Florianópolis Santa Catarina

2010

Monitoramento da Lagoa da Conceição, Florianópolis, SC, utilizando biomarcadores de estresse oxidativo em Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791) como indicadores de poluição aquática. Rodrigo Espinosa Souza

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Rodrigo Espinosa Souza

Monitoramento da Lagoa da Conceição, Florianópolis, SC, utilizando biomarcadores de estresse oxidativo em Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791) como indicadores de poluição aquática.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia da Universidade Federal de Santa Catarina, para obtenção de título de mestre em Ecologia. Área de concentração: Ecotoxicologia. Orientador(a): Dr. Danilo Wilhelm Filho

Florianópolis Santa Catarina

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Resumo Os ecossistemas costeiros, em especial regiões estuarinas, são extremamente importantes ecologicamente. Estes locais vêm sofrendo constante pressão pela atividade antrópica e o crescimento urbano desordenado. Na Ilha de Santa Catarina, particularmente a Lagoa da Conceição, tem sido vítima do “boom” populacional e da falta de planejamento para o desenvolvimento da região, com crescente aumento das atividades antrópicas e consequente aumento do impacto sobre o ambiente aquático. Os biomarcadores de estresse oxidativo constituem importante ferramenta na avaliação contaminação de ambientes aquáticos. O presente estudo realizou o monitoramento da contaminação desse ambiente através da análise comparativa (anos 2002 e 2009) dos efeitos dos contaminantes nos biomarcadores de estresse oxidativo existentes no órgão digestório do molusco Anomalocardia brasiliana, o berbigão. Na comparação dos resultados do atual trabalho com os obtidos sete anos atrás (PEREIRA, 2003), houve um acentuado aumento da concentração de coliformes fecais, possivelmente ligados a um aumento generalizado dos biomarcadores de estresse oxidativo, indicando um suposto aumento da contaminação deste ambiente. Em relação à lipoperoxidação (níveis de TBARS), houve um aumento de ∼200% no sítio Pontal da Daniela (ponto controle) e quedas significativas (∼860%) nos sítios Rio Vermelho e Osni Ortiga (∼340%). Ocorreu um aumento dos conteúdos da GSH e das atividades da CAT e da GPx, concomitantemente a queda da atividade da GST e SOD em todos os pontos amostrais. O presente estudo reflete a necessidade de estabelecer um monitoramento periódico deste ambiente lacustre para a avaliação de risco ambiental associado à sua crescente contaminação. Palavras-chave: molusco, biomarcadores de estresse oxidativo, defesas antioxidantes, Lagoa da Conceição.

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Abstract Coastal ecosystems, especially estuarine regions, are extremely important ecologically. These environments have been under constant pressure by human activity and urban sprawl. On the Santa Catarina Island, particularly the Lagoa da Conceição, has been place of the boom in population and lack of planning for the development of the region, with increasing human activities and the consequent increase in the impact on the aquatic environment. Biomarkers of oxidative stress consist of an important tool in assessing contamination of aquatic environments. This study did the contamination monitoring of the environment through the comparative analysis (years 2002 and 2009) of biomarkers of oxidative stress existing in the digestive gland of the clam Anomalocardia brasiliana, the “berbigão”. Comparing the results of the current study with those from seven years ago (PEREIRA, 2003), there was a remarkable enhancement of fecal coliform concentration, the lipoperoxidation (TBARS levels) increased by ∼200% in the Pontal da Daniela (reference site) and significant decreases in the sites Rio Vermelho (∼860%) and in Osni Ortiga (∼340%). Increased of GSH concentrations and activities of CAT and GST together with generally decreased GST and SOD activities were also detected. The results showed a general increase in biomarkers of oxidative stress, indirectly indicating an increase in contamination of the aquatic environment. This study reinforces the urgent necessity to establish a periodic monitoring of this lacustrine environment for the assessment of environmental risk associated with its increased contamination. Keywords: mollusk, biomarkers of oxidative stress, antioxidant defenses, Lagoa da Conceição.

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Índice Resumo........................................................................................05 Abstract.......................................................................................07 Índice...........................................................................................09 Lista de abreviaturas................................................................11 Lista de tabelas..........................................................................13 Lista de figuras..........................................................................15 Agradecimentos........................................................................17 Introdução..................................................................................19 Ecossistema da Lagoa da Conceição.......................................21 Material biológico......................................................................24 Análise de poluição aquática...................................................25 Biomarcadores de estresse oxidativo......................................28 Defesas antioxidantes...............................................................28 Objetivos ....................................................................................31 Metodologia...............................................................................32 Atividades de campo................................................................32 Sítios amostrais..........................................................................33 Atividade de laboratório..........................................................36 Resultados..................................................................................43 Parâmetros físico-químicos......................................................43 Parâmetros microbiológicos.....................................................45 Biomarcadores de estresse oxidativo......................................46 Discussão e conclusões............................................................55 Perspectivas futuras.................................................................67 Referências bibliográficas......................................................68 Anexos........................................................................................77

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Lista de abreviaturas CAT – Catalase CF – Coliformes fecais CT – Coliformes totais DA – Defesas antioxidantes DNA – Ácido desoxidoribonucleico DTNB - 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno

DTPA - Ácido dietilenotriaminopentacético ERO – Espécies reativas de oxigênio GPx – Glutationa peroxidase GR – Glutationa redutase GSSG – Glutationa oxidada GSH – Glutationa reduzida GST – Glutationa S-transferase GT – Glutationa total MDA - Malonaldeído SOD – Superóxido dismutase TBA – Ácido tiobarbitúrico TBARS – Substâncias que reagem ao Ácido tiobarbitúrico TCA – Ácido tricloroacético TNB - Ânion tiolato

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Lista de tabelas Tab. 01 – Comparação dos parâmetros físico-químicos obtidos em 2002 e 2009. Tab. 02 – Características microbiológicas da água nos sítios amostrados na Lagoa da Conceição e sítio controle. Tab. 03 – Variações das defesas antioxidantes no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana comparando os dados de 2002 e 2009. (Anexos)

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Lista de figuras Fig. 01 – Aspectos externos do molusco Anomalocardia brasiliana. Fig. 02 – Aspecto interno do molusco evidenciando em verde seu órgão digestor, adaptado de PEREIRA (2003). Fig.03 – Efeitos dos xenobiontes nos organismos. Fig. 04 – Imagem de satélite identificando a Baía Norte e o Pontal da Daniela, sítio controle. Fig. 05 – Sítios de coleta na Lagoa da Conceição.

Fig. 06 – Gráfico dos resultados comparativos de TBARS. Fig. 07 – Gráfico dos resultados comparativos de CAT. Fig. 08 – Gráfico dos resultados comparativos de GPx. Fig. 09 – Gráfico dos resultados comparativos de GSH. Fig. 10 – Gráfico dos resultados comparativos de GST. Fig. 11 – Gráfico dos resultados comparativos de GR. Fig. 12 – Gráfico dos resultados comparativos de SOD.

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Agradecimentos Agradeço primeiramente aos meus pais, Darville e Maria Clara, os primeiros mestres da minha vida, que me ensinaram todos os valores fundamentais à minha formação e me deram suporte emocional, financeiro e incentivaram incondicionalmente a lutar sempre pelos meus objetivos. À minha esposa Luana e minha filha Kaiane, por tolerarem e entenderem todos os momentos em que precisei da colaboração delas, no amor e carinho, nos momentos que precisei do silêncio ou mesmo quando tiveram que abrir mão da minha presença em função desse objetivo. Às demais pessoas da minha família, meu irmão Fernando, minha irmã Luciana, à “boadrasta” Sílvia, meus tios, meus avós, especialmente à vó Nunziata, muitas vezes dando apoio financeiro durante o período que tive de abdicar de trabalhos para me dedicar ao estudo. Aos meus padrinhos Jorge e Iná, incentivadores incondicionais da minha carreira de biólogo e professor. Jorge por seus ideais e caráter e Iná por ser sempre um exemplo de vida e de profissional na qual me espelhei para ser o professor que sou hoje. Ao amigo e Professor Danilo Wilhelm Filho, pela paciência, respeito, dedicação, conhecimento, suporte técnico e por me receber no Laboratório de Ecofisiologia Respiratória de portas abertas para desenvolver esse projeto. Aos colegas da equipe do Laboratório de Ecofisiologia Respiratória, que dedicaram grande parte de seu tempo a esse projeto: Patrícia Budni, Ana Maria Moratelli, Thaís Regina Garlet e Eduardo Benedetti Parisotto. Ao corpo docente do Curso de Mestrado em Ecologia, que em todos os momentos deram suporte científico, pelo constante incentivo e compreensão nos momentos de dificuldade e pela humildade de dividir seus conhecimentos atuando como verdadeiros mestres.

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Aos funcionários da POSECO, pelo auxílio e suporte durante o desenvolvimento do projeto. Aos colegas mestrandos, pelos momentos vividos, pelas trocas de experiências e contribuições durante o curso. Aline, Andrea, Áurea, Bruna, Diego, Lobato, Fernando, Lucas, Manoela, Marcelo, Mariana Paz, Polliana, Roona, Tati, Vanessa e, em especial, às colegas Mariana Bender e Mariana Hennemann, meu muito obrigado. À Universidade Federal de Santa Catarina, por proporcionar essa oportunidade a todos nós mestrandos.

