MAC GAYVER DA SILVA CASTRO

Modelagem do músculo liso da traqueia para o estudoda alteração mecânica devida ao formaldeído e a doses

crescentes de um agente contrátil

São Paulo2012

MAC GAYVER DA SILVA CASTRO

Modelagem do músculo liso da traqueia para o estudoda alteração mecânica devida ao formaldeído e a doses

crescentes de um agente contrátil

Dissertação apresentada à Faculdade deMedicina da Universidade de São Paulopara obtenção do título de Mestre em Ciências

Programa de Fisiopatologia ExperimentalOrientador: Prof. Dr. Adriano Mesquita Alencar

São Paulo2012

Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

reprodução autorizada pelo autor

Castro, Mac Gayver da Silva Modelagem do músculo liso da traqueia para o estudo da alteração mecânica devida ao formaldeído e a doses crescentes de um agente contrátil / Mac Gayver da Silva Castro. -- São Paulo, 2012.

Dissertação(mestrado)--Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Programa de Fisiopatologia Experimental.

Orientador: Adriano Mesquita Alencar.

Descritores: 1.Músculo liso 2.Formaldeído 3.Metacolina 4.Viscoelasticidade 5.Voronoi 6.Ratos Wistar

USP/FM/DBD-179/12

Aos meus pais, Luiz Carlos Castro e Silva e MariaTereza da Silva Castro, que tanto se esforçaram

para que eu pudesse ter a melhor educação possível.Se hoje tive forças para erguer mais um pilar foi por

causa deles. Pai e mãe, amo-os demais e parasempre. Obrigado por tudo. Vocês são meus heróis.

i

Agradecimentos

Minha dívida é grande para com o meu orientador Prof. Adriano Mesquita Alencar

pela confiança, paciência e que me permitiu construir mais e mais conhecimentos ao

longo dos anos. Em 2009 adentrei num mundo que não era secreto, mas que era to-

talmente novo para mim. Eu precisava de um guia para saber para onde olhar e como

olhar. Eu tinha de me esforçar para ver esse mundo, e o Prof. Adriano foi o meu grande

guia nessa história. Ele trabalhou comigo por mais de três anos estimulando-me desde

as primeiras partes deste projeto, sempre observando e ajudando no andamento do tra-

balho – certamente apavorado – quando várias vezes deslizei. Ao me mostrar que eu

poderia ser o grande mestre de obras de toda essa construção, ele estava me dizendo

que eu poderia ser muito mais do que aquilo que eu era. Prof. Adriano foi muito de-

dicado, atencioso e sincero durante todo o tempo do que imaginei que um orientador

seria. Foi uma honra trabalhar com ele durante essa empreitada.

À Profa. Marisa Dolhnikoff pela importante ajuda durante o credenciamento do

Prof. Adriano na Fisiopatologia Experimental. Sem a sua ajuda muitas coisas ficariam

complicadas.

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio

financeiro sem o qual a realização deste trabalho tornar-se-ia demasiado complicado.

À banca de qualificação, composta pelo Prof. Henrique Moriya, Profa. Iolanda

Tibério e Prof. Paulo Silveira, que leu com cuidado o texto da qualificação de mestrado

e sugeriu pertinentes modificações para este trabalho final.

ii

Em 2009 também conheci Miriam Lemos. Ela transmitiu-me suas experiências

como pesquisadora e leu com extrema atenção os textos da pré-defesa. Foi uma satis-

fação enorme conhecê-la.

Agradeço também a Mariangela Macchione, pelos ensinamentos na separação de

poluentes atmosféricos e também pelas queridas conversas, risos e abraços.

Agradeço também à família LabM2. Todas as nossas confraternizações foram es-

peciais para mim. Lembro detalhadamente do sorriso de cada um. Deste grupo gostaria

de agradecer em especial a: Alexandre Barros, Mariana Sacrini e Diana Martínez que

tiveram paciência para me escutar durante minhas apresentações preparativas para a

qualificação do mestrado. Nossas conversas durante o almoço e o “horário do café” no

laboratório tornaram-se inesquecíveis.

Ao LIM–05 e aos amigos da Fisiopatologia Experimental da Faculdade de Medi-

cina da USP (FMUSP); Luciana Duzolina, Camila Villegas, Marcia Hage, Francine,

Tânia Souza e Liduvina. Na FMUSP conheci também Luciano Belotti, Robson Seriani

e Luis Afonso Pires. Daí em diante conversávamos diaramente e, como consequência,

construímos uma amizade verdadeira, consolidada na sinceridade e respeito mútuos.

A convivência com eles foi maravilhosa e sempre renovadora.

A Suyane da Silva Castro, minha irmã, pelo amor e carinho dispensados durante

toda a minha empreitada longe da família.

Adriano Holanda e Alessandra, queridos e velhos amigos. Suas longas e sensatas

conversas foram muito preciosas. Minha gratidão e admiração por eles só crescem.

Bruno Sombra e Camilla Salviano, queridos amigos, que durante todo o tempo,

sempre estiveram muito presentes dando apoio e transmitindo alegria. Não há palavras

que façam a merecida justiça aos dois.

iii

Sou grato a Rafael Xavier, meu irmão de consideração. Não existem palavras que

façam a justiça que ele merece por ter me apoiado desde sempre.

George Táccio Candeiro também teve e tem uma importância grande durante a

minha caminhada. Seus conselhos, indagações foram de extrema importância.

Por último e não menos importante, agradeço a Anne Caroline Barros e Deborah

Almeida pelas conversas diárias durante a reta final do meu mestrado, pelos sorrisos,

que mesmo não podendo vê-los, sempre soube que eram verdadeiros.

iv

“[...] a ciência deve dar ênfase à experiência e àexperimentação – o modo como a natureza funciona– e não ao que afirma nossa intuição ou ao que nosparece mentalmente interessante. E, acima de tudo,

a ciência deve utilizar a matemática.”

Leonard Mlodinow, O Andar do Bêbado.

v

Esta dissertação está de acordo com as seguintes normas:

Referências: adaptado de International Committee of Medical Journals Editors (Van-

couver).

Requisitos uniformes para manuscritos / International Committee of Medical Journals

Editors.

Universidade de São Paulo. Faculdade de Medicina. Serviço de Biblioteca e Docu-

mentação. Guia de apresentação de dissertações, teses e monografias. Elaborado por

Annelise Carneiro da Cunha, Maria Julia de A. L. Freddi, Maria F. Crestana, Marinalva

de Souza Aragão, Suely Campos Cardoso, Valéria Vilhena. 3a Ed. São Paulo: Serviço

de Biblioteca e Documentação; 2011.

Abreviaturas dos títulos dos Periódicos de acordo com List of Journals Indexed em

Index Medicus.

Sumário

Lista de Símbolos viii

Lista de Abreviaturas x

Lista de Siglas xi

Lista de Figuras xii

Resumo xiv

Summary xv

1 INTRODUÇÃO 1

1.1 Modelos matemáticos e a mecânica do músculo liso . . . . . . . . . . 3

1.2 Proteínas do aparato contrátil do músculo liso . . . . . . . . . . . . . 11

1.3 Fibras do sistema colágeno . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.4 Fibras do sistema elástico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.5 Exposição ambiental ao formaldeído e a asma relacionada ao trabalho

(ART) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2 OBJETIVOS 26

3 MÉTODOS 27

3.1 Modelagem do músculo liso da traqueia . . . . . . . . . . . . . . . . 28

3.2 Modelagem do agente contrátil . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

3.3 Elasticidade da rede . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

3.4 Modelagem do efeito do formaldeído . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

4 RESULTADOS 44

4.1 Relação comprimento-rigidez . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

4.2 Efeito dos parâmetros γ e Dm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

4.3 Efeito do parâmetro c . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

4.4 Efeito dos parâmetros klig e K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

5 DISCUSSÃO 53

6 CONCLUSÃO 56

7 LIMITACÕES DO MODELO 57

8 ANEXOS 58

Referências 72

Apêndice 80

viii

Lista de Símbolos

fs força exercida por uma mola

k constante elástica da mola

`0 comprimento inicial ou original da mola

` comprimento corrente da mola

∆` variação do comprimento da mola

fd força exercida por um amortecedor

c coeficiente de viscosidade

v velocidade

f j força exercida pelo elemento viscoelástico j

ke constante elástica equivalente do elemento viscoelástico j

`0j comprimento inicial, original ou de equilíbrio do elemento viscoelástico j

` j comprimento corrente do elemento viscoelástico j

∆` j variação do comprimento do elemento viscoelástico

v j velocidade do elemento viscoelástico j

klig constante elástica fixa da mola do elemento viscoelástico

k j constante elástica dependente do comprimento inicial do elemento viscoelástico j

ε j deformação do elemento viscoelástico j

F1 força resultante na linha imaginária 1

F2 força resultante na linha imaginária 2

F3 força resultante na linha imaginária 3

F4 força resultante na linha imaginária 4

Fts força de transecção

ix

f j força exercida pelo elemento viscoelástico j

Dm parâmetro que representa a dose de metacolina no modelo

MMIN dose mínima de metacolina aplicada no experimento

MMAX dose máxima de metacolina aplicada no experimento

γ fator de contração do elemento viscoelástico

nm nanometro

pN piconewton

h hora

> maior que

< menor que

= igual a

6 menor ou igual a

x

Lista de Abreviaturas

FA Formaldeído

COV Composto orgânico volátil

ppm Partes por milhão

ART Asma relacionada ao trabalho

IgE Imunoglobulina E

IL Interleucina

MEC Matriz extracelular

ATP Adenosina trifosfato

ADP Adenosina difosfato

Pi Fosfato inorgânico

DMEM Deulbecco’s modified eagle medium

LTB4 Leucotrieno B4

PAS/AB PAS/Alcianblue (corante)

sen seno

xi

Lista de Siglas

FMUSP Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo

CETESB Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental

ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária

EPA Agência de Proteção Ambiental

xii

Lista de Figuras

1 Modelo de rede elástica bidimensional desenvolvido por Cavalcante e

colaboradores para representar o parênquima pulmonar sob estresse . 4

2 Modelo de citoesqueleto de uma célula muscular lisa . . . . . . . . . 7

3 Outro modelo de citoesqueleto de uma célula muscular lisa. . . . . . . 10

5 Estrutura da miosina II . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

6 Curso de tempo do efeito do formaldeído (FA) na responsividade traqueal 18

7 Detalhes sobre a ligação do átomo de nitrogênio da lisina da cadeia

lateral a um outro átomo de nitrogênio do peptídeo ligante . . . . . . 26

8 Representação simbólica de uma mola e de um amortecedor . . . . . 29

9 Ilustração da montagem do modelo de rede elástica bidimensional . . 30

10 Rede particionada em diferentes locais por linhas imaginárias para a

detecção de força . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

11 Ilustração do método para calcular a projeção da força no eixo-y para

os EVs que cruzam as linhas imaginárias . . . . . . . . . . . . . . . . 34

12 Relação entre a dose real de metacolina Dr e o parâmetro Dm . . . . . 36

13 Sistema de molas acopladas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

14 Ilustração da relação inversa rigidez-comprimento considerada para os

elementos viscoelásticos do modelo proposto . . . . . . . . . . . . . 42

15 Cálculo analítico e numérico da relação inversa entre comprimento e

rigidez dos elementos viscoelásticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

xiii

16 Efeito do parâmetro Dm no comprimento dos elementos viscoelásticos

que compõem a parte intermediária da rede no modelo matemático

proposto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

17 Percentagem de diminuição do comprimento natural `0j de dois EVs

presentes na parte intermediária da rede . . . . . . . . . . . . . . . . 47

18 Configuracões da rede e perfil de sua força sob diferentes coeficientes

de viscosidade . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

19 Efeito do parâmetro c na força da rede . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

20 Perfil das forças resultantes da rede com diferentes valores para c e n . 50

21 Configurações do modelo de rede de Voronoi mimetizando os estágios

de contração do tecido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

22 Tensão gerada pela contração da rede devido ao encurtamento dos ele-

mentos viscoelásticos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

23 Diagrama da disposição da matéria no sistema solar feito por Descartes

em 1633 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

24 Diagrama de Voronoi e os geradores . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

25 Diagrama de Voronoi e a relação entre as distâncias entre pontos . . . 67

26 Bordas e geradores de um diagrama de Voronoi . . . . . . . . . . . . 68

xiv

Resumo

Castro, M.G.S. Modelagem do músculo liso da traqueia para o estudo da alteraçãomecânica devida ao formaldeído e a doses crescentes de um agente contrátil [Disser-tação]. São Paulo: Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo; 2012.

A viscoelasticidade do pulmão do mamífero é determinada também pelas propriedadesmecânicas, estrutura e regulação do músculo liso das vias aéreas respiratórias. A ex-posição ao ar poluído pode deteriorar essas propriedades com consequências danosasà saúde individual. O formaldeído é um importante poluente presente em ambientesinternos que adentra o músculo liso formando ligações covalentes entre proteínas damatriz extracelular e da estrutura intracelular deteriorando algumas funções do mús-culo liso das vias aéreas, alterando propriedades mecânicas e induzindo a hiperres-ponsividade. O primeiro objetivo desse trabalho foi desenvolver um modelo de redeviscoelástica bidimensional baseada na tesselação de Voronoi para reproduzir algumaspropriedades mecânicas do músculo liso de via aérea a nível de tecido. O segundo obje-tivo foi comparar os resultados obtidos com o nosso modelo com aqueles previamenteobservados em experimentos com tiras de tecido após a exposição ao formaldeído.Nosso modelo simula as propriedades mecânicas do músculo liso de via aérea usandoum conjunto de molas e amortecedores. Esse conjunto de molas e amortecedores nãosomente mimetiza as propriedades viscoeláticas do músculo liso mas também o apa-rato contrátil das células. Nós hipotetizamos que a formação de ligações covalentes,devido à ação do formaldeído, pode ser representada no modelo por uma alteraçãosimples na constante elástica das molas, enquanto que a ação da metacolina reduz otamanho da mola. Nosso modelo é hábil para reproduzir uma medida de força iso-métrica onde o músculo liso é sujeito a um agente contrátil, com e sem exposição invitro ao formaldeído. Assim, a nossa nova abordagem mecanicista incorpora diversaspropriedades bem conhecidas do sistema contrátil das células em um tecido a nível demodelo. O modelo pode também ser usado em diferentes escalas biológicas.

Descritores: músculo liso, formaldeído, metacolina, viscoelasticidade, voronoi, ratoswistar

xv

Summary

Castro, M.G.S. Modeling of tracheal smooth muscle for the study of mechanical changedue to formaldehyde and increasing doses of contractile agent [dissertation]. São Paulo:“Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo”; 2012.

The viscoelastic properties of the mammalian lung is also determined by the mecha-nical properties, structure and regulation of the airways smooth muscle. The exposureto polluted air may deteriorate these properties with harmful consequences to indi-vidual health. Formaldehyde is an important indoor pollutant that permeate throughthe smooth muscle tissue forming covalent bonds between proteins in the extracellu-lar matrix and intracellular protein structure deteriorating some of the airways smoothmuscle functions, changing mechanical properties, and inducing hyperresponsiveness.The first objectives of this work was to develop a two-dimensional viscoelastic networkmodel based on Voronoi tessellation to reproduce some of the mechanical propertiesof airway smooth muscle at the tissue level. The second objective was to compare theresults obtained with our model with those previously observed in tissue strip experi-ments after the tissue exposure to formaldehyde. Our model simulates the mechanicalproperties of airway smooth muscle using a set of springs and dashpot. This set ofsprings and dashpot not only mimic the viscoelastic properties of the smooth musclebut also the cells contractile apparatus. We hypothesized that the formation of covalentbonds, due to the action formaldehyde, can be represented in the model by a simplechange in the elastic constant of the springs, while the action of methacholine reducethe size of the spring. Our model is able to reproduce an isometric force measurement,where the smooth muscle is subjected to a titration of a contractile agent, with andwithout an in vitro exposure to formaldehyde. Thus, our new mechanistic approachesincorporates several well know features of the contractile system of the cells in a tissuelevel model. The model can also be used in different biological scales.

Descriptors smooth muscle, formaldehyde, methacholine, viscoelasticity, voronoi, wis-tar rats

1

1 INTRODUÇÃO

O músculo liso é um músculo com comportamento involuntário encontrado em

muitos órgãos ocos de mamíferos. Nestes órgãos, o músculo liso é conhecido por re-

gular as suas propriedades mecânicas e também suas dimensões físicas (Bossé et al.

2008). Entretanto, em alguns casos, como nas vias aéreas respiratórias, sua função

exata ainda não está totalmente esclarecida. Tem-se especulado que o músculo liso

ajuda no fluxo aéreo respiratório controlando o calibre da via aérea e auxilia nas fases

da respiração (Macklin 1929).

O encurtamento exagerado e alterações mecânicas no músculo liso das vias aéreas

respiratórias contribuem para a manifestação de sintomas da asma1 com o desenvolvi-

mento da bronconstrição (Coburn 1989), (Agrawal e Townley 1990), (Fredberg 2002),

(Ito et al. 2006), (Bossé et al. 2008). Essas alterações nas propriedades mecânicas estão

relacionadas com a estrutura e viscoelasticidade das células musculares lisas (Gunst e

Tang 2000), (Gunst e Zhang 2008).

Além de fatores genéticos, a exposição do músculo liso das vias aéreas respiratórias

a alguns componentes naturais e poluentes ambientais pode afetar as suas proprieda-

des mecânicas levando à consequências danosas à saúde individual, similar àquelas

observadas na asma (Ito et al. 2006), (Berntsen et al. 2010).

Dentre os poluentes ambientais, o formaldeído (FA) é um minúsculo (2,4 – 2,7 Å)

composto orgânico volátil de quatro átomos (HCHO), presente em materiais sanean-

tes, materiais de escritório e também na exautão dos escapamentos dos carros (Lipari e

Swarin 1982), (Lino dos Santos Franco et al. 2010). Por décadas, o FA é utilizado para

1De acordo com a Iniciativa Global para Asma (GINA), a asma é uma doença pulmonar crônicacaracterizada por recorrentes problemas na respiração e sintomas como falta de ar, aperto no peito etosse.

