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ELIZABETH CRISTINA PÉREZ HURTADO

MODIFICAÇÃO FENOTÍPICA DO MELANOMA MURINO INDUZIDA PELA

INTERAÇÃO COM CÉLULAS B-1 – MECANISMOS DE TRANSDUÇÃO DE

SINAL

São Paulo 2008

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. José Daniel Lopes Co-orientador: Joel Jr. Machado

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ii

Pérez, Elizabeth Cristina Modificação fenotípica do melanoma murino induzida pela interação com células B-1 – Mecanismos de Transdução de Sinal. / Elizabeth Cristina Pérez. – São Paulo, 2008. xxi, 109f. Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia Título em Inglês: B-1 lymphocytes increase metastatic behavior of melanoma cells through the extracellular signal-regulated kinase pathway. 1. Células B16. 2. Linfócitos B-1. 3. ERK. 4. Metástases.

iii

Universidade Federal de São Paulo

Escola Paulista de Medicina

Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia

Chefe do Departamento: Prof. Dr. José Daniel Lopes

Coordenador do Curso de Pós-graduação: Prof. Dr. Renato Arruda Mortara

iv




SINAL

Presidente da banca: Prof. Dr. José Daniel Lopes

BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Maria Mitzi Brentani

Dra. Nathalie Cella

Profa. Dra. Célia Regina Whitaker Carneiro

Prof. Dr. Hugo Pequeno Monteiro

Aprovada em: 23/01/2008

v

Este trabalho foi desenvolvido na disciplina de

Imunologia do Departamento de Microbiologia,

Imunologia e Parasitologia da Universidade

Federal de São Paulo, com auxílios financeiros

concedidos pela Fundação de Amparo a

Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP

processo 03/05176-8)

vi

Dedicatória

Este trabalho é dedicado :

As memórias da minha mãe Carmen e da minha avó Rackel, Aos meus adorados homens: meu esposo Harold e meus filhos Juan David

e Luis Felipe

A meu pai Guillermo e meus irmãos Carolina e Guillermo

vii

Agradecimentos

Ao Prof. Dr. José Daniel Lopes, pelo seu carinhoso acolhimento, dedicação,

amizade, apoio, ensinamentos e auxílio na redação desta tese.

Ao Prof. Dr. Joel Machado pelo espírito crítico no desenvolvimento deste

trabalho, auxílio na redação desta tese e pela valiosa contribuição na realização

do artigo científico.

Ao Prof. Dr. Mario Mariano pela amizade e valiosas contribuições.

Às Profs. Dras. Célia Regina Whitaker Carneiro, Ieda Maria Longo Maugéri,

Miriam Galvonas Jasiulionis e Zulma Fernandes Peixinho, pela amizade, carinho e

valiosas contribuições.

À Prof. Dra. Marimélia Porcionatto (INFAR) pelo carinho, amizade e

grandes ensinamentos.

À Dra. Valderes Bastos Valero e sua equipe: Amarildo, Luis, Renato do

Laboratório de Experimentação animal do INFAR por seu grande carinho, amizade

e disposição no fornecimento de animais.

À Prof. Dra. Elaine Guadalupe Rodrigues, pela amizade e colaboração no

fornecimento de camundongos,

À Prof. Dra. Edna Freymüller (CEME) e sua equipe: André, Isabel, Márcia e

Patrícia, pelo carinho, amizade, disposição e colaboração nas análises por

microscopia eletrônica.

viii

Ao Prof. Dr. João Bosco Pesqueiro e sua equipe: Felipe, Raphael, Giuliana,

Jõao e demais estudantes, pela amizade, disposição e valiosa colaboração na

realização dos ensaios e análises por RT-PCR em tempo real,

Ao Prof. Dr. Sergio Schenkman e sua equipe pela amizade e colaboração

no empréstimo do sistema de foto-documentação utilizado nas análises por RT-

PCR realizadas durante este trabalho.

Aos funcionários da Disciplina de Imunologia: Aparecido Mendes, Creusa

Marina, Creusa Rosa, Eraldina do Nascimento, Geová dos Santos, Gisélia Lopes,

Ivone Mozat, Naide, Neta e Zélia Pereira, pela amizade, colaboração e convívio

alegre durante estes anos.

À Mércia, secretária da pós-graduação do departamento, pela amizade e

auxílio constante.

Aos professores, funcionários e colegas da disciplina de Biologia Celular

(oitavo andar) pela colaboração e boa disposição.

As amigas do “Lab 2”, Érika Kioshima (Londri), Fabiana Aliperti (Fabico),

Juliana Maricato (Juju), Lívia Pugliese e Patrícia Xander (Patlicia), pela

cumplicidade, carinho, apoio, clima alegre e grande ajuda na correção desta tese.

A todos os amigos do “Lab1 e Lab2”, Adriana, Aline (pulga), Bruno, Camila,

Creusa, Nadia, Marcela, Márcia, Patrícia, Renata, Toshie pela amizade, carinho e

convívio alegre e estimulante durante a realização deste trabalho.

À Fernanda Staquicini, colega que defendeu doutorado 3 anos atrás,

obrigada pela amizade e acolhida carinhosa ao chegar na Imuno assim como por

me ensinar o mundo das B-1.

ix

Aos amigos da Imuno, Inferno (Ronni Brito), Gugu (André), Carla Squaiella,

Juliana Mussalem, Tatiana, Adriana, Alice, Fernanda Molognoni, Karina, Tatiana

Rica, Ana Flavia Popi, Felipe, Fernanda, Helena, Maiko, Mauro, Ricardo, Carol,

Janaina, pelo carinho, amizade e simpatia.

Às amigas e amigos com quem tive oportunidade de trabalhar e que há

algum tempo já trilham seu próprio caminho: Ana Cristina Campos, Ana Flavia

Vigna (Oxigenada), Beatriz Helena Pizarro, Daniela Grosso, Fernanda Staquicini,

Hellen Fuzii, Ludmila Chinen, Luciana, Luciano Feitosa, Luiz Cláudio Godoy,

Priscila Penteado, Renata Ananias, Thalita Abrão; obrigada pelo carinho, amizade

e feliz convivência.

À FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) por

financiar este trabalho.

À minha “Virgencita” e aos meus Anjos protetores pela companhia,

iluminação e proteção de sempre.

E por suposto a minha família, meu esposo Harold e meus dos filhotes Juan

David e Luis Felipe por seu grande apoio, alegria, amor e carinho durantes estes

anos de correria, muitíssimo obrigada.

x

Sumário

Dedicatória..............................................................................................................VI

Agradecimentos......................................................................................................VII

Lista de Gráficos....................................................................................................XIII

Lista de Tabelas....................................................................................................XIV

Lista de Figuras......................................................................................................XV

Lista de Abreviaturas e Símbolos........................................................................XVII

RESUMO...............................................................................................................XX

1. INTRODUÇÃO......................................................................................................1

2. OBJETIVOS........................................................................................................16

2. MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................18

2.1 MATERIAIS.......................................................................................................19

2.1.1 Soluções Rotineiras.......................................................................................19

2.1.1.1 Soluções para SDS-PAGE.........................................................................19

2.1.1.2 Soluções para Coloração por Comassie Blue............................................20

2.1.1.3 Soluções para Immunoblotting...................................................................20

2.1.1.4 Soluções para ELISA.................................................................................20

2.1.1.5 Soluções para cultura de células................................................................21

2.1.2 Animais..........................................................................................................21

2.2 MÉTODOS........................................................................................................22

2.2.1 Cultura de células e tratamentos...................................................................22

2.2.2 Análises de moléculas de superfície por citometria de fluxo.........................24

xi

2.2.3 Ensaio de viabilidade celular por Trypan blue...............................................24

2.2.4 Ensaio de inibição da adesão........................................................................25

2.2.5 Ensaio de metástases experimental..............................................................25

2.2.6 Preparação de extratos celulares..................................................................26

2.2.7 Dosagem protéica pelo micrométodo de Bradford........................................26

2.2.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio (SDS-

PAGE).....................................................................................................................26

2.2.9 Transferência de proteínas de nitrocelulose (Immunoblot ou Western

blot).........................................................................................................................28

2.2.10 Microscopia eletrônica de transmissão........................................................29

2.2.11 Ensaios de proliferação celular....................................................................30

2.2.11.1 Incorporação de timidina tritiada...............................................................30

2.2.11.2 MTT (tetrazolium salt3-(-4,4-dimethylthiazol-2-yl_-2,5-diphenyltetrazolium

bromide...................................................................................................................30

2.2.12 Dosagem de citocinas no sobrenadante de cultura…………………............31

2.2.13 Obtenção de RNA total................................................................................32

2.2.14 RT-PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)...............33

2.2.14.1 Análise qualitativa por RT-PCR................................................................34

2.2.14.2 Análise quantitativa por RT-PCR em tempo real......................................36

2.2.15 Análise Estatística.......................................................................................37

3 RESULTADOS....................................................................................................39

3.1 Caracterização do sistema de co-cultivo..........................................................40

3.2 Células B-1 e B16 fisicamente interagem durante o co-cultivo........................41

xii

3.3 Fosforilação de ERK está aumentada nas células B16 após interação com

células B-1..............................................................................................................43

3.4 Aumento no potencial metastático de células B16 é dependente dos níveis de

ERK fosforilado.......................................................................................................44

3.5 Células B-1 não induzem aumento na proliferação de células B16.................46

3.6 Células B-1 induzem a expressão de genes relacionados com metástases nas

células B16.............................................................................................................46

3.7 Níveis basais de fosforilação de ERK nas células B-1 são necessários para

induzir aumento no potencial metastático das células B16....................................47

3.8 Níveis basais de fosforilação de ERK nas células B16 são inalterados pelo

estímulo com IL-10.................................................................................................50

4. DISCUSSÃO....................................................................................................,,.67

5. CONCLUSÕES...................................................................................................75

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................92

ABSTRACT

ANEXOS

xiii

Lista de Gráficos

Gráfico 1. Via canônica de Ras-Raf-MEK-ERK.....................................................15

xiv

Lista de Tabelas

Tabela 1. Classificação clínica de melanoma........................................................11

Tabela 2. Composição de gel para SDS-PAGE.....................................................27

Tabela 3. Seqüências oligo-nucleotídicas dos primers sense (S) e anti-sense (AS),

temperatura de anelamento (°C) e o tamanho do produto do PCR em pares de

bases (BP), dos transcritos estudados por RT-PCR qualitativo.............................35

Tabela 4. Seqüências oligo-nucleotídicas dos primers sense (S) e anti-sense (AS)

e tamanho do produto do PCR em pares de bases (bp), dos transcritos estudados

por RT-PCR em tempo real....................................................................................37

xv

Lista de Figuras

Figura 1. Células B-1 são eliminadas eficientemente das co-culturas após

aspiração do sobrenadante....................................................................................51

Figura 2. Células B-1 aumentam o potencial metastático das células B16...........52

Figura 3. Células B-1 induzem aumento no potencial metastático de células B16

independentemente da adesão celular...................................................................53

Figura 4. Fatores solúveis das células B-1 não contribuem para o aumento da

capacidade metastática das células B16................................................................54

Figura 5. Células B16 e B-1 interagem fisicamente durante o co-cultivo..............55

Figura 6. Células B-1 induzem aumento nos níveis de fosforilação de ERK nas

células B16.............................................................................................................56

Figura 7. Níveis basais de fosforilação de ERK em células B16 e B-1 são inibidos

pelo tratamento com PD98059...............................................................................57

Figura 8. O aumento no potencial metastático das células B16 induzido pelo

contato com células B-1 é dependente dos níveis de ERK fosforilado..................58

Figura 9. Células B-1 não induzem aumento na proliferação das células B16......59

Figura 10. Qualidade do RNA total após extração.................................................60

Figura 11. Células B-1 induzem a expressão de CXCR4 e MMP-9 nas células

B16..........................................................................................................................61

Figura 12. Produção de IL-10 por células B-1.......................................................62

Figura 13. Níveis basais de fosforilação de ERK nas células B-1 são necessários

para induzir aumento no potencial metastático das células B16............................63

xvi

Figura 14. Níveis de fosforilação de Stat3 nas células B16 antes e após co-cultivo

com células B-1......................................................................................................64

Figura 15. Níveis de ERK fosforilado e comportamento metastático das células

B16 não são aumentados por IL-10 recombinante.................................................65

Figura 16. Células B-1 de animais knock-out para IL-10 na são capazes de induzir

aumento no potencial metastático das células B16, mesmo na presença de IL-10

recombinante..........................................................................................................66

xvii

Lista de Abreviaturas e Símbolos

% Porcentagem

µg Micrograma

µL Microlitro

µM Micromolar

BCR B cell receptor

bp Pares de bases

BSA Soro albumina bovina

cDNA DNA complementar

CXCR4 Chemokine (C-X-C motif) receptor

DEPC Dietil pirocarbonato

DMSO Dimetilsulfóxido

DO Densidade óptica

EDTA Ácido etilenodiamino tetracético

ELISA Enzyme linked Immunosorbent Assay

ERK Extracellular signal-regulated kinase

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FITC Isotiocianato de fluoresceína

g Gramas

GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

GPDH Gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

H Hora

xviii

IgD Imunoglobulina D


IgM Imunoglobulina M

IL Interleucina

JAKs Janus-activated kinase

JNK June N-terminal kinase

kDA Kilo Dalton

LPS Lipopolissacarídeo

MAPK Mitogen activated protein kinase

MCP-1/CCL2 Monocyte chemotactic protein -1/ chemokine (C-C motif)

M-CSF Monocyte-colony-stimulating factor

MDSC Myeloid-derived suppressor cells

mL Mililitro

mM Milimolar

MMPs Matrix Metalloproteinases

MMP-9 Matrix Metalloproteinase-9

NK Natural killer

NO Óxido nítrico

PBS Tampão salino fosfato

PKC Protein kinase C

PMSF Fluoreto de fenilmetanosulfonato

q.s.p quantidade suficiente para

RGP Radial growth phase

ROI Reativos intermediários de oxigênio

xix

rpm Rotação por minuto

RTKs Receptores tirosina kinase


RT-PCR Reverse transcriptase polymerase chain reaction

SDF-1/CXCL12 Stromal cell-derived factor 1

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphte polyacrylamide gel

STAT Signal Transducers and Activators of Transcription

Stat3 Signal Transducer and Activator of Transcription 3

TAMs Tumour-associated macrophages

TNF Tumour necrosis factor

V Volts

v/v Volume a volume

VEGF-A Vascular endothelial growth factor - A

VGP Vertical growth phase

W Wats

W Wats

X Vezes

xx

Resumo

Evidências indicam que tumores necessitam constante influxo de células mielo-

monocíticas para sustentar seu comportamento maligno. Esse fato é devido a

fatores derivados do tumor, os quais recrutam e induzem diferenciação funcional

de células mielo-monocíticas, das quais a maioria são macrófagos. Embora os

precursores clássicos de macrófagos sejam linhagens mielóides, linhagens

linfóides como células B-1, subtipo de linfócitos B encontrados

predominantemente nas cavidades pleural e peritoneal são também capazes de

migrar para focos inflamatórios e se diferenciar em fagócitos mononucleares

apresentando fenótipo semelhante ao dos macrófagos. No presente trabalho foi

avaliada a interação entre células B16 de melanoma murino e células B-1 durante

o co-cultivo e se esta interação influencia ativação de vias de transdução de sinal

envolvidas com progressão e metástases. Utilizando sistema de co-cultura in vitro,

foi mostrado que células B16 e células B-1 interagem fisicamente após 48 horas

de co-cultura. Além disso, esta interação resulta em aumento da expressão de

genes associados com metástases como MMP-9 e CXCR4 nas células B16 que

favorecem o aumento na capacidade metastática destas células, como revelado

por ensaios experimentais de metástases in vivo. Este trabalho também revela

evidências de que células B16 apresentam marcado aumento na fosforilação da

quinase regulada por sinais extracelulares (ERK) após contato com células B-1. A

inibição da fosforilação de ERK com inibidor farmacológico da quinase ascendente

de ERK, MEK1/2, suprime fortemente a expressão de MMP-9 e CXCR4 e inibe o

aumento da capacidade metastática das células B16 induzido por contato com

xxi

células B-1. Adicionalmente, níveis constitutivos de ERK fosforilado nas células B-

1 são necessários para que estas células sejam capazes de induzir aumento no

potencial metastático das células B16. Nossos resultados em conjunto mostram

que células B-1 podem contribuir na aquisição de um fenótipo mais agressivo das

células tumorais.

1. INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

Uma das principais características no desenvolvimento do câncer é a

formação de metástases na qual células tumorais provenientes do tumor primário

invadem e colonizam tecidos ou órgãos distantes do sítio de origem (Hanahan &

Weinberg, 2000; Balkwill & Mantovani, 2001; Langley & Fidler, 2007; Aguirre-

Ghiso, 2007).

Embora grandes avanços tenham sido realizados na prevenção,

diagnóstico, técnicas cirúrgicas e terapias adjuvantes, a maior parte das mortes

em câncer são resultado da formação de metástases resistentes a terapias

convencionais. Por esta razão, o entendimento dos mecanismos celulares e

moleculares envolvidos na formação de metástases é importante para o

desenvolvimento de novos alvos terapêuticos

A formação de metástases é um processo complexo e seletivo que consiste

em vários passos seqüenciais e relacionados, nos quais células tumorais precisam

adquirir a capacidade de invadir tecidos adjacentes para formar tumores

secundários ou metástases (Poste & Fidler, 1980; Fidler, 2002a). Neste processo,

células com capacidade de metastatizar separam-se do tumor primário, entram na

circulação ao invadirem a parede dos vasos sanguíneos ou linfáticos, disseminam-

se e, posteriormente, aderem a órgãos determinados. Para que todos estes

eventos ocorram, o aumento na expressão de moléculas de adesão celular como

integrinas, proteases como metaloproteinases (MMPs) e moléculas quimio-

2

atraentes como citocinas e quimiocinas são essenciais para invasão e

metástatização das células tumorais (Sierra, 2005; Deryugina & Quigley, 2006).

Observações clínicas em pacientes com câncer e estudos experimentais

em camundongos têm demonstrado que certos tipos de tumores metastatizam

para órgãos específicos independentemente da anatomia vascular, do tamanho do

tumor ou do número de células tumorais recebidas em cada órgão (Sierra, 2005;

Fokas et al., 2007). Para explicar essa especificidade, a teoria soil and seed,

proposta por Paget em 1889, sustenta que órgãos diferentes (soil) provêm

condições de crescimento ótimas para cânceres específicos (seed; revisado por

Fidler, 2002b).

Assim como sugerido por Paget, outros autores (Balkwill & Mantovani,

2001; Coussens & Werb, 2002; Croci et al., 2007) têm demonstrado que durante a

progressão tumoral e metástase ocorre comunicação ativa (cross-talk) entre

células tumorais e seu estroma. Esta comunicação pode ser mediada tanto pelo

contato direto entre as células, como pela produção de citocinas, quimiocinas,

fatores de crescimento e metaloproteinases, que favorecem o avanço das células

tumorais para sítios distantes do tumor primário (Lehmann et al., 1987; Christofori

& Semb, 1999; McGary et al., 2002; Li et al., 2002). A interação entre células

estromais e tumorais sugere que o tumor não é apenas uma massa composta de

células malignas, e sim, um tecido com ampla diversidade celular que incluem

células residentes como adipócitos, fibroblastos, populações de células

hematopoiéticas migratórias como monócitos, macrófagos, neutrófilos, mastócitos,

eosinófilos, linfócitos T e B (Coussens et al., 1999; Coussens et al., 2000; Kuper et

al., 2000; Balkwill & Mantovani, 2001; Di Carlo et al., 2001; Coussens & Werb,

3

2002; Joyce, 2005; Inoue et al., 2006). Essa diversidade celular produz assim um

único micro-ambiente o qual é capaz de modificar as propriedades neoplásicas

das células tumorais (Coussens & Werb, 2002; Croci et al., 2007).

Macrófagos associados ao tumor (TAMs, tumor-associated

macrophages)

Macrófagos associados ao tumor (TAMs) representam o maior componente

do infiltrado inflamatório da maioria dos tumores (Mantovani et al., 1992, Balkwill &

Mantovani, 2001). No entanto, a alta freqüência destas células no infiltrado de

muitos cânceres humanos está associada a mau prognóstico (Mantovani et al.,

2006). TAMs são derivados de monócitos circulantes os quais são recrutados ao

sítio do tumor por fatores quimiotáticos como a proteína quimiotática para

monócitos - 1 [MCP-1/CCL2; monocyte chemotactic protein-1/chemokine (C-C

motif) ligand 2], o fator estimulador de colônias de monócitos (M-CSF; monocyte-

colony-stimulating factor) e o fator de crescimento do endotélio vascular – A

(VEGF-A; vascular endothelial growth factor – A; Mantovani et al., 1992; Barleon

et al., 1996).

Macrófagos são células versáteis que representam a primeira linha de

defesa da resposta imune inata e não requerem adaptação ou imunização para

funcionar. Estas células têm papel importante no recrutamento e ativação de

linfócitos por meio da apresentação de antígenos (Sica et al., 2002). Entretanto,

devido a sua funcionalidade heterogênea, podem também realizar funções

supressoras (Rutherford et al., 1993). Em câncer, os macrófagos são importantes

4

células efetoras na imunidade contra tumores e, dependendo de seu fenótipo,

podem tanto prevenir como promover a progressão tumoral.

Fenotipicamente dois tipos de macrófagos têm sido descritos: macrófagos

ativados pela via clássica e macrófagos ativados pela via alternativa. Os

macrófagos ativados pela via clássica têm fenótipo IL-12high, IL-23high, IL-10low e

são ativados por IFN-γ e lipopolissacarídeo (LPS; Mantovani et al., 2004a). Em

contraste, os macrófagos ativados pela via alternativa têm fenótipo IL-12low, IL-

23low, IL-10high e são ativados por IL-4 e IL-13 (Gordon, 2003). Pelo fato de

possuírem perfil de citocinas IL-12 e IL-10 similares aos das células T CD4+ Th1 e

Th2, os macrófagos ativados classicamente e os ativados alternativamente têm

sido chamados de M1 e M2, respectivamente (Mills et al., 2000; Mantovani et al.,

2002; Mantovani et al., 2005).

Quanto à função destas células no câncer, macrófagos M1 são células

efetoras potentes que eliminam células tumorais e promovem a rejeição do tumor

(Mantovani et al., 1992, Guiducci et al., 2005). Entretanto, os macrófagos M2

favorecem crescimento e disseminação tumoral provavelmente por favorecer um

ambiente imunossupressor pela produção de IL-10 (Ibe et al., 2001), assim como

por promover proliferação celular, angiogênese, remodelação tissular e reparo

(Sica et al., 2002; Mantovani et al., 2002; Gordon, 2003; Mantovani et al., 2004b;

Condeelis & Pollard, 2006; Porta et al., 2007).

5

Células supressoras derivadas da linhagem mielóide (MDSC: myeloid-

derived suppressor cells)

Além dos TAMs, recentes estudos mostraram o acumulo de células

mielóides imaturas na medula óssea, linfonodos e baço tanto em pacientes com

câncer como em camundongos com tumores implantados (Young et al., 1987;

Garrity et al., 1997; Almand et al., 2001; Zea et al., 2005). Estas células,

denominadas atualmente como células supressoras derivadas da linhagem

mielóide (MDSC; myeloid-derived suppressor cells), expressam marcadores de

células mielóides Mac-1 (CD11b) e Gr-1+ (Ly6G) e são induzidas por fatores de

crescimento como o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), o fator

estimulador de colônias granulocítica e monocítica (GM-CSF) e por citocinas pro -

inflamatórias como IL-1β (Gabrilovich et al., 1996; Young et al., 1997; Bronte et al.,

1999; Song et al., 2005; Bunt et al., 2006). MDSC interferem com a imunidade

tumoral e promovem crescimento tumoral por inibir a citotoxidade das células

tumorais mediada por células NK (Susuki et al., 2005), e por bloquear a ativação

de linfócitos T CD4+ e CD8+ reativos ao tumor (Kusmartsev et al., 2000; Bronte et

al., 2001; Melani et al., 2003; Sinhá et al., 2005). Além disso, recentes estudos

mostraram que MDSC também interferem na imunidade anti-tumoral tanto por

induzir o acúmulo de células T reguladoras imunossupressoras (Gabrilovich et al.,

2001; Huang et al., 2006) como por interagir com macrófagos, os quais aumentam

a produção de IL-10 e decrescem os níveis de IL-12, favorecendo assim um

ambiente imunossupressor propício para a progressão tumoral (Sinhá et al.,

2007).

6

Células B-1

Embora esteja bem estabelecido que linhagens mielóides são os

precursores clássicos de macrófagos, recentes evidências sugerem que a

linhagem linfóide pode também gerar células fagocíticas com características de

macrófagos (macrófago-like), como as células B-1 (Almeida et al., 2001).

As células B-1, subtipo de células B, foram inicialmente identificadas como

células B CD5+ que participam de processos autoimunes em camundongos

(Hayakawa et al., 1983), com características similares às das células responsáveis

pela Leucemia Linfocítica Crônica em humanos (Boumsell et al., 1978). Estas

células diferem das células B-2 convencionais por sua localização anatômica,

expressão de marcadores de superfície e funcionalidade (Hayakawa et al., 1985,

Herzenberg et al., 1986; Martin et al., 2001).

Estas células representam somente 1-5% das células B totais em

camundongos, mas são a principal população de células B nas cavidades

peritoneal e pleural, podendo ser também encontradas no baço, linfonodos e

intestinos (Kantor & Herzenberg, 1993). Células B-1 diferem das células B-2

convencionais por expressar altos níveis de IgM (IgMhi), baixos níveis de IgD

(IgDlo) e B220 (B220lo) e por expressar CD43 (sialoforina, marcador de leucócitos,

exceto nas células B). A maioria das células B-1 das cavidades peritoneal e

pleural expressam CD11b ou Mac-1, marcador de macrófagos/granulócitos que é

parte do receptor do complemento CR3. Entretanto, a maioria das células B-1 do

baço não expressam este marcador (Kantor & Herzenberg, 1993). Além disso, as

células B-1 presentes na cavidade peritoneal podem ser subdividas em 3

7

populações pela expressão de CD5 (marcador de linfócitos T) e CD11b. As células

B-1a expressam CD5 e CD11b; células B-1b não expressam CD5 mas expressam

CD11b; e, mais recentemente descritas, as células B-1c expressam CD5 mas não

expressam CD11b (Herzenberg et al., 1986; Kantor et al., 1992; Hastings et al.,

2006).

As diferenças funcionais entre as células B-1 e B-2 são numerosas e têm

sido revisadas extensamente (Kantor & Herzenberg, 1993; Martin et al., 2001;

Berland and Wortis, 2002; Hardy, 2006). O repertório de anticorpos produzidos

pelas células B-1 é menos diverso, comparado ao das células B-2 convencionais,

refletindo assim na capacidade de resposta ao antígeno destas duas populações

celulares (Hardy et al., 1989; Baumgarth et al., 2005). Células B-2 respondem

eficientemente a antígenos protéicos e participam da resposta imune adaptativa

por sofrer hipermutação somática dos genes das imunoglobulinas e maturação da

afinidade do receptor. Em contraste, células B-1 respondem rapidamente a

antígenos timo-independentes, razão pela qual têm sido reconhecidas como

veículos da imunidade inata (Hardy, 1992; Herzenberg, 2000; Baumgarth et al.,

2005). Além disso, recentes observações mostraram diferenças funcionais mesmo

entre os subtipos de células B-1 (Alugupalli et al., 2004; Haas et al., 2005;

Alugupalli & Gerstein, 2005; Hsu et al., 2006). Células B-1a secretam de forma

espontânea IgM, provendo a primeira barreira contra bactérias encapsuladas

como Streptococcus pneumoniae. Em contraste, a produção de anticorpos por

células B-1b é induzida e está envolvida na remoção final de patógenos e na

proteção a longo prazo (Haas et al., 2005).

8

Por outro lado, diferentemente das células B-2, que têm período de vida

curto e são continuamente geradas por progenitores na medula óssea, as células

B-1 são mantidas por proliferação homeostática ou auto-renovação, como

mostram os experimentos de transferência adotiva de células B-1 em animais

imunodeficientes (Hayakawa et al., 1985; Forster & Rajewisky, 1987). Além disso,

células B-1 independem da sinalização via receptor de células B (BCR, B cell

receptor) para proliferar (Berland & Wortis, 2002; Casola et al., 2004). Karras e

colaboradores (1997) mostraram que esta propriedade de crescimento das células

B-1 é devida à ativação constitutiva da proteína Stat3 (Signal transducer and

activator of transcription 3), que substitui o sinal de proliferação mediado pela

ligação BCR-antígeno. Adicionalmente, células B-1 também expressam níveis

constitutivos da quinase regulada por sinais extracelulares (ERK: extracellular

signal-regulated kinase 1/2). Entretanto, o papel desta quinase nestas células,

ainda é desconhecido, uma vez que o bloqueio da ativação de ERK não afeta a

capacidade de auto-renovação das células B-1 (Wong et al., 2002).

Células B-1 também produzem grandes quantidades de interleucina 10 (IL-

10; O’Garra et al., 1992; Gieni et al., 1997), uma citocina do tipo Th2,

antiinflamatória, que participa da supressão de respostas pro-inflamatórias (Moore

et al., 1993). As células B-1 utilizam esta citocina como fator autócrino de

crescimento (O’Garra et al., 1992) e, por esta razão, a eliminação de células B-1

induzida pelo tratamento com anticorpos anti-IL-10 é acompanhada por drástica

diminuição dos títulos de imunoglobulinas séricas (Ishida et al., 1992).