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Introdução

Em todo o planeta os recursos hídricos estão sofrendo com o constante aumento populacional humano e as conseqüências de atividades antrópicas. É notável que o ser humano, historicamente, sempre buscou ocupar os espaços próximos a corpos d’água. O crescimento das atividades humanas, principalmente junto às áreas costeiras, traz consigo o uso de um leque de agentes químicos e físicos que acabam alterando a dinâmica desses ambientes. Existem evidências de que estas substâncias químicas, entre elas metais pesados (DI GIULIO, 1989) e poluentes orgânicos, podem gerar espécies reativas de oxigênio (ERO) e danos aos seres vivos (WINSTON, 1991).

Em Florianópolis, a Lagoa da Conceição, constitui em importante sistema lacustre, pois serve de berçário natural para diversos organismos aquáticos, além de constituir uma das mais belas paisagens locais. A ocupação histórica de seu entorno e o constante aumento do turismo na região gera um sério impacto sobre a biota desse ecossistema. A variação sazonal de população e a falta de infra-estrutura (principalmente saneamento) para receber, nos meses quentes, um número elevado de pessoas, acabam refletindo em uma degradação crescente desse ambiente e despejando uma série de agentes contaminantes na água.

A partir da década de 80, surgiram vários estudos envolvendo a participação de agentes poluentes relacionados com a geração de ERO e suas conseqüências patológicas nos organismos. Há um crescente interesse em evidenciar a produção de ERO estimuladas por contaminantes, resultando em danos oxidativos, como um mecanismo de toxicidade em organismos aquáticos expostos à poluição (LIVINGSTONE, 2001). Organismos aquáticos caracterizam-se por apresentar acentuada sensibilidade a modificações dos parâmetros físicos e químicos ambientais (WINSTON, 1991; WALKER et al., 1996). Quando feito de forma regular, o uso sistemático de organismos

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vivos garante avaliações representativas quanto à mudança do ambiente, da qualidade da água e da integridade da biota (WALKER et al., 1996). O conceito de indicador biológico (bioindicador) é fundamental para o êxito de programas de biomonitoramento. Qualquer membro da fauna de macroinvertebrados (moluscos, crustáceos, poliquetas, etc.) ou vertebrados (notadamente peixes), bem como bactérias e protozoários ou integrantes da flora (algas e macrófitas) de um ecossistema aquático, são potenciais organismos bioindicadores da qualidade da água. No entanto, a sensibilidade de um organismo a uma determinada substância tóxica, a facilidade de amostragem e sua representação ecológica no ecossistema em questão, são fatores muitas vezes não muito simples de dimensionar, porém, importantes na escolha do bioindicador (WINSTON, 1991; WALKER et al., 1996). Os bivalves, adicionalmente, por sua característica de organismo filtrador e séssil ocupando o substrato lodoso nas regiões dos manguezais, por possuir uma população representativa ao longo das regiões costeiras e por sua posição trófica superior quando comparados às algas, são eleitos como organismos indispensáveis em estudos de monitoramento ambiental, nas avaliações de bioacumulação e biomagnificação ( WINSTON, 1991; WALKER et al., 1996). Muitos estudos indicam o uso desses organismos como bioindicadores (WILHELM FILHO et al., 2002; PEREIRA, 2003; ZOTTIS, 2005; BIANCHINI et al., 2006; DAFRE, 2006; DI MASCIO et al., 2006) por serem, em sua grande maioria, sésseis e filtradores, melhor refletindo as condições do ambiente em que se encontram. Algumas espécies são mais utilizadas no Brasil, e alguns autores como WILHELM FILHO et al. (2001), ZOTTIS (2005), DAFRÉ et al. (2006) e DI MASCIO et al. (2006) utilizaram o mexilhão Perna perna. As ostras Crassostrea gigas e Crassostrea rhizophorae foram eleitas por ZOTTIS (2005) e BIANCHINI et al. (2006), respectivamente, enquanto que TORRES et al. (2002)

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utilizaram Mytella guyanensis, o marisco-do-mangue como espécie bioindicadora de contaminação aquática. O berbigão, Anomalocardia brasiliana (Gmelin, 1791), organismo eleito para esse estudo e usado por PEREIRA (2003), é um molusco bivalve que se encontra amplamente distribuído ao longo da costa brasileira e constitui um importante recurso alimentar para as comunidades costeiras, além de sua importância ecológica. Por ser um animal filtrador, possui capacidade bioacumulativa, sendo utilizado como biomarcador de substâncias xenobióticas. O órgão digestório é o principal responsável pela acumulação e detoxificação desses xenobióticos (WILHELM FILHO et al.,2001a). Ecossistema da Lagoa da Conceição

A Lagoa da Conceição, na Ilha de Santa Catarina, é na realidade uma laguna ligada ao mar pelo Canal da Barra da Lagoa, apesar de que no Brasil, todos os corpos d’água costeiros ou de interiores são chamados de lagoas. Assim, na zona costeira, as lagoas tanto podem ser lagunas (ligadas com o mar) ou lagos costeiros (isolados do mar). Este corpo lagunar tem aproximadamente 19,2 km2 e se estende por aproximadamente 13,5 km no sentido norte/sul. Sua forma alongada é recortada por dunas, morros e praias (ao leste e ao sul)( PANITZ, 1997).

O solo da Lagoa é arenoso com sedimentos finos, siltosos e matéria orgânica (lodo) nas partes fundas e abrigadas dos ventos, bem como na desembocadura de rios. Os ventos predominantes são de quadrante sul e norte, influenciando muito na dinâmica do sistema, bem como a ação das variações de maré que trazem o aporte de água salgada e levam o sedimento para o ecossistema marinho. Isso torna o local uma importante fonte de energia para ambos o ambiente por sua alta produtividade (ECOLAGOA, 2003).

A comunicação com o mar se dá através de um canal natural e meândrico, com 2 km de extensão e largura aproximada

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de 40 metros. Devido ao seu comprimento, este canal reduz o efeito das marés no interior da Lagoa. O fluxo no canal foi garantido em 1982, com sua retilinização, dragagem e com a construção de molhes na sua desembocadura no mar. Antes destas retificações era natural que a barra do canal fechasse por períodos indefinidos, devido à deposição de areia pelo mar. As retificações foram feitas principalmente pelos pescadores, que viam sua atividade prejudicada, pela impossibilidade saírem da lagoa com suas embarcações. Estas alterações certamente causaram modificações na lagoa que ainda não foram suficientemente avaliadas, até porque continuam se processando (PANITZ, 1997).

Esta lagoa sempre foi tradicionalmente conhecida pela fartura na produção de pescado e principalmente de camarão. Atualmente, a atividade pesqueira diminuiu muito e o lançamento clandestino (normalmente durante as noites) de esgoto de fossas sépticas, principalmente de restaurantes em sua orla tem sido um problema freqüentemente ainda não solucionado com a instalação da rede de esgoto (PANITZ, 1997). A atividade pesqueira já foi extremamente importante para o desenvolvimento da população local, mas, nos dias de hoje, está perdendo espaço para o turismo que cresce a cada ano, aumentando o impacto sobre os organismos aquáticos. O crescimento urbano também pode estar contribuindo para esse aporte de contaminantes na Lagoa.

FONSECA et al. (2002), em uma amostragem no início da primavera de 2000, consideraram a Lagoa da Conceição como eutrófica à hipertrófica, com base na evolução da concentração de nutrientes inorgânicos dissolvidos nas últimas duas décadas e na proliferação de macroalgas oportunistas na região Sul. Durante o presente estudo, a biomassa das macroalgas na região Sul, apesar de não quantificada, foi visivelmente maior no verão, acompanhada de odor fétido proveniente da decomposição anaeróbica no local.

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É importante salientar que há uma grande flutuação na densidade populacional por efeito da sazonalidade, podendo aumentar em até mil por cento a ocupação das áreas do entorno no período de verão.

A Lagoa da Conceição abriga uma grande variedade de espécies que entram em seu corpo lagunar à procura de abrigo e alimento. A captura da tainha e do camarão é importante para a economia local. Dentre as comunidades bentônicas, podem-se citar como espécies da macrofauna mais abundantes: Callinectes danae (siri-azul), os moluscos Anomalocardia brasiliana (berbigão) e Brachidontes darwinianus (marisquinho-preto), além de formas juvenis de peixes e crustáceos (SANTIN, 1987).

ROSA (1989) estudou a densidade populacional de Anomalocardia brasiliana na Lagoa da Conceição, constatando que estes moluscos ocorrem nos três subsistemas da Lagoa, sendo mais abundantes na porção leste, onde o sedimento é do tipo areno-lodoso. Este molusco constitui-se numa importante fonte de alimento para a comunidade local. Devido à sua importância econômica e facilidade de captura, esta espécie vem sendo intensamente capturada no litoral catarinense. O berbigão, como é popularmente conhecido, serviu como importante fonte de proteínas para o homem do sambaqui, conhecido como um dos ancestrais com melhor qualidade alimentar. Esses registros são evidenciados por historiadores que encontram sítios arqueológicos (sambaquis) repletos de conchas desses moluscos.

