Universidade Federal de PernambucoCentro de Ciências Exatas e da NaturezaDepartamento de Química Fundamental

Química Analítica 12 – Prof.ª Madalena Areias

Técnicas de Separação:Cromatografia Líquida, Cromatografia Gasosa e Eletroforese Capilar

Aluna: Daniele Cristina Gomes da Cunha Kunze

Recife, 29 de julho de 2014

Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)

A cromatografia é uma técnica de separação na qual os componentes a serem

separados de uma mistura migram entre duas fases sendo uma fase móvel e a outra

estacionária.

O termo cromatografia foi primeiramente empregado em 1906 e sua utilização é

atribuída a um botânico russo ao descrever suas experiências na separação dos

componentes de extratos de folhas. Nesse estudo, a passagem de éter de petróleo (fase

móvel) através de uma coluna de vidro preenchida com carbonato de cálcio (fase

estacionária), à qual se adicionou o extrato, levou à separação dos componentes em

faixas coloridas. Este é provavelmente o motivo pelo qual a técnica é conhecida como

cromatografia (chrom = cor e graphie = escrita), podendo levar à errônea idéia de que o

processo seja dependente da cor.

Apesar deste estudo e de outros anteriores, que também poderiam ser

considerados precursores do uso dessa técnica, a cromatografia foi praticamente

ignorada até a década de 30, quando foi redescoberta. A partir daí, diversos trabalhos na

área possibilitaram seu aperfeiçoamento e, em conjunto com os avanços tecnológicos,

levaram-na a um elevado grau de sofisticação, que resultou no seu grande potencial de

aplicação em muitas áreas. A cromatografia pode ser utilizada para a identificação de

compostos, por comparação com padrões previamente existentes, para a purificação de

compostos, separando-se as substâncias indesejáveis e para a separação dos

componentes de uma mistura.

O processo cromatográfico consiste na migração dos componentes de uma

mistura entre a fase móvel e a fase estacionária. No caso da cromatografia líquida, a

fase móvel é um solvente e a estacionária é constituída de partículas sólidas

empacotadas em uma coluna, e é sobre essa coluna que a fase móvel é atravessada.

São as forças físicas e químicas que atuam entre os solutos e as duas fases são

responsáveis pela retenção dos solutos sobre a coluna cromatográfica. A diferença na

magnitude dessas forças que determina a resolução e portanto a separação dos solutos

individuais. As forças elementares que agem sobre as moléculas são de cinco tipos:

1. Forças de dispersão de London ou forças de Van der Waals;

2. Interações de dipolo induzido;

3. Ligações de hidrogênio;

4. Interações dielétricas;

5. Interações eletrostáticas e coulombianas.

As variáveis que afetarem essas forças intermoleculares irão influenciar o grau

de separação obtido pela passagem dos solutos através da coluna cromatográfica.

Há cinco tipos de fases estacionárias com diferentes mecanismos que regem as

separações cromatográficas na CLAE. Mediante a simples troca de coluna e fase móvel

é possível utilizar um deles:

1. Cromatografia líquido-sólido (ou por adsorção)

O mecanismo desse tipo de separação se baseia na competição que existe entre

moléculas da amostra e as da fase móvel em ocupar os sítios ativos na superfície de um

sólido (fase estacionária).

O equilíbrio estabelecido é: para que a molécula do soluto possa ser adsorvida na

fase estacionária, primeiro uma molécula da fase móvel deve ser deslocada da

superfície. Se assumir que o adsorvente possui uma superfície polar (por exemplo: sílica

ou alumina), grupos apolares (por exemplo, hidrocarbonetos) terão pouca afinidade por

essa superfície e não irão deslocar a molécula da fase móvel, por isso, não serão retidos.

Grupos funcionais polares capazes de formar pontes de hidrogênio terão fortes

afinidades pela superfície e serão fortemente retidos. Moléculas polarizáveis (por

exemplo, moléculas aromáticas) irão apresentar interação dipolo induzido-dipolo com a

superfície do adsorvente e, portanto, também serão retidas.

