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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
INSTITUTO METRÓPOLE DIGITAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOINFORMÁTICA
IARA DANTAS DE SOUZA
MAPA METABÓLICO DA INTOXICAÇÃO POR CHUMBO
NATAL RN
2017
IARA DANTAS DE SOUZA
MAPA METABÓLICO DA INTOXICAÇÃO POR CHUMBO
Defesa de Mestrado apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Bioinformática da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte.
Área de concentração: Bioinformática
Linha de Pesquisa: Biologia de Sistemas
Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliani Siqueira
Dalmolin
NATAL-RN
2017
Souza, Iara Dantas de. Mapa metabólico da intoxicação por chumbo / Iara Dantas deSouza. - Natal, 2017. 83 f.: il.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grandedo Norte. Instituto Metrópole Digital. Programa de Pós-Graduaçãoem Bioinformática. Orientador: Prof. Dr. Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin.
1. Chumbo - Dissertação. 2. Intoxicação por chumbo -Dissertação. 3. Envenenamento por chumbo - Dissertação. 4.Metais pesados - Dissertação. 5. Biologia de sistemas -Dissertação. 6. Toxicologia de sistemas - Dissertação. I.Dalmolin, Rodrigo Juliani Siqueira. II. Universidade Federal doRio Grande do Norte. III. Título.
RN/UF/BSE-CB CDU 546.815
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - UFRNSistema de Bibliotecas - SISBI
Catalogação de Publicação na Fonte. UFRN - Biblioteca Setorial Prof. Leopoldo Nelson - Centro de Biociências - CB
Dedico este trabalho à minha mãe, Ana Maria, que
em vida sempre me incentivou a seguir meus
sonhos.
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha família, em especial minha tia Izaneide Cortez, pelo apoio
incondicional durante minha vida acadêmica aqui em Natal.
Agradeço especialmente ao meu orientador, Rodrigo Dalmolin, que foi
extraordinário comigo durante este tempo de mestrado e é minha grande referência
acadêmica. Espero continuar trabalhando para fazer jus à confiança depositada em
mim.
As minhas amigas de infância: Carol, Joyce, Emmily, Ellyda, Edwiges, Thalita,
Izadora e Ylana pelo companheirismo que atravessa os anos.
Aos amigos que a Biomedicina me proporcionou: Hannaly, Jéssyca, Kamila,
Felipe, Brenda Alves e Brenda Cardoso, por acreditarem em mim e me incentivarem
a tentar o mestrado.
Aos amigos do BioME, os quais são muitos para citar, que tornaram estes dois
anos de formação muito mais divertidos. Obrigado pelo companheirismo nesta jornada
acadêmica, pelas viagens, pelos forrós das antigas, pelos “piqueniques” na casa de
Ricardo/Lucas, pelos karaokês, pelas edições divertidíssimas da disciplina BioME
Beach Party, pelas inúmeras conversas depressivas do almoço, pelas conversas
restauradoras na piscina, pela ajuda mútua durante as disciplinas (e fora delas
também), e pela confiança em mim que levou alguns a apostar a própria mão caso
não passe na seleção de doutorado. Vocês são perigosamente inspiradores.
RESUMO
Desde a antiguidade, o chumbo (Pb) vem sendo utilizado pela humanidade em virtude
das suas propriedades físico-químicas, como maleabilidade, ductilidade, resistência à
corrosão, baixo ponto de fusão e baixa condutividade elétrica. Entretanto, além de sua
importância econômica, o chumbo possui uma importância quanto à saúde humana,
uma vez que causa intoxicação. Muitos efeitos da intoxicação pelo chumbo já foram
relatados na literatura, sendo responsável pela toxicidade nos sistemas
cardiovascular, imunológico, ósseo, reprodutivo, hematopoiético, renal,
gastrointestinal e, principalmente, no sistema nervoso. Embora haja evidências sobre
como o chumbo afeta a homeostase em nível celular, a descrição das vias metabólicas
afetadas na intoxicação por chumbo não está estabelecida. Para esclarecer os efeitos
da intoxicação, o objetivo deste estudo é propor vias metabólicas das interações do
chumbo com os componentes celulares, através da curadoria das informações
presentes na literatura e em repositórios públicos. Após a busca na literatura,
encontramos um total de 23 proteínas, incluindo o tripeptídeo glutationa, as quais são
capazes de interagir com o chumbo e estão relacionadas com a base celular da
intoxicação. Estas informações, em conjunto com outras provenientes de repositórios
especializados, permitiram a integração do conhecimento em uma via metabólica da
intoxicação por chumbo. Por meio dela, observou-se que o chumbo atua de maneira
sistêmica no organismo, em especial, interferindo na função normal de proteínas as
quais se ligam a metais essenciais, como zinco e cálcio.
Palavras-chave: Chumbo, intoxicação por chumbo, envenenamento por chumbo,
metais pesados, biologia de sistemas, toxicologia de sistemas.
ABSTRACT
Since ancient times, lead (Pb) has been used by mankind because of its
physicochemical properties, such as malleability, ductility, corrosion resistance, low
melting point and low electrical conductivity. However, in addition to its economic
importance, lead is an important human health issue since it causes intoxication. Many
effects of lead intoxication have been reported in the literature, affecting the organism
as a whole and causing symptoms in cardiovascular, immune, skeletal, reproductive,
hematological, renal, gastrointestinal and nervous systems. Although there is evidence
on how lead affects cellular homeostasis, the description of the metabolic pathways
affected in lead poisoning is not fully established. To elucidate the effects of lead
poisoning, the aim of this study is to propose pathways of lead interactions with cell
components, through manual curation of information present in literature and public
repositories. After a search in literature, it was found a total of twenty-three proteins,
including glutathione, which can directly interact with lead and are related to the cellular
basis of intoxication. This knowledge taken together with the information present in
pathways repositories allowed the integration of the current information in a map of
lead poisoning. It was observed that lead acts in a systemic way, specially interfering
with the normal function of metalloproteins which rely on essential metals to the
organism, such as calcium and zinc.
Keywords: Lead, lead intoxication, lead poisoning, heavy metals, systems biology,
systems toxicology.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Relação entre uso de compostos de chumbo na gasolina e a concentração
média do chumbo no sangue de crianças do período de 1976 a 1980 nos EUA.
Adaptado de Jarup, 2003 .......................................................................................... 15
Figura 2. Níveis de chumbo no sangue considerados seguros pelo CDC do período
de 1960-2014. Adaptado de Burns & Gerstenberger, 2014. ..................................... 16
LISTA DE ABREVIATURAS
ALA Ácido aminolevulínico
ALAD Enzima ácido aminolevulínico desidratase
BLL Concentração de chumbo no sangue (do inglês, blood lead levels)
CDC Centro de Controle e Prevenção de Doenças dos Estados Unidos (do
inglês, U.S. Centers for Disease Control and Prevention)
COBRAC Companhia Brasileira de Chumbo
DMT1 Proteína transportadora de metais divalentes-1
GO Gene ontology
KEGG Enciclopédia de genes e genomas de Kyoto (do inglês, Kyoto
Encyclopedia of Genes and Genomes)
Pb Chumbo (Símbolo)
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11
1.1 Aspectos gerais do chumbo ................................................................................ 11
1.2 Ocorrência do chumbo no ambiente ................................................................... 11
1.3 Importância econômica ....................................................................................... 12
1.4 Aspectos epidemiológicos da intoxicação ........................................................... 13
1.5 Toxicocinética ...................................................................................................... 18
1.6 Sintomatologia da intoxicação por chumbo ......................................................... 19
1.7 Biomarcadores da intoxicação ............................................................................ 21
1.8 Justificativa do estudo ......................................................................................... 22
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23
2.1 Geral.................................................................................................................... 23
2.2 Específicos .......................................................................................................... 23
CAPÍTULO I .............................................................................................................. 24
3 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 70
3.1 Biologia de sistemas e repositórios públicos de informação ............................... 70
3.2 Metais pesados e sua relação com o metabolismo celular ................................. 71
3.3 Grupos de risco acerca da intoxicação por chumbo ............................................ 72
3.4 Bases moleculares da intoxicação por chumbo .................................................. 73
4 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 76
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 77
11
1 INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos gerais do chumbo
O chumbo é um dos metais pesados mais utilizados pela humanidade. O
chumbo é classificado como metal pesado em virtude do seu elevado número atômico,
massa molecular e densidade. Possui como símbolo Pb, número atômico 82, massa
atômica relativa 207,2 e densidade de 11.34 g/cm3, sendo o elemento estável de maior
número atômico. É encontrado na natureza sob uma mistura de quatro isótopos
diferentes, sendo aquele com maior massa atômica (208Pb) o mais comum. Os
isótopos do chumbo são provenientes do decaimento dos elementos urânio, actínio e
tório. O principal minério de extração do chumbo na natureza é a galena, o qual
contém chumbo na forma sulfatada, além de uma pequena proporção de prata. Na
sua forma pura, apresenta-se com coloração cinza-azulada brilhante. Apresenta
valência de +2 ou +4 que permite a formação de compostos inorgânicos de chumbo,
como o fluoreto de chumbo e o cloreto de chumbo, além de compostos orgânicos,
como o chumbo tetrametílico e o chumbo tetraetílico. Além disso, o chumbo apresenta
a capacidade de fazer ligações com outros átomos de chumbo, formando cadeias
(IARC, 2006).