2

preservar tecidos biológicos pela formação de ligações cruzadas entre proteínas nas

células e no tecido (Wadsworth e Pangborn 1980), (Theis 1945), (Gustavson 1947),

(Kitamoto e Maeda 1980) . Em 2003, Abe e colaboradores realizaram um estudo com

o objetivo de detectar as ligações cruzadas de colágeno e elastina em tecido fixado com

formalina e concluíram que as ligações cruzadas de colágeno foram preservadas, mas

as ligações da elastina não foram. A razão para isso é que pode ser que a formalina

(soluções comerciais de formaldeído em água) não fixe a elastina do tecido suficien-

temente, ou a destrói, mascara ou altera as ligações cruzadas da elastina, o que pode

alterar a rigidez natural do tecido (Abe et al. 2003).

O vapor do FA é um irritante que pode afetar múltiplos tecidos até em baixas con-

centrações (Rumchev et al. 2004). Devido ao seu tamanho diminuto, o FA pode per-

mear membranas biológicas e entrar nas células, resultando na formação de ligações

covalentes entre proteínas, podendo inativá-las, estabilizá-las ou imobilizá-las (Metz

et al. 2004), (Sutherland et al. 2008), (Schmiedeberg et al. 2009).

Nesta dissertação, desenvolveu-se um modelo de rede viscoelástica bidimensional

para estudar a alteração mecânica no músculo liso devida ao formaldeído e potencial-

mente outras drogas. Está bem documentado na literatura que o efeito do formaldeído

está correlacionado com o dano da reatividade bronquial (Lino dos Santos Franco et al.

2010) e asma relacionada ao trabalho (Burge et al. 1985), (Norbäck et al. 1995), (You-

akim 2001). O músculo liso presente nas vias aéreas respiratórias bem como suas pro-

priedades mecânicas exercem um importante papel nesses eventos, pois contam para a

hiperresponsividade brônquica.

3

1.1 Modelos matemáticos e a mecânica do músculo liso

Dentro das ciências biológicas a fisiologia é umas das áreas onde a matemática tem

exercido um papel importante com o passar dos anos. Os pesquisadores da área bioló-

gica têm repetidamente utilizado modelos matemáticos como ferramenta para ajudar a

entender certos processos fisiológicos, como o mecanismo de contração dos músculos

estriado e liso, por exemplo (Huxley e Niedergerke 1954), (Silveira et al. 2005), (Bates

e Lauzon 2005), (Ito et al. 2006), (Alencar et al. 2009).

Modelos matemáticos são encontrados em muitas áreas, tais como: biologia (Honda

et al. 2004), psicologia (Mazur 2009), química (Trsic e Pinto 2009), física (Alencar

et al. 2009), (Araújo et al. 2011). Um modelo matemático pode ser considerado uma

representação do mundo real, isto é, pode representar um sistema real e as modifica-

ções que nele ocorrem com um grande número de equações matemáticas. Isso dificulta

a resolução manual do problema sendo, muitas vezes, necessário o uso de computado-

res para realizarem os cálculos (Keener e Sneyd 1998), (Scherer 2005). É importante

frisar que independente da quantidade de equações que um modelo tenha ele sempre

será uma simplificação criada a partir da capturação das propriedades essenciais do

mundo real (Aris 1994).

A interação entre a biologia, física e matemática pode ser estudada utilizando-se

modelos matemáticos. Esses modelos podem ajudar a entender certos mecanismos da

fisiologia celular, como a dinâmica do cálcio (Goldbeter e Lefever 1972), comunica-

ções intercelulares (Boyd e Martin 1956), e também de sistemas fisiológicos; respira-

tório (Glass e Mackey 1979), hormonal (Schwartz 1969) e muscular (Huxley 1957).

Em 2005, Cavalcante e colaboradores desenvolveram um modelo de rede elástica

hexagonal bidimensional da estrutura alveolar incorporando as propriedades mecâni-

4

cas das fibras de colágeno e elastina e suas interações com proteoglicanos (Caval-

cante et al. 2005). Para a criação desse modelo, os autores usaram molas não-lineares

dispostas em geometria hexagonal (ver Figura 1). Na rede hexagonal, cada hexágono

Figura 1: Modelo de rede elástica bidimensional desenvolvido por Cavalcante e cola-boradores para representar o parênquima pulmonar sob estresse. (A): representação deuma rede rígida e (B): representação de uma rede macia. A cor é proporcional à ener-gia carregada pela molas. Os valores máximos de energia correspondem ao vermelhoescuro e os mínimos ao azul escuro. Figura modificada de (Cavalcante et al. 2005)

representa um alvéolo e cada mola (lado do hexágono) representa o comportamento

combinado das fibras de colágeno e elastina das paredes alveolares com uma relação

força-comprimento que pode ser obtida como a derivada da energia elástica (Es) com

respeito ao deslocamento da mola relativo ao seu comprimento de repouso (∆`):

Es =12

k∆`2 +13

b∆`3 (1)

onde k é a constante linear da mola e b a constante não linear da mola. O parâmetro b

conta para a não-linearidade elástica do colágeno, enquanto que a constante elástica k

contribui tanto para a elastina como para o colágeno.

5

Os nós dos hexágonos ao longo da parte superior e inferior da rede foram fixados.

Cada mola do sistema carrega uma pré-tensão (prestress), pois sem ela os hexágonos

distantes das bordas colapsam sob uma deformação uniaxial ou de cisalhamento. Esta

instabilidade surge do fato de que os elementos linhas, i.e., as molas, podem mover-se

sem nenhuma restrição, adquirindo também movimento de rotação. Para establizar a

rede, os autores assumiram que as molas não mais poderiam sofrer esse movimento

de rotação. Essa restrição foi implementada introduzindo um termo na energia elástica

total do sistema que é função da alteração no ângulo entre duas molas interconectadas:

Ea =12

r∆θ2 (2)

onde a indica que esse é o termo da contribuição angular, r dá a magnitude dessa con-

tribuição, denominada de bond-bending constant, e θ é a mudança no ângulo relativo

ao ângulo de respouso.

Para implementar a heterogeneidade similiar a observada no tecido, Cavalcante e

colaboradores criaram uma rede simétrica com elementos linhas possuindo compri-

mento e com um ângulo de repouso igual a 120o. Posteriormente, os nós, exceto aque-

les da parte superior e inferior, foram randomicamente deslocados e cada hexágono foi

randomicamente retorcido. A configuração de equilíbrio correspondeu a energia mí-

nima calculada usando as Equações 1 e 2 somadas para todas as molas da rede. Para

os nós obteve-se a configuração de equilíbrio aplicando uma variante da técnica de

simulated annealing.

Com o desenvolvimento deste modelo de rede elástica, Cavalcante e colaboradores

identificaram um novo e importante papel para os proteoglicanos; eles estabilizam a

6

rede colágeno-elastina do tecido conjuntivo e contribuem para a elasticidade e estabi-

lidade do pulmão e dos alvéolos (Cavalcante et al. 2005).

Em outro estudo, Ito e colaboradores desenvolveram também um modelo de rede

elástica não-linear mas para o citoesqueleto da célula do músculo liso (Ito et al. 2006).

A proposta do estudo de Ito foi caracterizar as propriedades viscoelásticas e não-

lineares das células do músculo liso de vias aéreas respiratórias a nível de tecido. Para

isso, juntamente com seus colaboradores, Ito hipotetizou que forças mecânicas, esti-

mulação contrátil e alterações na polimerização da actina são refletidos não somente

nas propriedades viscoelásticas, mas também no comportamento não-linear do mús-

culo liso in situ.

De forma semelhante ao modelo desenvolvido por Cavalcante e colaboradores, no

modelo de Ito, os elementos linhas foram arranjados em uma rede hexagonal (ver Fi-

gura 2). Tanto a parte superior como inferior da rede foram fixados, enquanto que os

nós laterais e internos ficaram livres para se moverem. As coordenadas de todos os

nós foram randomizadas e então o comprimento inicial de cada mola computado; aqui

definiu-se a configuração livre de estresse (stress-free configuration). Posteriormente, a

rede foi elongada uniaxialmente por um deslocamento de 20% na direção vertical para

cima. A energia potencial total da rede também foi minimizada usando-se simulated

annealing.

Neste modelo de Ito para o citoesqueleto da célula do músculo liso, a força total

desenvolvida pela rede foi obtida em cada deslocamento como sendo a soma das forças

exercidas pelas molas no topo da borda na direção do mesmo deslocamento.

A resposta das células do músculo liso de vias aéreas respiratórias a agonistas con-

tráteis, como a metacolina (MCh), foi mimetizado aumentando-se o número de ele-

7

mentos paralelos na rede comparados com o caso basal, que é equivalente a polimeri-

zação da actina (ver Figura 2). Já para mimetizar os efeitos do agente farmacológico

Citocalasina D, o número de elementos em paralelo na rede foi reduzido, que é equi-

valente a despolimerização da actina.

Figura 2: Modelo de citoesqueleto de uma célula muscular lisa criado por (Ito et al.2006). Configuração da rede hexagonal criada por Ito e colaboradores representandoos estágios controle, relaxado e contraído, respectivamente. O número de caminhosparalelos no estágio contraído é maior com relação aos outros estágios representandoa polimerização da actina. No estágio relaxado os caminhos paralelos são menores re-presentando a despolimerização da actina. A cor é proporcional à tensão nos elementoslinhas. Vermelho escuro denotando uma alta força e azul escuro denotando baixa força.Figura modificada de (Ito et al. 2006)

Com este trabalho, Ito e colaboradores concluíram que nem todos os aspectos das

propriedades viscoelásticas de tiras de músculo liso traqueal são similares àquelas ob-

servadas em cultura de células. Os autores atribuíram essas diferenças a uma contribui-

ção da matriz extracelular. Usando o seu modelo matemático, Ito também mostrou que

o comportamento dinâmico não-linear, que não tem sido observado em cultura de cé-

lulas, está associado com o estado de estresse contrátil e pode derivar da polimerização

ativa dentro do citoesqueleto (Ito et al. 2006).

As células do músculo liso das vias aéreas respiratórias estruturam uma maqui-

8

naria contrátil utilizando a actina e a miosina como principais ferramentas, e têm in-

trigantes propriedades mecânicas relacionadas à conectividade do seu citoesqueleto.

Essa conectividade foi recentemente estudada com um modelo de percolação2, onde

considerou-se o citoesqueleto como uma rede de filamentos de proteínas presas por

complexas estruturas proteicas, que foram definidas como nós (Silveira et al. 2009).

Este trabalho sugeriu que as propriedades de conectividade do citoesqueleto de células

vivas dependem da regulação do comprimento das conexões. Silveira e colaboradores

concluíram que a presença de conexões longas altera as propriedades de conectividade

da rede, e uma consequência disso é que as propriedades mecânicas e contráteis das

células com conexões longas devem ser diferentes também.

A simetria da maquinaria actomiosina no músculo estriado, conhecida como sarcô-

mero, pode facilitar a interpretação do mecanismo de funcionamento deste músculo

e, consequentemente, a interpretação da relação entre o comprimento do músculo e a

força isométrica gerada por ele. Essa relação foi interpretada por Gordon e colaborado-

res num estudo publicado em 1966, onde eles estudaram as alterações na sobreposição

entre filamentos de actina e os filamentos de miosina. Os autores observaram que a

força isométrica máxima de contração obtida era alcançada quando todas as cabeças

de miosina estavam ligadas aos filamentos de actina. Quando o tecido era esticado além

do seu comprimento inicial (L0) a força isométrica caía devido a redução das ligações

cabeça-actina (Gordon et al. 1966).

É complicado criar uma imagem desse mecanismo para o músculo liso, já que en-

tre este músculo e o músculo estriado existem grandes diferenças quanto a estrutura do

2A teoria da percolação descreve o comportamento coletivo em um conjunto de pontos interligados,conhecido como grafo. A percolação é aplicada à física, redes complexas, epidemiologia, bem como emoutras áreas.

9

aparato contrátil. São essas diferenças estruturais que tornam difícil explicar as propri-

edades mecânicas do músculo liso em relação às mudanças na sobreposição dos fila-

mentos. A organização deles pode também contribuir para as propriedades mecânicas

do músculo liso das vias aéreas respiratórias. Alterações nessas propriedades podem

acarretar disfunções no músculo liso e induzir anormalidades, como broncoconstrição

e hiperresponsividade brônquica, que são exibidas em vias aéreas de asmáticos (Lé-

guillette e Lauzon 2008).

Recentemente a interação entre actina e miosina foi estudada por Alencar e co-

laboradores (Alencar et al. 2009). Os autores desenvolveram um modelo estatístico,

utilizando o Método de Monte Carlo3, solucionado via algoritmo de Metropolis, para

estudar motores moleculares, especificamente o sistema actomiosina (Alencar et al.

2009). Esse modelo oferece um novo caminho para se estudar a cooperatividade nas

interações actomiosina das células em conexão com o citoesqueleto em várias con-

dições, como por exemplo, na presença de agentes externos às condições fisiológicas

normais das células.

Em 2005, Silveira e colaboradores apresentaram um modelo estocástico da dinâ-

mica do citoesqueleto da célula do músculo liso de via aérea. A principal constatação

é que a simples formação das ligações na rede pareceu capturar todas as características

mecânicas conhecidas do músculo liso à adaptação ao comprimento. O autor frisa que

o modelo não é para ser tomado como uma descrição literal da estrutura real do cito-

esqueleto, e sim como uma representação simplificada, projetada para capturar apenas

as caraterísticas mecânicas essenciais da rede da célula do músculo liso de via aérea.3O método de Monte Carlo é um processo estocástico, isto é, um processo aleatório que depende

do tempo, e que faz uso dos números aleatórios para a realização de uma simulação (Scherer 2005),(Morgon e Coutinho 2007).

10

Este modelo sugere que a adaptação funcional do músculo liso para alterar o com-

primento está intimamente ligada à estrutura da rede. Finalmente, o modelo desen-

volvido por Silveira e colaboradores suporta também o controle do comprimento das

estruturas filamentosas como um importante fator para regular a dinâmica do citoes-

queleto (Silveira et al. 2005).

Figura 3: Modelo de citoesqueleto de uma célula muscular lisa criado por (Silveiraet al. 2005). (A): Célula do músculo liso representada por um retângulo contendo nósconectados por retas, onde estas retas representam os filamentos contráteis. (B): Proje-ção do comprimento da conexão. (C): Projeção da força da conexão. Figura modificadade (Silveira et al. 2005)

Estas propriedades mecânicas do músculo liso das vias aéreas são muitos importan-

tes para a determinação da contratibilidade dessas vias, principalmente as propriedades

reológicas4 relacionadas com força e comprimento do músculo liso (Bates e Lauzon

2005).

Também em 2005, Bates criou um modelo computacional de uma tira de músculo

liso consistindo de um gerador de força, para representar as proteínas contráteis, aco-

plado a um componente elástico, representando o tecido conjuntivo, que sofre ação da

força proveniente do gerador (ver Figura 4). Os autores concluíram que o comporta-4Reologia é a parte da física que estuda a elasticidade, viscosidade, plasticidade de um material.

11

mento força-comprimento de tiras de músculo liso pode ser entendido em termos do

comportamento força-velocidade das proteínas contráteis deste músculo.

berg et al. (8) and Shen et al. (26) are also reproduced inAnafi and Wilson (1).

We will now develop a simple mechanistically based modelof the smooth muscle strip to account for the various featuresseen in the data identified above. Such a model obviouslyrequires a force generator to represent the activity of thecontractile proteins, actin and myosin, which are responsiblefor the ability of smooth muscle to shorten. In a muscle stripexperiment, the activities of these contractile proteins aretransmitted to force and length transducers through a substan-tial amount of connective tissue (19). This tissue contributes towhat are known as the series and parallel elastic components ofthe muscle, which have been modeled together with the con-tractile component in vascular smooth muscle as either aMaxwell or a Voigt body (6). In the present study we considerrelatively small variations in muscle strain, and so, followingSeow and Stephens (25), we will assume that the changes instress across the parallel elastic component play only a smallrole in the force-length loops of Fredberg et al. (8) and Shen etal. (26). We thus focus on the interactions between the con-tractile proteins of smooth muscle and the series elastic com-ponent and therefore model the oscillating activated smoothmuscle strip as a force generator connected in series to aspring, as shown in Fig. 1A.

The next task is to assign properties to the two componentsin Fig. 1A. These properties could rapidly become highlycomplex, given what is known about the rheology of biologicaltissue (2, 10) and the biophysics of actin and myosin (4, 13,

29), but we will begin with the simplest properties that makephysical sense. The simplest behavior we can assign to theseries elastic component so that it maintains the integrity of thesmooth muscle strip, while transmitting the generated forces tothe measuring apparatus, is that of a Hookean spring. Thus, ifE is the elastic spring constant, x(t) is the length of the spring,t is time, x0 is the relaxed spring length, and F(t) is the force itsustains, then

F!t" ! E#x!t" " x0$ (1)

In the case of the force generator itself, we need to considerthat activated smooth muscle generates a force that varies bothwith its length and with the rate of change of length. However,if the smooth muscle is stretched near its optimal length, thenforce varies with length only to second order. Furthermore, thepeak in the force-length curve is rather broad (18), so we willassume for now that force is actually independent of smoothmuscle length. The dependence of force on rate of change oflength, however, cannot be neglected because force decreasesmarkedly as contraction velocity increases (14, 28). This isdepicted in Fig. 1B and captured in the following equation:

dy!t"

dt!

b#F0 " F!t"$

a # F!t"when F!t" $ F0

!bF0

a # F0

"bF!t"

a # F0

when F!t" % F0

(2)

where y(t) is the length of the force-generating unit, a is aconstant with units of force, b is a constant with units ofvelocity, and F0 is isometric muscle force. The first line of Eq.2 is the hyperbolic Hill equation that has been described forairway smooth muscle by various investigators (3, 14, 28). Thesecond line of Eq. 2 is the equation of a straight line thataccounts for eccentric contraction of the smooth muscle andhas the same slope as the hyperbolic relationship at a velocityof zero in accord with the experimental findings of Hanks andStephens (14).

Equations 1 and 2 constitute our basic model of the smoothmuscle strip, which we implement numerically as follows.Initially, the smooth muscle strip is relaxed and uncontracted,so its length is y0 % x0 and F is zero. At t & 0 we activate thecontractile component and impose a sinusoidal oscillation offrequency f Hz on the right-hand end of the series elasticcomponent (Fig. 1A), while keeping the left-hand end of thecontractile component fixed, such that

x!t" # y!t" ! x0 # y0 # A sin!2'ft" (3)

Initially, there is no load on the smooth muscle so itcontracts [i.e., y(t) decreases] with the maximum possiblevelocity of bF0/a (Eq. 2). However, as the contractile compo-nent shortens and the series elastic component is pulled to theright, the spring becomes extended and generates a force that istransmitted to the contractile component and changes its ve-locity of shortening. This determines the rate of change of yaccording to Eq. 2, from which the value of y one time-steplater is determined by numerical integration. We solved thissystem of equations by first-order Euler integration with atime-step of 5 ms. Each simulation was run for 50 s to allowthe model to reach steady-state behavior.

