mentha pulegium l.: desenvolvimento e caracterização de...
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MESTRADO
CONTROLO DE QUALIDADE
Mentha pulegium L.: Desenvolvimento e
caracterização de uma formulação lipídica para
modulação da atividade cerebral
Rafael Santos Vilamarim
M
2017
Mentha pulegium L.: Desenvolvimento e caracterização de uma
formulação lipídica para modulação da atividade cerebral
Dissertação do 2º Ciclo de Estudos Conducente ao Grau de
Mestre em Controlo de Qualidade
Especialidade Fármacos e Plantas Medicinais
Rafael Santos Vilamarim
___________________________________
Trabalho realizado sob supervisão da Prof. Doutora Paula Cristina
Branquinho de Andrade e co-supervisão da Prof. Doutora Patrícia Carla
Ribeiro Valentão
Porto, Julho 2017
III
Eu, Rafael Santos Vilamarim, estudante do Mestrado em Controlo de Qualidade
da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, com o número 201507109,
assumo a responsabilidade pela originalidade desta dissertação.
É autorizada a reprodução integral desta dissertação/tese apenas para efeitos
de investigação, mediante a declaração escrita do interessado, que a tal se
compromete.
_________________________________
IV
“Tudo o que um sonho precisa para ser realizado é alguém que acredite que ele
possa ser realizado.”
Roberto Shinyashiki
V
Agradecimentos
A realização deste trabalho foi possível devido ao incentivo, cooperação e apoio de
diversas pessoas, que de alguma forma me ajudaram para que todos os meus objetivos
fossem concretizados, às quais eu gostaria de agradecer.
Em primeiro lugar agradeço à minha orientadora, a Professora Doutora Paula
Andrade, responsável pelo Laboratório de Farmacognosia do Departamento de Ciências
Químicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto, com um grande obrigado
pela forma que fui recebido, pela sua orientação, pela constante disponibilidade e tempo
dispensado, pela aprendizagem transmitida e por me ter concedido a oportunidade de
realizar este trabalho.
À minha co-orientadora, a Professora Doutora Patrícia Valentão do Laboratório de
Farmacognosia do Departamento de Ciências Químicas da Faculdade de Farmácia da
Universidade do Porto, pelo tempo dispensado, pela disponibilidade, pelo auxílio, por toda
a paciência, pelos ensinamentos transmitidos e palavras de incentivo durante todo o
trabalho.
Ao Professor Doutor Romeu Videira, Investigador Auxiliar do Laboratório de
Farmacognosia do Departamento de Ciências Químicas da Faculdade de Farmácia da
Universidade do Porto pela disponibilidade, pelo tempo dispensado, pela ajuda prestada,
pelos ensinamentos transmitidos durante a realização da parte experimental e escrita desta
dissertação.
Ao Mestre João Bernardo, estudante de Doutoramento do Laboratório de
Farmacognosia do Departamento de Ciências Químicas da Faculdade de Farmácia da
Universidade do Porto, pela ajuda constante, pelo encaminhamento, pela paciência em
ouvir sempre as minhas dúvidas e também pelos momentos de grandes risadas, um grande
obrigado do “Rúben”.
À Professora Doutora Beatriz Oliveira do Laboratório de Bromatologia e Hidrologia
do Departamento de Ciências Químicas da Faculdade de Farmácia da Universidade do
Porto, diretora de curso do Mestrado, por toda a ajuda, pela simpatia, pelo aconselhamento
e pela sua disponibilidade.
Aos colegas de laboratório que, sem excepção, me ajudaram, incentivaram e
ensinaram; além de contribuírem para a minha formação mostraram ser grandes amigos,
proporcionando-me bons momentos.
À Cátia, à Vera e à Sílvia, por todos os momentos passados, pela diversão, pela
motivação e pela coragem durante os dois anos de Mestrado.
VI
À Matos pela ajuda, incentivo e compreensão, fundamental para a realização desta
etapa, demonstrando que existem amigos independentemente da ocasião.
À Ana João, amiga de longa data, por estar sempre presente em todos os momentos
e como tal também se encontrou presente neste longo caminho importante da minha vida.
À Sandra, sempre presente nesta etapa, por todos os momentos passados, pelo
carinho, pelas palavras de incentivo e por acreditar sempre nas minhas capacidades, um
grande obrigado.
Aos meus amigos, de infância e da vida académica, que estão sempre presentes,
que dão força constantemente e permitem que alcance os meus objetivos.
Aos meus pais por todo o apoio, carinho, pelas palavras de incentivo, pelo esforço,
pela paciência, por acreditarem nas minhas capacidades e por toda a ajuda e conselhos
que deram para superar os obstáculos e concluir esta etapa, e próximas que virão,
tratando-se de um exemplo a seguir sempre no decorrer da minha vida.
Ao meu irmão e à minha cunhada pela preocupação, carinho e incentivo constante
para que eu alcance os meus objetivos e aos meus sobrinhos, Naroa e Luka, pela felicidade
que me transmitem.
A todos aqueles que me acompanharam nesta etapa da minha vida, e continuarão a
acompanhar em muitas outras etapas, proporcionando-me momentos únicos, um muito
obrigado!
VII
Índice geral
Agradecimentos ..................................................................................................... V
Índice geral ........................................................................................................... VII
Índice de figuras ..................................................................................................... X
Índice de tabelas ................................................................................................. XIII
Lista de abreviaturas ......................................................................................... XIV
Resumo ................................................................................................................ XV
Abstract .............................................................................................................. XVI
Capítulo I – Introdução .......................................................................................... 1
1) Sistema nervoso central como alvo terapêutico ........................................... 2
1.1) Afeções do Sistema Nervoso Central .................................................... 4
1.2) Passagem de fármacos para o Sistema Nervoso Central ..................... 7
1.2.1) Efeito de primeira passagem ................................................................ 7
1.2.2) Barreira hematoencefálica .................................................................... 7
1.3) Alvos terapêuticos do Sistema Nervoso Central .................................. 12
1.3.1) Monoamina oxidase ........................................................................... 12
1.3.2) Colinesterases .................................................................................... 14
2) Nanopartículas ........................................................................................... 15
2.1) Lipossomas ......................................................................................... 16
2.1.1.) Fitossomas ......................................................................................... 18
2.1.1.1) Composição lipídica de fitossomas .................................................. 20
2.1.1.2) Caracterização de fitossomas .......................................................... 21
3) Mentha pulegium L. .................................................................................... 22
Capítulo II – Objetivos .......................................................................................... 24
Capítulo III – Secção experimental ...................................................................... 26
1) Reagentes e substâncias de referência ..................................................... 27
2) Amostragem e preparação do extrato aquoso ............................................ 27
VIII
3) Determinação dos compostos fenólicos no extrato aquoso de M. pulegium
por HPLC-DAD ............................................................................................................ 28
4) Inibição de enzimas isoladas ..................................................................... 29
4.1) hMAO-A .............................................................................................. 29
4.2) Colinesterases .................................................................................... 30
5) Extração lipídica a partir da gema de ovo .................................................. 30
5.1) Quantificação de fosfato nos extratos lipídicos ....................................... 31
5.2) Quantificação de colesterol nos extratos lipídicos .................................. 32
5.3) Separação das classes de fosfolípidos do extrato lipídico ........................ 32
5.4) Determinação de carotenoides no extrato lipídico por HPLC-DAD ........... 32
6) Desenvolvimento de formulações com extrato aquoso de M. pulegium
incorporado .................................................................................................................. 33
7) Eficiência de encapsulamento do extrato ................................................... 34
8) Estabilidade dos fitossomas dialisados ...................................................... 35
9) Potencial Zeta e tamanho da partícula nas suspensões de fitossomas
dialisadas… ................................................................................................................. 35
10) Homogeneizados de cérebro de rato e sinaptossomas .......................... 35
10.1) Determinação de proteína .................................................................... 36
10.2) Inibição da MAO-A nos sinaptossomas ................................................ 36
11) Análise estatística ................................................................................... 37
Capítulo IV – Resultados e discussão ................................................................ 38
1) M. pulegium: estudo químico do extrato e sua bioatividade ....................... 39
1.1) Extração .............................................................................................. 39
1.2) Determinação dos compostos fenólicos do extrato aquoso de M.
pulegium por HPLC-DAD ......................................................................................... 39
1.3) Inibição de enzimas do SNC ............................................................... 44
1.3.1) Colinesterases .................................................................................... 44
1.3.2) hMAO-A .............................................................................................. 45
IX
2) Desenvolvimento e caracterização de uma formulação lipídica para o
transporte dos compostos bioativos do extrato aquoso de M. pulegium ...................... 47
2.1) A gema do ovo: fonte de fosfatidilcolinas ............................................ 47
2.1.1) Quantificação de fosfolípidos e colesterol nos extratos lipídicos
provenientes da gema do ovo .................................................................................. 47
2.1.2) Deteção e identificação de carotenoides no extrato lipídico por HPLC-
DAD……………. ....................................................................................................... 49
2.2) Eficiência de encapsulamento do extrato nos fitossomas após
diálise………. ........................................................................................................... 50
2.3) Interação dos compostos bioativos do extrato aquoso de M. pulegium
com os fosfolípidos membranares: Avaliação por espetroscopia de
fluorescência……… ................................................................................................. 54
2.4) Análise qualitativa por HPLC-DAD dos compostos polifenólicos
encapsulados nos fitossomas após diálise ............................................................... 58
2.5) Estabilidade dos fitossomas dialisados, avaliada por UV-Vis .............. 59
2.6) Caracterização dos fitossomas: potencial Zeta e tamanho de
partícula…….. .......................................................................................................... 60
3) Inibição da MAO-A em sinaptossomas ....................................................... 67
Capítulo V – Conclusões e perspetivas futuras ................................................. 70
Capítulo VI – Referências bibliográficas ............................................................ 72
X
Índice de figuras
Figura 1. Células neurovasculares na formação da barreira hematoencefálica
(adaptado de [42] ). ............................................................................................................. 9
Figura 2. Tipos de transporte através da barreira hematoencefálica (adaptado de [47]).
........................................................................................................................................ 11
Figura 3. Representação de um lipossoma (adaptado de: [89]). .............................. 17
Figura 4. Distinção de lipossomas e fitossomas (adaptado de: [106]). ..................... 20
Figura 5. Mentha pulegium L (fotografia de Rafael Vilamarim). ............................. 22
Figura 6. Cromatograma obtido por HPLC-DAD (330 nm) do extrato aquoso de
M.pulegium. 1: Ácido 3-cafeoilquínico; 2: Cafeoilpentósido; 3: Ácido 4-cafeoilquínico; 4:
Ácido salvianólico H; 5: Luteolina-7-O-glucuronato; 6: Luteolina-7-O-rutinósido; 7: Cafeoil-
hexosilpentósido; 8: Isómero do ácido salvianólico E; 9: Crisoeriol/diosmetina-7-O-
rutinósido; 10: Apigenina-7-O-glucuronato; 11: Ácido rosmarínico; 12: Feruloil-
hexosilpentósido; 13: Ácido litospérmico; 14: Isómero do ácido salvianólico C; 15: Ácido
feruloil-rosmarínico. ......................................................................................................... 40
Figura 7. Estruturas químicas de alguns dos compostos fenólicos encontrados no
extrato aquoso de M. pulegium. 1: Ácido 3-cafeoilquínico; 2: Cafeoilpentósido; 3: Ácido 4-
cafeoilquínico; 4: Ácido salvianólico H; 5: Luteolina-7-O-rutinósido; 6: Luteolina-7-O-
glucuronato; 7: Caffeoil-hexosilpentósido; 8: Isómero do ácido salvianólico E; 10:
Apigenina-7-O-glucuronato; 11: Ácido rosmarínico; 13: Ácido litospérmico; 14: Isómero do
ácido salvianólico C; 15: Ácido feruloil-rosmarínico. ........................................................ 42
Figura 8. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium (A) e do controlo positivo (B) sobre
a AChE. ........................................................................................................................... 44
Figura 9. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium (A) e do controlo positivo (B) sobre
a BuChE. ......................................................................................................................... 45
Figura 10. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium (A) e do controlo positivo (B)
sobre a hMAO-A. ............................................................................................................ 46
Figura 11. Identificação das diferentes classes de fosfolípidos por CCF. A1 e A2
correspondem a diferentes amostras de extratos lipídicos extraídos da gema de ovo. PC
corresponde ao padrão de fosfatidilcolina. ...................................................................... 49
Figura 12. Perfil de carotenoides do extrato lipídico obtido da gema de ovo (preto) e
respetivos padrões (luteína 0,02 mg/mL (laranja) e zeaxantina 0,02 mg/mL (azul)) por
HPLC-DAD. ..................................................................................................................... 50
XI
Figura 13. Espetros de absorção UV-Vis do extrato aquoso de M. pulegium (azul),
dos fitossomas antes da diálise (laranja), dos fitossomas após diálise (cinzento) e da
formulação sem incorporação de extrato (amarelo). Para as formulações com extrato
incorporado e para o extrato puro foi utilizada uma concentração final de 0,3125 mg/mL de
extrato no poço. .............................................................................................................. 51
Figura 14. Absorvência em função da concentração de extrato de M. pulegium
registada a 280 (azul), 330 (laranja) e 350 nm (cinzento). ............................................... 52
Figura 15. Eficiência de encapsulamento (%) dos fitossomas avaliada após diálise,
em função da concentração fosfolípidos, mantendo a concentração de extrato de M.
pulegium em 1 mg/mL. .................................................................................................... 53
Figura 16. Eficiência de encapsulamento (%) dos fitossomas avaliada após diálise,
em função da concentração de extrato aquoso de M. pulegium, mantendo a concentração
de fosfolípidos em 0,5 e 2,5 mM. ..................................................................................... 54
Figura 17. Espetros de emissão de fluorescência do extrato aquoso de M. pulegium
(cinzento), da solução/suspensão de fitossomas (62.5 µM em fosfolípidos) antes (azul) e
após diálise (laranja), fixando o comprimento de onda de excitação em 391 nm. Em todas
as situações a concentração de extrato aquoso de M. pulegium foi de 0,125 mg/mL. ..... 56
Figura 18. Espetros de emissão de fluorescência, fixando o comprimento de onda de
excitação em 391 nm, normalizados pelo valor da intensidade de florescência a 505 nm.
Extrato aquoso de M. pulegium (azul), fitossomas após diálise antes (laranja) e depois da
adição de detergente (0,05 mg/mL) (cinzento), preparados com 62,5 µM (A) e 1,25 mM (B)
de fosfolípidos em solução contendo 0,125 mg/mL de extrato. ....................................... 57
Figura 19. Cromatograma obtido por HPLC-DAD (330 nm) dos compostos
polifenólicos incorporados pelos fitossomas após diálise. 4: Ácido salvianólico H; 5:
Luteolina-7-O-glucuronato; 6: Luteolina-7-O-rutinósido; 7: Cafeoil-hexosilpentósido; 8:
Isómero do ácido salvianólico E; 9: Crisoeriol/diosmetina-7-O-rutinósido; 10: Apigenina-7-
O-glucuronato; 11: Ácido rosmarínico; 12: Feruloil-hexosilpentósido; 13: Ácido litospérmico;
14: Isómero do ácido salvianólico C; 15: Ácido feruloil-rosmarínico. ............................... 59
Figura 20. Variação da turbidez, avaliada pela absorvência a 610 nm, de formulações
de fitossomas dialisados em função do tempo. As formulações foram preparadas em
solução tampão suplementada com 1 mg/mL de extrato aquoso de M. pulegium com
diferentes concentrações de fosfolípidos, 0,5 mM (azul escuro), 1 mM (laranja), 2,5 mM
(cinzento), 5 mM (amarelo) e 10 mM (azul claro). ........................................................... 60
XII
Figura 21. Intensidade de dispersão da luz em função do diâmetro da partícula (nm).
Fitossomas analisados imediatamente após diálise (A) e passados 7 dias (B); Fitossomas
extrusados analisados imediatamente após diálise (C) e passados 7 dias (D). ............... 63
Figura 22. Número de partículas em função do diâmetro da partícula (nm).
Fitossomas analisados imediatamente após diálise (A) e passados 7 dias de
armazenamento (B); Fitossomas extrusados analisados imediatamente após diálise (C) e
passados 7 dias de armazenamento (D). ........................................................................ 65
Figura 23. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium (A) e do controlo positivo (B)
sobre a MAO-A presente nos sinaptossomas. ................................................................. 68
Figura 24. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium, fitossomas após diálise e
fitossomas após diálise e extrusão na atividade da MAO-A presente nos sinaptossomas.
........................................................................................................................................ 69
XIII
Índice de tabelas
Tabela 1. Regressão linear, limite de deteção e limite de quantificação para os
compostos fenólicos determinados. ................................................................................ 29
Tabela 2. Regressão linear, limite de deteção e limite de quantificação para os
carotenoides determinados. ............................................................................................ 33
Tabela 3. Parâmetros relativos à preparação do extrato aquoso de M. pulegium por
decocção. ........................................................................................................................ 39
Tabela 4. Espetro de UV e comportamento cromatográfico dos compostos
identificados por HPLC-DAD no extrato aquoso de M. pulegium e na solução proveniente
da extração líquido-líquido dos fitossomas com extrato incorporado após diálise. .......... 41
Tabela 5. Composição fenólica do extrato aquoso de M. pulegium.. ...................... 43
Tabela 6. Parâmetros relativos à extração dos fosfolípidos da gema de ovo. ........ 48
Tabela 7. Diâmetro (média ± desvio-padrão) e índice de polidispersidade (média ±
desvio-padrão) dos fitossomas nas formulações prepradas com e sem extrusão
imediatamente após diálise e depois de sete dias de armazenamento a 4 ºC. ................ 61
Tabela 8. Tamanho médio da partícula quanto à intensidade e número dos
fitossomas após diálise para as diferentes populações encontradas. .............................. 65
Tabela 9. Potencial Zeta dos fitossomas após diálise. ........................................... 66
XIV
Lista de abreviaturas
ACh Acetilcolina
AChE Acetilcolinesterase
ATCI Iodeto de acetilcolina
BHE Barreira hematoencefálica
BHT Hidroxitolueno butilado
BSA Albumina de soro bovino
BSLCR Barreira sangue-líquido cefalorraquidiano
BTCCI Cloreto de S-butiriltiocolina
BuChE Butirilcolinesterase
CCF Cromatografia em camada fina
DLS Dispersão dinâmica de luz
DTNB Reagente de Ellman ou ácido 5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico)
hMAO-A Recombinante humana da MAO-A
MAO Monoamina oxidase
PA Ácido fosfatídico
PC Fosfatidilcolina
PE Fosfatidiletanolamina
PEG Polietilenoglicol
P-gp Glicoproteína-P
PI Fosfatidilinositol
PS Fosfatidilserina
SNC Sistema Nervoso Central
SNP Sistema Nervoso Periférico
XV
Resumo
As doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas são um dos principais
problemas de saúde da atualidade. Apesar dos avanços recentes as ferramentas
terapêuticas são ainda limitadas. A nanotecnologia permite criar sistemas
nanoestruturados capazes de incorporar produtos naturais, uma possível alternativa
promissora para o tratamento/contenção destas patologias. Neste trabalho desenvolveu-
se uma nova formulação lipídica para o encapsulamento dos compostos bioativos de um
extrato aquoso de Mentha pulegium L., com o objetivo de modular a atividade cerebral.
A análise do extrato obtido por decocção, por HPLC-DAD, mostrou tratar-se de uma
mistura com pelo menos 15 compostos fenólicos, 11 ácidos hidroxicinâmicos e 4
flavonoides. Esta fração fenólica corresponde a 84,00 ± 4,28 mg/g extrato liofilizado, sendo
o ácido rosmarínico o composto mais abundante (43,45% do total de compostos fenólicos).