O grau de retenção depende da polarização de cada molécula ou grupo funcional. É

importante que as partículas da fase estacionária apresentem uma grande área de

superfície, isto é, um grande número de sítios ativos.

2. Cromatografia líquido-líquido (ou por partição)

O mecanismo de separação neste tipo de cromatografia, ou mecanismo de

distribuição como também é chamado, baseia-se nas diferentes solubilidades que

apresentam os componentes da amostra na fase móvel e na fase estacionária. Então, os

componentes mais solúveis na fase estacionária são seletivamente retidos por ela,

enquanto os menos solúveis são transportados mais rapidamente pela fase móvel.

O maior inconveniente desta técnica é a solubilidade da fase estacionária na fase

móvel, o que rapidamente deteriora a coluna, levando a não reprodutibilidade nas

separações repetitivas. Isto pode ser resolvido de duas maneiras: saturando a fase móvel

com a fase estacionária por meio de uma pré-coluna, colocada antes do injetor, que

contenha uma alta percentagem de fase estacionaria; ou utilizando materiais que

contenham a fase estacionária, quimicamente ligada a um suporte sólido.

3. Cromatografia líquida com fase ligada

A fase estacionária para a cromatografia líquida com fase ligada (CLFL) surgiu

como resposta aos problemas com a CLL. Como a fase estacionária é quimicamente

ligada à superfície do suporte, não há mais solubilidade da fase estacionária na fase

móvel.

O mecanismo principal desta técnica baseia-se na partição. Por outro lado, como

esta fase estacionária também apresenta influência de grupos ativos (polares) da

superfície (isto é, também ocorre o mecanismo de adsorção), a maioria dos

pesquisadores considera esta técnica um método separado.

Variando a natureza dos grupos funcionais da fase estacionária é possível obter

diferentes tipos de seletividade. Estes grupos podem ser polares, como o grupo amino

(-NH2) e o grupo nitrilo (-CN), que funcionam similarmente às fases polares da CLS,

sendo chamados de fase normal. E há os de natureza apolar, como os grupos octil

(-C8H17), octadecil (-C18H37) e fenil (-C6H5), que são chamados de fase reversa.

Este tipo de cromatografia é muito útil e se aplica a moléculas de baixa ou média

polaridade, não iônicas, de massa molecular inferior a 2000 e solúveis em solvente

orgânico.

4. Cromatografia líquida por troca iônica

Na cromatografia por troca iônica (CTI), a fase estacionária possui grupamentos

iônicos quimicamente ligados que podem ser trocadores de cátions ou de ânions. Esses

grupamentos apresentam contra-íons que são deslocados pelos íons da amostra.

5. Cromatografia líquida por exclusão

Esta técnica é baseada no tamanho efetivo das moléculas dos componentes da

amostra em solução. E existem limites que determinam o intervalo de tamanhos em que

um material é útil. O primeiro é o inferior, chamado de limite de permeação, abaixo do

qual todas as moléculas de menor tamanho são igualmente difundidas dentro dos poros

do material e o segundo é o superior, chamado limite de exclusão, acima do qual todas

as moléculas são muito grandes para penetrar nos poros. Moléculas de tamanho

intermediário entre ambos os limites serão separadas totalmente ou parcialmente de

acordo com a seletividade característica de cada material. Então, serão eluídas sem

resolução as moléculas menores que o limite de permeação e as maiores do que o limite

de exclusão, separando somente as que se encontram dentro destes limites.

