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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

MARIA FERNANDA FERRARO

Angioedema hereditário: estudo clínico e genético de uma família brasileira

Ribeirão Preto 2010

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MARIA FERNANDA FERRARO

Angioedema hereditário: estudo clínico e genético de uma família brasileira

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências Médicas. Área de concentração: Saúde da Criança e do Adolescente. Orientadora: Prof. Dra. Luisa Karla de Paula Arruda

Ribeirão Preto 2010

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste

trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins

de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

FICHA CATALOGRÁFICA

Ferraro, Maria Fernanda Angioedema hereditário: estudo clínico e genético de uma

família brasileira. Ribeirão Preto, 2010. 90 p. : il. ; 30cm

Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Saúde da Criança e do Adolescente.

Orientadora: Arruda, Luisa Karla de Paula. 1. Angioedema hereditário. 2. Inibidor de C1. 3. Mutação

genética. 4. Serpinas.

Nome: FERRARO, Maria Fernanda

Título: Angioedema hereditário: estudo clínico e genético de uma família brasileira

Tese apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutora em Ciências Médicas.

Aprovado em: __________________________

Banca examinadora

Prof(a) Dr(a):_________________________ Instituição: ___________________________ Julgamento: _________________________ Assinatura: ___________________________ Prof(a) Dr(a):_________________________ Instituição: ___________________________ Julgamento: _________________________ Assinatura: ___________________________ Prof(a) Dr(a):_________________________ Instituição: ___________________________ Julgamento: _________________________ Assinatura: ___________________________ Prof(a) Dr(a):_________________________ Instituição: ___________________________ Julgamento: _________________________ Assinatura: ___________________________ Prof(a) Dr(a):_________________________ Instituição: ___________________________ Julgamento: _________________________ Assinatura: ___________________________

Dedico este trabalho aos meus pais, Julio e LaideJulio e LaideJulio e LaideJulio e Laide – minha fonte de amor, de princípios e valores, base de toda a minha

formação, a quem amo e devo tudo que sou.

Ao meu avô Vitório FerraroVitório FerraroVitório FerraroVitório Ferraro que, se aqui estivesse, alegraria-se e vibraria como ninguém...

AgradecimentosAgradecimentosAgradecimentosAgradecimentos

A DeusDeusDeusDeus que me soprou a vida, que me iluminou sempre, que me deu força nos momentos difíceis, que me protegeu nas minhas cansativas idas e vindas, que é fonte do amor que nos move

À Dra Luisa Karla ArrudaDra Luisa Karla ArrudaDra Luisa Karla ArrudaDra Luisa Karla Arruda, pessoa de imenso valor, que me inspirou desde o primeiro momento com sua exemplar dedicação e entusiasmo pelo trabalho, e com sua competência invejável!

Pelo estímulo, pela generosidade, pelo imenso aprendizado, pela oportunidade de trabalhar ao seu lado e pela honra de ser sua aluna; oferecendo-me a sua confiança e apoio.

À Dra Virgínia FerrianiDra Virgínia FerrianiDra Virgínia FerrianiDra Virgínia Ferriani, pessoa admirável, que, com sua generosidade e comprometimento, contribuiu em diversos momentos da minha formação e com a realização deste trabalho

Ao Dr Willy SartiDr Willy SartiDr Willy SartiDr Willy Sarti, querido mestre, por todo o apoio na execução deste trabalho, pelo estímulo e pela convivência tão enriquecedora

Aos Drs Paulo LouzadaDrs Paulo LouzadaDrs Paulo LouzadaDrs Paulo Louzada e Marluce VilelaMarluce VilelaMarluce VilelaMarluce Vilela por terem aceitado participar da banca examinadora e, em especial, à Dra Cleni MachadoDra Cleni MachadoDra Cleni MachadoDra Cleni Machado por ter contribuído de maneira tão gentil e cuidadosa na

correção desta tese

A Helen ArcuriHelen ArcuriHelen ArcuriHelen Arcuri e ao Prof. Mario PalmaProf. Mario PalmaProf. Mario PalmaProf. Mario Palma pela ajuda com a elaboração dos modelos moleculares

Ao Dr. Konrad BorkDr. Konrad BorkDr. Konrad BorkDr. Konrad Bork, pelo estímulo e disponibilidade em realizar o sequencimento de DNA inicial em seu laboratório na Universidade de Mainz

Ao amigo Erick CastelliErick CastelliErick CastelliErick Castelli, com quem aprendi muito, pela inestimável e paciente ajuda sem a qual esse trabalho não seria possível

À querida Adriana MorenoAdriana MorenoAdriana MorenoAdriana Moreno pelo empenho e pela grande contribuição com o trabalho laboratorial

À Ana BeaAna BeaAna BeaAna Beatriz Rossetti Santostriz Rossetti Santostriz Rossetti Santostriz Rossetti Santos que me ajudou a dar os primeiros passos na biologia molecular, com toda sua paciência, delicadeza e boa vontade

À amiga Ana Paula LangeAna Paula LangeAna Paula LangeAna Paula Lange por ter sido um anjo quando nada parecia dar certo, pelo empenho em querer ajudar e, principalmente, pela amizade sincera e desinteressada...

À Michelle Rodrigues BarbosaMichelle Rodrigues BarbosaMichelle Rodrigues BarbosaMichelle Rodrigues Barbosa pela cooperação no dia-a-dia do laboratório e, principalmente, pela amizade e pelo carinho

Aos colegas Alergistas e Imunologistas Carol , Thaís, GilCarol , Thaís, GilCarol , Thaís, GilCarol , Thaís, Gil e LuanaLuanaLuanaLuana pela contribuição com o atendimento dos pacientes e pelo companheirismo e convívio durante todo esse período

Aos amigosamigosamigosamigos e às IrmãsIrmãsIrmãsIrmãs do pensionato Vita et Paxdo pensionato Vita et Paxdo pensionato Vita et Paxdo pensionato Vita et Pax, que foram minha família e meu lar nos meus longos dias distante de casa

Ao meu pai JulioJulioJulioJulio que, além de todo o apoio, participou ajudando nos mutirões de entrevistas e coletas; e à minha mãe LaideLaideLaideLaide que com suas orações iluminou meu caminho.

Aos meus irmãos, Ana Carolina e Julio CesarAna Carolina e Julio CesarAna Carolina e Julio CesarAna Carolina e Julio Cesar, companheiros da vida inteira, a quem amo com todo meu coração

Ao meu marido ChristianoChristianoChristianoChristiano pelo amor, pela paciência, compreensão, abdicação e por me apoiar sempre

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESPFAPESPFAPESPFAPESP) e à Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do Hospital das Clínicas da FMRP/USP (FAEPAFAEPAFAEPAFAEPA) pelo

apoio financeiro para a realização desta pesquisa.

Ao Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/ USPHospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/ USPHospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/ USPHospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/ USP – território das melhores oportunidades de aprendizado, fundamental para a minha formação científica e

profissional e que possibilitou o desenvolvimento deste trabalho

A todas as pessoas (ffffuncionários, técnicos, colegas,uncionários, técnicos, colegas,uncionários, técnicos, colegas,uncionários, técnicos, colegas, amigosamigosamigosamigos e familiarese familiarese familiarese familiares) que me ajudaram e estiveram ao meu lado durante toda essa jornada contribuindo com seu conhecimento, boa

vontade e estímulo

À Secretaria de Saúde de Carmo do Rio ClaroSecretaria de Saúde de Carmo do Rio ClaroSecretaria de Saúde de Carmo do Rio ClaroSecretaria de Saúde de Carmo do Rio Claro e aos seus funcionáriosfuncionáriosfuncionáriosfuncionários que colaboraram com a realização da coleta de dados

Aos pacientes pacientes pacientes pacientes que, em toda sua simplicidade, souberam valorizar este trabalho, confiaram em nós e se doaram com genuíno desejo de contribuir. Sem eles, nada disso seria possível!

““““A cada dia que vivo, mais me convenço de que o desperdício da A cada dia que vivo, mais me convenço de que o desperdício da A cada dia que vivo, mais me convenço de que o desperdício da A cada dia que vivo, mais me convenço de que o desperdício da vvvvidaidaidaida está no amor que não damos, nas forças que está no amor que não damos, nas forças que está no amor que não damos, nas forças que está no amor que não damos, nas forças que

não usamos, não usamos, não usamos, não usamos, na prudência egoísta que nadana prudência egoísta que nadana prudência egoísta que nadana prudência egoísta que nada arrisca, e que, esquivandoarrisca, e que, esquivandoarrisca, e que, esquivandoarrisca, e que, esquivando----sssseeee do do do do sofrimento,sofrimento,sofrimento,sofrimento,

perdemos também a felicidade.perdemos também a felicidade.perdemos também a felicidade.perdemos também a felicidade.””””

Carlos Drummond de Andrade

RESUMO

Ferraro MF. Angioedema hereditário: estudo clínico e genético de uma família brasileira

[tese]. Ribeirão Preto: Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto,

2010.

O angioedema hereditário (AEH) é uma doença autossômica dominante caracterizada por

episódios de edema subcutâneo e/ou submucoso localizado e não pruriginoso. É causado pela

deficiência de inibidor de C1 (C1-INH) funcional, o que leva à inibição insuficiente das

cascatas plasmáticas formadoras de bradicinina. Aumento nos níveis de bradicinina é evento-

chave na patogênese dos episódios de angioedema. Mais de 200 mutações foram descritas no

gene que codifica o C1-INH (SERPING1). Os objetivos deste estudo foram analisar as

características clínicas de uma numerosa família com caso-índice de AEH e investigar o

defeito genético causador da doença nessa família. O heredograma da família foi construído

com 275 indivíduos relacionados distribuídos em 5 gerações. Desses, 165 foram entrevistados

e tiveram amostras de sangue coletadas para análise genética. Os indivíduos que referiam

história de episódios recorrentes de angioedema e/ou crises de dor abdominal foram avaliados

para AEH, incluindo dosagens de C4 e C1-INH. Identificamos uma nova mutação no gene

SERPING1, c.351delC – deleção de um nucleotídeo citosina no exon 3 – que resulta em

frameshift e stop codon prematuro. Um modelo molecular da proteína truncada hipotética foi

gerado permitindo-nos concluir que, se transcrita, essa proteína não possui atividade

biológica. Vinte e oito membros da família preencheram critérios diagnósticos de AEH e

todos eles apresentaram a mutação c.351delC. Houve ampla variabilidade na apresentação

clínica do AEH nesses pacientes. Os outros 137 indivíduos avaliados sem AEH não

apresentaram a mutação c.351delC. Esta é a família com maior número de indivíduos com

AEH já descrita, e este estudo constitui-se na primeira análise molecular de AEH descrita na

América Latina. O presente estudo fornece evidência definitiva da relação causal entre a nova

mutação genética c.351delC e o desenvolvimento de AEH em pacientes de uma família

brasileira.

Palavras-chave: Angioedema hereditário. Inibidor de C1. Mutação genética. Serpinas.

ABSTRACT

Ferraro MF. Hereditary Angioedema: clinical and genetic study of a Brazilian family [thesis].

Ribeirão Preto: Universidade de São Paulo, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, 2010.

Hereditary angioedema (HAE) is an autosomal dominant disease characterized by episodes of

subcutaneous and submucosal edema. It is caused by deficiency of the active C1 inhibitor

protein (C1-INH), which leads to insufficient inhibition of bradykinin-forming enzymes.

Elevated levels of bradykinin are the key event in the pathogenesis of swelling episodes. More

than 200 mutations in the C1-INH gene (SERPING1) have been reported. The aim of this

study was to analyze the clinical features of a large family with an index case of HAE and to

determine the disease-causing mutation in this family. Family pedigree was constructed with

275 individuals distributed in 5 generations. Of those, 165 were interviewed and had blood

samples collected and analyzed for DNA mutation. Subjects referring history of recurrent

episodes of angioedema and/or abdominal pain attacks underwent evaluation for HAE, which

included measurements of C4 and C1-INH. We have identified a novel SERPING1 mutation,

c.351delC, which is a single-nucleotide deletion of a Citosine on exon 3, resulting in

frameshift with a premature stop codon. A molecular model of the hypothetical truncated CI-

INH protein was generated allowing us to conclude that, if transcription occurs, this protein

has no biological activity. Twenty eight members of the family fulfilled diagnostic criteria for

HAE and all of them presented the c.351delC mutation. Considerable variation in clinical

presentation and severity of the disease was observed among these patients. The others 137

evaluated subjects without HAE do not have the c.351delC mutation. This family has the

largest number of patients with HAE described so far and this study constitutes the first

molecular analysis of HAE described in Latin America. The present study has provided

definitive evidence to link a novel genetic mutation, c.351delC, to the development of HAE in

patients of a Brazilian family.

Keywords: Hereditary angioedema. C1 inhibitor. Genetic mutation. Serpins

LISTA DE APÊNDICES

Páginas

APÊNDICE A - Termo de consentimento livre e esclarecido ....................................... 83

APÊNDICE B - Termo de consentimento livre e esclarecido para menores de 18 anos . 85

APÊNDICE C - Ficha Clínica ...................................................................................... 88

LISTA DE FIGURAS

Páginas

Figura 1 - Ação do C1-INH em suas diferentes vias de inibição.................................. 20

Figura 2 - Análise da permeabilidade vascular em camundongos de diferentes genótipos...................................................................................................

22

Figura 3 - Prof. Maurício Oscar da Rocha e Silva (1910 – 1988)............................ 23

Figura 4 - Mecanismo de ação das serpinas ............................................................... 25

Figura 5 - Algoritmo para diagnóstico de AEH ......................................................... 29

Figura 6 –

Figura 7 –

Figura 8 –

Figura 9 –

Figura 10 -

Figura 11 -

Localização da mutação c.351delC no exon 3 do gene SERPING1............

Cromatograma do sequenciamento de DNA .............................................

Características da proteína inibidor de C1 original e da proteína truncada resultante da ocorrência da mutação c.351delC.........................................

Modelagem molecular ..............................................................................

Análise de produtos de PCR......................................................................

Heredograma ...........................................................................................

49 50

51

52

53

55

LISTA DE GRÁFICOS

Páginas

Gráfico 1 –

Gráfico 2 – Gráfico 3 – Gráfico 4 - Gráfico 5 – Gráfico 6 –

Gráfico 7 –

Gráfico 8 -

Idade de início dos sintomas nos pacientes com AEH .............................

Tempo decorrido entre a idade de início dos sintomas e o diagnóstico em cada um dos pacientes com AEH............................................................. Perfil de gravidade entre os pacientes com AEH da família em estudo...... Comparação da gravidade do AEH entre pacientes do sexo masculino e feminino .................................................................................................

Frequência de ocorrência dos diferentes sintomas entre os pacientes com AEH .......................................................................................................

Apresentação clínica entre os pacientes sintomáticos com AEH ..............

