microbiologia01

Programa de Educação Continuada a Distância

Curso de Microbiologia Geral

Aluno:

EAD - Educação a Distância Parceria entre Portal Educação e Sites Associados

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Este material deve ser utilizado apenas como parâmetro de estudo deste Programa. Os créditos deste conteúdo são dados aos seus respectivos autores.

Curso de Microbiologia Geral

MÓDULO I Atenção: O material deste módulo está disponível apenas como parâmetro de estudos para este Programa de Educação Continuada. É proibida qualquer forma de comercialização do mesmo. Os créditos do conteúdo aqui contido são dados aos seus respectivos autores descritos nas Referências Bibliográficas.

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SUMÁRIO MÓDULO I 1. Introdução

2. Requisitos Básicos para Instalação e Funcionamento de um Laboratório de

Microbiologia

2.1. Boas Práticas de Laboratório

2.2. Regras Básicas das Boas Práticas Laboratoriais

2.3. Gerenciamento das Boas Práticas

2.4. A Rotina nos Laboratórios

2.4.1. Desinfecção

2.4.2. Esterilização

2.5 Normas de Segurança nos Laboratórios

2.5.1. Risco Físico

2.5.2. Risco Químico

2.5.3. Risco Biológico

2.5.4. Risco Ambiental

2.5.5. Risco Ergonômico

2.5.6. Proteção Contra Incêndio

2.6. Sinalização de Segurança

3. Coleta de Amostras

4. Transporte de produtos biológicos

5. Recepção de Amostras e Observações Preliminares

5.1. Critérios de Rejeição das Amostras

6. Cultivo de Micro-organismos

6.1. Preparo do Meio de Cultura

6.2. Isolamento e Obtenção de Cultura Pura

7. Microscopia

8. Principais Métodos de Coloração

8.1. A Fresco

8.1.1. Entre Lâmina e Lamínula

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8.1.1.1 Salina

8.1.1.2. Hidróxido de Potássio (KOH)

8.1.1.3. Exame de Campo Escuro

8.1.1.4. Tinta da China (nanquim)

8.2. Fixados e Corados

8.2.1. Coloração Azul de Metileno de Loeffler

8.2.2. Coloração de Wright Giemsa

8.2.3. Coloração de Gram

8.2.4. Coloração de Ziehl-Neelsen

9. Controle de Qualidade

10. Biossegurança

MÓDULO II 1. As Bactérias

1.1. Estrutura

1.2. Taxonomia: classificação, nomenclatura e identificação das bactérias

1.3. Morfologia

1.4. Crescimento

1.5. Fisiologia

1.6. Coloração

1.7. Esporos

1.8. Sorologia

1.9. Metabolismo

1.10. Patogenicidade

2. Estafilococos

2.1. Staphylococcus aureus

2.2. Staphylococcus epidermidis

2.3. Staphylococcus saprophyticus

3. Estreptococos

3.1. Estreptococos beta-hemolíticos

3.1.1. Streptococcus pyogenes

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3.1.2. Streptococcus agalactiae

3.2. Estreptococos alfa-hemolíticos

3.2.1. Estreptococcus pneumoniae

3.3. Estreptococos gama-hemolíticos (não hemolíticos)

3.3.1. Estreptococcus viridans

4. Enterococos

5. Neisserias

6. Bacilos

6.1. Gênero Corynebacterium

6.2. Gênero Bacillus

6.2.1. Bacillus anthracis

6.2.2. Bacillus cereus

6.2.3. Bacillus subtilis

6.3. Gênero Clostridium

6.3.1. Clostridium perfringens

6.3.2. Clostridium tetani

6.3.3. Clostridium botulinium

6.3.4. Clostridium difficile

6.4. Gênero Listeria

6.5. Gênero Mycobacterium

6.6. Gênero Actinomyces

6.7. Gênero Nocardia

7. Enterobacteriaceae

7.1. Gênero Escherichia

7.2. Gênero Proteus

7.3. Gêneros Klebisiela, Serratia e Enterobacter

8. Salmonela, Shigela e Pseudomonas

8.1. Gênero Salmonella

8.2. Gênero Shigella

8.3. Gênero Pseudomonas

9. Bacilos gram-negativos curvos

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9.1. Gênero Vibrio

9.2. Gênero Campylobacter

10. Outras bactérias gram-negativas anaeróbias

10.1. Gênero Bacterioides

10.2. Gênero Haemophilus

10.3. Gênero Bordetela

10.4. Gênero Brucella

10.5. Genero Legionella

11. Bactérias Espiraladas

11.1. Gênero Treponema

11.2. Gênero Leptospira

11.3. Gênero Borrelia

12. Micoplasmas

13. Rickettsiae

MÓDULO III 1. Cultura Bacteriana

1.1. Interpretação de Resultados e Laudos

1.2. Identificação Bacteriana Presuntiva

1.3. Prova de Sensibilidade a Antimicrobianos

1.3.1. Método do Disco

1.3.2. Método da Fita

1.3.3. Diluição em Caldo

1.3.4. Diluição em Agar

1.3.5. Interpretação dos Resultados do Antibiograma

1.3.6. Métodos Automatizados

1.4. Análise Microbiológica

1.5. Algumas Sugestões Importantes

2. Os Vírus

2.1. Estrutura Viral

2.2. Classificação Viral

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2.3. Cultivo e Quantificação Viral

