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MARCAÇÃO DA 3LEOMICINA COM TECNÉCIO 99m PARA
DIAGNÓSTICO EM MEDICINA NUCLEAR
José Carloi Nassutt
DISSERTAÇÃO E TESE - IEA 150
IEA • DT • 150FEVEREIRO/1979
CONSELHO DELIBERATIVO
MEMBROS
Klaus Reinach - Prnidant*
Robarto DUtra Vaz
Helcio Modatto da Cocta
Ivano Humbert Marchaii
Admar Cervallinl
PARTICIPANTES
Ragina Elisatota Azarado Baratia
Flavio Gori
SUPERINTENDENTE
R&mulo Ribairo Piaroni
DISSERTAÇÃO E TESE-IEA 150 FEVEREIRO/1979IEA-DT-150
MARCAÇÃO DA BLEOMICINA COM TECNÉCIO 99m PARA
DIAGNOSTICO EM MEDICINA NUCLEAR
José Cario* Nastut»
Oio laçlo p m obttnçao «Io Tftulo á* "Martra-Tacnologia Nuctow" - Ortontador Ora.
MMihtfÉ ãtm #Ifc*j Iniaaiii i^ttm mnlfWP W Mim npmiHUI V
•m 17 da agottotto 187S, no Inttftutodt Enaqia Atftmíca.
INSTITUTO Dt etSROlA ATÔMICA
SXO PAULO - M A I I l
S*>» DISSERTAÇÃO E TESE IEAr
INIS CatagoriM and Datcriptors
B13
C2I
Bleomycin
Antimitotk drug*
Labelling
Tachnetium 99
Laballad compound*
Quality control
Dittribution
Scimisetnning
Excrttion
Noli A f«dacfe. drior*''* • eonoftoi «to d* rtipomaWlididi dn auwra.
SUMARIO
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO 1
1.1 - Uso de Radiois&topoc em Medicina Nuclear 11.2 - Uso de Antibiòticoi-Antinaaplásioot em Teraplutica • DiagnAttico 41.3 - Objetivos 6
CAPÍTULO II
MATERIAL E MÉTODOS 6
11.1 - Material 6
11.1.1 - Bleomicina 011.1.2 -Tacnéáo-99m 711.1.3 - Cloreto Enanoso Bimdratado 711.1.4 - Animais 711.1.5 - Equipamentos 7
11.2 - Metido* 7
11.2.1 - Preparação da Solução da Cloreto Estanoso 711.2.2 - Preparação da Soluçfò da Bleomicina 7I I . 2 . 3 - PreparecJo dot "Kit»" Bleomicina/Enanho .'. 8II.2.4 - LlofilizaçSo 8
- Marcaclo do» "Kit*" com t t l B T c 811.2.6.1 - Rateio "mTc/Sn|IU/Bleomicirta 811.2.6.2 - Control* da Pureza Radioqufmia 8II .2.6.3 - Diitribuiçfo Biológica 8
CAPITULO III
RESULTADOS E CONCLUSÕES 8
111.1 - Enutoi Prelimlnare» 10
llf.1.1 - Marcacfo da Blaomicina 10IH.1.2-ErtabllldadidaBLM- t fmTcemFuneIodoTempo 10
111.1.3 ~ Estabilidade da BLM-" m Tc em Função do pH 10
111.2 - Marcação dos "Kits" 10
111.2.1 - Influência da Rdaçffo em Massa entre Estanho • a Blaomicina no Rendimento
de Marcação : 10
111.2.2 — Influência do pH no Rendimento de Marcação 10
Hl.2.3-Influência do Tempo cfe Reação entre o Ion Partecnetato • o "Kit"
|Sn(ll)/BLM). no Rendimento da Mareaclo 17
111.3 - Controle de Qualidade do Produto Mareado 17
111.3.1 - Controle d» Pureza Radioqufmica 17
III .&2 - Ertabilidadt Ffsico-Química dos "Kits" 17
IM.3.3 - Estabilidada da BLM-*9mTc em Funçío do Tempo 23
111.3.4 - Esterilidade do Produto Marcado 23
111.3.5 - Toxicidade da Bleomicina para Animais 23
111.3.6 - Distribuição Biológica 23
111.3.6.1 - Concentração do Produto Marcado em Tecidos Tumorafe 26
IN.3.6.2 - Especificidade do Produto Marcado 28
MI.4 - Conclusões 28
111.4.1 - Características dos "Kits" 26
111.4.2- Marcação dos "Kits" 28
111.4.3 - Eliminação de Oxido* • Quelatos Inwlúvtis 31
111.4.4 - Distribuição Biológica 31
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 31
MARCAÇÃO DA BLEOMICINA COM TECNÉCIO-99m PARA
DIAGNÓSTICO EM MEDICINA NUCLEAR
José Carloi Nastutt
RESUMO
EitudMMt. • O M I M ' o rendimento d» marcação le um anthcancarfajno (bleomídna) com umradionucUdeo dt meta vidi curt» ('""Tc), mando como egenta ndutor o Sn(ll). ->
' AJJJi-X' Analisque ot parâmetros: o pH d* marcação, • influência do tampo d l raaçao a da mana da auanho no
randimanto da marcação. __
^.Pare tornar mais pratica a marcação. prapa«ran>sa "kits" de Sn<M)/BLM, liofiliados am frascos evacuados. • <
^ Fíi-se controlei ck qualidade, qua envolverão, técnicas cromatogrificn am piptl. controla dl Mtarilidadi •
ensak» "in vivo". Estai últimos foram efetuados em ratos sob tono barbitúrico. tanto am animeis sadios como am
•limais portadoras d» tacidos tumorais. ^_
l - Fsjt-se um ntuds da distribuiçfo biolãgica, do tempo da concantraçfo do produto nos tumores, do tampo a
via dl ixcraçfò, por maio da cintilogramas a cintifoios.
