meio cromogênio cps

NewsLab - edição 75 - 2006130

A Identificação Direta Pelos MeiosCromogênicos é Confiável a Ponto de Dispensar

as Provas Bioquímicas?Bernardo Gabriel de Oliveira1, Carlos Augusto Albini2, Gislene M. Diógenes Botão3, Helena Homem de Mello de Souza4

1 - Curso de especialização em Microbiologia PUC - PR

2 - Professor e Mestre Universidade Federal do Paraná

3 - Hospital de Clínicas, Curitiba - PR

4 - Hospital de Clínicas, Curitiba - PR

Artigo

A urocultura é a análise mais realizada em laboratórios deBacteriologia Clínica, uma vez que as infecções do trato uriná-rio estão entre as patologias mais comuns em humanos. A meto-dologia tradicional empregada para o cultivo de amostras deurina permite identificar o patógeno em pelo menos 48 horas,sendo que em alguns casos quando se necessita de provas adi-cionais de identificação, o processo pode demorar por váriosdias. Um sistema que simplifique o processo e utilize menor quan-tidade de meios de identificação, além de reduzir o tempo paraa liberação final do exame teria grande valor prático. A introdu-ção de meios cromogênicos para o plantio primário de amos-tras de urina permite a identificação dos principais uropatóge-nos através da verificação da morfologia colonial após 18 a 24horas de incubação. Foram realizadas 1.409 uroculturas utili-zando-se meio cromogênico (CPS ID 3 Biomerieux) no períodoentre 21 de fevereiro e 29 de março de 2005, em um laborató-rio privado de Curitiba, PR, sendo que 220 amostras foram po-sitivas (15,6%). Os isolados identificados presuntivamente peloaspecto macroscópico das colônias foram confirmados atravésde um método convencional de identificação bacteriana. Deze-nove diferentes espécies de uropatógenos foram identificadas,sendo que a espécie prevalente foi Escherichia coli, isolada em138 das 220 amostras positivas (62,7%). Das E. coli isoladas,9,4% (13/138) foram β glucoronidase negativas e, portanto,não puderam ser identificadas diretamente pelo meio cromogê-nico. A identificação direta pelo meio cromogênico foi confir-mada bioquimicamente em 99,3% das amostras analisadas, com-provando a sua eficácia e possibilitando ganho de tempo em69,1% das culturas positivas.

Palavras-chave: Urocultura, meio cromogênico, identifi-cação bacteriana

Resumo Summary

Urocultures are the most commonly analyses performedin clinical bacteriological laboratories as infections of theurinal tract are among the most frequent pathologies ofhumans. The traditional method employed for urinespecimen cultures enables the identification of the pathogenwithin 48 hours but when additional identificationexaminations are required the process may take severaldays. A system that simplifies the process and utilizes asmaller amount of identification mediums, as well as reducesthe time to complete the examination would have a greatpractical value. The introduction of chromogenic mediumsfor the first seeding of the urine samples allows theidentification of the main uropathogens through theverification of the clonal morphology after 18 to 24 hoursof incubation. A total of 1409 urocultures utilizingchromogenic mediums (COS ID 3 Biomerieux) wereperformed in the period from 21 February to 29 March2005 in a private laboratory in Curitiba, Brazil. Twohundred and twenty specimens were positive (15.6%). Theisolates presumptively identified by the macroscopicappearance of the colonies were later confirmed byconventional identification techniques, with Escherichia colibeing the most prevalent, identified in 138 of the 220positive samples (62.7%). Of the E. coli, 9.4% (13/138)were negative and therefore could not be directly identifiedby the chromogenic medium. The direct identification usingthe chromogenic medium was biochemically confirmed in99.3% of the analyzed samples, proving its efficiency andsaving time in 69.1% of the positive cultures.

Keywords: Urocultures, chromogenic medium,bacteriological identification


A

IntroduçãoIntrodução

urocultura é a análise mais

realizada em laboratórios de

Bacteriologia Clínica, uma vez que

as infecções do trato urinário es-

tão dentre as patologias mais co-

muns em humanos (1).

A metodologia empregada na

maioria dos laboratórios consiste

na inoculação da urina em meios

de cultura já consagrados como o

Ágar CLED (cistina - lactose - ele-

trólito - deficiente), Ágar sangue

e MacConkey (meio seletivo para

bacilos gram negativos), com pos-

terior identificação bacteriana ba-

seada em provas bioquímicas.