O extrato apresentou capacidade para inibir a acetilcolinesterase (IC50 =197,02 ± 17,95
µg/mL de polifenóis totais), a butirilcolinesterase (IC50 = 255,92 ± 16,19 µg/mL de polifenóis
totais) e a monoamina oxidase-A (hMAO-A) (IC50= 20,11 ± 0,86 µg/mL de polifenóis totais),
enzimas com relevância no funcionamento do SNC. Para aproveitar o potencial destes
compostos, prepararam-se formulações lipídicas (fitossomas) usando os lípidos extraídos
da gema de ovo. O estudo da eficiência de encapsulamento, em função da quantidade de
lípido e da quantidade de extrato, permitiu encontrar a razão adequada para maximizar
este parâmetro (54,61 ± 6,25%). Estas formulações foram caracterizadas quanto ao seu
tamanho, carga superficial e estabilidade em função do tempo de armazenamento. Os
fitossomas, com tamanho inferior a 200 nm e carga superficial negativa, resultam de
interações preferênciais entre os compostos fenólicos e os fosfolípidos, como revelado por
Dispersão dinâmica de luz, potencial Zeta e espetroscopia de fluorescência,
respetivamente. A capacidade do extrato inibir a MAO-A foi confirmada em sinaptossomas
obtidos de homogeneizados de cérebro de rato (IC50 = 19,54±0,89 µg/ml). Todavia, os
fitossomas mostraram-se incapazes de inibir esta enzima nos sinaptossomas, sugerindo
grande estabilidade da formulação e a inexistência de um sistema de transporte
(endocitose) dos fitossomas através da membrana plasmática dos sinaptossomas.
Assim, o encapsulamento do extrato aquoso de M. pulegium em formulações
lipídicas poderá constituir uma alternativa à modulação da atividade cerebral em patologias
associadas à MAO-A.
Palavras-chave: Mentha pulegium L.; Compostos fenólicos; Colinesterases; MAO-A;
Fitossomas.
XVI
Abstract
Neurodegenerative and neuropsychiatric diseases are one of the main problems
nowadays. Despite recent advances, their aetiology remains practically unknown, thus
limiting the development of new treatments. Nanotechnology allowed creating
nanostructured systems able to incorporate natural products, promising alternatives in the
treatment/restraint of these pathologies. In this work, a new lipid formulation to encapsulate
the bioactive compounds of an aqueous extract of Mentha pulegium L. was developed,
aiming the modulation of the cerebral activity.
The analysis of the extract obtained by decoction, performed by HPLC-DAD, showed
that it was a mixture of, at least, 15 phenolic compounds, 11 hydroxycinnamic acids and 4
flavonoids. This phenolic fraction corresponds to 84.00 ± 4.28 mg/g lyophilized extract,
rosmarinic acid being the most abundant compound (43.45% of total phenolic compounds).
The extract displayed capacity to inhibit acetylcholinesterase (IC50 = 197.02 ± 17.95 μg /
mL total polyphenols), butyrylcholinesterase (IC50 = 255.92 ± 16.19 μg / mL total
polyphenols), and monoamine oxidase-A (hMAO-A) (IC50 = 20.11 ± 0.86 μg / mL total
polyphenols), enzymes with a relevant role in the functioning of the SNC. To take advantage
from these compounds potential, lipid formulations (phytosomes) were prepared using the
lipids extracted from egg yolk. The study of the encapsulation efficiency, as function of the
lipid amount and of the extract amount, allowed finding the adequate ratio to maximize this
parameter (54.61 ± 6.25%). These formulations were characterized regarding their size,
surface charge and stability along storage. The phytosomes, with size lower than 200 nm
and negative surface charge, result from preferential interactions between the phenolic
compounds and the phospholipids, as revealed by dynamic light scattering, Zeta potential
and fluorescence spectroscopy. The capacity of the extract to inhibit MAO-A was confirmed
in synaptosomes obtained from mouse brain homogenates (IC 50 = 19.54 ± 0.89 μg/ml).
Nevertheless, the phytosomes were unable to inhibit this enzyme in the synaptosomes,
pointing to the great stability of the formulation and to the inexistence of a transport system
(endocytosis) of the phytosomes through the plasmatic membrane of the synaptosomes.
Thus, the encapsulation of the aqueous extract of M. pulegium in lipid formulations
may be an alternative to the modulation of brain activity in pathologies associated to MAO-
A.
Keywords: Mentha pulegium L.; Phenolic compounds; Cholinesterases; MAO-A;
Phytosomes.
1
Capítulo I – Introdução
Introdução
2
1) Sistema nervoso central como alvo terapêutico
O sistema nervoso tem a capacidade de receber milhões de bits de informação por
minuto e, de seguida, integrá-la e determinar a resposta desencadeada pelo organismo.
Trata-se de um sistema inigualável na execução de processos de pensamento e ações de
controlo de grande complexidade, [1] estando envolvido numa enorme variedade de funções
orgânicas: i) monitorização de inúmeros estímulos (temperatura, tato, paladar, olfato, som,
pressão arterial, pH dos fluidos corporais); ii) integração, processando a informação e início
da resposta; iii) atividade mental, através do encéfalo, coordenando a consciência, as
emoções, o pensamento e a memória; iv) controlo de músculos e glândulas (ex.
sudoríparas, salivares e do tubo digestivo); v) a nível de homeostasia, através de inibição
ou estimulação de diversas atividades em diversos órgãos. [2]
O sistema nervoso divide-se em dois subsistemas, o sistema nervoso central (SNC)
e o sistema nervoso periférico (SNP). O primeiro representa a maior parte, incluindo o
encéfalo (constituído pelo tronco cerebral, cerebelo, diencéfalo e cérebro) e a medula
espinal. [2] Este tem capacidade para receber a informação sensorial, avaliá-la,
armazenando parte dela, e seguidamente, desencadear reações. Por sua vez, o SNP
representa uma vasta rede de nervos espinais (ou raquidianos) e cranianos ligados à
medula espinal e ao encéfalo, recolhendo inúmeras informações, internas e externas,
retransmitindo-as ao SNC. [3]
A proteção do SNC envolve três elementos estruturais essenciais: a barreira sangue-
líquido cefalorraquidiano (BSLCR), a barreira sangue-aracnoide e a barreira
hematoencefálica (BHE). [4] Estas são estruturas especializadas do SNC fundamentais na
proteção, na homeostasia, como veículo para o transporte de substâncias importantes para
o SNC ou na remoção de resíduos e detritos. [5]
Estas barreiras limitam a entrada de componentes do plasma, glóbulos vermelhos e
leucócitos para o cérebro. No caso destes conseguirem atravessá-las, devido a lesão
isquémica, hemorragia intracerebral, trauma, processo neurodegenerativo, inflamação ou
distúrbio vascular, ocorre a formação de produtos neurotóxicos, podendo comprometer as
funções sinápticas e neuronais. [6]
Deste modo, o sistema nervoso é vulnerável a diversos perigos e danos, que são
representados por mais de 600 patologias já identificadas. [7] Entre estas destacam-se as
doenças neurodegenerativas, como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, a
doença de Huntington, a esclerose múltipla, entre outras, e as doenças neuropsiquiátricas,
nomeadamente a ansiedade, a epilepsia, a esquizofrenia, a neuroinflamação e a
depressão.
Introdução
3
Embora os referidos elementos estruturais sejam importantes para o SNC, estes
também se tornam um obstáculo para o desenvolvimento de novos fármacos que
combatam os distúrbios do SNC. Aproximadamente 98% das moléculas de pequena
dimensão e todas as moléculas de grande dimensão usadas em neuroterapia, como o caso
de péptidos, proteínas recombinantes e vetores genéticos, não consegue atravessar a
BHE. De facto, apenas moléculas lipofílicas de pequena dimensão (< 400-500 Da) são
capazes de atravessar esta barreira. [6]
Assim, o desenvolvimento de fármacos novos para tratamento de qualquer patologia
neurológica continua a ser difícil. Nos últimos 10 a 15 anos foram realizados dezenas de
ensaios clínicos envolvendo milhares de pacientes com doenças neurodegenerativas e
neuropsiquiátricas, que não foram bem sucedidos. [8] Embora na última década o número
de estudos tenha aumentado, [9] este tipo de doenças ainda não tem cura, [7] existindo
apenas terapias paliativas. A maior parte dos fármacos existentes apenas promove o alívio
sintomático, tentando abrandar a sua progressão. No entanto, como a maioria das
patologias tem um início precoce e permanece assintomática por muito tempo, as terapias
iniciadas numa fase já adiantada da doença são pouco significativas para o paciente. [9]
Assim, a procura de terapias alternativas e preventivas que possam interromper ou impedir
a progressão destas doenças tornou-se essencial. [9]
O recente desenvolvimento da nanotecnologia nas áreas farmacêutica e biomédica
levou ao desenvolvimento de agentes terapêuticos e de diagnóstico nanoestruturados, que
poderão beneficiar o tratamento de muitas doenças do SNC. [10] A capacidade de
nanopartículas para atingir mais facilmente os órgãos, comparativamente com partículas
de maiores dimensões, causa grande expetativa do ponto de vista de obtenção de efeitos
em vários órgãos e também no SNC. As nanopartículas movimentam-se de forma única na
circulação sistémica para o SNC, devido ao seu tamanho pequeno e à sua grande área de
superfície. Desta forma, as nanopartículas podem atravessar mais facilmente as barreiras
protetoras do SNC, podendo ser usadas como ferramenta na administração de fármacos
com este alvo. [11]
Inicialmente, a nanotecnologia foi aplicada principalmente no diagnóstico e no
tratamento de tumores cerebrais. Com o intuito de contornar ou atravessar as barreiras de
forma mais eficaz, foram exploradas novas vias de administração e mecanismos de
transporte, como, por exemplo, a interrupção temporária da BHE (para aumentar a
permeabilidade da nanopartícula), a utilização de polímeros impregnados (para a
administração local de fármacos), a administração aumentada por convecção,
administração intranasal, entre outros. [10]
Introdução
4
Os sistemas de libertação à base de nanopartículas têm sido muito utilizados para
incorporar produtos naturais, permitindo melhorar as suas propriedades terapêuticas e
aumentar a sua eficácia no local de ação. [12]
O uso de produtos naturais em terapêutica remonta ao início da civilização humana,
sendo que ao longo dos tempos os produtos minerais, vegetais e animais tornaram-se as
principais fontes de fármacos. [13, 14] As plantas, principalmente, têm sido muito utilizadas
para a obtenção de grande número de substâncias, quer na forma de compostos puros,
quer na forma de extratos, cuja incorporação em nanopartículas possibilitará o
desenvolvimento de medicamentos eficazes, com características desejáveis para uso
terapêutico. [12] O uso de produtos naturais tem aumentado devido ao facto dos
antioxidantes neuroprotetores serem considerados promissores para retardar a progressão
e limitar a extensão da perda de células neuronais em doenças neurodegenerativas. Têm
a capacidade de interferir com os radicais livres formados e limitarem a extensão dos danos
celulares, aliviando a carga metabólica secundária ao aumento dos níveis de radicais livres.
[15] Deste modo, a utilização de compostos naturais com propriedades antioxidantes em
nanopartículas é uma nova alternativa que tem suscitado interesse. [9]
1.1) Afeções do Sistema Nervoso Central
O sistema nervoso, tal como uma máquina complexa com grande número de peças,
está sujeito a inúmeras avarias, sendo vasta a bibliografia que descreve os diversos
distúrbios neurológicos. [16]
Um dos efeitos do envelhecimento sobre o sistema nervoso é a perda de neurónios.
Após os 30 anos, o nosso cérebro perde milhares de neurónios diariamente, podendo o
cortéx cerebral perder até 45% das suas células e o cérebro diminuir o seu peso em 7%
relativamente ao auge da vida. A capacidade de envio de impulsos nervosos fica diminuída,
tornando o processamento das informações mais lento, ocorrendo mudanças
degenerativas. [17]
A neurodegeneração corresponde a uma perda progressiva da função ou estrutura
neuronal, que resulta em danos cerebrais irreversíveis. [17] Esta é induzida por fatores
genéticos, ambientais e endógenos que se relacionam com o envelhecimento, cujo
potencial patogénico e mecanismos moleculares subjacentes não estão elucidados. [18]
A doença neurodegenerativa é o termo genérico para vários tipos de doenças
caracterizadas clinicamente pelo aparecimento em idades tardias, com sintomas
neurológicos específicos, tais como declínio cognitivo, ataxia, parkinsonismo, fraqueza
motora e disfunções neuronais progressivas, sendo geralmente acompanhada por morte
Introdução
5
celular de grupos específicos de neurónios. [19] Esta classificação abrange uma grande
gama de perturbações neurológicas agudas e crónicas caracterizadas pela perda de
células neuronais e gliais, tais como a doença de Alzheimer, a doença de Parkinson, a
doença de Huntington, a esclerose múltipla e a esclerose lateral amiotrófica, [20] estando a
prevalência destas patologias a aumentar a um ritmo alarmante por todo o mundo. [17]
As doenças neurodegenerativas têm características neuropatológicas comuns,
nomeadamente i) uma dinâmica anormal de proteínas (enrolamento incorreto, degradação
e agregação proteica defeituosa), ii) estado de stresse oxidativo, iii) deficiência
bioenergética, iv) disfunção mitocondrial, v) danos ao nível do DNA, vi) fragmentação do
aparelho de Golgi neuronal, vii) rutura do transporte axonal/celular, viii) disfunção das
neurotrofinas e ix) processos neuroinflamatórios/neuroimunes. [18, 21] A sequência segundo
a qual estes eventos ocorrem é difícil de identificar, tendo já sido demonstrado que os
primeiros sinais de doença são, normalmente, danos oxidativos no cérebro, derivados do
desequilíbrio entre a produção de espécies reativas de oxigénio e espécies reativas de
azoto e os sistemas antioxidantes da defesa celular. [13] Deste modo, estes mecanismos,
inter-relacionados em círculos viciosos complexos, levam à disfunção celular e morte do
indivíduo. [18]
Do ponto de vista histopatológico, muitas doenças neurodegenerativas caracterizam-
se pela presença de corpos de inclusão nos neurónios, bem como nas células gliais,
encontrando-se associadas a acumulações de proteínas com enrolamento incorreto e com
agregados de proteínas, como por exemplo, os corpos de Lewy na doença de Parkinson e
as placas senis na doença de Alzheimer. [19]
As doenças neuropsiquiátricas, por sua vez, são doenças com condições complexas
que afetam milhões de pessoas em todo o mundo, [22] sendo o número de distúrbios
neuropsiquiátricos substancial e responsável por cerca de um terço de incapacidade em
adultos. [23] Os distúrbios neuropsiquiátricos advêm de uma interação complexa de fatores
biológicos, psicológicos e sociais, representando um grupo de síndromes com
anormalidade nos domínios da cognição, afetivos e comportamentais, e sobreposição
significativa da sintomatologia em todos os domínios. [23]
A suscetibilidade às doenças neuropsiquiátricas é provocada por diversos fatores,
que incluem a predisposição genética, o desenvolvimento inadequado, as lesões cerebrais
e o envelhecimento natural (ou estado de doença), que no seu conjunto podem influenciar
as características moleculares, fisiológicas e estruturais do cérebro. Fatores externos,
como as exigências da vida, a perda de um ente querido ou abusos repetidos, também
podem ter um impacto negativo sobre a saúde do cérebro. [23] O stresse crónico e a
resposta inadequada às ameaças ambientais são considerados os fatores de risco mais
Introdução
6
importantes para o desenvolvimento de transtornos neuropsiquiátricos. [24] Desse modo, o
desenvolvimento de distúrbios neuropsiquiátricos é dependente de múltiplas variáveis,
resultando de trajetos diferentes com um mesmo resultado final: o aparecimento de uma
doença neuropsiquiátrica. [23] O progresso na compreensão da sua fisiopatologia tem sido
lento, apesar dos efeitos na saúde pública serem profundamente negativos, [25]
permanecendo os mecanismos patogénicos subjacentes a estes distúrbios praticamente
desconhecidos. [26]
A descoberta de novos mecanismos terapêuticos tem diminuído dramaticamente ao
longo da última década. Os mecanismos moleculares das principais classes atuais de
fármacos psicoterapêuticos continuam a ser os mesmos dos protótipos desenvolvidos há
mais de 50 anos e a maioria foi descoberta por acaso. [27]
Apesar de décadas de pesquisa, as bases biológicas da maioria dos distúrbios
neuropsiquiátricos são ainda impercetíveis. [23] A etiologia específica permanece
incompreendida, levando a que o número de tratamentos eficazes em pacientes ainda seja
muito limitado. [22] Embora nestas últimas duas décadas tenha ocorrido um progresso
rápido no desenvolvimento de tecnologias não invasivas para estudar a estrutura do
cérebro humano e a sua função, continuam a existir diversas limitações na capacidade de
investigar os detalhes da fisiologia e biologia molecular deste. [25] A heterogeneidade na
apresentação dos transtornos neuropsiquiátricos torna difícil a identificação de
biomarcadores específicos, levando a que alguns especialistas relacionem biomarcadores
com um grupo de sintomas em vez da doença como um todo. [23]
Assim, tenta-se proporcionar um tratamento eficaz para os distúrbios
neuropsiquiátricos, quer no que respeita ao diagnóstico correto da doença que causa os
sintomas, quer para iniciar o tratamento o mais cedo possível e monitorizar o impacto de
diferentes terapias de forma válida e confiável. [23]
Tanto quanto se sabe, a prevalência de depressão, ansiedade e stresse entre os
adolescentes e jovens adultos em todo o mundo é estimada entre 5 a 70%. Quase 25%
das mulheres e 12% dos homens são afetados por estas doenças. [28] Este tipo de doenças
está a aumentar significativamente e é esperado que os distúrbios neuropsiquiátricos
subam acentuadamente. [28] Uma grande análise europeia, em 2010, estimou que 38,2%
da população adulta da UE sofre de pelo menos um transtorno cerebral. [29]
Introdução
7
1.2) Passagem de fármacos para o Sistema Nervoso Central
1.2.1) Efeito de primeira passagem
Embora nos últimos anos tenha sido feito um vasto trabalho na pesquisa de fármacos
para o tratamento de doenças do SNC, os que se revelam promissores in vitro falham in
vivo. Na maioria dos casos tal acontece, provavelmente, devido ao rápido metabolismo e
eliminação sistémica. [30]
Como qualquer substância, após ingestão o fármaco sofre modificações no trato
gastrointestinal, por ação de diversas enzimas que o metabolizam antes de alcançar a
circulação sistémica. Estas modificações podem fazer com que o composto mantenha as
suas propriedades benéficas, ou se torne ineficaz ou mesmo prejudicial para o organismo.
A ingestão de alimentos com medicamentos é outro problema, pois pode alterar a
disponibilidade, ação e toxicidade dos fármacos devido à interação com os diversos
nutrientes. [31]
Para exercer a sua ação biológica o fármaco tem de atravessar a barreira epitelial da
mucosa intestinal, a fim de entrar na circulação sistémica. O tamanho molecular e a
solubilidade lipídica são fundamentais para que tal ocorra após a administração oral do
fármaco. [32]
A maioria dos fármacos administrados por via oral é absorvida pelo trato
gastrointestinal e transportada diretamente para o fígado, que é o principal órgão de
metabolização. [33] O fígado metaboliza os fármacos antes de alcançarem a circulação
sistémica e atingirem o órgão alvo, sendo responsável pela diminuição da sua
biodisponibilidade e degradação. [34] O efeito de primeira passagem hepática tem tal
significado que existem fármacos que necessitam de ser administrados por uma via
diferente da via oral, de modo a permitir a sua absorção. [33]
1.2.2) Barreira hematoencefálica
A BHE é um sistema especializado de células endoteliais capilares que protegem o
encéfalo de substâncias nocivas provenientes da corrente sanguínea e fornecem os
nutrientes necessários para o seu bom funcionamento. [35] Devido às suas características
anatómicas únicas, tem um papel fundamental na regulação do tráfego de substâncias
através do SNC. [36]
Adicionalmente, a BHE é responsável pela manutenção da composição do fluido
intersticial cerebral e do líquido cefalorraquidiano dentro de limites extremamente
Introdução
8
apertados, permitindo que os neurónios possam executar as suas funções complexas,
ajudando também a manter os neurotransmissores do SNC e do SNP separados conforme
a zona em que atuam. [35] Tem função neuroimunitária, incluíndo na secreção de citoquinas,
prostaglandinas e óxido nítrico, sendo capaz de receber um estímulo de um compartimento
e, simultaneamente, responder com secreções para o outro. [37] Outra função muito
importante é a neuroprotetora, protegendo o SNC de uma grande variedade de metabolitos
neurotóxicos e xenobióticos capazes de causar dano ou mesmo morte celular. Como a
reposição de células neuronais é baixa no SNC de mamíferos, só ocorrendo em duas zonas
diferentes (nas zonas sub-ventricular e sub-granular, parte do giro dentado do hipocampo),
[38] qualquer causa de morte de células neuronais irá resultar, com o avançar da idade, no
aumento acentuado do aparecimento de patologias degenerativas e no avanço natural da
debilidade. [35]
Conforme referido acima, a BHE (Fig. 1) é constituída por células endoteliais
capilares especializadas. Estas estão associadas à membrana basal e às células vizinhas,
sendo estas as células perivasculares, astrócitos, neurónios e microglia, [39] que
desempenham um papel essencial na manutenção das suas características. [40] O endotélio
microvascular na BHE é caracterizado pela presença de junções apertadas entre as células
endoteliais adjacentes, de poucas vesículas de pinocitose e falta de perfurações. [39] As
junções apertadas fecham o espaço entre as células endoteliais e bloqueiam a difusão livre
de substâncias polares hidrossolúveis. Estas células endoteliais possuem um número
maior de mitocôndrias, resultando num aumento da atividade metabólica. [40] Assim, ao
contrário dos capilares periféricos que permitem a troca (relativamente) livre de substâncias
através ou entre células, a BHE, limita estritamente o transporte de substâncias para o
cérebro através de barreiras físicas e metabólicas: [35] as físicas resultam das junções
apertadas entre as células endoteliais e as metabólicas ocorrem pela atividade de várias
enzimas que metabolizam fármacos e nutrientes.