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
1.1 - Uso dt Radioisotopos t m Medicina Nucle.tr
Durante a última dicada, com o desenvolvimento da tecnologia nuclear no campo da medicina,puderam os especialistas deste setor, contar com um número cada vez maior de radioisotopos primário*ou "ligados" • moléculas, para U M em diagnóstico e terapêutica.
É no campo do diagnóstico que surge o maior número de radioisótopot, destacando-se entraenes ot que se destinam i localização de processos tumorais e suas metástases. Nos últimos ano* têmtido usados com relativo sucesso o í 7 C o , ' " I n , " ' H g , * 7 Cu, 5 l Cr, *7Ge, " m T c e outros"61.
Entretanto, o uso de alguns radioisotopos torna-se limitado por causa de diversos fatores deordem química, física ou biológica, a saber: toxidade química, energia de radiaclo alta, meia-vida efetivalonga, afinidade do elemento com certos tipos de tecidos e por último a dificuldade de obtencéo181.
Com o advento e aperfeiçoamento dos denominados geradores de radioisotopos de meia-vidacurta, oi cemros de Medicina Nuclear, que por causa da distancia dot reatores e ciclotrons vfem suaiatividades tolhidas, puderam desenvolver-se rapidamente.
Aprovada para puMIcaceo em FenJretro/1979.
salivar»'".
99
anot 99ftu
0,92
0,740 MtV71,4*
0.514 N«V
0.181 N«V
0,142 M«V0,140 M.V
T r 0.292 H»VY 100»
Figura 1.1 - EiqiMm* d« dwainwmo do ' *Mo
Posteriormente, prepararam-se colóides marcados com ' " " T c . usando-se gái sulffdrico1211 oucloreto estanoso anidro que se destinam a cintilografias hepâticas1101.
0 " m T c tem uma meia-vida de seis horas, sendo um mono-emissor gama de 140 keV,originando-se do decaimento do " M o . O " m T c por sua vez decai para o " T c , que por ter umameia-vida de 2,1 x 10* anos poderia ser um problema grave do ponto de vista da proteção radiológica.Entretanto, um mCi de " m T c produz somente 3,3 x 10~6 /.Ci de " T c , que decai por sua vez para" R u (estável) por emissão de elétrons. Supondo que toda a dose (1 mCi) ficasse retida indefinidamenteno organismo, isso representaria expor o corpo inteiro a uma dose anual de 1,5 x IO" 7 rads.
Pelo fato do (on iwrtecnetato ( " m T c 0 4 ) ter um raio ionico e carga igual ao fon iodeto, ocomportamento biológico e distribuição no organismo humano são semelhantes. A distribuição do" m T c no organismo é rápida e se dá através do fluido extra-celular, concentrando-se na tireoide,glândulas salivares, plexo coróide e estômago. Verificou-se também que o fon pertecnetato é estável •não reage quando em contato com os sistemas biológicos.
0 " m T c pode se apresentar em vários estados de oxidacão, desde + 7 a 1, sendo que osestados mais estáveis quimicamente falando são o + 7 e +4. As formas mais reduzidas apresentamcapacidade de complexar ou quelar com moléculas existentes no meio aquoso .
O fon pertecnetato pode ser reduzido aos estados de oxidacão seguintes:
Tc(VII) Tc(VI)Tc(V|Tc(IV)Tc(lll)
O Tc(IV) i o mai< estável depois do Tc(VII) sendo que os estados intermediários tendem adesproporcionar dando misturas de Tc(IV) e Tc(VII):
3 Tc(VI) • 1 Tc(IV) + 2 Tc(VII)
3 Tc(V) • 2 TcdV» + 1 Tc(VII)
0 tecnécio nos estados intermediários e nos estados de oxidação mais baixos podem existir emsolução aquosa quando estabilizados como quelatos ou complexos.
A ligação coordenada covalente é essencial para a existência em meio aquoso daqueles estadosde oxidaçao, que a redução e a formaçSo de complexos podem ser considerados como um processosimultâneo.
Os produtos de reducío do pertecnetato dependem: da força do agente redutor, da afinidade degrupo* complexantes disponíveis a da concentração desses grupos. Estes fatores relacionam-se da talmaneira que, em algumas reações de redução do produzidos estados múltiplos da oxidacão.
Os fon* OH" e a H 3 0 tám grande afinidade por tecnécio reduzido competindo com outros
grupos complexantes, sendo os produtos da reação influenciados paio pH a talvaz até mesmo pela força
ftnica do meio. A marcação de moléculas orgânicas ocorre quando o composto a ser marcado acha-se
disponível para complexar com o tecnécio, i medida que ocorra a redução.
A marcação também pode ocorrer por uma troca de ligantas, em qua a molécula a ser marcariadesloca grupos de um complexo intermediário de Tc menos estável.
Portento, esquematizando tem-se:
Marcação direta: Na " m T c 0 4 ^?2- "mT(nnoléculamolécula
Marcação indireta N a " m T c 0 4 99lrTc-complexo intermediário
comp. interm.
" m T c C o m p . Interm. t r o c a ' 9 a n t e »""Tc-molécula(molécula)
Os complexos de tecnécio reduzido têm tendência a hidrolizar-se formando compostosínsolúveis como o dióxido de tecnécio (TcOj), ou a oxidar-se • desproporcionar reformando (oropertecnetato.
