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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI
Campus Alto Paraopeba
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS
PARA O DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
AVALIAÇÃO DA BIODEGRADAÇÃO DE FTALATOS PRESENTES EM FILMES DE
PVC COMERCIAIS EMPREGANDO-SE MICRORGANISMOS SELECIONADOS NA
BIOPROSPECÇÃO REALIZADA NO PARQUE ESTADUAL SERRA DE OURO
BRANCO/MG
Márcia Regina Figueiredo Luzia
Ouro Branco/MG
2015
___________________________________________________________________________
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO JOÃO DEL-REI
Campus Alto Paraopeba
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM TECNOLOGIAS
PARA O DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL
AVALIAÇÃO DA BIODEGRADAÇÃO DE FTALATOS PRESENTES EM FILMES DE PVC
COMERCIAIS EMPREGANDO-SE MICRORGANISMOS SELECIONADOS NA
BIOPROSPECÇÃO REALIZADA NO PARQUE ESTADUAL SERRA DE OURO
BRANCO/MG
Márcia Regina Figueiredo Luzia
Dissertação de mestrado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Tecnologias para o
Desenvolvimento Sustentável da Universidade
Federal de São João Del-Rei como parte dos
requisitos necessários para obtenção do título de
Mestre.
Orientadora: Profa. Dr. Renata Carolina Z. Lofrano
Co-Orientador: Prof. Dr.Boutros Sarrouh
Ouro Branco/MG
2015
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS................................................................................................................08
LISTA DE TABELAS................................................................................................................11
RESUMO..............................................................................................................................14
ABSTRACT............................................................................................................................15
INTRODUÇÃO.......................................................................................................................16
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..................................................................................................19
Parque Estadual Serra de Ouro Branco..........................................................................19
Bioprospecção..............................................................................................................20
Polímeros e Plásticos....................................................................................................21
Policloreto de vinila (PVC).............................................................................................22
Plastificantes e ftalatos.................................................................................................24
Ação do plastificante ftalato na malha polimérica do PVC.............................................29
Toxicidade dos ftalatos.................................................................................................31
Processo de migração do ftalato...................................................................................34
Degradação de plastificantes........................................................................................37
Biodegradação dos ftalatos...........................................................................................38
Enzimas........................................................................................................................41
Esterases......................................................................................................................42
2. OBJETIVOS.......................................................................................................................45
Objetivo Geral.....................................................................................................................45
Objetivos Específicos...........................................................................................................45
3. MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................................46
3.1. Condições estéreis.................................................................................................46
3.2. Reagentes químicos...............................................................................................46
3.3. Equipamentos........................................................................................................46
3.4. Licenciamento para coleta das amostras................................................................47
3.5. Coleta de amostras no Parque Estadual Serra de Ouro Branco...............................47
3.6. Manutenção e Isolamentos dos microrganismos....................................................48
3.6.1. Técnica do Imprinting................................................................................................48
3.6.2. Crescimento e isolamento dos microrganismos........................................................49
3.7. Caracterização morfológica dos microrganismos isolados.......................................49
3.8. Amostras do filme de PVC......................................................................................50
3.9. Seleção dos microrganismos isolados aptos a utilizar o ftalato presente no filme de
PVC como substrato......................................................................................................50
3.9.1. Seleção em meio sólido.............................................................................................50
3.9.2. Seleção em meio líquido – Degradação in vitro e cinética de crescimento dos micror-
ganismos..............................................................................................................................50
3.9.3. Preparação do inóculo...............................................................................................51
3.9.4. Degradação in vitro e cinética de crescimento..........................................................51
3.10. Detecção qualitativa de atividade enzimática em meio sólido..............................51
3.11. Ensaio de biodegradação do ftalato presente no filme de PVC usando-se o micror-
ganismo selecionado previamente................................................................................52
3.11.1. Preparação do inóculo para o ensaio de biodegradação........................................52
3.11.2. Ensaio de biodegradação........................................................................................52
3.12. Análise dos produtos obtidos no ensaio de biodegradação..................................53
3.12.1. Determinação do pH...............................................................................................53
3.12.2. Método titulométrico..............................................................................................53
3.12.3. Monitoramento das células viáveis.........................................................................53
3.12.4. Determinação da morte celular pelo método da concentração da amônia...........54
3.12.5. Curva analítica.........................................................................................................54
3.12.6. Determinação da perda de massa do PVC..............................................................54
3.13. Ensaio de migração do ftalato presente no PVC para o meio mineral...................55
3.14. Identificação qualitativa dos diferentes grupos funcionais obtidos nos ensaios de
biodegradação e de migração do ftalato......................................................................55
3.14.1. Detecção do grupo funcional carboxila (-COOH) empregando-se o Teste de conver-
são a Hidroxamato Férrico..................................................................................................55
3.14.2. Detecção do grupo funcional fenol (-ArOH) empregando-se o Teste do Cloreto
Férrico.................................................................................................................................56
4. RESULTADO E DISCUSSÃO.................................................................................................57
4.1. Caracterização morfológica dos microrganismos isolados.......................................57
4.2. Seleção dos microrganismos isolados aptos a utilizar o ftalato presente no filme de
PVC como substrato......................................................................................................59
4.2.1. Seleção em meio sólido.............................................................................................59
4.2.2. Seleção em meio líquido – Degradação in vitro e cinética de crescimento dos micror-
ganismos pré- selecionados.................................................................................................61
4.3. Detecção qualitativa de atividade enzimática em meio sólido pelos microrganismos
BB1, FF2, FF3.................................................................................................................62
4.4. Realização e Análises dos Ensaios de biodegradação do ftalato presente no filme de
PVC usando-se o microrganismo selecionado previamente...........................................63
4.4.1. Determinação do pH e método titulométrico...........................................................64
4.4.2. Monitoramento das células viáveis e determinação da morte celular pelo método da
concentração da amônia......................................................................................................65
4.4.3.Determinação da perda de massa do PVC.................................................................68
4.5. Migração do ftalato...............................................................................................70
4.6. Identificação qualitativa de diferentes grupos funcionais obtidos nos ensaios de
biodegradação e de migração do ftalato......................................................................71
4.6.1. Detecção do ácido carboxílico empregando-se o Teste de conversão a Hidroxamato
Férrico.................................................................................................................................72
4.6.2. Detecção do grupo funcional fenol empregando-se o Teste Cloreto Férrico............73
5. CONCLUSÕES...................................................................................................................76
6. PERSPECTIVAS FUTURAS..................................................................................................77
7. REFERÊNCIAS...................................................................................................................78
O maior de todos os projetos é tomar uma decisão”
(Autor desconhecido)
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Gráfico ilustrativo da segmentação do mercado de transformados de plásticos por aplicações.
Figura 2. Estrutura química do monômero do cloreto de vinila.
Figura 3. Estrutura química do policloreto de vinila (PVC).
Figura 4. Estrutura química dos ftalatos.
Figura 5. Esquema ilustrativo da reação de esterificação para obtenção ésteres ftálicos.
Figura 6. Esquema ilustrativo da disposição do ftalato na estrutura polimérica do policloreto de vinila.
Figura 7. Diagrama ilustrativo do éster ftálico na malha do policloreto de vinila.
Figura 8. Esquema ilustrativo do mecanismo de atração do tipo dipolo-dipolo, entre duas cadeias do
policloreto de vinila
Figura 9. Ilustração do mecanismo de plastificação do policloreto de vinila.
Figura 10. Ilustração do mecanismo de interação policloreto de vinila/plastificante.
Figura 11. Esquema ilustrativo dos modelos de migração de massas.
Figura 12. Esquema representativo dos compostos obtidos na biodegradação de ftalato de dietilo (DEP).
Figura 13. Esquema ilustrativo das rotas metabólicas da biodegradação dos ésteres ftálicos em meio
aeróbio e anaeróbio
Figura 14. Esquema geral da degradação do ftalato. (A) no ácido ftálico (C), diretamente ou através do
monoéster (B)
Figura 15. Representação esquemática em 3D das hidrolases. Folhas-β circundadas pelas regiões em α-
hélices.
Figura 16. Representação esquemática das enzimas da família α/β hidrolases. As folhas β (1-8) são
indicadas por setas e a alfa- hélices são indicadas pelos cilindros. As posições dos aminoácidos estão
indicadas pelos círculos preenchidos.
Figura 17. Representação da estrutura molecular em 3D da hidrolase de Pseudomonas aeruginosa. (a)
Representação das conformações α e β. (b) Representação da superfície molecular, a “tampa” foi
destacada em verde e laranja. (c) Sítio catalítico visto de cima, com a serina catalítica em vermelho.
Figura 18. Esquema da reação de hidrólise e síntese de ésteres de ácidos carboxílicos.
Figura 19. Imagem de satélite indicando o local de coleta das amostras no Parque Estadual Serra de Ouro
Branco. Imagem fornecida pelo IEF – Ouro Branco
Figura 20. Exemplos de microrganismos isolados do Parque Estadual Serra de Ouro Branco. A primeira
foto (esquerda) se refere ao microrganismo BC19, segunda ao BC8 e a terceira ao BB6.
Figura 21. Distribuição de frequência dos microrganismos isolados.
Figura 22. Foto ilustrativa do crescimento do microrganismo FF5 em meio sólido, contendo filme de PVC
como substrato.
Figura 23. Fotos ilustrativas dos diferentes microrganismos selecionados para os estudos cinéticos, de
acordo com a codificação apresentada na Tabela 6.
Figura 24. Gráfico relativo à cinética de crescimento dos microrganismos BB1, FF2, FF3, BB4, FF5, BB6,
BC7 e BC8, sob mesmas condições de cultivo.
Figura 25. Fotos ilustrativas de halos produzidos por cepas de microrganismos após 10 dias de
crescimento em meio suplementado com Tween 80, a atividade esterásica foi apresentada pelo halo
opaco ao redor da colônia dos microrganismos BB1, FF2 e FF3.
Figura 26. Gráfico referente aos valores do pH, obtidos usando-se pHmetro em relação a concentração do
ácido (mol/L) nos ensaios de biodegradação do ftalato presente nos filmes de policloreto de vinila.
Figura 27. Gráfico da concentração de ácido (mol/L-1) monitorada, pelo método titulométrico durante 24
dias dos ensaios de biodegradação do ftalato presente nos filmes de policloreto de vinila
Figura 28. Gráfico referente ao monitoramento concentração de células viáveis através da contagem de
unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL).
Figura 29. Gráfico da curva padrão da amônia.
Figura 30. Gráfico da variação da concentração de amônia no ensaio de biodegradação do ftalato.
Figura 31. Gráfico da variação da concentração da amônia em relação à quantidade de células viáveis
durante o ensaio de biodegradação
Figura 32. Gráfico referente ao monitoramento da perda de massa do filme de PVC durante o ensaio de
biodegradação.
Figura 33. Gráfico referente à concentração de células viáveis e a perda de massa do filme de policloreto
de vinila no decorrer do ensaio de biodegração.
Figura 34. Gráfico dos valores de pH, obtidos usando-se pHmetro, no ensaio para verificação da migração
do ftalato presente no filme de PVC em meio mineral o mesmo utilizado nos ensaios de biodegradação.
Figura 35. Fotos ilustrativas dos experimentos realizados para a detecção da presença da função do ácido
carboxílico nos ensaios de migração (à esquerda) e nos ensaios de biodegradação (à direita). Nos dois
ensaios, da direita para a esquerda os tubos de ensaio representam os tempos 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,
18, 20, 24 e os dois últimos tubos de ensaio ilustram os resultados negativo e positivo usados para fins
comparativos.
Figura 36. Fotos ilustrativas dos experimentos realizados para a detecção da presença da função fenol nos
ensaios de migração (à esquerda) e nos ensaios de biodegradação (à direita). Nos dois ensaios, da direita
para a esquerda os tubos de ensaio representam os tempos 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 e os dois
últimos tubos de ensaio ilustram os resultados negativo e positivo usados para fins comparativos.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Relação de isômeos dos di-ésteres ftálicos ou ftalatos.
Tabela 2. Relação de ftalatos comumente utilizados, seus nomes (IUPAC e comum), abreviações e
fórmulas moleculares.
Tabela 3. Relação de valores médios da concentração de ftalatos (mg.Kg-1) nas várias frações do Lixo
doméstico.
Tabela 4. Relação das principais propriedades físico-químicas de alguns ftalatos.
Tabela 5. Relação de amostras coletadas no Parque Estadual Serra de Ouro Branco e suas respectivas
localizações no Sistema de Posicionamento Global.
Tabela 6. Caracterização fenotípica dos microrganismos isolados.
Tabela 7. Relação de índices enzimáticos obtidos para os microrganismos isolados.
Tabela 8. Relação de ensaios químicos de ánalise funcional realizadosnos ensaios de biodegradação e
migração do ftalato.
Tabela 9. Resultados obtidos nos ensaios qualitativos de detecção da função orgânica ácido carboxílico
durante os ensaios de migração e de biodegradação do ftalato presente no filme de PVC.
Tabela 10. Resultados obtidos nos ensaios qualitativos de detecção da função orgânica fenol presentes
durante os ensaios de migração e de biodegradação do ftalato presente no filme de PVC.
Agradecimentos
Desafio tão grande quanto escrever essa dissertação, foi agradecer com carinho à todas as pessoas que
fizeram parte dessa trajetória.
Inicio meu agradecimento para aquele que tornou tudo possível, a Deus por me amparar nos momentos
difíceis, me dar força interior para superar as dificuldades, mostrar os caminhos nas horas incertas e me
suprir em todas as minhas necessidades. Por sempre atender a minhas preces, por me cobrir de luz e me
agraciar em sempre cruzar o caminho de pessoas maravilhosas.
A UFSJ e ao Programa de Programa de Pós-Graduação em Tecnologias para o Desenvolvimento
sustentável, pela oportunidade de realização do curso.
A minha querida Família, tios, tias, primos e avós, pela confiança, apoio e orações diárias.
Aos meus pais, por sempre me incentivarem perante os desafios, a fazer mais e melhor. À minha mãe.
porque a amo profundamente. Não caberia nesta dissertação, o que gostaria de registrar para
homenageá-la. Tudo o que vivemos juntas nesse tempo do mestrado, sob um amor incondicional. Forjou-
me a mulher que sou. Muito obrigada por você ser essa “fortaleza”, o meu porto seguro.
A minha irmã pelos lanches gostosos, pela paciência e principalmente por acreditar no meu sucesso.
Ao meu noivo Vitor, pelo companheirismo, força e carinho insubstituível, ouvinte atento de algumas
dúvidas, inquietações, desânimos e sucessos, pelo apoio, pela confiança e pela valorização sempre tão
entusiasta do meu trabalho, dando‐me, desta forma, coragem para ultrapassar todos os obstáculos. E
pelo seu dizer tranquilizante: “calma, tenho certeza que você vai conseguir! ”
Aos amigos “Lado A”, pelas descontrações nos finais de semana e pelas longas conversas em uma mesa
de bar.
À minha orientadora Profa. Renata Carolina e co-orientador prof. Boutros Sarrouh, pelas orientações,
compromisso e oportunidade de desenvolver este projeto, por acreditarem em mim. Por me mostrarem o
caminho da ciência, fazerem parte da minha vida nos momentos bons e ruins, por serem exemplos de
profissionais.
Ao técnico do laboratório Wesley, por sua ajuda nos momentos mais críticos e por acreditar no futuro
deste projeto. Sua participação foi fundamental para a realização deste trabalho. E tantos outros técnicos
do CAP que me ajudaram em diferentes etapas, seja, conseguindo um reagente que eu não tinha na hora
ou até mesmo, na coleta das amostras no Parque.
Aos meus amigos do Programa, Cássia, Camila e Bárbara Dutra que fizeram parte desses momentos,
sempre me incentivando e ajudando com palavras certas e na hora certa. Obrigada pelo otimismo de
sempre, momentos de descontrações e conversas alheias aos problemas. Posso falar que construí
amizades para a vida toda!
Aos colegas de curso e laboratório, por tudo que passamos juntos, pelas conversas nos corredores e pelas
orientações, pela disponibilidade de tempo, paciência em acompanhar e ensinar os trabalhos de bancada.
Ao LABICEM, BIOTEC e Laboratório de Microbiologia, por possibilitar o desenvolvimento desse trabalho.
A todos os professores do curso, pelos ensinamentos passados.
A Capes pelo apoio financeiro.
E as pessoas que me ajudaram diretamente ou indiretamente e que não foram mencionadas nesse texto,
o meu...
MUITO OBRIGADA !!!!
RESUMO ______________________________________________________________________________
Plastificantes são substâncias orgânicas sintéticas de baixa massa molar, adicionadas ao
polímero para aumentar sua flexibilidade e a resistência do produto final. Os ésteres ftálicos ou ftalatos,
são amplamente utilizados como plastificantes em indústrias químicas, principalmente como aditivo ao
policloreto de vinila (PVC). Estes ésteres têm sido encontrados no meio ambiente, como contaminantes
em solos e águas. Estudos afirmam que a quebra metabólica dos ésteres ftálicos através de
microrganismos é considerada uma das principais rotas de degradação ambiental destes poluentes. Esse
trabalho aborda a biodegradação dos ftalatos, presentes em filmes PVC comerciais. Para tal, foram
avaliados microrganismos epifíticos, isolados de amostras de água, briófitas, solo, terra de cupinzeiro,
folhas, caule de árvore e bromélias do Parque Estadual Serra de Ouro Branco/MG. Das 10 amostras
coletadas, 23 microrganismos foram isolados. Para a seleção dos microrganismos aptos a biodegradar o
ftalato foram realizados ensaios de crescimento em meio sólido e líquido, testes qualitativos de
atividade enzimática e ensaios de biodegradação utilizando-se meios de cultura, cuja única fonte de
carbono foi o ftalato presente no filme de PVC comercial. Por meio desses ensaios foram escolhidos os
microrganismos (BB1, FF2, FF3). Esses apresentaram maior capacidade de utilizar o ftalato como
substrato. A bactéria BB1 foi selecionada por apresentar o maior halo esterásico, no teste qualitativo de
atividade enzimática. Isso se justifica uma vez que estudos demonstram que essas enzimas catalisam a
clivagem de ligações ésteres presentes na estrutura dos ftalatos. A BB1 foi cultivada durante 24 dias, em
meio contendo sais e o filme PVC. Foram detectadas titulométricamente variações de 0,60 a 3,10 ± 0,07
mol/L na concentração de ácido no meio. Devido possivelmente à biodegradação do éster ftálico a ácido
ftálico. No monitoramento da perda de massa do filme de PVC, constatou-se uma diminuição de
aproximadamente 28% no valor de massa obtido. Visando-se esclarecer se a perda de massa foi
realmente devida à biodegradação do ftalado e não à simples transferência ou migração do mesmo para
o meio usado, foi feito um ensaio de migração. A partir da análise dos resultados obtidos observou-se
que o pH diminui gradualmente 89%, de 7,3 para 6,5 no decorrer dos 24 dias de ensaio, devido ao
aumento no da concentração do ácido ftálico no meio através do processo de migração do ftalato.Com
base no monitoramento da liberação de amônia no meio líquido e o crescimento celular constatou-se
que a partir do 10º dia do ensaio de biodegradação a quantidade de células viáveis e a concentração de
amônia não tiveram variações significativas, indicando que a manutenção da atividade celular ocorreu
devido ao consumo do ftalato e não em função da amônia provenientes das células mortas (consumo
endógeno). Foram feitos testes qualitativos para detecção de ácidos carboxílicos e fenol nos ensaios de
migração e biodegradação. Analisando os resultados da identificação do ácido carboxílico, percebeu-se
que a sua presença no ensaio de biodegração é provavelmente decorrente do processo de migração e
também da biodegradação dos ftalatos. A detecção de fenol comprova a efetividade do processo de
biodegradação, pois os fenóis são produtos exclusivos da biodegradação aeróbia dos ftalatos presentes
no filme PVC. A biodegradação do ftalato pela bactéria BB1 se mostrou promissora quanto a esse tipo
de plastificante.
Palavras-chave: Ftalatos; filmes de PVC; biodegradação; bioprospecção; Parque Estadual Serra de Ouro
Branco/MG.
17
ABSTRACT ______________________________________________________________________________
Plasticizers are synthetic organic substances of low molecular weight, added to the polymer to increase
its flexibility and endurance of the final product. The phthalic esters or phthalates, are extensively used
as plasticizers in the chemical, mainly as an additive to polyvinyl chloride (PVC). These esters have been
found in the environment, as contaminants in soils and water. Studies claim that the metabolic
breakdown of phthalate esters by microorganisms is considered one of the main routes of
environmental degradation of these pollutants. This work addresses the biodegradation of phthalates
present in PVC commercial films. For this have been assessed epiphytic microorganisms isolated from
water samples, bryophytes, soil, earth mound, leaves, tree stem and bromeliads State Park Serra de
Ouro Branco/MG. Among 10 samples collected, 23 microorganisms were isolated. For the selection of
microorganisms able to biodegrading phthalate, growth assays were performed on solid and liquid
medium, qualitative tests of enzymatic activity and biodegradation tests using culture media, whose
sole carbon source was phthalate present in the PVC film comercial. Through these tests were chosen
microorganisms (BB1, FF2, FF3). These showed higher capacity to use as a substrate phthalate. The BB1
bacterium was selected to present the highest halo esterase, in the qualitative test of enzyme activity.
This is justified since studies show that these enzymes catalyze the cleavage of ester bonds present in
the structure of phthalates. The BB1 was cultivated for 24 days in culture medium containing salts and
the PVC film. Variations were detected between 0,6 and 3,10 ± 0,07 mol/L of acid concentration found
in the biodegradation medium.This fact is Possibly due to the biodegradation of the phthalic ester to
phthalic acid. In monitoring the weight loss of the PVC film, there was a decrease of approximately 28%
in the mass value obtained. This demonstrates phthalate consumption by BB1. By monitoring the
release of ammonia in the liquid medium and cell growth it was found that from 10th day of
biodegradation assay the amount of viable cells and the concentration of ammonia did not change
significantly, indicating that the maintenance of cellular activity was due to phthalate consumption and
not in function of the ammonia from dead cells (endogenous consumption). Qualitative tests were
performed for the detection of carboxylic acids and phenolic compunds in the migration and
biodegradation assays. Analyzing the result of carboxylic acid identification, it was noticed that its
presence is probably a result both of the migration process and biodegradation of phthalates. The
phenol detection proves the effectiveness of the biodegradation process, since phenols are unique
products of aerobic biodegradation and was not detected in the migration assays. Biodegradation of
phthalate by BB1 bacteria proved promising as this type of plasticizer.
Key-words: phthalates; PVC films; biodegradation; bioprospecting; State Park Serra de Ouro Branco/MG.
18
INTRODUÇÃO ______________________________________________________________________________
Nas décadas passadas, a grande maioria dos artefatos eram confeccionados com os denominados
materiais convencionais como madeiras, metais, rochas, cerâmica, vidro, entre outros. Esses foram
substituídos, com vantagens, pelos plásticos. Por esta razão, o emprego deste alcançou um papel
essencial em nosso cotidiano (MIODOVNIK et al., 2014; RODOLFO e MEI, 2006). Esse uso frequente dos
plásticos pela sociedade moderna foi possível devido a adição de aditivos, os quais são aplicados para a
melhoria de alguma propriedade desejada do polímero base.
Os plastificantes, ou aditivos como denominado por muitos autores, são moléculas relativamente
pequenas de baixa massa molar e volatilidade. São adicionados aos polímeros, com o propósito de
aumentar sua processabilidade e flexibilidade (FERREIRA e MIRITA, 2014). Atuam incrustando-se entre
as cadeias poliméricas espaçando-as (incrementando um "volume livre") e modificando de forma
significativa as propriedades físicas do material (BROWN et al., 1996). Sendo assim, um determinado
material polimérico pode e muitas vezes devem receber um aditivo, seja no momento de sua síntese ou
durante o seu processamento (RODOLFO et al, 2006).
