minha dissertação 2004

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS

PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM

MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS

ADRIANA ELIAS PIRES

Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso

Campo Grande, MS

2004

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MATO GROSSO DO SUL

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE METODOLOGIAS

PARA DETERMINAÇÃO DE FURANOCUMARINAS EM

MEDICAMENTOS FITOTERÁPICOS

ADRIANA ELIAS PIRES

Orientadora: Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química – Curso de Mestrado em Química, da Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Química, área de concentração: Química Orgânica.

Campo Grande, MS

2004

"O Mestre na arte da vida

faz pouca distinção entre

o seu trabalho e o seu lazer,

entre a sua mente e o seu corpo, ...

entre o seu amor e a sua religião.

Ele simplesmente

persegue sua visão de excelência

em tudo que faz,

deixando para os outros

a decisão de saber se

está trabalhando ou

se divertindo."

Texto Budista

DEDICATÓRIA

Dedico a presente dissertação aos meus pais

Dario Xavier Pires e Tânia Mara Elias Pires,

presentes, dedicados, amorosos, sem os quais

nada seria possível.

Ao meu namorado Sókrates Campos Quevedo dos

Santos, prestativo e amoroso, companheiro de

todas as horas.

As minhas queridas irmãs Claudia e Fernanda.

A Deus por conceder a vida, a oportunidade de

compartilhá-la com pessoas tão maravilhosas, o

discernimento e o equilíbrio que me fizeram

completar mais esta etapa da vida.

AGRADECIMENTOS

A Deus. À Professora Dra. Cláudia Andréa Lima Cardoso, pela preciosa e

incessante orientação deste trabalho, apoio, amizade e compreensão. Às professoras Dra. Neli K. Honda e Dra. Rosenei L. Brum, pelos

ensinamentos, colaboração e por oferecerem o laboratório para realização deste trabalho.

Aos professores Dra. Fernanda R. Garcez, Dr. Walmir S. Garcez, Dra.

Neuza M. Mazzaro Somera, Dra. Rozanna M. Muzzi, Dra. Nilva R. Poppi, Dra. Márcia R. da Matta, que me proporcionaram novos conhecimentos.

Ao Luís Leonardo Viana pela colaboração e pelos grandes ensinamentos

na arte da cromatografia líquida. À Mestre Roberta do laboratório de análises instrumentais da INEP, pela

realização de análises em cromatografia gasosa. À Professora Dra. Conceição Eneida dos Santos Silveira e ao mestrando

em Botânica Dario Palhares da Universidade de Brasília pelas coletas e identificação de Brosimum gaudichaudii.

Aos colegas do curso de Mestrado em Química da UFMS e todos os

demais colegas.

Aos secretários do Mestrado do DQI/UFMS Celestino G. de Oliveira e Maria Otávia P. V. de Toledo pela colaboração.

A todos os funcionários e técnicos do Departamento de Química da

UFMS, em especial a Dona Rosa pela prestimosa organização do laboratório. À CAPES pela bolsa concedida.

i

SUMÁRIO

ÍNDICE DE FIGURAS ................................................................................................. v

ÍNDICE DE TABELAS ................................................................................................ ix

ABREVIATURAS ....................................................................................................... xi

RESUMO .................................................................................................................. xii

ABSTRACT .............................................................................................................. xiii

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1

1.1. Introdução Geral .......................................................................................................... 1

1.2. Furanocumarinas......................................................................................................... 3

1.3. Plantas contendo furanocumarinas .......................................................................... 7

1.3.1. Dorstenia .............................................................................................................. 7

1.3.1.1. Dorstenia multiformes ................................................................................. 9

1.3.1.2. Dorstenia brasiliensis ................................................................................. 9

1.3.2. Brosimum gaudichaudii .................................................................................... 10

1.4. Medicamentos Fitoterápicos .................................................................................... 11

1.4.1. Outras plantas presentes nos medicamentos estudados ........................... 12

1.4.1.1. Davilla rugosa ............................................................................................ 12

1.4.1.2. Plumeria lancifolia ..................................................................................... 13

1.4.1.3. Erythrina mulungu ..................................................................................... 13

1.4.1.4. Cereus jamacaru ....................................................................................... 13

1.5. Legislação de Fitoterápicos ..................................................................................... 14

1.6. Técnicas Instrumentais de Análise ......................................................................... 17

1.7. Validação de Métodos Analíticos ............................................................................ 18

1.7.1. Desenvolvimento do método ........................................................................... 19

1.7.2. Parâmetros de validação ................................................................................. 20

1.7.2.1. Especificidade / seletividade ................................................................... 20

1.7.2.2. Limite de quantificação (LQ) ................................................................... 21

1.7.2.3. Limite de detecção (LD) ........................................................................... 23

1.7.2.4. Linearidade e faixa de aplicação ............................................................ 23

ii

1.7.2.5. Sensibilidade .............................................................................................. 26

1.7.2.6. Exatidão ...................................................................................................... 27

1.7.2.7. Precisão ...................................................................................................... 28

1.7.2.8. Estabilidade ................................................................................................ 30

1.7.2.9. Robustez ..................................................................................................... 30

1.7.3. Parâmetros de validação requeridos ............................................................. 31

2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 32

3. PARTE EXPERIMENTAL ................................................................................................ 33

3.1. Materiais e Equipamentos Utilizados ..................................................................... 33

3.1.1. Materiais utilizados ............................................................................................ 33

3.1.2. Solventes utilizados .......................................................................................... 33

3.1.3. Equipamentos utilizados .................................................................................. 33

3.2. Medicamentos Fitoterápicos .................................................................................... 35

3.3. Desenvolvimento das Metodologias....................................................................... 38

3.3.1. Soluções orais ................................................................................................... 38

3.3.2. Cápsulas e comprimidos .................................................................................. 39

3.4. Validação das Metodologias .................................................................................... 40

3.4.1. Recuperação ...................................................................................................... 40

3.4.2. Limites de detecção e quantificação. ............................................................. 41

3.4.3. Curva de calibração .......................................................................................... 41

3.4.4. Linearidade ......................................................................................................... 42

3.4.5. Acurácia e precisão .......................................................................................... 42

3.4.6. Estabilidade ........................................................................................................ 43

3.4.7. Especificidade .................................................................................................... 43

3.5. Outros Estudos Realizados ..................................................................................... 44

3.5.1. Novas condições cromatográficas .................................................................. 44

3.5.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C. ........................................................... 44

3.5.3. Estudos preliminares com plantas presentes nos medicamentos

fitoterápicos ............................................................................................................................. 45

3.5.3.1. Material vegetal ......................................................................................... 45

3.5.3.2. Preparação das amostras ........................................................................ 47

iii

3.5.3.2.1. Preparação de amostras para determinação do comprimento de

onda ......................................................................................................................................... 47

3.5.3.2.2. Preparação de extratos de agoniada ............................................. 47

3.5.3.2.3. Preparação de extratos de Brosimum gaudichaudii .................... 47

3.5.3.2.4. Preparação de extratos de carapiá, mamica de cadela,

Dorstenia multiformes e Brosimum gaudichaudii ............................................................. 48

3.5.3.2.5. Preparação de tinturas por maceração e por percolação de

Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .............................................................. 49

3.5.3.2.6. Hidrólise de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii ... 49

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 50

4.1. Desenvolvimento das Metodologias....................................................................... 51

4.1.1. Soluções orais ................................................................................................... 51

4.1.2. Cápsulas e comprimidos .................................................................................. 59

4.2. Validação das Metodologias .................................................................................... 63

4.2.1. Recuperação ...................................................................................................... 64

4.2.2. Especificidade .................................................................................................... 67

4.2.3. Limites de detecção e quantificação .............................................................. 69

4.2.4. Estabilidade ........................................................................................................ 70

4.2.5. Curva de calibração .......................................................................................... 70

4.2.6. Linearidade do método ..................................................................................... 72

4.2.7. Acurácia e precisão .......................................................................................... 72

4.3. Avaliação das Quantidades Obtidas nos Medicamentos Analisados ............... 75

4.4. Outros Estudos Realizados ..................................................................................... 82

4.4.1. Novas condições cromatográficas .................................................................. 82

4.4.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C ............................................................ 90


fitoterápicos ............................................................................................................................. 90

4.4.3.1. Determinação do comprimento de onda ............................................... 90

4.4.3.2. Comparação de perfis cromatográficos dos extratos de agoniada ... 92

4.4.3.3. Teores de furanocumarinas em Brosimum gaudichaudii ................... 94

4.4.3.4. Comparação entre amostras de carapiá, mamica de cadela,

Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .............................................................. 97

iv

4.4.3.5. Maceração e percolação de Dorstenia brasiliensis e Brosimum

gaudichaudii .......................................................................................................................... 101

4.4.3.6 - Hidrólise de Dortenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii .......... 105

5. CONCLUSÕES ................................................................................................................ 107

6. REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 109

v

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Estrutura básica das cumarinas. ................................................................ 3

Figura 2 – Exemplos de furanocumarinas. .................................................................. 5

Figura 3 – Furanocumarinas preniladas encontradas em Dorstenia brasiliensis. ....... 8

Figura 4 – Exemplos de cumarinas encontradas em Brosimum gaudichaudii. ......... 11

Figura 5 – Pico de CLAE-UV representando uma relação sinal-ruído de 10:1.......... 22

Figura 6 – Curva de calibração por padrão externo. ................................................. 24

Figura 7 – Curva de calibração por adição de padrão na matriz contendo o analito . 25

Figura 8 – Curva de calibração com adição de padrão interno. ................................ 25

Figura 9 – Regressão linear de uma curva de calibração. Reta vermelha, reta ideal

estimada por regressão linear. .................................................................................. 26

Figura 10 - Estrutura das substâncias analisadas ..................................................... 50

Figura 11 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento A

(amostra bruta). ......................................................................................................... 52

Figura 12 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento B

(amostra bruta). ......................................................................................................... 53

Figura 13 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento C

(amostra bruta). ......................................................................................................... 53

Figura 14 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para

quantificação de furanocumarinas do medicamento A. ............................................. 55


quantificação de furanocumarinas do medicamento B. ............................................. 56


quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ............................................. 56

Figura 17 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução para estudos

posteriores do medicamento A. ................................................................................. 57


posteriores do medicamento B. ................................................................................. 57


posteriores do medicamento C. ................................................................................. 58

vi

Figura 20 – Cromatograma obtido da análise por CG-EM da solução para

quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ............................................. 59

Figura 21 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da solução de análise do

medicamento E. ........................................................................................................ 61


medicamento F. ......................................................................................................... 61


medicamento G. ........................................................................................................ 62


medicamento H. ........................................................................................................ 62


medicamento I. .......................................................................................................... 63

Figura 26 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV representativo de

análises de soluções orais. ....................................................................................... 67

Figura 27 –Cromatograma obtido por CG-DIC representativo de análises de

soluções orais. .......................................................................................................... 68


análises de cápsulas e comprimidos. ........................................................................ 68

Figura 29 –. Cromatograma obtido por CG-EM representativo de análises de

cápsulas e comprimidos. ........................................................................................... 69

Figura 30 – Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno

e bergapteno nos diferentes lotes de soluções orais A, B e C por análise em CLAE-

UV e CG-DIC. ............................................................................................................ 77

Figura 31 - Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno,

bergapteno e DT nos diferentes lotes de medicamentos E, F, G, H e I por análise em

CLAE-UV e CG-EM. .................................................................................................. 78

Figura 32 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da extração do

comprimido J. ............................................................................................................ 80

Figura 33 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática

para estudo do perfil cromatográfico do medicamento A (amostra bruta). ................ 83


para estudo do perfil cromatográfico do medicamento B (amostra bruta). ................ 83

vii


para estudo do perfil cromatográfico do medicamento C (amostra bruta). ................ 84

Figura 36 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do

medicamento A (amostra bruta). ............................................................................... 85


medicamento B (amostra bruta). ............................................................................... 86


medicamento C (amostra bruta). ............................................................................... 86

Figura 39 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da

solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento A. ....................... 87

Figura 40 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 da

solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento B. ....................... 87


solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento C. ....................... 88


solução para estudos posteriores do medicamento A. .............................................. 88


solução para estudos posteriores do medicamento B. .............................................. 89


solução para estudos posteriores do medicamento C. .............................................. 89

Figura 45 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição para

quantificação de furanocumarinas, de extrato etanólico de carapiáx. ........................ 91

Figura 46 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição isocrática

para estudo do perfil cromatográfico, de extrato etanólico de carapiáx. .................... 92

Figura 47 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição isocrática

para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniadax. .................. 93


para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniaday. .................. 93


para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniadaz. .................. 94

Figura 50 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV de extrato etanólico de

raiz de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................... 95

viii

Figura 51 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do extrato etanólico de

caule de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................ 95


folhas de Brosimum gaudichaudiix. ........................................................................... 96

Figura 53 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (10 µL da solução final

de 10 mL) do extrato etanólico de lenho da raiz de Brosimum gaudichaudiix. .......... 96

Figura 54 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (5 µL solução final de 25

mL) do extrato etanólico de casca da raiz de Brosimum gaudichaudiix. .................... 97


carapiáx. .................................................................................................................... 98


carapiáy. .................................................................................................................... 98


rizoma de Dorstenia brasiliensisx. ............................................................................. 99


mamica de cadelax. ................................................................................................... 99


raiz de Brosimum gaudichaudiix. ............................................................................. 100


tintura produzida por percolação de Dorstenia brasiliensisx. ................................... 103


tintura produzida por percolação de Brosimum gaudichaudiiy. ................................ 103

Figura 62 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do

medicamento D (amostra bruta). ............................................................................. 104

Figura 63 - Quantidades de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de

amostra) nas amostras de D.brasiliensisx, B.gaudichaudiiy e B.gaudichaudiiz

hidrolisadas e não hidrolisadas. .............................................................................. 106

ix

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Programação de temperatura utilizada em CG-DIC e CG-EM29 .............. 35

Tabela 2 - Informações sobre denominações, lotes, data de fabricação, data de

validade e cidade de aquisição dos medicamentos. ................................................. 37

Tabela 3 - Amostras de plantas adquiridas no comércio de Campo Grande. ........... 46

Tabela 4 - Tempo de retenção (minutos DP) das furanocumarinas em diferentes

equipamentos, empregando as condições de quantificação. .................................... 51

Tabela 5 – Porcentagens de recuperação de psoraleno e bergapteno nas soluções

orais A, B e C (n=15). ................................................................................................ 65

Tabela 6 – Porcentagens de recuperação de psoraleno, bergapteno e DT nas

cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15). .......................................................... 66

Tabela 7 - Limite de detecção e quantificação (μg mL-1) para psoraleno, bergapteno

e DT em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM. .................................................................... 69

Tabela 8 - Dados de regressão linear das curvas de calibração para determinação

quantitativa de psoraleno e bergapteno por CLAE-UV e CG-DIC para soluções orais.

.................................................................................................................................. 71


quantitativa de psoraleno, bergapteno e DT por CLAE-UV e CG-DIC para cápsulas e

comprimidos. ............................................................................................................. 71

Tabela 10 - Acurácia e precisão intradia do método por CLAE para determinação (μg

ml-1)(média DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B e

C (n=12). ................................................................................................................... 73

Tabela 11 - Acurácia e precisão interdia do método por CLAE para determinação (μg

ml-1) (média DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B

e C (n=15). ................................................................................................................ 73


mL-1) (média DP) de psoraleno, bergapteno e DT em amostras de cápsulas e

comprimidos E, F, G, H e I (n=15). ............................................................................ 74

x


mL-1) (média DP) de psoraleno, bergapteno e DT em amostras de cápsulas e

comprimidos E, F, G, H e I (n=15). ............................................................................ 74

Tabela 14 - Quantidade (μg mL-1) (média DP) de furanocumarinas nas soluções

orais empregando o método com CLAE-UV (n=15). ................................................. 75

Tabela 15 - Quantidade (μg/100 mg de cápsula ou comprimido) (média DP) de

furanocumarinas empregando o método com CLAE-UV (n=15). .............................. 76

Tabela 16 - Teores de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de

amostra) extraídos pelo procedimento com álcool etílico absoluto e reextrações com

clorofórmio. .............................................................................................................. 100


amostra) nas tinturas de D.brasiliensisx e B.gaudichaudiiy obtidas por maceração e

percolação. .............................................................................................................. 102

Tabela 18 – Comparação entre as quantidades (μg mL-1) de furanocumarinas

presentes nas tinturas de D.multiformes presentes nas soluções orais A, B, C e D e

as quantidades determinadas nas tinturas de D.brasiliensisX obtidas por maceração

e percolação. ........................................................................................................... 105

xi

LISTA DE ABREVIATURAS

PUVA - Psoralen plus UVA

P.A. - Pureza analítica

CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência

CLAE-UV - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de ultravioleta

CLAE-DAD - Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de

fotodiodos.

CG - Cromatografia em fase gasosa

CG-DIC – Cromatografia em fase gasosa com detector de ionização de chama

CG-EM - Cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas

UV - Ultravioleta

UVA - Ultravioleta A

RNA - Ácido ribonucleico

DNA – Ácido desoxirribonucleico

m – massa

v – volume

xii

RESUMO

A fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que tem crescido notadamente

nestes últimos anos, criando a necessidade de garantir a eficácia, segurança e

qualidade dos medicamentos fitoterápicos. O presente estudo desenvolveu

metodologias para determinação de furanocumarinas em medicamentos fitoterápicos

empregando CLAE-UV. Foram analisados medicamentos fitoterápicos na forma de

soluções orais, cápsulas e comprimidos, os quais foram formulados, empregando

espécies de Dorstenia ou Brosimum entre outras associações. Sete deles são

indicados para tratamento de distúrbios menstruais ou menopausa. Três deles são

utilizados para tratamento do vitiligo. Apenas um dos medicamentos possui

informação sobre a presença de uma furanocumarina em sua composição nas bulas

ou folhetos. Os métodos otimizados foram validados segundo as normas da

International Conference on Harmonization, mostrando boa especificidade, acurácia,

precisão e linearidade. O estudo interequipamento utilizando CG-DIC para soluções

orais e CG-EM para cápsulas e comprimidos, não revelou diferenças estatísticas

significativas. Devido a grande variedade das formulações dos medicamentos

utilizados no desenvolvimento e validação dos métodos, sugere-se que estes

possam ser utilizados para análise de psoraleno, bergapteno e 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-

dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona em outras

formulações de fitoterápicos presentes no mercado. O estudo do perfil

cromatográfico dos medicamentos foi realizado em condições isocráticas e em

gradiente por CLAE-UV. Foram determinadas furanocumarinas em nove

medicamentos analisados, o que oferece riscos à saúde pública devido ao

desconhecimento da presença destas substâncias, na maioria destes produtos.

Além disso, a furanocumarina encontrada em maior quantidade nos medicamentos

estudados foi o psoraleno, considerado mais tóxico que a xantotoxina, normalmente

prescrita pelos médicos para tratamento de doenças de pele. O uso de fitoterápicos

contendo furanocumarinas no tratamento de distúrbios menstruais pode ser

considerado de alto risco se for considerada a relação risco-benefício, pois se

acredita que sejam indicados pelas propriedades anticoagulantes das cumarinas

presentes nas plantas da formulação. Realizou-se também o estudo do perfil

cromatográfico e dosagem de furanocumarinas em plantas presentes nas

formulações dos medicamentos, utilizando tanto amostras adquiridas no comércio

como amostras identificadas.

xiii

ABSTRACT

The phytoterapy constitutes a form of medical therapy that notably have

been growing in the last years, creating the necessity to guarantee the effectiveness,

security and quality of phytomedicines. The present study has the development of

methodologies for the determination HPLC of furanocoumarins in phytomedicines.

Four oral solutions, three capsules and three tablets, all formulated using species of

Dorstenia or Brosimum among others associations, were analyzed. Seven of them

are indicated for the treatment of menstrual irregularities and disturbances related to

menopause. The other three are used for the treatment of vitiligo. Only one of the

medicines showed the information on the presence of furanocoumarin in its

composition. The optimized methods were validated according to the International

Conference of Harmonization, showing good specificity, accuracy, the inter- and

intra-day precision and linearity. The inter-equipment study was performed using GC-

FID for oral solutions and GC-MS for capsules and tablets. They did not displayed

significant statistic differences. Due to the great variety in the formulations of the

medicines used in the development and validation of the methods, it is suggested

that they can be used for analysis of psoralen, bergapten and 5-[3-(4,5-Dihydro-5,5-

dimethyl-4-oxo-2-furanyl)-butoxy]-7H-furo[3-2-g][1] benzopyran-7-one in the

formulation of other phytomedicines found at commerce. The study of the

chromatographic profile of medicines was evaluated in isocratic and gradient runs by

HPLC-UV. Furanocoumarins were detected in nine of the medicines analyzed. The

lack of knowledge of the presence of these substances in most of the analyzed

products offers risks to the public health. Moreover, psoralen was the furanocoumarin

found in the largest amount. Psoralen is considered more toxic than xanthotoxin,

which is normally prescribed by doctors on the treatment of skin illnesses. If we

consider the relation risk-benefit on the treatment of menstrual riots, the use of

phytomedicines containing furanocoumarins can be of high risk, since it is believed

that they are indicated because of the anticoagulation properties of coumarins found

on the plant’s formulation. The study of the chromatographic profile and dosage of

furanocoumarins in the plants found at the medicines’ formulation was also made,

using identified samples and samples acquired at commerce.

Introdução

Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em Medicamentos Fitoterápicos.

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Introdução Geral

A fitoterapia, uma forma de terapia medicinal, tem crescido notadamente

nestes últimos anos, ao ponto que, atualmente, o mercado mundial de fitoterápicos

gira em torno de aproximadamente 22 bilhões de dólares1.

As plantas medicinais representaram, durante séculos, a única fonte de

agentes terapêuticos para o homem. No início do século XIX, com o

desenvolvimento da química farmacêutica, as plantas passaram a representar a

primeira fonte de substâncias para o desenvolvimento de medicamentos.

Atualmente, 25% dos medicamentos prescritos nos países industrializados são

originários de plantas e 120 substâncias de origem natural são obtidas a partir de

cerca de 90 espécies de plantas utilizadas na terapia moderna. De fato, os produtos

naturais estão envolvidos no desenvolvimento de 44% de todas as novas drogas2.