Há relatos da utilização do chumbo nas sociedades da antiguidade, como
Egito, Grécia e Roma. A vasta utilização pela sociedade se deve às suas propriedades
físico-químicas. O chumbo é um metal com alta maleabilidade e ductibilidade, baixo
ponto de fusão e resistência à corrosão. Essas características possibilitaram seu uso
na confecção de utensílios domésticos, ferramentas, adornos e canos que levavam
água dos aquedutos para as cidades antigas. Por isso, o termo “Pb” é proveniente do
latim “plumbum” que significa “tubo”. Ainda, desde esta época já se relatavam
condições patológicas que se assemelhavam às da intoxicação pelo chumbo
(HERNBERG, 2000; HONG, S. et al., 1994).
1.2 Ocorrência do chumbo no ambiente
O chumbo ocorre de forma ubíqua no ambiente e sua distribuição se deve
aos processos naturais e às atividades antropogênicas. O intemperismo, a erosão e
as atividades vulcânicas são responsáveis pela liberação e dispersão do chumbo
12
presente na forma mineral para o ambiente (IARC, 2006). Estes processos naturais
de distribuição do chumbo correspondem a apenas uma pequena parcela do chumbo
liberado anualmente na crosta terrestre. A exploração mineral realizada pelo homem
passou a ter um peso maior para a dispersão do chumbo a partir do século XVIII, com
a Revolução Industrial (HERNBERG, 2000). Atualmente, estima-se que a
concentração de chumbo no ambiente é mil vezes maior do que aquela encontrada
em regiões não expostas à atividade exploratória, mostrando, desta maneira, a
importância da exploração humana como fonte de contaminação (PATTERSON, C. et
al., 1991). O chumbo pode ser acumulado no solo, na água e no ar e o intercâmbio
entre estes repositórios ocorre por forças físicas e naturais. Considerando as
atividades antropogênicas, o aumento da concentração do chumbo na atmosfera foi
resultado da exaustão de motores que utilizavam combustíveis com aditivos contendo
compostos de chumbo (MORE et al., 2017). Esta prática passou a ser abolida a partir
da década de 1970, nos Estados Unidos, sendo posteriormente também banida em
outros países. A mineração e fundição também influenciam no aumento dos níveis de
chumbo no ar, especialmente nas proximidades onde estas atividades ocorrem. Além
disso, processo de decaimento do radônio constitui uma fonte alternativa de liberação
de partículas de chumbo na atmosfera (IARC, 2006; TONG; SCHIRNDING, VON;
PRAPAMONTOL, 2000).
A contaminação do solo ocorre principalmente pela deposição do chumbo
atmosférico e pela liberação de resíduos provenientes de áreas de mineração. A
contaminação dos lençóis freáticos e das coleções externas de água é resultado do
desgaste natural dos minérios de chumbo e, em maiores proporções, da atividade
industrial. Os sistemas de encanamento, por exemplo, que usam tubulações com
soldas de chumbo, representam um risco adicional para a contaminação da água
(ATSDR, 2007; IARC, 2006).
1.3 Importância econômica
A produção do chumbo segue as vias primária e secundária. A produção
primária corresponde à extração do chumbo por meio da atividade mineradora; a
produção secundária, por sua vez, está relacionada às atividades de reciclagem dos
produtos que contém chumbo (IARC, 2006). Em virtude da versatilidade das suas
características físico-químicas, o chumbo é amplamente utilizado pela indústria.
13
Grande parte da sua versatilidade pode estar relacionada à formação de ligas
metálicas com outros metais, como o antimônio, cobre, cálcio e prata. As ligas são
usadas na fabricação de soldagens, lâminas e materiais de construção (KING et al.,
2005). O chumbo produz compostos resistentes à oxidação, sendo usado também na
produção de baterias, tintas e tubulações. Possui resistência à radiação ionizante e à
vibração mecânica, sendo usado na proteção contra raios-X e no isolamento acústico.
Em razão da sua elevada densidade e baixo custo, é usado na fabricação de munições
(JOHNSON, C. K.; KELLY; RIDEOUT, 2013). Alguns compostos de chumbo
apresentam coloração vermelha ou amarelada, sendo usados na fabricação de
ornamentos de vidro e cerâmica (IARC, 2006).
A maior parte dos materiais produzidos a partir do chumbo podem ser
reutilizados. A fabricação de baterias automotivas pode ser considerada atualmente a
principal aplicação econômica do chumbo, sendo também o produto com maior índice
de reciclagem deste metal (IARC, 2006; MEYER, P. A.; BROWN, M. J.; FALK, 2008).
1.4 Aspectos epidemiológicos da intoxicação
A intoxicação pelo chumbo é uma das doenças relacionadas à toxicologia
ambiental de maior importância para a saúde humana. Desde a antiguidade são
reportados casos de intoxicação pelo chumbo: a colica Pictorum era uma condição
bem conhecida da sociedade romana. Era caracterizada pela presença de fortes
cólicas abdominais seguidas de paralisia e outras disfunções do sistema nervoso
central, sendo estas manifestações patognomônicas da intoxicação crônica por
chumbo (EISINGER, 1982). Sabe-se que o chumbo é uma potente neurotoxina capaz
de causar danos irreversíveis, especialmente em crianças expostas a níveis crônicos
(SANDERS et al., 2009). Apesar de haver na história relatos do conhecimento dos
efeitos nocivos do chumbo, as medidas de prevenção não eram prioridade. Desde que
o chumbo começou a ser explorado até a Revolução Industrial, a população exposta
perecia sem o conhecimento da causa da sua enfermidade ou como poderiam tratá-
la.
A partir da segunda metade do século XX, a intoxicação pelo chumbo
tornou-se mais evidente, ganhando os holofotes da mídia e dos governos
(HERNBERG, 2000). Nos Estados Unidos, país que liderou muitas das discussões
sobre o assunto, houve inicialmente controvérsias por partes dos grupos de estudo
14
sobre a real influência do chumbo na saúde humana (NEEDLEMAN, 2000).
Entretanto, após alguns anos, o efeito tóxico do chumbo foi amplamente reconhecido
e medidas começaram a ser tomadas para o controle da exposição. Nesta época,
estas discussões incidiam sobre a adição de compostos de chumbo como
antidetonantes nos combustíveis, fato este que aumentou consideravelmente a
dispersão de partículas de chumbo pela atmosfera. Esta nova forma de exposição é
apontada como uma das principais causas relacionadas ao aumento dos níveis de
chumbo no sangue da população, especialmente urbana (MAHAFFEY, 1998;
RICHMOND-BRYANT et al., 2013, 2014). Em 1973, o governo estado-unidense
resolveu eliminar gradualmente o uso de compostos de chumbo nos combustíveis,
cuja eliminação completa só foi conseguida anos mais tarde, em 1988 (NIEBOER et
al., 2013). O primeiro incentivo à eliminação do chumbo é apontado como um dos
principais marcos no controle da exposição e iniciou uma era de políticas públicas em
outros países visando a prevenção e o combate à intoxicação pelo chumbo (Figura 1)
(PIRKLE et al., 1994; THOMAS, 1995). Neste período, outros marcos importantes
foram a eliminação da adição de compostos de chumbo em tintas e do uso de
soldagens de chumbo em latas usadas no armazenamento de alimentos (NIEBOER
et al., 2013).
15
Figura 1. Relação entre uso de compostos de chumbo na gasolina e a concentração média do
chumbo no sangue de crianças do período de 1976 a 1980 nos EUA. Adaptado de Jarup, 2003
Os estudos epidemiológicos auxiliam na caracterização de populações
susceptíveis à intoxicação e no planejamento de estratégias de ação para a prevenção
da intoxicação. As investigações têm como principais amostras populacionais os
trabalhadores que atuam na exploração e na indústria do chumbo, além da população
de forma geral. Podemos classificar a intoxicação pelo chumbo como aguda ou
crônica. A intoxicação aguda é definida como uma exposição à grandes quantidades
de chumbo em um curto espaço de tempo, ocasionando sintomas mais graves que
podem resultar em risco de vida se não houver um manejo rápido e adequado. A
intoxicação crônica, por sua vez, muitas vezes está relacionada à exposição
ocupacional e é resultado da exposição a quantidades baixas ou moderadas de
chumbo por um longo período de tempo. Os indivíduos cronicamente intoxicados
desenvolvem os sintomas gradualmente, tornando-se, com o passar do tempo, tão
graves quanto os da intoxicação aguda (FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012; ROSIN,
2009).