Para além disso, a BHE expressa numerosos transportadores de efluxo, tal como a
glicoproteína P (P-gp), proteínas de resistência a múltiplos fármacos, bem como
transportadores de absorção, como é o caso do transportador de glucose e os
transportadores de aminoácidos, que podem influenciar a absorção de um fármaco no
cérebro e no SNC. [41]
Introdução
9
Figura 1. Células neurovasculares na formação da barreira hematoencefálica (adaptado de [42]).
A capacidade de uma determinada substância para atravessar a BHE e penetrar no
cérebro depende de vários fatores: i) fatores relacionados com o fármaco, tais como
concentração, tamanho, flexibilidade, conformação, ionização (moléculas não ionizadas
penetram a BHE) e lipofilicidade da molécula, afinidade para os mecanismos de efluxo,
afinidade para os mecanismos de transporte, entre outros; ii) fatores relacionados com as
características físico-químicas, tais como o log Po/w do agente terapêutico [35] (medida da
lipofilicidade de um composto baseado na razão da concentração do mesmo, no equilíbrio,
após dissolução num sistema de duas fases formadas por dois solventes imiscíveis, água
e octanol), [43] que se trata de um dos parâmetros mais informativos. [35]
A lipossolubilidade de compostos tem sido utilizada para determinar a velocidade à
qual as moléculas são capazes de penetrar no cérebro pela via mediada por lípidos, sendo
maior quanto mais lipofílico for o composto. [41] A lipofilicidade de um determinado fármaco
está inversamente relacionada com o grau de formação de ligações de hidrogénio com a
água circundante. A presença de certos grupos funcionais na molécula, como amidas
terminais, aminas ou amidas primárias e grupos hidroxilo, favorece a formação de ligações
de hidrogénio, resultando na diminuição da lipofilicidade. Deste modo, aumentando a
lipofilicidade de moléculas pequenas, por diminuição das ligações de hidrogénio, promove-
se a permeabilidade e transferência do fármaco para o cérebro; a permeabilidade para
moléculas grandes ou com forte polaridade permanece baixa, independentemente da
lipofilicidade. [35]
Introdução
10
Apenas moléculas lipofílicas e pequenas moléculas hidrofílicas, [40] de peso molecular
inferior a 400-500 Da, [10] podem atravessar a BHE por difusão. No entanto, muitas
moléculas que possuem estas características são transportadas por transportadores de
efluxo muito eficientes, como o caso da P-gp, existindo também sistemas de transporte
específicos mediados por recetor para grandes moléculas, como péptidos e proteínas, [40]
o que faculta o acesso a nutrientes essenciais, como é o caso dos aminoácidos e glucose.
[35]
Tem sido demonstrado que a melhoria do acesso à BHE provoca um aumento da
resposta terapêutica, possibilitando melhores efeitos para diversas doenças relacionadas
com o SNC. [44] No entanto, é necessário que esta abertura seja reversível: é fundamental
que o aumento de permeabilidade não leve ao aumento da passagem de neurotoxinas
para o cérebro. [45]
Relativamente a transportadores de solutos através das membranas celulares,
alguns são unidirecionais e outros bidirecionais, permitindo assim que alguns solutos sejam
preferencialmente transportados para o cérebro e outros para fora dele. Outros solutos
dependem de gradientes de concentração, entrando e saindo conforme a necessidade do
SNC. [46]
Existem vários tipos de transporte através da BHE (Fig. 2): i) movimento de
leucócitos; ii) difusão passiva através das membranas celulares e das células endoteliais,
segundo a qual moléculas solúveis em lípidos e moléculas não polares irão penetrar no
SNC; iii) transporte por via de transportadores de efluxo, mediado por transportadores
ativos capazes de expulsar uma ampla gama de moléculas a partir da BHE e reduzir a sua
penetração no SNC para um nível inferior ao previsto pela solubilidade lipídica,
(normalmente fármacos anfifílicos e moléculas lipofílicas); iv) transporte por via de
transportadores de influxo mediado por transportadores ativos, fundamentais para a
entrada de muitos metabolitos e nutrientes polares necessários ao SNC, tais como a
glucose, aminoácidos, aminas, monocarboxilatos, nucleósidos e pequenos péptidos; v)
transcitose mediada por um recetor fundamental para algumas macromoléculas, proteínas
e péptidos, como, por exemplo, a insulina e a transferrina; vi) transcitose mediada por
adsorção para macromoléculas, em particular para macromoléculas catiónicas, como é o
caso da histona, a albumina catiónica e a avidina; vii) modulação das junções apertadas,
de forma a permitir o aumento do movimento de solutos polares para dentro do SNC. [47]
Introdução
11
Figura 2. Tipos de transporte através da barreira hematoencefálica (adaptado de [47]).
A transferência da maioria dos fármacos, a partir da corrente sanguínea, para o
cérebro é limitada pela BHE. [48] Apesar do avanço nas neurociências, a biodisponibilidade
dos fármacos para o tratamento de doenças do SNC continua a ser um grande desafio,
principalmente devido à natureza da BHE, [44] prejudicando um tratamento eficaz de muitas
doenças neurológicas/neuropsiquiátricas. [40] De facto, a melhoria da biodisponibilidade é
um incentivo para a investigação e desenvolvimento de novos medicamentos, [48] sendo
que nos últimos anos têm sido utilizadas estratégias diferentes para ultrapassar esta
barreira. Estas estratégias incluíram a abertura osmótica das junções apertadas, a
administração cirúrgica de fármacos diretamente no cérebro, a utilização de pro-fármacos
ou de sistemas veiculares como anticorpos [40] e a utilização de veículos de fármacos
coloidais, tais como lipossomas e nanopartículas, que têm como principal vantagem a
possibilidade de direcionar o fármaco por modificação da sua distribuição no organismo,
[47] podendo esta administração ser controlada. [49] Paralelamente tem-se observado um
incremento na exploração de transportadores para mediar o direcionamento para o SNC
de fármacos de síntese e semi-síntese, e também de moléculas orgânicas provenientes da
biotecnologia, tais como péptidos, proteínas e ácidos nucleicos, tendo sido usados modelos
celulares para prever a penetração na BHE. [50]
O avanço da nanotecnologia levou à utilização de lipossomas, nanopartículas sólido-
lípido ou diversas nanopartículas poliméricas, entre outras, no transporte de fármacos
através da BHE, tornando possível transportar um número crescente de fármacos com
Introdução
12
diferentes propriedades químicas. [40] Este avanço permitiu um aumento da entrega
intracelular do fármaco, [49] resultando assim em efeitos terapêuticos. Além disso, estas
nanopartículas não só aumentam o transporte do fármaco para o cérebro, como também
o protegem da degradação enzimática e são capazes de reduzir os seus efeitos
secundários. [40] Outra vantagem do transporte de moléculas dentro de nanopartículas
resulta da possibilidade de manipulação das suas propriedades de superfície, de forma a
evitar o reconhecimento pelos macrófagos, aumentando assim a probabilidade do fármaco
passar a BHE e atingir o seu alvo. [49]
1.3) Alvos terapêuticos do Sistema Nervoso Central
1.3.1) Monoamina oxidase
A monoamina oxidase (MAO) é uma flavoenzima que tem como cofator o dinucleótido
de flavina e adenina. Está ligada às membranas externas das mitocôndrias através de um
resíduo de cisteína, encontrando-se principalmente no tecido nervoso, fígado e pulmões.
[51-57]
Está envolvida no metabolismo de monoaminas, promovendo a desaminação
oxidativa de neurotransmissores como a epinefrina, norepinefrina, dopamina, serotonina
[55, 58-60] e β-feniletilamina, tendo uma grande importância no SNC. [57]
A capacidade da MAO para modular a função destes neurotransmissores específicos
permitiu a sua associação a diversos transtornos, como distúrbios de humor, ansiedade,
depressão, esquizofrenia, défice de atenção, hiperatividade, enxaqueca e doenças
neurodegenerativas, sendo cada vez mais considerada como alvo terapêutico. [52, 57]
Esta enzima existe sob duas isoformas distintas, a MAO-A e a MAO-B, que diferem
na sequência de aminoácidos (aproximadamente 70% de semelhança), na estrutura
tridimensional, na distribuição nos tecidos, na sensibilidade a inibidores e na especificidade
do substrato, sendo codificadas por genes distintos. [56, 57]
A sua seletividade para os neurotransmissores é diferente. A MAO-A degrada
preferencialmente a serotonina e a norepinefrina, enquanto a MAO-B tem preferência pela
β-feniletilamina. Esta distinção já não é feita relativamente à dopamina. [51, 52, 57, 61, 62]
A atividade da MAO tem sido associada a stresse oxidativo, neuroinflamação,
desencadeamento da apoptose, falha de depuração de agregados de proteínas, ativação
glial, agregação de α-sinucleína associada ao aparecimento de Parkinson precoce,
neurodegeneração dopaminérgica e morte celular neuronal. A sua ação leva à formação
de radicais hidroxilo que podem estar envolvidos em processos neurodegenerativos e
Introdução
13
desempenha um papel importante em diversos neurotransmissores associados a doenças
neuropsiquiátricas. [51]
No SNC, a isoforma A parece estar presente principalmente em neurónios
catecolaminérgicos [57] e níveis anormais, quer elevados, quer baixos, têm sido associados
a diversos transtornos neuropsiquiátricos. A MAO-B está localizada nos neurónios
histaminérgicos, [60] serotoninérgicos e principalmente na glia [57] e a sua atividade parece
estar aumentada em pacientes com doença de Alzheimer e doença de Parkinson. [62] Ao
contrário da maioria das enzimas, a atividade da MAO-B permanece inalterada até
aproximadamente aos 60 anos, aumentando de seguida de forma não linear. [63] Na doença
de Alzheimer o aumento da atividade desta enzima em certas regiões é de cerca de 40-
60% e está associado a grande quantidade de placas senis. A MAO-B parece atuar em
processos neurodegenerativos de duas formas. Através da desaminação da dopamina e
de outras aminas há formação de peróxido de hidrogénio, originando depois radicais
hidroxilo altamente tóxicos que reagem com as membranas neuronais, iniciando a
peroxidação lipídica e a morte celular. Por outro lado, a sua contribuição para a diminuição
de neurotransmissores no cérebro, nomeadamente de dopamina e serotonina, leva ao
aparecimento de sintomas de doenças neurodegenerativas observados em pacientes com
doença de Alzheimer. [64]
Conforme referido atrás, a inibição destas enzimas é uma aproximação terapêutica
importante, devido ao seu papel no metabolismo de neurotransmissores associados a
doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas. Desse modo a identificação de
inibidores específicos para a MAO-A e MAO-B tem sido alvo de intensa pesquisa.
Inibidores seletivos da MAO-A são eficazes no tratamento da depressão e ansiedade, e
inibidores da MAO-B estão mais relacionados com o tratamento da doença de Alzheimer
e da doença de Parkinson. [54, 55, 59, 61, 65]
Vários compostos têm sido identificados como inibidores reversíveis e irreversíveis,
seletivos para a MAO-A e MAO-B. [54] A selegilina e rasagilina são inibidores seletivos da
MAO-B e demonstraram retardar a neurodegeneração em pacientes com doença de
Parkinson. [51, 55] Por sua vez, os inibidores seletivos da MAO-A são a clorgilina e
moclobemida e são importantes no tratamento de ansiedade e depressão. [51] Apesar da
existência destes inibidores, a procura de alternativas tem sido intensa devido aos efeitos
adversos destas moléculas, como, por exemplo, citotoxicidade, hiperpirexia, coagulação
intravascular disseminada, convulsões, rigidez muscular e até coma. [59]
O possível uso de derivados de plantas como inibidores de ambos os tipos de
isoenzimas tem suscitado grande interesse, como alternativa para o tratamento de doenças
neuropsiquiátricas e neurodegenerativas. [65]
Introdução
14
1.3.2) Colinesterases
A acetilcolina (ACh) é o principal neurotransmissor do sistema colinérgico, tendo um
papel importante na memória e na aprendizagem. [66] É fundamental na transmissão dos
impulsos elétricos entre células nervosas e/ou de músculos voluntários para involuntários.
[67] É sintetizada pela acetilcolina transferase e é degradada pelas colinesterases. Nos
vertebrados existem duas isoformas das colinesterases: a acetilcolinesterase (AChE) e a
butirilcolinesterase (BuChE). A AChE é associada aos neurónios e axónios, enquanto a
BuChE é secretada pelas células gliais. Enquanto a BuChE é capaz de metabolizar várias
moléculas, a AChE é altamente seletiva para a ACh. [66] A AChE está presente em níveis
elevados no cérebro, nos nervos e nos glóbulos vermelhos; a BuChE encontra-se no soro
sanguíneo, no pâncreas, no fígado e no SNC. [68] A AChE e a BuChE têm uma homologia
de 65% na sequência de aminoácidos, com formas moleculares e locais ativos
semelhantes, apesar de serem provenientes de genes diferentes. [69]
O sistema colinérgico está envolvido na doença de Alzheimer. Assim, a “hipótese
colinérgica” atribui o declínio cognitivo associado à idade avançada destes pacientes à
perda da função colinérgica no SNC. [66, 70] Tem sido observado que a acetilcolina
transferase é substancialmente reduzida nesta doença. [71] Os fármacos utilizados no seu
tratamento, com base nesta hipótese, têm como objetivo contrariar o défice cerebral de
acetilcolina. [72]
Têm sido implementados inibidores das colinesterases com capacidade de aumentar
a atividade dos neurónios colinérgicos no cérebro. [68] No entanto, para serem eficazes têm
de se ligar reversivelmente ao local ativo das enzimas, evitando consequências graves,
como, por exemplo, a morte. [73]
A função colinérgica normal é dependente da inativação hidrolítica da ACh pelas
colinesterases. A inibição parcial das colinesterases pode prolongar o efeito da ACh, sendo
este o principal modo de ação dos fármacos usados para o tratamento da doença de
Alzheimer: tacrina, donepezilo, rivastigmina e galantamina. [74] Assim, estas moléculas
levam ao aumento dos níveis de ACh nas sinapses colinérgicas e melhoria da transmissão.
[75] A tacrina foi o primeiro inibidor; no entanto, devido à sua hepatotoxicidade e baixa
biodisponibilidade passou a ser pouco utilizada. [76] O donepezilo, a rivastigmina e a
galantamina inibem principalmente a AChE. Apesar da galantamina inibir também a
BuChE, fá-lo com 4 vezes menor eficácia comparativamente à AChE; o donepezilo é 100
vezes mais seletivo para a AChE do que para BuChE, enquanto a rivastigmina inibe de
igual forma as duas colinesterases. [77]
Introdução
15
A inibição das colinesterases tem sido assim uma abordagem atual para o tratamento
das doenças neurodegenerativas. Quanto maior for a inibição destas enzimas, maior será
a comunicação entre as terminações nervosas e a atividade nas vias colinérgicas no
cérebro. [78] Os fármacos referidos têm diversos efeitos colaterais, como hepatotoxicidade,
distúrbios gastrointestinais, tonturas, vómitos e náuseas; a procura de novas fontes para a
inibição destas enzimas à base de produtos naturais tem sido implementada, para
encontrar substâncias com menos efeitos colaterais. [73, 78, 79] De facto, a descoberta da
galantamina, um alcaloide, provocou um aumento da procura de inibidores à base de
plantas. [73] Por exemplo, inibidores à base de compostos fenólicos têm sido procurados,
devido à grande capacidade de interação com enzimas, possuindo um potencial inibitório
interessante para enzimas humanas, além dos benefícios devidos à sua ampla gama de
propriedades biológicas, como antioxidantes, anticancerígenos e antimicrobianos. [79]
2) Nanopartículas
A nanotecnologia é um campo emergente e multidisciplinar onde são utilizadas
técnicas e ferramentas de diversas áreas, como a biologia, a engenharia, a química e a
medicina. [80] Além de ter um potencial enorme para revolucionar a medicina, têm aparecido
grandes inovações muito rapidamente, observando-se um aumento exponencial de
patentes na área farmacêutica. [81]
Envolve estudos em escalas atómica e molecular, geralmente usando estruturas na
ordem dos nanómetros. [80] Os produtos farmacêuticos relacionados com nanopartículas
oferecem diversas vantagens em relação a partículas de maiores dimensões. [81] A
versatilidade da tecnologia de partículas permite a adaptação dos sistemas de
administração de fármacos considerando o alvo, o perfil farmacocinético desejado e a via
de administração. [82]
As nanopartículas usadas normalmente para a absorção ou encapsulamento de um
fármaco, permitindo protegê-lo da degradação química e enzimática que ocorre no
organismo, [83] definem-se como partículas coloidais submicrónicas, ou seja, com tamanho
inferior a 1 µm. [84] Estas podem ser usadas como adjuvantes em vacinas ou como veículo
em que o composto ativo pode ser dissolvido, aprisionado, encapsulado, adsorvido ou
quimicamente ligado. [83]
Normalmente o tamanho de uma nanopartícula é inferior a 100 nm, havendo a
possibilidade de controlá-lo de modo a ter dimensões menores ou comparáveis às de uma
célula (10-100 µm), de um vírus (20-450 nm), de uma proteína (5-50 nm) ou mesmo de um
Introdução
16
gene (2 nm de largura, 10-100 nm de comprimento), permitindo assim chegar perto do alvo
biológico de interesse. [85]
As nanopartículas são preparadas a partir de materiais biocompatíveis e
biodegradáveis, como é o caso de polímeros naturais (como a gelatina e albumina) e
sintéticos (como poliláctidos, polialquilcianoacrilatos), ou de lípidos sólidos. [83, 84] Existem
nanopartículas monolíticas, também chamadas de nanoesferas, nas quais o fármaco é
adsorvido, disperso ou dissolvido por toda a matriz. Existem também nanocápsulas, nas
quais o fármaco está confinado a um núcleo aquoso ou oleoso rodeado por uma parede
de revestimento. Por vezes o fármaco pode também ser ligado à superfície de forma
covalente. [84]
A absorção das nanopartículas dá-se por diversos mecanismos, como transcitose,
absorção intracelular, transporte através das células epiteliais da mucosa intestinal e pela
captação através das placas de Peyer, [84] tendo como principal objetivo, enquanto sistema
de entrega, a libertação dos agentes farmacologicamente ativos no local desejado, numa
taxa e dose ideais. [83]
Assim sendo, as nanopartículas apresentam diversas vantagens: elevada
estabilidade e especificidade; grande capacidade de suporte, sendo capazes de incorporar
diversas moléculas de fármacos; viabilidade para incorporar quer substâncias hidrofílicas,
quer hidrofóbicas; possibilidade de administração por diferentes vias (por exemplo, oral e
inalação); libertação controlada e sustentada do fármaco, de modo a aumentar a sua
eficácia e diminuir os efeitos colaterais; incorporação do fármaco sem ocorrência de
reações químicas, ajudando assim à sua preservação; controlo da libertação e degradação
do fármaco; aumento da biodisponibilidade do fármaco no local alvo, na quantidade certa
e num período de tempo ideal; possibilidade de melhorar a solubilidade de fármacos pouco
solúveis em água; prolongamento do tempo de vida na circulação sistémica, com redução
da imunogenicidade; conforto para o paciente e melhoria do desempenho terapêutico em
relação a outros sistemas. [83, 84]
2.1) Lipossomas
Os lipossomas (Fig. 3), descritos pela primeira vez em 1965, foram uma das primeiras
plataformas de nanopartículas a ser aplicada na medicina, [86] existindo hoje em dia mais
de 20 formulações em ensaios clínicos ou já aprovadas para uso clínico. [87] São vesículas
constituídas por uma ou mais bicamadas de fosfolípidos orientadas concentricamente em
redor de um compartimento aquoso, servindo para o transporte de fármacos hidrofílicos e
lipofílicos. [88]
Introdução
17
Figura 3. Representação de um lipossoma (adaptado de: [89]).
