MEDICINA REGENERATIVA PARA EL TRATAMIENTO DE LA

ANEMIA DE FRANCONI: GENERACIÓN DE CÉLULAS IPSC

ESPECÍFICAS DEL PACIENTE, LIBRES DE ENFERMEDAD Y

CAPACES DE DIFERENCIARSE EN PROGENITORES

HEMATOPOYÉTICOS Y PLAQUETAS

Núria Montserrat Pulido

IBEC Institut Bioenginyeria de Catalunya

Juan Antonio Bueren Roncero

CIEMAT Centro de Investigaciones Energéticas Mediambientales y Tecnológicas

Jordi Surrallés Calonge

Facultat de Biociències UAB

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1. Resumen del proyecto

La anemia de Fanconi (FA) es un síndrome de reparación del ADN caracterizado por el

agotamiento progresivo de las células madre hematopoyéticas. En la actualidad se

están llevando a cabo diferentes abordajes de terapia génica con el fin de corregir los

progenitores hematopoyéticos (PH) en los pacientes de FA. Sin embargo, en algunos

casos, especialmente en pacientes en estadios avanzados de la enfermedad, la

obtención de un número suficiente de PH para su posterior manipulación y trasplante

es la principal limitación para llevar estas aproximaciones a la clínica. Por esta razón, la

generación de PH libres de enfermedad a partir de fuentes celulares distintas a las

células madre hematopoyéticas supondría una mejor alternativa terapéutica. A tales

efectos, este proyecto se centró en dos enfoques innovadores para lograr este

objetivo. Por un lado, los investigadores desarrollaron con éxito diferentes estrategias

para la corrección de los fibroblastos de los pacientes de FA por métodos de edición

génica, dando lugar a la conversión directa de los fibroblastos de los pacientes de FA

hacia PH libres de enfermedad. Por otra parte, el equipo de investigación ha

desarrollado protocolos novedosos para la derivación de células madre pluripotentes

inducidas (iPSC) a partir de fibroblastos de pacientes de FA (FA-iPSC), que después de

su corrección se diferenciaron en diferentes tipos celulares comprometidos durante la

FA, lo que dio lugar a la generación de una plataforma in vitro para el modelado FA in

vitro e in vivo.

2. Resultados

Aprovechando la experiencia de los diferentes IP en los campos de la FA, la

reprogramación somática y la edición del genoma, el equipo coordinador desarrolló por

primera vez un protocolo robusto para la generación de iPSC a partir de pacientes de

FA (FA-iPSCs) mediante vectores episomales. Después, se procedió a realizar la

corrección de la mutación en las FA-iPSC utilizando un vector adenoviral (HDAdV-

FANCA-c-HDAdV), que cubre la región genómica desde el promotor del intrón 7 del gen

FANCA. Posteriormente, las líneas FA-iPSC corregidas/no corregidas se diferenciaron a

PH (FA-PH) mediante un protocolo que toma ventaja del uso de citocinas

hematopoyéticas desarrollado en el marco de este proyecto. Los FA-PH no

corregidos/corregidos se utilizaron como una plataforma in vitro para el cribado de

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compuestos terapéuticos dirigidos contra la enfermedad de FA in vitro. Del mismo

modo, las líneas FA-iPSC no corregidas/corregidas se diferenciaron hacia otros tipos de

células comprometidas durante la enfermedad, sirviendo como una plataforma celular

para la interrogación de los fenotipos celulares asociados a la enfermedad (modelado

de la enfermedad). Es importante destacar que los FA-PH corregidos fueron capaces de

diferenciarse en progenitores sanguíneos in vivo.

Teniendo en cuenta la variedad de mutaciones existentes en los 21 genes implicados

en la enfermedad, el equipo del Dr. Bueren se centró en el desarrollo de una

plataforma de edición génica que pudiera ser aplicable a todos los subtipos de anemia

de Fanconi, basándose en la inserción del gen terapéutico AF en un sitio seguro del

genoma. En concreto, el equipo investigador se centró en la integración específica del

gen FANCA en el sitio seguro AAVS1 en fibroblastos de pacientes AF-A después de la

cotransducción de un vector lentiviral no integrativo que porta los transgenes

EGFP/FANCA y un vector adenoviral que porta las nucleasas de dedos de zinc (ZFN)

específicas frente al locus AAVS1. Análisis moleculares, genéticos y citogenéticos de

estas células confirmaron su corrección a través del análisis de la integración del gen

FANCA en el sitio AAVS1. La transducción de los fibroblastos editados con un vector

lentiviral de reprogramación permitió la generación de IPSC corregidas. Finalmente los

clones de IPSC se diferenciaron in vitro para generar progenitores hematopoyéticos

corregidos. La diferenciación hematopoyética de estas células permitió la generación de

células CD34+ y CD45+ corregidas, con capacidad de generar colonias mieloides y

eritroides in vitro. Además, también se detectaron células CD45+ en los teratomas

generados en ratones inmunodeficientes en los que se implantaron las AF-IPSC

editadas. Nuestros datos demuestran, por primera vez, la eficacia de la terapia génica

mediada por recombinación homóloga y la reprogramación para la obtención de

progenitores hematopoyéticos corregidos derivados de pacientes con un síndrome

asociado al fallo de reparación del ADN.