Os óxidos tnsolúveis concentram-se no fígado1201, baço e no sistema retículo endotelial damedula óssea, enquanto que o (on pertecnetato vai para a tíreóide, glândulas salivares, estômago e plexocoróide.
Ultimamente, o interesse dos cientistas voltou-se para compostos que tivessem propriedade deformar quelatos ou complexar com o " m T c e que fossem úteis para uso em provas funcionais oudntilografias, a saber: ácido etilenodiamino tetraacético (EDTA), ácido dietilenotriamíno pentaacético(DTPA), manítol, penicilaminaacetozolamina, citrato, tetraciclina, inulina, glucoheptonato, trifosfato»,polifosfatos, pirofosfatos e outros'41.
O DTPA é usado para estudo da filtração glomerular nos rins'141, o manitol e o gluconato paracintilografias renais117I, o citrato e a inulina, também, são usados para estudo da filtraçío glomerular'1',os fosfatos na visualização do esqueleto, a tetraciclina no diagnóstico tumoral e enfarte do miocárdio.
\2 - Uso de Antibióticos-Antineoplâsicos em Terapêutica • Diagnóstico
Na segunda metade da década de 1950, durante a investigação sobre • obtenção de algunsgrupos de antibióticos de alto peso molecular, (mais de 1000) verificou-se que o da fleomicina tinhacapacidade peculiar de inibir o desenvolvimento de tumores em animais, principalmente do tipo daCarcinoma de Ehrlích.
Grande parte desses antibióticos é extraída de várias cepas ou linhagens de um gênero de fungodenominado Streptomyces. Assim do "Streptomycat verticillus", obtém-se • bleomicina'231.
A bleomicina, dentre todo* os produtos do grupo da fleomicina, i que mostra maiorestabilidade em pH alcalino e ácido. Quimicamente, • bleomicina é uma mistura complexa de moléculasdiversas denominadas: A , , A2> Dimetil-Aj, A'3 ( , A'2 b , A'3 { , B, , B2, B<r A f t t A 6 . Fundamentalmente,trata-se de uma estrutura polipeptídice (glicopepifdeo), á qual se ligam vários radicais emínicos, quedefinem as características d l cada bleomicina.
Pelo fato do composto ser uma misture «om porcentagens diferentes da» várias bleorricinas,conform* sua origem, o peso molecular está em torno de 1400/1600. A Figura 2.2 apresenta • fórmulada bleomicina.
S **."*
R • Radicals AaTnicos
RadWsl AaTnice
dinetii A2-NH2-CH2-CH2-CH2-S-CH
A2 — MHj-CM2-CH2-CH2S-(CH3)2X"
NH
C
NH UN
Figura 2 2 - Fórmula estrutural da Bleomicina
O pioduiü apresenta alta especificidade em inibir o desenvolvimento de tumores em tecidos <ieorigem célulo-epitelial (ectoderma). Apesar das pesquisas não terem chegado a conclusões definitivas, |áse pode afirmar que o sítio da ação da bleomicina está localizado ao nível da síntese do Ácidodesoxinoonucléico (ADN), bloqi ecndo-a nos núcleos das células tumorais de modo específico181
A bleomicina "in naiura", isto é, antes de ser purificado por cromatografia em akimina,apresenta-se quelada com átomos de cobre na proporção de 0,08%. Verificou-se, também, que todas asespécies de bleomicina têm uma absorção semelhante na região ultravioleta, com um máximo situadoentre 244 nm e 295 ran'23'. Observou se que a dose letal média (LDg 0) para camundongos é de12S mg/kg e para ratos é de 312 mg/kg.
Out«a vantagem da bleomicina é o fato dela raramente se concentrar em processosinflimatõrios, ao contrário do que ocorre com outros produtos complexados com radioisótopos. OU comestes últimos sob forma elementar, a saber: 6 7Ga, " ' I n , l 6 9 Y b e outros1 '2)
1.3 - Objetivos
Há vários anos vem sendo experimentada a quelação da bleomicina com algum cations bi etrivalentes1181: " ' l n , 6 7Ga, 6 7Cu, " ' Y b , 3 0 3Pb e o 5 7 C o ( 1 5 ) . Dentre todos, o que mostrou ser maisestável foi o quHato formado com o 5 7Co, mas que para uso em rotina mostrou-se impróprio, por causade sua meiavida longa (269d).
Surgiu em seguida a necessidade de preparar a bleomicina marcada com ' " " T c ' 1 5 ' 1 2 ' 1 9 ' , porcausa das características nucleares favoráveis deste radioisotopo.
A bleomicina ligada ao Tc é capaz de detectar tumores em tecidos de origem não epitelial,enquanto que a bleomicina n3o marcada tem seu uso terapêutico restrito aos processos neoplásicos cmtecidos de origem ectodérmica, fazendo crer que a complexação com o " m T c , modifica suascaracterísticas biodinâmicas141.
Neste trabalho procura-se padronizar um método simples • rápido para marcação dt umcomposto amicancerfgeno, com um radioisóiopo de meia-vida curta, com o objetivo de obter um meioeficaz e seguro para uso em diagnóstico tumoral. Estudam-se diversas variáveis, a saber: pH paracomplexaclo, reiaçlo das massas do redutor Sn(ll) e da bleomicina, a tempo da reaçfo.
Analisa-se a estabilidade do composto marcado a a distribuição biológica em animais. Faz-st usode uma técnica simples e rápida para detectar impurezas radioqu(micas, a finalmente prepara-se um "kit"de Sn/bleomicina sob forma liofilizada para emprego em ensaios radioqu ímicos e "in vivo".