Níveis séricos do inibidor de C1 de acordo com o score de gravidade apresentados pelos pacientes com AEH ..................................................

Tratamento profilático utilizado pelos pacientes sintomáticos com AEH .

58 59

60

60 61 62 63 64

LISTA DE TABELAS

Páginas

Tabela 1 - Aspectos clínicos e laboratoriais associados a angioedema por várias causas.....................................................................................................

31

Tabela 2 - Nomenclatura da mutação identificada de acordo com a numeração de nucleotídeos e aminoácidos em sistemas padronizados.............................

48

Tabela 3 - Características clínicas dos pacientes com angioedema hereditário......... 56

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 15

2 OBJETIVOS ....................................................................................................................... 37

3 SUJEITOS E MÉTODOS ................................................................................................. 39

3.1 Sujeitos ............................................................................................................................. 40

3.2 Coleta de dados ................................................................................................................ 40

3.3 Aspectos éticos ................................................................................................................. 41

3.4 Caracterização clínica e score de gravidade ................................................................. 42

3.5 Dosagem do inibidor de C1 e do componente C4 do complemento............................. 42

3.6 Identificação de mutação no DNA ................................................................................. 43

3.7 Modelagem molecular ..................................................................................................... 45

3.8 Análise estatística ............................................................................................................ 46

4 RESULTADOS ................................................................................................................... 47

4.1 Deleção de um único nucleotídeo citosina associada a angioedema hereditário ....... 48

4.2 Modelagem molecular ..................................................................................................... 52

4.3 Evidências de que a mutação c.351delC é causa de angioedema hereditário na

família em estudo .................................................................................................................. 53

4.4 Heredograma ................................................................................................................... 54

4.5 Características dos pacientes com AEH ........................................................................ 54

4.6 Pacientes com angioedema por outras causas .............................................................. 65

5 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 66

6 CONCLUSÕES .................................................................................................................. 72

REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 74

APÊNDICES .......................................................................................................................... 82

ANEXOS ................................................................................................................................ 89

15

1 INTRODUÇÃO

Introdução 16

1 INTRODUÇÃO

Angioedema hereditário: considerações gerais

O angioedema hereditário (AEH) é uma doença autossômica dominante causada pela

deficiência do inibidor de C1 (C1-INH). Trata-se de uma doença rara, debilitante e

potencialmente fatal que se caracteriza por episódios recorrentes de edema subcutâneo ou

submucoso localizado e não-pruriginoso.

A prevalência da doença é estimada em 1 caso para cada 50.000 pessoas, sem

diferenças entre grupos étnicos.1-4 Embora o AEH seja uma condição rara, é a doença humana

mais comum causada por defeito genético em uma proteína do sistema complemento.5

Angioedema recorrente é um sinal de várias entidades patológicas hereditárias e

adquiridas.6 Na maioria dos casos, episódios de angioedema são relacionados a processos

alérgicos, e as formas não-alérgicas de angioedema são pouco conhecidas na prática médica

levando frequentemente a diagnósticos incorretos e tratamentos inapropriados, que podem

resultar em sofrimento e riscos desnecessários. A semelhança clínica a condições alérgicas

leva os pacientes com AEH a serem considerados alérgicos e tratados com anti-histamínicos e

corticosteróides, ineficazes nessa doença. As crises de edema abdominal podem mimetizar um

quadro de abdome agudo de tal forma que alguns pacientes com AEH têm sido submetidos a

explorações cirúrgicas desnecessárias, em alguns casos por repetidas vezes.1

Histórico

Em 1888, Sir William Osler descreveu pela primeira vez uma forma hereditária de

angioedema, conhecida na época como edema angio-neurótico.7 O defeito bioquímico foi

identificado 75 anos mais tarde quando Donaldson e Evans demonstraram que o soro desses

pacientes continha quantidades diminuídas de uma proteína que era inibidora do primeiro

componente do sistema complemento, designada então como inibidor de C1-esterase 8 –

atualmente chamado de inibidor de C1 (C1-INH).1,9 Desde então vários pesquisadores têm

trabalhado buscando um melhor entendimento da genética, da patogênese e um manejo

clínico apropriado para a doença e, com o melhor conhecimento dos mecanismos

bioquímicos, o termo angio-neurótico foi sendo gradualmente abandonado.

Introdução 17

A terapia de reposição com concentrado do inibidor de C1 purificado de plasma

humano começou a ser utilizada na Europa em 1973 para o tratamento de pacientes com

crises agudas de AEH,1 e em 1980 para o tratamento profilático das crises de angioedema.10

As primeiras mutações no gene que codifica o inibidor de C1 associadas ao

aparecimento de AEH foram descritas em 198911,12 e em 1990-1991 a localização do gene foi

mapeada no cromossomo 11q12-q13.1.13,14 A sequência completa de nucleotídeos do gene

para o inibidor de C1 foi determinada em 1991 por Carter et al,15 e a estrutura tridimensional

da molécula foi resolvida em 2007 por Beinrohr et al.16

Características clínicas

Os sintomas do AEH são causados por extravasamento de plasma para as camadas

cutâneas ou mucosas mais profundas, como consequência da liberação local de peptídeos

vasoativos. Os episódios de angioedema não são acompanhados de urticária e envolvem

tipicamente a pele, o trato gastrintestinal e a laringe.6,9

Sintomas cutâneos: o edema cutâneo pode afetar qualquer parte do corpo, embora

ocorra tipicamente na face, extremidades e genitais, e se caracteriza por ter margens mal

definidas, não apresentar prurido ou eritema, e desfigurar o local afetado levando à perda

temporária de função.1

Sintomas abdominais: dor abdominal recorrente ocorre como consequência de edema

da parede gastrintestinal e é referida por cerca de 70% dos pacientes. Esse é um aspecto

distintivo da deficiência de inibidor de C1, já que o envolvimento abdominal é raramente

observado em angioedema por outras causas. Os sintomas podem variar de um desconforto

leve a uma dor intensa, intratável, acompanhada de náuseas, vômitos e/ou diarreia.1 Os sons

intestinais estão frequentemente diminuídos ou silenciosos e defesa abdominal pode estar

presente ao exame físico. O extravasamento de fluidos para o interstício ou cavidade

peritoneal durante as crises abdominais pode levar a hipotensão clinicamente significante, e

leucocitose moderada pode ser encontrada durante a crise.1,2 Esse conjunto de achados pode

mimetizar emergências cirúrgicas (abdome agudo), levando a explorações cirúrgicas

desnecessárias em até 1/3 dos pacientes com AEH não diagnosticado.1 Pacientes com AEH

que apresentam apenas crises abdominais são raros, mas já foram descritos.17 Sintomas

abdominais com frequência aparecem na infância e podem preceder o edema subcutâneo em

vários anos.18

Introdução 18

Sintomas laríngeos: os episódios de edema de laringe constituem a situação de maior

risco para os pacientes com AEH, sendo que mais da metade deles desenvolvem pelo menos 1

episódio durante a vida.19 Dados históricos sugerem que, no passado, 30% dos pacientes com

AEH morriam por asfixia. Mesmo hoje, pacientes eventualmente vão a óbito por asfixia,

particularmente na ausência de diagnóstico apropriado.1,2

Os sintomas se iniciam mais comumente durante a infância (idade escolar), se

agravam durante a puberdade e persistem por toda vida, com gravidade imprevisível. No

entanto, os sintomas podem ter início em qualquer idade, mesmo durante o 1º ano de vida ou

aos 70 – 80 anos de idade.3,9,20 Cerca de 50% dos pacientes apresentam sintomas na primeira

década de vida e outros 30% iniciam os sintomas na segunda década.1 Estima-se que 5% dos

adultos portadores de mutação no gene C1-INH sejam assintomáticos.21

A frequência e a gravidade dos sintomas é extremamente variável entre os indivíduos e

costuma variar também no mesmo indivíduo em diferentes períodos da vida. Um

levantamento entre pacientes italianos mostrou que pouco menos de 1/3 dos mesmos com

AEH têm mais do que 1 crise por mês (alguns a cada 5 dias); 40% têm de 6 a 11 episódios por

ano; e os outros 30% têm sintomas infrequentes ou são assintomáticos.1 Pacientes podem

permanecer longos períodos sem crises de AEH e então os sintomas surgem novamente, por

vezes ainda mais intensos. Não se conhecem as razões para tal variação.9 Essa variação da

expressão fenotípica não se correlaciona com os níveis séricos do inibidor de C1 e é

habitualmente inconsistente entre os grupos familiares. Dessa forma, se pode concluir que

outros fatores, genéticos ou ambientais, além da deficiência do inibidor de C1 interferem na

tendência do paciente em desenvolver angioedema.1 Os episódios de angioedema são

esporádicos e normalmente ocorrem sem nenhuma causa precipitante aparente, no entanto,

existem alguns fatores desencadeantes conhecidos, tais como: traumas mecânicos, stress,

procedimentos cirúrgicos ou dentários, alterações hormonais, drogas (ex: inibidores da

enzima conversora da angiotensina, contraceptivos orais) e infecções. 2,21

O padrão de herança autossômica dominante prediria incidência e gravidade

semelhantes entre os sexos, mas a maioria dos especialistas nota uma predominância de

mulheres buscando tratamento. Isso pode representar um viés de seleção, mas pode ser

também reflexo das influências hormonais na gravidade da doença. Estrógenos causam

aumento da freqüência e intensidade das crises. Algumas pacientes são tratadas com a simples

suspensão de contraceptivos orais e muitas mulheres notam que a frequência dos episódios é

maior durante o período menstrual.9 A gravidez tem efeito variável na gravidade da doença,

mas as crises são raras durante o parto.2

Introdução 19

As crises de angioedema normalmente seguem um curso previsível. Muitos episódios

são precedidos por um pródromo (normalmente uma sensação de formigamento) e alguns

pacientes referem aparecimento de eritema marginatum – um rash serpinginoso, não

pruriginoso e sem formação de pápulas ou placas. O edema classicamente progride nas

primeiras 24 horas e então regride gradualmente nas próximas 48 a 72 horas, mas isso pode

ser variável.2,9

Trata-se de uma doença com grande impacto econômico e social. A freqüente

necessidade de intervenções médicas, tratamento contínuo a longo-prazo e as interrupções nas

atividades diárias, especialmente no trabalho, levam frequentemente a prejuízos na qualidade

de vida, educação, carreira, além dos altos custos financeiros.

Fisiopatologia

Os sintomas do AEH não são mediados por histamina e não respondem bem aos anti-

histamínicos ou corticosteróides. A doença resulta da deficiência funcional e/ou quantitativa

do inibidor de C1, proteína membro da família das Serpinas (serpin, serine protease

inhibitor), que é o principal inibidor de várias proteases do sistema complemento (C1r, C1s,

MASP 1 e MASP 2) e das proteases do sistema de contato (calicreína e fator XIIa), e um

inibidor menos importante do sistema fibrinolítico (plasmina e plasminogênio tecidual).

Durante as crises de AEH, essas cascatas proteolíticas plasmáticas são ativadas e

várias substâncias vasoativas são liberadas.2,22,23 Estudos têm demonstrado de forma

consistente que a bradicinina é o principal mediador do aumento da permeabilidade capilar

nas crises de AEH.20,24

A ativação da cascata plasmática formadora de bradicinina compreende um complexo

processo de 3 passos em que ocorre ativação do fator XII (fator de Hageman), conversão da

pré-calicreína em calicreína plasmática e digestão do cininogênio de alto peso molecular, com

liberação de bradicinina. A cascata é ativada in vitro pela ligação do fator XII e de um

complexo de pré-calicreína e cininogênio de alto peso molecular a superfícies iniciadoras (ex:

silicatos, endotoxinas, cristais de ácido úrico). No entanto, in vivo, traumas na superfície

endotelial ou em outros tecidos podem expor superfícies iniciadoras (ex: proteínas de carga

negativa) que ativam o fator XII e iniciam cascatas fator XII-dependentes. A pré-calicreína

circula ligada ao cininogênio de alto peso molecular e é convertida em calicreína plasmática

pelos fatores XIIa e XIIf. A calicreína plasmática então cliva o cininogênio de alto peso

molecular, liberando bradicinina. O inibidor de C1 se liga ao sítio ativo da calicreína

Introdução 20

plasmática bloqueando a sua habilidade de clivar o cininogênio de alto peso molecular e de

ativar o fator XII. Além disso, ele é o único inibidor plasmático significativo para os fatores

XIIa e XIIf, controlando virtualmente todas as reações da cascata plasmática formadora de

bradicinina (Figura 1).

Figura 1. Ação do C1-INH em suas diferentes vias de inibição. Na via clássica do complemento o componente C1(protease) é ativado e então agrega C2 e C4 formando a C3 convertase (barras horizontais sobre os nomes indicam ativação). Na via de ativação do Sistema de Contato, traços de fator XIIa e/ou contato com superfícies iniciadoras ativam o fator XII que ativa a pré-calicreína em calicreína plasmática. Esta, por sua vez, ativa o próprio fator XII e cliva o cininogênio de alto peso molecular, liberando bradicinina. O fator XIIa também ativa o fator XI em fator XIa, levando a aumento na formação de fibrina. Na Via Fibrinolítica, o plasminogênio é ativado em plasmina que cliva a fibrina. Atividade proteolítica (ativação) está indicada pelas setas verdes e os passos inibidos pelo C1-INH com as barras vermelhas em “T”. (Modificada de Zuraw, 2008).2

Introdução 21

O primeiro componente do sistema complemento torna-se instável na ausência do

inibidor de C1, ocorrendo uma lenta auto-ativação de C1r. Esta é a provável razão pela qual

os níveis de C4 estão diminuídos em 95% dos pacientes com AEH, mesmo enquanto

assintomáticos. Durante um episódio de angioedema há maior ativação de complemento, os

níveis de C4 tendem a zero e os níveis de C2 caem. O C1 ativado forma complexos com o

inibidor de C1 diminuindo ainda mais os seus níveis. A ativação de C1r e C1s pelo fator XIIf

explica a diminuição nos níveis de C4 e C2 que coincidem com as crises de angioedema. Os

níveis de outros componentes do complemento e de anafilatoxinas são normais.25

As principais evidências que, em conjunto, demonstram ser a bradicinina o principal

mediador do angioedema na deficiência do inibidor de C1 são as seguintes: 1) pré-calicreína e

cininogênio de alto peso molecular são depletados durante as crises de angioedema e o

cininogênio de alto peso molecular é amplamente clivado;26,27 2) níveis de bradicinina estão

elevados em plasma de pacientes com AEH e no efluente venoso de um braço edemaciado

comparado com o braço não afetado;28 3) modelo animal com deficiência do inibidor de C1

apresentando edema e vasodilatação semelhantes aos de pacientes com AEH foi efetivamente

tratado por knockout do receptor B2 da bradicinina (Figura 2);29 4) uma família com uma

mutação singular do gene C1-INH, que é incapaz de inibir a ativação de C1, mas inibe

normalmente o fator XIIa e a calicreína plasmática, não apresenta evidência de angioedema

em uma grande coorte.30

Introdução 22

Bradicinina

O nonapeptídeo bradicinina é um potente mediador local de vasodilatação e aumento

da permeabilidade vascular, particularmente em vênulas pós-capilares, que produz seus

efeitos através da estimulação dos receptores B2 ligados a Proteína-G (B2R).