16
Não há nenhuma função conhecida no organismo para a qual o chumbo
seja necessário. Assim, qualquer nível de exposição ao chumbo pode ser considerado
prejudicial. Apesar disso, em função da ampla dispersão dos compostos de chumbo
no ar, solo e água, é aceito que virtualmente todas as populações estão expostas e
apresentem concentrações variáveis do chumbo no sangue (BURNS;
GERSTENBERGER, 2014). Em 1991, o Centro de Controle e Prevenção de Doenças
dos EUA (U.S. Centers for Disease Control and Prevention - CDC) estabeleceu a
concentração de 10 µg/dL como limiar preocupante para o chumbo no sangue, após
o amplo monitoramento da população infantil (CDC, 1991). Este valor de referência
passou a ser usado em todo o mundo como forma de avaliação de populações
susceptíveis. Entretanto, alguns grupos continuaram mostrando os efeitos nocivos do
chumbo em níveis menores que o limiar até então estabelecido, especialmente
relacionando baixos níveis de chumbo com o detrimento irrecuperável do
desenvolvimento cognitivo em crianças. Observou-se ainda que níveis de chumbo no
sangue menores que o limiar de 10 µg/dL estavam relacionados a disfunções
comportamentais, imunológicas, cardiovasculares e endócrinas. Assim, em 2012, o
CDC aboliu o termo “limiar de preocupação” e adotou como nível máximo para
desencadeamento de ações de combate à intoxicação o valor de 5 µg/dL de sangue
(Figura 2) (ACCLPP, 2012).
Figura 2. Níveis de chumbo no sangue considerados seguros pelo CDC do período de 1960-2014.
Adaptado de Burns & Gerstenberger, 2014.
17
Para fins de acompanhamento epidemiológico, a concentração de chumbo
no sangue total é a métrica mais usada para avaliar a exposição (SAKAI, 2000). As
medidas de controle tomadas ao longo dos últimos cinquenta anos, sobretudo com
relação à diminuição da emissão de compostos de chumbo no ar, foram responsáveis
pela diminuição dos níveis de chumbo no sangue em muitos países (RICHMOND-
BRYANT et al., 2014). Apesar desta diminuição, a intoxicação pelo chumbo segue
sendo um problema atual, especialmente nos países em desenvolvimento, os quais,
em geral, não possuem políticas públicas fortes de vigilância, prevenção e combate à
intoxicação.
A exposição da população em geral, aquela que não está submetida à
exposição ocupacional, varia em função da localização e da situação socioeconômica.
Nos EUA, houve uma diminuição de 87% na concentração de chumbo no sangue do
período de 1976 a 2000, chegando a uma média de 1.8 µg/dL em homens e mulheres.
A Austrália também seguiu esta tendência de diminuição. Na Ásia, a maior parte dos
países apresentaram níveis de chumbo menores que 10 µg/dL, com algumas áreas
urbanizadas apresentando níveis elevados. Na América Latina, a maior parte dos
países apresentam níveis de chumbo menores que 10 µg/dL. No continente africano,
por sua vez, a maioria dos países apresentam níveis de chumbo maiores que 10 µg/dL
(IARC, 2006).
No Brasil, poucos relatos epidemiológicos foram feitos nos últimos 50 anos
para acompanhar a situação da população quanto à exposição ao chumbo. Assim
como ocorreu em outros países, na década de 1980, houve uma preocupação por
parte do governo brasileiro em diminuir a presença de compostos de chumbo na
gasolina. Esta iniciativa fez parte da política econômica brasileira voltada para a
promoção de combustíveis de origem vegetal, como o etanol. A adição progressiva
do etanol à gasolina eliminou a necessidade de adição de compostos de chumbo nos
combustíveis usados nos veículos de passeio. Atualmente, os dados de estudos em
algumas localidades do país mostram que em populações não expostas pelas
atividades ocupacionais, a concentração de chumbo no sangue é baixa. Entretanto,
alguns casos pontuais foram observados, resultados de acidentes ambientais
(ALMEIDA LOPES et al., 2017; KIRA, 2014; PAOLIELLO; CAPITANI, 2005)
18
1.5 Toxicocinética
O chumbo pode ser absorvido por meio do trato gastrointestinal, pelo trato
respiratório e pela pele. A via de absorção pode depender do tipo de composto, se
orgânico ou inorgânico, e pelo tamanho da partícula. Ainda, alguns fatores podem
alterar a susceptibilidade à intoxicação, como idade, estado nutricional e
características genéticas (BARBOSA JR. et al., 2005).
Dependendo do tamanho da partícula, os compostos inorgânicos podem
ser absorvidos pela via respiratória e pela via gastrointestinal, sendo a primeira mais
eficiente. Ao chegar aos alvéolos, as partículas de chumbo são fagocitadas pelos
macrófagos alveolares e o chumbo é liberado na corrente sanguínea (NEAL;
GUILARTE, 2013). Considerando que atualmente a emissão de compostos de
chumbo no ar em função da queima de combustíveis é um evento raro, esta forma de
exposição é mais comum em populações localizadas próximas aos parques industriais
(IARC, 2006). No intestino, o chumbo é absorvido principalmente por transporte
facilitado. A proteína transportadora de metais divalentes-1 (DMT1) é uma proteína
expressa na superfície dos enterócitos e está envolvida no transporte de íons de ferro,
cogitando-se a relação desta proteína com a absorção de chumbo (NEAL; GUILARTE,
2013). Há um aumento da presença desta proteína na superfície intestinal em casos
de deficiência de ferro, o que pode acarretar um aumento na capacidade de absorção
ao chumbo (MEYER, P. A.; BROWN, M. J.; FALK, 2008). Em virtude da maior
hidrofobicidade, os compostos orgânicos de chumbo são melhor absorvidos pela pele.
Esta forma de exposição também se tornou rara com a eliminação dos compostos
alquilados nos combustíveis (ATSDR, 2007).
Uma vez absorvido, a maior parte dos íons de chumbo liga-se aos
eritrócitos, associando-se às proteínas intracelulares e às membranas. Há um
equilíbrio entre o chumbo eritrocítico e o chumbo plasmático, de modo que este
corresponde à fração biodisponível aos tecidos (SAKAI, 2000). O chumbo pode
permanecer por cerca de 40 dias no sangue e, através da corrente sanguínea, alcança
diversos órgãos, como cérebro, fígado, músculos, rins e pulmões, e os tecidos ósseos,
incluindo dentes (FOWLER, 1998). Apesar da grande seletividade, as barreiras
endoteliais, como a barreira hematoencefálica e a barreira placentária, são
permeáveis à passagem dos íons de chumbo, embora o mecanismo subjacente a este
transporte não tenha sido completamente desvendado (GUNDACKER;
19
HENGSTSCHLÄGER, 2012). Uma vez nestes tecidos, o chumbo deposita-se e
apresenta uma meia vida variável. O principal local de armazenamento do chumbo no
organismo são os ossos e dentes, correspondendo a 94% da carga total em adultos
e 73% em crianças (BARBOSA JR. et al., 2005). Os íons de chumbo substituem os
íons de cálcio presentes nos cristais de hidroxiapatita necessários à deposição óssea,
permanecendo armazenados neste tecido por décadas. Além disso, o processo de
reabsorção óssea contribui para a liberação para o sangue do chumbo armazenado,
sendo influenciado por fatores hormonais causados pela menopausa, lactação e pelo
crescimento (RABINOWITZ, 1991). Assim, a concentração de chumbo no sangue
reflete não somente o nível de exposição externa ao metal, mas também a
reexposição endógena, contribuindo para a cronificação da intoxicação. O chumbo
pode ser excretado por meio das fezes e da urina, podendo estar presente nas unhas,
suor, pelos e cabelos (ATSDR, 2007).
1.6 Sintomatologia da intoxicação por chumbo
A intoxicação por chumbo provoca uma vasta gama de sintomas, cuja
gravidade dependerá do tempo e nível de exposição, além do diagnóstico precoce e
adoção de medidas de tratamento e prevenção.
Um dos sintomas mais evidentes da intoxicação pelo chumbo é a anemia,
resultado do bloqueio da via de biossíntese do heme pelo chumbo e da retirada
precoce dos eritrócitos da circulação pelo sistema monocítico-macrofágico presente
nos órgãos hematopoiéticos. O bloqueio da via de biossíntese do heme ocasiona o
acúmulo de metabólitos, como o ácido aminolevulínico (ALA) e a zincoprotoporfirina,
os quais são usados como marcadores da intoxicação. A degradação precoce dos
eritrócitos está diretamente relacionada à meia-vida do chumbo na corrente
sanguínea, estando envolvida com comprometimento das membranas celulares em
virtude do processo oxidativo desencadeado pelo chumbo. Na intoxicação aguda,
prevalece a anemia hemolítica, definida como um excesso de destruição dos
eritrócitos; na intoxicação crônica, contudo, há uma franca anemia, caracterizada tanto
pelo excesso de destruição quanto pela diminuição da síntese de hemoglobina
(FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012; KIM, H.-C. et al., 2015).
O dano renal é uma das principais consequências da intoxicação. A
exposição sustentada a altos níveis de chumbo no sangue (70–80 μg/dl) já foi
20
associada à insuficiência renal crônica, através de estudos epidemiológicos e modelos
animais. Nos dias atuais, tal concentração de chumbo no sangue é rara,
especialmente nos países desenvolvidos; todavia, deve ser levada em consideração
em populações residentes próximas a áreas de contaminação. Contudo, como
mostrado por Ekong et al, o chumbo, mesmo em concentrações mínimas no sangue,
atua com outros fatores de risco bem estabelecidos para promover a doença renal
crônica (EKONG; JAAR; WEAVER, 2006).