O processo demora no mínimo

48 horas para identificar o pató-

geno e realizar o antibiograma.

Em alguns casos, a identificação

requer provas adicionais para con-

firmação do uropatógeno, que

poderá adiar o laudo final para até

72 horas.

Portanto, as informações par-

ciais possíveis de serem relatadas

com a metodologia resumem-se na

morfologia bacteriana, número de

leucócitos e reação do nitrito

(quando solicitado parcial de uri-

na com bacterioscopia pelo gram).

Muitos pacientes com infecção

urinária necessitam de tratamen-

to imediato. Assim, a grande des-

vantagem da metodologia expos-

ta acha-se na demora do laudo fi-

nal, embora em muitas situações

o tratamento empírico seja apli-

cado imediatamente após a cole-

ta do material (2).

Atualmente, existe uma nova

metodologia para a realização da

urocultura, através de meios cro-

mogênicos. Tais meios permitem

a identificação direta dos princi-

pais uropatógenos (Escherichia

coli, Proteus mirabilis e Enterococ-

cus spp.) em 24 horas após incu-

bação (3) .

A identificação presuntiva é

baseada nas diferentes colorações

das colônias bacterianas, causa-

da pelas reações enzimáticas es-

pécie ou gênero específico com

substratos incorporados no meio

de cultura, necessitando apenas

de poucas provas adicionais con-

firmatórias (2).

• Escherichia coli e Proteus

mirabilis (Figura 1)

No meio cromogênico, a E.coli

produz uma enzima chamada de

ß-glucuronidase, além de ser ne-

gativo para ß-glucosidase. A co-

loração rosa já é suficiente para a

sua confirmação, sem necessida-

de de nenhuma prova adicional (3)

(Tabela 1).

Já o Proteus mirabilis não pro-

duz as enzimas ß-glucuronidase e

ß-glucosidase, a sua identificação

ocorre devido a formação de co-

lônias de coloração marrom/cas-

tanho oriundas da produção de

desaminase no meio (Tabela 1).

Mas apenas a coloração não é su-

ficiente, sendo necessária a de-

tecção do indol que deve ser ne-

gativo para sua confirmação (3).

• Enterococcus spp (Figura 2)

No meio cromogênico, o Ente-

rococcus spp produz uma enzima

chamada de ß-glucosidase, sendo

negativo para outra enzima, a ß-

Projeto de pesquisa apresentado à coordenação do curso de Especialização em Microbiologia da Pontifícia Universidade Católica doParaná, Turma 2004. Orientador: Prof. e Msc. Carlos Augusto Albini. Co-orientadoras: Especialista Gislene M. Diógenes Botão, Msc.Helena Homem de Mello de Souza

Figura 1. Colônias rosa e marromcaracterísticas de Escherichia coli eProteus mirabilis, respectivamente

Figura 2. As colônias, azul turquesa(esq.) e rosa (dir.) são características deEnterococcus spp e Escherichia coli,respectivamente


Materiais e métodos

glucoronidase. Esta bactéria desen-

volve colônias no meio com colora-

ção azul turquesa (Tabela 1), ne-

cessitando apenas da realização do

Gram da colônia. Se na microsco-

pia, a morfologia da bactéria for

CGP, já é suficiente para confirmar

sua identificação (3).

Será que a identificação dos

meios cromogênicos é realmente

confiável em nossa realidade, a

ponto de dispensarem as provas

bioquímicas?

Quais as vantagens em relação

a custo-benefício na sua utilização

em laboratórios de microbiologia?

Materiais e métodos

O estudo foi realizado no labora-

tório Cendilab, localizado na cidade

de Curitiba, que realiza as culturas

de urina em meios cromogênicos.

As urinas foram inoculadas no

meio cromogênico CPS ID3 (Bio-

mérieux) e incubadas a 37ºC por

18-24 horas. As identificações fo-

ram realizadas primeiramente pelo

aspecto das colônias desenvolvi-

das. As colônias com colorações

características para as espécies

identificadas presuntivamente fo-

ram separadas para confirmação

e realização dos antibiogramas.