A partir de 2001, houve um ressurgimento do interesse nas plantas como

fonte de novos agentes terapêuticos. Grandes companhias farmacêuticas

aumentaram suas pesquisas com extratos de plantas para descobrir novas

substâncias ativas. Existem na Terra aproximadamente 350.000 espécies de

plantas, mas apenas uma pequena porcentagem foi investigada do ponto de vista

fitoquímico, e um número ainda menor de frações derivadas dessas plantas foi

analisada do ponto de vista farmacológico3.

Na União Européia (sobretudo na Alemanha, França e Bélgica, países

com maior tradição de consumo de fitoterápicos), o rigor da legislação e vigilância

sanitária sobre os fitoterápicos é praticamente similar à exercida sobre os demais

medicamentos. Os consumidores vêem os fitoterápicos como uma alternativa

terapêutica menos agressiva ao organismo que um similar sintético, mas exigem de

um fitoterápico a mesma qualidade (garantia de autenticidade, da presença do teor

Introdução


2

correto de princípios ativos, de boas condições de conservação e outros) buscada

nos medicamentos sintéticos4.

No Brasil, as plantas medicinais são consideradas “remédios de baixo

custo”, o que no país é encarado como sinônimo de má-qualidade4. Grande parte

das espécies vegetais utilizadas pela população do Brasil não possui ação

farmacológica comprovada, estudo químico realizado e nem mesmo estudos

toxicológicos5.

As plantas medicinais estão sujeitas a variações de sua composição

química como alteração do teor de princípios ativos ou surgimento de novas

substâncias devido a diversas variáveis a que estão dispostas durante seu

crescimento (fatores genéticos, climáticos, ecológicos etc.), sua coleta (época, etc.),

secagem (temperatura, tempo, etc.), armazenamento e processo de extração.

Devido à grande variabilidade na composição química das plantas medicinais, há a

necessidade de padronização dos fitoterápicos4.

Um fitoterápico padronizado é o que apresenta teor conhecido dos

princípios ativos e se enquadra dentro de critérios estabelecidos para a planta

medicinal em questão. Apresenta substâncias “marcadoras” características, mas

também não apresentam substâncias estranhas3,4 O ideal para elaboração de um

fitoterápico é o uso de, no máximo, uma ou duas drogas ou extratos vegetais, tendo

estes ação farmacológica e toxicidade conhecidas5.

As principais fraudes e/ou problemas na qualidade dos fitoterápicos são:

substituição de uma determinada espécie por outra semelhante, que pode não ter

efeitos farmacológicos similares; adulteração de parte ou do todo da planta por outra

espécie ou com outro material; desconsideração do prazo de validade do

fitoterápico; contaminação exógena com micotoxinas, metais pesados ou

pesticidas4. O uso de análises cromatográficas, utilizando o cromatograma como a

“impressão digital” de uma determinada amostra, pode ajudar na identificação de

amostras autênticas e auxiliar na identificação de possíveis compostos utilizados em

uma adulteração da mesma3.

Introdução


3

1.2. Furanocumarinas

As cumarinas (Figura 1) são metabólitos secundários muito comuns

presentes em plantas, sendo encontradas também em fungos e bactérias,

totalizando 800 diferentes estruturas determinadas. Estruturalmente, são lactonas do

ácido о-hidroxi-cinâmico (2H-1-benzopiran-2-onas), sendo o representante mais

simples a cumarina (1,2-benzopiranona)7.

Figura 1 – Estrutura básica das cumarinas.

Dentro da classe de cumarinas, encontram-se as furanocumarinas. Estas

substâncias são formadas pela condensação de um anel furânico com um núcleo

cumarínico8 e podem ser de ocorrência natural ou sintéticos9. Estes metabólitos

podem ser também fitoalexinas, já que sua formação é muitas vezes induzida na

planta em resposta a um estímulo, particularmente pela infecção por fungos10.

Furanocumarinas têm várias atividades biológicas importantes como:

analgésica, antiinflamatória, antibacteriana, antiviral, anticoagulante, além dos bem

conhecidos efeitos fotosensibilizantes11. São também interessantes porque são

usadas como um probe em biologia molecular e química dos ácidos nucléicos9.

As furanocumarinas têm sido usadas desde tempos remotos no

tratamento de doenças de pele como a psoríase, micoses fúngicas, dermatites e

eczema. Embora a utilização de plantas contendo furanocumarinas para propósitos

medicinais datem de 2000 a.C., atualmente o aumento no uso destas substâncias na

medicina tem sido ligado à alta incidência de câncer de pele e outras desordens,

Introdução


4

assim como trocas entre cromátides irmãs, mutação gênica e aberrações

cromossômicas em humanos12.

As furanocumarinas, como a maioria das cumarinas, são substâncias que

absorvem fortemente energia na região do ultravioleta (UV) e, por isso, são

altamente reativas sob incidência de luz. A faixa de comprimento de onda para essa

fotorreatividade situa-se entre 300 e 400 nm (UVA). Após a absorção do fóton, as

furanocumarinas formam um estado tripleto excitado, que pode reagir com

moléculas, tais como as bases nitrogenadas do DNA ou com o oxigênio no estado

fundamental. Disso resulta a formação de oxigênio singlete ou radicais tóxicos, como

os radicais superóxido ou hidróxi. Essas moléculas podem reagir com DNA, RNA,

proteínas e lipídios, ocasionando lesões nas células que os contêm. As

furanocumarinas têm especial habilidade em se ligar à bases pirimídicas do DNA

causando mutações12.

Furanocumarinas lineares, são compostos fotosensibilizantes comumente

empregados em dermatologia (oral ou topicamente), que associadas com irradiação

ultravioleta A (UVA) são usadas no tratamento de doenças de pele13. Psoraleno,

bergapteno (também denominado 5-metoxipsoraleno ou 5-MOP), e xantotoxina

(também denominado 8-metoxipsoraleno ou 8-MOP) são exemplos de

furanocumarinas (Figura 2).

Os distúrbios cutâneos de maior importância tratados com psoralenos

são: o vitiligo (um distúrbio de pigmentação devido à perda de melanócitos da

epiderme) e a psoríase (caracterizada pela proliferação aumentada das células

epidérmicas)14.

A combinação dos elementos: psoralenos + UVA é conhecida como

terapia PUVA13. Dependendo da dose, esta ligação pode levar tanto à morte da

célula como à replicação, síntese e reparo do DNA15,16. O fotosensibilizador

geralmente mais usado é xantotoxina (8-MOP)17.

Introdução


5

Figura 2 – Exemplos de furanocumarinas.

A xantotoxina pode também interagir com o DNA na presença de UVA,

formando fotoprodutos que causam a inibição da síntese de DNA celular. Acredita-se

que este mecanismo pode explicar o efeito benéfico do PUVA nas desordens

proliferativas como psoríase13. Na terapia PUVA, várias células são afetadas,

inclusive linfócitos circulantes no sangue periférico, promovendo alívio de muitas

doenças que são associadas a desordens imunológicas15.

Além das furanocumarinas já citadas, a isopimpinelina (5,8-

dimetoxipsoraleno) e o 4,5,8-trimetilpsoraleno também podem intercalar-se com o

DNA na presença de luz UV18.

Dentre as furanocumarinas, o 4,5,8-trimetilpsoraleno é considerado o

mais fototóxico19,20, seguido por psoraleno, bergapteno e xantotoxina21, enquanto

isopimpinelina não é considerada uma furanocumarina fototóxica e também é

considerada muito menos reativa22.

Introdução


6

Apesar do tratamento com a utilização de psoralenos (fotoquimioterapia

ou PUVA) ter importante atividade terapêutica, os pacientes estão sujeitos a

indesejáveis efeitos colaterais, tanto a curto prazo (eritema, hiperpigmentação,

genotoxicidade) como a longo prazo (catarata, risco de câncer de pele)9, o que têm

feito médicos e pacientes relutantes ao seu uso23. Mesmo 15 anos após a

interrupção do tratamento não há significante decréscimo do risco de

desenvolvimento de câncer de pele24.

A exposição à luz ultravioleta deve ser atentamente supervisionada, pois

existem relatos de casos de queimaduras de 6-40% do corpo em crianças com

vitiligo que estavam em tratamento com óleo meladinina (mistura de 8-MOP e 8-

isoamileno-oxi-psoraleno) devido à exposição não supervisionada ao Sol enquanto

brincavam ao ar livre25. Outros casos de queimaduras de 90-95% do corpo de jovens

pelo uso indiscriminado de furanocumarinas no intuito de adquirir um rápido

bronzeamento26. Foram relatados também, casos de desenvolvimento de lesões

bolhosas na pele após a exposição de um indivíduo ao óleo aromaterapêutico de

bergamota (que contém bergapteno)27 em sauna, seguida de exposição à radiação

UVA em salão de bronzeamento28.

Quantidades baixas de furanocumarinas, como 18 ppm, podem causar

lesões, dependendo das condições de exposição à luz UV22. Por esta razão, é muito

importante conhecer precisamente os níveis de furanocumarinas em medicamentos

fitoterápicos e plantas utilizadas pelo ser humano.

Na literatura podemos encontrar métodos de dosagem de

furanocumarinas no plasma27 e na derme de pacientes que utilizam a

fotoquimioterapia13. Também já estão descritos métodos validados de quantificação

de furanocumarinas em pomadas, cremes29, soluções tópicas30 e alguns métodos

não validados de dosagem em plantas31,32 e seus decoctos22.

Introdução


7

1.3. Plantas contendo furanocumarinas

Várias famílias de plantas são conhecidas como produtoras de

furanocumarinas, dentre as quais podemos citar: membros da família Apiaceae

(aipo, por exemplo), Rutaceae (plantas cítricas, por exemplo) e Moraceae11. Os

gêneros da família Moraceae são Sorocea, Clarisia, Maclura, Pseudolmedia,

Helicostylis, Naucleopsis, Brosimum, Dorstenia, Ficus, Coussapoa, Pourouma e

Cecropia 33. Os medicamentos fitoterápicos estudados neste trabalho apresentam os

gêneros Dorstenia e Brosimum em suas composições.

1.3.1. Dorstenia

O gênero Dorstenia Linne (Moraceae) é representado por 170 espécies

em todo o mundo34,35, sendo 37 espécies brasileiras. Quase todas as espécies do

gênero Dorstenia são herbáceas e campestres, geralmente crescendo em locais

sombreados33. Há espécies que se destacam pela beleza ornamental e outras pelos

rizomas aromáticos. A maioria se concentra no Brasil-sudeste à beira dos riachos e

grotões rochosos36.

A maior parte é conhecida pela medicina popular como “carapiá” ou

“figueirilha”31. Estas plantas estão distribuídas nas regiões subtropicais do mundo e

são conhecidas pela habilidade de sintetizar psoraleno, bergapteno, isobergapteno,

pimpinelina e isopimpinelina37.

O gênero Dorstenia é usado em terapia de plantas medicinais em muitos

países na África e América do Sul e Central como antiofídico e anti-reumático, além

do uso em infecções e doenças de pele30,38. O estudo das toxinas fotoativadas

revelou a ocorrência de fototoxinas em todas as espécies de Dorstenia investigadas.

Furanocumarinas foram isoladas em trabalhos com rizomas/raízes ou plantas brutas

de Dorstenia da América Latina como: Dorstenia contrajerva39,40, D. brasiliensis41, D.

asaroides31, D. brynoniifolia37,42, D. lindeniana43,34, D. vitifolia, D. tubicina41,32,

D.cayapiaa7, D. heringeri44, D.excentria, D.drakena e D. lindeniana43 assim como

Introdução


8

das espécies africanas D.psilurus45 e D.barnimiana46 e D. poinsettifolia47.

Furanocumarinas também foram encontradas em galhos de D. prorepens35 e D.

gigas34 e em folhas de D. gigas34.

Estruturalmente, as furanocumarinas em Dorstenia apresentam-se pouco

diversificadas, havendo predomínio de furanocumarinas angulares ou lineares

simples tais como bergapteno, psoraleno, isopimpinelina, pimpinelina, isobergapteno

etc. As exceções são três furanocumarinas preniladas encontradas em D. cayapiaa -

5-[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)butoxi-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona,

D.brasiliensis – 5-[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)butoxi-7H-furo[3-2-

g][1]benzopiran-7-ona (Figura 3, estrutura a) e o análogo insaturado 5-[[3-(4,5-diidro-

5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil) 2-butenil-]oxi]-7H-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona (Figura

3, estrutura b)41 e D.contrajerva – 4-[[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)-

butil]oxi]-7H-furo[3,2-g][1]benzopiran-7-ona43.

Figura 3 – Furanocumarinas preniladas encontradas em Dorstenia brasiliensis.

Estudos fitoquímicos do gênero relatam ainda a ocorrência de

cardenolídios48, triterpenos37, ácidos graxos42, esteróides41, diferentes

benzofuranos46 e vários flavonóides geranilados e prenilados49,50.

Introdução


9

1.3.1.1. Dorstenia multiformes

Dorstenia multiformes é a espécie descrita na Farmacopéia Brasileira51

com os nomes de carapiá, caapiá e contra-herva. Segundo esta, a parte usada é o

rizoma, para produção de extrato fluído de carapiá.

Na literatura52 podemos encontrar também a denominação de cayapiá-

preto para a espécie. Possui caule curto, rasteiro e em parte subterrâneo,

densamente estipulado, folhas longo-pecioladas, muito variáveis na forma, flores

pequeninas e frutos castanhos. Encontrada da Bahia até o Rio Grande do Sul e

Minas Gerais.

Possui variedades, como D.multiformes var. arifolia, ceratosanthes,

ficifolia, pinnatifida e ramosa36. Não há trabalhos na literatura sobre a composição

química da espécie D. multiformes. A espécie pode ser encontrada53,54 como

sinonímia científica de Dorstenia brasiliensis.

1.3.1.2. Dorstenia brasiliensis

É uma planta herbácea perene, nativa do Brasil, encontrada em São

Paulo, Goiás, Mato Grosso, Bahia, Pernambuco e, principalmente, em Minas Gerais

e Rio Grande do Sul. Conhecida como cayapiá verdadeiro, é a mais importante do

gênero, sob o ponto de vista terapêutico e a única admitida na farmacopéia de vários

países52. Tem folhas compridas e de bordas arredondadas, nascendo bem próximas

ao solo, e flores pequenas, divididas em masculinas e femininas, dispostas em forma

de pendão55. Rizoma cilíndrico, ovóide, curto, aromático, fibriloso, amarelado52.

Possui variedades, como D. brasiliensis var. mayor, palustris, tomentosa e typica36.

D. brasiliensis é conhecida no Brasil como carapiá, caiapiá ou contra-erva

e as cascas de sua raiz têm sido usadas na medicina popular para o tratamento de

doenças do sistema digestivo, febre tifóide56,55, como antiofídico, nas leucorréias, em

enfermidades na pele, em irregularidades menstruais como dismenorréia e

Introdução


10

amenorréia55,57 e na solidificação de ossos fraturados52, em mistura com a taiuiá

(Trianosperma tayuya)55.

Há apenas dois trabalhos sobre o isolamento de furanocumarinas da

espécie41,56 que identificaram psoraleno, bergapteno, 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-

oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona, 5-[[3-(4,5-diidro-5,5-dimetil-

4-oxo-2-furanil)-2-butenil-]oxi]-7h-furo[3-2-g][1]benzopiran-7-ona), (2’S,3’R)-3’-

hydroximarmesina 4’-O-β-D-glucopiranosida, (2’S)-marmesin 4’-O-α-L-

rhamnopiranosil (1→6)-O-β-D-glucopiranosida, (2’S,3’R)-3’-hydroximarmesina, 2’-(1”-

hidroxi-1”-metiletil)-psoraleno, 7-hydroxicumarina, 3-O-β-glucosilsitosterol, sucrose,

esteróides, diterpenóides e triterpenóides das raízes/rizomas da espécie. Os

triterpenóides (ácidos dorstênicos A e B) isolados de D. brasiliensis, apresentaram

moderada citoxicidade sobre células da leucemia (L-1210 e HL-60)56.

O nome popular “carapiá” também é encontrado referindo-se a outras

duas espécies: Cordia superba Cham.58 da família Boraginaceae, encontrada no Rio

de Janeiro, Minas Gerais e São Paulo e Sida macrodon52, da família das Malváceas.

A primeira espécie também pode ser encontrada com os nomes de árvore de ranho

e grão de galo e a segunda, como malva do campo.

1.3.2. Brosimum gaudichaudii

Brosimum gaudichaudii é uma espécie conhecida como “mamica de

cadela”. Utilizada em doenças de pele devido às furanocumarinas59. É nativa do

cerrado brasileiro, com uma ampla distribuição por todo o Brasil central60. Análises

da casca da raiz de B. gaudichaudii identificaram derivados dos ácidos cinâmicos e

diidrocinâmico, dez cumarinas (dentre elas psoraleno, bergapteno, xantiletina,

luvangetina e (+)-(2’S,3’R)-1’-hidroximarmesina) (Figura 4), uma chalcona, os

esteróides: β-sitosterol e 3-β-O-β-D-glicopiranosil- β-sitosterol e o triterpeno β-

amirina61,62.

Introdução


11

Figura 4 – Exemplos de cumarinas encontradas em Brosimum gaudichaudii.

Extratos da casca do caule de B.gaudichaudii mostraram atividade

mutagênica no teste com Salmonella typhimurium e em células do ovário de hamster

chinês (CHO)63.

O nome popular “mamica de cadela” também é encontrado referindo-se

às espécies Zanthoxylum rhoifolium Lam. e Zanthoxylum riedelianum Eng. da família

Rutaceae. Ambas são também conhecidas como mamica-de-porca e tembetari58.

1.4. Medicamentos Fitoterápicos

Os medicamentos presentes no mercado contendo plantas do gênero

Dorstenia são quase que exclusivamente compostos pela espécie Dorstenia

multiformes. As indicações são diversas, devido os vários usos populares da espécie

e as diversas indicações descritas nos medicamentos que a contêm:

os diversos usos populares do carapiá: antiofídico, tratamento de

irregularidades menstruais, ossificação de ossos fraturados etc;

a associação da espécie a diversas outras na constituição dos

medicamentos: D. multiformes está presente em soluções orais para inibição do

crescimento de pêlos (associada à Foeniculum vulgaris, Trigonella foenum-graecum

e Plumeria lancifolia), em soluções orais antitussígenas (associada à Passiflora

alata), em formulações homeopáticas reguladoras do sistema nervoso (associada a

Introdução


12

Carica pagaya, Acanthus volubilis e Mimosa virginalis), para tratamento das

irregularidades menstruais, tensão pré-menstrual e inflamação do útero e ovários,

(associada à Plumeria lancifolia), e em soluções orais e cápsulas para tratamento

das irregularidades menstruais e corrimentos vaginais (associada à Plumeria

lancifolia e Davilla rugosa) e contra os efeitos da menopausa (associada à Plumeria

lancifolia, Erythrina mulungu, Cereus grandiflorus).

Nenhum dos medicamentos fitoterápicos pesquisados, que contêm

Dorstenia, informava sobre a presença de furanocumarinas ou mesmo a

possibilidade de fotosensibilização pela exposição ao Sol durante o uso do

medicamento ou de seus efeitos tardios pelo uso prolongado. A maior parte deles

informava apenas as partes de cada planta utilizada e algumas classes de

substâncias presentes tais como flavonóides, saponinas, taninos etc. Apenas alguns

dos medicamentos informavam a presença de cumarinas em algumas das plantas

presentes e sua ação anticoagulante, sem se referir, como já dito, a

furanocumarinas.

1.4.1. Outras plantas presentes nos medicamentos estudados

1.4.1.1. Davilla rugosa

Davilla rugosa Poiret (Dilleniaceae) é conhecida no Brasil como cipó-

caboclo. Cresce em zonas tropicais e subtropicais no Brasil, Cuba, Nicarágua, Peru

e Chile. A espécie é mundialmente empregada como antiinflamatório, anti-úlcera,

purgativo, estimulante, afrodisíaco e droga tônica64. Segundo a medicina popular,

suas folhas possuem propriedades adstringentes, diuréticas e colagogas, a raiz

purgativa e drástica, os ramos excelente diurético e as sementes, violento efeito

emético-catártico55.

Flavonóides tais como miricetina, quercetina, miricetina-3-O-β-D-

ramnosideo, quercetina-3-O-β-D-ramnosideo e canferol foram isolados das folhas e

o alcalóide cafeína foi isolado das sementes. Estudos dos efeitos das frações do

extrato hidroalcoólico do caule de D.rugosa em lesões gástricas em ratos sugerem a

Introdução


13

atividade antiúlcera64. As frações mais polares do extrato da planta sugerem efeito

estimulante na atividade motora65. Um efeito ansiolítico foi observado com o extrato

hidroalcoólico inteiro65.

O Doliscarpus pubens, uma espécie das Dileniáces, é chamada de cipó-

caboclo-venenoso ou cipó-vermelho sendo seus frutos tóxicos e sua casca útil

contra febres palustres55.

1.4.1.2. Plumeria lancifolia

O gênero Plumeria originou-se da América Central e suas espécies são

mundialmente distribuídas em países tropicais66. Plumeria lancifolia Müll

(Apocynaceae) é conhecida na medicina popular como “agoniada” sendo

empregada como febrífuga, emenagoga, purgativa67, auxiliar da concepção e

regularizador da menstruação55. O extrato mostrou possuir atividade antiúlcera.

Desta espécie foram isolados iridóides, uleína e dimetoxiaspidospermina67.

1.4.1.3. Erythrina mulungu

Erythrina mulungu Mart., vulgarmente conhecida como mulungu,

mulungu-coral, tiricero, capa-homem e suína-suinã, é uma planta espinhenta

encontrada em Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso do Sul, São Paulo e na floresta

latifoliada semidecídua da bacia do Paraná58. Na medicina popular, o extrato da

casca é usado em banhos para acalmar a excitação do sistema nervoso e também

para combater insônias. O cozimento das cascas é utilizado em bronquites

asmáticas e nas inflamações do fígado e do baço57. Extrato hidroalcoólico de

Erythrina mulungu apresentou efeitos antinociceptivos em ratos68. Foram isolados

alcalóides69.