A participação das células B-1 tem sido observada em várias patologias,

tanto em humanos como em camundongos (Aramaki et al., 1998; Mohan et al.,

9

1998; Hayakawa et al., 2000; Antsiferova et al., 2005; Hardy, 2006; Duan & Morel,

2006). A expansão de células B-1 autorreativas foi associada ao desenvolvimento

de doenças auto-imunes (Murakami et al., 1992; Murakami et al., 1995; Mohan et

al., 1998) e leucemias de células B (Chevallier et al., 1998). Além disso, Minoprio e

colaboradores (1993) demonstraram que na infecção chagásica experimental

ocorre aumento significativo de células B-1 esplênicas na fase aguda da doença e

ainda, camundongos Xid, geneticamente modificados e desprovidos de células B-

1, resolvem com maior eficiência a infecção por esse protozoário. Resultados

semelhantes foram obtidos também em infecções causadas por Paracoccidioides

brasiliensis e por filarias linfáticas (Paciorkowoski et al., 2000; Marcelino França et

al., 2006). Por outro lado, estudos realizados em nosso laboratório demonstraram

que estas células são capazes de migrar para focos inflamatórios inespecíficos

induzidos por corpo estranho, diferenciando-se em fagócitos mononucleares com

características similares a macrófagos (Almeida et al., 2001; Bogsan et al., 2005).

Além disso, outros trabalhos do nosso grupo, alguns deles em andamento,

mostraram a participação das células B-1 na evolução da infecção causada por P.

brasiliensis (Godoy et al., 2003), no lupus eritematoso sistêmico murino (E Brito et

al., 2007), na cicatrização (Oliveira et al., in preparation), na formação de células

gigantes (Bogsan et al., 2005), e de granulomas (Vigna et al., 2006; Russo, in

preparation).

Além do papel imuno-modulador das células B-1 nas patologias descritas

acima, resultados ainda não publicados pelo nosso grupo (Staquicini, 2004)

mostraram que o contato prévio de células B-1 com células de melanoma murino

da linhagem B16 foi capaz de induzir aumento no potencial metastático dessas

10

células tumorais sugerindo assim, a participação das células B-1 também na

regulação de mecanismos que controlam metástases.

Melanoma

Melanoma é um tipo comum e letal de câncer de pele que acomete

principalmente populações relativamente jovens (Parker et al., 1997). O melanoma

tem sido catalogado como a terceira forma mais comum de câncer de pele; porém,

devido à sua alta taxa de recorrência e capacidade metastática, é a forma que

maior número de mortes produz. Além disso, o melanoma é altamente resistente

aos métodos convencionais de tratamento como quimioterapia e radioterapia

(Sober et al., 1991; Li et al., 2002; Tarhini & Agarwala, 2006).

O melanoma origina-se de células pigmentadas denominadas melanócitos,

células derivadas de melanoblastos neuro-ectodermais que migraram durante a

embriogênese para a epiderme, derme e outros sítios, sendo encontradas na

camada basal da pele e em outras superfícies epiteliais como olhos e ouvido

interno (Herlyn et al., 2000; Smith et al., 2002).

De acordo com sua localização anatômica e padrões de crescimento, o

melanoma pode ser dividido em diferentes subtipos: melanoma superficial,

nodular, lentigo acral, lentigo maligno e melanoma não-cutâneo (Tabela 1).

Quanto à progressão, cinco etapas têm sido propostas baseadas no curso clínico

e nas características histopatológicas: 1) nevo congênito, com melanócitos

estruturalmente normais os quais têm curto período de vida e geralmente

carregam anormalidades citogenéticas; 2) nevo displásico, caracterizado por

11

células com atipia estrutural e, em alguns casos, é precursor da neoplasia; 3)

etapa de crescimento radial (RGP), fase inicial do melanoma primário,

caracterizado pelo crescimento horizontal da epiderme podendo ou não alcançar

crescimento vertical (VGP), e pode ser curado por excisão cirúrgica; 4) VGP, fase

na qual as células invadem a derme e têm potencial para metastatizar; 5)

melanoma metastático, com a formação de metástases em sítios distantes do

local de origem do tumor primário (Clark et al., 1984; Meier et al., 1998; Rusciano,

2000; Chudnovsky et al., 2005).

Tabela 1. Classificação clínica de melanoma.

Subtipo Freqüência Sitio comum Características gerais

Melanoma expansivo

superficial (MES)

70% Tronco nos homens

Pernas nas mulheres

RGP, evolução de 1–5 anos

Melanoma nodular

(MN)

10–25% Tronco nos homens

Pernas nas mulheres

RGP, evolução de 6–18 meses.

Sexo masculino, na proporção

2:1

Melanoma

lentiginoso acral

(MLA)

5% Regiões palmoplantares,

extremidades digitais

(unhas)

Não relacionado à exposição

solar.

Não tem predileção por sexo.

Mais freqüente em não brancos

(30 a 70%).

Melanoma lentigo

maligno (MLM)

<1% Cabeça e pescoço de

idosos

Associada com exposição

crônica ao sol


Melanoma não

cutâneo

5% Ocular, mucosa Não relacionado à exposição

solar.

Prognóstico e tratamento

deferem dos subtipos cutâneos

Chudnovsky et al., 2005

12

Para compreender os mecanismos biológicos envolvidos no processo

metastático em melanomas, estudos experimentais vêm sendo realizados com

células de melanoma murino B16 (Johnson et al., 1987). Estas células foram

geradas espontaneamente em camundongos C57BL/6 e isoladas por Isaiah Fidler

(1973). A partir da linhagem parental B16, Fidler (1978) obteve variantes com

diferentes potenciais de malignidade. Para tanto, células B16 foram injetadas

endovenosamente em camundongos singênicos e, após três semanas, as

primeiras colônias formadas no pulmão foram dissecadas e adaptadas à cultura

celular. A primeira variante selecionada in vivo, B16F1, foi re-injetada em novos

animais e, após três semanas, as colônias formadas no pulmão foram novamente

dissecadas para posterior cultivo. Assim, dez linhagens foram selecionadas in vivo

com crescente potencial metastático, uma vez que células B16F10 apresentaram

capacidade superior à linhagem parental para metastatização. Em conjunto este

estudo demonstrou claramente que células B16 são heterogêneas e que poucas

células de potencial altamente maligno pré-existem na linhagem parental.

Recentes avanços para determinação dos mecanismos envolvidos na

transformação e malignização de células tumorais como o melanoma mostraram

aumento nos níveis de ativação de várias vias de sinalização intracelular

envolvidas com invasão e progressão metastática, dentre as quais se destaca a

via das MAPKs (Mitogen-activated protein kinases; Buettner et al., 2002;

Chudnovsky et al., 2005; Meier et al., 2005, Lopez-Bergami et al., 2007; Meier et

al., 2007). O aumento na ativação destas vias induz expressão de genes que

codificam integrinas, fatores de crescimento, metaloproteinases, quimiocinas,

citocinas, oncogenes, entre outras moléculas que favorecem o avanço e

13

instalação das células tumorais em sítios distantes do tumor primário (Lewis et al.,

2005; Axelsen et al., 2007). Sendo assim, o estudo do papel das vias de

transdução de sinal envolvidas com invasão e metástases torna-se indispensável

para esclarecer os mecanismos celulares e moleculares pelos quais células

tumorais como o melanoma adquirem o fenótipo metastático.

Quinase regulada por sinais extracelulares (ERK: Extracellular-signal

Regulated Kinase)

A via das proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPKs: mitogen-

activated protein kinase) é uma cascata de sinalização intracelular essencial para

numerosos eventos celulares. Esta via é ativada diferencialmente por fatores de

crescimento, hormônios, citocinas, stress celular (irradiação, choque térmico,

desigualdade osmótica, dano ao DNA) e por produtos bacterianos como o

lipopolissacarídeo (LPS). A ativação das MAPKs em resposta a estes estímulos

está relacionada ao controle de diversos eventos biológicos como resposta

inflamatória, metabolismo, diferenciação, ciclo celular, proliferação e apoptose. As

três principais vias das MAPKs incluem a quinase regulada por sinais

extracelulares (ERK1/2) também referida como via Ras-Raf-MEK-ERK; a quinase

Jun N-terminal (JNK: June N-terminal kinase) e p38 (Cobb & Goldsmith, 1995;

Weston & Davies, 2002; Zebisch et al., 2007).

As MAPK são quinases serina/treonina as quais são ativadas pela

fosforilação de seus resíduos serina e/ou treonina localizados em regiões

específicas (Crews et al., 1992). A via canônica de Ras-Raf-MEK-ERK é

desencadeada pela interação de ligantes extracelulares com os receptores tirosina

14

quinase (RTKs) na superfície celular. Esta ligação induz o recrutamento

intracelular de Ras GTP, envolvido na ativação de Raf-1. Raf-1 ativado fosforila

MEK que fosforila ERK, o qual dimeriza e transloca para o núcleo celular, onde

fosforila e estimula diversos fatores de transcrição que regulam a expressão de

genes associados ao ciclo celular, proliferação, sobrevivência, diferenciação,

adesão, remodelamento de matriz extracelular, entre outros eventos (Viala &

Pouyssegur, 2004; Zebisch et al., 2007; Gráfico 1).

Nos últimos anos o papel da via Ras/Raf/MEK/ERK na progressão do

melanoma tem recebido grande atenção devido à identificação de mutações no

gene B-Raf em 70% dos casos de melanomas ocasionados por exposição

constante ao sol (Davies et al., 2002; Maldonado et al., 2003). Esta mutação

confere super-ativação da quinase ERK a qual tem sido associada com expansão

metastática de melanomas (Klafter & Arbiser, 2000; Cohen et al., 2002;

Govindarajan et al., 2003; Smalley, 2003; Lopez-Bergami et al., 2007). Além das

mutações no gene B-Raf, mutações no gene N-Ras, verificadas em quase 20% de

melanomas humanos, podem também conferir ativação constitutiva da via das

quinases Raf/MEK/ERK em melanoma (Mansour et al., 1994; Davies et al., 2002;

Gorden et al., 2003).

Devido ao fato desta via estar envolvida com várias funções celulares,

numerosos estudos experimentais em modelos murinos e humanos mostraram

correlação direta entre a ativação da via das MAPKs com angiogênese,

tumorigênese (D´Angelo et al., 1995; Ilan et al., 1998; Cohen et al., 2002) e

metástases (Krueger et al., 2001; Sahai et al., 2001; Choo et al., 2005), razão pela

15

qual esta via vem sendo estudada como alvo terapêutico (Chudnovsky et al.,

2005; Alvarado & Giles, 2007; Lopez-Bergami et al., 2007).

Assim, o estudo da participação da via ERK no aumento do potencial

metastático das células B16 induzido pelo contato com células B-1, poderia

contribuir para explicar os mecanismos envolvidos neste fenômeno.

Gráfico 1. Via canônica de Ras-Raf-MEK-ERK .

RTKRTK

2. OBJETIVOS

2. OBJETIVOS

1.1 OBJETIVOS

Considerando que células B-1 são capazes de induzir aumento no potencial

metastático de células de melanoma murino da linhagem B16, este estudo tem

como objetivo principal determinar os mecanismos celulares envolvidos nesse

fenômeno.

Objetivo específico

1. Investigar a participação de ERK no aumento do potencial metastático de

células de melanoma B16 induzido pelo contato com células B-1.

3. MATERIAIS E MÉTODOS


2.1. MATERIAIS

2.1.1 Soluções Rotineiras

Todas as soluções aqui descritas foram preparadas com água bi-destilada

ou com padrão Mili-Q e com reagentes qualidade P.A.

• Solução estoque de tampão fosfato-salina 20X (PBS): NaCl 2,7378 M,

KCl 0,053 M, Na2HPO4 0,1301 M e K2HPO4 0,0229 M. Para uso, esta solução foi

diluída 20X (PBS 1X).

• Solução estoque de tampão tris-salina 10X (TBS): Tris base 24,2 g; NaCl

80g; pH 7.6 e 1000 mL de água q.s.p. Para uso, esta solução foi diluída 10X.

2.1.1.1 Soluções para SDS-PAGE

• Tampão de amostra para SDS-PAGE: Tris-HCl 62 mM, pH 8,8, contendo

0,2% (p/v) de SDS, β-mercaptoetanol 50 mM, 0,005% (p/v) de azul de bromofenol

e 10% (v/v) de glicerol.

• Solução estoque de acrilamida/bis para gel de proteína: 30% de

acrilamida, 0,8% de bis-acrilamida e água bi-destilada 100 mL q.s.p.

• Tampão para gel de proteína (separação) desnaturante: Tris-HCl 1,5 M,

pH 8,8, contendo 0,4% de SDS (p/v).

• Tampão para gel de proteína (empilhamento) desnaturante: Tris-HCl 0,5

M, pH 6,8, contendo 0,4% de SDS (p/v).

• Tampão de corrida para SDS-PAGE: Tris 25 mM, glicina 190 mM, pH 8,3,

e 0,1% de SDS (p/v).

20

2.1.1.2 Soluções para coloração por Comassie blue

• Corante de azul de Coomassie: 0,2% de Coomassie R250 (p/V) em 50%

de metanol e 10% de ácido acético (v/v).

• Descorante forte para Coomassie: 50% de metanol, 10% de ácido acético

e 40% de água destilada (v/v).

2.1.1.3 Soluções para Immunoblotting

• Tampão de transferência: Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM e 20% de

metanol (v/v).

• Corante de Ponceau: 0,5% (p/v) de Ponceau S em 5% de ácido acético

(v/v).

• Tampão de bloqueio: TBS 1X, 0,1% de Tween-20 com 5% de leite

desnatado em pó (p/v).

• Tampão de lavagem: 0,1% de Tween-20 em TBS 1X.

• Tampão striping: 1,87 g de glicina pH 2.5, 100 mL de SDS 10% e 1000

mL de água q.s.p.

2.1.1.4 Soluções para ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

• Tampão de lavagem (PBS-T): 0,05% de Tween-20 em PBS 1X.

• PBS-BSA (soro albumina bovina): 3% de BSA em PBS 1X.

• Peróxido de Hidrogênio: 3% de Peróxido de Hidrogênio em PBS 1X.

• Tampão para OPD: Na2PO4 0,4 M; Ácido Cítrico 0,4 M; pH 5,8, contendo

5.05% (V/V) de H2O2 (Perhidrol, Merk).

21

• Bloqueio da Revelação: Ácido Sulfúrico (H2SO4) 4 N em água destilada.

2.1.1.5 Soluções para cultura de células

• Meio RPMI: RPMI 1640 (Sigma, St Louis, MO) acrescido de ácido N-2-

hiroxietilpiperazina-N-2-etanosulfônico 10 mM (HEPES, da Sigma), bicarbonato de

sódio 24 mM (Sigma) e 40 µg/mL de garamicina (Schering Plough, N.J, USA).