We first endeavored to have the model match the force-length loops of Fredberg et al. (Fig. 1 of Ref. 8) by oscillating

Fig. 1. A: model of smooth muscle strip. y is the length of the force generator,and x is the length of the series elastic component. B: the force-velocityrelationship (Eq. 2) used to determine how airway smooth muscle contractsagainst a load. Below the isometric force (F0), the relationship is described bythe classic hyperbolic Hill equation. Above F0, the relationship is a straightline with a slope equal to that of the hyperbola at F0.

L850 AIRWAY SMOOTH MUSCLE DYNAMICS

AJP-Lung Cell Mol Physiol • VOL 289 • NOVEMBER 2005 • www.ajplung.org

on Decem

ber 12, 2010ajplung.physiology.org

Dow

nloaded from

]Modelo de uma tira de músculo liso proposto por (Bates e Lauzon 2005). Ocomprimento do gerador de força é representado por y e x é o comprimento do

componente elástico. Figura modificada de (Bates e Lauzon 2005)

Alguns estudos têm proposto outros mecanismos, como interações entre células

vizinhas, que podem contribuir com as propriedades mecânicas do músculo liso que

se relacionam com a força e comprimento. As células do músculo liso estão mecani-

camente acopladas entre si e, desta forma, a maquinaria contrátil de cada célula exerce

força sobre a célula vizinha e essa força limita o encurtamento do tecido (Meiss 1999).

Isso sugere que o comprimento e também a força no músculo liso dependem das intera-

ções mecânicas intercelulares. Acredita-se que o encurtamento do músculo liso exerça

um papel central na reatividade bronquial e na broncoconstrição verificadas na asma

(Lei et al. 1997), (Bousquet et al. 2000).

1.2 Proteínas do aparato contrátil do músculo liso

A miosina, juntamente com a actina, foi identificada pela primeira vez no tecido

muscular esquelético e muito do que se sabe sobre a interação entre essas duas proteí-

nas foi descoberto analisando-se este tecido (Huxley e Hanson 1954).

No músculo, a actina, miosina e outras proteínas, conhecidas como proteínas aces-

sórias, formam, dentro da célula, feixes denominados de fibras tensionais. Essas fibras

12

possuem duas extremidades onde uma delas está ancorada à membrana plasmática em

locais específicos chamados de contatos focais e a outra extremidade fica ancorada a

uma rede de filamentos intermediários que ficam ao redor do núcleo da célula. A parte

externa dos contatos focais interage com a face externa da célula e têm a função de

transmitir sinais da matriz extracelular para o citoesqueleto.

As interações entre os filamentos de actina, que estão no interior da célula, com a

matriz extracelular são mediadas por uma classe de proteínas transmembrana conhe-

cidas como integrinas. As integrinas estão localizadas nos contatos focais, onde uma

parte de sua estrutura fica para fora da célula, tendo contato direto com a matriz extra-

celular, e a outra parte fica localizada internamente à célula mantendo contato indireto

com os filamentos de actina (Alberts et al. 1997), (Pollard e Earnshaw 2006), (Pollard

e Cooper 2009). Esse contato interno é indireto pois ele é mediado primeiramente por

outras proteínas como a talina, vinculina e a α–actinina.

A actina tem uma grande importância para a sobrevivência da maioria das células

pois ela fornece suporte mecânico via estrutura do citoesqueleto, sendo um meio de

conduzir forças celulares para a manutenção da tensão interna e movimentos celulares,

dentre outras propriedades como a movimentação de materiais dentro da célula (Fabry

et al. 2001), (Pollard e Cooper 2009). A contribuição da actina para os movimentos ce-

lulares ocorre de duas formas: em primeiro lugar, a polimerização e despolimerização

dos filamentos de actina dentro da célula contribuem para a locomoção celular com

extensão de pseudópodos. E em segundo, os filamentos de actina interagem com a mi-

osina atuando como “trilhos” e formando o sistema actomiosina, fundamental para a

contração muscular (Rayment et al. 1993) (Richards e Cavalier-Smith 2005), (Alencar

et al. 2009).

13

A miosina muscular pertence à subfamília denominada miosina II e todos os mem-

bros dessa subfamília têm uma estrutura composta por uma longa cauda e duas uni-

dades estruturais conhecidas como cabeças da miosina que produzem força sobre os

filamentos de actina e onde ocorre as atividades de ATPase e motora durante a contra-

ção muscular (ver Figura 5) (Alberts et al. 1997), (Pollard e Earnshaw 2006).

A miosina II é composta por seis cadeias polipeptídicas; duas cadeias pesadas, com

2.000 aminoácidos cada uma, e quatro cadeias leves onde cada par de cadeias possui

170 e o outro 190 aminoácidos e estão localizados uma vez em cada cabeça da miosina

(ver Figura 5). A miosina tipo II também possui uma região amino-terminal que forma

o zona motora da cabeça. As duas cadeias pesadas interagem entre si e se enrolam

formando um dímero estável em formato de cauda. A cauda é útil para permitir a

polimerização, que é de extrema importância para a função da miosina, que consiste

em deslocar os filamentos de actina no sentido contrário ao seu movimento.

Figura 5: Estrutura da miosina II. Figura modificada de (Alberts et al. 1997)

Acredita-se que durante a contração muscular a miosina seja a responsável pela

geração de força e movimento (Rayment et al. 1993), (Pollard e Cooper 2009) por

repetidos ciclos mecânicos de encaixes e desencaixes da sua cabeça à actina (Warrick

e Spudich 1987). A energia necessária para esses ciclos ocorrerem provém da hidró-

lise de adenosina trifosfato (ATP) na cabeça da miosina, e posteriormente a energia

14

química da hidrólise se transforma em trabalho mecânico causando um movimento do

filamento de actina. Rayment e colaboradores propuseram uma hipótese para explicar

a conversão dessa energia em movimento. Nessa hipótese, a ligação da ATP com a mi-

osina resulta em uma gama de mudanças conformacionais na cabeça da miosina que

reduz sua afinidade por filamentos de actina e permite a hidrólise de ATP em ADP e

fosfato inorgânico (Pi). Como a cabeça da miosina se reconecta ao filamento de actina

as alterações conformacionais são reversíveis causando, desta forma, um movimento

relativo à actina (Rayment et al. 1996).

Esse movimento foi estudado com detalhes por Finer e colaboradores (Finer et al.

1994). Eles determinaram o tamanho do passo mecânico dado pela miosina durante um

ciclo de hidrólise do ATP. Primeiramente, um filamento de actina foi preso entre duas

microesferas plásticas. Posteriormente, uma associação entre o filamento de actina e

a miosina foi feita. Quando ATP foi fornecido, uma cabeça de miosina pôde mover o

filamento de actina a uma pequena distância, que correspondeu ao tamanho do passo

dado pela cabeça da miosina, e a duração dele depende da concentração de ATP. Para

cada ciclo de ATP a miosina moveu o filamento de actina por 5 a 15 nm desenvolvendo

uma força entre 3 a 7 pN (Finer et al. 1994).

Outro estudo registrou a rigidez de um filamento de actina utilizando uma técnica

de nanomanipulação (Kojima et al. 1994). Neste estudo, Kojima e colaboradores me-

diram diretamente a rigidez de um filamento de actina isolado com e sem tropomiosina

anexada e verificaram que a rigidez é inversamente proporcional ao comprimento do

filamento de actina (Kojima et al. 1994). A rigidez do filamento foi 65,3 ± 6,3 (mé-

dia ± erro médio quadrado) e 43,7 ± 4,6 pN/nm com e sem tropomiosina anexada,

respectivamente.

15

1.3 Fibras do sistema colágeno

Os principais constituintes da MEC da maioria dos órgãos são a fibras coláge-

nas. Os colágenos são proteínas produzidas e secretadas por células do tecido con-

juntivo e por serem os componentes principais da pele e dos ossos são as proteínas

mais abundantes e constituem 30% do total de proteínas do organismo (Alberts et al.

1997). O colágeno é produzido dentro da célula do tecido conjuntivo e depois de passar

por processos intracelulares ele é secretado para o meio extracelular. A característica

chave dos colágenos é que eles são uma estrutura em tripla-hélice em forma de bas-

tão, onde essa tripla-hélice é formada por três polipeptídeos que se enovelam numa

repetida sequência de aminoácidos G–X–Y, onde o padrão mais comum nesta sequên-

cia é Glicina–Prolina–Hidroxiprolina, porém o colágeno possui mais um aminoácido

chamado hidroxilisina. Depois de secretado para o meio extracelular ocorre um alinha-

mento de vários colágenos formando fibrilas num processo termodinânimo sem gasto

de energia. Durante a formação dessas fibrilas os colágenos necessitam de ligações

covalentes entre as triplas-hélices para reforçar esta formação. As ligações covalentes

dão às fibrilas de colágeno uma grande resistência a força tensora, ao contrário dos

glicosaminoglicanos, também presentes na MEC, que apresentam resistência a forças

compressoras.

Os colágenos se diferem em tamanho, estrutura e função e são divididos em vários

tipos (Tipo I, Tipo II, Tipo III, etc) (Rest e Garrone 1991), porém essa divisão não

está correlacionada com sua função e sim com a ordem de descobrimento. Os tipos

de colágenos estão sub-divididos em quatro grupos: colágeno formadores de fibrilas

(Tipos I, II, III, V e XI), associados a fibrilas (Tipo IX e XII), que formam rede (Tipo

IV) e colágeno de ancoragem (Tipo VII). No pulmão os tipos I, III, IV e V estão pre-

16

sentes em maior quantidade e juntos correspondem a 60–65% da MEC de um pulmão

saudável (Bradley et al. 1975). O colágeno Tipo I é 3 a 6 vezes mais abundante do

que o Tipo III, e o Tipo V representa menos de 5% do colágeno presente no pulmão

saudável (Reiser e Last 1983). No pulmão doente, macrógafos alveolares e neutrófilos

sintetizam a colagenase, uma proteína lisossomal que tem a capacidade de degradar o

colágeno [Wooley 1984 citado por (Lemos 1998)]. Os neutrófilos também podem libe-

rar a elastase que além clivar o colágeno Tipo IV pode destruir a elastina, uma proteína

fundamental para o pulmão (West 2010).

1.4 Fibras do sistema elástico

A elastina é o principal componente das fibras elásticas. Essas fibras tem uma im-

portância ímpar para os tecidos, pois elas fornecem elasticidade, principalmente ao

tecido conjuntivo onde estão mais presentes. As propriedades elásticas de muitos te-

cidos, como vasos sanguíneos, pulmões, são devidas a presença dessas fibras na MEC

que fornecem a elasticidade necessária para que o tecido volte à sua forma original

após uma distensão temporária (Rosenbloom et al. 1993).

A elastina é composta por dois aminoácidos, a desmosina e isodesmosina, forma-

dos por ligações covalentes entre os resíduos de lisina e parece que essas ligações são

as responsáveis pelo caráter elástico da elastina (Junqueira e Carneiro 1999). Acredita-

se que a base física para a elasticidade seja uma diferença na entropia do polipeptídeo

nos estágios esticado e contraído. As fibras no estágio esticado armazenam energia de-

vido ao arranjo ordenado dos polipeptídeos, isto é, baixa entropia, e as fibras entram

no estágio contraído quando os polipeptídeos entram em desarranjo num estado de

alta entropia. Uma discussão detalhada sobre os estágios da elastina pode ser vista no

17

trabalho publicado por Rosenbloom em 1993 (Rosenbloom et al. 1993).

Recentemente, um estudo registrou um aumento na fração de área de fibras elás-

ticas no músculo liso das vias aéreas respiratórias grandes e pequenas em pacientes

com asma fatal (Araujo et al. 2008). Os autores concluíram que esse aumento pode

ter consequências importantes para a função sintética e mecânica do músculo liso das

vias aéreas respiratórias. O músculo liso controla o calibre dessas vias e existem sus-

peitas de que anormalidades no seu funcionamento contribua para a fisiopatologia da

asma. Não está claro se na asma existem modificações intrínsecas nas propriedades

deste músculo, se ocorrem alterações nas suas propriedades a nível de aparato con-

trátil, mas essas alterações podem ser resultados de inflamações aguda ou crônica e

remodelamento do tecido (An et al. 2007).

No contexto envolvendo formaldeído, um dano da reatividade do músculo liso foi

observado no trabalho experimental realizado por Lino dos Santos Franco e colabo-

radores (Lino dos Santos Franco et al. 2010). Neste trabalho, os autores registraram

a reatividade do músculo liso da traquéia de ratos pela exposição aguda ao FA. Nesse

estudo, os autores incubaram amostras de anéis traqueais de ratos Wistar machos (180-

200 g) com DMEM contendo FA (0,1 ppm) por 30 minutos, 6 h, 24 h, 36 h, 48 h e 72

h. Posteriormente, a força isométrica do músculo liso dos anéis foi quantificada usando

um transdutor de força. O grupo controle consistiu dos anéis incubados somente com

DMEM e o grupo FA aqueles incubados com DMEM contendo FA na concentração

de 0,1 ppm. Os autores observaram o curso de tempo do efeito do FA na responsivi-

dade traqueal e verificaram hiperresponsividade à metacolina naqueles anéis que foram

incubados por 48 h em DMEM contendo 0,1 ppm de FA (ver Figura 6) (Lino dos San-

tos Franco et al. 2010).

18

Figura 6: Curso de tempo do efeito do formaldeído (FA) na responsividade traquealno tempo de incubação de 48 h. Figura modificada de (Lino dos Santos Franco et al.2010)

Com base nesse resultado, os autores investigaram os mecanismos da hiperrespon-

sividade traqueal com 48 h de incubação com FA. Esses mecanismos foram inves-

tigados depletando os mastócitos do tecido conjuntivo da traquéia ou ativando-os por

reação alérgica, ambos antes da incubação com FA. Antagonista de receptores de LTB4

e L-arginina também foram utilizados para investigar os mecanismos da hiperrespon-

sividade traqueal (Lino dos Santos Franco et al. 2010).

Porém, apesar de estudos como esse de Lino dos Santos Franco, há uma escassez

muito grande daqueles que correlacionem o efeito do FA com o aparato contrátil do

músculo liso das vias aéreas. Umazume e colaboradores, relataram uma ligação do FA

entre a cabeça da miosina e a superfície do filamento fino, porém em músculo esque-

lético de rã (Umazume et al. 1991). Com isso, surge uma indagação importante acerca

19

da exposição ao FA e do aparato contrátil do músculo liso das vias aéreas respiratórias:

• A formação das pontes de metileno, que são estruturas estáveis e irreversíveis,

devida a exposição ao FA pode comprometer o comportamento mecânico do

músculo liso das vias aéreas respiratórias?

Muitos sistemas naturais são complexos e, desta forma, exigem uma abordagem

multidisciplinar para os seus estudos, e a criação de modelos matemáticos que repre-

sentem de forma quantitativa as hipóteses que foram utilizadas para a sua construção

e que se apoiam sobre o sistema real torna-se necessária (Mogilner et al. 2006). Para

haver uma conjunção dessas hipóteses com os resultados experimentais, propusemos

um modelo de rede viscoelástica bidimensional, baseado na tesselação de Voronoi, que

contribuisse com o entendimento do comportamento do músculo liso em condições de

exposição ao FA e submissão a um agente contrátil.

Modelos de redes hexagonais, como as desenvolvidas por Cavalcante (Cavalcante

et al. 2005) e Ito (Ito et al. 2006), são regulares e podem não ser ideais para representar

o músculo liso de via aérea. Por outro lado, a tesselação de Voronoi5 gera uma rede

aleatória mais adequada para resolver alguns problemas topológicos em biologia. Na

matemática, a tesselação de Voronoi é um tipo especial de decomposição de um deter-

minado espaço métrico pela distância a um grupo de objetos no espaço (Okabe et al.

1999).

Com o advento da geometria computacional, a tesselação de Voronoi tem se tor-

nado mais viável e muito atrativa para aplicações biológicas. Em 1978, Honda propôs

um método para agregados celulares bidimensionais (Honda 1978) e os primeiros estu-

dos envolvendo tecidos biológicos datam de 1984 por Sulsky e colaboradores (Sulsky5Para mais detalhes sobre a tesselação de Voronoi ver Anexo B.

20

et al. 1984). Depois, em 2004, o método de Voronoi foi usado em modelos 3D de

tecidos (Honda et al. 2004).

Recentemente, foi estudado o decaimento da rigidez de uma fibra elástica sob ten-

são durante a digestão enzimática usando um modelo anisotrópico acoplado com rea-

ções de vínculo-desvínculo (binding-unbinding reactions). Esse estudo mostrou que a

rigidez da fibra decai exponencialmente e para melhor entender esse decaimento uma

camada de elastina foi mantida sob tensão fixa, enquanto digerida pela elastase, e re-

presentada como uma rede bidimensional mantida também sob tensão fixa. Para mime-

tizar a camada de elastina, onde as fibras são arranjadas em uma orientação randômica

foi considerada uma tesselação de Voronoi (Araújo et al. 2011).

Em outro estudo, a interação RNA-proteína foi computada via diagrama de Voro-

noi. Nesse estudo, os autores apresentaram algumas medidas geométricas para a aná-

lise apropriada de cada interação RNA-proteína extraída a partir de PDB (Protein Data

Bank) e mostraram que o modelo de Voronoi pode ser usado para a análise das intera-

ções RNA-proteína em comparação com o método clássico (Mahdavi et al. 2012).

Nesta dissertação, utilizou-se a tesselação de Voronoi, que melhor reproduz redes

biológicas aleatórias, para mimetizar uma tira de músculo liso. A primeira intenção

dessa dissertação foi construir um alicerce para entender diferentes propriedades me-

cânicas do músculo liso de via aérea respiratória. Assim, para a construção desse ali-

cerce, utilizando-se o conceito de Diagramas de Voronoi, desenvolveu-se um modelo

de rede viscoelástica bidimensional.