CAPITULO II
MATERIAL E MÉTODOS
11.1 - Mawriel
11.1.1 - Bleomíeína
Utilizou-se a bleomicina liofilizada, na forma da sulfato. Essa bleomicina produzidaLaborterápica Bristol S/A Indústria Química e Farmacêutica i fornecida em empoles.
Quimieamente, trata-se de uma mistura que contim aproximadamente 56% de bleomicina A j ,27% de B2 , 9% da A 1 e 3% de DMA2 , livre de cobre'51. Apresenta-se como um pô branco, cristalino, debaixa densidade, solúvel em égua e metanol, pouco solúvel em etanol, acetona e éter.
11.1.2 - Tecn*eic-99m
O " m T c usado neste trabalho proveio de um gerador tipo Ultra-Technekow-FM (MallinckrodtNuclear) contendo " M o obtido por fissio do 3 3 S U . O gerador é constituído por uma coluna dealumina na qual é fixado o " M o , sendo o tecnécio eluído com soluçSo salina isotônica (NaCI 0,9%),« t i . í|, apirogínica, na forma de pertecnetato de sódio.
11.1.3 - Cloreto Estanoso Bihidratado
O SnClj.2H2O usado é de origem americana (J. T. Baker), com grau de pureza 98,0 — 102%.
11.1.4 — Animais
Usaram-se ratos (Rattus norvegicus, variedade Albinus), provenientes de colônias mantidas nobiotérk) do Centro de Aplicações Médicas de Radioisótopos e Radiações - Area de Radiobiologia doInstituto de Energia Atômica, alimentados com ração comercial padra*ò.
11.1.5 - Equipamentos
Câmara estanque, tipo "Glove box", conectada a um torpedo de nitrogênio gasoso, e dotada defiltros de ar na entrada e saída, e de luz ultravioleta.
Liofilizador marca Virtis, modelo 10-146 MR-BA, com cabeça dotada de dispositivo parafechamento de frascos em que se fez vácuo, previamente.
- Gama câmara (Fogama), tipo HP da Nuclear Chicago.
— Mapeador de corpo inteiro Scintimatic tipo 2F da Siemens.
- Contador de esteira, modelo Ultrascaler II da Nuclear Chicago (cristal da N i l ativado comTI).
— Mediae modelo 6362 da Nuclear Chicago.
11.2-Métodos
11.2.1 - Preparação da Solução da Cloreto Estanoto
Díssolveram-M 5 mg de SnCtj.2HjO am 60 mililitros de HCI I N , obtendo-se uma soluçfo comuma concentração de 50na de Sn(ll) por milílítro. A operação foi realizada em ambiente saturado denitrogênio gasoso. A distoluçfo do cloreto estanoso em HCI I N te faz com borbulhamento ininterruptode N j , durando esta oparaçiò 15 minutos.
11.2.2 - Preoaraçlo da Sohielo da Blaomieina
Dissolveram-se 10 mg da bleomicina (conteúdo de uma ampola comercial), em um mililitro d*água destilada em temperatura ambienta. A unidade usada na terapêutica para a bleomicina, denomina-*mg/potência, cuja equivalência com o mg/peso è: 1,5 mg/potência = 1,0 mg/peso.
11.2.3 - Preparação dos "Kits" Bleomicina/Estanho
Dois mililitros da solução de cloreto eslanoso (item 11.2.1) comendo 100ug de Sn(ll), foramadicionados à solução aquosa de bleomicina (10 mg/ml). Percolou-se esta soluçSo por filtro esterilizam»Millipore 0.22 u e dividiu-se a solução (3 ml) em três porções iguais de um mililitro, resultando 3,3 mgde bleomicina para 33 M6 de Sn(ll) em cada frasco.
Os frascos usados são do tipo penicilina de 10 ml de capacidade, sendo fechados manualmentecom tampas especiais de borracha, para posterior vedação e produção de vácuo no lioliliiador.
11.2.4 - Liofilizaçào
Colocaram-se os frascos tipo penicilina imediatamente no banho do liofitizador a -20°C, aipermanecendo por dez minutos, tempo necessário para o congelamento da solução. Retirados do banho,os frascos foram introduzidos no interior da cabeça do liofilizador, onde sob vácuo de 50 M' de ar nomínimo, obteve-se um produto liofilizado após cinco horas de operação. Os frascos são fechados aindadentro do aparelho, usando-se para isso um dispositivo a ar comprimido. Apôs esta operaçãocolocaram-se os "kits" sob refrigeração normal (+4°C).
11.2.5 - Marcação doi "Kits" com " m T c
11.2.5.1 - Reacio 99mTc/Sn(ll)/Bleomicina
Usou-se " m T c de concentração radioativa em torno de 10mCi/ml e contido num volumenunca superior a quatro mililitros. Se o volume eluído do gerador de " m T c , tosse muito reduzido oumaior que 4 ml, fazia-se necessário um acerto do pH, usando solução de HCI 0,1 N ou de NaOH 0,1 N,ou adicionando-se NaCI 0,9% até o pH chegar ao desejado (2,0/2,5). Após agitação moderada por cercade 15 minutos passou-se a solução por filtro esterilizante Millipore 0,22/J.
11.2.5.2 - Controle da Pureza Radioqulmíca
Inicialmente, fizeram-se os controles de pureza radioquímica do produto marcado porcromatografia ascer.dente em papel Whatman n.1, utilizando-se diversos solventes, a saber: solução decloreto de amònea a 10%, metanol em solução aquosa a 85%, solução de cloreto de sódio a 0,9% e porúltimo a metil etil cetona.
Infelizmente, estes métodos revelaram-se falhos e imprecisos, alem do que o temporelativamente longo (1 a 2 h) para a corrida do cromatograma, provocava reoxidaeio do **n tTc(IV) a" m T c ( V I I ) , adulterando os resultados.