A bradicinina foi descoberta pelo médico e cientista brasileiro Dr. Mauricio Rocha e

Silva (Figura 3), no curso de experimentos conduzidos no Instituto Biológico em São Paulo,

ao investigar o papel fisiológico do veneno de cobra jararaca (Bothrops jararaca).31 Rocha e

Silva et al relataram que a adição de amostra de sangue de cachorro obtida após a injeção de

quantidades diminutas do veneno de jararaca a preparação de intestino de guinea pig, ou a

adição in vitro de soro de cachorro juntamente com veneno de jararaca a essa preparação,

tinham um efeito marcante de contração do intestino. Os autores usaram então o termo

Figura 2. Análise da permeabilidade vascular em camundongos de diferentes genótipos. Foi feita aplicação endovenosa de corante azul de Evans em camundongos de diferentes genótipos e observou-se que o extravasamento do corante após 15-30 minutos foi muito mais extenso nos camundongos deficientes de C1-INH (Knockout para o gene do C1-INH) (b) do que nos camundongos wildtype (a). A diferença na extensão do extravasamento ficou claramente demonstrada pela coloração das patas traseiras dos camundongos de cada genótipo. A administração de C1-INH humano resultou em redução da permeabilidade vascular, assim como a combinação de deficiência do receptor B2 da bradicinina (Bk2R) associada à deficiência de C1-INH (c). (Modificado de Han et al, 2002).29

Introdução 23

bradicinina para identificar essa substância presente no plasma ou no soro que produzia um

movimento mais lento do intestino, quando comparado ao efeito de outras substâncias como a

histamina e acetilcolina. Preparação de bradicinina purificada também causou uma queda

brusca e intensa da pressão arterial quando injetada via endovenosa em cães e gatos, levando

a estado de choque, seguida de um lento retorno da pressão arterial a níveis basais.31 A

presença de um potente agente hipotensor e estimulante de músculo liso em plasma ou soro

oferecia uma nova possibilidade para explicar a etiologia de muitos sintomas que ocorrem em

choque causado por venenos. Estudos subsequentes desenvolvidos por Rocha e Silva e Sérgio

Ferreira na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto resultaram na identificação da fração

peptídica do veneno de Bothrops jararaca que potencializava a ação da bradicinina em vários

órgãos isolados e na pressão arterial de gatos. Os autores demonstraram que esse fator,

denominado Bradykinin Potentiating Factor, causava inibição da ação de enzimas que

degradam a bradicinina.32

Essas descobertas por pesquisadores brasileiros forneceram a base para o

desenvolvimento dos inibidores da Enzima Conversora da Angiotensina (inibidores da ECA),

introduzidos em 1981, que são medicações amplamente utilizadas no tratamento da

hipertensão arterial e insuficiência cardíaca congestiva em todo o mundo, com grande

eficácia. De forma interessante, um dos efeitos adversos do uso de inibidores da ECA é o

aparecimento de angioedema que ocorre em cerca de 0,7% dos pacientes, e que se assemelha

ao AEH em muitos de seus aspectos clínicos. O mecanismo principal do angioedema por

inibidores da ECA, que é classe-específico, não é completamente conhecido, entretanto

Figura 3. Prof. MAURÍCIO OSCAR DA ROCHA E SILVA (1910 – 1988). Médico pesquisador do Instituto Biológico, aonde realizou os experimentos que levaram à descoberta da Bradicinina, em colaboração com o fisiologista Wilson Beraldo e o hematologista Gastão Rosenfeld em 1948. Na década de 40 liderou o movimento para a criação da Sociedade Brasileira para o Progresso da Ciência – SBPC. Em 1957, no auge de sua carreira, foi convidado a lecionar na então recém-fundada Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP, aonde foi Professor do Departamento de Farmacologia. O professor, Dr. Maurício Rocha e Silva foi um “homem culto, criativo e corajoso, inteligência privilegiada, lutador incansável, trabalhador invencível, um idealista, um sonhador que se guiou pela intuição”.34

Introdução 24

evidências consistentes indicam que há aumento da bradicinina por diminuição da degradação

da mesma pela ECA e, possivelmente, deficiência quantitativa e/ou qualitativa de outras

proteases alternativas que têm ação na degradação da bradicinina, incluindo Aminopeptidase

P (APP) e Dipeptidilpeptidase IV (DPPIV).33

Inibidor de C1: aspectos genéticos, estrutura e mecanismo de ação

O gene SERPING, que codifica o inibidor de C1, inclui 8 exons distribuídos em uma

região de 17kb e está localizado na sub-região q12-q13 do cromossomo 11.1,35 Codifica uma

proteína de 500 aminoácidos, incluindo um signal peptide de 22 aminoácidos. A proteína

madura tem, portanto, 478 aminoácidos e é fortemente glicosilada (aproximadamente 30% do

seu peso), contendo 13 sítios de glicosilação. Embora a proteína migre com peso molecular

de 104 kDa em análise por SDS-PAGE, o seu peso molecular calculado é um pouco mais

baixo, sendo de 76 kDa. O inibidor de C1 consiste de um domínio N-terminal de 113

aminoácidos e um domínio serpina de 365 aminoácidos. A região N-terminal é área de

glicosilação intensa, entretanto sua função não é bem conhecida. Duas pontes dissulfeto ligam

a Cisteina 101 à Cisteina 406; e a Cisteina 108 à Cisteina 183, conectando os domínios N-

terminal e C-terminal, e acredita-se que essas ligações dissulfeto tenham papel na estabilidade

da molécula. A atividade enzimática está localizada no domínio serpina. A estrutura do

domínio serpina é homóloga àquela de outras serpinas e é essencial para a atividade inibitória

da molécula; a deglicosilação não modifica a atividade enzimática.36

O inibidor de C1 é membro da superfamília das serpinas, que constituem uma classe

de proteinas altamente conservadas através da evolução, cuja principal função é regular a

atividade das serina proteases. Alfa-1-antitripsina é considerada o arquétipo das serpinas. A

estrutura tridimensional das serpinas mostra que elas são proteínas globulares com α -hélices,

β-sheets e uma alça central reativa móvel (Reactive Central Loop RCL). O domínio serpina do

inibidor de C1 humano recombinante foi recentemente cristalizado na sua chamada “forma

latente” que é a conformação da serpina inativa, sem clivagem da alça central reativa, a partir

de um construct iniciando no aminoácido de número 97 da proteína madura.16 Após a ligação

covalente do sítio ativo da protease alvo com o resíduo de aminoácido da alça central reativa

do inibidor, a protease é inativada por um mecanismo tipo “ratoeira” sendo transferida do

polo superior ao polo inferior da proteína enquanto a alça central reativa é inserida na

molécula (Figura 4).37 Esse elegante mecanismo é quase invariavelmente destruído por

Introdução 25

mutações pontuais.5 O complexo serpina-protease é rapidamente eliminado da circulação. No

caso do inibidor de C1, a meia vida plasmática para o clearance de complexos com várias

proteínas alvo varia de 20 a 47 minutos.36

Figura 4. Mecanismo de ação das serpinas. a) o passo inicial é a ligação da protease livre ao resíduo P1 apresentado pela alça reativa central (RCL) da serpina em sua forma ativa; b) a protease cliva a RCL causando uma profunda alteração conformacional na molécula da serpina enquanto a protease é deformada e translocada para o polo oposto da molécula do inibidor, resultando em inibição enzimática por distorção do sítio ativo; c) o complexo exibe novos epítopos que promovem a internalização celular e degradação. Desta forma, o complexo protease-serpina pode ser considerado, de maneira geral, biologicamente irreversível, e o mecanismo é considerado como “suicida”. (Modificada de Cugno et al, 2009).38

Introdução 26

Mutações no gene SERPING1 associadas a angioedema hereditário

De acordo com a base de dados de mutações no gene do inibidor de C1 (HAEdb,

http://hae.enzim.hu), mais de 200 mutações diferentes foram identificadas em pacientes com

AEH até o momento, indicando a heterogeneidade genética da doença.39 Apesar da extrema

variabilidade na frequência e gravidade dos sintomas, estes não se correlacionam com o tipo

de defeito genético. Mutações missense constituem o maior grupo de mutações no gene

SERPING1 resultando em AEH (34,2%), seguidas por alterações de frameshift (24,4%),

defeitos splice-site (9,4%), mutações nonsense (7,1%), pequenas inserções ou deleções (6,8%)

e mudanças no promotor (1,1%).39,40 A taxa de mutações espontâneas (mutações de novo) no

SERPING1 é de 25%, ou seja, mutações identificadas naqueles pacientes com AEH que não

possuem história familiar da doença.1,2,9,40 Apesar do conhecimento das mutações que levam

ao aparecimento do AEH, tem sido descrita de forma consistente uma correlação pobre entre

o tipo particular de mutação, os níveis plasmáticos do C1-INH e o fenótipo da doença.41,42

Classificação

O AEH tem sido tradicionalmente classificado em dois tipos, de acordo com as

concentrações antigênicas e atividade funcional do C1-INH: AEH tipo I - engloba a maioria

(85%) dos casos e AEH tipo II – 15% dos casos. Os dois tipos são indistinguíveis do ponto de

vista clínico, mas são causados por tipos de mutação diferentes. As mutações no gene

SERPING1 que causam AEH tipo I ocorrem por todo o gene e resultam em proteínas

truncadas que não são eficientemente secretadas, levando a níveis antigênicos e funcionais do

C1-INH diminuídos. As mutações que causam o AEH tipo II normalmente envolvem o exon 8

(no sítio ativo ou perto dele) e resultam na secreção de uma proteína mutante que é

disfuncional e, desta maneira, os níveis antigênicos do C1-INH são normais ou pouco

aumentados, mas sua atividade funcional encontra-se reduzida.1,2,5,40,43

Mais recentemente foi descrito um terceiro tipo de angioedema familiar (AEH tipo III)

no qual os pacientes apresentam níveis antigênicos e funcionais do C1-INH normais.35,44,45 As

primeiras descrições indicavam a dependência de níveis elevados de estrógeno, sendo que os

sintomas acometiam apenas mulheres, particularmente durante a gestação ou durante

tratamento com estrógenos exógenos. Posteriormente foram descritas famílias com indivíduos

do sexo masculino também acometidos.6 Clinicamente o AEH tipo III é indistinguível dos

http://hae.enzim.hu/�

Introdução 27

tipos I e II, exceto por apresentar uma maior porcentagem de episódios faciais de

angioedema.46 Muitos, mas não todos os indivíduos com AEH tipo III apresentam uma

mutação de ganho de função no fator XII da coagulação que pode induzir ao aumento na

geração de bradicinina.47-51

Diagnóstico

Longos atrasos no diagnóstico são comuns em pacientes com AEH. O tempo médio

entre o início dos sintomas e o diagnóstico era de 22 anos em 1977 e de um pouco mais que

10 anos em 2005, de acordo com registros Europeus. No Brasil, essa média deve ser ainda

maior considerando-se o pouco conhecimento a respeito da doença e a carência de centros de

referência na maioria das regiões brasileiras.

O diagnóstico deve ser suspeitado em qualquer indivíduo que apresente episódios

recorrentes de angioedema e/ou dor abdominal na ausência de urticária associada e/ou

naqueles indivíduos com história familiar positiva. A avaliação diagnóstica feita antes de 1

ano de idade pode não ser confiável e deve ser confirmada após essa idade (exames falso-

negativos ou falso-positivos podem ocorrer a não ser que seja feita análise genética).3,4,19,52

Deve-se considerar que, embora a maioria dos pacientes refira história familiar de

angioedema, até 25% são portadores de mutações de novo. Portanto, história familiar não é

necessária para se estabelecer o diagnóstico de AEH.20

Exames laboratoriais são necessários para confirmar ou excluir o diagnóstico.

Praticamente todos os pacientes com AEH apresentam níveis séricos ou plasmáticos de C4

diminuídos permanentemente, níveis de C2 diminuídos apenas durante as crises de

angioedema e níveis normais de C1 e C3. A dosagem dos níveis de C4 é um teste de

screening eficiente em termos de custo para excluir o diagnóstico de AEH, embora em raros

casos (cerca de 2 %), os níveis de C4 possam estar normais entre as crises. No entanto, uma

dosagem normal de C4 durante uma crise de angioedema torna o diagnóstico de AEH

muitíssimo improvável.2,3 Para se completar o diagnóstico de AEH, dosagens subsequentes

dos níveis antigênicos e da atividade funcional (em alguns casos) do C1-INH são necessárias.