Ésteres ou di-ésteres ftálicos ou ainda ftalatos estão entre os aditivos mais comumente utilizados
pelas industrias de polímeros, o que explica a sua ampla aplicabilidade em diferentes produtos. Dados
relatados por XU e colaboradores (2008) demonstram que produção mundial de plastificantes
aumentou de 1,8 milhões de toneladas em 1975 para 3 milhões de toneladas em 2001, sendo que 25%
dessa produção é de di-etilhexil ftalato. Em 2002, a produção dos plastificantes dibutil ftalato e di-
etilhexil ftalato atingiu 134 e 394 mil toneladas, respectivamente.
Estimativas mostram que cerca de 80% dos plastificantes estão voltados para a aplicação no
policloreto de vinila (PVC), que é um dos polímeros mais consumidos mundialmente. O PVC é
classificado como plástico rígido e possui elevada capacidade de aceitar grandes quantidades de aditivo,
o que é fundamental para aplicações nas quais a flexibilidade é requerida (GRISA et al., 2011). Os
ftalatos são os plastificantes mais adicionados ao PVC, destacando-se o ftalato de dioctila também
conhecido como di-etilhexil ftalato, que é o mais consumido dentre os ftalatos e é considerado como
plastificante padrão (WANG et al., 2014).
Os ésteres ftálicos, os plastificantes mais utilizados para a produção do PVC, são denominados
também com dialquil ou alquilaril éster do ácido 1,2- benzenodicarboxílico. São a utilizados também
como plastificantes em indústrias químicas como aditivo às resinas de poliuretano, resinas celulósicas e
outros, podem também ser empregados na produção de repelentes de insetos, de fibras sintéticas e de
cosméticos (BROWN et al., 1996).
Mesmo diante desta realidade de intenso uso, há um lado desfavorável relacionado aos ftalatos.
Estes têm sido encontrados em diversos meios devido a transferência desse plastificante para o meio
19
ambiente durante o processo de manufatura, uso, distribuição e disposição final inadequada dos
plastificantes e dos produtos que os contém (GRISA et al., 2011; MUCELIN e BELLINI, 2008). Os ésteres
ftálicos tendem a se acumular no solo e nas partículas de sedimentos, em razão do alto coeficiente de
partição octanol-água e da baixa solubilidade em água, o que causa a sua permanência no meio
ambiente e consequentemente a contaminação do mesmo (FERREIRA e MIRITA, 2012).
Diante desse contexto, a contaminação das águas e do solo produzida pelo descarte inadequado
de materiais plásticos, contendo plastificantes do tipo ftalato, tem gerado um grande impacto ambiental
e consequentemente uma grande preocupação para a humanidade. Estudos toxicológicos demonstram
que o contato com ftalatos de baixa massa molecular podem causar irritações nos olhos, nariz e
garganta e os ftalatos de alta massa molecular são considerados potencialmente carcinogênicos e
teratogênicos, causando danos ao fígado, rins e órgãos reprodutivos, bem como disfunções endócrinas
(PAGANETTO et al., 2000). Os ftalatos são também tóxicos para muitas espécies, incluindo algas,
protozoários, moluscos, crustáceos, peixes e invertebrados, o que interfere drasticamente no meio
ambiente (CHEN et al., 2004).
De acordo com GRISA (2011) a principal forma de reduzir o impacto sócio-ambiental causado pela
contaminação do ambiente por ftalatos é a descontaminação destes. Entre as técnicas de
descontaminação conhecidas atualmente, destaca-se a biodegradação, que consta com a presença de
microrganismos degradadores do contaminante (CHEN et al., 2004). Além da biodegradação de certos
poluentes e materiais orgânicos, os microrganismos também são responsáveis por processos-chave no
ciclismo geoquímico e proteção dos ecossistemas, o que torna a técnica sustentável (YUAN et al., 2010).
Muitos estudos envolvendo a descontaminação ambiental por plastificantes demonstram que a
ação microbiana é o recurso principal e mais eficiente para a sua degradação nos sistemas aquáticos e
terrestres, tais como solos, sedimentos e águas superficiais (YUAN et al., 2010; DI GENNARO et al.,
2005), uma vez que a degradação abiótica desses materiais por hidrólise e fotólise ocorrem de forma
mais lenta que a biodegradação (ABDEL-DAIEM et al., 2012, YAUN et al.,2010). Devido à demora da
biodegradação de plastificantes via abiótica, estudos afirmam que a via biológica é uma das principais
vias para a degradação de tais materiais. Vários tipos de organismos já são conhecidos por serem
capazes de degradar os plastificantes, e os seus metabolitos têm sido analisados (PSILLAKIS et al., 2004).
Medir as taxas de biodegradação é uma forma importante para avaliar o destino e os riscos destes
contaminantes, sendo o foco da maioria dos estudos in situ. Dessa forma, tornam-se viáveis estudos em
escala laboratorial, uma vez que são mais rápidos e controláveis (LIN et al., 2003).
Diante do exposto, pode-se citar que, nos últimos anos tem surgido um crescente interesse na
área de biodegradação de poluentes ambientais do tipo ftalato, e consequentemente o interesse em
microrganismos que o faz. Uma das técnicas possíveis em selecionar microrganismos degradadores de
poluentes do tipo ftalatos é a bioprospecção. Essa técnica torna possível a pesquisa de material
20
biológico com a finalidade de explorar os recursos genéticos garantindo seu uso de forma sustentável,
com a utilização de estratégias de conservação e consequentemente a bioremediação, garantindo a
distribuição justa e equitativa dos benefícios advindos de sua utilização e a promoção e regulamentação
de novas tecnologias, uma vez que este material biológico se tornou um recurso e a informação
genética tem valor de mercado (AZEVEDO, 2003).
Esse método torna-se uns dos principais alvos das pesquisas, visto que a utilização de
microrganismos pode apresentar resultados satisfatórios na degradação de poluentes (MUCELIN e
BELLINI, 2008). Pesquisas atuais são direcionadas para o desenvolvimento de métodos analíticos simples
e sensíveis, capazes de monitorar, com precisão, a remoção de traços de ftalatos, através da degradação
biológica, por meio de tecnologias inovadoras de tratamento (PSILLAKIS et al., 2004).
Todos estes fatores têm dispertado o interesse da comunidade científica na investigação da
presença, dos efeitos, controle e tratamento de ftalatos no ambiente. E uma vez que os filmes de
policloreto de vinila comerciais são largamente utilizados no nosso cotidiano, temos uma maior
possibilidade de contaminação de águas e solos com esses compostos orgânicos nocivos à saúde
humana. Dessa forma, o desenvolvimento de estudos de biodegradação de ftalatos aliado à
biopropospecção de novos microrganismos, que são os alvos desse trabalho, contemplam duas áreas de
suma importância socioeconômica e ambiental na atualidade, a biotecnologia e a sustentabilidade, mais
especificamente a preservação do meio ambiente, demonstrando a importância do trabalho aqui
apresentado.
21
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
__________________________________________________________________________________
Parque Estadual Serra de Ouro Branco
A região do Parque Estadual Serra de Ouro Branco está situada na borda limítrofe da Serra do
Espinhaço, sendo a primeira formação geológica considerada como marco nos municípios de Ouro
Branco e Ouro Preto (IEF, 2014). A Cadeia do Espinhaço foi uma fonte importante de riquezas minerais,
principalmente de pedras preciosas durante o período colonial. Com isso várias cidades se
estabeleceram em seu entorno, as quais controlavam a economia brasileira. A região central, onde se
localiza o Parque, foi o local das primeiras descobertas de riquezas minerais pelos paulistas, as
chamadas Minas Gerais. A região serviu de trajeto para aqueles que vinham de São Paulo, pelo caminho
velho, e depois do Rio de Janeiro pelo caminho novo ou Estrada Real (PINTO, 2011).
Desde setembro de 2009 pelo decreto 45.189, “a Serra”, como era denominada anteriormente,
foi transformada no Parque Estadual da Serra de Ouro Branco, administrado pelo Instituto Estadual de
Florestas (IEF). O Parque engloba uma área de aproximadamente 7.520 hectares, se iniciando como uma
elevação abrupta, formada por um paredão com cerca de 20 km de extensão a sudeste, que delimita um
planalto cuja altitude varia entre 1250 e 1568 metros (IEF, 2014; BRAGA, 2011).
A Cadeia do Espinhaço foi apontada como “Área de Importância Especial” para a conservação de
répteis e anfíbios em Minas Gerais devido a sua grande biodiversidade (DRUMMOND et al., 2005).
Considerada Unidade de Conservação pela Conservação Internacional de 2005, o Parque Estadual Serra
de Ouro Branco está localizado na área de transição entre a Mata Atlântica e o Cerrado, dois biomas
considerados áreas de relevância ecológica por possuir vegetação diferenciada da restante e,
consequentemente, abrigar espécies endêmicas (hot spots mundiais) (BRAGA, 2011). Essa é reconhecida
como uma das regiões com maior diversidade florística na América do Sul, com mais de 30% de espécies
endêmicas, sendo que a maioria destas estão associadas a ambientes de afloramentos rochosos. A alta
diversidade contrasta com as graves condições climáticas típicas de afloramentos em geral, tais como
elevada intensidade de raios ultravioleta (UV), variações térmicas diárias do substrato que podem
atingir 45°C, perda de água acelerada, cobertura do solo pouco desenvolvida e solo que apresenta um
elevado teor de metais pesados devido à presença de ferro. Devido à topografia irregular e ao solo
impróprio para agricultura, os campos rupestres dessa região não parecem sofrer pressão antrópica
acentuada (JACOBI e CARMO, 2008; RAPINI et al., 2008).
22
Bioprospecção
A bioprospecção para muitos pesquisadores é uma atividade de pesquisa que busca coletar e
descrever a triagem de um material biológico. A Convenção sobre Diversidade Biológica (CDB) define
bioprospecção como, exploração da biodiversidade de recursos genéticos e bioquímicos de valor
comercial. Pela Medida Provisória nº 2.186-16/01, é definida como sendo a “atividade exploratória que
visa identificar componente do patrimônio genético e informação sobre conhecimento tradicional
associado, com potencial uso comercial” (art.7º, inc. VII). De acordo com ARTUSO (2002), a
bioprospecção consiste na identificação e avaliação de materiais biológicos encontrados na natureza,
para a obtenção de novos produtos ou processos. Como se pode perceber as explicações sobre
bioprospecção variam, algumas incluem apenas a busca por materiais genéticos valiosos, enquanto
outros abrangem o desenvolvimento e a aplicação de tais materiais (SYNNES, 2007).
Os microrganismos são essenciais para o meio ambiente, dado que, participam da ciclagem de
nutriente e contribuem para a estabilidade de ecossistemas, sendo também responsáveis pela
metabolização dos compostos químicos, incluindo a degradação de poluentes ambientais. Apesar de sua
grande importância na manutenção da biosfera, estima-se que menos de 10% dos microrganismos
existentes no planeta tenham sido caracterizados e descritos. O conhecimento da biodiversidade e
bioprospecção de novos microrganismos tornaram-se un dos focos principais da era biotecnológica,
visto que, a utilização destes organismos na busca de soluções nas áreas de alimento, saúde, meio
ambiente e indústria vêm crescendo de forma acelerada no cenário mundial (NASCIMENTO et al., 2012;
OLIVEIRA et al., 2006; STALEY, 1998).
O Brasil possui cerca de 20% da biodiversidade mundial e é fonte importante para diversos
setores. No entanto, pouco se conhece sobre sua diversidade biológica, as espécies que a compõem e
suas relações filogenéticas, inclusive dos microrganismos e suas interações com outros seres (MORAIS et
al., 2014; SOUZA et al., 2004).
A atividade de prospecção biológica tem crescido exponencialmente nos últimos anos por causa
dos progressos realizados na biotecnologia e ciências afins. Isso tem feito crescer consideravelmente o
interesse das indústrias e consequentemente ao aumento de empreendimentos em matéria de
bioprospecção. A utilização comercial dos descobrimentos das pesquisas biológicas é evidenciada em
diversos ramos da indústria farmacêutica, agricultura, bioremediação, horticultura, medicina, botânica,
cosmética, higiene pessoal, dentre outras. A propagação desta atividade tenderá a aumentar, na medida
em que novas técnicas e tecnologias sejam desenvolvidas. A bioprospecção de microrganismos quando
realizada com precaução e cuidados adequados torna-se sustentável (SYNNES, 2007; KOSKINEN et al.,
2008).
23
Polímeros e Plásticos
A palavra plástico teve origem na Grécia, a qual significa, capaz de moldar em diferentes formas.
Por força do rápido avanço da tecnologia e da progressão geométrica do crescimento da população
mundial, materiais plásticos têm encontrado aplicações versáteis em todos os aspectos da vida humana
moderna (BENJAMIN et al., 2015).
Os plásticos são denominados também como polímeros, os quais se definem como uma
macromolécula constituída por pequenas unidades químicas repetidas, os monômeros. Existem duas
classes principais de polímeros, os naturais ou biopolímeros, dos quais fazem parte, por exemplo as
proteínas e os polissacarídeos, e os polímeros sintéticos, como por exemplo, os plásticos e os adesivos
FRANCHETTI e MARCONATO, 2006).
A tecnologia permitiu grandes avanços na área de polímeros o que têm levado ao aparecimento
de inúmeros materiais plásticos com excelente desempenho e baixo custo de produção. No entanto,
além destes materiais serem majoritariamente derivados de fonte não renovável (petróleo), estes
materiais são ainda poluentes ambientais, não sendo biodegrados de forma fácil e rápida no ambiente.
Mais recentemente, pesquisas vêm sendo realizadas na tentativa de biodegradar os materiais que
contêm plastificantes, com o intuito de atribuir uma maior sustentabilidade ambiental aos processos de
descarte (PEDROZO, 2009).
O mercado e a indústria de plásticos no Brasil adquiriram importante posição em termos de
produção e expressão internacional em alguns setores, estando atualmente, presente nos setores de
calçados, resinas, tintas, embalagens, têxteis, tubos para conexões, entre outros. Desde o
desenvolvimento das primeiras aplicações nestas áreas, os polímeros vêm sendo utilizados com
inúmeras vantagens na fabricação de uma grande variedade de artefatos, conferindo-lhes propriedades
mecânicas, físicas e químicas muito superiores. Assim, os plásticos mantêm e garantem seu predomínio
perante outros tipos de materiais ditos convencionais (RODOLFO et al, 2006; PEDROZO, 2009).
Os materiais poliméricos podem muitas vezes receber aditivo, mediante suas necessidades, seja
no momento de sua síntese ou durante o seu processamento. Podem ser empregados diversos tipos de
aditivos, tais como: cargas minerais, plastificantes, antioxidantes, lubrificantes, corantes, estabilizantes
entre outros (RODOLFO e JOHN, 2006; RODOLFO et al, 2006).
De acordo com a Associação Brasileira da Indústria do Plástico (Abiplast) um quarto (25,9%) das
aplicações dos aditivos está voltada para o setor alimentício. Enquanto a construção civil e as
embalagens diversas respondem por uma parcela considerável, os setores de brinquedos e
automobilísticos correspondem juntos a apenas 2% deste mercado (Figura 1).
24
Figura 1. Segmentação do mercado de transformados de plásticos por aplicações. Fonte: Abiplast adaptação Anuário Indústria Química (ABIQUIM), 2010.
Policloreto de vinila (PVC)
Os registros na literatura sobre o policloreto de vinila começam a partir de 1835, quando Justus
Von Liebig descobriu o monômero cloreto de vinila (MCV), um gás de propriedades interessantes, cujo
ponto de ebulição foi determinado como sendo igual a -13,8oC. Em 1872 ocorrem a primeira citação da
polimerização do cloreto de vinila e da obtenção do policloreto de vinila, por Baumann, através do
detalhamento do estado físico do cloreto de vinila, induzida pela luz solar, para um produto sólido
branco, na época considerado um isômero do monômero (BRASKEM, 2006).
O policloreto de vinila começou a ser produzido comercialmente em 1927 nos Estados Unidos e
na Alemanha em 1930. Durante a Segunda Guerra Mundial, sua produção foi estimulada em
decorrência das necessidades da própria guerra. A partir daquele momento o PVC passou a ser
empregado nas mais diversas formas (FERNANDES et al., 1987).
Em 1932 ocorreu o primeiro avanço que viabilizaria seus diferentes usos, com a descoberta da
utilização de plastificantes, o que possibilitou a solução de problemas relacionados à estabilidade e ao
processamento térmico do policloreto de vinila (ENDO, 2002). A produção de PVC britânico teve início
apenas nos anos 40, e no Brasil, a produção comercial iniciou em 1954, em uma planta construída
mediante a associação dos Estados Unidos e das indústrias Químicas Matarazzo em São Paulo
(RODOLFO e JOHN, 2006).
25
O policloreto de vinila é um termoplástico vinílico obtido a partir da polimerização do
monômero cloreto de vinila (Figura 2) em dispersão aquosa, na presença de catalisador e agente de
dispersão. O polímero é isolado no final da reação por filtração (FERNANDES et.al., 1987). Após a
polimerização tem-se o policloreto de vinila sob a forma de um pó branco e poroso, semelhante à
semolina (CABRAL e FERNANDES, 1980).
De acordo com o Instituto do PVC, 57% do material produzido é obtido a partir do cloro e 43%
provem de insumos não renováveis como o petróleo e o gás natural. A partir do sal marinho é obtido o
cloro, enquanto a partir do petróleo é obtido o eteno. Em fase gasosa, o eteno e o cloro reagem para
formar o cloreto de vinila. As moléculas do cloreto de vinila são submetidas ao processo de
polimerização para formação do policloreto de vinila (RODOLFO e JOHN, 2006; RODOLFO et al., 2006).
A presença do cloro, como mostrado na Figura 3, torna o policloreto de vinila um material
resistente à propagação de chamas. Além disso, a grande quantidade de cloro na estrutura molecular do
policloreto de vinila faz com que ele se torne polar, aumentando ainda mais a vasta gama de aditivos
que podem ser incorporados a ele (RODOLFO et al., 2006).
Cl Figura 2. Estrutura química do monômero cloreto de vinila.
Figura 3. Estrutura química do policloreto de vinila (RODOLFO et al., 2006).
O policloreto de vinila é um dos polímeros mais usados por ser facilmente processado, as
matérias-primas envolvidas na sua formulação têm um custo baixo, e apresenta uma grande variedade
de propriedades. As principais características que fazem o policloreto de vinila ser amplamente utilizado
são: a rigidez, a transparência, boa resistência ao impacto, boas propriedades de barreira a gases e
vapor d’água, resistência química e flexibilidade (FERNANDES et al., 1987).
As reações de polimerização resultam usualmente em substâncias de alta massa molecular,
porém, como já foi mencionada, essa conversão não alcança 100% e o polímero pode reter na sua
estrutura monômeros residuais e oligômeros, decorrentes do tipo de tecnologia de fabricação
(BRISTOON e KATAM, 1974; GILBERT, 1980; ABRANTES, 1998). Para a transformação do policloreto de
vinila em produtos acabados, se faz necessário a incorporação de aditivos, tais como plastificantes,
26
estabilizantes térmicos, lubrificantes, modificadores de impacto e outros, que conferem ao produto as
características apropriadas a cada aplicação (FERNANDES et al., 1987).
O policloreto de vinila ocupa um lugar de destaque entre os termoplásticos e pode ser
considerado um dos mais versáteis dentre os plásticos, pois com a incorporação de aditivos, esse pode
ter suas características alteradas, modificando-se suas propriedades em função da aplicação final, desde
a sua forma rígida à extremamente flexível. Esta grande faixa de variação de propriedades permite que
o PVC seja utilizado em aplicações que vão desde tubos e perfis rígidos, para uso na construção civil, até
brinquedos e laminados flexíveis para acondicionamento de sangue e plasma (BRAUN et al., 2013). Para
diversas aplicações, o policloreto de vinila é totalmente atóxico e inerte, portanto, a escolha de aditivos
com essas mesmas características também permite a sua utilização em múltiplas aplicações (RODOLFO e
JOHN., 2006).
O PVC tem sido amplamente utilizado no segmento de embalagens, na forma de filme flexível,
para acondicionamento de alimentos in natura, tais como carnes, frango e frutas. Tais filmes são
utilizados em supermercados e vendidos para uso doméstico. O que viabiliza essa aplicação é a adição
de plastificantes ao seu polímero (BARROS et al., 2011).
Plastificantes e Ftalatos
Plastificantes são substâncias orgânicas sintéticas de baixa massa molar, adicionadas ao
polímero para aumentar sua flexibilidade e a resistência do produto final, facilitando a produção e a
processabilidade do material. Os plastificantes são aditivos que alteram propriedades tais como a
viscosidade, temperatura de amolecimento, temperatura de transição vítrea (Tg) e módulos de
elasticidade (SOUZA et al., 2012). Para fins práticos, a IUPAC (União Internacional de Química Pura e
Aplicada/International Union of Pure and Applied Chemistry) define os plastificantes como “substâncias
incorporadas aos plásticos ou elastômeros com a finalidade de aumentar sua flexibilidade,
processabilidade ou capacidade de alongamento”.
Os plastificantes normalmente utilizados são os adipatos, os ftalatos e o óleo de soja epoxidado.
A faixa de concentração dos plastificantes utilizada no plástico é de 20 a 40% (m/m), da massa do
polímero. A proporção com que esses plastificantes são utilizados é cuidadosamente escolhida para
fornecer a permeabilidade adequada ao oxigênio, ao dióxido de carbono e ao vapor de água
(FERNANDES et al., 1987).
Os ftalatos são ésteres de 1,2-benzeno-dicarboxílico (Figura.4). São compostos líquidos,
incolores, inodoros, cuja estrutura consiste em um anel aromático ligado a dois grupamentos éster na
posição orto. Essa estrutura varia dependendo do número de cadeias laterais ligadas a uma porção fenil
(Tabela 1). As três formas isoméricas (orto, meta e para) do ácido 1,2-benzeno-dicarboxílico
correspondem a uma grande categoria de plastificantes (Tabela 1). As configurações meta e para são
27
conhecidas como isoftalato e tereftalato respectivamente, enquanto que a orto é conhecida pelo nome
genérico de ftalato. (BANEGAS, 2011). O isômero orto dos ácidos ftálicos e ésteres ftálicos representam
a maior parte de todos os ftalatos produzidos globalmente, especialmente destinados, como
plastificantes na fabricação do policloreto de vinila. O isômero meta e seus ésteres, são utilizados
principalmente como monômeros para a síntese de vários poliésteres na indústria (SCAPIN, 2009).
OR
OR'
O
O
Figura 4. Estrutura química dos ftalatos.
Tabela 1. Relação de isômeros dos di-ésteres ftálicos ou ftalatos
Fonte: Adaptada SCAPIN, 2009.
Estes plastificantes foram sintetizados pela primeira vez no final do século XIX, mas só foram
empregados no mercado de materiais no início do século XX. Alguns tipos de ftalatos, como o di-metil
Isômeros do ftalato Exemplos
o-ftalato Di- metilftalato
p-ftalato Di- metiltetra ftalato
m-ftalato Di- isometilftalato
28
ftalato e o dibutil ftalato estão sendo amplamente usados como repelentes para insetos. Mesmo com
uma vasta aplicabilidade, a produção destes materiais aumentou significativamente quando o di-
etilhexil ftalato, foi testado com grande sucesso para tornar o PVC mais flexível (LOUREIRO, 2002;
SCAPIN, 2009).
Os diésteres ftálicos são produzidos industrialmente pela condensação de álcoois contendo 1 a
13 átomos de carbono com o anidrito ftálico, como indicado na Figura 5 (LOURENÇO, 2011).
O
O
O
+ ROHOR
OR
O
O
Anidrido Ftálico Álcool Éster Ftálico
Figura 5. Reação de esterificação para obtenção ésteres ftálicos.
Fonte: KLUWE, 1982 apud LOURENÇO, 2011.
A produção mundial de ftalatos é em torno de 2,7 milhões de toneladas por ano e um quarto dos
plastificantes produzidos é o ftalato de di-etilhexil ftalato, o DEHP (Instituto do PVC, 2010). Os ftalatos
são um grupo bem conhecido de plastificantes necessários para transformar o policloreto de vinila em
materiais flexíveis (VAN WEZEL et al., 2000; CHEN et al., 2014). Alguns dos ftalatos comumente
utilizados são descritos na Tabela 2.
29
Tabela 2. Relação de ftalatos comumente utilizados, seus nomes (IUPAC e comum), abreviações e fórmulas moleculares.