Dependendo da conceção, o tamanho dos lipossomas pode variar entre a dezena de
nanómetros e micrómetros. [86] Em torno do compartimento aquoso interno podem
apresentar apenas uma única bicamada lipídica, chamando-se unilamelares, ou múltiplas
bicamadas, denominando-se de multilamelares. Os lipossomas podem ser classificados de
acordo com o tamanho lamelar: vesículas unilamelares, quando o diâmetro varia entre 20
e 100 nm; vesículas unilamelares grandes, se o diâmetro é superior a 100 nm; vesículas
unilamelares gigantes, quando o diâmetro é até 1 µm; vesículas oligolamelares, se o
diâmetro varia entre 0,1 e 1 µm; vesículas multilamelares, que têm até 500 nm de diâmetro.
[88]
Os lipossomas são também agrupados em niossomas, transferossomas, etossomas
e fitossomas. Os niossomas são formados por automontagem de agentes tensioativos não
iónicos numa dispersão aquosa, sendo flexíveis e mais estáveis do que os lipossomas
convencionais. Os transferossomas são vesículas compostas por fosfolípidos deformáveis,
geralmente administrados por via transdérmica. Os etossomas são lipossomas
convencionais ou transferossomas que contêm até 10% de etanol, podendo promover a
solubilização de fármacos hidrofílicos. Os fitossomas formam-se através da ligação de
componentes individuais de extratos de plantas à fosfatidilcolina. [88]
As características dos lipossomas tornam-nos nanotransportadores ideais devido à
facilidade em modificar as dimensões, à fluidez da membrana e à superfície. [90] Uma
característica que distingue os lipossomas é a camada dupla de lípidos que imita as
membranas celulares, facilitando a fusão com, por exemplo, micróbios infeciosos, e a
libertação da carga de fármaco transportada para as membranas celulares. [83]
Introdução
18
A biocompatibilidade, a biodegradabilidade, e a possibilidade de encapsular agentes
hidrofílicos no núcleo aquoso e agentes hidrófobos dentro das lamelas fazem dos
lipossomas transportadores excelentes para a terapêutica. [86] A bicamada lipídica
lipossómica é composta por lípidos presentes nas membranas biológicas, sendo
constituintes comuns a esfingomielina, a fosfatidilcolina e os glicerofosfolípidos. O
colesterol é incluído porque diminui a permeabilidade e aumenta a estabilidade do
lipossoma. [91]
As desvantagens dos lipossomas são a sua elevada instabilidade nos fluidos
biológicos, a elevada velocidade de libertação do fármaco, a capacidade de transporte de
cargas baixas, a instabilidade durante a armazenagem [92] e eliminação rápida pelo sistema
reticuloendotelial, principalmente no fígado e baço. De forma a reduzir esta eliminação a
estrutura dos lipossomas tem sido modificada através do revestimento com polímeros
inertes e biocompatíveis, como o polietilenoglicol (PEG), dando origem aos chamados
lipossomas de longa duração. [93]
De acordo com o trabalho que foi desenvolvido no âmbito desta dissertação, será
dado destaque aos fitossomas.
2.1.1.) Fitossomas
Um produto natural é um composto químico ou uma substância produzida por um
organismo vivo que normalmente exerce uma atividade biológica ou farmacológica
importante para a descoberta e conceção de novos medicamentos. Deste modo, os
produtos naturais, incluindo os provenientes de plantas, animais e minerais, têm sido a
base do tratamento de diversas doenças humanas. [94] Os derivados das plantas,
particularmente, sempre receberam grande atenção. [95]
As plantas têm capacidade para produzir uma vasta e diversificada gama de
compostos orgânicos. Os que não participam diretamente no crescimento e
desenvolvimento da planta (metabolitos secundários) revelam-se cada vez mais
interessantes, embora as suas funções não sejam totalmente claras. Os metabolitos
primários, contrariamente, são encontrados em todas as plantas e executam funções
metabólicas que são essenciais para a planta. [96]
A distinção entre metabolito primário e secundário é, no entanto, difícil e um pouco
ambígua. Assim, segundo uma definição funcional, os metabolitos primários são produtos
que participam na alimentação e nos processos metabólicos essenciais da planta,
enquanto os metabolitos secundários (produtos naturais) são aqueles que influenciam as
interações entre a planta e o ambiente envolvente. Desse modo, com base nas suas
Introdução
19
origens biossintéticas, os compostos vegetais naturais podem ser divididos em três grupos
principais: os terpenoides, os alcaloides e os compostos fenólicos. [96]
A biodisponibilidade destes compostos, no entanto, tem sido um grande obstáculo à
utilização de extratos de plantas no tratamento de doenças, principalmente daqueles cujos
compostos ativos são solúveis em água e têm tendência a agregar-se, como é o caso de
muitos polifenóis. [97]
Vários extratos de plantas e compostos provenientes de plantas revelam grande
atividade in vitro, o mesmo não ocorrendo in vivo. Tal facto pode ser devido à baixa
lipofilicidade ou a possuírem estruturas moleculares grandes, o que restringe a aptidão
para atravessar a membrana celular e a absorção no intestino, podendo também haver
perda de alguns constituintes devido aos sucos gástricos. [98-101]
De modo a aumentar a disponibilidade oral destes compostos, e dos extratos que os
contêm, têm sido utilizados sistemas de libertação nanoestruturados variados. [97] Existem
diversas vantagens no uso destes tipos de sistema para libertação de compostos de
plantas: além de melhorar a biodisponibilidade, permitem o aumento da solubilidade,
protegem da toxicidade, melhoram a atividade, proporcionam mais estabilidade, entrega
sustentada e previnem a degradação química. [102]
Ultimamente a complexação de compostos de plantas com fosfolípidos tem sido alvo
de grande interesse, melhorando a biodisponibilidade e eficácia terapêutica dos compostos
de plantas mal absorvidos. [97, 99, 101] No ano de 1989, um grupo de investigadores italiano
desenvolveu a primeira formulação que permitiu a ligação de moléculas solúveis em água
provenientes de plantas, como o caso dos polifenóis, a fosfolípidos (Phitossome ®),
possibilitando o seu transporte e aumentando a sua absorção e a biodisponibilidade. [30]
Esta descoberta permitiu um equilíbrio entre a hidrofilicidade, essencial para se dissolver
no fluido gástrico, e a lipofilicidade, necessária para ultrapassar as membranas lipídicas,
melhorando assim a absorção. [99, 101, 103, 104]
Na formação dos fitossomas é criada uma pequena estrutura, essencial para que os
componentes do extrato sejam protegidos da destruição pelas secreções digestivas e
bactérias intestinais e importante para a transição do ambiente hidrofílico para o ambiente
lipofílico das membranas. [100, 104, 105] A ligação química estabelecida permite uma maior
estabilidade, para além de proporcionar uma maior duração de ação. [100]
O passo principal na produção de fitossomas é a reação de uma quantidade
estequiométrica do fosfolípido com o extrato ou composto, formando um complexo
fosfolípido-composto bioativo. [101, 103] A formação desse complexo resulta de ligações de
hidrogénio, principal interação neste tipo de estruturas. Estas ligações ocorrem entre a
parte polar dos fosfolípidos, os grupos fosfato, e as secções polares das substâncias
Introdução
20
bioativas. [98, 100] Nos fitossomas a razão entre o composto ativo e o lípido utilizado para a
formação do complexo varia normalmente entre 1:1,5 e 1:4. [103]
A principal diferença entre um lipossoma e um fitossoma (Fig.4) é que no primeiro
não se estabelecem ligações de hidrogénio entre os fosfolípidos e os compostos bioativos.
No caso dos lipossomas o composto ativo está dissolvido na parte interna ou a flutuar na
parte da membrana, enquanto nos fitossomas o composto ativo está ancorado à cabeça
polar dos fosfolípidos, integrando a membrana. Estas diferenças permitem que os
fitossomas tenham uma absorção muito melhor e uma maior disponibilidade do que os
lipossomas. [98, 100, 101]
Figura 4. Distinção de lipossomas e fitossomas (adaptado de: [106]).
2.1.1.1) Composição lipídica de fitossomas
Os fosfolípidos são lípidos que contêm fósforo na sua composição, possuindo uma
parte polar e outra não polar. Os glicerofosfolípidos, os principais fosfolípidos das células
eucariotas, [107] são constituídos por uma molécula de glicerol ligada a dois ácidos gordos
e no terceiro carbono um grupo fosfato ligado a um álcool. [98] Existem diferentes
glicerofosfolípidos, como a fosfatidilcolina (PC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina
(PS), ácido fosfatídico (PA) e fosfatidilinositol (PI). [107]
As principais fontes de fosfolípidos são os óleos vegetais (soja, milho, girassol, colza)
e tecidos animais, como a gema do ovo e cérebro de bovino. [111] Os fosfolípidos produzidos
Introdução
21
industrialmente são facéis de obter, sendo a soja, o girassol e a gema do ovo as fontes
mais usadas. [98, 107]
O perfil de fosfolípidos difere significativamente conforme a origem natural,
principalmente ao nível do teor em PC. Por exemplo, a gema de ovo contém 73-74% de
PC, 0,4-1% de PI, 17-24% de PE e não apresenta PA. Deste modo, a fonte de fosfolípidos
usada na produção dos fitossomas condicionará a sua estrutura e estabilidade. [108]
A PC, a PS e a PE são os principais fosfolípidos utilizados na produção de
fitossomas. No entanto, a primeira é mais usada do que os restantes. [98] É uma molécula
anfipática, com um grupo fosfatidil (lipofílico) e um grupo colina (hidrofílico), muito
importante. A cabeça polar liga-se aos compostos bioativos pelas ligações de hidrogénio e
o grupo fosfatidil lipofílico permite envolver a mistura, promovendo a formação do complexo
fosfolípido-composto bioativo. [98, 109] Embora esta seja fundamental na produção de
fitossomas, além de atuar como transportador já demonstrou ser benéfica para a saúde,
verificando-se um efeito sinérgico quando certas substâncias são administradas. [98,100, 109]
Adicionalmente é fundamental na construção molecular de lipoproteínas e nas membranas
celulares. [110]
2.1.1.2) Caracterização de fitossomas
O comportamento dos fitossomas é devido a diversos fatores, como a
permeabilidade da membrana, o tamanho, a composição química, bem como a pureza do
material utilizado na sua preparação. Assim, o tamanho, forma, distribuição, composição
química e capacidade de encapsulamento são características importantes. [111]
A análise do tamanho da partícula, da integridade estrutural e do potencial Zeta dos
fitossomas são parâmetros importantes para avaliar a sua estabilidade num intervalo de
tempo adequado. O tamanho médio da partícula pode ser medido através de analisadores
de tamanho de partícula, como é o caso de analisadores de dispersão dinâmica de luz
(DLS), e por microscopia eletrónica em alto vácuo, enquanto a integridade estrutural pode
ser avaliada por microscopia eletrónica de transmissão e microscopia de força atómica. A
eficiência de encapsulamento permite verificar a quantidade de composto bioativo que foi
encapsulada e pode ser determinada por espetrofotometria (UV-Vis) ou métodos
cromatográficos (como o HPLC). [98]
O tamanho das partículas e a distribuição de tamanhos destas são as características
mais importantes nestes sistemas, pois determinam a distribuição e a sua toxicidade no
destino biológico. Quanto maior o número de nanopartículas pequenas, maiores serão as
vantagens, nomeadamente a nível de absorção intracelular e disponibilidade para maior
Introdução
22
variedade de alvos biológicos. Por sua vez, a libertação do fármaco será mais rápida,
devido ao facto do fármaco estar associado à superfície da partícula. [111]
3) Mentha pulegium L.
Existem diversas plantas com moléculas com atividade no SNC, sendo as da família
Lamiaceae as mais interessantes. Esta família botânica é composta por plantas ou
arbustos de pequeno porte, [113] incluindo 61 espécies do género Mentha que se encontram
espalhadas por todo o mundo. [114]
A Mentha pulegium L. (Fig. 5), conhecida vulgarmente como poejo, é uma planta
com 20 a 40 cm de altura, fortemente aromática, com grande distribuição em Portugal
continental e nos Açores. [115, 116] O óleo essencial e as partes secas da planta têm sido
tradicionalmente utilizados no tratamento de distúrbios digestivos, do fígado, da vesícula
biliar, da gota, de resfriados, de doenças de pele, para aumento da micção e interrupção
da gravidez, bem como em aromaterapia, cosmética e com fins gastronómicos. [117]
Figura 5. Mentha pulegium L (fotografia de Rafael Vilamarim).
A maioria dos estudos realizados com esta planta envolve o seu óleo essencial, [117]
que é tambem usado como repelente, contra pulgas e outros insetos, sendo eficaz no alívio
Introdução
23
do acne e mordidas de escorpiões e cobras. [115] Por sua vez, as partes aéreas floridas,
têm sido utilizadas tradicionalmente no tratamento da sinusite, cólera, intoxicações
alimentares, bronquite, tuberculose, mau estar menstrual, como anti-séptico no tratamento
de resfriados, como antiflatulente, carminativo, expetorante, diurético e antitússico. [118] O
decocto também foi usado para tratamentos de diversos tipos de cancro, como o da
gengiva, do cólon, baço, estomago e útero. [119]
No género Mentha estão descritos diversos compostos fenólicos, metabolitos
secundários com grande distribuição na natureza e biologicamente ativos. Este género é
rico em derivados do ácido cafeico, como o ácido clorogénico e o ácido rosmarínico, sendo
este último o principal constituinte. [120]
O ácido rosmarínico tem demonstrado propriedades interessantes para o combate
de doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas. De Mello Andrade e colaboradores
demonstraram que este composto é um antioxidante capaz de inibir a peroxidação lipídica,
inibindo também a MAO-A, a MAO-B e a catecol-O-metiltransferase, enzimas relacionadas
com este tipo de doenças. [121] O ácido rosmarínico demonstrou igualmente capacidade
para inibir a AChE e para a BuChE em concentrações na ordem dos picomolar. [122]
Ferreres e colaboradores procederam à caracterização dos compostos fenólicos de
um extrato aquoso de M. pulegium, preparado de forma a mimetizar a forma habitual de
consumo da espécie. A análise por HPLC-DAD-ESI/MSn permitiu observar que 94% dos
compostos determinados eram ácidos fenólicos, sendo o ácido rosmarínico o principal, tal
como esperado para este género. Foram também encontrados derivados glicosilados de
flavonoides. [116]
Deste modo, a inclusão do extrato aquoso de M. pulegium em fitossomas, de modo
a ultrapassar barreiras naturais e melhorar a absorção dos compostos bioativos (como o
ácido rosmarínico), poderá ser uma alternativa para o tratamento de doenças
neurodegenerativas e neuropsiquiátricas.
24
Capítulo II – Objetivos
25
O presente trabalho tem como objetivos gerais o desenvolvimento de uma nova
formulação lipídica para encapsular os compostos bioativos do extrato aquoso de Mentha
pulegium L. (fitossoma) e investigar o potencial para modular a atividade cerebral, no
contexto de doenças neurodegenerativas e neuropsiquiátricas.
Os objetivos específicos são:
✓ Obter e caracterizar um extrato rico em compostos fenólicos de M. pulegium
destinado ao consumo humano;
✓ Avaliar o efeito do extrato em enzimas-alvo do sistema nervoso central
(MAO-A e colinesterases);
✓ Extrair os fosfolípidos da gema de ovo para preparar as formulações
lipídicas;
✓ Caracterizar as propriedades dos fitossomas em função da sua composição
lipídica e dos compostos fenólicos (interação composto fenólico-lípido, tamanho, potencial
Zeta, eficiência de encapsulamento e estabilidade).
26
Capítulo III – Secção experimental
Secção experimental
27
1) Reagentes e substâncias de referência
O ácido 5-O-cafeoilquínico, ácido ascórbico, ácido cafeico, ácido fosfatídico (PA),
ácido perclórico, ácido rosmarínico, ácido sulfúrico, AChE extraída de Electrophorus
electricus, albumina de soro bovino (BSA), BuChE extraída do soro de cavalo, cloreto de
magnésio hexahidratado, cloreto de S-butiriltiocolina (BTCCI), colesterol, clorgilina,
clorofórmio, PC, PE, PI, PS, fosfato de potássio monobásico, galantamina, meio Hepes,
hidroxitolueno butilado (BHT), hidróxido de sódio, iodeto de acetilcolina (ATCI), luteína,
quinuramina, recombinante humana da MAO-A (hMAO-A), sacarose, sulfato de sódio, terc-
butilmetil éter, trietilamina, triton TM X-100, trizma ® HCl e zeaxantina eram da Sigma-
Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O cloreto de sódio foi adquirido à José Manuel Gomes dos
Santos, LDA (Odivelas). A acetona foi obtida da VWR International S.A.S. (Fontenay-sous-
Bois, França). O ácido acético glacial, metanol e ácido fórmico foram da Chem-Lab NV
(Zedelgem, Bélgica). O molibdato de amónio foi adquirido à May & Baker Ltd. (Londres,
Reino Unido). O anidrido acético, acetronitrilo, ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) e
tartarato de potássio e sódio foram obtidos da Merck kGaA (Darmstadt, Alemanha). O ácido
5,5’-ditio-bis-(2-nitrobenzóico) (DTNB, reagente de Ellman) e etanol eram da Thermo
Fisher Scientific (Waltham, Massachusetts, EUA). O sulfato de cobre foi obtido da José M.
Vaz Pereira, LDA (Lisboa). O iodeto de potássio foi adquirido à LABKEM (Barcelona,
Espanha). O ácido ferúlico, luteolina 7-O-glucósido e apigenina 7-O-glucósido foram
obtidos de Extrasynthese (Genay, França).
2) Amostragem e preparação do extrato aquoso
A amostra (partes aéreas de M. pulegium) foi fornecida pela Direção Regional de
Agricultura entre o Douro e Minho (DRAEM). O material vegetal foi seco a 30 ºC durante
24 horas, pulverizado (< 910 µm) e armazenado, protegido da luz e da humidade.
De modo a mimetizar o extrato habitualmente preparado para consumo humano,
procedeu-se a uma decocção: foram adicionados 500 mL de água destilada a 3,00 g do
material vegetal, levando-se à fervura durante 20 minutos. O extrato obtido foi filtrado,
congelado a -20 ºC e posteriormente liofilizado num equipamento VirTis SP Scientific
Sentry 2.0. (Gardiner, NY, EUA).
Secção experimental
28
3) Determinação dos compostos fenólicos no extrato aquoso de M.
pulegium por HPLC-DAD
A análise cromatográfica do extrato aquoso foi realizada conforme descrito por
Ferreres e colaboradores. [116] Foi usada uma coluna Kinetex (5 μm, C18, 100 Å, 150 x 4,6
mm, Phenomenex, Macclesfield, Reino Unido). A fase móvel (fluxo 1 mL/min) consistiu em
dois eluentes: água-ácido fórmico (1%) (A) e acetonitrilo-ácido fórmico (1%) (B), sendo
aplicado o seguinte gradiente: início com 10% de B, 30% de B aos 20 minutos, 30% de B
até aos 25 minutos, 90% de B aos 35 minutos, 90% de B aos 40 minutos. Foram injetados
20 µL do extrato (10 mg/mL) numa unidade de HPLC-DAD (Gilson; Villiers le Bel, França).
Os dados obtidos foram processados com o software Unipoint System (Gilson Medical
Electronics, Villiers le Bel, França).
Os dados espetrais de todos os picos foram acumulados entre 240 e 400 nm e os
cromatogramas foram registados a 330 nm. A quantificação dos compostos fenólicos foi
feita a 320 e 350 nm para os ácidos fenólicos e flavonoides, respetivamente, relativamente
a curvas de calibração externas (Tabela 1). Uma vez que não estão disponíveis
comercialmente substâncias de referência para todos os compostos identificados, os
glucósidos, trimeros e tetrâmeros de ácido cafeico foram quantificados como ácido cafeico,
o glucósido de ácido ferúlico como ácido ferúlico, os derivados da luteolina e da apigenina
como luteolina 7-O-glucósido e apigenina 7-O-glucósido, respetivamente; os ácidos
cafeoilquínicos foram quantificados como ácido 5-O-cafeoilquínico e o ácido rosmarínico e
os seus derivados foram quantificados como ácido rosmarínico.