Após preparação o meio foi esterilizado por filtração positiva em filtro de 0,22 µM.

• Meio completo (R-10): meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino

fetal (SBF, da Cultilab, Campinas, SP).

• Meio para congelamento de células: 45% de RPMI, 45% de soro fetal

bovino e 10% de DMSO.

• PBS-EDTA (ácido etileno diaminoacético): 2,0 mM de EDTA em PBS 1X.

Após preparada esta solução foi esterilizada em autoclave a 120°C por 15

minutos.

2.1.2 Animais

Camundongos C57BL/6 wild-type (wt) fêmeos de 2 a 3 meses de idade

foram cedidos pelo Laboratório de experimentação animal do INFAR da

Universidade Federal de São Paulo, UNIFESP. Camundongos C57BL/6 knock-out

para IL-10 (KO) fêmeos de 2 a 3 meses de idade foram cedidos gentilmente pelo

Dr. João Santana da Silva (Departamento de Farmacologia, Escola de Medicina,

USP, Riberão Preto, SP). Os animais foram mantidos livres de germes, em micro-

isoladores com água e ração autoclavadas. Todos os procedimentos realizados

22

com os animais foram executados de acordo com normas estabelecidas pelo

Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal de São

Paulo.

2.2 MÉTODOS

2.2.1 Cultura de células e tratamentos

Células de melanoma B16 (B16): Células de melanoma de baixo potencial

metastático, obtidas em nosso laboratório a partir da linhagem de melanoma

murino B16F10 (Staquicini et al., 2003), foram cultivadas como monocamadas em

meio completo (RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino, SBF) a

37oC em atmosfera úmida de 5% de CO2. O descolamento das células para

posterior sub-cultivo foi realizado por curta exposição à PBS-EDTA 2 mM ou

Tripsina (Cultilab). Nos ensaios de Western blott ou Immunoblot, as células B16

utilizadas para extratos foram previamente plaqueadas em garrafas de cultura de

75 cm2 ou placas de Petri 100 X 90 mm. Após de alcançar confluência de 80%, o

meio foi aspirado e as células aderidas foram lavadas 3 vezes com PBS e re-

cultivadas com RPMI sem soro por 24 horas. Em seguida, estas células foram ou

não estimuladas com 10% de SBF ou tratadas com inibidor de MEK1/2 (PD98059,

Cell Signalling, Beverly, MA, USA) ou com IL-10 recombinante (Pharmigen, San

Diego, CA), durante diferentes períodos de tempo (entre 15 e 120 minutos).

Células B-1: Linfócitos B-1 foram obtidos a partir de cultura de células

aderentes de lavado peritoneal de camundongos C57BL/6 como descrito

previamente (Almeida et al., 2001). Assim, células peritoneais de camundongos

23

wild-type (B-1wt) e knock-out para IL-10 (B-1KO), foram coletadas por lavagens

sucessivas com RPMI e incubadas em garrafas de cultura por 40 minutos a 37oC.

Em seguida, o sobrenadante foi desprezado e as células aderidas foram re-

cultivadas até 7 dias, em na presença de meio completo. Após este período a

maior porcentagem de células presentes no sobrenadante destas culturas (células

flutuantes) corresponde às células B-1 (Almeida et al., 2001). Para ensaios de

Western blot, monocultura de células B-1 com seis dias de incubação, presentes

no sobrenadante da cultura acima descrita, foram centrifugadas, lavadas 3 vezes

com PBS e re-cultivadas com RPMI sem soro por 24 horas. Em seguida, estas

células foram estimuladas ou não com SBF ou tratadas com inibidor farmacológico

de MEK1/2 (PD98059) de 1 até 24 horas.

Co-culturas de células B16 e B-1: Co-culturas de células B16 e B-1 foram

realizadas em placas de 6 orifícios ou em garrafas para ensaio de metástases in

vivo ou para Western blot, respectivamente. Brevemente, 1X105 células B16 foram

plaqueadas em meio completo e incubadas por 24 horas para adesão. Após este

período, o meio foi aspirado e 1X106 células de B-1 com 5 dias de cultura foram

adicionadas juntamente com seu meio condicionado (mB1) e incubadas por

diferentes períodos na ausência ou presença de PD98059. Logo após os

diferentes períodos de incubação, as células B-1 foram removidas por aspiração e

as células B16 aderidas foram lavadas 3 vezes com PBS para remover qualquer

resíduo de células B-1. Em seguida, células B16 foram coletadas e submetidas a

análises por citometria de fluxo (FACS), utilizando-se os marcadores B220 e Mac-

1 de células B-1 objetivando confirmar a pureza das células B16 após co-cultivo.

Assim células B16 livres de células B-1 após co-cultivo (B16+B-1) foram usadas

24

nos ensaios experimentais in vivo e na preparação de extratos celulares para

análises de Western Blot.

2.2.2 Análises de moléculas de superfície por citometria de fluxo

Monoculturas de células B16 ou B-1 ou células B16 após co-cultivo com B-1

foram coletadas e lavadas 2 vezes com PBS e ajustadas à concentração 1X106

células/amostra. Estas células foram marcadas duplamente com anticorpos anti-

B220 conjugado com ficoeritrina (PE) e anti CD11b (Mac-1) conjugado a

fluoresceína (FITC), ambos da Pharmingen (San Diego, CA, USA), na diluição de

1:100 em PBS acrescido de 1% de BSA e incubados no escuro por 1 hora, no

gelo. Após este período as células foram lavadas e ressuspendidas em 500 µl de

PBS e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur da Becton

Dickinson, Mountain View, CA) usando o programa CellQuest.

2.2.3 Ensaio de viabilidade celular por Trypan blue

Solução de Trypan blue foi preparada em PBS e filtrada antes do uso.

Células B16 ou B-1 de monoculturas ou co-culturas após diferentes tratamentos

descritos anteriormente, foram coletadas e ressuspendidas em PBS. Dez

microlitros de cada suspensão celular foram diluídos com 10 µL do reagente

Trypan blue e, em seguida, 10 µl desta diluição foram contados em câmara de

Neubauer para estabelecer o porcentual de células coradas (mortas) em cada

amostra. Depois de verificada a viabilidade celular, as suspensões celulares com

mais de 80% de células viáveis foram utilizadas para ensaios experimentais in vivo

25

e para a preparação dos extratos celulares utilizados nas análises de Western

Blot.

2.2.4 Ensaio de inibição da adesão

Para criar a condição de cultura não-aderente, monoculturas de células B16

ou B-1 ou co-culturas de ambas as células foram plaqueadas em placas de Petri

cobertas previamente com uma camada fina de agarose 1% e incubadas a 37°C

com 5 % de CO2 por 72 horas. Após este período, células em suspensão foram

coletadas e ressuspendidas em PBS. Agregados celulares foram mecanicamente

separados por agitação vigorosa e as células individuais foram submetidas a

análise de viabilidade por Trypan blue e em seguida a ensaio experimental de

metástase in vivo.

2.2.5 Ensaio de metástase experimental

Células B-1 ou B16 de monoculturas ou células B16 após co-cultivadas com

células B-1 foram coletadas e ressuspendidas em PBS. Logo, 1X105 células

diluídas em 100 µL de PBS foram injetadas na veia da cauda de camundongos

C57BL/6 wild-type. Para cada grupo celular analisado foram feitas injeções em

pelo menos três camundongos. Após 14 dias de inoculação os animais foram

sacrificados e seus pulmões removidos cirurgicamente para estabelecer

macroscopicamente o número de nódulos metastáticos instalados.

26

2.2.6 Preparação de extratos celulares

Para extração de proteínas totais, células foram lavadas 2 vezes com PBS

a 4°C e, em seguida, lisadas com 100 µL de tampão de lise (contendo, 20 mM de

Tris-HCl pH7.4, 100 mM de NaCl, 1 mM de Na3VO4, 40 mM de NaF, o,5% de NP-

40, 1 mM de PMSF, 10 µg/mL de leupeptina e 10 µg/mL de aprotinina), por 10

minutos a 4°C. Após este período, os lisados celulares foram centrifugados por 15

minutos a 4°C para remoção de resíduos não protéicos. Em seguida, os

sobrenadantes foram coletados e a concentração protéica determinada pelo

método de Bradford (1976).

2.2.7 Dosagem protéica pelo micrométodo de Bradford

As determinações das concentrações protéicas foram realizadas segundo

método proposto por Bradford (1976), que utiliza Coomassie brilliant blue (CBB)

G-250 (Sigma) como reativo e albumina bovina (BSA) 1,0 mg/mL como padrão. A

leitura da curva padrão foi realizada em comprimento de onda de 570 nm em leitor

EIA Reader Titertek, Multiskan, MCC340 (Labsystem, Santa Fé, USA).

2.2.8 Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio

(SDS-PAGE)

Os procedimentos para SDS-PAGE foram executados em equipamentos

Mini-Protean II (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) conforme descrito

anteriormente (Laemmli, 1970). Para as proteínas em estudo, o gel de separação

foi feito na concentração de 10% de acrilamida e o gel de empilhamento na

27

concentração de 3% de acrilamida. As amostras em análise foram diluídas 1:5 em

tampão de amostra, anteriormente descrito, fervidas por 5 minutos e aplicadas no

gel de poliacrilamida, preparados como descrito na Tabela 2.

Os géis, com espessura de 0,75 mm, foram deixados a temperatura

ambiente até completa polimerização. Em seguida, quantidades equivalentes de

proteína (40 µg) e padrão de peso molecular foram aplicadas nos poços

respectivos. Uma vez aplicadas as amostras, os eletrodos do aparelho foram

mergulhados em tampão de corrida e submetidos a voltagem constante de 170 V

até o corante de acompanhamento atingir a extremidade final do gel (1 hora

aproximadamente).

Após a corrida eletroforética, os géis foram corados com Coomassie brilliant

blue para a coloração de proteínas, ou então transferidos para membranas de

nitrocelulose (Bio-Rad Laboratories).

Tabela 2. Composição de gel para SDS-PAGE

Gel de empilhamento

(Volume final: 5,02 mL)

Gel de separação

(Volume final 14,8575 mL)

Soluções estoque

(mantidas a 4°C) 3% 10%

Acrilamida 30%, bisacrilamida 0,8% 0,8 mL 5,0 mL

Tampão para gel de proteína

(empilhamento) desnaturante

1,25 mL -


(separação) desnaturante

- 3,0 mL

Água bi-destilada 2,95 mL 6,8 mL

TEMED 5 µL 7,5 µL

Persulfato de amônio 10% (p/v) 15 µL 50 µL

28

2.2.9 Transferência de proteínas para membranas de nitrocelulose

(Immunoblot ou Western blot)

A transferência eletroforética dos géis de poliacrilamida para membranas de

nitrocelulose foi efetuada conforme descrito por Towbin e colaboradores (1979),

usando equipamento Trans-Blot System (Bio-Rad Laboratories). Após a

eletroforese os géis foram postos sobre membranas de nitrocelulose (Bio-Rad

Laboratories) ou PVDF (Amersham Pharmacia Biotech, Buckinghamshire, UK),

recobertos com papel de filtro e comprimidos com esponjas. Todos os materiais

foram embebidos em tampão de transferência e em seguida, encaixados em

placas acrílicas perfuradas e mergulhados na câmara de eletroforese contendo o

mesmo tampão. A transferência foi realizada na voltagem constante de 100 V por

1 hora e meia. Em seguida, as membranas foram coradas com Ponceau S para a

visualização das bandas protéicas e depois bloqueadas com tampão de bloqueio

por 1 hora a temperatura ambiente. Após lavagem, as membranas foram

incubadas overnight a 4°C com anticorpo primário específico para ERK fosforilado

[p-ERK, (E-4): sc-7383), ERK total [(K-23): sc-94], Stat3 total [(C-20): sc-482]

todos da Santa Cruz Biotechnology, INC (Santa Cruz, CA, USA) ou Stat3

fosforilado (p-Stat3, da BioVision, CA, USA), diluídos em tampão de bloqueio

segundo instruções do fabricante. Após este período, as membranas foram

lavadas e incubadas por 1 hora a temperatura ambiente, com o respectivo

anticorpo secundário (Ig-G) conjugado também a peroxidase. Em seguida, bandas

reativas foram visualizadas por quimiluminescência (ECL-Amersham-Pharmacia)

em filmes Kodak e/ou Amersham (Hyperfilm ECL). Após a detecção, as

29

membranas foram lavadas e incubadas com tampão de stripping para serem re-

incubadas com outros anticorpos.

2.2.10 Microscopia eletrônica de transmissão

Células B-1 ou células B16 co-cultivadas ou não com células B-1 foram

incubadas por 24, 48 e 72 horas sobre lamínulas de plástico contidas em placas

de doze (12) orifícios (Costar). Após estes períodos de incubação, as células

foram fixadas em 50% de glutaraldeído, 4% de formaldeído, 0,2 M de cacodilato

de sódio em pH 7.2 por 2 horas. Em seguida, foram lavadas por 4 vezes (1 hora

cada lavagem) com tampão cacodilato 0,1 M e logo fixadas novamente com

tetróxido de ósmio 2% em tampão cacodilato 0,1 M. As amostras foram então

lavadas 3 vezes e desidratadas em concentrações crescentes de etanol e óxido

de propileno. Em seguida, as amostras foram incluídas em resina Araldite® e

mantidas a vácuo por 4 horas e logo a 60°C por 40 horas para polimerização. Uma

vez polimerizadas, as amostras incluídas em Araldite® foram cortadas em seções

de 90 a 95 µm de espessura e coradas com 2% de uranil-acetato aquoso durante

8 minutos. Estas preparações foram subsequentemente coradas com citrato de

chumbo diluído em água destilada por 4 minutos. Amostras foram analisadas e

fotografadas em microscópio eletrônico (JEOL JEM 1200 EX II).

30

2.2.11 Ensaios de proliferação celular

2.2.11.1 Incorporação de timidina tritiada

Células B16 (2X103 células por poço em um volume final de 200 µl) foram

cultivadas com meio completo em placas de 96 poços (uma placa para cada

tempo de incubação: 24, 48, 72 e 120 horas) e incubadas por 6 horas em estufa a

37oC e 5% de CO2. Em seguida, células aderidas foram lavadas com PBS e

ressuspendidas em RPMI sem soro e incubadas overnight nestas condições. Após

este período, o sobrenadante foi retirado e substituído por meio completo ou meio

condicionado de cultura de células B-1 na presença (B16+B-1) ou ausência

(B16+mB-1) de 2X104 células B-1. Células submetidas a estas condições foram

incubadas durante 24, 48 e 72 horas a 37oC e 5% de CO2.. Dezoito horas antes do

término de cada incubação, 1 µCi de timidina tritiada (Amersham) foi adicionado

às culturas. Posteriormente, cada amostra foi adsorvida em papel de filtro e cada

filtro foi colocado em tubos com 2 ml de líquido de cintilação para a leitura em

aparelho Beckman LS 5801. O experimento foi realizado em triplicata para cada

grupo celular estudado.