Nome IUPAC
Nome comum
Sigla Fórmula
molecular
Dimetil 1,2-benzenodicarboxílico Di-metil ftalato DMP C10H10O4
Dietil 1,2-benzenodicarboxílico Di-etil ftalato DEP C12H14O4
1,2-dipropil 1,2-benzenodicarboxílico Di-pentil ftalato DPP C12H18O4
Dibutil 1,2-benzenodicarboxílico Di-butil ftalato DBP C16H22O
Bis-(2-metilpropil) 1,2-benzenodicarboxílico Di-isobutil ftalato DIBP C16H22O4
Dipentil benzeno 1,2-benzenodicarboxílico Di-exil pentil ftalato DNPP C18H26O4
Benzil butil 1,2-benzenodicarboxílico Butil benzil ftalato BBP C19H20O4
Dihexil 1,2-benzenodicarboxílico Di-exil ftalato DNHP C20H30O4
Bis-(2 etilhezil) 1,2-benzenodicarboxílico Di-etilhexil ftalato DEHP C24H38O4
Dioctil 1,2-benzenodicarboxílico Octil ftalato DOP C24H38O4
Bis-(6-metilheptil) 1,2-benzenodicarboxílico Di-isooctil ftalato DIOP C24H38O4
Bis-(7-metiloctil) 1,2-benzenodicarboxílico Di-isononil ftalato DINP C26H42O4
Bis-(6-metilnonil) 1,2-benzenodicarboxílico Di-isodecil ftalato DIDP C28H46O4
Dimetil 1,3-benzenodicarboxílico Di-isometil ftalato DMIP C10H10O4
Dietil 1,3-benzenodicarboxílico Di-isoetil ftalato DEIP C12H14O4
Dimetil 1,4-benzenodicarboxílico Di-metiltetra ftalato DMTP C10H10O4
Dietil 1,4-benzenodicarboxílico Di-etiltetra ftalato DETP C12H14O4
Fonte: SARATH et al., 2014, apud BENJAMIN et al. 2015, JOSH et al, 2014.
Os ftalatos destacam-se no setor industrial mundial da borracha e do plástico e representa mais
de 80% de todos os plastificantes utilizados no policloreto de vinila. O di-etilhexil ftalato, representa
pelo menos 60% desse montante (COLTRO et al., 2013, BAZILIO, 2014). O destaque dos ftalatos se deve
as suas características desejáveis como plastificante, são elas: baixa volatilidade, ausência de odor e cor,
melhor relação entre custo e benefício (BARROS, 2010). Tais aditivos normalmente possuem uma
elevada mobilidade devido à massa molar relativamente baixa e a facilidade de se difundirem para os
meios nos quais estão em contato. Alguns estudos demonstram solos contaminados por plastificantes,
que migram do policloreto de vinila, como o di-etilhexil ftalato e o adipato de di-etilhexil (BARROS, 2010;
BARROS et al., 2011; BAZILIO, 2014).
Atuação do plastificante ftalato na malha polimérica do PVC
O policloreto de vinila (PVC) possui características que facilitam a inserção de plastificantes, pois
apresenta uma cadeia polihalogenada, com átomos de cloro covalentemente ligados a átomos de
carbono, gerando assim, muitos pontos de interação dipolar ao longo de sua cadeia. Essas ligações
30
químicas dão origem a interações fortes entre cadeias e consequente rigidez desse material polimérico.
A Figura 6 proposta por LEUCHS apud TITOW demostrada no estudo de MADALENO et al. (2009),
apresenta a molécula de ftalato (plastificante) presente entre as cadeias do PVC.
Figura 6. Esquema ilustrativo da disposição do ftalato na estrutura polimérica do policloreto de vinila (MADALENO et al., 2009).
Os plastificantes interagem com essas ligações quebrando a interação dipolo-dipolo intercadeias
proporcionando um material com mobilidade e flexibilidade características de um polímero com menor
número de interações. Assim, o uso de plastificantes possibilita a utilização do policloreto de vinila em
outras diversas aplicações, entre elas dispositivos médicos, material para embalagem e ainda produtos
infantis (VINHAS et al., 2003)
Diversas substâncias químicas podem ser utilizadas como plastificantes do policloreto de vinila,
dado que, é uma molécula relativamente polar que permite a sua mistura com uma gama de aditivos.
De maneira geral, os plastificantes com maior importância comercial, são líquidos inodoros, incolores,
insolúveis em água e de baixa volatilidade, sendo em sua grande maioria ésteres ou poliésteres
(MADALENO, 2013).
Segundo RETO (2007), os ftalatos fazem tanto sucesso talvez por terem iniciado a utilização dos
plastificantes como aditivos do policloreto de vinila e continuam ainda com o uso amplo na indústria
para a fabricação de filmes de PVC, porque constituem as substâncias que oferecem a melhor relação
custo/benefício associada à sua gama de propriedades.
A dureza do policloreto de vinila diminui com o aumento da proporção de plastificante a ele
misturado. Um aumento da quantidade do plastificante no plástico diminui a sua resistência à tração,
aumentando assim, a plasticidade do produto final.
Um significativo efeito negativo associado a estes produtos do policloreto de vinila/plastificante é
a lixiviação do ftalatos a partir da estrutura das cadeias polímericas para o meio que o contêm ou para o
meio ambiente . Isso é devido à ausência de ligação química entre as cadeias poliméricas e os moléculas
do plastificante, o que resulta na migração gradual do ftalato adsorvido ao policloreto de vinila para o
31
ambiente circundante, como mostrado na Figura 7. Os plastificantes formam ligações fortes do tipo
ligações de hidrogênio (ou pontes de hidrogênio) na malha polimérica do policloreto de vinila. Dessa
forma, os ftalatos ao longo do tempo podem ser lixiviados para o ambiente, especialmente se aquecidos
(PSILLAKIS et al., 2004), o que promove mudanças significativas nas propriedades físicas e mecânicas do
material policloreto de vinila/plastificante (BENJAMIN et al., 2015).
Figura 7. Diagrama ilustrativo do éster ftálico na malha do policloreto de vinila (BENJAMIN et al., 2015).
A Figura 8 mostra, esquematicamente, como interagem as cadeias poliméricas do policloreto de
vinila quando na ausência do plastificante. Este apresenta em sua estrutura ligações covalentes
Carbono-Cloro que devido à diferença de eletronegatividade entre esses átomos torna-se uma ligação
polar. Assim, em toda a estrutura polímerica estão presentes densidades de carga fortemente negativas
e positivas que promovem as interações fortes tipo dipolo-dipolo, responsáveis por conectar as cadeias
entre si na malha polimérica. Devido a essas interações, as cadeias do policloreto de vinila sofrem
intensa atração eletrostática umas pelas outras, resultando em um polímero rígido (ZAIONCZ, 2004).
Figura 8. Mecanismo de atração do tipo dipolo-dipolo, entre duas cadeias do policloreto de vinila
(ZAIONCZ,2004).
Malha do
POLICLORETO
DE VINILA
Éster Ftálico
32
Segundo a teoria do gel desenvolvida a partir do trabalho de DOOLITTLE apud RODOLFO et al.
(2006), os plastificantes atuam sobre as interações do tipo dipolo-dipolo, atenuando-as, e
conseqüentemente, reduzindo a rigidez do polímero. Isso ocorre uma vez que as moléculas de
plastificante, ao se posicionarem entre as cadeias poliméricas do policloreto de vinila, aumentam a
distância entre as mesmas, tornando-as mais distantes uma das outras, gerando assim, mais espaços na
malha polimérica (Figura 9).
A força de atração eletrostática é inversamente proporcional à distância entre as cargas
elétricas. Portanto, o aumento da distância intermolecular atenua a força de atração entre as cadeias,
tornando o polímero flexível. Em outras palavras, a presença das moléculas do plastificante em meio às
cadeias poliméricas do policloreto de vinila promove a “quebra” das interações do tipo dipolo-dipolo
entre as últimas, criando novos dipolos entre o policloreto de vinila e o plastificante, como representado
na Figura 9 (ZAIONCZ, 2004).
Figura 9. Mecanismo de plastificação do policloreto de vinila segundo Doolittle representado por
ZAIONCZ, 2004.
Figura 10. Mecanismo de interação policloreto de vinila/plastificante. (RODOLFO et al., 2006 – adaptado).
33
A Figura 10 representa esquematicamente a interação das cadeias poliméricas do policloreto de
vinila entre si e com a presença de um plastificante do tipo ftalato. Nesta ilustração, pode ser observado
o efeito de atenuação das interações dipolo-dipolo entre as cadeias poliméricas, devido à presença da
molécula de plastificante que, por sua vez, também interage com o polímero. Como conseqüência da
incorporação do plastificante ocorre um aumento na distância entre as cadeias, dando ao material um
caráter flexível cuja intensidade depende da quantidade de plastificante incorporado (RODOLFO et al.,
2006).
Toxicidade dos Ftalatos
Os ftalatos ou di-ésteres ftálicos são amplamente utilizados desde 1920 na fabricação e
transformação de produtos de plástico como plastificantes em uma gama muito ampla de aplicações
industriais (RODOLFO e JOHN, 2006). Os ftalatos têm sido detectados em todo o ambiente de todo o
mundo uma vez que podem migrar a partir do material inserido para o meio ambiente (FARAHAN et al.,
2007; WANG et al., 2014). Como o di-etilhexil ftalato não está quimicamente ligado, apenas adsorvido
ao plástico, ele é uma fonte de riscos e de perigos de contaminação pela simples difusão para os meios
ou fluidos em contato. Reconhecendo a toxicidade do di-etilhezil ftalato, a Agência de Proteção
Ambiental dos Estados Unidos da América (“Environmental Protection Agency”/USA - EPA) fixou a
concentração do mesmo, em 6 μg/L para águas acondicionadas em garrafas plásticas e o uso de
plastificantes tóxicos foi proibido em brinquedos, que vão à boca de crianças (CHEN et al., 2004).
Estudos relatam a presença desses estéres em resíduos sólidos urbanos, lamas, águas fluviais e
marinhas e sedimentos, águas residuais (NET et al., 2014) e água potável (LIN et al., 2003). As
concentrações individuais variam de acordo com a localização e as atividades nas proximidades (NET et
al., 2015).
A maioria dos produtos contendo ftalato é propenso a ser descartada em aterros sanitários,
onde serão expostos ao ambiente físico e químico nesses locais. Deste modo, os ftalatos podem ser
liberados da composição original do produto que os contêm e lixiviar para o ambiente, uma vez que não
estão quimicamente ligados e sim adsorvidos à matriz polimérica dos produtos (JONSSON et al., 2003).
Despejos domésticos constituem uma ampla fonte do contaminante ftalato para o ambiente, já que
cada vez mais fazem parte de materiais e equipamentos, como pode ser visto na Tabela 3 (LOUREIRO,
2002).
34
Tabela 3. Relação de valores médios da concentração de ftalatos (mg.Kg-1) nas várias frações do Lixo doméstico.
FONTE: LOUREIRO, 2002.
A onipresença de plastificantes no ambiente originou uma maior consciência em relação aos
papéis bioquímicos e toxicológicos destes compostos na biosfera (NET, et al., 2015). Entre os impactos
ambientais negativos que podem ser originados a partir do uso constante desses plastificantes nos
materiais plásticos, estão os efeitos decorrentes da prática de disposição inadequada de resíduos
sólidos em fundos de vale, às margens de ruas e cursos d’água. Essas práticas habituais podem provocar
a contaminação de corpos d’água, assoreamento, enchentes, poluição visual e contaminação do
ambiente (MUCELIN e BELLINI, 2008). Além disso, esses plastificantes são nocivos á saúde humana
(FERREIRA e MIRITA, 2012).
Os ftalatos têm sido um dos poluentes mais freqüentemente encontrados no meio ambiente,
pois são compostos orgânicos amplamente utilizados pelas indústrias na produção de lubrificantes,
colas, repelentes de insetos e plásticos. Dentre os existentes, o ftalato di-etilhexil é um dos mais usados,
por ser uma das matérias-primas para manufatura do policloreto de vinila flexível (SOUZA et al., 2012).
Segundo FERREIRA e MIRITA (2012), esses compostos tendem a se acumular no solo e nas partículas de
sedimentos, em razão do alto coeficiente de partição octanol-água e da baixa solubilidade em água,
causando um grande impacto ambiental.
A contaminação do solo por plastificantes tem gerado uma preocupação para a humanidade.
Uma forma de reduzir esse impacto é a descontaminação desses solos. Nesse processo destaca-se a
biodegradação, na qual são usados microrganismos aptos à quebra das moléculas do contaminante. A
degradação biológica de plastificantes depende das propriedades dos plastificantes e das condições
físicas, químicas e ambientais do meio onde o polímero/plastificante encontra-se inserido (GRISA, 2011).
A Resolução do Conama no 420/09 estabeleceu valores orientadores para a concentação de
ftalatos em solos e águas subterrâneas no Brasil. O valor de prevenção, correspondente à concentração
que pode causar alterações no solo e na água subterrânea, para o di-etilhexil ftalato, é de 0,6 mg kg-1
solo seco. Os valores de intervenção – que representam as concentrações acima das quais existem
riscos potenciais à saúde humana – são de 10,0, 4,0 e 1,2 mg kg-1 solo seco para os usos industrial,
residencial e agrícola, respectivamente (BRASIL, 2009).
Frações Di-metil ftalato
Di-etil ftalato
Di-butil ftalato
Butil benzil ftalato
Di-etilhexil ftalato
Alimentos 0,8 0,9 5,6 1,4 64,3
Papel reciclável 0,4 1,5 15,2 0,9 29,7
Papel não reciclável 0,3 0,7 11,6 0,6 71,1
Filmes plásticos 0,3 1,2 36,2 7,8 444,9
Outros plásticos 0,5 3,7 181,2 26,8 1027,6
35
Numerosos estudos tiveram seu foco na ecotoxicologia dos plastificantes, incluindo os
organismos aquáticos e roedores. Dados mostram que o dibutil ftalalto e di-etilhexil ftalato podem ser
acumulados em altos níveis nos organismos aquaticos (STAPLES et al., 1997; NET et al., 2015). VETHAK e
colaboradoes (2002) relataram a contaminação de di-metil ftalato e di-etilhexil ftalato em espécies de
água doce e marinhas.
Em virtude da comprovação de sua ecotoxicidade, alguns plastificantes, foram adicionados à
lista de poluentes prioritários e tiveram seus valores de uso recomendado, assim sendo, a Agência de
Proteção Ambiental (EPA) dos EUA e a Administração Estatal de Proteção Ambiental da China (SEPA)
listaram o dibutil ftalato e o di-etilhexil ftalato como poluentes ambientais prioritários e o di-etilhexil
ftalato foi listado também pela Comunidade Europeia como uma das 33 substâncias mais perigosas na
água (YUAN et al., 2008).
Atualmente, o uso de plastificantes está sujeito a um controle mais rigoroso e alguns foram
proibidos, sendo que não existem soluções imediatas disponíveis para evitar a contaminação por eles
provocada ao meio ambiente. Os principais objetivos dessas ações são a proteção dos recursos naturais
e a saúde humana. Para uma melhor representação do nível de contaminação e condição
ecotoxicológica do ambiente, a compreensão do comportamento dos plastificantes em diferentes
poliméros é fundamental (NET et al., 2015).
Na Holanda, foram identificadas 400.000 áreas suspeitas de contaminação por plastificantes,
sendo confirmada a necessidade de descontaminação de 55.000 delas pelo Ministério da Habitação,
Planejamento e Meio Ambiente Holandês. Foram remediadas 5.188 áreas de 2000 a 2004 (TIKTAK, 2006
apud FERREIRA, 2009). Um diagnóstico feito no Brasil, em 2004, identificou 689 áreas, potenciais e
efetivas, com populações expostas ou sob risco de exposição a solos contaminados. No último
inventário de 2005, foram 703 áreas contaminadas (BRASIL, 2005).
Estudos laboratoriais revelam que a toxicidade dos ftalatos e a exposição à eles, afetam o
funcionamento dos ecossistemas (KOLENA et al., 2014). As principais preocupações relacionadas com a
exposição de animais selvagens à esses plastificantes são os danos causados na fertilidade, problemas
no desenvolvimento dos recém-nascidos, além do efeito do seu caráter cancerígeno nesses animais. Os
plastificantes são tóxicos para muitas espécies, incluindo algas, protozoários, moluscos, crustáceos,
peixes e invertebrados. Por exemplo, a exposição ao di-etilhexil ftalato pode afetar a reprodução em
anelídeos (tanto terrestres e aquáticos), moluscos, crustáceos, insetos, peixes e anfíbios, e prejudica o
desenvolvimento em crustáceos e anfíbios e também induz a aberrações genéticas (CHEN et al., 2014).
No estudo de FROMME e colaboradores (2002), certos xenoestrógenos, tais como o bisfenol-A
(BPA), bisfenol-F (BPF), butil benzil ftalato, dibutil ftalato e o di-etilhexil ftalato, foram quantificados em
vários ambientes diferentes da Alemanha, a fim de se contribuir para uma melhor compreensão da
exposição à esses compostos. Os ambientes analisados foram às águas de vários rios, lagos e canais, de
36
estações de tratamento de esgoto, de uma indústria química, de um hospital, de uma unidade de
tratamento de plantas aquáticas e de lamas de depuração. Tal amostragem foi selecionada visando-se
obter um panorama geral da contaminação do ambiente aquático desse país, promovida por esses
compostos. A presença de ftalatos foi detectada através de análises de cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massa. Os resultados demonstraram que o principal poluente presente nas amostras
foi o di-etilhexil ftalato. Segundo os pesquisadores o resultado obtido foi satisfatório, devido à natureza
da interação química (adsorção) entre os ftalatos e o material polimérico dos produtos, que permite a
lixiviação desse plastificante, presente na composição do material, para a água e são os ftalatos os mais
utilizados comercialmente.
ORECCHIO e colaboradores (2014) demonstraram que o Bis-(n-butil)ftalato e o di-etilhexil ftalato
utilizados como amaciadores em pinturas sintéticas, à base de água, podem ser libertados para a
atmosfera a partir de superfícies pintadas. Isso ocorre em função da fotodegradação em superfícies
pintadas, sob irradiação de luz UV. Consequentemente os plastificantes e/ou seus produtos de
fotodegradação são liberados na atmosfera, causando a contaminação do ar, no ambiente no qual foi
realizado o uso desse material.
Nesse contexto, a biodegradação assume um importante papel no processo de remoção de
plastificantes tóxicos do meio ambiente A biodegradação dos plastificantes varia dependendo da
densidade e tipos de espécies dos microrganismos (YUAN et al., 2008).
Processo de Migração do Ftalato
A contaminação ambiental pelos plastificantes pode ocorrer de diferentes maneiras. As causas
mais relevantes incluem a contaminação durante o processo de fabricação do plastificante ou do
polímero, por lixiviação, por migração e ainda pela evaporação dos plastificantes (WANG et al., 2014,
ORECCHIO et al., 2014, CACHO et al.; 2015).
Os ftalatos devido a sua natureza fluídica, podem se difundir pelos materiais nos quais são
adicionados, sendo consequentemente lixiviados. Esse processo leva a sua presença em diversas
amostras ambientais, como no ambiente aquático pela descarga de resíduos industriais de unidades de
transformação, nos efluentes de esgotos doméstico e industrial, pela lixiviação de produtos plásticos, e
no ambiente terrestre incluindo a atmosfera, lamas, solos, aterros sanitários e nas plantas (SOUZA et al.,
2012).
Segundo MARCILLA e colaboradores (2004), em muitas de suas aplicações, pode ocorrer a
migração do plastificante do policloreto de vinila para os meios em contato com o mesmo (gás, líquido
ou sólido), através de catéteres, máscaras para nebulizações, bolsas de sangue, alimentos embalados
com PVC, brinquedos plásticos, sapatos e roupas, enfim, quaisquer materiais que tenham sido
37
produzidos utilizando o policloreto de vinila, podem apresentar a migração dos aditivos utilizados para
fornecer flexibilidade ao mesmo.
O termo migração é descrito na legislação brasileira como “ ... Transferência de componentes do
material em contato com alimentos para estes produtos, devido a fenômenos físico-químicos” (BRASIL,
2006).
São definidos dois tipos de migração: a total ou global e a específica. A migração global refere-se
à transferência total ou à quantidade de substâncias totais que migram da embalagem para o alimento;
a migração global, portanto, é a transferência de todas as substâncias para o alimento, sendo elas
tóxicas ou não. A migração específica relaciona a transferência de uma ou mais substâncias
identificáveis, reconhecidas ou consideradas como de risco para a saúde do homem, não levando em
consideração a quantidade total de outros migrantes que passam para o alimento (FERNANDES et al.,
1987, DARGNAT et al., 2009).
O processo de migração pode depender das propriedades do polímero, massa molecular, da
natureza e quantidade do plastificante, do processo de produção, da homogeneidade do composto, da
natureza e do tipo da área de contato com o plástico (compatibilidade com o plastificante), da
temperatura e da área de contato (MARCILLA et al., 2004).
Os ftalatos possuem propriedades específicas, como demonstrado na Tabela 4. A solubilidade
em água (Cw,) indica o quanto de uma determinada substância irá se dissolver na água. É expressa como
sendo a quantidade mínima de ftalato que irá se dissolver completamente em um mL de água. Quanto
maior esse valor, mais solúvel o ftalato será na água (PANNA, 2006).
O Coeficiente de Partição-Octanol-Água (log K) mede como uma substância química se distribui
entre dois solventes imiscíveis: água (solvente polar) e octanol (solvente apolar). É a proporção/razão
entre as concentrações de uma substância nas fases octanol e a água numa determinada temperatura.
Esse coeficiente é importante para definir o destino das moléculas no ambiente e suas interações com
outras substâncias. Substâncias lipofílicas (log K > 4, mais solúvel em octanol e menos solúvel em água),
tendem a se acumular em materiais lipídicos, como por exemplo, a fração orgânica do solo, enquanto
que as hidrofílicas (log K < 1, mais solúvel em água e menos solúveis em octanol), são relativamente
pouco absorvidas pelo solo e demais sedimentos nele presentes (REGITANO, 2002).
38
Tabela 4. Relação das principais propriedades físico-químicas de alguns ftalatos.
Substância Aspecto Pontos de ebulição
(°C)
Solubilidade em água
Log Koct/água
-Log Cw
sat ( #) µg.mL-1
Di-metil ftalato Líquido incolor viscoso 283,7 1,646 4,5x104* 1,53/1,83
Di-etil ftalato Líquido incolor viscoso 298 2,364 1,2x103* 2,35/2,76
Butil benzil ftalato Líquido incolor viscoso 370 5,180 <100 4,91/4,59
Di-butil ftalato Óleo incolor 340 4,402 1,01* 4,57/4,37
Di-etilhexil ftalato Óleo incolor 384 6,374 4,1x10-2* 9,64/7,06
Di-n-octil ftalato Óleo levemente colorido 220 6,137 <100 6,99
Di-hexil ftalato Líquido incolor viscoso 350 6,144 -- 6,30
Di-isobutil ftalato Líquido incolor viscoso 296 -- 6,2 4,11
Diciclohexil ftalato Sólido granular branco 220 2,630 -- 4,90
Di-metoxi etil ftalato Líquido incolor viscoso -- 1,860 -- 2,90
Di-etoxi etil ftalato Líquido incolor viscoso -- 3,090 -- 4,05
Dipentil ftalato Líquido incolor 342 5,836 -- 4,85
Dipropil ftalato Líquido incolor 304 3,401 -- 3,64
FONTE: THOMSEN,1999 apud LOUREIRO, 2002.
A migração dos plastificantes presentes na malha polimérica do PVC flexível pode ocorrer de
diferentes formas, são elas (MARCILLA,2008):
A volatilização a partir da superfície do PVC para o ar;
A extração promovida pelo contato de um meio líquido com o PVC flexível;
A migração do PVC para um estado sólido ou semi-sólido em contato com ele;
A exsudação sob pressão.
Os principais fatores que afetam a migração de plastificantes são:
O tipo de polímero, sua massa molar e sua compatibilidade com o plastificante;
O tipo e concentração do plastificante, sua massa molar, ramificações e polaridade;
O processo de produção empregado e a homogeneidade do produto;
As condições do teste de migração (tipo de contato, tempo de permanência, temperatura e
características do polímero).
