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UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
DOUTORADO EM ODONTOLOGIA
Estudo da Imunomarcação da Interleucina-10 (IL-10) no
Periodonto de Ratos submetidos à Movimentação
Ortodôntica e Laserterapia de Baixa Intensidade
MARCELO DE GOUVEIA SAHAD
Orientador: Prof. Dr. Lúcio Frigo
Tese apresentada ao Doutorado em Odontologia, da Universidade Cruzeiro do Sul, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Odontologia.
SÃO PAULO
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL DA
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
S138e
Sahad, Marcelo de Gouveia.
Estudo da imunomarcação da interleucina-10 (IL-10) no periodonto de ratos submetidos a movimentação ortodôntica e laserterapia de baixa intensidade / Marcelo de Gouveia Sahad. -- São Paulo; SP: [s.n], 2014.
101 p. : il. ; 30 cm. Orientador: Lúcio Frigo. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em
Odontologia, Universidade Cruzeiro do Sul. 1. Movimentação dentária 2. Ortodontia 3. Terapia a laser de
baixa intensidade 4. Interleucina-10 (IL-10). I. Frigo, Lúcio. II. Universidade Cruzeiro do Sul. Programa de Pós-Graduação em Odontologia. III. Título.
CDU: 616.314-089.23(043.2)
UNIVERSIDADE CRUZEIRO DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
Estudo da imunomarcação da interleucina-10 (IL-10) no
periodonto de ratos submetidos à movimentação
ortodôntica e laserterapia de baixa intensidade
Marcelo de Gouveia Sahad
Tese de doutorado defendida e aprovada
pela Banca Examinadora em 09/05/2014.
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr°. Lúcio Frigo
Universidade Cruzeiro do Sul
Presidente
Prof. Dr°. Maurício Teixeira Duarte
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr°. Pedro Antonio Fernandes
Universidade Cruzeiro do Sul
Prof. Dr°. José Cássio de Almeida Magalhães
Universidade Camilo Castelo Branco
Prof. Dr°. Artênio José Isper Garbin
UNESP - Araçatuba
DEDICATÓRIA
À Deus por ter me dado tudo o que tenho e sempre
me guiar em minha jornada para me tornar quem
hoje sou.
Aos meus queridos e amados pais, Moysés Elias
Sahad (in memorian) e Dulce Regina de Almeida
Gouveia Sahad, pelos ensinamentos e,
principalmente, pelo exemplo maravilhoso de vida e
amor, herança que tenho orgulho e agradeço a
Deus todos os dias por ter me dado o privilégio de
receber.
“A NEVE E A TEMPESTADE MATAM AS FLORES, MAS NADA PODEM
CONTRA AS SEMENTES.”
Khalil Gibran
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
À minha amada esposa Suzana Bellani Sahad, por
todo amor, carinho, apoio e compreensão todos
esses anos, sempre ao meu lado.
Aos meus queridos irmãos Claudio Cesar de
Gouveia Sahad e Carlos Roberto de Gouveia Sahad
pela amizade, dedicação e amor incondicional.
À todos os meus familiares que com suas
maravilhosas histórias de vida, sempre me
motivaram e inspiraram a me tornar um homem
melhor em todos os sentidos.
“PROCURE SER UMA PESSOA DE VALOR, EM VEZ DE PROCURAR SER
UMA PESSOA DE SUCESSO. O SUCESSO É CONSEQUÊNCIA.”
Albert Einstein
AGRADECIMENTOS
Aos nossos Mestres que, mais do que dividir conosco o seu saber, souberam ser nossos companheiros, emocionando-se com nossas vitórias e nos suportando em nossas pelejas diárias na busca pelo saber. O meu muito obrigado àqueles que, quando tinham a obrigação de apenas lecionar, foram amigos, e, através dessa amizade, nos deram sua compreensão, orientação e incentivo para seguir nosso caminho. Recebam minha admiração, reconhecimento e os meus mais sinceros agradecimentos.
Ao Prof. Dr. Lúcio Frigo, orientador deste trabalho, pelos conhecimentos transmitidos, incentivo, apoio e pela amizade demonstrada.
Ao Prof. Dr. Eduardo Guedes-Pinto (in memorian), grande mestre, amigo e incentivador, com quem tive o orgulho de compartilhar momentos muito especiais.
À Profª. Joseli Maria Cordeiro Daniele pela amizade, orientações e inestimável apoio, além dos conhecimentos transmitidos durante a realização deste trabalho.
Ao meu colega e amigo Prof. Dr. Francisco Antônio Delgado Grieco pelo companheirismo e apoio em muitos momentos especiais da minha vida.
Aos meus caros colegas professores e alunos do curso de pós-graduação em Ortodontia e Ortopedia Facial da Universidade Cruzeiro do Sul pela amizade, dedicação e profissionalismo sempre demonstrados.
Aos Técnicos do Laboratório de Imuno-histoquímica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), muito bem representados por Ângela Santos, na realização dos procedimentos laboratoriais.
À minha querida amiga e cunhada Raquel Bellani, pela inestimável colaboração e dedicação, muito me ajudando na confecção deste trabalho.
“A MENTE QUE SE ABRE A UMA NOVA IDEIA JAMAIS VOLTARÁ AO SEU
TAMANHO ORIGINAL. ”
Albert Einstein
Aos meus queridos AMIGOS:
“Tenho amigos que não sabem o quanto são meus amigos. Não percebem o amor que lhes devoto e a absoluta necessidade que tenho deles.
A amizade é um sentimento mais nobre do que o amor, eis que permite que o objeto dela se divida em outros afetos, enquanto o amor tem intrínseco o ciúme, que não admite a rivalidade.
E eu poderia suportar, embora não sem dor, que tivessem morrido todos os meus amores, mas enlouqueceria se morressem todos os meus amigos!
Até mesmo aqueles que não percebem o quanto são meus amigos e o quanto minha vida depende de suas existências...
A alguns deles não procuro, basta-me saber que eles existem. Esta mera condição me encoraja a seguir em frente pela vida.
Mas, porque não os procuro com assiduidade, não posso lhes dizer o quanto gosto deles. Eles não iriam acreditar.
Muitos deles estão lendo esta crônica e não sabem que estão incluídos na sagrada relação de meus amigos.
Mas é delicioso que eu saiba e sinta que os adoro, embora não declare e não os procure.
E às vezes, quando os procuro, noto que eles não têm noção de como me são necessários, de como são indispensáveis ao meu equilíbrio vital, porque eles fazem parte do mundo que eu, tremulamente, construí, e se tornaram alicerces do meu encanto pela vida.
Se um deles morrer, eu ficarei torto para um lado. Se todos eles morrerem, eu desabo! Por isso é que, sem que eles saibam, eu rezo pela vida deles.
E me envergonho, porque essa minha prece é, em síntese, dirigida ao meu bem estar. Ela é, talvez, fruto do meu egoísmo. Por vezes, mergulho em pensamentos sobre alguns deles.
Quando viajo e fico diante de lugares maravilhosos, cai-me alguma lágrima por não estarem junto de mim, compartilhando daquele prazer...
Se alguma coisa me consome e me envelhece é que a roda furiosa da vida não me permite ter sempre ao meu lado, morando comigo, andando comigo, falando comigo, vivendo comigo, todos os meus amigos, e, principalmente, os que só desconfiam - ou talvez nunca vão saber - que são meus amigos!
A GENTE NÃO FAZ AMIGOS, RECONHECE-OS.”
Paulo Sant’Ana
“APRENDI QUE UM HOMEM SÓ TEM O DIREITO DE OLHAR UM OUTRO DE CIMA PARA BAIXO PARA AJUDÁ-LO A LEVANTAR-SE.”
Gabriel García Marquez
SAHAD, M. G. Estudo da imunomarcação da interleucina-10 (IL-10) no periodonto de ratos submetidos à movimentação ortodôntica e laserterapia de baixa intensidade. 2014. 101 f. Tese (Doutorado em Odontologia)-Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2014.
RESUMO
Durante a movimentação ortodôntica, a resposta mais imediata do tecido periodontal
é a inflamação. Hoje sabe-se que os mediadores inflamatórios desempenham papel
central na evolução deste processo. Os mediadores compreendem, desde
substâncias vasoativas e metabólitos do ácido araquidônico, até uma gama
diversificada de citocinas, como a Interleucina-10 (IL-10). Alternativamente à terapia
medicamentosa tradicional, composta por analgésicos e antiinflamatórios que,
segundo alguns autores, podem retardar o movimento dentário, os lasers de baixa
intensidade têm demonstrado sua efetividade no controle da resposta inflamatória,
agilizando sua resolução. A laserterapia de baixa intensidade (LTBI) possui
propriedades analgésica, antiinflamatória, regenerativa e bioestimulante,
aumentando a velocidade da movimentação dentária ortodonticamente induzida,
quando adequadamente aplicada. Embora haja um número expressivo de estudos
focando os efeitos da LTBI na movimentação ortodôntica, a modulação fotobiológica
sobre a IL-10 neste processo, permanece desconhecida. Desta forma, o presente
trabalho insere-se na busca por elementos que elucidem esta interação. Para tanto,
trinta ratos Wistar tiveram o primeiro molar superior direito tracionado por uma mola
fechada de NiTi (Níquel-Titâneo). Destes, quinze animais receberam tratamento com
LTBI por três dias consecutivos (As-Ga-Al, λ=880nm, 100mW) e densidade de
energia de 5J/cm2 formando o grupo irradiado (TO/L). Os outros quinze ratos não
receberam LTBI, sendo denominado grupo não-irradiado (TO/SL). Ambos os grupos
foram divididos em três subgrupos cada, segundo o momento do sacrifício: 72h,
120h e 168h após o início do experimento, ficando cada subgrupo com cinco ratos.
Foi acrescentado um terceiro grupo, também com cinco ratos, sem intervenção
ortodôntica, nem irradiação, para controle do experimento (STO/SL). Após o
sacrifício, as maxilas dos animais foram submetidas ao processamento histológico e
a expressão de IL-10 foi quantificada por método imuno-histoquímico. As áreas
percentuais obtidas com a análise da marcação da IL-10 foram submetidas ao teste
estatístico não paramétrico de Mann Whitney. Os achados da estratificação por
períodos revelaram que o subgrupo 72h-TO/L apresentou queda na expressão de
IL-10, quando comparada ao subgrupo 72h-TO/SL (1,42% e 4,67%,
respectivamente). Da mesma forma, o subgrupo 168h-TO/L apresentou 3,87%,
enquanto que o subgrupo 168h-TO/SL apresentou 7,15% de área marcada. As
diferenças encontradas são estatisticamente significantes. Estes resultados sugerem
que os efeitos antiinflamatórios da LTBI resultam em menor demanda de síntese de
IL-10 nos tecidos irradiados.
Palavras-chave: Movimentação dentária, Ortodontia, Laserterapia de baixa
intensidade, Interleucina, IL-10.
SAHAD, M. G. Immunohistochemistry study of Interleuketin-10 (IL-10) in rats periodontal tissue after orthodontic tooth movement and low-level laser therapy. 2014. 101 f. Tese (Doutorado em Odontologia)-Universidade Cruzeiro do Sul, São Paulo, 2014.
ABSTRACT
During the orthodontic tooth movement the immediate answer of periodontal tissue is
the inflammation. It is known that inflammatory markers have a key role in this
process. These markers include vasoactive substances and metabolites from
arachidonic acid, in addition to a wide diversity of cytokines such as Inteleukin-10 (IL-
10). Alternatively to the traditional drug therapy, composed by analgesic and anti-
inflammatory drugs which, according to some authors, might delay the tooth
movement, the low-level laser therapy (LLLT) has been showing its efficient in
controlling the inflammatory response, accelerating this process. The LLLT has
analgesic, anti-inflammatory, regenerative and bio stimulating effects which all
combined increase the orthodontically induced tooth movement velocity when
suitably applied. Although it has a significant numbers of studies focus on the LLLT
effects in the tooth movement, the photobiological modulation of IL-10 remains
unknown. Thus, this work is involved in the search for elements which help to clarify
this interaction. For this, 30 Wistar mice had their right upper first molar pulled by a
NiTi (Nickel-Titanium) closed coil spring. Among all 30 rats, 15 of them were treated
with the LLLT for 3 consecutive days (As-GA-Al, λ=880nm, 100mW) with 5J/cm2 of
energy density, this groups constituted the irradiated group (TO/L). The remaining 15
rats which were not irradiated with LLLT were called the non-irradiated group
(TO/SL). Both of the groups were divided in other 3 subgroups according to their
killed time: 72h, 120h and 168h counting after the experiment start (n=5). It was
added a third group (5 rats) without intervention or irradiation as a control group.
After the sacrifice the rat’s maxillary went through a histological process and IL-10
expression was quantified by immunohistochemistry technique. The percentage
areas from IL-10 marking analysis were calculated using the non-parametric statistic
test by Mann Whitney. The findings by period revealed that the 72h- TO/SL subgroup
showed decreased expression of IL-10 when compared with 168h- TO/L subgroup
(1,42% and 4,67% respectively). Similarly, 168h-TO/L subgroup revealed 3,87%
while 168h-TO/SL showed 7,15%. These differences were statistically significant.
These results suggest that the anti-inflammatory effects of LLLT results in a lower
demand of IL-10 synthesis in the irradiated tissues.
Keywords: Tooth movement, Orthodontics, Low-level laser therapy, Interleukin, IL-
10.
LISTA DE ILUSTRAÇÔES
Figura 1 Efeitos da aplicação de forças excessivas em incisivo de um cão ...
............................................................................................................. 26
Figura 2 Sequencia de eventos desencadeados pelas citocinas produzidas
na interface de tensão do LPD. ......................................................... 31
Figura 3 Sequencia de eventos desencadeados pelas citocinas produzidas
na interface de pressão do LPD. ....................................................... 32
Figura 4 Regulação da ativação de osteoclastos por osteoblastos na
interface de pressão do LPD ............................................................. 33
Figura 5 Diferentes tipos de radiação luminosa, em comparação à radiação
laser, com suas características de monocromaticidade,
unidirecionalidade e coerência ......................................................... 40
Figura 6 Dispositivo ortodôntico instalado e preso com resina no 1º molar e
nos incisivos. ..................................................................................... 60
Figura 7 Perfuração com motor de alta rotação e broca diamantada na
mesial dos incisivos superiores. ...................................................... 61
Figura 8 Amarrilho na região posterior envolvendo molar. .......................... 62
Figura 9 Amarrilho na região posterior envolvendo molar. .......................... 62
Figura 10 Resina utilizada para fixar o amarrilho. ............................................ 63
Figura 11 Resina utilizada para fixar o amarrilho. ............................................ 63
Figura 12 Tensiomêtro calibrado a força aplicada. .......................................... 64
Figura 13 Desgaste nos incisivos inferiores para evitar interferências. ........ 65
Figura 14 Aparelho utilizado no estudo. ........................................................... 66
Figura 15 Expressão de IL-10 para os subgrupos experimentais após 72h,
120h e 168h. ........................................................................................ 69
Figura 16 Expressão de IL-10 para os subgrupos experimentais após 72h,
120h e 168h. Comparações entre os subgrupos de irradiados. .... 70
Figura 17 Preparado histológico (método imuno-histoquímico) do grupo
controle, mostrando o LPD (seta), no momento zero. Aumento de
100x. .................................................................................................... 71
Figura 18 Preparado histológico do lado de tensão do LPD do subgrupo 72h-
TO/SL (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x. ............... 72
Figura 19 Preparado histológico do lado de tensão do LPD do subgrupo 72h-
TO/L (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x. ................. 72
Figura 20 Preparado histológico do lado de tensão do LPD do subgrupo
168h-TO/SL (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x. ..... 73
Figura 21 Preparado histológico do lado de tensão do LPD do subgrupo
168h-TO/L (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x. ........ 73
Figura 22 Lâminas do lado de tensão do LPD do grupo irradiado nos três
momentos do experimento (método imuno-histoquímico).