Níveis antigênicos diminuídos confirmam o diagnóstico de AEH tipo I. Caso os níveis

antigênicos sejam normais, a avaliação da atividade funcional do C1-INH é necessária e, se

diminuída, confirma o diagnóstico de AEH tipo II (níveis antigênicos normais, porém

atividade funcional do C1-INH diminuída). A maioria dos consensos orienta que os testes

sejam repetidos uma vez para confirmação do diagnóstico.1,3,35 O Quadro 1 indica os critérios

Introdução 28

diagnósticos sugeridos pelo Third C1 Esterase Inhibitor Deficiency Workshop de 2003,1 e a

Figura 5 apresenta algoritmo para diagnóstico sugerido pelo International consensus

algorithm for the diagnosis, therapy and management of hereditary angioedema de 2010.3

CRITÉRIOS CLÍNICOS:

Maiores

1. Angiodema auto-limitado, não-inflamatório, sem urticária, geralmente recorrente e com duração maior que 12 horas

2. Dor abdominal de remissão espontânea, sem causa orgânica determinada, geralmente recorrente e com duração maior que 6 horas

3. Edema de laringe recorrente

Menor

4. História familiar de angioedema recorrente e/ou dor abdominal e/ou edema laríngeo

CRITÉRIOS LABORATORIAIS

1. Níveis antigênicos do inibidor de C1 diminuídos em 2 determinações distintas com paciente assintomático e após o primeiro ano de vida

2. Atividade diminuída do inibidor de C1 em 2 determinações distintas com paciente assintomático e após o primeiro ano de vida

3. Mutação no gene codificador do inibidor de C1, alterando a síntese ou função da proteína

O diagnóstico pode ser estabelecido na presença de 1 critério clínico maior (1-3) e 1 critério laboratorial

Quadro 1. Critérios para diagnóstico de angioedema causado por deficiência do inibidor de C1 (Agostoni et al, 2004, tradução nossa).1

Introdução 29

Figura 5. Algoritmo para diagnóstico de AEH (Bowen et al, 2010, tradução nossa).3

Introdução 30

Diagnóstico diferencial

Além da forma hereditária, existe uma forma adquirida de angioedema por deficiência

do inibidor de C1, que não é o foco deste trabalho. O Angioedema Adquirido (AEA) está

frequentemente associado a doenças linfoproliferativas, neoplásicas, infecciosas ou

autoimunes e ocorre pelo consumo acelerado do inibidor de C1, relacionado muitas vezes à

presença de auto-anticorpos que inativam o C1-INH.1 O AEA apresenta sintomas semelhantes

aos do AEH, mas se diferencia pela ausência de história familiar, idade de início dos sintomas

mais tardia (normalmente durante ou após a 4ª década) e níveis plasmáticos de C1q

diminuídos, como mostra a Figura 5.2,3,4,53

Angioedema é efeito adverso conhecido da terapia com inibidores da enzima

conversora da angiotensina (I-ECA), ocorrendo em 0,1 a 0,7% dos pacientes tratados. O

angioedema induzido por I-ECA, assim como o AEH, tem como seu principal mediador a

bradicinina e afeta mais frequentemente face, pescoço, lábios, língua e laringe. O mecanismo

do angioedema induzido por I-ECA se dá pela própria inibição da ECA (envolvida na

degradação da bradicinina) que bloqueia a conversão da angiotensina e reduz o catabolismo

da bradicinina, aumentando sua atividade.33 O angioedema ocorre mais comumente no início

do tratamento com I-ECA, mas pode se desenvolver anos após o uso da droga ter sido

iniciado. Vários fatores de risco para o angioedema induzido por I-ECA têm sido

identificados, incluindo: raça negra, sexo feminino, tabagismo, idade superior a 65 anos,

alergias, obesidade, cirurgia ou trauma nas vias aéreas superiores, apneia do sono e

imunossupressão em receptores de transplantes cardíaco ou renal. Como o angioedema por

I-ECA é um efeito classe-dependente, deve ser feita a substituição da droga por um anti-

hipertensivo de outra classe.54

Várias formas de angioedema e as principais características diferenciais estão descritas

na Tabela 1.2

Introdução 31

Introdução 32

Tratamento

O manejo ideal do AEH deve incluir o tratamento das crises agudas, profilaxia de

curto prazo em situações de risco conhecido, e profilaxia de longo-prazo buscando minimizar

a frequência e a gravidade das crises.

Tratamento das crises. Terapia de reposição com inibidor de C1 purificado do plasma,

pasteurizado (Berinert P®, CSL Behring) e nanofiltrado (Cinryze®, ViroPharma) tem se

mostrado altamente efetiva e segura e constitui o principal tratamento para as crises de AEH

em vários países. Em geral, as crises começam a se resolver dentro de 30 a 60 minutos após

injeção intravenosa do inibidor de C1.2,55,56 A terapia é utilizada na Europa há mais de 30

anos21 e só foi aprovada pelo Food and Drug Administration (FDA) nos Estados Unidos em

2009 para o tratamento da crise aguda.55 O inibidor de C1 não é licenciado e disponível no

Brasil.

Como alternativa, em nosso meio dispomos do plasma fresco congelado. O plasma

fresco congelado contém inibidor de C1 e vários estudos não controlados têm relatado

benefício do seu uso nas crises agudas de AEH. No entanto, esse uso é controverso, uma vez

que o plasma fresco congelado também contém proteínas do sistema de contato que podem

servir como substrato para a geração adicional de bradicinina, o que poderia exacerbar os

ataques em alguns pacientes.1-3 A experiência clínica indica que o uso de epinefrina na crise

aguda de angioedema pode trazer um benefício transitório, ocasionalmente prevenindo a

necessidade de intubação nos pacientes com angioedema de laringe.1 Anti-histamínicos e

corticoesteróides não trazem benefícios durante as crises de AEH e não devem ser usados

com essa indicação.2 Não há dados suficientes para se recomendar formalmente o uso dos

andrógenos ou dos antifibrinolíticos no tratamento da crise aguda, porém, na ausência de

outras alternativas terapêuticas eles podem ser utilizados.1,3,4 Alguns argumentam que,

embora sejam eficazes na profilaxia das crises de AEH, essas drogas demoram alguns dias

para atingirem seus efeitos terapêuticos – o que as torna inapropriadas para o tratamento das

crises agudas.2

Mais recentemente, novos tratamentos têm sido aprovados para as crises de AEH. Há

poucos meses, uma nova droga para o tratamento das crises de AEH foi aprovada para uso no

Brasil – o icatibanto (Firazyr®, Shire), que é utilizado desde 2008 na Europa, mas ainda não

foi aprovado pelo FDA nos Estados Unidos.55 Trata-se de um peptídeo contendo 10

aminoácidos que atua como antagonista seletivo do receptor B2 da bradicinina. Estudos

Introdução 33

mostraram que o icatibanto reverte o aumento da permeabilidade vascular em camundongos

knockout para o inibidor de C1,24 inibe a vasodilatação mediada por bradicinina em humanos

e, em estudo de fase 1, mostrou inibição dose-dependente dos efeitos induzidos pela

bradicinina in vivo.57 Em estudo de fase 2, os sintomas melhoraram significativamente após

tratamento open-label com icatibanto em 15 pacientes com AEH apresentando crises de

angioedema cutâneo ou dor abdominal.58 Em 2 estudos recentes de fase 3 – um placebo-

controlado e outro comparando icatibanto com ácido tranexâmico – a aplicação de icatibanto

subcutâneo reduziu o tempo para alívio dos sintomas em pacientes com crises agudas, embora

a diferença tenha atingido significância apenas no segundo estudo.59 Embora o icatibanto se

apresente como a única alternativa terapêutica eficaz disponível em nosso país, o seu alto

custo ainda limita o uso para a maioria dos pacientes em nosso meio.

O ecallantide (Kalbitor®, Dyax) é uma proteína de 60 aminoácidos com potente ação

de inibição específica para a calicreína plasmática, e não tem efeitos no sistema complemento

ou no sistema da coagulação. Em estudos prévios, envolvendo mais de 100 pacientes com

AEH, o ecallantide mostrou um bom perfil de segurança e eficácia nas crises agudas.55 Em

recente publicação, Cicardi et al 60 apresentaram os resultados de estudo de fase 3 placebo-

controlado. O uso de ecallantide subcutâneo se mostrou seguro e eficaz quando comparado ao

placebo em crises agudas. A segurança, eficácia e antigenicidade no uso a longo-prazo ainda

devem ser avaliadas. O ecallantide foi aprovado pelo FDA para o tratamento das crises agudas

de AEH em 2009, mas ainda não foi licenciado na Europa e no Brasil.55

O manejo da dor, a reposição de fluidos e os cuidados de suporte são essenciais, mas

não afetam o prognóstico das crises.

Profilaxia de curto prazo. O tratamento profilático de curto-prazo é útil para prevenir

ataques de AEH em pacientes com exposição programada a situações de risco, tais como

procedimentos dentários, procedimentos médicos invasios ou cirurgias.

Consensos e recomendações baseados em estudos não controlados recomendam que os

pacientes com AEH se protejam de crises graves com uso de:

1) Inibidor de C1 endovenoso (500 a 1500 U administrado 1 hora antes do

procedimento) OU - se não houver disponibilidade do inibidor de C1,

2) altas doses de andrógenos atenuados (ex: danazol 200 mg por via oral 3 vezes ao

dia) por 5 a 10 dias antes do procedimento OU

3) plasma fresco congelado (2U via endovenosa 1 a 12 horas antes do procedimento).

Introdução 34

Embora o plasma fresco congelado seja mais caro quando comparado aos andrógenos

e associado ao risco de infecções, ele é geralmente mais efetivo em prevenir ou minimizar os

ataques – ao contrário do seu papel controverso no tratamento dos ataques agudos.

Profilaxia de longo-prazo. A profilaxia de longo-prazo deve ser considerada para

aqueles pacientes que apresentam crises graves e/ou frequentes (mais que 1 vez ao mês) ou

quando tratamentos efetivos para as crises agudas não estiverem disponíveis. A profilaxia

pode ser feita com andrógenos atenuados, agentes antifibrinolíticos ou concentrado de

inibidor de C1.1,2,3,35

Andrógenos sintéticos atenuados, como Danazol e Stanazolol, são as drogas mais

comumente utilizadas para o tratamento profilático do AEH. Os mecanismos pelos quais estas

drogas beneficiam os pacientes com AEH não são totalmente compreendidos, mas há

evidências de que elas estimulam a síntese hepática do inibidor de C1 pelo alelo normal,

reduzindo significantemente a frequência das crises. As principais contra-indicações para o

tratamento com andrógenos são: gravidez, lactação, câncer, hepatite e infância. Os efeitos

adversos são dose-dependente e incluem virilização, ganho de peso, acne, hirsutismo,

alteração da libido, alteração na voz, irregularidade menstrual, sintomas vasomotores,

cefaléia, depressão, hipertensão arterial, aterogênese, alteração do metabolismo lipídico,

hepatotoxicidade, neoplasias hepáticas, eritrocitose, cistite hemorrágica e genitália ambígua

em recém-nascidos de mães tratadas durante a gravidez.1,2,3,35 No entanto, estudos

demonstram que os efeitos colaterais são raros e, em geral, leves, quando se utiliza a dose

mínima eficaz para o controle dos sintomas, mesmo após 10 anos de tratamento.61,62,63 Assim

sendo, é fundamental que a dose de manutenção seja ajustada individualmente até a mínima

dose efetiva para o controle clínico dos sintomas - exames laboratoriais não são úteis na

determinação da dose. Durante o uso dessas drogas deve ser feito monitoramento semestral

com enzimas hepáticas, perfil lipídico, hemograma e urinanálise, além de ultrasom de fígado

anual. A indução com andrógenos pode ser feita com doses altas (ex: 400 a 600 mg de

danazol/dia) seguida de redução, ou com doses baixas progredindo a doses maiores buscando

a dose de manutenção mais baixa capaz de manter o controle dos sintomas (dose máxima

diária recomendada para manutenção: 200 mg de danazol ou 2 mg de Stanazolol).1,3,4, 63

Entre os agentes antifibrinolíticos, o Ácido Tranexâmico é mais eficaz que o Ácido

Epsilon Aminocapróico, porém ambos são menos eficazes que os andrógenos para o

tratamento profilático do AEH.1,3,4 São drogas que atuam diretamente na Via da Coagulação,

inibindo a ativação do plasminogênio em plasmina e, indiretamente, levam a diminuição na

Introdução 35

formação de bradicinina – a plasmina possui um efeito catalizador indireto na clivagem do

cininogênio de alto peso molecular.64 São utilizados principalmente para profilaxia em

crianças antes do estadio puberal Tanner V, em gestantes e em adultos que não toleram ou não

aceitam os riscos dos efeitos colaterais dos andrógenos.35 Os principais efeitos adversos

incluem mialgia, fraqueza muscular, níveis elevados de creatina fosfoquinase ou aldolase.

Deve ser feito monitoramente semestral com CK, exame de urina, função renal, enzimas

hepáticas e exame oftalmológico anual para avaliação da pressão ocular (risco de glaucoma).

O uso deve ser criterioso se há história familiar de trombofilia ou doença tromboembólica

ativa. A dose não está bem estabelecida, mas recomenda-se início com 20 a 50 mg/kg/dia

(máximo 4 a 6 g/dia), buscando-se a menor dose efetiva para o controle dos sintomas.3

Em alguns países da Europa e nos EUA o uso da terapia de reposição com

concentrado de inibidor de C1 derivado de plasma para profilaxia a longo-prazo do AEH já

foi aprovado e vem sendo utilizado com sucesso – são administradas 500 a 1000 U por via

endovenosa a cada 3 ou 4 dias.3,4,65 No entanto essa terapia ainda não está disponível no Brasil

nem mesmo para o tratamento das crises agudas.

Pacientes com AEH devem ser advertidos a evitar estímulos que possam precipitar as

crises agudas. Como os inibidores da enzima conversora da angiotensina diminuem o

catabolismo da bradicinina, o seu uso é contra-indicado nos pacientes com AEH. Do mesmo

modo, os estrógenos exógenos (contraceptivos orais e terapia de reposição hormonal) podem

exacerbar os sintomas de AEH.

Angioedema hereditário em nosso meio

O AEH é uma doença pouco conhecida em nosso meio. Há poucos estudos sobre AEH

publicados no Brasil, todos eles focalizados na descrição das características clínicas da

doença:

- em 1992 Solé, Leser e Naspitz descrevem as características clínicas e laboratoriais de 9

pacientes pertencentes a 2 famílias distintas diagnosticados com AEH tipo II, nos quais os

sintomas tiveram início antes dos 10 anos de idade em 78% dos casos; nesses pacientes,

edema de face e de extremidades foram as apresentações clínicas mais comuns.66

- em um estudo de 2004, Chagas et al descreveram as características clínicas e a resposta ao

tratamento em 10 pacientes com AEH, pertencentes a 4 famílias distintas, e revelaram que,

dentro da mesma família, houve heterogeneidade marcante na apresentação clínica e na

gravidade dos sintomas, além de variabilidade na indicação de tratamento específico.67

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sol%C3%A9%20D%22%5BAuthor%5D�

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=%22Sol%C3%A9%20D%22%5BAuthor%5D�

Introdução 36

- em 2009 Jorge et al relataram um caso de associação de AEH com urticária crônica.68

- em 2007 Grumach et al reuniram todos os casos de AEH diagnosticados nos principais

centros de referência do Brasil, totalizando uma série de 120 pacientes.69

Não há publicações referentes a mutações identificadas em pacientes com AEH no

Brasil ou na América Latina.

No Ambulatório de Alergia do HC-FMRP-USP, identificamos uma família

procedente de Carmo do Rio Claro (MG) com 275 membros relacionados, distribuídos em 5

gerações, com caso índice de uma paciente do sexo feminino, atualmente com 28 anos de

idade, diagnosticada com angioedema hereditário no ano de 2003. Essa paciente apresentava

história de episódios de edema desfigurante de face, língua, tronco e membros desde a

infância. A frequência dos episódios era semanal e os mesmos duravam cerca de 3 dias. A

avaliação clínica revelou níveis séricos do inibidor de C1 de 31% do valor médio normal e

níveis séricos de C4 diminuídos, além de história familiar de AEH - confirmando o

diagnóstico de AEH tipo I. Em abril de 2004 foi iniciado tratamento profilático com Danazol,

e atualmente ela usa 100 mg 2 vezes por semana com excelente controle dos sintomas. No

presente estudo, nossos objetivos foram determinar a mutação no gene que codifica o

C1-INH, responsável pelo desenvolvimento e transmissão genética do angioedema

hereditário, e realizar a caracterização clínica detalhada dos indivíduos com AEH dessa

família brasileira.