A ocorrência da transferência de substâncias a partir do material polimérico pode ocorrer de
acordo com três modelos de transferência de massa (Figura 11), sendo estes: permeação, migração ou
dessorção e adsorção (ABRANTES, 1998; GILBERT et al., 1980). Este fenômeno é controlado pelo
39
mecanismo de difusão, sendo esta definida como a transferência de massa resultante de movimentos
moleculares naturais e espontâneos que ocorrem sem a ajuda de forças externas (FERNANDES et
al.,1987).
Figura 11. Esquema ilustrativo dos modelos de migração de massas.
Degradação de Plastificantes
Plastificantes podem ser degradados por diferentes caminhos bióticos e abióticos. O tempo de
meia-vida é o tempo (em dias, semanas ou anos) requerido para a concentração da substância ser
dissipada no ambiente em 50% de seu valor inicial. Esse decaimento é causado por processos biológicos
(biodegradação) e abióticos (causados por processos físico-químicos como hidrólise, fotólise e oxidação,
que abrangem os processos de mineralização, degradação, absorção e transporte).
O conhecimento científico atual mostra que a biodegradação diminui o tempo de meia-vida dos
plastificantes nos solos e sedimentos, com resultados que variam entre alguns dias a meses de acordo
com as condições ambientais (ABDEL-DAIEM et al.,2012, OKAMOTO et al., 2006).
A atividade de biodegradação parece ser maior do que degradação abiótica em águas
superficiais, sedimentos e solos. Ftalatos com baixa massa molar são mais facilmente biodegradados do
que aqueles com massas moleculares elevadas. Em ambientes naturais, as grandes variações de
degradação de plastificantes são causados pelas propriedades físico-químicas do aditivo, do tipo de
linhagens bacterianas, das variações de temperatura e das condições de alimentação do icrorganismo
degradador. Estudos relatam que é provável que a meia-vida dos ftalatos, em condições anaeróbias e
em ambientes pobres em nutrientes, seja maior (YUAN et al., 2010, YUAN et al., 2002).
Os ftalatos podem ser removidos do ambiente por alguns processos que incluem a
transformação microbiológica, à volatilização, foto-oxidação, fotólise, sorção e captação biológica
(ABDEL-DAIEM et al., 2012, STAPLES et al., 1997). Estudos laboratoriais têm mostrado que os
microrganismos aeróbios ou anaeróbios de vários habitats (água, sedimentos, solo) são capazes de
degradar plastificantes. No entanto, os tempos de meia-vida dos plastificantes dependem intensamente
de seu habitat, da densidade microbiana e da intensidade dos raios solares (NET et al., 2015).
Os estudos sobre a degradabilidade dos plastificantes demonstram que a cinética da degradação
anaeróbica ou aerobia em sedimento depende de vários fatores, incluindo o pH, a temperatura, os
tensoativos, os poluentes ou inibidores microbianos (NET et al., 2015). A ação microbiana é
40
deterninante na degradação de plastificantes em ambos os sistemas aquáticos e terrestres (por
exemplo, esgotos, solos, sedimentos, água) (STAPLES et al., 1997).
CHANG e colaboradores (2005) demonstraram que em sedimentos de mangue, sob condição
aeróbia, a biodegradação do bis-(n-butil)ftalato e do di-etilhexil ftalato foi considerada rápida.
Resultados similares foram encontrados para tempos de meia-vida do dietil ftalato, bis(n-butil)ftalato e
di-etilhexil ftalato em sedimentos de rio, sob condições anaeróbias à 30°C e pH neutro. As taxas de
biodegradação primária em sedimentos foram estimados de 3 á 4 semanas e 3 meses, respectivamente,
para bis-(n-butil)ftalato e di-etilhexil ftalato (TEGATZ el al,. 1986).
OTTON e colaboradores (2008) mediram a cinética de biodegradação de oito ftalatos
monoalquílicos em sedimentos marinhos e de água doce, coletados em três diferentes locais em
Vancouver. Os ésteres estudados foram biodegradados, em ambos os sedimentos, à 22 °C. Foram
obtidos tempos de meia vida que variaram entre 16 e 39 horas. Experiências de degradação abiótica do
bis-(n-butil)ftalato e di-etilhexil ftalato indicaram que apenas 2,91% em massa, foram degradadas
durante 30 dias. Esse resultado confirmou que a degradação abiotica é muito mais lenta do que a
biodegradação biótica desses compostos (XU et al., 2008).
Biodegradação dos Ftalatos
A biodegradação pode ser definida como a característica que algumas substâncias químicas
apresentam de atuarem como substrato para microrganismos, que as empregam para produzir energia
por respiração celular e criar outras substâncias como aminoácidos e novos tecidos organismos. Além da
biodegradação de certos poluentes e materiais orgânicos, os microrganismos também são responsáveis
por processos-chave no ciclismo geoquímico, bem como na proteção de biomas inteiros (AMANN et al.,
1995).
As taxas de degradação de ftalatos são dependentes do seu peso molecular; aqueles com
maiores cadeias laterais alquil tendem a ter maiores meias-vidas em um determinado ambiente
(ROGERS, 1996). Por isso, di-etilhexil ftalato, o mais prolífico ftalato em uso hoje em dia, é também um
dos mais persistentes no ambiente (FRANCHETTI et al., 2006).
A degradação de ftalatos em monoésteres pode ser biótica ou abiótica. Sendo a degradação
biótica considerada como a capacidade de degradação do diéster no ambiente (JONSSON et al., 2003). A
meia-vida da degradação abiótica (hidrólise de diésteres para monoésteres) varia, para o dimetil ftalato
e o di-etilhexil ftalato em milhares de anos a pH neutro (STAPLES et al., 1997).
Lixiviados de 17 diferentes aterros da Europa foram analisados por JONSSON e colaboradores
(2003) quanto à presença de ftalatos e seus produtos de degradação, monoésteres ftálicos e ácido
ftálico. Os resultados mostraram que os diésteres estavam presentes na maioria dos lixiviados
investigados. Os monoésteres foram detectados na concentração de 1 a 20 mg/L e ácido ftálico 2 a 880
41
mg/L. Diante desses resultados os autores verificaram que os plastificantes estudados foram
degradados nas condições em que esses se encontravam nos aterros. Fica evidente também, que os
microrganismos presentes nesses aterros atuam na degradação dos ftalatos liberados a partir de uma
variedade de produtos, incluindo o policloreto de vinila.
XU e colaboradores (2008) analisaram os tipos de poluição e de degradação de duas qualidades
de ftalatos, dibutil ftalato e o di-etilhexilftalato, em dois tipos de solos, cultivados e não-cultivados
adquiridos nos distritos de Harbin (solos negros) e de Handan (solos úmidos/ fluvo-hidromorfia) na
China. Observaram que as amostras dos solos não cultivados contém menores teores de plastificantes,
sugerindo que os tipos de poluentes neles presentes, são em grande parte derivados de atividades
agrícolas humanas. Experimentos confirmaram que as degradações de ambos os plastificantes ocorrem
principalmente via processos microbianos. Os produtos da degradação foram analisados através da
técnica de cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa e demostraram que o
metabolismo dos plastificantes se iniciou com a hidrólise do di-éster em monobutil ftalato e em seguida,
o correspondente álcool. O monobutil ftalato foi degradado em ácido ftálico ou benzoato de butilo, cuja
obtenção possivelmente foi causada por descarboxilação microbiana. E finalmente ambos os derivados
de monobutil ftalato foram degradados formando protocatecato através da clivagem do anel e
consecutiva mineralização.
Outros estudos sobre a biodegradação de plastificantes, como o de KAREGOUDAR e PUJAR
(1984) e ZHANG e REARDON (1990) apud Xu (2008) propõem que a detecção de butil-benzoato e
dióxido de carbono sugere a existência de uma via de degradação especial, como mostrado na Figura.
12.
Figura 12. Esquema representativo dos compostos obtidos na biodegradação de ftalato de dietil (DEP).
42
STAPLES e colaboradores (1997) descreveram que a rota metabólica de biodegradação dos
ftalatos, em condições aeróbicas e anaeróbias, é iniciada pela hidrólise do ftalato, formando monoéster,
álcool e posteriormente, ácido ftálico, sendo esta denominada biodegradação primária. Esse processo
de degradação é apresentado na Figura 13. A etapa seguinte, denominada como biodegradação última,
resulta na completa mineralização do ácido ftálico e depende do meio. Em condições aeróbias, a
degradação enzimática do monoéster ocorre via ácido ftálico, obtendo-se o ácido 3,4-dihidroxiftalato
e/ou o ácido 4,5-dihidroxiftalato até o protocatecato. A degradação continua através da clivagem desses
compostos formados até a formação de acetato, succinato, piruvato e gás carbônico. Sob condições
anaeróbias, o monoéster é degradado a ácido ftálico e segue pela rota de degradação do benzoato, que
é biodegradado nestas condições (Figura 13).
Figura 13. Rotas metabólicas da biodegradação dos ésteres ftálicos em meio aeróbio e anaeróbio
(STAPLES et al., 1997 apud FERREIRA, 2009).
43
De acordo com a revisão bibliográfica realizada por IEDA e colaboradores (2012), esses
concluíram que a rota aeróbia citada (Figura 13) é a descrita pela maioria dos pesquisadores.
JONSSON e colaboradores (2003) forneceram informações adicionais sobre a dinâmica de
transformação dos ftalatos e seus metabólitos devido à presença destas substâncias em lixiviados de
reatores de simulação, sendo as amostras estudadas provenientes de aterros. Mais precisamente,
verificaram que a concentração dos ftalatos diminuía simultaneamente ao aumento da concentração
dos monoésteres, e que estas mudanças ocorreram durante a transformação do ftalato em ácido ftálico
diretamente ou por intermediação do monoéster (Figura 14).
Figura 14. Esquema geral da degradação do ftalato (A), no ácido ftálico (C), diretamente ou através do monoéster (B)(EJLERTSSON et al., 1996 apud JONSSON et al., 2003).
Estudos realizados por ZENG et al., (2002) demonstraram uma nova rota de degradação do di-
etilhexil ftalato pelas bactérias Pseudomonas Fluoresences, isoladas a partir lodos ativados de indústrias
petroquímicas. Tais bactérias foram identificadas como degradadoras de ftalatos, sendo esses
compostos a única fonte de carbono e energia. A alteração da rota metabólica via hidrólise do ftalato,
ocorreu a partir do monoéster, onde a degradação enzimática produziu ácido ftálico, ácido benzoico,
fenol e finalmente dióxido de carbono e água, sob condições aeróbias.
Enzimas
A nomenclatura “enzima” vem do grego en, (em) + zyme, (levedura), nome este que visa
enfatizar que tal substância se encontra na levedura. As enzimas são conhecidas pela humanidade
desde o final do século XVII, quando estudos começaram a abordar e explicar a relação das secreções do
estômago com a digestão de carne em seres humanos. Esse termo enzima foi usado pela primeira vez
pelo fisiologista alemão Wilhelm Künhe (SAYALI et al., 2013, SAID e PIETRO, 2004).
As enzimas constituem a maior e mais altamente especializada classe de proteínas. Elas
catalisam várias reações químicas, que conjuntamente constituem o metabolismo intermediário das
células (LEHNINGER, 1977).
As enzimas são produzidas por todos os seres vivos, em concentrações diferentes, podendo ser
de origem vegetal, animal ou microbiana. Diferentemente das enzimas vegetais e animais, a produção
44
de enzimas microbianas não depende diretamente de fatores climáticos, que muitas vezes são
incontroláveis. Além disso, somam-se a esses fatores a enorme biodiversidade dos microrganismos em
variados habitats, até mesmo aqueles que vivem em condições extremas (SAID e PIETRO, 2004).
Essas proteínas atuam como catalisadores biológicos que participam das reações metabólicas
energeticamente possíveis às quais elas aceleram por ativação específica. São as enzimas que permitem
atingir rapidamente o estado de equilíbrio da reação, sem modificá-lo. Sua complexa estrutura é
majoritariamente constituída por uma parte proteica, podendo também estar associada a outras
moléculas, como carboidratos e lipídeos.
Algumas enzimas para apresentarem atividade catalítica exigem a participação de moléculas
menores, de natureza não proteica, que são chamados de cofatores. Esses podem ser íons ou moléculas
orgânicas. A vantagem da utilização de enzimas como catalisadores em processos é que estas tornam
geralmente, os processos mais rápidos, eficientes e ambientalmente sustentáveis (MONTEIRO e SILVA,
2009).
Sendo assim, são cruciais em áreas como biotecnologia, bioindústria e engenharia
microbiológica, pois catalisam as reações metabólicas e asseguram a sua regulação. Permitem também
à engenharia genética realizar modificações no material enzimático de alguns microrganismos, com
vistas a torná-los aptos à biossíntese de metabólitos de interesse (SCRIBAN, 1985).
Esterases
As esterases compreendem um grupo diverso de hidrolases que catalisam a clivagem e a
formação de ligações ésteres. Estas são largamente encontradas em animais, plantas e microrganismos
(LOPES, 2011). A análise da estrutura tridimensional das esterases revela uma característica conhecida
como uma dobra α/β das hidrolases, que consiste de uma folha β-central, rodeado por um número
variável de α-hélices, e acomoda uma tríade catalítica formada pelos aminoácidos serina (Ser), histidina
(His) e aspartato (Asp) e um ácido carboxílico. O resíduo aspartato é em alguns casos substituído por
glutamato (Glu) (BORNSCHEUER, 2002) (Figuras 15 e 16). Devido a sua estrutura são classificadas como
enzimas da família α/β hidrolases. Além disso, as esterases são inibidas pelo composto dietil-p-nitrofenil
fosfato, o que as classifica como serina hidrolases (NARDINI et al., 1999). Muitas esterases têm seu sítio
ativo envolvido por elementos estruturais secundários que deve mudar a conformação para permitir o
acesso do substrato ao sítio ativo. Estes elementos da estrutura secundária foram chamados de tampas
ou abas, e têm um papel importante na regulação da acessibilidade de substratos para o dispositivo
catalítico, como evidenciado pela Figura 17. As esterases microbianas possuem massa molecular entre
20 e 60 kDa (MALA e TAKEUCHI, 2008).
45
Figura 15. Representação esquemática em 3D das hidrolases. Folhas-β circundadas pelas regiões em α-hélices (NARDINI et al., 2000 apud GLOGAUER, 2011).
Figura 16. Representação esquemática das enzimas da família α/β hidrolases. As folhas β (1-8) são indicadas por setas e a alfa- hélices são indicadas pelos cilindros. As posições dos aminoácidos estão
indicadas pelos círculos preenchidos (NARDINI et al., 2000 apud GLOGAUER, 2011)
A B C
Figura 17. Representação da estrutura molecular em 3D da hidrolase de Pseudomonas aeruginosa. (a) Representação das conformações α e β. (b) Representação da superfície molecular, a “tampa” foi
destacada em verde e laranja. (c) Sítio catalítico visto de cima, com a serina catalítica em vermelho (NARDINI et al., 2000 apud GLOGAUER, 2011).
No início do processo de biodegradação, as esterases especificamente agem sobre as ligações
éster (-RCOOR) do ftalato, resultando na formação de monoéster e seu respectivo álcool (BENJAMIN et
al., 2015).
46
O mecanismo da hidrólise de uma ligação éster é composto por quatro etapas. Na primeira, o
substrato está ligado à serina ativa, dando origem a um intermediário tetraédrico que é estabilizado por
seus resíduos histidina e aspartato. Na etapa seguinte, uma molécula de álcool é liberada e um
complexo de acil-enzima é formado. Na terceira etapa, o ataque do nucleófilo (água no caso da
hidrólise, álcool ou éster em reações de esterificação) forma novamente um intermediário tetraédrico,
que após sua estabilização produz o produto (um ácido ou um éster) e a enzima fica livre para outro
substrato. A liberação da enzima é conhecida como quarta ou ultima etapa. (BORNSCHEUER, 2002). A
Figura 18 apresenta os reagentes e produtos da hidrólise do éster.
R
O
OR1
+ H2O
Hidrólise de ésteres
Síntese de ésteres
R
O
OH+ R1OH
Éster Água Ácido Carboxílico Álcool
Meio aquoso Meio orgânico
Figura 18. Esquema da reação de hidrólise e síntese de ésteres de ácidos carboxílicos (LOPES, 2011).
47
2. OBJETIVOS
_____________________________________________________________________________________
Objetivo Geral
Diante do abordado até o momento, o objetivo dessa dissertação foi investigar a biodegração do
plastificante ftalato presente no filme de PVC comercial, utilizando-se microrganismos selecionados na
bioprospecção realizada no Parque Estadual Serra de Ouro Branco/MG.
Objetivos Específicos
Isolamento de microrganismos presentes em diferentes amostras coletadas no Parque Estadual
Serra de Ouro Branco;
Seleção dos microrganismos capazes de crescer em meio sólido contendo o filme de PVC e das
cepas microbianas produtoras de esterases utilizando-se testes de halo de hidrólise;
No processo de biodegradação, estudar a cinética de crescimento celular, a perda de massa do
filme de PVC, determinar a acidez e liberação da amônia no meio líquido utilizado.
Caracterização qualitativa dos compostos presentes no meio líquido estudado, no decorrer dos
ensaios de migração e biodegradação do ftalato, para determinar a eficiência da biodegradação e
detectar a migração do ftalato presente na malha polimérica do filme de PVC para o meio líquido
utilizado.
Caracterização qualitativa dos compostos obtidos na biodegradação do ftalato presente no filme de
PVC;
48
3. MATERIAL E MÉTODOS
__________________________________________________________________________________
3.1. Condições estéreis
Para certificar condições estéreis de crescimento dos microrganismos, nos meios sólidos e
líquidos de inoculação, bem como todos os materiais utilizados foram esterilizados em autoclave a
121°C, durante 20 minutos. A esterilização do filme de policloreto de vinila (PVC) começou com a
limpeza do filme com água esterilizada em autoclave e depois foram colocados em erlemeyers de 250
mL previamente esterilizados e vedados com tampas de gases e algodão. Posteriormente foram
submetidos a irradiação com luz ultravioleta (UV) a 230λ no fluxo laminar laboratorial durante 5
minutos, conforme descrito por KUNICHIKA e colaboradores (2004). Com o objetivo de assegurar uma
esterilização eficiente após o tratamento com radiação os filmes foram colocados em micro-ondas e
submetidos à três ciclos de 3 minutos, a cada ciclo finalizado esperava-se 1 minuto para o resfriamento
do filme. Utilizou-se 3 watts de potêcia (SILBAR et al., 1990; SABORN et al., 1982).
Todos os materiais manuseados durante o ensaio e para o tratamento da amostra foram
utensílios de vidro ou de prolipropileno, a fim de minimizar a contaminação das amostras. Toda a
vidraria utilizada foi lavada com um solvente orgânico apropriado, o n-hexano para evitar contaminação
por plastificantes que não são de interesse no estudo (DARGNAT et al., 2009; MOUSA et al., 2013)
3.2. Reagentes Quimicos
Cloreto de amônio (98%), fosfato de potássio (99,5%), Sulfato de magnésio (98%) Ágar base
(93,8%) peptona (95,5%), cloreto de sódio (99%), cloreto de cálcio (98,9%), corante safrinha (99%),
todos marca Synth; Tween 80 (99%), azul de bromotimol (95,9%), hidróxido de sódio (97%), e
nitroprussiato de sódio (97,5%), hipoclorito de sódio (98%), verde malaquita (98%), todos da marca
Merck; Cloreto de cálcio anidro (97%), etanol (95%), iodeto de Potássio (98%), amido P.A. (99%),
cloridrato de hidroxilamina., etanol 95% , ácido clorídrico (99,8%), cloreto férrico (96%), ciclo-hexona
(99%), butanoato de etila (99%), todos da marca Sigma Aldrich; Cloreto de zinco (97%), álcool sec-
butílico (99%) fenol (98,9%), todos da marca Proquimios.
3.3. Equipamentos
Banho Maria, Novatecnica NT 268; pHmetro, DEL LABDLA-PH; Fluxo laminar Buzattos; Estufa de
Secagem e Esterilização SLABMA 1351100; Agitador e aquecedor magnético.Nova ética 114; Balança
analítica Marte AY220; Estufa Bacteriológica, SOLAB 101/150; Centrífuga, Hettich zentrifugen Rotina
38R; Espectrofotômetro, Biospectro SP-220; shaker Multitec 430, paquímetro Kingtools 500.150.
49
3.4. Licenciamento para coleta das amostras
A coleta das amostras no Parque Estadual Serra de Ouro Branco/MG foi condicionada ao
licenciamento junto à Diretoria de Pesquisa e Proteção à Biodiversidade da Secretaria de Estado de
Meio-Ambiente e Desenvolvimento Sustentável de Minas Gerais – SEMAD. Sendo o número da
autorização: COL: 006/13 e o número do Processo SIGED – IEF/DPBIO/GPROP: 0000003821012013-15.
3.5. Coleta de Amostras no Parque Estadual Serra de Ouro Branco
A escolha do Parque Estadual Serra de Ouro Branco, localizado no município de Ouro
Branco/MG, como área de bioprospecção se deu pelo fato do mesmo apresentar características
ambientais bastante peculiares e ainda uma grande diversidade de espécies vegetais, com elevado
potencial biotecnológico em relação aos seus microrganismos.
Na coleta das amostras, realizada no dia 02 de agosto de 2014, foram estabelecidos cinco
diferentes pontos de coleta, perfazendo uma grande área de abrangência do Parque, visando-se uma
maior diversidade de espécies coletadas. Para tal, foram escolhidas regiões com maior diversidade de
habitats e vegetação bastante densa. Foram coletadas 10 amostras distintas em 9 locais diferentes.
Sendo elas amostras de água de nascente, briófitas, solo coberto por densa vegetação, terra de
cupinzeiro, folhas de árvores de pequeno porte I e II, bromélia I e II e caule de árvore de grante porte.
(Tabela 5).
As amostras coletadas tiveram sua localização definida pelos técnicos do Instituto Estadual de
Florestas (IEF) utilizando-se um aparelho de localização no Sistema de Posicionamento Global (GPS)
(Figura 19). As localizações para cada uma das diferentes amostras coletadas podem ser observada na
(Tabela 5).
Tabela 5. Relação de amostras coletadas no Parque Estadual Serra de Ouro Branco e suas respectivas localizações no Sistema de Posicionamento Global.
Amostras Localização georreferenciada
Água S20°28'51,7'' / W043°43'00,8''
Briófita S20°28'49,4'' / W043°43'04,3''
Solo S20°28'49'' / W043°13'04,4''
Terra de cupinzeiro S20°28'48,7'' / W043°43'04,7''
Folha I S20°28'50,6'' / W043°43'04,8''
Caule S20°28'50'' / W043°43'03,8''
Folha II S20°28'49,8'' / W043°43'04,0''
Bromélia I S520°28'51,7'' /W043°43'00,3''
Bromélia II S520°28'52'' / W043°43'00,3''
50
Figura 19. Imagem de satélite indicando o local de coleta das amostras no Parque Estadual Serra de Ouro Branco. Imagem fornecida pelo IEF – Ouro Branco.
__ Delimitações do Parque Estadual Serra de Ouro Branco.
3.6. Isolamento e manutenção dos microrganismos
As amostras coletadas foram acondicionadas em béqueres de 1 L de polipropileno previamente
esterilizados, devido a facilidade de manuseio desses béqueres nas áreas de coleta no Parque Estadual
Serra de Ouro Branco. Essas amostras foram mantidas refrigeradas, em caixas térmicas, até sua chegada
ao laboratório, sendo processadas num período de até 5 h após sua coleta.
O isolamento dos microrganismos colonizadores das amostras foram realizadas pela técnica do
imprinting em meio de cultura Yest Malt Ágar (YMA) (g/L-1): extrato de malte, 3; extrato de levedura, 3;
peptona, 5; glicose, 10; ágar, 17.
