MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA MÉTODOS DE ESTUDOS EM BIOLOGIA CELULARCELULAR

I - MICROSCOPIAS

MMIICCRROOSSCCOOPPIIAASS

Início (1600):- Incorporação do microscópio aos estudos

anatômicos;- Desenvolvimento de técnicas de preparo para a

visualização dos materiais biológicos

1663Robert Hooke

185217501689Marcello Malpighi

Marcello Malpighi(1628-1694)

(1689)

“ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena,interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso

a nenhum médico”

Médicos: Rejeitaram microscopia – inútil

Descrições sobre os capilares eram falsas

Anatomia comparada era irrelevante para medicina

Anatomia humana → só era útil para descrição

Introdução da microscopia à medicina

Estudo de capilares

Fundamento: Sistema de lentes combinadas, que são colocadas de forma a ampliarem a imagem do objeto

Interação da luz com o espécime

Absorção

Refração dos

raios de luz

ou

Criar contrastes entre o objeto e o meio em que envolve

Na formação da imagem aos Microscópios, dois fenômenos devem ser considerados: a

absorção e a refração

Interação da luz com o espécime

Microscópio

produção de imagens aumentadas de objetos não

visualizados à olho nú

Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia

1) De luz (ML) / óptico (comum) Modificado (variações) com propósitos especiais

Contraste de fase Invertido Polarização

Fluorescência2) Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons Microscópio eletrônico de transmissão (MET) Microscópio eletrônico de varredura (MEV)

Fonte luminosa → luz branca(lâmpada com filamento de

tungstênio)

Óptica → lentesampliação condensação

Mecânica

Sistema de iluminação

Microscópio de luz comum / campo claro

Componentes:

Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho

Princípios da formação da imagem ao Microscópio

Fonte de luz condensadora

objetivaocular

objetoImagem

I

Imagem II

F F FC C C

O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida

Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular

Trajeto da luz

Centralização do feixe de luz

“Iluminação de Köhler”

Iluminação perfeita

Menos ocorrência de aberrações e

irregularidades no trajeto luminoso

Objetiva (s) = próxima ao objeto Corrige aberrações = qualidade da imagem Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática, planapocromática

Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão)

Projeta imagem real e invertida

Ocular (es) = imagem projetada pela objetiva Aumentos: 10x, 12x

Aumento final

4x = Vermelha10x = Amarela40x = Azul claro100x = Preta / branca

Objetiva

A = Ângulo de abertura da objetiva = Ângulo correspondente à metade de AAN = Abertura numéricaN = Índice de refração do meio de montagemsen = Fornecido pelo fabricante da lente

AN = 0,12 (4x)AN = 0,34 (10x)AN = 0,60 (40x)AN = acima de 1 (100x)

AN = n.senα

Abertura numérico

Bom microscópio:

1) Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do próprio microscópio) em formar imagens com

detalhes mínimos”

2) Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto, que poderão ser

individualizados na imagem final”

> > PR < LRPR < LR

Poder de Resolução X Limite de Resolução

ou

Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2 pontos distintos do

objeto (< LR) maior será a definição da imagem formada no aparelho ( >

PR)

Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio

Planos de cortes

Imagem microscópio = bidimensional Objeto de estudo = tridimensional

Planos de cortes

Leia a etiqueta da lâmina material / corte / coloração

Examine a lâmina macroscopicamente pode-se obter muita informação

Objetiva de menor aumento (panorâmica)

Ajustar área a ser observada, centralizando-a na platina

Iluminação de Köehler

Objetivas de aumentos maiores

Sequência de passos

Observação: imagem → invertida

Microscopia de LuzMicroscopia convencionalMicroscopia de contraste de faseMicroscopia de contraste interferencialMicroscopia de campo escuroMicroscopia de polarizaçãoMicroscopia de fluorescênciaMicroscopia confocal a laser

Microscopia eletrônicaMicroscopia eletrônica de transmissãoMicroscopia eletrônica de alta voltagemMicroscopia eletrônica de varredura