PEREIRA (2003), FARIA (2008) e CESA (2008) utilizaram o estudo do estresse oxidativo desta espécie como indicador de contaminação ambiental obtendo resultados que indicam ser esta uma espécie-chave no diagnóstico dos ecossistemas aquáticos onde ocorre. O trabalho de PEREIRA (2003) serviu de referência comparativa para o presente trabalho.

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Material biológico

O material biológico analisado nesse estudo é o molusco bivalve Anomalocardia brasiliana, conhecido popularmente como Berbigão. Possui concha trigonal, com aproximadamente 37 mm de comprimento, 32 mm de altura e 23 mm de largura. Tem brilho vítreo e coloração amarelada, apresentando freqüentemente manchas ou faixas sinuosas cinza-escuras; interior porcelanoso, muitas vezes com manchas acinzentadas na região posterior. Vive próximo das zonas entre-marés, em praias abrigadas e de fundo lodoso, sendo encontrado enterrado a pequenas profundidades (BOFFI, 1979).

Fig. 01 – Aspectos externos do molusco Anomalocardia brasiliana Fonte: www.idscaro.net

A porção escolhida para análise é o órgão digestório do molusco. MOURÃO et al., (1994) estudaram esse órgão e constataram tratar-se de uma glândula exócrina e acinosa composta. Os ácinos contêm células digestivas que passam por diversas modificações fisiológicas: absorção, digestão, intracelular, assimilação, secreção, fragmentação e restauração.

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Quanto à fisiologia, o órgão digestório não só participa da absorção de alimentos como também da elaboração de enzimas e estocagem de reservas energéticas.

Fig.02 – Aspecto interno do molusco evidenciando em verde seu órgão digestor.

Análise de poluição aquática Foram avaliados nesse estudo alguns parâmetros que indicam a exposição do organismo a agentes contaminantes. Esses biomarcadores permitem a leitura das condições ambientais através da resposta orgânica à exposição a esses xenobiontes. A lenta introdução do oxigênio na atmosfera terrestre (há cerca de 3 milhões de anos) deu início à ação deletéria das chamadas espécies reativas de oxigênio (ERO) sobre os organismos aeróbios. São originadas principalmente através da redução parcial do oxigênio durante os processos de oxidação metabólica, e seus efeitos sobre as estruturas biológicas são processos contínuos, estando presentes mesmo em condições de normóxia em organismos aeróbios sadios dotados de diferentes e específicas defesas antioxidantes (DA). Um desequilíbrio nestes processos de oxidação pode levar o organismo a uma condição

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denominada de estresse oxidativo (SIES, 1985; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). O estresse oxidativo é caracterizado por desvios no estado de equilíbrio dinâmico intracelular entre as proteções antioxidantes e as ERO. Neste caso, as defesas antioxidantes podem não estar aumentadas com o aumento das ERO. Nas situações mais graves, concomitantemente a um aumento da concentração das ERO, há uma redução paralela das defesas antioxidantes (SIES, 1985; AMSTAD & CERUTTI, 1990). As ERO incluem outras moléculas não radicais que também são reativas, tais como o peróxido de hidrogênio e o oxigênio singlete. O estresse oxidativo pode estar relacionado com vários processos tais como: mutagênese, carcinogênese, lipoperoxidação, oxidação e fragmentação de proteínas e carboidratos. Entre os principais danos celulares causados por esses radicais está a oxidação dos lipídios das membranas celulares, levando à perda da fluidez e aumento da permeabilidade das membranas, com liberação de nutrientes e substâncias tóxicas à célula no espaço extracelular, e até mesmo sua ruptura (FERREIRA & MATSUBARA, 1997).

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Fig. 03 – Efeitos dos xenobiontes nos organismos.

Dose Externa

Efeitos

Rota Freqüência

Mudanças Físicas

Metabolismo Microflora Intestinal

Fase de Exposição

Químico disponível para absorção

Fase Toxicocinética

Absorção Distribuição Metabolismo Excreção

Interação com componentes celulares

Seletividade Reversibilidade

Fase Toxicodinâmica

Químico disponível para ação

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Biomarcadores de estresse oxidativo Segundo WALKER et al. (1996), os biomarcadores são definidos como alterações biológicas ao nível molecular, celular, fisiológico ou comportamental, que expressam a exposição e os efeitos tóxicos dos poluentes presentes no ambiente. Por serem freqüentemente os primeiros a sofrer alteração, devido à sua grande suscetibilidade, boa sensibilidade e relativa especificidade, os biomarcadores são considerados recursos úteis em programas de monitoramento (STEGEMAN et al., 1992; WILHELM FILHO et al., 2001a). Os biomarcadores podem ser classificados como de exposição ou de efeito. Um biomarcador de exposição será qualquer alteração biológica mensurável que evidencie a exposição dos organismos a um poluente. Um exemplo desse tipo de marcador é a atividade das enzimas antioxidantes. Biomarcadores de efeito são aqueles que evidenciam alguma reação tóxica associada à exposição do organismo ao poluente, como por exemplo, a lipoperoxidação ou dano ao DNA (ZOTTIS, 2005). Enzimas de defesa antioxidante e conjugação de xenobióticos são bons biomarcadores, pois fornecem informações importantes da capacidade de defesa dos organismos, bem como da capacidade de excreção dos compostos tóxicos (LIVINGSTONE et al., 1990; VIDAL et al., 2001)

O estudo de biomarcadores de estresse oxidativo pode fornecer dados importantes para o estudo da atual situação deste sistema lacustre, bem como indicar caminhos para o manejo e conservação desse importante ambiente. Defesas Antioxidantes Antioxidante é qualquer substância que inibe ou retarda significativamente a oxidação de um substrato oxidável (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Todo organismo que utiliza o metabolismo oxidativo é portador de um complexo

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sistema de proteção antioxidante (WILHELM FILHO, 1994, 2001a; HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). As principais proteções antioxidantes podem ser divididas em dois grupos: defesas enzimáticas e não-enzimáticas. Entre as defesas enzimáticas, algumas são mais utilizadas como marcadoras de estresse. A superóxido dismutase (SOD) tem a função de catalisar a dismutação do radical O2.- em H2O2 e está presente em quase todos os organismos eucariontes. Amplamente difundida entre os seres aeróbios, a catalase (CAT) é uma enzima que decompõe H2O2 em H2O e O2. A glutationa peroxidase (GPx) utiliza o tripeptídeo tiólico glutationa reduzida (GSH) como doador de elétrons para a redução de H2O2 em H2O, e também os peróxidos orgânicos, como, por exemplo, os lipoperóxidos resultantes de lipoperoxidação lipídica (KELLING & SMITH, 1982). As concentrações celulares reduzidas de O2-.- e H2O2 são mantidas graças à ação combinada das três enzimas descritas acima (SOD, CAT e GPx) (CHANCE et al., 1979). Para complementar a ação das enzimas na redução das ERO, a glutationa redutase (GR) age como uma enzima acessória que viabiliza indiretamente a ação contínua da GPx catalisando a redução da glutationa oxidada (GSSG) através da oxidação do NADPH (HALLIWELL & GUTTERIDGE, 1999). Já a glutationa S-transferase (GST) tem a função de transferir a GSH para grupamentos bioativos, que resultam da ação da monooxigenase em biotransformação de xenobióticos (KETTERER, 1986; WARHOLM et al., 1983; MONKS et al., 1990; DEKANT & VANVAKAS, 1993).

Entre os marcadores não-enzimáticos, temos glutationa reduzida (GSH), oxidada (GSSG) e total (GT). A GSH, um antioxidante citosólico, é um importante tripeptídeo presente nas células de todos organismos aeróbicos (WILHELM FILHO et al., 2000). A GSH atua doando hidrogênio nas reações promovidas pela ação da GPx, em que há redução de hidroperóxidos (WINTERBOURN, 1993). Na biotransformação de xenobióticos, a GSH é transferida pela GST para grupamentos bioativos,

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resultantes da ação de monooxigenases (MONKS et al., 1990; KOOB & DEKANT, 1991). A GSH, após estas reações, constitui-se na forma oxidada GSSG. As substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico (TBARS) constituem excelentes indicadores de lesão celular, na medida em que reagem com lipídeos das membranas celulares.

No estado de Santa Catarina já foram realizados estudos utilizando os biomarcadores de estresse oxidativo como indicadores de poluição, especialmente em Anomalocardia brasiliana. PEREIRA (2003) e FARIA (2008) fizeram seus estudos analisando esta espécie.

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Objetivo geral

Analisar a situação atual da contaminação da Lagoa da Conceição através da análise dos biomarcadores de estresse oxidativo no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana, comparativamente aos resultados obtidos em 2002 (PEREIRA, 2003). Objetivos específicos:

• Analisar as respostas das defesas antioxidantes enzimáticas (SOD, CAT, GST, GPx e GR), não-enzimática (GSH) e respostas dos marcadores de danos (TBARS) no órgão digestor dos berbigões coletados nos diferentes pontos dentro do sistema da Lagoa da Conceição, comparativamente ao ponto controle e aos dados obtidos anteriormente (PEREIRA, 2003). • Analisar eventuais correlações entre os níveis dos diferentes biomarcadores de estresse oxidativo com os indicadores de qualidade da água nos pontos amostrais.