Hipotetizou-se que a formação de ligações covalentes, devida à ação do FA, limita

o funcionamento normal das proteínas da matriz extracelular, especificamente redu-

zindo a mobilidade do colágeno e elastina, que pode provocar um aumento da rigidez

21

do tecido. Finalmente, para validar o modelo matemático, os resultados provenientes

dele foram comparados com àqueles obtidos experimentalmente por Franco e colabo-

radores (Lino dos Santos Franco et al. 2010).

1.5 Exposição ambiental ao formaldeído e a asma relacionada ao

trabalho (ART)

O formaldeído (FA) é um composto orgânico volátil (CH2O) pertencente ao grupo

dos aldeídos. Descoberto em 1867 pelo químico alemão August Wilhelm von Hof-

mann o FA faz parte da composição de materiais de construção, como compensado

de madeira, onde é usado como adesivo, e produtos de limpeza, como detergentes,

desinfetante, alvejantes e demais materiais saneantes (CPSC 1997). O gás natural, ar

condicionado e mobílias são fontes de FA (ver Tabela 1) (EPA 1992). O FA é um gás

incolor a temperatura ambiente, muito solúvel em água e é considerado um agente tó-

xico em concentrações acima de 0,1 ppm, pois ele pode causar irritações nas partes

úmidas do corpo humano como os olhos e o trato respiratório (Carmo e Prado 1999).

Ele também pode destruir o revestimento interno do nariz com uma consequente di-

minuição da retenção de partículas de ar podendo levar a doenças respiratórias (CPSC

1997).

Tabela 1: Fontes e poluentes encontrados em residências e escritórios.Ambiente Fontes PoluentesResidência Fogão a gás NO2, CO, Hidrocarbonetos Gasosos

Fogão a lenha Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticose/ou Materiais de construção Formaldeído, COV

Mobílias Formaldeído, COVEscritório Atividades de limpeza COV

Ar Condicionado FormaldeídoFONTE: (Brickus e de Aquino Neto 1999)

22

O sistema de registro de substâncias químicas da agência ambiental norte-americana

possui o cadastro de 231 compostos que pertencem ao grupo dos compostos orgâni-

cos voláteis (COVs). Os níveis destes compostos podem ser 5 a 10 vezes maiores em

ambientes fechados que abertos (Samet 1990), mas as suas concentrações em ambi-

entes fechados normalmente ainda são inferiores a seus limites de tolerância6. Porém,

estudos indicam que mesmo em baixas concentrações esses compostos causam algum

tipo de reação no organismo. Rumchev e colaboradores registraram a associação da

asma7 com COVs encontrados em ambientes domésticos e mostraram que em baixas

concentrações esses poluentes podem aumentar o risco de asma (Rumchev et al. 2004).

Apesar do grande número de COVs registrados na agência ambiental norte-americana,

os mais frequentemente encontrados em ambientes fechados são o FA, benzeno, tolu-

eno, etilbenzeno, xileno e acetaldeído (EPA 2008). O FA chega a ser considerado por

certos autores como um dos COVs mais importantes encontrados em ambientes fecha-

dos (Carmo e Prado 1999) e que tem o potencial de induzir a asma relacionada ao

trabalho (ART) (Kim et al. 2001), (Youakim 2001), (Oh e Kim 2010).

Em agosto de 1998, o Ministério da Saúde do Brasil publicou a Portaria no 3.523

que contém o regulamento técnico sobre o estabelecimento de medidas referentes à

limpeza de ambientes fechados e seus componentes identificando poluentes, sua natu-

reza e suas respectivas fontes, com o objetivo de prevenir riscos à saúde dos ocupantes

desses ambientes. Posteriormente, em outubro de 2000, a ANVISA publicou a Reso-

lução 176. Essa resolução contém algumas orientações técnicas sobre os padrões da

qualidade do ar de ambientes fechados climatizados artificialmente e também definiu

os parâmetros mínimos para a concentração de monóxido de carbono, material par-

6Ministério do Trabalho, Portaria MTB No 3.214, de junho de 1978, Norma Regulamentadora 15.7Para detalhes sobre fisiopatologia da asma, ver Anexo A.

23

ticulado, COVs, com o objetivo de alcançar uma boa qualidade de ar de ambientes

fechados e evitar doenças respiratórias como a ART.

O conceito de ART envolve a asma que pode ser agravada em indivíduos que já a

portam ou aqueles que a desenvolveram devido às condições do ambiente de trabalho,

sendo esta última conhecida como asma ocupacional (AO), e está sendo o foco de es-

tudos nos últimos anos (Sarti 1997), (Youakim 2001), (Fernandes et al. 2006), (Lopes

et al. 2008), (Burge 2010), (Vandenplas 2011). O primeiro registro descritivo sobre

ART foi feito por Bernardino Ramazzini, considerado por muitos o pai da medicina

ocupacional, em 1700 na Itália. No seu registro, intitulado De Morbis Artificum Dia-

triba ou Doença dos Trabalhadores, Ramazzini descreve alguns sintomas, como falta

de ar e tosse, que são vistos em padeiros e trabalhadores que estão sujeitos à inalação

de algum tipo de pó. Nos seus escritos Ramazzini supunha que a causa desses sintomas

era a formação de um fluido pastoso pela deposição de farinha nas vias aéreas respi-

ratórias dos padeiros (Sarti 1997) [Ramazinni, 17008, citado por (Bagatin e Kitamura

2005)].

A ART afeta preferencialmente adultos jovens em fase produtiva e vem sendo re-

conhecida como uma doença que pode causar a incapacidade para o trabalho. Também

tem havido aumento na sua incidência e prevalência. Nos EUA, a incidencia é de 3

a 18 casos por milhão, no Canadá 50 por milhão de indivíduos, na Finlândia 187. A

prevalência de AO nos EUA é de 14%, 29% na Finlândia e 36% no Canadá (Sarti

1997), (Fernandes et al. 2006), (Lopes et al. 2008). Em 2006, Caldeira e colaborado-

res registraram, de um total de 1922 indivíduos no Brasil, que a prevalência de ART

foi de 4,2% (81 casos); 1,5% (29 casos) foram classificados como asma agravada pelo

8Ramazzini, B. De Morbis Artificium Diatriba, Itália; 1700.

24

ambiente de trabalho e 2,7% (52 casos) como AO (Caldeira et al. 2006).

A ART é dividida em dois tipos: ART com período de latência e sem período de la-

tência. A ART com latência se caracteriza pela indução da asma depois de um período

entre a primeira exposição e o aparecimento dos sintomas que pode variar de semanas

até vários anos (Youakim 2001). A ART com latência é a mais comum e é causada

por agentes que têm baixo e alto peso molecular, tais como enzimas, metais, tintas,

corantes e poeira de madeira para os quais mecanismos imunológicos envolvendo IgE

tem sido registrados (Youakim 2001), (Fernandes et al. 2006), (Lopes et al. 2008). Já a

ART sem latência relaciona-se à indução da AO após a uma única ou várias exposições

a irritantes em altas concentrações, levando a um quadro conhecido como síndrome de

disfunção das vias aéreas respiratórias (RADS) (Youakim 2001).

A exposição aguda ao FA pode deteriorar as funções das vias aéreas respiratórias

induzindo sintomas da ART e desenvolvendo a hiperresponsividade dessas vias (Swi-

ecichowski et al. 1993), (Daisey et al. 2003), (Kita et al. 2003), (Richards e DeHate

2006), (Thompson et al. 2008). Estudos clínicos mostraram que indivíduos asmáticos

têm os sintomas da asma agravados devido a exposição a este poluente (Franklin et al.

2000), (Kim et al. 2001), (Fló-Neyret et al. 2001). A maior exposição contínua ao

FA foi a concentrações de 2 a 5 ppm durante o envernizamento de móveis e pisos de

madeira (WHO 2006). Curtas exposições, porém a níveis elevados de FA, acima de 3

ppm, foram relatadas para patologistas e embalsamadores (WHO 2006) que utilizam o

FA para preservação de tecidos biológicos (Kiernan 2000).

Devido ao seu pequeno tamanho, o FA pode permear a membrana celular e en-

trar na célula, resultando na formação de ligações covalentes entre proteínas podendo

inativá-las, estabilizá-las ou imobilizá-las (Metz et al. 2004),(Sutherland et al. 2008),

25

(Schmiedeberg et al. 2009). Metz e colaboradores demonstraram que, dependendo da

sua sequência, peptídeos podem sofrer modificações químicas após o contato com FA

(Metz et al. 2004). Essas modificações podem dividas em três tipos: (1) grupos me-

tilol, (2) Schiff-bases e (3) pontes de metileno. Os grupos metilol e Schiff-bases são

formações reversíveis, porém difíceis de serem detectadas. As pontes de metileno são

irreversíveis e, por isso, são consideradas a mais importante modificação de peptídeos

e proteínas induzidas por FA.

Em outro estudo, Sutherland e colaboradores realizaram um estudo sobre a visão

geral das aplicações biológicas das ligações criadas pelo FA e suas principais carac-

terísticas e especularam que a lisina das cadeias laterais, presente no colágeno, por

exemplo, poderia ser o principal local reativo das ligações criadas pelo FA (Suther-

land et al. 2008) (ver Figura 7). Utilizando a análise de espectroscopia de massa os

autores confirmaram que as ligações covalentes induzidas por FA podem ser formadas

entre lisina e arginina, lisina e tirosina, cisteína e tirosina e cisteína e resíduos amino

terminais.

Em 2003, Abe realizou um estudo com o objetivo de detectar ligações do colágeno

(piridinolina) e elastina (desmosina e isodesmosina) em tecidos fixados com formalina

e, juntamente com seus colaboradores, concluiu que as ligações do colágeno foram

preservadas em formalina, mas as ligações da elastina não foram. A razão para isso

pode ser que a formalina não fixa a elastina do tecido suficientemente, ou a destrói,

mascara ou altera as suas ligações e isso pode alterar a rigidez natural do tecido (Abe

et al. 2003).

26

Figura 7: Detalhes sobre a ligação do átomo de nitrogênio da lisina da cadeia laterala um outro átomo de nitrogênio do peptídeo ligante. Figura modificada de (Kiernan2000)

2 OBJETIVOS

Os objetivos desta dissertação são:

1. Desenvolver um modelo matemático de rede viscoelástica bidimensional, uti-

lizando a tesselação de Voronoi e unidades viscoelásticas, para representar o

músculo liso de via aérea e incorporar o efeito característico do formaldéido e

do fármaco metacolina.

2. Comparar os resultados obtidos com o modelo matemático com àqueles observa-

dos em experimentos biológicos envolvendo exposição ao formaldeído e a doses

crescentes de metacolina.

27

3 MÉTODOS

O desenvolvimento do modelo matemático proposto nesta dissertação foi inspi-

rado no estudo experimental realizado por Lino dos Santos Franco e colaboradores

(Lino dos Santos Franco et al. 2010) (ver Figura 6). Apesar de toda a investigação

feita por esses autores sobre os mecanismos da hiperresponsividade do músculo liso

após incubação com formaldeído, no modelo considerou-se somente o efeito do for-

maldeído e do agente contrátil, isto é, não foi levado em consideração o processo de

depleção dos mastócitos ou sua ativação por reação alérgica nem a ação do antagonista

de LTB4 e L-arginina.

As seguintes hipóteses metodológicas foram consideradas para a construção do

modelo matemático:

Hipótese 1: O comportamento de um grande número de células e proteínas

fibrosas da matriz extracelular do músculo liso pode ser representado por um elemento

viscoelástico.

Hipótese 2: A disposição desses elementos viscoelásticos de acordo com a

Rede de Voronoi é um método viável para modelagem de tecidos biológicos.

Hipótese 3: O efeito do formaldeído pode ser representado alterando as pro-

priedades elásticas do elementos viscoelásticos.

Hipótese 4: O efeito do agente contrátil pode ser representado como uma

redução reversível do comprimento de cada um desses elementos viscoelásticos.

28

3.1 Modelagem do músculo liso da traqueia

Sistemas biológicos, como o caso de células e tecido pulmonar, podem ser mode-

lados utilizando um sistema de molas e amortecedores acoplados individualmente ou

fazendo parte de uma rede (Cavalcante et al. 2005), (Bates e Lauzon 2005), (Ito et al.

2006). As molas representam o componente elástico (ver Figura 8A) desses sistemas

biológicos enquanto que os amortecedores (ver Figura 8B) representam o componente

viscoso.

O comportamento elástico da mola é regido pela lei de Hooke, representada pela

seguinte equação clássica:

fs =−K ∆` com ∆`= `− `0, (3)

onde ` é comprimento atual da mola, `0 é o comprimento de equilíbrio da mola, K é

uma constante positiva denominada constante elástica da mola e traduz a sua rigidez:

quanto maior for o valor dessa constante, maior será a rigidez da mola. A variação do

comprimento da mola em relação à posição de equilíbrio é representada por ∆` e pode

ser resultado de uma tensão aplicada por um agente externo (Landau e Lifshitz 1969),

(Symon 1982). O sinal negativo na Equação 3 informa que a força que a mola exerce

é oposta a deformação: quando a mola é esticada, ela puxa o agente externo, e quando

comprimida, empurra-o. O que significa que a mola tende a retornar à sua posição de

equilíbrio e ao seu comprimento original `0, ou seja, a força é restauradora.

O comportamento viscoso de um amortecedor é regido pela seguinte equação:

fd =−cv, (4)

29

onde c é um coeficiente positivo denominado coeficiente de viscosidade do amortece-

dor e v a velocidade do objeto ao qual está acoplado (Landau e Lifshitz 1969), (Symon

1982). O sinal negativo desta equação informa que o amortecedor exerce uma força

contrária ao movimento, ou seja, quando o amortecedor está movimentando-se para

um lado a força está para o outro.

Figura 8: (A): Representação simbólica de uma mola. (B): Representação simbólica deum amortecedor

Nesta dissertação, o comportamento viscoelástico do músculo liso da traquéia (ver

Figura 9A) foi modelado por uma rede viscoelástica bidimensional formada por molas

e amortecedores. Cada mola e amortecedor representa o comportamento combinado de

um conjunto de sistemas actomiosinas das células do músculo liso bem como de alguns

componentes de sua matriz extracelular como o colágeno e elastina, respectivamente.

O modelo é uma área retangular (ver Figura 9B) que representa o músculo liso da

traqueia. Para a construção desse modelo, inicialmente 1200 pontos aleatórios foram

distribuídos dentro de uma área retangular e, posteriormente, o Diagrama de Voronoi

para cada ponto foi computado gerando, desta forma, a rede bidimensional contendo

6451 linhas (ver Figura 9B). Cada linha gerada pela diagramação de Voronoi (ver Fi-

gura 9C) representa um grupo que denominou-se de elemento viscoelástico. Cada ele-

mento viscoelástico (EV) é composto por uma mola, representando as ligações mais

30

rígidas, com constante elástica klig, em série com uma combinação em paralelo de uma

outra mola, com constante elástica k j, com um amortecedor, representando os EVs, pri-

mariamente, formados por redes de actina e miosina (ver Figura 9D). As partes mais

escuras superior e inferior da rede foram fixadas afim de representar as paredes às quais

a rede fica anexada. Assim, somente os elementos viscoelásticos localizados na parte

intermediária ficaram livres para se mover, cerca de 3428 elementos. A construção da

rede, as simulações e as exposições dos dados foram inteiramente realizados com o

software MatLab R© R2009a.

Figura 9: Ilustração da montagem do modelo de rede elástica bidimensional. (A): Vistasuperior de anel cartilaginoso traqueal com um aumento de 400x com coloração dePAS/AB. (B): Representação do modelo de rede para o músculo liso (ML) traqueal.(C): Cada linha da rede é organizada como um Diagrama de Voronoi e representadapor uma mola conectada em série com uma combinação em paralelo de uma outramola com um amortecedor (D) que chamamos de elemento viscoelástico. (E): Pro-jeção da força do sistema mola-amortecedor mostrado em (C). (Imagem histológicacedida pelo doutorando Robson Seriani e pela pesquisadora Mariangela Macchione doDepartamento de Patologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo)

31

Para saber a força exercida por cada elemento viscoelástico a Equação 3 foi com-

binada com a Equação 4, como segue abaixo:

f = fs + fd

f =−K ∆`− cv. (5)

Generalizando para o j-ésimo elemento, tem-se

f j =−K j∆` j− cv j (6)

onde parâmetro K j representa a constante elástica equivalente do j-ésimo EV, fisi-

ologicamente inclui a contribuição elástica do colágeno e elastina. Como um EV é

formado por uma mola conectada a um sistema mola-amortecedor em paralelo, então

a sua constante elástica equivalente é dada por:

K j =kligk j

k j + klig, (7)

onde klig é constante fixa para todos EVs, k j = K/`0j , onde `0

j é a nova notação para o

comprimento de equilíbrio do j-ésimo EV, e não mais `0, e K é uma constante positiva.

Substituindo a Equação 7 na Equação 6, fica

f j =

[−

kligk j

k j + klig

]∆` j− cv j,

então,

f j =

[−

klig(K/`0j)

(K/`0j)+ klig

]∆` j− cv j,

32

como ∆` j = ` j− `0j , tem-se

f j =

[−

klig(K/`0j)

(K/`0j)+ klig

](` j− `0

j)− cv j,

onde ` j é o comprimento corrente do EV. Reorganizando os termos da equação acima,

obtêm-se

f j =

[−

kligK(K/`0

j)+ klig

][(` j/`

0j)− `0

j/`0j)]− cv j,

onde ε j = ` j/`0j , é a deformação do EV, logo,

f j =

[−

kligK(K/`0

j)+ klig

](ε j−1)− cv j.

Tanto o comprimento ` j como v j podem variar no tempo, logo pode-se reescrever a

expressão acima como

f j(t) =

[−

kligK(K/`0

j)+ klig

][ε j(t)−1]− cv j(t), (8)

onde o parâmetro c representa o comportamento viscoso das estruturas que compõem

o músculo liso.

Para computar o posicionamento de cada EV utilizou-se o método de Runge-Kutta9

sobre a Equação 8. O posicionamento dos EVs foi um fator importante para discriminar

a situação de equilíbrio da rede. As linhas horizontais, evidenciadas na Figura 10, que

cruzam imaginariamente a rede foram os locais onde as forças resultantes dos EVs

9Um grande número de fenômenos físicos é descrito por equações conhecidas como Equações Di-ferenciais Ordinárias (EDOs). As EDOs permitem investigar problemas tanto no campo da física, daquímica como da biologia. Na física, o comportamento de uma mola, por exemplo, é descrito utilizando-se as EDOs. Para resolver essas EDOs alguns métodos matemáticos podem ser utilizados, e um delesé o método de Runge-Kutta. Para mais detalhes sobre este método consulte (Butcher 2003) e (Scherer2005).