Quando a identificação presun-

tiva não era possível, a amostra

era submetida à identificação bi-

oquímica e antibiograma.

Durante o período do trabalho,

registrou-se todas as culturas po-

sitivas em planilhas contendo in-

formações como: iniciais dos no-

mes, idade, sexo, a bactéria iso-

lada, biotipo, percentual, provas

adicionais, etc. As culturas mis-

tas e/ou contaminadas foram con-

sideradas negativas.

As amostras confirmadas dire-

tamente foram separadas e nu-

meradas para posterior confirma-

ção bioquímica.

Utilizou-se para confirmação da

Escherichia coli e Proteus mirabi-

lis um kit contendo cinco tubos

desenvolvidos pela Newprov para

identificação das enterobactérias.

Cada tubo propicia a leitura de

algumas provas e o somatório das

leituras positivas e negativas ca-

racterizam um código que equi-

vale ao biotipo e percentual da

bactéria encontrada. Quando o

biotipo não se aproxima dos

100%, algumas provas adicionais

são sugeridas pelo fabricante para

confirmação bacteriana.

Para a prova da lactose, neces-

sária para complementar a iden-

tificação bacteriana, foi utilizado

o meio Mac Conkey e o teste em

tubo lactose, ambos desenvolvi-

dos pela Newprov.

As etapas de inoculação, incu-

bação e leitura das provas foram

realizadas conforme orientações

de Pilonetto (4). Os procedimen-

tos sobre o uso do tubo lactose

foram seguidos, conforme orien-

tações do fabricante.

Para confirmação bioquímica

do Enterococcus spp., utilizou-se

os seguintes materiais: água oxi-

genada a 10 volumes (prova da

catalase), meio de tolerância ao

sal (MTS) em tubo e a prova da

bile esculina em tubo, todos de-

senvolvidos pela Newprov.

A catalase sendo negativa, com

positividade para o MTS e bile es-

culina, é suficiente para sua con-

firmação (4).

As etapas de inoculação, incu-

bação e leitura das provas, também

foram realizadas conforme orienta-

ções de Pilonetto (4). As bactérias

analisadas bioquimicamente foram

repicadas e armazenadas em meio

gelose de conservação.

Informações como o total de

Tabela 1. Interpretação das culturas no meio cromogênico

Bactéria Rosa Azul turquesa Marrom/Castanho

β-glucoronidase β-glucosidase Desaminase

Escherichia coli + - -Proteus mirabilis - - +Proteus indol +

Morganella e - - +Providencia

Enterococcus spp. - + -


Resultados

culturas realizadas, o percentual de

positividade, as concordâncias en-

tre as identificações presuntiva e

bioquímica, juntamente com o per-

centual de culturas favorecidas pela

identificação presuntiva e o custo

dos meios, serão utilizados para a

conclusão da eficácia e viabilidade

no uso dos meios cromogênicos.

Resultados

No período entre 21/02/2005

e 29/03/2005, foram realizadas

1.409 culturas de urina no labo-

ratório Cendilab, sendo que 220

foram positivas (15,6%), contra

1.189 (84,6%) de culturas consi-

deradas negativas.

A grande maioria dos pacien-

tes é ambulatorial, de ambos os

sexos, e idade variando de recém-

nascidos a idosos.

Das culturas positivas, foram

identificadas 19 diferentes espé-

cies de uropatógenos, sendo que

a bactéria mais isolada entre elas

foi a Escherichia coli, identificada

em 138 / 220 ou 62,7% dos ca-

sos (Gráfico 1).

Somando o total de achados

entre Escherichia coli (138), Pro-

teus mirabilis (11) e Enterococcus

sp.(16), obteve-se 165/220

(75%) de todas as culturas posi-

tivas no laboratório (Gráfico 2).

As colorações características

para a identificação direta no meio

cromogênico foram observadas em

todas as amostras de Proteus mi-

rabilis e Enterococcus spp.

bactérias isoladas

E.coli; 138

P.mirabilis; 11

Enterococcus; 16

ENPC; 12

S.agalactiae; 13

K. pneumoniae; 4

outras; 26

E.coli

P.mirabilis

Enterococcus

ENPC

S.agalactiae

K. pneumoniae

outras

Gráfico 1. Principais bactérias identificadas durante o estudoENPC: Estafilococos não produtor de coagulase

Gráfico 2. Identificações do grupo das bactérias cromogênicas

Gráfico 3. Comparaçãoentre as E. coli rosas eincolores encontradas

138

11

16

0 20 40 60 80 100 120 140

E.coli

P.mirabilis

Enterococcus sp.

bactérias cromogênicas

bactérias cromogênicas 138 11 16

E.coli P.mirabilis Enterococcus sp.