2.2.11.2 MTT [tetrazolium salt3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-

diphenyltetrazolium bromide]

Células B16 (2,5X103 células por poço em volume final de 100 µl) foram


tempo de incubação: 0, 24, 48, 72 horas) e incubadas 12 horas em estufa a 37oC

e 5% de CO2. Em seguida, células aderidas foram lavadas com PBS

31

ressuspendidas com RPMI sem soro e incubadas overnight nestas condições.

Após este período, o sobrenadante foi retirado e substituído por meio completo ou

meio condicionado de cultura de células B-1 na presença (B16+B-1) ou ausência


então incubadas durante 24, 48 e 72 horas a 37oC e 5% de CO2. Posteriormente,

2,5 horas antes do término de cada incubação, foram adicionados 10 µl de MTT (5

mg/mL) às culturas e deixados por 1,5 horas a 37oC e 5% de CO2. Em seguida, o

sobrenadante de cada poço foi aspirado e foram adicionados 100 µl de

isopropanol (Merk) e mantidas a temperatura ambiente por 15 minutos. Após este

período, as placas foram analisadas em comprimento de onda de 570 nm em leitor

de ELISA, EIA Reader Titertek, Multiskan, MCC340 (Labsystem). O experimento

foi realizado em triplicata para cada grupo celular estudado.

2.2.12 Dosagem de citocinas no sobrenadante de cultura

A produção de IL-10 no sobrenadante de cultura de células B-1 tanto de

animais wt como KO foi quantificada por ELISA (Enzymed linked

immunoabsorvent assay) seguindo as instruções do fabricante (Duoset mouse IL-

10, R&D System, Minneapolis, MN, USA). Brevemente, células B-1 foram

cultivadas como descrito acima e os sobrenadantes foram coletados após 7 dias

de cultura e mantidos a 70°C até o momento da dosagem. Para a determinação

da citocina, placas de ELISA de 96 poços foram sensibilizadas overnight a

temperatura ambiente com anticorpos monoclonais anti-IL-10. Após este período,

as placas foram lavadas por 4 vezes com PBS-T e logo incubadas com 200 µL de

32

PBS-BSA a temperatura ambiente durante 2 horas, para prevenir ligações

inespecíficas. Placas foram lavadas 4 vezes com OS-T e incubadas 2 horas com

100 µL por orifício de cada sobrenadante (amostras em triplicatas) ou com

standard de IL-10 diluído serialmente em PBS-BSA. Em seguida, placas foram

lavadas 4 vezes com PBS-T e incubadas 2 horas com 100 µL/poço de anti-IL-10 a

temperatura ambiente. As placas foram então novamente lavadas e a revelação

foi realizada com 50 µL/poço de ο-fenilenodiamina (OPD, 1 mg/mL, Sigma)

dissolvida em tampão citrato-fosfato 100 mM pH5,8, contendo 0,05% (v/v) de H2O2

(água oxigenada). A reação foi interrompida após o aparecimento de cor com 50

µL/poço de H2SO4 4 N (50 µL/poço). Os resultados foram avaliados por leitura

espectrofotométrica em comprimento de onda 492 nm em leitor de ELISA

(Labsystems). A sensibilidade do ensaio foi de 20 pg/mL. Resultados são

apresentados como medianas ±SD.

2.2.13 Obtenção de RNA total

O RNA total foi extraído de células B-1 e de células B16 tanto de

monoculturas como co-culturas utilizando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de

acordo com as instruções do fabricante. Brevemente, 1,5 mL de Trizol foi

adicionado às células e após homogeneização por 5 minutos, o lisado celular foi

transferido para tubos de propilpropileno de 2 mL, e adicionados 300 µL de

clorofórmio a cada tubo. O conteúdo foi agitado vigorosamente e centrifugado a

14.000 rpm por 15 minutos a 4°C. A fase aquosa (superior) foi transferida para

microtubos de 1,5 mL, contendo 750 µL de isopropanol e em seguida

33

homogeneizado. Após precipitação por 24 horas a -20°C, centrifugou-se a 14.000

rpm por 15 minutos a 4°C. O RNA precipitado foi lavado 2 vezes com etanol 70%

em água DEPC 0,001% (dietil pirocarbonato), desidratado por evaporação a

temperatura ambiente e diluído de 30 a 50 µL de água DEPC.

A quantificação do RNA foi feita por espectrofotometria a 260 nm. O

resultado da densidade óptica (DO) foi multiplicado pelo fator 40, o que fornece a

concentração em µg/mL, uma vez que uma unidade de DO a 260 nm equivale a

40 µg/mL.

A qualidade do RNA foi avaliada de duas maneiras: em primeiro lugar, com

relação à contaminação por proteína, a qual é dada pela razão entre as leituras a

260 e 280 nm, que precisa estar entre 1,6 e 1,8. Em segundo lugar, foi avaliada a

integridade do RNA utilizando gel de agarose. Nesta análise a amostra é

considerada íntegra e livre de contaminação quando no gel estão presentes duas

bandas, 28S e 18S, sendo que a banda de 28S é mais intensa que a de 18S. A

ocorrência de outra banda, de tamanho superior a de 28S, denota contaminação

por DNA genômico e, neste caso, a amostra deve ser submetida à re-extração por

Trizol.

2.2.14 RT-PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase Chain Reaction)

A sínteses de cDNA a partir de amostras de RNA total (transcrição reversa)

para estudos de expressão gênica por RT-PCR, foi realizada com o kit SuperScript

III (Invitrogen- Life Technology) de acordo com as instruções do fabricante. Assim,

a transcrição reversa foi realizada a partir de 3 µg de RNA total, tratado

34

previamente com DNase 1 (Invitrogen- Life Technology), para eliminar qualquer

tipo de contaminação com DNA genômico, conforme verificado pela não

amplificação do gene de controle interno GAPDH.

Após preparados os cDNAs foram submetidos a RT-PCR qualitativo e a

RT–PCR quantitativo em tempo real.

2.2.14.1 Análise qualitativa por RT-PCR

Cada amplificação foi realizada em volume total de 25 µl contendo 100 ng

de cada primer (sense e anti-sense), 1,5 mM de solução de 25 mM de Mg2+, 10 ul

de MasterMix (2,5x) (Eppendorf) e 2 µl de cDNA diluído 1:2 em água bi-destilada

estéril. Como controle negativo de cada reação de PCR foi utilizada água bi-

destilada ao invés de cDNA .

As condições de amplificação comuns para cada par de primers foram:

desnaturação 94°C por 30 segundos, anelamento por 30 segundos (temperatura

específica para cada par de primers), extensão 72°C por 30 segundos, número de

ciclos 35. A temperatura de anelamento de cada par de primers foi escolhida após

o teste de gradiente de temperatura utilizando o termo-ciclador Mastercycler

Gradient (Eppendorf). Na Tabela 3 estão descritas as seqüências de

oligonucleotídeos utilizadas para cada transcrito e, também a temperatura de

anelamento, e o tamanho dos produtos do PCR em número de pares de bases

(bp).

35


temperatura de anelamento (°C) e o tamanho do produto do PCR em pares de bases

(BP), dos transcritos estudados por RT-PCR qualitativo.

Transcrito Primers

5’-seqüência oligo-nucleotídica- 3’

Temperatura de anelamento (°C)

Tamanho do produto (bp)

GAPDH S: ACCACAGTCCATGCCATCAC AS: TCCACCACCCTGTTGCTGTA

62 500

CXCR4 S: AGTTTTCACTCCAGCTAACCCTTAT AS: TGGAATGTTCAGTTTCTTCCTCTAC

58 321

MMP-9 S: TTCTCTGGACGTCAAATGTGG AS: CAAAGAAGGAGCCCTAGTTCAAGG

60 413

Para a análise da amplificação, aos produtos de PCR foram adicionados 5

µl de loading buffer, constituído por solução de glicerol a 50% (Sigma Chemical

Company) acrescida de 1mg/ml de vermelho de cresol (Sigma Chemical

Company) em 0,5x TBE (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, USA). Cada amostra

diluída 1:6 com este tampão foi aplicada em volume de 10 µl ao gel de agarose

1,5 % (Gibco BRL) preparado em 0,5x TBE com 0,75 µg/ml de brometo de etídio

(Sigma Chemical Company) e submetida a eletroforese com 100 V por 50

minutos. Adicionalmente, também foi submetido a eletroforese o marcador de

massa molecular (Low mass, Invitrogen). As bandas foram visualizadas sob luz

ultravioleta. Uma vez verificada a positividade no controle e a ausência de

contaminação (controle negativo), a análise do mRNA foi realizada através do

sistema de documentação de imagem do gel de eletroforese “Kodak Digital

Science – Electrophoresis Documentation and Analysis System 120” (Eastman

Kodak Co,, Rochester, NY, USA).

36

2.2.14.2 Análise quantitativa por RT-PCR em tempo real

A reação de PCR em tempo real foi realizada com o reagente Sybr Green

(Applied Biosystems). A partir da reação de transcrição reversa, utilizou-se 1 mL

de cDNA, 7,5 mL de master mix Sybr Green, 0,5 mL de cada oligonucleotídeo (18

µM): sense e anti-sense (Tabela 4), e água Milli Q autoclavada q.s.p 15 mL. Em

seguida, as reações para PCR em tempo real foram realizadas utilizando ABI

7000 Real Time PCR System (Applied Biosystems), nas seguintes condições: 10

minutos a 50°C para ativação da enzima, desnaturação por 5 minutos a 95°C, e 40

ciclos de 95°C por 30 segundos e 60°C por 1 minuto. Após avaliar a qualidade da

reação com base nas curvas de dissociação, os resultados foram analisados

utilizando o programa ABI 7000 SDS software (Applied Biosystems). Para a

quantificação relativa, foi realizado o seguinte cálculo: inicialmente determinou-se

o cycle threshold (CT), dado pelo número do ciclo em que o sinal de fluorescência

atingiu a linha limiar (threshold line), ou seja, a linha em que a emissão de

fluorescência está acima do ruído de fundo (background). O CT encontrou-se

invariavelmente na região correspondente à fase exponencial da amplificação, o

que torna mais acurada a estimativa de quantificação dos transcritos na amostra

original. Os valores de CT dos genes de interesse foram normalizados em relação

ao CT do gene constitutivo (GAPDH), resultando o ∆CT, representado pelo

CTgene - CTconstitutivo. Por fim, calculou-se o 2-∆CT, sendo este o valor a ser

trabalhado como representante da expressão relativa para cada gene

(Vandesompele et al., 2002; Bustin et al., 2005). Para melhor interpretação dos

37

resultados estes foram multiplicados no final por 100 para obtenção de números

inteiros.

Tabela 4. Seqüências oligo-nucleotídicas dos primers sense (S) e anti-sense (AS) e

tamanho do produto do PCR em pares de bases (bp), dos transcritos estudados por RT-

PCR em tempo real.

Transcrito Primers



GAPDH S: AAATGGTGAAGGTCGGTGTG

AS: TGAAGGGGTCGTTGATGG

120

CXCR4 S: TGGAACCGATCAGTGTGAGT

AS: GTAGATGGTGGGCAGGAAGA

128

MMP-9 S: CATTCGCGTGGATAAGGAGT

AS: GGTCCACCTTGTTCACCTCA

140

2.2.15 Análise Estatística

As análises estatísticas foram realizadas pela análise de variância (ANOVA)

e o teste Tukey-Kramer, utilizando o programa INSTAT (GraphPad, San Diego

CA).

4. RESULTADOS

4. RESULTADOS

3.1 Caracterização do sistema de co-cultivo

Estudos anteriores realizados no nosso laboratório mostraram que o co-

cultivo de células B-1 com células de melanoma murino da linhagem B16, foi

capaz de induzir aumento no potencial metastático destas células (Staquicini,

2004). Com o intuito de determinar quais mecanismos moleculares controlam este

efeito, experimentos iniciais foram realizados para caracterizar o sistema de co-

cultivo e avaliar o tipo de interação entre estas células. Para isso, células B-1

foram isoladas de lavados peritoneais de camundongos e co-cultivadas por 24, 48

e 72 horas com uma sublinhagem de células B16 caracterizada pelo seu baixo

potencial metastático (Staquicini et al., 2003). Após estes períodos, células B-1

foram eliminadas por aspiração e em seguida, células B16 livres de células B-1

foram utilizadas em ensaios experimentais de metástase in vivo. O método de

eliminação das células B-1 após os diferentes períodos de co-cultivo foi eficiente,

como evidenciado por citometria de fluxo (Fig. 1). Esta análise mostrou que

populações celulares duplamente marcadas para os marcadores fenotípicos B220

e Mac-1 de células B-1, foram detectados em células B-1, porém não em

monoculturas de células B16 ou em células B-16 livres de células B-1 após o co-

cultivo (B16+B1). Após 14 dias da inoculação, o número de nódulos metastáticos

presentes nos pulmões dos animais foi determinado macroscopicamente.

Conforme demonstrado na Figura 2, a inoculação de células B16 submetidas ao

co-cultivo com células B-1 por 48 ou 72 horas, aumentou significativamente o

40

número de nódulos metastáticos quando comparado com animais injetados com

células B16 ou B-1 isoladas de monoculturas.

Uma vez que no sistema de co-cultivo as células B16 são aderentes e

células B-1 não são, foi determinado se o aumento do potencial metastático das

células B16, induzido pela presença das células B-1, dependia da adesão das

células B16 ao plástico. Para testar isto, os dois tipos celulares foram co-

cultivados sobre substrato não adesivo (agarose) por 72 horas e após este

período um pool de células B16+B1 foi submetido a ensaios experimentais de

metástases in vivo. Conforme mostrado na Figura 3, animais injetados com células

B16 co-cultivadas com B-1 em suspensão (sB16+B1) produziram

significativamente mais colônias metastáticas no pulmão comparado aos grupos

controles injetados com células B16 (sB16) ou B-1 (sB1) coletadas de

monoculturas mantidas nas mesmas condições (Fig. 3A). Adicionalmente, ensaios

de viabilidade celular por Trypan blue mostraram a manutenção da viabilidade das

células B16 e B-1 mantidas em suspensão por 72 horas (Fig. 3B). Em conjunto,

estes resultados demonstram que células B-1 são capazes de aumentar o

potencial metastático das células B16 e que a adesão das células B16 não é

necessária para este efeito.

3.2 Células B-1 e B16 fisicamente interagem durante o co-cultivo.

Em seguida, foi determinado se o aumento no potencial metastático das

células B16 era dependente do contato físico entre as duas células ou se fatores

solúveis produzidos pelas células B-1 poderiam estar envolvidos neste feito. Para

41

esta análise, células B16 foram cultivadas por 72 horas em meio condicionado

proveniente tanto de monoculturas de células B-1 como de células B16 co-

cultivadas com células B-1 por 72 horas. Como apresentado na Figura 4, não

foram observadas diferenças no número de nódulos metastáticos nos pulmões de

animais injetados com células B16 cultivadas em seu próprio meio comparado

com aquelas cultivadas em meio condicionado tanto de monoculturas de células

B-1 (B16+mB1) como do co-cultivo de células B16 com B-1 [B16+m(B16+B1)]. Por

outro lado, quando células B16 submetidas ao co-cultivo com células B-1 (B16+B-

1) foram injetadas, o número de nódulos metastáticos presentes nos pulmões

desses animais foi significativamente maior comparado com os grupos acima

descritos.