1.4.1.4. Cereus jamacaru

Cereus jamacaru, da família das Cactáceas, é um arbusto que vegeta em

Pernambuco e outros Estados do norte do Brasil. É vulgarmente conhecida como

Introdução


14

jamacaru, urumbeva e cumbela. É utilizada pela medicina popular em tratamento de

problemas nas vias respiratórias, como bronquites, afecções pulmonares e tosses

persistentes. Usa-se também contra o escorbuto e febres gástricas. Externamente,

em cataplasmas, é utilizada no tratamento de úlceras e tumores70.

1.5. Legislação de Fitoterápicos

O primeiro ato normativo de expressão referente às plantas medicinais no

Brasil, foi a publicação da primeira edição da Farmacopéia Brasileira51, que refletia

as características da terapêutica da época, fundamentada em fitoterápicos e

produtos biológicos, oficializando a utilização de plantas medicinais como matéria-

prima farmacêutica71.

A profissão farmacêutica e seu exercício foram normatizados através do

Decreto nº 19606 de 19 de janeiro de 1931. Este decreto foi regulamentado pelo

Decreto nº 20377 de 08 de setembro do mesmo ano, que marca o início formal das

atividades de vigilância sanitária no país71.

Com relação aos procedimentos de registro de medicamentos, o Decreto

nº 19606 estabeleceu exigência de licença, que corresponde hoje ao registro, no

órgão nacional de saúde antes de serem entregues ao consumo; estabeleceu ainda

uma classificação dos medicamentos em oficiais e especialidades farmacêuticas,

liberando os primeiros da necessidade de licença, sem definir o que seriam tais

produtos, quais os limites dessa liberalização e os critérios ao controle administrativo

e de qualidade. Determinava também, a apreensão e inutilização de plantas

medicinais sob classificação botânica falsa ou desprovidas de ação terapêutica.

Esses decretos estabeleciam o comércio direto de plantas medicinais de aplicações

terapêuticas com o consumidor, como privativo de farmácias e ervarias71.

No Brasil, houve então a constituição do Grupo de Estudos de Produtos

Fitoterápicos (GEPFITO) em 1994, posteriormente alterada pela CONAFIT em 1998.

Introdução


15

O primeiro trabalho do GEPFITO foi a publicação de normatização de registro de

produtos fitoterápicos por meio de uma proposta aberta de consulta pública em

1994, que resultou na Portaria SVS nº 6 de 31 de janeiro de 199571.

A Portaria SVS nº 6 conceituou os fitoterápicos como medicamentos

preparados exclusivamente por matérias ativas oriundas de plantas medicinais,

obedecendo integralmente aos requisitos técnicos para a preparação farmacêutica e

o uso terapêutico; padronizou os conceitos e termos técnicos próprios da área;

estabeleceu padronização para qualquer fitoterápico, a cerca dos critérios de

segurança e eficácia baseado em modelos farmacológicos adequados; fixou normas

de qualidade para a matéria-prima, processamento e para o produto final. No pedido

de registro, a empresa deveria apresentar as técnicas desenvolvidas para o controle

de qualidade72.

A Portaria SVS nº 6 foi aprimorada em alguns de seus itens pela SVS nº

1.029/98, cuja maior finalidade é o procedimento diferenciado ao registro de

produtos fitoterápicos tradicionais71.

A norma vigente, durante o desenvolvimento deste trabalho, sobre o

registro de medicamentos fitoterápicos, foi a RDC nº 17 de 25 de fevereiro de

200073, que dispõe sobre registro de medicamentos fitoterápicos, não só nacionais,

mas também importados. Regulariza o conceito de medicamento fitoterápico e

define como devem ser industrializados, embalados e comercializados em nosso

país. Apresenta o regulamento técnico que trata de medicamentos fitoterápicos

novo, tradicional e com base na similaridade; da isenção de registro; da revalidação

do registro de fitoterápicos registrados até 31 de janeiro de 1995; da embalagem e

bula dos medicamentos. Para os medicamentos fitoterápicos importados, estabelece

que devem cumprir os mesmos requisitos previstos neste regulamento e na

legislação específica em vigor.

O ano de 2002 apresentou várias consultas públicas74 que sugeriam

mudanças no que se refere à legislação brasileira de medicamentos fitoterápicos. Na

Consulta Pública nº 59 de 12 de agosto, sugeriu-se alterações na Resolução nº

Introdução


16

17/2000. As seguintes Consultas Públicas: nº 61/2002 e nº 84/2002 sugeriam

atualização da normatização de registro de medicamentos fitoterápicos junto ao

Sistema de Vigilância Sanitária. A Consulta Pública nº 84/2002 é por sua vez,

complementada pelas Consultas Públicas nº 87/2002 e nº 88/2002 que trazem guias

para a realização de alterações, inclusões e notificações pós-registro de

medicamentos fitoterápicos e um guia para notificação de Lotes-Piloto de

medicamentos. Estas consultas públicas, publicadas em outubro de 2002, não se

transformaram em legislações em função das grandes controvérsias ainda

existentes sobre o assunto. A Consulta Pública nº 94 de 6 de novembro de 2003

resultou na Resolução RDC nº48 de 16 de março de 200474.

A Resolução RDC nº 4875 visa atualizar a normatização do registro de

medicamentos fitoterápicos. Este regulamento abrange medicamentos cujos

princípios ativos são exclusivamente derivados de drogas vegetais. Segundo a

resolução, não é objeto de registro ou cadastro planta medicinal ou suas partes,

após processos de coleta, estabilização e secagem, podendo ser íntegra, rasurada,

triturada ou pulverizada.

Segundo a nova resolução, a partir de 360 dias contados de sua

publicação, todos os testes referentes a controle de qualidade (quando

terceirizados), deverão ser executados em instituições credenciadas no sistema

REBLAS - Rede Brasileira de Laboratórios em Saúde ou por empresas fabricantes

de medicamentos que tenham certificado de BPFC (Certificado de Boas Práticas de

Fabricação e Controle emitido pela ANVISA) atualizado e satisfatório. A partir desta

data, a apresentação dos resultados destes testes será exigida pela ANVISA no

registro e na renovação do registro.

Estabelece também um regulamento técnico mais criterioso para os

fitoterápicos quanto a medidas antecedentes ao registro, ao pedido de registro e

medidas pós-registro. Em relação à legislação anterior, a nova resolução em

demonstra mais detalhamento nas exigências sobre controle de qualidade química,

estudos de toxicidade, eficácia e indicações terapêuticas dos medicamentos

fitoterápicos.

Introdução


17

1.6. Técnicas Instrumentais de Análise

As aplicações da cromatografia cresceram de modo explosivo nos últimos

cinqüenta anos e isto se deve não somente ao desenvolvimento de novos tipos de

técnicas cromatográficas, mas também à necessidade crescente dos cientistas de

melhores métodos para caracterizar misturas complexas76.

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é a mais usada de todas

as técnicas analíticas de separação devido a sua sensibilidade, fácil adaptação para

determinações quantitativas acuradas, sua adequação à separação de espécies

não-voláteis ou termicamente frágeis e, acima de tudo, sua ampla aplicabilidade a

substâncias de grande interesse para indústria, para muitos campos da ciência e

para o público. Exemplos desses materiais incluem: aminoácidos, ácidos nucléicos,

pesticidas, drogas e muitas substâncias inorgânicas76.

Na última década, a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi

uma das técnicas mais utilizadas para análise e isolamento de produtos naturais a

partir de matrizes complexas, por exemplo, extratos de plantas. A CLAE tem sido

utilizada de maneira rotineira como “piloto” para o isolamento em escala preparativa

de produtos naturais pela otimização das condições experimentais, pelo controle de

diferentes frações obtidas durante o isolamento e pelo controle da pureza final dos

compostos isolados3.

Detectores baseados em absorção de luz ultravioleta (UV), fluorescência,

índice de refração, difração de luz e eletroquímica proporcionam boa detecção e

sensibilidade. Uma desvantagem, apesar do custo menor desses detectores em

relação aos detectores de espectrometria de massas (EM) e ressonância magnética

nuclear (RMN), é a pouca ou nenhuma informação estrutural fornecida3.

A introdução das técnicas de acoplamento, tais como CLAE-UV equipada

com detector com arranjo de fotodiodos (CLAE/UV-DAD) e o acoplamento com a

espectrometria de massa (CLAE-EM) e ressonância magnética nuclear (CLAE-RMN)

Introdução


18

proporcionou um real avanço na identificação estrutural, em linha, de produtos

naturais3.

A cromatografia em fase gasosa (CG) é muito utilizada na realização de

separações com relação a sistemas bioquímicos, complexos orgânico-metálicos ou

orgânicos, constituídos de espécies voláteis ou de espécies que podem reagir e

formar produtos voláteis76. Dentre os detectores mais usados estão o de

condutividade térmica, ionização por chama e captura de elétrons. O detector de

ionização por chama é excelente na análise destes compostos orgânicos em nível

de traços devido à seletividade por esses compostos77.

A cromatografia em fase gasosa (CG) possui detectores universalmente

aplicáveis como detectores de ionização por chama e de condutividade térmica78. Os

detectores da CLAE não possuem esta característica.

Uma tendência importante é o acoplamento com a espectrometria de massa

(CG-EM)76, apesar de seu alto custo se comparado com outros detectores

empregados nesta técnica.

1.7. Validação de Métodos Analíticos

A validação de um método analítico é realizada para garantir que uma

metodologia analítica seja exata, específica, reproduzível e robusta dentro de uma

faixa de aplicação em que o analito será analisado79,80. Assegura credibilidade às

medidas obtidas80,81,82. Tem se tornado requisito indispensável para publicação de

novas metodologias, tendo alguns periódicos83 publicado os parâmetros mínimos de

validação.

A validação permite que a transferência de um método entre laboratórios

ocorra da forma mais satisfatória82, pois avalia a influência de parâmetros como

mudança de temperatura, pH, analistas, equipamentos, entre outros parâmetros no

Introdução


19

resultado final de uma análise. Os mesmos princípios gerais podem ser aplicados

com sucesso em métodos cromatográficos e não cromatográficos84.

As normas internacionais, nacionais e sistemas de qualidade destacam a

importância da validação de métodos analíticos e a documentação do trabalho de

validação para a obtenção de resultados confiáveis e adequados ao uso

pretendido85.

Para validação de métodos analíticos, guias da US Food and Drug

Administration (FDA)86,87,88, United States Pharmacopeia (USP)89 e Internacional

Conference on Harmonization (ICH)90,91 entre outros, fornecem a descrição dos

parâmetros principais.

O uso da validação no desenvolvimento de novas metodologias tem

aumentado consideravelmente em todo o mundo. No Brasil, o aumento do interesse

pela validação gerou a necessidade da formulação pela Agência Nacional de

Vigilância Sanitária –ANVISA- da Resolução RE nº 899, de 29 de maio de 200379,

que descreve os parâmetros a serem avaliados para a validação de métodos

analíticos e bioanalíticos para determinação de fármacos e suas impurezas,

podendo ser aplicado também a métodos imunológicos e microbiológicos.

1.7.1. Desenvolvimento do método

Um protocolo de validação inicia-se com a definição do objetivo do

método80: quais os resultados pretendidos (identificação, quantificação, etc.); qual

matriz será utilizada (comprimido, ar, plasma, etc.); possíveis interferentes e quais os

níveis de exatidão, precisão, sensibilidade, limite de detecção requeridos.

Durante o desenvolvimento do método, identifica-se a (s) substância (s)

de interesse na matriz e otimiza-se um método de extração. No processo de

otimização, várias substâncias extratoras, formas e tempos de extração são

testados. Após obtenção do método otimizado, realiza-se o procedimento de

recuperação que avalia a eficiência do processo de extração. A recuperação

Introdução


20

consiste em submeter a amostra com adição de diferentes concentrações da

substância de interesse (analito) ao método otimizado para avaliar a porcentagem de

recuperação. Uma boa recuperação do método garante que o analito seja analisado

na totalidade de sua massa presente na amostra79,93,94.

Para o monitoramento dos testes é necessário qualificar um equipamento

analítico que seja compatível com a avaliação do analito (absorção atômica,

cromatógrafo líquido, entre outros). Após a escolha do equipamento, realiza-se o

teste de adequação do sistema que estabelece se os dados obtidos terão qualidade

aceitável. No caso da cromatografia líquida de alta performance, por exemplo, o fator

de capacidade, repetitividade de injeção, retenção relativa, resolução, fator de cauda

e pratos teóricos devem ser avaliados80.

Para a avaliação da estabilidade das soluções analíticas são testadas

soluções de amostras e padrões durante 24 horas em condições de estocagem. A

concentração das soluções de amostras e padrões não deve variar mais que 2% em

relação a amostras frescas e seus cromatogramas devem ser equivalentes80.

1.7.2. Parâmetros de validação

Os principais parâmetros de validação são: especificidade, exatidão,

precisão, linearidade, faixa de aplicação, sensibilidade, limite de detecção, limite de

quantificação e robustez. A seguir são descritos os parâmetros de validação de

metodologias, segundo as principais referências citadas em artigos científicos.

1.7.2.1. Especificidade / seletividade

Especificidade/seletividade é a capacidade de um método diferenciar um

composto em presença de outros componentes da amostra (impurezas,

intermediários de síntese, excipientes, produtos de degradação e componentes da

matriz)93,94,95,96. Na literatura podemos encontrar uma diferenciação dos dois termos:

especificidade refere-se a um método que produz resposta somente para um único

analito, e seletividade diz respeito a um método que produz resposta para um

Introdução


21

determinado número de substâncias químicas que podem ou não ser

distinguíveis82,94. Algumas normas trazem os dois termos juntos79,86 ou optaram por

um deles88,89,90.

A seletividade / especificidade pode ser dividida em duas categorias:

análises qualitativas e análises quantitativas. Para análise qualitativa é necessário

demonstrar a capacidade de seleção do método entre compostos com estruturas

relacionadas que podem estar presentes79,90. Para análise quantitativa e análise de

impurezas, a especificidade pode ser determinada pela comparação dos resultados

obtidos de amostras fortificadas com quantidades apropriadas de impurezas ou

excipientes e amostras não fortificadas, para demonstrar que o resultado do teste

não é afetado por esses materiais. Estas comparações devem incluir amostras

armazenadas sob condições de estresse (por ex. luz, calor, umidade, hidrólise

ácida/básica, oxidação) 79,90,95.

A determinação da especificidade é extremamente importante durante a

validação de um método não cromatográfico, porque este não contém uma fase de

separação que garanta a não interferência dos excipientes. Os métodos não

cromatográficos contam com diferenças intrínsecas às propriedades físicas ou

químicas, para garantir sua capacidade de determinar a concentração da substância

em exame, mesmo em amostras contendo misturas complexas84.

Em métodos cromatográficos, deve-se tomar as precauções necessárias

para garantir a separação dos picos cromatográficos. A utilização de testes de

pureza de pico (por exemplo, com auxílio de detector de arranjo de fotodiodos ou

espectrometria de massas) é interessante para demonstrar que o pico

cromatográfico é atribuído a um só componente79,90,95.

1.7.2.2. Limite de quantificação (LQ)

Limite de quantificação é a menor quantidade do analito em uma amostra

que pode ser determinada com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições

experimentais estabelecidas79,81,82,88,93,94,95. É um parâmetro determinado

Introdução


22

principalmente, para ensaios quantitativos de impurezas e produtos de degradação,

sendo expresso em concentração do analito (por exemplo, porcentagem p/p ou p/v,

partes por milhão) na amostra79.

Várias metodologias para a determinação do LQ são possíveis,

dependendo do procedimento ser instrumental ou não. Os modos atuais mais

aceitáveis são descritos a seguir:

a) baseado na avaliação visual: é determinado pela análise de várias

amostras com quantidades conhecidas de analito, estabelecendo-se o nível mínimo

em que pode ser quantificado com aceitável exatidão e precisão. É utilizado

principalmente para métodos não instrumentais90.

b) baseado na relação sinal-ruído (Figura 5): pode ser aplicado somente

em procedimentos analíticos que exibem ruído de linha de base. É determinado pela

comparação da medida dos sinais de amostras com baixas quantidades conhecidas

de analito, estabelecendo-se a mínima concentração em que o analito pode ser

quantificado com confiabilidade. A relação sinal-ruído típica é 10:1 (concentração do

analito que produz sinal 10 vezes superior ao ruído da linha de base) 79,90,95.

Figura 5 – Pico de CLAE-UV representando uma relação sinal-ruído de 10:1.

c) baseado no desvio padrão da resposta e no coeficiente angular da

curva de calibração: o LQ pode ser expresso como LQ = 10 (DP/S), onde S é a

inclinação da curva de calibração e o DP é o desvio padrão da resposta que pode

ser determinado com base no DP do branco79,82,90,95, no DP da análise de amostras

Introdução


23

com baixas quantidades de analito84, no DP do residual da linha de regressão90,95 ou

no DP da intersecção do y das linhas de regressão79,90,95. Para este último cálculo do

DP, são necessárias, no mínimo, três curvas de calibração contendo concentrações

do analito próximas ao suposto limite de quantificação79. A relação 10 DP é

associada a um erro de 30% com 99% de probabilidade97.

O termo limite observado de quantificação (LOQ) pode ser encontrado em

análises de resíduos98. Um outro termo encontrado na literatura é o limite inferior de

quantificação (LIQ) utilizado em análises de matrizes biológicas79,88.

1.7.2.3. Limite de detecção (LD)

Limite de detecção é a menor quantidade do analito em uma amostra que

pode ser detectada, porém não necessariamente quantificada, sob as condições

experimentais estabelecidas.

Pode ser determinado com base na avaliação visual79,90, na relação sinal-

ruído, cuja relação sinal-ruído típica é 2:188,89,90 ou 3:179,89,90 ou ainda, pode ser

expresso como LD = 3,3 (DP/S)90, onde S é o coeficiente angular da curva de

calibração e o DP é o desvio padrão da resposta que pode ser determinado pelos

mesmos métodos descritos para LQ. A relação LD = 3 (DP/S) também é encontrada

na literatura79. Na determinação pela relação 3,3 ou 3 DP/S, o resultado será um

verdadeiro reflexo do limite de detecção se S for bem definido e a intersecção for

essencialmente zero82.

1.7.2.4. Linearidade e faixa de aplicação

Linearidade é a habilidade do método produzir resultados diretamente

proporcionais à concentração do analito num dado intervalo de variação81,90,94,95,96.

Intervalo é a faixa de variação entre o maior e o menor nível de analito

que demonstra ser determinado com precisão, exatidão e linearidade usando o

método descrito79.

Introdução


24

Para análise da linearidade do método, recomenda-se o número de cinco

concentrações em replicata (n>2) 79,90 nas seguintes faixas mínimas de variação:

para doseamento, 80 a 120% da concentração do teste79,86,90; para teste de

impurezas, do nível esperado até 120% do limite máximo especificado; em análises

de resíduos, de ½ a 5 LOQ98; em testes de uniformidade de conteúdo: 70 a

130%79,90 e em ensaios de dissolução: ± 20% em relação à faixa de variação do

teste79,90. Em toxicologia os limites devem se adequar às quantidades a serem

controladas79,86,90.

A linearidade pode ser demonstrada pelo exame visual do gráfico (Figura

6) que relaciona os sinais obtidos na análise e a concentração do analito79,88. A

equação da reta é definida por: y = ax + b93, onde y= resposta do analito, x=

concentração, a= coeficiente angular e b= coeficiente linear.

Figura 6 – Curva de calibração por padrão externo.

A avaliação da linearidade pode ser realizada de diversas formas

dependendo da natureza da análise:

a) pela construção de curva de calibração a partir de soluções-padrão

(padrão externo) de analito em diferentes concentrações81 (Figura 6). Relaciona a

resposta do aparelho com a massa do analito81,94 sem levar em conta a interferência

da matriz94.

Introdução


25

b) pela construção da curva de calibração com adição do analito à matriz,

a qual elimina a interferência da matriz e de outras etapas do método94. O analito

pode ser adicionado na etapa inicial do método ou na fase final, imediatamente

antes da realização da medida pelo equipamento. Geralmente é utilizada quando há

impossibilidade de se obter uma matriz branca (sem a presença do analito) (Figura

7)81,94. Neste caso, o intercepto da curva no eixo y (coeficiente linear) corresponde

ao sinal do analito presente na matriz sem adição81.

Figura 7 – Curva de calibração por adição de padrão na matriz contendo o analito

c) pela construção da curva de calibração com adição de padrão interno.

A curva é construída a partir de soluções-padrão de analito em diferentes

concentrações, nas quais é adicionada uma concentração fixa de padrão interno81,94

(Figura 8), cuja medida permite comparação relativa com o analito. O padrão interno

é uma substância de tempo de retenção próximo e boa resolução em relação ao

analito, alta pureza e estabilidade81,94.

Figura 8 – Curva de calibração com adição de padrão interno.

Introdução


26

Havendo relação linear aparente, os resultados deverão ser tratados por

métodos estatísticos apropriados para determinação da soma residual dos

quadrados mínimos da regressão linear, do coeficiente de correlação, da intersecção

com o eixo y, do coeficiente angular e desvio padrão relativo79,90.

Figura 9 – Regressão linear de uma curva de calibração. Reta vermelha, reta ideal

estimada por regressão linear.

A regressão linear (método dos mínimos quadrados) (Figura 9) é uma

forma de estimar qual a melhor reta que passa pelos pontos obtidos

experimentalmente93, geralmente realizada por programas computacionais.

O coeficiente de correlação (r) expressa a relação de x e y na curva, em

que os valores ideais esperados são 1 e –1 , ou seja, quanto mais próximo da

unidade maior a relação, maior a probabilidade de existir uma relação linear definida.

Caso os valores tendam a zero, indica que não há relação linear15. Alguns critérios

mínimos aceitáveis são r= 0,9979 e 0,99986. A maioria dos artigos avalia a

linearidade pelo coeficiente de determinação: o quadrado do coeficiente de

correlação (r2)99,100,101.

1.7.2.5. Sensibilidade

Pode-se definir sensibilidade como sendo a capacidade de um método

distinguir, com determinado nível de confiança, duas concentrações próximas81,86,94.

Introdução


27

Na literatura há uma divergência sobre o conceito de sensibilidade que

pode ser definido pela determinação dos limites de quantificação e detecção81,96 ou

pela coeficiente angular da curva de calibração82,94,95. Segundo os defensores do

segundo conceito, sensibilidade não é uma referência ao conceito atual de limite de

detecção e quantificação.