Alguns estudos mostram a relação da exposição ao chumbo com a
ocorrência de doenças cardiovasculares. Sabe-se que a exposição crônica ao chumbo
aumenta a frequência de hipertensão arterial, bem como acidentes cerebrovasculares
e doença vascular periférica (ALMEIDA LOPES et al., 2017; KIM et al., 2015). O
mecanismo por trás deste processo ainda não foi desvendado, mas há evidências do
papel do estresse oxidativo na ocorrência deste processo (SIRIVARASAI et al., 2015).
Os efeitos do chumbo nos ossos afetam o desenvolvimento, formação e
reabsorção ósseas. Mostrou-se que o chumbo é capaz de ser depositado no
esqueleto fetal e provocar aberrações ósseas, especialmente o esqueleto axial. O
chumbo deposita-se na região trabecular, a qual mantém a liberação de chumbo no
sangue, e na região cortical, onde o chumbo permanece armazenado e ficando pouco
disponível para trocas com o plasma. A reabsorção óssea é responsável por 40-70%
do chumbo no sangue, constituindo uma fonte de exposição endógena (SMITH;
OSTERLOH; FLEGAL, A. R., 1996).
As consequências mais graves da intoxicação pelo chumbo estão
relacionadas ao funcionamento do sistema nervoso. A encefalopatia é observada na
intoxicação aguda e crônica e manifesta-se como apatia, irritabilidade, falta de
atenção, dor de cabeça, tremor muscular, perda de memória e alucinações, e nos
casos mais graves, ocorre delírio, falta de coordenação, convulsões, paralisia, coma
e ataxia (FLORA; GUPTA, D.; TIWARI, 2012). Os efeitos no sistema nervoso periférico
são mais pronunciados em adultos que em crianças, enquanto que os efeitos centrais
são mais importantes na infância. Fetos e crianças tem maior susceptibilidade aos
efeitos centrais em função da maior capacidade de absorção do sistema nervoso em
desenvolvimento (NEEDLEMAN, 2004). Em baixas concentrações, o chumbo pode
prejudicar o desenvolvimento cognitivo, com diminuição do QI, alterações
comportamentais e habilidade de concentração (BELLINGER; NEEDLEMAN, 2003).
21
1.7 Biomarcadores da intoxicação
Na toxicologia, biomarcadores são medidas biológicas usadas no
diagnóstico ou na avaliação de risco de potenciais agentes tóxicos. Os biomarcadores
de exposição ao chumbo podem ser classificados como biomarcadores de exposição
e biomarcadores de efeito. Ambos representam mecanismos de interação do chumbo
com o organismo (SAKAI, 2000).
Os biomarcadores de exposição reportam o contato, recente ou não, com
o chumbo. O mais utilizado é a concentração de chumbo no sangue total, já que a
maior parte do chumbo na corrente sanguínea está associado aos eritrócitos, ficando
disponível por cerca de 40 dias (BARBOSA JR. et al., 2005). A concentração do
chumbo plasmático reflete o equilíbrio entre sangue e outros compartimentos do
organismo, mas possui uma meia-vida muito curta, de cerca de uma hora (SAKAI,
2000). O chumbo urinário, de forma menos frequente, também pode ser usado como
medida de exposição. As concentrações de chumbo plasmático e urinário, entretanto,
relacionam-se diretamente com o chumbo no sangue e tendem a aumentar
exponencialmente conforme o aumento deste (BERGDAHL et al., 1997). Deve-se
lembrar que a concentração de chumbo no sangue é resultado da combinação de
exposições ambientais ao chumbo bem como da exposição endógena às reservas
presentes nos ossos e dentes (SAKAI, 2000).
Os marcadores de efeito são biomoléculas cujo metabolismo é interferido
pela ação toxicodinâmica do agente tóxico. Em geral, correspondem a metabólitos os
quais são acumulados após a interferência do chumbo. Dentre eles, temos o ácido
aminolevulínico (ALA), substrato usado pela enzima ácido aminolevulínico
desidratase (ALAD) na segunda reação da via de biossíntese do heme, a qual é
fortemente inibida pelo chumbo. A exposição ao chumbo interfere na via de
biossíntese do heme e acarreta o aumento de ALA em vários tecidos, resultando em
aumento da concentração de ALA no sangue, plasma e urina; embora o aumento no
plasma e no sangue seja melhores indicadores do efeito do chumbo sobre a medula
óssea. Ainda, a atividade da enzima ALAD eritrocitária também pode ser usada como
marcador de efeito, uma vez que sua atividade é especificamente inibida por baixos
níveis de chumbo no sangue (AJIOKA; PHILLIPS; KUSHNER, 2006; MEYER, U. A.;
SCHUURMANS; LINDBERG, 1998). A zincoprotoporfirina é produzida como resultado
da inibição da transferência dos íons de ferro pelo chumbo para a protoporfirina, na
22
última etapa da via de biossíntese do heme. O acúmulo de zincoprotoporfirina nos
eritrócitos também mostra-se um bom marcador do efeito do chumbo sobre a medula
óssea (MARTIN, C. J.; WERNTZ; DUCATMAN, 2004). Por fim, o coproporfirinogênio
III é outro metabólito da via de biossíntese do heme, sendo excretado anormalmente
na urina de trabalhadores expostos pelo menos duas semanas depois do início dos
sintomas da intoxicação (SAKAI, 2000).
1.8 Justificativa do estudo
A preocupação sobre a influência do chumbo na saúde humana que surgiu
nas últimas décadas estimulou inúmeros estudos os quais visaram a identificação dos
alvos moleculares para este metal no organismo. Muitos destes trabalhos
conseguiram identificar proteínas as quais apresentavam alterações de suas funções
quando submetidas à ação do chumbo, resultando em modificação da homeostase
celular e relacionando-se aos sintomas observados na intoxicação (GARZA; VEGA;
SOTO, 2006).
A identificação de componentes celulares envolvidos na fisiopatologia de
doenças seguiu uma linha reducionista desde o surgimento da biologia molecular.
Nesta premissa, cada componente celular é estudado separadamente do sistema o
qual faz parte na busca do entendimento da contribuição deste para o processo. Com
o desenvolvimento de novas tecnologias, tornou-se possível o estudo do metabolismo
celular de forma coordenada, contribuindo para a expansão da biologia de sistemas
(BARABASI; OLTVAI, 2004).
A biologia de sistemas permitiu a observação da funcionalidade dos
componentes celulares integradamente. Apesar de haver repositórios especializados
na montagem e representação dos processos celulares, estes não possuem vias
celulares que demonstrem de maneira coordenada, a interação do chumbo com os
diversos componentes celulares e como esta interação pode explicar os sintomas da
intoxicação.
23
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Este trabalho tem como objetivo principal propor vias que possam explicar
os mecanismos celulares subjacentes à intoxicação por chumbo.
2.2 Específicos
• Analisar os dados presentes na literatura e buscar proteínas de interação com
o chumbo por meio de mineração de texto;
• Fazer uma busca utilizando o banco de dados KEGG Pathway sobre as vias
metabólicas as quais as proteínas de interação com o chumbo participam;
• Reunir as informações presentes na literatura com aquelas adquiridas do banco
de dados citado e integrar este conhecimento em vias da intoxicação por
chumbo;
• Elucidar a base molecular pela qual o chumbo é capaz de interferir nos
sistemas do organismo e provocar os sintomas observados na intoxicação;
24
CAPÍTULO I
Artigo: Lead poisoning metabolic map
Escrito por: Iara Dantas de Souza, Abraão Silveira de Andrade, Rodrigo Juliani
Siqueira Dalmolin
Manuscrito submetido ao periódico Critical Reviews in Toxicology
For Peer Review O
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Lead poisoning metabolic map
Journal: Critical Reviews in Toxicology
Manuscript ID Draft
Manuscript Type: Review
Date Submitted by the Author: n/a
Complete List of Authors: de Souza, Iara; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment de Andrade, Abraão; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment Dalmolin, Rodrigo; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Bioinformatics Multidisciplinary Environment; Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Biochemistry
Keywords: heavy metals, lead intoxication, environmental toxicity, systems toxicology, environmental health, systemic effect of lead poisoning
URL: http://mc.manuscriptcentral.com/btxc Email: [email protected]
Critical Reviews in Toxicology
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Lead poisoning metabolic map
Iara Dantas de Souzaa, Abraão Silveira de Andradea, Rodrigo Juliani Siqueira
Dalmolina,b*
aBioinformatics Multidisciplinary Environment, Federal University of Rio Grande do Norte,
Natal, Brazil; bDepartment of Biochemistry, Federal University of Rio Grande do Norte,
Natal, Brazil.
BioME – Bioinformatics Multidisciplinary Environment.
Address: Rua Odilon Gomes de Lima, 1722, Natal – RN. Brazil. Zip code 59078-400.