3.6.1. Técnica do Imprinting
Para o isolamento da população de microrganismos presentes nas briófitas, folhas, caule de
árvore e bromélias, foram retirados pequenos fragmentos das amostras, estas foram colocadas em
contato direto com o meio de cultura em dois tempos de contato: 0h (as amostras foram retiradas
imediatamente após o contato com o meio de cultura) e 24 h (de contato da amostra com o meio). Logo
51
em seguida as placas foram incubadas a 28 oC até o crescimento das colônias (FUENTEFRIA e VALENTE,
2004).
Para a incubação da água foi retirada uma alíquota de 1 mL da amostra e esta foi colocada
diretamente no meio sólido; já as amostras de solo e de terra de cupinzeiro foram inoculadas
colocando-se uma pequena quantidade das mesmas nas placas contendo o meio. Todas as placas foram
incubadas a 28°C. Para essas amostras, no tempo 0h, as placas foram totalmente invertidas a fim de que
todo resquício da amostra fosse retirado imediatamente após o contato com o meio de cultura. Alguns
remanescentes foram retirados com uma espátula de vidro previamente esterilizada.
3.6.2. Crescimento e isolamento dos microrganismos
Após o período de incubação, os microrganismos foram isolados, levando-se em conta as
características macromorfológicas das colônias, como a cor e aspecto das colônias. Posteriormente
foram purificados pela técnica de esgotamento por estrias em meio sólido YMA. Este procedimento foi
repetido quantas vezes foram necessárias, visando à obtenção de colônias puras. As colônias isoladas
sofreram repiques em meio sólido a cada 30 dias e foram mantidas em meio YMA, a 4°C.
3.7. Caracterização morfológica dos microrganismos isolados
Para uma identificação prévia dos microrganismos isolados e crescidos em meio YMA os mesmos
foram submetidos à preparação de lâminas a fresco aliadas à técnica de Coloração de Gram.
Para a identificação dos gêneros fúngicos, realizou-se a técnica de microcultivo, de acordo com o
método descrito pela ANVISA (2004). Foram autoclavados kits de microcultivo contendo os seguintes
elementos: uma placa de Petri, uma lâmina de microscopia, uma lamínula, um palito e um pedaço
pequeno de algodão comum. Os elementos foram esterilizados dentro de cada placa de Petri, e esta
embrulhada individualmente. Os elementos esterilizados foram organizados da seguinte forma: cada
placa continha em seu interior um pedaço de algodão umidificado com água destilada estéril e uma
lâmina suspensa por dois palitos. Um cubo de aproximadamente 1 cm³ de meio de cultura YMA foi
cortado com o auxílio de uma espátula e colocado sobre a lâmina contida no interior da placa. Em
seguida inoculou-se o fungo, com auxílio de uma alça de platina, esterilizada em bico de Bunsen, nas
bordas do ágar e sobre este foi colocada uma lamínula esterilizada. A placa foi incubada por 10 dias a
28°C. Após o período de incubação, inativou-se a esporulação, adicionando 1 ml de formol ao algodão
estéril contido no interior da placa e a vedou com fita adesiva durante 48h. O vapor de formol, além de
inativar o fungo, auxilia na fixação das estruturas microscópicas. Após o tempo determinado, a lamínula
foi então colocada sobre uma gota do corante azul de metileno presente na superfície de uma lâmina
limpa. Todo esse processo foi realizado em fluxo laminar. As lâminas preparadas foram fixadas com
esmalte nas suas laterais e posteriormente observadas em microscópio óptico.
52
3.8. Amostra do filme de PVC
O filme de PVC utilizado nos estudos foi de uso comercial, em bobina, medindo 1.600 m. X 40
cm x 11 μm, respectivamente, comprimento, largura e espessura, com o prazo de validade próprio para
o uso e com o lote nº 32280 para a rastreabilidade do produto estampados no rótulo da embalagem de
papelão. A bobina do filme de PVC foi comprada em estabelecimento comercial, varejista, do município
de Ouro Branco/MG em agosto de 2013. Foi utilizado uma massa de aproximadamente 1 g desse filme
para os ensaios decritos a seguir.
3.9. Seleção dos microrganismos isolados aptos a utilizar o ftalato presente no filme de PVC
como substrato.
3.9.1. Seleção em meio sólido
Os microrganismos foram selecionados conforme a técnica descrita por CHANG e ORIEL (1994).
Esse procedimento se baseia na inoculação dos microrganismos isolados nas etapas anteriores em meio
mineral (1,0 g/L NH4Cl, 0,5g/L K2HPO4, 20mg/L MgSO4.7H20 adicionando 17g/L de Ágar) contendo o
substrato de interesse como única fonte de carbono e energia. O substrato utilizado foi o filme PVC, o
qual foi previamente esterilizado, conforme descrito no item 3.1. e cortado em pedaços de
aproximadamente 0,10g cada. Para verificar a metabolização da fonte de carbono foi montado um
sistema de três placas, sendo que uma placa continha a fonte de carbono a ser testada (pedaços de
filme PVC), a outra continha glicose como fonte de carbono (controle positivo), e a terceira placa não
continha nenhuma fonte de carbono (controle negativo). A semeadura dos microrganismos nas placas
contendo o meio mineral foi realizada com auxílio de uma alça de platina previamente flambada no bico
de Bunsen e os microrganismos foram inoculados na forma de estrias. Posteriormente, as placas foram
incubadas a temperatura de 28°C por no máximo 15 dias. Para análise dos resultados foi avaliado o
consumo da fonte de carbono comparando-se o crescimento das bactérias nas 3 placas estudadas. Com
incubação em estufa bacteriológica, as bactérias podem ser capazes de utilizar diferentes fontes de
carbono e energia (NIAZI et al., 2001). Essa técnica permite a seleção direta de microrganismos com
potencial para degradar o ftalato contido no filme de policloreto de vinila.
3.9.2. Seleção em meio líquido - Degradação in vitro e cinética de crescimento dos microrganismos
pré-selecionados
Os oito microrganismos que apresentaram melhor adaptação à fonte de carbono adicionada ao
meio sólido foram selecionados para as próximas etapas do estudo. Assim, realizou-se um ensaio em
meio líquido. Utilizou-se a mesma metodologia descrita para o ensaio em meio sólido (item 3.9.1.),
53
ressaltando que, em meio líquido não há necessidade de acrescentar o componente Ágar ao meio
mineral.
3.9.3. Preparação do inóculo
Para obtenção do pré-inóculo, uma colônia de cada microrganismo foi retirada da placa de Petri
e semeada em erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL de meio líquido YMA e mantida a 28°C mantida
a 30 oC, sob agitação de 150 rpm por 24h. Logo após esse período alíquotas de 25 mL do meio
fermentado foram transferidas para Erlenmeyers previamente esterilizados contendo 75 mL de meio
mineral e foram submetidas às mesmas condições de incubação descrita acima, a fim de se obter o
inóculo que será utilizado nas etapas posteriores.
3.9.4. Degradação in vitro e cinética de crescimento
Com base nas técnicas utilizadas por CHATTERJEE e DUTTA (2003), alíquotas de 1mL do inoculo
(item 3.9.3.) foram transferidos para 8 erlenmeyers de 250mL contendo cada um deles 149 ml de meio
mineral líquido (1,0g/L NH4Cl, 0,5g/L K2HPO4,20mg/L MgSO4.7H20) e suplementados individualmente
com 0,25g de filme PVC, previamente preparados como única fonte de carbono. O inóculo e os pedaços
de filme PVC foram preparados conforme o item 3.9.3 e 3.1., respectivamente. O tubo de controle foi
preparado sem o filme PVC (controle endógeno). Durante os experimentos foi observado o crescimento
de contaminantes. Os Erlenmeyers contendo o inóculo, o PVC e o controle foram tampados e
submetidos a uma incubadora “shaker” com agitação de 180 rpm na temperatura de 28°C. Diariamente
amostras de 10 mL de extrato foram coletadas no mesmo horário da inoculação durante 10 dias.
Para o monitoramento do crescimento celular foram retiradas nos tempos alíquotas de 1 mL dos
cultivos. Estas alíquotas foram centrifugadas a 13.000 rpm durante 10 minutos para precipitação das
células. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células depositado no fundo do tubo foi
ressuspendido em 1mL de água destilada. Logo em seguida, tomou-se 500μL dessa suspensão aos quais
foram adicionados 2,5 mL de água destilada para monitoramento da densidade óptica (600nm) em
cubeta de 3 mL em espectrofotômetro (GOMIDE, 2012).
3.10. Detecção qualitativa de atividade enzimática em meio sólido
As esterases foram detectadas pela realização do teste qualitativo de método de difusão em
ágar. A capacidade de hidrolisar ésteres foi testada em placas de Petri contendo 10,0g de peptona, 5,0g
de NaCl, 0,1g de CaCl2, 15g de Ágar e 1,0 L de água destilada. Posteriormente o meio foi autoclavado por
20 minutos a 121°C. Foram autoclavados também 5 ml de Tween 80 e adicionados ao meio. As placas de
Petri foram preenchidas com 25ml do meio descrito acima. Os microrganismos de interesse foram
54
cultivados durante 24h em meio YMA. Esses microrganismos previamente cultivados foram transferidos
para o meio de Tween 80 através do toque no centro do meio de Ágar usando-se hastes flexíveis
previamente esterilizadas, de modo a preparar um local de inoculação circular de 10 mm de diâmetro.
Os testes foram realizados em triplicatas. As placas de Ágar inoculadas foram incubadas a 30°C e foram
examinadas diariamente por 10 dias (MARCIELLE, 2011). A atividade esterásica foi revelada pela
presença de um precipitado visível (halo opaco) ao redor da colônia (CARISSIMI et al., 2007). Foi
calculado para cada microrganismo o índice enzimático (IE) considerado como a razão entre os
diâmetros médios dos halos de degradação dos substratos e os diâmetros médios das respectivas
colônias (HANKIN e ANAGNOSTAKIS, 1975). As medições dos diâmetros dos halos de hidrólise e das
colônias foram realizadas usando-se um paquímetro (HUBBELL et al., 1978).
3.11. Ensaio de biodegradação do ftalato presente no filme de PVC usando-se o
microrganismo selecionado previamente.
O microrganismo que apresentou maior atividade esterásica em meio sólido suplementado por
Tween 80 foi selecionado para as posteriores etapas desse estudo.
3.11.1. Preparação do inóculo para o ensaio de biodegradação
Para obtenção do pré-inóculo, uma colônia do microrganismo foi retirada da placa de Petri e
semeada em erlenmeyer de 500mL contendo 300 mL de meio líquido (10,0g de peptona, 5,0g de NaCl,
0,1g de CaCl2, 15g de Ágar em 1,0 L de água destilada) mantida a 28oC, sob agitação de 150 rpm por 24
horas. Logo após esse período alíquotas de 25 mL do meio fermentado foram transferidas para
Erlenmeyers previamente esterilizados contendo 225 mL de meio mineral (1,0g/L NH4Cl, 0,5g/L K2HPO4,
20mg/L MgSO4.7H20 em 1L de água destilada) e foram submetidas as mesmas condições de incubação
descrita no item 3.9.3., a fim de se obter o inóculo utilizado nas etapas poeteriores
3.11.2. Ensaio de biodegradação
Com base nas técnicas utilizadas por CHATTERJEE e DUTRA (2008), alíquotas de 25mL do inoculo
foram distribuídas em 12 erlenmeyers de 250 mL contendo 125 mL de meio mineral líquido (1,0g/L
NH4Cl, 0,5g/L K2PO4, 20mg/L MgSO4.7H20) e suplementado com aproximadamente 1,0g de PVC
previamente esterilizados conforme o item 3.1, como única fonte de carbono. Todo o experimento foi
feito em duplicata e dois tubos de controle foram montados, um sem PVC (controle negativo) e outro
com o PVC (controle positivo), para detectar possíveis contaminações. Os Erlenmeyers contendo o
inóculo e o PVC, as duplicatas e os controles foram tampados e submetidos a uma incubadora shaker
com agitação de 180 rpm na temperatura de 28°C. O ensaio de biodegradação foi conduzido durante 24
55
dias, sendo que, a cada 2 dias (48 h) um erlenmeyer e sua respectiva duplicata eram retirados do shaker
para análise da mistura formada nesse ensaio.
3.12. Análises dos produtos obtidos no ensaio de biodegradação
As análises foram feitas na mistura formada no ensaio de biodegradação e na sua respectiva
duplicata.
3.12.2. Determinação do índice de acidez
Em um erlenmeyer de 100 ml foram adicionados uma alíquota de 40 mL da mistura na qual a
biodegradação estava ocorrendo (item 3.11.2.) e 2 gotas do indicador solução alcoólica de azul de
bromotimol (50 mg de azul de bromotimol dissolvidos na mistura composta por 4 mL de hidróxido de
sódio a 0,02 mol/L-1, 20 mL de álcool e 100 mL de água destilada). A titulação foi realizada em bureta de
10 ml usando-se uma solução aquosa padrão 0,0075 mol-1 de NaOH (titulante), a qual foi padronizada
com biftalato de potássio. Através do volume da solução de NaOH usada na titulação, calculou-se o
índice de acidez (expresso em mol/L-1) da amostra, mediante emprego da equação 1:
Equação 1
Sendo:
C: concentração do ácido, mol/L;
M: molaridade do titulante, mol;
V: volume titulado, L.
Essa análise tem como finalidade determinar a concentração total de H+ na mistura em questão.
3.12.3. Monitoramento das células viáveis
Foi realizada através da contagem de colônias em placas ou Unidade formadoras de Colônias
(UFC), que determina somente o número de células viáveis e indica possíveis contaminações. As células
foram colhidas logo após a retirada de cada amostra. Diluições decimais seriadas da suspensão de
células foram feitas em solução estéril de peptona a 0,1% (1g/L peptona, 8,5g/L NaCl). Um ml de cada
diluição foi inoculado em placas duplicadas de Petri e misturada com o meio Agar (10,0g de peptona,
5,0g de NaCl, 0,1g de CaCl2, 15g de Ágar em 1,0 L de água destilada) (por espalhamento na superfície do
meio). As placas de Petri foram incubadas 24 h a 30 °C antes da contagem. A diluição utilizada foi de
56
1x10-8, pois foi a qual apresentou uma média de 130 a 280 colônias, estando dentro da faixa
recomendada pela literatura, que é entre 30 e 300 colônias. Em seguida foram feitos os cálculos para
padronização do inóculo segundo a Equação 2 abaixo.
Equação 2:
Sendo:
C: Unidade Formadoras de Colônias, UFC/mL;
D: diluição invertida, mL;
M: média de colônias contadas, UFC;
Fc: fator de correção do plaqueamento determinado na literatura.
3.12.4. Determinação da morte celular pelo método da concentração da amônia
A cada 24h alíquotas de 50 µl da mistura na qual a biodegradação estava ocorrendo (item
3.11.2.) foram retiradas e tratadas com 3,0 ml de Reagente Fenol (11,68 ml de fenol e 0,0625g de
nitroprussiato de sódio) e 3 ml de Reagente Hipoclorito de Sódio (6,25g de NaOH e 3,67 ml de
hipoclorito de sódio). As amostras foram agitadas após a adição de cada reagente. Em seguida foram
incubadas a 39°C por 20 minutos em banho Maria. As amostras foram novamente agitadas e analisadas
a 630 nm em cubeta de vidro A quantidade de amônia produzida pelas bactérias foi estimada usando
coeficientes obtidos a partir da curva padrão da amônia.
A confecção da curva analítica foi realizada de acordo com o procedimento operacional padrão
(POP) n0 65.3120.064 (INCQS/FIOCRUZ, 2004), modificado da seguinte forma: A curva padrão foi
confeccionada com cinco pontos, obtidos através da solução estoque genuínas do padrão de sulfato de
amônia e os reagentes descritos no item anterior (Item 3.12.4). A partir desta solução foram feitas
diluições, em cada caso, foi medida a absorbância a 630 nm.
3.12.5. Determinação da perda da massa do filme PVC
Os pedaços de PVC residuais foram removidos a cada intervalo de 48 h, concomitante à coleta
feita da mistura de biodegradação no item 3.11.2 Esses PVCs foram lavados com água Mili-Q e secos
sobre cloreto de cálcio anidro em estufa a 45°C por 48 horas. Já à temperatura ambiente foram
novamente pesados. Valores de perda de massa foram calculados a partir da Equação 3 (SEARPE e
WOODRO, 1971):
Equação 3:
57
Sendo:
M R: Massa resultante do PVC, g;
M F: Massa final do PVC, g;
M I: Massa inicial do PVC, g.
3.13. Ensaio de migração do ftalato presente no PVC para o meio mineral
O filme de PVC foi cortado em pequenos pedaços de aproximadamente 1g cada e esterilizou-se
conforme descrito no item 3.1. Os filmes de PVC foram colocados erlenmeyer com capacidade de
500mL, contendo 400mL de meio mineral líquido (1,0g/L NH4Cl, 0,5g/L K2PO4,20mg/L MgSO4.7H20). Os
frascos foram tampados e submetidos a um shaker com agitação de 180 rpm na temperatura de 28°C,
sob as mesmas condições do ensaio de biodegradação descrito no item 3.11.2. Em intervalos de tempo
de 48 h, alíquotas foram retiradas para a determinação do ídice de acidez. Todos os experimentos foram
realizados em duplicata.
3.14. Identificação qualitativa dos diferentes grupos funcionais obtidos nos ensaio de
biodegradação e de migração do ftalato.
3.14.1. Detecção do grupo funcional carboxila (-COOH) empregando-se o Teste de conversão a
Hidroxamato Férrico.
Inicialmente foi preparada a seguinte mistura: 1 mL de cloridrato de hidroxilamina 0,5 mol/L-1
em etanol a 95% e 0,4 mL de hidróxido de sódio (6 mol/ L-1).
Em um tubo de ensaio foram adicionadas 300 µl da mistura na qual a biodegradação estava
ocorrendo (item 3.11.2.) e 1mL da mistura recém preparada de cloridrato de hidroxilamina. Em seguida,
o tubo foi aquecido por 30 segundos em banho-maria à 40°C e, posteriormente resfriado em banho de
gelo. Foram então adicionados 2 mL de ácido clorídrico (1 mol/L-1) e uma gota da solução aquosa de
cloreto férrico 5% (v/v). Esse foi agitado lentamente. O aparecimento da cor vinho/marrom
avermelhado é indicativo da presença do grupo funcional ácido carboxílico no meio testado.
Procedimento idêntico foi adotado usando-se amostras retiradas do ensaio de migração do ftalato (item
3.13.). Ambos os procedimentos foram acompanhados da realização do ensaio “branco” (ENGEU, 2012).
O composto utilizado para o teste positivo foi o butanoato de etila.
58
3.14.2. Detecção do grupo funcional fenol (ArOH) empregando-se o teste do cloreto férrico.
Em um béquer de 50 mL contendo 1 mL de água destilada foram adicionadas cinco gotas da
amostra proveniente dos ensaios de biodegradação (item 3.11.2) e sete gotas de solução aquosa de
cloreto férrico a 2,5%. O aparecimento da coloração violeta, azul ou verde intensa é indicativo da
presença do grupo funcional fenol na amostra testada. Procedimento idêntico foi adotado usando-se
amostras retiradas do ensaio de migração do ftalato (item 3.13.). Ambos os procedimentos foram
acompanhados da realização do ensaio “branco” (ENGEU, 2012). O composto utilizado para o teste
positivo foi o fenol.
59
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
____________________________________________________________________________________
4.1. Caracterização morfológica dos microrganismos isolados
Foram isolados 23 microrganismos das amostras selecionadas no Parque Estadual Serra de Ouro
Branco/MG, sendo todos esses classificados de acordo com suas características fenotípicas.
Os microrganismos selecionados foram codificados de acordo com sua morfologia celular e
foram nomeados da seguinte forma: FF no caso de fungos filamentosos, BC para bactérias do tipo cocos
e BB para bactérias do tipo bastonetes. Os resultados obtidos quanto à morfologia, coloração, aspectos
da superfície das colônias, segundo os códigos estabelecidos, foram apresentados na Tabela 6.
Tabela 6. Caracterização morfológica dos microrganismos isolados.
Microrganismos Amostras Cor das
Colônias Aspectos
Morfologias
Celulares
BB1 Água Roxo Brilhante Bastonetes Gram -
BC19 Água Bege Brilhante Cocos Gram -
BC22 Água Bege Brilhante Cocos Gram -
BB23 Água Banco Brilhante Bastonetes Gram -
BC4 Bromélia I Branco Brilhante Cocos Gram-
BB21 Caule de árvore Bege/claro Brilhante Batonete Gram -
BC20 Cupinzeiro Branco Brilhante Cocos Gram -
FF5 Folha I Branco/verde Fosco Geotrichum sp
BB6 Folha I Amarelo Brilhante Batonetes Gram+
BC7 Folha I Marrom/claro Brilhante Cocos Gram -
BC8 Folha I Laranja Brilhante Cocos Gram -
BC9 Folha I Branco Brilhante Cocos Gram -
BC10 Folha I Branco Brilhante Cocos Gram -
BC11 Folha I Bege/claro Brilhante Cocos Gram -
BB12 Folha II Laranja Fosco Bastonetes Gram+
FF13 Folha II Amarelo Fosco Aspergillus sp
FF14 Folha II Bege/claro Fosco Aspergillus sp
FF2 Folha II Bege Fosco Aspergillus sp
FF3 Folha II Bege Fosco Aspergillus sp
BC15 Solo Bege Brilhante Cocos Gram -
BC16 Solo Laranja/claro Brilhante Cocos Gram -
BB17 Solo Bege Brilhante Bastonetes Gram -
BC18 Solo Bege Brilhante Cocos Gram -
A caracterização morfológica mostrou-se primordial, uma vez que, a coloração Gram é uma
técnica simples e seus custos são consideravelmente baixos diante da eficácia alcançada com os
resultados imediatos dos testes.
60
Nessa as bactérias são separadas em dois grandes grupos, o das bactérias Gram positivas e o das
Gram negativas, o que é importante para a caracterização e classificação dessas bactérias. Através dessa
técnica são obtidas informações sobre a morfologia celular e a constituição da parede celular das
bactérias a serem caracterizadas.
Dessa forma, a análise da coloração Gram das bactérias isoladas, demonstrou que 16 bactérias
são Gram-negativas e somente 2 Gram-positivas, quanto à morfologia bacteriana as bactérias isoladas
apresentaram forma de cocos e bastonetes. O fungos se diferenciam em 4 Aspergillus sp e 1 Geotrichum
sp. Foram 6 as bactérias que apresentaram a morfologia de bastonetes (BB1, BB6, BB12, BB17, BB21 e
BB23), sendo a BB6 e BB12 Gram positivas e a BB1, BB17, BB21 E BB23 Gram negativas. Essas foram
isoladas a partir de amostras de água, folhas, tronco e solo, e suas colônias apresentaram diferentes
cores (roxo, amarelo, laranja, bege e branco) e aspecto brilhante (Figura 20).
Todas as 12 bactérias BC4, BC7, BC8, BC9, BC10, BC11, BC15 BC16, BC18, BC19, BC20 e BC22 que
apresentaram morfologia bacteriana Cocos foram detectadas como Gram negativas. Sendo essas
provenientes de amostras de folhas, bromélia, água e solo. Verificou-se que todas essas colônias de
bactérias apresentaram aspecto brilhante com cores que variaram entre branco, bege, laranja e marrom
(Figura 20).
Figura 20. Exemplos de microrganismos isolados do Parque Estadual Serra de Ouro Branco. A primeira foto (esquerda) se refere ao microrganismo BC19, segunda ao BC8 e a terceira ao BB6.
A preparação microscópica para a observação dos fungos é de extrema importância, uma vez
que a identificação dos microrganismos isolados depende, em grande parte, do conhecimento das suas
características morfológicas, tais como as estruturas de reprodução, textura e tempo de
desenvolvimento da colônia. Foi utilizada a técnica do microcultivo para identificação dos gêneros de
fungos encontrados neste estudo. Assim foram identificados em diferentes amostras os gêneros
Aspergillus sp. e Geotrichum sp.
As amostras codificadas como FF2, FF3, FF13 e FF14, originárias exclusivamente de folhas II
foram classificados como Aspergillus sp, e suas colônias apresentaram aspecto fosco e coloração
BC19 BC8 BB6
61
amarela ou bege. Somente a amostra FF5, também de aspecto fosco e proveniente de folhas I, foi
caracterizada como Geotrichum sp.