Para determinar os compostos fenólicos incorporados na formulação preparada após
diálise procedeu-se à sua rutura. Para isso a formulação foi homogeneizada durante 1
minuto e misturada com metanol e clorofórmio, na proporção 1:2:1
(formulação:metanol:clorofórmio; 1 mL volume final). A mistura foi depois centrifugada
(Refrigerated Microfuge SIGMA 1-14K, SIGMA Laborzentrifugen GmbH, Alemanha) a 1500
rpm, durante 10 minutos. Adicionaram-se 250 µL de clorofórmio e 250 µL de água ao
sobrenadante, e analisou-se a fase aquosa.
Secção experimental
29
Tabela 1. Regressão linear, limite de deteção e limite de quantificação para os compostos fenólicos
determinados.
Composto Regressão linear R2 Intervalo de
concentrações (mg/mL)
LD a (mg/mL)
LQ b (mg/mL)
Ácido 5-O-cafeoilquínico
y= 7,2×108 x - 3,1×106 0,994 1,2×10-1 – 1,5×10-2 4,3×10-4 1,3×10-3
Ácido cafeico
y= 1,5×109 x + 7,5×106 0,992 1,6×10-1 – 8,0×10-3 6,4×10-4 1,9×10-3
Ácido ferúlico
y= 1,4×109 x + 6,2×106 0,994 1,3×10-1 – 6,0×10-3 4,7×10-4 1,4×10-3
Ácido rosmarínico y= 8,2×108 x + 6,1×106 0,994 2,1×10-1 – 1,1×10-2 1,3×10-3 1,4×10-3
Luteolina 7-O-glucósido
y= 4,6×108 x + 2,0×106 0,999 1,2×10-1 – 6,0×10-3 1,1×10-4 3,4×10-4
Apigenina 7-O-glucósido
y= 8,5×108 x - 1,5×106 0,997 1,4×10-1 – 1,7×10-2 4,3×10-4 1,3×10-3
a Limite de deteção. b Limite de quantificação.
4) Inibição de enzimas isoladas
4.1) hMAO-A
A capacidade de inibição da hMAO-A foi avaliada com base em métodos descritos
com algumas modificações, por Dittmann e colaboradores e por Novaroli e colaboradores.
[54, 63] Foram testadas 5 concentrações do extrato aquoso de M. pulegium (100, 150, 200,
400 e 800 µg/mL). Como controlo positivo foi utilizada a clorgilina.
O meio reacional consistiu em 5 µL dos diferentes extratos ou 5 µL de tampão fosfato
0,1 M (pH 7,4), no caso do controlo negativo, aos quais foram adicionados 350 µL do
tampão fosfato e 20 µL de quinuramina a 3,75 mM. A mistura foi incubada a 37 ºC durante
10 minutos. Após este período adicionaram-se 125 µL de hMAO-A a 17 U/mL e incubou-
se a mistura a 37 ºC, durante 70 minutos.
A reação foi concluída com a adição de 75 µL de NaOH 2N e as absorvências foram
lidas a 314 nm utilizando um espetrofotómetro (Thermo Spectronic, Unicam Helios Alpha,
Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).
A inibição enzimática foi calculada de acordo com a seguinte equação:
% Inibição = [(AbsControlo - AbsAmostra) / AbsControlo] × 100
Secção experimental
30
O valor de IC50 foi calculado a partir de três ensaios independentes, realizados em
triplicado.
4.2) Colinesterases
A capacidade de inibição das colinesterases foi avaliada com base no método de
Ellman, como relatado anteriormente. [123] Foram usados três tampões diferentes: tampão
A, constituído por Tris-HCl 50 mM (pH 8), tampão B, constituído por Tris-HCl 50 mM (pH
8), contendo 0,1% de BSA, e tampão C, constituído por Tris-HCl 50 mM (pH 8), contendo
NaCl 0,1 M e MgCl2 . 6H2O 0,02 M.
A ACh é hidrolisada pela enzima ocorrendo libertação da tiocolina, que reage com o
reagente de Ellman (DTNB), produzindo 2-nitrobenzoato-5-mercaptotiocolina e 5-tio-2-
nitrobenzoato, detetado a 405 nm. A enzima liofilizada foi dissolvida em tampão A (1000
U/mL, solução de stock) e adicionalmente diluída em tampão B (concentração final de 0,44
U/mL).
A atividade de AChE foi medida utilizando um leitor de placas (Multiskan Ascent,
Thermo, Electron Corporation). A mistura reacional em cada poço continha 25 µL de ATCI
15 mM em água, 125 µL de DTNB 3 mM em tampão C, 50 µL de tampão B e 25 µL de
amostra dissolvida em tampão A. Procedeu-se à leitura em modo cinético durante 2
minutos, a 405 nm, sendo adicionados 25 µL de enzima 0,44 U/mL por poço.
A atividade inibitória foi calculada recorrendo ao software Ascent, versão 2.6 (Thermo
Labsystems Oy). O extrato de M. pulegium foi testado na gama de concentração de 93,75
– 6000 µg/mL. A percentagem de inibição foi calculada comparando o valor controlo com
o das diferentes concentrações testadas.
O ensaio para BuChE foi realizado do mesmo modo, mas usando como substrato 25
µL de BTCCI 15 mM em água e 25 µL de enzima com concentração final de 0,1 U/mL. A
gama de concentração do extrato utilizada foi 93,75 – 4500 µg/mL.
Para ambos os casos foi utilizada galantamina como controlo positivo.
O valor de IC50, em ambos os casos, foi calculado a partir de três ensaios
independentes, realizados em triplicado.
5) Extração lipídica a partir da gema de ovo
A extração de lípidos foi realizada a partir do ovo, após remoção da clara. Foram
utilizados 100 mL de uma mistura de solventes, composta por metanol:clorofórmio:água,
Secção experimental
31
na proporção de 1:2:2 (v:v:v). À mistura foi adicionado também o antioxidante BHT a
0,005%, dissolvido em metanol:clorofórmio na proporção de 1:1.
Inicialmente adicionou-se metanol à gema do ovo. Procedeu-se à homogeneização
com uma vareta de vidro, promovendo-se a desnaturação das proteínas. Seguidamente,
foi adicionado clorofórmio e a mistura foi submetida a agitação magnética (30 minutos à
temperatura ambiente). Posteriormente a mistura foi filtrada e colocada numa ampola de
decantação, à qual se adicionou a água para separação das fases. O processo foi repetido
até esgotamento.
A fase orgânica, contendo os lípidos totais, foi depois centrifugada (ROTOFIX 32A,
Hettich,Tuttlingen, Alemanha) a 4000 rpm durante 5 minutos, para remoção de alguma
proteína que ainda pudesse estar presente. Assim, a fase inferior de clorofórmio contendo
os lípidos da amostra foi recolhida e o seu solvente foi concentrado até 1/3 do seu volume.
Para maximizar a obtenção de fosfolípidos, minimizando a presença dos restantes
componentes (como o colesterol e outros lípidos indesejados), procedeu-se à precipitação
dos fosfolípidos, aproveitando a diferença de solubilidade dos diferentes componentes
lipídicos, pela adição de um volume 10 vezes superior de acetona a 4 °C. A mistura foi
deixada a -20 °C até ao dia segunte para aumentar a eficiência do processo.
Por fim, os cristais lipídicos foram ressuspendidos num volume conhecido de
clorofórmio para posterior quantificação. Depois de quantificados, o clorofórmio foi
evaporado sob uma corrente de azoto, evitando-se a sua oxidação. Os resíduos lipídicos
foram guardados em tubos de vidro a - 20 °C.
5.1) Quantificação de fosfato nos extratos lipídicos
Os fosfolípidos provenientes da extração lipídica foram quantificados pela
determinação do fosfato inorgânico libertado, após hidrólise ácida dos fosfolípidos,
conforme descrito por Bartlett e Lewis. [124] De acordo com este método, ocorre a conversão
do fosfato inorgânico num complexo de fosfomolibdato, de cor azul e quantificado por
espetrofotometria. [125-126]
Alíquotas de 5 µL de extrato lipídico dissolvidos em clorofórmio foram transferidas
para tubos de vidro. O solvente foi evaporado sob uma corrente de azoto e efetuou-se a
hidrólise dos fosfolípidos com a adição de 0,5 mL de ácido perclórico a 70%. Os tubos
foram cobertos com esferas de vidro e foram aquecidos a 180 ºC durante 2 horas.
De seguida adicionou-se a cada tubo 3,3 mL de água, 0,5 mL de molibdato de amónio
(0,25 g/10 mL) e 0,5 mL de ácido ascórbico (1 g/10 mL). Após agitação os tubos foram
tapados com esferas de vidro e incubados num banho de água à ebulição, durante 5-10
Secção experimental
32
minutos. As absorvências foram lidas a 800 nm, no leitor de placas (Multiskan ™ GO
Microplate Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A
concentração de fosfato inorgânico nas amostras foi calculada a partir da curva padrão de
KH2PO4 e os resultados expressos em µmol de lípido por mL de clorofórmio.
5.2) Quantificação de colesterol nos extratos lipídicos
O colesterol dos extratos lipídicos foi quantificado de acordo com o método de
Liebermann-Burchard, com algumas modificações. Este método baseia-se na reação do
colesterol e dos ésteres de colesterol com anidrido acético e ácido sulfúrico concentrado,
resultando na formação de um complexo corado de azul-esverdeado. [126-127]
Os extratos lipídicos secos foram dissolvidos em 0,1 mL de ácido acético. Em seguida
foram adicionados a cada tubo 2 mL de reagente Liebermann-Burchard (120 mL de
anidrido acético, 60 mL de ácido acético, 4 g Na2SO4; 20 mL de ácido sulfúrico) e as
misturas foram incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos.
A absorção dos padrões e das amostras foi determinada em leitor de placas
(Multiskan ™ GO Microplate Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA,
EUA), a 630 nm. O teor de colesterol nos extratos lipídicos foi calculado a partir da curva
padrão e expresso em µmol de colesterol por mL de clorofórmio.
5.3) Separação das classes de fosfolípidos do extrato lipídico
O método usado foi descrito por Monteiro-Cardoso e colaboradores. [126] Procedeu-
se à cromatografia em camada fina (CCF) do extrato lipídico e de padrões de referência
(PS, PE, PC, PA, PI) em placa de gel de sílica, usando como eluente uma mistura de
clorofórmio:etanol:água:trietilamina (35:30:7:35). A deteção foi feita à luz ultravioleta (λ=
365 nm), após a pulverização da placa com primulina (50 µg/100 ml de acetona:água,
80:20).
5.4) Determinação de carotenoides no extrato lipídico por HPLC-DAD
O extrato lipídico dissolvido em clorofórmio (500 µL) foi seco sob corrente de azoto.
Ao resíduo obtido foram adicionados 10 mL de acetona com 0,05% de BHT e a mistura foi
submetida a 15 minutos de sonicação, seguidos de 45 minutos de maceração, sob agitação
(600 rpm), à temperatura ambiente. O extrato obtido foi filtrado por membrana de 0,22 µm
Secção experimental
33
de poro e seco sobre uma corrente de azoto. O resíduo foi posteriormente redissolvido em
100 µL de etanol e mantido a -20 ºC.
A análise de carotenoides foi feita num sistema de HPLC-DAD (Gilson Medical
Electronics, França) de acordo com o procedimento anteriormente descrito por Oliveira e
colaboradores. [128] Foi usada uma coluna C30 YMC (5 μm, 250 × 4,6 mm i.d., YMC, Quioto,
Japão), à temperatura ambiente. A fase móvel (0,9 mL / min) consistiu em dois solventes:
metanol (A) e terc-butilmetil éter (B). A eluição começou com 95% de A e utilizou-se um
gradiente em que é obtido 70% de A aos 30 minutos, e 50% de A aos 50 min. O volume de
injeção foi de 20 µL. Os dados espetrais de todos os picos foram recolhidos no intervalo
de 200 a 700 nm, e os cromatogramas foram registados a 450 nm. Os dados foram
processados no software Unipoint System (Gilson Medical Electronics, Villiers le Bel,
França). Os compostos foram identificados através da comparação dos tempos de
retenção e dos espetros UV-Vis com os de padrões analisados nas mesmas condições
cromatográficas.
A quantificação dos carotenoides foi realizada utilizando curvas de calibração
externas resultantes de seis concentrações dos padrões disponíveis. A Tabela 2
demonstra a regressão linear, o R2, o intervalo de concentrações utilizadas para cada curva
de calibração, o limite de detecção e o limite de quantificação.
Tabela 2. Regressão linear, limite de deteção e limite de quantificação para os carotenoides determinados.
Composto Regressão linear R2 Intervalo de
concentrações (mg/mL)
LD a (mg/mL)
LQ b (mg/mL)
Luteína y = 260231 x + 24,534 0,999 5,9×10-5 – 1,9×10-3 4,6×10-5 1,4×10-4
Zeaxantina y = 83020,206 x + 1,584 1,000 3,9×10-5 – 1,3×10-3 1,4×10-5 4,2×10-5
a Limite de deteção. b Limite de quantificação.
6) Desenvolvimento de formulações com extrato aquoso de M. pulegium
incorporado
Para o desenvolvimento das formulações lipídicas foi usada uma alíquota de extrato
lipídico extraído da gema de ovo com uma quantidade conhecida de fosfolípidos, dissolvida
em clorofórmio num balão de fundo redondo. O solvente foi de seguida evaporado, ficando
o extrato lipídico fixado na parede do balão.
Secção experimental
34
Ao balão contendo o extrato lipídico seco foram adicionados 7 mL de extrato aquoso
de M. pulegium dissolvido em tampão de NaCl a 50 mM e KH2PO4 a 10 mM (pH = 7,2).
Utilizou-se um banho de ultrassons à temperatura de 40 ºC e foram aplicados movimentos
circulares e amplos ao balão, mantendo a sonicação durante 5 minutos. De seguida, foram
aplicados os mesmos movimentos durante 10 minutos, sem o ultrassons ligado e
vortexando esporadicamente o balão. Por fim, o balão foi sujeito a movimentos circulares
amplos durante 2 minutos, com ajuda de ultrassons.
Em seguida, 2 mL da suspensão de fitossomas foram colocados num tubo de vidro
que foi armazenado a 4 ºC. O volume restante foi sujeito a diálise durante a noite, usando
para isso uma membrana de diálise natural, colocada no tampão utilizado para a sua
preparação.
No dia seguinte as formulações foram recolhidas, tendo o extrato que não foi
incorporado ficado retido no tampão. Os fitossomas dialisados foram armazenados em
tubos de vidro rolhados a 4 ºC no frigorífico.
Parte do volume das suspensões de fitossomas dialisadas foi filtrado recorrendo a
um extrusor manual com um filtro com poro de 200 µm de diâmetro.
7) Eficiência de encapsulamento do extrato
A eficiência de encapsulamento do extrato aquoso de M. pulegium nos fitossomas foi
avaliada espetrofotometricamente em leitor de placas (Multiskan ™ GO Microplate
Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). Primeiramente foi
realizado um varrimento da absorvência entre 200 e 600 nm, com o extrato de M. pulegium
dissolvido em tampão, com suspensões de fitossomas antes e após diálise e com
formulações sem incorporação de extrato, de modo a conhecer o seu espetro de absorção
UV-Vis. Seguidamente foi verificado o intervalo de concentrações de extrato de M.
pulegium que obedece à linearidade da lei de Lambert-Beer, a 280, 330 e 350 nm,
comprimentos de onda correspondentes aos máximos de absorção dos compostos
fenólicos encontrados no extrato.
A eficiência de encapsulamento foi calculada através da seguinte fórmula:
Eficiência (%) = (1 - [ (Fitossoma330 – Fitossoma após diálise 330) / Fitossoma 330 ]) ×
100
Secção experimental
35
8) Estabilidade dos fitossomas dialisados
Para avaliar a estabilidade das suspensões de fitossomas dialisadas e armazenadas
a 4 ºC foi analisada a variação da absorvência a 610 nm em função do tempo, em leitor de
placas (Multiskan ™ GO Microplate Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific,
Waltham, MA, EUA). O grau de turvação, que é proporcional ao tamanho dos fitossomas
em suspensão, permite ver a modificação do seu tamanho, que pode ocorrer por fusão das
vesiculas nas formulações.
9) Potencial Zeta e tamanho da partícula nas suspensões de fitossomas
dialisadas
O tamanho de partícula foi determinado num analisador de DLS (Brookhaven
Instruments, Holtsville, NY, EUA). Todas as amostras foram diluídas (1:20) previamente
em água destilada. A determinação foi feita a 25 ºC, com um ângulo de luz fixa de 90 º.
Foram determinados o diâmetro hidrodinâmico médio e o índice de polidispersidade
correspondente à média de dez medições. As medidas foram realizadas em triplicado. Para
cada população encontrada foi calculada a média ponderada. O software utilizado para a
avaliação do tamanho da partícula foi o BIC Particle Sizing.
O potencial Zeta foi determinado através da medição da mobilidade eletroforética,
usando um analisador de potencial Zeta (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY, EUA). As
amostras foram diluídas (1:20) em água destilada e foram analisadas a 25 °C. O potencial
Zeta foi obtido calculando a média de seis corridas (cada uma com dez ciclos). As medidas
foram realizadas em triplicado. O software utilizado para a avaliação do potencial Zeta foi
o BIC PALS Zeta Potential Analyzer.
10) Homogeneizados de cérebro de rato e sinaptossomas
Os ratos Wistar machos foram mortos por deslocamento cervical e decapitados de
modo a sangrar rapidamente. Os cérebros foram retirados cuidadosamente e colocados
em copos de vidro contendo tampão de homogeneização (250 mM sacarose, 0,5 mM
EDTA, Hepes 10 mM (pH 7,4)), previamente arrefecido a 4 ºC. O tecido de
homogeneização (1 g de tecido em 10 mL de tampão), mantido entre 0 e 4 ºC, foi cortado
em pequenas frações, transferido para um homogeneizador de vidro do tipo “Potter-
Elvejhem” com um pistão de teflon e homogeneizado a 500 rotações/minuto, para
libertação do conteúdo intracelular. A estrutura cerebral foi assim desintegrada em
Secção experimental
36
fragmentos de células, células intactas e organelos intracelulares, designando-se
homogeneizado de cérebro.
O homogeneizado de cérebro foi centrifugado (ROTOFIX 32A, Hettich,Tuttlingen,
Alemanha) duas vezes, durante 10 minutos, a 2500 rpm. O sobrenadante foi dividido por
eppendorfs, e procedeu-se a nova centrifugação (Refrigerated Microfuge SIGMA 1-14K,
SIGMA Laborzentrifugen GmbH, Alemanha) a 11 500 g durante 15 minutos (duas vezes).
O pellet, constituído por sinaptossomas e mitocôndrias não sinápticas, foi ressuspendido
num volume mínimo (1 mL) de tampão.
10.1) Determinação de proteína
A concentração de proteína foi determinada pelo método colorimétrico do biureto,
que consiste na formação de um complexo violeta, resultante da reação das proteínas com
o CuSO4 em meio básico, que é quantificado espetrofotometricamente. [129]
O homogeneizado do tecido cerebral (100 µL) foi solubilizado em 100 µL de Triton x-
100 a 10%, perfazendo-se o volume de 2 mL com água desmineralizada. Seguidamente
foram adicionados 2 mL do reagente de biureto (CuSO4.5H2O 0,15%, NaKC4H4O6.4H2O
0,6%, NaOH 3 % e KI 0,1%). Ao fim de 15 minutos de incubação à temperatura ambiente
foi determinada a absorvência a 514 nm, num leitor de placas (Multiskan ™ GO Microplate
Spectrophotometer, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). A quantidade de
proteína foi calculada a partir de uma curva obtida com BSA (0-2,4 mg de proteína).
10.2) Inibição da MAO-A nos sinaptossomas
A capacidade de inibição da MAO-A foi avaliada através de um ensaio fluorimétrico
baseado no trabalho de Morinan e Garratt, com algumas alterações. [130] O meio reacional
continha sinaptossomas correspondentes a 0,2 mg de proteína, tampão fosfato 0,1 M (pH
7,4) e quinuramina (92 µM), num volume final de 1 mL. Procedeu-se a uma primeira
incubação sem quinuramina durante 20 minutos a 37 ºC, seguida de outra (60 minutos a
37 ºC) já com quinuramina. Após este período foram adicionados 300 µL de ácido
perclórico (0,4 M), para parar a reação, e as amostras foram centrifugadas durante 1 minuto
a 11 600 g (Refrigerated Microfuge SIGMA 1-14K, SIGMA Laborzentrifugen GmbH,
Alemanha).