Desta forma, os resultados acima descritos mostram que fatores solúveis

produzidos pelas células B-1 são insuficientes para aumentar a capacidade

metastática das células B16, sugerindo que o contato físico entre as duas células

ocorre durante o co-cultivo. De fato, análises por microscopia eletrônica de

transmissão revelaram a existência de interação física entre as células B16 e B-1.

Na Figura 5A, podemos observar uma célula B-1 caracterizada por sua atípica

morfologia nuclear com reentrâncias delimitando dois lóbulos distintos, descrita

por Abrahão e colaboradores em 2004. Na Figura 5B, não observamos interação

física entre células B-1 e células B16 co-cultivadas por 24h. Entretanto, quando

estas células foram co-cultivadas por 48 e 72h, vários pontos de interação entre as

membranas plasmáticas destas células foram detectados (Fig. 5C e D). Juntos

estes resultados demonstram que estes dois tipos celulares interagem fisicamente

42

quando co-cultivados por tempos superiores a 48h, observação esta que

correlaciona com o tempo de co-cultivo necessário para aumentar o potencial

metastático das células B-16 (Fig. 2).

3.3 Fosforilação de ERK está aumentada nas células B16 após

interação com células B-1

Considerando que células B16 e B-1 interagem fisicamente, foi

hipotetizado que as células B-1 poderiam influenciar no aumento do potencial

metastático das células B16 através da interferência em vias de sinalização celular

que regulam invasão e metástase.

Em melanomas há relatos mostrando que a ativação da quinase regulada

por sinais extracelulares ERK 1/2, da família das MAPKs (proteínas quinases

ativadas por mitógenos), está envolvida de forma positiva na regulação da

proliferação celular, assim como no aumento do potencial metastático destes

tumores (Davies et al, 2002; Zebish et al., 2007; Lopez –Bergami et al., 2007). Por

esta razão, a participação de ERK foi avaliada no aumento do potencial

metastático das células B16 após o co-cultivo com células B-1.

Inicialmente, foi determinado o perfil de fosforilação basal de ERK nas

monoculturas tanto de células B16 como de células B-1. Para isso foi utilizado um

anticorpo que reconhece especificamente as duas formas (p42/p44 kDa) de ERK

fosforilada/ativada. Como pode ser observado na Figura 6A, monoculturas de

células B16 ou de células B-1 cultivadas overnight na ausência de soro bovino

fetal (SBF) apresentaram níveis basais de fosforilação de ERK. Enquanto a adição

43

de SBF induziu um leve aumento na fosforilação de ERK nas células B16, a

presença de SBF não alterou o perfil basal de fosforilação desta quinase nas

células B-1, mostrando que ambos os tipos celulares apresentam ERK

constitutivamente fosforilado.

Para avaliar se células B-1 poderiam aumentar os níveis basais de

fosforilação de ERK nas células B16 durante o co-cultivo, células B16 foram

mantidas por 24 horas na ausência de soro e então estimuladas ou não com SBF

por 1 hora (1h) na presença ou ausência de células B-1. Após este período,

extratos celulares de monoculturas de células B16 ou de células B16 livres de

células B-1 após o co-cultivo foram produzidos e submetidos a Immunobloting

para investigar os níveis de ERK fosforilado. Conforme mostrado na Figura 6B, um

aumento considerável nos níveis de fosforilação de ERK foi observado nas células

B16 após o co-cultivo com células B-1 (B16+B1), independente da presença de

soro, comparado com células B16 de monoculturas.

3.4 Aumento no potencial metastático de células B16 é dependente

dos níveis de ERK fosforilado

Para avaliar se o aumento na ativação de ERK nas células B16 após o co-

cultivo com células B-1 é um evento importante no aumento do potencial

metastático das células B16, foi utilizado o inibidor farmacológico de MEK1/2

(PD98059) que é a quinase up-stream a ERK na via de sinalização.

Como observado na Figura 7, os níveis basais de ERK fosforilado foram

completamente inibidos na presença de 40 µM de PD98059. Além disso, as

44

análises por Trypan blue não indicaram perda significativa da viabilidade destas

células na presença do inibidor (dados não mostrados).

Em seguida, foi avaliado se o tratamento das células B16 com PD98059

antes ou durante o co-cultivo poderia prevenir o aumento da fosforilação de ERK

induzido pelas células B-1. Para isto, células B16 foram pré-tratadas ou não com

40 µM de PD98059 por 24 horas e co-cultivadas ou não com células B-1 por 72

horas. Adicionalmente, ambos os tipos celulares foram co-cultivados por 72 horas

na presença do inibidor. Como mostra a Figura 8A, independentemente se as

células B16 foram pré-tratadas com PD98059 antes do co-cultivo [(B16+PD)+B1]

ou co-cultivadas com células B-1 na presença do inibidor [(B16+B1)+PD], os

níveis de ERK fosforilado permaneceram similares aos encontrados nas

monoculturas de células B16 não tratadas (B16). Em contraste, os níveis de ERK

fosforilado aumentarão nas células B16 co-cultivadas com B-1 na ausência do

inibidor (B16+B1). Interessantemente, prevenindo o aumento na fosforilação de

ERK induzido pelas células B-1, o número de nódulos metastáticos produzidos

pelas células B16 não apresentou diferença estatística daqueles produzidos por

células B16 cultivadas sozinhas na ausência do inibidor, enquanto que células B16

provenientes de co-culturas não tratadas desenvolveram mais nódulos

metastáticos (Fig. 8B). Notavelmente, apesar da quase completa inibição da

fosforilação de ERK nas células B16 cultivadas sozinhas na presença de

PD98059, esta inibição não refletiu quantitativamente em redução de nódulos

pulmonares, comparado com células B16 cultivadas sozinhas na ausência do

inibidor (Fig. 8B). Juntos estes resultados mostram que existe uma clara

45

associação entre aumento da fosforilação de ERK induzido pelas células B-1 e

aumento no potencial metastático das células B16.

3.5 Células B-1 não induzem aumento na proliferação de células B16

Uma vez que a quinase ERK além de regular invasão e metástase também

está envolvida no controle da proliferação celular (Raman et al., 2007), foi

investigado se o co-cultivo com as células B-1 poderia induzir aumento na

proliferação das células B16. Entretanto, ensaios de MTT e timidina tritiada

realizados por 24, 48, e 72 horas não mostraram aumento na proliferação de

células B16 após co-cultivo com células B-1 (B16+B1) ou quando as células B16

foram cultivadas em meio condicionado proveniente de monoculturas de células B-

1 (B16+mB1) (Fig. 9).

3.6 Células B-1 induzem a expressão de genes relacionados com

metástases nas células B16.

Para explorar em maior detalhe a influência biológica das células B-1 no

aumento do potencial metastático das células B16, a expressão de genes

relacionados com metástase como CXCR-4 [Chemokine (C-X-C motif) receptor] e

MMP-9 (Matrix metalloproteinase-9) foi avaliada nestas células antes e após o co-

cultivo com células B-1. Para isto, RNA total de células B16 co-cultivadas ou não

com células B-1 na ausência ou presença de PD98059 foi extraído. Uma vez

verificada nas amostras de RNA, após tratamento com DNase, a integridade do

RNA (Fig. 10A) e a não amplificação de GAPDH, gene de controle interno, (Fig.

46

10B) foi preparado cDNA a partir destas amostras para análises de expressão

gênica por RT-PCR qualitativo e RT-PCR em tempo real.

Conforme demonstrado na Figura 11A e B, células B16 co-cultivadas com

células B-1 (B16+B1) apresentaram considerável aumento na expressão de MMP-

9 e CXCR4 comparado com monoculturas de células B16 (B16).

Interessantemente, o aumento na expressão destes genes foi inibido nas células

B16 provenientes de co-culturas com células B-1 tratadas com PD98059

[(B16+B1)+PD]. Em conjunto estes resultados sugerem que o aumento na

fosforilação de ERK induzido pelas células B-1 regula a expressão de genes

relacionados a metástase nas células B16, os quais por sua vez podem contribuir

para aumentar o potencial metastático destas células.

3.7 Níveis basais de fosforilação de ERK nas células B-1 são

necessários para induzir aumento no potencial metastático das células

B16.

Resultados descritos na Figura 6A mostraram que células B-1 ex vivo

apresentam níveis constitutivos de ERK fosforilado. Considerando esta evidência,

foi avaliada se a ativação constitutiva desta quinase nas células B-1 poderia estar

relacionada no comprometimento destas células para induzir aumento no potencial

metastático das células B16.

Trabalhos na literatura mostraram que células B-1 produzem e utilizam IL-

10 como fator de crescimento autócrino (O`Garra et al., 1992). Além disso,

existem vários relatos mostrando que esta citocina foi capaz de promover ativação

47

de ERK, enquanto outros relacionaram a eficiente transcrição de IL-10 com a

atividade de ERK (Zhou et al., 2001; Lee et al., 2002; Niemand et al., 2003; Mathur

et al., 2004). Baseado nestas premissas, foi determinado o perfil de fosforilação de

ERK em células B-1 provenientes de camundongos knock-out para IL-10 (B-1

KO). Como pode ser observado na Figura 12, níveis de IL-10 foram detectados no

sobrenadante de culturas de células B-1 de animais wilde-type (B1 wt), enquanto

que no sobrenandante de culturas de células B-1 KO (B1KO) essa citocina não

apresentou níveis detectáveis. Interessantemente, os níveis de fosforilação de

ERK foram notavelmente menores em células B-1 KO, comparado com os níveis

observados em células B-1 wt (Fig. 13A), mostrando assim diferença nos níveis

constitutivos de ERK fosforilado nestas duas células.

Por outro lado, levando em conta relatos da literatura que mostram a

contribuição de ERK para a fosforilação do resíduo serina 727 do fator de

transcrição Stat3 (Signal transducer and activator of transcription 3; Kuroki &

O`Flaherty, 1999; Kakisis et al., 2005) foi avaliado se os níveis baixos de ERK

fosforilado encontrados nas células B-1 KO poderiam influenciar os níveis de

fosforilação de Stat3 nestas células. Entretanto, conforme mostrado na Figura 13B

os níveis de Stat3 fosforilado (resíduo serina727) encontrados nas células B-1 KO

foram equivalentes aos níveis das células B-1 wt.

Em seguida, foi investigado o efeito das células B-1 KO nas células B16

após co-cultivo de ambas as células. Quando os níveis de fosforilação de ERK nas

células B16 submetidas ao co-cultivo com células B-1 KO (B16+B1KO) foram

avaliados estes permaneceram basais, enquanto que nas células B16 de co-

culturas com células B-1 wt (B16+B1wt) os níveis de fosforilação de ERK foram

48

aumentados (Fig. 13C). Por outro lado, o incremento nos níveis de fosforilação de

ERK foi abolido quando as células B-1 wt foram pré-tratadas com PD98059 antes

do co-cultivo com células B16 (Fig. 13C).

Corroborando com os resultados acima, ensaios experimentais de

metástase (Fig. 13D) demonstraram que injeção de células B16 co-cultivadas com

células B-1 wt (B16+B1wt), mas não com células B-1 KO (B16+B1KO) ou células

B-1 wt pré-tratadas com PD98059 antes do co-cultivo [B16+(B1+PD)], induziram

aumento no número de nódulos metastáticos pulmonares. Estes resultados

sustentam a hipótese que níveis constitutivos de ERK fosforilado nas células B-1

participam no comprometimento destas células para induzir aumento no potencial

metastáticos das células B16.

Adicionalmente, o status de ativação de Stat3 nas células B16 co-cultivadas

ou não com células B-1 wt ou B-1 KO foi analisado também por Immunoblot.

Conforme mostrado na Figura 14, níveis basais equivalentes de fosforilação de

Stat3 foram observados nas células B16 cultivadas tanto na ausência quanto na

presença de soro. Entretanto, quando células B16 foram co-cultivadas com células

B-1 wt ou KO, aumento nos níveis de fosforilação de Stat3 foi observado nas

células B16. Juntos estes resultados mostram que, a pesar do co-cultivo com

células B-1 wt e B-1 KO aumentarem os níveis de fosforilação de Stat3 nas células

B16, este aumento não correlaciona com o aumento do potencial metastático das

células B16, uma vez que o co-cultivo destas células com células B-1 KO não

potencializou a capacidade metastática das células B16 (Fig. 13D).

49

3.8 Níveis basais de fosforilação de ERK nas células B16 são

inalterados pelo estímulo com IL-10

Considerando que a IL-10 pode promover aumento nos níveis de

fosforilação de ERK via ativação do receptor de IL-10 (Zhou et al., 2001; Lee et al.,

2002), foi descartada a possível participação da IL-10, produzida pelas células B-1

wt, no aumento dos níveis de fosforilação de ERK nas células B16 submetidas ao

co-cultivo. Para checar isto, células B16 foram tratadas com diferentes

concentrações de IL-10 recombinante (IL-10r) por diferentes tempos. Como

apresentado na Figura 15A, os tratamentos com IL-10r não foram capazes de

aumentar os níveis basais de fosforilação de ERK nas células B16. Além disso, a

inabilidade da IL-10r em incrementar os níveis de fosfo-ERK nas células B-16,

correlacionou com a incapacidade desta citocina ou do meio condicionado de

culturas de células B-1 wt de aumentar a capacidade metastática das células B16

(Fig. 15B). Comparativamente, células B16 submetidas ao co-cultivo com células

B-1 wt produziram maior número de nódulos pulmonares.

Adicionalmente, foi verificado se o tratamento de células B-1 KO na

presença de IL-10r poderia mimetizar os efeitos das células B-1 wt no aumento do

potencial metastático das células B16 durante o co-cultivo. Para avaliar esta

hipótese, células B16 (B16) foram co-cultivadas ou não com células B-1 wt

(B16+B1wt) ou com células B-1 KO na ausência (B16+B1KO) ou presença de 10

ng/ml de IL-10r [(B16+B1KO)+IL-10r] por 72 horas. Adicionalmente, células B-1

KO foram pré-tratadas com 10 ng/ml de IL-10r [B16+(B1KO+IL-10r)] ou com meio

condicionado de culturas de células B-1 wt [B16+(B1KO+mB1wt)] antes do co-

50

cultivo. Após estes tratamentos, células B16 foram coletadas e submetidas a

ensaios de metástase experimental in vivo. Conforme observado na Figura 16A,

células B16 co-cultivadas com células B-1 KO submetidas aos tratamentos com

IL-10r ou com meio condicionado de células B-1 wt, produziram número de

nódulos metastáticos similares àqueles produzidos por células B16 de

monoculturas, enquanto células B16 co-cultivadas com células B-1 wt foram

significativamente mais metastáticas.

