e ligação das cadeiasdas cadeias

Reparo Reparo DNA com DNA com fidelidadefidelidade

ProcessamenProcessamento das to das

extremidadeextremidadess

LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-LIGAÇÃO DAS EXTREMIDADES NÃO-HOMÓLOGASHOMÓLOGAS

DNA fita duplaDNA fita dupla

Agente Agente danificantedanificante

Quebra de cadeia Quebra de cadeia dupladupla

DNA DNA PKc1PKc1

KU80KU70

KU80KU70

XRCC4XRCC4

DNA ligase DNA ligase IVIV Ligação das Ligação das

extremidadextremidadeses

DNA reparado DNA reparado com baixa com baixa fidelidadefidelidade

Ligação c/ RPA (proteína de replicação) e RAD51 (recombinase)

Facilita o encontro da cromátide-irmã e invasão

Células em proliferação

Células em proliferação ou não

Ligação das extremidades pela LIG4+XRCC4

Modificação das extremidades: KU70 e KU80 recruta DNA-PK (proteína quinase) complexo

Ligação das extremidades pela LIG1

http://www.sbbq.org.br/revista/mtdidaticos/Env.pdf

CLASSES DE DISTÚRBIOS AFETANDO A

MANUTENÇÃO DO GENOMA

1. Envelhecimento acelerado: síndromes progeróides

2. Tipos de câncer:

3. Envelhecimento acelerado e câncer

SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: ENVELHECIMENTO (PROGÉRIA)

Síndrome Genes mutados Processo Afetado Sintomas

Cockayne CSA, CSB, XPB, NER

XPD, XPG

Tricotiodistrofia XPB, XPD, TTDA NER

Rothmund-Thomson RECQL4 Deficiência helicase

(reparo de danos oxidativos)

Hutchison-Gilford LMNA função da lâmina nuclear

(Progéria)

SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: CÂNCER

Síndrome Genes mutados Processo Afetado

Câncer mama BRCA1, BRCA2 Reparo Homólogo

familial (quebras duplas)

Li-Fraumeni TP53 Checkpoint G1-S

Câncer colorretal não- MSH2, MLH1 Mismatch repair

polipose hereditário (MMR)

(HNPCC)

SÍNDROMES COM DEFEITOS NA MANUTENÇÃO DO GENOMA: PROGÉRIA + CÂNCER

Síndrome Genes mutados Processo Afetado

Xeroderma pigmentoso XPA-XPG NER

S. Bloom BLM Deficiência helicase

(recombinação mitótica)

Anemia de Fanconi FANC Reparo DNA crosslink

Ataxia telangiectasia ATM Reparo DSB

S. Werner WRN Deficiência helicase

(recombinação/reparo DNA

manutenção dos telômeros)

Adolescência - 40 anos

Xeroderma Pigmentoso

Síndrome de Cockaine

Tricotiodistrofia

Anemia de Fanconi

Ataxia telangiectasia

Síndrome de Bloom

SÍNDROMES DE INSTABILIDADE CROMOSSÔMICA

defeitos nos mecanismos de reparo e replicação do DNA

freqüência aberrações cromossômicas

incidência câncer

AR

Clínica

manifestações cutâneas (1,5 anos)

anomalias oculares (4 anos)

anomalias neurológicas progressiva (6 meses)

primeiro câncer de pele (8 anos)

Xeroderma (pele seca)

Incidência:

1/250.000 (USA) e 1/40.000 (Japão)

Células XP: sensíveis a radiação UV indivíduos incapazes reparar dímeros TT: risco ↑ câncer de pele (2000x)

XP: defeito no reparo de excisão de nucleotídeos (NER)

XERODERMA PIGMENTOSO (XP)

grupos de complementação: XPA-XPG diferenças clínicas defeitos enzimáticos incapacidade de excisar danos induzidos pela luz UV e mutagênicos químicos

diagnóstico exposição a luz solar

tratamento proteção da pele da luz solar

chapéus

óculos que absorvem luz UV

bloqueadores solares

roupas protetoras

acompanhamento periódico por dermatologista

Síndrome de Cockayne

Características:- Anormalidades esqueléticas: face

parecida com a de um passarinho

- Cáries, cifose e osteoporose em pacientes de idade avançada.

- Degeneração neurológica progressiva: início precoce, desenvolvimento psicomotor atrasado, defeitos no modo de andar e retardo mental.

- Microcefalia- Perda da audição, retinopatia

pigmentar, cabelos finos e cataratas

Morte: 12,5 anos

principais causas: pneumonia e infecções respiratórias

Alterações genéticas: Dois genes com mutações foram

identificados nesta síndrome: CSA e CSB.