3. Parvovírus

4. Papilomavírus

5. Herpesvírus

6. Adenovírus

7. Hepadnavírus

8. Poxvírus

9. Picornavírus

10. Orthomyxovírus

11. Paramyxovírus

12. Togavírus

13. Retrovírus

14. Rhabdovírus

15. Arenavírus

16. Reovírus

17. Coronavírus

18. Príons (Scrapie)

MÓDULO IV 1. Os Fungos

1.1. Estrutura e Crescimento

1.1.1. Bolores

1.1.2. Leveduras

1.2. Citologia

1.3. Parede Celular

1.4. Reprodução

1.4.1. Reprodução Assexuada

1.4.2. Reprodução Sexuada

1.4.3. Dimorfismo

1.5. Fatores de Crescimento

1.6. Metabolismo

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1.7. Classificação

2. Estudo Visual dos Fungos

2.1. Estudo Macroscópico

2.2. Estudo Microscópico

3. Identificação e Isolamento dos Fungos

4. Micoses Superfciais

5. Micoses Profundas

5.1. Aspergillus

5.2. Blastomyces

5.3. Candida

5.4. Coccidioides

5.5. Histoplasma

6. Pneumocystis Carinii

7. Protozoários

7.1. Classificação

8. Cryptosporidium Parvum

9. Entamoeba Histolytica

10. Giardia Lamblia

11. Leishmania

12. Plasmodium

13. Toxoplasma Gondii

14. Trichomonas Vaginalis

15. Trypanosoma

16. Considerações Finais

17. Glossário

18. Referências Bibliográficas

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MÓDULO I

1. INTRODUÇÃO

A microbiologia é definida como a biologia dos organismos microscópicos

que relaciona os organismos “invisíveis a olho nu”, pelo seu tamanho, com as

principais doenças infecciosas do homem e de seus animais domésticos.

Os micro-organismos são encontrados em todos os ambientes, incluindo

solo, água, ar e participam de todas as funções vitais. Embora não possam existir

dúvidas de que bactérias e vírus sejam os patógenos mais numerosos e

importantes, o estudo da microbiologia também está ligado à micologia e

parasitologia.

A relação entre o hospedeiro e o micro-organismo pode se estabelecer de

diversas maneiras. Esta associação ou simbiose (viver juntos) pode ter uma

conotação de benefício ou prejuízo para o hospedeiro. Tentando categorizar

especificamente estas associações, os pesquisadores conseguiram por

conveniência identificar três categorias, que foram nomeadas como: comensalismo

(uma espécie utiliza a outra como seu ambiente físico; por exemplo, microbiota),

mutualismo (as duas espécies se beneficiam; por exemplo, bactérias entéricas de

ruminantes) e parasitismo (apenas uma espécie se beneficia, trazendo prejuízo ao

hospedeiro; por exemplo, vírus da raiva).

Estamos, agora, diante da oportunidade de ampliar e aprofundar temas

considerados essenciais dentro do estudo da microbiologia. Nossa expectativa é de

que os usuários desta apostila de Microbiologia Geral possam assimilar e alcançar

novos níveis de complexidade laboratorial. Não tivemos a pretensão de alcançar o

conteúdo e a profundidade dos livros-texto de microbiologia tradicionalmente

consultados e que também nos serviram de referência, mas sim, de incluir apenas

uma pequena parte de uma explosiva base de dados que se expande em forma

exponencial, concernente ao número e classes de micro-organismos e às

propriedades que lhes permite causar doenças.

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O material apresentado aqui é apenas um “instantâneo” da microbiologia

atual, com respeitosa mesura aos avanços científicos dos anos passados e com a

visão de que as novas tecnologias descritas neste e nos próximos módulos já

revolucionaram as práticas laboratoriais e continuarão a afetar as abordagens atuais

e futuras da arte e da ciência da microbiologia.

Esta apostila foi programada em quatro módulos, abrangendo os seguintes

temas:

Módulo I – Introdução; Requisitos básicos para instalação e funcionamento

de um laboratório de microbiologia; Coleta e transporte de materiais clínicos;

Recepção de amostras e observações preliminares; Preparo de meios de cultura;

Exames microscópicos; Coloração; Controle de qualidade; Biossegurança.

Módulo II – Bacteriologia; Propriedades gerais das bactérias; Identificação

de Estafilococos; Identificação dos estreptococos; Identificação de outras bactérias

de interesse médico; Interpretação de resultados.

Módulo III – Virologia; Propriedades gerais dos vírus; Patogenia e

identificação de doenças virais.

Módulo IV – Micologia; Classificação das micoses humanas; Identificação

de fungos isolados em cultivos; Parasitologia; Riscos e prevenções de doenças

parasitárias; Identificação e diferenciação de parasitas.

O primeiro passo para o conhecimento dos micro-organismos é o mesmo

que se deve seguir para conhecer uma pessoa; é necessário saber seu nome. No

estudo do mundo dos micro-organismos como agentes de doenças no homem, é

primeiramente importante assimilar como as bactérias e outros micro-organismos

são denominados. Isto é a ciência da taxonomia.

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2. REQUISITOS BÁSICOS PARA INSTALAÇÃO E FUNCIONAMENTO DE

UM LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA

Os requisitos básicos para um laboratório de microbiologia pretendem

elaborar e viabilizar boas práticas, normas para coleta, conservação e transporte de

material de interesse clínico. Além de estabelecer e executar rotinas microbiológicas,

dentro dos padrões técnico-científicos vigentes, que permitam o isolamento e

identificação dos principais agentes infecciosos de importância clínica, por gênero e,

se possível, por espécie.

O laboratório ainda precisa determinar a sensibilidade às drogas

antimicrobianas, efetuar o controle de qualidade de suas atividades e dos processos

de esterilização, além de divulgar e implementar normas de biossegurança.

Os equipamentos mínimos para funcionamento de um laboratório de

microbiologia consistem em: estufa bacteriológica, forno de Pasteur, autoclave,

microscópio binocular, centrífuga de baixa rotação, homogeneizador, banho-maria

de pequena dimensão, destilador para água, balança para tarar tubos, balança

comum com uma ou duas casas decimais, bico de Bunsen, geladeira e capela de

fluxo laminar.

Além desses equipamentos, o laboratório poderá contar com outros

aparelhos, como: microscópio estereoscópico, congelador (-20oC ou -70oC), bomba

de vácuo para filtração com membranas, potenciômetro e balança analítica.

2.1. BOAS PRÁTICAS DE LABORATÓRIO

O trabalho laboratorial executado de forma adequada e bem planejado

previne a exposição indevida a agentes considerados de risco à saúde e sem dúvida

evita acidentes.