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Metodologia Atividades de campo

O material biológico foi coletado manualmente nos locais estabelecidos previamente e transportados, ainda vivos, em recipientes com água da Lagoa e sedimento ao Laboratório de Ecofisiologia Respiratória da UFSC em abril de 2009 no período da manhã, quando a maré estava baixa. Foram coletados 30 animais e utilizado um N = 15 animais para cada sítio amostral. Os parâmetros físico-químicos foram obtidos através de medições no momento exato em que os animais eram coletados. Foram analisados pH, condutividade, salinidade, oxigênio dissolvido, temperatura atmosférica, temperatura da água e intensidade do vento utilizando os equipamentos descritos abaixo (Standard methods for the examination of water and wastewater). As medições de coliformes fecais foram fornecidas pela FATMA, através das análises para o relatório de balneabilidade. pH – pHmetro digital Alfakit modelo AT310 calibrado com pH 7,0 e pH 4,0. Condutividade – condutivímetro digital Alfakit modelo AT230 calibrado com água destilada. Salinidade – utilizando o salinômetro Alfakit calibrado com água destilada. Oxigênio dissolvido – oxímetro microprocessado Alfakit modelo AT150. Temperatura atmosférica e vento – através do anemômetro Temperatura da água – utilizando termômetro.

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Sítios amostrais

A escolha dos sítios obedeceu alguns critérios de acordo com levantamento feito junto à população, observação direta do ambiente da Lagoa e de acordo com PEREIRA (2003). Os principais fatores de decisão dos locais foram:

a) presença de Anomalocardia brasiliana no local; b) presença de atividade antrópica com potencial contaminante; c) distribuição geográfica dentro do sistema lagunar; d) locais onde já haviam sido feitos estudos anteriores para que se possa atualizar os dados e comparar a situação atual com detecções anteriores.

Ponto controle – Pontal da Daniela A região do Pontal da Daniela (Lat. 27°27’9.74”S/ Long. 48°32’17.73”O) encontra-se ao norte da Enseada de Ratones e consiste numa extensão de faixa arenosa, com presença de um manguezal atrás dessa faixa arenosa, de grande valor ecológico. O Estuário do Rio Ratones consiste num dos estuários menos impactados pela ação antrópica na Ilha de Santa Catarina, apesar de certa interferência humana local (RIBEIRO et al., 2001). Apesar de a Enseada receber um aporte de efluentes domésticos da população local, o manguezal ali existente impede que os dejetos sejam levados diretamente ao mar (SORIANO-SIERRA, com. Pessoal, 2002). Atualmente toda a área, incluindo o manguezal de Ratones, faz parte da Estação Ecológica de Carijós, unidade de conservação criada em 1987.

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Fig. 04 – Imagem de satélite identificando a Baia Norte e o Pontal da Daniela, sítio controle.

Ponto 1 – Trapiche do Rio Vermelho

Localiza-se dentro do Parque Florestal do Rio Vermelho (Lat. 27°33’5.65”S/ Long. 48°26’51.57”O), onde há uma plantação de Pinus elliotti, Gimnosperma que produz resinas ácidas, altamente tóxicas e cumulativas. Em condições anaeróbias, estas resinas convertem-se em substâncias mais tóxicas que as originais (SOARES, 2001). Além disso, há um grande número de embarcações (COOPERCOSTA) que utilizam o local para levar turistas e materiais à Costa da Lagoa. Além da potencial

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contaminação por combustíveis, as embarcações utilizam tintas anti-encrustrantes que liberam metais na água. Ponto 2 – Avenida Osni Ortiga

Localiza-se no início da avenida (Lat. 27°36’31.74”S/ Long. 48°27’47.32”O), uma região bem urbanizada e com constante movimento de embarcações motorizadas. O local é um dos pontos com maior emissão de esgotos e repleto de construções irregulares que invadem o espaço lacustre com marinas e trapiches. Ponto 3 – Ponta das Almas

Situado na região do Canto dos Araçás (Lat. 27°36’17.13”S/ Long. 48°27’45.42”O), área residencial com grande aporte de matéria orgânica proveniente de efluentes domésticos, emitidos sem tratamento na Lagoa. Nesse local circulam diariamente inúmeras embarcações (COOPEBARCO) que fazem o transporte coletivo dos moradores da Costa da Lagoa e Canto dos Araçás. O sítio de coleta fica muito próximo ao canal de navegação. Ponto 4 – Lagoa Iate Clube

Local com grande ocupação urbana e intensa prática de esportes náuticos, na parte sul da Lagoa (Lat. 27°36’44.60”S/ Long. 48°28’51.29”O), onde há uma baixa hidrodinâmica devido ao estrangulamento da Lagoa na região da ponte. O ponto tem baixa influência das marés devido à distância do canal. Situa-se oposto ao P2 e sofre bastante influência dos ventos Sul e Nordeste.

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Fig. 05 – Sítios de coleta na Lagoa da Conceição; P1- Trapiche do Rio Vermelho; P2 -Osni Ortiga; P3- Ponta da Almas; P4- LIC.

Atividade de laboratório Os animais foram mantidos em recipientes contendo sedimento e água dos sítios onde foram coletados e transportados ao laboratório. Primeiramente, todos os indivíduos foram pesados e foi feita uma medida do diâmetro da concha. Em seguida, os berbigões passaram por dissecação para retirada dos órgãos digestórios e pesagem dos mesmos em balança de

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precisão. Para que a biomassa gerasse um volume suficiente de amostra, foi feito um “pool” com três órgãos digestores para cada amostra. Aspecto utilizado anteriormente no Laboratório de Ecofiosiologia Respiratória da UFSC, e que não interfere numa análise comparativa envolvendo um número amostral relativamente grande (n=15) (WILHELM FILHO et al., 2001a). Uma porção dessa amostra foi submetida à precipitação em ácido tricloroacético (diluição 1:9), para preparação de extratos ácidos para dosagem dos níveis de GSH. Outra porção foi homogeneizada com tampão fosfato 0,1 M (diluição 1:19) para análise enzimática, seguindo os protocolos abaixo: SOD (Superóxido Dismutase)

A análise da superóxido dismutase foi realizada segundo o método xantina/xantina oxidase, envolvendo a oxidação da adrenalina em adrenocromo e lida em 480 nm (FLOHÉ & ÖTTING, 1984). Os ensaios para a atividade da SOD foram realizados em duplicata, e os valores foram expressos em U SOD.g-1.

CAT (Catalase)

Para análise da atividade desta enzima foi utilizado o método descrito por AEBI (1984), que quantifica a velocidade de decomposição do peróxido de hidrogênio, em 240 nm durante 30 s, em monofeixe, pela enzima presente na amostra. Utilizou-se a solução de peróxido de hidrogênio 10 mM em tampão fosfato 50 mM pH 7,0 preparada no dia da análise. Todas as amostras foram analisadas em duplicata, sendo os valores expressos em mmol.min-1.g-1.

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GPx (Glutationa Peroxidase)

Para este ensaio, segundo FLOHÉ e GUNZLER (1984), utilizou-se 10μl de amostra e 10μl de ter-butilhidroperóxido (t-BuOOH), colocados em 1 ml de um meio de reação composto de 25 ml de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0, 8,6 mg de NADPH, 10 ml de ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) 0,005 M pH 7,0, 15 ml de água destilada, 0,024 g glutationa reduzida, e 5 U de glutationa redutase colocada momentos antes do ensaio. Este ensaio baseia-se na medida do decréscimo da absorbância (340 nm) do NADPH por 1 min, promovendo a redução da GSSG, catalisada pela GR. A velocidade de oxidação de NADPH é proporcional à velocidade de produção de GSH a partir de GSSG, em presença de t-BuOOH, catalisada pela GPx. Os ensaios para a atividade da GPx foram realizados em duplicata, e os valores foram expressos em μmol.min-1.g-1. GST (Glutationa S-transferase)

A atividade da glutationa S-transferase foi medida

espectrofotometricamente em 340 nm, em duplo feixe, de acordo com HABIG et al. (1976). A amostra adicionada em um meio contando 10μl de 1-cloro-2,4-dinitrobenzeno 0,1 M (CDNB), 10μl de glutationa redutase, 0,1 M (GSH) e 970μl de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0, sendo que na cubeta de referência utilizou-se 980μl de tampão fosfato 0,1 M pH 7,0. As análises foram feitas em duplicata e os valores expressos em μmol.min-1.g-1.

GR (Glutationa Redutase)

O método utilizado para análise desta atividade foi o de

CARLBERG e MANNERVICH (1992), onde se verifica, em 340 nm, a taxa de oxidação do NADPH, devido à redução da glutationa oxidada pela glutationa redutase (5 U/ml) presente na amostra, em um meio de reação contendo tampão fosfato 0,1 M

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pH 7,0; 8,6 mg de NADPH; glutationa oxidada (30,6 mg/50ml de meio de reação) e DTPA (ácido dietilenotriaminopentacético) 5mM. O ensaio das amostras foi realizado em duplicata e os valores expressos em μmol.min-1.g-1.