Instrumentação

Um equipamento básico de cromatografia líquida contém basicamente cinco

componentes, como pode ser visto no esquema abaixo:

1. Reservatório da fase móvel: A fase móvel da CLAE deve ser um solvente que

respeite algumas características impostas por esse método analítico. A principal

característica é que a fase móvel dissolva a amostra sem qualquer interação química

entre ambas. Esta fase deve ter alto grau de pureza ou ser de fácil purificação, para

que se possam fazer análises de alta sensibilidade, pois as impurezas podem

interferir na detecção do analito por ultravioleta (UV).

A fase móvel deve ser compatível com o detector empregado e, também possuir

polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos componentes da

amostra. Embora existam vários solventes, três deles são mais utilizados: água,

metanol e acetonitrila. As fases móveis polares têm tendência a dissolver oxigênio e

outros gases. Se esses gases são liberados dentro do equipamento, formam bolhas e

podem afetar o funcionamento do detector e a eficiência da coluna. Por esse motivo

é necessário remover os gases dissolvidos na fase móvel. Em muitos equipamentos,

o próprio reservatório está condicionado a efetuar a remoção, por exemplo, pela

aplicação de vácuo no reservatório e agitação da fase móvel sob ação de ultrassom

e/ou aquecimento. O problema da formação de bolhas tem sido reduzido pela

adição de um filtro na saída do detector, o que restringe um pouco a vazão e produz

uma pequena pressão na cela do detector, impedindo a formação de bolhas.

2. Bombas de alta pressão: O grande avanço na cromatografia em coluna foi o

desenvolvimento e a utilização de suportes com partículas diminutas responsáveis

pela alta eficiência, as quais tornam necessário o uso de bombas de alta pressão

para a eluição da fase móvel, devido a sua baixa permeabilidade. 

A bomba de alta pressão é o dispositivo que

bombeia e controla o fluxo e a pressão da fase

móvel (solvente). É composta de um ou mais

pistões acoplados a um sistema de válvulas e

fornece uma alta pressão. A bomba tem que

proporcionar uma vazão razoável através da

coluna, para que a análise não seja lenta, e uma

vazão constante, para não atrapalhar o sistema de

detecção. Podem ser considerados basicamente

dois tipos de bombas, as mecânicas e as

pneumáticas.

3. Válvulas para amostragem: Anteriormente, a introdução da amostra era efetuada

de forma similar à realizada na cromatografia gasosa, ou seja, mediante micro-

seringa que injeta a amostra dentro de uma pequena câmara, de onde é eluída pela

fase móvel.

Os equipamentos modernos empregam válvulas para amostragem, como a ilustrada

abaixo:

A amostra, introduzida na válvula mediante seringa, deve encher o espaço interno

da porção do tubo capilar de aço, a alça de amostragem (carga). Normalmente o

volume contido na alça é de 1 a 100 µL. A amostra é injetada na coluna, ao girar a

válvula para que a posição de entrada e saída mude (injeção na coluna). Desta

forma pode injetar-se na coluna pressurizada um intervalo amplo de volumes de

amostra, dependendo do tubo capilar (alça de amostragem) utilizado, com um alto

grau de reprodutibilidade. As válvulas para amostragem são fabricadas somente de

material inerte, como teflon e aço inoxidável, e seu desenho é tal que resistem a

pressões muito elevadas.

4. Coluna cromatográfica: É feita de um material inerte que resiste a todas as

pressões em que ela vai ser usada. A capacidade da coluna é determinada pelo

comprimento, diâmetro e pelo material de recheio. Geralmente, é utilizada também

uma pré-coluna, que é uma pequena coluna instalada a montante da coluna analítica

e tem como objetivo reter sólidos e, em muitos casos, reter materiais que por

reações químicas podem precipitar sobre a fase estacionária.

As colunas geralmente utilizadas são: octadecil (C18, RP18, ODS), octil (C8, RP8),

CN (cianopropil) e NH2 (amina). A fase estacionária mais utilizada é composta de

partículas microporosas de sílica. São permeáveis ao solvente e possuem uma área

superficial de várias centenas de metros por gramas.