37

2 OBJETIVOS

Objetivos 38

2 OBJETIVOS

Os objetivos deste trabalho foram:

1. Identificar a mutação no gene que codifica o inibidor de C1 em indivíduos membros

de família com caso índice de angioedema hereditário

2. Estabelecer a relação entre a presença da mutação genética e o desenvolvimento de

angioedema hereditário

3. Realizar a caracterização clínica detalhada e avaliar a resposta ao tratamento em

pacientes da família em estudo com diagnóstico de angioedema hereditário

4. Correlacionar gravidade de sintomas e níveis séricos do inibidor de C1 nos indivíduos

da família em estudo com diagnóstico de angioedema hereditário

39

3 SUJEITOS E MÉTODOS

Sujeitos e Métodos 40

3 SUJEITOS E MÉTODOS

3.1 Sujeitos

O heredograma da família foi construído com 275 indíviduos consanguíneos

distribuídos em 5 gerações. Desses, 165 com idades variando entre 1 e 72 anos, foram

entrevistados e tiveram amostras de sangue coletadas para análise de mutações no gene

SERPING1. Os indivíduos que referiram história de episódios de angioedema e/ou crises de

dor abdominal foram encaminhados ao Ambulatório de Alergia do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto-USP para avaliação clínica e laboratorial, incluindo

dosagens de C4 e inibidor de C1, e o diagnóstico de AEH foi realizado de acordo com

critérios estabelecidos.1,3 Informações a respeito dos outros 110 indivíduos foram obtidas

através dos familiares próximos que foram entrevistados.

Critérios de inclusão

- Ser membro relacionado da família com caso índice de angioedema hereditário

- Concordar com a participação no estudo após entendimento dos objetivos e assinatura de

termo de consentimento livre e esclarecido

Critérios de exclusão

- Recusar participação no estudo

3.2 Coleta de dados

A coleta de dados e de amostras foi realizada por ocasião de duas visitas à cidade de

origem da família, Carmo do Rio Claro, MG. Com o apoio da Secretaria de Saúde do

Município, que forneceu autorização e toda a infra-estrutura necessária, foram realizadas as

entrevistas clínicas pela investigadora (MFF) e a coleta de amostras de sangue (5 ml) para

análise genética, que teve a ajuda de profissionais de saúde locais. Para cada indivíduo foram

coletados 5 ml de sangue em tubo de coleta de plástico contendo EDTA ((Vacutainer, BD,

Plymouth, UK), que foram em seguida divididos em alíquotas de 1 ml, mantidas em gelo seco

até o retorno ao Laboratório de Alergia no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de

Ribeirão Preto – USP, onde foram estocadas em freezer a -70ºC até seu processamento.


A visita da equipe de pesquisa à cidade de Carmo do Rio Claro gerou grande interesse

da comunidade local. Por ocasião da nossa segunda visita à cidade, a imprensa compareceu ao

local da coleta e realizou algumas matérias e entrevistas para os jornais locais, uma delas

disponibilizada no site da cidade (http://carmodorioclaro.mg.gov.br/noticias.php?idn=89).

3.3 Aspectos éticos

O presente estudo foi aprovado pelo comitê de Ética do Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (anexo A) e todos os indivíduos ou responsáveis

legais assinaram Termo de Consentimento Livre e Esclarecido autorizando a participação no

estudo (apêndices A e B).

1 3

4 2

Fotos 1, 2, 3 e 4. A equipe de pesquisa durante as visitas para coleta de dados e amostras na cidade de Carmo do Rio Claro (1 e 2) e alguns dos membros da família em estudo que compareceram à coleta (3 e 4).


3.4 Caracterização clínica e score de gravidade

Dados de história clínica, incluindo idade de início dos sintomas, duração e gravidade

das crises de angioedema, tipo de tratamento e resposta terapêutica, fatores desencadeantes

e/ou agravantes dos sintomas e evolução do quadro clínico foram obtidos através do

preenchimento da ficha clínica previamente elaborada (apêndice C).

Score de gravidade para AEH. Um score de gravidade simplificado foi elaborado a partir dos

critérios propostos pelo Third C1 Esterase Inhibitor Deficiency Workshop de 2003.1 Os

episódios de angioedema foram classificados de acordo com o grau de comprometimento

clínico e a frequência média dos sintomas desde o início da doença. A frequência dos

sintomas foi quantificada da seguinte maneira: mais que 1 episódio por mês = 3 pontos, de 6 a

11 episódios por ano = 2 pontos, menos que 6 episódios por ano = 1 ponto, sem sintomas de

angioedema = 0 ponto. A intensidade dos sintomas foi classificada como: presença de

desconforto, porém sem prejuízo das atividades diárias = 2 pontos, desconforto que afeta as

atividades diárias normais = 4 pontos, crises graves com necessidade de hospitalização = 5

pontos. A soma dos pontos obtidos pela classificação da frequência e intensidade dos

sintomas foi utilizada para classificar a gravidade da doença em 4 níveis: Grave (score > 7

pontos); Moderado (score 5 ou 6 pontos); Leve (score < 4); Assintomático (score = 0), como

mostra o Quadro 2. O score de gravidade foi utilizado por ocasião do diagnóstico e no

seguimento clínico após início do tratamento.

3.5 Dosagem do inibidor de C1 e do componente C4 do Complemento

Níveis séricos do inibidor de C1 (Dade Behring, EUA) e do componente C4 do

complemento foram quantificados por nefelometria, no laboratório de Imunologia Clínica do

HC-FMRP-USP; com valores de normalidade variando de 0.21g/L a 0.39 g/L e 0.1 g/L to 0.4

g/L, respectivamente. Essas dosagens foram feitas para aqueles indivíduos que referiram

história de episódios de angioedema e/ou crises de dor abdominal e nos indivíduos

assintomáticos que apresentaram a mutação no gene SERPING1. Amostras de 5 ml de sangue

foram coletadas em tubos de coleta de plástico com ativador de coagulação e gel para

separação de soro (Vacutainer, BD, Plymouth, UK). Em seguida o sangue foi centrifugado a

3.500 rpm durante 10 minutos para separação do soro que então foi dividido em 2 alíquotas de


1 ml cada, uma em microtubo para dosagem do inibidor de C1 e outra em microtubo contendo

100 µl de EDTA para dosagem de C4. Esses tubos foram então armazenados em gelo seco

e/ou frezzer a -70o C até serem processados.

Freqüência Pontos

Mais que 1 episódio por mês 3

Entre 6 a 11 episódios por ano 2

Sintomas infrequentes (<6/ano) 1

Nunca teve sintomas 0

Intensidade

Desconforto, sem prejuízo das atividades diárias 2

Desconforto que afeta as atividades diárias normais 4

Crise grave com necessidade de hospitalização (edema glote, trato gastrintestinal)

5

Score

1 – GRAVE ≥ 7

2 – MODERADO 5 ou 6

3 – LEVE ≤ 4

4 – ASSINTOMÁTICO (com nível sérico e/ou atividade do C1-INH diminuídos e/ou presença da mutação no gene do C1-INH)

0

Quadro 2. Score de gravidade para AEH.

3.6 Identificação de mutação no DNA

O DNA genômico foi extraído de amostras de sangue periférico utilizando o kit de

extração de DNA Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, Madison, WI, USA),

seguindo as recomendações do fabricante. Sequenciamento completo dos 8 exons do gene

SERPING1 foi realizado em amostras de 2 pacientes da família com diagnóstico de AEH em

laboratório de referência na Universidade de Mainz - Alemanha.70 Posteriormente, foi feito

sequenciamento parcial do exon 3 em amostra de outros 163 indivíduos membros da família,

além das 2 pacientes já analisadas, no Laborátorio de Alergia no Hospital das Clínicas da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP. Para fins de sequenciamento, foi feita

amplificação por Polymerase chain reaction - PCR (MJ Research, New Jersey, USA) da

região de interesse no exon 3 do gene SERPING1 utilizando os primers sense


5`-TCCAGCTTGCCGACAACCAACTCA-3` e anti-sense 5`-TACAGCTTCTTCCCAGAGGCATGG-3`

produzindo um fragmento de 466 pb. 70

As condições para amplificação foram as seguintes: hot start a 94oC por 3 minutos

seguido de 30 ciclos a 94oC por 30 segundos, 61oC por 30 segundos e 72oC por 45 segundos;

extensão final a 72oC por 2 minutos. As concentrações finais dos reagentes foram: 1X tampão

de PCR (5X Colorless GoTaq reaction buffer); 1,5 mM MgCl2; 20 mM dNTP (5 mM de cada

nucleotídeo); 7,5 pmol de cada primer; 1 U de DNA polimerase (Promega, USA) e 100 - 200

ng de DNA genômico, para um volume final de 25 µl.

Os produtos de PCR foram analisados em gel de agarose a 2%, purificados com

Illustra TM GFX TM PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare, UK), e

sequenciados diretamente utilizando o aparelho sequenciador ABI Prism 3100 Genetic

Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) e o conjunto de reagentes Big DyeTM

Terminator V3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). As sequências obtidas foram

alinhadas à sequência-padrão obtida no GenBank, de forma a se detectar qualquer alteração na

sequência de bases.

Método para designar a localização da mutação pela numeração de nucleotídeos e

aminoácidos. A partir de terminologia padronizada, a mutação foi designada de acordo com

os 3 sistemas de nomenclatura utilizados pela base de dados de mutações do gene do inibidor

de C1 (http://hae.enzim.hu/). Para numeração de nucleotídeos do gene, o Sistema Tradicional

e o Sistema HUGO utilizam como referência a sequência do DNA genômico. O Sistema

Tradicional considera o local de inicialização da transcrição como a posição 1, ou seja, o

primeiro nucleotídeo do exon 1 (correspondendo à posição 1183 da sequência genômica de

referência do GenBank - X54486).15 O Sistema HUGO utiliza o prefixo “g.” e considera

como número “1” o primeiro nucleotídeo de toda a sequência.71 A nomenclatura recomendada

pela Human Genome Variation Society (HGVS) (http://www.HGVS.org/mutnomen/) é

baseada na sequência de referência do DNA codificador (cDNA), utiliza o prefixo “c.” e

considera o primeiro nucleotídeo do códon de inicialização da tradução (A do códon ATG)

como nucleotídeo de número 1. Para a numeração dos aminoácidos, utilizamos a

padronização recomendada pela HGVS (Sistema HUGO na HAEdb) que considerada o

aminoácido número 1 como o primeiro aminoácido traduzido incluindo, portanto, a sequência

do signal peptide de 22 aminoácidos. Utilizamos também a nomenclatura pelo Sistema

Tradicional, no qual o primeiro aminoácido da proteína madura é o aminoácido número 1,

contando os primeiros 22 aminoácidos do signal peptide em números negativos.72,73


3.7 Modelagem molecular

Modelagem molecular comparativa foi o método computacional utilizado para

predizer a estrutura tridimensional (3D) da proteína inibidor de C1 truncada por ocorrência da

mutação identificada no exon 3 do DNA de pacientes com angioedema hereditário no

presente estudo. Esta técnica de desenvolvimento de modelos 3D parte de uma sequência

primária conhecida de uma proteína cuja estrutura 3D é indeterminada (inibidor de C1

truncado pela ocorrência da mutação) e utiliza como molde uma ou mais sequências de

proteínas cujas estruturas 3D já foram resolvidas e que possuem alta similaridade com a

molécula de interesse. A modelagem molecular utilizada no presente trabalho consistiu nas

etapas descritas abaixo:74

- Busca por moldes: foi realizada no banco de dados Protein Data Bank 75

(http://www.rcsb.org/pdb). O principal parâmetro utilizado foi a porcentagem de identidade

(superior a 30%) entre a sequência primária do molde e sequência da proteína a ser

modelada.

- Alinhamento: o alinhamento da sequência do molde com a sequência da proteína a ser

modelada foi realizado utilizando o algoritmo ALIGN2D.

- Modelagem: a construção do modelo foi realizada com o programa MODELLER 9v2. 76 O

programa MODELLER gera, a partir da estrutura do molde, um conjunto de restrições que

são aplicadas à sequência de aminoácidos da proteína a ser modelada. Estas restrições

limitam, por exemplo, a distância entre dois resíduos no modelo que está sendo construído,

sendo esta distância baseada naquela entre os dois resíduos equivalentes na estrutura molde.

Esse cálculo de restrições também foi aplicado nas ligações angulares (entre três átomos) e

nos ângulos diedrais (entre quatro átomos).74

- Avaliação dos modelos: a qualidade estereoquímica do modelo foi analisada usando o

PROCHECK 77 que faz parte do pacote CCP4 (Collaborative Computational Project N° 4). A

análise da qualidade do modelo foi em seguida implementada usando o programa VERIFY

3D.78

A dinâmica molecular foi avaliada por simulações físico-químicas.79 Nesse método,

energia é adicionada ao sistema da proteína pela simulação de um “aquecimento”. Essa

energia promove uma força oposta que movimenta os átomos na molécula para fora das

conformações tradicionais. As ações e reações de centenas de átomos em um dado sistema


molecular podem ser simuladas utilizando esta abstração.79 A dinâmica molecular no presente

estudo foi realizada de acordo com os parâmetros abaixo:

- Pacote de simulação: o programa NAMD 80 na versão 2.7b 1 foi utilizado para a realização

das simulações. Esse programa consiste de um conjunto de programas capazes de executar

todos os passos necessários para a simulação da dinâmica molecular, desde a preparação dos

sistemas até a análise dos resultados obtidos.

- Minimização de energia: cada sistema a ser simulado passou por um processo de

minimização de energia, o que favorece a correta termalização do sistema. Todas as

simulações foram equilibradas por 300 ps.

- Procedimentos de simulação: todas as simulações de dinâmica molecular foram realizadas

conforme amostra isotérmica e isobárica em temperatura de 310 K. O passo de integração

utilizado foi de 2 fs e o tempo real de 5 ns, o campo de força e o arquivo de topologia

escolhidos foram os do programa CHARMM22.81 O tratamento eletrostático foi feito com

cut-off de 1,4 nm, de forma a garantir que nenhum átomo ou molécula presente na caixa de

simulação fosse considerado mais de uma vez nos cálculos das interações eletrostáticas.

Para avaliar o comportamento global das estruturas foi calculada a Raiz do Desvio

Médio Quadrático (Root mean square deviation, RMSD) para os sistemas, no tempo, tomando

como referência a estrutura após as minimizações. O programa VMD foi utilizado para

visualizar as estruturas geradas ao longo do processo de dinâmica molecular.

3.8 Análise estatística

Para verificar a associação entre a gravidade da doença (através do score de

gravidade) e o sexo foi utilizado o Teste Exato de Fisher. Buscando verificar correlação entre

a gravidade da doença e os níveis séricos do inibidor de C1, foi ajustado um modelo de

regressão linear, através do PROC GLM do software SAS 9.0. As possíveis diferenças entre

os graus de gravidade foram estimadas através de contrastes ortogonais.