TBARS

O homogenato foi precipitado com ácido tricloroacético

(TCA) a 12% e agitado vigorosamente durante cerca de 5s. Em seguida, incubado em tampão Tris-HCl 60 mM, pH 7,4 (0,1 mM DTPA), e ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,73% durante 60 min a 100°C. Após, o material foi resfriado durante 15 min a 5°C e centrifugado (5 min a 5000g), e a absorbância do cromóforo de cor rósea foi medida em 535nm, sendo os valores expressos em nmol.g-1. A avaliação da peroxidação lipídica endógena foi realizada em triplicata, com monofeixe, através da detecção em A535 dos derivados de seus produtos de oxidação, através de substâncias que reagem com o ácido tiobarbitúrico, destacando-se o malondialdeído, ou MDA, produzindo uma base de Shiff de coloração rosa (BIRD; DRAPER, 1984). GSH (Glutationa Reduzida)

Para avaliar a concentração tecidual de tióis não protéicos

em precipitado ácido (ácido tricloroacético 12%, 1:9, p:v), foi empregado o método de BEUTLER (1975). A adição de 0,2 ml de ácido 2-nitrobenzóico 2,5mM (DTNB) nas cubetas contendo 1,9 ml de tampão Tris-HCl 0,2M pH 8,0 e 0,1 ml da amostra, permitia, após cerca de 3 min, a obtenção máxima de formação do ânion tiolato (TNB) de cor amarela, feita em duplicata e foi mensurada em A412.

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Armazenamento e análises

As amostras foram acondicionadas em criotubos e armazenadas em nitrogênio líquido. As análises das defesas antioxidantes e do dano celular (TBARS) foram realizadas em espectrofotômetro marca GBC, UV-VIS, duplo feixe, com termostatização eletrônica (sistema Peltier) da câmara de cubetas, conectado em computador, possuindo software apropriado para diferentes análises como cinética enzimática. Todos os dados obtidos através da análise enzimática foram calculados e examinados através de gráficos e tabelas gerados pelo programa Prism Graphpad 5 para facilitar a interpretação dos resultados. Análise estatística A avaliação dos resultados foi feita utilizando a análise de variância ANOVA, uma via entre os diferentes pontos de coleta e duas vias dentro de cada ponto para comparar dados obtidos em 2002 e 2009, complementadas pelo pós-teste de Tuckey, considerando um nível de significância mínima de 5% (p<0,05). Análises microbiológicas da água Os níveis de contaminação por organismos patogênicos foram obtidos através da FATMA, Fundação do Meio Ambiente de Santa Catarina, que faz análises periódicas em diversos pontos da Lagoa da Conceição, incluindo os pontos eleitos nesse estudo, para elaborar relatórios mensais de balneabilidade. As análises detectam a presença e a contagem de Escherichia coli, um coliforme fecal. As bactérias do grupo coliforme são consideradas os principais indicadores de contaminação fecal. O uso da bactéria coliforme fecal para indicar poluição sanitária mostra-se mais significativo que o uso da bactéria coliforme total, porque as bactérias fecais estão restritas ao trato intestinal de animais

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endotermos. A determinação da concentração de coliformes assume importância como parâmetro indicador da possibilidade da existência de agentes patogênicos, responsáveis pela transmissão de doenças de veiculação hídrica como febre tifóide, febre paratifóide, desinteria bacilar e cólera (JUNKES, 2004; TIRELLI 2003).

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Resultados

Parâmetros físico-químicos

A análise da água nos sítios amostrais constituiu-se da determinação dos principais parâmetros que influenciam esse corpo lacustre. Foram observados temperatura (água e atmosférica), regime de ventos e intensidade dos mesmos, pH, condutividade, salinidade e oxigênio dissolvido. Os valores obtidos podem ser observados na tabela abaixo:

Tabela 01 – comparação dos parâmetros físico-químicos obtidos em 2002 e 2009. NA = não analisado. Pc: Pontal da Daniela; P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4: Praia do LIC.

Parâmetros Pc

2002

Pc

2009

P1

2002

P1

2009

P2

2002

P2

2009

P3

2002

P3

2009

P4

2002

P4

2009

pH 8,30 7,75 8,5 7,30 8,3 8,17 8,27 8,19 7,87 7,70

Cond. (mS/Cm)

49,2 25,1 36,9 8,7 31,1 23,2 39,8 32,3 29,2 10,7

Salinidade (‰) 31,08 20 23,4 5 19,2 16 25,1 20 18 7

O2 disso. (MG/l)

6,86 5,93 10,7 6,80 9,3 6,92 7,23 8,05 4,59 6,72

Temp. atm. (°C)

NA 22 NA 21,2 NA 23 NA 23,7 NA 22,1

Temp. água (°C)

17,7 20,1 21,7 19,4 24 21,4 19,1 20,5 18,4 20,8

Vento (km/h) NA 4,0 NA 6,0 NA 2,0 NA 0,2 NA 2,0

É importante salientar na análise dos parâmetros físico-

químicos que, nas datas próximas e no dia da coleta, houve um grande volume de chuva, trazendo um grande aporte de água doce para o corpo lagunar. Dentre os valores obtidos, destacam-se a baixa salinidade encontrada nos pontos P1 e P4, 5,0 e 7,0‰ respectivamente, e, como consequência disso, nos mesmos pontos pode-se observar baixa condutividade, 8,75 mS no P1 e 10,7 mS no P4.

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As salinidades mais altas foram encontradas no Pc e P3 com 20‰, sendo que no Pontal da Daniela, a salinidade apresentou-se relativamente baixa (20‰) visto que é um ambiente marinho. Provavelmente houve influência do grande volume de chuvas, deixando os valores muito próximos dos encontrados na Lagoa, nos sítios P2 e P3. Com relação ao pH, não houve grande variação entre os pontos estudados. O P1 apresentou o menor valor (7,30) enquanto que os valores mais altos foram encontrados em P2 e P3, com 8,17 e 8,19 respectivamente. Ao compararmos o valor de P1 com o valor obtido em 2002, podemos perceber uma diferença significativa no pH na região do Rio Vermelho, podendo indicar a ação das resinas ácidas da floresta de Pinus existente no local.

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Parâmetros Microbiológicos Os parâmetros microbiológicos foram obtidos com a contribuição da FATMA, dados de abril de 2009 e comparados aos obtidos em abril de 2002 por PEREIRA. Tabela 02: Características microbiológicas da água nos sítios amostrados na Lagoa da Conceição e sítio controle. P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4:

Praia do LIC; PC: Sítio Controle – (Pontal da Daniela); NA= não analisado

Param. microb./ sítios amostrais

Pc P1 P2 P3 P4 Unidade

Colif. fecais 2002 18,3 >2419,2 1732,9 960,6 111,9 NMP/ 100mL

Colif. fecais 2009 NA ≥ 16000 ≥ 5000 ≥ 3800 ≥ 1700 NMP/ 100mL

Pode ser observado, em relação aos dados obtidos por PEREIRA (2003), um aumento generalizado e acentuado na média de coliformes fecais na Lagoa da Conceição no mês de abril, indicando uma forte correlação com o aumento observado nas atividades das enzimas antioxidantes (vide adiante). O aporte de matéria orgânica proveniente dos efluentes domésticos aparentemente impulsionou o aumento de E. coli, uma consequência natural da expansão populacional que essa região vem sofrendo. FONSECA et al.,(2002) já constataram um aumento na matéria orgânica no ambiente da lagoa nas duas últimas décadas.

Biomarcadores de estresse oxidativo TBARS

TBARS comparativo

02c P

09c P

021 P

091 P

022 P

092 P

023 P

093 P

024 P

094 P

0

200

400

600

800

1000

**

****** ***

***

nmol.g

-1

Fig. 06 – concentrações de TBARS no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana, obtidas em 2002 e 2009 nos sítios amostrais. Pc: Pontal da Daniela; P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4: Praia do LIC; *(p>0,05)

Com relação aos níveis de TBARS, comparando os dados de 2002 com 2009, houve um aumento significativo no Pc,, assim como em P4, indicando um provável aumento de dano celular nos organismos encontrados nesses pontos. Provavelmente nestes locais os moluscos ainda possuem condições suficientes para uma resposta antioxidante compensatória, mesmo apresentando níveis aumentados relativamente ao processo de lipoperoxidação, provavelmente em decorrência da queda dos níveis de GSH nesses organismos. Nos demais sítios, houve uma queda dos níveis de lipoperoxidação em relação a 2002. Por um lado,

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poderia ser sugerida uma atenuação do agravamento da contaminação aquática nestes pontos amostrados. Entretanto, de forma similar ao já verificado em acarás cronicamente expostos a ambientes severamente contaminados por longos períodos (WILHELM FILHO et al., 2001), podem sugerir que a exposição constante a contaminantes não está permitindo que haja uma compensação antioxidante adequada do organismo nestes locais de coleta.

