metodos rapidos de analise micro biologic a

8/2/2019 Metodos Rapidos de Analise Micro Biologic A

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS

Departamento de Cincias dos AlimentosBacharelado em Qumica de AlimentosDisciplina de Seminrios

Mtodos rpidos de anlise microbiolgica

Jlia Coswig Goldbeck

Pelotas, 2008.


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Jlia Coswig Goldbeck

Mtodos rpidos de anlise microbiolgica

Trabalho acadmico apresentado aoCurso de Bacharelado em Qumica

de Alimentos da Universidade

Federal de Pelotas, como requisito

parcial da disciplina de seminrios.

Orientadora: Josiane Chim

Co-Orientadora: Carla Mendona

Pelotas, 2008.


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Agradecimentos

colaborao de todos integrantes da Microbial, em especial a Msc. Andria

Saldanha de Lima e ao Prof. Dr. Wladimir Padilha da Silva, pela orientao,

confiana e oportunidade de crescimento pessoal e profissional.

Profa. Dra. Miriam Galvo e Dra. Caroline Borges, pela orientao e

conhecimentos transmitidos.

s orientadoras da referente disciplina, Profa. Dra. Carla Mendona e Profa.

Josiane Chim.

Aos amigos, e ao apoio e compreenso do meu companheiro de todas as

horas, Wilson Colvara.

Ao rgo apoiador de minha graduao, CNPQ, pela concesso de bolsa

Iniciao Cientfica.


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A descoberta consiste em ver o quetodo mundo viu e pensar no que

ningum pensou. "( Jonathan Swift )


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GOLDBECK, Jlia C. Mtodos rpidos de anlise microbiolgica. 2008. 32f.

Trabalho acadmico. Bacharelado em Qumica de Alimentos. Universidade Federal

de Pelotas.

Resumo

A necessidade de rapidez dos resultados de anlise, fez surgir os mtodos rpidos

de anlise microbiolgica. Os mtodos rpidos possuem vrias vantagens, como

diminuio de custos para a empresa, facilidade de leitura e interpretao dosresultados, bem como, simplificao de tarefas. Alguns desses mtodos j so

aprovados pela AOAC, porm, resultados positivos devem ser apenas presuntivos,

enquanto que resultados negativos so considerados confirmatrios. Sob viso

geral, os mtodos so projetados especificamente para identificar um grupo ou

espcie bacteriana. Quase todos os mtodos rpidos so projetados para identificar

um nico alvo, o que os torna muito eficientes em programas de qualidade. Os

testes so similares no formato e desempenho e possuem de 90 99% de exatidoquando comparados a mtodos convencionais, sendo que os resultados so obtidos

em alguns minutos, segundos ou em algumas horas. Os mtodos rpidos so

divididos em mtodos para avaliar a qualidade e mtodos para avaliar a inocuidade.


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Lista de tabelas

Tabela 1 Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimticos

encontrados no mercado.................................................................................. 23


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Lista de figuras

Figura 1 Microscpio fluorognico, usado para contagem de microrganismos e

conseqente formao de colnias........................................................................... 18Figura 2 Placas PetrifilmTM prontas para uso.........................................................

Figura 3 Reao antgeno anticorpo que ocorre no Kit ELISA.............................

Figura 4 Eletroforese em gel de agarose................................................................

18

26

28Figura 5 Bax System, sistema automatizado de PCR real

time...........................

28

Figura 6 Riboprinter System da DuPont Qualicon, usado para identificar e

caracterizar bactrias de forma automatizada........................................................... 29
http://www.madasa.com.br/index.php?option=com_docman&task=cat_view&gid=49&Itemid=65&lang=pt_brhttp://www2.dupont.com/Qualicon/en_US/products/RiboPrinter_System/index.htmlhttp://www.madasa.com.br/index.php?option=com_docman&task=cat_view&gid=49&Itemid=65&lang=pt_brhttp://www2.dupont.com/Qualicon/en_US/products/RiboPrinter_System/index.html


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Sumrio

1 Introduo................................................................................................... 102 Mtodos rpidos........................................................................................ 122.1 Mtodos convencionais x mtodos rpidos........................................ 133 Tcnicas rpidas para a identificao de microrganismos................... 153.1 Mtodos para avaliar a qualidade......................................................... 153.1.1 Mtodos de contagem direta.............................................................. 153.1.1.1 Tcnica de membrana filtrante........................................................ 15

3.1.1.2 Tcnica de epifluorescncia direta................................................. 163.1.1.3 Tcnica fluorognica........................................................................ 173.1.1.4 Sistemas prontos para uso.............................................................. 183.1.2 Mtodos de contagem indireta........................................................... 193.1.2.1 Bioluminescncia............................................................................. 203.1.2.2 Impedncia/condutncia.................................................................. 213.1.2.3 Placas SIMPLATETM......................................................................... 213.2 Mtodos para avaliar a inocuidade....................................................... 223.2.1 Mtodos bioqumicos.......................................................................... 223.2.2 Mtodos imunolgicos........................................................................ 223.2.2.1 Ensaios imunoenzimticos.............................................................. 22

3.2.2.2 Imunocaptura.................................................................................... 233.2.2.3 Imunoimobilizao............................................................................ 243.2.2.4 Coaglutinao................................................................................... 243.2.2.5 ELISA................................................................................................ 243.2.3 Mtodos moleculares.......................................................................... 263.2.3.1 Sondas genticas............................................................................ 263.2.3.2 Reao de Polimerase em cadeia (PCR)........................................ 263.2.3.3 Bacterifagos com DNA modificado............................................... 283.2.3.4 Ribotipagem...................................................................................... 28

4 Concluses ................................................................................................ 30

Referncias.................................................................................................... 32


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1. Introduo

impossvel determinar exatamente quando, na histria da humanidade, o

homem tomou conhecimento da existncia de microrganismos e da sua importncia

para os alimentos.