Aumento de 200x................................................................................ 74
Figura 23 Lâminas do LPD do grupo irradiado nos três momentos do
experimento (método imuno-histoquímico). Aumento de 100x. .... 75
Quadro 1 Distribuição dos animais utilizados no experimento ...................... 59
Quadro 2 Expressão de IL-10 (%) por subgrupo, nos três momentos do
experimento. ....................................................................................... 70
Tabela 1 Principais tipos de lasers de aplicação clínica. .............................. 41
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AsGaAl Arsênio-Gálio-Alumínio
ATP Adenosina trifosfato
BMP’s Proteínas morfogenéticas ósseas
Ca Cálcio
C-fms Colony-stimulating factor-1 receptor
CO2 Dióxido de carbono
COX Cicloxigenase
DNA Deoxyribonucleic acid
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
FGF Fator de crescimento para fibroblastos
h Hora
HE Hematoxilina e Eosina
HeNe Hélio-Neônio
IGF Insulin-like growth factor (somatomedina)
IL Interleucina
IFN Interferon
J/cm2 Joules por centímetro quadrado
LASER Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation
LTBI Laserterapia de baixa intensidade
LED Light emitting diode
LPD Ligamento periodontal
MCP-1 Monocyte chemotactic protein-1
M-CSF Macrophage colony-stimulating factor
MMP Metaloproteinase de matriz
mm Milímetros
mW mili-Watt
NF- kβ Nuclear factor kβ
nm Nanômetro
NK Natural Killer cells
NO Óxido nítrico
OPG Osteoprotegerina
PGE Prostaglandina
RANK Receptor de ativação nuclear kβ
RANKL Ligante do receptor de ativação nuclear kβ
RNA Ribonucleic acid
RNAm Messenger ribonucleic acid
Th-1 Linfócito T helper 1
Th-2 Linfócito T helper 2
TIMPs Inibidores de tecido de metaloproteinases
TNF-α Fator de necrose tumoral alfa
VEGF Vascular endothelial growth factor
W Watts
W/cm2 Watts por centímetro quadrado
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ..................................................................................... 18
2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................................... 21
2.1 Aspectos da movimentação ortodôntica ......................................... 21
2.1.1 Modelo bioelétrico .............................................................................. 23
2.1.2 Teoria da Pressão-Tensão ................................................................. 24
2.2 Inflamação e movimentação ortodôntica ......................................... 26
2.2.1 O ligamento periodontal (LPD).......................................................... 26
2.2.2 Os mediadores inflamatórios ............................................................ 27
2.2.2.1 Citocinas ............................................................................................. 29
2.3 Interleucina-10 (IL-10) ........................................................................ 35
2.3.1 O papel da IL-10 na reabsorção e aposição ósseas........................ 36
2.4 Laserterapia: fotobiomodulação na movimentação ortodôntica ... 38
2.4.1 Laser: características e aplicações .................................................. 38
2.4.2 Aspectos biomoduladores da laserterapia ...................................... 42
2.4.3 Laserterapia na regeneração óssea ................................................. 45
2.4.4 Laserterapia na movimentação dentária induzida .......................... 47
2.5 Laserterapia e IL-10 ............................................................................ 53
3 OBJETIVOS ......................................................................................... 57
4 METODOLOGIA .................................................................................. 58
4.1 Animais Experimentais ...................................................................... 58
4.2 Grupos experimentais ....................................................................... 58
4.3 Procedimentos experimentais .......................................................... 59
4.3 Preparo e processamento das peças para análise imuno-
histoquímica ....................................................................................... 66
4.3.1 Análise morfométrica – imuno-histoquímica para IL-10 ................. 68
4.4 Análise estatística .............................................................................. 68
5 RESULTADOS .................................................................................... 69
6 DISCUSSÃO ........................................................................................ 76
6.1 Considerações Metodológicas ......................................................... 80
7 CONCLUSÃO ...................................................................................... 81
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 82
ANEXOS ............................................................................................................. 97
18
1 INTRODUÇÃO
O tratamento ortodôntico é um procedimento que compreende eventos
complexos, onde o tecido ósseo alveolar, passível de remodelação graças a sua
grande plasticidade, responde a um estímulo mecânico contínuo, de maneira que
resulte no movimento controlado dos dentes.
Estudos recentes apontam que o movimento ortodôntico é um processo de
transdução de sinal, no qual ocorre a transformação de um estímulo físico em
biológico. Este processo é sustentado por eventos histológicos, bioelétricos,
bioquímicos e moleculares, envolvendo os tecidos dentário e do periodonto de
inserção (cemento, ligamentos periodontais e osso) (MEIKLE, 2006).
Estes eventos estão no cerne de duas hipóteses, que visam explicar o
movimento ortodôntico: o modelo bioelétrico e a teoria da pressão-tensão. Ambas as
hipóteses não são mutuamente excludentes; mas antes, apresentam aspectos
complementares, ampliando a compreensão do intrincado processo (PROFFIT;
FIELDS; SARVER, 2007; MASELLA; CHUNG, 2008).
No modelo bioelétrico, a ação das forças mecânicas sobre o osso alveolar
originam o efeito piezoelétrico, no qual há geração de correntes iônicas resultantes
da deflexão óssea. Os campos elétricos gerados alteram a permeabilidade das
membranas celulares e a atividade bioquímica intracelular, afetando a aposição e
reabsorção óssea (ANDREW; BASSET, 1968; MOSTAFA et al.,1983; ISAACSON et
al., 1993).
Já na teoria da pressão-tensão, as células da região do ligamento periodontal
se diferenciam em osteoclastos na interface de pressão, resultando em reabsorção
óssea e em osteoblastos e fibroblastos na interface de tensão, possibilitando a
osteogênese. Assim, a remodelação óssea alveolar ocorre para que haja alívio da
pressão sobre o ligamento periodontal, viabilizando a movimentação dentária.
(BECKER de OLIVEIRA, 2002; KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006; PROFFIT;
FIELDS; SARVER, 2007).
19
Neste modelo, as forças incidentes acarretam menor perfusão sanguínea na
zona de compressão, quando comparada a de tensão; suscitando o surgimento de
áreas de hipóxia, o que leva ao rompimento da homeostasia celular (MARTYN;
DIBIASE, 2010).
No microambiente alterado estabelece-se o processo inflamatório asséptico,
com consequente migração leucocitária e a liberação de mediadores químicos,
como as aminas vasoativas, fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas e
metabólitos do ácido araquidônico (KRISHNAN; DAVIDOVITCH, 2006).
Os mediadores químicos modulam todas as etapas da inflamação, desde a
inicialização, passando pela manutenção, até a finalização do processo. Já no
estágio final, é crucial a atuação da Interleucina-10 (IL-10), uma citocina
antiinflamatória, cuja ação é fator limitante do processo, além do seu papel
regulatório na diferenciação de células endoteliais e do sistema imune. A IL-10
modula o início do processo cicatricial, ao mesmo tempo em que atua como
mantenedora das propriedades histológicas dos tecidos (DE PAOLA, 1988; ALAM et
al., 1994; MOORE et al., 2001; LIN et al., 2006; RICCHETTI et al., 2008).
Alternativamente à terapia medicamentosa tradicional, os lasers de baixa
intensidade têm demonstrado sua efetividade no tratamento da resposta inflamatória
e na agilização dos processos reparativos e cicatriciais (AIMBIRE et al., 2006).
Mizutani et al. (2004) e Piva et al. (2011) sugerem que o laser de baixa
intensidade inibe a cascata do ácido araquidônico em tecidos lesados, levando a
uma queda na síntese de eicosanóides. Desta forma, diminui-se a produção de
outros mediadores inflamatórios como a bradicinina e a histamina, além de alterar a
síntese de diversas interleucinas.
Devido ao seu efeito bioestimulante, a laserterapia de baixa intensidade
incentiva desde a neoformação da rede microvascular, melhorando a perfusão
tecidual, até a aceleração da multiplicação celular, resultando em um estímulo trófico
importante. Tais propriedades são observadas em todos os tecidos envolvidos na
movimentação ortodôntica, pois a irradiação promove o aumento da síntese de DNA,
RNA e ATP, dentre outros efeitos (GENOVESE, 2000; CEPERA, 2008).
20
Embora haja um número expressivo de estudos focando os efeitos da
laserterapia de baixa intensidade na movimentação ortodôntica, a modulação
fotobiológica sobre a ação das citocinas e especificamente sobre a expressão de IL-
10 neste processo, permanece desconhecida. Sendo assim, o presente trabalho
insere-se na busca por elementos que elucidem esta interação.
21
2 REVISÃO DA LITERATURA
Os esforços da comunidade científica em compreender como os aspectos
envolvidos na movimentação ortodôntica respondem ao efeito bioestimulante da
laserterapia de baixa intensidade, tem resultado em um número crescente de
publicações ao longo dos anos.
Se, por um lado, tal cenário demonstra a evolução de um campo promissor de
tratamento dentro da ortodontia, por outro, tem suscitado questionamentos quanto a
inúmeros aspectos ainda por elucidar. Dentre estes, a resposta da IL-10, frente a
esta abordagem terapêutica, permanece desconhecida.
2.1 Aspectos da movimentação ortodôntica
O primeiro artigo sobre a movimentação dentária foi publicado há mais de 100
anos e de lá para cá, o conhecimento acumulado pode ser verificado através de
extensa literatura, abrangendo desde os aspectos tissulares até os mais recentes
avanços da biologia molecular (SANDSTEDT, 1905; REITAN, 1951; DAVIDOVITCH,
1991; SANDY; FARNDALE; MEIKLE, 1993; PEVERALI; BASDRA;
PAPAVASSILIOU, 2001; MEIKLE, 2006).
A movimentação dentária, ortodonticamente induzida, é uma sequencia
complexa de eventos que ocorrem no periodonto de sustentação. O
reposicionamento do dente só é possível devido à natureza intrinsecamente plástica
dos tecidos periodontais, que ao responderem aos aparelhos utilizados, possibilitam
o reposicionamento do dente e assim, a obtenção de ganhos na função mastigatória
e/ou estética. Isto decorre da forma como as forças mecânicas agem na Ortodontia;
pois estas, ao incidirem sobre o dente, transferem sua carga ao periodonto, mais
especificamente ao ligamento periodontal (LPD), uma vez que o dente é uma
estrutura rígida (INTERLANDI, 1999; THILANDER; RYGH; REITAN, 2002).
As forças ortodônticas diferem das forças ortopédicas, sendo estas últimas
de maior intensidade e aplicáveis as bases ósseas dos maxilares; já as forças
ortodônticas, são aquelas que atuam nos tecidos periodontais e possuem
22
características específicas, como ponto de aplicação, magnitude, duração e direção,
cujas propriedades promovem a reabsorção e aposição do osso alveolar. Todavia,
tanto as forças ortodônticas, como as ortopédicas, envolvem a remodelação óssea e
exigem um profundo conhecimento sobre os efeitos do estresse mecânico sobre as
diferentes populações de células que formam o tecido ósseo (HĚRT; LISKOVÁ;
LANDA, 1971; LANYON; BAGGOTT, 1976; THILANDER; RYGH; REITAN, 2002,
MEIKLE, 2006).
Existem dois tipos diferentes de forças aplicadas aos dentes durante a
movimentação ortodôntica: contínua e intermitente.
Forças contínuas: Apesar de a força contínua típica atuar por períodos
mais longos, a força interrompida é de duração comparativamente curta (3 a 4
semanas em média). Um exemplo é quando um dente está ligado ao arco vestibular,
sendo mantida a posição do dente depois que a força não estiver mais agindo
(THILANDER; RYGH; REITAN, 2002).
Variando de acordo com força exercida, a reabsorção óssea pode ser do tipo
direto ou indireto. Certos movimentos interrompidos tais como pequenos aumentos
do torque efetuado com forças medidas, podem resultar em uma reabsorção óssea
direta. No lado de tensão haverá uma calcificação gradual e uma reorganização de
tecido recém-formado durante o período de descanso. Então é dado aos tecidos
bastante tempo para sua reorganização, e para que a proliferação celular seja
favoráveis para posteriores mudanças teciduais quando o aparelho for novamente
ativado (THILANDER; RYGH; REITAN, 2002).
Forças intermitentes: Diversos tipos de placas removíveis exercem uma
ação intermitente e estão entre os mais antigos aparelhos usados. A ação
intermitente típica é produzida por uma força que atua como um impulso ou um
choque de curta duração ou por curtos períodos com uma série de interrupções.
Essas interrupções ocorrem quando a força se torna gradualmente mais ativa ou
mais passiva à medida que o aparelho se move. Uma força intermitente atua durante
um curto período, sendo induzida principalmente pelos aparelhos ortodônticos
removíveis e pelos aparelhos ortopédicos funcionais (THILANDER; RYGH; REITAN,
2002).
23
O movimento ortodôntico é coordenado por fatores biológicos, bioelétricos,
bioquímicos e mecânicos, que orquestram a resposta do tecido periodontal às forças
investidas (PROFFIT; FIELDS, 2002).
Ao longo do tempo, vários estudos têm sido realizados para explicar a
movimentação dentária induzida e, atualmente, há duas hipóteses que buscam
explicar o movimento ortodôntico: o modelo bioelétrico e a teoria da pressão-tensão.
As duas teorias não são incompatíveis, nem se excluem mutuamente, descrevendo
processos complementares (REITAN; RYGH, 1996; THILANDER; RYGH; REITAN,
2002; PROFFIT; FIELDS; SARVER, 2007; MASELLA; CHUNG, 2008).
2.1.1 Modelo bioelétrico
O osso alveolar é constituído por uma fase orgânica, onde predominam as
fibras colágenas e uma fase inorgânica composta por cristais de hidroxiapatita. Esta
constituição permite a deflexão da estrutura cristalina, devido à flexibilidade da fase
orgânica. Esta deformação cria um fluxo de íons no osso alveolar, originando
campos elétricos. Denominado de efeito piezoelétrico, este fenômeno altera a
permeabilidade das membranas celulares, influenciando os processos de
remodelação óssea e desta forma, a movimentação dentária (MARINO; BECKER;
SODERHOLM, 1971; RYGH; MOYERS,1991; ISAACSON et al., 1993).
A piezoeletricidade resulta da aplicação de forças sobre estruturas cristalinas.
No osso alveolar, tal fenômeno implica na formação de uma corrente iônica que se
inverte quando a força mecânica é retirada. Deste modo, quando as forças são
aplicadas de maneira intermitente, há uma geração rítmica de elétrons, que
modificam os potenciais de membrana, alterando a fisiologia celular e
desencadeando as alterações teciduais necessárias para que o movimento
ortodôntico se realize (COCHRAN; PAWLUCK; BASSET, 1967; ANDREW; BASSET,
1968; MOSTAFA et al.,1983; RYGH; MOYERS,1991; ISAACSON et al., 1993).
Segundo Mostafa et al. (1983) a influência do efeito piezoelétrico na
bioquímica celular é o principal fator no estabelecimento da direção do movimento
ortodôntico. Esta afirmação está de acordo com Furstman e Bernik (1972) que
24
apontaram a importância deste efeito na ação dos osteoblastos e osteoclastos na
remodelação óssea ortodonticamente induzida.
Por outro lado, Roberts (1996) argumentou que as diferenças de potenciais
de membrana podem ser resultado da própria atividade celular em resposta aos
estímulos mecânicos, e não, necessariamente, ao efeito piezoelétrico.
2.1.2 Teoria da Pressão-Tensão
Nesta teoria, o movimento ortodôntico está estreitamente relacionado às
alterações tissulares resultantes da modificação do fluxo sanguíneo no LPD. Isto
decorre da movimentação do dente dentro do alvéolo, em resposta às forças
mecânicas aplicadas sobre ele (GÖTZ et al., 2006).
Este movimento faz com que a raiz comprima o LPD, acarretando a
diminuição do fluxo sanguíneo na interface de pressão. Já na interface oposta, onde
ocorre distensão do ligamento, o fluxo sanguíneo diminui apenas no início, porém,
não apenas se restabelece rapidamente, como aumenta ao longo do processo.
Desta forma, a quebra da homeostasia tissular é mais evidente na interface de
pressão (PROFFIT, 1995; REITAN; RYGH, 1996; BECKER de OLIVEIRA, 2002;
PROFFIT; FIELDS, 2002; GÖTZ et al., 2006; WISE; KING, 2008; MARTYN;
DIBIASE, 2010).