1

incolores

rosas

125

13

0

20

40

60

80

100

120

140

frequência

coloração

E. coli isoladas

incolores

rosas

137NewsLab - edição 75 - 2006

No entanto, 13 colônias de Es-

cherichia coli 13/138 (9,4%) apre-

sentaram-se incolores, impossibi-

litando sua identificação cromogê-

nica. Nesse caso, necessitou-se

das provas bioquímicas para iden-

tificá-las (Gráfico 3).

Entre as colônias incolores iden-

tificadas bioquimicamente, curio-

samente, em sete ou 53,8% de-

las, encontrou-se o mesmo bioti-

po 2961. Foram testadas bioqui-

micamente 153 culturas identifica-

das diretamente, resultando em

152 confirmações e uma discre-

pância (99,3% de concordância).

A discrepância ocorreu com

uma bactéria que produziu a en-

zima ß-glucoronidase, apresen-

tando coloração semelhante à ca-

racterística para Escherichia coli

(Figura 3).

Nas provas bioquímicas resultou

no biotipo 2931, com 9,74% de

possibilidade para essa bactéria.

Realizaram-se as provas adicionais:

sorbitol, VP (Voges-Proskauer) e

rafinose. Os resultados foram posi-

tivos em todos os testes, caracte- rizando bioquimicamente a bacté-

ria como Enterobacter sp.

A amostra foi encaminhada

para o Hospital de Clínicas de Cu-

ritiba, visando à realização de uma

terceira metodologia para confir-

mação de sua identificação.

O laudo final resultou em En-

terobacter sp., biotipo 2933, con-

firmando a sua discrepância. O

mesmo biotipo foi encontrado em

outra amostra, porém, as provas

adicionais (sorbitol + , VP - e rafi-

nose -), confirmaram a bactéria

como Escherichia coli.

As provas adicionais foram re-

alizadas quando o percentual

para a bactéria pesquisada ocor-

resse abaixo de 50%. Além dos

dois casos citados, foram reali-

zados também em outros dois.

No primeiro, o biotipo encontra-

do foi o 2661, com compatibili-

dade para E. coli de 46,34%. As

provas realizadas foram: t-j e

sorbitol, com resultado positivoFigura 3. Foto da amostra comidentificação discrepante

Gráfico 4.Resultados obtidosdas bactériasidentificáveis direta-mente no meiocromogênico

Gráfico 5. Resultados finais dos procedimentos adotados nas amostras de culturade urina, realizados durante o período do estudo

Coloração característica

incolores

discrepante

bactériasidentificáveis

152

13

1

0

20

40

60

80

100

120

140

160

bactérias identificáveis

bactérias identificáveis 152 13 1

Coloração característica incolores discrepante

Resultados finais

1189

152

68

negativas

identificadas diretamente

necessidade de provas bioquimicas

Resultados finais


Discussão

em ambos os testes, confirman-

do a bactéria.

Outra confirmação realizada na

amostra de biotipo 8631, com

10,6% para Proteus mirabilis e con-

firmado com as provas arabinose e

manitol, resultando negativo.

Resumidamente, das 166 amos-

tras encontradas no meio cromogê-

nico como pertencentes às bactéri-

as identificáveis diretamente, 13/

166 (7,8%) apresentaram-se inco-

lores e 01/166 (0,6%) não foi con-

firmado bioquimicamente (Gráfico

4). A identificação direta ocorreu em

152/166 (91,5%) dos casos.

Comparada com o total de cul-

turas positivas, a identificação di-

reta foi satisfatória em 152/220

(69,1%) das identificações.

As identificações realizadas no

restante das culturas positivas fo-

ram apenas registradas em plani-

lhas, pois pertencem às bactérias

que necessitam das provas bio-

químicas mesmo utilizando mei-

os cromogênicos.