5. Detectores: Uma instrumentação melhor é requerida para a CLAE, em relação à

sensibilidade dos detectores, para monitorização do efluente que sai da coluna.

Infelizmente as propriedades físicas ou físico-químicas da amostra e fase móvel

são, muitas vezes, similares. Algumas soluções para o problema de detecção têm

sido procuradas no desenvolvimento da CLAE: medidas diferenciadas de

propriedades gerais de ambas: amostras e fase móvel; medidas de uma propriedade

da amostra que não é apresentada pela fase móvel; e detecção após a eliminação da

fase móvel.

Uma variedade de detectores tem sido desenvolvida para CLAE, baseando-se em

uma destas soluções. Um detector ideal para a CLAE seria aquele com as seguintes

características:

Alta sensibilidade e baixo limite de detecção;

Resposta rápida a todos os solutos;

Insensibilidade a mudanças nas temperaturas e na vazão da fase móvel;

Resposta independente da fase móvel;

Pequena contribuição ao alargamento do pico pelo volume extra da cela do

detector;

Resposta que aumente linearmente com a quantidade do soluto;

Não destruição do soluto;

Segurança e conveniência de uso;

Informação qualitativa do pico desejado.

Infelizmente, não existe um detector que apresente todas estas propriedades, a

não ser que ele seja desenvolvido. A tabela abaixo resume algumas das

propriedades dos detectores:

Cromatografia Gasosa

Assim como a cromatografia líquida, a cromatografia gasosa é um método físico

de separação, no qual os componentes a serem separados são distribuídos entre duas

fases: a fase estacionária, e a fase móvel. Neste caso, a fase móvel é um gás inerte,

normalmente nitrogênio, hélio ou hidrogênio. A amostra é transportada por uma

corrente de gás através de uma coluna empacotada com um sólido recoberta com uma

película de um líquido.

Devido a sua simplicidade, sensibilidade e efetividade para separar os

componentes de misturas, a cromatografia de gás é uma das ferramentas mais

importantes em química. É amplamente usada para análises quantitativos e qualitativos

de espécies químicas e para a determinar constantes termoquímicas tais como calores de

solução e vaporização, pressão de vapor e coeficientes de atividade. A cromatografia de

gás é também usada para monitorar os processos industriais de forma automática:

analisam-se as correntes de gás periodicamente e realizam-se reações de forma manual

ou automática para compensar variações não desejadas. 

O método consiste primeiramente na introdução da mistura de prova ou amostra

em uma corrente de gás inerte, normalmente hidrogênio, hélio, nitrogênio ou argônio,

que atuarão como gás de arraste. As amostras líquidas vaporizam-se antes da injeção no

gás de arrastre. O fluxo de gás passa pela coluna empacotada através da qual os

componentes da amostra se deslocam a velocidades influenciadas pelo grau de interação

de cada componente com a fase estacionária não volátil. As substâncias que têm a maior

interação com a fase estacionária são retidas por mais tempo e, por tanto, separadas

daquelas de menor interação. À medida que as substâncias eluem da coluna, passam por

um detector, que gera um sinal elétrico proporcional à quantidade de material eluido. O

registro deste sinal em função do tempo é o cromatograma, sendo que as substâncias

aparecem nele como picos com área proporcional à sua massa, o que possibilita a

análise.

 Existem dois tipos de cromatografia de gás: cromatografia gás-sólido (CGS) e

cromatografia gás-líquido (CGL). A cromatografia gás-sólido se baseia na base sólida

estacionária, na qual a retenção das substâncias analisáveis é a consequência da

absorção física. A cromatografia gás-líquido é útil para separar íons ou moléculas

dissolvidas em um solvente. Se a solução de amostra estiver em contato com um

segundo sólido ou fase líquida, os diferentes solutos interagem com a outra fase em

diferentes graus, devido a diferenças de adsorção, intercâmbio de íons, partição, ou

tamanho. Estas diferenças permitem que os componentes da mistura se separem usando

estas diferenças para determinar o tempo de retenção dos solutos através da coluna.