47

4 RESULTADOS

Resultados 48

4 RESULTADOS

4.1 Deleção de um único nucleotídeo citosina associada a angioedema hereditário

O sequenciamento completo dos 8 exons do gene SERPING1 feito em duas pacientes

da família em estudo diagnosticadas com AEH revelou uma deleção heterozigota de uma das

citosinas em posição 2493, 2494 ou 2495 no exon 3. Independente de qual das 3 citosinas

tenha sofrido deleção, ocorre a formação de novo códon "cca" e conseqüente frameshift.

Convencionamos designar que a deleção ocorre na última citosina do códon – posição 2495

na sequência de referência do GenBank para o gene SERPING1 (X54486), considerando a

numeração do Sistema Tradicional (Figuras 6 e 7). Dessa forma, a mutação que identificamos

no presente estudo pode ser designada de três diferentes maneiras: 1. como c.351delC pela

numeração sistemática do cDNA (sequência do GenBank NM_000062.1); 2. como 2495delC

(Sistema Tradicional) utilizando a sequência do DNA genômico; ou 3. como g.3677delC

(Sistema HUGO), que utiliza também a seqüência do DNA genômico (Tabela 2). No presente

trabalho, optamos por nos referir à nova mutação como c.351delC, que é a nomenclatura

recomendada pela Human Genome Variation Society e a mais amplamente utilizada.

Tabela 2. Nomenclatura da mutação identificada de acordo com a numeração de nucleotídeos e aminoácidos em sistemas padronizados

Alte

raçã

o de

nucl

eotíd

eo

Sistema cDNA (GenBank NM_000062.1) c.351delC

Sistema Tradicional (GenBank X54486) 2495delC

Sistema HUGO g.3677delC

Con

sequ

ênci

a

mol

ecul

ar Sistema Tradicional Frameshift

Sistema HUGO Pro117fs

Resultados 49

B gatagagcctcctcaaatccaaatgctaccagctccagctcccaggatccagagagtttg -5 D R A S S N P N A T S S S S Q D P E S L 15 caagacagaggcgaagggaaggtcgcaacaacagttatctccaagatgctattcgttgaa Q D R G E G K V A T T V I S K M L F V E 35 cccatcctggaggtttccagcttgccgacaaccaactcaacaaccaattcagccaccaaa P I L E V S S L P T T N S T T N S A T K 55 ataacagctaataccactgatgaacccaccacacaacccaccacagagcccaccacccaa I T A N T T D E P T T Q P T T E P T T Q 75 cccaccatccaacccacccaaccaactacccagctcccaacagattctcctacccagccc P T I Q P T Q P T T Q L P T D S P T Q P 95 actactgggtccttctgcccaggacctgttactctctgctctgacttggagagtcattca T T G S F C P G P V T L C S D L E S H S 115 acagaggccgtgttgggggatgctttggtagatttctccctgaagctctaccacgccttc T E A V L G D A L V D F S L K L Y H A F 135 tcagcaatgaagaaggtggagaccaacatggccttttccccattcagcatcgccagcctc S A M K K V E T N M A F S P F S I A S L 155 cttacccaggtcctgctcg L T Q V L L 161

Figura 6. Localização da mutação c.351delC no exon 3 do gene SERPING1. A. Desenho esquemático da estrutura do gene de 17 kb SERPING1 contendo 8 exons; o local da mutação c.351delC está indicado no exon 3 pela seta vermelha (modificado de Zuraw e Herschbach, 2000).70 B. Sequência de nucleotídeos do exon 3 e sequência deduzida de aminoácidos (www.expasy.org); a citosina que sofreu deleção está indicada em vermelho, o primeiro aminoácido da proteína madura (N) está indicado em azul, e a região aonde inicia o domínio serpina está mostrada em verde.

Resultados 50

Figura 7. Cromatograma do sequenciamento de DNA. A. Sequência de bases de DNA de parte do exon 3 do gene SERPING1 de um indivíduo sem AEH (gene selvagem). B. Sequência de bases da mesma região mostrando a mutação c.351delC em DNA de indivíduo com AEH. A seta indica o nucleotídeo citosina que sofreu deleção.

A mutação c.351delC resulta em frameshift e aparecimento de stop codon na posição

do códon 31, após o último códon da proteína original (Figura 8). Considerando que seja

transcrita, a proteína truncada seria então constituída por 94 aminoácidos do domínio N-

terminal da molécula original, e 30 aminoácidos adicionais resultantes da transcrição dos 30

códons resultantes do frameshift até atingir o stop codon, portanto consistiria de 124

aminoácidos, e teria peso molecular estimado em 13.3 kDa (www.expasy.com.br).

A

B

http://www.expasy.com.br/�

Resultados 51

A

B

C

MASRLTLLTLLLLLLAGDRASSNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPLLGPSAQDLLLSALTWRVIQQRPCWGMLW

Figura 8. Características da proteína inibidor de C1 original e da proteína truncada resultante da ocorrência da mutação c.351delC . A. Desenho esquemático da proteína inibidor de C1 de 500 aminoácidos, indicando o signal peptide de 22 aminoácidos, o domínio N-terminal de 112 aminoácidos e o domínio serpina de 366 aminoácidos. A seta vermelha indica o local da mutação c.351delC. B. Sequência de aminoácidos da proteína truncada hipotética resultante da ocorrência da mutação c.351delC: o signal peptide está indicado em rosa, seguido de região correspondente a 95 aminoácidos presentes no inibidor de C1 original até o último aminoácido (Q) antes do início do frameshift, em azul, e de 30 aminoácidos adicionais até o último aminoácido (W) antes do stop codon na posição 31, mostrados em laranja. C. Sequência completa de aminoácidos da proteína inibidor de C1 (código de acesso Swiss-ProtKB: P05155).

MASRLTLLTLLLLLLAGDRASSNPNATSSSSQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLFVEPILEVSSLPTTNSTTNSATKITANTTDEPTTQPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTDSPTQPTTGSFCPGPVTLCSDLESHSTEAVLGDALVDFSLKLYHAFSAMKKVETNMAFSPFSIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQDMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA

Resultados 52

4.2 Modelagem molecular

Após busca na base de dados PDB (http://www.rcsb.org/pdb) por estruturas

tridimensionais que poderiam servir como molde, foi verificado que não havia molde com

identidade suficiente para gerar um modelo da região N-terminal da molécula, onde ocorre a

mutação c.351delC. Foi então construído um modelo tridimensional quimérico da hipotética

proteína truncada, onde foram utilizados vários moldes incluindo os das proteínas C5a

peptidase e alfa1-antitripsina. Um total de 1000 modelos foi gerado, e aquele que apresentou

melhor escore pelos programas de avaliação foi selecionado (Figura 9A). Um segundo

modelo foi gerado utilizando a estrutura tridimensional determinada por cristalografia do

inibidor de C1, à qual foi adicionado o modelo do domínio N-terminal (Figura 9B). A análise

molecular nos permite afirmar de forma definitiva que a mutação c.351delC resulta na

produção de uma proteína truncada contendo o domínio N-terminal, sem nenhuma

possibilidade de atividade enzimática.

Figura 9. Modelagem molecular. A. Modelo molecular da proteína hipotética produzida por ocorrência da mutação c.351delC. Em azul, representados os 94 aminoácidos presentes na proteína C1-INH original e, em laranja, os 30 aminoácidos adicionais formados após frameshift, até o aparecimento de stop codon. B. Modelo mostrando a estrutura tridimensional do domínio serpina da molécula do C1-INH previamente determinada por cristalografia (código acesso Swiss-ProtKB: P05155, proteína cristalizada 2OAY), que contém a atividade enzimática, adicionado do modelo do domínio N-terminal obtido no presente trabalho, contendo os 94 aminoácidos presentes na proteína original.

A B

http://www.rcsb.org/pdb�

Resultados 53

4.3 Evidências de que a mutação c.351delC é causa de angioedema hereditário na

família em estudo

A partir da identificação da mutação c.351delC no exon 3, foi desenvolvido método

baseado em sequenciamento de produto de PCR para detecção da mutação em 165 indivíduos

da família em estudo, incluindo aqueles com história de angioedema e seus familiares

consanguíneos (Figura 10). A mutação c.351delC foi identificada em 28 indivíduos, sendo 23

deles pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de AEH tipo I. Os outros 5 pacientes

não apresentam ou apresentaram sintomas de AEH, no entanto, quando avaliados

laboratorialmente, apresentaram níveis séricos diminuídos do inibidor de C1 e de C4.

Observando o fluxograma para diagnóstico de AEH proposto por Bowen et al 3 (Figura 5)

podemos considerar que a história familiar de angioedema positiva, juntamente com níveis

séricos do inibidor de C1 diminuídos são critérios suficientes para o diagnóstico de AEH,

portanto, esses 5 pacientes apresentam AEH assintomático. Todos os pacientes com

diagnóstico de AEH nessa família apresentam a mutação c.351delC. Por outro lado, nenhum

dos 137 indivíduos avaliados que não apresentam a mutação c.351delC preenche critérios

diagnósticos para AEH.

Figura 10. Análise de produtos de PCR. Gel de agarose após eletroforese de produtos de PCR mostrando amplificação de fragmento do exon 3 do gene SERPING1 contendo 466 pares de bases em amostras de 19 pacientes (linhas 2 a 20). Marcador 100 pares de bases, 100 pb a 1000 pb (linha 1).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Resultados 54

4.4 Heredograma

Coletamos informações de um total de 275 familiares consanguíneos. A primeira

geração de indivíduos dos quais temos informação disponível compreende 9 indivíduos (8 já

falecidos), descendentes de 2 irmãos dos quais não temos informações. Dentre esses 9

indivíduos, apenas dois apresentaram sintomas sugestivos de AEH, segundo relato dos

familiares. Heredograma construído a partir dos nove familiares da primeira geração,

incluindo todos os pacientes com AEH, está apresentado na Figura 11 (vide encarte) e

contem:

- 23 pacientes com AEH e mutação c.351delC

- 5 indivíduos com AEH assintomático e mutação c.351delC

- 137 indivíduos sem AEH e sem mutação c.351delC

- 110 indivíduos que não foram entrevistados e avaliados; desses, 4 com história de

sintomas de AEH (todos falecidos) e 106 sem história de sintomas de AEH, segundo

informações fornecidas pelos familiares entrevistados

- indivíduos identificados com número seguido pela letra “a” são cônjuges (não

descendentes).

A média de indivíduos acometidos com AEH e mutação c.351delC entre os

descendentes de cada indivíduo com AEH ou com história de sintomas de AEH, ou seja, a

taxa média de transmissão da doença foi de 47,6%. Essa taxa variou de 0% (em núcleos

familiares nos quais nenhum descente direto do indivíduo portador da mutação apresentou a

mutação) a 100% (um indivíduo portador teve todos os seus descendentes apresentando a

mutação).

4.5 Características dos pacientes com AEH

O grupo de 28 pacientes que apresentam a mutação c.351delC compreende 23

pacientes com diagnóstico clínico de AEH, e 5 pacientes com AEH assintomáticos. Dentre

esses 5 indivíduos, um é do sexo feminino e tem 8 anos de idade (paciente IV-12 na Tabela 3

e na Figura 11), e os outros quatro são do sexo masculino com idades de 2, 6, 26 e 53 anos

(IV-11, IV-13, III-37 e III-48 respectivamente, na Tabela 3 e Figura 11). Estes 5 indivíduos

têm parentes próximos (pais ou irmãos) diagnosticados com AEH e com a mutação

c.351delC, e a avaliação dos níveis séricos do inibidor de C1 e de C4 mostrou níveis

diminuídos em todos eles. Características clínicas dos 28 pacientes com AEH estão

apresentadas na Tabela 3.

Resultados 55

Vide anexo “Heredograma”

Resultados 56

Resultados 57

Resultados 58

A idade média desses pacientes é de 30,9 anos, variando de 2 a 72 anos. Quinze

pacientes (53,6%) são do sexo feminino. Entre os pacientes sintomáticos, a idade média de

início dos sintomas foi de 14,5 anos, variando de 3 meses a 42 anos. Entre as mulheres a

idade média de início dos sintomas foi de 13,2 anos, variando de 3 meses a 40 anos; e entre os

homens foi de 16,6 anos, variando de 3 a 42 anos (Gráfico 1).

O tempo transcorrido entre o início dos sintomas e o diagnóstico foi de 15,5 anos, em

média, variando de 1 mês a 40 anos (Gráfico 2).

Gráfico 1. Idade de início dos sintomas nos pacientes com AEH.

Resultados 59

Resultados 60

De acordo com o score de gravidade, 5 pacientes (17,8%) tem doença leve; 7 (25%)

tem doença moderada; 11 (39,2%) tem doença grave e 5 (17,8%) são assintomáticos

(Gráfico3). Observamos que pacientes do sexo feminino apresentam doença mais grave

(Gráfico 4, p=0,04). Vale ressaltar ainda que os 2 indivíduos adultos assintomáticos são

homens.

Gráfico 3. Perfil de gravidade entre os pacientes com AEH da família em estudo. Rótulos indicam o número total de pacientes.

Gráfico 4. Comparação da gravidade do AEH entre pacientes do sexo masculino e feminino.

Resultados 61

Angioedema subcutâneo (Fotos 5 e 6) foi a apresentação clínica mais frequente entre

os pacientes sintomáticos (22/23; 95,6%), associado a crises recorrentes de dor abdominal em

10 pacientes (43,4%), a edema de laringe em 2 pacientes (8,6%) ou aos dois em 4 pacientes

(17,3%). Um paciente (4,3%) apresentou dor abdominal recorrente como seu único sintoma

(Gráficos 5 e 6 e Tabela 3).

Gráfico 5. Frequência de ocorrência dos diferentes sintomas entre os pacientes com AEH.

Fotos 5 e 6. Angioedema de face e lábios apresentado por paciente da família em estudo.

Resultados 62

Os níveis séricos do inibidor de C1 variaram de 9% a 33% (média de 21%, desvio

padrão 7%) do valor médio normal, e não observamos correlação entre os níveis séricos do

inibidor de C1 e a gravidade da doença (Gráfico 7). Os níveis do inibidor de C1 foram

significantemente mais baixos entre pacientes com doença moderada quando comparada a

leve, grave e assintomática (p <0,01); entretanto nenhuma diferença significante foi observada

entre níveis do inibidor de C1 entre pacientes com doença leve, grave ou assintomática.

Gráfico 6. Apresentação clínica entre os pacientes sintomáticos com AEH. Rótulos indicam a porcentagem entre os pacientes sintomáticos com AEH.