Uma vez que o tratamento de células B-1 KO com IL-10r não mimetizou o

efeito das células B-1 wt no aumento do potencial metastático das células B16, foi

verificado se existiam diferenças na expressão do receptor de IL-10 entre essas

células. Para isso, utilizando RT-PCR qualitativo foi determinada a expressão de

mRNA do receptor de IL-10 nas células B-1 wt e KO. Conforme observado na

Figura 16B a expressão de mRNA do receptor de IL-10 (IL-10R) nas células B-1

KO é quase inexistente comparado com os níveis de expressão das células B-1

wt.

51

Figura 1. Células B-1 são eliminadas eficientemente das co-culturas após aspiração

do sobrenadante. Células B16 e B-1 foram co-cultivadas por 72 horas (B16+B1). Após

este período, o sobrenadante do co-cultivo foi aspirado e as células B16 (aderidas) foram

lavadas por 3 vezes com PBS. Em seguida, células B16 livres de células B-1 (B16+B1)

foram coletadas e analisadas por citometria de fluxo para determinação da presença de

marcadores de células B-1 (B220 e Mac-1). Paralelamente, mono-culturas de células B-1

(B1) e B16 também foram analisadas para estes marcadores. Populações duplamente

marcadas estão localizadas nos painéis superiores à direita e as porcentagens de células

duplamente marcadas estão indicadas.

52

Figura 2. Células B-1 aumentam o potencial metastático das células B16.

Monoculturas de células B16 (B16) ou B-1 (B1) ou co-culturas de ambas as células

(B16+B1; 1X105 e 1X106 células, respectivamente) foram cultivadas por 24, 48 ou 72

horas. Após estes períodos, células B16 e B-1 cultivadas de forma individual ou células

B16 livres de células B-1 após o co-cultivo foram coletadas e injetadas na veia da cauda

de camundongos (1X105 células por camundongo). Quatorze dias após a injeção, os

animais foram sacrificados e os pulmões retirados para determinar o número de nódulos

metastáticos formados. Barras correspondem ao número médio de triplicatas realizadas

para cada grupo analisado. Resultados representativos de 3 experimentos independentes.

p<0.05.

53


independentemente da adesão celular. Células B16 (sB16), B-1 (sB1) ou células B16

co-cultivadas com células B-1 (sB16+B1), foram plaqueadas em condições de

impedimento de adesão por 72 horas. Após este período, as células cultivadas de forma

individual ou pool de células B16+B1 provenientes do co-cultivo foram coletadas, os

clusters celulares formados durante o período de co-cultivo foram dissociados e

submetidos tanto a (A) ensaios experimentais de metástases in vivo como (B) ensaio de

viabilidade por Trypan blue. Em (A) barras representam o número médio de nódulos

metastáticos obtidos das triplicatas realizadas para cada grupo analisado e em (B) a

porcentagem da viabilidade celular de cada grupo de células. Os resultados são

representativos de 3 experimentos independentes. p<0.05.

54


capacidade metastática das células B16. Células B16 foram cultivadas por 72 horas em

seu próprio meio (B16) ou co-cultivadas com células B-1 (B16+B1) ou cultivadas em meio

condicionado tanto de monoculturas de 5 dias de células B-1 (B16+mB1) como de co-

cultura de células B16 com B-1 [B16+m(B16+B1)]. Após este período, células B16 de

monoculturas ou do co-cultivo com células B-1 foram coletadas e submetidas a ensaios

experimentais de metástases in vivo. Barras correspondem ao número médio de

triplicatas realizadas para cada grupo analisado. Resultados são representativos de 3

experimentos independentes. p<0.05.

55

Figura 5. Células B16 e B-1 interagem fisicamente durante o co-cultivo. Análises

morfológicas por microscopia eletrônica de transmissão de (A) cultura de 5 dias de células

B-1, ou dos co-cultivos de células B16 e B-1 por (B) 24 horas, (C) 48 horas e (D) 72

horas. Setas indicam: em B pontos de interação entre as duas células. Escala de barras

indicam em A: (1 µm), B: (0,5 µm), C:(1,1 µm), D: (0,4 µm).

56


células B16. (A) Monoculturas de células B16 e B-1 foram mantidas por 24 horas em

meio sem soro e estimuladas ou não com 10% de soro bovino fetal (SBF) por 1 hora (1 h),

conforme indicado. (B) Células B16 mantidas por 24 h sem soro foram estimuladas ou

não com 10% SFB por 1 h e em cada uma destas condições as células B16 foram co-

cultivadas ou não com células B-1 (B16+B-1), como indicado. Após este período, extratos

totais de monoculturas de células B16 e de células B16 livres de células B-1 após o co-

cultivo foram produzidos e submetidos a Immunobloting para detecção dos níveis de ERK

fosforilado (p-ERK). Níveis de ERK total foram analisados como controle interno dos

níveis protéicos aplicados no gel.

57


pelo tratamento com PD98059. (A) Monoculturas de células B16 e B-1 foram cultivadas

em meio completo e tratadas ou não com 20 ou 40 µM de PD98059 por 24 horas. Após

este período extratos totais foram preparados e analisados por Western Blot para a

detecção dos níveis de ERK fosforilado. Níveis de ERK total foram analisados como

controle interno dos níveis protéicos aplicados no gel.

58

Figura 8. O aumento no potencial metastático das células B16 induzido pelo contato

com células B-1 é dependente dos níveis de ERK fosforilado. Monoculturas de células

B16 foram mantidas em meio completo na ausência (B16) ou presença de 40 µM de

PD98059 (B16+PD) por 72 horas (72 h). Para co-culturas, células B16 e B-1 foram co-

cultivadas na ausência (B16+B-1) ou presença de 40 µM de PD98059 por 72 h [(B16+B1)

+PD]. Adicionalmente, monoculturas de células B16 foram pré-tratadas 24 h com 40 µM

de PD98059 e em seguida, co-cultivadas com células B-1 por 72 h na ausência do inibidor

[(B16+PD) +B1]. Após este período, células B16 das monoculturas ou células B16 livres

de células B-1 após o co-cultivo foram coletadas e submetidas tanto a (A) análises por

Western blot para detecção dos níveis de ERK fosforilado, como (B) ensaios

experimentais de metástases in vivo. Barras correspondem ao número médio de nódulos

obtidos das triplicatas realizadas para cada grupo analisado. Estes resultados são


59

Figura 9. Células B-1 não induzem aumento na proliferação das células B16. Células

B16 cultivadas em meio completo na ausência (B16) ou presença de células B-1

(B16+B1) ou do meio condicionado de cultura de células B-1 de 5 dias (B16+mB1) foram

incubadas durante 24, 48 e 72 horas. Após este período, células B16 (aderidas) foram

submetidas a ensaios de proliferação: (A) MTT e (B) incorporação de timidina tritiada.

Barras correspondem ao valor médio das triplicatas. Resultados representativos de 4

experimentos independentes. DO=Densidade Ótica, cpm=contas por minuto.

60

Figura 10. Qualidade do RNA total após extração. Corrida eletroforética em gel de

agarose 1%, evidenciando (A) as bandas de RNAs ribossômicos 28S e 18S em amostras

extraídas de monoculturas (1) ou co-culturas de células B16 e B-1 na ausência (2) ou

presença de PD98059 (3) e (B) a não expressão de mRNA de GAPDH nestas amostras.

Marcador de peso molecular Low mass (Invitrogen).

61

Figura 11. Células B-1 induzem a expressão de CXCR4 e MMP-9 nas células B16.

Células B16 (B16) foram co-cultivadas ou não com células B-1 na ausência (B16+B1) ou

presença de 40 µM de PD98059 [(B16+B1)+PD]. Níveis relativos da expressão de CXCR4

e MMP-9 foram analisados por (A) RT-PCR qualitativo e (B) RT-PCR em tempo real, em

relação à expressão do gene de controle interno, GAPDH. Barras correspondem ao valor

médio das triplicatas de cada grupo. Resultados representativos de 3 experimentos

independentes. p<0.05.

62

Figura 12. Produção de IL-10 por células B-1. Células B-1 isoladas de animais wild-type

(B1wt) ou knock-out (B1KO) foram cultivadas em meio completo durante 5 dias. Após este

período, sobrenadantes destas culturas foram coletados e analisados por ELISA para

detecção dos níveis de IL-10. Barras correspondem ao valor médio das triplicatas de cada

grupo. Resultados representativos de 3 experimentos independentes.

63


para induzir aumento no potencial metastático das células B16. Extratos totais de (A

e B) monoculturas de 5 dias de células B-1 tanto de animais wild-type (B1wt) como knock-

out para IL-10 (B1KO) ou (C) células B16 de monoculturas (B16) ou co-cultivadas por 72

horas com células B-1wt (B16+B1wt), B-1KO (B16+B1KO) ou com B-1wt pré-tratadas

com 40 µM de PD98059 [B16+(B1wt+PD)], foram submetidas à análises por Western blot

para detecção dos níveis de ERK fosforilado (A e C) ou fosforilação do resíduo serina 727

da Stat3 (B). Níveis de ERK total e Stat3 total foram usados para confirmar quantidades

iguais dos extratos celulares. (D) Células B16 foram tratadas como descrito em C e

posteriormente submetidas a ensaio de metástases experimental in vivo. Barras

correspondem ao número médio de nódulos obtidos das triplicatas realizadas para cada

grupo analisado. Resultados representativos de 3 experimentos independentes. p<0.05.

64


com células B-1. Extratos totais de células B16 mantidas 24 horas na ausência de soro

(SBF) e em seguida estimuladas com SBF ou co-cultivadas com células B-1 de animais

tanto wild-type (B16+B1wt) como knock-out para IL-10 (B16+B1KO) foram submetidos a

Western blot para verificar a fosforilação da serina 727 da Stat3. Níveis de Stat3 total

foram usados para confirmar quantidades iguais dos extratos celulares. Resultados

representativos de 3 experimentos independentes.

65

Figura 15. Níveis de ERK fosforilado e comportamento metastático das células B16

não são aumentados por IL-10 recombinante. (A) Células B16 foram mantidas em meio

sem soro durante 24 horas (24 h). Em seguida, células B16 foram estimuladas por 1 h

com 10% de soro bovino fetal (SBF) ou tratadas com diferentes concentrações de IL-10

recombinante (IL-10r) por diferentes tempos, como indicado. Extratos totais destes

tratamentos foram elaborados e submetidos a Western blot para ERK fosforilado. Níveis

de ERK total foram usados para confirmar quantidades iguais dos extratos celulares. (B)

Células B16 co-cultivadas ou não por 72 h com células B-1wt (B16+B1wt) ou com o meio

condicionado delas (B16+mB1) ou com diferentes concentrações de IL-10r foram

submetidas a ensaios experimentais de metástases in vivo. Barras correspondem ao

número médio de nódulos obtidos das triplicatas realizadas para cada grupo analisado.

Resultados representativos de 3 experimentos independentes. p<0.05.

66



recombinante. (A) Células B16 de monoculturas (B16) ou co-culturas com células B-1

tanto de animais wild-type (B16+B1wt) como knock-out para IL-10 co-cultivadas na

ausência (B16+B1KO) ou presença de 10 ng/ml de IL-10 recombinante [(B16+B1 KO)+IL-

10r] foram mantidas durante 72 horas e em seguida submetidas a ensaio experimental de

metástases in vivo. Adicionalmente, células B-1KO cultivadas 5 dias antes do co-cultivo

com 10 ng/ml de IL-10r [B16+(B1KO+IL-10r)] ou com o meio condicionado da cultura de 5

dias de B-1wt [B16+(B1KO+mB1)] foram também submetidas a ensaio experimental de

metástase in vivo. (B) Análise por RT-PCR da expressão de mRNA do receptor de IL-10

(IL-10R) nas células B-1 KO e B1 wt. Barras correspondem ao número médio de nódulos

obtidos das triplicatas realizadas para cada grupo analisado. Datas representativas de 3

experimentos independentes. Expressão de mRNA de GAPDH foi utilizada como gene de

controle interno. p<0.05.

5. DISCUSSÃO

5. DISCUSSÃO

Relatos da literatura têm demonstrado que a expansão metastática de

células de melanoma é um processo altamente complexo dependente de

interações entre as células tumorais e seu estroma (Langley & Fidler, 2007;

Aguirre-Ghiso, 2007). Embora os macrófagos associados ao tumor (TAMs) sejam

a principal população de células inflamatórias presentes no micro-ambiente

tumoral, outros tipos celulares podem também favorecer a formação de

metástases ao interagir de forma direta com as células tumorais e ou indireta pela

produção de fatores solúveis (Balkwill & Mantovani, 2001; Inoue et al., 2006; Croci

et al., 2007; Mantovani et al., 2007; Hofmeister et al., 2008).

Evidências apresentadas no presente estudo mostram que interações in

vitro entre células de melanoma murino B16 e células B-1, subtipo de linfócitos B

presentes nas cavidades pleural e peritoneal, resultam em aumento do potencial

metastático das células de melanoma (Fig.2). Os resultados apresentados

mostraram inequivocamente que interações físicas entre células B16 e B-1, e não

fatores solúveis produzidos pelas células B-1, representam a principal condição

para aumentar a capacidade metastática das células B16 (Fig. 4 e 5),

corroborando dados prévios de nosso grupo, ainda não publicados. Análises de

microscopia eletrônica (Fig. 5), realizadas com intuito de investigar com mais

detalhe o tipo de interação entre essas células durante o co-cultivo, demonstraram

estreita comunicação física entre elas. Esta interação, entretanto, não sugeriu

69

fusão celular, já que os contornos das membranas plasmáticas de cada célula

apresentaram-se claramente delimitados.

Um dos resultados inéditos deste trabalho mostrou que o aumento do

potencial metastático das células B16 induzido pelo contato com células B1 está

associado a aumento na ativação de ERK. Análises de Western blot evidenciaram

que o contato de células B-1 induz aumento nos níveis de fosforilação de ERK nas

células B16 (Fig. 6B). Interessantemente, quando o aumento da fosforilação de

ERK foi bloqueada pelo inibidor farmacológico de MEK (PD98059), quinase up-

stream de ERK, o aumento da capacidade metastática das células B16 foi inibido

(Fig. 8B). Em contraste, monoculturas de células B16 apresentam níveis basais

constitutivos de ERK (Fig. 6A), e a completa inibição desta quinase nestas células

não inibiu sua capacidade natural de formar nódulos metastáticos no pulmão (Fig.

8B). Esta observação sugere que o fenótipo intrínseco da linhagem celular B16 de

baixo potencial metastático pode ser sustentado por outra via de sinalização que

independe de background mínimo de ERK fosforilado. Por outro lado, o fato de

que células B-1 não serem capazes de elevar os níveis de ERK fosforilado nem o

potencial metastático das células B16 tratadas previamente com PD98059 sugere

que, os efeitos desencadeados pelas células B-1 dependem de níveis basais de

ERK fosforilado nas células B16.