Phone number: +55 84 33422216
*Corresponding author
Iara Dantas de Souza. e-mail: [email protected]
Abraão Silveira de Andrade. e-mail: [email protected]
*Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin. e-mail: [email protected]
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Abstract
Lead is an important heavy metal used worldwide in several applications, especially in
industry. People exposed to lead can develop a wide range of symptoms associated
with lead poisoning. Many effects of lead poisoning were reported in the literature,
showing a compromising of whole body health, with symptoms related to cardiovascu-
lar, immune, bone, reproductive, hematological, renal, gastrointestinal, and nervous
system. However, the molecular lead targets as well as the pathways affected by lead
poisoning are not completely described. The aim of this study was to construct a map
of metabolic pathways impaired in lead poisoning by evaluating which biomolecules
are directly affected by lead. Through manual literature curation, we identified proteins
which physically interact with lead and subsequently determined the metabolic path-
ways those proteins are involved with. At total, we identified 23 proteins involved with
heme synthesis, calcium metabolism, neurotransmission, among other biological sys-
tems, which helps to understand the wide range of lead poisoning symptoms.
Keywords: heavy metals; lead intoxication; environmental toxicity; systems toxicolo-
gy; environmental health; systemic effect of lead poisoning;.
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Table of contents
Introduction4
Methods6
Inclusion Criteria6
Exclusion Criteria6
Results7
Lead poisoning symptoms7
Systemic effects of lead poisoning8
Proteins related to hematological system8
Proteins related to oxidative stress10
Proteins related to calcium metabolism10
Proteins of nuclear function11
Proteins involved with lead bioavailability11
Proteins related to nervous system metabolism13
NMDA Receptors14
Acetylcholine Receptors15
Synaptotagmin16
Voltage-Gated Calcium Channels17
Discussion and perspectives17
Acknowledgments20
Declaration of interest20
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References20
Introduction
Lead is one of the most important heavy metals due to its impact on the economy and human
health. It has been used since ancient times for several purposes, such as household utensil
manufacturing, plumbing systems, and even in food (Hernberg 2000). After the Industrial
Revolution, lead has been used in paint manufacturing, maritime industry, automotive battery
manufacturing, metal soldering, nuclear industry, and fuel. Despite the decrease of lead use in
past years, lead containing compounds are still essential for industries and relevant for the
economy in several countries. The Centers for Disease Control and Prevention from the US
(CDC) establishes blood lead levels (BLL) at 5 µg/dL as reference for health surveillance
(ACCLP 2012). However, studies using animal models to assess the effects of lead poisoning
have shown that BLL lower than the established by CDC are capable of impairing some bio-
logical systems, especially the nervous system (C.M. Bouton et al. 2001; Gillis et al. 2012).
The consequences of lead exposure remain a significant public health problem especially in
developing countries.
Lead compounds are absorbed mainly through respiratory and gastrointestinal tract
(Figure 1), being the former more efficient when compared to the latter (Hodgkins et al.
1991). It can also be absorbed through skin, particularly when forming hydrophobic organic
compounds such as tetraethyl lead. Once in the bloodstream, 99% of lead is associated with
erythrocytes (Schütz et al. 1996). Lead can also interact with plasma and cellular proteins,
mainly thiol and sulfhydryl containing proteins (Al-Modhefer et al. 1991). Bones and teeth
can store lead, retaining it for decades. Lead compounds might be released back to the blood-
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stream through processes as bone remodeling. Additionally, lead can accumulate in soft tis-
sues, especially liver, kidney, and brain. Adults have greater lead storage capacity than chil-
dren, causing the latter to have greater lead available in the blood (Liu et al. 2013). Lead
might crosses the blood-brain barrier through active transport by protein channels that carry
ions to the brain tissues (Simons & Pocock 1987). Lead has a special affinity for blood-brain
barrier and the choroid plexus endothelial cells. Therefore, those structures can protect central
nervous system against the deleterious effects of lead poisoning (Strużyńska et al. 1997). On
the other hand, there is no consensus in the literature whether lead has a preferential deposi-
tion area in the brain (Neal & Guilarte 2013). There are no lead detoxification systems de-
scribed and its half-life in the blood is approximately 40 days. It is excreted mainly in urine
and feces, and additionally in hair, skin, sweat, milk, and nails (Barbosa Jr et al. 2006). [Fig-
ure 1 near here]
The symptoms associated to lead intoxication might vary depending on whether the
exposure is acute or chronic. The primary effects of lead in the body are related to neurologi-
cal, hematological, cardiovascular, immune, bone, reproductive, and renal dysfunctions (Flo-
ra et al. 2012). The broad spectrum of symptoms indicates that lead can impair several sys-
tems by interacting with many cellular components and/or affect signaling cascades. The
complexity and heterogeneity of the lead intoxication symptoms reflect the systemic impair-
ment of cellular functions. Many studies on lead poisoning report the effects of lead on pro-
teins and show the influence of this metal on the metabolic functions by affecting lead-
interacting proteins. The aim of this work is to organize and combine the lead influence on
metabolism, in a broad and coordinated way, to describe the lead poisoning metabolic map
focusing on systemic, neuronal, and cellular levels.
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Methods
Proteins that directly interact with lead were identified by systematical literature curation.
Briefly, PubMed Database search was performed using the following terms: “Lead intoxica-
tion”, “Lead poisoning”, “Lead binding proteins”, and “Lead(II) and Pb(II)”. Also, the fol-
lowing filters have been established: article types (“classical articles”, “reviews”, “case re-
ports”, and “datasets”) and language (“English”). In total, 83 articles that report the effects of
lead poisoning in the human body, focusing on systemic effects, have been selected. From
those 83 articles, 34 studies showing proteins that directly interact with lead have been se-
lected, resulting in a list of 23 proteins (including the tripeptide glutathione). The Gene Sym-
bol of each selected protein was checked using HUGO Gene Nomenclature Committee
(Yates et al. 2017). The pathways associated with each retrieved protein was obtained using
KEGG Pathways Database (Supplemental Table S1) (Kanehisa et al. 2016). Disease-related
pathways have been excluded.
Inclusion Criteria
The proteins included in the metabolic map were chosen based on whether they can directly
interact with lead. Structural studies showing the molecular interaction between the lead ions
and proteins were considered the gold standard for our purposes. Additionally, previous stud-
ies regarding the interference of lead on the enzyme and membrane channel activity were
considered.
Exclusion Criteria
Proteins reported in the literature having their expression altered by lead without any infor-
mation supporting the inclusion criteria cited above were excluded.
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Results
Lead poisoning symptoms
Acute and chronic exposure to lead produces a set of systemic symptoms. The clinical fea-
tures observed in lead poisoning are non-specific and may be confused by porphyrias and in-
toxication by other metals. The most prominent symptoms are related to central nervous sys-
tem, such as dullness, irritability, and poor attention. The aggression of blood-brain barrier
results in encephalopathy with cerebral edema and hemorrhages (Strużyńska et al. 1997; Flo-
ra et al. 2012). Animal studies showed that prenatal exposure is particularly relevant consid-
ering the ineffectiveness of the blood-brain barrier in protecting the nervous system against
lead during development (Toews et al. 1978). In severe cases, the intoxication outcomes in-
clude convulsions, paralysis, and coma (Flora et al. 2012).
Chronic kidney disease occurs with chronic BLL of 70–80 mg/dl (Khalil-Manesh et
al. 1992; Said & Hernandez 2015). The high and stead lead levels cause the lead nephropa-
thy, defined by chronic tubulointerstitial nephritis. High chronic levels of exposure are rare,
particularly in developed countries. Despite the worldwide lead exposure reduction, there is
still evidence to support renal damage at chronic low lead levels (Ekong et al. 2006). Bones
are the main lead reservoir in the human body and the skeletal lead level reflects long term
exposure (Álvarez-Lloret et al. 2017). Animal studies showed developing effects of prenatal
lead exposure, resulting in impairment of axial skeleton (Ferm & Carpenter 1967; Jacquet et
al. 1977). Lead intoxication also comprises the development of bones and teeth through life
(Lee et al. 2016; Beier et al. 2016). Resolving lead intoxication symptoms requires continued
treatment in order to eliminate the skeletal lead content to avoid endogenous exposure
(Wedeen 1992). Lead can also accumulate at bone marrow affecting the maturation process
of blood components, while strongly inhibits the heme synthesis (Ajioka et al. 2006).
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Systemic effects of lead poisoning
Lead effects on cellular metabolism may be due to its interaction with susceptible proteins,
especially those with prosthetic groups composed of calcium and zinc (Gorkhali et al. 2016).
Those ions act in the cell by regulating the electrochemical gradient between intra- and extra-
cellular environments, controlling transmission of secondary signals, and/or altering gene ex-
pression (Baranowska-Bosiacka et al. 2012). Lead interacts with ion-binding sites, interfering
with normal protein activity affecting the cellular processes they participate in.