Em resposta às alterações vasculares, as células periodontais sintetizam e
liberam mediadores químicos que deflagram o processo inflamatório, instalando uma
seqüência de eventos neste microambiente alterado. A partir daí, ocorrem aumento
da permeabilidade vascular, vasodilatação e exsudação de fluídos para o interstício,
resultando em migração leucocitária. Estes eventos ativam os processos de
regeneração tecidual, pois modulam a migração de células predecessoras, que se
diferenciarão em fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos favorecendo os processos
de reabsorção e aposição ósseas (VANDEVSKA-RANUDOVIC, 1999; MELSEN,
2001; CONSOLARO, 2002; WAGLE et al., 2005; GIANNOPOULOU; DUDIC;
KILIARIDIS, 2006; SILVEIRA, 2006; GARLET et al., 2007; MERMUT et al., 2007;
MILLER et al., 2007; PROFFIT; FIELDS; SARVER, 2007; SANTAMARIA JR et al.,
2007).
25
Na interface de pressão, área onde a hipóxia é mais severa, o pouco oxigênio
disponível favorece a diferenciação das células predecessoras em osteoclastos,
resultando em reabsorção óssea. Na área de tensão, ao contrário, o aporte
aumentado de oxigênio promove a diferenciação destas células em fibroblastos e
osteoblastos, possibilitando a osteogênese e, assim, a aposição óssea. (GÖTZ et
al., 2006; GOKCE et al., 2008; MARTYN; DIBIASE, 2010).
Outro aspecto importante, apontado por vários autores, refere-se à
intensidade das forças mecânicas aplicadas. Considera-se, de modo geral, que uma
força leve aplicada a certa distância, move um dente mais rapidamente, causando
menos lesões nos tecidos de suporte, do que uma força pesada. As forças
aplicadas, sendo ideais, resultam em menor necrose tecidual, preservando um maior
contingente de células viáveis no tecido periodontal, o que acelera o tratamento
ortodôntico. Este é um ponto importante, pois, na área sob compressão, as fibras
colágenas estão compactadas e os vasos sanguíneos apresentam-se colapsados,
resultando em degeneração celular. Ao microscópio de luz branca essa região é
conhecida como área hialina. Esta tem características de um área necrótica estéril,
geralmente limitada a 1 ou 2 mm de diâmetro, sendo praticamente inevitável no
período inicial do movimento dentário (Figura 1). De qualquer forma, forças
excessivas devem ser evitadas, para que as áreas de hialinização geradas sejam as
menores possíveis (REITAN, 1964; CONSOLARO, 2002; THILANDER; RYGH;
REITAN, 2002; MASELLA; MEISTER, 2006; MEIKLE, 2006; SILVA, 2007).
26
Figura 1 – Efeitos da aplicação de forças excessivas em incisivo de um cão. Fonte: MEIKLE, 2006.
A figura 1, mostra que a aplicação de uma força de torque de 200 g (A) no
segundo incisivo de um cão, resultou em duas áreas hialinizadas (H) no LPD, em
resposta à compressão excessiva. O desenho indica a área de reabsorção óssea
(R) e de aposição óssea (F) e as áreas de injúria radicular (1,2). As setas indicam a
direção do movimento do dente.
2.2 Inflamação e movimentação ortodôntica
No tratamento ortodôntico, durante a movimentação dentária, a resposta mais
imediata do tecido periodontal ao estresse mecânico é a inflamação. Ao longo do
tempo, a observação mais acurada dessas alterações teciduais, particularmente no
LPD, tem demonstrado sua importância central na evolução da intervenção
ortodôntica (CONSOLARO, 2002).
2.2.1 O ligamento periodontal (LPD)
O LPD é constituído por tecido conjuntivo, composto por grande variedade de
células, densa rede microvascular com capilares fenestrados, terminações nervosas
27
e abundante matriz extracelular (LINDHE; KARRING; LANG, 2005; PROFFIT;
FIELDS; SARVER, 2007; ELEY et al., 2012).
Os tipos celulares encontrados são os fibroblastos, fibrócitos, macrófagos,
mastócitos, plasmócitos, cementoblastos, osteoblastos, osteoclastos e células
mesenquimais indiferenciadas (predecessoras), que conferem ao LPD sua
capacidade regenerativa. A matriz extracelular é composta por uma porção fibrilar,
as fibras colágenas e pela substância fundamental amorfa que é formada por
glicosaminoglicanos, glicoproteínas, proteoglicanos e água. (ELEY et al., 2012).
Pelo estímulo de fatores de crescimento, os fibroblastos proliferam e secretam
a matriz extracelular. Desta forma, são eles os responsáveis pela síntese das fibras
colágenas e sua disposição em feixes em diferentes direções, tornando o LPD
resistente às trações; além de sintetizarem as fibras oxitalânicas, que conferem
suporte aos demais elementos do tecido. São estas características estruturais que
fazem do LPD o receptáculo das forças mecânicas induzidas ortodonticamente.
Estas geram uma distorção na matriz extracelular que acaba por alterar o
citoesqueleto e a própria forma das células do ligamento (CONSOLARO, 2002;
ELEY et al., 2012).
Estas deformações fazem com que as células do LPD sintetizem e liberem
citocinas, deflagrando o processo inflamatório. Este influenciará a bioquímica celular
e, portanto, todo o processo de destruição e regeneração tecidual próprios da
movimentação ortodôntica (LOWNEY et al., 1995; CONSOLARO, 2002; KRISHNAN;
DAVIDOVITCH, 2006).
Consequentemente, a remodelação óssea ocorre para que as forças
incidentes sobre o ligamento sejam aliviadas; ou seja, a remodelação do osso
alveolar é mediada pelos eventos inflamatórios do LPD (GRIEVE; JOHNSON;
MOORE, 1994; CONSOLARO, 2002; WAGLE et al., 2005; MILLER et al., 2007).
2.2.2 Os mediadores inflamatórios
As células danificadas do LPD respondem ao estresse mecânico liberando os
mediadores químicos da inflamação, alterando o microambiente periodontal. Esta
28
alteração decorre da capacidade destes mediadores químicos em provocar reações
em cascata, estimulando a liberação de outros mediadores pelas células-alvo
(SHETTY et al., 2011).
Alguns mediadores inflamatórios já estão pré-formados nos grânulos no
interior dos mastócitos, enquanto outros são sintetizados no local da inflamação, em
resposta a um estímulo. Estes compostos incluem as aminas vasoativas, os
metabólitos do ácido araquidônico, as enzimas lisossômicas dos leucócitos, os
fatores de crescimento e as citocinas (KUMAR et al., 2008).
Os mastócitos são células próprias do tecido conjuntivo, cuja função é
armazenar potentes mediadores químicos como a histamina e a serotonina, que são
aminas vasoativas; além de sintetizarem os fatores quimiotáxicos de neutrófilos.
Uma vez ativados, os mastócitos, por meio da exocitose, liberam seus produtos,
deflagrando a resposta inflamatória e iniciando a migração leucocitária para o local.
A liberação de aminas vasoativas acarreta o aumento da permeabilidade
vascular, promovendo a exsudação das proteínas plasmáticas e favorecendo o
acesso de monócitos oriundos dos tecidos adjacentes.
A ação dos neutrófilos, na eliminação das células lesadas, promoverá a
liberação do ácido araquidônico, um ácido graxo essencial, constituinte da
membrana celular das células danificadas. A metabolização do ácido araquidônico
originará as prostaglandinas, tromboxanos, prostaciclinas e leucotrienos,
mediadores importantes para diversas funções biológicas (COLLET; STEWART,
1991; FUNK, 2001).
Estudos demonstraram que os leucotrienos têm papel importante na
reabsorção óssea, pois estimulam a ação dos osteoclastos, bem como sua
diferenciação a partir das células predecessoras do LPD (MEGHJI et al., 1988;
GALLWITZ et al., 1993; FLYNN at al., 1999). Já as prostaglandinas, além de
vasodilatadores potentes, também estão relacionadas com a movimentação
dentária, pois modulam a ação dos osteoblastos e osteoclastos e, portanto, a
velocidade da remodelação do osso alveolar (YAMASAKI; SHIBATA; FUKUTHARA,
1982; LEIKER et al., 1995; PROFFIT, FIELDS; SARVER, 2007; HIKIJI et al., 2008).
29
2.2.2.1 Citocinas
As citocinas são polipeptídeos de baixo peso molecular que atuam na
intercomunicação celular. Podemos agrupá-las em diferentes categorias baseadas
em suas funções ou origens, mas como são produzidas por variados tipos celulares
com ação em tecidos diversos, qualquer tentativa de categorizá-las está sujeita a
limitações (MALE; ROTH; BROSTOFF, 2006).
O fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), os interferons, as proteínas
morfogenéticas ósseas (BMPs), pertencentes à superfamília do fator de
transformação do crescimento beta (TGF-β), o fator de crescimento vascular
endotelial (VEGF), o fator estimulante de colônia de macrófagos (M-CSF), o ligante
do receptor de ativação nuclear kβ (RANKL), as quimiocinas e as interleucinas são
tipos de citocinas. Estes mediadores apresentam múltiplas ações de amplo espectro,
que abrangem desde a expressão de novas funções, passando pelo controle de
proliferação das células-alvo, até a modulação da resposta imunológica. No tecido
ósseo, estas proteínas desempenham funções importantes na quimiotaxia, cito-
diferenciação e ativação de osteoblastos e osteoclastos (COTRAN, 1999; BAIN;
GUPTA, 2003; LUO et al., 2003; MEIKLE, 2006).
Em uma conferência em 1986, Meikle e colaboradores já haviam lançado a
hipótese de que os eventos de remodelação do tecido ósseo seriam modulados por
citocinas. Davidovitch et al. (1988) produziram a primeira evidência experimental, ao
identificar a presença da IL-1 no LPD de gatos submetidos à forças ortodônticas.
Desde então, inúmeros estudos clínicos tem demonstrado a presença de vários tipos
de citocinas, em altas concentrações, no fluido crevicular gengival de pacientes
durante o movimento ortodôntico (MEIKLE, 1989; GRIEVE; JOHNSON; MOORE,
1994; LOWNEY et al., 1995; UEMATSU; MOGI; DEGUCHI,1996).
Em 2009 Vieira demonstrou que os osteoblastos sintetizam e secretam
diversas citocinas durante o processo de remodelação óssea, modulando a atividade
de outros tipos celulares do tecido ósseo.
As citocinas interagem com receptores celulares de alta afinidade, alterando
as funções da célula-alvo. A ligação no receptor desencadeia uma via de transdução
de sinais, que altera a expressão gênica celular. O efeito produzido consiste na
30
modulação da atividade imunitária e na regulação da resposta anti e pró-
inflamatória, através da comunicação intercelular. Além de exercer uma ação
autócrina e parácrina, alguns desses mediadores também podem agir em nível
endócrino (ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003; SHETTY et al., 2011).
As citocinas podem ter ações pleiotrópicas, redundantes, sinérgicas ou
antagônicas e geralmente participam de um sistema de indução em cascata,
influenciando a homeostasia tecidual (HAMBLIN, 1993; SANDY; FARNDALE;
MEIKLE, 1993; ALHASHIMI et al., 2001; ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003).
Monócitos, macrófagos, células endoteliais, fibroblastos e células
mesenquimais, sintetizam citocinas que agem na adesão, quimiotaxia e ativação
leucocitária, além de promoverem o recrutamento, diferenciação e proliferação de
células inflamatórias.
No LPD, além das células endoteliais, os fibroblastos e osteoblastos
sintetizam o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), promovendo a
angiogênese na interface de tensão (Figura 2), enquanto que na interface oposta
(Figura 3), as células mesenquimais secretam o fator estimulador de colônia de
macrófagos (M-CSF), promovendo a sobrevivência, proliferação e diferenciação de
células hematopoiéticas das séries monócito-macrófago. A Figura 4 mostra a
seqüência de eventos orquestrada por M-CSF, RANKL e osteoprotegerina (OPG) na
regulação da maturação e função dos osteoclastos por osteoblastos (MEIKLE,
2002).
31
Figura 2 – Sequencia de eventos desencadeados pelas citocinas produzidas na interface de tensão do LPD. Fonte: MEIKLE, 2006.
Na Figura 2, os fibroblastos sob tensão (1), sintetizam várias citocinas (IL-1 e
IL-6) que, por sua vez, estimulam as metaloproteinases de matriz (MMPs) e
desativam os inibidores de tecido de metaloproteinases (TIMPs). As MMPs
degradam o colágeno e as glicosaminaglicanas (2), enquanto que o VEGF promove
a angiogênese (3). A degradação da matriz extracelular (MEC) por MMPs facilita a
proliferação celular e o crescimento capilar. Os fibroblastos (4) remodelam a matriz,
sintetizando mais MEC, enquanto que os osteoblastos (5) sintetizam o osteóide, fase
inicial da aposição óssea.
Já na interface de pressão, há intensa atividade reabsortiva, conforme mostra
a figura abaixo.
32
Figura 3 – Sequencia de eventos desencadeados pelas citocinas produzidas na interface de pressão do LPD. Fonte: MEIKLE, 2006.
As células do LPD na interface de pressão (Figura 3) sintetizam IL-1 e IL-6
(1), que atuam de forma autócrina e parácrina, ativando o RANKL (2) e as MMPs (3).
Os osteoblastos liberam as MMPs que degradam o osteóide, enquanto que as
MMPs produzidas pelos fibroblastos degradam a MEC (4). O RANKL estimula a
osteoclastogênese a partir de células predecessoras. Os osteoclastos diferenciados
degradam a matriz óssea mineralizada (5). Os osteócitos da superfície óssea
regulam a deformação do osso alveolar modulando a expressão de MMPs.
Os promotores da reabsorção óssea (Figura 4), tais como a vitamina D
[1,25(OH2)D3], o paratormônio (PTH) e a interleucina-1 (IL-1) aumentam a formação
dos osteoclastos, estimulando a expressão de RANKL por osteoblastos e células
mesenquimais, enquanto que a OPG faz a contra-regulação, atuando como um
inibidor da osteoclastogenese, ao competir com o RANKL pelo receptor de
membrana dos osteoblastos e células predecessoras. O M-CSF age diretamente
sobre as células precursoras dos osteoclastos, regulando sua proliferação e
diferenciação.
33
Figura 4 – Regulação da ativação de osteoclastos por osteoblastos na interface de pressão do LPD Fonte: MEIKLE, 2006.
No tecido periodontal os macrófagos sintetizam e liberam TNF-α, citocina que
estimula a diferenciação e atividade dos osteoclastos, estimulando a reabsorção
óssea (DI DOMENICO et al., 2012).
Conforme o processo inflamatório evolui, os linfócitos T ativados chegam à
interface de pressão e sintetizam o interferon tipo II (INF-γ) citocina que aumenta a
atividade fagocítica dos osteoclastos e assim como os leucotrienos, também
estimula a sua diferenciação, consistindo em exemplos de ações sinérgicas e
redundantes (ASSUMA et al., 1998; KUBY et al., 1999; ALHASHIMI et al., 2000;
BINGHAM, 2002; MALE; ROTH; BROSTOFF, 2006).
A comunicação entre os linfócitos é orquestrada pelas interleucinas, também
conhecidas como linfocinas.
O termo interleucina (IL) refere-se às citocinas produzidas, majoritariamente,
por linfócitos T ativados, embora algumas delas sejam sintetizadas também por
outros tipos celulares. As interleucinas possuem várias funções, mas a maioria está
envolvida na ativação, diferenciação e promoção do crescimento de linfócitos e na
indução da proliferação de outras células. Entre os principais alvos destes
mediadores estão os próprios linfócitos T, os linfócitos B, os fibroblastos,
osteoblastos, osteoclastos e as células endoteliais (ABBAS; LICHTMAN; POBER,
2003).
34
Vários estudos têm apontado a presença de interleucinas no fluido gengival
de pacientes submetidos à movimentação ortodôntica, como a IL-1, IL-2, IL-3, IL-6,
IL-8, IL-10 e IL-12, entre outras citocinas (ALHASHIMI et al., 2000; MEIKLE, 2002;
IWASAKI et al., 2005; GARLET et al., 2007; REN et al., 2007).
Na resposta inflamatória aguda há a participação de interleucinas que
participam da imunidade inata, como a IL-1, que é a primeira a ser secretada pelos
macrófagos. A IL-1 ativa os fibroblastos, aumentando a proliferação e produção da
matriz extracelular, além de promover a osteoclastogênese. Logo os fagócitos
passam a liberar IL-6, que age em sinergia com a IL-1, amplificando a resposta
inflamatória imediata (GLANTSCHNIG et al., 2003; SEIDENBERG; AN, 2004;
KUMAR et al., 2008; YAO et al., 2008).