Vários relatos da literatura sustentam que os substratos de ERK incluem

alvos presentes no citoplasma como também fatores de transcrição tais como as

famílias ELK/SAP, Ets/PEA3, AP-1 e Stat (Hill & Treisman, 1996; Harper &

LoGrasso, 2001; Viala & Pouyssegur, 2004). Algumas destas famílias, como AP-1

e Ets são importantes na regulação da expressão de várias metaloproteinases

70

(MMPs) como MMP-9 e quimiocinas como CXCR4, as quais estão associadas

com progressão metastática em diversos tipos de cânceres entre eles o melanoma

(John & Tuszynski, 2001; Hofmann et al., 2003; Kulbe et al., 2004; Tower et al.,

2002; Kim et al., 2006; Maroni et al., 2007; Ruffini et al., 2007).

Análises de expressão gênica para CXCR4 e MMP-9 por RT-PCR

qualitativo e em tempo real realizadas neste trabalho mostraram aumento

substancial na expressão destes transcritos nas células B16 após contato com

células B-1 (Fig. 11). Interessantemente, estes resultados também mostraram que

o aumento na expressão de mRNA de CXCR4 e MMP-9 é inibido pela adição do

inibidor farmacológico PD98059. Assim como os achados de outros grupos, este

resultado sustenta a participação de ERK na regulação da expressão destes

transcritos (Gum et al., 1997; Simon et al., 1998; Lakka et al., 2000; Maroni et al.,

2007) e ainda, sugere que o aumento na expressão de mRNA de MMP-9 e

CXCR4 nas células B16 induzida pelo co-cultivo com células B-1 pode contribuir

para potencializar a capacidade metastática das células B16 ao favorecer o

extravasamento e migração destas células aos pulmões.

Outro dado importante e inédito de nossa pesquisa foi a necessidade de

níveis constitutivos de ERK fosforilado nas células B-1 para o comprometimento

destas células na indução do aumento no potencial metastático das células B16.

Resultados obtidos mostram que a inibição da fosforilação de ERK nas células B-1

pelo tratamento com PD98059, prejudica consideravelmente a capacidade destas

células de induzir aumento tanto nos níveis de ERK fosforilado como na

capacidade metastática das células B16. Esta observação foi também sustentada

por estudos com células B-1 provenientes de camundongos knock-out para IL-10

71

(KO), as quais apresentaram níveis basais de ERK fosforilado menores dos níveis

encontrados nas células B-1 de animais wild-type (wt) (Fig. 13A). Resultados

obtidos também com células B-1 KO mostraram que estas células não têm

capacidade para aumentar os níveis de ERK fosforilado nem o potencial

metastático das células B16 quando comparadas com células B-1 wt.

Considerando dados da literatura que evidenciam aumento nos níveis de

ERK fosforilado via ativação do receptor de IL-10 (Yi et al., 2002; Mathur et al.,

2004; Liu et al., 2006; Chanteux et al., 2007), é possível especular que os níveis

baixos de ERK fosforilado observados nas células B-1 KO sejam devidos a níveis

também baixos de expressão de mRNA do receptor de IL-10 nestas células (Fig.

16). Embora o nível de fosforilação de ERK nas células B-1 wt após estímulo com

IL-10 recombinante (IL-10r) não tenha sido analisado, os resultados acima

descritos sugerem que o estímulo das células B-1 com IL-10, poderia contribuir

com os níveis basais de fosforilação de ERK observados nestas células. Em

contraste, células B-16 não apresentaram aumento nos níveis de fosforilação de

ERK nem aumento do seu potencial metastático após estímulo com IL-10r ou com

o sobrenadante de cultura de células B1wt (Fig. 15). Estes resultados, em

conjunto, sugerem que IL-10 pode ser um fator importante para manutenção de

níveis constitutivos de ERK nas células B-1 wt, os quais podem favorecer a

expressão de prováveis moléculas de membrana, que ao interagir no co-cultivo

com receptores presentes nas células B16 promovem o crescimento metastático

destas células.

Fosforilação constitutiva de ERK nas células B-1 foi previamente

demonstrada por Wong e colaboradores (2002). Embora a atividade de ERK não

72

seja necessária para a sobrevida destas células em cultura, ainda são

desconhecidos quais aspectos da fisiologia das células B-1 são regulados pela

quinase ERK (Wong et al., 2002). Com base nos resultados aqui apresentados

ainda não foi possível estabelecer porque as células B-1 precisam de altos níveis

de ERK fosforilado para potencializar a capacidade metastática das células B16.

Entretanto, relatos da literatura têm demonstrado que diferenças na duração,

magnitude e distribuição sub-celular da atividade de ERK determinam programas

celulares específicos (Balmanno & Cook, 1999; Sasagawa et al., 2005; Ebisuya et

al., 2005). Assim, considerando os resultados acima descritos que sustentam a

necessidade do contato físico entre células B16 e B-1, é possível especular que

níveis basais de ERK nas células B-1 são requeridos para regular a expressão de

moléculas de superfície nestas células, as quais ao interagirem com células B16

durante o co-cultivo, formam uma rede interativa de sinalização célula-célula.

Por outro lado, além da ativação constitutiva de ERK, células B-1 também

apresentam ativação constitutiva de Stat3 (Signal transducer and activator of

transcription 3), o qual tem papel importante na capacidade de auto-renovação

destas células (Karras et al., 1997). As proteínas STATs são fatores de transcrição

ativados por fosforilação de uma tirosina (Y705) ou uma serina (S727) em

resposta a um ligante extracelular, que pode ser citocina ou fatores de

crescimento (Darnell, et al., 1997; Bromberg, et al., 1999; Ihle, 2001; Chen, et al.,

2004). Considerando relatos da literatura, nos quais foi mostrado que ERK pode

contribuir com a fosforilação do resíduo serina da Stat3 (Kuroki & O`Flaherty,

1999; Kakisis et al., 2005), investigou-se nas células B-1 KO os níveis de

fosforilação de Stat3, visto que estas células apresentam níveis de ERK fosforilado

73

menores quando comparados com os níveis observados nas B-1 wt (Fig. 13A). O

fato que os níveis de Stat3 nas células B-1 KO foram semelhantes aos observados

nas células B-1 wt (Figura 13B) sugere que a ativação do resíduo serina (727) da

Stat3 nestas células independe da atividade de ERK. Por outro lado, considerando

que aumento na ativação de Stat3 foi associado também com progressão

metastática em vários tipos de cânceres, entre eles o melanoma (Gabrilovich et

al., 1996; Mora et al., 2002; Kortylewisky et al., 2005; Lassmann et al., 2007), o

status de ativação deste fator de transcrição foi avaliado nas células B16 antes e

após contato com células B-1. Conforme mostrado na Figura 14, células B16

apresentam níveis basais de Stat3 (resíduo serina 727) e estes níveis são

aumentados após interação com células B-1, sejam KO ou wt. Entretanto, células

B-1 KO não têm capacidade de aumentar nem os níveis de fosforilação de ERK

nem a capacidade metastática das células B16 (Fig 13 C e D, respectivamente).

Embora outros experimentos sejam necessários para excluir a participação de

Stat3 neste modelo de estudo, estes resultados sugerem fortemente que a via da

Stat3 não tem participação no aumento do potencial metastático induzido pelo

contato com células B-1.

Adicionalmente, outras vias de transdução de sinal que atuam sobre

mensageiros intermediários como PKC e Fak (Kahana, et al., 2002; Oka & Kikawa,

2005), cuja up-regulation tem sido associada com invasão e metástases de células

de melanoma, também foram analisadas. Entretanto, resultados obtidos com estas

quinases não levaram a resultados conclusivos da sua participação neste modelo

de estudo.

74

Em resumo os resultados apresentados neste trabalho fornecem as

primeiras evidências do envolvimento da via ERK no aumento da capacidade

metastática das células B16 induzido pelo contato com células B-1. Sugerem que

a up-regulation desta via é um dos mecanismos pelos quais linfócitos B-1 podem

influenciar diretamente no potencial metastático de células tumorais. Além disso,

este trabalho reforça a idéia que as células B-1 podem estar presentes no micro-

ambiente tumoral realizando funções similares aos TAMs ao favorecer a formação

de metástases. Para confirmar esta última hipótese, atualmente nosso grupo

investiga a presença das células B-1 em isolados de tecidos tumorais humanos

com o intuito de determinar se o efeito das células B-1 sobre o comportamento

metastático das células de melanoma apresentadas neste estudo ocorre também

in vivo no contexto dinâmico do micro-ambiente tumoral.

6. CONCLUSÕES

6. CONCLUSÕES

1 – Células B-1 interagem fisicamente com células de melanoma murino

B16 após 48 horas de co-cultivo e esta interação é necessária para o aumento do

potencial metastático das células B16;

2 – A participação da citocina IL-10 ou outro fator solúvel produzido pelas

células B-1 como responsáveis pela indução do aumento tanto dos níveis de

fosforilação de ERK como da capacidade metastática das células B16 foi excluída;

3 – Células B-1 induzem aumento na capacidade metastática das células

B16 ao induzir up-regulation dos níveis basais de ERK fosforilado nestas células;

4 – Níveis basais de ERK fosforilado tanto nas células B16 como nas B-1

são necessários para potencializar o crescimento metastático das células B16

induzido pelo contato com células B-1;

5 – Células B-1 induzem aumento na expressão de genes associados a

progressão metastática, como MMP-9 e CXCR-4 nas células B16;

77

6 – Altos níveis de foforilação de ERK nas células B-1 são necessários para

o comprometimento destas células para induzir aumento no potencial metastático

das células B16;

7 – A fosforilação do resíduo serina da Stat3 nas células B-1 independe dos

níveis de ativação de ERK, nestas células.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


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ABSTRACT

Summary

Increasing evidence indicates that tumors require a constant influx of

myelomonocytic cells to support their malignant behavior. This is caused by tumor-

derived factors, which recruit and induce functional differentiation of

myelomonocytic cells, most of which are macrophages. Although myeloid lineages

are the classical precursors of macrophages, B lymphoid lineages such as B-1

cells, a subset of B lymphocytes found predominantly in pleural and peritoneal

cavities, are also able to migrate to inflammatory sites and differentiate into

mononuclear phagocytes exhibiting macrophage-like phenotype. Here we

examined the interplay of B-1 cells and tumor cells and checked whether this

interaction provides signals to influence melanoma cells metastases. Using in vitro

coculture experiments we showed that B16, a murine melanoma cell line, and B-1

cells physically interact. Moreover, interaction of B16 with B-1 cells leads to

upregulation of metastasis-related genes expression (MMP-9 and CXCR-4),

increasing its metastatic potential, as revealed by experimental metastases assays

in vivo. We also provide evidences that B16 cells exhibit markedly upregulated

phosphorylation of the extracellular signalregulated kinase (ERK) when co-cultured

with B-1 cells. Inhibition of ERK

phosphorylation induced by B-1 cells with an inhibitor of MEK1/2 strongly

suppressed the induction of MMP-9 and CXCR-4 mRNA expression and impaired

the increased metastatic behavior of B16. In addition, constitutive levels of ERK1/2

phosphorylation in B-1 cells are necessary for their commitment to affect the

metastatic potential of B16 cells. Our findings show for the first time, that B-1

80

lymphocytes can contribute to tumor cell properties required for invasiveness

during metastatic spread.

ANEXOS

80

----- Mensagem encaminhada de [email protected] ----- Data: Tue, 15 Jan 2008 19:19:14 -0500 (EST) De: [email protected] Reponder para: [email protected] Assunto: Cancer Science (CAS-OA-0602-2007.R1): Acceptance Para: [email protected] Date: 15-Jan-2008 RE: Ms No.: CAS-OA-0602-2007.R1 Title: B-1 lymphocytes increase metastatic behavior of melanoma cells through the extracellular signal-regulated kinase pathway. Author(s): Pérez, Elizabeth; Machado Jr, Joel; Aliperti, Fabiana; Freym�ler, Edna; Mariano, Mario; Lopes, Jos� Dear Prof. Joel Machado Jr: We are pleased to inform you that your revised paper has been accepted for publication in Cancer Science and will be published in Cancer Science. The comments of the Associate Editor and reviewer(s) who reviewed your manuscript are included at the foot of this letter. Thank you for your fine contribution. On behalf of the Editors of Cancer Science, we look forward to your continued contributions to the Journal. We would like to take this opportunity to explain our recently launched functions to assist authors with tracking their manuscripts through the production process. To minimise publication time of your manuscript it is important that all electronic artwork is supplied to the editorial office in the correct format and resolution. I recommend that you consult the Illustration guidelines at http://www.blackwellpublishing.com/bauthor/digill.asp if you need advice on any aspect of preparing your artwork. Copyright - If you havenuft already sent your completed Copyright Assignment Form for your manuscript at the time of submission, please sign and return to this office within two weeks. Accepted articles canuft go into production for an issue until a completed form has been received. Author Services - Production status tracking - You can now track your article via the publisherufs Author Services. Once your paper is with the Production Editor, you will receive an e-mail with a unique code that automatically adds your article to the system when you register. With Author Services you can check the status of your article online and choose to receive automated e-mails at key stages of production. Therefore, please ensure that we have your complete e-mail address. There may be a short delay whilst the article is sent to the Production Editor and logged into the production tracking system. Additional services will be added to the website soon. Proofing your manuscript – Cancer Science is included in a new electronic service, uge-proofinguh. You will receive an e-mail from the typesetter when your article is ready for proofing. Youufll receive instructions about how to download your paper and how to return your corrections. Your e-mail address is needed for this vital step, too. OnlineEarly – Cancer Science operates a system called OnlineEarly, whereby articles are published online ahead of assignment to an issue and publication in print. If your article is eligible for this service (Review Articles and Original Articles only), you can track the progress of your article and learn when it is published online by registering for Author Services. Please note that in order to publish your article as quickly as possible, and if your article is received very close to the copy deadline for an issue, it may be

81

incorporated directly into that issue without first appearing OnlineEarly. The Blackwell Synergy Website for Cancer Science is http://www.blackwell-synergy.com/loi/cas. Reprints and Offprints - You will receive instructions for ordering offprints when you are notified that your proofs are ready for review. Sincerely yours, Dr. Setsuo Hirohashi, Editor Cancer Science --- Cancer Science Editorial Office TEL: 81-3-3830-1266 FAX: 81-3-5689-7278 [email protected] http://www.blackwellpublishing.com/cas Associate Editor's decision: Acceptance Comments to Author: Associate Editor: 1 Comments to the Author: The authors have properly revised the manuscript according to the reviewers' comments. I recommend to accept this manuscript for publication in Cancer Science. ----- Finalizar mensagem encaminhada -----




SINAL

São Paulo 2008

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para obtenção do Título de Doutor em Ciências da Saúde. Orientador: Prof. Dr. José Daniel Lopes Co-orientador: Joel Jr. Machado