Manipulação de agentes considerados contaminantes é regida por leis

federais, estaduais e municipais. A manipulação, armazenamento e transporte de

agentes de risco requerem licenças especiais que são controladas por órgãos

federais.O Regulamento Técnico de Funcionamento do Laboratório Clínico foi

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elaborado a partir de trabalho conjunto de técnicos da ANVISA, com o grupo de

trabalho instituído pela Portaria nº 864, de 30 de setembro de 2003. Este grupo de

trabalho foi composto por técnicos da ANVISA, secretaria de atenção à saúde

(SAS/MS), secretaria de vigilância à saúde (SVS/MS), vigilâncias sanitárias

estaduais, laboratório de saúde pública, sociedade brasileira de patologia

clínica/medicina laboratorial, sociedade brasileira de análises clínicas, provedores de

ensaio de proficiência e um consultor técnico com experiência na área.

A proposta de Regulamento Técnico elaborado pelo grupo de trabalho foi

publicada como consulta pública nº 50, em 6 de agosto de 2004. As sugestões

recebidas foram consolidadas pelos técnicos da gerência geral de tecnologia em

serviços de saúde (GGTES/ANVISA), pelos componentes do grupo de trabalho

juntamente com o consultor. Após discussões, as sugestões pertinentes foram

incorporadas ao texto do Regulamento Técnico, sendo produzido o documento final

consensual sobre o assunto.

Este Regulamento Técnico discriminado na resolução da diretoria colegiada

- RDC nº 302, de 13 de outubro de 2005, regulamenta:

“A Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no uso

da atribuição que lhe confere o art.11, inciso IV, do Regulamento da ANVISA

aprovado pelo Decreto nº 3.029, de 16 de abril de 1999, c/c o § 1º do art.111 do

Regimento Interno aprovado pela Portaria nº 593, de 25 de agosto de 2000,

republicada no D.O.U. de 22 de dezembro de 2000, em reunião realizada em 10 de

outubro de 2005; considerando as disposições constitucionais e a Lei Federal nº

8080, de 19 de setembro de 1990, que trata das condições para a promoção,

proteção e recuperação da saúde, como direito fundamental do ser humano;

considerando a necessidade de normalização do funcionamento do Laboratório

Clínico e Posto de Coleta Laboratorial; considerando a relevância da qualidade dos

exames laboratoriais para apoio ao diagnóstico eficaz, adota a seguinte Resolução

da Diretoria Colegiada e eu, Diretor-Presidente substituto, determino a sua

publicação”:

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• Art. 1º - Aprovar o Regulamento Técnico para funcionamento dos serviços

que realizam atividades laboratoriais, tais como Laboratório Clínico, e Posto de

Coleta Laboratorial, em anexo.

• Art. 2º - Estabelecer que a construção, reforma ou adaptação na estrutura

física do laboratório clínico e posto de coleta laboratorial deve ser precedida de

aprovação do projeto junto à autoridade sanitária local em conformidade com a

RDC/ANVISA nº 50, de 21 de fevereiro de 2002, e RDC/ANVISA nº 189, de 18 de

julho de 2003, suas atualizações ou instrumento legal que venha a substituí-las.

• Art. 3º - As Secretarias de Saúde Estaduais, Municipais e do Distrito

Federal devem implementar os procedimentos para adoção do Regulamento

Técnico estabelecido por esta RDC, podendo adotar normas de caráter suplementar,

com a finalidade de adequá-lo às especificidades locais.

• Art. 4º - O descumprimento das determinações deste Regulamento

Técnico constitui infração de natureza sanitária sujeitando o infrator a processo e

penalidades previstas na Lei nº 6437, de 20 de agosto de 1977, suas atualizações,

ou instrumento legal que venha a substituí-la, sem prejuízo das responsabilidades

penal e civil cabíveis.

• Art. 5º - Esta Resolução entra em vigor na data de sua publicação.

É necessário que os profissionais sejam previamente conscientizados sobre

os riscos, assim como as medidas de controle e proteção adotadas para a

manutenção e respeito às normas de segurança. E o cuidado tomado pelos

administradores deve ser maior e mais rigoroso, para prevenir ou reduzir o risco de

desenvolver alguma doença profissional por exposição. A organização das

atividades e o respeito às normas de segurança é um aspecto fundamental para

segurança de todos os usuários e para a garantia da qualidade e dos resultados

precisos.

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As medidas de controle e proteção laboratorial são divididas em medidas

coletivas (descarte e remoção de lixo, extintores de incêndio, lavador de olhos e

sinalização) como mostra a Figura 1.

A B

C D

A B

C D

Materiais relacionados com as MEDIDAS COLETIVAS de controle e proteção laboratorial. (A) Remoção do lixo, (B) lavador de olhos, (C) Descarte de materiais perfurocortantes e (D)Extintor de incêndio.

Fig. 1. Materiais relacionados com as MEDIDAS COLETIVAS de controle e proteção laboratorial. (A) Remoção do lixo, (B) lavador de olhos, (C) Descarte de materiais perfurocortantes e (D)Extintor de incêndio.

Fig. 1.

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As medidas individuais referem-se ao emprego de equipamentos de

proteção individual - EPIs (luvas, máscara, avental de manga comprida, pró-pés,

óculos de proteção) como são mostradas na Figura 2.

E

D

B

C

A

D

E

E

D

B

C

A

D

E

Fig. 2. Materiais relacionados com as MEDIDAS INDIVIDUAIS de

controle e proteção laboratorial. (A) óculos; (B) máscara;

(C) avental, (D) luvas e (E) pro-pés.

É difícil quantificar o risco no trabalho em laboratórios, com relação aos

agentes infecciosos. Tem-se por base, porém, que o risco individual aumenta com a

frequência e com os níveis de contato com o agente infeccioso. O primeiro cuidado a

ser tomado no laboratório que trabalha com espécimes clínicas é com o risco de

exposição à infecção. Por outro lado, deve-se considerar que os riscos são

influenciados por uma relação variável entre o agente infectante, o hospedeiro e a

atividade desempenhada. Fatores aplicáveis ao agente incluem a virulência, a carga

infectante, o ciclo e a toxigenicidade. As principais variáveis que influem no risco do

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hospedeiro são: idade, sexo, etnia, gravidez, uso de antimicrobianos, imunidade

(vacinação prévia), e o uso de drogas imunossupressoras. Finalmente, a natureza

da atividade laboratorial (por exemplo: diagnóstico, produção, pesquisa) pode afetar

significativamente o risco pessoal em razão do tipo, quantidade e concentração dos

agentes empregados, a manipulação dos agentes e a eficácia primária e secundária

dos equipamentos de proteção e práticas de laboratório.