33

foram capturadas. Primeiramente, foi feita uma contagem dos EVs que cruzam cada

linha imaginária. Depois, a força na direção-y foi calculada para cada elemento que

cruza a mesma linha. Estas forças, referentes aos elementos da mesma linha, foram

somadas dando origem a força resultante F1, por exemplo. Esse processo foi executado

para as outras linhas evidenciadas dando origem as forças resultantes F2,F3 e F4. A

configuração de equilíbrio da rede correspondeu a igualdade dessas forças, ou seja, a

rede foi considerada equilibrada quando F1 = F2 = F3 = F4 .

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

Linha 1 (F1)

Linha 2 (F2)

Linha 3 (F3)

Linha 4 (F4)

Figura 10: Rede particionada em diferentes locais por linhas imaginárias para a detec-ção de força

A força foi calculada por transecção (Fts) como sendo a soma da projeção da força

no eixo-y exercida por cada EV (ver Figura 9E). A Figura 11 esclarece como esse cál-

culo foi feito.

Como vários EVs cruzam uma linha imaginária, tem-se:

Fts = f1senφ1 + f 2senφ2 + f3senφ3 + · · ·+ fhsenφh,

34

Figura 11: Ilustração do método para calcular a projeção da força no eixo-y para osEVs que cruzam as linhas imaginárias

logo

Fts =h

∑j=1

fjsenφj (9)

onde h é o número total de EVs que compõem a rede, f j é a força exercida por cada

EV (ver Equação 8) e φ é o ângulo do EV com o plano horizontal.

35

3.2 Modelagem do agente contrátil

Entender a reatividade do músculo liso presente nas vias aéreas respiratórias de

mamíferos é importante para o estudo da fisiopatologia de muitas doenças como a

asma. Essa reatividade é quantificada submetendo uma amostra desse músculo a dife-

rentes dosagens de um agente contrátil. Usualmente encontram-se trabalhos onde essas

dosagens são dadas de forma logarítmica, como mostrado na Figura 6.

Lino dos Santos Franco e colaboradores submeteram amostras de anéis traqueais

de ratos Wistar a diferentes doses do agente contrátil metacolina, e quantificaram a

tensão de contração do músculo liso desses anéis para essas doses.

Um agente contrátil, como a metacolina, ativa o sistema actomiosina das células

fazendo o tamanho médio das fibras diminuir. No modelo matemático proposto nesta

dissertação, essa característica foi implementada alterando o comprimento de equilí-

brio de cada EV para cada valor de um novo parâmetro, Dm. Agora o comprimento `0j

é dependente de Dm, ou seja, `0j(Dm). O parâmetro Dm é uma representação numérica

de uma quantidade exponencial e varia proporcionalmente com a quantidade de me-

tacolina que foi adicionada no experimento. Esse parâmetro foi mapeado com a dose

real de metacolina M aplicada no experimento em 30 valores discretos NDm seguindo

as condições de contorno do experimento, da mínima dose real MMIN = 10−9M até a

máxima dose real de metacolina MMAX = 10−3M, seguindo a equação:

Dm = 1+(NDm−1) ln(M/MMIN)

ln(MMAX)− ln(MMIN)(10)

36

e a sua forma inversa:

logM =(1−Dm) log

(MMINMMAX

)NDm−1

+ log(MMIN) . (11)

Esse mapeamento apenas transforma as quantidades experimentais das dosagens

de metacolina, que variam logariticamente, em um conjunto de números que variam

linearmente entre 1 e NDm (ver Figura 12), facilitando a representação numérica. O

efeito do agente contrátil no modelo, fez com que cada valor de Dm causasse uma

diminuição do comprimento de equilíbrio `0j de todos os EVs que compõem a parte

intermediária da rede. Em outras palavras, à medida que Dm cresce os comprimentos

dos EVs diminui.

−9 −8 −7 −6 −5 −4 −30

5

10

15

20

25

30

Dose real de metacolina (Dr), Log[M] MCh

Dm

Figura 12: Relação entre a dose real de metacolina Dr e o parâmetro Dm proposto nessetrabalho. A linha contínua representa a Equação 10 e os círculos os valores utilizadosneste trabalho

37

Utilizando o conceito de derivada10, representou-se a diminuição do comprimento

de equilíbrio `0j de um dado EV de acordo com a seguinte equação:

d`0j(Dm)

dDm=−`0

j(Dm)γ(Dm) (12)

onded`0

j(Dm)

dDmé a taxa de variação do comprimento de equilíbrio de um elemento com

relação ao parâmetro Dm, `0j(Dm) é o comprimento de equilíbrio de um dado EV e γ

um fator de contração associado a Dm. Para representar a variabilidade natural de um

sistema biológico, esse fator de contração possui um componente determinístico e um

componente aleatório,

γ(Dm) = A.Dm +η, (13)

onde A é uma constante positiva e η é um número randômico proveniente de uma

distribuição gaussiana.

Fisiologicamente, é sabido que o ciclo de contração do músculo continua enquanto

o nível de cálcio intracelular permanecer elevado. À medida que o nível de cálcio

diminui a fibra muscular relaxa. O encurtamento que ocorre quando um músculo é

estimulado depende de quanto tempo o ciclo de contração continua. No músculo estri-

ado, entre 20 e 38oC, o sarcômero pode encutar em 40% do seu comprimento (Honikel

et al. 1986).

Apesar do modelo matemático proposto nesta dissertação tratar do músculo liso,

assumiu-se que o encurtamento máximo das fibras deste músculo foi também de 40%

do seu comprimento. Sendo assim, o limite de contração de cada EV foi considerado

ser de 40% do seu comprimento de repouso `0j . Quando um EV atinge esse valor de

10 Ver Anexo C.

38

encurtamento o seu comprimento não mais se altera, como está evidenciado na Equa-

ção 14.

d`0

j(Dm)

dDm=−`0

j(Dm)γ(Dm) se `0j(Dm)> 0,4`0

j(0),

d`0j(Dm)

dDm= 0 se `0

j(Dm)≤ 0,4`0j(0),

(14)

Isto é, se o comprimento corrente `0j(Dm) de um EV for maior do que 40% do com-

primento de repouso `0j(0) esse mesmo elemento ainda continuará se contraindo até

alcançar o limite de contração, que é 0,4`0j(0). Atingido este limite, o elemento visco-

elástico não pode ser mais contraído.

Para evidenciar como a diminuição do comprimento inicial de um dado EV foi

inserido no modelo, multiplicou-se ambos os lados da Equação 12 por dDm. Então,

tem-se

d`0j(Dm) =−`0

j(Dm)γ(Dm)dDm.

Discretizando a equação acima, isto é, fazendo d`0j(Dm) = ∆`0

j(Dm) e dDm = ∆Dm,

fica

∆`0j(Dm) =−`0

j(Dm)γ(Dm)∆Dm

fazendo ∆Dm = 1,

∆`0j(Dm) =−`0

j(Dm)γ(Dm),

39

sendo ∆`0j(Dm) = `0

j(Dm +1)− `0j(Dm), pode-se escrever

`0j(Dm +1)− `0

j(Dm) =−`0j(Dm)γ(Dm)

onde `0j(Dm) é o comprimento de equilíbrio de um dado elemento viscoelástico j em

um certo Dm e `0j(Dm+1) é o comprimento do mesmo elemento para o valor de Dm+1.

Rearranjando a equação acima, tem-se

`0j(Dm +1) = `0

j(Dm)− `0j(Dm)γ(Dm). (15)

Utilizou-se a Equação 15 no modelo matemático para reduzir o comprimento ori-

ginal `0j de cada EV presente na parte intermediária da rede. A Equação 15 informa

que para Dm + 1 o comprimento `0j(Dm + 1) de um dado EV é menor do que o seu

comprimento `0j(Dm) no valor anterior Dm.

40

3.3 Elasticidade da rede

A constante elástica K , que traduz a rigidez dos EVs, foi desenvolvida aqui nesta

seção. Inicialmente, abordaremos, de uma forma geral, a relação entre a rigidez e com-

primento de um sistema de molas acopladas. No final desta seção, apresentaremos

a forma genérica da relação rigidez-comprimento que inicialmente adotamos para os

EVs que compõem o nosso modelo de rede.

Inicialmente, considere a figura abaixo ilustrando um sistema de molas acopladas

em uma rede. Todo esse sistema pode ser representado por um único componente k.

Figura 13: Sistema de molas acopladas

Esse sistema é composto por N grupos paralelos de molas, onde cada grupo pa-

ralelo é composto por M molas associadas em série e com constante elástica k. Cada

41

grupo de molas, como enfatizado na Figura 13, pode ser substituído por uma única

mola. Essa nova mola tem uma constante elástica equivalente (keq) a do grupo que está

substituindo. Essa rigidez equivalente é dada por:

keq =kM

, (16)

onde k é a rigidez de uma das molas do grupo e M a quantidade dessas molas existente

nesse grupo. Logo, pode-se concluir que a rigidez da mola equivalente será menor que

a rigidez de uma das mola do grupo.

Note que agora, após essa representação N × M molas de constante elástica k

serão substituídas por N molas de constante elástica k/M. Agora essas molas podem

ser novamente reagrupadas em um única mola representando todo o sistema. Nesse

caso, a constante elástica equivalente será:

keqsistema =kM

N. (17)

É importante notar, que se N for fixo, a medida que o número M de molas na verti-

cal aumenta a rigidez equivalente total do sistema keqsistema diminui. Em contrapartida,

quando o número de grupos N paralelos de molas aumenta, com M fixo, keqsistema

também aumenta.

Saindo desta representação discreta para uma representação contínua, tem-se

km = EA0

Lm

onde km é a rigidez do material e é proporcional à sua área e inversamente proporcional

42

ao seu comprimento Lm de repouso. O termo E é a constante de proporcionalidade

denominada de módulo elástico ou módulo de Young do material e é dado por:

E =F.Lm

A0.∆Lm, (18)

onde A0 é a área original do material e Lm o seu comprimento de repouso. Na equação

do módulo de Young, F representa a força aplicada no material, ∆Lm representa a va-

riação no comprimento do material. A rigidez da amostra é inversamente proporcional

ao seu comprimento, ou seja, quanto maior a amostra menor a sua rigidez e quanto

menor a amostra maior a sua rigidez. Essa relação inversa entre o comprimento e a ri-

gidez foi incorporada ao modelo matemático, considerando uma alta rigidez para EVs

curtos e uma baixa rigidez para EVs longos (ver Figura 14), utilizando a Equação 7.

Mais detalhes sobre essa relação serão abordados na Seção 4.

Figura 14: Ilustração da relação inversa rigidez-comprimento considerada para os ele-mentos viscoelásticos do modelo proposto

43

3.4 Modelagem do efeito do formaldeído

Para capturar o efeito da formação de ligações irrerversíveis (pontes de metileno),

em paralelo com o efeito da metacolina, foi assumido que se o tecido ficou tempo

suficiente na solução com formaldeído a rigidez de todas as fibras foi homogeneamente

afetada. Esse efeito pode ser capturado pelo modelo matemático por um aumento em

K na Equação 8 em todos os elementos viscoelásticos da rede.

Essa representação é similar à representação do efeito causado pela metacolina,

mas a natureza é diferente. No caso do efeito do formaldeído, a propriedade física do

elemento viscoelástico é alterada, enquanto que no caso da modelagem do efeito da

metacolina somente a posição de equilíbrio do elemento viscoelástico é afetada, sem

alterar qualquer propriedade, ou seja, é uma alteração reversível. Assim, enquanto o

efeito do formaldeído é irrerversível, o efeito da metacolina é reversível.

44

4 RESULTADOS

Neste trabalho, foi construída uma rede de Voronoi com 1200 pontos distribuí-

dos em uma região retangular com base W = 1 e altura L = 2,4 com o objetivo de

capturar as principais características dos experimentos. Testes computacionais foram

feitos no modelo matemático proposto e verificou-se que para klig > K evita-se insta-

bilidades computacionais. Escolheu-se klig = 2 e K = klig/10 e encontrou-se um valor

de c = 0,35 que estabilizou a rede depois de 0,5 h, aproximadamente, usando 2000

passos de Runge-Kutta. O valor de A = 0,0032 na Equação 13 fez com que a contra-

ção dos EVs atingisse seu limite de 40% em torno de Dm = 25, similar ao observado

experimentalmente quando substituído na Equação 11. Assim, esse é um importante

parâmetro de ajuste do modelo matemático proposto nesta dissertação.

4.1 Relação comprimento-rigidez

A relação inversa entre o comprimento e a rigidez para o modelo de rede proposto

nesta dissertação foi calculada analiticamente pela Equação 7, com klig = 2 e K =

klig/10. Esta relação inversa foi incorporada numericamente no modelo matemático.

Assumiu-se que os EVs com grande comprimento tiveram uma menor rigidez quando

comparados com outros EVs com comprimento menor (ver Figura 15).

No modelo, os valores da rigidez k variaram entre 1 e 2, onde kmin = 1 e kmax = 2

são a menor e a maior rigidez que um EV pode ter, respectivamente. Os valores dos

comprimentos desses EVs variaram entre `min = 6×10−6 e `max = 0,096352, o menor

e o maior comprimento detectados na parte móvel da rede. A rigidez dos demais EVs

presentes na parte móvel da rede pode ser verificada na Figura 15.

45

0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.101.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

comprimento do elemento viscoelástico Hunidades arbitráriasL

Rig

ide

zk

Hun

ida

de

sa

rbitrá

ria

sL

Figura 15: Cálculo analítico (linha na cor preta) e numérico (linha na cor vermelha) darelação inversa entre comprimento e rigidez dos elementos viscoelásticos

4.2 Efeito dos parâmetros γ e Dm

Na Equação 13, considerou-se A = 0,0032 para que a contração dos EVs atingisse

seu limite de 40% em torno de Dm = 25, e η como sendo um número randômico

proveniente de distribuição gaussiana com média igual a zero e desvio-padrão igual a

0,02.

O termo ADm faz os valores de γ aumentarem à medida que Dm aumenta. A variável

Dm no modelo é análoga à concentração da dose de metacolina no experimento. Sendo

assim, quanto maior do valor de Dm maior a contração dos EVs.

Considerou-se desvio-padrão igual a 0,02 para que os valores do fator de contração

γ estivessem contidos no intervalo [-0,05 , 0,15] colaborando para que a contração dos

EVs cessasse em torno de Dm = 25. Os valores negativos contidos no intervalo contam

para a aleatoriedade do sistema biológico.

Na Figura 16 as flutuações são consequências do componente aleatório de γ(Dm).

46

Nota-se que os comprimentos param de descrescer em torno de Dm = 25. Isto ocorre

porque os comprimentos dos EVs atingiram seus limites de contração, que foi esti-

pulado ser de 40% do comprimento inicial `0j do EV, e quando ele alcança esse valor

seu comprimento não se altera mais, como está evidenciado também na Equação 14 e

Figura 17.

Figura 16: Efeito do parâmetro Dm no comprimento de dois elementos viscoelásticosque compõem a parte intermediária da rede no modelo matemático proposto. (A): Mé-dia (–•–) e desvio-padrão (barra de erros) para cada valor de Dm. (B): Diminuição docomprimento de dois elementos viscoelásticos que compõem a parte intermediária darede

4.3 Efeito do parâmetro c

Após a estabilização da rede para c = 0,35, resolveu-se executar três simulações

para verificar o efeito desse parâmetro no perfil de força da rede. Em cada simulação

47

0 5 10 15 20 25 30D

m

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

%l 0

Figura 17: Percentagem de diminuição do comprimento natural `0j de dois EVs em

relação ao parâmetro Dm do modelo

a rede sofreu deslocamentos exponenciais na direção vertical para cima até atingir a

posição final como sendo 10% acima da sua posição inicial. As três simulações foram

executadas para n = 2000 passos de Runge-Kutta. Os resultados estão apresentados na

Figura 18.

Na Figura 18A, para c = 1, observa-se que a força não se propagou de forma ho-

mogênea devido a alta viscosidade da rede. No topo a rede está muito tensionada,

diferentemente do que ocorre na base. Isso é evidenciado pela grande quantidade de

linhas vermelhas no topo da rede e linhas azúis na base e pelo gráfico correspondente,

onde, neste último, pode-se observar as discrepâncias entre as forças resultantes. Para

c = 0,5 a rede também apresentou discrepâncias entre as forças resultantes, porém me-

nores, tendo como causa uma propagação mais homogênea da força comparado com o

caso anterior. Para c = 0,35 não houve discrepâncias entre as forças e rede alcançou o

equilíbrio, tendo F1=F2=F3=F4, como evidencia a Figura 18C.

48

A Figura 19 mostra o comportamento das forças mostradas na Figura 18 para os

diferentes valores do coeficiente c. Quantificou-se também a diferença entre as forças

F4 e F1 (forças no topo e na base da rede) e constatou-se que quanto maior o valor do

coeficiente de viscosidade c da rede maior o valor da diferença entre F4 e F1. Nota-se

que para n = 2000 quanto maior o valor do parâmetro c maiores as discrepâncias entre

as forças.

Posteriormente, verificou-se que para n = 12000 a rede com c = 0,5 não apre-

sentou discrepâncias, como está evidenciado na Figura 20. Desta forma, o problema

das disparidades entre as forças observadas na Figura 18 pode ser solucionado aumen-

tando o número de interações n de Runge-Kutta ou reduzindo o parâmetro c, como foi

descrito anteriomente. Todavia, aumentando o número de interações de Runge-Kutta

aumenta-se bastante o custo computacional.

Como o interesse aqui não está focado na dinâmica temporal da rede, e sim em situ-

ações quase-estáticas, qualquer uma dessas soluções poderiam ser utilizadas. Optou-se

aqui pela solução de menor custo computacional, que é a diminuição do parâmetro c.