Aps o perodo no qual o ser humano tinha a sua alimentao baseada

apenas nos abundantes recursos da natureza, o homem passou a plantar, criar

animais e produzir o seu prprio alimento. Com o surgimento de alimentos


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preparados, comearam a ocorrer os problemas relacionados com doenas

transmitidas pelos alimentos e com a rpida deteriorao dos mesmos,

principalmente pela conservao inadequada (FRANCO, 1999).

Entre os vrios parmetros que determinam a qualidade de um produto, os

mais importantes so, sem dvida, aqueles que diferem as suas caractersticas

microbiolgicas. A avaliao microbiolgica do alimento fornece informaes que

permitem avali-lo quanto s condies em relao sade da populao.

Para que a anlise microbiolgica seja conduzida de forma que os resultados

obtidos permitam um julgamento correto do produto analisado, necessrio que os

critrios de avaliao sejam claramente estabelecidos. Esses critrios so definidos

de modo a permitir uma avaliao segura e vlida.Os critrios de avaliao so estabelecidos pela legislao de cada pas, e

em nvel internacional, por um programa conjunto FAO/WHO, da Organizao das

Naes Unidas (Joint FAO/WHO Food Standards Program) e atravs da comisso

do Codex Alimentarius.

No Brasil, padres microbiolgicos para alimentos so definidos em nvel

federal, pelo Ministrio da Sade sob RDC n 12 de 02 de janeiro de 2001, devem

ser aprovados pela Association of Official Analytical Chemists (AOAC). Em nvelestadual, alguns estados de federao, como So Paulo, tm legislao prpria.

Logo, a anlise de alimentos para se verificar quais e quantos microrganismos

esto presentes fundamental, no somente para conhecer as condies de higiene

de determinado produto, como tambm para observar se os padres e

especificaes microbiolgicos, nacionais ou internacionais, esto sendo atendidos

adequadamente (FRANCO & LANDGRAF, 1996).

Atualmente, a anlise microbiolgica de um alimento pode ser realizadaatravs dos mtodos convencionais, aqueles desenvolvidos h muitos anos e que

ainda vm sendo empregados como mtodos oficiais, ou mtodos rpidos, ao quais

vm se desenvolvendo de forma espantosa devido a sua praticidade.

Portanto, o objetivo do presente trabalho, foi conhecer as caractersticas, bem

como as vantagens e desvantagens, em relao aos mtodos convencionais, de

alguns mtodos rpidos empregados na anlise microbiolgica de alimentos.


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2. Mtodos rpidos

Os mtodos rpidos surgiram a partir da dcada de 70, como conseqncia da

necessidade de se abreviar o tempo necessrio para a obteno de resultados

analticos e de se melhorar a produtividade laboratorial (HAJDENWURCEL, 1998).

So utilizados, geralmente, como tcnicas de seleo e a fim de garantir a

segurana dos consumidores. Sob viso geral, a maioria desses mtodos consiste

em um dispositivo descartvel que contm 15 a 30 meios ou carcaas, projetados


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especificamente para identificar um grupo ou uma espcie bacteriana. Os testes so

similares no formato e no desempenho e possuem exatido de 90 99% quando

comparados a mtodos convencionais (FUNG et al., 2000)

A maioria dos testes so projetados para identificar/quantificar as bactrias

entricas, como tambm Campylobacter, Listeria, bactrias anaerbias, gran

negativas e gran positivas. Os mtodos rpidos mais encontrados no mercado so

os para contagem de coliformes totais e Escherichia coli, contagem de bolores e

leveduras, deteco de Salmonella spp. e Listeria, monocytogenes

(HAJDENWURCEL, 1998).

Quase todos os mtodos rpidos so projetados para detectar um nico alvo,

o que os torna eficientes em programas de controle de qualidade por selecionarrapidamente um grande nmero de amostras contaminadas por um determinado

patgeno (YUSTE, 2007).

Os resultados com a utilizao dos mtodos rpidos podem se dar em alguns

minutos, segundos ou algumas horas e, as avaliaes dos mesmos, mostram que o

bom desempenho desses mtodos est relacionado com o tipo de alimento. Isto

pode ser atribudo, na maioria das vezes devido composio qumica do alimento,

por isso, aconselhvel executar estudos comparativos para assegurar a eficinciada anlise (FRAQUEZA, 2002).

Ainda so poucos os mtodos validados oficialmente para alimentos, porm, vrios

mtodos alternativos de contagem tm sido proposto nos ltimos anos, tem se

observado que a rea de mtodos rpidos desenvolve-se de forma espantosa.

Porm, muitos dos chamados novos mtodos em microbiologia de alimentos nada

tem de novos, so na verdade resultados da transposio de mtodos h muito

tempo utilizados em outras reas da microbiologia.