Instrumentação

Os constituintes básicos de um sistema cromatográfico gasoso são bastante

semelhantes ao líquido:

1. Reservatório de Gás de Arraste

O gás de arraste fica contido em cilindros sob pressão. Assim, a escolha do gás

de arraste independe da amostra a ser separada. O parâmetro mais importante é a sua

compatibilidade com o detector (alguns detectores trabalham melhor quando se usam

determinados gases). Os gases mais empregados são H2, He e N2 e a vazão do gás de

arraste, que deve ser controlada, é constante durante a análise.

2. Sistema de Introdução de Amostra

Na CG, a seção do cromatógrafo gasoso onde é feita a introdução da amostra é o

injetor (ou vaporizador). Na versão mais simples, trata-se de um bloco de metal

conectado à coluna cromatográfica e à alimentação de gás de arraste. Este bloco contém

um orifício com um septo, geralmente de borracha de silicone, pelo qual amostras

líquidas ou gasosas podem ser injetadas com micro seringas hipodérmicas. Amostras

sólidas podem ser dissolvidas em um solvente adequado. O injetor deve estar aquecido a

uma temperatura acima do ponto de ebulição dos componentes da amostra, para que a

amostra se volatilize completa e instantaneamente e seja carregada para a coluna. Se a

temperatura for excessivamente alta, pode ocorrer decomposição da amostra. A amostra

deve entrar na coluna na forma de um segmento estreito, para evitar alargamento dos

picos.

3. Coluna Cromatográfica

Depois de injetada e vaporizada, a amostra é introduzida na coluna

cromatográfica, onde é efetuada a separação. Na CG a "afinidade" de um soluto pela

fase móvel é determinada pela volatilidade do soluto, sua pressão de vapor, que é

função da estrutura do composto e da temperatura. Alterando-se a temperatura, altera-se

também a pressão de vapor e, por conseguinte, a "afinidade" de uma substância pela

fase móvel.

4. Detector

Quantifica e indica o que sai da coluna. Os dois tipos mais utilizados são o

detector por ionização de chama (FID) e o detector fotométrico de chama (FPD).

Um detector de ionização de chama (FID ou DIC) consiste em

uma chama de hidrogênio (H2)/ar e um prato coletor. O efluente passa

da coluna do CG através da chama, a qual divide em moléculas

orgânicas e produz íons. Os íons são recolhidos em um eletrodo

negativo e produzem um sinal elétrico. O FID é extremamente

sensível com uma faixa dinâmica grande. Sua única desvantagem é

que destrói a amostra. Sua maior utilização é na detecção de

hidrocarbonetos. O FID oferece uma leitura rápida, precisa e contínua

da concentração total de HC para níveis tão baixos como ppb.

Já o detector fotométrico de chama (FPD)

permite medições sensíveis e seletivas de enxofre

volátil e compostos de fósforo. O princípio de detecção

é a formação de espécies de enxofre excitado (S2*) e

HOP* em uma chama. Um tubo fotomultiplicador

mede a emissão de quimiluminescência característica

dessas espécies. O filtro óptico pode ser trocado para

permitir ao fotomultiplicador visualizar luz de 394 nm (para a medição de enxofre) ou

526 nm (para fósforo). A resposta do detector ao fósforo é linear, ao passo que a

resposta ao enxofre depende da concentração. Normalmente utiliza-se (N2) como gás de

arrastre.

5. Eletrônica de tratamentos: Purifica os ruídos para melhor análise;

6. Registro de sinal: Analisa e avalia os dados obtidos no processo.

Eletroforese Capilar

Este método de separação pode ser definido como sendo a migração de espécies

carregadas eletricamente, que ocorre quando as mesmas são dissolvidas ou suspensas

em um eletrólito, através do qual uma corrente elétrica é aplicada.