Outros tipos de microscópioMicroscopia de tunelamento quânticoMicroscopia de força atômicaMicroespectrofotometria

Tipos de Microscópios

Princípios da Difração da LuzAnéis metálicos colocados no caminho da luz (Zerniké, 1950)Objetivas de contraste de fase: Ph (Phase)

Retardo ópticoe

Refração da luz

Microscopia de Contraste de fase

Microscopia de Contraste de fase

Análise do material biológico sem coloração prévia:

1.Culturas de células2. Exames parasitológicos3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios)4. Sangue5. Protozoários de ambientes aquáticos6.Algas 7. Bactérias

Diferenças de índices de refração

Sem coloração

BactériasCultura de células: neurônios

Aplicações da Microscopia de Contraste de fase

Esfregaço de Sangue Divisão Celular em Raiz de Cebola

Aplicações da Microscopia de Contraste de fase

Análise do material com coloração prévia

Prismas ópticos posicionados no caminho da luz

Microscopia de Contraste Interferencial

Os prismas modificam a fase da onda luminosa

Contraste com o meio em que se encontra o material

Microscopia de Contraste Interferencial

Defasagem dos comprimentos de onda

Microscopia de Normarski

Microscopia de Contraste Interferencial

Gera uma “deformação” na imagemPermite contraste interferencial

Aumentando o relevo das superfícies do material

analisado

Observação de materiais biológicos sem coloração: 1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices parasitos (taxonomia) 2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de material biológico 3. Monitoramento de culturas celulares

Algas

Escamas

Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial

Cultura Celular: macrófago Ácaro

Aplicações da Microscopia de Contraste Interferencial

Princípios da formação da imagem ao Microscópio

Com coloração fluorescente

Sem coloração

Com coloração

Diferenças de índices

de refração

Cores de interferênci

a

Campo escuro

2 Filtros / Prismas:1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o condensador

2º Analisador → Entre a objetiva e a ocular

Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das ondas luminosas Plano da luz polarizada

(PLP) Observação: Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de vibração em todos os planos

Microscopia de Polarização

2º

1º

Microscopia de Polarização

1º

2º

PLP

Microscopia de Polarização

Anisotropias Ópticas

Fenômenos de ordem espectral

Dicroísmo(1 filtro

polarizador)

Birrefringência(2 filtros polarizadores

cruzados perpendiculares)

Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e rotacionados a 90o permitem a distinção de macromoléculas ditas anisotrópicas (birrefingentes ou dicróicas)

Microscopia de Polarização

Birrefringência ocorre

Componentes macromoleculares birrefringentes

Anisotrópicos (brilho colorido ou não)

Cruzamos perpendicularmente os 2

filtros (polarizador e analisador)

Realçados

Outros componentes

Isotrópicos (não refrigentes) Indistintos em fundo escuro

1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina2. Análise de células que apresentem organização interna de suas macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética, espermatozóides (ordem molecular)3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente4. Análise de componentes cristalinos dos minerais

5. Outros: parede celular; amido.

Aplicações da Microscopia de Polarização

Tecido ósseo

Grãos de Amido

Aplicações da Microscopia de Polarização

Birrefringência pode ser

intensificada por corantes

Exemplos: Colágeno

- Xylidine Ponceau- Picro-sirius

Cromatina / Matriz Extracelular- Azul de toluidina

(ordem e agregação molecular )

Tecido ósseo: osso esponjoso / fibras colágenas

Tecido ósseo : sistema de Havers ou ósteon / fibras

colágenas

Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada

Aplicações da Microscopia de Polarização

Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius (fibras de colágeno: intensa birrefringência / brilhante /

amarelo)

Microscopia de Luz Polarizada

Birrefringência dependendo do grau de agregação de cristalinidade

Medida das propriedades anisotrópicas (dicroísmo e birrefringência)

Diagnósticos patológicos

Material biológicos

Estabelecimento ordem molecular

Fases da vida celular

Os microscópios de campo escuro apresentam um tipo especial de condensador - inclina a luz de tal modo que ela não atravessa o objeto

A luz se dispersa

Apenas os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema (objetivas e oculares)