2.1 Mtodos convencionais X mtodos rpidos

Os mtodos convencionais recebem essa denominao porque foram

desenvolvidos h muitos anos e desde ento vem sendo empregados como

mtodos oficiais na maioria dos laboratrios de microbiologia de alimentos. Esses

mtodos esto descritos em publicaes consideradas de referncia,

internacionalmente aceitos e recomendados pela American Public Health


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Association (APHA), pelo International Commission on Microbiological Specification

for Foods (ICMSF) e pela Food and Drug Administration (FDA).

O mtodo convencional de contagem de microrganismos consiste

basicamente no plaqueamento de alquotas do produto homogeneizado e de suas

diluies em meios de cultura slidos, adequadamente selecionados em funo do

microrganismo a ser enumerado. O plaqueamento pode ser feito por semeadura na

superfcie do meio de cultura previamente distribudo em placas de Petri estreis

(semeadura em superfcie), ou ento o meio de cultura pode ser adicionado aps a

transferncia das alquotas para as placas de Petri vazias (semeadura em

profundidade). As placas so ento incubadas a uma combinao de tempo e

temperatura adequada para a determinao a ser feita, durante a qual osmicrorganismos se multiplicam formando as colnias visveis, que podem ser

enumeradas manualmente ou com o auxlio de contadores automticos (FRANCO,

1999).

Apesar da aparente simplicidade dessa tcnica, ela bastante trabalhosa e

sujeita a erros, levando em considerao que: os microrganismos esto arranjados

em pares, ttrades, cadeias e cachos, conseqentemente, o nmero de colnias que

aparece na placa no corresponde ao nmero de clulas individuais presentes, almdisso, quando muitas diluies precisam ser plaqueadas tambm pode haver erros,

bem como algumas partculas de alimentos podem ser confundidas com colnias,

levando a um falso resultado positivo, sendo a leitura dos resultados bastante difcil,

pois pode variar de acordo com o analista, alm de ser cansativa e imprecisa,

mesmo quando contadores automticos so empregados (SILVEIRA et al.,1997).

Visando minimizar estes problemas, surgiram os mtodos alternativos

(mtodos rpidos), que apresentam a convenincia de produzirem resultados maisrpidos, sensveis e especficos, se comparados s tcnicas convencionais. Tais

mtodos tambm podem oferecer economia de espao e materiais, aumentando a

produtividade laboratorial. Alternando a necessidade de rapidez dos resultados de

anlises microbiolgicas, em face do alto volume de alimentos disposio do

consumidor em curto espao de tempo (SILVA, 1996).

Como vantagens dos mtodos rpidos, pode-se enumerar:

Reduo do tempo de anlise;

Menor tempo de reteno do produto na indstria;


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Diminuio de custos;

Simplificao das tarefas envolvidos na anlise;

Facilidade de leitura dos resultados;

Especificidade;

Maior sensibilidade de alguns mtodos quando comparados com os

mtodos convencionais.

Contudo, ao se escolher e implantar os mtodos rpidos deve se levar em

conta parmetros como preciso, custo, tempo de anlise, aceitabilidade pelos

rgos oficiais, simplicidade de operao, assistncia tcnica dos fabricantes e

disponibilidade de espao no laboratrio. Porm, segundo Feng (1995), os mtodos

rpidos aprovados pelos rgos oficiais podem ser utilizados somente para controle,

sendo que os resultados negativos so considerados como definitivos, mas

resultados positivos so considerados presuntivos e devem ser confirmados por

mtodos padres.

3. Tcnicas rpidas para a identificao de microrganismos

Os mtodos rpidos podem ser divididos em dois grupos: mtodos para

avaliar a qualidade e mtodos para avaliar a inocuidade (SILVEIRA, 2006). Os

mtodos que avaliam a qualidade do alimento esto mais relacionados aos


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microrganismos deteriorantes, aqueles no patognicos, j os mtodos que avaliam

a inocuidade, quantificam/identificam microrganismos patognicos.

3.1 Mtodos para avaliar a qualidade

3.1.1 Mtodos de contagem direta

3.1.1.1 Tcnica de membrana filtrante

Utilizada h bastante tempo para enumerao de coliformes totais, fecais e

Escherichia coliem gua, porm, seu uso em alimentos mais recente. A mistura

alimento-diluente filtrada atravs de membranas filtrantes de acetato de celulose

ou de nitrocelulose que tem porosidade suficiente (0,45m) para reteno dos

microrganismos presentes nessa mistura. Em seguida as membranas so

transferidas para a superfcie de placas contendo gar ou cartes absorventes

saturados com meio de cultura. Aps o tempo de incubao adequado para cada

microrganismo, faz-se a enumerao das colnias que surgiram na superfcie das

membranas. A contagem pode ser facilitada pelo emprego de membranas

quadriculadas e pelo uso de contadores automticos.

A tcnica das membranas filtrantes apresenta as seguintes vantagens:

Remove os componentes do alimento que podem interferir no

crescimento microbiano (slidos em suspenso ou agentes

antimicrobianos);

Microrganismos presentes em pequeno nmero, por vezes no

detectveis em outras tcnicas, podem ser concentrados pela filtrao

de volume maior da amostra;

Permite a contagem de 1 at 1,6x10-3 UFC por membrana, o que elimina

a necessidade de diluio;

As colnias so coradas para facilitar a visualizao.

O uso de membranas Isogrid aprovado pela AOAC para enumerao de

bactrias totais, coliformes totais, Escherichi coli e Salmonella, sendo tambm

aprovados diversos tratamentos enzimticos que podem ser utilizados em funo do

tipo de alimento, para melhorar a filtrabilidade.