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CAT

CAT comparativo

02cP

09cP

021P

091P

022P

092P

023P

093P

024P

094P

0

50

100

150

200 ***

***

***

***

***

mmol.m

in-1.g

-1

Fig. 07 – Atividades de CAT no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana, obtidas em 2002 e 2009 nos sítios amostrais. Pc: Pontal da Daniela; P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4: Praia do LIC; *(p>0,05)

Os aumentos significativos de CAT em todos os sítios amostrais, ao compararmos com os organismos coletados em 2002, sugerem um aumento generalizado dos contaminantes em todos os locais estudados. Dentre os valores obtidos, houve maior grau de significância em P1, P2 e P4. É importante destacar o aumento (200%) no Pontal da Daniela, utilizado anteriormente como sítio controle por PEREIRA (2003) que, no presente estudo, revelou-se aparentemente sem condições de servir como parâmetro de referência neste particular.

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GPx

GPx comparativo

02c P

09c P

021 P

091 P

022 P

092 P

023 P

093 P

024 P

094 P

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*** ***

******

µµ µµ m

ol.g

-1

Fig. 08 – Atividades de GPx no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana, obtidas em 2002 e 2009 nos sítios amostrais. Pc: Pontal da Daniela; P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4: Praia do LIC; *(p>0,05)

De modo semelhante à atividade da CAT, em todos os sítios amostrais houve aumento da atividade da GPx em relação ao estudo anterior. No P1 não houve um aumento significativo, porém os níveis permaneceram altos como os encontrados em 2002. Em todos os demais sítios os níveis dessa enzima aumentaram de forma significativa, destacando o Pc, P2 e P3 onde os aumentos foram mais acentuados.

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GSH

GSH comparativo

02c P

09c P

021 P

091 P

022 P

092 P

023 P

093 P

024 P

094 P

0

1

2

3 ***

**

mM

Fig. 09 – Concentrações de GSH no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana, obtidas em 2002 e 2009 nos sítios amostrais. Pc: Pontal da Daniela; P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4: Praia do LIC; *(p>0,05)

Os resultados de concentrações de glutationa reduzida corroboraram os valores encontrados nos níveis de TBARS. Os sítios onde houve queda dos valores de TBARS (P1, P2 e P3) indicaram um aumento inversamente proporcional nos níveis de GSH no órgão digestor dos organismos. Para estes sítios, pode-se dizer que houve uma mobilização da GSH no sentido de fornecer elétrons para que a glutationa peroxidase pudesse executar sua função, pois se mostrou aumentada nos mesmos. Por outro lado, os sítios Pc e P4 indicaram queda na GSH quando comparados aos valores obtidos em 2002, nos quais esta disponibilização não seria suficiente.

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GST

GST comparativo

02c P

09c P

021 P

091 P

022 P

092 P

023 P

093 P

024 P

094 P

0

1

2

3

4

***

***

**nmol.g

-1

Fig. 10 – Atividades de GST no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana, obtidas em 2002 e 2009 nos sítios amostrais. Pc: Pontal da Daniela; P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4: Praia do LIC; *(p>0,05)

Nos resultados de GST, houve uma queda geral dos valores ao compararmos com o trabalho de PEREIRA (2003), com exceção dos valores encontrados em P3(1,06 μmol.min-1.g-1 em 2009 e 0,73 μmol.min-1.g-1 em 2002). As quedas mais evidentes foram as de Pc(0,39 μmol.min-1.g-1) e P2(1, 67 μmol.min-1.g-1). Essa enzima apresenta-se geralmente induzida em organismos expostos a poluentes (TORRES, 2000; CHEUNG et al., 2001), porém WILHELM FILHO et al. (2001) e GRECO et al. (2010) mostraram diminuições da GST em organismos aquáticos expostos cronicamente a diferentes tipos de contaminantes. FARIA (2008) também encontrou essa situação em estudo utilizando a mesma espécie. Aparentemente, nestes organismos onde a GST não

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possui mais condições de uma resposta de indução enzimática compensatória, pode constituir uma condição de estresse oxidativo acentuado, tornando-o incapaz de uma resposta adequada aos níveis aparentemente crescentes e persistentes de contaminação.

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GR

GR comparativo

02c P

09c P

021 P

091 P

022 P

092 P

023 P

093 P

024 P

094 P

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

***

***

*

µµ µµmol.min

-1. g-1

Fig. 11 – Atividades de GR no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana, obtidas em 2002 e 2009 nos sítios amostrais. Pc: Pontal da Daniela; P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4: Praia do LIC; *(p>0,05)

A GR é uma enzima ligada intimamente à GSH. Os níveis de indicam uma indução dessa enzima nos locais onde a GSH apresentou-se baixa (Pc,, P1 e P2). Isso ocorreu provavelmente para que os níveis de GSH permanecessem estáveis. Os aumentos mais significativos de GR ocorreram em P2 (0,09 ± 0,048 μmol.min-1.g-1) e Pc (0,13 ± 0,023 μmol.min-1.g-1) respectivamente. A queda mais significativa ocorreu em P3 (0,06 ± 0,026 μmol.min-

1.g-1). Em P4 a queda não foi significativa.

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SOD

SOD comparativo

02c P

09c P

021 P

091 P

022 P

092 P

023 P

093 P

024 P

094 P

0

50

100

150

200

250

******

***

USOD.g

-1

Fig. 12 – Atividades de SOD no órgão digestor de Anomalocardia brasiliana, obtidas em 2002 e 2009 nos sítios amostrais. Pc: Pontal da Daniela; P1: Rio Vermelho; P2: Osni Ortiga; P3: Ponta das Almas; P4: Praia do LIC; *(p>0,05)

A análise da superóxido dismutase revelou uma depletação geral dos níveis dessa enzima em todos os sítios amostrais em relação aos resultados de 2002. As quedas mais significativas foram em P1, P3 e P4. Esses resultados indicam um comprometimento geral desta defesa antioxidante enzimática em todos os locais estudados e, consequentemente, sugerem fortemente um aumento da contaminação no ecossistema como um todo. Esse resultado corroborou as quedas observadas na atividade da GST, as quais também foram diminuídas na comparação com os estudos de 2002.

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Discussão e conclusões Discussão A análise de estresse oxidativo de Anomalocardia brasiliana constitui-se em uma importante ferramenta de monitoramento da Lagoa da Conceição. Os berbigões são animais sésseis e filtradores que fisiologicamente tendem a bioacumular xenobióticos, o que lhes confere uma grande capacidade de refletir as condições ambientais do local onde se encontram. PEREIRA (2003) já evidenciou estresse oxidativo nesses animais através da análise dos mesmos biomarcadores. Em um primeiro momento, observou-se que o sítio controle experimental, o Pontal da Daniela, apresentou atualmente aparentes indícios de contaminação. SORIANO-SERRA (2002) indicou esse local por ser um ambiente menos antropizado na Ilha de Santa Catarina onde os berbigões poderiam ser coletados, e isso foi evidenciado e utilizado por PEREIRA em coleta de campo realizada em 2002. Porém, as análises atuais revelam uma resposta distinta dos berbigões, aparentemente a situações mais acentuadas de estresse oxidativo.

Os níveis de TBARS encontrados atualmente no Pontal da Daniela apresentam-se cerca de 200% mais altos comparados a 2002, o que indica uma alta taxa de lipoperoxidação promovida pela exposição a contaminantes. No caso desse local, muito provavelmente esses animais estejam expostos ao despejo de efluentes domésticos, uma conseqüência natural da explosão populacional que Florianópolis sofreu nos últimos anos. A provável associação entre aumentos de níveis de coliformes totais e fecais, como marcadores de efluentes domésticos, e os biomarcadores de estresse oxidativo em sítios contaminados, provavelmente estaria relacionada com a crescente descarga de xenobióticos de natureza farmacêutica (SANTOS et al. 2008). Os compostos farmacêuticos tais como analgésicos, antibióticos, anticonvulsivos, medicamentos para patologias cancerígenas,

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reguladores de colesterol e medicamentos psiquiátricos têm sido encontrados nas massas de água em diversas partes do mundo (em rios, lagos, córregos e canais, bem como em sistemas marinhos), sendo também a sua presença detectada em águas subterrâneas. A informação disponível acerca da ecotoxicologia destes compostos é escassa, não permitindo captar o modo de ação típico destas substâncias biologicamente ativas (JONES et al., 2004). Da mesma maneira, os fármacos utilizados na medicina veterinária, podem entrar no meio hídrico através da aplicação de estrume em campos agrícolas e da sua consequente percolação. Outra via da contaminação é pela utilização direta de compostos farmacêuticos na aquicultura. A preocupação ambiental não passa necessariamente pelo elevado volume de produção de um determinado composto farmacêutico, mas sim pela sua persistência no ambiente e pela sua atividade biológica crítica, resultando na elevada toxicidade e no potencial para gerar efeitos nos processos biológicos-chave, como é o caso da reprodução (ROQUE, 2009). Segundo FILHO (2007), além da persistência dos fármacos no ambiente, outro problema resulta de estes terem sido produzidos para desencadearem efeitos fisiológicos específicos, tornando a biota mais suscetível a impactos advindos da presença destes compostos no meio hídrico. Embora a concentração de alguns fármacos seja baixa, a sua combinação poderá ter efeitos pronunciados devido ao mecanismo de ação sinergética.