We identified 23 proteins (including the tripeptide glutathione) described to physical-
ly interact with lead (Table 1). Among them, 5 proteins are able to bind lead acting as chela-
tors (e.g. metallothioneins), 15 have its functions inhibited by lead, and 3 are described to be
stimulated by lead. Lead binding proteins act in several pathways such as signal transduction,
proliferation, cell survival, secretion, and regulation of gene expression (Figure
2)(Verstraeten et al. 2008; Gonick 2011). In the following sessions, we will discuss interac-
tion aspects of lead and lead-interacting proteins, and the cellular basis of symptoms pro-
voked by lead toxicity. [Table 1 near here]
Proteins related to hematological system
The interaction of lead with hematological cells induces changes in cell homeostasis and
culminates in anemia (Suwalsky et al. 2003). Proteins affected by lead play essential func-
tions in blood stream metabolism, controlling biomolecules synthesis and metabolites pro-
cessing. The inhibition of the enzymes related to hematological pathways results in substrate
accumulation, decreasing the concentration of final pathway metabolites.
The δ-aminolevulic acid dehydratase (ALAD) is one of the main targets of lead (Jaffe
et al. 2001). This cytoplasmic enzyme catalyzes the asymmetric condensation of two mole-
cules of δ-aminolevulic acid to form one molecule of porphobilinogen, in a rate-limiting step
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of heme biosynthesis (Ajioka et al. 2006). Replacement of zinc in the enzyme metal binding
site strongly inhibit ALAD activity (Figure 2), making the enzyme a good biomarker of lead
exposure (Talia Sanders et al. 2009). The inhibition of ALAD promotes the increase of δ-
aminolevulic acid concentration in blood, plasma, and urine (Barbosa Jr et al. 2006). The two
ALAD most common alleles, ALAD-1 and ALAD-2, have different distributions among eth-
nic groups and they were related to distinct susceptibilities to lead poisoning (Wetmur et al.
1991). Lead also stimulates the accumulation of other metabolites derived from heme biosyn-
thesis, such as zinc protoporphyrin. Collectively, the metabolites mentioned are used as bi-
omarkers of lead exposure (Sakai 2000).
Pyrimidine 5'-nucleotidase 1 is an erythrocyte enzyme involved in pyrimidine nucleo-
tide metabolism, catalyzing the hydrolysis of cytidine monophosphate (CMP) or 7-
methylguanosine monophosphate nucleotides (Valentine et al. 1976). Lead inhibits Pyrimi-
dine 5'-nucleotidase 1 by a yet unclear mechanism (Figure 2). The enzyme inhibition causes
the accumulation of pyrimidine nucleotides, which affects RNA catabolism (Paglia et al.
1975). The accumulation of RNA molecules stimulates its aggregation and it appears as a
basophilic stippling in erythrocytes. The presence of those histological features in peripheral
blood is another indication of lead poisoning. On the other hand, basophilic stipplings are
present in the pyrimidine 5'-nucleotidase 1congenital deficiency, which makes it difficult to
use basophilic stipplings as a specific biomarker for lead poisoning (Chiarelli et al. 2006).
The inhibition of pyrimidine 5'-nucleotidase 1 and ALAD disturb blood cells physiol-
ogy (Suwalsky et al. 2003). In consequence, intoxicated individuals present anemia as a com-
bination of decreasing in heme biosynthesis and impairment of hemoglobin synthesis (Sakai
2000). The accumulation of metabolites and the lipid oxidation result in early removal and
destruction of erythrocytes from blood stream on spleen, liver, and/or bone marrow
(Adonaylo & Oteiza 1999; Jang et al. 2011). [Figure 2 near here]
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Proteins related to oxidative stress
Lead intoxication is well-known to disrupt redox balance by inducing oxidative stress (Flora
et al. 2012). The oxidative stress in lead poisoning is a result of at least two mechanisms: the
increase of reactive oxygen species (ROS) production and the depletion of antioxidant mole-
cules reserves. The inhibition of ALAD synthesis accumulates ALA substrate, which gener-
ates hydroxyl radical (Jan et al. 2015). Additionally, lead can directly interact with membrane
lipids, leading to lipid peroxidation (Flora et al. 2012). Lead also impairs glutathione recy-
cling systems by affecting glutathione peroxidase (Gpx) and glutathione reductase (Grx),
which become inactive and therefore no longer capable of recycling glutathione (Figure 2)
(Flora et al. 2012). As a consequence of the disrupted redox state, chronic lead-induced oxi-
dative stress causes extensive DNA damage (Danadevi et al. 2003). Moreover, lead is able of
interfering with nucleotide excision repair (NER) through the inhibition of Ape endonuclease.
This often introduces critical DNA mutations and it consequently prompts apoptosis (Jan et
al. 2015).
Proteins related to calcium metabolism
Pb2+ can replace other divalent metals, such as Zn2+ (Ordemann & Austin 2016) and Ca2+
(Gorkhali et al. 2016). This binding often implies in protein function loss or hyperactivation.
This property is crucial for several clinical manifestations of lead poisoning. For example, it
enables lead to cross blood-brain barrier tight junctions through ion channels by substituting
Ca2+ (T. Sanders et al. 2009). Also, calcium replacement can impair calmodulin-mediated
pathways. Calmodulin is a ubiquitous calcium-binding protein, which affects and stimulates
many intracellular functions such as inflammation, metabolism, apoptosis, muscle contrac-
tion, intracellular movement, nerve growth, and immune response (Hudmon & Schulman
2002; Xia & Storm 2005). Lead has a higher affinity for calmodulin binding sites (Figure 2)
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and it is able to bind it in lower concentrations when compared to calcium (Fullmers et al.
1985; Richardt et al. 1986). Consequently, lead-bound calmodulin undergoes conformational
changes and may cause inappropriate activation of several proteins, many belonging to the
protein kinase C (PKC) family and N-methyl-D-aspartate glutamate receptor subtype
(Gorkhali et al. 2016). These protein complexes are deeply involved in learning and cognitive
functions and they are also thought to interact significantly with each other to mediate cogni-
tive functions (Marchetti 2003).
Proteins of nuclear function
Lead often forms large granular aggregates called inclusion bodies when inside the cell (Gon-
ick 2011). Lead ions that do not associate in inclusion bodies are left free in the cytosol and
eventually reach the nucleus, affecting nuclear enzymes (Figure 2). Lead has been described
to have a strong affinity for apurinic/apyrimidinic endonuclease 1 (APE1) (McNeill et al.
2004). APE1 is one of the main proteins involved in DNA repair and its activity is greatly
inhibited when the enzyme is bound to lead, making DNA nucleotide repair systems progres-
sively inefficient (McNeill et al. 2004). Lead also binds to human protamine P2 (HP2), a pro-
tein that acts as a histone in sperm cells (Quintanilla-Vega et al. 2000). HP2 condenses DNA
protecting it during spermatogenesis. Lead binds to the zinc site on HP2, leading to a con-
formational change that results in chromatin instability and that may affect fertility and off-
spring development (Quintanilla-Vega et al. 2000).
Proteins involved with lead bioavailability
Several proteins can protect against heavy metals by acting as chelators. The expression of
those proteins is stimulated after the ions enter the cell, preventing heavy metal toxic effects.
Some chelators may have other physiological functions which could be comprised by the in-
teraction with the heavy metal (Gonick 2011). One of the first studies to understand proteins
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associated to lead intoxication was conducted by Raghavan and Gonick in the 1970's, which
used human erythrocytes to identify a protein capable of sequestering lead available in the
cell (Raghavan & Gonick 1977).
Metallothionein corresponds to a family of small molecular weight proteins rich in
cysteine residues (Ruttkay-Nedecky et al. 2013), involved with metal detoxification and reac-
tive oxygen species scavenging (Vallee 1995; Kang 2006; Carpenè et al. 2007). Oxidative
stress stimulates its expression, serving as a free radical acceptor. Due to its ability to bind
metal ions inside the cell, metallothionein is an important biomarker for heavy metal poison-
ing (Ademuyiwa et al. 2010). Metallothionein is also expressed in placenta, being present in
syncytiotrophoblast and the villous interstitial layer (Gundacker et al. 2012). The presence of
metallothionein in placenta can prevent the passage of lead into the fetal circulation and, pre-
sumably, protect the fetus against lead (Adonaylo & Oteiza 1999; Gundacker et al. 2012).
Lead intoxication induces the formation of inclusion bodies in kidney and brain. Such
structures are formed by aggregates of lead and proteins, especially metallothionein. Inclu-
sion bodies formation is initiated in the cytoplasm and then the complex is transported to the
nucleus (Figure 3) (Qu et al. 2002; Waalkes et al. 2004; Zuo, Qu, Ryan N. Cooper, et al.