Adotou-se posteriormente a técnica cromatográfica "Michrom"131, que consist* na Justaposiçãoda dois processos cromatograficot, mando como solvente acetone • soluçlo salina (NaCI 0,0%). Comofase estacionaria (suporta), usaram-se tirai da celulose embebidas am silica gel, medindo cada uma delas67 mm de comprimento por 7 mm de largura.
Numa das tire» (A), usou-s* por solvente a soluçlo salina, na outra tira (B), a acatona. Natira (A), ferie um traço demarcatório a 20 mm da base, tendo-se pois uma Mcçio A , «4 este traço a
tecclo A 2 do traço até o topo da fita. Na tira (B) (acatona), fez-se um traço demarcatório a 17 mm dotopo, a chamou-se a «sta seccio da B,, a a que vai do traço até a base, da B1.
As tiras foram posteriormente «mbebidas em uma suspensfo da silica gal a 6% (60-200 "math"- grau 62) a sacas ao ar. Para melhor visualização da corrida, poda-se colocar uma gota da um corantesolúvel; na tira (A), o metil orange e na tira (B) a violeta de genciana, ambas a 10 mm da bate.
Após a secagem, as tiras foram guardadas em dessecadores. para posterior uso. Colocaram-» dkcinco a dez microlitros da amostra a analisar nos pontos corados (tanto em A como am B), deixou-wsecar. Em seguida, puseram-se as tiras em pequenos tubos de ensaio, com solvente até altura de 2 mm,mantendo-se ot tubos na posição vertical.
Nfo houve necessidade de te fechar os tubos, pois a saturação é rápida. A corrida lavou ammédia 60 segundos, finda a qual retiraram-se as tiras, secaram-se e seccionaram-te nos traços divisórios,obtendo portanto duas secçSes. Registraram-se as atividades das secçSes, a faz-ta o cálculo daporcentagem de " m T c em suas diferentes formas químicas de acordo com as expressões:
A ," m T c reduzido, mas màocomplexado = x 100%
(A, + A 2 )
B2
" m T c 0 « * livre = x 100%IB, • B7)
""•Tccomptaxado = 100% - ( " m T c reduzido + •» m Tc Livre) ou
(•»mTc|IV) • " m T c O « l
11.2.6.3 - Distribuição Biológica
Fizeram-sa estudos de distribuição biológica em ratos (pesando 200 g aproximadamente) sadiosa com tumores espontâneos, tendo o produto marcado introduzido no organismo do animal por meio dainjeelo intravenosa em veias do pénit ou da calda.
Af doses injetadas foram da 100 pCi a 1 mCí, com a matta da Weomicina variando da 0,6 mg a2fl mg. Ot animais quando da «xacuçlo dot cintilogremat, achavam-ta sob tono barbitúrico a daitadoida dorto am placa f ixadort espacial.
Flzerem-te cintilogramat logo apót injeclo, a am inurvalot da tampo variáveis (16', 30/, W ,120* • 180"). Utilizou-ta produto marcado com ou tem pastagem prévia por Millipore 0,22 p. Faz-te umanulo da concentração do " m T c - B L M em Intervalos de tampo convenlentet (até o máximo da 8 h|,mando o Fogtma acoplado • uma Polaroid, para obtancfo d* Imagtnt fotográficas.
10
CAPITULO III
RESULTADOS E CONCLUSÕES
111.1 - Ensaios Preliminares
111.1.1 - Manaçfc da Bleomicina
Fez-» inicialmente a marcação da 5 mg de bleomidna, usando 100/ig da cloreto itanosoe 14 mCi de " m T c contido em 2 ml de solução de NaCI 0,9%.
Para o controle de pureza radioqufmica, usou-se cromatografia ascendente em papel Whatmana i , utilizando como solvente o metanol 75%. Segundo LIN e GOODWIN191, a bleomicina marcada seespalha do Rf 0,0 a 0,6, enquanto o pertecnetato nàb reduzido (TcO«~) se situa entre 0,6 e 0,78. AFigura 3.3 mostra os resultados obtidos.
111.1.2 - Estabilidade da BLM- 9 9 mTc em Função do Tempo
Fez-se o ensaio de estabilidade do composto em relaçSo ao tempo de marcaçfo, sendo ocontrole realizado por cromatografia em papel conforme II I .1.1, após 24 horas e 48 horas. A Figura 3.4,mostra que o composto é estável nesse período de tempo.
111.1.3 - Estabilidade da BLM " m T c em Função do pH
Analisou-se a estabilidade do produto a posteriores alterações do pH, usando-se hidróxido desódio 0,1 N. Os resultados indicaram uma gradual decomposição do composto com o aumento do pH,fato este evidenciado pela elevação na porcentagem d» tecnécio livre (TcO«) conforme mostra iFigura 3.5.
111.2 - Marcação dos "Kits"
IH.2.1 - Influência da Relaçio em Massa entra Estanho e a Bleomicina no Rendimento de Marcaçio
Para esse estudo utilizou-se a técnica especificada em 11.2.5.1 e a cromatografia "Michrom" paradetirminacZo das porcentagens de bleomicina-'*mTc, de tecnécio na forma de pertecnetato e datecnécio reduzido, conforme apresentado no item 11.2.5.2.
Nesse ensaio a massa de bleomicina foi mantida inalterada (3,3 mg), o tempo da reação foi de15 minuto» e variou-se a massa de estanho em cada "kit". Usando sempre pertecnetato de «ódio comconcentração radioativa de aproximadamente 10mCi/ml, obteve-se resultado qua indica ser a relaçio1:132{Sn/BLM) a mais adequada, conforma poda-se observar pela Figura 3.6.