A IL-1 também atua na ativação dos linfócitos T, dando início a ação da
imunidade adaptativa (GOWEN; MEIKLE; REYNOLDS, 1983; HEATH et al., 1985).
Com o recrutamento e ativação dos linfócitos T, inicia-se uma fase de limpeza e
reparação tecidual, na qual são sintetizadas e liberadas outras interleucinas,
conforme a resposta inflamatória progride para a resolução do processo.
A célula T diretamente implicada nos processos inflamatórios é o linfócito T-
helper (Th) por sua estreita interação com os macrófagos. As células Th são
mensageiras fundamentais, propiciando a intercomunicação de todo o sistema
imune. Há dois subtipos de linfócito T-helper: Th1 e Th2; sendo que cada subtipo
sintetiza interleucinas específicas.
As células Th não ativadas permanecem em estado de quiescência, sendo
denominadas linfócitos Th0. A diferenciação destes nos subtipos 1 ou 2 depende da
interleucina presente no microambiente tecidual no momento. Os Th0 serão
diferenciados em Th1 na presença da IL-12, mantendo a resposta inflamatória;
porém, se a IL-4 estiver presente, os Th0 se diferenciarão no subtipo Th2, que
determinam uma resposta antiinflamatória.
Na evolução do processo inflamatório, ambos os subtipos serão ativados,
influenciando-se mutuamente e de forma antagônica: os linfócitos Th1 sintetizam e
liberam INF-γ, uma citocina que inibe a ação dos linfócitos Th2, enquanto que estes
35
produzem e secretam a Interleucina-10, que possui ação inibitória sobre o subtipo
Th1.
2.3 Interleucina-10 (IL-10)
A IL-10 é uma citocina antiinflamatória, produzida e secretada pelos linfócitos
Th2, principalmente, mas também por células dendríticas e macrófagos ativados.
Outros tipos celulares também transcrevem o gene da IL-10, tais como linfócitos B,
células NK, monócitos, eosinófilos e mastócitos, modulando sua proliferação por
mecanismo autócrino. Entre seus receptores, o IL-10 R1 é encontrado em células
hematopoiéticas, fibroblastos e células epiteliais, apresentando maior afinidade à
interleucina, que seu outro receptor IL-10 R2, encontrado na maioria das células.
(MOSSER et al., 2008; MARCOS, 2010). Estes dados estão de acordo com Reitamo
et al (1994) que já afirmavam que a IL-10 pode modular a atividade de fibroblastos e
condrócitos, desempenhando papel importante na reparação tecidual.
A IL-10 age no controle homeostático das reações da imunidade inata e da
imunidade mediada por células, exercendo seus efeitos pleiotrópicos após interação
com o receptor específico, nos tipos celulares responsivos a ela (HO et al., 1993;
LIU et al., 1994; KRONFOL; REMICK, 2000; ABBAS; LICHTMAN; POBER, 2003).
Células dendríticas e macrófagos ativados ao secretarem IL-10 inibem sua
própria atividade, por supressão do complexo de histocompatibilidade (MHC classe
II) consistindo em um exemplo clássico de feedback negativo. Nestes tipos celulares
a IL-10 também inibe a síntese e liberação de IL-12 e TNF-α (DE WAAL MALEFYT
et al., 1991; McGUIRK, CANN; MILK, 2002).
A IL-10 reduz a proliferação e produção de diversas citocinas dos linfócitos
Th1 como IFN-γ, IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 e IL-12, entre outras, através do bloqueio da
atividade do fator nuclear kappa B (NF-kB), possibilitando o estabelecimento de
respostas Th2. Estas consistem na elevação da produção de IL-4 e IL-5, que
promovem a proliferação e diferenciação de linfócitos B (MOSSMANN; COFFMAN,
1989).
36
Germann, Partenheimer e Rude (1990) observaram que a inibição dos
linfócitos Th1 na presença de IL-10, se dá através da supressão de IL-12 nestas
células, pois a produção de citocinas inflamatórias por Th1 é dependente da ação
estimulatória de IL-12.
A ação antiinflamatória se dá, portanto, pela diminuição da produção de
citocinas pró-inflamatórias, pela inibição da migração de células inflamatórias para o
local da lesão, além de aumentar os receptores antagonistas de IL-1 pelos
macrófagos e suprimir a ativação e diferenciação de monócitos. (FIORENTINO et al.,
1991; MARQUES, CIZZA; STERNBERG, 2007; RICCHETTI et al., 2008; MOSSER;
ZHANG, 2008).
Além da atividade imunossupressora, a literatura descreve a IL-10 como uma
interleucina que promove o processo cicatricial, resguardando as características
mecânicas e funcionais da área em reparo tecidual (RICCHETTI et al., 2008).
A síntese e secreção desta interleucina também responde ao mecanismo de
feedback negativo: a síntese de IL-10 é inibida por IL-4 e pela própria IL-10
(BENJAMIN; KNOBLOCK; DAYTON, 1992).
2.3.1 O papel da IL-10 na reabsorção e aposição ósseas
Além de mediar a resposta imune, a IL-10 desempenha funções centrais na
recuperação da homeostase do tecido ósseo alveolar, tanto em condições
fisiológicas, como sob movimentação ortodonticamente induzida.
Uma vez presente, a IL-10 promoverá a quimiotaxia de células
mensenquimais (predecessoras), que poderão se diferenciar em osteoblastos
mediante ação autócrina e parácrina das proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs).
Todavia, o papel da IL-10 na própria diferenciação das células predecessoras em
osteoblastos ainda é mal compreendida (DUCY; KARSENTY, 2000).
Os achados de experimentos in vitro, muitas vezes parecem contraditórios,
porém, nem sempre se pode extrapolar os resultados apresentados por células
diferenciadas de uma espécie para outras (MEIKLE, 2006). Neste sentido Long, et
al. (2001) em experimento com células do LPD humano, submetidas a forças de
37
tensão cíclicas, aumentaram a expressão de IL-10, enquanto que, no experimento
de García-López et al. (2005) com osteoblastos da calvária de ratos, a produção de
IL-10 diminuiu após a aplicação de tensão de tração intermitente.
Esta diferenciação em osteoblastos é central na neoformação óssea, pois são
estas células que sintetizam e depositam a matriz óssea ou osteóide, com sua
subseqüente mineralização, quando os osteoblastos secretam vesículas ricas em
fosfatase alcalina e vesículas ricas em cálcio, promovendo a calcificação da matriz
(JOHNSON, 2000).
O processo evolui para a maturação do tecido formado, com a diferenciação
dos osteoblastos em osteócitos, que constitui evento fundamental para a
homeostase do tecido ósseo. Aqui, novamente, a IL-10 desempenha um papel
importante, como demonstrou o estudo de Claudino et al. (2010) com ratos knockout
para IL-10: nestes animais a diferenciação dos osteoblastos em osteócitos está
prejudicada.Os autores também enfatizaram a propriedade anti-apoptótica da IL-10,
como possível fator de proteção para os osteócitos e concluíram o estudo
enfatizando a necessidade de mais pesquisas que elucidem os mecanismos
bioquímicos pelos quais a IL-10 interage com osteoblastos e osteócitos.
Por outro lado, a IL-10 afeta diretamente as células predecessoras dos
osteoclastos, inibindo a osteoclastogênese, além de coibir a ativação dos
osteoclastos já diferenciados (MEIKLE, 2006; MOHAMED et al., 2007).
A inibição da osteoclastogênese se dá por várias vias, como o aumento da
expressão de OPG, inibição de RANKL e de M-CSF. (MEIKLE, 2006; LIU; YAO;
WISE, 2006). Outra importante via de inibição da osteoclastogênese decorre da
redução da expressão de NFATc1 (fator nuclear de células T ativadas isoforma c1)
na presença de IL-10 (EVANS; FOX, 2007; MOHAMED et al., 2007).
Na mesma direção, apontam os achados de Menezes et al. (2008), que
identificaram uma correlação positiva entre as concentrações de IL-10 e a ação dos
supressores de sinalização de citocinas (SOCS) que ao suspenderem a via de
sinalização pró-inflamatória, também inibiram a diferenciação e ativação de
osteoclastos, atenuando a progressão da lesão tecidual.
38
Hilgenberg et al. (2006) estudaram a expressão de fatores de transcrição,
mediadores e inibidores de remodelação tecidual em amostras de ligamento
periodontal de dentes submetidos a forças ortodônticas: os achados demonstraram
que no lado de tensão a expressão de IL-10 e fatores de crescimento foi
significantemente maior do que no grupo controle. Para os autores, as citocinas
desempenham papel determinante na resposta tecidual frente às forças
ortodônticas, modulando o equilíbrio entre reabsorção e neoformação ósseas.
2.4 Laserterapia: fotobiomodulação na movimentação ortodôntica
2.4.1 Laser: características e aplicações
A palavra laser é o acrônimo da expressão inglesa Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation, que, traduzido, significa amplificação da luz por
emissão estimulada de radiação.
Albert Einstein postulou a primeira teoria sobre o laser em 1916, lançando as
bases para as pesquisas subsequentes. A partir das idéias de Einstein, Theodore
Maiman concebeu o primeiro aparelho de emissão de laser, durante a década de 60,
possibilitando sua utilização nas mais diversas áreas, inclusive na medicina e
odontologia (ALMEIDA-LOPES et al., 1999).
O laser é uma forma de radiação eletromagnética, convertida em energia
luminosa, visível ou não, cujo espectro varia do infravermelho ao ultravioleta. Sua
visibilidade depende das características físicas da matéria que o produz.
(BRUGNERA JR; VILLA; GENOVESE, 1991; GENOVESE, 2000).
A radiação laser é produzida através de um meio ativo, composto por
substâncias gasosas, líquidas ou sólidas, que emitem energia luminosa quando
excitadas por uma fonte de energia externa. O processo gerador do laser consiste
em transformar o meio ativo em meio amplificador de radiação, através do fenômeno
denominado “inversão de população”. Este fenômeno consiste no “salto” do elétron
de um nível de energia menor para um maior e deste para o menor novamente. Este
decaimento libera um fóton, que é um quantum de energia altamente concentrado.
Este fóton desencadeia o decaimento em cascata dos demais elétrons excitados,
39
resultando em emissão estimulada de radiação (HALLIDAY, 1995; ALMEIDA-
LOPES, 2004).
O espectro eletromagnético é estritamente organizado em ondas. Desta
forma, suas características essenciais são a frequência, amplitude e comprimento de
onda, que variam segundo o material que produz a radiação. Das características
citadas, é o comprimento de onda que determinará a visibilidade da radiação
luminosa. O espectro visível ao olho humano possui comprimento de onda entre 385
e 760nm; abaixo desta faixa a luz é denominada de ultravioleta e acima de
infravermelha, ambas invisíveis ao ser humano (MISERENDINO, 1995; GENOVESE,
2000).
O laser difere de outras formas de energia luminosa devido a propriedades
muito específicas. Três delas são distintivas: a monocromaticidade, a coerência e a
unidirecionalidade ou colimação.
A monocromaticidade é conferida por fótons de uma única cor e com o
mesmo comprimento de onda; este atributo é de fundamental interesse na prática
terapêutica, por possibilitar a absorção seletiva pelos diferentes tecidos humanos. A
coerência consiste na capacidade de propagação ordenada, devido à emissão
estimulada que gera fótons que viajam em sincronismo na mesma direção,
movendo-se em fases no tempo e no espaço. A unidirecionalidade ou colimação
refere-se aos feixes paralelos e unidirecionais característicos da luz laser, cujo
paralelismo existente entre o feixe e o eixo do tubo que a produz, resulta em
diminuta divergência angular. Esta propriedade, através de um sistema de lentes,
possibilita a concentração de energia em um único ponto focal, permitindo aos lasers
transportar uma grande densidade de energia para sítios delimitados no tecido
(BRUGNERA JR; VILLA; GENOVESE, 1991; ALMEIDA-LOPES, 1998; GENOVESE,
2000; PINHEIRO, 2001).
40
Lâmpada comum policromática
Luz solar policromática
Luz monocromática
Luz laser
Figura 5 – Diferentes tipos de radiação luminosa, em comparação à radiação laser, com suas características de monocromaticidade, unidirecionalidade e coerência Fonte: DANIELE, 2009.
Os principais tipos de lasers utilizados na prática clínica de diversas
especialidades estão na Tabela 1.
41
Tabela 1 - Principais tipos de lasers de aplicação clínica.
Tipo de Laser Comprimento de onda Aplicações
Argônio (Contínuo) 418/514 nm Lesões vasculares
Argônio (pulsátil) 577/585 nm Lesões vasculares
Cobre vapor/brometo 510/578 nm Lesões pigmentares, lesões vasculares.
Potássio-titânio-fosfato 532 nm
Lesões pigmentares, lesões vasculares, tecido quelóide, hipertrofia tecidual.
Rubi 694 nm Lesões pigmentares, lesões vasculares, remoção capilar.
Hélio-Neônio 632 nm Cicatrização tecidual, amplo uso na odontologia.
Índio-Gálio-Alumínio 660 nm Aplicações odontológicas.
Alexandrita 755 nm Lesões pigmentares, lesões vasculares, varizes, remoção capilar.
Arsênio-Gálio-Alumínio 830 nm Cicatrização tecidual, amplo uso na
odontologia.
Arsênio-Gálio 940 nm Cicatrização tecidual, amplo uso na odontologia.
Diodo 1064 nm Lesões pigmentares, lesões vasculares, varizes, remoção capilar.
Dióxido de carbono (contínuo) 10600 nm Verrugas, hipertrofias dermatológicas.
Dióxido de carbono (pulsátil) 10600 nm “Remodelação” cutânea, lesões
dermais.
Fonte: DANIELE, 2009.
Mesmo diante da diversidade dos tipos de lasers, suas características
fundamentais são as mesmas, visto que são gerados através do mesmo princípio.
A potência de emissão de radiação e a capacidade de interação com os
tecidos são os critérios de classificação dos lasers. Estes podem ser de alta potência
ou “High-Intensity Laser Treatment” (HILT), normalmente utilizados em cirurgias, ou
de baixa, também denominados lasers não-cirúrgicos, soft laser ou “Low-Intensity
Laser Treatment” (LILT); este último emite radiação de baixa potência, sem
capacidade destrutiva. Em 1965 Sinclair e Knoll desenvolveram então o laser
terapêutico, sem capacidade de corte, cujo objetivo é a bioestimulação tecidual
(SANTOS et al., 2005; CEPERA et al., 2008).
42
Os lasers de alta e baixa potência diferem, principalmente, quanto ao
mecanismo de ação, onde, nos primeiros, a ação se dá por aumento da
temperatura, enquanto que nos últimos por mecanismos fotoquímicos, fotofísicos e
fotobiológicos (LOEVSCHALL; ARENHOLT-BINDSLEV, 1994; Al-WATBAN; ZHANG,
1997).
Em Odontologia os tipos de laser de alta intensidade mais utilizados são: CO2
(dióxido de carbono), Nd:YAG (Neodímio-Itrio-Alumínio-Granada), Er:YAG (Érbio-
Itrio-Alumínio-Granada), Argônio e diodos semicondutores, enquanto que os de
baixa potência mais utilizados são os de Arsênio-Gálio (AsGa), Arsênio-Gálio-
Alumínio (AsGaAl), Hélio-Neônio (HeNe) e Indio-Gálio-Alumínio-Fósforo (InGaAlP)
(THEODORO; GARCIA, 2001).
Na prática odontológica o laser mais utilizado é o de baixa intensidade, devido
as suas propriedades analgésica, antiinflamatória e bioestimulante. Estes efeitos
biológicos contribuem na reparação tecidual (BRUGNERA JR; PINHEIRO, 1998).
Segundo Turner e Hode (2007) laserterapia é um termo que se refere aos
procedimentos terapêuticos no qual são empregados lasers de baixa intensidade, na
faixa do vermelho (luz visível) de 630 a 700 nanômetros (nm) e infravermelho
próximo: de 700nm a 904nm. O infravermelho tem maior penetração tecidual, sendo
o mais indicado para o tratamento do tecido ósseo e nervoso (BRUGNERA JR;
VILLA; GENOVESE, 1991; GENOVESE, 2000; MELLO; MELLO, 2001).