2009). There is no concrete evidence about how these inclusion bodies can impair cellular
homeostasis. They could play a protective role against lead intoxication by sequestering the
ions, preventing lead from accessing cell structures sensitive to their toxic effects. Knockout
mice for the two major isoforms of metallothionein (MT-I/II) have not shown inclusion bod-
ies in their renal cells (Zuo, Qu, Ryan N. Cooper, et al. 2009), and are more susceptible to the
occurrence of carcinogenic events (Zuo, Qu, Ryan N Cooper, et al. 2009). Besides metal-
lothionein, other proteins have been suggested to be lead-binding proteins, such as α2µ-
microglobulin, diazepam binding inhibitor, and thymosin β4 (Fowler 1998). [Figure 3 near
here]
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Studies have shown that glial cells can accumulate higher lead levels than the extra-
cellular medium (Tiffany-Castiglioni et al. 1989), implying a possible protective function in
nerve tissues. Following these assumptions, Qian and collaborators have conducted a study
using rat glial cells to verify which proteins were involved in resistance to lead intoxication
(Qian et al. 2000). They have observed that lead was able to bind to 78 kDa glucose-regulated
protein (GRP78), also known as heat shock 70 kDa protein, an endoplasmic reticulum protein
(Figure 2) responsible for the correct folding of newly synthesized proteins and the mainte-
nance of intracellular calcium levels (Qian et al. 2000). In addition to providing a binding site
for lead, its expression was stimulated in a time-dependent manner and remained elevated
until the last day of cell exposure, suggesting that increased protein synthesis may be a de-
fense mechanism against the toxic effects of lead. However, it is unknown if this mechanism
of cell resilience may compromise other important functions performed by GRP78.
Interactions involving the proteins mentioned above and lead need to be better under-
stood, and it is still necessary to comprehend the protein content of inclusion bodies since
studies made so far are not conclusive about the structure’s protein identity.
Proteins related to nervous system metabolism
The most known effects of lead on human physiology are related to its ability to cause chron-
ic and acute damage to the nervous system. In the 1990’s, research groups began to discuss
safe BLL for the population. It was noted that BLL below the level of concern designated by
CDC could also result into complications and irreversible damages (Gilbert & Weiss 2006;
Betts 2012). Studies have shown that the developmental period of the nervous system is more
susceptible to chronic imbalances in neural pathways essential for cognition, resulting in
nervous system development deficiency mostly in spatial learning pathways and memory
consolidation processes (Toscano & Guilarte 2005; Guilarte et al. 2012). Chronic exposure to
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lead during childhood may result in deleterious consequences that persist into adult life. Early
and chronic exposure to lead is associated with several cognitive disorders in children (Nigg
2008; Baranowska-Bosiacka et al. 2012). Chronic lead exposure during adulthood may be
associated with increased susceptibility to neurodegenerative diseases, probably due to the
interaction of lead with enzymes and transcription factors associated with Parkinson, Alz-
heimer, and Schizophrenia (Ordemann & Austin 2016).
NMDA Receptors
Glutamatergic neurons mediate the larger proportion of excitatory neural pathways with an
essential role in the memory process through a cellular mechanism called Long Term Poten-
tiation (LTP) (Nihei et al. 2000; Nihei & Guilarte 2001). The most abundant NMDA receptor
subtypes in nervous system are NR1/NR2A and NR1/NR2B, being present in synaptic densi-
ty and glial cells, respectively (Monyer et al. 1994; Luo et al. 1996; Toscano & Guilarte
2005). The extracellular part of the receptor has binding sites for glutamate and glycine, and a
metal-binding site occupied by zinc. This ion binding site regulates the affinity of glycine to
the receptor. The channel allows the transit of Na+, K+, and Ca+2, and its structural features
make it more selective to Ca+2 (Garza et al. 2006). [Figure 4 near here]
Lead is a potent NMDA receptor antagonist (Figure 4) (Ujihara & Albuquerque 1992;
Omelchenko et al. 1997). The inhibition caused by lead possibly occurs through the substitu-
tion of zinc at the regulatory site, causing the receptor to have a lower glycine affinity. The
inhibition of glycine binding to the receptor inhibits its activation interfering with intracellu-
lar calcium-dependent processes (Hashemzadeh-Gargari & Guilarte 1999). Lead blocks the
calcium influx to cytoplasm due to the higher affinity of lead ions with the channel glutamate
residues (Garza et al. 2006). Studies have concluded that lead selectively affects NMDA re-
ceptor-mediated LTP in the hippocampus, but does not cause injury to LTP mediated by oth-
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er non-NMDA pathways, showing the selectivity of lead in this particular receptor (Gutowski
et al. 1998). This is probably the mechanism by which chronic exposure to lead, especially in
periods of the nervous system development, triggers cognitive deficits in memory and learn-
ing.
Lead intoxication is reported to change the ontogeny pattern of NMDA receptor sub-
units during the nervous system development in addition to the direct NMDA receptors inhi-
bition. NR1/NR2B receptors are present in major proportions during the primary stages of
nervous system development. Over time, there is a change in the composition of those recep-
tors, which in the adult brain are composed mainly of NR2A subunits. This shift in subunit
predominance reflects the need for neural pathway consolidation through synaptic plasticity
(Sun et al. 2017). Receptors containing the NR2B subunits have slower deactivation kinetics
and have the optimum performance for the early stages of development. Then, after increas-
ing the stimuli, the NR2A receptors are more efficient since their deactivation kinetics is fast-
er (Toscano & Guilarte 2005). NR2A receptors are required for the acquisition of more effi-
cient neuronal responses end its increased expression remains through life in the mature
brain. It has been observed that lead may decrease the expression of NR2A subunits and in-
crease the expression of NR2B subunits during the early stages of brain development (Gui-
larte & McGlothan 1998). The perturbation of the ontogeny of NMDA receptors, through the
change in the composition of their subunits, can alter the normal development and maturation
of the nervous system, especially in the hippocampal areas (Guilarte & McGlothan 1998; Ni-
hei & Guilarte 1999).
Acetylcholine Receptors
Acetylcholine is one of the main neurotransmitters involved in neuromodulation, a process
related to attention, memory, learning, and synaptic plasticity (Teles-Grilo Ruivo & Mellor
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2013). Lead acts by decreasing the frequency of opening ionic channels associated with cho-
linergic receptors (Figure 4) (Nagata et al. 1997). Lead is associated with a reduction in mus-
carinic receptor amount during the perinatal period and a decreased choline acetyltransferase
activity. All those mechanisms might work together, impairing cholinergic transmission.
While the results described here do not clearly explain the molecular basis of lead interfer-
ence on those pathways, they give us evidence about the mechanisms involved with the influ-
ence of lead intoxication in learning and memory consolidation.
Synaptotagmin
Synaptotagmin is a protein present in the synaptic vesicles and functions as a cellular regula-
tor of vesicle fusion to the presynaptic membrane (Zimmerberg et al. 2006). Neurotransmitter
release occurs rapidly after calcium influx through the opening of the ion channels. Synapto-
tagmin has two C2 domains that interact with calcium (C2a and C2b), both homologous to
those found in PKC. As intracellular calcium concentrations increase, synaptotagmin initiates
the union of the vesicle with the membrane through the interactions with other proteins
(Südhof 2013). This process occurs after signal evocation, membrane depolarization, and
opening of the calcium channels. However, lead has been described to stimulate the sponta-
neous neurotransmitter release in several neuronal pathways. The exact mechanism behind
this phenomenon is unknown, but lead in picomolar concentrations are able to activate PKC
(Markovac & Gary W Goldstein 1988; Morales et al. 2011). Once activated, PKC stimulates
other cellular pathways, culminating in the release of the neurotransmitters present in the
synaptic vesicles. Lead interacts with Synaptotagmin C2 domain but prevents its bind to syn-
taxin, a protein required for the presynaptic membrane fusion (Figure 4). Thus, the spontane-
ous release of neurotransmitters induced by lead does not appear to occur directly through the
interaction between lead and synaptotagmin (C.M.L.S. Bouton et al. 2001).
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Voltage-Gated Calcium Channels
Voltage-gated calcium channels are ion channels which allow calcium flux from the extracel-
lular to the intracellular medium. They are present in several cell types and their activation
induces calcium-dependent pathways, regulation of gene expression, hormonal secretion,
neurotransmitter release, muscle contraction, and onset of synaptic transmission. Calcium
channels convert the electrical signal from the membrane into cellular response mediated by
other proteins. Thus, the cellular effects of calcium channels activation will depend on the
cell type, the channel subtype, and the current type generated (Catterall 2011; Simms &
Zamponi 2014).
Many of the processes discussed so far are intrinsically involved with calcium metab-
olism. In neurons, calcium channel activation and the consequent increase of intracellular
calcium stimulate calcium-dependent proteins such as PKC and CaM, which will activate
gene transcription (Zimmerberg et al. 2006). It was experimentally observed that lead inhibits
calcium channel activation (Figure 4), interfering with the nerve impulse (Büsselberg et al.
1993). The effect of lead on each channel subtypes was evaluated by Ujihara and collabora-
tors and it was observed that lead could block all types of calcium channels at the highest
concentrations tested (10µM), but there is a selective blockade of type-P channels at low lev-
els equivalent to those observed in chronic intoxication (Ujihara et al. 1995). The inhibition
of calcium channels caused by lead chronic exposure may contribute to neurotoxicity due to
the wide distribution of those channels in nervous system.
Discussion and perspectives
The broad spectrum of lead poisoning symptoms indicates that lead can impair several sys-
tems by interacting with many cellular components. The toxic effect of lead relies on suscep-
tible proteins, especially those with prosthetic groups composed of calcium and zinc. Lead
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interacts with the protein ion-binding sites, interfering with normal protein activity and, con-
sequently, affecting the cellular processes they participate. Ions act at various cellular levels,
regulating the electrochemical gradient between intra and extracellular environments, control-
ling transmission of secondary signals within the cell, and/or altering gene expression (Bar-
anowska-Bosiacka et al. 2012; Gorkhali et al. 2016).