Pode ser utilizada como parâmetro comparativo entre dois métodos.

Quanto maior for o coeficiente angular da curva de calibração, maior a sensibilidade

do método82,94.

1.7.2.6. Exatidão

Exatidão é o grau de concordância ou compatibilidade entre o valor médio

dos resultados e o valor de referência aceito79,81,82,86,93,94,95,96. O cálculo é realizado

pela fórmula79:

%Exatidão = Concentração média experimental 100%

Concentração de referência aceita

ou em termos de inexatidão94:

%Inexatidão = Concentração obtida – Concentração esperada 100%

Concentração esperada

Os termos exatidão e acurácia são utilizados como sinônimos, sendo o

termo exatidão mais comum na literatura brasileira. Apenas uma das literaturas

consultadas designa acurácia como a medida que combina precisão e exatidão82.

Várias formas de avaliação da exatidão estão disponíveis: análise de

amostra de concentração conhecida (padrão de referência) e comparação dos

dados com o valor verdadeiro79,90,95; comparação dos dados do método novo com os

de uma metodologia bem caracterizada de exatidão estabelecida79,90,95; recuperação

Introdução


28

de quantidades conhecidas de analito adicionadas a matrizes brancas79,90,95 e

recuperação de quantidades conhecidas de analito adicionadas a matrizes com o

analito79,90. Este último é mais utilizado quando há impossibilidade de obter matriz

branca, como por exemplo, em medicamentos fitoterápicos.

%Recuperação = Concentração obtida 100%

Concentração adicionada

Recomenda-se que a análise da exatidão seja realizada com nove

determinações contemplando o intervalo linear do procedimento, ou seja, 3

concentrações, baixa, média e alta, com 3 réplicas cada79,90,96. Na literatura

podemos encontrar os níveis de concentração baixo, médio e alto indicados como

80, 100 e 120% da concentração usual da amostra86. A concentração recomendada

para avaliação da exatidão varia de acordo com as matrizes ou quantidade de

analito na amostra.

Na avaliação de recuperação de resíduos de pesticidas por exemplo,

recomenda-se que as três concentrações sejam: 1L OQ, 2 LOQ e 10 LOQ98. Valores

de exatidão de 98 a 102% são recomendados para métodos de doseamento,

inclusive de produtos farmacêuticos96. No caso de dosagem de impurezas: 0,1%

absoluto ou 10% relativo80. Para resíduos: 70 a 120% de exatidão98. Em análises

bioanalíticas considera-se valores 15%, ou 20% no LQ79,88.

1.7.2.7. Precisão

Precisão é a avaliação da proximidade dos resultados obtidos em uma

série de medidas do método79,82,93. É calculada pelo coeficiente de variação (CV):

%CV = desvio padrão das medidas 100%

concentração média determinada

Pode ser avaliada em três níveis: repetitividade, precisão intermediária e

reprodutividade.

Introdução


29

Repetitividade: expressa a precisão entre os resultados de medidas do

mesmo método para a mesma amostra, no mesmo laboratório, pelo mesmo

operador usando mesmo equipamento em um curto intervalo de

tempo79,82,86,90,93,94,95. Deve ser avaliada pela análise de amostras em 3

concentrações em triplicata contemplando intervalo linear ou 6 determinações a

100% da concentração teórica da amostra79,80,90,95. Amostras autênticas são

utilizadas para evitar diferenças devido à interação entre o analito e a matriz94. Em

análises bioanalíticas utiliza-se 3 concentrações em quintuplicata79,80,90. A

repetitividade do instrumento também deve ser avaliada através de 10 injeções de

uma mesma amostra86.

Para doseamento recomenda-se que a variação seja 2% e a precisão

do instrumento 1%80. No caso de impurezas, 5% no LQ e a precisão do

instrumento 10%80. Em análise de resíduos valores até 20% são aceitos98.

Precisão intermediária expressa a precisão dos resultados obtidos

usando o mesmo laboratório, mas em dias diferentes, com analistas diferentes e/ou

equipamentos diferentes79,81,82,86,90,95,96. Para a determinação da precisão

intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas

diferentes79,94. O uso de amostras autênticas também é indicado90.

A reprodutividade expressa a precisão dos resultados obtidos pelo

mesmo método e mesma amostra, por diferentes operadores, usando diferentes

equipamentos em diferentes laboratórios79,82,90,93,94,95. Geralmente avaliada em

estudos colaborativos, aplicados à padronização de metodologia analítica, por

exemplo, para inclusão de metodologia em farmacopéias79,90. O valor máximo

aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a

concentração do analito na amostra, o tipo de matriz e a finalidade do método, não

se admitindo valores superiores a 5%79. Em análises bioanalíticas, o valor limite é

15%, sendo no LIQ, valores menores ou iguais a 20%79,88.

Alguns aspectos da precisão, como precisão intermediária e

reprodutividade, estão intimamente associados à robustez do método82.

Introdução


30

1.7.2.8. Estabilidade

A estabilidade é um parâmetro de validação muito pouco descrito em

normas de validação de metodologias analíticas79,89,90. No entanto, a maior parte das

publicações nessa área avalia a estabilidade em seus métodos, sendo inclusive

solicitado para publicação de métodos de validação em alguns periódicos83.

Nas normas para métodos bioanalíticos79,88, a estabilidade é de

fundamental importância para validação de um método. A estabilidade do analito em

líquidos biológicos depende de suas propriedades químicas, da matriz biológica e do

material de acondicionamento utilizado.

As condições de realização dos ensaios de estabilidade devem reproduzir

as reais condições de manuseio e análise das amostras: estabilidade após ciclos de

congelamento e descongelamento, estabilidade de curta duração, estabilidade de

longa duração, estabilidade pós-processamento e a estabilidade das soluções

estoque padrão79,88.

1.7.2.9. Robustez

Robustez é a capacidade de um método não ser afetado por uma

pequena e deliberada modificação em seus parâmetros. Se os resultados do método

ou outras medidas são sensíveis à variação dos parâmetros, estes devem ser

adequadamente controlados e algumas precauções devem ser incluídas na sua

documentação79,95. Quando as alterações estiverem dentro de limites que produzam

resultados aceitáveis, estas alterações devem ser incorporadas ao procedimento do

método, que é então, considerado robusto94.

Os principais parâmetros que podem resultar em variação na resposta do

método são: no preparo das amostras: estabilidade das soluções analíticas, tempo

de extração; em espectrofotometria: variação do pH da solução, temperatura,

diferentes fabricantes de solventes; em cromatografia líquida: variação do pH da

fase móvel, variação na composição da fase móvel, diferentes lotes ou fabricantes

Introdução


31

de colunas, temperatura, fluxo da fase móvel; e em cromatografia gasosa: diferentes

lotes ou fabricantes de colunas, temperatura, velocidade do gás de arraste.

1.7.3. Parâmetros de validação requeridos

O tipo de método e seu respectivo uso determinam quais parâmetros

devem ser investigados95. Para métodos de doseamento, cuja informação

quantitativa é desejada, não há necessidade de avaliar LQ ou LD, pois normalmente

o analito está presente em altos níveis na amostra. Em doseamento de impurezas, o

LQ é necessário devido à pequena quantidade destas substâncias nas amostras.

Para ensaios-limite, sendo a informação quantitativa desnecessária, requer-se

apenas o LD, e não o LQ. Em testes de identificação é necessário apenas avaliar se

o método é específico para o analito.

Objetivos


32

2. OBJETIVOS

O presente estudo teve como objetivos:

o desenvolvimento de metodologias de extração de furanocumarinas para dez

medicamentos fitoterápicos comercializados em farmácias de manipulação,

drogarias e ervanários em forma de soluções orais, cápsulas e comprimidos;

a validação das metodologias desenvolvidas segundo os parâmetros de

validação da International Conference on Harmonization (ICH)90,91; e

a realização de estudos preliminares para análise dos demais constituintes dos

medicamentos fitoterápicos.

Parte Experimental


33

3. PARTE EXPERIMENTAL

3.1. Materiais e Equipamentos Utilizados

3.1.1. Materiais utilizados

Nas análises por cromatografia em camada delgada (CCD) foram

utilizadas placas de sílica gel 60 f254 da Merck. Os padrões de psoraleno,

bergapteno, isopimpinelina, isobergapteno e 5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-

furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona (denominado no trabalho como

DT) utilizados foram isolados e purificados por nosso grupo de pesquisa (psoraleno

98,89%, bergapteno 99,01% , DT 97,45% , pimpinelina 98,01% e isopimpinelina

97,34% de pureza) empregando técnicas cromatográficas e ressonância magnética

nuclear.

3.1.2. Solventes utilizados

Os solventes orgânicos utilizados nas extrações de plantas e como

eluentes nas análises em CCD foram solventes de grau P.A. Os solventes

empregados no desenvolvimento das metodologias para os medicamentos

fitoterápicos e aqueles empregados em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM foram grau

CLAE (Darmstadt, Germânia). A água utilizada foi tratada pelo sistema Milli-Q

(Millipore).

3.1.3. Equipamentos utilizados

Ultra-som de mesa marca Thornton, tipo T14 modelo C/T;

Luz UV de comprimentos de onda 254 nm e 366 nm;

Centrífuga: Excelsa Baby I modelo 206;

Balança analítica: Scientech SA120 (precisão 0,001g).

Parte Experimental


34

Sistema Milli-Q MILLIPORE (CPNQ004D2)

CLAE-UV

Modelo: Shimadzu LC-6AD.

Detector: UV-Vis de comprimento de onda fixo – Modelo SPD-6AV (Shimadzu)

Coluna: fase reversa octadecyl Shim-pack CLC-ODS (25cm x 4,6mm x 5 μm) e pré-

coluna (2,5 cm X 4,6 mm) de mesma fase da coluna

Eluente: água – acetonitrila 45:55 v/v; fluxo: 1mL / minuto

Comprimento de onda: 223 nm

CG-DIC

Modelo: Varian

Coluna: 5% fenil dimetil polisiloxano LM-5 (15m x 0,2mm x 0,2 μm)

Detector: DIC, temperatura 280 C

Injetor: 280 C

Split: 1:20

Gás de arraste: Hidrogênio com fluxo de 0,8 mL / minuto

CG-EM

Modelo: Shimadzu 17

Coluna: LM-5 (15m x 0,2mm x 0,2 μm)

Injetor Split/Splitless: razão de Split 1:20

Temperatura da interface: 280 C

Temperatura do injetor: 280ºC

Detector seletivo de massa, modelo: Shimadzu QP 5000

Modo de ionização: impacto de elétrons

Modo de aquisição de dados: Scan

Parte Experimental


35

Intervalo: 55-550 u

Gás de arraste: Hélio com fluxo de 0,6 mL / minuto

Tabela 1 - Programação de temperatura utilizada em CG-DIC e CG-EM29

Temperatura (C) Velocidade de aquecimento (C/min) Tempo de isoterma (min)

150,0 10,0 -

240,0 5,0 -

280,0 - 20,0

min, minutos.

3.2. Medicamentos Fitoterápicos

Dentre todos os medicamentos presentes no mercado que possuíam

Dorstenia em sua composição, foram selecionados para o estudo sete

medicamentos (denominados no trabalho como A, B, C, D, E, F e G). Estes

medicamentos são indicados para tratamento de distúrbios menstruais ou sintomas

da menopausa. Dentre eles, apenas os medicamentos A e B continham apenas uma

informação em suas bulas da presença de cumarinas em D. multiformes.

Foram também incluídos no estudo, três medicamentos indicados para

vitiligo (denominados no trabalho como H, I e J). Os medicamentos H e I não tinham

indicação das plantas de sua constituição, sendo apenas designados como produto

natural. O medicamento J constituído por Brosimum gaudichaudii e vitaminas foi o

único medicamento selecionado que apresentava informação sobre presença de

furanocumarinas, no caso o bergapteno, na bula. Dois deles apresentavam

indicação para vitiligo em folheto explicativo ou bula (H e J respectivamente) e o

outro fitoterápico (I) foi selecionado, pois estava sendo usado por um paciente com

vitiligo por indicação de leigos.

Parte Experimental


36

Dos medicamentos fitoterápicos (Tabela 2): quatro estavam na forma de

soluções orais hidroalcoólicas (A, B, C e D), três em cápsulas (E, F, G) e três em

comprimidos (H, I e J). Todos foram comprados em farmácias de manipulação,

drogarias e ervanários sem a necessidade de receita médica. Os medicamentos A e

B são de um mesmo fabricante, o mesmo ocorrendo para C e F. Os demais são de

diferentes fabricantes.

As soluções orais contêm as seguintes tinturas ou misturas de tinturas: A

(Dorstenia multiformis - Davilla rugosa - Plumeria lancifolia 1:2:1 v/v/v), B (Dorstenia

multiformis - Plumeria lancifolia 1:1 v/v), C (Dorstenia multiformis - Cereus jamacaru -

Plumeria lancifolia - Erythrina mulungu 2:5:1:2 v/v/v/v), D (Dorstenia multiformis).

As cápsulas e comprimidos contêm diversas composições: E (extratos

secos de Dorstenia multiformes - Plumeria lancifolia, 1:1 m/m). F (extratos secos de

Dorstenia multiformis - Plumeria lancifolia - Cereus jamacaru - Erythrina mulungu,

2:5:1:2 m/m/m/m), G (pó do rizoma de Dorstenia brasiliensis), H (produto natural) e I

(produto natural), J (seiva concentrada de Brosimum gaudichaudii - nicotinamida

(fator PP) - cloridrato de tiamina (vitamina B1) - cloridrato de piridoxina (vitamina B6),

400:20:3:3 m/m/m/m).

As soluções orais A e B têm registro regular na Agência Nacional de

Vigilância Sanitária102. A solução oral C e a cápsula F nunca receberam registro e

são comercializados apenas com o nº de protocolo. O fabricante solicitou o

arquivamento do processo em 2002, pois não tinha condições naquele momento de

responder às exigências formuladas, quanto à eficácia. A solução oral D saiu do

mercado durante o processo de validação do método e não possuía registro. O

comprimido J possui um registro no ano de 1980, mas não se pode informar se

continua ativo, sem uma consulta direta ao processo. Os demais fitoterápicos

discutidos no trabalho não possuem registro na ANVISA.

Parte Experimental


37

Tabela 2 - Informações sobre denominações, lotes, data de fabricação, data de

validade e cidade de aquisição dos medicamentos.

Tintura Lote Fabricação Validade Cidade de aquisição

A1 1015 10/2000 10/2003 São Paulo, Brasília

A2 0335 10/2000 10/2003 Goiânia

A3 1016 10/2000 10/2003 Rio de Janeiro

B1 1235 02/2001 02/2004 São Paulo, Goiânia, Rio de Janeiro

B2 1192 02/2001 02/2004 Brasília

C1 1751 10/2002 10/2005 Campo Grande

C2 0951 04/2001 04/2004 Campo Grande

C3 1442 01/2002 01/2005 Campo Grande

D 11281 04/1999 04/2002 Campo Grande

Cápsulas Lote Fabricação Validade Cidade de aquisição

E1 3505 12/2001 12/2004 Campo Grande

E2 3402 04/2001 04/2004 Campo Grande.

E3 3234 07/2000 07/2003 Campo Grande

F1 1865 01/2002 01/2005 Campo Grande

F2 1971 02/2002 02/2005 Campo Grande

F3 1864 01/2002 02/2005 Campo Grande

G1 1068 DA: 08/2000 SI Rio de Janeiro



Comprimidos Lote Fabricação Validade Cidade de aquisição

H1 SIL 02/2000 SI Campo Grande



I1 SIL DA: 03\2000 SI Coxim

I2 SIL DA: 04/2000 SI Coxim

I3 SIL DA: 07/2000 SI Coxim

J1 688 10/2001 10/2003 Campo Grande

J2 772 06/2002 06/2004 Campo Grande

SI, sem indicação de lote; DA, data de aquisição.

Parte Experimental


38

Durante o desenvolvimento do trabalho foram utilizados três lotes de cada

medicamento. Apenas do medicamento B foram utilizados dois lotes, pois houve

dificuldades de obter novos lotes deste, mesmo em outros estados.

3.3. Desenvolvimento das Metodologias

3.3.1. Soluções orais

Uma avaliação inicial das tinturas por cromatografia em camada delgada

(CCD) foi empregada para avaliar presença de psoraleno, bergapteno, pimpinelina

ou isobergapteno. Para isso, as tinturas A, B, C e D foram diluídas na proporção de

proporção 1:2,5 v/v com álcool etílico absoluto e permaneceram por 5 minutos em

ultra-som para facilitar a solubilização de material em suspensão. Foram testados

eluentes com diversas capacidades de eluição: tolueno/álcool etílico, tolueno/acetato

de etila/ácido acético e tolueno/éter/ácido acético. Como revelador foram utilizadas

luz UV (254 e 336 nm) e p-anisaldeído com aquecimento a 80ºC por 3 minutos.

Realizou-se também uma análise direta preliminar das soluções orais por

CLAE-UV em condição cromatográfica otimizada30 para quantificação de

furanocumarinas (descrita no item 3.1.3.) após filtração das amostras em filtro Millex

de 0,45 μm.

A extração líquido – líquido foi avaliada por ser rápida e pelas amostras

serem matrizes líquidas. Para isso, várias amostras de 5 mL das soluções orais A, B,

C e D foram colocadas separadamente em tubos de ensaio de 13 mL e a cada um

destes tubos foram adicionados 7 mL de um dos seguintes solventes: clorofórmio,

diclorometano e éter etílico. As extrações foram realizadas em banho de ultra-som

durante 30 minutos. Houve formação de duas fases com os solventes clorofórmio e

diclorometano, que ficaram mais bem definidas com 10 minutos de centrifugação. As

fases superiores e as fases inferiores foram secas em capela ou sob atmosfera de

nitrogênio. Os resíduos foram solubilizados em metanol, filtrados em filtro Millex 0,45

Parte Experimental


39

μm e seus volumes completados para 10 mL em balão volumétrico para serem

analisados por CLAE-UV.

Para otimizar o tempo em banho de ultra-som realizou-se o mesmo

experimento com clorofórmio variando-se o tempo de ultra-som em: 0, 10, 30 e 50

minutos.

Para garantir a extração das furanocumarinas em sua totalidade, as fases

superiores foram transferidas para tubos de ensaio, onde foram adicionados 5 mL de

clorofórmio. A reextração foi realizada em banho de ultra-som por 10 minutos

formando duas fases, que foram separadas por 10 minutos de centrifugação. As

fases inferiores da primeira e segunda extração de cada amostra de solução oral

foram então reunidas para quantificação das furanocumarinas. As fases superiores

resultantes da segunda extração foram utilizadas para estudos posteriores. Todos os

procedimentos foram realizados em triplicata.

3.3.2. Cápsulas e comprimidos

Várias amostras de 100 mg dos medicamentos F e J foram colocadas

separadamente em tubos de ensaio de 13 mL e a cada um deles foram adicionados

10 mL de um dos seguintes solventes ou misturas de solventes: metanol,

clorofórmio, metanol-clorofórmio em proporções 7:3, 3:7, 9:1, 1:9, diclorometano,

metanol-diclorometano 7:3 e metanol -acetato de etila 7:3. As extrações foram

realizadas em banho de ultra-som durante 15 minutos e então o material foi

centrifugado por 10 minutos. O resíduo foi reextraído mantendo-se o mesmo

solvente, tempo em ultra-som e centrifugação. Os dois extratos foram reunidos e o

solvente evaporado até a secura em capela ou sob atmosfera de nitrogênio. Este

resíduo foi solubilizado em 2 mL de metanol, filtrado através de filtro Millex 0,45 m

e seu volume completado para 5 ou 10 mL em balão volumétrico para a

quantificação das furanocumarinas por CLAE-UV.

Parte Experimental


40

3.4. Validação das Metodologias

Os parâmetros de validação do método para determinação de

furanocumarinas em soluções orais e do método em cápsulas e comprimidos foram

avaliados segundo o International Conference on Harmonisation90.

Para o preparo das soluções-padrão utilizadas nos procedimentos de

validação, cada padrão foi pesado em balança analítica e transferido para um balão

volumétrico com metanol para preparação das soluções-padrão.

O preparo das amostras com adição de padrão seguiu a técnica descrita a

seguir: foram adicionadas diferentes alíquotas da solução-padrão - dependendo da

concentração final de padrões desejada (item 3.4.1.) - a 5 mL das amostras de A, B

e C e a 100 mg de cada cápsula ou comprimido para avaliar a recuperação. Em

cápsulas e comprimidos, foi adicionado também, padrão de DT. As soluções orais

com adição de padrões permaneceram 10 minutos em ultra-som e as cápsulas e

comprimidos permaneceram 20 minutos em contato com as alíquotas para

homogeneização inicial antes do início da extração.

A avaliação dos parâmetros de validação foi realizada conforme descrito a

seguir:

3.4.1. Recuperação

A eficiência da extração (recuperação) foi determinada pela adição de

psoraleno, bergapteno e DT (padrões) em baixa, média e alta concentração nas

amostras analisadas.

A cada amostra de solução oral foi adicionada diferentes concentrações

do padrão, sendo que as concentrações finais de cada padrão nas amostras foram:

4, 40, 100 e 200 μg mL-1. Nas cápsulas e comprimidos as concentrações finais

foram: 1, 20 e 40 μg mL-1. Os experimentos foram realizados em quintuplicata (n= 5).

Parte Experimental


41

3.4.2. Limites de detecção e quantificação.

Os limites de detecção foram determinados pela injeção (n=5) de

soluções-padrão das furanocumarinas (10 μL cada), reduzindo a concentração dos

padrões até detectar um pico com três vezes a relação sinal/ruído. A concentração

correspondente foi considerada como a mínima concentração detectável. Os limites

de quantificação foram determinados pela mesma metodologia, sendo considerado

como a concentração correspondente ao pico cromatográfico com dez vezes a

relação sinal/ruído.

3.4.3. Curva de calibração

A avaliação do conteúdo dos analitos nas soluções orais foi realizada por

calibração externa. As furanocumarinas em estudo foram dissolvidas separadamente

em metanol para obter soluções estoque adequadamente diluídas para

concentrações na faixa de 1-600 µg mL-1 de psoraleno e de 1-400 µg mL-1 de

bergapteno, para o método de soluções orais. Para o método de cápsulas e

comprimidos, as soluções estoque eram adequadamente diluídas para

concentrações na faixa de 1-50 µg mL-1 para psoraleno, bergapteno e DT. Alíquotas

de 10 diluições para cada padrão foram analisadas por CLAE, sendo que cada

determinação foi realizada cinco vezes.