Desta forma, sempre que o termo laserterapia aparecer no presente trabalho
referir-se-á à laserterapia de baixa intensidade (LTBI).
2.4.2 Aspectos biomoduladores da laserterapia
Tal como a luz comum, a radiação laser pode ser refletida, absorvida e
transmitida, sofrendo ou não espalhamento durante o seu trajeto pelo tecido. Estas
características, somadas as suas propriedades únicas, como focalização e emissão
de altas densidades de energia, fazem do laser, um instrumento de grande eficácia e
aplicabilidade nas áreas biomédicas (ALMEIDA-LOPES, 1998; BRUGNERA JR;
PINHEIRO, 1998; GENOVESE, 2000).
43
A energia radiante do laser é do tipo não ionizante, portanto, não há remoção
de elétrons das biomoléculas que constituem o meio, através do qual o laser está se
deslocando no momento da aplicação. Todavia, o laser de baixa intensidade possui
uma propriedade de indução fotobiológica, capaz de provocar alterações
bioquímicas, bioelétricas e bioenergéticas nas células irradiadas, com a vantagem
de ser um método não invasivo, podendo ser empregado, inclusive, em gestantes e
portadores de marca-passo (PINHEIRO, 2008; KARU, 1999).
Os tecidos biológicos são responsíveis ao laser de baixa intensidade, devido
aos cromóforos (moléculas fotorreceptoras, capazes de absorver luz) que integram
compostos biomoleculares como as flavoproteínas, porfirinas, citocromo, melanina,
hemoglobina, tirosina e asparagina, presentes nas células. A interação do laser com
os diferentes cromóforos depende do comprimento de onda utilizada, o que
determinará alterações específicas no metabolismo celular, melhorando ou
reabilitando o seu funcionamento nos mais diversos tecidos (KARU, 1998; AMAT et
al., 2005; HUANG; HAMBLIN, 2012).
O principal mecanismo de ação, deste tipo de laser, é a fotobioestimulação
exercida sobre os cromóforos das membranas mitocondriais, cujo efeito sobre a
cadeia respiratória resulta em aumento da síntese de ATP (trifosfato de adenosina).
Desta forma, ocorre incremento da síntese protéica, com consequente estímulo à
proliferação celular, aceleração de mitoses e reequilíbrio do potencial de membrana,
resultando em aumento do trofismo celular, com conseqüente normalização de
deficiências (GENOVESE, 2000; KARU; PYATIBRAT; AFANASYEVA, 2005;
PINHEIRO, 2008).
A modulação do metabolismo celular, no tecido ósseo, por exemplo, promove
a diferenciação de fibroblastos, com normalização do depósito de fibras colágenas e
elásticas no tecido em reparação, além de otimizar a microcirculação, controlando o
processo inflamatório. Todos os efeitos biológicos observados decorrem de eventos
não térmicos (PASSARELLA et al., 1984; GENOVESE, 2000; SCHAFFER et al.,
2000; TUNÉR; HODE, 2002; WALSH, 2003; GAVISH; YURKE; IMRY, 2004;
VEDOVELLO FILHO et al., 2005; RENNO et al., 2006; CEPERA et al., 2008).
44
A ação fotobiológica resulta em modulação bioquímica no tecido irradiado,
promovendo a síntese e liberação de mediadores, como a histamina, serotonina,
bradicinina e heparina, ou por alterações nas reações enzimáticas (AMAT et al.,
2006).
A energia radiante, após ser absorvida e interagir em nível molecular, será
transduzida, promovendo a resposta tecidual objetivada pela ação terapêutica. A
intensidade desta interação é determinada pelo comprimento de onda, sua afinidade
pelo tecido irradiado e pelas características ópticas de cada tecido. A natureza desta
interação é específica, devido à propriedade de monocromaticidade do laser, que
corresponde a um único comprimento de onda, determinando quais biomoléculas
absorverão a radiação incidente. Assim, para cada comprimento de onda há um tipo
diferente de interação entre tecido e radiação laser. Os outros fatores que interferem
na biomodulação consistem na densidade de energia e no tempo de irradiação
(KARU, 1989; BRUGNERA JR; PINHEIRO, 1998; AMAT et al., 2006).
Smith (1991) propôs que as propriedades fotofísicas dos lasers de radiação
infravermelha agem na membrana celular aumentando a permeabilidade dos canais
de cálcio divalente (Ca++); o aumento da concentração deste cátion no meio
intracelular modula a síntese de ácido ribonucléico (RNA) e ácido
desoxirribonucléico (DNA). Os íons Ca++ são mensageiros intracelulares em muitos
sistemas de transdução sinalizada.
A dosimetria adequada depende de inúmeros fatores, como tipo de aparelho,
distância deste ao tecido alvo, tipo de laser, modo de liberação, número de
irradiações, duração do tratamento, entre outros, dependendo dos efeitos
terapêuticos buscados. Todavia, os parâmetros que norteiam a dosimetria ideal
ainda precisam ser melhor compreendidos (BRUGNERA JR; PINHEIRO, 1998).
Neste aspecto, Pinheiro e Gerbi (2006) ressaltaram que além da dose total de
irradiação, a duração das sessões e o modo de liberação são parâmetros
importantes na obtenção dos desfechos buscados: são encontrados na literatura
estudos com lasers na faixa do infravermelho, que mostram o efeito trófico sobre
osteoblastos e deposição de colágeno, como o trabalho de Ueda e Shimizu (2003)
45
no qual a proliferação osteoblástica foi aumentada quando a cultura de células
recebeu irradiação de laser AsGaAl no modo pulsado, acelerando a formação óssea.
Na literatura há muitos estudos sobre o efeito da LTBI na reparação de
tecidos lesados, onde a proliferação de fibroblastos de espécies variadas e a síntese
de matriz extracelular são estimuladas por este tipo de energia radiante
(BEDNARSKA et al., 1998; KREISLER et al., 2002; ALMEIDA-LOPES et al., 2001;
ZANG et al., 2004; FRIGO et al., 2009).
A efetividade da LTBI no controle do processo inflamatório também foi
constatada por Brugnera Jr e Pinheiro (1998) cujos achados revelaram a capacidade
do laser em inibir a síntese de mediadores inflamatórios. Estes resultados estão
alinhados com Yu et al. (1996) que antes demonstraram a inibição da IL-1 em
cultura de queratinócitos humanos. Já Sakurai, Yamaguchi e Abiko (2000)
apontaram para a modulação sobre a atividade de fibroblastos e a redução de
metabólitos do ácido araquidônico.
Os esforços de Neiburger (1999) e Moore, et al. (2005) demonstraram a
habilidade do laser de baixa intensidade em acelerar o processo de cicatrização
tecidual.
Dube, Bansal e Gupta (2003) constataram que células do sistema imune
também são suscetíveis aos efeitos fotobiológicos do laser, ao terem sua
proliferação e ativação aumentadas após irradiação, assim como os macrófagos,
cuja atividade fagocítica foi acentuada. A secreção de fatores de crescimento de
fibroblastos e a reabsorção de fibrina também foram estimuladas.
2.4.3 Laserterapia na regeneração óssea
O tecido ósseo tem se mostrado muito responsivo ao efeito biomodulador da
LTBI, conforme indica a literatura, tanto em estudos in vitro como in vivo. Muitos
autores têm investigado os efeitos do laser de baixa intensidade, buscando uma
correlação positiva com a osteogênese. Segundo Viegas et al. (2005) a LTBI pode
proporcionar maior deposição de matriz óssea, sobretudo no início do processo.
Veronesi e Munin (2006) e Casalechi et al. (2007) também mencionaram tais efeitos,
46
ressaltando a atividade promotora da reparação alveolar, neoformação óssea pós
disjunção palatina e reparação de fraturas, principalmente pelo estímulo à
proliferação de osteoblastos.
Nos estudos com radiação laser Hélio-Neônio (HeNe), este estímulo foi
demonstrado, porém com uma relação dose-dependente. Já as pesquisas com
Arsênio-Gálio-Alumínio (AsGaAl) evidenciaram sua elevada penetração tecidual,
devido a absorção pela hidroxiapatita, enquanto que a água e a hemoglobina
apresentam baixo coeficiente de absorção para este tipo de laser (FENERICH,
2009).
Utilizando laser diodo (comprimento de onda de 904nm e 20 J/cm² de
densidade de energia) Takeda et al. (1998) observaram o aumento na proliferação
de fibroblastos, melhora na formação de tecido de granulação cicatricial, aceleração
do fechamento das bordas epiteliais da lesão, deposição precoce de matriz óssea e
aceleração na formação das trabéculas após irradiação em alvéolos de
ratos,previamente submetidos a exodontia.
Trelles e Mayayo (1987) verificaram que o laser HeNe (comprimento de onda
632 nm, com energia incidente de 2,4 J/cm2, potência de 4 mW) irradiado em
sessões de 10 minutos, com intervalo de 48 horas; em um total de 12 sessões,
diminuiu o processo inflamatório, promoveu a vascularização e o aumento no
número de trabéculas ósseas em experimento com fratura tibial de ratos. Resultado
similar foi obtido por Yaakobi, Maltz e Oron (1996) ao também irradiarem laser HeNe
na região cortical da tíbia fraturada de ratos, onde o laser aumentou em duas vezes
o reparo ósseo. Freitas, Baranauskas e Cruz-Höfling (2000) compararam os efeitos
de três doses diferentes de HeNe no tratamento de fratura tibial de ratos, com doses
de 3,15 J/cm², 31,5 J/cm² e 94,7 J/cm², durante 8 a 15 dias. Os resultados
mostraram uma relação dose-dependente, na qual a dose 94,7 J/cm² acelerou o
reparo ósseo e aumentou sua área. Silva Jr et al. (2002) realizaram experimento
com 60 ratos, também submetidos a fratura de tíbia, irradiados com laser HeNe (632
nm, potência de 4 mW e densidade de 2,4 J/cm²) aplicado em um único ponto focal
a cada 48 horas, obtendo resultados similares aos autores já citados,com aumento
na velocidade de neoformação e densidade ósseas, em comparação ao grupo de
animais não irradiados.
47
Vários autores realizaram estudos com o laser AsGaAl, como Guzzardella et
al. (2002) que utilizaram este tipo de laser com 780nm, 30 J/cm², 300Hz e 1W para
irradiar células de fêmures de ratos em sessões de 10 minutos durante 10 dias. Os
autores mensuraram os níveis de fosfatase alcalina, cálcio e oxido nítrico e
constataram o aumento significativo destes indicadores, denotando aceleração da
formação óssea.
Neves et al. (2005) aplicaram laser AsGaAl (790 nm, 2J/cm2) obtendo efeito
analgésico, antiinflamatório e aceleração da reparação óssea nos casos de
expansão rápida da maxila em humanos, com aplicação em 3 pontos, em 2 e 3
sessões semanais. Já Galvão et al. (2006) aceleraram o reparo ósseo em
osteotomia realizada na tíbia de ratos da raça Wistar com a utilização de laser
AsGaAl (780nm, 30mW, 112,5J/cm2) em 12 sessões de 2,5 minutos cada.
Khadra et al. (2004) observaram maior concentração de cálcio e fósforo em
análise histomorfométrica do tecido tibial de coelhos irradiadas com laser AsGaAl,
após a colocação de implantes. Os autores concluíram que no grupo irradiado a
maturação óssea foi mais rápida. Os mesmos autores avaliaram o efeito do laser de
diodo AsGaAl (dosagens de 1,5 a 3 J/cm²) na síntese de fatores de crescimento em
cultura de células osteoblásticas mandibulares humanas e observaram maior síntese
de TGF-β1, diferenciação e proliferação deste tipo celular.
O incremento na atividade dos osteoblastos e a down-regulation na
osteoclastogênese foi demonstrada por Ninomiya et al. (2007) em experimento com
laser pulsado de 1064 nm, obtendo maior volume ósseo em um claro estímulo a
osteogênese. Esses achados corroboraram os resultados de Ozawa et al. (1998)
com cultura de células ósseas de ratos, irradiadas com laser AsGaAl (830 nm, 500
mW). Neste estudo os autores observaram o aumento da diferenciação e
proliferação de osteoblastos, maior atividade da fosfatase alcalina e aumento da
expressão do gene que codifica a osteocalcina, promovendo neoformação óssea.
2.4.4 Laserterapia na movimentação dentária induzida
A Ortodontia é uma das áreas de grande aplicação da LTBI, devido a suas
características bioestimulante e regenerativa, que proporcionam um meio eficaz de
48
modular a remodelação dos tecidos periodontais, acelerar a remodelação óssea
alveolar, auxiliar no controle do processo inflamatório associado e aumentar a
velocidade da movimentação dentária ortodonticamente induzida (KAWASAKI;
SHIMIZU, 2000; CRUZ et al., 2004; KIM et al., 2007; YAMAGUCHI et al., 2007;
FUJITA et al., 2008; YOUSSEF et al., 2008; DANIELE, 2009; VIEIRA, 2009).
Walsh (2003) salientou que, na dosimetria adequada, o laser de AsGaAl
estimula a micro-circulação;considerando que este efeito é extremamente desejável,
quando o objetivo é a reabsorção e a neo-formação ósseas, a LTBI pode consistir
em técnica de interesse na clínica ortodôntica.
Fenerich (2009) mencionou que o tecido ósseo, submetido à compressão por
movimentação ortodôntica, deposita mais cálcio após irradiação com laser AsGaAl.
Também os níveis de fosfatase alcalina, cálcio e óxido nítrico podem sofrer aumento
com a LTBI.
Um dos primeiros trabalhos em LTBI com finalidade ortodôntica foi realizado
por Saito e Shimizu (1997). Neste estudo, os autores avaliaram os efeitos do laser
AsGaAl (830nm, modo contínuo, 100mW, com densidade entre 126 a 420 J/cm²) na
regeneração óssea, após cirurgia de expansão da maxila de ratos. As sessões de
irradiação foram realizadas no dia da cirurgia e nos três dias subsequentes,
revelando que a neoformação óssea e a maturação das trabéculas foram mais
evidentes, quanto mais precoce foi a aplicação do laser, sendo que o grupo irradiado
somente uma vez, não mostrou diferença significante do grupo controle. Os autores
concluíram que a regeneração óssea está diretamente relacionada à dose aplicada,
número de aplicações e ao intervalo de tempo entre as sessões, além de enfatizar
que o osso formado nessas situações, apresenta qualidade superior àquele que não
sofreu o mesmo procedimento terapêutico.
Já Kreisler et al. (2003), em experimento in vitro, provocaram alta proliferação
de fibroblastos do ligamento periodontal humano, ao irradiá-los com laser AsGaAl,
809 nm, 10 mW, 7,84 J/cm2, durante 75, 150 e 300 segundos.
Cruz et al. (2004) utilizou a LTBI em 11 indivíduos, submetidos à retração dos
caninos. O estudo, que teve duração de 60 dias, teve o seguinte delineamento: o
laser foi irradiado na mucosa alveolar ao redor do canino de um dos hemiarcos
49
dentários superiores, sendo o canino do lado oposto o controle. O canino do lado
experimental recebeu ativação mecânica a cada 30 dias e irradiação de um laser de
diodo semicondutor de AsGaAl, com 780 nm, potência de 20mW e doses de 5 J/cm2,
em sessões de 10 segundos, durante 4 dias, em cada um dos dois meses de
estudo. O laser foi aplicado em cinco pontos na face vestibular e cinco na face
palatina, assim distribuídos: dois no terço cervical da raiz (mesial e distal), dois no
terço apical (mesial e distal) e um no terço médio (centro da raiz). O canino do lado
controle, apenas recebeu a ativação a cada 30 dias. Ao final do estudo, o canino do
lado irradiado de todos os pacientes, apresentou velocidade de distalização 30%
acima da velocidade desenvolvida pelo canino do lado controle.
Ferreira Filho (2006) analisou a analgesia em 42 indivíduos adultos de ambos
os sexos, após instalação de elásticos separadores, onde metade da amostra
recebeu aplicações de laser de diodo (790 nm, 2J/cm²) em duas sessões. O grupo
irradiado referiu demora no início da sensação dolorosa, com redução da
intensidade, além de demonstrar melhor resposta da movimentação dentária.