1114.2 - Influencia do pH no Rendimento da Marcaçfo
Para essa estudo utilizou-ta a técnica especificada em 11.2.6.1, com 3,3 mg dt bleomicina, tampoda reaçlo 16 minuto* a pH variando de 2 a 8. Usou-se a cromatografia "Michrom" para determlneçlo do**mTc-bleomicine, do íon pertacnetato a dei forma* reduzida*.
30
20-
10-
Rf 0,0 - 0,6(BLM-99mTc)
Solvent»: Metanol 751
Tcnpo de corrida : 2 h.
0.1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,C
- Cromatografia aic«nd«ntt da Blaomicina-*tmTc
300
250-
200'
« 150'
100
50-
• — 24 h— 48 h
Cromatografia: papel Whatman N:1
Solvente: Metanol 751
Tempo de corrida: 2 h
0,5 0,6 0.70.1 0,4Rf
Fkjtira3.4 - Estabilidade d« ligação: BLM-'»mTc
0'.9 1 0
13
u
100
80
60
40
20'
—f-25 50
-4-
75
Mi
100
Fig»» 3.6 - foranttpm «It itlvidKl* d . BLM-MmTe, (to M" lToO1 • M m T e 0 í «n funçto d»M dt Sn(ll).
100
25 •'
2 4 6Fipira3.7 - Rvndinwnto de marciçio d* bleomicin»-"mTc em funçfc do pH
TTT pH
16
Segundo OWUNWANNE 1 1 3 1 , as formas quelantes de tecnécio slo o 9 * m T c 0 " ou" m Tc(OH) 3
< 2 . isto é, tecnécio apresentando-se no estado de oxidaçlo + 4. Estas formes aparecemquando o pH for igual ou menor que dois, ocorrendo hidrólise quando o meio se toma menos ácido. Aprincipal forma hidrolisada é o TcO2.2H,O. que como oxido insolúvel vai provocar uma queda bruscano rendimento de marcaçfo, por ser uma forma nio quelante. A Tabela 111.1 e a Figura 3.7 mostram queo melhor pH de marcação 4 2.
Tabela 111.1
Rendimento de Marcação da BLM-*9mYc em Functo do pH
pH
2
4
6
8
9 9 m T c 0 , %
25
10
75
10
5
25
5
75
B L M * 9 m T c %
70
65
20
15
Em nosso trabalho o único fator que poderia alterar o pH, no momento da reaçfo, seria ovolume de elufdo (pertecnetato de sódio em NaCI 0,9%) do gerador, cu|o pH varia de 5,0 a 5,5. Paratanto fez-se um ensaio com adições progressivas de volumes do eluído, verificando-se que até 4 ml niohouve alteração significativa do pH. 0 resultado do experimento mostra-se na Tabela 1112.
Tabela
Modificação do pH com • Adíçfo de VolumesDiferente* do Elufdo
Experiência
n°
123466789
10
Volume•*mNaTc0j(ml»
123466789
10
pH(final)
3,03,03,03,64,04,64,66,06,06,0
17
111.2.3 - Influência do Tempo da Reação entro o Ion Partecnetatt a o "Kit" (Sn(ll)/BLM). noRendimento de Marcaçlo
Para os experimentos utilizou-se a técnica descrita am II.2.5.1, com 3,3 mg de bleomicina, 50figde estanho e pH = 2,0 tempo de reação variou de IB a 105 minutos. Para controle das porcentagens daatividade da bleornicina-9*mTc, do Ton pertecnetato a do tecnécio reduzido, usando-se a técnicacromatografica "Michron" descrita em 11.2.5.2.
Verificou SE que a partir de l ã minutos alcança-se um rendimento de marcação em tomo da75X, após o que o rendimento tende a aumentar lentamente. Todavia um tempo de reação muitoprolongado prejudica a medida de atividade, por causa de meia-vida do " m T c ser de apenas 6 horas,tornando-se o processo inaplicável na rotina. O resultado do ensaio é mostrado na Figura 3.8.
I I 1.3 - Controle de Qualidade do Produto Marcado
111.3.1 - Controle de Pureza Radioqulmica
Conforme descrito em II.2.5.2, usou-se inicialmente método cromatográfico ascendente empapel Whatman n.1, ensaiando-se o comportamento de vários solventes, a saber:
a) Cloreto de amõnia a 10% - verificou-se que havia sobreposição de atividade dableomicina (Rf = 0,6 — 0,75) com o pico de atividade correspondente ao fon pertecnetato(Rf = 0,7 — 0,8), prejudicando o resultado, como pode-se ver pela Figura 3.9.
b) Metanol 85% - a bleomicina marcada se espalha do Rf = O,0 a 0,6<11>, havendo umaseparação razoável do Ton pertecnetato ( 9 ' m T c 0 í ) , o qual tanto pode ser resultado daredução incompleta ou de uma reoxidação, pois o processo leva cerca de duas horas. Oresultado do ensaio está exposto na Figura 3.10.
c) Solução salina (NaCI 0,9%) - com este solvente obteve-se uma separação satisfatória do" m T c reduzido, do não reduzido ( ' " "TcOi ) este último sobrepondo-se parcialmente ao99mTc-bleomicina, como se observa na Figura 3.11.
d) Metil etil cetona - Com este solvente conseguiu-se separar o " m T c reduzido e o " m T ccomplexado, que permaneciam próximos da origem, do pertecnetato ( ' " "TcOi ) queatinge o Rf = 0,9 a 1,0 conforme mostra a Figura 3.12.