Nas análises interequipamento das soluções orais por CG-DIC, a faixa de

concentrações empregada foi de 10-100 µg mL-1 de psoraleno e de 5-90 µg mL-1 de

bergapteno. Para as análises de cápsulas e comprimidos por CG-EM, a faixa de

concentrações foi a mesma utilizada em CLAE-UV para estas amostras.

Para cada solução-padrão foi obtido um cromatograma correspondente e

construído um gráfico relacionando os valores das áreas dos picos e as

concentrações das soluções. A regressão linear foi realizada para determinar os

coeficientes de correlação. Os parâmetros da equação (coeficiente angular e linear)

de cada curva de calibração foram usados para obter os valores de concentração

das amostras desconhecidas de soluções orais. Amostras com a concentração de

Parte Experimental


42

analito excedendo a curva de calibração foram reanalizadas após a apropriada

diluição.

3.4.4. Linearidade

A linearidade do método foi determinada para avaliar se a resposta do

método otimizado permanecia linear com concentrações diferentes de analitos nas

matrizes dentro do intervalo da curva de calibração. Foi determinada pela análise de

cada solução oral, cápsula e comprimido com adição de quantidade conhecida dos

padrões de interesse em quatro concentrações. Cada determinação foi realizada

cinco vezes (n= 5). Alíquotas (10l) foram analisadas por CLAE como descrito

anteriormente. Para cada amostra foi obtido um cromatograma correspondente e

construído um gráfico relacionando os valores das áreas dos picos e as

concentrações das amostras de solução oral com adição de padrão. A regressão

linear foi realizada para determinar os coeficientes de correlação.

3.4.5. Acurácia e precisão

A acurácia ou exatidão do método foi avaliada pela realização de análises

em cada solução, cápsula ou comprimido. O cálculo foi realizado pela fórmula da

inexatidão usando a fórmula descrita na página 27.

A precisão do método foi avaliada em níveis de repetitividade, precisão

intermediária e análise interequipamento. A precisão foi expressa como a

percentagem do coeficiente de variação (CV) das medidas usando a fórmula descrita

na página 28.

A repetitividade do método foi avaliada nas análises intradia das soluções

orais, cápsulas e comprimidos. Para precisão intermediária foram avaliadas as

análises interdia dos medicamentos.

A avaliação da acurácia e precisão intradia foi realizada em três

experimentos durante o período de um dia, cada um contendo a análise de cada

Parte Experimental


43

solução oral (n=4), cápsula e comprimido (n=5) com adição dos padrões em três

concentrações diferentes (4, 40 e 200μg/mL de solução oral e 1, 20 e 40 μg/mL para

cápsulas e comprimidos). A avaliação da acurácia interdia difere da anterior, pois é

realizado um experimento por dia, durante três dias diferentes, consecutivos ou não.

Foi cinco (n=5) o número de determinações neste experimento para todas as

amostras.

A análise interequipamento dos métodos foi realizada para avaliar os

resultados em diferentes equipamentos: CG-DIC para o método de soluções orais e

CG-EM para o método de cápsulas e comprimidos, empregando uma condição

cromatográfica otimizada29.

3.4.6. Estabilidade

A estabilidade das soluções-padrão e dos padrões nas soluções de

análise dos medicamentos (condição otimizada) foi testada a 22ºC (temperatura de

trabalho), 4ºC e –5ºC (temperatura de estocagem). Para o método para cápsulas e

comprimidos, as temperaturas empregadas foram 22ºC, 4ºC e –5ºC. As amostras

com adição de padrão foram analisadas imediatamente após a preparação e a

seguir foram estocadas.

A estabilidade foi definida como sendo menos que 5% de perda da

concentração da solução inicial dos analitos nas amostras analisadas.

3.4.7. Especificidade

Para avaliar a especificidade do método, duas outras diferentes

furanocumarinas (pimpinelina e isobergapteno), comumente encontrados no gênero

Dorstenia foram avaliadas pelo mesmo procedimento descrito para CLAE-UV e CG-

DIC e CG-EM, e os tempos de retenção foram comparados com os dos analitos de

interesse nas soluções orais, cápsulas e comprimidos.

Parte Experimental


44

3.5. Outros Estudos Realizados

3.5.1. Novas condições cromatográficas

Para a condição isocrática de estudo do perfil cromatográfico foram

testados os seguintes eluentes: água-metanol-acetonitrila 55:0:45; 30:0:70;

50:25:25; 50:30:20, 60:20:20; 70:15:15; 64:18:18; 64:22:14; 64:25:15; 64:20:16;

64:16:20; 90:0:10; 53:47:0; 60:40:0 v/v/v; variando-se o fluxo de 0,5 mL a 1 mL /

minuto em uma absorbância fixa em 223 nm. Após a determinação do eluente e

velocidade de fluxo apropriados, foram testados quatro comprimentos de onda: 223,

254, 287 e 362 nm.

Para determinação de uma condição gradiente, duas condições foram

testadas. A primeira (G1) provinha de um aumento gradiente da relação entre os

solventes acetonitrila – água de 10:90 v/v para 65:35 v/v em 25 minutos, seguido de

um aumento de 65:35 v/v para 100:0 v/v em 3 minutos, mantendo-se por 5 minutos,

voltando à condição inicial em 10 minutos, totalizando um tempo de 43 minutos com

fluxo de 1 mL / minuto, com aquisição de 50 minutos. A segunda (G2) provinha de

um aumento gradiente da relação entre os solventes acetonitrila – água de 5:95 v/v

para 100:0 v/v em 50 minutos, voltando à condição inicial em 20 minutos, com

aquisição dos primeiros 50 minutos com fluxo de 1,2 mL / minuto. As análises foram

conduzidas no comprimento de onda de 223 nm.

3.5.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C.

A fim de avaliar a possível presença de glicosídios furanocumarínicos nas

soluções orais, 5 mL de cada amostra foram secos em capela ou sob atmosfera de

nitrogênio. A quantidade de enzima adicionada (1 mg) foi calculada a partir da

proporção material vegetal – volume da tintura final 1:5 m/v104.

Parte Experimental


45

Os extratos secos foram inicialmente homogeneizados com 1,5 mL de

tampão acetato 0,1 mol/L (pH 5,0; 5mL) por 1 minuto em ultra-som. Em seguida 1,25

mg de β-Glucosidase foi adicionado às suspensões, sendo incubadas a 37ºC por 72

horas104. Após este período, foram adicionados 3,5 mL de álcool etílico de cereais

96º GL. Após uma rápida homogeneização do tubo de ensaio contendo a

suspensão, realizou-se todo o processo otimizado de extração, descrito

anteriormente, para soluções orais. As tinturas foram então analisadas em CLAE-UV

e seus perfis cromatográficos comparados com os das tinturas não hidrolisadas. Os

procedimentos de hidrólise foram realizados em triplicata.


fitoterápicos

3.5.3.1. Material vegetal

Três espécimes diferentes de Brosimum gaudichaudii Trécul de porte

arbustivo foram coletados pelo mestrando em Botânica Dario Palhares da

Universidade de Brasília (UnB), nas proximidades do Campus desta Universidade. O

material do primeiro espécimex foi coletado em dezembro de 2002, do segundoy em

abril de 2003 e do terceiroz em outubro do mesmo ano. A identificação foi realizada

pela Prof. Dra. Conceição Eneida dos Santos Silveira e por Dario Palhares, ambos

da UnB. As exsicatas dos dois primeiros materiais encontram-se catalogadas e

depositadas no Herbário da Universidade de Brasília sob referências UB 12050, UB

12052. A exsicata do terceiro espécime está em processo de tombamento.

O material dos três espécimes foi separado em folhas, caule, raiz e então

seco em estufa com circulação de ar a 37ºC e em seguida armazenado em frascos

bem vedados, protegidos da luz. Algumas das amostras foram separadas em casca

e lenho da raiz e casca e lenho do caule. O látex liberado pelos espécimes após a

retirada das folhas foi coletado em frasco âmbar e em seguida, vedado e

armazenado em freezer.

Parte Experimental


46

Nas amostras de Dorstenia coletadas pela Prof. Dra. Cláudia Andréa Lima

Cardoso da Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul em Piraputanga,

Aquidauana, Miranda, Bonito, Jardim, Campo Grande, Coxim e Rio Negro, no

período de 1996 a 2001 não foram constatadas a presença de Dorstenia brasiliensis

e Dorstenia multiformes. Dentre estas amostras coletadas na região, D. tubicina, D.

asaroides, D. vitifolia foram identificadas pelo Botânico Prof. Dr. Jorge Pedro Pereira

Carauta, do Jardim Botânico do Rio de Janeiro.

Amostras de Dorstenia brasiliensisx foram coletadas em São Paulo, em

Mogiguaçu, em fevereiro de 1998 e identificadas pelo Prof. Dr. Jorge Pedro Pereira

Carauta.

Além das amostras identificadas, foram adquiridas no comércio de Campo

Grande, amostras vendidas como agoniada, cipó caboclo, carapiá e mamica de

cadela (Tabela 3).

Tabela 3 - Amostras de plantas adquiridas no comércio de Campo Grande.

Amostra Parte Lote Fabricação Validade

Agoniadax casca SI 01/2000 01/2003

Agoniaday casca SI DA: 09/2002 SI

Agoniadaz casca SI DA: 10/2002 SI

Cipó caboclox cipó SI SI 02/2004

Carapiáx rizoma SI DA: 12/2002 SI

Carapiáy rizoma SI DA:12/2002 SI

Mamica de cadelax raiz SI DA:12/2002 SI

SI, sem indicação; DA, data de aquisição.

Parte Experimental


47

3.5.3.2. Preparação das amostras

3.5.3.2.1. Preparação de amostras para determinação do comprimento de onda

Análises preliminares com algumas das plantas presentes nas

formulações dos medicamentos foram iniciadas com a preparação de extratos a

partir das amostras adquiridas no mercado. As tinturas de cipó caboclox, agoniadax e

carapiáx foram preparadas a partir da extração das drogas vegetais, na qual as

amostras foram deixadas em contato com álcool etílico 96º e com álcool etílico 65º

por 7 dias.

Foi realizada também uma análise inicial das amostras de agoniada1, cipó

caboclox, carapiáx e mamica de cadelax, em condição isocrática para estudo do perfil

cromatográfico, nos comprimentos de onda 223, 254, 287 e 365 nm.

3.5.3.2.2. Preparação de extratos de agoniada

Cascas de agoniada estão presentes nas formulações dos medicamentos

A, B, C, E e F. Uma análise preliminar para comparação dos perfis cromatográficos

de amostras vendidas no mercado foi realizada através de dois experimentos. No

primeiro realizou-se a extração de três agoniadasx,y,z na qual as amostras foram

deixadas em repouso em contato com álcool etílico 95% na proporção de material

vegetal - solvente 2:10 m/v por 6 dias. Em outro, as mesmas amostras foram

deixadas em contato com álcool etílico absoluto na proporção material vegetal -

solvente 1:10 (m/v) por 2 dias com 30 minutos de ultra-som a cada dia. As amostras

foram analisadas em CLAE-UV na condição isocrática para estudo do perfil

cromatográfico.

3.5.3.2.3. Preparação de extratos de Brosimum gaudichaudii

Realizou-se a extração de raiz, caule e folhas de B. gaudichaudiix, na qual

as amostras foram deixadas em contato com álcool etílico absoluto na proporção de

material vegetal – solvente 1:20 (m/v) por 2 dias, sendo mantidas durante 30 minutos

Parte Experimental


48

em ultra-som a cada dia. As amostras foram reextraídas duas vezes com clorofórmio

na proporção 1:10 (m/v). As tinturas foram secas em capela, solubilizadas em álcool

etílico, filtradas e seus volumes completados para 5 ou 10 mL em balão volumétrico.

O mesmo procedimento foi repetido em análises posteriores para casca e lenho da

raiz.

Para análise do látex de B. gaudichaudiix,y,z, gotas do material foram

coletadas no ponto em que as folhas eram retiradas do espécime. 500 mg de cada

látex foram colocados em tubo de ensaio e extraídos com 10 mL de clorofórmio por

10 minutos em ultra-som e então centrifugados por 10 minutos havendo a separação

de duas fases. Ambas as fases foram secas em capela. A cada uma delas foi

adicionado metanol, sendo mantidas por 10 minutos em ultra-som, filtradas e seus

volumes completados para 5 mL em balão volumétrico. As duas fases foram

analisadas em CLAE-UV na condição utilizada para quantificação de

furanocumarinas.

3.5.3.2.4. Preparação de extratos de carapiá, mamica de cadela, Dorstenia

multiformes e Brosimum gaudichaudii

Realizou-se a extração das amostras de carapiáx,y, mamica de cadelax,

rizomas de D. brasiliensisx, raiz inteira de B. gaudichaudii1 e cascas das raízes de B.

gaudichaudiix,y,z, na qual foram deixadas em contato com álcool etílico absoluto na

proporção de material vegetal - volume de solvente 1:20 m/v por 2 dias, sendo

mantidas por 30 minutos de ultra-som a cada dia. As amostras foram reextraídas

duas vezes com clorofórmio na proporção 1:10 m/v. As tinturas foram secas em

capela e solubilizadas em metanol, filtradas e seus volumes completados para 5 ou

10 mL em balão volumétrico.

As amostras foram analisadas e seus perfis cromatográficos foram

comparados por CLAE-UV na condição utilizada para quantificação das

furanocumarinas.

Parte Experimental


49

3.5.3.2.5. Preparação de tinturas por maceração e por percolação de Dorstenia

brasiliensis e Brosimum gaudichaudii

Para a preparação das tinturas de D. brasiliensis e B. gaudichaudii

utilizou-se então, álcool etílico de cereais 70º com a relação 1:5 entre quantidade de

amostra e volume da tintura final (m/v), utilizando dois processos de extração

descritos na Farmacopéia Brasileira103.

Para a percolação, 1,00g de rizoma de D.brasiliensisx e 1,00g de casca

da raiz de B.gaudichaudiiy ficaram inicialmente em contato com 3 mL de álcool etílico

de cereais 70º por 6 horas. Em seguida, as misturas foram extraídas por álcool

etílico de cereais 70º em percolador (15 cm de comprimento por 1 cm de largura),

produzindo 5 mL de percolado com um gotejamento de 20 gotas por minuto.

Para a maceração, 1,00g de rizoma de D.brasiliensisx e 1,00g de casca

de raiz de B.gaudichaudiiy ficaram em contato com 7 mL de álcool etílico de cereais

70º por 7 dias ao abrigo da luz. Durante este período, as misturas foram levemente

homogeneizadas. Após a filtração, os volumes foram completados para 5 mL, se

necessário.

3.5.3.2.6. Hidrólise de Dorstenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii

1 mg de β-Glucosidase foi adicionado a uma suspensão contendo 500 mg

de rizoma de D.brasiliensisx e raiz de B.gaudichaudiiy,z em tampão acetato 0,1 mol/L

(pH 5,0; 5mL). As misturas foram incubadas a 37ºC por 72 horas104. Após a filtração,

foram obtidos a fase aquosa e o resíduo. A extração do resíduo foi realizada com 10

mL de álcool etílico absoluto, na qual foi deixado em contato com o solvente por 2

dias, com 30 minutos de ultra-som a cada dia, sendo reextraído duas vezes com 5

mL de clorofórmio. Os extratos provenientes do resíduo foram reunidos e secos em

capela. A extração da fase aquosa foi realizada pelo mesmo volume de clorofórmio

por 3 vezes, sendo as extrações reunidas e secas em capela. Os extratos

provenientes do resíduo e da fase aquosa foram solubilizados em metanol, filtrados

e seus volumes completados para 10 mL e analisados em CLAE-UV.

Resultados e Discussão


50

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os cromatogramas obtidos por CLAE-UV em todas as condições

cromatográficas, por CG-DIC e por CG-EM possuem os números 1, 2 e 3 indicando

psoraleno, bergapteno e DT (Figura 10), respectivamente, quando presentes nas

amostras.

*

Figura 10 - Estrutura das substâncias analisadas

A análise em CLAE-UV, na condição empregada para quantificação,

mostrou uma boa separação dos picos dos compostos de interesse na linha de base

que poderiam ser analisados num intervalo de tempo satisfatório, menor que doze

minutos para soluções orais, cápsulas e comprimidos (Tabela 4). A análise em GC-

FID e CG-EM também mostrou uma boa separação dos picos dos compostos de

interesse na linha de base que poderiam ser analisados num intervalo de tempo

satisfatório, menor que 17 minutos (Tabela 4). As amostras A, B, E, G e I, que não

continham DT, puderam ser analisadas em tempo menor que 8 minutos em todos os

equipamentos.

*5-[3-(4,5-Diidro-5,5-dimetil-4-oxo-2-furanil)-butoxi]-7H-furo[3-2-g][1] benzopiran-7-ona



51

Tabela 4 - Tempo de retenção (minutos DP) das furanocumarinas em diferentes

equipamentos, empregando as condições de quantificação.

Substâncias CLAE-UV CG-DIC CG-EM

Psoraleno 6,14 0,04 4,25 0,03 4,30 0,05

Bergapteno 7,43 0,03 6,35 0,01 6,37 0,04

DT 11,41 0,03 16,55 0,03 16,57 0,05

DP, desvio padrão.

4.1. Desenvolvimento das Metodologias

4.1.1. Soluções orais

Dentre os primeiros sistemas testados para CCD, o mais adequado tem

como eluente a mistura de solventes: tolueno - acetato de etila - ácido acético 6:4:1,

revelado por luz UV no comprimento de onda de 365 nm, pois este sistema permitia

um melhor espaçamento entre as manchas dos padrões e a distinção de colorações

entre algumas furanocumarinas. O padrão de psoraleno adquiriu coloração azul; o

bergapteno, amarela; a pimpinelina e isopimpinelina, alaranjadas. Os três primeiros

com Fatores de Retenção (Rf) muito semelhantes (entre 0,51 e 0,53) e o último com

Rf um pouco maior (0,58). Quando psoraleno e bergapteno estão conjuntamente

presentes, tem-se uma única mancha azulada. Nas tinturas A, B, C e D foi

identificada a mancha relacionada às furanocumarinas bergapteno e/ou psoraleno

em análise comparativa com os padrões.

A análise preliminar das soluções orais A, B, C e D por CLAE-UV permitiu

a identificação das furanocumarinas psoraleno e bergapteno por tempo de retenção

em comparação com os padrões (Figuras 11 a 13). Uma terceira furanocumarina

com mesmo tempo de retenção da DT foi encontrada em quantidade bem menor



52

que psoraleno e bergapteno na solução oral C, com a integração do pico no

cromatograma de CLAE-UV prejudicada devido à grande quantidade de substâncias

polares presentes na amostra. Uma análise preliminar das soluções em CG-DIC não

foi possível devido à presença de água nas amostras e uma grande quantidade de

substâncias polares que prejudicariam a fase estacionária da coluna cromatográfica,

e com isso, a eficiência da mesma.

Figura 11 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento A

(amostra bruta**).

**amostra sem aplicação da metodologia.



53

Figura 12 - Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento B

(amostra bruta).

Figura 13 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV do medicamento C

(amostra bruta).

Baseado nos resultados discutidos dos testes preliminares, foi necessário

desenvolver uma metodologia de extração das furanocumarinas que excluísse a

água e a maior parte das substâncias polares presentes nas amostras. A solução de

análise final deveria estar apta a ser analisada em CG-DIC sem o prejuízo à coluna



54

cromatográfica, além de permitir uma melhor integração das substâncias de

interesse em CLAE-UV.

A fim de se avaliar qual o melhor método de extração, verificou-se a

extração das furanocumarinas das soluções orais A, B, C e D por partição líquido-

líquido com éter etílico, clorofórmio e diclorometano. O primeiro solvente não formou

fase com a matriz líquida.

As análises por CCD das fases inferiores e superiores das extrações com

clorofórmio e diclorometano mostraram que a maior parte das furanocumarinas foi

extraída pelos solventes, estando na fase inferior das partições líquido-líquido após

a extração. Não houve diferença visível entre os dois solventes. A seleção do

clorofórmio como melhor solvente extrator foi realizada pela análise por CLAE-UV.

Foi determinada maior quantidade de furanocumarinas na fase inferior da extração

com este solvente. A análise das fases superiores das extrações com clorofórmio

determinou que ainda havia presença de furanocumarinas nesta fase, necessitando,

portanto, de uma otimização do método.

A otimização do tempo em banho de ultra-som mostrou que o rendimento

da extração foi maior com 10 minutos em relação ao método sem ultra-som, não

havendo aumento significativo até 50 minutos. Ainda assim, as fases superiores

mantinham pequena quantidade de furanocumarinas.

A reextração da fase superior com 5 mL de clorofórmio mostrou ser mais

segura e eficiente na extração das furanocumarinas presentes na fase superior, não

havendo formação de emulsão durante o processo. As análises por CLAE-UV

mostraram que a reextração foi eficiente, revelando uma quantidade menor que 1%

do total de psoraleno e bergapteno na fase superior da segunda extração.

O procedimento otimizado encontrado foi: 5 mL da solução oral são

extraídos por 7 mL de clorofórmio durante 10 minutos em banho de ultra-som e em

seguida, centrifugados por 10 minutos para a separação das fases. A fase superior é

reextraída por 5 mL de clorofórmio mantendo-se o mesmo tempo em ultra-som e em



55

centrifugação. As duas fases inferiores foram reunidas e o solvente evaporado até a

secura sob atmosfera de nitrogênio. Cada resíduo foi solubilizado em 5 mL de

metanol, filtrado em filtro Millex 0,45 m e o volume da solução completado para 10

mL com metanol em balão volumétrico (solução para quantificação de

furanocumarinas) para ser analisada em CLAE-UV. A fase superior resultante foi

nomeada: solução para estudos posteriores para ser também analisada em

CLAE-UV.