Dentes de ratos foram irradiados com laser AsGaAl (830nm, 100 mW, 18
J/ponto) uma vez por dia durante doze dias. As aplicações ocorreram em três pontos
de contato com a gengiva ao redor do 1º molar superior esquerdo, um por mesial,
outro por vestibular e o terceiro por palatino, com duração de 3 minutos por ponto. A
medição denotou que o movimento dentário no grupo irradiado foi 30% maior que no
grupo controle. Os resultados também revelaram que a proliferação celular no lado
de tensão foi mais acentuada, assim como a população de osteoclastos no lado de
pressão, quando comparados ao grupo não irradiado. Os autores concluíram que a
LTBI pode acelerar a remodelação óssea e o movimento dentário a ela associado
(KAWASAKI; SHIMIZU, 2000).
Stein et al. (2005) irradiaram células osteoblásticas de humanos in vitro com
laser HeNe (632nm, 10mW) e verificaram que a diferenciação, proliferação e
maturação das células irradiadas foi significativamente maior do que no grupo de
células não irradiadas.
Mendes (2005) utilizou laser AsGaAl (830nm, 100mW, diâmetro do feixe
0,6mm, 54J) por quatorze dias em dentes de ratos submetidos a movimentação
50
ortodôntica e concluiu que o laser promoveu a absorção óssea no lado de pressão.
Também Aihara, Yamaguchi e Kasai (2006) reiteraram que a LTBI estimula a
diferenciação e ativação de osteoclastos.
Limpanichkul et al. (2006) realizaram um estudo randomizado, duplo cego e
controlado por placebo, para testar a hipótese de que as forças mecânicas somadas
à laserterapia resultam em aumento de velocidade na movimentação ortodôntica.
Doze adultos jovens, que necessitavam de retração dos caninos superiores, usando
molas de retração fixadas à aparelhagem de Edgewise, participaram deste estudo,
onde um lado do arco foi irradiado e no oposto foi realizada uma pseudo-aplicação.
Após exodontia dos primeiros pré-molares do mesmo arco, receberam tratamento
com laser AsGaAl em oito pontos (860nm, potência de saída 100mW, densidade de
potência 1,11W/cm2, 2,3 J por ponto, dose total de 25 J/cm2) em sessões de 23
segundos por ponto, durante três meses. Foram irradiados três pontos na mucosa
alveolar vestibular e mais três pontos por palatino, sendo um na cervical, outro no
terço médio e mais um no ápice radicular, além de mais dois pontos na distal do
canino superior. As sessões ocorreram após a ativação mensal das molas por três
dias consecutivos no início e mais três dias no final de cada mês. Os resultados das
medições demonstraram que não houve diferença significante nos valores da
distalização dos caninos entre o lado irradiado e o lado placebo. Os autores
sugeriram que os resultados podem ter decorrido da dose utilizada, a qual foi
considerada baixa, a posteriori.
Segundo Goulart et al. (2006) o comprimento de onda e a dosimetria podem
determinar resultados opostos. A irradiação de laser de diodo AsGaAl com 780nm,
70mW, 5,25J/cm2, durante três segundos, pode acelerar o movimento ortodôntico,
enquanto que o mesmo tipo de laser com os parâmetros 660nm, 70mW, 35J/cm2,
durante 20 segundos, pode retardá-lo.
Yamaguchi et al. (2007) utilizaram um laser de 810 nm em modo contínuo
aplicado em três pontos por 3 minutos cada, na mesial, na vestibular e outro por
palatino ao redor do 1º molar superior, em aplicações de 3 minutos por ponto,
totalizando 54 J de energia total. Os achados revelaram que a LTBI estimulou a
atividade de remodelação óssea, aumentando a velocidade na movimentação
51
dentária através das expressões de M-CSF e C-fms, diminuindo o tempo de
tratamento ortodôntico.
Já Seifi et al. (2007) que também compararam os efeitos provocados por
lasers, com comprimento de onda diferentes, obtiveram resultados controversos na
cavidade oral de coelhos. O laser foi aplicado uma vez por dia, durante nove dias,
em contato com a gengiva por palatino ao redor do 1º molar superior. Um grupo
recebeu aplicações de laser de 850 nm em modo pulsado, com potência de 5mW,
totalizando 8,1 J, por 3 minutos por ponto; o outro grupo foi irradiado com laser 630
nm em modo contínuo, com potência de 10mW, totalizando 27 J de energia, por 5
minutos por ponto. Os resultados apontaram que a movimentação dentária foi 50%
mais rápida no grupo controle, quando comparado a ambos os grupos de irradiados.
Youssef et al. (2008) em estudo semelhante ao realizado por Cruz et al. em
2004 e Limpanichkul et al. em 2006, tratou com laser diodo AsGaAl (809 nm, 100
mW, 8 J/cm2) 15 pacientes submetidos à retração dos caninos. Este estudo foi
delineado tendo um dos lados do arco dentário superior e inferior como grupo
experimental e o outro lado como grupo controle. Foram avaliadas velocidade de
distalização dos caninos e percepção de dor. O tratamento foi iniciado com a
exodontia dos primeiros pré-molares superiores e inferiores, devido à insuficiência
de espaço para o correto alinhamento dos dentes, ou presença de biprotrusões. O
tratamento ortodôntico foi iniciado 14 dias após a extração dos pré-molares. A
retração dos caninos foi acompanhada do uso de molas pré-fabricadas em ambos
os arcos. O lado experimental (direito) foi irradiado com o laser, cuja ponteira foi
aplicada na gengiva por vestibular e por lingual. O tempo de aplicação variou
segundo o ponto aplicado: cervical, 10 segundos; ponto no terço médio, 20
segundos e o terceiro no ápice da raiz, por mais 10 segundos. O laser foi aplicado
nos dias zero, três, sete e quatorze. A mola foi reativada no 21º dia em ambos os
lados. A retração do canino foi mensurada com um paquímetro digital e comparada
com o dente oposto do mesmo arco dentário. A velocidade da movimentação dos
caninos, em ambos os arcos dentários, foi significantemente maior no lado irradiado
do que no lado controle e a percepção de dor, avaliada através de um questionário
respondido pelo paciente, foi menor no lado irradiado.
52
Abi-Ramia et al. (2010) observaram a intensificação da neovascularização
provocada pelo laser de baixa intensidade (AsGaAl, 830 nm, 100 mW, 18 J/cm2), no
tecido pulpar de ratos submetidos à movimentação ortodôntica. No grupo irradiado,
a LTBI provocou um afluxo maior de fibroblastos e demais células diferenciadas,
resultando em aumento da deposição de fibras colágenas, em comparação com o
grupo controle, também submetido à movimentação dentária, porém sem tratamento
com laser. Os autores concluíram que a LTBI otimiza o tratamento ortodôntico,
devido à aceleração do reparo do tecido pulpar.
Com o objetivo de observar os efeitos do laser em alguns dos fatores
desencadeantes da osteoclastogênese e seu papel na velocidade da movimentação
dentária induzida, Yamaguchi et al. (2010) irradiaram os molares de um grupo de
ratos Wistar, submetidos à movimentação por aplicação de 10 g de força. Todos os
50 animais do experimento foram submetidos à movimentação ortodôntica e então
divididos em dois grupos: irradiados e não-irradiados. Para mensurar a velocidade
da movimentação, as maxilas de ambos os grupos foram moldadas com silicone
antes e depois da indução do movimento, durante todos os dias do experimento,
para confecção de modelos de gesso. Esses modelos foram então digitalizados,
através de um aparelho de medição tridimensional por contato (3-D), possibilitando a
mensuração da velocidade de movimentação. Os autores realizaram uma sessão
diária de aplicação do laser AsGaAl (810nm, 100mW, 54 J de densidade total) sendo
que o número total de sessões variou segundo o dia do sacrifício (1, 2, 3, 4 e 7),
quando o tecido periodontal foi removido e encaminhado à análise histológica e
imuno-histoquímica. Os resultados demonstraram que, em relação ao grupo
controle, os irradiados apresentaram no dia 3, principalmente, uma maior expressão
de metaloprotease-9 (MMP-9), catepsina K e subunidades alfa v e beta 3 das
integrinas, que são os fatores desencadeantes da osteoclastogênese, além de terem
observado um maior número de lacunas de reabsorção, com osteoclastos
multinucleados na superfície do osso alveolar no sétimo dia do experimento. As
maxilas digitalizadas demonstraram que a velocidade de movimentação dentária foi
maior no grupo irradiado, em comparação ao grupo controle. Desta forma, os
autores concluíram que a LTBI aumentou a velocidade de movimentação dentária,
devido à maior expressão dos fatores desencadeantes da osteoclastogênese.
53
2.5 Laserterapia e IL-10
A IL-10 é uma citocina antiinflamatória e ativa no processo de reparação
tecidual, desempenhando um papel importante na remodelação tissular, em
resposta às forças ortodônticas. Todavia, inexistem estudos sobre a influência do
laser de baixa intensidade sobre a expressão de IL-10, na movimentação dentária
induzida. Desta forma, estão elencados abaixo os escassos estudos sobre a
interação da LTBI e a IL-10 na clínica geral.
Ademais, convém ressaltar que a interação entre as diversas modalidades da
LTBI na modulação da IL-10 é ainda controvertida na literatura, demonstrando a
necessidade de protocolos e parâmetros bem descritos para revisões sistemáticas
futuras.
Boschi et al. (2008) realizaram um experimento, no qual trataram pleurisia
induzida em ratos Wistar, com laser Indio-Gálio-Alumínio-Fósforo (InGaAIP) 660 nm,
20 mW, em modo contínuo, em três dosagens diferentes (0,9 J; 2,1 J e 4,2 J por
cm2). O líquido pleural aspirado do grupo dos animais tratados com 2,1J/cm2 de
dosagem de energia, continha menos leucócitos e menor expressão de NO, TNF-α,
MCP-1, IL-6 e IL-10 na comparação com o grupo controle sem tratamento. Os
autores concluíram que a LTBI induziu um efeito antiinflamatório dose-dependente.
Marcos (2010) comparou os efeitos do diclofenaco de sódio com o laser
infravermelho, aplicado em três densidades de energia diferentes, no tratamento de
tendinite induzida em ratos Wistar. Os animais foram alocados em grupos
experimentais, sendo que em um deles, foi injetada uma solução salina na região
peritendínia, servindo como controle. Nos demais animais do experimento, foi
induzida uma inflamação através de injeção transcutânea de colagenase no tendão
calcâneo. Estes animais foram distribuídos nos seguintes subgrupos: tratados com
diclofenaco de sódio 30 minutos antes da indução de inflamação, irradiados com 1
Joule, irradiados 3 Joules, irradiados 6 Joules e um grupo que não recebeu
tratamento algum. Os animais foram irradiados por contato em um único ponto na
região da injeção, em uma dose única, 1 hora após a indução do processo
inflamatório. O tempo de aplicação variou de acordo com a densidade de energia.
Após o sacrifício, os tendões foram removidos e a expressão de IL-10, citocinas
54
inflamatórias, COX-1 e COX-2 e PGE2 foram analisadas. Os resultados apontaram
para a efetividade da LTBI, com a densidade energética de 3J, que reduziu a
expressão de COX-2, o infiltrado inflamatório, o edema e a atividade neutrofílica,
enquanto que determinou um grande incremento de IL-10 nas amostras desse
grupo. O autor observou que o laser nos parâmetros 810nm,100mW, densidade de
energia 3J/cm2, apresentou melhor performance que o diclofenaco de sódio na
mensuração de todos os mediadores avaliados.
Mozzati et al. (2011) aplicou laser de baixa intensidade (904 nm , 200 mW ,
180 J/cm2) em 10 indivíduos adultos submetidos a extração dentária bilateral. Neste
estudo cada paciente recebeu sessões de laser na cavidade alveolar pós extração
de um dos dentes, sendo que a outra cavidade não recebeu tratamento algum,
funcionando como controle. As aplicações foram realizadas por sete dias
consecutivos, com duração de 15 minutos. Amostras de tecidos moles foram obtidas
antes da extração e sete dias após a exodontia, para análise da expressão de
mediadores inflamatórios. Os resultados revelaram que as amostras irradiadas
apresentaram menor concentração de ciclo-oxigenase-2 (COX-2), IL-1β, IL-6 e IL-10
após sete dias de tratamento, desenvolvendo um processo inflamatório muito menos
intenso do que na outra cavidade alveolar que não recebeu a LTBI, além dos
pacientes referirem menos dor no local tratado.
Laraia (2011) em experimento com ratos Wistar, analisou os níveis de
expressão de mediadores da inflamação, em resposta à terapêutica com laser
InGaAIP no tratamento de lesão cortante no tendão calcâneo. Os animais foram
alocados em três grupos experimentais de acordo com o momento da eutanásia: 6
horas, 24 horas e 72 horas após a tricotomia tendínea, sendo que cada grupo foi
subdividido em irradiados e controles. Estes últimos, portanto, também foram
submetidos à lesão, mas não foram tratados com LTBI. As aplicações com o laser
InGaAIP (660 nm, 100mW, 6 J/cm2 de densidade de energia obtida com afastador
de 1 cm2) foram iniciadas logo após a tricotomia do tendão, com uma sessão diária
de 60 segundos, em ponto único, até a data do sacrifício, quando os tendões foram
removidos e levados para análise. A expressão das interleucinas pró-inflamatórias
IL-1β e IL-6 e a antiinflamatória IL-10 foram mensuradas por teste imunoenzimático
(ELISA). Os resultados mostraram que o laser foi eficaz na redução da expressão
55
das citocinas inflamatórias, sendo que a IL-1β reduziu em todos os grupos tratados,
enquanto que a IL-6 apresentou redução apenas no grupo com mais tempo de
exposição ao laser (72 h). Já a expressão de IL-10 apresentou aumento significativo
em todos os grupos irradiados (6h: 32.811.9; 24h: 36.69.2; 72h: 25.03.3) quando
comparada ao grupo controle relacionado (6h: 10.20.9, p=0.0007; 24h: 27.75.7,
p=0.0256; 72h: 10.37.3, p<0.0001). A autora concluiu que a LTBI nos parâmetros
utilizados, foi efetiva na modulação do processo inflamatório e na reparação tecidual.
No mesmo ano, Taciro (2011) utilizou laser AsGaAl, 685 nm, 5,4 W/cm2 para
tratar o tendão de ratos Wistar jovens e adultos, após tenotomiaradical do calcâneo.
O autor testou o laser em duas densidades de energia (3 J/cm2e 10 J/cm2), em 12
sessões consecutivas, uma vez ao dia, em ponto único, no local da lesão. A
expressão de NO, IL-1β e IL-10 foram avaliadas. Os resultados demonstraram que a
LTBI não alterou os níveis de NO em nenhum dos grupos tratados, enquanto que as
concentrações de IL-10 e IL-1β aumentaram no grupo adulto irradiado com 3 J/cm2,
o que, a princípio, parece ser um dado contraditório. Nos demais grupos irradiados
com 10 J/cm2, a expressão de IL-10 diminuiu em ambas as idades. Os autores
concluíram que a idade é uma variável clínica importante na parametrização da LTBI
e que há uma relação dose-dependente na modulação da expressão dos
mediadores da inflamação, resultando em janelas inibitórias ou estimulatórias,
dependendo dos parâmetros utilizados.
Oliveira et al. (2013) compararam os efeitos do laser AsGa (780 nm, 70mW,
3,8 J/cm2, em modo pulsado) com o fármaco imunossupressor azatioprina (AZA) em
experimento com ratos com hipersensibilidade tardia a ovoalbumina. Os animais
foram separados em grupos, segundo o tipo de intervenção, além do grupo controle.
As aplicações de laser ocorreram na cauda dos animais durante seis dias, em
sessões diárias com duração de dez segundos cada. Os resultados demonstraram
que o efeito imunomodulador da LTBI foi similar ao tratamento com o fármaco, não
apresentando diferenças estatisticamente significativas. Desta forma, tal como
ocorrido no grupo tratado com o AZA, o laser promoveu a diminuição dos
mediadores TNF-α, IFN-γ e IL-10 e do infiltrado inflamatório.