Secção experimental
37
A 1 mL de sobrenadante foi adionado 1 mL de NaOH 2 N e de seguida foi
determinada a fluorescência (excitação a 315 nm, emissão a 380 nm) num leitor de placas
de fluorescência (Synergy H1 Multi-Mode Reader, BioTek, Winooski, EUA).
O extrato aquoso de M. pulegium, as suspensões de fitossomas após diálise e as de
fitossomas após diálise e extrusão foram adicionados antes da primeira incubação.
A clorgilina (0,00025 - 25,921 µM) foi o controlo positivo.
11) Análise estatística
O rendimento da extração aquosa de M. pulegium por decocção foi expresso em
média ± desvio-padrão e obtido a partir de 5 ensaios independentes. A quantificação dos
compostos fenólicos por HPLC-DAD foi obtida a partir de 3 ensaios independentes e os
resultados foram expressos em média ± desvio-padrão.
Para avaliação do efeito sobre as enzimas in vitro foram realizados 3 ensaios
independentes, cada um em triplicado e foi calculado o IC50 ± erro padrão da média.
A quantificação do fosfato e colesterol presente nos extratos lipídicos foi obtida a
partir de 4 ensaios independentes. O potencial Zeta, o tamanho de partícula e a eficiência
de encapsulamento das formulações lipídicas foram calculados a partir de 3 ensaios
independentes e os resultados foram expressos em média ± desvio-padrão.
A análise estatística dos resultados da inibição da MAO-A em homogeneizados de
cérebro de rato foi feita pelo teste one-way ANOVA, seguido de post hoc Bonferroni
(GraphPad Prism, versão 6.01) e os valores de IC50, obtidos a partir de 3 ensaios
independentes, em triplicado, foram expressos em média ± erro padrão da média. O nível
de significância foi fixado num valor de p < 0,05. Na análise estatística dos resultados do
diâmetro das partículas e o do índice de polidispersidade das formulações lipídicas foi
aplicado o teste t-student. O nível de significância foi fixado num valor de p < 0,05.
38
Capítulo IV – Resultados e discussão
Resultados e discussão
39
1) M. pulegium: estudo químico do extrato e sua bioatividade
1.1) Extração
O ser humano recorre quase diariamente à extração por solvente (água), na
preparação, por exemplo, de café ou de tisanas. [131] Os processos de decocção e de
infusão são amplamente utilizados na preparação de tisanas, permitindo a libertação dos
constituintes da planta com interesse para a saúde humana. [132]
Por outro lado, a extração com solventes orgânicos, embora muito usada
industrialmente, apresenta diversos problemas, pois esses solventes são tóxicos para o
organismo, além de ser difícil realizar a remoção de todo o solvente residual sem custos e
e gastos de energia elevados, estando ainda associados à formação de novos compostos
tóxicos. [131] Assim, a extração com água constitui uma boa alternativa: pode ser feita de
modo simples quotidianamente, sem grandes custos, além deste solvente ser desprovido
de toxicidade.
A opção pela preparação de um extrato aquoso de M. pulegium teve como base o
facto de ser usado para consumo humano. A Tabela 3 mostra o rendimento obtido na
preparação de extratos aquosos de partes aéreas de M. pulegium por decocção.
Tabela 3. Parâmetros relativos à preparação do extrato aquoso de M. pulegium por decocção.
Extrações Massa de planta
seca (g) Extrato aquoso
liofilizado (g) Rendimento (%)
Extração 1 3,04520 0,92720 30,45
Extração 2 3,00151 0,85543 28,45
Extração 3 3,00074 0,86868 28,95
Extração 4 3,00070 0,91280 30,41
Extração 5 3,00350 0,97586 32,49
Média ± DP a 3,01 ± 0,02 0,91 ± 0,05 30,15 ± 1,58 a DP: desvio-padrão.
1.2) Determinação dos compostos fenólicos do extrato aquoso de M.
pulegium por HPLC-DAD
Dado o potencial biológico dos compostos fenólicos, e para tentar estabelecer
relações entre composição e atividade, procedeu-se à caracterização química do extrato
aquoso de M. pulegium por HPLC-DAD, em fase reversa. A identificação dos compostos
fenólicos presentes no extrato foi feita com base na análise do seu comportamento
cromatográfico (Fig. 6) e espetro de ultravioleta (UV) (Tabela 4) e por comparação com o
Resultados e discussão
40
descrito anteriormente por Ferreres e colaboradores. [116] Foi assim possível confirmar a
existência maioritária de compostos com espetro de UV característico de derivados de
ácidos hidroxicinâmicos (1-4, 7-8, 11-15) (Tabela 4). Os compostos 1 e 3 são ésteres do
ácido cafeico com ácido quínico (Fig. 7). Os compostos 2, 7 e 12 são derivados do ácido
cafeico ligados a açúcares, (Fig. 7).
Figura 6. Cromatograma obtido por HPLC-DAD (330 nm) do extrato aquoso de M.pulegium. 1: Ácido 3-
cafeoilquínico; 2: Cafeoilpentósido; 3: Ácido 4-cafeoilquínico; 4: Ácido salvianólico H; 5: Luteolina-7-O-
glucuronato; 6: Luteolina-7-O-rutinósido; 7: Cafeoil-hexosilpentósido; 8: Isómero do ácido salvianólico E; 9:
Crisoeriol/diosmetina-7-O-rutinósido; 10: Apigenina-7-O-glucuronato; 11: Ácido rosmarínico; 12: Feruloil-
hexosilpentósido; 13: Ácido litospérmico; 14: Isómero do ácido salvianólico C; 15: Ácido feruloil-rosmarínico.
O composto 11, ácido rosmarínico (Fig. 7), é o composto maioritário do extrato
aquoso (Tabela 5), tal como descrito anteriormente por Ferreres e colaboradores. [116] O
composto 15 é um derivado do ácido rosmarínico e do ácido ferúlico (Fig. 7). Os compostos
4, 13 e 14, por sua vez, correspondem a trimeros e o composto 8 é um tetrâmero (Fig. 7).
89 10
0,0
0,6
1,2
1,8
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0 25,0 30,0 35,0 40,0 45,0
AU
Tempo (min.)
23
11
7
4
5
6
12
13
14
151
Resultados e discussão
41
Tabela 4. Espetro de UV e comportamento cromatográfico dos compostos identificados por HPLC-DAD no
extrato aquoso de M. pulegium e na solução proveniente da extração líquido-líquido dos fitossomas com extrato
incorporado após diálise.
Tempo de retenção (min.)
Composto Extrato Solução
após diálise UV (nm)
1 Ácido 3-cafeoilquínico 3,78 - 300sh, 328
2 Cafeoilpentósido 4,92 - 300sh, 328
3 Ácido 4-cafeoilquínico 6,05 - 300sh, 328
4 Ácido salvianólico H 12,61 31,97 252, 286, 314sh, 344
5 Luteolina-7-O-rutinósido 13,44 32,61 256, 266sh, 348
6 Luteolina-7-O- glucuronato 14,62 33,31 256, 266sh, 348
7 Cafeoil-hexosilpentósido 15,08 33,66 300sh, 328
8 Isómero do ácido salvianólico E 16,30 34,42 256, 284, 316, 348
9 Crisoeriol/diosmetina-7-O-rutinósido 17,61 34,99 256, 268sh, 348
10 Apigenina-7-O-glucuronato 18,14 35,47 267, 337
11 Ácido rosmarínico 18,38 35,68 300sh, 328
12 Feruloil-hexosilpentósido 20,00 36,78 300sh, 328
13 Ácido litospérmico 22,65 39,39 298sh, 325
14 Isómero do ácido salvianólico C 24,55 40,00 262, 320
15 Ácido feruloil-rosmarínico 26,04 41,05 300sh, 328
Também foi observada a presença de compostos com espetro de UV característico
de flavonoides (5-6, 9-10) (Tabela 4). Os compostos 5 e 6 demonstraram ser derivados da
luteolina (Fig. 7). O composto 9 é também um heterósido, cuja aglícona poderá
corresponder ao crisoeriol ou à diosmetina, conforme descrito na literatura. [116] O composto
10 é um derivado de apigenina conjugado com ácido glucurónico (Tabela 4; Fig. 7).
Todos estes compostos tinham sido descritos anteriormente por Ferreres e
colaboradores. [116]
Resultados e discussão
42
Figura 7. Estruturas químicas de alguns dos compostos fenólicos encontrados no extrato aquoso de M.
pulegium. 1: Ácido 3-cafeoilquínico; 2: Cafeoilpentósido; 3: Ácido 4-cafeoilquínico; 4: Ácido salvianólico H; 5:
Luteolina-7-O-rutinósido; 6: Luteolina-7-O-glucuronato; 7: Caffeoil-hexosilpentósido; 8: Isómero do ácido
salvianólico E; 10: Apigenina-7-O-glucuronato; 11: Ácido rosmarínico; 13: Ácido litospérmico; 14: Isómero do
ácido salvianólico C; 15: Ácido feruloil-rosmarínico.
Resultados e discussão
43
A soma dos compostos fenólicos identificados corresponde a 84,00 ± 4,28 mg/g de
extrato aquoso liofilizado (Tabela 5). Os ácidos fenólicos representam 88,19% e os
flavonoides apenas 11,71% desses compostos. O ácido rosmarínico (composto 11)
corresponde a 43,45% dos compostos quantificados. Relativamente aos flavonoides, o
composto em maior quantidade foi a luteolina-7-O-glucuronato (5,68% dos compostos
determinados).
Tabela 5. Composição fenólica do extrato aquoso de M. pulegium.
Composto mg/g de extrato liofilizadoa
1 Ácido 3-cafeoilquínico 1,57 ± 0,02
2 Cafeoilpentósido 1,10 ± 0,06
3 Ácido 4-cafeoilquínico 6,43 ± 0,15
4 Ácido salvianólico H 4,96 ± 0,09
5 Luteolina-7-O-rutinósido 2,44 ± 0,10
6 Luteolina-7-O-glucuronato 4,77 ± 0,41
7 Cafeoil-hexosilpentósido 13,54 ± 0,69
8 Isómero do ácido salvianólico E 1,00 ± 0,01
9 Crisoeriol/diosmetina-7-O-rutinósido 1,60 ± 0,07
10 Apigenina-7-O-glucuronato 1,03 ± 0,07
11 Ácido rosmarínico 36,50 ± 1,52
12 Feruloil-hexosilpentósido 7,30 ± 0,96
13 Ácido litospérmico 0,14 ± 0,02
14 Isómero do ácido salvianólico C 0,31 ± 0,07
15 Ácido feruloil-rosmarínico 1,31 ± 0,03
∑ 84,00 ± 4,28
a Os resultados são expressos como médias ± desvios padrão de três ensaios independentes.
No seguimento desta dissertação os resultados foram expressos em termos de
quantidade de polifenóis quantificados por HPLC-DAD, que correspondem
aproximadamente a 8,4% do extrato aquoso de M. pulegium.
Resultados e discussão
44
1.3) Inibição de enzimas do SNC
Conforme referido atrás, a procura de alternativas para o tratamento de doenças
neurodegenerativas e neuropsiquiátricas tem sido constante. Devido ao envolvimento de
enzimas como a MAO-A e as colinesterases no metabolismo de neurotransmissores
associados a essas doenças, estas são alvos terapêuticos de interesse. Assim, procedeu-
se ao estudo da capacidade do extrato aquoso de M. pulegium para inibir estas enzimas,
de modo a avaliar o seu potencial no combate dessas patologias.
1.3.1) Colinesterases
Relativamente à AChE o extrato demonstrou um efeito inibidor dependente da
concentração (Fig. 8A), com um IC50 correspondente a 197,02 ± 17,95 µg/mL de polifenóis
totais. A galantamina (controlo positivo) (Fig. 8B) revelou-se mais eficaz a inibir esta
enzima: o valor de IC50 obtido foi quase 94 vezes inferior ao encontrado para o extrato.
Estes resultados sugerem que o extrato aquoso de M. pulegium não tem grande
capacidade para inibir a AChE.
Figura 8. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium (A) e do controlo positivo (B) sobre a AChE.
Tal como observado para a AChE, o extrato também se revelou capaz de inibir a
BuChE (Fig. 9A). No entanto, o valor de IC50 encontrado (255,92 ± 16,19 µg/mL de
polifenóis totais) foi mais elevado, apontado para maior seletividade do extrato para a
AChE. De qualquer modo, tanto quanto sabemos foi a primeira vez que o extrato aquoso
de M. pulegium foi testado contra a BuChE. A galantamina foi igualmente testada contra a
BuChE (Fig. 9B), revelando-se cerca de 39 vezes mais eficaz do que o extrato (IC50 = 6,61
± 0,29 µg/mL).
Resultados e discussão
45
Figura 9. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium (A) e do controlo positivo (B) sobre a BuChE.
Mata e colaboradores [72] e Vladimir-Knežević e colaboradores [133] já haviam testado
um extrato aquoso de M. pulegium tendo observado um efeito reduzido sobre a AChE.
Adicionalmente, Vladimir-Knežević e colaboradores estudaram a ação de alguns
compostos fenólicos encontrados nesse extrato e de seus derivados, tendo verificado que
o ácido rosmarínico, o ácido cafeico, o ácido clorogénico e o ácido ferúlico tinham um maior
potencial de inibição da AChE. [133]
De Mello Andrade e colaboradores [121] estudaram a capacidade de inibição do ácido
rosmarínico relativamente às duas colinesterases, tendo encontrado valores de IC50
superiores a 300 mM para ambas. Estes valores sugerem que o ácido rosmarínico,
composto maioritário do extrato aqui testado não será muito promissor relativamente a
estas enzimas. No entanto, a bibliografia é controversa. Por exemplo, num outro estudo,
realizado por Orhan I e colaboradores, o ácido rosmarínico, por comparação com a
galantamina, demonstrou baixa capacidade inibitória para a AChE, mas forte para a
BuChE, [134] enquanto Gülçin İ e colaboradores indicaram que o ácido rosmarínico é muito
eficaz na inibição da AChE, tendo uma atividade interessante relativamente à BuChE. [122]
De qualquer modo, os compostos fenólicos encontrados no extrato aquoso de M.
pulegium testado nesta dissertação poderão contribuir, pelo menos em parte, para o seu
efeito sobre as colinesterases.
1.3.2) hMAO-A
O extrato aquoso de M. pulegium foi capaz de inibir a hMAO-A, de forma dependente
da concentração, tendo-se encontrado um valor de IC50 de 20,11 ± 0,86 µg/mL de polifenóis
totais (Fig. 10A). Neste ensaio o controlo positivo foi a clorgilina (IC50 = 10,79 ± 1,50 µg/mL)
(Fig. 10B).
Resultados e discussão
46
Figura 10. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium (A) e do controlo positivo (B) sobre a hMAO-A.
O potencial de inibição da hMAO-A do ácido rosmarínico, composto maioritário do
extrato, já se encontra descrito: [121] o valor de IC50 encontrado na literatura (50,1 ± 1,2 µM)
parece apontar para algum grau de seletividade para esta enzima, tendo revelado um maior
efeito inibitório da hMAO-A comparativamente a compostos fenólicos de estrutura
semelhante. O ácido rosmarínico mostrou atuar como inibidor reversível da enzima. Este
modo de ação tem vindo a ser procurado, devido ao facto de a inibição irreversível (como
acontece com a clorgilina) por vezes resultar em reações cardiovasculares graves após
ingestões de alimentos contendo tiramina. [135]
Também alguns dos flavonoides encontrados no extrato aquoso analisado nesta
dissertação já demonstraram inibir esta enzima: com a apigenina-7-O-glucuronato e a
luteolina-7-O-glucuronato foram obtidos valores de IC50 de 1,0-6,5 μM [136,137] e 118,6 μM,
respetivamente. [138] Num trabalho anterior verificou-se que a capacidade para inibir a
atividade da MAO-A segue a ordem flavona, flavonol e glicósidos de flavonas,
demonstrando-se ainda que esta capacidade diminui com a adição de grupos hidroxilo no
anel B ou com a introdução de uma glucose ou ácido glucurónico na posição 7-OH do
esqueleto da flavona. [139]
Assim, o efeito do extrato aquoso de M. pulegium na atividade da MAO-A será
resultante quer da ação dos ácidos fenólicos, quer dos flavonoides nele presentes.
Tendo em consideração os controlos positivos usados, os resultados obtidos na
inibição das três enzimas pelo extrato aquoso de M. pulegium apontavam para um efeito
mais interessante sobre a MAO-A. Assim, os estudos seguintes foram direcionados para a
possível utilização deste extrato em doenças do SNC associadas a esta enzima.
Resultados e discussão
47
2) Desenvolvimento e caracterização de uma formulação lipídica para o
transporte dos compostos bioativos do extrato aquoso de M. pulegium
2.1) A gema do ovo: fonte de fosfatidilcolinas
A escolha do biorrecurso para obtenção dos fosfolípidos que suportam a formulação
lipídica é uma etapa inicial importante, dado que condiciona a sustentabilidade do recurso,
influencia a viabilidade económica do processo de extração e o sucesso terapêutico da
formulação final. A PC, fosfolípido maioritário das membranas biológicas das células
animais, tem sido o fosfolípido mais usado para preparar fitossomas. [98] De facto, os ovos
de galinha são um recurso renovável e acessível e a suas gemas contêm elevado teor de
PC; além de fáceis de obter, apresentam uma diversidade de espécies fosfolipídicas que
permite a preparação de lipossomas com membranas fluidas à temperatura ambiente. [98,
107-108] Assim, a gema do ovo foi o recurso escolhido para a obtenção dos lípidos utilizados
na formulação.
2.1.1) Quantificação de fosfolípidos e colesterol nos extratos
lipídicos provenientes da gema do ovo
De acordo com literatura, [140] a gema do ovo é rica em lípidos sob a forma de
triacilglicerídeos, fosfolípidos e colesterol. Os triacilglicerídeos representam 61-72%, os
fosfolípidos 25-36% e os restantes lípidos, incluindo colesterol, ésteres de colesterol e
ácidos gordos livres, representam conteúdos inferiores a 10%. Assim, implementou-se um
processo de extração para maximizar a obtenção de fosfolípidos (PC em particular)
minimizando a presença dos restantes componentes, aproveitando as diferenças de
solubilidade dos diversos componentes lipídicos em acetona arrefecida a 4 ºC. Os
resultados obtidos em quatro extrações com amostras independentes estão apresentados
na Tabela 6.
Resultados e discussão
48
Tabela 6. Parâmetros relativos à extração dos fosfolípidos da gema de ovo.
Extração dos fosfolípidos da gema de ovo
Ensaio 1 Ensaio 2 Ensaio 3 Ensaio 4
Gema de ovo (base
fresca) (g) 13,89 34,47 35,58 39,77
Extrato lipídico final
Fosfolípidos (µmol) 617,50 2573,44 1065,35 2068,60
Colesterol total (µmol) 49,63 81,82 82,55 74,34
Colesterol / fosfolípidos
(razão molar) 0,080 0,032 0,078 0,036
Percentagem molar de
colesterol (%) 7,43 3,08 7,19 3,47
Fosfolípidos/ massa de
gema (µmol/g) 44,46 74,66 29,94 52,01
Considerando os dados da Tabela 6, o processo de extração apresentou uma grande
variabilidade, como ilustrado pelos valores de percentagem molar do colesterol, a qual
variou entre 3,08 – 7,43%. Assim, antes de utilizar estes extratos lipídicos para a
preparação das formulações (fitossomas) o seu conteúdo em colesterol foi ajustado, pela
adição de colesterol puro, para uma percentagem molar de 7,5%. Assim, os fitossomas
foram preparados com uma proporção fosfolípido:colesterol de 92,5:7,5 (% molar).
Para avaliar a pureza do extrato lipídico obtido, os fosfolípidos foram separados por
classes. A Figura 11 mostra a separação por CCF dos lípidos de dois dos extratos, após
revelação por primulina e irradiação com luz ultravioleta. Os resultados indicam que as
fosfatidilcolinas são os lípidos maioritários do extrato lipídico obtido. No entanto, é possível
detetar quantidades vestigiais de outras classes de fosfolípidos ou lípidos não polares (e.g.
colesterol) com maior afinidade para a fase móvel.