Nenhum desses processos cromatográficos forneceu dados que permitissem discriminar os trêsprincipais produtos radioativos presentes apôs a complexacio, o BLM-" m Tc, o " m T c O j e o" m T c 0 i , impossibilitando o cálculo de rendimento da reaçiò.
Por esse motivo, abandonou-se esse método cromatográfico, passando • utilizar-se em todos oiexperimentos de marcação, a técnica "Miehrom" descrita em 11.2.6.2.
111.3.2 - Estabilidade Físlco-Qulmica dos "Kto"
Os "kits" com 60 e 90 dias após a preparação, mostraram-se estáveis paio fato da tarem sido
liofilizado* e estocados em frascos com vácuo sob refrigeração (• 4*C). A ausência d* oxiglnio evita •
oxidacto do Sn(ll), • i liofilizacto protegi o "kit" dos efeitos das m e t a d» hWroliie. A estabilidade
dos "kits" durante o período citado foi comprovada pela marcaçlo com * * m Te.
IR
in•O
. Ocn
•o •
3
10
19
1000 i
©
K
mV
500
450
400'
350'
300'
250'
200
150
100
50-
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Figura 3 4 - Ptrfii eronwtogrificoi do BLM-*fmTc(il • '*mTe0i(b( «n elortio dt tmAnli 10%
70
300
0.2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 00,1
400
360
320
280
240
200
X
E 120O.U
8(
4(
b
•
•
-
|
III1 11 1
1 o 11 ° 1la* \
0,1 0,2 0,3 0,4 Rf0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
nama.10 - Pmi» cromatoyifieo» do BLM-**mTcl§) • t fmTeOi(W m mtttnol B8%
21
0,1 0,2 0,3 0 , 4 o f 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 ,7 0 ,8 0,9 1,0
i 1 - **V*ciomwoyefloo»do BtM-f•mTe(«> • MWTc041W m «oluçlo tttlnt (N«a 0,9%)
22
360
330
300
270
240
210
o 180
: iso" 120
90
60
30
\1
JnA* 1
^ ^
0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1Rf
Fltwr.312 - Ptrfll crom«o«rifleo do m iMtN flllt CMMN
23
111.3.3 - Estabilidade d* B L M - " m T c M I Funçio do Tempo
Fizeranxe ensaios de estabilidade, submetendo-se o produto marcado à cromatografia"Michrom", logo apôs a marcação • durante período* subsequente* até 8 hora*. O produto marcadomostrou-se estável durante o intervalo de tampo ensaiado, como mostra a Figura 3.13 • Tabela 111.3.
Tabela I I I 3
Porcentual Relativo em Atividade do Produto Marcado eImpurezas Radioqufmicas com o Tempo
Tempo (h)
2468
" m T c < V %
3432
" m T c O , %
27312730
B L M - " m T c %
70657068
III.3.4 - Esterilidade do Produto Marcado
A esterilidade do produto marcado foi garantida pela passagem por filtro Millipore 0,22/i, aconfirmada por ensaios microbiologicos em caldo simples, tioglicolato • sebouraud com resultadosnegativos quanto ao crescimento bacteriano.
111.3.5 - Toxicidade da Bleomícina para Animais
Segundo o "Committee of Clinical Research of Bleomycin"'2', a dose letal média (LD M > pêrãratos machos é de cerca de 250 mg potência, portanto mais alta do que a massa usada em nossosexperimentos, que foi de 4,95 mg/potência (ou 3,3 mg/massa). Nlo houve nenhum caso da choque oumorte de animais, o que comprova que a massa usada nos. experimentos está realmente situada numafaixa subtoxica.
111.3.6 - Distribuição Biológica
Segundo ECKELMAN<4>, S R I V A S T A V A 0 3 ' • RHODES1181 , há grande possibilidade deformação de complexos coloidais do tipo Tc/Sn e ôxidos insolúveis como TcOj , quando da reação doton pertecnetato com o Sn(ll).
Fizerim-sa inicialmente cintilografiM da ratos sadios, injetados com * fmTe-bleomicina,veríficande-se que realmente ai formas coloidais se formam • slo retidas paio sistema retículo andotallal(SREI do fígado. A Figura 3.14 apresenu o cintilograma com • imagem hepátlca.
Pode-se notar que o prodv.o nlo sa concentra na tireoide, glândulas salivam e cérebro, o queelimina a possibilidade da existência da " m T c livra ( * f m T e O ; i , havendo eliminado (16') do complexoradioativo pelH viei urinárias.
Segundo CM autores R Y O " " , VAN DE POLL 1 1 5 ' , GOODWIN1 9 ' e M O R I 1 1 2 ' H I M quelatos
25
• •ir.:.:r.yiw.,i' IVV.^T..1;;! v
\1
1
1
.5ÍW
, i , ,. A 'i.1
i i '
11
Kl7' •
Logo apôs inj£ 15 min. 30 min.tad?
Fifurs3.14 - CintilografiM «qtenciaii da rato tn|«»do com BLM**mTe, MITI pMugam prévia porMilliport 0,22*1. Nom^Ê a nltlàê imag«m h«pat<ea rafultado à$ rattnelò dai format eo-toídal* paio SRE.
26
insolúveis podem ser em granda parta eliminados por uma simples passagam do produto marcado porfiltro Millipore 0.22 \i.
Fez-se este experimento e obteve-sa o produto livre de formas coloidais, o que poda terverificado pela Figura 3.15, onde nJo se nota a retençlo no fígado. Observou-se que a eliminacfo doproduto do organismo sadio, se d i entre três e quatro horas após injeçfo intravenosa.