As furanocumarinas foram extraídas em sua totalidade dos medicamentos

A, B e C, estando presentes nas soluções de análise de furanocumarinas (Figuras

14 a 16), o que comprova eficiência do método para estas substâncias. Este fato

pode observado pela ausência de furanocumarinas nos cromatogramas das

soluções para estudos posteriores dos três medicamentos citados (Figuras 17 a 19).


quantificação de furanocumarinas do medicamento A.



56


quantificação de furanocumarinas do medicamento B.


quantificação de furanocumarinas do medicamento C.



57


posteriores do medicamento A.


posteriores do medicamento B.



58


posteriores do medicamento C.

A avaliação mostrou que as soluções para análise de furanocumarinas

apresentaram uma grande redução nos teores (cerca de 90%) das substâncias que

eluem no intervalo de tempo 0 a 4 minutos, em relação às amostras brutas,

promovendo uma limpeza da amostra, que era pretendido pelo método. Isto permitiu

que a solução de análise passasse a ser constituída principalmente pelas

furanocumarinas de interesse, facilitando uma melhor visualização e integração

destas e ressaltando a presença de outras cumarinas que pudessem estar presentes

em menores quantidades.

Além de proporcionar melhores condições de análise, a solução mais

clara e límpida resultante da metodologia de extração, possibilitou a preservação da

coluna cromatográfica de CLAE-UV.

A maior parte das substâncias presentes nos medicamentos A, B, e C que

eluem no intervalo de tempo 0 a 4 minutos ficou nas soluções para análises

posteriores (Figuras 17 a 19). Como não temos padrões que apresentem picos com

os mesmos tempos de retenção, uma análise por CLAE-EM está sendo

disponibilizada para determinação destes constituintes nas amostras.



59

A presença da DT na solução oral C foi confirmada após adição de

padrão e aumento do pico do cromatograma por CG-EM (Figura 20).

Figura 20 – Cromatograma obtido da análise por CG-EM da solução para

quantificação de furanocumarinas do medicamento C.

Pelo mesmo procedimento, não foi identificada DT nas demais soluções.

A avaliação da metodologia de extração para a DT deste medicamento fitoterápico

mostrou boa repetitividade dos resultados em análises preliminares. Como a solução

oral C foi a última a ser inserida no trabalho, experimentos de recuperação em

CLAE-UV e procedimentos de validação da metodologia para esta furanocumarina

deverão ser realizados.

4.1.2. Cápsulas e comprimidos

A metodologia de extração dos medicamentos fitoterápicos em cápsulas

E, G e comprimidos H, I já havia sido determinada em nosso laboratório. Várias

formas de extração de psoraleno, bergapteno e DT foram testadas, variando o tipo e

volume de solvente e os tempos de ultra-som e centrifugação. A preparação

otimizada das amostras utilizava a quantidade de 100 mg de cada amostra, 10 mL

de metanol-clorofórmio 7:3 como solvente extrator com 15 minutos em ultra-som e

10 minutos em centrifugação para extração das furanocumarinas.



60

Um novo medicamento fitoterápico foi adicionado ao trabalho em

andamento no sentido de estudar a aplicabilidade do método a uma amostra com

maior complexibilidade de composição: a cápsula F que contém uma mistura de

extratos secos de 4 plantas medicinais.

Um outro medicamento contendo, segundo a bula, seiva concentrada de

uma planta medicinal e vitaminas também foi avaliado como parte complementar do

nosso trabalho. Este medicamento J não é um medicamento fitoterápico segundo a

legislação73 por possuir em sua formulação substâncias ativas isoladas, o que o

difere de todos os outros medicamentos já presentes no desenvolvimento da

metodologia.

Para avaliar o melhor solvente extrator para furanocumarinas nos

medicamentos F e J, foi empregado o mesmo tempo em ultra-som e centrifugação já

estipulados para as outras cápsulas e comprimidos estudados. A análise das

soluções metanólicas resultantes da extração destas novas amostras por CLAE-UV

e CG-EM selecionou a mistura de solventes: metanol-clorofórmio 7:3 v/v.

O procedimento de recuperação foi realizado para confirmar a eficiência

da extração para os medicamentos F e J. Como a recuperação foi eficiente apenas

para o medicamento em cápsulas F, este foi reunido às amostras já analisadas (E,

G, H, I), sendo o método otimizado descrito a seguir: cada amostra (100 mg) é

extraída com 10 mL de metanol - clorofórmio 7:3 v/v em ultra-som por 15 minutos e

então centrifugada por 10 minutos. O resíduo é reextraído mantendo-se o mesmo

solvente, tempo em ultra-som e centrifugação. Os dois extratos são reunidos e o

solvente evaporado até a secura sob atmosfera de nitrogênio. Este resíduo é

dissolvido em 2 mL de metanol, filtrado através de filtro Millex de 0,45 μm e a

solução completada para 5 ou 10 mL com metanol em balão volumétrico para ser

analisada por CLAE-UV (Figuras 21 a 25).



61


medicamento E.


medicamento F.



62


medicamento G.


medicamento H.



63


medicamento I.

4.2. Validação das Metodologias

Os cálculos de validação do método para cápsulas e comprimidos

anteriormente trabalhados (cápsulas E,G e comprimidos H, I) e os cálculos de

validação para a amostra que se enquadrou no método (cápsula F), estão reunidos,

para efeito deste trabalho, com um único método validado, apresentado nos

resultados.

Os resultados obtidos da avaliação dos parâmetros utilizados na

validação do método de determinação de furanocumarinas em soluções orais e para

o método de determinação furanocumarinas em cápsulas e comprimidos serão

apresentados a seguir:



64

4.2.1. Recuperação

A avaliação da recuperação das furanocumarinas (psoraleno e

bergapteno) das soluções orais A, B e C com adição de padrão confirmou a

eficiência do método para a extração destas substâncias. O mesmo pode ser

afirmado para a avaliação da recuperação das furanocumarinas (psoraleno,

bergapteno e DT) das cápsulas e comprimidos. Os resultados encontrados no

processo estão descritos nas Tabelas 5 e 6.


Desenvolvimento e Validação de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em Medicamentos Fitoterápicos. 65

Tabela 5 – Porcentagens de recuperação de psoraleno e bergapteno nas soluções orais A, B e C (n=15).

Psoraleno (%) (média DP) Bergapteno (%) (média DP)

Conc. adicionada

(μg ml-1)

A B C A B C

4 95,99 1,17 97,28 0,91 96,13 1,16 98,76 0,74 98,34 1,17 96,43 1,11

40 92,35 0,35 96,55 1,14 97,19 0,99 99,89 0,87 99,97 0,89 97,29 0,67

100 93,76 0,81 99,05 0,74 98,98 1,01 94,43 0,53 98,43 0,79 98,11 1,03

200 96,83 0,97 95,95 0,87 98,37 0,78 98,26 0,93 96,86 1,05 97,81 1,15

Conc., concentração; DP, desvio padrão.



Tabela 6 – Porcentagens de recuperação de psoraleno, bergapteno e DT nas cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15).

Psoraleno (%) (média DP)

C adicionada

(μg ml-1)

E F G H I

1 97,33 1,36 97,99 0,94 97,34 0,99 97,45 1,16 97,89 0,87

20 98,79 0,85 99,14 1,37 98,98 0,96 98,96 0,78 99,44 1,11

40 99,03 0,97 99,05 0,77 99,47 1,27 99,29 0,91 99,27 0,80

Bergapteno (%) (média DP)

C adicionada

(μg ml-1)

E F G H I

1 98,13 0,81 98,87 1,12 98,01 1,19 97,89 1,10 98,67 0,83

20 99,43 0,71 99,46 0,91 99,26 0,73 99,02 0,86 99,29 1,11

40 99,01 0,67 99,39 0,80 98,11 1,03 99,44 0,93 99,33 0,76

DT (%) (média DP)

C adicionada

(μg ml-1)

E F G H I

1 97,45 1,28 97,88 0,99 97,67 0,87 97,74 1,25 98,68 1,03

20 98,99 0,73 99,35 1,27 99,01 1,13 98,76 0,89 99,50 1,19

40 99,14 1,02 99,13 0,97 98,00 1,22 99,36 1,27 99,55 0,82

C, concentração; DP, desvio padrão.



67

4.2.2. Especificidade

As análises das soluções orais, cápsulas e comprimidos não

apresentaram interferentes com tempos de retenção próximos aos das

furanocumarinas que prejudicassem a quantificação. São apresentados abaixo, dois

cromatogramas que podem ser representativos das análises de soluções orais

(Figuras 26 e 27) e dois outros representativos das análises de cápsulas e

comprimidos (Figuras 28 e 29) nos equipamentos utilizados para validação das

metodologias.


análises de soluções orais.



68

Figura 27 –Cromatograma obtido por CG-DIC representativo de análises de

soluções orais.


análises de cápsulas e comprimidos.



69

Figura 29 –. Cromatograma obtido por CG-EM representativo de análises de

cápsulas e comprimidos.

4.2.3. Limites de detecção e quantificação

Os limites de detecção em ambos os métodos em CLAE-UV, CG-DIC e

CG-EM estão descritos na tabela 7.

Tabela 7 - Limite de detecção e quantificação (μg mL-1) para psoraleno, bergapteno

e DT em CLAE-UV, CG-DIC e CG-EM.

Psoraleno Bergapteno DT

LD LQ LD LQ LD LQ

CLAE-UV 0,03 0,10 0,07 0,23 0,24 0,80

CG-DIC 1,3 4,3 0,6 2,0 1,5 5,0

CG-EM 0,10 0,33 0,09 0,30 0,24 0,80

LD, limite de detecção, LQ, limite de quantificação.

O método em CG-DIC demonstrou maiores limites de detecção e

quantificação, enquanto os procedimentos em CLAE-UV e CG-EM apresentaram

limites de detecção e quantificação semelhantes para as substâncias de interesse

em soluções orais, cápsulas e comprimidos.



70

4.2.4. Estabilidade

Nenhuma mudança na concentração de psoraleno, bergapteno e DT foi

detectada nas soluções padrões de trabalho depois de 24 horas a 22 ºC, 2 meses a

4 oC e 6 meses de estocagem a -5 oC.

Psoraleno, bergapteno e DT foram estáveis nas soluções de análise dos

medicamentos (condição otimizada) após 24 h a 22ºC, um mês a 4º e 6 meses a -

5ºC. Os métodos validados para análise de furanocumarinas em soluções orais e em

cápsulas e comprimidos podem ser considerados como estáveis.

4.2.5. Curva de calibração

As curvas de calibração para análise de soluções orais foram lineares no

intervalo de 1,0-600,0 g mL-1 para psoraleno e 1,0-400,0 μg mL-1 para bergapteno

em CLAE-UV e no intervalo de 5,0-600,0 μg mL-1 para psoraleno e 5,0-400,0 μg mL-1

para bergapteno em CG-DIC (Tabela 8). O desvio padrão das áreas dos picos das

replicatas das injeções (n=5) foi menor que 2% mostrando boa repetitividade dos

equipamentos.

As curvas de calibração para análise de cápsulas e comprimidos foram

lineares no intervalo de 1,0-50,0 µg mL-1 para psoraleno, bergapteno e DT em CLAE-

UV e em CG-EM (Tabela 9). O desvio padrão das áreas dos picos das replicatas das

injeções (n=5) foram menores que 1% mostrando boa repetitividade dos

equipamentos.



71


quantitativa de psoraleno e bergapteno por CLAE-UV e CG-DIC para soluções orais.

CLAE-UV CG-DIC

Substâncias Psoraleno Bergapteno Psoraleno Bergapteno

FL (μg ml-1) 1-600 1-400 10-100 5-90

b 0,38437 0,36371 0,35642 0,35431

a 0,05459 0,02154 0,05357 0,02343

Pa 0,05008 0,04391 0,05176 0,04773

Pb 0,00169 0,00139 0,00161 0,00148

r 0,9998 0,9998 0,9998 0,9997

n 9 9 10 10

FL: faixa de linearidade, b: inclinação da curva, a: intersecção no eixo y, Pb: desvio padrão da

inclinação da curva, Pa: desvio padrão do intersecção no eixo y, r: coeficiente de correlação, n:

número de dados. Fórmula da regressão linear: y= a + bx, onde y= área do pico, x= concentração (μg

mL-1

).


quantitativa de psoraleno, bergapteno e DT por CLAE-UV e CG-DIC para cápsulas e

comprimidos.

CLAE-UV CG-EM

Substâncias Psoraleno Bergapteno DT Psoraleno Bergapteno DT

FL (μg ml-1) 1-50 1-50 1-50 1-50 1-50 1-50

b 0,21645 0,23119 0,34576 0,35345 0,37781 0,49872

a 0,03337 0,02137 0,03236 0,04139 0,03901 0,04789

Pa 0,02345 0,02101 0,02905 0,02678 0,02341 0,02659

Pb 0,00132 0,00129 0,00157 0,00229 0,00237 0,00217

r 0,9998 0,9999 0,9997 0,9998 0,9998 0,9997

n 10 10 10 10 10 10

FL: faixa de linearidade, b: inclinação da curva, a: intersecção no eixo y, Pb: desvio padrão da

inclinação da curva, Pa: desvio padrão da intersecção no eixo y, r: coeficiente de correlação, n:

número de dados. Fórmula da regressão linear: y= a + bx, onde y= área do pico, x= concentração (μg

mL-1

).



72

4.2.6. Linearidade do método

A linearidade dos métodos foi determinada por regressão linear. As

análises das amostras com adição de quantidades conhecidas de padrões

demonstraram que a resposta do método foi proporcional às concentrações das

amostras, com um coeficiente de determinação r2: 0,9998 no intervalo linear da

curva de calibração para as amostras de A, B, C, E, F, G, H e I em ambos

equipamentos. Os valores de furanocumarinas para as amostras analisadas pela

extrapolação da reta no eixo x da curva da linearidade do método foram

semelhantes aos encontrados pela curva de calibração empregando padrão externo.

4.2.7. Acurácia e precisão

Os valores de acurácia foram menores que 6% (Tabelas 10 e 11) para

análises de soluções orais e menores que 5% para análise de cápsulas e

comprimidos (Tabelas 12 e 13). Em relação à precisão do método, os coeficientes

de variação (CVs) intradia e interdia foram menores que 6% (Tabelas 10 e 11) para

soluções orais e menores que 5% para cápsulas e comprimidos (Tabelas 12 e 13).

Estes dados indicam que os métodos são precisos dentro do mesmo dia e em três

diferentes dias. A análise da repetitividade de injeção foi discutida na curva de

calibração. A avaliação da variabilidade do método por diferentes analistas mostrou

um CV menor que 2%.



73


ml-1)(média DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B e

C (n=12).

Psoraleno Bergapteno

C adicionada

(μg mL-1)

C determinada

Acurácia

(%)

CV

(%)

C determinada Acurácia

(%)

CV

(%)

4 3,9 0,17 -2,5 4,35 3,8 0,18 5,0 4,73

40 41,0 0,83 2,5 2,02 42,0 1,13 5,0 2,69

200 202,0 2,39 1,0 1,18 203,0 3,05 1,5 1,50

C, concentração; CV, coeficiente de variação; DP, desvio padrão.


ml-1) (média DP) de psoraleno e bergapteno em amostras das soluções orais A, B

e C (n=15).

Psoraleno Bergapteno

C adicionada

(μg mL-1)


(%)

CV

(%)


(%)

CV

(%)

4 3,9 0,16 2,5 4,10 3,9 0,15 2,5 3,85

40 42,0 2,07 5,0 4,93 42,0 1,79 5,0 4,26

200 204,0 3,23 2,0 1,58 203,0 3,91 1,5 1,93




Tabela 12 - Acurácia e precisão intradia do método por CLAE para determinação (μg mL-1) (média DP) de psoraleno,

bergapteno e DT em amostras de cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15).


C adicionada

(μg mL-1)


(%)

CV

(%)


(%)

CV

(%)


(%)

CV

(%)

1 1,03 0,05 3,00 4,85 1,01 0,04 1,00 3,96 1,03 0,05 3,00 3,96

20 19,51 0,53 2,45 2,72 20,02 0,47 0,10 2,35 20,08 0,57 0,40 2,84

40 39,32 0,91 1,70 2,31 39,51 0,85 1,23 2,15 39,43 0,99 0,14 2,51


Tabela 13 - Acurácia e precisão interdia do método por CLAE para determinação (μg mL-1) (média DP) de psoraleno,

bergapteno e DT em amostras de cápsulas e comprimidos E, F, G, H e I (n=15).


C adicionada

(μg mL-1)

C determinada

Acurácia

(%)

CV

(%)

C determinada

Acurácia

(%)

CV

(%)

C determinada

Acurácia

(%)

CV

(%)

1 1,05 0,05 5,00 4,76 1,02 0,05 2,00 4,90 1,03 0,05 3,00 3,96

20 19,78 0,59 1,10 3,01 20,06 0,51 0,30 2,54 20,10 0,42 0,50 4,20

40 39,50 0,82 1,25 2,08 39,63 0,79 0,93 1,99 39,50 0,87 1,25 2,20




75

4.3. Avaliação das Quantidades Obtidas nos Medicamentos Analisados

As soluções orais A, B e C, os medicamentos em cápsulas E e F e o

medicamento em comprimido H não mostraram discrepâncias na quantidade de

furanocumarinas na comparação dos lotes analisados (Tabelas 14 e 15). A solução

oral C mostrou discrepâncias na quantidade de psoraleno entre os lotes atingindo

20% (Tabela 14). O medicamento G mostrou discrepâncias de 150 a 240% na

quantidade de psoraleno e de 4 a 30% na quantidade de bergapteno (Tabela 15).

Tabela 14 - Quantidade (μg mL-1) (média DP) de furanocumarinas nas soluções

orais empregando o método com CLAE-UV (n=15).

Soluções orais Psoraleno Bergapteno

A1 274 4,3 65 2,9

A2 272 4,1 63 2,1

A3 260 4,9 66 2,0

B1 530 3,1 134 3,6

B2 522 5,9 128 3,2

C1 265 4,9 72 2,8

C2 314 6,7 84 3,4

C3 325 7,3 90 2,1

DP, desvio padrão.



76

Tabela 15 - Quantidade (μg/100 mg de cápsula ou comprimido) (média DP) de

furanocumarinas empregando o método com CLAE-UV (n=15).

Medicamentos Psoraleno Bergapteno DT

E1 250 1,4 83 1,3 -

E2 249 1,3 85 0,9 -

E3 250 1,4 80 1,2 -

F1 210 2,2 60 1,7 10 0,3

F2 213 2,2 63 2,1 12 0,3

F3 210 2,0 67 1,4 14 0,4

G1 172 2,6 75 1,9 -

G2 70 1,1 72 2,5 -

G3 237 2,4 94 3,3 -

H1 225 2,2 55 1,7 11 0,2

H2 232 2,2 56 2,1 13 0,3

H3 222 2,0 53 1,4 12 0,4

I1 - - -

I2 - - -

I3 - - -

DP, desvio padrão.

A presença de DT foi somente detectada na solução oral C (Figura 20), no

medicamento em cápsula F, e no medicamento em comprimidos H. Não foi

detectada a presença de furanocumarinas no medicamento em comprimido I (Tabela

15 e Figuras 21 a 25).

Os resultados da avaliação interequipamento dos métodos estão listados

nas Figuras 30 e 31.



77

0

100

200

300

400

500

600

A1 A2 A3 B1 B2 C1 C2 C3

Co

nce

ntr

açã

o (

μg

mL-1

)

Psoraleno: CLAE-UV

Psoraleno: CG-DIC

Bergapeno: CLAE-UV

Bergapteno: CG-EM

Figura 30 – Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno

e bergapteno nos diferentes lotes de soluções orais A, B e C por análise em CLAE-

UV e CG-DIC.



0

50

100

150

200

250

300

E1 E2 E3 F1 F2 F3 G1 G2 G3 H1 H2 H3

Co

nce

ntr

açã

o (

µg

mL-1

)

Psoraleno: CLAE-UV

Psoraleno: CG-EM

Bergapteno: CLAE-UV

Bergapteno: CG-EM

DT: CLAE-UV

DT: CG-EM

Figura 31 - Comparação entre as quantidades determinadas (µg mL-1) de psoraleno, bergapteno e DT nos diferentes lotes de

medicamentos E, F, G, H e I por análise em CLAE-UV e CG-EM.



79

As análises não revelaram diferenças estatísticas significativas dentre os

dados obtidos pelos dois aparelhos seguindo o mesmo método otimizado, para um

nível de significância de 95%, o que garante uma boa reprodutividade de

equipamento.

Além dos dados de precisão interequipamento, a análise em CG-DIC e

CG-EM foi necessária para confirmar com maior segurança os valores (μg mL-1)

encontrados de furanocumarinas nas amostras, dada a inexistência de matrizes

brancas tanto para o método de soluções orais, como para o de cápsulas e

comprimidos. Além disso, um dos objetivos do trabalho era avaliar a possibilidade do

método desenvolvido em CLAE-UV ser convertido em método por CG-DIC. Para

isso, todas as análises realizadas em CLAE-UV foram refeitas em CG-DIC, no caso

do método de soluções orais. Para o método de cápsulas e comprimidos foi utilizado

CG-EM.

O comprimido J apresentou quantidades pequenas de furanocumarinas

que variaram de 0,015 a 0,030 mg de psoraleno e 0,010 a 0,035 mg de bergapteno /

comprimido nas triplicatas realizadas. Além disso, a grande quantidade de

substâncias polares (vitaminas) presentes na amostra resultou em picos muito

grandes no cromatograma de CLAE-UV (Figura 32) dificultando a integração dos

picos das furanocumarinas. Não foi possível estimar a quantidade de

furanocumarinas pela adição de padrão, uma vez que o método não apresentou

repetitividade.



80

Figura 32 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV da extração do

comprimido J.

Algumas tentativas de separação em fase sólida destas vitaminas foram

testadas, porém sem sucesso.

Utilizando os dados obtidos por CLAE-UV, as soluções orais analisadas

apresentaram psoraleno em concentrações entre 0,26 mg mL-1 – 0,53 mg mL-1 e

bergapteno entre 0,06 mg mL-1 – 0,13 mg mL-1 (Tabela 14). Segundo a bula, a dose

recomendada pelos fabricantes das soluções orais A, B e C é de 15 mL/dia (em

média 5,92 mg de psoraleno e 1,42 mg de bergapteno). Ao final de uma semana, a

quantidade total ingerida seria de 53,38 mg de furanocumarinas.