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Alm da aprovao oficial, as membranas podem ser tambm utilizadas para a

pesquisa de Staphylococcus aureus, V. parahaemolyticus, Y. enterocoltica, C.

perfringens, P. aeruginosa, bactrias gran negativas e estreptococus fecais. Sua

aplicao em alimentos como leite, carne, condimentos, farinhas vegetais, frutos do

mar e outros tm apresentado timos resultados (MACHADO, 2007).

3.1.1.2 Tcnica de epifluorescncia direta

Tcnica rpida de contagem de microrganismos que no depende de seu

cultivo e conseqente formao de colnias. Os microrganismos viveis e no

viveis so enumerados por microscopia, sendo uma das tcnicas que ofereceresultados mais rapidamente. A amostra devidamente homogeneizada tratada com

enzimas e tensoativos, se necessrio, filtrada atravs de uma membrana de

policarbonato, que retm os microrganismos. Essa membrana ento corada com

fluorocromo nucleoflico (alaranjado de acridina) e observada em um microscpio de

fluorescncia. O corante permite a diferenciao das clulas viveis, pois o DNA e

RNA corados apresentam fluorescncia de colorao diferente, em funo da fase

de crescimento microbiano. As clulas viveis apresentam fluorescncia laranja-avermelhado, enquanto clulas mortas tm fluorescncia verde. A epifluorescncia

direta tem boa sensibilidade, resultante da concentrao das clulas na superfcie da

membrana filtrante. Tem sido bastante usada em leite.

Essa tcnica, porm,apresenta algumas desvantagens:

Tcnica muito cansativa;

Injria de bactrias devido ao calor pode alterar a fluorescncia;

O custo elevado dos equipamentos torna seu uso limitado a grandeslaboratrios(MACHADO, 2007).

3.1.1.3 Tcnica fluorognica

Os testes baseados na adio de MUG (4-metil-umbeliferil--D-glicuronideo) a

um caldo de cultura para deteco de Escherichia coli., so exemplos desta tcnica.

A enzima -glicuronidase produzida pela grande maioria das cepas dessemicrorganismo transforma o MUG em umbeliferona, fluorescente quando observado


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sob luz ultravioleta de onda longa. A observao do nmero de tubos turvos, com

gs e fluorescentes aps 24 ou 48h, permite o clculo do nmero mais provvel de

E. colipor grama (ou mL) do produto (MACHADO, 2007).

Este mtodo oferece como vantagens:

- Rapidez e facilidade de usar;

- Identificao direta e enumerao de Escherichia coli ou enterococos em 36

horas (em comparao com 3 ou 4 dias usando mtodos tradicionais);

- Dispensa a preparao de meio de cultura;

- Emprega microplacas estreis e prontas para uso;

- Padronizao do preparo, incubao e tcnica de leitura para E. coli e

Enterococcus;- Deteco da atividade de uma enzima especfica de cada bactria por

microplaca;

- Resultados confiveis;

- Economia de tempo e material.

A Fig. 1 representa ilustrativamente um microscpio fluorognico, usado

nesta tcnica para enumerar as clulas viveis no viveis.

Figura 1 Microscpio fluorognico, usado para contagem de microrganismos.Fonte: Google imagens (Epifluorescncia direta), 2008.

3.1.1.4 Sistemas prontos para uso

Existem diferentes sistemas disponveis comercialmente, com princpios

distintos, nos quais os meios de cultura j vm prontos para uso, muitas vezes j na

prpria placa de petri. Entre esses, destacam-se as Placas de Petrifilm-3M, Placas

de Simplate e diversos gares adicionados de substratos cromognicos ou

fluorognicos.

As placas PetrifilmTM so produzidas e comercializadas pela 3M, so filmes de

papel quadriculado revestido com polietileno, recobertos de nutrientes desidratadose gis hidrossolveis a frio. Cada placa tem ainda um filme superior de polipropileno,


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que na face voltada para o filme inferior revestido por gis hidrossolveis a frio e

um corante indicador (cloreto de trifeniltetrazolio TTC), com exceo daquelas

usadas para contagem de fungos.

As placas devem ser armazenadas em temperaturas inferiores a 8C, antes do

uso necessitam estar em temperaturas ambientes. A exposio das mesmas a

temperaturas superiores a 25C e/ou umidade superior a 50% podem afetar seu

desempenho.

As placas Petrifilm so prontas para uso, isto , basta erguer o filme superior e

inocular 1mL do produto a ser analisado, voltar o filme para a posio inicial e aplicar

um difusor plstico a fim de distribuir uniformemente o inoculo pela placa, atravs de

leve presso manual. Os agentes gelificantes so solveis em gua e a frio. A guade diluio contida na amostra, em contato com os componentes da placa provoca a

hidratao dos nutrientes e a geleificao da mistura.

Aps a geleificao (1 min) as placas so incubadas na temperatura e tempo

adequados, fazendo-se em seguida a enumerao de colnias. As colnias

apresentam-se vermelhas devido ao indicador que quando reduzido pelo

microrganismo passa de incolor para vermelho.

A tecnologia Petrifilm pode ser usada para a enumerao de: bactriasaerbias totais, coliformes totais e fecais, E. coli, enterobactrias, leveduras e

bolores e ainda bactrias lticas.

