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Montagem de Genomas

Prof. Dr. Alessandro Varani UNESP - FCAV

Conceitos da Genômica

O que é um genoma ?

→ O conjunto de DNA que compõe um determinado (micro) organismo

- Cromossomos; - Organelas: Mitocôndria e Cloroplasto; - Plasmídeos; - Vírus (alguns são de RNA e não de DNA); - Bacteriófagos (fagos)

→ Essencialmente um conjunto de strings

- Usando as 4 letras do alfabeto de DNA (A,G,C,T)

Conceitos da Genômica

Tamanho de Genomas

→ A quantidade de DNA de um genoma haploide é designada de valor C.

→ O valor C é constante dentro de uma espécie, porém variável entre espécies

Escala de tamanho

- 1 Kb = 1,000bp; - 1 Mb = 1,000,000bp; - 1 Gb = 1,000,000,000bp

Tamanhos dos Genomas (procariotos)

http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics/topics/chroms-genes-prots/genomes.html

Cópias do genoma

Leituras ou

”reads"

Montagem

Sequenciamento Processamento dos dados

Aula de hoje Como montar ?

→ Reconstruir a sequência do genoma, a partir

de abordagens computacionais

Como ?

→ Quais os problemas que podem ocorrer ?

Como solucioná-los ?

Objetivos

http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n4/full/nmeth.1935.html

Montagem de Genoma em uma figura (1)

Montagem de Genoma em uma figura (2)

Ideal Mundo Real

Leituras não ambíguas e em erros

Leituras ambíguas e pequenas e com com

problemas de qualidade ou erros

1. O princípio

Shotgun – Craig Venter (1995) 1995 - Haemophilus influenzae: 1,830,140 bp

1. O princípio

Shotgun – Craig Venter (1995) 1995 - Haemophilus influenzae: 1,830,140 bp

nebulizador sonicador

2. Apresentando os ”Vilões”

Ion torrent: 1 Gb em 2-4 horas (leitura ~200 bases)

Ion proton: 200 Gb em 2-4 horas

(leitura ~100 bases)

Illumina MiSeq: ~8 Gb em 24 horas (leitura 2x250 bases)

Sequenciadores de DNA de nova geração

2. Apresentando os ”Vilões”

- 454 GS FXL+ : 700Mb em 23h (leituras de até 1kb); - 454 Gs Jr: 35Mb em 10 horas (leituras ~ 400

bases);

- HiScan SQ: 18Gb em 8 dias e meio

(Leitura 2x 100bases)

Sequenciadores de DNA de nova geração

2. Apresentando os Vilões Sequenciadores de DNA de nova geração

Como centenas de leituras de 50 pb - 450 pb podem reconstituir um genoma de 5 Mb, 10 Mb, 60Mb ou 3Gb (ou

mais) ??

Porém, quanto maior a leitura melhor e mais fácil será o processo!

2. Apresentando o futuro ”Mocinho”

Sequenciadores de DNA leituras longas

Single Molecule, Real Time (SMRT) DNA Sequencing

Leitura do DNA 99,999% correta (?)

1/10 do custo !!!

Pacific Biociences – PacBio RS Tempo de corrida de 2 a 4 horas

Leituras com tamanho médio de 4.500 pb Leituras podem chegar até 12,500 pb !!!

~230 Mb por corrida

2. Apresentando o futuro ”Mocinho”

Sequenciadores de DNA leituras longas

3. O objetivo (princípio)

O inverso do picador de papel...

Genoma

Reconstituído

ou ”montado”

Montagem

Reads

(leituras)

O fluxo de todo esse processo atualmente

”In a nutshell”

shotgun montagem

Bioinformática Você !

- Qual o melhor algoritmo ?

- Quais as melhores abordagens de sequenciamento ? - Depois de montado o genoma, como poderemos

inferir se a montagem reflete realmente a biologia ?

Dentre outros problemas: regiões repetidas (duplicações, tandens), variação de GC%, poliploidia e

limitações técnicas das tecnologias.