49

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

x 104

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

Tempo (unidades arbitrárias)

For

ça (

unid

ades

arb

itrár

ias)

F

1

F2

F3

F4

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

x 104

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

Tempo (unidades arbitrárias)

For

ça (

unid

ades

arb

itrár

ias)

F

1

F2

F3

F4

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

x 104

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

Tempo (unidades arbitrárias)

For

ça (

unid

ades

arb

itrár

ias)

F

1

F2

F3

F4

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05

Figura 18: Configuracões da rede e perfil de sua força sob diferentes coeficientes deviscosidade c. (A): Rede e perfil de força para c = 1. (B): Rede e perfil de força parac = 0,5. (C): Rede e perfil de força para c = 0,35. Essas simulações foram executadascom n = 2000

50

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

Valor de c (unidades arbitrárias)

For

ça (

unid

ades

arb

itrár

ias)

Figura 19: Efeito do parâmetro c na força detectada na rede. O parâmetro c assumiutrês diferentes valores: 0,35, 0,5 e 1. As forças F1, F2, F3 e F4 estão representadas nasseguintes cores: vermelha, azul, verde e preta, respectivamente. (+) Diferença entre asforças F4 e F1 para os diferentes valores de c. Essas simulações foram executadas paran = 2000

0 2 4 6 8 10 12 14

x 104

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

Tempo (unidades arbitrárias)

For

ça (

unid

ades

arb

itrár

ias)

F1

F2

F3

F4

0 1 2 3 4 5 6 7 8

x 104

0

0.02

0.04

0.06

0.08

0.1

0.12

0.14

Tempo (unidades arbitrárias)

For

ça (

unid

ades

arb

itrár

ias)

F

1

F2

F3

F4

Figura 20: (Esquerda): Perfil das forças resultantes na rede para c = 0,5 e n = 12000.(Direita): Perfil das forças resultantes na rede para c = 0,35 e n = 8000

4.4 Efeito dos parâmetros klig e K

As configurações de rede correspondendo ao músculo liso nos estágios relaxado e

contraído são mostradas abaixo na Figura 21. A cor é proporcional à força no elemento

51

viscoelástico: vermelho escuro denotando uma alta força e azul escuro denotando uma

baixa força.

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

(A)

StretchedD

m = 0

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

StretchedD

m = 15

(B)

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

StretchedD

m = 30

(C)

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045 0.05

Figura 21: Configurações do modelo de rede de Voronoi mimetizando os estágios decontração do tecido. (A): Rede sem ação do parâmetro Dm (Dm = 0). (B): Rede sobação de Dm = 15. (C): Rede sob ação de Dm = 30. As cores são proporcionais à forçatensora no elemento viscoelástico: vermelho escuro denotando alta força e azul escurodenotando baixa força.

Observe que quando Dm = 0 (ver Figura 21A) existe heterogeneidade na distri-

buição de força, que tende a desaparecer com o aumento de Dm. Isso é devido a duas

características do modelo matemático: (1) uma determinada deformação em qualquer

elemento viscoelástico gera, aproximadamente, a mesma força e; (2) o efeito da meta-

colina, em todos os elementos viscoelásticos, independente da direção, têm a mesma

probabilidade de obter a mesma contração. A rede tornou-se mais afilada na parte in-

termediária apenas porque as partes superior e inferior da rede são fixas.

Para modelar o efeito da presença do formaldeído no músculo liso, como descrito

na Sub-Seção 3.4, tanto o valor de klig como K sofreram um aumento de 0 a 60% e

então 120%. Descobriu-se que este modelo matemático, embora simples, incorpora a

fenomenologia da metacolina e do formaldeído e reproduz resultados experimentais

52

observados com a exposição in vitro de músculo liso em formaldeído (ver Figura 22).

Figura 22: Tensão gerada pela contração da rede devido ao encurtamento dos elemen-tos viscoelásticos. O efeito do formaldeído foi aumentar as constantes elásticas doselementos viscoelásticos. Da base até o topo da rede klig e K sofreram um aumento de0 a 60% e então 120%. (◦): representa klig e K não modificados. (∗): representa klige K aumentados em 10%. (•): representa klig e K aumentados em 30%. (–◦–): repre-senta klig e K aumentados em 60%. (–•–): representa klig e K aumentados em 120%.Os dados experimentais foram obtidos por (Lino dos Santos Franco et al. 2010)

53

5 DISCUSSÃO

No presente modelo, as propriedades mecânicas do músculo liso de via aérea, com

e sem a participação do formaldeído, foram caracterizadas utilizando uma rede vis-

coelástica bidimensional baseada na tesselação de Voronoi. A força de contração da

rede apresentou similaridades com resultados experimentais de exposição do músculo

liso ao formaldeído quando a rigidez dos elementos viscoelásticos da rede sofreu um

aumento percentual de 120%.

O recuo elástico do músculo liso foi representado usando um elemento viscoe-

lástico composto por uma mola com constante elástica klig conectada em série com

uma combinação em paralelo de uma outra mola com um amortecedor. Dos três pa-

râmetros (K, klig e c) usados para representar o elemento viscoelástico somente K foi

relevante para a simulação de um experimento quase-estático. Tanto klig como c fo-

ram usados para estabilizar a simulação computacional. Ao menos que a constante

elástica klig� K/〈`0j〉, onde 〈`0

j〉 é o valor médio de `, nenhum efeito será verificado.

Para grande valores de c, o sistema “congela” e para pequenos valores ele reage muito

rápido gerando instabilidades numéricas. Já para processos dinâmicos o valor de c

torna-se relevante e deve ser ajustado para os experimentos.

A rede foi testada sob três diferentes caminhos para representar K j em função de

`0j e não foi encontrada diferença significativa nos principais resultados mostrados na

Figura 22. Em outra mão, K foi o principal parâmetro. A fim de manter a coerência,

foi considerado que o aumento da rigidez produzida por ligações cruzadas devido à

presença do formaldeído em proteínas fibrosas trabalha de modo idêntico em todos

os tipos de fibras. Assim, foi assumido que klig e K aumentaram na mesma taxa para

54

representar a ação do formaldeído no tecido.

A diferença mais significante entre o modelo proposto nesta dissertação e os en-

contrados na literatura é o fato de que a constante elástica dos elementos viscoelásticos

depende do comprimento de equilíbrio e que a mesma deformação em elementos dife-

rentes irá gerar aproximadamente a mesma força.

Outra característica chave do modelo foi a maneira como o efeito da metacolina foi

mimetizado. A aleatoriedade introduzida pela Equação 13 não foi uma característica

essencial, porém ela faz a transição próxima à saturação, log[M] = −4 na Figura 22.

No entanto, a aleatoriedade incorpora os efeitos que podem ser causados pelo remo-

delamento do músculo liso. Diferentemente de Ito e colaboradores (Ito et al. 2006),

que mimetizaram a resposta das células do músculo liso a metacolina aumentando o

número de elementos paralelos da rede comparado com o caso basal, no modelo de-

senvolvido nesta dissertação essa resposta a metacolina foi mimetizada utilizando um

fator de contração γ responsável pela contração do elemento viscoelástico dependente

do parâmetro Dm que varia de 1 a 30 em passos de 1 (ver Equação 13). Para cada Dm

a contração aumenta, isso significa que grandes valores de Dm implicará em grandes

contrações do EV. Fisiologicamente, doses de metacolina muito concentradas produ-

zem grandes contrações das fibras no tecido. Todos os elementos viscoelásticos tiveram

um limite de contração estabelecido em 40% do seu comprimento inicial. Quando o

elemento viscoelástico atinge esse limite sua contração cessa, isto é,d`0

jdDm

= 0 e o sis-

tema atinge um platô, como mostrado na Figura 17. Outra característica importante é

expressa na Equação 14, onde a redução do `0j é proporcional ao seu tamanho corrente.

Na Figura 17, as flutuações são consequências do componente randômico presente na

Equação 13.

55

O acordo entre o modelo matemático desenvolvido neste trabalho e os resultados

experimentais obtidos por Franco e colaboradores (Lino dos Santos Franco et al. 2010)

sugere que o modelo captura características fundamentais usando uma pequena quan-

tidade de parâmetros. O modelo sugere também que o formaldeído na concentração de

0,1 ppm pode afetar a propriedade elástica das fibras por um fator de 120%.

Os pulmões são inerentemente instáveis (Alencar et al. 2002) e sua estrutura e

recolhimento elástico são determinados por uma associação complexa entre o tecido

conjuntivo e as células do músculo liso. O tecido conjuntivo é composto por fibras

de colágeno e elastina embebidas em uma matriz extracelular, tendo diferentes pro-

priedades elásticas. O colágeno é o mais abundante componente e é responsável pelas

propriedades de tensão-deformação (stress-strain) em deformações mais elevadas. Por

outro lado, a elastina mantém a tensão em pequenas deformações (Cavalcante et al.

2005), (Faffe e Zin 2009). O músculo liso sintoniza as propriedades mecânicas de todo

o pulmão e sua viscoelasticidade é principalmente devida ao citoesqueleto (Park et al.

2010), (Berntsen et al. 2010). Existem diversas teorias tentando explicar a dinâmica

das fibras biológicas no pulmão e o comportamento viscoelástico dos tecidos.

Entre elas, uma sugere que as propriedades mecânicas do pulmão são uma con-

sequência de alterações conformacionais da fibra na matriz extracelular e no citoesque-

leto (Suki et al. 1994), (Rosenblatt et al. 2006). Outra teoria propõe que a dissipação

da energia ocorre no nível de fibra com fibra, e não a nível molecular, e os glicosami-

noglicanos provém a lubrificação entre as fibras adjacentes (Mijailovich et al. 1993).

O modelo desenvolvido nesta dissertação satisfaz ambas as ideias uma vez que

incorpora algum mecanismo do nível molecular, tal como a maneira de mimetizar o

efeito da metacolina.

56

6 CONCLUSÃO

No modelo proposto nesta dissertação, mostrou-se que o efeito de um agente con-

trátil pode ser modelado como uma alteração no comprimento de equilíbrio dos ele-

mentos viscoelásticos que compõem a rede. Adicionalmente, a modificação na pro-

priedade física desses elementos, para mimetizar o efeito do formaldeído, induziu um

aumento da força contrátil do sistema como um todo. O aumento gradual da rigidez de

tais elementos também levou a rede a um comportamento similar ao observado expe-

rimentalmente com músculo liso após a exposição ao formaldeído, sugerindo que este

composto pode alterar a rigidez das fibras de tal músculo em um fator de 120%.

O modelo sugere que o efeito do formaldeído, isto é, a formação de ligações cova-

lentes estáveis e irreversíveis entre proteínas, pode comprometer o movimento e função

das proteínas fibrosas presentes na matriz extracelular, como o colágeno e elastina, o

que pode explicar o aumento da rigidez e contratibilidade do músculo liso.

Finalmente, este modelo é capaz de reproduzir uma medição de força isométrica

do músculo liso quando submetido a ação de um agente contrátil com e sem exposição

in vitro ao formaldeído. Assim, as abordagens mecanicistas consideradas incorporam

várias características bem conhecidas do sistema contrátil das células em um modelo a

nível de tecido. É importante frisar também que o modelo pode ser usado em diferentes

escalas biológicas.

57

7 LIMITACÕES DO MODELO

Uma das limitações do modelo matemático proposto nesta dissertação concerne

ao método utilizado para o cálculo das forças, que foi o Método de Runge-Kutta de

2a Ordem. Utilizando esse método, verificou-se que para altos valores do coeficiente

de viscosidade, c > 0,35, as forças não convergiram devido a um problema de con-

vergência proveniente do método em si (ver Figura 18). Vale frisar que este não é um

problema de aplicação do método, mas sim intrínseco a ele. Esse problema foi minimi-

zado aumentando-se o número n de interações de Runge-Kutta (ver Figuras 20 e 18B).

Em contrapartida, devido a este aumento de n, verificou-se também um aumento no

custo computacional.

Outra limitação importante é sobre a modelagem do efeito do formaldeído. Neste

ponto, assumiu-se que todas as fibras do tecido foram homogeneamente afetadas pelo

composto, i.e., todos os elementos viscoelásticos que compõem a rede sofreram uma

mesma alteração percentual na sua rigidez, o que pode não ser a melhor representação

da realidade apesar das similaridades observadas nos resultados.

58

8 ANEXOS

Anexo A – Fisiopatologia da asma

A asma é uma doença inflamatória crônica das vias aéreas respiratórias que se

caracteriza por dispnéia, chiado e tosse resultantes da hiper-reatividade das vias aéreas

a estímulos específicos e inespecíficos com graus variáveis de obstrução reversível ao

fluxo aéreo (Muro et al. 2000), (Bousquet et al. 2000), (Carvalho 2006).

Não existe um único mecanismo que sirva para explicar a ocorrência da asma em

todos os indivíduos que a portam. O que existe é um conjunto de eventos que carac-

terizam os processos patológicos que ocasionam a asma (Pessoa 2000). Os ataques de

asma podem ser causados por diversos fatores, como vírus (Busse e Gern 1997), ar

poluído (Kim et al. 2001), (Bakonyi et al. 2004), (Fernandes et al. 2006), exposição a

alérgenos (Holt et al. 1999) e cada um pode induzir uma resposta inflamatória.

É importante ressaltar que a resposta inflamatória pode ser benéfica ou maléfica

para o hospedeiro. Por exemplo, um aumento na perfusão vascular pode aumentar o

fluxo de neutrófilos e, consequentemente, aumentar a defesa do organismo, já que os

neutrófilos têm a capacidade de ingerir, degradar e matar agentes estranhos ao orga-

nismo humano. Assim, a perfusão age em benefício do organismo. Em contrapartida,

a inflamação pode ser maléfica se ela causar uma lesão no tecido interferindo nas fun-

ções do mesmo, como acontece na asma devido a ação exacerbada dos mastócitos e

eosinófilos, por exemplo (Stites et al. 2000), (McPhee et al. 2003).

O organismo de um indivíduo asmático exposto a alérgenos específicos inicia uma

sequência de ativações celulares nas vias aéreas respiratórias resultando em processos

inflamatórios mediados pela liberação dos mastócitos e isso pode alterar o tonus e res-

59

ponsividade do músculo liso das vias aéreas, produzir secreção de muco e deteriorar

o epitélio dessas vias (Holt et al. 1999), (McPhee et al. 2003). Os mastócitos contém

receptores de imunoglobulina (IgE) em sua superfície e em seu interior existem grâ-

nulos cheios de uma substância chamada histamina e a interação entre o alérgeno e os

receptores de IgE ativa os mastócitos e faz com que eles liberem a histamina e outros

mediadores como as proteases e citocinas num processo conhecido como desgranula-

ção (Gounni et al. 1994).

Durante o processo de desgranulação, a histamina é liberada para o meio extrace-

lular e exerce diversos efeitos fisiológicos ao interagir com três tipos de receptores,

denominados de H1, H2 e H3, que são encontrados na superfície das células-alvo. O

principal efeito resultante da interação da histamina com os receptores H1 é a contra-

ção do músculo liso presente nas vias aéreas respiratórias. Já, quando a histamina está

em contato com os receptores H2 os efeitos são aumento da secreção de ácido gástrico

e de muco nas vias aéreas. A ligação da histamina com o receptor H3 interfere na sín-

tese e liberação da histamina. A desgranulação atrai também outros tipos de células

inflamatórias, como por exemplo, os eosinófilos (McPhee et al. 2003).

Os eosinófilos são as células numericamente mais predominantes na asma. Elas são

produzidas na medula óssea e são muito importantes na inflamação devido a sua forte

associação com reações alérgicas. Da mesma forma que os mastócitos, os eosinófilos

também possuem grânulos cheios de substâncias em seu interior. Nesses grânulos exis-

tem enzimas que podem produzir uma lisfosfatase citotóxica conhecida como proteína

de cristais de Charcot-Leyden, que é um indicativo de doença que envolve inflamação

eosinofílica como a asma (Kroegel et al. 1994).

Os grânulos nos eosinófilos também estocam um arsenal de outras substâncias, tais

60

como interleucinas (IL), quimiocinas e fatores de crescimento que modulam a resposta

imune. Os eosinófilos estão presentes nas vias aéreas de asmáticos e por apresentarem

atividade citotóxica eles podem causar danos à função das vias aéreas, pois os media-

dores liberados por eles podem induzir broncoespasmo e hiper-reatividade brônquica.

Esta hiper-reatividade e a gravidade da asma se correlacionam com o número de eo-

sinófilos que estão presentes nas vias aéreas, tanto de asmáticos alérgicos como de

não-alérgicos (Bousquet et al. 1990), (Prete et al. 1993), (Leff 1994).

Outro grupo de células, denominadas linfócitos T, também se correlacionam com a

gravidade da asma. Resumidamente, eles controlam a inflamação crônica na asma alér-

gica e não-alérgica através da liberação das citocinas do tipo Th2, como a interleucina

3 e 5 (IL-3 e IL-5) (Prete et al. 1993), (Palombini et al. 2001). As citocinas produzi-

das pelos linfócitos T têm participação importante na resposta inflamatória da asma.

Elas entram em contato com os receptores específicos de células-alvo e fazem com que

ocorram transmissões de sinais que ativam e proliferam outras citocinas. A IL-3, por

exemplo, diferencia e ativa os mastócitos, neutrófilos e eosinófilos. A IL-5 também é

o determinante da diferenciação, recrutamento e ativação, adesão e sobrevida dos eo-

sinófilos o que promove um acúmulo dessas células inflamatórias em doenças como a

asma (Kroegel et al. 1994), (Stites et al. 2000). Assim, as células Th2 e seus mediado-

res podem esclarecer muitos fenômenos inflamatórios da asma, incluindo eosinofilia.

Num estudo recente, Leckie e colaboradores administraram anticorpo anti–IL-5 e

observaram que a quantidade de eosinófilos nas vias aéreas de pacientes asmáticos

reduziu efetivamente, porém não amenizou os sintomas da asma ou a hiperresponsi-

vidade brônquica (Leckie et al. 2000). Isso evidencia que a asma não é apenas uma

inflamação via Th2. Vários fatores de crescimento e citocinas que regulam a atividade

61

e proliferação das células do músculo liso de vias aéreas foram encontrados em asmá-

ticos e isso levou alguns estudiosos a proporem que a célula deste músculo poderia ser

um tipo de célula mais importante na patologia da asma (Borger et al. 2006). Não so-

mente porque essas células são as causadoras da constrição da via aérea, mas também

porque em indivíduos asmáticos elas se proliferam mais rapidamente, produzem mais

citocinas e fatores de crescimento e possuem a habilidade de induzir e sustentar um

ambiente que promove a inflamação e o remodelamento das vias aéreas (Johnson et al.

2004), (Borger et al. 2006), (Araujo et al. 2008).

O remodelamento é uma alteração na estrutura das vias aéreas e algumas das suas

características são:

• hipertrofia e hiperplasia do músculo liso presente nessas vias aéreas (Heard e

Hossain 1973);

• aumento das glândulas mucosas (Bousquet et al. 2000);

• aumento na quantidade dos componentes da matriz extracelular (MEC) (Johnson

et al. 2004).