Os resultados podem ser obtidos em 24 horas sendo, em alguns casos,

necessrio incubar por 48 horas. Leveduras e bolores podem ser enumerados,

sendo a incubao pelo perodo de 3-5 dias a 25C (SANTANA; CONCEIO;

AZEREDO, 2002).

Entre as vantagens desse sistema, tem-se: Ser um sistema pronto para uso;

Execuo fcil e rpida, que dispensa a necessidade de preparo de meios de

cultura, do uso de placas de Petri e de equipamentos laboratoriais especiais;

Custo baixo;

Obteno rpida dos resultados.

A Fig. 2 mostra as placas Petrifilm ilustrando que cada placa tem ainda um

filme superior de polipropileno e, como observado o resultado final,respectivamente,


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Figura 2. Placas PetrifilmTM prontas para uso.Fonte: Google Imagens (Placas Petrifilm), 2008.

3.1.2 Mtodos de contagem indireta

Alm das tcnicas diretas os analistas tm a seu dispor diversas tcnicas

alternativas indiretas, baseadas na medio da atividade metablica dos

microrganismos nos alimentos. Nestas tcnicas os microrganismos presentes so

quantificados atravs da dosagem de determinados produtos metablicos, que

produzem quando se multiplicam nos alimentos ou, ainda, atravs de medidas de

alteraes fsicas ocorridas durante este processo. Estas tcnicas exigem a

construo de curvas-padro, nas quais se faz a correlao entre os parmetros

medidos e o nmero de clulas viveis presentes. O princpio bsico quanto maior

o nmero de microrganismos presentes mais intenso o fenmeno medido, desta

maneira quanto maior for o nvel de contaminao de um produto, menor o tempo

de reteno.

Atravs destas tcnicas, teoricamente, possvel detectar a presena de at

uma clula vivel na amostra em teste (FRANCO et al., 1992).

3.1.2.1 Bioluminescncia

Esta tcnica est baseada no princpio de que a quantidade de Adenosina

Trifosfato (ATP) presente em um sistema est relacionada ao numero de clulas

metabolicamente ativas, inclusive microrganismos. Uma das formas mais simples de

se medir a quantidade de ATP atravs do sistema luciferina-luciferase, inicialmenteobtido da cauda de vagalumes ou extrado de peixes e, mais recentemente, obtido


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por manipulao gentica de microrganismos. ATP reage com a enzima luciferase,

na presena de luciferina e ons Mg++, formando um complexo que, em contato com

o oxignio, sofre uma descarboxilao, com emisso simultnea de luz.

A luz emitida pode ser medida em luminmetro, um fluormetro ou em um

espectrofotmetro de cintilao lquida, podendo ser expressa atravs da seguinte

reao:

Mg+2

E + LH2 + ATP E - LH2 - AMP + PP

E - LH2 - AMP + O2 oxiluciferina + CO2 + AMP + luz

E = enzima luciferase, LH2 = luciferina , E - LH2 - AMP = complexo luciferase-

luciferina-AMP

Equao 1. Reaes que ocorrem durante o ensaio de bioluminescncia.

Uma das grandes aplicaes dessa tcnica o monitoramento da eficincia

de procedimentos de limpeza e higienizao em plantas processadoras de alimentos

(FRANCO; LANDGRAF, 1996).Esta tcnica bastante conveniente no monitoramento de programas de

APPCC (anlise de perigos e pontos crticos de controle).

Apresenta como vantagens:

- Fcil leitura, com valores mximos e mnimos;

- Resultados em minutos;

- Sistema porttil, fcil transporte;

-

Fcil utilizao, qualquer pessoa pode usar;- Capacidade de armazenamento de dados (memria);

- No necessita adio de solues;

- Medio exata da quantidade de ATP.

3.1.2.2 Impedncia/Condutncia

So baseadas na propriedade que os microrganismos tm de alterar a

transmisso da corrente eltrica atravs de um meio de cultura. Essas alteraes

ocorrem como conseqncia da mudana da composio qumica desse meio


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devido atividade metablica dos microrganismos presentes. Durante a

multiplicao microbiana, molculas grandes (protenas, lipdeos, carboidratos) so

transformadas em molculas menores (aminocidos, cidos graxos, cidos

orgnicos), quimicamente mais ativas; o acmulo desses metablitos finais resulta

em alteraes mensurveis na condutncia e impedncia eltrica do meio

(SILVEIRA, 2006).

So exemplos de equipamentos o Bactometer (bioMurieux), RABIT (Don

Whitley Scientific) e o Malthus 2000 (Malthus Instrumments).

3.1.2.3 Placas SIMPLATETM

Tcnica alternativa para a enumerao de bactrias totais, coliformes,

Escherichia coli, bolores e leveduras em alimentos. As placas so plsticas e

apresentam 84 ou 198 cmaras, s quais se adicionam alquotas da amostra em

anlise e o meio de cultura Simplate. As placas so incubadas a 35C por 24 horas.

A contagem de bolores e leveduras e bactrias mesfilas so realizadas

enumerando-se as cmaras que apresentam fluorescncia sob luz UV. Colorao

prpura indica presena de coliformes totais e fluorescncia sob luz UV presena deEscherichia coli. O nmero de microrganismos determinado atravs de uma

tabela, expressando-se o NMP.g-1 ou mL-1 de alimento analisado (SILVA; GALLO,

2003).