Um dos mais complexos procedimentos computacionais na biologia.

Sequenciadores Leituras curtas

(~500bp)

O fluxo de todo esse processo

”In a nutshell”

montagem

Bioinformática Você !

Sequenciadores Leituras longas

(~15.000bp)

A promessa de um processo menos “custoso”

Em um futuro (presente?) não muito distante...

Sequenciadores Leituras curtas

(~500bp)

Formato FASTQ (o papel picado)

Como os reads (papel picado) podem ser sequenciados ?

Voltamos a falar lá na frente…

Trimagem (arrumando o papel picado)

→ Trimagem de qualidade:

- Baseado nos scores de qualidade;

→ Trimagem de ambiguidade:

- Remover NNs;

→ Remoção de adaptadores e/ou contaminantes;

→ Remoção de bases:

- Remove um número específicos de bases na posição 5’ ou 3’;

→ Trimagem por tamanho

- Remove reads um tamanho específico (menores que 50 pb)

Programas para Trimagem

→ Seqyclean (linha de comando)

Abordagem de Montagem de Genomas

(1) De novo

(2) Montagem usando uma referência

Montando um genoma (a analogia do ferro velho)...

Pavel A. Pevzner - Computational Molecular Biology: An Algorithmic Approach

Filtragem

-Remoção de baixa

qualidade;

-Contaminantes.

Montando um genoma (a analogia do ferro velho)...


Montando um genoma (a analogia do ferro velho)

O resultado da montagem esperado



O resultado da montagem inesperado!


?


Abordagem comparativa – Procurando um Genoma de Referência



Abordagem comparativa – Genoma de Referência



Abordagem comparativa – Genoma Referência



Os problemas de usar um Genoma Referência


Nem sempre existe um genoma referência próximo e parecido ao seu.

E muitas vezes não fazemos idéia destas diferenças.

Essas diferenças vão influênciar na montagem por referência!

Referências Disponíveis


Os problemas de usar um Genoma Referência


?

referência


Em resumo, alguns princípios:


1) Quanto menores forem as peças (reads

curtos/pequenos) mais complicado será o

processo;

2) Peças maiores facilitam o processo de

montagem;

3) Utilizar uma referência pode ajudar o

processo. Tem que ser muito parecida

(colinearidade, conteúdo gênico, repetições e

etc);

4) Um genoma de referência “distante” vai

certamente induzir a montagens erradas.

ATCGCGAATTCCGATTAGCAGGTACGTAGCTAGACGAGCTAGCTACCGATGCCGATC

Por que é um processo complicado ?

Não sabemos a posição de cada sequência (fragmento) do genoma!

?

Reads

actgcagtctgatgctgatcccatatgcttagacgatgctcagtagagatgac DNA

GAP

Contig

O que acontece durante a montagem ?

Descobrimos a posição de cada sequência (fragmento) do genoma

através da sobreposição, realizadas por um programa de computador

Termos Técnicos em Montagem

→ Read: Fragmento sequenciado, produto do laboratório e do sequenciador. É um arquivo texto, geralmente no formato FASTQ; → Contig/Consenso: Sequência contigua, formada pela sobreposição de um conjunto de reads (alinhamento semi-global – programa de computador para montagem) ; → Singlet: Read que não apresenta nenhuma sobreposição. No resultado final da montagem está sozinho e solto nos arquivos gerados. Pode representar uma região do genoma com baixa cobertura; → Gap: Região do genoma que ainda não foi sequenciada; → Cobertura: Quantidade de bases sequenciadas dividido pelo tamanho do genoma. De 8X a 10X para Sanger. 15X para 454 e mais de 30X para Illumina.