Os medicamentos em cápsulas e comprimidos analisados apresentaram

concentrações entre 0,35 – 1,25 mg de psoraleno; 0,265-0,47 mg de bergapteno e

0,05-0,07mg de DT (Tabela 15). A dose recomendada pelos fabricantes é de três

cápsulas ou comprimidos / dia (em média 2,40 mg de psoraleno, 1,10 mg de

bergapteno e 0,18 mg de DT). Ao final de uma semana, a quantidade total ingerida

seria de 25,76 mg de furanocumarinas utilizando os dados de CLAE-UV.



81

Os valores indicam que a dose de furanocumarinas nas soluções orais,

cápsulas e comprimidos, normalmente, são subterapêuticas para os tratamentos de

doenças de pele. Na medicação sistêmica para doenças de pele é indicada a

ingestão de 1,2 mg/kg de bergapteno (5-MOP); 0,2 a 0,4 mg/kg de xantotoxina (8-

MOP) ou 0,6 a 0,8 mg/kg de trimetilpsoraleno (TMP) duas vezes por semana, duas

horas antes da exposição à radiação UVA105. Considerando-se uma pessoa com

peso médio de 60 kg, esta deveria consumir em média, 144 mg de bergapteno, 36

mg de xantotoxina ou 84 mg de trimetilpsoraleno por semana.

Porém são dados que confirmam os riscos a que os consumidores estão

expostos pelo desconhecimento das substâncias que estão ingerindo e pela

desinformação sobre a potencialização dos efeitos carcinogênicos, mutagênicos e

fototóxicos das furanocumarinas pela exposição à luz do Sol. Em alguns países em

desenvolvimento, a fotoquimioterapia utiliza a luz natural do Sol como a fonte de

luz17. Além disso, o psoraleno é mais tóxico que a xantotoxina, a furanocumarina

normalmente prescrita pelos médicos21 e foi o psoraleno, a furanocumarina

encontrada em maior quantidade nos medicamentos estudados (Tabelas 14 e 15).

Segundo a literatura, as cumarinas reúnem um amplo espectro de ações

farmacológicas, como antiarrítmica, vasodilatadora, hipotensora, anticoagulante,

broncodilatadora, bloqueadora da junção neuro-muscular, espasmolítica,

simpatolítica entre outras106,107. As furanocumarinas, no entanto, têm o seu uso

terapêutico relacionado à incidência crescente de câncer. Por isso, sua utilização

necessita de uma avaliação risco-benefício rigorosa107. Acreditamos os

medicamentos A, B, C, D, E, F e G apresentem espécies de Dorstenia em suas

formulações devido às propriedades anticoagulantes das cumarinas. Portanto, o uso

de fitoterápicos contendo furanocumarinas no tratamento de distúrbios menstruais

pode ser considerado de alto risco, se considerarmos esta avaliação.

Como não há informação nas bulas ou informativos da presença de

furanocumarinas nestes medicamentos, há ainda a possibilidade dos medicamentos

serem ingeridos por longos períodos, dado suas indicações diversas como



82

tratamento dos sintomas da menopausa e de cólicas menstruais, aumentando

assim, o risco de desenvolver carcinomas.

4.4. Outros Estudos Realizados

4.4.1. Novas condições cromatográficas

Para determinar o perfil cromatográfico dos medicamentos A, B e C, foi

necessário obter uma melhor resolução dos picos das substâncias que eluem no

intervalo de tempo 0 a 4 minutos na condição utilizada para quantificação de

furanocumarinas (Figuras 11 a 13). Foram testadas outras condições

cromatográficas isocráticas e em fluxo de gradiente para CLAE utilizando misturas

binárias e ternárias dos solventes: água, metanol e acetonitrila.

O eluente que proporcionou melhor separação dos picos das substâncias

mais polares que as furanocumarinas foi: metanol-água-acetonitrila 16:64:20 v/v/v,

com fluxo de 1 mL / minuto (condição isocrática para estudo do perfil

cromatográfico). Nesta nova condição cromatográfica, os picos de psoraleno e

bergapteno eluíram com tempo inferior a 50 minutos. Apenas a solução oral C

apresentou substâncias em menor quantidade com tempo de retenção superior a 50

minutos. Para análises desta última, a aquisição dos dados foi realizada em 50

minutos, seguidos de mais 50 minutos para eluição de todas as substâncias.

As análises das soluções orais na condição isocrática para estudo do

perfil cromatográfico nos comprimentos de onda 223, 254, 287 e 362 nm

apresentaram maior número e área de picos para as soluções B, C e D em 223 nm e

equivalência em 223 e 254 nm para solução A. Por este motivo, a absorbância

utilizada foi 223 nm (Figuras 33 a 35).



83


para estudo do perfil cromatográfico do medicamento A (amostra bruta).


para estudo do perfil cromatográfico do medicamento B (amostra bruta).



84


para estudo do perfil cromatográfico do medicamento C (amostra bruta).

A melhor condição isocrática determinada para análise das soluções orais

ainda apresentava muitos picos coeluindo, não sendo ainda, a ideal para a

comparação de perfis cromatográficos. Foram testadas então, condições

cromatográficas em gradiente.

A condição gradiente G1 com fluxo de 1,2 mL / minuto promoveu uma

pressão que foi além de 250 kgf, não permitida pela programação do aparelho.

Mesmo padronizando o fluxo de 1 mL / minuto para as duas condições (G1 e G2), a

melhor condição gradiente foi a obtida em G2, que permitiu uma boa separação dos

picos das amostras dos medicamentos sendo a mais indicada para o estudo de perfil

cromatográfico destes.



85

A análise do perfil cromatográfico das soluções orais A, B e C em CLAE-

UV na condição G2 permitiu uma melhor comparação dos perfis cromatográficos das

amostras brutas (Figuras 36 a 38) e das respectivas soluções resultantes da

metodologia de extração (Figuras 39 a 44). A comparação entre os cromatogramas

das amostras brutas (Figuras 36 a 38) e das soluções para quantificação das

furanocumarinas (Figuras 39 a 41) mostra que a metodologia de extração exclui uma

série de picos conjuntos com tempos de retenção próximos aos tempos de retenção

das furanocumarinas na condição gradiente, o que veio a facilitar mais o processo

de análise. Como exemplo, os interferentes presentes na amostra bruta do

medicamento A (Figura 36) foram eliminados pelo método, estando presente na

solução para estudos posteriores (Figura 42). Apenas um pico com tempo de

retenção 14,9 minutos no cromatograma da solução oral B (Figura 37) foi encontrado

em grande quantidade tanto na solução para quantificação de furanocumarinas

como na solução para estudos posteriores (Figuras 40 e 43).


medicamento A (amostra bruta).



86


medicamento B (amostra bruta).


medicamento C (amostra bruta).



87


solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento A.


solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento B.



88


solução para quantificação de furanocumarinas do medicamento C.


solução para estudos posteriores do medicamento A.



89


solução para estudos posteriores do medicamento B.


solução para estudos posteriores do medicamento C.

Os perfis cromatográficos dos lotes analisados para cada solução oral

foram muito semelhantes, tanto na condição isocrática como na condição gradiente

selecionadas para estudo de perfil.



90

4.4.2. Hidrólise das soluções orais A, B e C

A fim de avaliar a possível presença de glicosídios furanocumarínicos nas

soluções orais A, B e C, foram realizadas hidrólises enzimáticas das amostras.

Para a solução oral hidrolisada ter características semelhantes às das

soluções não hidrolisadas, as amostras foram reconstituídas com álcool etílico de

cereais para aproximar-se da graduação alcoólica de 70º geralmente presente na

maioria das formulações de tinturas.

As tinturas hidrolisadas foram analisadas em CLAE-UV, não

demonstrando nenhuma mudança significativa nos valores de psoraleno e

bergapteno, além de não haver aparecimento de novos picos no cromatograma.

Os cromatogramas, em condição gradiente, das amostras hidrolisadas

não apresentaram mudanças no perfil cromatográfico se comparado com os das não

hidrolisadas.


fitoterápicos

4.4.3.1. Determinação do comprimento de onda

As análises preliminares por cromatografia líquida das tinturas de cipó

caboclox, agoniadax e carapiáx preparadas com álcool etílico 96º e com álcool etílico

65º, mostraram as presenças de psoraleno e bergapteno somente nas duas tinturas

de carapiá. A maioria das tinturas de álcool 65º apresentou contaminação por fungos

durante o processo de secagem, devido ao maior teor de água e o longo tempo

(aproximadamente 48 horas) requerido para levá-las à secura em capela.

A análise por CLAE-UV, na condição isocrática para estudo do perfil

cromatográfico, das amostras de agoniadax, cipó caboclox, carapiáx e mamica de



91

cadelax adquiridas no mercado, mostrou que o comprimento de onda de 223 nm,

escolhido para as soluções orais, cápsulas e comprimidos, também foi o mais

apropriado para a análise dos constituintes destas plantas. Os cromatogramas

indicaram melhor separação dos picos das substâncias mais polares que as

furanocumarinas, em comparação à condição utilizada para a quantificação das

furanocumarinas. Como exemplo, estão a seguir os cromatogramas de carapiáx nas

duas condições (Figuras 45 e 46).

Figura 45 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição para

quantificação de furanocumarinas, de extrato etanólico de carapiáx.



92

Figura 46 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV, na condição isocrática

para estudo do perfil cromatográfico, de extrato etanólico de carapiáx.

Para as amostras de agoniada e cipó caboclo, os tempos necessários

para eluição foram de 10 minutos, para o carapiá, de 47 minutos (devido à presença

de furanocumarinas). Esta condição cromatográfica não foi adequada apenas para a

mamica de cadela, pois a amostra possui picos cromatográficos com maiores

tempos de retenção que eluem após os 50 minutos.

4.4.3.2. Comparação de perfis cromatográficos dos extratos de agoniada

A análise dos perfis cromatográficos por CLAE-UV dos extratos de

agoniadax,y,z apresentaram muitas semelhanças nos tempos de retenção dos picos,

porém a proporção entre as alturas dos picos variou muito, inclusive com a presença

de um pico em tempo de retenção de 10,7 minutos no cromatograma do extrato de

uma amostray, resquícios deste em outrox e ausência do mesmo no terceiroz

(Figuras 47 a 49). Na comparação entre os métodos de extração, houve muita

semelhança nos perfis cromatográficos tanto no tempo de retenção dos picos quanto

na proporção entre as áreas dos mesmos.



93


para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniadax.


para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniaday.



94


para estudo do perfil cromatográfico do extrato etanólico de agoniadaz.

4.4.3.3. Teores de furanocumarinas em Brosimum gaudichaudii

A extração de raiz, caule e folhas de B.gaudichaudiix mostrou que a maior

parte das furanocumarinas, cerca de 99% do psoraleno e do bergapteno presente na

planta encontrava-se em suas raízes. Foram verificados valores menores que

0,003% destas substâncias no caule e ausência nas suas folhas (Figuras 50 a 52).



95

Figura 50 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV de extrato etanólico de

raiz de Brosimum gaudichaudiix.


caule de Brosimum gaudichaudiix.



96


folhas de Brosimum gaudichaudiix.

Uma análise posterior com amostras da mesma coleta mostrou que cerca

de 95% do psoraleno e 94% do bergapteno da raiz encontravam-se na casca

(Figuras 53 e 54).

Figura 53 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (10 µL da solução final

de 10 mL) do extrato etanólico de lenho da raiz de Brosimum gaudichaudiix.



97

Figura 54 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV (5 µL solução final de 25

mL) do extrato etanólico de casca da raiz de Brosimum gaudichaudiix.

4.4.3.4. Comparação entre amostras de carapiá, mamica de cadela, Dorstenia

brasiliensis e Brosimum gaudichaudii

Tanto as amostras de carapiáx,y e Dorstenia multiformesx comercializadas

em Campo Grande, como as amostras de mamica de cadelax e Brosimum

gaudichaudiix mostraram perfis cromatográficos semelhantes em CLAE-UV na

condição utilizada para quantificação de furanocumarinas, quanto aos tempos de

retenção e quanto à presença de furanocumarinas. No entanto, os cromatogramas

das amostras de carapiáx,y apresentavam maior quantidade de substâncias mais

polares que as furanocumarinas em relação aos de D. brasiliensisx (Figuras 55 a

57). O inverso pode-se dizer para os cromatogramas de mamica de cadela em

relação aos da raiz de Brosimum gaudichaudiix (Figuras 58 e 59).



98


carapiáx.


carapiáy.



99


rizoma de Dorstenia brasiliensisx.


mamica de cadelax.



100


raiz de Brosimum gaudichaudiix.

Quanto à proporção entre psoraleno e bergapteno, as amostras de

carapiáx,y e D. brasiliensisx contiveram sempre maior proporção de psoraleno

(Figuras 55 a 57 e Tabela 16), enquanto que nas amostras de mamica de cadelax e

B .gaudichaudiix,y,z, foi verificada uma maior variação entre as proporções destas

substâncias (Figuras 58 e 59 e Tabela 16).


amostra) extraídos pelo procedimento com álcool etílico absoluto e reextrações com

clorofórmio.

Amostra Psoraleno (%) Bergapteno (%)

Carapiáx 0,62 0,11

Carapiáy 0,40 0,10

D.brasiliensisx (rizoma) 0,69 0,17

Mamica de cadelax <0,01 0,48

B.gaudichaudiix (raiz bruta) 0,36 1,07

B.gaudichaudiix (casca da raiz) 2,09 3,49

B.gaudichaudiiy (casca da raiz) 1,10 0,16

B.gaudichaudiiz (casca da raiz) 0,04 1,02



101

Acreditamos que a variação das porcentagens de psoraleno e bergapteno

e as diferentes proporções entre as duas furanocumarinas presentes nas cascas das

raízes das amostras identificadas de B. gaudichaudiix,y,z provenham de uma possível

variabilidade intrínseca ou sazonal da espécie. Na literatura existem relatos de

variação sazonal do teor de bergapteno, xantotoxina e psoraleno em Apium

graveolens110. Além disso, não se conhece a idade dos espécimes de B.

gaudichaudii, cada um se desenvolve em um microambiente diferente e cada um

deles foi coletado num período do ano diferente. O segundo espécime

(B.gaudichaudiiy) estava fortemente parasitado por insetos xilófagos, ou seja, a raiz

estava toda carcomida, mas a planta persistia vigorosa o que aumentou o número de

variáveis envolvidas no processo. Como a comparação entre os espécimes não foi

realizada em replicata, necessita-se de mais estudos para que se possam obter

conclusões definitivas.

A análise das soluções metanólicas para análise do látex de Brosimum

gaudichaudiix,y,z, não revelou a presença das furanocumarinas monitoradas na

amostra.

A análise do látex foi importante, pois o medicamento J possui em sua

formulação, segundo a bula, cerca de 400 mg de seiva concentrada da espécie por

comprimido. Porém, geralmente há um equívoco no termo “seiva” utilizado nos

medicamentos fitoterápicos, pois o que realmente se coleta são o látex, resinas ou

gomas, produtos de tecidos secretores vegetais. Como Brosimum gaudichaudii

possui látex, a análise foi realizada com este material.

4.4.3.5. Maceração e percolação de Dorstenia brasiliensis e Brosimum

gaudichaudii

Tinturas são produzidas geralmente com álcool etílico 65º ou 70º103. Na

formulação de produtos farmacêuticos hidroalcoólicos de uso oral, utiliza-se álcool

etílico de cereais, como é de consenso da maioria das farmácias de manipulação.



102

A proporção material vegetal – volume da tintura final 1:5 m/v foi utilizada

porque o objetivo seria obter tinturas utilizando método semelhante aos utilizados

pelos fabricantes das soluções orais. As soluções orais A e B não forneciam esta

informação, mas a solução oral C indicava, em sua bula, a proporção 1:5.

As tinturas produzidas por percolação e maceração, baseado nos

resultados da quantificação das furanocumarinas utilizando CLAE-UV, mostraram

que as técnicas podem ser consideradas equivalentes quanto à extração das

furanocumarinas psoraleno e bergapteno em D. brasiliensisx. A percolação mostrou-

se mais eficiente para B. gaudichaudiiy (Tabela 17).


amostra) nas tinturas de D.brasiliensisx e B.gaudichaudiiy obtidas por maceração e

percolação.

Amostras Método Psoraleno (%) Bergapteno (%)

D.brasiliensisx Percolação 0,85 0,19

D.brasiliensisx Maceração 0,75 0,17

B.gaudichaudiiy Percolação 1,18 0,20

B.gaudichaudiiy Maceração 0,61 0,10

A comparação dos perfis cromatográficos das tinturas de D.brasiliensisx

por CLAE-UV em condições G2 mostrou muita semelhança entre as duplicatas

realizadas e entre os dois processos de extração. O mesmo foi verificado para as

tinturas de B.gaudichaudiiy. Como os perfis cromatográficos foram muito

semelhantes são apresentados abaixo os cromatogramas representativos para cada

espécie (Figuras 60 e 61).



103


tintura produzida por percolação de Dorstenia brasiliensisx.


tintura produzida por percolação de Brosimum gaudichaudiiy.

A comparação dos perfis cromatográficos em condições G2 das tinturas

farmacopéicas de D.brasiliensisx e B.gaudichaudiiy (Figuras 60 e 61) e das tinturas

produzidas pelo método com álcool etílico absoluto com reextrações com clorofórmio



104

(Figuras 54 e 57), mostrou semelhanças nos tempos de retenção das substâncias e

proporções de furanocumarinas em ambas as espécies. Uma diferença encontrada

foi a maior área dos picos na região inicial dos cromatogramas das tinturas

farmacopéicas, relacionada às substâncias mais polares. Isto se deve

provavelmente à maior polaridade do solvente extrator utilizado – álcool etílico de

cereais 70º, se comparado com o álcool etílico absoluto e clorofórmio utilizados no

outro processo.

Como a solução oral D é formulada somente por tintura de carapiá (no

caso, D. multiformes), foi realizada uma comparação de perfil cromatográfico desta

com as tinturas farmacopéicas de D.brasiliensisx em condições G2. Os

cromatogramas apresentaram-se muito semelhantes (Figuras 60 e 62), inclusive na

presença de maior área dos picos na região mais polar, o que indica que a solução

D também foi preparada com solvente hidroalcoólico.

Figura 62 – Cromatograma obtido da análise por CLAE-UV na condição G2 do

medicamento D (amostra bruta).

As quantidades de psoraleno e bergapteno (µg mL-1) determinadas nas

soluções orais A, B e C serviram como dados para estimativa destas substâncias

nas tinturas de Dorstenia multiformes presentes na formulação destas soluções. A



105

solução oral D não participou da validação, mas a metodologia validada foi aplicada

a esta solução. A comparação entre as quantidades estimadas de furanocumarinas

nas tinturas de D. multiformes para cada solução oral, considerando todos os lotes, e

as médias destas mesmas furanocumarinas determinadas nas tinturas de D.

brasiliensisx obtidas por percolação e maceração estão apresentadas na Tabela 18.

Tabela 18 – Comparação entre as quantidades (μg mL-1) de furanocumarinas

presentes nas tinturas de D.multiformes presentes nas soluções orais A, B, C e D e

as quantidades determinadas nas tinturas de D.brasiliensisX obtidas por maceração

e percolação.

Tinturas Psoraleno Bergapteno

Tintura de D. multiformes na solução oral A 1074 259

Tintura de D. multifomes na solução oral B 1052 262

Tintura de D. multiformes na solução oral C 1506 410

Tintura de D. multiformes na solução oral D 1052 483

Tintura de D. brasiliensisx por maceração 1703 352

Tintura de D. brasiliensisx por percolação 1507 311

As tinturas de D. multiformes presentes nas formulações das soluções A e

B apresentam praticamente os mesmos valores de psoraleno e bergapteno, o que

sugere que sejam formuladas a partir da mesma tintura de partida. A tintura presente

na solução oral C apresenta furanocumarinas em quantidades maiores que as

presentes nas soluções A e B, mas em quantidades mais próximas às presentes nas

tinturas produzidas por maceração e percolação, em que se utilizou a proporção de

material vegetal - volume da tintura final de 1:5 m/v. Se considerarmos que D.

multiformes seja realmente sinonímia de D. brasiliensis ou que contenham

quantidades semelhantes de furanocumarinas, pode-se supor que as tinturas

presentes nas soluções orais A e B são extraídas com a proporção de material

vegetal – volume da tintura final 1:10 m/v.

4.4.3.6 - Hidrólise de Dortenia brasiliensis e Brosimum gaudichaudii



106

A fim de avaliar a possível presença de glicosídios furanocumarínicos em

D. brasiliensisx e B. gaudichaudiiy,z, foram realizadas hidrólises enzimáticas das

amostras.

A hidrólise da amostra de D.brasiliensisx e B. gaudichaudiiy promoveu

pequena variação no conteúdo de furanocumarinas em relação às amostras não

hidrolisadas. Para as amostras de B.gaudichaudiz, foi verificado um aumento

significativo do teor de furanocumarinas. A variação obtida foi de 50% para o

psoraleno e de 126% para o bergapteno (Figura 63).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

% p

or

pe

so

se

co

Dx By Bz

Psoraleno

Psoraleno H

Bergapteno

Bergapteno H

Dx, D.brasiliensisx; By, B. gaudichaudii

y; Bz, B.gaudichaudii

z; H, amostra hidrolisada.

Figura 63 - Quantidades de psoraleno e bergapteno (porcentagem por peso seco de

amostra) nas amostras de D.brasiliensisx, B.gaudichaudiiy e B.gaudichaudiiz

hidrolisadas e não hidrolisadas.

Novos experimentos em replicata devem ser realizados para confirmar se

há aumento do teor de furanocumarinas apenas na amostra de B.gaudichaudiiz.

Conclusões


107

5. CONCLUSÕES

As análises das soluções orais por CLAE-UV e CG-DIC e das cápsulas e

comprimidos por CLAE-UV e CG-EM segundo os métodos otimizados foram

validados segundo as normas da ICH, mostrando boa especificidade, acurácia,

precisão e linearidade. Portanto, cada um dos instrumentos pode ser usado em

análises de psoraleno e bergapteno em soluções orais e de psoraleno, bergapteno e

DT nas cápsulas e comprimidos.