Todas as bactérias identifica-

das como ENPC (estafilococos não

produtores de coagulase) foram

submetidas ao teste da novobio-

cina e, curiosamente, nenhuma

amostra foi compatível a Sta-

phylococcus saprophyticus.

Assim, a identificação direta foi

realizada em 152 amostras, en-

quanto necessitou-se de provas

bioquímicas em 68 amostras do

total de 1.409 culturas realizadas

no laboratório durante o período

estudado (Gráfico 5).

Discussão

O presente estudo demonstrou

que 220/1.409 (15,6%) do total

de culturas de urina realizadas

foram positivas. Percentual razo-

ável quando relacionado a um la-

boratório de microbiologia que

atende pacientes ambulatoriais na

sua grande maioria.

Outro dado importante é o nú-

mero de culturas positivas identi-

ficadas diretamente pelo meio cro-

mogênico, 152/220 (69,1%). Re-

sultados semelhantes foram en-

contrados por Scarparo (68,8%) e

Chaux (60,3%), sendo o último re-

alizado com pacientes exclusiva-

mente hospitalares.

O laboratório necessitou utili-

zar provas bioquímicas em 30,9%

(68/220) das amostras positivas.

É evidente que um sistema no qual

houvesse simplificação de técni-

cas e redução da quantidade de

meios de identificação seria de

inegável valor prático (6).

A identificação direta em 24 ho-

ras auxilia o clínico na escolha do

medicamento. Porém, em labora-

tórios ambulatoriais, essa vanta-

gem não é relevante, pois os pa-

cientes só retornam para retirar o

laudo quando o resultado do anti-

biograma, que demora no míni-

mo 48 horas, estiver pronto, ou,

quando houver reconsultas que

geralmente são marcadas em in-

tervalos de tempo maiores.

Então, a grande vantagem des-

sa metodologia, nesse caso, está

no ganho de tempo em bancada

pelo profissional do laboratório.

Uma desvantagem encontrada

na identificação direta é a impos-

sibilidade de dados adicionais

como o biotipo da bactéria, que

em certas ocasiões pode ser im-

portante, como na pesquisa de

surtos de infecções hospitalares

ou no diagnóstico de infecções

sucessivas no mesmo paciente.

As colônias identificadas dire-

tamente foram confirmadas pelas

provas bioquímicas em 99,3% ou

152/153 dos casos, resultado que

comprova a eficácia da identifica-

ção do meio.

O fabricante estima um per-

centual de Escherichia coli não

produtoras de ß-glucoronidase,

em torno de 5-7% (CPS ID2 -

Agar, 2002, 01). Porém, o per-

Tabela 2. Valor pago nos meios por cultura, pelo laboratório Cendilab

Meio cromogênico Biplaca cled/cled Kit para enterobactérias Mão-de-obra(2 testes/placa) por minuto

R$ 2,28 R$ 1,80 R$ 3,51 R$ 0,26

OBS: os valores são referentes às notas emitidas pelos fabricantes. Foram relatados por unidade.


Conclusão

centual encontrado 13/138

(9,4%) foi superior ao estabele-

cido. Resultados semelhantes fo-

ram encontrados por Scarparo

(43/429 ou 10%).

Embora isolados com menor

freqüência, tanto o Proteus mira-

bilis (11) como Enterococcus spp.

(16) foram identificados direta-

mente e confirmados bioquimica-

mente em todos os casos. No es-

tudo realizado por Scarparo, a

identificação direta dessas bacté-

rias também ocorreu em 100% dos

casos, com 61 amostras de Pro-

teus mirabilis e 213 de Enterococ-

cus spp.

Bactérias como o Enterobacter

sp. produtor de ß-glucoronidase,

apresentando colônias rosas no

meio cromogênico, semelhante à

coloração característica da Escheri-

chia coli, também foram relatados

em outros estudos: Salmonella spp.,

Citrobacter freundii e Shigella son-

nei (2), Salmonella spp., Citrobac-

ter freundii, Shigella sonnei e Ente-

robacter sp. (5) e Enterobacter clo-

acae e Citrobacter sp. (7).

O meio cromogênico utilizado

nesses estudos foi o CPS ID2, en-

quanto no presente trabalho foi

utilizado o CPS ID3. A diferença

entre eles é que o CPS ID2 re-

comenda confirmação da Esche-

richia coli pelo teste do indol,

enquanto o CPS ID3 dispensa

esse procedimento, garantindo

a identificação apenas pela colo-

ração da bactéria.