Para uma separação eletroforética ocorrer, uma pequena quantidade de amostra é

injetada numa solução tampão aquosa contida em um tubo estreito ou em um suporte

poroso e plano, como papel ou gel semissólido. Aplica-se então, um alto potencial de

corrente contínua ao longo do comprimento do tampão através de um par de eletrodos

localizados nas extremidades. A aplicação desse potencial faz com que os íons da

amostra migrem em direção a um ou a outro eletrodo. As separações são baseadas nas

diferenças das relações carga/tamanho dos analitos da amostra. Se um potencial alto for

aplicado através de um tubo capilar contendo solução tampão, ocorre um fluxo eletro

osmótico, onde o solvente migra em direção ao cátodo ou ao ânodo.

O princípio da separação em eletroforese se baseia na diferença nas velocidades

de migração de compostos diferentes quando aplicado uma ddp entre as extremidades

do capilar.

v=μe × E onde: µe = mobilidade eletroforética

E = força do campo elétrico

Altos potenciais levam a uma velocidade de migração elevada, isto é uma

separação rápida.

A eletroforese capilar (EC) é uma técnica aplicável na determinação de uma

grande variedade de amostras. Uma característica que difere a EC das outras técnicas é

a sua capacidade única para separar macromoléculas carregadas eletricamente de

interesse tanto em indústrias de biotecnologia quanto em pesquisas biológicas.

Na eletroforese capilar é possível empregar diversos modos de separação, cada

qual com seu mecanismo e seletividade característicos. A seguir são apresentadas, de

forma simplificada, as características de cada tipo de separação.

1) Eletroforese capilar de zona (CZE)

A eletroforese de zona em solução livre é a técnica mais utilizada e tem esta

denominação devido ao fato de que o capilar e os reservatórios contendo os eletrodos

são cheios com um tampão (denominado eletrólito carreador), o qual conduz a corrente

elétrica e fornece a capacidade tamponante. A amostra, contendo uma mistura iônica, é

introduzida no capilar como uma banda de pequena espessura. Sob a influência do

campo elétrico, as espécies iônicas da amostra e do tampão migram para o eletrodo

correspondente, isto é, cátions em direção ao catodo e ânions em direção ao anodo,

como é mostrado na figura abaixo:

2) Cromatografia eletrocinética micelar (MEKC)

Na eletroforese de zona em solução livre não é possível à separação de

diferentes compostos neutros, pois estes migram na mesma velocidade, já que não estão

sob a influência do campo elétrico. Desta forma, para separá-los é necessário utilizar

outra técnica de separação, como por exemplo, a cromatografia eletrocinética. Neste

tipo de eletroforese, a separação do soluto é dependente da distribuição entre as fases

aquosa e micelar, como representado abaixo:

3) Isotacoforese Capilar (CITP)

Na isotacoforese, a amostra é introduzida na interface de um sistema tampão,

consistindo de um eletrólito líder e um eletrólito terminal. Para efetuar a separação,

utilizam-se as diferenças nas mobilidades eletroforéticas de cátions e ânions, em relação

aos íons dos eletrólitos líder e terminal.

Na separação de uma amostra de cátions, por exemplo, o eletrólito líder deve

possuir cátions cuja mobilidade seja maior que a dos íons a serem separados e o

eletrólito terminal deve possuir cátions com mobilidades inferiores aos cátions da

amostra. Desta forma, estabelecem-se zonas de amostras, entre os dois tipos de

eletrólitos, que vão sendo continuamente separadas, até que cada zona contenha um

único tipo de íon. Todas as zonas migram, na mesma velocidade do íon do eletrólito

líder, em direção ao eletrodo correspondente.