2.2. REGRAS BÁSICAS DAS BOAS PRÁTICAS LABORATORIAIS

As regras básicas de segurança em laboratório serão descritas na Figura 3.

Estes itens são inegociáveis e devem ser respeitados rigorosamente sem exceção.

2.3. GERENCIAMENTO DAS BOAS PRÁTICAS

Uma organização de gerenciamento das boas práticas, ou melhor, a garantia

da qualidade dentro do laboratório se faz necessária para ajudar a manter a ordem

minimizando os riscos de contaminação, além de elaborar planos de gerenciamento

de rejeitos químicos. Esta organização deve estar ligada à Comissão Técnica

Nacional de Biossegurança (CTNBio), segundo a Lei 8.974, de 5 e janeiro de 1995.

A CTNBio regulamenta os procedimentos de segurança por meio de

instruções normativas, conforme o grau de periculosidade, bem como estabelece os

níveis de concentração e de tratamento dos resíduos, a liberação planejada para o

ambiente, transporte, importação, comercialização de organismos geneticamente

modificados e intervenções genéticas em humanos e animais.

As práticas de biossegurança baseiam-se na necessidade de proteção ao

operador, seus auxiliares e a comunidade local contra riscos que possam prejudicar

a saúde.Embasado nestes itens a CTNBio se responsabiliza por todos os

procedimentos institucionais, onde inspecionará e fornecerá licenças para áreas de

nível 1. E as solicitações de licenças para nível 2, 3 e 4 serão encaminhadas pela

Comissão Interna de Biossegurança para CTNBio e serão sujeitas as inspeções

desta. As áreas de nível de laboratório estão classificadas no sistema de grupo de

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risco dos micro-organismos, e está baseada na potência de causarem doença em

seres humanos e contaminarem o ambiente.Os micro-organismos se dividem em

grupos quanto a patogenicidade para o homem, a virulência, o modo de

transmissão, a endemicidade e a existência de profilaxia e/ou de terapêutica

eficazes. Segundo a Resolução no 1, de 1998 do Conselho Nacional de Saúde, Cap.

X, art. 64, os micro-organismos podem ser classificados em classes de risco de 1 a 4

por ordem crescente:

Classe 1 – classificam-se os agentes que não apresentam riscos para o

manipulador, nem para a comunidade (ex.: Escherichia coli, Bacillus subtilis, vírus

adenoassociados).

Classe 2 – classificam-se os agentes que apresentam risco moderado para

o manipulador, havendo sempre um tratamento preventivo (ex.: Clostridium tetani,

Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus; Epstein-Barr Vírus - EBV,

Herpesvírus; Candida albicans; Plasmodium sp, Schistosoma sp).

Classe 3 – classificam-se os agentes que apresentam risco grave para o

manipulador e moderado para a comunidade, sendo as lesões ou sinais clínicos

graves e nem sempre há tratamento (ex.: Bacillus anthracis, Brucella sp, Chlamydia

psittaci, Mycobacterium tuberculosis; vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, HTLV

1 e 2, HIV, flavivírus; Blastomyces dermatiolis, Histoplasma; Echinococcus sp,

Leishmania sp, Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi);

Classe 4 – classificam-se os agentes que apresentam risco grave para o

manipulador e para a comunidade, não existe tratamento e os riscos em caso de

propagação são bastante graves (ex.: arenavírus, certos arbovírus, vírus da

encefalite de St. Louis e Coxiella burnetii).

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Boas práticas em laboratórioFig. 3. Boas práticas em laboratórioFig. 3.

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2.4. A ROTINA NOS LABORATÓRIOS

Agora relacionaremos as rotinas que auxiliam na otimização do serviço dos

usuários:

a) Manter as bancadas sempre limpas e livres de materiais estranhos ao

trabalho.

b) Fazer uma limpeza prévia, com o solvente adequado, ao esvaziar um

frasco de reagente antes de colocá-lo para lavagem.

c) Rotular imediatamente qualquer reagente ou solução preparada,

utilizando etiquetas adequadas.

d) Retirar da bancada os materiais, as amostras e os regentes após o

término do trabalho.

e) Jogar papéis e outros materiais dispensáveis que não ofereçam riscos,

em lixos específicos.

f) Usar pinças e materiais de tamanho adequado e em perfeito estado de

conservação.

g) Limpar, imediatamente, qualquer derramamento de produtos e reagentes

protegendo-se se necessário, para fazer essa limpeza.

h) Tomar as seguintes providências em caso de derramamento de líquidos

inflamáveis, produtos tóxicos, biológicos, tóxicos e/ou corrosivos - Interromper o

trabalho/advertir as pessoas próximas sobre o ocorrido/solicitar ou efetuar a limpeza

imediata/verificar e corrigir a causa do problema.

2.4.1. DESINFECÇÃO

A desinfecção é definida como a eliminação parcial dos micro-organismos

presentes em um determinado ambiente. Os métodos de desinfecção pretendem

principalmente destruir as formas microbianas patogênicas ao homem, por meio da

utilização de um agente desinfetante ou antimicrobiano.

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Os diversos tipos de agentes antimicrobianos podem ser divididos em três

grupos: agentes físicos, químicos e quimioterápicos. O grau de eficiência de cada

um deles é dependente da concentração ou intensidade, das condições do ambiente

e do estado das células.

2.4.2. ESTERILIZAÇÃO

A esterilização é um processo de eliminação completa de todas as formas

vivas de um material ou ambiente. Por meio da esterilização dos meios de cultura e

do instrumental usado nos trabalhos, o isolamento e a manutenção das culturas

puras de micro-organismos se tornaram possíveis.

A esterilização pode ser feita por diferentes processos que empregam

métodos físicos (calor, atrito, radiação e filtração) e métodos químicos. Normalmente

são utilizadas embalagens para acondicionar os materiais durante a esterilização

para evitar contaminação posterior.

A eficácia da esterilização é monitorada pelo emprego de indicadores. A

maioria dos protocolos requer treinamento especial para adequada preparação dos

instrumentos com remoção de toda matéria orgânica, o correto preenchimento da

câmara e operação do ciclo de esterilização dentro de parâmetros estritamente

definidos.