3.2 Mtodos para avaliar a inocuidade

3.2.1 Mtodos Bioqumicos

So baseados na avaliao da capacidade dos microrganismos de utilizarem

determinados substratos ou de produzirem determinados metablitos. Existem no

mercado diversos kits, na maioria miniaturizados, onde os testes so executados

com pequenos volumes de meio de cultura, os quais se encontram na forma

desidratada ou liofilizada, e so reidratados pela adio de pequeno volume da


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amostra a ser testada. Aps a incubao faz-se a leitura dos resultados,

normalmente atravs de uma combinao de nmeros obtida de acordo com o

resultado de cada um dos testes que faz parte do sistema. Cada combinao de

nmeros corresponde a um microrganismo diferente (MACHADO, 2007).

3.2.2 Mtodos Imunolgicos

Esses mtodos apresentam grande sensibilidade e elevada especificidade e,

em funo disso, vm sendo empregados cada vez mais em microbiologia de

alimentos. So baseados em reaes especficas entre antgenos e anticorpos, os

quais podem ser poli ou monoclonais. Os principais mtodos imunolgicos sodescritos abaixo (SILVEIRA, 2006).

3.2.2.1 Ensaios imunoenzimticos

Nesses ensaios um dos reagentes, antgeno ou anticorpo, fica adsorvido a

superfcie de uma matriz slida (esferas de poliestireno, placas de microtitulao,

partculas metlicas revestidas de policarbonato e outras). A reao baseada naligao no covalente e reversvel do antgeno com o anticorpo especfico, no qual

um desses reagentes marcado com uma enzima, normalmente cromognica, ou

seja, que age em reaes que resultam no desenvolvimento de cor. A cor formada

pode ser observada a olho nu ou em espectrofotmetro. Dois tipos de ensaios

imunoenzimticos so mais comumente utilizados: competitivo e no competitivo. O

tipo no competitivo, tambm conhecido como tipo Sanduche, o mais utilizado nos

sistemas de triagem de microrganismos patognicos em alimentos (SILVEIRA,2006).

Existe no mercado um grande nmero de sistemas comerciais baseados em

tcnicas imunoenzimticas, conforme a Tab. 1, a seguir.

Tabela 1 Alguns sistemas baseados em ensaios imunoenzimticos

encontrados no mercado


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Fonte: MACHADO, 2007.

3.2.2.2 Imunocaptura

Tambm chamada de imunoseparao magntica, nessa tcnica os

anticorpos ficam ligados a partculas metlicas recobertas com policarbonato. Aps

a ligao com o antgeno especfico, as partculas metlicas so atradas por um

im, permitindo que o restante do material seja removido. Aps a retirada do im,

obtm-se um produto concentrado que pode, ento, ser submetido aos testes de

escolha para pesquisa do microrganismo de interesse. Essa tcnica, quando

aplicada diretamente em alimentos pode reduzir, ou mesmo substituir a etapa de

pr-enriquecimento, sempre necessria quando se pretende investigar a presena

de microrganismos patognicos em alimentos por mtodos convencionais (SILVA,

1996).

3.2.2.3 Imunoimobilizao

Nessa tcnica, bactrias mveis cultivadas em meio semi-slido tm sua

mobilidade bloqueada pela adio de anticorpos flagelares especficos. H formao

de uma banda de precipitao visvel na interface anticorpo-bactria.

3.2.2.4 Coaglutinao

SISTEMA FABRICANTE

Salmonella-Tek, Listeria-Tek, EHEC-Teck Organon TeknikaListeria-Via, Salmonella-Via, EHEC-Via, S. aureus-

Via

Tecra

Unique Salmonella, Unique Listeria TecraECOLI Difcro

Listeria Rapid Test OxoidREVEAL Listeria, Salmonella e E. coli Neogen

Vip E. coli BiocontrolVIDAS Siatema Salmonella, Listeria, E. coli e E.

aureus

bioMuriex


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Essa tcnica baseada na aglutinao de partculas de ltex sensibilizadas

com anticorpos antitoxinas. Tambm so conhecidas como reaes de aglutinao

de ltex ou aglutinao passiva reversa.

3.2.2.5 ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)

um teste imunoenzimtico que permite a deteco de anticorpos

especficos no soro. Este teste usado no diagnstico de vrias doenas

infecciosas uma vez que vrios agentes patolgicos induzem a produo de

anticorpos (imunoglobulinas) por parte dos linfcitos B do sistema imunolgico

humoral humano.Este o teste de primeira linha no diagnstico da infeco pelo HIVvrus da

SIDA/AIDS, estes testes at a sua terceira gerao s detectavam a presena de

anticorpos (IgG e IgM) trs ou quatro semanas aps o contato, no entanto, os testes

de quarta gerao j detectam tanto anticorpos como um dos antgenos do HIV - a

protena p24 - fato esse que diminuiu sensivelmente o perodo de janela

imunolgica, podendo chegar a apenas duas semanas.

Um resultado positivo num teste de ELISA sempre confirmado por outrostestes especficos como o caso do Western blot, que detecta protenas do vrus, e

do PCR, que detecta os cidos nucleicos virais.

O teste ELISA tambm pode ser utilizado de diversas outras formas.

Utilizando-se de um mtodo semelhante ao mtodo de Imunoradioensaio, pode-se

transformar muitas outras substncias em antgeno e obter um anticorpo do mesmo.

Assim, possvel utilizar o teste para se detectar outras substncias de interesse

como, por exemplo, hormnios. Pelo fato do radioimunoensaio ser muito caro, oteste ELISA pode ser uma alternativa muito mais simples e barata.