O gene CSA, responsável pela síndrome de Cockayne do tipo 1→ cromossomo 5.

O gene CSB, responsável pela síndrome de Cockayne do tipo 2 → cromossomo 10q11.

Reparo defeituoso: NER

TRICOTIODISTROFIA (TTD)

AR

Clínica

cabelos quebradiços (deficientes S)

iquitiose (escamas de peixe)

retardo mental e físico

fácies distintivas orelhas protuberantes queixo retraído

descrita 1968 Pollitt e colaboradores

1/2 pacientes fotossensibilidade NER defeituoso

TTD não desenvolvem câncer de pele

TTD

XPB XPD

Helicases do fator de reparo/transcrição TFIIH

30 grupo de complementação: TTD-A (fator de transcrição basal)

AR

Clínica

anemia

alterações da pigmentação da pele (64%)

baixa estatura (62%)

malformações do rádio (50%)

anomalias oculares (41%), renais (34%),

microcefalia (37%), deficiência mental (25%)

90% anemia aplástica

ANEMIA DE FANCONI (FA)

descrita 1927 Guido Fanconi

incidência: 1/22.000 a 1/476.000 indivíduos

8 grupos de complementação: FA-A, FA-B, FA-C, FA-D1, FA-D2, FA-E, FA-F e FA-G heterogeneidade genética

células FA: sensíveis à agentes químicos que causam ligações cruzadas entre as fitas de DNA: mitomicina C (MMC), diepoxibutano (DEB), mostarda nitrogenada (NM), cisplatina , ...

freqüência de neoplasias: leucemias e tumores hepáticos

quebras cromossômicas espontâneas, figuras tri, quadri e multirradiais.

AR

Clínica

peso ao nascimento

retardo de crescimento pré e pós-natal

(145 cm H; 130 cm M)

telangiectasias e fotossensibilidade (borboleta)

cabeça alongada, microcefalia, inteligência normal

imunodeficiência: infecções (respiratórias e gastrointestinais)

SÍNDROME DE BLOOM (SB)

Incidência: 1/58.000 judeus

asquenazim

figuras quadrirradiais

mutações no gene BLM 15q26.1 DNA helicase ( RecQ) papel na replicação e reparo do DNA

Risco maior de câncer: carcinomas, leucemias e linfomas

AR

Clínica

-ataxia cerebelar (12-14 meses) disfunção neuromotora

-telangiectasia olhos e pele (3 e 5 anos) retardo de crescimento (70%)

incidência neoplasias (linfoma e leucemia linfóide) e imunodeficiências

incidência: 1/40.000

risco câncer de mama heterozigotos AT

ATAXIA TELANGIECTASIA (AT) SÍNDROME DE LOUIS-BAR

células AT sensíveis a radiação ionizante e agentes radiomiméticos (N-acetoxi-N-2-acetil-2-aminofluoreno - 4-NQO)

linfócitos AT rearranjos espontâneos dos cromossomos 7 e 14

4 grupos de complementação: A, C, D e E mutações gene ATM

gene ATM (11q22-23) diversas vias

controle transdução de sinal

checkpoint ciclo celular

resposta celular ao dano no DNA induzido por radiação

gene ATM interage p53 na checagem G1-S e mutações no gene ATM abolem mecanismo de reparo pré-síntese de DNA

defeito mecanismo de reparo do DNA ou defeito na replicação DNA

Doença Características Tipo de reparo do defeito Xeroderma Pigmentoso

Tumores de pele, fotossensibilidade,

cataratas, anomalias neurológicas

Defeitos de reparo de excisão de nucleotídeo, incluindo mutações nos

genes de endonuclease e helicase (XPA-XPG)

Anemia de Fanconi Anemia, suscetibilidade a

leucemia, malformações nos membros, rins e coração,

instabilidade cromossômica

Até oito genes diferentes (FANCA-FANCH) podem estar envolvidos, mas

sua função exata no reparo do DNA ainda não é conhecida

Síndrome de Bloom Deficiência de crescimento, imunodeficiência,

instabilidade cromossômica, aumento de incidência de

câncer

Mutações na família reqQ helicase Gene BLM

Síndrome de Werner Cataratas, osteoporose, aterosclerose, perda de

elasticidade da pele, baixa estatura, diabetes, aumento

de incidência de câncer

Mutações na família reqQ helicase Gene WRN

Ataxia telangiectasia Ataxia cerebelar, telangiectasias*, deficiência

imune, aumento de incidência de câncer,

instabilidade cromossômica

Produto do gene normal (ATM) provavelmente está envolvido no

bloqueio do ciclo celular após ocorrer dano ao DNA