Com base nas características macromorfológicas apresentadas pelos microrganismos observou-
se uma variedade de cores das colônias isoladas das amostras, como branco, verde, laranja, rosa, roxo,
amarelo, e bege, além dos aspectos fosco e brilhante. Essa metodologia de caracterização morfológica,
destaca-se nesse estudo, pois possibilitou conhecimento de vários microorganismos diferentes
presentes no Parque Estadual Serra de Ouro Branco ressaltando, consequentemente a importância da
técnica da bioprospecção.
A distribuição de frequência dos microrganismos isolados, segundo sua morfologia celular,
demonstrou que as bactérias do tipo cocos Gram negativos apresentaram maior frequência relativa
(52,2%), seguidos dos fungos (21,7%), do bastonetes Gram negativos (17,4%) e dos bastonetes Gram
positivos (8,7%). Tais resultados estão apresentados na Figura 21.
Figura 21. Distribuição de frequência dos microrganismos isolados.
4.2. Seleção dos microrganismos isolados aptos a utilizar o ftalato presente no filme de PVC como
substrato
4.2.1 Seleção em meio sólido
A Figura 22 apresenta uma foto ilustrativa da placa de Petri preparada para o ensaio de seleção
em meio sólido. Nesta fase do estudo foram selecionados oito microrganismos, BB1, FF2, FF3, BB4, FF5,
BB6, BC7 e BC8 (Tabela 6), os quais apresentaram melhor crescimento em meio sólido mineral
suplementado com filme policloreto de vinila como única fonte de carbono. Observou-se que os
microrganismos selecionados nessa etapa foram capazes de degradar o ftalato presente no filme PVC,
uma vez que esses não possuem meio aquoso para se difundirem.
62
Analisando-se a Figura 22, percebeu-se que o microrganismo coloniza e cresce na presença do
filme de PVC. Esse crescimento indica a metabolização do filme PVC como fonte de carbono, uma vez
que não há outra fonte de carbono e por ser meio sólido o ftalato presente no filme não difunde para o
meio. O filme PVC foi colocado na superfície do meio e não misturado ao meio.
A Figura 23 representa os oito microrganismos selecionados nessa etapa, ou seja,
microrganismos que utilizaram o ftalato do policloreto de vinila como fonte de energia e carbono.
Analisando a Figura 23 e a Tabela 6, pode-se percerber que os microrganismos que evidenciam a
utilização do ftalato em seu metabolismo são de diferentes formas e cores e seus habitats são variados,
como água, folha e bromélia.
Figura 22. Foto ilustrativa do crescimento do microrganismo FF5 em meio sólido, contendo filme de policloreto de vinila como substrato.
Figura 23. Fotos ilustrativas dos diferentes microrganismos selecionados para os estudos cinéticos, de acordo com a codificação apresentada na Tabela 6.
BB1 FF2 FF3 BB4
FF5 BB6 BC7 BC8
63
Estudo semelhante foi desenvolvido por KUNICHIKA e colaboradores (2005), no qual, foi
investigado a utilização de microrganismos para degradar e remover o di-etilhexil ftalato, a partir do
policloreto de vinila. Os possíveis microrganismos que degradam o di-etilhexil ftalato foram adquiridos a
partir do solo e de lodos de esgoto. Estes foram submetidos a ensaios contendo di-etilhexil ftalato
(0,3%) como a única fonte de carbono. A partir de mais de 100 amostras testadas, foram isolados quatro
microrganismos, dos quais apenas um deles foi capaz de degradar completamente o di-etilhexil ftalato.
Resultados semelhantes foram demostrados nesse trabalho, uma vez que selecionou em meio sólido
microrganismos capazes de metabolizar o ftalato presente no filme PVC. Sendo que no estudo de
KUNICHIKA e colaboradores (2005) a fonte de carbono foi o próprio plastificante, já nesse estudo o
plastificante estava inserido na estrutura polimérica do PVC.
4.2.2. Seleção em meio líquido - Degradação in vitro e cinética de crescimento dos
microrganismos pré-selecionados
Os estudos cinéticos de crescimento dos 8 microrganismos selecionados (BB1, FF2, FF3, BB4,
FF5, BB6, BC7e BC8) apresentados na Figura 23, foram realizados tendo como parâmetro o crescimento
celular analisado através da leitura da densidade óptica em 600 nm.
A Figura 24 mostra o perfil cinético do crescimento celular dos microrganismos selecionados
utilizando o ftalato presente no filme policloreto de vinila como única fonte de carbono.
De acordo com os resultados obtidos (Figura 24) verificou-se que, os microrganismos BB1, FF2,
FF3 demostraram elevado crescimento após 10 dias de fermentação, alcançando uma densidade óptica
superior a 1,0. Por outro lado, os microrganismos BB4, FF5, BB6, BC7 e BC8 obtiveram uma densidade
óptica inferior a 0,5 com o mesmo tempo de fermentação.
Figura 24. Gráfico relativo à cinética de crescimento dos microrganismos BB1, FF2, FF3, BB4, FF5, BB6, BC7 e BC8, sob mesmas condições de cultivo.
B
B
1
64
4.3. Detecção qualitativa de atividade enzimática em meio sólido pelos microrganismos BB1, FF2, FF3
Nessa fase de estudo foram utilizados os três microrganismos que apresentaram o melhor perfil
cinético de crescimento (BB1, FF2, FF3). Nessa etapa foi avaliada a capacidade de produção de esterase
pelos microrganismos BB1, FF2, FF3 a partir da formação de halos de hidrólise em meio sólido mineral
suplementado com o substrato Tween 80. A presença desses halos indicou a produção extracelular da
enzima esterase responsável pela degradação desse substrato. Estudos da colonização de fungos e
biodegradação do policloreto de vinila por WEBB et al. (2000) evidenciam que os fungos produzem
esterases extracelular que degradam os plastificantes que se encontram no policloreto de vinila.
Segundo VAZZOLLER (2001) apud GRISA et al. (2011), os microrganismos isolados de aterro sanitário
secretam as enzimas, que são responsáveis pelo metabolismo, transformação e quebra de uma
substância em outra. Sendo assim, as células microbianas possuem arsenais enzimáticos que são
capazes de atuar sobre substâncias químicas sintéticas oriundas das atividades antropogênicas. Através
desse estudo observou-se que bactérias e fungos produziram a enzima esterase.
A escolha do substrato para a determinação das atividades esterásicas foi direcionada para
Tween 80, pois o uso do mesmo é indicado para o estudo da especificidade das esterases que hidrolisam
ésteres de ácidos graxos de cadeias curtas (LAMBRECHTS et al., 1995).
A Figura 25 apresenta exemplos dos halos de hidrólise produzidos pelos microrganismos BB1, FF2,
FF3. Os halos indicativos da produção das enzimas esterase, podem ser vistos mesmo com a ausência da
solução reveladora e foram detectados pela presença de uma zona clara ao redor das colônias como
avaliado por GOPINATH e colaboradores (2005). Sendo assim, analisando-se a Figura 25 percebe-se que
a BB1 gerou o maior halo, possivelmente devido à sua maior capacidade de produção de enzimas do
tipo esterase. Nos casos demonstrados na Figura 25 (resultado positivo) foram medidos os diâmetros
dos halos de hidrólise e das colônias.
A atividade enzimática extracelular foi avaliada mediante a relação entre o diâmetro médio do
halo de degradação e o diâmetro médio da colônia e expressa como índice enzimático (IE). Desse modo,
quanto maior o índice maior é a atividade enzimática no meio (HUBBELL et al., 1978).
Figura 25. Fotos ilustrativas de halos produzidos por cepas de microrganismos após 10 dias de
crescimento em meio suplementado com Tween 80. A atividade esterásica foi apresentada pelo halo opaco ao redor da colônia dos microrganismos BB1, FF2 e FF3.
BB1 FF2 FF3
65
Os valores do índice enzimático (IE) dos microrganismos BB1, FF2, FF3 estão representados na
Tabela 7. Segundo os resultados obtidos observou-se que, o microrganismo BB1 apresentou o maior
halo de hidrólise com IE superior a 2. Entretanto, os microrganismos FF2, FF3 obtiveram um IE de 1,15 e
1,13 respectivamente. LEALEM e GASHE (1994) consideram um microrganismo como produtor potencial
de enzimas, quando este em meio sólido apresenta um índice enzimático ≥ 2,0.
Tabela 7. Relação de índices enzimáticos obtidos para os microrganismos isolados.
As esterases são enzimas que clivam as ligações éster, sendo assim, microrganismos que
sintetizam as mesmas podem degradar o ftalato. O estudo de GAVALA e colaboradores (2004)
investigou a degradação anaeróbia de três di-ésteres ftálicos, o dietil 1,2-benzenodicarboxílico, dibutil
1,2-benzenodicarboxílico, di-etilhexil ftalato, presentes em lodo gerados durante o tratamento de águas
residuais. A enzima esterase foi adicionada ao lodos contendo os ftalatos e submetidas a uma
incubadora, sob agitação á 28°C, por 20 dias. Diante dos resultados os autores concluiram que o
tratamento enzimático foi eficiente na remoção dos plastificantes. Além disso, observaram que o
tratamento enzimático resultou na meia-vida mais curta de di-etilhexil ftalato nas lamas relatado até
agora. Devido aos resultados dessa pesquisa pode-se considerar que microrganismos com potencial de
sintetizar a enzima esterase são provavelmente mais aptos a degradar os ftalatos presentes no filme de
PVC.
4.4. Realização e Análise dos Ensaios de biodegradação do ftalato presente no filme de PVC usando-se
o microrganismo selecionado previamente.
Para realização dos ensaios de biodegradação em meio líquido mineral, contendo o filme de PVC
como única fonte de carbono, durante 24 dias, foi escolhida a bactéria BB1, a qual produziu maior halo
enzimático frente ao teste com Tween 80. Para o monitoramento destes ensaios, amostras foram
retiradas a cada 48 horas (2 dias) e analisadas. Foram realizadas análises titulométricas, de detecção da
perda de massa, de contagem de células, monitoramento da amônia e testes qualitativos para a
detecção de diferentes funções orgânicas, tais como ácido carboxílico e fenol.
O método utilizado baseia-se nas definições de FEIGL. Esse método permite através de conceitos
de especificidade, seletividade e sensibilidade das reações usadas, a caracterização de Grupos
Funcionais.
Microrganismos Índices Enzimáticos (IE)
BB1 2,05 FF2 1,15 FF3 1,13
66
4.5. Migração do ftalato
Visando-se esclarecer se o aumento dos íons H+ dos ensaios foi realmente devida à
biodegradação do ftalado presente no filme PVC e não à simples transferência ou migração do ftalato
para o meio usado. Mantendo-se as mesmas condições do ensaio de biodegradação, exceto pela
ausência da bactéria BB1, no decorrer do mesmo tempo (24 dias), foram realizados estudos na tentativa
de identificar a presença do ftalato e seus metabólitos no meio.
4.5.1 Determinação do índice de acidez do ensaio de biodegradação e migração
O método titulométrico foi utilizado para detecção de possíveis variações na acidez do meio
devido à quebra metabólica dos di-ésteres ftálicos em ácidos ftálicos por microrganismos (ensaio
biótico) ou pela transferência ou migração (ensaio abiótico) do ftalato para o meio usado.
Esse método foi escolhido, pois através dele é possível verificar as variações na concentração de
íons H+ nas amostras retiradas do meio dos ensaios de biodegradação e migração. A partir dos
resultados obtidos observou-se que houve um aumento na concentração de íons H+ no decorrer de 24
dias, indicando a presença de substâncias ácidas nos meios de degradação biótica e abiótica (Figura 27).
Figura 26. Concentração do ácido (mol/L) nos ensaios de biodegradação ( ) e migração do ftalato ( )
presente no filme PVC, baseados no método titulométrico.
Observou-se que as maiores concentrações de ácidos foram alcançadas após o 12 dia do ensaio
de biodegradação, indicando que a bactéria BB1 provavelmente degradou o ftalato presente nos filmes
PVC, em ácidos ftálicos (Figura 27). Segundo os dados gráficos da Figura 26, foi possível observar
também que houve o aumento na concentração de ións H+ ao decorrer do tempo do ensaio de
migração. Tal resultado indica que a dessorção do plastificante ftalato é devida a hidrólise da ligação
éster, provocada pelo meio aquoso, em ácido ftálico e o respectivo álcool, de acordo com o que pode
ser visto na Figura 19. Concluiu-se então, que o aumento na concentração dos íons H+ no ensaio de
67
biodegradação não foi somente devido a degradação biótica, uma parte foi resultante do processo
abiótico, ou seja, da migração do ftalato para o meio mineral. Analisando a Figura 26 observou-se que a
maior liberação de íons H+ foi decorrente do metabolismo das bactérias, uma vez que demonstrou
concentrações de ácidos maiores que no ensaio abiótico.
Resultados similares aos encontrados neste estudo foram relatados por AL-SALEH e
colaboradores (2011) no estudo de determinação da presença de ftalatos em 10 marcas diferentes de
garrafas de água disponíveis nos mercados da Arábia Saudita. Os pesquisadores concluíram que os
plastificantes são transferidos a partir dos materiais poliméricos das embalagens para a água mineral
contida na garrafa. Sendo assim, pode-se constatar que o aumento da concentração do ácido do ensaio
de migração foi devido a transferência do ftalato em forma de ácidos ftálicos para o meio mineral.
Resultado semelhante foi relatado por JUNESON e colaboradores (2001) que avaliaram a
biodegradação do di-etilhexil ftalato em reatores. Eles observaram o aumento da concentração de
ácidos durante 30 dias de experimento. Com esses resultados eles concluíram que provavelmente esse
decaimento é devido a presença e natureza ácida dos produtos da biodegradação de ftalatos. Esse
resultado corrobora com os resultados obtidos pelo método titulométrico, uma vez que a concentração
de íons H+ aumentou, o que indica a provável presença de ácido ftálico no meio (Figura 26).
A partir da análise dos resultados obtidos, observou-se que até o quarto dia não houve
alterações significativas na concentração de ácido no ensaio abiótico. Resultados semelhantes foram
discutidos por KUNICHIKA e colaboradores (2005), no estudo da migração do DEHP presentes em folhas
finas de policloreto de vinila para meios como: água, tampão de soro fisiológico e saliva artificial. As
análises de cromatografia líquida de alto eficiência e cromatografia gasosa e espectrometria de massas
demonstraram que após 3 dias de ensaio, o DEHP não foi encontrado em tampão de soro fisiológico ou
em água. O que indica que não houve migração ou houve em taxas muito baixas do ftalato para o meio
estudado, como observado no resultado obtido na Figura 26.
4.5.2. Monitoramento das células viáveis e determinação da morte celular pelo método da
concentração da amônia.
A maior quantidade de colônias bacterianas foi identificada no sexto dia de cultivo,
apresentando 3,02x10-8 ± 0,07 UFC/mL, como demonstrado na Figura 28. Esse resultado se deve
possivelmente a aclimatização das bactérias BB1 ao novo meio e ao novo substrato, como enunciado
por alguns pesquisadores, como fase Log (JIANLONG et al.; 1997). Observou-se que no segundo e quarto
dias obteve-se as menores taxas de colônias, evidenciando a dificuldade das bactérias em utilizar o
ftalato como fonte de energia, uma vez que, o pré-inóculo continha o substrato ideal e disponível ao
acesso das bactérias. Foi observado também que no oitavo dia de ensaio houve um declínio nas
Unidades Formadoras de Colônias/mL. Esse declínio pode ser atribuído à seleção das bactérias aptas em
68
usar o ftalato presente no filme policloreto de vinila como fontes de carbono e energia para suprir seu
metabolismo. Essa justificativa se sustenta se considerarmos que após o oitavo dia de ensaio, as taxas
das colônias quase se mantiveram constantes, sem nenhum decaimento repentino. Esses resultados são
semelhantes aos demonstrados por CHANG e colaboradores (2004), no qual avaliaram através da
contagem de colônias taxas de degradação de plastificantes a partir de duas linhagens de bactérias
isoladas de lodo de rio e efluentes petroquímicos. Os mesmos obtiveram em 7 dias de ensaio uma
contagem de 8.0×106 para 1.40×108 UFC/mL, concluíram que devido ao aumento das bactérias isoladas,
estas tinham capacidade de utilizar o plastificante como fonte de carbono e fonte de energia. No nosso
estudo observou-se em 24 dias de ensaio uma contagem no segundo dia e no 24 dia, respectivamente,
de 2.32 x 10-8 para 2.94 x 10-8 UFC/mL.
Figura 28. Monitoramento concentração de células viáveis através da contagem de unidades formadoras de colônias por mL (UFC/mL), durante os 24 dias do ensaio de biodegradação.
A concentração de amônia presente no meio líquido, devido à morte celular no decorrer do
ensaio de biodegradação, tem relação direta com o consumo endógeno e com o crescimento das células
sobreviventes. A liberação de amônia resulta do consume endógeno no qual a bactéria utiliza proteína e
o RNA de algumas bactérias mortas como fonte de carbono e energia (WARREN et al., 1960 apud
SHARPE et al., 1971).
CAVETT e WOODROW (1968) indicaram que para a linhagem de Pseudomonas fluorescens a
utilização endógena (tal como medido pela libertação de CO2) foi inversamente correlacionado com a
capacidade das células de metabolizar os plastificantes presentes no policloreto de vinila quando estes
materiais foram à única fonte de carbono.
Para monitorar a concentração da amônia uma curva padrão foi estabelecida, a qual relaciona
os valores de absorbância e as concentrações conhecidas de sulfato de amônia. A partir da solução
aquosa padrão de amônia (0,004 mol/L) foram feitas diluições e em cada caso, foi medida a absorbância
69
a 630 nm. Os valores de absorbância obtidos e os valores das concentrações pré-estabelecidas foram
plotados para construção da curva padrão apresentada na Figura 29. A quantidade de amônia produzida
pelas bactérias foi estimada através de coeficientes obtidos a partir da referida curva padrão como
demonstrado na Figura 30.
Figura 29. Curvaa padrão da amônia obtida por padronização externa após análise por espectrofotometria.
Figura 30. Variação da concentração de amônia durante os 24 dias do ensaio de biodegradação do
ftalato.
70
Figura 31. Variação da concentração da amônia ( ) em relação à quantidade de células viáveis ( )durante os 24 dias do ensaio de biodegradação.
A Figura 31 apresenta a concentração da amônia (mol/L) em relação às células viáveis (UFC/mL).
Segundo os resultados obtidos observou-se que a partir do sexto dia do ensaio de biodegradação a
quantidade de células viáveis e a concentração de amônia não tiveram uma variação significativa
indicando que a sobrevivência das células da BB1 é independente do consumo da amônia presente no
meio líquido do ensaio de biogradação (consumo endógeno) e sim do consumo do ftalato presente nos
filmes de policloreto de vinila, utilizados como única fonte de carbono. Verificou-se também que no
segundo dia de ensaio a quantidade de amônia no meio aumentou e a quantidade de colônias viáveis
diminui, evidenciando a morte celular e consequentemente o consumo endógeno das bactérias.
Possivelmente esse resultado foi em consequência do estresse gerado nas bactérias devido à mudança
de substrato disponível a elas. Uma parte da amônia detectada no meio de biodegradação
possivelmente é proveniente da amônia (NH4) usada na preparação do meio mineral, o que afirma a
metabolização do ftalato e não o consumo endógeno pelas bactérias.
Resultados semelhantes aos encontrados nesse estudo foram relatados por SHARPE e
colaboradores (1971), num teste rápido de biodegradação envolvendo o policloreto de vinila por
Pseudomonas sp. No qual observaram que o número total de células e a concentração de amônia não
sofreram alterações significativas nos últimos dias do experimento. Diante dessa observação concluíram
que as necessidades energéticas das células foram, portanto, satisfeitas pelo metabolismo do
transferido do policloreto de vinila, uma vez que, as bactérias continuaram vivas e houve perda
significativa da massa do filme policloreto de vinila.
4.5.3. Determinação da perda da massa do PVC
Verificou-se que a perda de massa ocorre devido aos dois processos biodegradação e migração.
Em função disso, podemos atribuir apenas parte da diminuição da massa do filme à biodegradção. Isso
71
ocorre em função do consumo dos ftalatos presentes na estrutura dos filmes PVC pelo pela bactéria BB1
e consequentemente, a sua posterior transformação em ácidos ftálicos. A Figura 32 apresenta a perda
de massa dos filmes de policloreto de vinila em porcentagem. Os resultados observados mostraram que
houve a perda de 28% de massa do PVC contido no ensaio de biodegradação. Esse resultado indica que
a perda da massa observada foi decorrente do ftalato presente nos filmes PVC, uma vez que,
FERNANDES e colaboradores (1987) expõem em seu estudo que a faixa de concentração dos
plastificantes utilizada no plástico é de 20 a 40% (m/m), da massa do polímero. Essa perda de massa
pode ser atribuída a biodegradação e a migração do ftalato, uma vez, que pesquisas demostram que a
cadeia polimérica do PVC é homogênea e muito estável. Sendo assim, a transferência e a degradação da
cadeia polimérica do PVC são muito difícil, e a transferência do ftalato mais fácil por não ser ligado
quimicamente a malha polimérica do PVC (ALVES, 2009; BENJAMIN, 2015).
Figura 32. Monitoramento da perda de massa do filme de policloreto de vinila durante os 24 dias do ensaio de biodegradação.
Resultados semelhantes foram apresentados no estudo desenvolvido por KUNICHIKA e
colaboradores (2005), no qual foi cultivada a linhagem NK0301 juntamente com algumas folhas (finas de
0,2 e 0,3 mm de espessura) de cloreto de polivinila contendo cerca de 15% DEHP. Para cada espessura,
três diferentes massas (7, 14, 28 mg) foram testadas, e DEHP foi removida com sucesso a partir de
folhas do PVC em todos os tratamentos. A eficiência do processo foi inversamente relacionada com a
espessura e massa da folha do policloreto de vinila. Foram obtidos valores de 60% e a taxa de
biodegração chegou a 90% após 3 dias usando-se as folhas mais finas.
Observou-se uma porcentagem de perda de massa total de 28% e uma expressiva perda de
massa nos três últimos dias de ensaio, apresentando uma perda superior a 9 vezes em relação a perda
do segundo dia. Esse resultado possivelmente representa a escassez de substrato ideal e a necessidade
dos microrganismos utilizarem o ftalato como única fonte de carbono, a adaptação das bactérias ao
72
novo meio e seleção das bactérias aptas em consumir o ftalato presente nos filmes policloreto de vinila
em seu metabolismo (Figura 32).
Analisando o gráfico da Figura 33, observou-se que a quantidade de colônias a partir do décimo
dia não tiveram grandes variações, indicando que as bactérias selecionadas foram capazes de utilizar o
ftalato disponível no meio, como fonte de energia, uma vez que, não houve morte significativa dos
microrganismos, mas, houve perda da massa do filme em questão.
Analisando-se os resultados pode-se concluir que a bactéria BB1 foi capaz de degradar o ftalato,
fato que foi comprovado por parte da diminuição da massa dos filmes policloreto de vinila em
aproximadamente 28% após 24 dias de biodegradação. O resultado apresentado nesse estudo concorda
com os resultados demonstrados por FERREIRA E MORITA (2012), que avaliaram a biorremediação de
DHP por microrganismos presentes no solo pela adição de inóculo adaptado em reator em fase de lama.
Concluíram que a biodegradação foi eficiente uma vez que os teores iniciais de contaminantes do solo
foram de 18 mg kg-1 e após 120 dias de biorremediação, o teor de DEHP foi de 3 mg kg-1.
Figura 33. Concentração de células viáveis ( ) e a perda de massa do filme de policloreto de vinila ( ) no
decorrer dos 24 dias do ensaio de biodegração.
4.6. Identificação qualitativa de diferentes grupos funcionais obtidos no ensaio de biodegradação e de
migração do ftalato.
O método utilizado baseia-se nas definições de FEIGL. Esse método permite através de conceitos
de especificidade, seletividade e sensibilidade das reações usadas, a caracterização de Grupos
Funcionais. Os ensaios realizados nesse estudo são de natureza cromogênica, ou seja, implicam em
mudança de cor. São ensaios muito simples de serem realizados no laboratório, muito sensíveis, com
limite de identificação da ordem de micrograma e na maioria das vezes são bem específicos.