O mtodo utilizado para realizar o teste se baseia na interao anticorpo-

antgeno. Normalmente usada uma placa de superfcie inerte com poos onde

sero adsorvidas as protenas de interesse. Depois realizada uma lavagem com

uma protena inespecfica para que esta ocupe os poos livres. A superfcie ento

tratada com soluo de anticorpo primrio, sabendo-se que exista uma quantidade

maior de anticorpo do que a protena, especfico para a protena de interesse e este

vai se ligar a ela. A superfcie lavada novamente para retirar os anticorpos

primrios que no foram incorporados em nenhuma protena. Em seguida o produto
http://pt.wikipedia.org/wiki/Anticorpohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Imunoglobulinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Linf%C3%B3citohttp://pt.wikipedia.org/wiki/HIVhttp://pt.wikipedia.org/wiki/V%C3%ADrushttp://pt.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADndrome_da_imuno-defici%C3%AAncia_adquiridahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADnahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Western_blothttp://pt.wikipedia.org/wiki/PCRhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Anticorpohttp://pt.wikipedia.org/wiki/Imunoglobulinahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Linf%C3%B3citohttp://pt.wikipedia.org/wiki/HIVhttp://pt.wikipedia.org/wiki/V%C3%ADrushttp://pt.wikipedia.org/wiki/S%C3%ADndrome_da_imuno-defici%C3%AAncia_adquiridahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADnahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Western_blothttp://pt.wikipedia.org/wiki/PCR


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tratado com anticorpos secundrios que possuem uma enzima acoplada que ir

produzir uma substncia corada e que se constitui de um anticorpo para o anticorpo

primrio. A superfcie lavada novamente para a retirada do anticorpo secundrio

que no se ligou ao anticorpo primrio. Adiciona-se o substrato de ligao para a

enzima produzir a substncia corada e, assim, medindo-se a intensidade da cor da

superfcie, pode-se quantificar e verificar a presena de alguma substncia de

interesse (SIMERSKY,2000).

A Fig. 3 mostra ilustrativamente como ocorre a reao especfica entre o

antgeno e o anticorpo.

Figura 3. Reao antgeno e anticorpo que ocorre no Kit ELISA.

Fonte: Google Imagens (ELISA), 2008.A figura acima, mostra como possvel estabelecer a concentrao do analito

em questo, ou seja quanto maior a intensidade da cor emitida pela enzima

cromognica, menor a concentrao do analito, uma vez que, a enzima

cromognica liga-se enzima conjugada. A concentrao obtida atravs de uma

curva de calibrao (Absorbancia x concentrao), sendo porm inversamente

proporcional a quantidade do analito.

3.2.3 Mtodos Moleculares

3.2.3.1 Sondas genticas


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Nessa tcnica necessrio submeter os microrganismos a um tratamento em

que seu material gentico liberado e separado em duas fitas simples. Em seguida,

adicionam-se sondas, que so fragmentos de DNA ou RNA especficos para o

patgeno alvo, marcadas com enzimas, normalmente cromognicas e, quando h

hibridizao com a sonda, h desenvolvimento de cor e, portanto, a presena do

microrganismo investigado detectada (MACHADO, 2007).

3.2.3.2 Reao de Polimerase em Cadeia (PCR)

uma tcnica muito utilizada em microbiologia para amplificao do materialgentico de microrganismos.

A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR) um mtodo muito sensvel de

anlise e por isso realizada com muito cuidado para evitar contaminaes que

possam inviabilizar ou tornar errneo o resultado. Em primeiro lugar, deve-se extrair

o material gentico da clula ou outro material a ser estudado sem danific-lo.

Normalmente o material extrado o DNA (ADN), mas pode-se trabalhar com o RNA

(ARN) em uma RT-PCR que um desdobramento da PCR e possui outrasaplicaes (FUNG, 2002).

Depois de extrado o DNA, a este adicionada uma mistura (tambm

conhecida como pr-mix) que contm os dNTPs (desoxirribonucleotdeos

trifosfatos), que so as bases nitrogenadas ligadas com trs fosfato, os primers

tambm chamados de oligonucleotdeos (ou iniciadores) e a enzima DNA

polimerase em uma soluo tampo. Toda esta mistura colocada no termociclador,

o qual faz ciclos de temperatura pr-estabelecidos com tempos exatos especficospara cada reao (fragmento a ser amplificado).

Na primeira etapa do ciclo a temperatura elevada de 94 a 96C, por pouco

tempo, para que haja a separao da dupla cadeia de DNA (Desnaturao). Na

segunda etapa, a temperatura reduzida entre 50 a 60C, dependendo da

quantidade de C e G encontrada no primer, para que os primers se anelem

(pareiem) com a fita molde de DNA (anelamento). Na ltima etapa do ciclo a

temperatura elevada a 72C para que a enzima possa funcionar sintetizando a

nova molcula (extenso), em seguida um novo ciclo iniciado. Normalmente so

realizados de 25 a 40 ciclos para cada reao na qual a taxa de replicao
http://pt.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNTPhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Primerhttp://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Iniciador&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerasehttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerasehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Solu%C3%A7%C3%A3o_tamp%C3%A3ohttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNAhttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNTPhttp://pt.wikipedia.org/wiki/Primerhttp://pt.wikipedia.org/w/index.php?title=Iniciador&action=edit&redlink=1http://pt.wikipedia.org/wiki/Enzimahttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerasehttp://pt.wikipedia.org/wiki/DNA_polimerasehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Solu%C3%A7%C3%A3o_tamp%C3%A3o


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exponencial 2ciclo. O resultado analisado atravs de uma eletroforese em gel de

agarose ou de poliacrilamida (figura 4).