El equipo liderado por el Dr. Surrallés trabajó en la identificación y caracterización de

pacientes afectados de FA para obtener células diana para poder realizar las otras

tareas del proyecto, así como complementar la caracterización genética de las células

antes y después de la manipulación genética realizada por los otros equipos del

proyecto coordinado. Durante los 3 años y medio del proyecto, el equipo de la UAB

identificó 28 pacientes Fanconi nuevos gracias a sus rasgos clínicos y al resultado

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positivo del ensayo de fragilidad cromosómica, el ensayo considerado el gold standard

en el diagnóstico de esta enfermedad. Posteriormente, se generaron 15 líneas celulares

a disponer por los otros miembros del consorcio de investigación. A partir del análisis

mutacional y, cuando eran requeridos, estudios funcionales de las mutaciones, el

equipo detectó que el 80% de los pacientes tenían mutaciones en el gen FANCA, el gen

diana en este proyecto de edición génica y medicina regenerativa. También se

comprobó la supresión de la fragilidad cromosómica tras la terapia génica dirigida

realizada por los socios del proyecto por diferentes aproximaciones genéticas.

Finalmente, la UAB realizó estudios funcionales en células genéticamente editadas para

demostrar genéticamente que la reversión del fenotipo Fanconi no estaba causada por

una reversión espontánea de las mutaciones patogénicas del alelo endógeno.

3. Relevancia y posibles implicaciones

La generación de PH a partir de iPSC específicas de pacientes de FA ha aumentado

nuestro conocimiento sobre la gestación de la patología de FA in vitro. A su vez, el

establecimiento de plataformas basadas en la derivación de FA-iPSC también ha

permitido la detección e identificación de compuestos terapéuticos dirigidos a la

enfermedad, lo que indica la viabilidad de este enfoque para el modelado in vitro de

enfermedades humanas. El conocimiento proporcionado en el marco del proyecto

también abrió la puerta a la descripción de los protocolos in vitro para la derivación de

PH a partir de FA-iPSC y de fibroblastos derivados de pacientes de FA, lo que

proporciona una plataforma fiable para la conversión de linaje de células somáticas

humanas en células madre sanguíneas con potencial de reconstitución hematopoyética

y posibles implicaciones clínicas.

4. Bibliografía científica generada

1. Garreta E, de Oñate L, Fernández-Santos ME, Oria R, Tarantino C, Climent

AM, Marco A, Samitier M, Martínez E, Valls-Margarit M, Matesanz R, Taylor

DA, Fernández-Avilés F, Izpisua Belmonte JC, Montserrat N.

Myocardial commitment from human pluripotent stem cells: Rapid production of human

heart grafts. Biomaterials. 2016; 98:64-78.

6

2. Montserrat N, Garreta E, Izpisua Belmonte JC.

Regenerative strategies for kidney engineering.

FEBS J. 2016; 283(18):3303-3324.

3. Trujillo JP, Surralles J.

Savior siblings and Fanconi anemia: analysis of success rates from the family’s

perspective.

Genetics in Medicine 2015; 17(11):935-938.

4. Bogliolo M, Surrallés J.

Fanconi anemia: from novel genes to advanced therapies.

Current Opinion in Genetics and Development 2015; 33:32-40.

5. Liu GH, Suzuki K, Li M, Qu J, Montserrat N, Tarantino C, Gu Y, Yi F, Xu X,

Zhang W, Ruiz S, Plongthongkum N, Zhang K, Masuda S, Nivet E, Tsunekawa Y,

Soligalla RD, Goebl A, Aizawa E, Kim NY, Kim J, Dubova I, Li Y, Ren R, Benner C, del

Sol A, Bueren J, Trujillo JP, Surralles J, Cappelli E, Dufour C, Esteban CR, Izpisua

Belmonte JC.

Modelling Fanconi anemia pathogenesis and therapeutics using integration-free patient-

derived iPSCs.

Nature Communications 2014; 5:4330-4336.

6. Pulecio J, Nivet E, Sancho-Martinez I, Vitaloni M, Guenechea G, Xia Y, Kurian L,

Dubova I, Bueren J, Laricchia-Robbio L, Izpisua Belmonte JC.

Conversion of human fibroblasts into monocyte-like progenitor cells.

Stem Cells 2014; 32(11):2923-38.

7. Río P, Baños R, Lombardo A, Quintana-Bustamante O, Alvarez L, Garate Z,

Genovese P, Almarza E, Valeri A, Díez B, Navarro S, Torres Y, Trujillo JP, Murillas R,

Segovia JC, Samper E, Surralles J, Gregory PD, Holmes MC, Naldini L, Bueren JA.

Targeted Gene Therapy and Cell Reprogramming in Fanconi Anemia.

EMBO Mol Therapy 2014; 6:835-848.

8. Molina-Estevez FJ, Lozano ML, Navarro S, Torres Y, Grabundzija I, Ivics Z,

Samper E, Bueren JA, Guenechea G.

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Brief report: Impaired cell reprogramming in nonhomologous end joining deficient cells.

Stem Cells 2013; 31(8):1726-1730.

Publicaciones en revisión:

Actualmente se están revisando los siguientes artículos basados en los resultados

obtenidos en el marco del proyecto:

Revista: Blood

ID#: BLOOD/2016/713412

Título: The transcriptional landscape of transplanted human hematopoietic stem cells.

Revista: Journal of Experimental Medicine

ID#: Manuscript 20160057

Título: Dynamic WNT pathway modulation clears barriers of multipotent hematopoietic

progenitor differentiation of Human iPSCs.

Actividades de comunicación al público en general:

Publicación en una revista escolar sobre la actividad de La Marató y, en particular,

sobre el presente proyecto: La Marató a l’escola: un projecte de tots, Dra. Montserrat,

2016.