BOYD e FURLONG (2002) destacaram que pesquisas demonstraram que muitos compostos farmacêuticos podem ser bioacumuláveis, afetando negativamente os organismos aquáticos através da alteração dos seus processos fisiológicos, funções reprodutivas, aumentando as taxas de cancro, bem como podem contribuir para o desenvolvimento da resistência de estirpes de bactérias a antibióticos.

Além disso, com a enorme variedade de compostos, existirão aqueles que são suficientemente hidrofóbicos para se ligarem aos sedimentos. O destino destes compostos no meio hídrico é essencial para determinar a sua biodisponibilidade,

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degradação e transporte, uma vez que os compostos que forem adsorvidos/absorvidos aos sedimentos existirão numa concentração superior em relação aos presentes na coluna de água, expondo mais os organismos bentônicos do que os pelágicos (ROQUE, 2009).

PEREIRA (2003) verificou que altos níveis de TBARS foram encontrados em organismos coletados em locais contaminados por coliformes fecais, e também são associados frequentemente à presença de metais-traço. Ficou claro também que houve consumo de GSH e aumentos das enzimas CAT e GPx como mecanismos antioxidantes compensatórios. Isso permite a conclusão que o Pontal da Daniela atualmente não parece ser um sítio que sirva como parâmetro confiável de qualidade ambiental, sendo necessário buscar outros locais em futuros trabalhos comparativos. Nos outros sítios amostrais estudados na Lagoa da Conceição também é possível constatar situações de aumento de estresse oxidativo nos animais. Em todos os pontos amostrados houve um aumento significativo da CAT, com destaque para o Rio Vermelho que apresentou as maiores atividades médias (184,20 mmol.min-1.g-1 ). A catalase é uma enzima que responde em uma segunda linha de defesa dos organismos expostos a xenobiontes, indicando que houve uma mobilização dessa enzima de forma geral nos berbigões coletados na Lagoa da Conceição. Em todos os sítios houve uma queda de SOD ao compararmos com os dados de 2002, sendo as mais expressivas em P1, P3 e P4, evidenciando uma acentuação nos níveis de contaminação. Evidentemente, há uma variação metabólica dos organismos durante as estações do ano, bem como dos biomarcadores, conforme foi constatado por WILHELM FILHO et al. (2001). VIDAL et al. (2001) também constataram variações sazonais dos biomarcadores em Corbicula fluminea (Muller) relacionadas principalmente com as variações de temperatura da água e período reprodutivo da espécie, sendo que nos períodos quentes do ano houve maior atividade reprodutiva, refletida na

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antioxidante. De forma análoga, REGOLI et al. (2001) verificaram em Adamussium colbecki, um bivalve bioindicador da Antártida, maiores respostas antioxidantes no verão.

Uma evidência marcante foram os diferentes padrões de tamanho encontrados nos sítios da Lagoa, talvez indicando uma inibição do crescimento pela mobilização da atividade metabólica no combate à contaminação. Isso ficou mais evidente em P1, onde os indivíduos apresentavam um diâmetro médio de 16 mm e aproximadamente 1,5 g de massa total, valores muito inferiores aos encontrados em Pc. No Pontal da Daniela os indivíduos tinham um diâmetro médio de 32 mm e uma massa aproximada de 12,0 g. Nos demais locais amostrados da lagoa, a média do diâmetro foi de 22 mm e a massa média de 4,2 g. FARIA (2008) também detectou diferenças no tamanho dos berbigões coletados em áreas contaminadas, indicando relação da inibição do crescimento com emissão de efluentes domésticos. Também foi relatada, no mesmo estudo, uma diferença na textura dos órgãos digestores, apresentando menos consistência nos locais poluídos. WILHELM FILHO et al. (2001) encontraram a mesma situação nos fígados de peixes expostos cronicamente a poluentes. No presente estudo esta mudança de textura foi observada com mais evidência em P1, onde ocorreram os animais com tamanho médio mais reduzido. O sítio do Trapiche do Rio Vermelho (P1) apresenta uma grande influência antrópica depletando gradativamente a população de berbigões. As atividades turísticas aumentam a cada ano no município e a circulação de embarcações nesse local também. Dados das cooperativas COOPEBARCO e COOPERCOSTA apontam um crescimento do número de barcos de transporte coletivo na área da Lagoa da Conceição de aproximadamente 15% de 2002 a 2009. São 69 embarcações registradas atualmente para a região e 59 registradas em 2002. Sem contar ainda os barcos de lazer, sobre os quais os números não foram informados pela Capitania dos Portos, que provavelmente aumentaram bastante com o aumento do poder

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aquisitivo da população. Além de contaminar a água com o combustível, essas embarcações são pintadas com tintas que inibem a fixação de moluscos e crustáceos em seus cascos, gerando também resíduos químicos disponíveis na água.

O chumbo é um dos metais presentes como aditivo na gasolina e presente em tintas, o que provavelmente contribui para o aumento dos níveis desse metal no ambiente (PEREIRA, 2003). Além disso, o zinco também é muito utilizado como componente de tintas como inibidor de corrosão e também amplamente utilizado na indústria de galvanoplastia química. Alguns estudos, como o de CALAMARI & ZHANG (2002) na China, apontam para a contaminação de organismos aquáticos por metais originários de pesticidas, o que não se aplica ao ambiente da Lagoa da Conceição já que há pouca atividade agrícola no seu entorno. LAMOTTE et al. (1996) indicaram que existe uma associação preferencial de alguns metais com sedimentos de granulação fina, porém zinco, cobre, cromo e prata não apresentam correlação com esse tipo de sedimento e possivelmente estejam relacionados à matéria orgânica. Vale lembrar que Anomalocardia brasiliana tem preferência por sedimentos de granulação fina. RIVAIL (1996) e GARCIA (1999) indicaram um aumento nos valores de metais-traço no sedimento da Lagoa da Conceição e associaram esse processo ao crescimento populacional e o consequente aumento do despejo de efluentes e do uso de embarcações, causando um efeito estressante no ambiente lagunar.

PEREIRA (2003) relatou que as atividades relacionadas ao aumento populacional vêm ocasionando sérias intervenções nos ambientes aquáticos, trazendo prejuízos à fauna e flora, aumentando os riscos de exposição à saúde humana, considerando a capacidade de bioacumulação de xenobióticos por organismos aquáticos, transferidos ao homem por meio da cadeia trófica.

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Adicionalmente, no Rio Vermelho há emissão de esgoto doméstico e a influência dos resíduos provenientes da porção noroeste da Lagoa, comunidade conhecida como Costa da Lagoa, que vem recebendo um número cada vez maior de turistas e pessoas que lá fixam residência. A ocorrência do vento nordeste carrega esses efluentes da Costa da Lagoa para a região do Trapiche, contribuindo para a contaminação dos animais. Somado aos fatores anteriores, há ainda a influência da plantação de Pinus que são amensais, liberando uma resina ácida que é carregada pelas chuvas para o leito lagunar. Todos esses fatores devem contribuir para a situação de estresse gerada nesses organismos, aspectos já mencionados por PEREIRA (2003).

A exposição acentuada desses organismos à contaminação pode ser observada através da queda do valor de TBARS encontrada atualmente. Espera-se que, em locais recentemente contaminados ou com níveis relativamente menores de contaminantes, apresentem um valor maior em termos de processo de lipoperoxidação. Por outro lado, a queda desses níveis pode permitir a leitura de que a situação de contaminação ambiental esteja tão acentuada que o organismo nem mesmo consiga reagir adequadamente à contaminação existente, de caráter crônico e quantitativamente relevante. De forma semelhante, FARIA (2008) encontrou a mesma situação na Tapera da Base, sítio que apresentou valores de TBARS inferiores ao sítio controle, indicando também uma exposição crônica e severa a xenobióticos (CESA; FARIA, 2008).

A contaminação ambiental neste sítio fica fortemente sugerida pela indução das enzimas CAT, GR e GPx, enquanto que a GST e SOD foram inibidas, aparentemente sem poder utilizar adequadamente a GSH, que foi depletada, para a conjugação de xenobióticos no processo de biotransformação dos mesmos. Conforme já mencionado anteriormente, o aumento da descarga de xenobióticos de origem farmacêutica pode estar induzindo algumas defesas antioxidantes enzimáticas, efeito que estaria refletido no aumento dos níveis de coliformes totais e

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fecais. Neste sentido, ZOTTIS (2005) evidenciou em ostras e mexilhões uma relação direta entre os aumentos de coliformes e o aumento das defesas antioxidantes em malacoculturas de três sítios amostrais na Ilha de Santa Catarina. Em relação à orla da Avenida Osni Ortiga (P2), situada na porção sul da Lagoa, é importante salientar que esse sítio amostral, assim como o P4, localiza-se na região onde há um estrangulamento do corpo lagunar. Essa parte mantém contato com a porção maior apenas por um canal de navegação com aproximadamente 4m de largura e 3m de profundidade média, sofrendo pouca influência das variações de maré e do aporte de água salgada vindo do canal da Barra da Lagoa. Nesse sítio, a influência dos ventos é muito mais significativa. Analisando o comportamento dos biomarcadores, houve um padrão muito semelhante ao P1, ao compararmos com o trabalho de PEREIRA (2003). Em P2 ocorreu uma queda nos valores de TBARS e um aumento nas atividades de GR, CAT e GPx, bem como diminuição da GST, SOD e dos níveis de GSH, à semelhança do que havia sido constatado no P1. PEREIRA (2003) evidenciou em seu estudo que a contaminação por coliformes fecais poderia ser mais deletéria para o berbigão do que a presença de metais-traço per se.

