metodologia de detecção de ovos de helmintos em alface e
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Metodologia de Detecção de Ovos de Helmintos em Alface e Rúcula
(Parte 2)
Coordenação:
Regina Maura Bueno Franco (Unicamp/SP)
Colaboradores:
Regina Célia Stancari (IAL/Bauru)
Flaviane Cristina Lopes Matosinhos (FUNED/MG)
Mini-Curso Teórico e Prático: Detecção de Ovos de Helmintos em Hortaliças
Porque há a necessidade de examinar hortaliças para a presença de ovos de helmintos?
BRASIL – DE 2008 A 2013:
195.516
106.615
74.312
0
50.000
100.000
150.000
200.000
250.000
Ascarislumbricoides
Ancylostoma sp. Trichuristrichiura
Nº de Casos
Porque há a necessidade de examinar hortaliças para a presença de ovos de helmintos?
BRASIL –Período de 2005 a 2014:
Média de 330 óbitos pelos principais helmintos,
sendo Ascaris lumbricoides responsável por 57,4% desses óbitos!
Fonte: Sistema de Informação de Mortalidade/MS.
Metodologia de Detecção de Ovos de Helmintos em Hortaliças
Passo 1: Pesagem dos vegetais no laboratório – amostras de 30g
2.Colocar em um recipiente limpo e seco, sem que as folhas fiquem sobrepostas.
1. Pesar 30 g de alface
Passo 2: Extração e concentração das formas parasitárias
3. as folhas já colocadas em saco plástico limpo e sem uso prévio, adicionando-se às folhas do vegetal 200 mL da solução de glicina 1M, pH5.5 e d= 1,025.
Alface
4. Fechar bem o saco plástico.
Passo 2: Extração e concentração das formas parasitárias
5. Proceder à agitação manual por 3 min. (folhas dentro do saco plástico com glicina 1 M)
Alface + solução de glicina 1M
Passo 2: Extração e concentração das formas parasitárias
6. Após a agitação, as folhas das verduras serão retiradas do saco plástico com
auxilio de uma pinça grande. Ainda dentro do saco, segurando folha por folha com a pinça, sacuda-a levemente para que a solução de lavagem (que é a AMOSTRA de interesse) permaneça no saco plástico.
7. Após retirar todas as folhas de dentro do saco plástico, o liquido restante no saco plástico (“amostra’) será peneirado em peneira plástica e recolhido em cálice de sedimentação.
8. Deixar em repouso durante 2 horas (etapa de Sedimentação).
09. Após 2h, com auxilio de uma pipeta Pasteur, retire cuidadosamente o sobrenadante, deixando um sedimento de cerca de 10 mL que será transferido para um tubo de centrifugação de 15 mL.
10 mL
10 mL
10. “Lavar” o cálice de sedimentação com 5 ml de água destilada. Esses 5mL de H20d serão adicionado aos 10 mL já presentes no tubo de centrifugação, completando 15 mL.
5 mL
15 mL
11. Centrifugar a 1.120 x g por 5 minutos. Obs: se a centrifuga for em rpm, você precisará
fazer a conversão de g para rpm, para saber o quanto 1120xg, corresponde em rpm. Isso deve ser feito para cada maquina pois depende do tamanho do eixo do rotor.
10 µL
12. Retire o tubo da centrífuga com cuidado. Descarte o sobrenadante cuidadosamente. Homogenize o liquido que restou no fundo do tubo, com pipeta Pasteur de vidro. Faça laminas deste sedimento para contagem dos ovos recuperados.
13. Todo o sedimento que restou no fundo do tubo de centrifugação , após o término do processamento da amostra, deverá ser examinado. Ou seja, deve-se examinar quantas alíquotas forem necessárias até que se esgote todo o volume do sedimento obtido após a centrifugação. Para facilitar a visualização dos ovos, pode-se adicionar um gotinha de Lugol à aliquota a ser examinada.
Obs: Se preparar todas as lâminas de uma só vez, mantenha-as em camara úmida para evitar o ressecamento. É melhor preparar uma, examinar e preparar outra, examinar...
X µL
14. Examinar com aumento de 40x, caso haja dificuldade de visualizar os ovos de Ascaris sp. nas lâminas. Anote o número de ovos recuperados e visualizados em cada lamina examinada. A soma desses números dará o numero total de ovos recuperados por amostra (30 g de folhas de alface/rucula).
Ovo de Ascaris suum retirado dos útero da fêmea.
Exemplo: se você precisou de 3 lâminas para examinar todo o sedimento, e em cada lâmina encontrou:
-Lâmina 1 (alíquota examinada 10 µl): 20 ovos
-Lâmina 2 (alíquota examinada 10 µl): 30 ovos
-Lâmina 3 (alíquota examinada 10 µl): 25 ovos.
-O número total de ovos recuperados dessa amostra foi de 75 ovos.
Protocolo proposto para a detecção de ovos de helmintos em alface e/ou rúcula.
Análise microscópica
10 mL + 5 mL de água 1120 x g 5
min.
2 horas
Alface – 30g Glicina 1M (200 mL) 3 minutos
Lembretes!
1. É preferivel usar material de vidro pois os ovos aderem em material plástico. Quando necessário utilizar plástico seria aconselhável enxaguar previamente com solução de Tween 80 a 0,01% para impedir a adesão dos ovos. Enxague, deixe secar e só então use a vidraria no experimento.
2. Juntamente com o Eppendorf, usar ponteiras já enxaguadas com solução de Tween nos ensaios.