→ Genoma Draft: Em geral é feito o sequenciamento e montagem, porém não são resolvidos os gaps, repetições, duplicações. Portanto o resultado final geralmente é um arquivo FASTA com centenas ou milhares de contigs representando o genoma bruto. Nada de cromossomos, replicons e plasmídeos separados, esta tudo junto e misturado e as regiões repetidas geralmente estão colapsadas em únicos contigs; → Genoma Fechado: Cromosssomos, replicons, plasmídeos já estão montados em 1 contig para cada, porém ainda pode existir pequenos gaps, regiões repetidas ou não 100% resolvidas e regiões de baixa cobertura. A próxima etapa é a finalização (finishing);

→ Genoma Completo e Finalizado: Cromosssomos, replicons, plasmídeos montados em 1 contig para cada, sem gaps, com alta cobertura e qualidade.

Fatores Técnicos a serem considerados na escolha

do organismo/micro-organismo

→ Total de bases: Quanto maior o genoma a ser sequenciado provavelmente (99,99%) mais difícil será o processo de montagem;

→ Número de cromossomos: Quantos mais cópias dos cromossomos mais complicado fica o processo. Fase dicariótioca (fungos);

→ Projeto procariotos: cultura axénica (pura);

→ Projeto eucariotos: Genoma haplóide se possível;

Experimentos de bancada que podem ajudar a resolver estas questões: PFGE e ensaios de restrição;

Conhecer o número de genes (esperado): Auxilia no processo de montagem e a estimar o tamanho do genoma.

Exemplo: contig, reads, gap, singlets e cobertura

Genoma Draft

Exemplo: Visualização do resultado da montagem (CONSED) e cobertura

Conceito de Scaffold

Ordenando os contigs


Vínculos entre os reads!

1) Ordenação dos contigs;

2) Ajuda a resolver a montagem de regiões repetidas, ambíguas.

Resolvendo o problema dos repeats

Vínculos entre os reads: jumping library

- Bibliotecas mate-paired: 5kb, 10kb até 15kb (illumina) - Sequenciamento de “pontas” de BACs, Cosmídeos e etc (Sanger)

O programa de computador entende esse informação e leva em

consideração no processo de montagem

Exemplo: Vínculos entre os reads

Ordenação dos contigs -> Scaffold

Auxílio na ordenação da montagem e resolução de regiões repetidas

-> Gaps Virtuais: Sabe-se o tamanho ao qual ele corresponde (tamanho do inserto); -> Gaps Reais: Não sabe-se nada a respeito (tamanho). Difícil resolução (primer walking ou re-sequenciamento)

Quais os problemas que podem ocorrer ?

Repetições ou repeats

Ocorrem em praticamente todos genomas já sequenciados!

-> Podem representar mais de 20% em genomas de bactérias;

Quem são: Profagos, transposons e outros EGMs, duplicações e etc.

-> Em algumas plantas e vertebrados podem compor a maior parte do genoma.

Quem são: retrotransposons e outros EGMs, duplicações (poliploidia), microsatélites.

Repetições ou repeats (A analogia do quebra cabeça)

Visualizando Repetições ou repeats em uma montagem

Identificando repeats

-Alinhamentos

-Visualização da montagem

Erros de montagem causados por repeats

Complexidade dos Genomas Bacterianos

depositados no NCBI

Classe I: poucas repetições (rRNAs) (~5kb) -> 69%

Classe II: transposons, duplicações, tandem repeats (~5kb a 7kb) -> 8%

Classe III: profagos, grandes duplicações e tandem repeats (> 7kb) -> 23%

Koren et al., 2013

Programas para Montagem de Genomas

→ 1 geração: Phrap, TIGR assembler, CAP3;

→ 2 geração: Celera Assembler, Arachne, Mira

→ “Novos”: Velvet, Euler, ABySS, CLCBio, ALLPATHS-LG, Newbler, SSPADE … vários, dezenas !

Algoritmos:

de Bruijn Graph e Overlap/Layout/consensus

Uma lista com vários programas montadores:

http://en.wikipedia.org/wiki/Sequence_assembly

a

a

http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n4/full/nmeth.1935.html

Montagem de Genoma em uma figura

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