Numa tentativa de detectar e identificar os compostos obtidos nos processos de migração e
biodegradação foram realizados ensaios químicos de análise funcional, segundo o método de FEIGL.
73
Através desses ensaios espera-se caracterizar no caso da migração, o ftalato e/ou ácido ftálico e ainda o
corresponde álcool, para isso foram testadas as presenças dos grupos funcionais éster, ácido carboxílico
e álcool, respectivamente. A presença de tais compostos, resultantes do processo de migração se deve à
hidrólise do éster promovida pelo meio aquoso mineral empregado nesse ensaio, a ácido ftálico e o
respectivo álcool, segundo o que está descrito na Figura 18 (LOPES, 2011).
No caso da biodegradação, de acordo com a Figura 12, espera-se obter inicialmente o
monoéster, o respectivo álcool e posteriormente o ácido ftálico, produtos da degradação primária. Na
degradação última (aeróbia) esperava-se obter os compostos: ácido 3,4-dihidroxiftalato ou o ácido 4,5-
di-hidroxiftalato até o prototecato. Para a caracterização desses compostos foram feitos ensaios para
detecção do grupo funcional fenol. Na Tabela 8 abaixo estão descritos os ensaios químicos de análise
funcional realizados.
Tabela 8. Relação de ensaios químicos de análise funcional realizados nos ensaios de biodegradação e migração do ftalato.
Grupos funcionais Reações de caracterização
Ácido Carboxílico -(C=O)OH Conversão a Hidroxamato Férrico (cor marrom avermelhado)
Fenol Ar-OH Cloreto Férrico (Cores vermelha, azul, violeta ou verde)
4.6.1. Detecção do ácido carboxílico empregando-se o Teste de conversão a Hidroxamato
Férrico
A função orgânica ácido carboxílico foi detectada qualitativamente realizando-se inicialmente o
teste de Conversão a Hidroxamato Férrico (Tabela 8 e Figura 35).
Observando-se os resultados listados na Tabela 9, verificou-se que nos testes realizados nos
analitos durante a biodegradação foi detectada a função ácido carboxílico, pela presença da coloração
marrom avermelhada (Figura 35 (à direita)) indicando a presença do ácido ftálico a partir do oitavo dia
de reação. Tal resultado pode ser confirmado pela Figura 26, devido ao aumento da concentração dos
íons H+, e diminuição do pH, do meio durante a biodegração do ftalato. A ausência do ácido ftálico nos
primeiros seis dias de ensaio, uma vez que de acordo com a Figura 26, ocorre um aumento da
concentração dos íons H+, não pode ter sido detectada por estar abaixo do limite de detecção do
respectivo teste que é da ordem de microgramas.
No caso das análises feitas nos analitos obtidos no processo de migração, observou-se também
a presença do ácido ftálico, devido aos resultados positivos obtidos para a função ácido carboxílico do
segundo ao vigésimo quarto dia de ensaio. Esse resultado é confirmado pela Figura 34, na qual observou
a diminuição gradativa do pH, principalmente a partir do quarto dia de ensaio. Mais uma vez aqui, o
teste nos dois primeiros dias de estudo, pode não ter dado positivo, devido à concentração do ácido
ftálico estar abaixo do limite de detecção do teste realizado.
74
Tabela 9. Resultados obtidos nos ensaios qualitativos de detecção da função orgânica ácido carboxílico durante os ensaios de migração e de biodegradação do ftalato presente no filme de PVC.
Tempo (dias)
Presença da função ácido carboxílico
Biodegradação Migração
0 Não Não
2 Não Sim
4 Não Sim
6 Não Sim
8 Sim Sim
10 Sim Sim
12 Sim Sim
14 Sim Sim
16 Sim Sim
18 Sim Sim
20 Sim Sim
22 Sim Sim
24 Sim Sim
Figura 35. Fotos ilustrativas dos experimentos realizados para a detecção da presença da função do ácido carboxílico nos ensaios de migração (à esquerda) e nos ensaios de biodegradação (à direita). Nos dois ensaios, esquerda para direita os tubos de ensaio representam os tempos 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 e os dois últimos tubos de ensaio ilustram os resultados negativo e positivo usados para fins comparativos.
4.6.2. Detecção do grupo funcional fenol empregando-se o Teste do Cloreto Férrico
As amostras contendo fenol quando submetidas ao teste com cloreto férrico, formam um
complexo dos fenóis com o íon Fe (III), resultando na coloração azul escuro como demostrado pelos
tubos de ensaios na Figura 36 (à direita). Esse teste foi necessário para comprovar a efetividade do
processo de biodegradação, pois os fenóis são produtos exclusivos da biodegradação aeróbia e sua
presença nos analitos desse ensaio, indicam que podem ter sido obtidos o ácido 3,4-dihidroxiftalato
e/ou o ácido 4,5-dihidroxiftalato ou ainda o protocatecato de acordo com a Figura 13. Os resultados
foram positivos para a presença de fenol a partir do décimo segundo dia de ensaio de biodegradação,
indicando que esse produto depende da formação do ácido ftálico, e dessa forma só pode ser detectado
dias depois da produção do mesmo (Tabela 10). Observando-se a Figura 27 verificou-se uma alteração
na concentração dos íons H+ 1,5. 10-2 para 1,8. 10-2mol/L, indicando um aumento de 20% do sexto para o
75
décimo segundo dia de ensaio de biodegradação. Já do décimo segundo dia ao vigésimo quarto dia,
detectou-se uma variação de 1,8. 10-2 para 3,1. 10-2mol/L, aproximadamente 58% de aumento na
concentração de íons H+ no meio de cultura usado. Tais aumentos coincidem com a formação inicial
exclusiva do ácido ftálico, somente com dois hidrogênios dissociáveis, seguida da formação dos
compostos fenólicos, ácido 3,4-dihidroxiftalato, ácido 4,5-dihidroxiftalato e protocatecato, com 4 e 3
hidrogênios dissociáveis respectivamente. Dessa forma, possivelmente podemos atribuir o aumento de
58% na concentração dos íons H+, ao aumento no número de hidrogênios dissociáveis, provenientes dos
compostos fenólicos formados, indicando a obtenção dos mesmos na biodegradação do ftalato
presente no filme comercial de policloreto de vinila de acordo com a literatura (STAPLES et al., 1997
apud FERREIRA, 2009).
Tabela 10. Resultados obtidos nos ensaios qualitativos de detecção da função orgânica fenol durante os
ensaios de migração e de biodegradação do ftalato presente no filme de PVC.
Tempo (dias)
Presença da função fenol
Biodegradação Migração
0 Não Não
2 Não Não
4 Não Não
6 Não Não
8 Não Não
10 Não Não
12 Sim Não
14 Sim Não
16 Sim Não
18 Sim Não
20 Sim Não
22 Sim Não
24 Sim Não
Figura 36. Fotos ilustrativas dos experimentos realizados para a detecção da presença da função fenol nos ensaios de migração (à esquerda) e nos ensaios de biodegradação (à direita). Nos dois ensaios, da esquerda para direita os tubos de ensaio representam os tempos 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 e os dois últimos tubos de ensaio ilustram os resultados negativo e positivo usados para fins comparativos.
76
5. CONCLUSÕES
_____________________________________________________________________________________
Na bioprospecção realizada no Parque Estadual Serra de Ouro Branco/MG foram isolados 23
diferentes microrganismos de origens distintas (água, solo, folhas e bromélia). Isso demonstra que a
bioprospecção é uma técnica promissora para o isolamento de diferentes espécies de microrganismos.
Os testes de halo de hidrólise realizados demonstraram que os microrganismos BB1, FF2, FF3
foram capazes de produzir esterase. Sendo o microrganismo BB1 o que apresentou o maior halo.
Na determinação da concentração de ácidos presentes no meio estudado, realizada no decorrer
do ensaio de biodegração em meio líquido, verificou-se um aumento na concentração de ácidos de 0,60
para 3,10 ± 0,07 mol/L. Tal resultado é devido provavelmente à biodegradação do di-éster ftálico a
ácido ftálico, sendo a presença desse no meio estudado, a responsável pelo aumento na concentração
dos íons H + no meio.
Observou-se também, no decorrer dos 24 dias de ensaio de biodegradação, uma perda de
massa dos filmes de PVC de aproximadamente 28%. Tal resultado é devido tanto à biodegradação
quanto à migração do ftalato presente no filme de PVC estudado.
A partir do sexto dia do ensaio de biodegradação a quantidade de células viáveis e a
concentração de amônia no meio estudado, não tiveram uma variação significativa indicando que a
sobrevivência das células da BB1 não foi dependente do consumo da amônia presente no meio líquido
usado no ensaio de biogradação (consumo endógeno) e sim do consumo do ftalato presente nos filmes
de PVC, sendo esse a única fonte de carbono disponível.
A partir do ensaio de migração, foi possível observar que a concentração de iós H+ aumentou.
Tais resultados indicam que a dessorção do plastificante ftalato é devida a hidrólise da ligação éster,
provocada pelo meio aquoso, em ácido ftálico e o respectivo álcool, de acordo com a literatura.
Analisando o resultado da identificação qualitativa do grupo funcional, ácido carboxílico, percebe-se que
a sua presença no ensaio de biodegração é decorrente do processo de migração e da biodegradação dos
ftalatos. A detecção de fenol comprova a efetividade do processo de biodegradação, pois os fenóis são
produtos exclusivos da biodegradação aeróbia como mostrado na literatura.
Até o presente momento, a biodegradação do ftalato presente no filme de PVC comercial em
meio líquido pela bactéria estudada (BB1) se mostrou muito promissora quanto à biodegradação desse
tipo de plastificante
77
6. PERSPECTIVAS FUTURAS
____________________________________________________________________________________
Caracterizar quimicamente os analitos dos ensaios de biodegradação visando-se estabelecer a
rota metabólica adotada nesses estudos;
Comparar a rota metabólica encontrada com as rotas metabólicas descritas na literatura para
esse tipo de ensaio de biodegradação;
Determinar a taxonomia do microrganismo BB1;
Realizar a caraterização química, estrutural e morfológica do filme de policloreto de vinila, antes
e depois dos ensaios de biodegradação, através de análises de Espectroscopia na região do
Infravermelho (FTIR), Analise Termogravimétrica (TGA) /Calorimetria Diferencial de Varredura
(DSC) e Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) respectivamente;
Determinar a toxicidade dos metabólitos obtidos no ensaio de biodegradação através de ensaios
de toxicidade com o microcrustáceo Artemia salina.
Estudar detalhadamente a biodegradação do ftalato em meio sólido;
Comparar os resultados obtidos nos ensaios de biodegração em meios sólido e líquido;
Fazer o depósito do microrganismo estudado na Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG),
no Centro de Coleções Taxonômicas (CCT) localizado no Instituto de Ciências Biológicas (ICB).
78
7. REFERÊNCIAS
_____________________________________________________________________________________
ABDEL-DAIE M. M.; Rivera-Utrilla, J.; OCAMPO-PÉREZ, R.; MÉNDEZ-DÍAZ, J. D.; SÁNCHEZ-POLO, M. Environmental impact of phthalic acid esters and their removal from water and sediment by different technologies. Journal of Environmental Management, v.109, p.164– 178, 2012.
ABIPLAST, Associação Brasileira da Indústria do Plástico. http://www.abiplast.org.br. Acesso em 24 de julho de 2015.
ABIQUIM, Associação Brasileira da Industria Química. http://abiquim.org.br/ Acesso em 2 de maio de 2015.Acesso em 10 de outubro de 2014.
ABRANTES, S.M.P. Uso da eletroforese capilar para a determinação da migração química em alimentos em contato com embalagens.Tese (Doutorado em Química Orgânica) – Instituto de Química, Rio de Janeiro, 1998.
AL-SALEH, I.; SHINWARI, N.; ALSABBAHEEN, A. Phthalates residues in plastic bottled Waters. Journal of Toxicological Sciences, v.36, p. 469-478, 2011.
ALVES, S. T. A contaminação de alimentos gordurosos através de migração de plastificantes do tipo DEHA e DEHP do filme de PVC. Trabalho de conclusão de curso (Especialização em Qualidade em Alimentos) - Universidade de Brasília, 2009.
AMANN, R. I.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K-H. Phylogenetic Identification and In Situ Detection of Individual Microbial Cells without Cultivation. Microbiological Reviews, v. 59, p. 143-169, 1995.
AMARAL, L. Química Orgânica. São Paulo: Editora Moderna, 1981.
ANDRADE, J.A.; GRANE, S.W., TALSNESS, C.E.; GROTE, K., GOLOMBIEWSKI, A.; STERNER-KOCK, A.; CHAHOUD, I. A dose response study following in utero and lactational exposure to di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP). Toxicology, v.225, p. 64–74, 2006.
ARICETTI, J.A. “Métodos titulométricos alternativos para a avaliação da qualidade do biodiesel”. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Estadual de Campinas, 2010.
ARTUSO. A. Bioprospecting, Benefit Sharing, and Biotechnological Capacity Building. World Development, v. 30, n. 8, p. 1355-1368, 2002.
AZEVEDO, C. M. A. Bioprospecção: Coleta de Material Biológico com a finalidade de explorar os recursos genéticos. Cadernos da Reserva da Biofera da Mata Atlântica. 2ª ed, caderno 17. São Paulo: Conselho Nacional da Reserva da Biosfera da Mata Atlântica, 2003.
BANEGAS, R. S. Estudos em filmes formados por PVC e agentes plastificantes: estabilidade, morfologia, propriedades térmicas e mecânicas. Dissertação (Mestrado em Química) – Universidade Federal de Santa Catarina, 2011.
BARROS, H. D. Estudo da exposição do consumidor aos plastificantes Ftalato e adipato de di- (2-etil-hexila) adicionados a filmes de PVC, utilizados para acondicionamento de alimentos Gordurosos. Tese (Doutorado em Vigilância Sanitária) - Fundação Oswaldo Cruz, Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, 2010.
BARROS, H.D.; ZAMITH, H.P.S.; BAZÍLIO, F.S.; CARVALHO, L.J.; ABRANTES, S.M.P. Identificação dos alimentos gordurosos com possibilidades de contaminação por plastificantes quando acondicionados em filme de pvc. Ciência e Tecnologia de Alimento, v.31, n.2, p.547-552, 2011.
79
BAZILIO, F.S. Determinação da migração específica dos plastificantes ftalato de di- (2-etil-hezila) e adipato di-(2-etil-hezila) de filmes flexíveis de PVC para alimentos gordurosos: validação de método e controle Sanitário do filme flexível de PVC. Dissertação do Programa de Pós-graduação em Vigilância Sanitária do Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde da Fundação Oswaldo Cruz, 2014.
BENJAMIN, S., PRADEEP, S.; JOSH, M.S., KUMAR, S.; MASAI, E. A monograph on the remediation of hazardous phthalates. Journal of Hazardous Materials; v. 298, p. 58–72, 2015.
BORNSCHEUER, U. T. Microbial carboxyl esterases: classification, properties and application in biocatalysis. FEMS Microbiology Reviews, v. 26, n. 1, p. 73-81, 2002
BRAGA, C. A. de C. Estrutura de comunidade de pequenos mamíferos em áreas afetadas por plantações de milho (Zea mays) e estradas na Serra do Ouro Branco. Dissertação (Mestrado em Ecologia de Biomas Tropicais) - Universidade Federal de Ouro Preto, 2011.
BRASIL. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Detecção e Identificação dos Fungos de Importância Médica. http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/microbiologia/mod_7_2004.pdf. Acesso em 20 de setembro de 2015.
BRASIL. Ministério Da Agricultura, Pecuária E Abastecimento. Segurança alimentar,2006. Disponível em: <www.agricultura.gov.br/segurancaalimentar>. Acesso em 09 agosto de. 2014.
BRASIL. Ministério da saúde. Secretário de Vigilância em Saúde. Vigiloso: Identificação de populações sob risco de exposição e priorização de éreas com populações expostas a solos contaminados, 2005.
BRASIL. Resolução Conama no 420 de 28 de dezembro de 2009. Dispõe sobre critérios e valores orientadores de qualidade do solo quanto à presença de substâncias químicas e estabelece diretrizes para o gerenciamento ambiental de áreas contaminadas por essas substâncias em decorrência de atividades antrópicas. DOU nº 249, de 30/12/2009, p.81-84.
BRASIL. Resolução n° 105 de 19 de maio de 1999. Aprova os regulamentos técnicos e disposições gerais para embalagens e equipamentos plásticos em contato com alimentos. Diário Oficial da República Federativa do Brasil. Brasília, DF, 20 de maio de 1999. Disponível em:<http://portal.anvisa.gov.br/wps/wcm/connect/96d114004d8b6a7baa2debc11623c3b/ALIMENTOS+RESOLU%C3%87%C3%83O+N%C2%BA+105,+DE+19+DE+MAIO+DE+1999.pdf?MOD=AJPERES>. Acesso em 16 de junho.de 2014
BRASKEM. Tecnologia do PVC. São Paulo, p.450, 2006. Disponível em: <http://www.braskem.com.br/Portal/Principal/Arquivos/Download/Upload/Tecnologia_22.pdf>. Acesso em 16 junho 2015.
BRAUN, J.M.; SATHYANARAYANA, S.; HAUSER, R. Phthalate exposure and children’s health. Current opinion in pediatrics, p. 247–254, 2013.
BRISTON, J.H.; KATAN, L. Plastics in contact with food. Trade Press, p.71, 1974.
BROWN, D.; THOMPSON, R.S; STEWART, K.M.; CROUDACE, C.P.; EDWARD, G. The effect of phthalate ester plasticisers on the emergence of the midge (Chironomus riparius) from treated sediments. Chemosphere, v.32, p. 2177-2187, 1996.
CABRAL, A.C.D. & FERNANDES, M.H.C. Aspectos gerais sobre a vida de prateleira de produtos alimentícios. Boletim do Instituto de Tecnologia de Alimentos. v. 17, n. 4, p 371-439, 1980.
CACHO, J.I.; CAMPILLO, N.; VINAS, P.; CÓRDOBA, H.M. Direct sample introduction gas chromatography and mass spectrometry for the determination of phthalate esters in cleaning products. Science Direct Journal of Chromatography, p. 156-161, 2015.
80
CARISSIMI, M.; STOPIGLIA, C. D. O.; SOUZA, T. F.; CORBELLINI, V. A.; SCROFERNEKER, M. L. Comparison of lipolytic activity of Sporothrix schenckii strains utilizing olive oil-rhodamine B and tween 80. Tecnológica, v. 11, p. 33-36, 2007.
CAVETT, J. J.; WOODROW, M. N. A rapid method for determining degradation of plasticized PVC by micro-organisms. In Biodeterioratwn of Materials. Eds A. H, 1968.
CHANG, B. V.; LIAO, C. S.; YUAN, S. Y. Anaerobic degradation of diethyl phthalate, di-n-butylphthalate, and di-(2-ethylhexyl) phthalate from river sediment in Taiwan. Chemosphere, v.58, p.1601– 1607, 2005.
CHANG, B.V.; YANG, C.M.; CHENG, C.H.; YUAN, S.Y. Biodegradation of phthalate esters by two bacteria strains. Chemosphere, v. 55, p. 533–538, 2004.
CHANG, H.; ORIEL, P. Bioproduction of Perillyl Alcohol and Related Monoterpenes by Isolates of Bacillus stearothermophilus. Journal of Food Science, v. 59, n.3, p. 660–662, 1994.
CHATTERJEE, S.; DUTTA, T.K. Metabolismo f butyl benzyl phthalate by Gordonia sp strain MTCC 4818.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v.309, p.36-43,2003.
CHEN, C.Y.; ANIL, V.G.; WEN, Y.C.; CHIUNG, C.W.; YI SHIN, C.; YONG, C.L. Rapid identification of phthalates in blood bags and food packaging using ToF-SIMS. Applied Surface Science. v. 231/232, p. 447-451, 2004.
CHEN, X.; XU,S.; TAN T.; LEE ,S.T.; CHENG, S.H.; LEE, F.W.F., Xu, S.J.L.; Ho, K.C. Toxicity and estrogenic endocrine disrupting activity of phthalates and their mixtures.International Journal of Environmental Research Public Health, v.11, p. 3156–3168, 2014.
CLAUDIO, C.N. Análise orgânica: métodos e procedimentos para caracterização de organoquímicos. Rio de Janeiro, v.1, URFJ, 2004.
COLTRO, L.; PITTA, J. B.; MADALENO, E. Performance evaluation of new plasticizers for stretch PVC films. Polymer Testing, v. 32, n. 2, p. 272-278, 2013.
DARGNAT, C., TEIL, M.J.; CHEVREUIL, M.; BLANCHARD, M. Phthalate removal throughout wastewater treatment plant: case study of Marne Aval station (France). Science of the Total Environment, v. 407, p. 1235–1244, 2009.
DINIZ, PATRÍCIA FABIAN DE ARAÚJO; LUIZ EDSON MOTA DE OLIVEIRA; NOELLY ALVES LOPES, LIGIANE APARECIDA FLORENTINO,; TEOTONIO SOARES DE CARVALHO; FATIMA MARIA DE SOUZA MOREIRA. Bactérias diazotróficas em solos sob siringeiras. Revista Brasileira de Ciências do Solo, v. 36, p.1426-1433, 2012.
DI GENNARO, P.; COLLINA, E.; FRANZETTI, A.; LASAGNI, M.´; LURIDIANA, A., PITEA, D., BESTETTI, G. Bioremediation of diethylhexyl phthalate contaminated soil: a feasibility study in slurry-and solid-phase reactors. Environomental Science Technology, v.39, p. 325–330, 2005.
DRUMMOND, G. M., C. S. MARTINS, A. B. M.; MACHADO, F.A. Biodiversidade de Minas Gerais, um atlas para sua conservação. Fundação Biodiversitas, Belo Horizonte, p.222, 2005.
EJLERTSSON, J.; MEYERSON, M.; SVENSSON, B.H. Anaerobic degradation of phthalic acid esters during digestion of municipal solid waste under landfilling conditions. Biodegradation, v.7, p. 345–352, 1996.
ENDO, K, Synthesis and structure of poly (vinyl chloride). Science Direct, p. 2021–2054, 2002.
ENGEL, R.G.; KRIZ, G.S.; LAMPMAN, M.G.; PAVI, D.F. Química orgânica experimental: técnicas em escala pequena. 3ª ed.Cenage Learning, São Paulo, 2012.
81
FAO-Food and Agriculture Organization of the United Nations. Assessing soil contamination. A reference manual. Roma: FAO, 2000. Disponível em: <http// :www.fao.org/docrep/003/X2570E00.htm>. Acesso em: 30 de outobro.de 2015.
FARAHAN, H.;NOROUZI, P.;DINARVAND, R.; GANJALI,M.Z. Development of dispersive liquid–liquid microextraction combined with gas chromatography–mass spectrometry as a simple, rapid and highly sensitive method for the determination of phthalate esters in water samples. A.v.1172, p.105–112, 2007.
FELIX, F.F.; NAVICKIENE, S.; DÓREA, H.S.Poluentes Orgânicos Persistentes (POPs) como Indicadores da Qualidade dos Solos. Revista da Fapese, v.3, n. 2, p. 39-62, 2007.
FERNANDES, M.H.C.; GARCIA, E.E.C.; PADULA, M. Migração de Componentes de Embalagens Plásticas para Alimentos. Instituto de Tecnologia de Alimentos, p.153,1987.
FERREIRA, D.I. Biorremediação de solo tropical contaminado com resíduos da produção de plastificantes. Dissertação do Programa de Pós-graduação em Hidráulica e Ambiental da Universidade de São Paulo, 2009.
FERREIRA, I. D.; MORITA, D. M. Biorremediação de solo contaminado por isobutanol, Bis-2-etil-hexilftalato e Di-isodecilftalato. Revista Brasileira Ciência do Solo, v.36, p. 643-652, 2012. ISSN 0100-0683. http://dx.doi.org/10.1590/S0100-06832012000200033. Acesso em 10 de novembro de 2012.