Microscopia de Campo Escuro

É empregada para estudos de pequenos materiais: Plâncton Bactérias Cristais Estruturas subcelular (fimbrias e flagelos) Grãos de pólen

Microscopia de campo escuro da bactéria

Leptospira spp

Aplicações da Microscopia de Campo Escuro

Propriedade física de algumas substâncias absorverem a luz em

um determinado comprimento de

onda e emitirem luz com comprimentos de onda maiores e níveis energéticos

mais baixos

Microscopia de Fluorescência

Microscopia de fluorescência mostrando uma célula embrionária de Caenorhabditis elegans em divisão

Fluorescência natural:Existem componentes celulares ou moleculares

naturalmente fluorescentes

ClorofilaLignina de parede

vegetalElastina

Colágeno

A fluorescência visível neste nudibranqueo é dupla: os pigmentos verdes próprios da lesma e as algas

vermelhas no seu intestino Algas (clorofila)

Outros componentes:Se ligam a substâncias fluorescentes → fluorocromos

→ emitem brilho contra fundo escuro

Alaranjado de acridina

(fluorocromo)

Células do testículo de triatomíneos

(barbeiro)Divisão celular

RNA - vermelho

DNA - verde

1. Sistema óptico interage com pouca luz:

Luz de mercúrio de alta pressão2. Sistemas de filtros para detectar o brilho do material contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem)Fonte de luz → Fótons → Filtro de excitação (seleciona os fótons de determinado comprimento) → Objeto → Emite luz fluorescente → Filtro de barragem (luz de excitação é bloqueada) → Imagem observada (formada pela luz que atravessa o filtro de barragem)

b. Filtro de barragemOcular

a. Filtro de excitação

Fonte de luz

Objetiva

Microscopia de Fluorescência

Microscopia de Fluorescência

Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) → muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência

Fluorocromos:Alaranjado de acridina

EosinaDAPI

RodaminaFluoresceina

Emitem brilho contrafundo escuro

Aplicações da Microscopia de Fluorescência

Outras aplicações da Microscopia de Fluorescência

Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica

Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos que permite identificação de moléculas específicas

Imunocitoquímica

Hibridação “in situ” (FISH)

Aplicações da Microscopia de Fluorescência

1987 - Disponível mundialmente

O microscópio confocal tem seu funcionamento baseado nos princípios da microscopia de fluorescência → Utiliza laser como fonte de luz

Permite a visualização: materiais espessos; corpos inteiros sem coloração prévia (vivos ou pré-fixados)

Reconstrução do objeto tridimensionalmente → Vários planos focais ou cortes ópticos (programas computacionais)

Microscopia confocal a laser

Aplicações da Microscopia confocal a laser1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de fluorescência convencional

2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos

3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares. Exs: microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos finos da matriz extracelular

Células em apoptose: condrócitos

Células em prófase

Aplicações da Microscopia confocal a laser

Protozoário

Macrófago

Aplicações da Microscopia confocal a laser

Grãos de Pólen

Divisão celular / Fuso mitótico

Aplicações da Microscopia confocal a laser

Início: Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons

Semelhantes a fótons num

sistema de vácuoPrimeiros experimentos: Década de 1920 → Busch (elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas)

1931 → Ruska → Primeiro M.E. → Poder de resolução: 0,5 nm → 25 mil vezes a capacidade do olho humano

Microscopia eletrônica

Ernst August Friedrich Ruska

(1906-1988)

Principais diferenças

Fonte Luz (porção inferior)

Elétrons (porção superior)

Lentes Vidro EletromagnéticasLentes de aumento (principal)

Objetivas e oculares Eletromagnéticas

Suporte para amostra

Lâmina de vidro Grade de metal (telinha)Cobre ou

níquelLimite de resolução

0,2 µ 0,0002 µ

Formação da imagem

Transparência e coloração Variações de densidade e contrastação

Microscópio eletrônicode transmissão (MET)

Microscópio de luz (ML)