Os métodos mais utilizados são: calor úmido, que provoca a inativação ou

coagulação das proteínas dos micro-organismos (autoclavagem e tindalização) e o

calor seco, que provoca a eliminação dos micro-organismos pela oxidação e queima

das proteínas (forno de Pasteur e chama).

Em microbiologia a autoclavagem é utilizada na esterilização de material

usado na preparação de meios de cultura e esterilização em geral. O vapor d’água

sob pressão e uma temperatura superior a 1000C destroem os micro-organismos e

seus esporos (quando produzidos) em um curto espaço de tempo.

A tindalização é um processo de esterilização fracionada, para substâncias

que não podem ser aquecidas acima de 1000C. O processo consiste em aquecer o

material por três vezes consecutivas, em intervalos de 24 horas.

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Tanto o forno de Pasteur como as esterilizações pela chama são processos

que requerem temperaturas elevadas por longos períodos.

Outros métodos de esterilização são utilizados, tais como:

a) Irradiação pela luz ultravioleta (<330nm de comprimento de onda). Este

método é utilizado em câmaras de segurança microbiológica, em laboratórios, ou

também, pela radiação ionizante, por elétrons do cobalto-60 e ainda por um

acelerador linear para a esterilização de artigos plásticos descartáveis sensíveis ao

calor.

b) Filtração pela utilização de diferentes tipos de filtros, incluindo asbesto,

cerâmica e vidro prensado. Atualmente, são mais utilizados os filtros de membrana

de nitro-celulose que são utilizadas para a esterilização de líquidos sensíveis ao

calor, incluindo soro e antibióticos.

c) Substâncias Químicas, o gás formaldeído, a formalina líquida, o

glutaraldeído e o óxido de etileno que são esporicidas e viricidas e, por isso,

conseguem esterilizar materiais. No entanto, estas substâncias são tóxicas e

irritantes e seu uso é restrito.

2.5 NORMAS DE SEGURANÇA NOS LABORATÓRIOS

As normas de segurança são embasadas nos perigos e riscos que os

usuários podem sofrer durante o trabalho. Os perigos são divididos em risco físico,

químico, biológico, ambiental e ergonômico.

As normas de segurança adotadas para prevenção contra os acidentes

laboratoriais são:

a) Todo perigo e risco deve ser conhecido pelo manipulador, bem como o

respeito das regras gerais de biossegurança e ainda a execução das medidas de

proteção individual.

b) Todo experimento dentro ou fora do expediente, que não tiver o

acompanhamento do interessado, deverá ter uma ficha ao lado, com nome, horário

de experimentação, reagentes envolvidos e medidas a serem adotadas em casos de

acidentes.

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c) Todo experimento que envolver certo grau de periculosidade exigirá a

obrigatoriedade da utilização de indumentária adequada (luvas, óculos, máscaras,

pinças, aventais, extintores de incêndio).

d) Todo laboratório ou sala de experimento deverá possuir os seguintes

equipamentos - óculos de segurança, máscara contra gases, um cobertor e um

chuveiro em funcionamento normal e caixas de primeiros socorros.

e) Todo e qualquer material que venha a prejudicar ou colocar em perigo a

vida ou a saúde dos usuários do ambiente, ou que cause incômodo, deverá ser

discutido ou comunicado ao responsável do laboratório, o qual sugerirá e/ou

autorizará o evento sob certas condições como avisos, precauções e horário que

deve ser feito.

f) Todo manuseio de produtos não deve ser feito sem o uso do equipamento

de segurança adequado, não faça improvisações.

g) Todo e qualquer acidente ou irregularidade deve ser comunicado ao seu

superior e à segurança.

h) Todo e qualquer produto químico não deve ser cheirado, nem ser

guardado em lugares impróprios.

i) Todo produto químico deve ser transportado de maneira segura.

j) Todo profissional deve ser e deve estar bem informado no que se refere à

maneira como a contaminação pode ocorrer, o que implica no conhecimento amplo

do micro-organismo ou vetor com o qual se trabalha.

Os equipamentos de segurança relacionados a seguir devem estar ao

alcance de todos os funcionários, como: extintores de incêndio (pó químico e CO2),

chuveiros de emergência, lavador de olhos, aventais e luvas de PVC contra produtos

corrosivos, máscaras e óculos de segurança, luvas de amianto ou raspa de couro,

máscaras contra gases e máscara contra pó (ex.: sílica, asbesto).

2.5.1. RISCO FÍSICO

Consideram-se agentes de riscos físicos os equipamentos que geram:

ruídos, vibrações, pressões anormais, radiações ionizantes, radiações não

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ionizantes, ultrassom, materiais cortantes, materiais pontiagudos, calor, frio, chamas,

umidade, ultravioleta, infravermelha, raios laser, ondas de rádio, campo elétrico.

2.5.2. RISCO QUÍMICO

Consideram-se agentes de risco químico: as substâncias compostas ou

produtos que possam penetrar no organismo pela via respiratória nas formas de

poeiras, fumaças (incluindo cigarro), névoas, neblinas, gases e vapores; ou que

possam penetrar no organismo por contato ou por absorção através da pele ou

ingestão nas formas de substâncias tóxicas, substâncias explosivas, irritantes,

oxidantes, corrosivas, voláteis, inflamáveis e cancerígenas.

2.5.3. RISCO BIOLÓGICO

Consideram-se agentes de risco biológico as bactérias, fungos, parasitos,

vírus, entre outros. Os agentes biológicos apresentam um risco real ou potencial

para o homem e para o meio ambiente. Por essa razão, é fundamental que se

prepare uma estrutura adequada para prevenção dos riscos encontrados nos

laboratórios.

2.5.4. RISCO AMBIENTAL

Consideram-se agentes de risco ambiental os equipamentos de vidro,

instrumentos perfurantes, equipamentos com gás comprimido, equipamentos de

trituração, incêndio, explosão, eletricidade.

2.5.5. RISCO ERGONÔMICO

Consideram-se agentes de risco ergonômico os assentos, a altura das

bancadas, entre outros que possam provocar lesões por má postura.