Resultados 63

Treze pacientes (56%) estão sendo tratados com Danazol: um deles utiliza 400 mg por

dia, seis utilizam 100 mg três vezes por semana, cinco usam 100 mg duas vezes por semana, e

um (adolescente de 15 anos) toma 100 mg 1 vez por semana. A maioria dos pacientes em

tratamento com Danazol mantém bom controle dos episódios de angioedema e não referem

efeitos colaterais: uma paciente refere ganho de peso. Não observamos alterações na função

hepática nas avaliações laboratoriais semestrais realizadas no seguimento desses pacientes por

até 6 anos. Apenas o paciente que faz uso de doses mais elevadas de Danazol (400mg/dia)

apresentou discreta elevação nos valores das enzimas hepáticas e nas dosagens de colesterol e

triglicérides, além de queixar-se de muitas cãibras após o início do tratamento. Duas crianças

faziam tratamento profilático com Ácido Tranexâmico e apresentavam controle parcial dos

sintomas, no entanto, uma delas desistiu do tratamento devido a queixas de efeitos adversos,

mas que, aparentemente, não estão relacionadas ao efeito da medicação como dor no peito,

falta de ar e ganho de peso excessivo (Gráfico 8).

Gráfico 7. Níveis séricos do inibidor de C1 de acordo com o score de gravidade apresentados pelos pacientes com AEH. Mediana, valores do primeiro e terceiro quartil, e valores mínimos e máximos estão indicados.

Resultados 64

Em concordância com estudos realizados em outras populações,19 os fatores

desencadeantes de episódios de angioedema em nossos pacientes incluíram uso de inibidores

da ECA, uso de estrógenos, período pós-gestacional, stress emocional, procedimentos

dentários e traumas físicos. Além disso, alguns pacientes relacionaram episódios de

angioedema com fatores considerados atípicos - de acordo com os dados da literatura - como

ingestão de alimentos (carne de porco, 4 pacientes; camarão e abacaxi, 1 paciente), uso de

Dipirona (5 pacientes) e contato com produtos químicos (alvejantes, inseticidas – 2

pacientes). Houve grande heterogeneidade em relação ao comportamento da doença durante

as gestações. Das oito pacientes com AEH que são mães, três referiram melhora dos sintomas

durante as gestações, três acharam que os sintomas se intensificaram e duas não perceberam

mudanças na frequência ou intensidade dos sintomas. Quatro pacientes (III-35, III-42, IV-29 e

IV-31 na Tabela 3) referiram exacerbação importante dos sintomas de AEH com o uso de

contraceptivos orais, inclusive uma delas (III-42) permaneceu assintomática durante um longo

período após a suspensão da medicação. Todas as pacientes com diagnóstico de AEH foram

orientadas a evitar o uso de contraceptivos orais e terapia de reposição hormonal,

Gráfico 8. Tratamento profilático utilizado pelos pacientes sintomáticos com AEH. A. Número de pacientes em diferentes tratamentos. B. Número de pacientes que utilizam diferentes doses de Danazol.

A B

Resultados 65

considerando o risco de agravamento da doença associado ao aumento dos níveis de

estrógeno.

4.6 Pacientes com angioedema por outras causas

Além dos 28 pacientes que tiveram diagnóstico confirmado de AEH, outros 23

indivíduos membros da família foram encaminhados para avaliação clínica e laboratorial no

Ambulatório de Alergia do HC-FMRP devido a queixas como: episódios únicos ou

recorrentes de angioedema, dores abdominais recorrentes e edemas de extremidades e/ou de

face não característicos de angioedema. Foram realizadas dosagens dos níveis séricos do

inibidor de C1 e de C4 para todos esses indivíduos e todos apresentaram níveis normais. Em

investigação subsequente encontramos como possíveis diagnósticos para esses pacientes:

angioedema alérgico (níveis muito elevados de IgE total, testes cutâneos positivos, relação

temporal com ingestão de alimentos específicos), angioedema induzido por drogas

(contraceptivos orais e anti-inflamatórios não-esteroidais), hipertensão arterial com uso de

bloqueadores dos canais de cálcio, hipotireoidismo, intolerância à lactose, parasitose

intestinal, gastrite (confirmada por endoscopia digestiva) e angioedema idiopático.

66

5 DISCUSSÃO

Discussão 67

5 DISCUSSÃO

O presente estudo é o primeiro a descrever uma mutação genética entre pacientes com

AEH na América Latina. Avaliamos uma numerosa família de uma pequena cidade do

Sudeste do Brasil (Carmo do Rio Claro, Minas Gerias), com um caso índice de angioedema

hereditário tipo I diagnosticado no Ambulatório de Alergia do HC-FMRP em 2003. A análise

do seqüenciamento completo do gene SERPING1 dessa paciente e de um familiar com

diagnóstico de AEH mostrou deleção de um único nucleotídeo citosina no exon 3 que resulta

em interrupção prematura da síntese da proteína, impedindo a produção de inibidor de C1

biologicamente ativo. Seqüenciamento parcial do exon 3 incluindo a região de localização da

mutação em outros 163 membros da família revelou que todos os 28 pacientes da família que

preenchiam critérios diagnósticos de AEH apresentavam a mesma mutação c.351delC,

incluindo 5 indivíduos assintomáticos com níveis séricos do inibidor de C1 e de C4

diminuídos.

Análise sistemática de mutações no gene SERPING1 tem sido realizada em várias

séries de casos de AEH 70,72,82,83 e aproximadamente 200 mutações distintas foram

identificadas até o momento, localizadas através de toda a extensão do gene. Prova de forte

associação entre uma mutação específica e uma doença pode ser obtida por estudos de

segregação em grandes famílias. No entanto, em doenças como o AEH, caracterizadas por

mutações exclusivas em pequeno número de familiares, essa abordagem raramente é aplicável

e o papel patogênico da mutação é normalmente deduzido pelas evidências de que elas

interferem na produção da proteína. Extensa busca na literatura e em base de dados de AEH

revelou que a família avaliada no presente estudo é a que contém o maior número de

indivíduos com AEH já descrita. O presente estudo com uma família tão numerosa fornece

dados definitivos que indicam o papel patogênico dessa nova mutação no gene SERPING1,

c.351delC, no desenvolvimento de AEH.

Há descrição de adultos assintomáticos que carreiam mutações no gene do C1-INH e

estima-se que representem até 5% dos pacientes com AEH.21 Na família de nosso estudo,

observamos freqüência de 17,8% de pacientes com AEH assintomático, dentre os portadores

da mutação c.351delC. A ausência de sintomas nesses pacientes pode ser em parte explicada

pela baixa idade da maioria deles – 3 são crianças com menos de 9 anos de idade e 1 é adulto

jovem de 26 anos – sendo, portanto, possível que ainda venham a manifestar os sintomas da

doença. De forma interessante, embora tenhamos observado que os sintomas de AEH

tenderam a iniciar na infância ou adolescência, em alguns de nossos pacientes os primeiros

Discussão 68

sintomas correram numa idade mais tardia, depois dos 40 anos. Isto indica que o início de

sintomas mais tardiamente na vida não deve ser considerado como elemento para afastar o

diagnóstico de AEH.

No presente estudo, a análise genética foi essencial para que pudéssemos fazer o

diagnóstico de AEH de forma precoce, antes mesmo do aparecimento de sintomas, em 5

indivíduos da família em estudo, o que indica que a análise genética de rotina representa uma

valiosa ferramenta para a prevenção e tratamento adequado de crises agudas e potencialmente

fatais de angioedema. Benefícios adicionais da análise genética incluem: permitir o

diagnóstico de AEH em crianças menores de um ano de idade, uma vez que nessa faixa etária

os níveis séricos de inibidor de C1 são variáveis, sendo comuns resultados falso-positivos e

falso-negativos;3 eliminar a preocupação de desenvolver a doença ou de transferir uma

mutação genética para os descendentes, entre aqueles indivíduos que são membros de famílias

de pacientes com AEH, mas que não apresentam a mutação.

As propriedades estruturais do inibidor de C1 são bem conhecidas. A estrutura do

domínio serpina (aminoácidos 113-478), que contém a alça central reativa (reactive center

loop RCL), essencial para a atividade biológica, mostra aspectos comuns a outras moléculas

de serpinas. Por outro lado, a atividade biológica da porção N-terminal da molécula do

inibidor de C1 é desconhecida. Busca em banco de dados não revelou nenhuma homologia

significante do domínio N-terminal com outras proteínas conhecidas, e para a confecção do

modelo apresentado no presente estudo, foram utilizadas múltiplas seqüências. A mutação em

nosso estudo ocorreu na sequência que codifica o aminoácido 95 da proteína madura, portanto

ficou aparente que se uma proteína for formada, será uma forma truncada com 124

aminoácidos, incluindo apenas o domínio N-terminal, sem qualquer possibilidade de alguma

atividade biológica, ao contrário da proteína “selvagem” de 478 aminoácidos.

Com raríssimas exceções 84 todos os pacientes com deficiência do inibidor de C1 são

heterozigotos para o defeito genético, portanto, os níveis funcionais esperados para o inibidor

de C1 em pacientes com AEH tipo I ou tipo II seriam em torno de 50% do normal,

considerando-se o alelo normal a funcionar adequadamente. No entanto, os níveis sanguíneos

são tipicamente abaixo dos 50% em pacientes com AEH. Nos pacientes do presente estudo, os

níveis séricos do inibidor de C1 foram de 21% em média, variando de 9% a 33%, mesmo em

períodos assintomáticos. Uma possível explicação para essa diminuição abaixo de 50% (que

seria esperado numa condição heterozigota) é que a diminuição dos níveis de inibidor de C1

resulta em aumento da ativação de algumas ou de todas as proteases reguladas por ele. Essas

proteases ativadas consomem o inibidor de C1 produzindo assim níveis séricos bem abaixo

Discussão 69

dos 50% esperados.36 Estudos in vivo do catabolismo do inibidor de C1 em pacientes com

AEH são consistentes com essa explicação.85 Além disso, em pacientes com algumas

mutações, é possível que o RNAm ou a proteína mutada possam produzir um efeito

supressivo na transcrição ou na tradução do alelo anormal.86,87

A literatura especializada observa que a gravidade do AEH é altamente variável e que

não se correlaciona com os níveis séricos do inibidor de C1. No presente estudo, verificamos

uma extrema variabilidade na apresentação clínica da doença em 28 indivíduos de uma

mesma família e com o mesmo defeito molecular de base, reafirmando o conceito de que

mutações específicas não predizem o fenótipo de pacientes com AEH, assim como na maioria

das doenças genéticas.40 Também não houve correlação entre a gravidade dos sintomas e os

níveis séricos de inibidor de C1 nesses pacientes. Uma observação importante é que em uma

das crianças com AEH dor abdominal recorrente foi o único sintoma presente. Portanto,

embora dor abdominal recorrente tenha várias etiologias possíveis, pode ser útil incluir o

AEH no diagnóstico diferencial, especialmente em crianças com história familiar positiva

para angioedema.

Apesar do progresso na elucidação das características bioquímicas e moleculares do

AEH, os mecanismos que levam à iniciação e resolução das crises permanecem

desconhecidos. Fatores ambientais e outros fatores como polimorfismos no receptor da

bradicinina, ou em proteínas do sistema de contato, ou ainda variações nos níveis e/ou função

das cininases provavelmente modificam a gravidade da doença. No entanto, a contribuição

desses fatores ainda não foi elucidada.

O padrão de herança autossômica dominante prediria incidência e gravidade

semelhantes entre os sexos, entretanto a maioria dos especialistas nota predominância de

mulheres buscando tratamento. No presente estudo, envolvendo um número elevado de

pacientes com AEH de uma única família, observamos que não houve diferença na incidência

de AEH entre os sexos, mas sim uma tendência a uma apresentação mais grave da doença

entre pacientes do sexo feminino, em concordância com observações de outros autores.1,9 Isso

pode representar reflexo das influências hormonais na gravidade da doença, uma vez que

situações em que ocorre aumento de estrógenos levam, muitas vezes, a aumento da freqüência

e intensidade das crises de angioedema em pacientes com AEH. De forma interessante, nossos

pacientes com AEH incluíram 2 indivíduos do sexo masculino (III-45 e II-12) que apresentam

remissão dos sintomas por mais de 24 anos, o que não ocorre com nenhuma das pacientes do

sexo feminino; e ainda, os 2 indivíduos adultos assintomáticos também são do sexo

masculino.

Discussão 70

A prevalência média de casos de AEH nos diferentes subgrupos acometidos pela

doença nessa família foi de 47,6%, o que é condizente, embora não exatamente, com a taxa de

transmissibilidade de 50% esperada em condições heterozigotas autossômicas dominantes. No

entanto, é importante lembrar que essa média pode ser um pouco maior na realidade, uma vez

que há 106 indivíduos assintomáticos que não foram avaliados para a presença da mutação

c.352delC, e entre eles podem ainda existir alguns portadores da mutação c.351delC, ou seja,

pacientes com AEH assintomático.

Em diferentes partes do mundo, longos atrasos no diagnóstico em pacientes com AEH

são relatados de forma freqüente. Em nosso estudo, o tempo transcorrido entre o início dos

sintomas e o diagnóstico variou entre 1 mês e 40 anos, com média de 15,5 anos. Entretanto,

deve-se considerar que tratam-se de indivíduos pertencentes a uma mesma família, o que

facilitou progressivamente o diagnóstico entre eles. Dados de registros Europeus estimam

que o tempo médio entre o início dos sintomas e o diagnóstico foi de 22 anos em 1977, e de

um pouco mais que 10 anos em 2005. Esses dados reforçam a idéia de que o AEH é uma

doença ainda pouco conhecida e diagnosticada em todo o mundo. No Brasil, um registro

nacional de casos feito por Grumach et al,69 contabilizando dados dos principais centros de

referência do país, totalizou 120 casos diagnosticados. Considerando-se a prevalência média

da doença de 1 caso para cada 50.000 habitantes, teríamos uma estimativa de cerca de 3800

casos de AEH na população brasileira. Esses dados demonstram claramente como o AEH é

extremamente sub-diagnosticado em nosso meio. Essa falha no diagnóstico pode ter sérias

consequências, tendo em vista que o AEH é uma doença que traz um grande impacto na

qualidade de vida dos pacientes e que pode ser altamente debilitante e até mesmo letal (mais

de 50% dos pacientes apresentam pelo menos 1 episódio de edema de glote durante a vida e

que a taxa de letalidade gira em torno de 30% quando esses episódios não são diagnosticados

e tratados apropriadamente).

No grupo de pacientes em tratamento profilático com andrógeno atenuado (Danazol)

observamos boa resposta ao tratamento com doses mais baixas do que as recomendadas1 em

12/13 pacientes e, nessas doses, não observamos efeitos adversos importantes. No entanto,

não dispomos atualmente de nenhuma alternativa terapêutica eficaz e segura para o

tratamento das crises de AEH em nosso meio. Segundo relato de familiares, 2 mulheres da

família em estudo (I-2 e II-10 na Figura 11) foram a óbito em consequência de crise de AEH.