Microscopia de Luz e Microscopia Eletrônica

Questões importantes: Ampliação e Resolução

Microscopia eletrônica

O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de que os elétrons tinham comportamento

ondulatório semelhante aos fótons de luz

Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET)

Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV)

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) e de Varredura (MEV)

Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

Microscópio eletrônico

de transmissão (MET)

Microscópio eletrônicode varredura(MEV)

Formação da imagem ao Microscópio eletrônico:Fonte de elétrons → Caminha por um sistema de lentes eletromagnéticas (coluna) → Feixe de elétrons → Acelerados → Lente condensadora → Amostra → Lentes objetivas (primeira imagem aumentada da amostra) → Lentes intermediarias / projetivas (formação final da imagem) → Imagem ampliada → Anteparo fluorescente / monitor

Fixação

Desidratação

Inclusão

Cortes

Contrastação commetais pesados

Principais etapas da preparação das amostras para MET

Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro etc Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como: hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio etcObservação:

Contrastação do material biológico (maioria eletrolúcidos): metais pesados

Imagem final ao MET

Coloração negativa: vírus Tecido muscular

Hepátócito: Complexo de

Golgi

CílioCélulas epiteliais

Microscopia Eletrônica de Transmissão

Revela feições topográficas da superfície (detalhes) Imagens tridimensionais:

- Vermes- Insetos- Células livres (animais/vegetais)- Embriões- Fragmentos geológicos

Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Scanning Electron Microscopy (SEM)

Guelras de um peixe

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Preparação das amostras

Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio)

Desidratação

Secagem (“ponto crítico”)

Evaporação com ouro na superfície a ser analisada

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Title: “An Army of One" Category: Photo Microscopy Photographer: Freder Medina

Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

Descrição de estruturas subcelulares (µ)Ex.: Citoesqueleto

Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares- Alta aceleração eletrônica (500 a 1.000 KV)- Permite estudos de corte grossos- Reconstrução tridimensional

Microscopia Eletrônica de Alata Voltagem ou Alta Aceleração

Década de 1980 Potência visual do olho humano: 1 milhão de vezes (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física Corpos: - Características ondulatórias - Emissão de energia

Microscopia de Tunelamento Quântico

Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å Percorre a superfície da amostra → corrente elétrica (tunelamento) Corrente atrai elétrons do material para a agulha → “tunel” Agulha sobre um átomo → corrente ↑ Agulha sobre os espaços entre os átomos → corrente ↓ Esses sinais (↑ e ↓) são transmitidos para o computador → imagens ≈ à superfície de vales e montanhas

Microscopia de Tunelamento Quântico

1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET) =

ESTURUTRA ATÔMICA

Molécula de miosina Cromossomos

Microscopia de Tunelamento Quântico

É semelhante ao Microscópio de Tunelamento QuânticoDiferença: - Microespelho - Feixe de “laser” sobre a agulha Menor agressividade à amostra Detecção de detalhes de superfície

Aplicações: - Imagens em solução - Sequências de reações químicas / modificações ao longo do tempo - Estrutura atômica de biomoléculas

Microscopia de Força Atômica

Microscopia de Força Atômica

Imagem de uma plaqueta obtida por microscopia de força

atómica

Imagem de eritrócitos obtida por microscopia de força

atómica

Brasileiro ganha prêmio internacional para imagens de microscopia de força atômica

Luciano Paulino da Silva, pesquisador da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, conquistou o segundo lugar na primeira edição do Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de Força Atômica.

A imagem de autoria do pesquisador da Embrapa, que mostra a superfície das células vermelhas do sangue depois do tratamento com peptídeos antibióticos, foi a única imagem não européia premiada dentre as mais de 250 inscritas. O prêmio visa o reconhecimento da importância das imagens de microscopia para os avanços da nanotecnologia em todo o mundo.

Reportagem publicada no dia 10/09/2007

Title: “Formosa Nano-Rose" Photographer: Dr. Kuei-Hsien ChenVencedor do “Science as Art Contest” de 2008

Scanning electron Microscopy – imagem representa um único cristal de Wurtzite indium nitride (InN) sintetizado

Fim