A parede das vias aéreas de indivíduos asmáticos é caracterizada por um aumento

na sua espessura devido ao aumento das glândulas mucosas e da massa do músculo liso

presente nas vias (Bousquet et al. 2000). O aumento das glândulas mucosas contribui

para a produção excessiva de muco, o que é verificado na asma fatal onde a via aérea

é obstruída por grandes rolhas de muco (Palombini et al. 2001). O aumento de massa

no músculo liso foi verificado tanto em vias aéreas pequenas como grandes em asma

não-fatal e fatal e acredita-se que ele possa estar relacionado com a ação de citocinas

e mediadores inflamatórios.

62

Outra característica do remodelamento são alterações na MEC do tecido conjun-

tivo. A MEC é uma rede de macromoléculas que dá suporte mecânico, mantém a estru-

tura e função das via aéreas e pode influenciar também nas funções celulares (Smith e

Thier 1985). O remodelamento nas vias aéreas respiratórias é uma característica essen-

cial da persistência da asma e inclui alterações no perfil proteico da MEC em torno do

músculo liso com um aumento do colágeno I, III e V, fibronectina, dentre outras proteí-

nas quando comparado com indivíduos não-asmáticos (Johnson et al. 2004), (Araujo

et al. 2008). Johnson e colaboradores mostraram que células do músculo liso de vias

aéreas de pacientes asmáticos produzem e secretam para a MEC um valor aumen-

tado de colágeno Tipo I quando comparado com pacientes não-asmáticos e que isso

pode contribuir para o remodelamento da via aérea que ocorre na asma (Johnson et al.

2004). Por sua vez, Araujo e colaboradores observaram um aumento de fibras elásti-

cas no músculo liso das vias aéreas respiratórias em pacientes com asma fatal (Araujo

et al. 2008). Essa deposição aumentada de proteínas da MEC no músculo liso pode

contribuir para a hiperresponsividade brônquica alterando as propriedades mecânicas

da vias, como contratilidade e rigidez (Bousquet et al. 2000).

63

Anexo B – Uma breve revisão sobre diagrama de Voronoi

Neste apêndice, faz-se uma breve revisão da história, da utilização e do formalismo

matemático do diagrama de Voronoi. Isso com intuito de dar a informação necessária

ao leitor, com a preocupação de algum não ter experiência com o material necessário

para o entendimento da parte metodológica do trabalho que se encontra na Seção 3.

Existem vários tipos de diagramas de Voronoi; o ordinário, o ponderado, o de ordem

superior, o de Poisson entre outros (Okabe et al. 1999). Aqui, direcionaremos nossas

explicações somente para o diagrama de Voronoi ordinário.

Parte histórica e a utilização do diagrama

A primeira discussão compreensiva sobre diagrama de Voronoi foi apresentada

nos trabalhos do matemático alemão Johann Peter Gustav Lejeune Dirichlet (1805–

1859) e do matemático russo Georgy Fedoseevich Voronoy (ou Voronoi) (1868–1908)

[Voronoi, 1908, citado por (Okabe et al. 1999)].

Sob um ponto de vista bem geral, à sua época, Dirichlet estudou tanto casos bi-

dimensionais como tridimensionais dos diagramas, enquanto que Voronoi dedicou-se

aos casos mais gerais, isto é, aos casos n-dimensionais. Mesmo a primeira discussão

formal sobre diagrama de Voronoi ter sido nos anos citados, existem evidências de

que esse diagrama tenha sido mencionado bem antes de 1800, pois no livro O Mundo

ou Tratado da Luz, obra escrita por René Descartes entre 1632 e 1633 que contém

algumas das conquistas definitivas da física clássica, como a lei da inércia e a lei da

refração da luz e que também trata da fragmentação cósmica, René Descartes usa o

diagrama de Voronoi para explicar a disposição da matéria no sistema solar (Descartes

1633).

64

Figura 23: Diagrama da disposição da matéria no sistema solar feito por Descartes em1633. Fonte: (Descartes 1633)

Àquela época esse diagrama de Voronoi não era denominado dessa maneira, mas

um fato demasiado interessante nestes escritos é que não existem definições detalhadas

sobre o diagrama, e isto faz com que hoje se creia que o conceito desse diagrama já

fosse algo comum antes de 1800. Em 1908 Georgy Voronoy formalizou o diagrama no

seu trabalho sobre a teoria das formas quadráticas [Voronoi, 1908, citado por (Okabe

et al. 1999)].

Após este trabalho de 1908, o diagrama de Voronoi começou a ser aplicado em di-

versas áreas. Em 1953, Meijering utilizou-o para desenvolver um modelo de agregado

de cristal onde usou algumas propriedades de crescimento do modelo de Voronoi em

que os cristais iniciavam seu crescimento de maneira simultânea e isotrópica (Meije-

ring 1953). Aos poucos os estudiosos começaram a perceber a grande aplicabilidade

desse diagrama e logo ele foi aplicado também no campo da ecologia. Em 1965, Brown

ao estimar a intensidade de árvores em uma floresta definiu uma região de Voronoi para

cada árvore, chamando esta região de área potencialmente disponível para uma árvore

65

conhecido também como APA (Area Potentially Available) (Brown 1965). Vinte anos

mais tarde, Hoofd definiu as regiões de Voronoi com respeito aos centros de capilares

em cortes de tecido (Hoofd et al. 1985).

A necessidade da utilização desse diagrama tornava-se cada vez maior e fez com

que fossem desenvolvidos diversos algoritmos de construção desse diagrama. Essa si-

tuação foi o combustível para o nascimento do que conhecemos hoje por Geometria

Computacional (O’Rourke 1998). Essa geometria fez o diagrama de Voronoi se tornar

um método mais viável e, desde de então, tem evoluído muito tornando-se atraente

para aplicações biológicas. Em 1978, Honda propôs um método bidimensional para

agregados celulares (Honda 1978). Os primeiros estudos envolvendo tecidos biológi-

cos datam de 1984, com Sulsky e colaboradores (Sulsky et al. 1984). Mas, somente a

partir de 2004 foi que o diagrama de Voronoi foi utilizado em modelos 3D de tecidos

(Honda et al. 2004).

Formalismo matemático

Para planejar o investimento de recursos em um posto de saúde, por exemplo, é de

grande importância saber a área de abrangência deste posto. O diagrama de Voronoi é

uma técnica para saber tal área de abrangência.

O diagrama de Voronoi é uma coleção de regiões que dividem o plano bidimensio-

nal. Cada região é gerada em torno de um ponto, onde esse ponto pode ser um posto de

saúde ou um hospital, por exemplo, e, por isso, esse ponto é conhecido como gerador

(ver Figura 24).

Para saber a área de abrangência ou região de Voronoi de um conjunto de postos de

saúde de uma cidade, primeiramente é necessário denotar a localização de cada posto.

66

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

X

YLOCALIZAÇÃO DOS POSTOS DE SAÚDE (GERADORES)

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1DIAGRAMA DE VORONOI DOS POSTOS DE SAÚDE

X

Y

Geradores(Postos de saúde)

Figura 24: (Esquerda): Distribuição espacial dos geradores ou distribuição espacial dospostos de saúde numa cidade. (Direita): Diagrama de Voronoi dos postos de saúde. Istoque dizer que cada posto de saúde só irá atender as pessoas que se encontram dentroda sua respectiva região

Pode-se denotar a localização de cada posto como sendo Pi(xi,yi), onde i é o índice do

posto. Isto quer dizer que P1(x1,y1) é a localização do posto de saúde número 1, que

P2(x2,y2) é a localização do posto de saúde número 2 e assim por diante. Denota-se

também a distância entre um posto de saúde e uma residência próxima como sendo d.

O conjunto de postos pertencentes a uma cidade é definido como

P = {P1, . . . ,n} ∈ℜ2

onde 2 < n < ∞ e isto quer dizer que o número de postos deve ser maior do que 2.

A notação Pi 6= Pj informa que os postos de saúde não podem ocupar o mesmo lugar.

Com essas definições, uma área de abrangência de um posto de saúde ou região de

Voronoi é definida como:

Ai = {d ∈ℜ2 : di < d j,∀i 6= j}

onde Ai é a área de abrangência do posto i. A notação d ∈ℜ2 informa que a distância

67

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

X

Y

DIAGRAMA DE VORONOI DOS POSTOS DE SAÚDE

Pi

Pj

Pk

Pl

Pm

dj

di

dk

dl

(Ai)

(Aj)

(Ak)

(Al)

(Am

)

dm

Figura 25: Diagrama mostrando que um ponto qualquer pertencente a região Ai estámais próximo do ponto gerador Pi do que qualquer outro ponto gerador fora dessaregião. Note que a seta di é menor do que todas os outras setas (d j, dk, dl , dm)

d pertence ao plano bidimensional, representado por ℜ2. di é a distância do posto i a

uma residência próxima e d j é a distância do posto j a uma residência dentro da área de

abrangência do posto i. Então, o termo di < d j nos diz que uma residência pertencente

a área de abrangência do posto i está mais próxima deste posto i do que qualquer outra

residência fora dessa área de abrangência (ver Figura 25). Isso é válido para todo posto

i diferente do posto j em localização, o que é representado por ∀i 6= j.

Pode-se afirmar que para n geradores ou postos de saúde tem-se n regiões, então

V = {A1, . . . ,An},

V =n⋃

i=1

Ai. (19)

onde V é o diagrama de Voronoi, o símbolo⋃

representa a união de todas as áreas.

Então, tem-se aqui a união de todas as regiões de Voronoi ou áreas de abrangência, que

é denominada de Diagrama de Voronoi (ver Figura 24) (Bock et al. 2010).

68

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 10

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1DIAGRAMA DE VORONOI DOS POSTOS DE SAÚDE

X

Y

(A1)

(A2)

(A3)

(A4)

(A5)

B34

B12

B35

Bordas(Limite entre áreasde abrangência)

Vértice

Figura 26: As setas apontam para as bordas do diagrama de Voronoi gerado para ospostos de saúde de uma cidade. A1, A2, A3, A4 e A5 são as áreas dos postos de saúde1, 2, 3, 4 e 5, respectivamente. B12 é a borda que separa A1 e A2. B34 é a borda quesepara A3 e A4. B35 é a borda que separa A3 e A5. Os círculos indicam os vérices(ponto de encontro entre bordas) do diagrama de Voronoi

Outra definição importante dentro do contexto de Diagramas de Voronoi, são as

interseções entre duas regiões; interseção esta que comumente denomina-se de borda.

É o mesmo que a interseção entre duas áreas de abrangência dos postos de saúde (ver

Figura 26).

A borda de contato entre duas regiões é definida como sendo

Bi j = Ai∩A j, i 6= j, (20)

onde Bi j é a borda ou interseção, representada pelo símbolo ∩, entre as áreas de abran-

gências dos postos de saúde i e j, isto é, entre Ai e A j. Logo, a borda entre A1 e A2 é

representado por B12, a borda entre A3 e A4 por B34 e assim por diante (ver Figura 26).

Sendo assim, a união de todas essas bordas ao redor do posto i, isto é, o contorno total

ao redor do posto i é

69

∂Ai =⋃i 6= j

Bi j. (21)

onde o símbolo ∂ é a representação de todas as linhas do diagrama de Voronoi.

Os diagramas de Voronoi são compostos por três componentes básicos. Até aqui já

se comentou sobre dois deles: os geradores (representados como postos de saúde) e as

bordas (interseção entre áreas de abrangência de dois postos). O terceiro componente

básico dos diagramas de Voronoi é o vértice, denotado por qi. Uma definição bem

simples de vértice é: o ponto de encontro entre três bordas ou o ponto de encontro

entre três áreas de abrangência. O número de bordas que se encontram em um vértice

denota o grau do vértice. No modelo construído neste trabalho, utilizamos o diagrama

de Voronoi clássico onde os vértices têm grau(qi) = 3 (ver Figura 26).

70

Anexo C – Um breve conceito de derivada

De início é importante salientar que a intenção deste anexo não é definir formal-

mente a derivada11, mas apenas esclarecer o seu conceito e suas aplicações. Na Se-

ção 3, a contração de um elemento viscoelástico é regida pela Equação 12, que é uma

derivada. A derivada representa a variação de uma grandeza com relação a outra e é

aplicada tanto na física, química, biologia, matemática, economia e em muitas outras

áreas que estão interessadas em saber a variação de um parâmetro em relação a outro.

Por exemplo, na biologia, quando queremos estudar a taxa de crescimento no tempo

de bactérias de uma cultura utilizamos a derivada. A taxa de polimerização e despo-

limerização da actina no citoesqueleto também pode ser estudada utilizando-se este

conceito.

A derivada é notada da seguinte forma:

T =dC(t)

dt

onde C(t) pode ser uma função que descreve o crescimento de bactérias em cultura e t

é o tempo. Sendo assim, T é a taxa de variação temporal do crescimento de bactérias

em cultura. Em outras palavras, se uma variável x é função do tempo t, então a taxa de

variação de x em relação ao tempo é dada por dx/dt.

No caso da Equação 12 também temos uma taxa de variação:

d`0j(Dm)

dDm=−`0

j(Dm)γ(Dm),

onde `0j é o comprimento de um dado elemento viscoelástico e Dm um parâmetro do

11Para mais detalhes sobre derivada, consultar (Batschelet 1978).

71

modelo desenvolvido. Assim, o termod`0

j(Dm)

dDmrepresenta a taxa de variação do com-

primento de um dado elemento viscoelástico em relação ao parâmetro Dm. Em outras

palavras, mostra como o comprimento de um dado elemento viscoelástico se comporta

quando Dm varia.

72

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Apêndice

A Mathematical Model of the Airway Smooth Muscle:The Effect of Methacholine and Formaldehyde

Mac Gayver S. Castroa, Adriano M. Alencarb,c

aDepartment of Pathology, Medical School of the Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, BrazilbInstituto de Fisica of the Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, SP, Brazil

cCorresponding author. Tel.: +55 11 3091 6658; fax: +55 11 3813 4334E-mail address: aalencar@if.usp.br (Adriano M. Alencar)

Abstract

The viscoelastic properties of the mammalian lung are mainly determined by the mechanical properties, structure and regulation ofthe airways smooth muscle. The exposure to polluted air may alter these properties with harmful consequences to individual health.Formaldehyde is an important indoor pollutant that permeates through the smooth muscle tissue forming covalent bonds betweenproteins in the extracellular matrix and intracellular protein structure deteriorating some of the airways smooth muscle functions,changing mechanical properties, and inducing hyperresponsiveness. Our main objective was to develop a two-dimensional vis-coelastic network model based on Voronoi tessellation to reproduce some of the mechanical properties of airway smooth muscleat the tissue level. The second objective was to compare the results of our model with those previously observed in tissue stripexperiments after tissue exposure to formaldehyde. Our model simulates the mechanical properties of airway smooth muscle usinga set of springs and dashpot. This set of springs and dashpot not only mimic the viscoelastic properties of the smooth muscle butalso the cells contractile apparatus. We hypothesize that the formation of covalent bonds, due to the action formaldehyde, can berepresented in the model by a simple change in the elastic constant of the springs, while the action of methacholine reduces the sizeof the spring. Our model is able to reproduce an isometric force measurement, where the smooth muscle is subjected to a titrationof a contractile agent, with and without an in vitro exposure to formaldehyde. Thus, our new mechanistic approaches incorporatesseveral well know features of the contractile system of the cells in a tissue level model. The model can also be used in differentbiological scales.

Keywords: airway smooth muscle, viscoelasticity, voronoi

1. Introduction

The smooth muscle is an involuntary muscle found in mostof the mammalian organs. In hollow organs, smooth muscleis known to regulate the mechanical properties and its physicaldimensions (Bosse et al., 2008). However, in some cases, suchas within the walls of the lung airway tree, its exact function isnot fully clarified. Nevertheless, it has been speculated that thesmooth muscle helps the lung airflow by caliber control, andassists the respiration phases (Macklin, 1929).

According to Global Initiative for Asthma (GINA), theasthma is a chronic lung disease characterized by recurrentbreathing problems and symptoms such as breathlessness,wheezing, chest tightness, and coughing. There is a widespreadagreement that exaggerated shortening and mechanical changesof airway smooth muscle contributes for manifestation ofasthma symptoms with the development of bronchoconstric-tion (Ito et al., 2006; Coburn, 1989; Agrawal and Townley,1990; Fredberg, 2002; Bosse et al., 2008). Such changes in themechanical properties is related with the smooth muscle cellstructure and viscoelasticity (Gunst and Tang, 2000; Ito et al.,2006; Gunst and Zhang, 2008). Besides genetic factors, smoothmuscle exposure to some natural components and environmen-

tal pollutants can also affect the smooth muscle mechanicalproperties leading to consequences to individual health, simi-lar to those observed in asthma (Ito et al., 2006; Berntsen et al.,2010).

Formaldehyde (FA) is an important very small ( 2.3–2.7 Å)indoor pollutant present in automobile exhaust containing onlyfour atoms (HCHO) (Lipari and Swarin, 1982). For decades,FA has been used to preserve tissues by cross-link proteinsin cells and tissue (Wadsworth and Pangborn, 1936; Theis,1945; Gustavson, 1947; Kitamoto and Maeda, 1980). The va-por of FA is an irritant which can affect multiple living tissueseven at low concentrations (Rumchev et al., 2004). Due tothe small size of FA, it permeates biological walls and entersinto the cells, resulting in the formation of covalent bonds be-tween proteins (cross-link) that can inactivate, stabilize or im-mobilize proteins (Metz et al., 2004; Sutherland et al., 2008;Schmiedeberg et al., 2009). Metz and colleagues demonstratedthat, depending on their sequence, peptides can suffer chemicalmodifications after formaldehyde contact (Metz et al., 2004).These modifications can be divided into three types: (1) methy-lol groups, (2) Schiff-bases and (3) methylene bridges. TheSchiff-bases and methylol groups are reversible and are diffi-cult to detect. The stable methylene bridges are irreversible,

Preprint submitted to Journal of Theoretical Biology May 8, 2012

so they are considered the most important modification of pep-tides and proteins induced by FA. In another study, Sutherlandand co-workers conducted a overview of common biologicalapplications of formaldehyde cross-linking and their character-istic features and speculated that lysine side chains might be themajor reactive sites of the formaldehyde cross-linking reaction(Sutherland et al., 2008). Utilizing mass spectrometry analysisit has been confirmed that covalent links induced by formalde-hyde can be formed between lysine and arginine, lysine andtyrosine, cysteine and tyrosine and cysteine and amino terminalresidues (Metz et al., 2004; Sutherland et al., 2008). In 2003,Abe and co-workers performed a study with aim of detectingcrosslinks of collagen and elastin in formalin-fixed tissue andconcluded that crosslinks of collagen were preserved in forma-lin, but crosslinks of elastin were not preserved. The reason forthis might be that formalin did not fix elastin tissue sufficiently,or it destroyed, masked, or altered elastin crosslinks (Abe et al.,2003) and could alter the natural tissue stiffness. In short, theFA is a substance that can create stable and irreversible struc-tures called methylene bridges. This bridges are covalent bondsformed between proteins in tissue and may lead to a additionalrigidity of this tissue.