4) Focalização Isoelétrica Capilar (CIEF)

Na focalização isoelétrica, os analitos são separados de acordo com seus pontos

isoelétricos (pI) isto é, o valor do pH no qual o anfólito tem carga residual nula. No pI

não ocorre migração sob a ação de um campo elétrico. A amostra é misturada com uma

série de reagentes, denominados anfólitos carreadores, que possuem boa capacidade

tamponante em seus valores individuais de pI. Um gradiente de pH é obtido quando se

aplica o campo elétrico, fazendo com que ocorra uma movimentação do soluto, de

acordo com o valor do pH. Desta forma, em valores de pH mais baixos que o pI dos

analitos, estes migram para o catodo, pois estão positivamente carregados. Em pH mais

alto, eles migram para o anodo, pois estão carregados negativamente. Este tipo de

eletroforese é utilizado, quase exclusivamente, para a separação de espécies anfóteras,

como proteínas e polipeptídios.

5) Eletroforese Capilar em Gel (CGE)

Este tipo de eletroforese é utilizado quando a razão carga/raio dos analitos é tão

próxima, que não é possível separá-los com o uso da eletroforese de zona tradicional.

A separação é realizada com base na diferença entre o tamanho das moléculas

dos analitos; sendo assim, a maior ou menor facilidade com que os analitos de diversos

tamanhos migram através da matriz de gel é que produz a separação, como mostra a

figura abaixo:

6) Eletrocromatografia Capilar (CEC)

A eletrocromatografia capilar é uma técnica de separação que mistura

características da eletroforese capilar e de HPLC. Este tipo de eletroforese emprega

como fase estacionária micro partículas de sílica fundida, usualmente contendo um

ligante hidrofóbico que retém os solutos. Da mesma forma que em HPLC, na CEC

existe uma fase móvel que é, normalmente, uma mistura de tampões aquosos. A

superfície de sílica possui uma alta densidade de grupos silanóis ionizados, gerando,

desta forma, um elevado fluxo eletroosmótico quando a voltagem é aplicada. O

mecanismo de separação é dependente da natureza da amostra.

Instrumentação

Geralmente o funcionamento de um equipamento de eletroforese capilar (EC)

envolve a aplicação de alta voltagem, tipicamente 5 a 30 kV em um capilar de diâmetro

reduzido gerando correntes na faixa de 10 a 100 mA. O uso do capilar apresenta várias

vantagens, particularmente com respeito ao aquecimento Joule.

A alta resistência elétrica deste permite a aplicação de campos elétricos altos

pois gera um aquecimento mínimo, além disso o formato de capilar propicia uma

dissipação eficiente do calor gerado. O uso de campos elétricos altos resulta em tempo

de análise curto, alta eficiência e resolução.

Na eletroforese capilar, o capilar é preenchido com uma solução tampão e suas

extremidades são mergulhadas em recipientes que a contém e onde é aplicado um

campo elétrico, que gera uma corrente no interior do capilar. Os eletrodos são feitos de

um material inerte, tal como, platina, e são também mergulhados na solução para fechar

o circuito. O capilar passa através de um detector, usualmente um detector

espectrofotométrico de absorção no UV/Vis.

Uma pequena quantidade de amostra é introduzida em uma das extremidades do

capilar. A aplicação do campo elétrico provoca o movimento dos analitos em direção

aos eletrodos. As separações em EC são baseadas na presença de um fluxo

eletricamente induzido, denominado fluxo eletroosmótico (FEO), um fenômeno

eletroforético que gera o fluxo da solução dentro do capilar, que faz com que os solutos

se movimentem em direção ao detector. Este fluxo pode reduzir significativamente o

tempo de análise ou forçar um íon a reverter a sua tendência de migração em direção a

um eletrodo, pelo qual está sendo atraído, devido ao sinal de sua carga.