Oliveira (2013) testou os efeitos da fototerapia nos métodos laser e LED (Light
Emitting Diode) ambos de baixa intensidade, no tratamento de inflamação induzida
56
no tendão calcâneo de 60 ratos Wistar. Os animais foram distribuídos em 12 grupos
(6 para estudo com laser e 6 com LED).Grupo laser: um grupo controle, sem
indução de inflamação; dois grupos com tendinite não tratada: 7 e 14 dias e três
grupos tratados com LTBI: durante 7 e 14 dias e um tratado tardiamente, do 7º ao
14º dia. Exatamente o mesmo esquema foi utilizado para o grupo LED. A tendinite
foi induzida com injeção de colagenase no tendão calcâneo, sendo que os
procedimentos terapêuticos tiveram início 12 horas após esta indução. Os
parâmetros do laser utilizado foram 780 nm, 22mW, 7,7 J/cm2 , em modo contínuo,
com duração de aplicação de 70 segundos, enquanto que os do LED foram: 880 nm,
22mW, 7,5 J/cm2, com duração de aplicação de 170 segundos. O mesmo esquema
de aplicação foi adotado em ambos, com intervalo entre sessões de 48 horas, com
aplicação em ponto único, na região lesionada, sendo que os animais com tendinite
não tratada foram submetidos à simulação com o aparelho desligado. As eutanásias
foram realizadas no 7º e 14º dia do experimento e os tendões removidos. Foram
realizadas análises histomorfométricas, utilizada espectroscopia Raman, para
quantificação dos colágenos e RT-PCR para mensurar a expressão de RNAm para
VEGF, colágenos tipos 1 e 3, metaloproteinases e IL-10. Os resultados
demonstraram que no grupo laser, em comparação com os grupos sem tratamento,
houve diminuição do infiltrado inflamatório, tanto no grupo tratado por 7 dias como
no tratado por 14 dias e aumento significativo da expressão de RNAm para IL-10 em
todos os grupos tratados. Também ocorreu aumento significativo do RNAm para o
VEGF nos ambos os grupos irradiados (7 e 14 dias) porém não mostrou diferença
no grupo que iniciou o tratamento tardiamente, assim como nas metaloproteinases.
A expressão de RNAm para o colágeno tipo 1 aumentou nos grupos tratados por 14
dias, inclusiveno grupo tardio.Todavia, não houve diferença no período experimental
de 7 dias, enquanto que para o colágeno 3, houve aumento do RNAm em ambos os
períodos (7 e 14 dias), quando comparado a controles e inflamados sem tratamento.
O desempenho da fototerapia com LED teve algumas similaridades com o laser,
porém na comparação entre as duas técnicas, o VEGF não mostrou diferença em
nenhum grupo tratado, o colágeno 1 somente aumentou na fase inicial do
tratamento, enquanto que o incremento na concentração de RNAm para IL-10
também ocorreu apenas nos primeiros sete dias e com menor expressão quando
comparado ao laser.
57
3 OBJETIVOS
• Investigar o efeito potencial da terapia laser de baixa intensidade na
expressão da Interleucina-10 na fase aguda da inflamação do periodonto de
inserção de ratos submetidos à movimentação ortodôntica.
58
4 METODOLOGIA
4.1 Animais Experimentais
O projeto foi avaliado e aprovado pela Comissão de Ética para Análise de
Projetos de Pesquisa, na Universidade Cruzeira do Sul (protocolo CE/UCS-
006/2013) (ANEXO A).
Foram utilizados 35 ratos machos, da linhagem Wistar (Rattusnorvegicus)
pesando entre 200 e 300 gramas e mantidos sob condições controladas, conforme
preconizado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA).
Os animais foram fornecidos pelo biotério da Universidade Cruzeiro do Sul,
onde foram mantidos durante todo o período experimental, sendo alimentados com
ração balanceada (Labina Purina®) e água mineral ad libitum. A ração fornecida foi
pulverizada e umidificada com água mineral, para evitar danos ao dispositivo
ortodôntico durante a mastigação, exigindo a sua troca diária para evitar a formação
e proliferação de fungos.
A temperatura ambiente foi mantida entre 21 e 23ºC e em condições
adequadas de luminosidade, com ciclo claro/escuro de 12 horas. O
acondicionamento foi efetuado em gaiolas individuais, forradas com raspas de
madeira seca, garantindo as condições sanitárias ideais à saúde e bem-estar dos
animais.
4.2 Grupos experimentais
Os animais foram divididos aleatoriamente, em dois grupos experimentais:
grupo não-irradiado (TO/SL), composto de 15 animais submetidos à movimentação
dentária ortodôntica; e grupo-irradiado (TO/L), com 15 animais submetidos à
movimentação dentária ortodôntica e à irradiação de laser de baixa intensidade.
59
Os animais dos grupos experimentais (TO/SL e TO/L) foram distribuídos em
seis subgrupos, divididos de acordo com o momento do sacrifício (72hs, 120hs,
168hs), conforme descrito no Quadro 1.
Um grupo de 05 animais foi utilizado como controle, sem laser e sem
movimentação ortodôntica (STO/SL).
Grupos Sacrifício Subgrupos N° de Animais
Não-Irradiado (TO/SL)
72 horas (3 dias) 72h-TO/SL 5
120 horas (5 dias) 120h-TO/SL 5
168 horas (7 dias) 168h-TO/SL 5
Irradiado (TO/L)
72 horas (3 dias) 72h-TO/L 5
120 horas (5 dias) 120h-TO/L 5
168 horas (7 dias) 168h-TO/L 5
Controle (STO/SL) 5
Quadro 1 – Distribuição dos animais utilizados no experimento
Os animais do grupo TO/SL caracterizaram os aspectos clínicos e imuno-
histoquímicos da movimentação dentária, sem a influência do laser, servindo como
parâmetro para comparação com animais do grupo TO/L e STO/SL, da mesma
forma que o grupo STO/SL serve de parâmetro para comparação com os grupos
TO/SL e TO/L.
4.3 Procedimentos experimentais
O dispositivo ortodôntico utilizado consistiu de uma mola helicoidal fechada
de níquel-titânio de tração com 7 mm de comprimento (ref. 35.20.064- Morelli),
distendida entre os incisivos superiores e o primeiro molar superior direito para
promover a mesialização do molar (Figura 6), criando áreas de pressão e de tração
no ligamento periodontal.
Os animais foram previamente anestesiados em todos os procedimentos
com risco de resultar em ansiedade e/ou dor, com cloridrato de ketamina e xilazina
(2:1) 1,5 cc por 100 gramas dekg/peso, administrada por via intramuscular, com
agulha hipodérmica descartável, acoplada à seringa de 1cc.
60
Figura 6 - Dispositivo ortodôntico instalado e preso com resina no 1º molar e nos incisivos.
Iniciou-se a montagem do dispositivo com o animal posicionado em decúbito
dorsal e mantido em mesa operatória apropriada. Realizou-se uma perfuração na
mesial dos incisivos superiores com uma broca diamantada n°1090 (KG.Sorensen) e
com um motor de alta rotação Kavo (Figura 7).
61
Figura 7 - Perfuração com motor de alta rotação e broca diamantada na mesial dos incisivos superiores.
Essa perfuração serviu para passar o fio de amarrilho 0,25mm (Morelli), que
envolveu o incisivo superior e, nesse amarrilho, fixou-se a extremidade anterior da
mola.
Com o objetivo de aumentar a retenção do amarrilho, impedindo seu
deslocamento, este foi recoberto com resina composta (Fill Magic ortodôntico) e
fotopolimerizada com um aparelho fotopolimerizador (GnatusOpty600). A adição de
resina foi precedida pelo preparo da superfície dentária, o qual incluiu: profilaxia,
lavagem, secagem, condicionamento da superfície (ácido ortofosfórico a 37%), nova
lavagem e secagem (de acordo com o fabricante).
Na região posterior utilizou-se fio de amarrilho 0,25mm para envolver o
molar que passou por baixo do ponto de contato desse dente com o segundo molar,
fixando a extremidade posterior da mola, utilizando-se uma pinça Mathiew (Figuras 8
e 9).
62
Figuras 8 e 9 (abaixo) - Amarrilho na região posterior envolvendo molar.
Depois de cortado o excesso de fio, a ponta foi dobrada de modo a não
causar trauma ou desconforto para o animal; logo em seguida realizou-se o preparo
da superfície dentária, o qual incluiu: profilaxia, lavagem, secagem, condicionamento
da superfície (ácido ortofosfórico a 37%), nova lavagem e secagem (de acordo com
o fabricante); para aumentar a retenção do amarrilho, impedindo seu deslocamento,
este foi recoberto com resina composta (Fill Magic ortodôntico) e fotopolimerizada
com aparelho fotopolimerizador (Gnatus 600) (Figuras 10 e 11).
63
Figuras 10 e 11 (próxima página) - Resina utilizada para fixar o amarrilho.
A mola foi ativada para liberar uma força de 250mg, calibrada por um
tensiomêtro (Morelli) (Figura 12). Não foram realizadas reativações.
64
Figura 12 – Tensiomêtro calibrado a força aplicada.
Por fim, as bordas dos incisivos inferiores foram reduzidas com brocas diamantadas
nº1090 (K.G.Sorensen) para evitar possíveis interferências oclusais com o
dispositivo instalado (Figura 13).
65
Figura 13 – Desgaste nos incisivos inferiores para evitar interferências.
Em seguida, foi realizada a aplicação do laser de baixa intensidade AsGaAl
(PHOTON LASE III - DMC), tensão de operação: 90 a 230V, potência elétrica: 1,2W,
emissor invisível de luz em comprimento de onda: 808nm (típico) na potência de
100mW, emissão contínua na região do molar com uma densidade de energia de
5J/cm2 (Figura 14).
66
Figura 14 – Aparelho utilizado no estudo.
As aplicações do laser foram realizadas segundo o protocolo estabelecido
por Genovese (2000), com sessões diárias por três dias consecutivos, sendo a
primeira imediatamente após a instalação do aparelho ortodôntico e as demais
24horas e 48horas depois. As irradiações foram feitas através de fibra óptica
utilizando-se o método direto e pontual sobre a região vestibular e lingual do primeiro
molar permanente superior direito. O tempo de aplicação foi de 50 segundos,
totalizando um período de 1 minuto e quarenta segundos de aplicação por animal.
No grupo não-irradiado (TO/SL) foi utilizado o mesmo procedimento para
preparar os molares e o incisivo, mas não foi aplicado o laser.
Decorridos os períodos de 72hs, 120hs e 168hs os animais foram
sacrificados com overdose de anestésico (hidrato de cloral) 1ml/100grs do animal.
Após o sacrifício, as maxilas dos animais foram submetidas ao processamento
histológico.
4.3 Preparo e processamento das peças para análise imuno-histoquímica
Os procedimentos laboratoriais foram realizados no Laboratório de Imuno-
histoquímica da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP).
67
As maxilas permaneceram imersas em solução de formol (10%) por 48h
para a fixação dos tecidos e, em seguida, descalcificadas em solução de ácido
fórmico (25%) por 7 dias.
As peças foram incluídas em parafina paralelamente em relação à superfície
da mandíbula e a seguir os cortes histológicos foram cortados transversalmente com
4µm de espessura em micrótomo manual (Leica-RM2145).
Os cortes histológicos foram então dispostos sobre lâminas silanizadas (3-
Aminopropil-trietoxi-silano-Sigma ChemicalCo.; St. Louis, Missouri, EUA) em suporte
adequado.
A etapa seguinte consistiu na desparanifinização dos cortes, na qualas
lâminas foram colocadas em xilol aquecido e mantidas em estufa (60 a 65ºC) por 5
minutos. Após, as lâminas passaram por três banhos em xilol frio.
A hidratação dos cortes foi realizada mediante banhos sucessivos em
alcoóis de concentração decrescente: dois banhos em álcool absoluto, um banho em
álcool 95° e um banho em álcool 70°. Em seguida, as lâminas foram lavadas em
água corrente e depois em água deionizada. Após a hidratação, as lâminas
permaneceram em tampão fosfato com pH 7,4.
Os preparados histológicos foram então processados para recuperação
antigênica, realizada em alta temperatura em solução de ácido cítrico 10 mM com
pH 6.
Para o bloqueio da peroxidase endógena, presente nas hemácias, os cortes
histológicos foram tratados com água oxigenada a 3%. Já o bloqueio das proteínas
inespecíficas foi feito mediante imersão das lâminas em caseína diluída em tampão
fosfato pH 7,4 (Synth, São Paulo, Brasil) por 5 minutos em temperatura ambiente.
Depois de lavados, os cortes histológicos foram primeiramente incubados a
4ºC com o anticorpo primário para IL-10, diluído em 1% de albumina de soro bovino
(BSA) por 24 horas, na proporção de 1:150. Após, foram incubados com o anticorpo
secundário ABC Kit Vectastain (Vector LabCA). O cromógeno utilizado foi a
Diaminobenzidina (DAB) (Sigma-AldrichChemie, Steinheim, Alemanha).
68
Posteriormente, foi realizada a contra-coloração com Hematoxilina de Harris (Merck,
Darmstadt, Alemanha).
4.3.1 Análise morfométrica – imuno-histoquímica para IL-10
As lâminas foram examinadas ao microscópio através de lentes objetivas
com 200 vezes de aumento. O campo microscópico foi movimentado ao longo das
raízes do 1°molar superior direito.
O efeito dos tratamentos sobre a expressão da IL-10, observado na reação
de imuno-histoquímica, foi analisado pela quantificação da área marcada
positivamente para esta proteína. Toda a região correspondente ao ligamento
periodontal foi fotografada nos aumentos de 100x (objetiva de 10x) e 200x (objetiva
de 20x), pela câmera CoolSNAP-Procf (Media CyberneticsInc) acoplada ao
microscópio Nikon Eclipse-E800. Porém, para a quantificação da área marcada para
IL-10, foram utilizadas somente as imagens obtidas com aumento de 200x. Após a
obtenção das imagens, a área marcada foi identificada por ferramenta de
reconhecimento colorimétrico, com auxílio do sistema computadorizado de imagens
Image-ProPlus, versão 4.5 (Media CyberneticsInc). Esta ferramenta possibilita que o
usuário forneça para o sistema a cor correspondente à marcação positiva para o
colágeno de interesse, e a partir desta padronização, o sistema reconhece e
quantifica a área. Em seguida, as áreas marcadas foram somadas individualmente
por lâmina e calculada a porcentagem de IL-10, em relação à área total analisada.
Os resultados foram expressos em porcentagem média e desvio padrão.
4.4 Análise estatística
As áreas percentuais obtidas com a análise da marcação da interleucina 10
(IL-10) foram submetidas ao teste estatístico não paramétrico de Mann Whitney, com
auxílio do programa GraphPadPrism, versão 3.0. As comparações foram realizadas
inter e intra grupos e consideradas estatisticamente significativas as diferenças onde
p < 0,05.
69
5 RESULTADOS
As análises dos níveis de IL-10 foram realizadas nos três momentos do
estudo: após 72h, 120h e 168h, além do marco zero como controle (ANEXO B).
A quantificação de IL-10 por reação imuno-histoquímica, revelou que a área
marcada para esta interleucina, variou de 1,42% a 7,15% nas lâminas analisadas
(Quadro 2).
A estratificação por períodos demonstrou que após 72h do início do
experimento, foi encontrada diferença estatisticamente significante (p< 0,01) entre os
subgrupos não-irradiado e irradiado neste momento do estudo, com valores entre
4,67% e 1,42% de área marcada para IL-10, respectivamente. Após 120 horas, os
valores encontrados para os subgrupos 120h-TO/SL e 120h-TO/L foram 3,99% e
4,34%, respectivamente, onde não foi observada diferença estatisticamente
significante (p>0,05). No momento final do estudo, após 168 h, o subgrupo irradiado
apresentou o valor 3,87%, enquanto que o subgrupo não-irradiado apresentou
7,15% de área marcada para IL-10, um valor estatisticamente maior do que no grupo
irradiado (p< 0,01). A síntese das mensurações pode ser observada na figura 15. As
comparações entre os subgrupos de irradiados estão destacadas na figura 16.
Figura 15– Expressão de IL-10 para os subgrupos experimentais após 72h, 120h e 168h.
70
Figura 16– Expressão de IL-10 para os subgrupos experimentais após 72h, 120h e 168h. Comparações entre os subgrupos de irradiados.
* Diferença estatisticamente significativa em relação aos subgrupos TO/SL em 72h e 168h.
a Diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo 72h-TO/L; teste de Mann-Whitney, p = 0,0079.