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2.5.6. PROTEÇÃO CONTRA INCÊNDIO

As regras básicas em caso de incêndio no laboratório são:

a) Manter a calma.

b) Começar o combate imediatamente com os extintores de CO2 (gás

carbônico). Afastar os inflamáveis de perto.

c) Evacuar o local imediatamente caso a situação fuja ao seu controle.

d) Ligar o alarme (uma pequena caixa vermelha), quebrando o vidro para

acioná-lo.

e) Evacuar o prédio.

f) Desligar a chave geral de eletricidade.

g) Ir até o telefone mais próximo e discar para o corpo de bombeiros 193.

h) Dar a exata localização do fogo (ensinar como chegar lá).

i) Informar a condição de risco do laboratório para que os bombeiros saibam

como agir com rapidez e eficiência.

j) Tapar o frasco com uma rolha, toalha ou vidro de relógio de modo a

impedir a entrada de ar quando o fogo irromper em um béquer ou balão de reação.

k) Levar para o chuveiro quando o fogo atingir a roupa de uma pessoa, há

uma tendência para que a pessoa corra, aumentando a combustão, neste caso,

deve-se derrubá-la e rola-la no chão até que o fogo seja exterminado ou embrulhá-la

rapidamente em um cobertor. E ainda, pode-se também usar o extintor de CO2, se

este for o meio mais rápido.

l) Usar extintor de CO2 ou pó químico para apagar o fogo em um laboratório.

Nunca utilize água.

m) Usar extintor de pó químico quando o fogo atingir sódio, potássio ou lítio;

ou ainda os reagentes, carbonato de sódio (Na2CO3) ou cloreto de sódio (NaCl).

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2.6. SINALIZAÇÃO DE SEGURANÇA (Figura 4)

Sinalizações importantes para orientaçãoFig. 4. Sinalizações importantes para orientaçãoFig. 4. 3. COLETA DE AMOSTRAS

É possível que a coleta apropriada de uma amostra para cultivo seja a etapa

mais importante na confirmação final de que um micro-organismo é responsável pelo

processo de enfermidade infecciosa. Assim, todo resultado liberado pelo laboratório

de microbiologia é consequência da qualidade da amostra recebida.

O material colhido deve ser representativo do processo infeccioso

investigado, devendo ser eleito o melhor sitio da lesão, evitando contaminação com

as áreas adjacentes. Deve se estabelecer o momento ótimo para a coleta de

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amostras com o objetivo de contar com a melhor possibilidade de isolar o micro-

organismo em questão. Deve-se obter quantidade suficiente de material para

permitir uma completa análise microbiológica. Caso a quantidade seja pequena,

priorizar os exames.

Portanto, a coleta inadequada pode ocasionar falhas no isolamento do

agente etiológico e favorecer o desenvolvimento da flora contaminante, induzindo a

um tratamento não apropriado. Quem colhe o material deve ser devidamente

treinado e periodicamente reciclado nesta atividade. Deve saber que o material

deverá ser destinado, o mais brevemente possível, ao laboratório. Deve conhecer ou

obter instruções sobre conservação e/ou transporte do material caso este não possa

ser realizado imediatamente.

Algumas considerações são fundamentais na coleta de amostras, como:

colher amostras antes da antibioticoterapia (sempre que possível); instruir

claramente o paciente sobre o procedimento; observar a assepsia na coleta de todos

os materiais clínicos. O pedido do exame deve conter, além da identificação do

paciente, dados como idade, doença de base, indicação de antibióticos, data e hora

da coleta e as amostras devem ser coletadas em recipientes esterilizados.

4. TRANSPORTE DE PRODUTOS BIOLÓGICOS

Os regulamentos sobre o transporte de agentes biológicos são definidos de

forma a assegurar proteção ao público e aos trabalhadores da rede de transporte à

exposição a qualquer agente que possa estar presente na embalagem.

As substâncias infecciosas e materiais orgânicos para diagnóstico precisam

estar embalados em um recipiente impermeável à água (recipiente primário), dentro

do qual se encontra a amostra. Este recipiente primário deverá estar dentro de um

segundo recipiente impermeável, de preferência de metal, contendo quantidade

suficiente de material absorvente entre suas paredes. Os recipientes primários e

secundários deverão conter uma etiqueta ou rótulo com a identificação da amostra e

deverão ser introduzidos em uma embalagem externa de envio que tem a finalidade

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de proteção contra fatores externos. A embalagem externa deve estar rotulada

adequadamente com o símbolo “risco biológico” e outro rótulo com o endereço da

instituição (Figura 5).

Para evitar possíveis acidentes durante o transporte de amostra biológica,

dentro dos setores do laboratório, é necessário transportar em recipiente

impermeável, resistente à queda e o transporte de vidraria deve ser feito com o uso

de carrinhos para frascos de grande porte e bandejas para frascos de pequeno

porte.

Técnica apropriada para embalar materiais biologicamente perigosos.

Fig. 5. Técnica apropriada para embalar materiais biologicamente perigosos.

Fig. 5.

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O objetivo primário no transporte de amostras para diagnóstico, seja dentro

de um hospital ou clínica, ou externamente por correio, para um laboratório de

referência distante, consiste em manter a amostra o mais próximo possível de seu

estado original (Tabela 1), ou seja, com deterioração mínima, e minimizar os riscos

para os transportadores das amostras. As amostras devem estar acondicionadas de

forma que resistam as condições ambientais.

Se for previsto um atraso prolongado antes que a amostra possa ser

processada, é preferível congelar a amostra a 70oC negativos. No entanto, se o

período de estocagem for breve pode ser utilizado um congelador a 20oC negativos.

Para a maioria das amostras pode ser utilizado um meio de manutenção ou

transporte, que consiste essencialmente de uma solução tampão isento de

carboidratos, peptonas e outros nutrientes e fatores de crescimento formulado para

conservar a viabilidade das bactérias durante o transporte sem permitir a

multiplicação das mesmas.

Tempo crítico para entrega da amostra ao laboratório e meios de transporte

Tab. 1.Tempo crítico para entrega da amostra ao laboratório e meios de transporte

Tab. 1.