Recently, Franco and colleagues quantified the airway reac-tivity after acute exposure of FA through titration of metha-choline (MCh) using an isomeric force equipment. They foundthat when a tracheal segment was incubated in Dulbecco-modified Eagle’s medium (DMEM) containing formaldehyde(0.1 ppm) for 48 hours, it displayed hyperresponsiveness toMCh (dos Santos Franco et al., 2010). Others studies also indi-cate a positive association between asthma and FA (Kim et al.,2001; Jr. et al., 2010). However, to our knowledge, there areonly a few studies addressing the mechanism of FA in smoothmuscle, and no mathematical model which can be used to testhypothesis.

Cavalcante and co-workers developed a two-dimensionalsteady hexagonal network model of alveolar structure utilizingsprings incorporating the mechanical properties of collagen-elastin fibers and their interactions with proteoglycans and con-cluded that the compressibility of these proteoglycans con-tributes to the stability of the fiber network of the lung (Cav-alcante et al., 2005).

Another two-dimensional hexagonal network model was de-veloped by Ito and colleagues but to mimic the smooth muscleand to characterize yours viscoelastic and dynamic properties.They concluded that not all aspects of the viscoelastic prop-erties of the tracheal smooth muscle strip are similar to thosepreviously observed in cultured cells (Ito et al., 2006).

Hexagonal networks are regular and may not be ideal to beused as a biological network. On the other hand, Voronoi tes-sellation is well know as a random network better suitable tosolve some topological problems in biology. In mathematics, aVoronoi tessellation is a special type of decomposition of a met-ric space determined by the distance to a particular group of ob-jects in space (Voronoi, 1908; Okabe et al., 1999). With the ad-vent of computational geometry, Voronoi tessellation have be-come more viable and become very attractive for biological ap-plications. Honda has proposed a method for two-dimensional

cell aggregates (Honda, 1978) and the first studies involving bi-ological tissues date of 1984 by Sulsky and colleagues (Sulskyet al., 1984). Later, in 2004, the Voronoi diagram was used in3D models of tissues (Honda et al., 2004).

Recently, Araujo and co-workers studied the decay of stiff-ness of a single fiber under tension during enzymatic digestionusing an anisotropic model coupled with binding-unbinding re-actions. That study showed that fiber stiffness decrease expo-nentially. To better understand this stiffness exponential decay,the elastin sheet held under fixed strain while being digestedby elastase was represented as a two-dimensional network heldunder a fixed strain. To mimic the elastin sheet the fibers in themodel were arranged in a random orientation under Voronoitessellation (Araujo et al., 2011).

In another study, the RNA-protein interaction interface sur-face was computed via Voronoi diagram (Mahdavi et al., 2012).In that study, the authors presented some geometrical measuresfor the proper analysis of each RNA-protein interaction ex-tracted for the Protein Data Bank (PDB) and shown that theVoronoi model can be used for the analysis of the RNA-Proteininteractions compared to classical model.

In order to understand some of the smooth muscle phe-nomenological mechanisms, we developed a mathematicalmodel which is able to mimic two main features of the smoothmuscle: its contraction by an agonist drug and the stiffnesschange by protein chemical bonds inside the muscle. We con-fronted our model with the effect of methacholine and a com-mon indoor chemical pollutant, which also mimic some patho-logic conditions of the muscle, such as asthma. For our study,we used Voronoi tessellation, which better reproduce biologi-cal random networks to mimic the smooth muscle tissue strips.The primary aim of this study was build a framework to under-stand different mechanical properties of airway smooth muscleexposed to both methacholine and FA. Thus, we developed atwo-dimensional viscoelastic network model based on Voronoitessellation. Different of Ito and colleagues (Ito et al., 2006), werepresented the action of methacholine by changing one internalproperty of the viscoelastic element of the Voronoi network, in aclose analogy with the real physiologic effect of methacholine.We also hypothesized that the formation of covalent bonds dueto the action of FA would limit the normal functioning of theextracellular matrix proteins, specifically reducing the mobilityof collagen and elastin, which would cause an increase in tissuestiffness. This hypothesis was incorporated in the model alsochanging another internal property of the viscoelatic element ofthe network. Finally, to validate our mathematical model, ourresults were compared with those obtained experimentally byFranco and colleagues (dos Santos Franco et al., 2010).

2. Methods

The methods consist of three steps. We first built a two-dimension Voronoi network (tessellation) with a shape similarto the tissue were are interested in mimicking. Then, we setthe parameters of the viscoelastic elements of the network andsolved the system until it reached the equilibrium. The last stepwas to incorporate changes in the model which would mimic

2

the physiologic condition were are interested in: (a) agonistcontraction by methacholine and (b) protein cross link due thepresence of FA. We will go through these three steps one byone.

2.1. The Elastic Network ModelTo build the two-dimension viscoelastic network, we first

randomly distribute NP points inside a rectangular region ofspace, with width and the length respectively equal to W andL. Thus, each point Pi has a x and y coordinate, such that0 < x < W and 0 < y < L. Here, W/L is the width-length ratioof the network and the tissue strip were are interested in to mim-icking. Using a standard algorithm, we built a Voronoi networkon top of the NP points. Then, we replaced each bond elementof the Voronoi network by an viscoelastic element (VE) com-posed by one spring connected in series with a parallel combi-nation with another spring and a dashpot, and each node bya mass element m (see Fig. 1). By definition, all the nodeshas coordination number Z = 3. A small region on the bot-tom, 0 < x < δx, is fixed. Another small region on the top,(W − δx) < x < W, are fixed in a moving plate, where δx � W,while the lateral and the internal nodes were free to move. Wethen considered the geometric part of the network built.

After the geometric part, we replaced each bond j by a VE.The first spring has a constant spring constant klig, representingall elastic components of the tissue plus the actomyosin system.The second spring constant was not fix but depended on it ini-tial length �0j , such that k j = K/�0j , and represents the combinedactomyosin system of that region of the tissue, where K is con-stant. To build the original pre-stress of the tissue, the length�0j was set to be 10% smaller than the length of the jth boundin the Voronoi network. Each VE builds a coarse grains ofthe combined mechanical behavior of a huge group of smoothmuscle cells and extracellular matrix. Thus, the force at jthVE followed the classic Hooke equation for this combinationof springs and dashpot,

F j(t) = −kligK[� j − 1]

K�0j+ klig

− cv j (1)

where � j = � j/�0j is the strain, c is viscous coefficient, and v j is

the approaching velocity between the nodes connected by thejth bond. With this definition, we mimicked certain homogene-ity in the system, such that the same strain would generate verysimilar force independent of the size of the bond of the VE.

Next, the network was stretched uniaxially by 10% strainin the vertical direction, and solved using the Runge-Kutta’smethod on the Eq. 1. At any time, we could compute the totalforce the system applies in the moving plate by summing theforces in the direction of the strain of all VE which cross sev-eral horizontal imaginary lines crossing the network. We con-sidered that the system reached equilibrium when all the calcu-lated forces were equal.

2.2. Modeling the Effect of Contractile AgentThe contractile agent, like methacholine, activated the acto-

myosin system of the cells making the average size of the fiber

Figure 1: Our network model and linear inverse relationship between stiffnessand length. Two opposite sides, the top and bottom, of the network were fixed,while the lateral and the internal nodes were free to move. The relationshipbetween stiffness and length is valid only for the lateral and internal viscoelasticelements.

smaller. We built this feature in our model by changing the restlength of the VE in the Eq.1. We replaced the initial length �0jby �0j (Dm), which depends on a positive parameter Dm, repre-senting the amount of methacholine was added in the media.In that case �0j (Dm) < �0j as soon as Dm > 0. The parameterDm can be mapped to the real dose of methacholine M appliedin the experiment as NDm = 30 discrete values following theboundary of the experiment, from the minimal methacholinedose MMIN = 10−9 to the maxima dose MMAX = 10−3 (dosSantos Franco et al., 2010), following the equation:

Dm = 1 +(NDm − 1) ln(M/MMIN)ln(MMAX) − ln(MMIN)

(2)

and it inverse form:

log M =(1 − Dm) log

�MMINMMAX

�

NDm − 1+ log(MMIN) . (3)

We assumed that, in the muscle, each positive change in theconcentration of methacholine results in fibers contraction inactomyosin system, and the maximum amount of contraction is40% of the initial length. Thus, in our model this assumptionwas mapped as a small reduction in the �0j in Eq. 1, now rela-beled as �0j (Dm). This reduction is not deterministic, becausethis is a live system and fibers can remodel adapting to the newconfiguration, thus we mapped the effect of change in the con-centration of methacholine by

d�0j (Dm)

dDm= −�0j (Dm)γ(Dm) if �0j (Dm) > 0.4�0j (0),

d�0j (Dm)

dDm= 0 if �0j (Dm) ≤ 0.4�0j (0),

(4)

3

Figure 2: Effect of the parameter Dm in the length of viscoelastic elements ofinternal and lateral parts. (A): Average and error bar of lengths for each valueof Dm. (B): Length reduction of two viscoelastic elements.

Thus, we implemented in our model with the following equa-tion,

γ(Dm) = ADm + η (5)

where A = 0.0032 is a positive constant and η is a Gaussianrandom number with zero mean and SD = 0.02. Thus, a highervalue of Dm produces a greater value of the shrinkage factor andthis will result in a greater contraction of the VE. The averagedecrease of the lengths of the viscoelastic elements is shown inFig. 2.

2.3. Modeling the Effect of Formaldehyde

To capture the formation of irreversible covalent bonds(methylene bridges), in parallel with the effect of methacholine,we assumed that, if the formaldehyde stayed long enough inthe solution where the tissue were in, the stiffness of all fiberswould homogeneously be affected, which could be captured byour model by an increase in K in Eq. 1 in all the VE of the net-work. Although this representation is similar to the representa-tion of the effect caused by methacholine, the nature of the rep-resentation is different. In this case, the physical property of theVE is changed, while in the former case, only the equilibriumposition of the VE is affected, without changing any property,i.e., a reversible change. Thus, while effect of formaldehyde isirreversible and the effect of methacholine is reversible.

3. Results

We constructed a Voronoi network with NP = 1200 pointsdistributed in a rectangular region with W = 1 and L = 2.4, andm = 1 in arbitrary units, such that the main goal was to capturethe main features of the experiments. We know that the system

is damped and quasistatic in the time scale of the experiments.We first arbitrarily chose klig = 2 and K = klig/10 and founda value of c = 0.35, which would stabilized, dampening thesystem after aproximately 0.5 h using 8000 Runge-Kutta steps.The value of A = 0.0032 in Eq. 5 fitted the effect that we wantedto model, most of the VE reach the saturation contraction of40% of the initial length �0 with Dm near 25.

The network configurations corresponding to single musclein the control and the contracted states are shown in Fig.3. Thecolor is proportional to force on the VE, dark red denoting highforce and blue, low force. Note that when Dm = 0 there is someheterogeneity in the force distribution, which tends to disappearas Dm increases. This is due two characteristics of our model:(1) a given strain in any VE will generate approximately thesame force; and (2) the effect of methacholine, where regardlessof the direction, the VEs have the same probability to contract.Thus, the network became thinner in the intermediate zone onlybecause at the top and at the bottom the network was fixed.

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

(A)

StretchedDm = 0

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

StretchedDm = 15

(B)

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

StretchedDm = 30

(C)

−2 −1.5 −1 −0.5 0 0.5 1 1.5 2−1

−0.5

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

X

Y

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

Figure 3: Configurations of the Voronoi network model mimicking the con-traction states of tissue. (A): Stretched network without action of Dm param-eter (Dm = 0). (B): Stretched network under the action of the average Dm(Dm = 15). (C): Stretched network under the action of the last value of Dm(Dm = 30). The color is proportional to tensile force on the line elements darkred denoting high force and blue low force.

To model the effects of the presence of formaldehyde in thesmooth muscle, we increased both klig and K, from 0 to 60%and then to 120%. We found that this model, although sim-ple, incorporates the phenomenology of both methacholine andformaldehyde and reproduces experimental results observedwith in vitro exposure of smooth muscle to formaldehyde, (Fig.4).

4. Discussion

Formaldehyde is a pollutant that can induce bronchoconstric-tion and deteriorate airway function (Norback et al., 1995).The increasing use of alcohol as an alternative fuel to dieselor gasoline can increase emission of formaldehyde, which caneasily permeate cell membranes. Inside the cell, formalde-

4

Figure 4: Tension generated by contraction of the network due to the shorteningof viscoelastic elements. The effects of formaldehyde was the increasing of theelastic constants of the viscoelastic elements. From botton to top, klig and Kchanges from 0 to 60% and then to 120%. (◦): represents klig and K unchanged.(∗): represents klig and K increased by 10%. (•): represents klig and K increasedby 30%. (–◦–): represents klig and K increased by 60%. (–•–): representsklig and K increased by 120%. The experimental data were obtained by (dosSantos Franco et al., 2010).

hyde will form covalent bonds between proteins, which in-activate, stabilize or immobilize proteins and other reactivemolecules (Sutherland et al., 2008; Metz et al., 2004). It wasfound that lysine side chains might be the major reactive sitesof the formaldehyde cross-linking reaction (Sutherland et al.,2008) and this may give an extra rigidity to the tissue possiblebecause fibrous proteins of extracellular matrix have lysine intheir composition.

In the present study, the mechanical properties of airwaysmooth muscle under formaldehyde action were characterizedutilizing two-dimensional viscoelastic network model based onVoronoi tessellation composed by springs and dashpots.

We represent the elastic recoil using what we called the Vis-coelastic Element (VE) composed of one spring with elasticconstant klig connected in series with a parallel combination ofanother spring and a dashpot. From the three used parametersto represent the VE, only K is relevant for the simulation of aquasi-static experiment. Both klig and c are used to stabilize thecomputer simulation. Unless the elastic constant klig � K/��0j �,where ��0j � is the average value of �, not much effect will be ob-served. For large values of c, the system freezes and for smallvalues it reacts too fast generating numerical instabilities. If onewants to simulate a dynamic process, the value of c becomesrelevant and has to be adjusted for the experiment. Indeed, wetested the network under three ways to represent k j as a func-tion of �0j , and found no significant difference in the our mainresults shown in Fig. 4. On the other hand, K was found to bethe main parameter. In order to keep coherence, we assumed

that the increase in rigidity produced by protein cross-links duethe presence of FA in fibrous proteins works the same way inall types of fibers. Thus, we assumed that klig and K valueswere increased at the same rate to represent the action of FA onthe tissue. The most significant difference between our modeland the models found in the literature, is the fact that the elasticconstant of the bonds depends on the initial length, such thatthe same strain will generate approximately the same force.

Another key feature of the model is the way we mimickedthe effect of methacholine. The randomness we introduced bythe Eq. 5 is not a key feature of the model, but its make thetransition near the saturation, log[M] = −4 at Fig. 4, smooth.Reducing the SD of η makes that transition sharper. Inverselyincreasing it will make smoother. However, this randomness in-corporates all the effects may be caused by the smooth muscleremodeling. Differently of Ito and colleagues (Ito et al., 2006),that mimicked the response of airway smooth muscle cells tocontractile agent, such as MCh, by increasing the number ofparallel network elements compared with baseline, we mim-icked this response utilizing a shrinkage factor γ responsibleby the contraction of the VE and depend of Dm which variesfrom 1 to 30 in steps of 1 (Eq. 5). For each Dm the contractionincreases, meaning that for large values of Dm we have largecontractions of the VE. Physiologically, bigger doses of metha-choline produce larger contraction of the fibers in the tissue.All VE have a shrinkage limit established in 40% of restinglength. When the VE reaches this limit its contraction ceases(see Eq. 4) and the system reaches a plateau, as shown in Fig. 2for Dm > 25. The important feature, is expressed in Eq. 4, thereduction of �0j is proportional to its current size. In Fig. 2, thelength fluctuations are consequence of the random componentpresent in Eq. 5. The agreement between our model and theexperimental results obtained by Franco and co-workers (dosSantos Franco et al., 2010) suggests that our model captures allthe fundamental features using a small number of parameters.

The lungs are inherently instable Alencar et al. (2002) andits structure and elastic recoil are determined by a complex as-sociation between connective tissue and smooth muscle cellswith coating fluids. The connective tissue is composed by colla-gen and elastin fibers embedded in an extracellular matrix, hav-ing different elastic properties. Collagen is the most abundantcomponent and is responsible for the stress-strain properties athigher strains. On the other hand, elastin maintain the tensionat lower strains (Cavalcante et al., 2005; Faffe and Zin, 2009).The smooth muscle tune the mechanical properties of the wholelung and its viscoelasticity is mainly due the cytoskeleton (Parket al., 2010; Berntsen et al., 2010). There are several theoriesattempting to explain the dynamics of biological fibers in thelung and the viscoelastic behavior of tissues.

Among them, one suggests that the mechanical propertiesof the lung are a consequence of the conformational changesof the fiber in the extracellular matrix and in the cytoskele-ton (Suki et al., 1994; Rosenblatt et al., 2006). Another the-ory proposes the dissipation of energy occurs at the level offiber with fiber, and not at the molecular level, in this theorythe glycosaminoglycans provide lubrification between adjacentfibers (Mijailovich et al., 1993). Our model satisfy both ideas

5

since we incorporate some mechanism of the molecular level,such as the way me mimic the effect of methacholine while weconsider a viscous effect in the equation of force. In conclusion,our simulations suggest that formaldehyde action, i.e., forma-tion of covalent bonds between proteins, can compromise themovement and function of fibrous proteins in the extracellularmatrix, such as collagen and elastin, which may explain the in-creased stiffness and muscle contractility.

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