Crises graves podem ser letais quando não tratadas apropriadamente, por isso, é

imprescindível que as novas drogas desenvolvidas para o tratamento das crises incluindo o

antagonista de receptor da bradicinina (icatibanto), o inibidor da calicreína plasmática

Discussão 71

(ecallantide) e, em especial, o concentrado do inibidor de C1, sejam registradas e tenham seu

uso viabilizado para os pacientes com AEH no Brasil.

72

6 CONCLUSÕES

Conclusões 73

6 CONCLUSÕES

1. A mutação c.351delC no gene que codifica o inibidor de C1, SERPING1, tem ligação

causal definitiva com o desenvolvimento de angioedema hereditário tipo I em

membros de uma família brasileira

2. Se transcrita, a proteína codificada a partir do gene com a mutação c.351delC é

truncada e sem atividade biológica

3. A análise genética permite o diagnóstico precoce de angioedema hereditário em

portadores assintomáticos da mutação c.351delC

4. Há ampla variabilidade de apresentação e gravidade clínicas do angioedema

hereditário em pacientes da mesma família com a mutação c.351delC

5. Não há correlação entre a gravidade clínica e os níveis séricos do inibidor de C1 nos

pacientes com diagnóstico de angioedema hereditário que apresentam a mesma

mutação genética.

74

REFERÊNCIAS

Referências 75

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82

APÊNDICES

Apêndices 83

APÊNDICE A – Termo de consentimento livre e esclarecido

HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE R IBEIRÃO PRETO - UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CAMPUS UNIVERSITÁRIO – MONTE ALEGRE – FONE: 3633 1000 FAX 3633 1144 – CEP: 14048-900

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Nome da pesquisa: ANGIOEDEMA HEREDITÁRIO: ESTUDO CLÍNICO E GENÉTICO DE UMA FAMÍLIA BRASILEIRA Pesquisadoras responsáveis: Dra. Maria Fernanda Ferraro (CRM 109.221) e Prof. Dra. Luisa Karla de Paula Arruda (CRM 50.494) (orientadora) Local da Pesquisa: Ambulatório de Alergia (AALE) do Hospital das Clínicas e Laboratório de Imunologia Clínica, Departamento de Clínica Médica, FMRP-USP Objetivos e Procedimentos do Estudo:

O angioedema hereditário é uma doença que pode passar de pai para filho. Esta

doença causa o aparecimento de edemas (inchaços) em várias partes do corpo, por exemplo,

face, mãos, pés, língua, laringe e intestinos. As pessoas que têm esse problema apresentam

sintomas variáveis: algumas têm edemas muito freqüentes, outras só de vez em quando, outras

têm muitas dores de barriga devido ao inchaço do intestino. Algumas vezes, os sintomas são

leves e incomodam apenas um pouco, mas, outras vezes, as crises podem ser muito graves,

levando até mesmo à morte por asfixia quando acontece o edema de glote.

A sua família tem muitas pessoas que apresentam esse problema. É importante que

todos sejam avaliados para que possamos ter certeza do diagnóstico e iniciar o tratamento

para evitar as crises de inchaço. Pretendemos também fazer o estudo genético (DNA) de cada

um para que possamos saber quem tem o defeito nos genes (material que passa de pai para

filho) que causa a doença. Com isso poderemos orientar a todos da sua família quanto ao

diagnóstico, o tratamento, a chance de ter a doença no futuro e a chance de ter um filho com a

doença. O estudo da sua família nos ajudará a entender melhor essa doença e, assim, poderá

ajudar também a outras famílias no futuro.

Você está sendo convidado a participar do presente estudo. Para isso, precisaremos

coletar 5 ml do seu sangue para o estudo genético e, se você tiver história de edemas, mais 10

ml para dosar os componentes do sangue que levam ao inchaço, em 2 ocasiões.

Caso você não aceite participar do estudo, não haverá nenhum prejuízo e você será

atendido normalmente no nosso ambulatório no Hospital das Clínicas, caso necessite.

Apêndices 84

Desconforto e riscos esperados

A punção venosa para coletar o sangue pode causar um pequeno desconforto e em

alguns casos, formar um pequeno hematoma no local, mas será realizada por pessoa treinada,

pertencente ao grupo de pesquisa.

Em caso de qualquer dúvida ou evento associado ao estudo, contactar:

Dra. L. Karla Arruda – Hospital das Clínicas da FMRP-USP, 6º Andar, Sala 632 Tels: (016) 3602-3279 (laboratório); (016) 3972-3718 (residência); (016) 8137 2172 (celular) ou

Dra. Maria Fernanda Ferraro - Laboratório de Alergia – Anexo A, Bloco B – FMRP-USP Tels: (016) 3602-3279 (laboratório); (034) 3235-9674 (residência); (034) 9997-1778 (celular)

Eu, ____________________________________________________________________

R.G.____________________________________, abaixo assinado, tendo recebido as informações acima e ciente dos meus direitos abaixo relacionados, concordo em participar da pesquisa. 1. A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento acerca dos procedimentos, riscos, benefícios e outros relacionados à pesquisa e o tratamento a que serei submetido. 2. A liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar do estudo sem que isso traga prejuízo à continuação do meu cuidado e tratamento. 3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido o caráter confidencial da informação relacionada com a minha privacidade. 4. O compromisso de me proporcionar informação atualizada durante o estudo, ainda que esta possa afetar minha vontade de continuar participando. 5. O compromisso de que serei devidamente acompanhado e assistido durante todo o período de minha participação no projeto, bem como de que será garantida a continuidade do meu tratamento, após a conclusão dos trabalhos de pesquisa. Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade em participar do referido projeto.

Data: _____/_____/_______

Assinatura do paciente

Pesquisador responsável

Apêndices 85

APÊNDICE B – Termo de consentimento livre e esclarecido para menores de 18 anos

HOSPITAL DAS CLÍNICAS DA FACULDADE DE MEDICINA DE R IBEIRÃO PRETO - UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

CAMPUS UNIVERSITÁRIO – MONTE ALEGRE – FONE: 3633 1000 FAX 3633 1144 – CEP: 14048-900 TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO- MENORES DE 18 ANOS

Nome da pesquisa: ANGIOEDEMA HEREDITÁRIO: ESTUDO CLÍNICO E GENÉTICO DE UMA FAMÍLIA BRASILEIRA Pesquisadoras responsáveis: Dra. Maria Fernanda Ferraro (CRM 109.221) e Prof. Dra. Luisa Karla de Paula Arruda (CRM 50.494) (orientadora) Local da Pesquisa: Ambulatório de Alergia (AALE) do Hospital das Clínicas e Laboratório de Imunologia Clínica, Departamento de Clínica Médica, FMRP-USP Objetivos e Procedimentos do Estudo:

O angioedema hereditário é uma doença que pode passar de pai para filho. Esta doença

causa o aparecimento de edemas (inchaços) em várias partes do corpo, por exemplo, face,

mãos, pés, língua, laringe e intestinos. As pessoas que têm esse problema apresentam sintomas

variáveis: algumas têm edemas muito freqüentes, outras só de vez em quando, outras têm

muitas dores de barriga devido ao inchaço do intestino. Algumas vezes, os sintomas são leves

e incomodam apenas um pouco, mas, outras vezes, as crises podem ser muito graves, levando

até mesmo à morte por asfixia quando acontece o edema de glote.

A sua família tem muitas pessoas que apresentam esse problema. É importante que todos

sejam avaliados para que possamos ter certeza do diagnóstico e iniciar o tratamento para evitar

as crises de inchaço. Pretendemos também fazer o estudo genético (DNA) de cada um para

que possamos saber quem tem o defeito nos genes (material que passa de pai para filho) que

causa a doença. Com isso poderemos orientar a todos da sua família quanto ao diagnóstico, o

tratamento, a chance de ter a doença no futuro e a chance de ter um filho com a doença. O

estudo da sua família nos ajudará a entender melhor essa doença e, assim, poderá ajudar

também a outras famílias no futuro.

Apêndices 86

Seu (sua) filho(a) ou o menor pelo qual você é o responsável legal está sendo

convidado a participar do presente estudo. Para isso, precisaremos coletar 5 ml do menor para

o estudo genético e, se ele (ela) tiver história de edemas, mais 10 ml para dosar os

componentes do sangue que levam ao inchaço, em 2 ocasiões.

Caso você não aceite que seu (sua) filho(a) ou o menor pelo qual você é o responsável

legal participe do estudo, não haverá nenhum prejuízo e o menor será atendido normalmente

no nosso ambulatório no Hospital das Clínicas, caso necessite.

Desconforto e riscos esperados

A punção venosa para coletar o sangue pode causar um pequeno desconforto e em

alguns casos, formar um pequeno hematoma no local, mas será realizada por pessoa treinada,

pertencente ao grupo de pesquisa.

Em caso de qualquer dúvida ou evento associado ao estudo, contactar:

Dra. L. Karla Arruda – Hospital das Clínicas da FMRP-USP, 6º Andar , Sala 632 Tels: (016) 3602-3279 (laboratório); (016) 3972-3718 (residência); (016) 8137 2172 (celular) ou

Dra. Maria Fernanda Ferraro - Laboratório de Alergia – Anexo A, Bloco B – FMRP-USP Tels: (016) 3602-3279 (laboratório); (034) 3235-9674 (residência); (016) 9997-1778 (celular)

Eu, ____________________________________________________________________

R.G.____________________________________, abaixo assinado, responsável legal pelo menor _______________________________________________________, tendo recebido as informações acima e ciente dos meus direitos abaixo relacionados, concordo que meu (minha) filho (a) ou o menor pelo qual sou o responsável legal participe da pesquisa.

1. A garantia de receber a resposta a qualquer pergunta ou esclarecimento acerca dos

procedimentos, riscos, benefícios e outros relacionados a pesquisa e o tratamento a que serei submetido.

2. A liberdade de retirar meu consentimento a qualquer momento e deixar de participar no estudo sem que isso traga prejuízo à continuação do meu cuidado e tratamento.

3. A segurança de que não serei identificado e que será mantido o caráter confidencial da informação relacionada com a minha privacidade.

4. O compromisso de me proporcionar informação atualizada durante o estudo, ainda que esta possa afetar minha vontade de continuar participando.

Apêndices 87

5. O compromisso de que serei devidamente acompanhado e assistido durante todo o período de

minha participação no projeto, bem como de que será garantida a continuidade do meu tratamento, após a conclusão dos trabalhos de pesquisa. Declaro, ainda, que concordo inteiramente com as condições que me foram apresentadas e que, livremente, manifesto a minha vontade de que meu (minha) filho (a) ou o menor pelo qual sou o responsável legal participe do referido projeto.

Data:___/___/_____

Assinatura do pai, mãe ou responsável legal pelo menor

Pesquisador responsável

Apêndices 88

APÊNDICE C – Ficha Clínica

NOME: __________________________________________________________________ SEXO:

DATA NASC.: _____/_____/_________ IDADE:_________________________________

NOME DO

PAI:______________________________________________________________________________

NOME DA MÃE: ____________________________________________________________________________

TELEFONE PARA CONTATO: ( )____________________________

EPISÓDIOS DE ANGIOEDEMA: SIM NÃO (SE SIM CONTINUAR RESPONDENDO)

IDADE INÍCIO SINTOMAS:____________________ IDADE DA MENARCA: _____________________

TIPO SINTOMAS: PELE LARINGE TRATO GASTRINTESTINAL

GRAVIDADE: DESCONFORTO, SEM PREJUÍZO DAS ATIVIDADES DIÁRIAS

DESCONFORTO QUE AFETA AS ATIVIDADES DIÁRIAS NORMAIS

CRISE GRAVE, NECESSITA ATENDIMENTO MÉDICO/HOSPITALIZAÇÃO

FREQUÊNCIA: mais de 1 vez ao mês 6 a 11 vezes/ano menos que 6 vezes ao ano

FATORES DE MELHORA:_______________________________________________________________

______________________________________________________________________________________

FATORES DE PIORA: __________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

GRAVIDEZ USO DE ACO

PERÍODO DE MAIOR INTENSIDADE DOS SINTOMAS: ____________________________________

______________________________________________________________________________________

DOENÇAS ASSOCIADAS: _______________________________________________________________

USO DE MEDICAÇÕES: ________________________________________________________________

PARENTES COM AE:___________________________________________________________________

______________________________________________________________________________________

OBS: _________________________________________________________________________________

2° ° ° ° PARTE

DATA:_____/_____/_______

DATA INÍCIO TRATAMENTO: ___/_____/_______ MEDICAÇÃ O/DOSE: _______________________

TRATAMENTO ATUAL: _______________________ DOSE: ________________________________

RESPOSTA AO TRAT/O: ASSINTOMÁTICO SINTOMAS LEVES E ESPORÁDICOS

SINTOMAS LEVES FREQUENTES SINTOMAS GRAVES

EFEITOS COLATERAIS:_________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________

89

ANEXOS

Anexos 90

ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa

22a

12 12a 1414a

40a 40 41 41a 42a 42 43 43a 44a 44 45 46 47

14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 262525a 27 28

48 48a

29a 29 31a 31 32 3330 34 36 3735a 35 38 38a 39 40 41a 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

49 49a 50a 50 51a 51 52a 52 5353a 54 54a 55

1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14

24 24a

10

5139a

I

II

III

IV

22a

1a 1 2 3a 3

1 2

1

4

4a 4

5 6 7

6a 6

10 11 12

7 7a

13 14 15 16 17

8a 8

18 19 20a 20 21 22 23

4 5

9 9a

24 25 26 26a 27 28 29a 29 30 31 32

6 8 9

10a 10

33 33a 34 37 37a3635a 35

11 12 13

11a 11

38 39

1 1a

3 3a 5

98a 8

3 10

24a

7

13 13a

56 57 58a 58 59a 59 60

15 15a

61a 61 62 63 64 64a 65 65a

16 16a

66a 66 67a 67 68 69 69a 70 70a

17a 17

71 71a 72a 72 73 74 75 75a 76 77 78 79 80 81 82 83

18 18a 19 20 21 22a 22

84 85 86 87

23 23a

87a 88 88a 89a 89

24a 24

90 90a 91 92 93a 93 94 95 96

25 25a

97 98 99 100

26a 26

101 102

27 28

103

33a 4 4a 5 5a

52 53 54 55 56 57 58 59 60a 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98

15 16 17 18

V

? ?

6

? ?

7 8 9 9a

29 30 31a 31 33 34 35 36 3732 37a

104 105 106 107 108 109 110 111 112 113

2a21a 1

Indivíduos com AEH e mutação c.351delC

Indivíduos sem AEH e sem mutação c.351delC

Indivíduos não avaliados

Indivíduos com AEH assintomático e mutação c.351delC

Indivíduos falecidos com história de sintomas de AEH

Caso índice

Figura 11. Heredograma

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