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5. RECEPÇÃO DE AMOSTRAS E OBSERVAÇÕES PRELIMINARES

Os laboratórios de microbiologia precisam ter uma área específica destinada

e reservada para a recepção de amostras para cultivo. E o manipulador deve usar os

equipamentos de proteção individual apropriados para manipulação da amostra.

O processamento das amostras inclui: o ingresso dos dados em um livro de

registro e/ou terminal de computador, exame visual e determinação de todos os

critérios para aceitação da amostra e exame microscópico de montagens úmidas ou

de esfregaços corados para o diagnóstico presuntivo.

5.1. CRITÉRIOS DE REJEIÇÃO DAS AMOSTRAS

Em todos os laboratórios devem ser estabelecidos critérios para a rejeição

de amostras não adequadas para o cultivo. Devem ser controlados: formulário do

pedido, etiqueta da amostra (nome, número de identificação, idade, sexo, domicílio,

nome do médico, data, hora), origem da amostra e procedimentos solicitados. A

história clínica do paciente também é útil, para saber se o exame solicitado é

compatível com o diagnóstico.

Sempre que uma amostra for rejeitada, a pessoa que o enviou precisa ser

comunicada para explicar a natureza do problema. Como regra empírica, deve-se

fazer o possível para não recusar amostras de difícil coleta (lavados brônquicos,

líquidos cefalorraquidianos, entre outros).

6. CULTIVO DE MICRO-ORGANISMOS

O estudo dos micro-organismos, sua identificação e avaliação de suas

populações nos diferentes materiais e ambientes requerem seu cultivo nas

condições do laboratório.

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6.1. PREPARO DO MEIO DE CULTURA

Para preparar um meio de cultura é necessário conhecer as exigências

nutricionais dos micro-organismos. São considerados componentes essenciais do

meio de cultura: fonte de energia, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, fatores de

crescimento, fonte de minerais e água.

Além dos nutrientes, o meio de cultura deve suprir algumas condições

ambientais, como: pH, atmosfera (presença de O2, CO2), pressão osmótica.

O meio de cultura pode ser classificado quanto à origem (naturais e

artificiais), quanto à composição (complexos e sintéticos), quanto ao estado físico

(sólido, semissólido e líquidos) e quanto à finalidade (gerais ou básicos,

enriquecidos, seletivos, indicadores ou diferenciais, dosagem, transporte, estocagem

ou manutenção).

6.2. ISOLAMENTO E OBTENÇÃO DE CULTURA PURA

A obtenção de culturas puras (ou axênicas) a partir de culturas mistas,

também denominadas isolamento é o primeiro passo para que se possa realizar o

diagnóstico dos micro-organismos. Esta técnica também é necessária na indústria

para a fabricação de antibióticos. O segundo passo consiste na análise do

crescimento em meio líquido, caldo nutriente, e correlação com as necessidades de

oxigênio dos micro-organismos presentes.

O procedimento mais prático para a obtenção de colônias isoladas consiste

na semeadura em superfície, no meio de cultura até o esgotamento do inócuo.

Desta forma, o inócuo é diluído progressivamente de modo que se obtêm, ao final,

células isoladas que darão origem a colônias puras (Figura 6).

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7. MICROSCOPIA

O equipamento rotineiramente utilizado em laboratórios de microbiologia é o

microscópio óptico composto. Seu princípio de funcionamento baseia-se no aumento

da imagem por um conjunto de lentes convergentes, associado a uma forte

iluminação do campo de observação, isto fornece uma imagem translúcida dos

micro-organismos.

Com o passar dos anos a microscopia sofreu algumas modificações, tanto

no microscópio como nas técnicas de preparo das lâminas, como por exemplo:

microscopia de campo escuro, microscopia de luz ultravioleta (fluorescência e

imunofluorescência), microscopia de contraste de fase e microscopia eletrônica.

Isolamento de colônias de bactérias em meio sólido

Fig. 6. Isolamento de colônias de bactérias em meio sólido

Fig. 6.

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8. PRINCIPAIS MÉTODOS DE COLORAÇÃO A perfeita visualização dos micro-organismos e/ou das suas estruturas só é

possível se, além da escolha do tipo mais eficiente de microscopia, a preparação

estiver adequada. A escolha do tipo de preparação depende da informação desejada

e do micro-organismo a ser avaliado. Duas técnicas são empregadas: a fresco

(direto e sem coloração) e fixado e corado.

De uma maneira geral, as bactérias têm afinidade por um grande número de

corantes, principalmente aqueles do grupo dos derivados básicos da anilina (azul de

metileno, cristal violeta e fucsina básica). Dentre todos os métodos existentes,

aqueles que têm mais importância dentro do laboratório de microbiologia são os

métodos de Gram e de Ziehl-Neelsen.

8.1. A FRESCO

As preparações deste tipo permitem o exame dos micro-organismos nas

condições normais de vida e são perfeitamente utilizadas nas seguintes situações:

quando a morfologia fica distorcida em virtude dos processos de fixação e coloração,

durante a verificação da motilidade, durante os processos fisiológicos (divisão

celular, produção de esporos) e durante a observação de corpúsculos (vacúolos e

material graxo).

8.1.1. ENTRE LÂMINA E LAMÍNULA

8.1.1.1 SALINA

Esta técnica pode ser usada para avaliar bactérias cultivadas em meio

líquido e fungos. A técnica consiste em gotejar com o auxílio de uma alça de platina,

esterilizada, no centro da lâmina, uma gotícula da cultura a ser investigada. Ou um

fragmento da cultura em meio sólido do fungo a ser analisado. Em seguida, cobrir

com lamínula e examinar ao microscópio.

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8.1.1.2. HIDRÓXIDO DE POTÁSSIO (KOH)

Esta técnica é usada para pesquisa de fungos, proveniente de material

biológico como muco, restos celulares, pelos e unhas. A técnica consiste em colocar

uma pequena amostra do material biológico a ser pesquisado no centro da lâmina;

suspender o material com uma ou duas gotas de KOH, cobrir com uma lamínula e

aguardar 30 minutos ou aquecer ligeiramente a lâmina para acelerar o clareamento.