Momento Subgrupos Média (%) Desvio Padrão
Após 72 horas 72h-TO/SL 4,67 0,44 72h-TO/L 1,42 0,31
Após 120 horas 120h-TO/SL 3,99 0,42 120h-TO/L 4,34 1,16
Após 168 horas 168-TO/SL 7,15 0,78
168-TO/L 3,87 0,76
Marco zero STO/SL (controle) 1,34 0,60
Quadro 2 – Expressão de IL-10 (%) por subgrupo, nos três momentos do experimento.
Abaixo seguem fotomicrografias dos cortes histológicos preparados por
método imuno-histoquímico, nos diferentes momentos do experimento. A primeira
imagem (Figura 17); é a fotomicrografia de lâmina do grupo controle (STO/SL), em
aumento de 100 vezes para melhor visualização da regiãodo ligamento periodontal,
no momento zero do experimento.
71
As duas próximas imagens referem-se às lâminas obtidas após 72 horas do
início do experimento. A Figura 18 consiste em amostra do grupo não-irradiado (72h-
TO/SL) e a Figura 19 do grupo irradiado no mesmo momento experimental. Na
sequencia, são apresentadas duas imagens (Figuras 20 e 21) do momento final do
experimento. Todas as imagens dos subgrupos mostram o lado de tensão do LPD,
em aumento de 200 vezes.
Figura 17– Preparado histológico (método imuno-histoquímico) do grupo controle, mostrando o LPD (seta), no momento zero. Aumento de 100x.
72
Figura 18– Preparado histológico do lado de tensão do LPD do subgrupo 72h-TO/SL (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x.
Figura 19– Preparado histológico do lado de tensão do LPD do subgrupo 72h-TO/L (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x.
73
Figura 20– Preparado histológico do lado de tensão do LPD do subgrupo 168h-TO/SL (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x.
Figura 21 – Preparado histológico do lado de tensão do LPD do subgrupo 168h-TO/L (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x.
A expressão de IL-10 entre os subgrupos de irradiados (Figura 22) também
foi observada, sendo encontradas diferenças estatisticamente significantes na
comparação do subgrupo 72h-TO/L em relação aos demais, 120h-TO/L e 168h-TO/L
74
(p< 0,01). A Figura 23 consiste em amostras do PDL dos três subgrupos do grupo
irradiado, fotografadas em aumento de 100 vezes, onde se tem melhor visualização
do LPD; lembrando que as fotomicrografias utilizadas na quantificação de IL-10
foram aquelas que estão acima, com aumento de 200 vezes (Figura 22).
Figura 22– Lâminas do lado de tensão do LPD do grupo irradiado nos três momentos do experimento (método imuno-histoquímico). Aumento de 200x.
75
Figura 23– Lâminas do LPD do grupo irradiado nos três momentos do experimento (método imuno-histoquímico). Aumento de 100x.
76
6 DISCUSSÃO
A importância do processo inflamatório para a movimentação ortodôntica
tem sido alvo de muitos estudos no meio científico, porém, muitas das
especificidades que envolvem a modulação exercida pelos mediadores inflamatórios
na evolução e resolução deste processo, permanecem por ser desvendadas.
Tais aspectos, ainda pouco compreendidos, resultam nos posicionamentos
contraditórios encontrados na literatura, quanto ao papel do processo inflamatório na
remodelação óssea alveolar. Para Thilander, Rygh e Reitan (2002) e Tuncay (2004)
o uso de fármacos antiinflamatórios, durante a intervenção ortodôntica, retarda o
movimento dentário. Já Consolaro (2007) questiona tal afirmação, apontando que a
extrapolação de achados oriundos de experimentos com animais, devem ser
considerados de maneira criteriosa, uma vez que nem todos os trabalhos observam
a metodologia da extrapolação alométrica, que prevê a dosagem adequada de
fármaco a ser extrapolada para os seres humanos.
Experimentos com fármacos e modelos animais devem levar em
consideração as doses elevadas ministradas por períodos muito longos, se
considerarmos o tempo de vida destes animais. O rato, por exemplo, vive em média
um ano e meio e submetem-no a medicação por 2 a 3 meses, o equivalente a 1/6 da
sua vida média. Portanto, a extrapolação também deve levar em conta este aspecto.
Desde 2003, Consolaro vem apontando essas imprecisões metodológicas.
Este autor observou que o turnover ósseo dos ossos maxilares está entre os mais
lentos, quando se considera o esqueleto como um todo. Portanto, para que um
fármaco atrase a movimentação dentária, este deve ser ingerido em altas doses e
por tempo prolongado. A efetividade de um medicamento para interferir no turnover
ósseo maxilar deve se basear em um efeito altamente específico para esta região,
ou então, sua aplicação deverá ser local.
Consolaro (2003) expôs as vantagens de se criar um medicamento que
modulasse o turnover ósseo maxilar: 1) Controlar a velocidade da movimentação
dentária e influenciar no tempo do tratamento ortodôntico; 2) Atender com segurança
77
as necessidades ortodônticas de pacientes com doenças crônicas controladas por
medicamentos; e 3) Reduzir o risco de reabsorções dentárias.
Segundo estas afirmações, chegamos à conclusão de que a LTBI, por ser
uma terapia de uso local, não possuir efeitos colaterais dentro das normas de
aplicação preconizadas e ter sua atuação comprovada cientificamente na modulação
inflamatória, apresenta-se como uma alternativa interessante para controlar a
velocidade da movimentação dentária, reduzir o tempo do tratamento ortodôntico e
diminuir a dor durante este tratamento, ainda que o exato mecanismo pelo qual o
laser exerça esse papel, não seja totalmente compreendido.
O mecanismo de ação de vários mediadores inflamatórios, também guarda
muitos aspectos ainda por elucidar. Dentre entes, as interleucinas com suas ações
pleiotrópicas e imunomoduladoras, são exemplos de objetos complexos de
investigação, apresentando resultados controversos em muitos dos trabalhos
presentes na literatura (MOORE et al., 2001).
Por outro lado, a utilização do laser de baixa intensidade, mesmo
apresentando resultados consistentes no ganho de qualidade dos tratamentos
ortodônticos, ainda reserva grandes desafios, como o estabelecimento de protocolos
parametrizados de aplicação, o que os tornaria adequadamente comparáveis,
facilitando a obtenção de metodologias progressivamente mais efetivas (PEREIRA,
et al., 2002).
Se os trabalhos sobre a interação entre LTBI e IL-10 já são escassos, dados
sobre pesquisas que tenham investigado esses três elementos inexistem na
literatura. Desta forma, o presente trabalho tratou de observar a influência da LTBI
sobre a expressão de IL-10, durante a movimentação ortodonticamente induzida.
Conforme amplamente exposto na literatura, o laser de baixa intensidade
otimiza a microcirculação, aumenta a vasodilatação e a angiogênese e promove a
síntese de ATP, acelerando os processos biológicos nos tecidos irradiados.
Portanto, o efeito conjunto destas propriedades, acelera a movimentação dentária,
quando a LTBI é adequadamente aplicada. Além disso, estes atributos garantem o
ganho de qualidade na resposta tissular à inflamação, induzindo mais rapidamente a
fase reparativa (KARU, 1989; GENOVESE, 2000; BRUGNERA JR, 2004; STEIN et
78
al., 2005). Por outro lado, as células do tecido inflamado aumentam a síntese e
expressão de IL-10, cuja ação antiinflamatória já está bem descrita na literatura
(ALAM et al., 1994; LIN et al., 2006; RICCHETTI et al., 2008).
Vale ressaltar, que a importância da inflamação para a movimentação
ortodôntica, decorre do estímulo à diferenciação e proliferação celular, cuja ação
resulta em reabsorção óssea no lado de pressão e aposição óssea na interface de
tensão. Todavia, como demonstraram os trabalhos de Kasai et al. (1996), Kim et al.
(2007), Kawasaki e Shimizu (2000) e Yoshida et al. (2009), as propriedades
fotobiológicas da LTBI conferem um incremento ainda mais acentuado à
diferenciação e proliferação celular, promovendo o aumento das populações de
fibroblastos, osteoblastos e osteoclastos, bem como sua atividade, ao mesmo tempo
em que acelera a resolução do processo inflamatório. Tais efeitos corroboram os
achados de Ozawa et al. (1998) em experimento in vitro com células irradiadas de
murino, que revelaram aumento da diferenciação e proliferação osteoblástica, além
de observarem maior atividade da fosfatase alcalina e maior expressão do gene da
osteocalcina. Aihara, Yamaguchi e Kasai (2006) por sua vez, em experimento com
linhagens de células precursoras de osteoclastos, observaram maior expressão de
RANK, promovendo a diferenciação, proliferação, fusão, ativação e sobrevivência
osteoclástica após irradiação, favorecendo a reabsorção óssea.
Desta forma, os achados do presente estudo colocam a questão, ainda por
responder, de que se o laser, ao melhorar a resposta tecidual à inflamação,
acelerando a resolução deste processo, poderia decorrer em menor demanda de IL-
10, o que explicaria os resultados obtidos.
Achados semelhantes foram encontrados por Boschi et al. (2008), no qual o
laser diodo de InGaAIP (660 nm, 20 mW, 2,1 J/cm2) reduziu a expressão de IL-6 e
IL-10 no líquido aspirado da pleura de ratos Wistar, quatro horas após a indução da
inflamação. O experimento de Taciro (2011) também promoveu a diminuição de IL-
10, ao irradiar o tendão calcâneo de ratos Wistar em 12 sessões de LTBI (685 nm,
5,4 J/cm2). Já Oliveira et al. (2013) demonstraram que a LTBI tem efeito similar ao
fármaco imunossupressor azatioprina, diminuindo a expressão de IL-10, entre outros
mediadores, ao irradiar laser AsGa (780 nm, 70mW, 3,8 J/cm2) na cauda de ratos
com hipersensibilidade tardia a ovoalbumina.
79
O decréscimo na expressão de IL-10, concomitantemente a um processo
inflamatório bem menos intenso, também foi observado por Mozzati et al. (2011)
com humanos submetidos a extração bilateral, no qual uma das cavidades
resultantes da exodontia foi tratada com laser (904 nm , 200 mW , 180 J/cm2)
enquanto que a outra cavidade do mesmo indivíduo não foi irradiada.
Todavia, resultados opostos aos obtidos no presente trabalho foram
descritos por Marcos (2010) ao observar grande aumento na expressão de IL-10 no
tratamento de tendinite em ratos Wistar, com laser infravermelho (810 nm, 100 mW,
3 J/cm2) após 72 horas do início do experimento. Laraia (2011) apresentou achados
semelhantes no tratamento de lesão no tendão calcâneo de ratos Wistar com laser
InGaAIP (660 nm, 100mW, 6 J/cm2), com aumentos de IL-10 nos três momentos do
estudo: 6h, 24h e 72h.
No período subsequente de análise (120h) não se observa tendências ou
diferenças estatisticamente significantes entre o grupo irradiado e não-irradiado,
porém, a comparação intragrupo revela o aumento na expressão de IL-10 nos
subgrupos de irradiados, frente ao primeiro momento do estudo. Este achado está
de acordo com a literatura que menciona o aumento desta interleucina como um
evento mais tardio na evolução do processo inflamatório.
A presença de achados tão diversificados quanto a IL-10 na literatura,
podem decorrer das próprias particularidades das citocinas, com suas características
pleiotrópicas (uma mesma citocina pode ter ações diferentes, dependendo do meio
no qual ela está sendo expressa), redundantes (várias citocinas exercem a mesma
função), sinérgicas (várias citocinas cooperam para a obtenção de um efeito) e
antagônicas (uma citocina pode inibir a expressão e ação de outra). Além disso,
vários polimorfismos do gene que codifica a IL-10 já foram observados, podendo
estar associados a diferentes níveis de expressão gênica; isto pode alterar os sítios
específicos de reconhecimento de fatores transcricionais, reduzindo a produção da
citocina (JOHN et al., 1998; POWELL et al., 2000). Toda esta complexidade
envolvendo as interleucinas e demais citocinas demanda que a metodologia de
experimentos seja muito bem descrita para que os achados sejam adequadamente
comparados em seu contexto.
80
Por tratar-se um estudo inédito, com escassa literatura a respeito, faz-se
necessária a realização de mais trabalhos que busquem elucidar a modulação de IL-
10 pela LTBI na movimentação ortodôntica.
Além disso, o estabelecimento de parâmetros fundamentais da LTBI, em
protocolos sistematizados, para uma apropriada comparação de dados entre os
variados estudos é crucial para um entendimento mais amplo sobre os efeitos
buscados com o uso do laser como ferramenta terapêutica na Ortodontia.
6.1 Considerações metodológicas
O método de análise imuno-histoquímica apresenta limitações que precisam
ser consideradas. O êxito da técnica depende de peças morfologicamente bem
preservadas, bem como a retenção da antigenicidade das moléculas de interesse.
Com relação à integridade dos tecidos e manejo das peças, a metodologia do
presente trabalho foi validada pelo estudo de Daniele (2009). A retenção antigênica,
no entanto, constitui ponto crítico, pois, mesmo sendo controlada por métodos não
enzimáticos, os mecanismos moleculares envolvidos neste processo ainda precisam
ser melhor elucidados.
81
7 CONCLUSÃO
A observação e quantificação da IL-10 no presente trabalho, demonstrou
que um dos efeitos potenciais da LTBI é a diminuição da expressão desta
interleucina no periodonto de ratos submetidos à movimentação ortodôntica,
sugerindo que o efeito antiinflamatório da técnica terapêutica investigada, resulta em
menor demanda de síntese de IL-10 nos tecidos irradiados.
82
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97
ANEXOS
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
98
ANEXO B – Resultados da análise imuno-histoquímica
1. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 10 (IL-10) - Grupo TO/SL – 72h
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 4,30
4,23 L2 4,17
R2 L1 4,12
3,31 L2 2,50
R3 L1 4,89
4,88 L2 4,88
R4 L1 5,15
5,51 L2 5,87
Média 4,48 4,48 Desvio 0,99 0,94
2. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 10 (IL-10) - Grupo TO/L – 72h
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 1,08
3,70 L2 6,31
R2 L1 1,55
1,28 L2 1,01
R3 L1 1,09
1,19 L2 1,30
R4 L1 0,47
1,17 L2 1,88
R5 L1 0,97
1,12 L2 1,27
Média 1,69 1,69 Desvio 1,67 1,12
99
3. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 10 (IL-10) - Grupo TO/SL –
120h
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R6 L1 6,39
6,39 L2
R7 L1 2,37
3,12 L2 3,87
R8 L1 7,02
5,86 L2 4,70
R9 L1 1,80
2,73 L2 3,66
R10 L1 7,01
5,36 L2 3,71
Média 4,50 4,69 Desvio 1,93 1,66
4. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 10 (IL-10) - Grupo TO/L – 120h
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 2,93
2,43 L2 1,93
R2 L1 3,74
3,62 L2 3,49
R3 L1 5,11
3,01 L2 0,91
R4 L1 7,18
5,77 L2 4,35
R5 L1 5,79
4,18 L2 2,57
Média 3,80 3,80 Desvio 1,88 1,28
100
5. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 10 (IL-10) - Grupo TO/SL –
168h
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 8,06
6,30 L2 4,54
R2 L1 7,82
6,44 L2 5,06
R3 L1 14,49
10,56 L2 6,63
R4 L1 7,04
6,94 L2 6,84
R5 L1 6,22
4,40 L2 2,57
Média 6,93 6,93 Desvio 3,13 2,25
6. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 10 (IL-10) - Grupo TO/L – 168h
Amostras Lâmina % área
marcada % área média
marcada
R1 L1 3,31
3,15 L2 2,99
R2 L1 4,27
3,71 L2 3,14
R3 L1 3,82
3,96 L2 4,11
R4 L1 3,04
2,08 L2 1,13
R5 L1 1,84
3,38 L2 4,93
Média 3,26 3,26 Desvio 1,13 0,73
101
7. Análise imuno-histoquímica para Interleucina 10 (IL-10) - Grupo Controle
(STO/SL).
Amostras Lâmina % área marcada
% área média marcada
R1 L1 2,12 1,30 L2 0,48
R2 L1 0,78 1,24 L2 1,70
R3 L1 0,93 0,96 L2 1,06
R4 L1 2,10 1,37 L2 0,63
R5 L1 1,04 1,81 L2 2,59
Média 1,34 1,34 Desvio 0,65 0,60