FRANCHETTI, S. M. A; MARCONATO J. C. Polímeros Biodegradáveis- Uma solução parcial para diminuir a quantidade dos resíduos plásticos. Química Nova, v. 29, p. 811-816, 2006
FROMME, H.; KUCHLERB, T.; OTTOC, T.; PILZA, K., MULLERB, J.M.; WENZEL, A. Occurrence of phthalates and bisphenol A and F in the environment, Water Research, v.36, p.1429–1438, 2002.
FUENTEFRIA, A.M.; VALENTE, P. Screeening of enzyme-producing yeast and yeastlike fungi from the phylloplane of Hibiscus rosa-sinensis in Brazil. Revista Tecno-Lógica, n.9, p. 9-24, 2004
GASCON, M., VALVI, D., FORNS, J.; CASAS, M.; MARTÍNEZ, D.´; JÚLVEZ, J.; MONFORT, N.; VETURA, R.; SUNYER, J.; VRIJHEID, M. Prenatal exposure to phthalates and neuropsychological development during childhood. International Journal of Hygiene and Environmental Health, v.218. p.550-558, 2015.
GAVALA, H.N., YENAL, U., AHRING, B.K. Thermal and enzymatic pretreatment of sludge containing phthalate esters prior to mesophilic anaerobic digestion. Biotechnology and Bioengineering, v.85. n.5, p.561–567, 2004.
GILBERT, S.G. Low molecular weight components os polymers used in packaging. Environmental Health Perspectives, v. 11, p. 47-52, 1980.
GLOGAUER, A. Isolamento de clones com atividade lipolítica do metagenoma de solo contaminado com gordura animal e caracterização de uma nova e eficiente lipase. Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências – Bioquímica, Universidade Federal do Paraná,2011
GOMEZ, H.A.; CABALOS, A.M.P.Social and economic interest in the control of phthalic acid esters .Trends in Analytical Chemistry, v.. 22, n. 11, 2003.
GOMIDE, F. T. F. Otimização de produção, purificação e caracterização parcial de lipases produzidas pela levedura Moniliellaspathulata R25L270. Dissertação (Mestrado em Ciências) – Universidade Federal de Minas Gerais, 2012.
GOPINATH, S. C. B.; ANBU, P.; HILDA, A. Extracellular enzymatic activity profiles in fungi isolated from oil-rich environments. Mycoscience. v. 46, v. 2, p. 119–126, 2005.
82
GREENHOU, E. J. AL-MUDARRIS, B.F. The indicator electrodes for the non-aqueous potentiometric titration of week acids Talanta, 22, p. 417, 1975.
GREENHOU, E.J.; “Catalytic thermometric titrimetry”, Chemical Reviews, p. 835., 1977.
GRISA, Ana M. C.; CARDOSO, V.; ZOPPAS, B.C.D.A; BRANDALISE, R.N., ZENI, M. Degradação biológica do PVC em aterro sanitário e avaliação microbiológica. Polímeros, São Carlos , v. 21, n. 3, 2011.
HANKIN, L; ANAGNOSTAKIS, S.L. The use of solid media for detection of enzyme production by fungi. Mycologia, v. 67, p. 597-607, 1975.
HERMANN, F.; KUCHLERB T.; OTTOC, T.; PILZC, K.; MULLERB, J.; WENZELB, A. Occurrence of phthalates and bisphenol A and F in the environment. Water Research, v.36 p.1429–1438, 2002.
HUBBELL, D.H.; MORALES, V.M.; UMALLI-GARCIA, M. Pectolytic Enzymes in Rhizobium. Applied and Environmental. Microbiology, v. 35, n. 1, p. 210-213, 1978.
IEF – Instituto Estadual de Florestas. Parque Estadual Serra do Ouro Branco. Disponível em: http://www.ief.mg.gov.br/component/content/article/1411. Acesso em 31 de março de 2014.
INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz:Métodos químicos e físicos para análise de alimentos, 3. ed. São Paulo: IMESP, v.1,. p. 27,1985
INSTITUTO DO PVC. Consumo aparente das resinas de PVC. 2010. Disponível em: <http://www.institutodopvc.org/publico/?a=conteudoecanal_id=65esubcanal_id=66>.Acesso em 13 junho. 2015
INSTITUTO NACIONAL DE CONTROLE DE QUALIDADE EM SAÚDE, FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ (INCQS/FIOCRUZ). POP nº 65.3120.064: determinação do teor de adipato e fatalato de di-(2-etil-hexila) em filme flexível de PVC. Revisão 04, seção 10. Ministério da Saúde, Rio de Janeiro, 2004
IUPAC, International Union of Pure ad Applied Chemistry. http://www.iupac.org/. Acesso em 15 de maio de 2015.
JACOBI, C. M.; CARMO, F. do C. Diversidade dos campos rupestres ferruginosos no Quadrilátero Ferrífero, MG. Megadiversidade, v. 4, n. 1-2,2008.
JIANLONG, W.; LIU, ping, Yi, Q. Biodegradation of phthalic acid esters by immobilized microbial cells. Environment International, v. 23, p. 775-782, 1997.
JOHNSON, B.T; M.A. HEITKAMP, M.A.; JONES, J.R. Environmental and chemical factors influencing the biodegradation of phthalic acid esters in fresh-water sediments. Environmeental Pollution Series B, Chemical and Physical, v.8,p. 101–118, 1984.
JONSSON, S.; EJLERTSSON, J.; SVENSSONvensson, B.H. Transformation of phthalates in young landfill cells. Waste Manage., v.23, p. 641–651, 2003.
JONSSONA, S.; EJLERTSSONA, J.; LEDINB, A.; MERSIOWSKYC, I.;.SVENSSONA, B.H. Mono-and diesters from o-phthalic acid in leachates from different European landfills. Water Research, v.37, p.609–617, 2003.
JOSH S. M.K., PRADEEP, S., AMMA, V.K.S, BALACHANDRAN, S. Abdul, J.U.C, Doble, M., SPENER,F.;BENJAMIN, S. Phthalates efficiently bind to human peroxisome proliferator activated receptorand retinoid X receptor α, β, γ subtypes: an in silico approach. Journal of Applied Toxicology, v.34, p. 754–765, 2014.
83
JOURNAL OF BIOSCIENCE AND BIOENGINEERING, The Society for Biotechnology,v. 99, n. 2, p.115–119, 2005.
JUNESON, C.; WARD, O.P.; SINGH, A. Biodegradation of bis(2-ethylhexyl)phthalate in a soil slurry-sequencing batch reactor. Process Biochemistry, v. 37, p. 305-313, 2001.
KEITH, L. H. Environmental endocrine disruptors. Pure Applied Chemistry, v. 70, p. 2319-2326, 1998.
KLUWE, W.M. Overview of Phthalate Ester Pharmacokinetics in Mammalian Species. Environmental Health Perspectives, v. 45, p. 3-10, 1982.
KOLENA, B.; PETROVICOCA, I.; PILKA, T.; PUCHEROVA, Z.; MUNK, M.; MATULA, B.; VANKOVA, V.; PETLUS, P.; JENISOVA, Z.; ROZOVA, Z.; WIMMEROVA, S.; TRNOVEC, T. Phthalate exposure and health-related outcomes in specific types of work.International Journal of Environmental Research Public Health, v.11, pp. 5628–5639, 2014.
KOSKINEN,P.E.P; LAY C.H. Lay, S.R. Beck, K.E. TOLVANEN, A.H. Koksonen, ORLYGSSON, J.; LIN, C.Y.; PUHAKKA, J.A.Bioprospecting thermophilic microorganisms from Icelandic hot springs for hydrogen and ethanol production. Energy e Fuels, v.22 , p. 134–140, 2008.
KUNICHIKA, N.,SYUNJI, H.,HIROYASU, I., JOHN, S. E.,AKIO, Y., MASATOSHI, M. Microbial Treatment of Bis (2-Ethylhexyl) Phthalate in Polyvinyl Chloride with Isolated Bacteria. Journal of Biocience and Bioengineering, v. 99, No. 2, p. 115–119, 2005.
LAMBRECHTS, C.; ESCUDERO, J.; GALZY, P. Purification and properties of three esterases from Brevibacteriumsp. R 312. Journal of Applied Bacteriology, v. 78, p. 180 - 188, 1995.
LEALEM, F.; GASHE, B. A. Amylase production by a gram-positive bacterium isolated from fermenting tef (Eraglostis tef). Journal of Applied Bacteriology, v. 77, n. 3, p. 348352. 1994.
LEHNINGER, A. Fundamentos de Bioquímica. São Paulo: SARVIER, 1977.
LEITE, F.S.F.; JUNCA, F.A.; ETEROVICK, P.C. Status do conhecimento, endemismo e conservação de anfíbios anuros da Cadeia do Espinhaço, Brasil. Megadiversidade, v. 4, n. 1-2, p. 158-176, 2008.
LIN, Z.P., IKONOMOU, M.G., JING, H., MACKINTOSH, C.; GOBAS, F.A. Determination of phthalate ester congeners and mixtures by LC/ESI-MS in sediments and biota of an urbanized marine inlet. Environomental Science Technology, v. 37, p. 2100–2108, 2003.
LOPES, D. B.; FRAGA, L. P.; FLEURI, L. F.; MACEDO, G. A. Lipase and esterase: to what extent can this classification be applied accurately .Ciência Tecnologia de Alimentos. vol. 31, n.3, p. 603-613, 2011.
LOUREIRO, I. R. A importância e ocorrência de ftalatos em água potável e no ecossistema da Baía de Guanabara. Tese (Doutorado em Química Analítica) – Departamento de Química do Centro Técnico e Cientifico da PUC-Rio, 2002.
LOURENÇO, A.C.S.Influência de diferentes veículos oleosos na toxicidade reprodutiva do di-butil ftalato (DBP). Tese (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Paraná, 2011.
MADALENO, E. Formulação de pvc biodegradável com adição de plastificante e amido de origem vegetal. Dissertação (Mestrado em Engenharia e Ciência dos Materiais), Universidade São Carlos, 2013
MADALENO, E., ROSA, D.S.; ZAWADZKI, S.F.; PEDROZO, T.H.; RAMOS, L.P. Estudo do uso de plastificantes de fontes renovável em composições de pvc.Polímeros, v.19, n.4, p. 263-270, 2009.
MALA, J. G.; TAKEUCHI, S. Understanding structural features of microbial lipases-an overview. Journal of Analytical Chemistry Insights, v. 3, p. 9-19, 2008.
84
MARCIELLE S. S. Atividade enzimática extracelular de leveduras isoladas da fermentação do cacau. Dissertação do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia da Universidade Estadual de Feira de Santana, 2011.
MARCILLA, A.; GARCÍA, S.; GARCÍA-QUESADA, J.C. Study of the migration of pvc plasticizers. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, v. 71, p. 457-463,2004.
MIPDOVNIK, A.; EDWARDS, A.; BELLINGER, D.C.,HAUSER,R.Developmental neurotoxicity of ortho-phthalate diesters: review of human and experimental evidence. Neurotoxicology,p. 112–122, 2014.
MONTEIRO, V.N.; SILVA, R.N. Aplicações industriais da biotecnologia enzimática. Revista Processos Químicos, v. 3, n. 5, p. 9-22, 2009.
MORAIS, M. J. F; YOSHIMOTO, M.; RHODEN.; PAMPHILE, J. A. Bioprospecting of microoganisms producing bioactive compounds with antitumoral activity. Revista UNINGÁ Review, v.17,n.1,p.27-34, 2014.
MORRISON, R.; BOYD, R. Química Orgânica. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian, 13 ed, 1996.
MUCELIN, C. A.; BELLINI, M. Lixo e impactos ambientais perceptíveis no ecossistema urbano. Sociedade e Natureza, v. 20, n.1, p. 111-124, 2008.
NAKAMIYA, K.; HASHIMOTO, S.; ITO,H.; EDMONDS, J.S.;YASUHARA , A.; MORITA, M. Microbial Treatment of Bis (2-Ethylhexyl) Phthalate in Polyvinyl Chloride with Isolated Bacteria. Journal of Bioscience and Bioengineering, v.99, p.115–119, 2005.
NARDINI, M.; DIJKSTRA, B.W. α/β Hydrolase fold enzymes: the Family keeps growing. Currentopinion in structural biology, v. 9, n. 6, p. 732-737, 1999.
NASCIMENTO, M; ORTIZ-MARQUEZ, J.C.F.; SANCHEZ-RIZZA, L.;, M.M. ECHARTE, M.M.; CURATTI,L.Bioprospecting for fast growing and biomass characterization of oleaginous microalgae from South-Eastern Buenos Aires, Argentina.Bioresource Technology.,v.125 , pp. 283–290, 2012.
NET, S.; DUMOULIN, D.; EL-OSMANI, R.; RABODONIRINA, S.; OUDDANE, B.Case study of PAHs, Me-PAHs, PCBs, phthalates and pesticides contamination in the Somme River water, France. International Journal of Environmental Research.,v.8, p. 1159–1170, 2014.
NET, S.; SEMPÉRÉ, R.; DELMONT, A.; PALUSELLI,A.; OUDDANE, B. Occurrence, Fate, Behavior and Ecotoxicological State of Phthalates in Different Environmental Matrices. Environmental. Science. Technology, v.49, p 4019–403, 2015.
NIAZI, H.J.; PRASAD, T.D; KAREGOUDAR, T.B. Initial degradation of dimethylphthalate by esterases from
Bacillus species. FEMS Microbiology Letters, p.201-205, 2001.
OKAMOTO, Y.; HAYASHI, T.; TODA, C.; UEDA, K.; HASHIZUME, K.; ITOH, K.; NISHIKAWA, J.; NISHIHARA, T.; KOJIMA, N. Formation of estrogenic products from environmental phthalate esters under light exposure.Chemosphere, v. 64, p.1785– 1792, 2006.
OLIVEIRA, M.O.; SETTE L.D. GARBOGGINI, F.F. Preservação e Prospecção de Recursos Microbianos. Multiciências, 2006.
ORECCHIO, S.; INDELICATO, R.; BARRECA,, S. Determination of selected phthalates by gas chromatography–mass spectrometry in mural paintings from Palermo (Italy). Microchemical Journal, v. 114, p.187– 191, 2014.
85
OTTON, S. V.; SURA, S.; BLAIR, J.; IKONOMOU, M. G.; GOBAS, F. A. P. C.Biodegradation of mono-alkyl phthalate esters in natural sediments. Chemosphere , v.71, p.2011– 2016. 2008.
PAGANETTO, G.O.; CAMPI, F.;VARANI K. Endocrine-disrupting agents on healthy human tissues. Pharmacology Toxicolology, v-26, p. 24-29, 2000.
PANNA-PESTICIDE ACTION NETWORK NORTH AMERICA. Physical Properties of Pesticides, 2006. Disponível em: <http://www.pesticideinfo.org/Docs/ ref_waterair1.html> Acesso em: 30 de outubro de 2015.
PEDROZO, T. H. Ésteres etílicos epoxidadosdo óleo de milho como plastificante alternativo para o pvc. Dissertação do Programa de Pós Graduação em Química, Universidade Federal do Paraná, 2009.
PINTO, L. C. L. Etnozoologia e conservação da biodiversidade em comunidades rurais da Serra do Ouro Branco, Minas Gerais. Dissertação (Mestrado em Ecologia de Biomas Tropicais) – Universidade Federal de Ouro Preto , 2011.
PSILLAKIS, E.; MANTZAVINOS, D.; KALOGERAKIS, N. Monitoring the sonochemical degradation of phthalate esters in water using solid-phase microextraction. Chemosphere, v.54, p. 849-857, 2004.
RAPINI, A.; RIBEIRO, P.L.; LAMBERT, S.; PIRANI, J.R. A flora dos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço. Megadiversidade, v.4, n.1-2, p. 16- 24, 2008.
REGITANO JB. Propriedades físico-químicas dos defensivos e seu destino no ambiente. SIMPÓSIO SOBRE DINÂMICA DE DEFENSIVOS AGRÍCOLAS NO SOLO, p.40-50, 2002.
RETO, A.D.S. Acusações de toxicidade caem no vazio e ftalatos dominam o mercado mundial. Revista Plástico,n. 395, 2007. Disponível em:<http://www.plastico.com.br/revista/pm357/plastificantes1.htm>. Acesso em 24 setembro de. 2014.
RODOLFO, A.; NUNES, L. R.; ORMANJI, W. Tecnologia do pvc. São Paulo,Braskem, 18ª Ed., 2006.
RODOLFO, A.JR.; JOHN, V. M. Desenvolvimento de pvc reforçado com resíduos de Pinus para substituir madeira convencional em diversas aplicações.Polímeros, v.16, n.1, p. 1-11,2006.
RODOLFO, A.JR.; MEI, L.H. I.Nanocompósitos de pvc com argila organicamente modificada: efeitos do processamento e do método de incorporação da argila. Polímeros,vol.19,n.1,p.1-9,2009. http://dx.doi.org/10.1590/S0104-14282009000100006. Acesso em 20 de junho de 2015.
ROGERS, H. R. Sources, behaviour and fate of organic contaminants during sewage treatment e in sewage sludges. Science Total Environmental, v. 185 p. 3-26, 1996.
SABORN, M.; WAN, S.K.; BULARD, R. Microwave sterilization of plastic tissue culture vessels for reuse. Applied. Enviromental Microbiology, v. 44, n.4, p.960-964, 1982. SAID, S.; PIETRO, C.L.R. Generalidades sobre aplicação industrial de enzimas. Enzimas como agentes biotecnológicos. Legis Summa,.p 1-7, 2004.
SANTOS, E.S.; INNECCO, B.R.; CRAPEZ, M. A. C. Matéria orgânica particulada e atividade bacteriana nos sedimentos superficiais da Baía de Guanabara, no Rio de Janeiro, Brasil. Sociedade Brasileira de Geologia, v.42, p.411-422,2012.
SAYALI, K.; SADICHHA, P.; SUREKHA, S.Microbial Esterases: An overview. International Journal of Current Microbiology na Applied Sciences, v.2, n.7,p. 135-146, 2013.
SCAPIN, V. O. Avaliação da Contaminação por Elementos Inorgânicos e Ésteres Ftálicos em Poeira Doméstica da Região Metropolitana de São Paulo. Dissertação (Doutorado em Ciências na Área de
86
Tecnologia Nuclear e Materiais) Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, Autarquia Associada à Universidade de São Paulo, 2009.
SCRIBAN, R. Biotecnologia: Manole, 1985.
SHARPE, A. N. e WOODROW, M. N. A Rapid Test for Biodegradability of pvc Film by Pseudomonads. Journal of Applied Bacteriology, v.34, p 485–489, 1971
SHCHIPUNOV, YURY. "Bionanocomposites: green sustainable materials for the near future.Pure and Applied Chemistry, v. 84, p.2579-2607, 2012. http://pac.iupac.org/publications/pac/pdf/2012/pdf/8412x2579.pdf. Acesso em 17 de julho de 2014.
SILBAR,E. C.; CICMANEC, J.F.; BURKE, B.M.; BRACKEN, R.B. Microwave sterilization: a method for home sterilization of urinay catheters. Journal of Urology, v. 141, p.88-90, 1990. SKORONSKI, E. Universidade Federal de Santa Catarina. Estudo Cinético da Síntese do Octanoato de n-Pentila Catalisada pela Enzima Lipozyme. (Mestrado) Florianópolis, 2006.
SOLOMONS, G.; FRYHLE, C. Química Orgânica. Rio de Janeiro, v.2, 2002.
SOUZA A. Q. L.; SOUZA A.D.L.; ASTOLFI, S.; BELÉM, M.L.P.; SARQUIS M.I.M.; PEREIRA, J.O. Atividade antimicrobiana de fungos endofíticos isolados de plantas tóxicas da Amazônia: Palicourea longiflora (aubl.) rich e Strychnos cogens bentham. Acta Amazônica; v.34, p.185-95. 2004.
SOUZA, R. R.; MARTINS E.A J.; Martins; OTOMO, J.I.; FURUSAWA, H.A.; PIRES, M.A.F.Determinação de plastificantes em água potável utilizando cromatografia gasosa e espectrometria de massas. Química Nova, v. 35, p. 1453-1458, 2012.
STALEY, J. Microbial Diversity and the Biosphere, 1998. www.bdt.org.br/oea/sib/staley. Acesso em janeiro de 2015.
STAPLES, C. A.; PETERSON, D. R.; PARKERTON, T. F.; ADAMS, W.J.The environmental fate of phthalates esters: A literature review Chemosphere, v.35, p.667-749, 1997.
SYNNES, M. Bioprospecting of organisms from the deep sea: scientific and environmental aspects lean Techn Environ Policy. Springer, v.9, p. 53-59, 2007.
TANAKA, T. Reproductive and neurobehavioural toxicity study of bis(2-ethylhexyl) phathalate (DEHP) administered to mice in the diet. Food and Chemical Toxicology, v. 40,p. 1499-1506, 2002.
TEGATZ, M. E.; PLAIA, G. R.; DEANS, C. H.Toxicity of dibutyl phthalate-contaminated sediment of laboratory-and field-colonized estuarine benthic communities. Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology, v.37,p.141- 150, 1986.
TEIXEIRA, A.S.; CHAVES, L., YUYAMA, K. Esterases no exame da estrutura populacional de Camu-camu (Myrciaria dúbia (Kunth) McVaugh-Myrtaceae).Acta amozonica, v.34, p.75-88, 2004 http://dx.doi.org/10.1590/S0044-59672004000100011. Acesso em 27 de setembro de 20015.
UNITED STATES ENVIRONMETAL PROTECTION AGENCY (EPA). Water: contaminants of emerging concern. 2012. Disponível em: Acesso em 3 de setembro de 2014.
VAN WEZEL, A .P.; VAM VLAARDINGEN, P. POSTHUMUS,R. CROMMENTUIJN, G.H., SIJM, D.T. Environmental risk limits for two phthalates, wiyh special emphasis on endocrine disruptive properties. Ecotoxicology and Environmental Safety, v. 46, p. 304-321, 2000.
VETHAK, A. D.; RIJS, G. B. J.; SCHRAP,, S. M.; RUITER, H.; GERRTSEN, A.; LAHR, J. Oestrogens and Xeno-Estrogens in the Aquatic Environment of the Netherlands, Occurrence, potency and biological effects. Rijkswaterstaat, 2002.
87
VINHAS, G. M.; SOUTO-MAIOR, R.M.; LAPA, C.M; ALMEIDA, Y.M.B . Degradation studies on plasticized pvc films submited to gamma radiation. Materials Research, v. 6, p. 497-500, 2003.
WANG, J.; BO, L.; LI, L.; WANG, D.; CHEN, G.; CHRISTIE, P.; TENG, Y. Occurrence of phthalate esters in river sediments in areas with different land use patterns. Science of the Total Environment, p.113–119, 2014.
XU, G.; LI, F. S.; WANG, Q. H.Occurrence and degradation characteristics of dibutyl phthalate (DBP) and di-(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP) in typical agricultural soils of Chin. Science of The Total Environment, v.393, p.333- 340, 2008.
YUAN, B.; LI, X.; GRAHAM, N. Aqueous oxidation of dimethyl phthalate in a Fe(VI)/TiO2/UV reaction system. Water Research, v. 42, p. 1413- 1420, 2008.
YUAN, S. Y.; LIU, C.; LIAO, C. S.; CHANG, B. V. Occurrence and microbial degradation of phthalate esters in Taiwan river sediments.Chemosphere, v.49, p.1295-1299, 2002.
YUAN, S.Y.; HUANG, I.C.; CHANG, B.V. Biodegradation of dibutyl phthalate and di-(2-ethylhexyl) phthalate and microbial community changes in mangrove sediment. JOURNAL OF HAZARDOUS MATERIALS,v. 184, p. 826– 831, 2010.
ZAIONCZ, S. Estudo do efeito da plastificação interna do pvc quimicamente modificado. Dissertação Mestrado em Química (Curso de Pós-Graduação em Química - Área de Concentração Química Orgânica), Universidade Federal do Paraná, 2004.
ZENG,F.; CUI,K., LI,X.; FU, J.; SHENG, G. Biodegradation kinetes of phthalate ester by Pseudomonas fluoresences FS1. Process Biochemistry, v.39, p.1125-1129, 2002.