111.3.6.1 - Concentração do Produto Marcado em Tecidos Tumorah
Utilizando-se o aparelho Fogama fizeram-» cintitogramas de ratos com tumores dedesenvolvimento espontâneo, apresentando metástases, verificando-se a concentração do produto notecido tumoral. A série de cintifotos da Figura 3.16, mostra o resultado, pelo qual se infere que o tamponecessário para otimizar a imagem é de 4 horas. Nota-se a presença do tumor original na região püvica,pouco abaixo da bexiga.
Outros dois ratos, um com tumor testicular (Figura 3.17) a outro com turror toráxico(Figura 3.18), foram injetados 1,0 mCi de B L M - " m T c Fizeram-se tíntilogramai 15, 60, 120 e 180minutos após injeção intravenosa caudal.
Os resultados mostraram a localização do produto marcado not tumores, conduindo-se I$M Otempo ideal para visualização nítida da regiSo tumoral vai de duas a três horas após infecto. Utilizou-senesses experimentos o CintiKgrafo tipo Scintimatic 2F.
111.3.6.2 - Especificidade do Produto Marcado
Pelos cintilogramas obtidos notou-se nítida concentração do produto nos tecidos doentes •rápida eliminação da corrente circulatória. Nío se notou concentrações do complexo em órgãos ousistemas sadios, verificando-se após duas horas da introduçlo no organismo apenas m imagens do sistemaexcretor urinário (rins e bexiga).
111.4-Conclusões
111.4.1 - Características dot "Krtt"
Os "kits" mostraram-se adequados para marcação com * * m T c , paios fatores seguinte*-.
a) Simplicidade t rapidez . « preparação.
b) Estabilidade ffsico-qufmica.
c) Facilidade para uso am marcações rotineiras, bastando adiciona' o radiotsótopo paraobtenção do complexo utilizável em Medicina Nuclear.
d) Baixo teor de Sn (máximo SOjifl), tomando mínima • possibilidade d» tmMta paiometal.
111.4.2 - Mercaclo dos "Kit*"
No que se refere i marceclo dos "kits", conclui-se que:
i ...IK"1
S* I »
27
• ' • • • ! ; V v ! " • '
"v;.,::r-.;•,I l t f H
. ; • ••*• i 'Cv : ; . • •>£""i!i..;«.>r/..
I f •'•• I 1 * 1 .
•••.••T.v.V
(* • • f « I I
após injetado 15 min. 30 min.
Flgur.3.1B - Cintilogrtfia. Nqtenci,!, d. rato Injrado com BLM"-"Tc, comM.lhpor. 0.22 * Nota-M «.rfnela d . Imagm hapatlea.
pwMflWfi prévlt por
Figura 116 - Cintifotos am seqüência cronológica da um rato, com processo tumoral ptflvico injatado com BLM-'*mTc
* Ml"* ^ ^ -ii-i.il I ill I v
i- n'.'i1.* • 'I'.'.'^.'-V.•.',","•"!•.".!"'.!',.!(' « I \
15 m i n . 60 m i n . 120 m i n . 180 m i n .
Fipir«3.17 — Cintilogramas de um rato com tumor na região pélvica, injetado por via caudal com BLM-**mTc *
30
:".- . í:. e&
O
2an
ccc
Eo
E
31
•) O volume do ehjfdo do garador (pertacnetato) deve wr manor ou igual * 4 ml, a aconcentração radioativa maior ou igual a 10 mCi/ml.
b) 0 pH de marcaçSo deva astar entre 2,0 e 2.5, para evitar a formaçlo da oxido intotúvtl •coloides.
c) 0 tempo de reação deve ser de no mínimo 15 minutos, com constante agitação ematmosfera inerte.
ú\ A retaçSo em massa Uig) entre o redutor Sn(tl) e a bteomicina mostra que na faixa da1 5 0 a 1:100 (Sn II/BLM) o rendimento é maximizado.
I I 1.4.3 - Eliminação da Óxidos a Qualatos Insotúveis
Os ensaios realizados mostraram a necessidade imperiosa da passagem do produto marcado, porfiltro Millipore 0,22n para eliminação dos óxidos insoluveis (TcO2 .2H,O) e da forma coloidal Tc/Sn,que M nid subtraídas do complexo, irSo se localizar no fígado.
IM.4.4 - Distribuição Biológica
A distribuição biológica mostrou que o produto B L M - " m Tc é apropriado para os fins a que sedestina, ou seja, detectar tecidos tumorais, com rápida eliminação do organismo • conseqüentediminuição da dose absorvida. A concentração máxima do produto nos tecidos tumorais duas horas apósinjeção e sua «liminaçSo total em menos de 24 horas, toma promissor o uso em diagnóstico tumoralpara a Medicina Nuclear.
ABSTRACT
* • vSÜSvaswr ptfmmm* study about the behavior of the labelling yMd of «antineopMc drug (bleomyòn) with
• «nort-livtd radionuclida « ' " "Tc ) , using Sh(lll as a redactor «gent, ifc fyjLiX
Parameteri lik« the pH in the labelling, influence of the reaction time and mm Of tin on the labelling yield
> analysed-^
' To simplify ttw totalling, a lyofiliied kit of Sn(IO/BLM in ewcueted vials ««as prepared.
^ The quality control involving paper chrometograpny, sterility and "In vivo" tan turn ma
were meek both in healthy rats and in mow «with tumorous tissues, under barbituric action. ^
- • Ths biological distribution, the concemreiion tirne of the protyen in tumor», the excretion time and excretion
vie «eve ttudied by mean* of icintignphy and (cintipholot. f ) , , (,••• o •
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T»l»fonr. 211-6011Endaraço Tttográfico - IEATOMICATtkx - 011-33692 IENA BR