As bactérias citadas produtoras

de ß-glucoronidase, incluindo o En-

terobacter sp. encontrado nesse

estudo, são indol negativos.

O teste do indol é importante na

distinção entre Proteus mirabilis e

demais espécies de Proteus e, tam-

bém, na distinção entre Escherichia

coli e bactérias dos gêneros Klebsi-

ella e Enterobacter (6).

Conforme relatado acima, a pro-

dução da enzima ß-glucoronidase

não ocorre apenas em Escherichia

coli. Portanto, como apenas a colo-

ração rosa proveniente da produção

dessa enzima, embora raramente,

gera riscos na interpretação da bac-

téria isolada e 96,4% (133/138) das

Escherichia coli identificadas no es-

tudo (anexo 1) são indol positivas,

fica como sugestão o uso do teste

do indol mesmo no meio CPS ID3.

Avaliando o custo de ambas

metodologias utilizadas no labo-

ratório em estudo, observa-se

uma redução de 11,16% dos

meios cromogênicos em relação

aos meios tradicionais (CLED/

CLED e provas bioquímicas) (Ta-

belas 2 e 3). A mão-de-obra foi

considerada em relação ao piso

salarial + encargos do respon-

sável técnico

Os valores para Enterococcus sp.

não foram calculados devido a sua

baixa ocorrência, não influencian-

do no resultado final.

Conclusão

A identificação direta pelo meio

cromogênico foi confirmada bioqui-

micamente em 99,3% das amos-

tras analisadas, comprovando a

sua eficácia e possibilitando gan-

ho de tempo em 69,1% das cultu-

ras positivas.

Com isso, possibilita o profis-

sional do laboratório a finalizar

mais rapidamente as culturas de

Tabela 3. Comparação de custos entre as metodologias

Custos Negativas Positivas Positivas Mão-de-obra Totalem Reais (1189) EP* com provas (1393)

(136) (68)

Metodologia R$: 1070,10 R$: 599,76 R$: 61,20 R$ 525,38 R$: 2.256,44tradicional 47,42% 26,58% 2,72% 23,28%

Metodologia R$: 1355,46 R$: 155,04 R$: 77,52 R$ 416,58 R$: 2.004,60cromogênica 67,62% 7,74% 3,86% 20,78%

EP*: somente E. coli e P. mirabilis identificados diretamente pela metodologia cromogênica.Positivos com provas: demais bactérias com necessidade de provas bioquímicas em ambas metodologias. Obs: os valores das provas utilizadas nãoforam incluídos, pois são os mesmos. Sendo apenas somados os valores dos meios de cultivo.


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fácil identificação, podendo dedi-

car-se com maior tranqüilidade

em outras atividades.

O percentual de Escherichia coli

com colônias incolores identifica-

do, foi próximo ao encontrado em

outros estudos, onde se utilizou

uma versão anterior do mesmo

meio cromogênico. Ambos os re-

sultados foram praticamente o do-

bro do estipulado pelo fabricante.

As mudanças entre as versões

dos meios cromogênicos não fo-

ram vantajosas na identificação da

Escherichia coli, pois observou-se

os mesmos achados com relação

à colônias incolores e produção de

ß-glucoronidase por diferentes

bactérias.

Concluiu-se que a retirada da

prova do indol pelo CPS ID3, ape-

nas potencializa a possibilidade de

erro na identificação. Porém, no

laboratório em estudo, mesmo

com percentual de Escherichia coli

de colônias incolores alto, o seu

uso torna-se viável, pois reduz

custos e tempo.

Em laboratórios menores, o

custo dos meios cromogênicos

inviabiliza seu uso e o ganho de

tempo também não é significa-

tivo. Cada laboratório deve fa-

zer um levantamento de sua ro-

tina e dos preços oferecidos pe-

los meios para concluir a viabili-

dade do seu uso.

Agradedcimentos

• Laboratório Cendilab, empre-

sa filiada ao grupo Clinihauer

• Hospital de Clínicas de Curitiba

• Newprov, produtos para la-

boratórios

Correspondência para:

Bernardo Gabriel de Oliveira

E-mail: [email protected]

meio cromogênio cps

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