8.1.1.3. EXAME DE CAMPO ESCURO

Esta técnica é empregada para observar a motilidade de bactérias

dificilmente observadas em microscopia a fresco com salina. A técnica consiste em

atritar as bordas da lesão suspeita com um swab ou alça bacteriológica, colher o

exsudato com a própria alça ou fazer um imprint com a lâmina e cobrir com a

lamínula (utilizar uma gota de salina). Realizar a pesquisa rapidamente, ou, se o

material for líquido (urina recém-emitida), centrifugar e examinar o sedimento. A

microscopia em campo escuro é realizada colocando-se óleo de imersão.

8.1.1.4. TINTA DA CHINA (NANQUIM)

Esta técnica é empregada para pesquisa de fungos em líquido

cefalorraquidiano e outros materiais, permitindo destacar a cápsula deste fungo

contra um fundo negro. A técnica consiste em pegar o líquido cefalorraquidiano

sedimentado ou uma amostra do meio de cultura líquido e ressuspender em uma

gota de tinta da china, fazendo um filme bem delgado entre lâmina e lamínula.

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8.2. FIXADOS E CORADOS

As preparações fixadas e coradas são usadas para verificar as

características morfológicas, sendo bastante utilizadas na identificação das

bactérias, pois tornam mais fácil a visualização das formas e permitem a verificação

do comportamento tintorial do micro-organismo em relação às colorações

diferenciais.

8.2.1. COLORAÇÃO AZUL DE METILENO DE LOEFFLER

Esta técnica é utilizada principalmente na avaliação da morfologia de

bactérias em esfregaços de líquido cefalorraquidiano, pois os danos causados às

células são menores em razão do menor número de manipulações. Esta técnica

consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado deixando-se

corar por 3 a 5 minutos. Em seguida, escorre-se o corante, lava-se em água corrente

e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio.

8.2.2. COLORAÇÃO DE WRIGHT GIEMSA

Esta técnica é utilizada para corar os elementos celulares em esfregaços

sanguíneos, para demonstração de micro-organismos intracelulares e também para

demonstrar inclusões intracelulares em esfregaços diretos, de pele ou mucosas.

Esta técnica consiste em colocar o corante sobre o esfregaço previamente fixado

deixando-se corar por 3 a 5 minutos. Em seguida, escorre-se o corante, lava-se em

água corrente e deixa-se secar para posterior observação ao microscópio.

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8.2.3. COLORAÇÃO DE GRAM

A coloração de Gram, descoberta há pouco mais de 100 anos por Hans

Christian Joaquim Gram, é utilizada com muita frequência para o exame

microscópico direto de amostras e subcultivos, para demonstrar as propriedades

tintoriais de todos os tipos de bactérias.

As bactérias coradas por esta técnica pertencem a duas categorias distintas:

gram-positivas e gram-negativas. A diferença básica entre os dois grupos é

resultado da estrutura de suas paredes celulares. A técnica consiste na aplicação de

um corante básico, o cristal violeta e uma solução de iodo e iodeto de potássio

(lugol), em um esfregaço previamente fixado na chama. A preparação é, então,

tratada com um solvente orgânico (álcool ou acetona), com o objetivo de descolorir

as células.

As bactérias gram-positivas retêm o corante ou o complexo cristal violeta e

iodo após a descoloração e aparecem em azul escuro. As bactérias gram-negativas

não são capazes de reter o complexo cristal violeta e iodo após a descoloração e

são contra coradas com um segundo corante (fucsina ou safranina), chamado

corante de contraste e adquirem a coloração vermelha.

8.2.4. COLORAÇÃO DE ZIEHL-NEELSEN

Esta técnica é utilizada para corar os bacilos álcool-ácido resistentes

(BAAR). Estes bacilos são assim denominados porque possuem um envoltório céreo

que é resistente à coloração. Para o corante penetrar na célula é necessário calor ou

detergente. Uma vez coradas as bactérias álcool-ácido resistentes, estas resistem à

descoloração, enquanto outras bactérias descoram com o álcool-ácido. A técnica

consiste em corar o esfregaço previamente fixado com carbolfucsina (aquecer três

vezes), descorar com álcool-ácido a 3% e contra corar com o azul de metileno.

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9. CONTROLE DE QUALIDADE

Em um sentido estrito, o controle de qualidade consistia em uma avaliação

contínua e sistemática do trabalho em andamento, para assegurar que o produto

final se encontrava em grau aceitável. Hoje, o controle de qualidade deve continuar

como antes, garantindo a qualidade do trabalho realizado. No entanto, os diretores e

supervisores do laboratório devem compreender que o controle de qualidade é

apenas uma das muitas facetas das certificações de qualidade do manejo de risco.

10. BIOSSEGURANÇA

Biossegurança pode ser definida como o conjunto de medidas voltadas para

a prevenção, minimização ou eliminação de riscos inerentes às atividades de

pesquisa, produção, ensino, desenvolvimento tecnológico e prestação de serviços,

que podem comprometer a saúde do homem, dos animais, do meio ambiente ou a

qualidade dos trabalhos desenvolvidos.

A segurança é, antes de tudo, um direito e uma obrigação individual. A

Biossegurança laboratorial deve ser sustentada pelos planejamentos prévios das

atividades, avaliação dos riscos e adequação das instalações.

A utilização de normas de segurança requer atitude, bom senso e boa

conduta do profissional. Desta forma a prevenção contra acidentes assegura os

resultados e a integridade das pessoas, instalações e equipamentos.

Em um laboratório, todos fazem parte de uma equipe, e a segurança

depende da ação dessa equipe, para avaliar os prováveis riscos e determinar as

condições de segurança necessárias para o trabalho.

Os ambientes voltados à prática de atividades relacionadas à saúde podem

não parecer, para muitos, mas também são locais de trabalho que não estão livres

de acidentes.

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O profissional de saúde, como também pacientes, visitantes, pessoal de

apoio (limpeza e manutenção) e administração está inserido em um grupo, que

diariamente está em contato direto com elementos geradores de riscos em potencial,

tais como equipamentos e substâncias variadas utilizadas em processos de limpeza

e esterilização.

Quando não são orientados devidamente, no tocante à segurança, tornam-

se presas fáceis desses elementos, que causam danos aos seus corpos, muitas

vezes de forma irreversível.

----------- FIM MÓDULO I -----------

microbiologia01

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