O gráfico, gerado pelo detector, tempo em função de resposta do detector é

denominado eletroferograma:

Capilares

Os capilares podem ser de vidro (para l > 280 nm), teflon (flexível, transparente

no UV, porém não pode ser usado com alta voltagem), ou sílica fundida, normalmente

recoberta externamente com uma camada de proteção de poliamida, que produz uma

melhora na resistência mecânica, uma vez que é extremamente frágil e se quebra com

facilidade. Uma pequena porção deste recobrimento é removida a fim de se formar uma

janela para a detecção. A janela é então alinhada ao centro óptico do detector.

Os capilares são, tipicamente, de 25 a 100 cm de comprimento com 15 a 100 µm

de diâmetro interno. Nos instrumentos disponíveis comercialmente, os capilares são

mantidos dentro de um dispositivo, denominado cassete, que facilita a inserção no

instrumento e protege a janela delicada de detecção. A superfície interna do capilar pode

ser quimicamente modificada por meio de ligação covalente com diferentes substâncias.

Estes recobrimentos são utilizados para uma grande variedade de propósitos, tais como,

reduzir a adsorção da amostra ou mudar a carga iônica da parede do capilar.

O controle de temperatura ao redor do capilar é muito importante para assegurar

separações reprodutíveis. O controle é feito geralmente por ar ou líquido refrigerante, os

quais são forçados a passar através do cassete, onde se encontra o capilar.

Introdução da Amostra

Na EC, diferentemente das técnicas cromatográficas (Cromatografia Gasosa -

CG e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência - CLAE), a amostra não é injetada e sim

introduzida no capilar pelo lado mais distante do detector.

O modo de injeção mais empregado em EC é o denominado hidrodinâmico,

onde o capilar é mergulhado em um frasco contendo a amostra o qual é em seguida

pressurizado, submetido ao vácuo ou erguido (efeito sifão) provocando a entrada de um

certo volume de amostra no capilar. Uma outra alternativa é obtida através da inserção

do capilar e do eletrodo no frasco da amostra seguida da aplicação de uma voltagem,

sendo que solutos neutros são arrastados pelo FEO, ao passo que solutos carregados irão

migrar para dentro do capilar, por causa do FEO e também da migração eletroforética.

Este tipo de injeção é denominado de injeção eletrocinética. A figura abaixo mostra os

esquemas para introdução de amostras:

Detectores

O detector mais frequentemente utilizado em EC é o espectrofotométrico de

absorção no UV/Vis devido à sua natureza quase universal, ou seja, pode ser aplicado

na detecção de várias classes de substâncias. A maioria dos instrumentos tem também

detectores com arranjo de diodos disponíveis, o qual fornece um espectro de UV/Vis

para cada substância detectada.

Alguns detectores alternativos são os de fluorescência, de fluorescência indireta,

de fluorescência induzida por laser, o espectrômetro de massa, o amperométrico e o de

condutividade. O acoplamento de EC com espectrômetro de massas é usualmente

empregado para dar informações estruturais dos analitos.

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http://hiq.linde-gas.com.br/international/w

eb/lg/br/like35lgspgbr.nsf/docbyalias/anal_gaschrom. Acessado em 26 de julho de

2014).

8) Teoria Geral sobre Eletroforese Capilar. PUC – Rio. (Disponível em:

http://www2.dbd.puc-rio.br/pergamum/tesesabertas/0212144_06_cap_02.pdf.

Acessado em: 26 de julho de 2014).

9) Eletroforese Capilar. SOUSA, R. UFJF. (Disponível em: http://www.ufjf.br/bacca

n/files/2010/10/Aula-11-Eletroforese-Capilar-Modo-de-Compatibilidade.pdf.

Acessado em: 26 de julho de 2014).

10) Eletroforese Capilar. QUEIROZ, S. C. N., JARDIM, I. C. S. F. UNICAMP.

(Disponível em: http://chemkeys.com/br/wp-content/themes/chemkeysbr/articleI.p

hp?u=ZWxldHJvZm9yZXNlLWNhcGlsYXI=. Acessado em: 26 de julho de 2014).