Resultados e discussão
49
Figura 11. Identificação das diferentes classes de fosfolípidos por CCF. A1 e A2 correspondem a diferentes
amostras de extratos lipídicos extraídos da gema de ovo. PC corresponde ao padrão de fosfatidilcolina.
2.1.2) Deteção e identificação de carotenoides no extrato lipídico
por HPLC-DAD
Os carotenoides são os pigmentos responsáveis pela cor amarelo-laranja tipica das
gemas dos ovos, [141] estando a sua presença dependente da dieta alimentar das aves. [142]
Vários carotenoides, principalmente a zeaxantina, luteína, criptoxantina e o β-caroteno,
foram identificados na gema do ovo. No entanto, a luteína e a zeaxantina são usualmente
detetados em maiores quantidades. [143]
Visto que os extratos lipídicos finais, obtidos da gema de ovo, apresentavam uma
ténue tonalidade amarelo-laranja fomos averiguar a presença de carotenoides por HPLC-
DAD. A Figura 12 mostra o perfil de carotenoides do extrato lipídico obtido das gemas de
ovo. Os resultados indicam que o extrato lipídico contém quantidades vestigiais de luteína
e zeaxantina. A utilização de curvas de calibração externas construídas com as duas
susbtâncias de referência permitiu concluir que os referidos carotenoides se encontravam
em quantidade inferior à do limite de quantificação. Assim, o processo de extração não
permitiu eliminar por completo a luteína e a zeaxantina presentes na gema do ovo,
deixando-os em concentrações vestigiais. Dado que os carotenoides são bioativos em
células animais em concentrações muito superiores (várias ordens de grandeza) às
encontradas no extrato lipídico, [140] a presença em concentrações vestigiais não deverá
influenciar significativamente a bioatividade dos fitossomas utilizados no presente trabalho.
A1 A2 PC
Resultados e discussão
50
Figura 12. Perfil de carotenoides do extrato lipídico obtido da gema de ovo (preto) e respetivos padrões (luteína
0,02 mg/mL (laranja) e zeaxantina 0,02 mg/mL (azul)) por HPLC-DAD.
2.2) Eficiência de encapsulamento do extrato nos fitossomas após
diálise
A eficiência de encapsulamento dos compostos presentes no extrato aquoso de M.
pulegium nos fitossomas foi avaliada por espetroscopia de absorção na região do UV-Vis.
A Figura 13 mostra os espetros de absorção do extrato aquoso de M. pulegium na
concentração de 0,3125 mg/mL em solução tampão (NaCl 50 mM, KH2PO4 10 mM, pH 7,2)
(azul), dos fitossomas preparados em solução tampão suplementadas com 0,3125 mg/mL
de extrato aquoso de M. pulegium antes (laranja) e após diálise (cinzento) e de formulações
lipídicas equivalentes preparadas na ausência do extrato (amarelo). Os dados da Figura
13 mostram que soluções aquosas de extrato aquoso de M. pulegium apresentam, pelo
menos, quatro bandas de absorção: uma de grande intensidade com máximo a 214 nm,
outra detetada como um ombro próximo de 250 nm, uma terceira banda de absorção com
máximo a 287 nm e uma quarta banda que se estende até aos 370 nm e tem máximo de
absorção a 323 nm. A formulação não dialisada apresenta, no essencial, as mesmas
bandas detetadas no espetro do extrato aquoso de M. pulegium. Todavia, a intensidade de
cada uma das bandas é superior, sugerindo que os lipossomas, por si só, também
absorvem nesta região, como detetado no espetro (amarelo). A diálise reduziu
significativamente a intensidade de todas as bandas de absorção, indicando que os
compostos do extrato aquoso de M. pulegium não encapsulados foram excluídos do
0,0
0,1
0,2
0,3
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
AU
Tempo (min.)
Resultados e discussão
51
sistema. Com exceção da banda de absorção com máximo a 214 nm, as bandas de
absorção tornaram-se menos definidas, mas não sofreram desvios significativos,
permitindo utilizar esta metodologia para avaliar a eficiência de encapsulamento.
Figura 13. Espetros de absorção UV-Vis do extrato aquoso de M. pulegium (azul), dos fitossomas antes da
diálise (laranja), dos fitossomas após diálise (cinzento) e da formulação sem incorporação de extrato (amarelo).
Para as formulações com extrato incorporado e para o extrato puro foi utilizada uma concentração final de
0,3125 mg/mL de extrato no poço.
Os compostos fenólicos possuem máximos de absorção a comprimentos onda
específicos, conforme a classe à qual pertencem. Por exemplo, as catequinas normalmente
possuem máximos de absorção a cerca de 280 nm e não absorvem a 330 e 350 nm; os
derivados hidroxicinâmicos têm um máximo característico entre 310 e 330 nm,
determinando-se normalmente a 330 nm, enquanto os flavonoides possuem máximo de
absorção entre 340 e 370, sendo quantificados usualmente a 350 nm. [144]
A Figura 14 mostra a variação da absorvência a 280, 330, e 350 nm, comprimentos
de onda correspondentes a máximos de absorção característicos dos compostos fenólicos
de soluções aquosas preparadas com diferentes concentrações de extrato aquoso de M.
pulegium. Os dados revelam que, para estes comprimentos de onda, a absorvência
aumenta linearmente com a concentração de extrato, pelo que é um parâmetro com
potencial para ser utilizado na avaliação da eficiência de encapsulamento. Todavia,
selecionou-se a absorvência a 330 nm por corresponder a um pico detetável na formulação
0,000
0,500
1,000
1,500
2,000
2,500
3,000
200 250 300 350 400 450
Ab
so
rvê
nc
ia
Comprimento de onda (nm)
280 330 350
Resultados e discussão
52
de fitossomas após diálise, ter maior intensidade e um menor contributo dos lípidos que
formam o lipossoma.
Figura 14. Absorvência em função da concentração de extrato de M. pulegium registada a 280 (azul), 330
(laranja) e 350 nm (cinzento).
A eficiência de encapsulamento de compostos solúveis no tampão aquoso onde se
formam os lipossomas é afetada por diversos parâmetros sucetíveis de manipulação,
incluindo a concentração de compostos bioativos e a quantidade de lípidos, e parâmetros
inerentes ao processo de preparação dos lipossomas, como a temperatura, o procedimento
de preparação do filme lipídico e de hidratação dos fosfolípidos. No presente trabalho
fixaram-se os parâmetros inerentes à preparação dos lipossomas e estudou-se o efeito da
variação da razão concentração molar de lípidos/concentração de extrato aquoso de M.
pulegium.
A Figura 15 mostra a eficiência de encapsulamento (%) em função do aumento da
concentração de fosfolípidos, mantendo a concentração de extrato aquoso de M. pulegium
em 1 mg/mL. Os dados da figura revelam que a eficiência de encapsulamento cresce com
o aumento da concentração de lípidos e que os resultados experimentais podem ser
descritos convenientemente por uma função logarítmica (R2 = 0,9104). De facto, a
concentração de fosfolípidos afeta de um modo significativo a eficiência de
encapsulamento, sendo possível encapsular até 75,22 ± 6,27% dos compostos bioativos
presentes numa solução de extrato aquoso de M. pulegium com a concentração de 1
mg/mL.
y = 4,34x + 0,0301R² = 0,9987
y = 4,8158x + 0,0313R² = 0,9978
y = 2,8846x + 0,0165R² = 0,9991
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800
Ab
so
rvê
cia
[C] extrato (mg/mL)
Resultados e discussão
53
Figura 15. Eficiência de encapsulamento (%) dos fitossomas avaliada após diálise, em função da concentração
fosfolípidos, mantendo a concentração de extrato de M. pulegium em 1 mg/mL.
A variação da eficiência de encapsulamento em função da concentração de extrato
aquoso de M. pulegium, mantendo a concentração de fosfolípidos em 0,5 mM ou 2,5 mM,
é apresentada na Figura 16. Para ambas as concentrações de fosfolípidos, a eficiência
decresceu com o aumento da concentração de extrato aquoso de M. pulegium e os
resultados podem ser convenientemente descritos por uma função logarítmica (0,5 mM, R2
=0,8373; 2,5 mM R2 =0,9634). Adicionalmente, a redução da eficiência de encapsulamento
em função da concentração de extrato aquoso de M. pulegium é mais acentuada nas
formulações preparadas na presença de 2,5 mM de fosfolípidos, decaindo de 71,67 ±
8,24% para 22,84 ± 1,73% quando a concentração de extrato aquoso de M. pulegium
aumenta de 0,5 para 10 mg/mL.
Resultados e discussão
54
Figura 16. Eficiência de encapsulamento (%) dos fitossomas avaliada após diálise, em função da concentração
de extrato aquoso de M. pulegium, mantendo a concentração de fosfolípidos em 0,5 e 2,5 mM.
Combinando os resultados das Figuras 15 e 16 é possível determinar qual a razão
concentração molar de lípidos/concentração de extrato de M. pulegium que permite
maximizar a eficiência de encapsulamento, minimizando a quantidade de recursos
utilizados (i.e., quantidade de extrato aquoso de M. pulegium não encapsulado e de lípido
utilizado na preparação de lipossomas). Neste sentido, selecionaram-se as concentrações
de 2,5 mM de fosfolípidos e de 1 mg/mL de extrato aquoso de M. pulegium para preparar
os fitossomas utilizados nos restantes ensaios. Nestas condições a eficiência é de 54,61 ±
6,25%.
2.3) Interação dos compostos bioativos do extrato aquoso de M.
pulegium com os fosfolípidos membranares: Avaliação por
espetroscopia de fluorescência
A interação dos compostos bioativos presentes no extrato aquoso de M. pulegium
com a bicamada lipídica resultante da hidratação, em solução tampão (NaCl 50 mM,
KH2PO4 10 mM, pH 7,2), dos fosfolípidos obtidos da gema do ovo foi avaliada por
espetroscopia de fluorescência. A Figura 17 mostra os espetros de emissão de
fluorescência, fixando a excitação no comprimento de onda de 391 nm, do extrato aquoso
de M. pulegium a 0, 125 mg/mL em solução tampão (cinzento) e dos fitossomas (62,5 µM
em fosfolípidos) preparados na solução tampão suplementada com 0,125 mg/mL de extrato
M. pulegium antes (azul) e após (laranja) diálise.
Resultados e discussão
55
Os dados da Figura 17 mostram que a solução de extrato aquoso de M. pulegium
emite fluorescência numa larga região do espetro vísivel, de 420 até 640 nm, com um
ombro na região do azul (454 nm) e um máximo na região do verde (515 nm), sugerindo a
presença de vários fluoróforos.
A solução contendo os fitossomas não dialisados apresenta uma diminuição muito
significativa da intensidade de fluorescência na região do verde e o máximo deslocado para
o azul, dado que ocorre a 505 nm. Adicionalmente, a emissão de fluorescência no azul
surge como um pico bem definido com máximo a 450 nm. Dado que esta solução de
fitossomas contém os compostos fluorescentes em concentração igual à da solução de
extrato aquoso de M. pulegium sem a presença de fosfolípidos, então o processo de
encapsulamento será o responsável pelas alterações no espetro de fluorescência. O desvio
para a região do azul do pico de maior intensidade de fluorescência sugere que os
compostos responsáveis por esta emissão estão num ambiente mais hidrofóbico, como a
bicamada lipídica. [145] A redução da intensidade de fluorescência na região do verde indica
que o encapsulamento promoveu um fenómeno de supressão de fluorescência. A
supressão de fluorescência depende da sexta potência da distância entre o fluoróforo e o
seu supressor, [145] estando relacionada com a formação de complexos (fluoróforo-
supressor) ou a ocorrência de choques moleculares durante o tempo de vida do estado
excitado do fluoróforo (da ordem de alguns nano-segundos). [145] Assim, o processo de
encapsulamento confinou os compostos fluorescentes presentes no extrato aquoso de M.
pulegium em pequenos volumes da solução/suspensão, eventualmente, pela própria
bicamada lipídica (interior hidrofóbico ou a sua superfície polar). A diálise remove da
solução os compostos do extrato aquoso de M. pulegium que não foram encapsulados,
pelo que o espetro da solução/suspensão de fitossomas dialisados deve evidenciar a
interação entre os compostos bioativos de M. pulegium e a bicamada fosfolipídica. De
facto, a intensidade de fluorescência da solução/suspensão dialisada é bastante inferior,
como evidenciado pela redução da fluorescência em ambos os picos de emissão no azul
e no verde. Adicionalmente, surge um novo pico de fluorescência na região do vermelho,
com máximo a 678 nm, o que implica um deslocamento de Stokes de 278 nm.
Deslocamentos de Stokes grandes estão normalmente associados a processos de
transferência de energia por ressonância; i.e., uma molécula com propriedades de
fluorescência, designada por doadora, absorve a luz de excitação e transfere-a, sem
emissão, para outra molécula também com propriedades de fluorescência, designada por
recetora, a qual emite luz a comprimentos de onda muito superiores aos da primeira
molécula. [145] Tal como o processo de supressão de fluorescência, também a transferência
de energia por ressonância exige grande proximidade entre os fluoróforos intervenientes.
Resultados e discussão
56
[145] Assim, este novo pico de emissão de fluorescência na região do vermelho suporta a
hipótese de alguns compostos do extrato aquoso do M. pulegium serem incorporados na
membrana fosfolipídica.
Figura 17. Espetros de emissão de fluorescência do extrato aquoso de M. pulegium (cinzento), da
solução/suspensão de fitossomas (62.5 µM em fosfolípidos) antes (azul) e após diálise (laranja), fixando o
comprimento de onda de excitação em 391 nm. Em todas as situações a concentração de extrato aquoso de
M. pulegium foi de 0,125 mg/mL.
Com objetivo de mostrar que ocorre uma interação preferencial entre os compostos
fluorescentes presentes no extrato aquoso de M. pulegium e os fosfolípidos da bicamada,
procedeu-se à normalização dos espetros de emissão de fluorescência obtidos do extrato
aquoso de M. pulegium (solução aquosa 0,125 mg/mL) e de fitossomas após diálise,
preparados com soluções de 0,125 mg/mL em extrato aquoso de M. pulegium e com duas
concentrações de fosfolípidos distintas, 62,5 µM (Figura 18A) e 1,25 mM (Figura 18B), no
máximo de emissão da solução/suspensão de fitossomas após diálise.
Os dados da Figura 18 mostram que a solução/suspensão dos fitossomas apresenta
emissão a 454 nm (laranja) com uma intensidade relativa muito superior à da solução dos
extrato de M. pulegium (azul). Adicionalmente, esta diferença aumenta com o aumento da
concentração de fosfolípidos (0,39 para 62,5 µM de fosfolípido; 0,52 para 1,25 mM de
fosfolípido) (comparação entre a Figura 18A e 18B). Estes dados indicam que pelo menos
os compostos responsáveis pela fluorescência a 454 nm interagem fortemente com os
fosfolípidos. A adição de detergente (Triton TM X-100; 0,05 mg/mL no poço) aos fitossomas
(Figura 18, cinzento) promove a destruição das bicamadas levando à saída dos compostos
encapsulados na fase aquosa dos lipossomas, criando em alternativa estruturas micelares
contendo as moléculas de detergente juntamente com fosfolípidos. As micelas, tal como
Resultados e discussão
57
os lipossomas, têm uma região apolar e uma região polar. Na presença de detergente, o
pico a 454 nm aumenta de intensidade, tanto mais quanto menor a concentração de
fosfolípidos utilizada para preparar os fitossomas. Adicionalmente, a adição de detergente
não altera o pico de fluorescência na região do vermelho, reforçando a hipótese deste
resultar de um processo de transferência de energia por ressonância confinado às
moléculas localizadas na região hidrofóbica das estruturas supra-moleculares lipídicas.
Portanto, os compostos do extrato aquoso de M. pulegium com emissão de fluorescência
a 454 e 678 nm preferem a fase lipídica à fase aquosa, pelo que no fitossoma deverão ser
parte integrante da própria membrana.
Figura 18. Espetros de emissão de fluorescência, fixando o comprimento de onda de excitação em 391 nm,
normalizados pelo valor da intensidade de florescência a 505 nm. Extrato aquoso de M. pulegium (azul),
fitossomas após diálise antes (laranja) e depois da adição de detergente (0,05 mg/mL) (cinzento), preparados
com 62,5 µM (A) e 1,25 mM (B) de fosfolípidos em solução contendo 0,125 mg/mL de extrato.
Resultados e discussão
58
2.4) Análise qualitativa por HPLC-DAD dos compostos polifenólicos
encapsulados nos fitossomas após diálise
Os compostos fenólicos presentes no extrato aquoso de M. pulegium encapsulado
foram identificados por HPLC-DAD e a eficiência de encapsulamento avaliada por
espetroscopia UV-Visível. Todavia, o estudo das formulações por fluorescência, descrito
acima, sugere a possibilidade de o processo de encapsulamento ser seletivo como
resultado da interação preferencial de alguns polifenóis com os fosfolípidos membranares.
Assim, desenhou-se um procedimento experimental para tentar esclarecer a extensão
dessa interação e identificar os compostos fenólicos envolvidos. Para alcançar este
objetivo, os fitossomas dialisados foram submetidos a um processo de extração com uma
mistura de solventes (1 ml de fase aquosa (contendo os fitossomas): 2 ml de metanol: 1 ml
de clorofórmio). Nestas proporções forma-se uma fase única e promove-se a rutura dos
lipossomas. De seguida promoveu-se a separação de fases por adição de volumes iguais
de água e de clorofórmio; a fase aquosa foi recolhida e os compostos fenólicos nela
presentes foram analisados por HPLC-DAD (Fig. 19). O estudo cromatográfico revelou dois
aspetos curiosos: i) a afinidade dos compostos fenólicos para a fase estacionária (coluna
Kinetex (5 μm, C18, 100 Å, 150 x 4,6 mm)) aumenta de um modo significativo, como
demonstrado pelos tempos de retenção significativamente superiores; ii) com exceção dos
compostos mais polares (compostos 1, 2 e 3, respetivamente, ácido 3-cafeoilquínico,
cafeoilpentósido e ácido 4-cafeoilquínico), os compostos fenólicos presentes no extrato
aquoso de M. pulegium são também detetatos na fase aquosa resultante da rutura dos
fitossomas dialisados.
O facto de os compostos fenólicos serem detetados nos cromatogramas com tempos
de retenção significativamente superiores (entre 15 e 20 minutos) sugere que ocorre uma
interação entre estes e os fosfolípidos. Esta interação deve ser suficientemente forte para
arrastar para a fase aquosa fosfolípidos que na ausência dos compostos fenólicos ficariam
na fase clorofórmica. Assim, devem-se formar complexos do tipo fosfolípido-composto
fenólico, os quais são menos polares do que os compostos fenólicos originais, pelo que
apresentam maior afinidade para a fase estacionária da coluna de HPLC e,
consequentemente, tempos de retenção significativamente superiores aos dos compostos
fenólicos em soluções aquosas na ausência de fosfolípidos. Adicionalmente, o processo
de encapsulamento também deve excluir, total ou parcialmente, dos fitossomas os
compostos fenólicos mais polares, dado que o ácido 3-cafeoilquínico, o cafeoilpentósido e
o ácido 4-cafeoilquínico, não foram detetados no cromatograma da Figura 19, para além
Resultados e discussão
59
de que o composto seguinte com maior polaridade, o ácido salvianólico H (composto 4),
sofre uma redução da sua abundância relativa de aproximadamente 7,8%.
Figura 19. Cromatograma obtido por HPLC-DAD (330 nm) dos compostos polifenólicos incorporados pelos
fitossomas após diálise. 4: Ácido salvianólico H; 5: Luteolina-7-O-glucuronato; 6: Luteolina-7-O-rutinósido; 7:
Cafeoil-hexosilpentósido; 8: Isómero do ácido salvianólico E; 9: Crisoeriol/diosmetina-7-O-rutinósido; 10:
Apigenina-7-O-glucuronato; 11: Ácido rosmarínico; 12: Feruloil-hexosilpentósido; 13: Ácido litospérmico; 14:
Isómero do ácido salvianólico C; 15: Ácido feruloil-rosmarínico.