Correlação entre a elevação dos indicadores microbiológicos (CF e CT) e as alterações associadas às defesas antioxidantes de peixes em regiões poluídas por dejetos domésticos já foi demonstrada anteriormente por OAKES (2004) na Europa e em moluscos cultivados na Ilha de Santa Catarina (ZOTTIS, 2005), e também no berbigão, relacionando os biomarcadores de estresse oxidativo com doenças de veiculação hídrica (CESA; FARIA, 2008). Esta área, orla da Avenida Osni Ortiga, está exposta diretamente à influência antrópica da região central e comercial da Lagoa da Conceição. Fica evidente o processo de contaminação pelo aumento desordenado do turismo e da ocupação do bairro, visto que é a preferida por turistas e imigrantes que chegam ao município.

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O P3, a Praia Ponta das Almas, é o local com maior influência da dinâmica de marés e do fluxo de nutrientes do canal da Barra. Teoricamente isso também possibilitaria maior dispersão ou diluição dos contaminantes disponíveis na água. Assim como nos demais pontos, ocorreu uma queda nos valores de TBARS e SOD. Entretanto, e contrariamente ao verificado anteriormente nos pontos controle, P1 e P2, foi constatado um aumento dos níveis de GSH e, coerente e concomitantemente, na atividade da GST e na queda da GR. Por outro lado, houve aumentos em relação à CAT e GPx, o que indica uma possível resposta antioxidante adequada à exposição aos xenobióticos.

Os principais produtos da ação antrópica nesse local são os efluentes domésticos provenientes da ocupação das regiões da Costa da Lagoa e do Canto dos Araçás e os combustíveis e tintas oriundos da grande circulação de embarcações que transportam moradores e turistas para a região da Costa. É importante destacar a relação do aumento do poder econômico do país e do poder aquisitivo da população fez aumentar o número de embarcações de esportes náuticos, principalmente no estado de Santa Catarina. A Praia do LIC (P4), assim como P2, não sofre influência evidente da dinâmica de marés da Lagoa. Situado na porção sudoeste do corpo lagunar, esse ponto sofre basicamente com o despejo de esgotos já que a ocupação do local é basicamente de residências locais, além de combustíveis e tintas associados às atividades de esportes náuticos. Houve um aumento significativo do TBARS (178,36 nmol.g-1), maior índice de lipoperoxidação dentre os pontos analisados nesse estudo, concomitatemente a uma depleção de GSH e inibição da atividade de GR, GST e SOD, paralelamente a aumentos das atividades da CAT e GPx. Provavelmente esse local apresente um crescente de contaminação e bioacumulação gerando uma resposta positiva dos organismos a esse processo, sugerindo que nesse ponto os berbigões ainda possuem capacidade de compensar a agressão relativa aos xenobióticos presentes no ambiente.

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Na porção sul da Lagoa, onde está situada a Praia do LIC (P4), observa-se um grande acúmulo de talófitas que se aproveitam do excesso de matéria orgânica disponível em seu processo reprodutivo e, posteriormente, são decompostas por bactérias, eutrofizando o ambiente e liberando enxofre para a atmosfera. Esse tipo de contaminação ganha mais destaque na mídia, pois é mais perceptível visualmente e pelo odor que exala. Segundo FONSECA (2004), essa porção da lagoa apresenta maior índice de nutrientes disponíveis. Esse aporte, proveniente da falta de saneamento, soma-se à baixa renovação da água nesse local e contribui para o processo de eutrofização, e a resposta encontrada nos biomarcadores de estresse oxidativo aparentemente confirmaria uma condição ambiental deteriorada. Os candidatos mais prováveis desta contaminação detectada pelo crescente índice de coliformes fecais (FATMA, 2009), seriam produtos farmacêuticos (ROQUE, 2009), carreados por efluentes domésticos despejados junto da Lagoa da Conceição. Várias destas substâncias, notadamente analgésicas, ansiolíticas e antidepressivas têm a capacidade de induzir estresse oxidativo em diferentes organismos aquáticos (SANTOS et al., 2008).

É notório o aumento da pressão antrópica sobre a Lagoa da Conceição, um dos principais pontos turísticos do município de Florianópolis. Esse ambiente convive com o crescimento desordenado do turismo, da população que ocupa seu entorno e a conseqüente especulação imobiliária em um dos locais paisagisticamente mais privilegiados e economicamente mais valorizados de Santa Catarina. Vários estudos anteriores já apontavam para a degradação ambiental afetando elementos da fauna e da flora locais, principalmente pelas alterações físico-químicas da água. Somado a isso, o local não apresenta infra-estrutura, especialmente relacionadas ao saneamento, para suportar o aumento populacional que vem sofrendo. É importante que se tomem providências no sentido de minimizar os impactos sobre esse local já que os indícios são de um processo acentuado e persistente de degradação ambiental.

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Desde 2003 o Ministério Público Federal vem agindo no sentido de impedir a ocupação das margens do corpo lagunar. Além disso, o órgão quer que o município seja obrigado a adotar medidas de fiscalização e punitivas a quaisquer tipos de atitudes que gerem impactos e degradação aos recursos naturais da Lagoa da Conceição.

Fica claro através dos estudos já realizados anteriormente e no presente trabalho que a situação da Lagoa da Conceição é crítica em termos ambientais. Os biomarcadores de estresse oxidativo encontrados no órgão digestor do berbigão indicam claramente que este organismo e provavelmente outros relacionados com este sistema lacustre estão expostos a uma condição ambiental crescentemente adversa. Neste sentido reforça a condição de que os biomarcadores de estresse oxidativo constituem uma ferramenta importante, tanto no diagnóstico como no monitoramento ambiental. São necessárias medidas urgentes, tanto nas políticas públicas quanto nas atividades mitigatórias diretas, envolvendo todos os setores da sociedade e, principalmente, a comunidade que utiliza de uma forma ou de outra os recursos naturais desse importante ecossistema. Educação ambiental e um plano de manejo bem executados são passos importantes para recuperar um dos principais pontos turísticos de Santa Catarina.

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Conclusões • As respostas da maioria dos biomarcadores de estresse oxidativo nos sítios amostrais estudados apontam para uma crescente contaminação da Lagoa da Conceição, constatado tanto pela indução de algumas enzimas (CAT, GPx e GR), como por sua inibição (SOD e GST). • Alguns sítios, como o Trapiche do Rio Vermelho, a Praia da Avenida Osni Ortiga, incluindo o próprio sítio controle, Pontal da Daniela, apresentaram um quadro de maior deterioração ambiental. • A contaminação aquática, diretamente verificada pelo aumento dos níveis de coliformes fecais e indiretamente pelos biomarcadores de estresse oxidativo, está aparentemente vinculada aos efluentes de origem doméstica, sugerindo uma ligação direta entre o crescimento populacional e a falta de saneamento básico compatível com essa expansão. • Provavelmente, o despejo de fármacos de origem médica e veterinária, seriam as fontes mais prováveis dessa contaminação, segundo dados mais recentes da literatura congênere. • O estudo dos biomarcadores de estresse oxidativo em Anomalocardia brasiliana constitui importante ferramenta de diagnóstico e monitoramento da Lagoa da Conceição.

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Perspectivas futuras • Aprofundar o estudo dos biomarcadores de estresse oxidativo em Anomalocardia brasiliana, através da análise de outros marcadores no órgão digestor desta espécie de molusco, como o dano a proteínas e ao material genético. • Analisar outros parâmetros físico-químicos adicionais e, principalmente, das substâncias que provavelmente estão afetando os biomarcadores de estresse oxidativo e contribuindo com a contaminação ambiental da Lagoa da Conceição, como os fármacos associados ao despejo de efluentes domésticos. • Disponibilizar os dados obtidos nesse estudo, que indicam altos índices de contaminação, pode servir como um alerta para que se repense as atitudes e políticas de preservação da Lagoa da Conceição. • Tentar estabelecer um sistema de monitoramento local permanente, indicando possíveis atividades de manejo para conservação desse importante sistema lagunar. • O presente trabalho, assim como outros estudos já citados anteriormente, evidencia a importância do uso de organismos bioindicadores no monitoramento ambiental. Na Lagoa da Conceição, Anomalocardia brasiliana torna-se uma espécie-chave neste processo. Seria importante que essa ferramenta se tornasse um instrumento para acompanhamento deste ecossistema.

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