Devido à grande variedade de formulações dos medicamentos utilizados

no desenvolvimento dos métodos, os métodos validados podem ser utilizados para

análise de furanocumarinas em outras formulações de fitoterápicos presentes no

mercado.

Foram encontradas furanocumarinas nos medicamentos A, B, C, D, E, F e

G e H sem que a informação estivesse presente nas bulas. Como a maioria destes

medicamentos é utilizada para tratamento de distúrbios menstruais e de sintomas da

menopausa, sem a devida orientação dos consumidores da presença das

furanocumarinas, é possível que casos de câncer sejam desenvolvidos com o uso

continuado desses medicamentos fitoterápicos.

As amostras de carapiá presentes no mercado assemelharam-se à

amostra identificada de Dorstenia brasiliensis quanto à proporção de psoraleno e

bergapteno. As amostras identificadas de Brosimum gaudichaudii apresentaram

muita variação quanto às proporções e quantidades de furanocumarinas, sendo

material de estudo de novos experimentos.

Percolação e maceração, métodos farmacopéicos de extração

mostraram-se muito eficientes na extração de furanocumarinas. Mostraram-se

praticamente equivalentes para Dorstenia multiformes. A percolação mostrou-se

mais eficiente para Brosimum gaudichaudii.

Conclusões


108

O látex foi avaliado nos 3 espécimes de Brosimum gaudichaudii

analisados. Como não foi detectada a presença de furanocumarinas, sugere-se que

o medicamento seja formulado com outra parte da planta.

Referências

Desenvolvimento de Metodologias para Determinação de Furanocumarinas em Medicamentos Fitoterápicos

109

6. REFERÊNCIAS

1. YUNES, R, A.; PEDROSA, R. C; FILHO, V. C. Fármacos e fitoterápicos: a

necessidade do desenvolvimento da indústria de fitoterápicos e fitofármacos no

Brasil. Química Nova, v.24, n.1, p.147-152, 2001.

2. CRAGG, G. M.; NEWMAN, D. J.; SNADER, K. M. Natural products in drug

discovery and development. Journal of Natural Products, v.60, p.52-60, 1997.

3. HOSTETTMAN, K.; QUEIROZ, E. F.; VIEIRA, P. C. Princípios ativos de plantas

superiores. São Carlos: UFSCar, 2003.

4. VILEGAS, J. H. Y. Tese de Livre Docência – USP, São Carlos. 2001.

5. BACCHI, E. M. Controle de qualidade de fitoterápicos. In: Di STASI, L. C. (Org.).

Plantas Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São

Paulo: UNESP, 1996. Cap. 12.

6. OKIGANI, H. Fitoterápicos: Uma viagem em extratos testados clinicamente.

Science News, v.1, n.1,2000.

7. VILEGAS, W.; VILEGAS, J. H. Y.; POZETTI, G. L. Furanocoumarins from

Brasilian Dorstenia ssp. Rev. Latinoam.Quim., v.23, p.78-80, 1994.

8. MURRAY, R. D. H. Coumarins. Nat. Prod. Rep., v.6, p.477-505, 1995.

9. CHIMICHI, S. et al. A convenient synthesis of psoralens. Tetrahedron, v.58,

p.4859-4863, 2002.

10. CHAUDARY, S. K. et al. Increased furocoumarin content of celery during storage.

J. Agric. Food Chem., v.33, p.1153-1157, 1985.

11. ABDEL-KADER, M. S. New ester and furocoumarins from the roots of Pituranthos

tortuosus. J. Braz. Chem. Soc., v.14, n.1, p.1-7, 2003.

Referências


110

12. DIAWARA, M. M.; TRUMBLE, J. T. Linear furanocoumarins. In: D’MELLO, J. P. F.

(Ed.). Handbook of plant and fungal toxicants. New York: CRC Press, 1997.

p.175-189.

13. LEVEQUE, N. et al. Validation fo a microdialysis-gas chromatographic-mass

spectrometric method to asses 8-methoxypsoralen in psoriatic patient dermis. J.

Chromatogr, B. n. 780, p.119-127, 2002.

14. FAPERJ 2000. Quando os linfócitos passam para o time adversário. Rio de

Janeiro, ano III, n. 18, p.6-7, jun.jul 2001. Disponível em:

http://www.faperj.br/interna.phtml?obj_id=301. Acesso em: 11 dez. 2003.

15. ZARABSKA, Z. et al. PUVA (psoralen+UVA) photochemotherapy: proceses

triggered in the cells. II Farmaco, v.55, p.515-520, 2000.

16. TEREGUN, M., OZTURK, S., SELMAN-PAKOGLU, N. An unusual cause of burn

injury: unsupervised use of drugs that contain psoralens. J. Burn. Care Rehabil.,

v.20, p.2-5, 1999.

17. ROELANDTS, R. Photo(chemo)therapy for vitiligo. Photodermatol.

Photoimmunol. Photomed., v.19, p.1-4, 2003.

18. SCOTT, B.R.; PATHAK, M. A.; MOHN, G. R. Molecular and genetic basis of

furocoumarin reactions. Mutat. Res., v.39, p.29-74, 1976.

19. DIAWARA, M. M. et al. Toxicity of linear furanocoumarins to spodopteraexigua-

evidence for antagonistic interactions. J. Chem. Ecol., v.19, p.2473-2484, 1993.

20. TRUMBLE, J. T. et al. Seasonal patterns and pesticidal effects on the phototoxic

linear furanocoumarins in celery, Apium graveolens L. J. Agric. Food Chem.,

v.40, p.1501-1506, 1992.

21. OJALA, T. et al. A bioassay using Artemia salina for detecting phototoxicity of

plant coumarins. Planta Med., v.65, p.715-718, 1999.

http://www.faperj.br/interna.phtml?obj_id=301

Referências


111

22. CARDOSO, C. A. L. et al. Simultaneous determination of furanocoumarins in

infusions and decoctions from “carapiá” (Dorstenia species) by high-performance

liquid chromatography. J. Agric. Food Chem., v.50, p.1465-1469, 2002.

23. NATTA, R. et al. Narrowband ultraviolet B radiation therapy for recalcitrant vitiligo

in Asians. J. Am. Acad. Dermatol., v.49, n.3, p.473-476.

24. NIJSTEN T. E. C.; STERN, R. S. The increased risk of skin cancer is persistent

after discontinuation of Psoralen plus Ultraviolet A: A cohort study. J. Invest.

Dermatol., v.121, n2, p.252-258, 2003.

25. AL-QATTAN, M. M. Pediatric burns induced by psoralens in Saudi Arabia. Burns,

v.26, p.653-655, 2000.

26. NETTELBLAD, H. et al. Psoralens used for cosmetic sun tanning: an unusual

cause of extensive burn injury. Burns, v.22, n.8, p.633-635, 1996.

27. WANG, L. TSO, M. Determination of 5-methoxypsoralen in human serum. J.

Pharm. Biomed. Anal., v.30, p.539-600, 2002.

28. KADDU, S.; KERL, H.; WOLF, P. Accidental bullous phototoxic reactions to

bergamot aromatherapy oil. Journal of the American Academy of Dermatology,

v.45, n.3, p.458-461, 2001.

29. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Rapid determination of

furanocoumarins in creams and pomades using SPE and CG. J. Pharm. Biomed.

Anal., v. 22, p.203-214, 2000.

30. CARDOSO, C. A. L.; HONDA, N. K.; BARISON, A. Simple and rapid determination

of psoralens in topic solutions using liquid chromatography. J. Pharm. Biomed.

Anal., v27, p.217-224, 2002.

31. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Quantitative determination of

furocoumarins in samples of “carapiá” by capillary gas chromatography.

Chromatographia. v.50, n.1/2, p.11-14, 1999.

Referências


112

32. CARDOSO, C. A. L.; VILEGAS, W.; HONDA, N. K. Quantitative determinations of

furanocoumarins and identification of other chemicals constituints of rhizomes and

leaves from Dorstenia tubicina and commercial samples. South. Bras. J. Chem.,

v.7, p.51-60, 1999.

33. CARAUTA, J. P. P. Moráceas do estado do Rio de Janeiro. Albertoa, v.4, n.13,

p.196, 1996.

34. FRANKE, K. et al. Furanocoumarins from Dorstenia gigas. Phytochemistry, v.56,

p.611-621, 2001.

35. ABEGAZ, B. M. et al. Chalcones and other constituents of Dorstenia prorepens

and Dorstenia zenkeri. Phytochemistry, v.59, p.877-883, 2002.

36. CARAUTA, J.P.P. Dorstenia L. (Moraceae) do Brasil e países limítrofes.

Dissertação (Mestrado em Botânica) – UFRJ, Rio de Janeiro. 1976.

37. VILEGAS, J. H. Y. et al. Further triterpenes, steroids and furocoumarins from

Brazilian medicinal plants of Dorstenia genus (Moraceae). J. Braz. Chem. Soc.,

v.8, p.529-535, 1997.

38. ABEGAZ, B. M. et al. Chemistry of the genus Dorstenia. Curr. Org. Chem., v.4,

p.1079-1090, 2000.

39. TERREAUX, C. et al. Structure revision of a furanocoumarin from Dorstenia

contrajerva. Phytochemistry, v.39, n.3, p.645-647, 1995.

40. MIRANDA, T.R. et al. Isolation, total synthesis, and relative stereochemistry of a

dihydrofurocoumarin from Dorstenia contrajerva. J. Nat. Prod., v.61, p.1216-1220,

1998.

41. KUSTER, R. M. et al. Furocoumarins from the rhizomes of Dorstenia brasiliensis.

Phytochemistry, v.36, n.1, p.221-223, 1994.

42. POZETTI, G. L. Estudo químico de Dorstenia bryoniifolia MART EX MIQ.

(MORACEAE). Ecl. Quím., v.13, p.41-51, 1988.

Referências


113

43. ROJAS-LIMA, S. et al. Furocoumarins of three species of the genus Dorstenia.

Phytochemistry. v.50, p.863-868, 1999.

44. VILEGAS, W.; VILEGAS, J. H. Y.; POZETTI, G. L. Cromatografia de permeação

em gel das furanocumarinas de Dorstenia heringeri CAR & VAL. Rev. Ciênc.

Farm., v.14, p.133-138, 1992.

45. NAGDJUI, B. T. et al. Prenylated flavones and phenylpropanoid derivates from

rotos Dorstenia psilurus. Phytochemistry, v.48, n.4, p.733-737, 1998.

46. WOLDU, Y. et al. Styrenes from Dorstenia barnimiana. Phytochemistry, v.27,

n.4, p.1227-1228, 1988.

47. TSOPMO, A. et al. Geranylated flavonoids from Dorstenia poinsettifolia.


48. CASAGRANDE, C. RONCHIETTI, F. RUSSO, G. The structure of syriogenin.

Tetrahedron, v.30, p.3587-3559, 1974.

49. NGADJUI, B.T. et al. Geranylated and prenylated flavonoids from the twigs of

Dorstenia manni. Phytochemistry, v.48, n.2, p.349-354, 1998.

50. NAGDJUI, B. T. et al. Dorsilurins C, D and E, three prenylated flavonoids from the

roots of Dorstenia psilurus. Phytochemistry, v.52, p.731-735, 1999.

51. SILVA, R. A .D. Pharmacopéia dos Estados Unidos do Brasil. São Paulo:

Nacional, 1929.

52. CORRÊA, M. P. Dicionário de Plantas úteis do Brasil. Rio de Janeiro:

Ministério da Agricultura, 1931. 6v. v.2.

53. CONCEIÇÃO, M. As plantas medicinais do ano 2000. Brasília: Tao.

Brasília,1980. p.41-88.

54. SEPLANTEC. Inventário de plantas medicinais do estado da Bahia. Salvador:

Subsecretaria de ciência e tecnologia, 1979.

Referências


114

55. ALZUGARAY, D.; ALZUGARAY, C. Plantas que curam. São Paulo: Companhia

Lithográphica Ypiranga, 1983.

56. UCHIYAMA. T. et al. seco-Adianane-type triterpenoides from Dorstenia

brasiliensis (Moraceae). Phytochemistry, v.60, p.761-764, 2002.

57. ALMEIDA, E. R.; Plantas medicinais brasileiras: conhecimentos populares e

científicos. São Paulo: Hemus, 1993.

58. LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de

plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Plantarum, 1992.

59. VILEGAS, J. H. Y. et al. Off-line supercritical fluid extraction-high resolution gas

chromatography applied to the study of Moraceae species. Phytochemistry, v.4,

n.5, p.230-234, 1993.

60. MARTINS, M. V. Brosimum gaudichaudii Tréc. a brasilian medicinal plant.

Newsletter-G-15 Gene Bank for medicinal plants, v.7-8, p.9, 1995.

61. MONTEIRO, V. F. F. et al. Prenylated coumarins, chalcone and new cinnamic acid

and dihydrocinnamic acid derivates from Brosimum gaudichaudii. J. Braz. Chem.

Soc., v.13, n.2, p.281-287, 2002.

62. VIEIRA, I. J. C. et al. A new coumarin from Brosimum gaudichaudii Trecul. Nat.

Prod. Lett., v.13,n.1, p.47-52, 1999.

63. VARANDA, E. A. et al. Genotoxicity of Brosimum gaudichaudii measured by the

Salmonella / microsome assay and chromosomal aberrations in CHO cells.

Journal of Ethnopharmacology, v.81, p.257-264, 2002.

64. GUARALDO, L.; SERTIÈ, J. A. A.; BACCHI, E. M. Antiulcer action of the

hydroalcoholic extract and fractions of Davilla rugosa Poiret in the rat. Journal of

Ethnopharmacology, v.76, p.191-195, 2001.

65. GUARALDO, L. et al. Hydroalcoholic extract and fractions of Davilla rugosa Poiret:

effects on spontaneous motor activity and elevated plus-maze behavior. Journal

of Ethnopharmacology, v.72, p. 61-67, 2000.

Referências


115

66. SIDDIQUI, B. S. et al. Minor iridoids from the leaves of Plumeria obtusa.


67. FRANÇA, O. O.; BROWN, R. T.; SANTOS, C. A. M. Uleine and

demethoxyaspidospermine from the bark of Plumeria lancifolia. Fitoterapia, v.71,

p.208-210, 2000.

68. VASCONCELOS, S. M. M. et al. Antinociceptive activities of the hydroalcoholic

extracts from Erythrina velutina and Erythrina mulungu in mice. Biol. Pharm.

Bull., v.26, n.7, p.946-949, 2003.

69. SARRAGIOTTO, M. H.; LEITAO, H.; MARSAIOLI, A. J. Erysotrine-n-oxide and

erythrartine-n-oxide, 2 novel alkaloids from Erythrina mulungu. Canadian Journal

of chemistry-revue canadienne de chimie, v.59, n.18, p.2771-2775,1981.

70. CRUZ, G. L. Dicionário das plantas úteis do Brasil. Rio de Janeiro: Civilização

Brasileira S. A., 1979.

71. MARQUES, L. C. Normatização da produção e comercialização de fitoterápicos

no Brasil. In: Simões, C. M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.;

Mentz, L.A. & Petrovick, P.R. (Orgs.). Farmacognosia: da planta ao

medicamento. 2. ed. Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS, 2000. Cap. 14.

72. BRITO, A. R. M. S. Legislação de fitoterápicos. In: Di STASI, L. C. (Org.). Plantas

Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo interdisciplinar. São Paulo:

UNESP, 1996. Cap. 13.

73. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução RDC

nº 17 de 24 de fevereiro de 2000. Dispõe sobre o registro de medicamentos

fitoterápicos. Diário Oficial da União, 25 fev. 2000.

74. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Consultas

públicas n. 59, 61, 84, 87, 88 e 94. Disponível em:

<http://www.anvisa.gov.br/scriptsweb/consulta_publica/consultas_paginado.asp?p

age=6&ano=2002>. Acesso em 25/03/04.

http://www.anvisa.gov.br/scriptsweb/consulta_publica/consultas_paginado.asp?page=6&ano=2002

http://www.anvisa.gov.br/scriptsweb/consulta_publica/consultas_paginado.asp?page=6&ano=2002

Referências


116

75. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução RDC

n. 48. Dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos. Diário Oficial da

União, 16 mar. 2004.

76. SKOOG, D. A.; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T.A. Princípios de análise

instrumental. 5.ed. Porto Alegre: Bookman, 2002. p.597-677.

77. LANCAS, F. M. Cromatografia em fase gasosa. São Carlos: Acta, 1993.

78. MELO, L. F. C. Emprego das cromatografias como técnica de “screening” na

análise de fármacos. Exame de Qualificação Geral de Doutorado (Doutorado em

Química) – UNICAMP, São Paulo. 1999.

79. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância Sanitária. Resolução RE nº

899 de 29 de maio de 2003. Dispõe sobre validação de métodos analíticos e

bioanalíticos. Diário Oficial da União, 01 mar. 2003.

80. SHABIR, G. A. Validation of high-performance liquid chromatography methods for

pharmaceutical analysis Understating the differences and similarities between

validation requirements of the US Food and Drug Administration, the US

Pharmacopeia and the International Conference on Harmonization. J. of

Chromatog. A, v.987, p. 57-66, 2003.

81. CASS, Q. B.; DEGANI, A. L. G. Desenvolvimento de métodos por HPLC:

fundamentos, estratégias e validação. São Carlos: UFSCar, 2001.

82. BARROS, C. B.;.HIRATA, Y. S; SATO, N. M. N. Validação de métodos analíticos.

Taboão da Serra: ISOLAB Consultoria e Cursos, 03 e 04 dez. 1997.

83. REQUIREMENTS for initial assay validation and publication in J. Chromatography

B. J.of Chromatogr B, v.707, p.1-2, 1998.

84. BRITTAIN, H. G. Validação de métodos analíticos não cromatográficos.

Pharmaceutical Technology, jun. 1998, p.4-9.

85. De BARROS, C. B. Validação de métodos analíticos. Biológico, v.64, n.2, p.175-

177, 2002.

Referências


117

86. U.S. DEPARTAMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES. Food and drug

administration. Center for Drug Evaluation and Research. Reviewer Guidance.

Validation of Chromatographic Methods. Rockville, 1994.


administration. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for industry:

Analytical Procedures and Methods Validation, Rockville, 2000.


administration. Center for Drug Evaluation and Research. Guidance for industry.

Bioanalytical method validation. Rockville, 2001.

89. UNITED States Pharmacopeia 23, Rockville, 1995.

90. INTERNATIONAL Conference on the Harmonization of Technical requirements for

registration of pharmaceuticals for human use. ICH Harmonized Tripartite

Guideline: Validation of analytical procedures: methodology Q2B, nov.1994.

91. INTERNATIONAL Conference on the Harmonization of Technical requirements for

registration of pharmaceuticals for human use. ICH Harmonized Tripartite

Guideline: Text on validation of analytical procedures Q2A, oct.1994.

92. BIBLIOTECA on-line. Disponível em:

<http://isi3.isiknowledge.com/portal.cgi?DestApp=WOS&Func=Framehttp://www.is

i3newisiknowledge.com>. Acesso em: 12 dez. 2003.

93. LEITE, F. Validação em análise química. 3. ed. Átomo: Campinas, 1996.

94. CHASIN, A. A. M. et al. Validação de métodos em analyses toxicológicas: uma

abordagem geral. Rev. Brasileira de Toxicologia, v. 11, n.1, p.1-6, 1998.

95. SWARTZ, M. E.; KRULL, I. S. Validação de métodos cromatográficos.

Pharmaceutical Technology, jun. 1998, p. 12-19.

96. JENKE, D.R. Chromatographic method validation: a review of current practices

and procedures. Part I and II. J. Liq. Chrom. & Rel. Technol., v. 19, n.5, p.719-

757, 1996.

http://www.isi3newisiknowledge.com/

http://www.isi3newisiknowledge.com/

Referências


118

97. TAYLOR, J. K.; Quality assurance of chemical measurements. 2.ed. Chelsea:

Lewis, 1987.

98. GYMENEZ, W. E. M. Avaliação de método analítico para a análise de resíduos de

pesticidas. In: GARP (Associação grupo de analistas de resíduos de pesticidas).

Manual de resíduos de pesticidas em alimentos, 1989, p. 66-73.

99. JAMALI, B.; NIELSEN, H. M.; Development and validation of a capillary

electrophoresis-indirect photometric detection method for the determination of the

non-UV-absorbing 1,4-dideoxy-1,4-imino-D-arabinitol in active pharmaceutical

ingredients, solutions and tables using an internal standard. J. Chromatogr. A, v.

996, p. 213-223, 2003.

100. PRADOS-ROSALES, R. C.; GARCÍA, J. L. L.; De CASTRO, M. D. L. Rapid

analytical method for the determination of pesticide residues in sunflower seeds

based on focused microwave-assisted soxhlet extraction prior to gas

chromatography–tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A, v. 993, p.121-

129, 2003.

101. LAMPINEN, M. et al. Validation of a meted for quantifiation of ketobemidone in

human plasma with liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J.

Chromatogr. A, v. 789, p. 347-354, 2003.

102. AGÊNCIA Nacional de Vigilância Sanitária. Disponível em:

<http://www.anvisa.com.br>. Acesso em 25 nov. 2003.

103. FARMACOPÉIA dos Estados Unidos do Brasil, 2. ed. São Paulo: Siqueira, 1959.

104. INNOCENTI, G. et al. Quantitative recovery of furanocoumarins from Psoralea

bituminosa. Phytochem. Anal., v.8, p.84-86, 1997.

105. SALDAÑA, L. S. et al. Dermatología Peruana, v. 12, n.1, jan/jun. 2002.

106. Di STASI, C. L. Química de produtos naturais: principais constituintes ativos. In: Di

STASI, L. C. (Org.). Plantas Medicinais: arte e ciência. Um guia de estudo

interdisciplinar. São Paulo: UNESP, 1996. Cap. 9.

http://www.anvisa.com.br/

Referências


119

107. KUSTER, R. M.; ROCHA, L. M. Cumarinas, cromonas e xantonas. In: Simões, C.

M. O.; Schenkel, E. P.; Gosmann, G.; Mello, J. C. P.; Mentz, L.A. & Petrovick, P.R.

(Orgs.). Farmacognosia: da planta ao medicamento. 2. ed. Porto

Alegre/Florianópolis: UFRGS, 2000. Cap. 21.

minha dissertação 2004

Health & Medicine