2.5) Estabilidade dos fitossomas dialisados, avaliada por UV-Vis
A Figura 20 mostra a variação da absorvência, a 610 nm, de formulações de
fitossomas dialisadas em função do tempo. Este procedimento permite avaliar, de um modo
rápido e barato, a estabilidade das formulações ao longo do tempo, dado que os
componentes em solução não absorvem a este comprimento de onda e os valores de
absorvência refletem a turvação. O grau de turvação, para uma dada temperatura e uma
determinada quantidade de lípido, é proporcional ao tamanho dos fitossomas em
suspensão. As diferentes formulações foram preparadas com diferentes concentrações de
fosfolípidos mantendo-se a concentração de extrato aquoso de M. pulegium (1 mg/mL). Os
resultados da Figura 20 mostram que a turbidez das formulações é tanto maior quanto
maior a concentração de fosfolípidos e que não sofre alterações significativas durante 44
dias de armazenamento à temperatura de 4 ºC. Portanto, os fitossomas apresentam uma
boa estabilidade aparente, não sofrendo processos de fusão significativos, os quais
aumentariam o seu tamanho e, consequentemente, a turbidez da suspensão.
5
6
8
0,00
0,20
0,40
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
AU
Tempo (min.)
4
7
9
10
11
12
13 1415
Resultados e discussão
60
Figura 20. Variação da turbidez, avaliada pela absorvência a 610 nm, de formulações de fitossomas dialisados
em função do tempo. As formulações foram preparadas em solução tampão suplementada com 1 mg/mL de
extrato aquoso de M. pulegium com diferentes concentrações de fosfolípidos, 0,5 mM (azul escuro), 1 mM
(laranja), 2,5 mM (cinzento), 5 mM (amarelo) e 10 mM (azul claro).
2.6) Caracterização dos fitossomas: potencial Zeta e tamanho de
partícula
O tamanho e carga superficial dos fitossomas são parâmetros que influenciam a sua
estabilidade no sistema circulatório e a sua biodistribuição, incluindo a capacidade para
ultrapassar as diferentes barreiras biológicas (e.g., BHE) existentes entre o local de
administração e o local de ação. [146-147] De acordo com alguns autores [147], a maioria das
nanopartículas que mostrou capacidade de transportar compostos farmacologicamente
ativos através da BHE apresentava carga superficial negativa e um diâmetro médio entre
150-300 nm. [147] Assim, o tamanho e carga superficial dos fitossomas são factores que
modulam a eficiência terapêutica da formulação. Portanto, procuram-se compostos e
metodologias que garantam a preparação de formulações de fitossomas com carga
superficial e tamanho bem definido, cuja heterogeneidade seja minimizada tanto quanto
possível, para que o sucesso terapêutico seja maximizado e reprodutível. [148]
Relativamente ao tamanho, o índice de polidispersidade, parâmetro que indica a
distribuição do tamanho das partículas em suspensão, é utilizado em associação com o
diâmetro médio das partículas, para aferir, do ponto de vista qualitativo, o potencial
terapêutico das formulações e a reprodutibilidade da metodologia utilizada na sua
preparação. Formulações com índice de polidispersidade inferior a 0,5 são consideradas
monodispersas, sendo constituídas por uma população homogénea de partículas. Por
outro lado, índices de polidispersidade superiores a 0,5 caracterizam formulações
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
0 10 20 30 40 50
Ab
so
rvê
nc
ia (
61
0 n
m)
Tempo (Dias)
Resultados e discussão
61
polidispersas e representam normalmente várias populações de partículas com tamanhos
distintos. [149] As formulações com um índice de polidispersidade inferior 0,3 são
consideradas adequadas para fins terapêuticos. [150]
Uma formulação de fitossomas, preparada com 2,5 mM de fosfolípido e 1 mg/mL de
extrato aquoso de M. pulegium, foi submetida a diálise e analisada, imediatamente e após
7 dias de armazenamento à temperatura de 4 ºC, por DLS, para avaliar o tamanho e o
índice de polidispersidade das partículas em suspensão. Em paralelo, preparou-se, nas
mesmas condições, outra formulação de fitossomas que foram submetidos a um processo
de extrusão por filtro de 200 nm antes da diálise e depois analisada por DLS, tal como a
primeira formulação. Pretendeu-se com este procedimento estudar o impacto do processo
de extrusão no tamanho das partículas em suspensão e a influência do tempo de
armazenamento na estabilidade, em termos de tamanho, dos fitossomas preparados pelas
duas metodologias.
A Tabela 7 mostra a média dos diâmetros dos fitossomas e o índice de
polidispersidade das formulações preparadas pelos dois procedimentos, imediatamente
após a diálise e após 7 de dias de armazenamento.
Tabela 7. Diâmetro (média ± desvio-padrão) e índice de polidispersidade (média ± desvio-padrão) dos
fitossomas nas formulações prepradas com e sem extrusão imediatamente após diálise e depois de sete dias
de armazenamento a 4 ºC.
Tempo após diálise (dias) 0 7
Fitossomas Sem extrusão Com extrusão Sem extrusão Com extrusão
Diâmetro da partícula (nm) 294,3a ± 9,6 236,8b ± 8,0 364,6c ± 16,6 326,7d ± 9,2
Índice de polidispersidade 0,284a ± 0,02 0,266b ± 0,01 0,306c ± 0,02 0,290d ± 0,01
a,b,c,d diferenças estatisticamente significativas (p < 0,05).
Os resultados da Tabela 7 indicam que os fitossomas preparados sem extrusão
apresentam um diâmetro hidrodinâmico médio e um índice de polidispersidade
significativamente superiores aos obtidos pelo processo de extrusão. Assim, o processo de
extrusão permite obter formulações de fitossomas com maior homogeneidade e menor
tamanho. Curiosamente, o tamanho médio dos fitossomas é superior ao diâmetro do poro
pelo qual ocorreu a extrusão, sugerindo a ocorrência de processos de fusão durante a
diálise ou refletindo a flexibilidade das bicamadas lipídicas que permitem níveis
significativos de deformação, sem rutura, quando sujeitas à pressão subjacente ao
processo de filtração. Alternativamente, o tamanho médio dos fitossomas superior ao poro
do filtro de extrusão pode resultar na presença de várias populações de partículas em
Resultados e discussão
62
suspensão, umas com tamanho inferior ao poro e outras com tamanho muito superior ao
poro, que resultaram da fusão. Para ambas as situações experimentais o processo de
armazenamento promove o aumento do tamanho dos fitossomas e da heterogeneidade
das partículas em suspensão, como refletido pelo aumento do índice de polidispersidade.
Estes dados sugerem que ocorrem processos de fusão durante o armazenamento dos
fitossomas. Adicionalmente, o armazenamento das formulações durante 7 dias promove
nos fitossomas submetidos a extrusão um aumento do seu diâmetro médio (90 nm)
superior ao dos fitossomas preparados sem extrusão (70 nm). Todavia, os índices de
polidispersidade mantêm-se inferiores a 0,5, pelo que as formulações podem considerar-
se monodispersas e adequadas para utilização com fins terapêuticos. [149]
O estudo da distribuição de tamanhos de partículas em suspensão por DLS permite
analisar os resultados considerando diversas variáveis correlacionadas, incluindo a
intensidade, o número e o volume. No presente estudo considera-se apenas a expressão
dos resultados em termos de intensidade e de número. Os dados relativos à análise do
tamanho dos fitossomas em termos de intensidade da dispersão de luz são apresentados
na Figura 21 e na Tabela 8. As formulações de fitossomas preparadas sem extrusão e
analisadas após diálise podem ser distribuídas por dois grupos de populações de
fitossomas com tamanhos distintos: um grupo formado por fitossomas mais pequenos, com
diâmetros entre 111,9 e 156,9 nm (média ponderada = 137,94 nm), e outro formado por
fitossomas maiores, com diâmetros entre 462,5 e 648,4 nm (média ponderada = 546,14
nm), que apresenta maior capacidade para dispersar a luz (Fig. 21A). A formulação
submetida a extrusão também apresenta dois grupos de populações de fitossomas: um
formado por estruturas com diâmetros entre 103,3 e 143,3 nm (média ponderada = 125,49
nm), e outro com diâmetros entre 382,1 e 529,8 nm (média ponderada = 460,21 nm) (Fig.
21C; Tabela 8); ambos os grupos têm tamanhos inferiores aos apresentados pela
formulação que não foi submetida a extrusão. Em ambas as situações experimentais, o
armazenamento durante 7 dias, apesar de preservar os dois grupos de populações de
fitossomas, aumentou o diâmetro médio dos fitossomas em cada um deles (Fig. 21B e D;
Tabela 8). Assim, na formulação sem extrusão o grupo com as populações de fitossomas
mais pequenas apresenta diâmetros entre 128,1 e 296,1 nm, enquanto no grupo de
populações com fitossomas maiores os diâmetros variam entre 578,8 e 1338,1 nm (Fig.
21B). Por outro lado, na formulação submetida a extrusão o grupo das populações com
fitossomas mais pequenos apresenta partículas com tamanhos entre 128,8 e 184,7 nm e
o grupo dos fitossomas maiores tamanhos entre 544,5 e 780,7 nm (Fig. 21D). Estes dados
sugerem que ocorre a fusão dos fitossomas durante o armazenamento.
Resultados e discussão
63
Figura 21. Intensidade de dispersão da luz em função do diâmetro da partícula (nm). Fitossomas analisados
imediatamente após diálise (A) e passados 7 dias (B); Fitossomas extrusados analisados imediatamente após
diálise (C) e passados 7 dias (D).
A análise geral dos dados da Figura 21 pode sugerir que os fitossomas de maior
tamanho predominam nas formulações. Todavia, a dispersão da luz por partículas em
suspensão depende, no essencial, de três fatores: número, tamanho e forma.
Considerando que os lipossomas são estruturas esféricas independentemente do seu
tamanho, então a intensidade da luz dispersa aumenta com o número de partículas e, para
um mesmo número, a intensidade da luz dispersa é tanto maior quanto maior o tamanho
das partículas. Adicionalmente, a utilização de formulações de lipossomas para o
transporte de moléculas bioativas pretende maximizar a entrega dessas moléculas no alvo
terapêutico, a qual depende, entre outros fatores, do número de partículas. Assim, uma
análise da distribuição do tamanho dos fitossomas em suspensão tendo por base o número
(abundância) é um aspeto fundamental no processo de caracterização das formulações
preparadas para fins terapêuticos.
A Figura 22 mostra a distribuição do tamanho dos fitossomas em suspensão em
termos de número. Os dados da figura evidenciam, em todas as formulações, que os
Resultados e discussão
64
fitossomas com tamanhos mais pequenos (com diâmetro inferior a 160 nm nas formulações
analisadas após a diálise) são os mais representados, dominando em termos de
abundância (número) nas formulações. De facto, os fitossomas com diâmetros
enquadrados no grupo das populações de fitossomas de maior tamanho apresentam
abundância relativa bastante reduzida. Nas formulações que não foram submetidas a
extração o conjunto das populações de fitossomas com tamanhos maiores representam
5,7% das partículas em suspensão e o seu armazenamento decresce a sua abundância
para 4,1%. Por outro lado, nas formulações submetidas a extrusão a abundância relativa
do grupo de fitossomas maiores é de 12,56%, decaindo para 4,17% com o armazenamento
durante 7 dias. Portanto, os processos de fusão ocorrem principalmente nos fitossomas de
maior tamanho. Adicionalmente, a fusão de fitossomas no grupo das populações com
tamanho mais pequeno também produz estruturas de maior tamanho, mas ainda
enquadradas neste grupo, como revelado pelo diâmetro médio dos fitossomas
apresentado na Tabela 8.
Os resultados da análise em número (Fig. 22) mostram que as populações de maior
tamanho estão em quantidades muito diminutas e que as partículas presentes em maior
quantidade, partículas de menor tamanho, possuem as características desejáveis para
ultrapassar a BHE, apontando para uma possível utilização dos nossos fitossomas no
tratamento de doenças do SNC.
Resultados e discussão
65
Figura 22. Número de partículas em função do diâmetro da partícula (nm). Fitossomas analisados
imediatamente após diálise (A) e passados 7 dias de armazenamento (B); Fitossomas extrusados analisados
imediatamente após diálise (C) e passados 7 dias de armazenamento (D).
Tabela 8. Tamanho médio da partícula quanto à intensidade e número dos fitossomas após diálise para as
diferentes populações encontradas.
Tempo
0 dias 7 dias
Fitossomas Sem
extrusão
Com
extrusão
Sem
extrusão
Com
extrusão
Diâmetro da
partícula
(nm)a
Intensidade População 1 137,94 125,49 196,96 157,98
População 2 546,14 460,21 872,83 652,31
Número População 1 128,13 116,77 165,10 151,21
População 2 500,05 451,44 798,03 673,09
a Média ponderada do tamanho das partículas para as diferentes populações de fitossomas.
O potencial Zeta corresponde ao potencial elétrico no campo de quebra (i.e., plano
de corte), definido como a distância da superfície da partícula a um ponto no fluído da
suspensão, onde os iões de carga elétrica oposta e as moléculas de água apresentam uma
Resultados e discussão
66
orientação definida, de tal modo que se movem juntamente com a partícula quando
submetidas a um campo elétrico. Assim, o potencial Zeta é determinado pela mobilidade
eletroforética das partículas sujeitas a um campo elétrico. [151] Neste sentido, o potencial
Zeta emerge como uma medida da carga superficial das partículas em suspensão e traduz
a sua estabilidade na suspensão, dado que quando as partículas em suspensão
apresentam um potencial Zeta elevado (negativa ou positivamente) têm tendência a repelir-
se umas às outras, decrescendo a possibilidade de se formarem agregados. Portanto, a
carga superficial em termos de potencial Zeta traduz a magnitude de interações
eletrostáticas repulsivas entre os fitossomas, [152] influenciando a sua estabilidade e
comportamento nos sistemas biológicos. [153] Quando comparadas com nanopartículas
carregadas positivamente, as nanopartículas com potencial Zeta negativo apresentam,
normalmente, maior eficiência na entrega de fármacos no cérebro. Adicionalmente, as
nanopartículas carregadas negativamente também apresentam menor toxicidade do que
as suas congéneres carregadas positivamente. [154] Nanopartículas com valores de
potencial Zeta próximo de 30 mV são consideradas altamente estáveis, enquanto aquelas
cujo valor de potencial Zeta varia entre 20 e 30 mV são consideradas relativamente
estáveis. [155] Os valores do potencial Zeta dos fitossomas nas formulações dialisadas são
apresentados na Tabela 9.
Tabela 9. Potencial Zeta dos fitossomas após diálise.
Tempo
0 dias 7 dias
Fitossomas Sem extrusão Com extrusão Sem extrusão Com extrusão
Potencial Zeta (mV)a -15,45 ± 7,66 -15,15 ± 2,54 -10,69 ± 3,15 -26,07 ± 10,31
a Média ± desvio-padrão de 3 leituras independentes.
Os dados mostram que ambas as formulações apresentam fitossomas com valores
negativos de potencial Zeta (próximo de -15 mV) e que o processo de extrusão, tal como
o armazenamento durante 7 dias à temperatura de 4 ºC, não promove alterações
significativas dos valores de potencial Zeta. No entanto, é importante salientar que ao
tempo zero os fitossomas submetidos a extrusão apresentam maior homogeneidade
(traduzida pelo menor desvio-padrão) que o processo de armazenamento promovendo
uma maior heterogeneidade de carga superficial, tornando, em média, mais negativa a
carga dos fitossomas. Em oposição, o armazenamento da formulação que não foi
submetida a extrusão tornou, em média, a carga dos fitossomas menos negativa (-10,69 ±
Resultados e discussão
67
3,15 mV). Os valores de potencial Zeta negativos sugerem que as formulações devem
apresentar baixa toxicidade e uma estabilidade moderada. [154]
3) Inibição da MAO-A em sinaptossomas
Os sinaptossomas são membranas pré-sinápticas resseladas após fracionamento do
tecido nervoso. Estes correspondem aos terminais sinápticos dos neurónios e o seu
conteúdo inclui mitocôndrias, citoesqueleto e vesiculas sinápticas. Assim, os
sinaptossomas mimetizam estruturas celulares, mantendo algumas funções que ocorrem
in vivo: produzem ATP; a membrana contém canais iónicos, recetores e transportadores
funcionais; libertam neurotransmissores; a membrana tem capacidade de se renovar. Após
a sua preparação, estes permanecem viáveis por várias horas, mantendo as propriedades
dos neurónios intactas, embora os seus processos de transporte se tornem lentos e não
ocorra a reposição de proteínas. [156] Deste modo, os sinaptossomas constituem um
sistema interessante, mais próximo de um sistema in vivo e a avaliação do potencial de
inibição da MAO-A do extrato e das nossas formulações neste sistema pode ser mais
relevante. Por outro lado, a espetroscopia de fluorescência é uma técnica mais sensível, e
com menor interferência de sinal e ruído provenientes do elevado conteúdo proteico do
meio reacional verificados nas determinações por UV-Vis.
O extrato aquoso de M. pulegium inibiu a MAO-A de modo dependente da
concentração (Fig. 23A). O efeito observado num sistema com sinaptossomas foi
semelhante ao já descrito acima para a hMAO-A (Fig. 10A). Nestas condições
experimentais o valor de IC50 obtido foi de 19,54 ± 0,89 µg/ mL de polifenóis totais. Como
controlo positivo foi também avaliado o potencial de inibição da clorgilina (Fig. 23B). Este
inibidor específico revelou menor eficácia na inibição da enzima (IC50 = 180,71 ± 20,80
µg/mL) quando comparado com o extrato aquoso, sendo o valor de IC50 aproximadamente
9 vezes superior ao encontrado para o extrato.
Estes resultados confirmam que o extrato aquoso de M. pulegium tem capacidade
para inibir a MAO-A in vitro, tanto em modelos mais simples como em modelos mais
complexos como é o caso dos sinaptossomas. Visto este ser um modelo mais próximo da
realidade de um organismo vivo, os resultados obtidos com o extrato são muito
promissores.
Resultados e discussão
68
Figura 23. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium (A) e do controlo positivo (B) sobre a MAO-A presente nos
sinaptossomas.
Os fitossomas após diálise e os fitossomas após diálise e extrusão foram também
testados neste mesmo modelo. A Figura 24 mostra o efeito do extrato aquoso de M.
pulegium, dos fitossomas após diálise e dos fitossomas após diálise e extrusão, ambos
adicionados numa concentração final de 0,03 mg/mL, na atividade da MAO-A presente nos
sinaptossomas. As formulações não afetam a atividade da enzima, ao contrário do
observado para o extrato aquoso de M. pulegium (Fig. 24). Dado que as condições de
ensaio foram as mesmas, pode-se inferir que os compostos encapsulados nos fitossomas
não conseguem interagir com a MAO-A. Uma possível explicação é a incapacidade de os
sinaptossomas promoverem a endocitose dos fitossomas, [156] impossibilitando a interação
posterior dos compostos fenólicos com a enzima que está no seu interior.
Neste sentido, a formulação permanece estável em situações que se aproximam da
das condições fisiológicas. A utilização de um modelo in vivo poderia permitir avaliar a
eficiência das formulações lipídicas relativamente à MAO-A.
Resultados e discussão
69
Figura 24. Efeito do extrato aquoso de M. pulegium, fitossomas após diálise e fitossomas após diálise e
extrusão na atividade da MAO-A presente nos sinaptossomas.
70
Capítulo V – Conclusões e perspetivas futuras
Conclusões e perspetivas futuras
71
Este trabalho permitiu concluir que o extrato aquoso de M. pulegium L. apresenta
vários derivados de ácidos hidroxicinâmicos e flavonoides, sendo o ácido rosmarínico o
composto maioritário (superior a 40% dos compostos fenólicos).
Este extrato tem capacidade para inibir a MAO-A, numa gama de concentrações
suscetíveis de ser alcançadas nos meios biológicos. Em oposição, a capacidade de
inibição das colinesterases é limitada, ocorrendo apenas a concentrações elevadas.
A gema de ovo revelou-se um recurso acessível de lípidos com relevância funcional
para preparar as formulações (fitossomas).
O processo de preparação das formulações permitiu estabelecer a razão
quantidade de lípido/quantidade de extrato necessária para maximizar a eficiência de
encapsulamento.
As formulações apresentaram fitossomas com homogeneidade relativamente ao
seu tamanho (inferior a 200 nm) e potencial Zeta negativo, indicadores de estabilidade, e
potencial terapêutico.
Estes ensaios in vitro permitem considerar os parâmetros necessários associados
às formulações destes fitossomas para desenvolver estudos in vivo com o objetivo de
avaliar a sua eficência na modulação de doenças associadas à hiperatividade da MAO-A.
72
Capítulo VI – Referências bibliográficas
Referências bibliográficas
73
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