Figura 4. Eletroforese em gel de agarose.Fonte: Google Imagens (PCR), 2008.

Atualmente existem outras tcnicas mais rpidas que a PCR, como por

exemplo o Bax Sisten o qual um sistema automatizado de PCR real-time,

baseado em DNA para anlises microbiolgicas de Salmonella, E.Coli 0157:H7,

Listeria Monocytogenes, Listeria.sp, Enterobacter.sakazakii, Campylobacter

jejuni/coli, Bolores e Leveduras. Roda de uma a noventa e seis anlises por vez,

com resultados disponveis em cerca de 3 horas e meia. Essa tcnica avalia a

caracterstica gentica da bactria, o que aumenta a capacidade e a estabilidade do

mtodo de uma forma nica, pois as variaes do meio, flora acompanhante e

outras variveis tm as suas influncias reduzidas a praticamente zero (YUSTE;

FUNG, 2007).

A Fig. 5 mostra, ilustrativamente, a tcnica acima citada, onde a leitura feita

diretamente na tela do aparelho, ou seja no h a necessidade de realizar uma

eletroforese, como na tcnica de Reao de Polimerase em Cadeia (PCR).
http://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforesehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Agarosehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Poliacrilamidahttp://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforesehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Agarosehttp://pt.wikipedia.org/wiki/Poliacrilamida


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Figura 5. Bax System, sistema automatizado de PCR real timeFonte: Google Imagens (Sistema Bax Sistem), 2008.

3.2.3.3 Bacterifagos com DNA modificado

Esses bacterifagos carregam informao gentica para a sntese de

protenas especiais, responsveis pela formao de cristais de gelo, quando a

amostra resfriada adequadamente. Esse princpio utilizado em um teste para

Salmonella e, quando esse microrganismo est presente na amostra, os

bacterifagos se ligam a Salmonella e o material gentico introduzido na bactria,

que passa a sintetizar protenas especiais. A formao dos cristais de gelo provoca

alterao na colorao do meio, facilmente observada a olho nu (MACHADO, 2007).

3.2.3.4 Ribotipagem

feita em um equipamento sofisticado, totalmente automatizado, no qual

bactrias podem ser identificadas rapidamente (menos de 8 horas) em nvel de

espcie. Virtualmente qualquer bactria pode ser identificada por esse mtodo.

Como exemplo pode-se citar o Riboprinter System da DuPont Qualicon a

nica tecnologia no mercado capaz de identificar e caracterizar bactrias de forma

automatizada, alm de criar um banco de dados digital. O processo se baseia na

ribotipagem, ou seja, na anlise e comparao de DNA-RNA oferecendo assim, um

alto poder discriminatrio pela diferenciao em nvel gentico.

A Fig. 6 ilustra o equipamento da Riboprinter System da DuPont Qualicon.

Figura 6. Riboprinter System da DuPont Qualicon, usado para identificar ecaracterizar bactrias de forma automatizada.Fonte: Google imagens (Ribotipagem), 2008.
http://www.madasa.com.br/index.php?option=com_docman&task=cat_view&gid=49&Itemid=65&lang=pt_brhttp://www2.dupont.com/Qualicon/en_US/products/RiboPrinter_System/index.htmlhttp://www.madasa.com.br/index.php?option=com_docman&task=cat_view&gid=49&Itemid=65&lang=pt_brhttp://www2.dupont.com/Qualicon/en_US/products/RiboPrinter_System/index.html


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Com este equipamento possvel realizar a rastreabilidade completa do

microrganismo em questo, identificando a fonte e causa da contaminao de uma

maneira direta e indubitvel, pois fornece um perfil gentico de cada uma das

bactrias implicadas, permitindo que as bactrias com o ribogrupo coincidente sejam

identificadas e a causa do problema prevenida e/ou eliminada (FRANCO et al,

1996).

4. Concluses

A partir do estudo realizado, observou-se que o controle e segurana da

qualidade dos alimentos tem sido um dos grandes desafios colocados indstria

alimentar. Logo, devido necessidade de rapidez de resultados, hoje, j so

encontrados no mercado varias tcnicas que possibilitam resultados muito rpidos,essas tcnicas so conhecidas por mtodos rpidos de anlise microbiolgica, os


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mais usados na rea da pesquisa so PCR, o ELISA, placas petrifilm e placas

simplate.

Os mtodos rpidos possuem muitas vantagens, como boa exatido, alm de

minimizar os custos de uma empresa, sendo de rpida e fcil leitura, porm,

possuem algumas desvantagens, como o elevados custo de algumas tcnicas e

mesmo aqueles j aprovados pela AOAC, os resultados positivos ainda no so

considerados confirmatrios.

No entanto, torna-se imprescindvel, no s aos microbiologistas, mas a todos

da rea de alimentos, estarem interados com essas novas tcnicas, pois estas vm

crescendo, substituindo, em parte, os mtodos convencionais aplicados na maioria

dos laboratrios de microbiologia de alimentos.

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sobre pades microbiolgicos para alimentos. Dirio oficial da Repblica do

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