Calcium is one most essential ions to the cell due to regulating a wide variety of pro-
cesses. It is found in higher concentrations in the extracellular medium so that the electro-
chemical gradient of calcium between the extracellular matrix and the cytoplasm reaches the
order of 104 (Gorkhali et al. 2016). Calcium influx is performed by protein channels that al-
low the ions transit through the hydrophobic membrane. The opening of those channels and
the maintenance of the intracellular calcium buffering system regulates ionic balance between
intra and extracellular environments. Calcium is an important secondary messenger given its
capacity to interact with many proteins. Modulation of calcium binding proteins within the
neuronal cell is essential for neuronal excitability, synaptic transmission, and neuronal plas-
ticity (Nikoletopoulou & Tavernarakis 2012). The C2 domain present in PKC and synapto-
tagmin as well as the EF domain present in calmodulin are examples of calcium binding do-
mains (Nalefski & Falke 1996; Lewit-Bentley & Réty 2000). Specifically, PKC family have a
key role in regulating signal transduction, gene expression, membrane channels, and synaptic
plasticity, commonly associated with the arising and progress of diseases (Sun et al. 1999;
Geraldes & King 2010). Lead has a higher affinity for C2 PKC domain by replacing calcium
ions of its binding site in presence of phosphatidylserine containing membranes. The interac-
tion of PKC and membrane lipids is crucial for its kinase activity. Lead was reported to be as
effective as calcium to prompt membrane association (Morales et al. 2011). Also, when com-
pared to calcium, lower concentrations of lead can trigger PKC activation (Markovac & Gary
W. Goldstein 1988; Markovac & Gary W Goldstein 1988; Hwang et al. 2002). Given the
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wide set of cellular responses invoked by PKC activation, its interaction with lead clearly
contributes to the basis of lead toxicity.
Like calcium, zinc is an essential ion and participates in several cellular mechanisms.
Among many functions, it is required for the structural constitution zinc fingers protein fami-
ly. These structurally diverse proteins are widely distributed in eukaryotic genomes, corre-
sponding to 3% of human genome. Zinc fingers are related to several functions such as DNA
recognition, RNA packaging, transcriptional activation, apoptosis, protein packaging, and
lipid binding (Malgieri et al. 2015). Some zinc fingers have been reported to interact with
lead. Their functions are heterogeneous, relating to erythropoiesis regulation and immune re-
sponse regulation (Gao et al. 2007). The interaction of zinc finger (e. g. GATA-1, TFIIIA,
and EGR-1) with lead comprising their DNA binding properties (Reddy & Zawia 2000;
Crumpton et al 2001; Huang et al 2004; Ghering et al 2005). Zinc fingers also participate in
nervous system development and their interaction with lead have been associated with neuro-
degenerative diseases (Ordemann & Austin 2016).
Some studies have associated lead exposure with cancer development risk. It is well
reported the effect of oxidative stress in the emergency of genetic instability and the initial
cancer events. As discussed above, lead can induce free radicals production through damage
in cell membranes and inhibition of glutathione detoxification system, besides inhibition of
Apu/Apy-endonuclease 1, related to protection against DNA damage caused by reactive oxy-
gen species. Those factors could increase cancer susceptibility (Wang & Shi 2001; Chen &
Shi 2002; Harris & Shi 2003; Leonard et al. 2004).
The study of cellular pathophysiology of lead intoxication may help to elucidate the
mechanisms that result in the symptoms observed in lead poisoning. We found that lead can
interact with several cellular components, comprising its normal function. Lead acts in a sys-
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temic way interacting with a heterogeneous set of proteins, such as enzymes, transcription
factors, neuronal receptors, xenobiotic responsive, and oxidative stress-detox system proteins.
Acknowledgments
We acknowledge KEGG and PUBMED databases for providing public access to their data. This work
was supported by CAPES, CNPQ and PROPESQ.
Declaration of interest
The authors report no conflicts of interest. The author’s affiliation is as shown on the cover page. The
authors have sole responsibility for the writing and content of the paper.
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Tables
Table 1. Lead interacting proteins.
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Figure captions
Figure 1. The toxicokinetics of lead poisoning. Lead enters in the organism mainly through
gastrointestinal and respiratory tracts but skin could absorb organic lead compounds in rarer
cases. Lead reaches the blood stream and associates to erythrocytes. Lead associated with
cells remains in equilibrium with plasmatic lead. Plasmatic lead corresponds to a tiny propor-
tion of lead pool, yet is important because it is available to other tissues. After achieving hard
tissues such as bone and teeth, lead can remain stored for decades. Soft tissues, such as kid-
ney, liver, lungs, and brain can also store lead. After damaging blood-brain barrier, lead can
accumulate in the brain and to impair brain development. Lead is excreted in feces and urine.
Figure 2. Cellular effects of lead poisoning. Lead can affect redox detoxification by inhibition
of glutathione system, enhancing reactive oxygen species. Lead can also inhibit some im-
portant enzymes involved in heme synthesis leading to hematological symptoms. Lead inter-
feres with calcium metabolism, through activation of protein kinase C and calmodulin, and
by inhibition of adenylate cyclase and voltage-gated calcium channels, which are key pro-
teins related to signal transduction and activation of second messengers. Lead can interact
with nuclear proteins, such as transcription factors and DNA repair enzymes. Finally, lead
can be chelated by cytosolic proteins and endoplasmic reticulum proteins.
Figure 3. Hypothetical mechanism of inclusion bodies formation.
Figure 4. Effects of lead on the nervous system. Most of the studies about lead poisoning fo-
cus on explaining the mechanisms underlying the clinical manifestations and the develop-
mental consequences of lead exposure. Evidence so far shows that lead interferes with glu-
tamatergic pathways, one of the main excitatory pathways of the nervous system. It has a
great importance on memory consolidation due to the ionotropic receptors, mostly NMDA
receptors, which mediate the synaptic plasticity by stimulation of Long-Term Potentiation
and Long-Term Depression on hippocampus. Lead also might inhibit the current on nicotinic
receptors, an ionotropic cholinergic receptor. Additionally, lead can interrupt the currents
mediated by voltage-gated calcium channels. Lead binds to synaptotagmin, but apparently, it
is not related to neurotransmitter release. It is not well described how lead can access neuron
cytoplasm, but it is possible that lead crosses the hydrophobic membrane through ion chan-
nels such as the ionotropic receptors mentioned above. Within the cell, lead can mimic essen-
tial ions and trigger secondary pathways that regulate important neuronal processes.
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Diazepam binding inhibitor Fowler, 1998
Thymosin beta 4 Fowler, 1998
Synaptotagmin 1 Bouton et al. 2001
Heat shock protein family A (Hsp70) member 5 Qian et al. 2000
Metallothionein
Qu et al. 2002
Zuo et al. 2009
Waalkes et al. 2004
General transcription factor IIIA Huang et al. 2004
Early growth response 1 Reddy & Zawia 2000
GATA binding protein 1 Ghering et al. 2005
Apurinic/apyrimidinic endodeoxyribonuclease 1 McNeill et al. 2004
NMDA receptor
Omelchenko et al. 1997
Ujihara & Albuquerque 1992
Hashemzadeh-Gargari & Guilarte 1999
Voltage-gated calcium channels Ujihara et al. 1995
Nicotinic acetylcholine receptor Nagata et al. 1997
Adenylate cyclase Nathanson & Bloom 1975
Protamine 2 Quintanilla-Vega et al. 2000
Aminolevulinate dehydratase Jaffe et al. 2001
Glutamine synthetase Flora et al. 2012
Glutathione reductase Flora et al. 2012
Glutathione peroxidase Flora et al. 2012
Glutathionea Flora et al. 2012
Pyrimidine 5'-nucleotidase 1 Paglia et al. 1975
Sp1 transcription factor Crumpton et al. 2001
CalmodulinFullmers et al. 1985
Richardt et al. 1986
Protein kinase C
(Markovac & Gary W. Goldstein 1988)
(Markovac & Gary W Goldstein 1988)
(Morales et al. 2011)
(Hwang et al. 2002)
Binding
Inhibition
Stimulation
ª Glutathione is a tripeptide inhibited by lead.
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Figure 1. The toxicokinetics of lead poisoning. Lead enters in the organism mainly through gastrointestinal and respiratory tracts but skin could absorb organic lead compounds in rarer cases. Lead reaches the blood stream and associates to erythrocytes. Lead associated with cells remains in equilibrium with plasmatic lead. Plasmatic lead corresponds to a tiny proportion of lead pool, yet is important because it is available to other
tissues. After achieving hard tissues such as bone and teeth, lead can remain stored for decades. Soft tissues, such as kidney, liver, lungs, and brain can also store lead. After damaging blood-brain barrier, lead
can accumulate in the brain and to impair brain development. Lead is excreted in feces and urine.
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Figure 2. Cellular effects of lead poisoning. Lead can affect redox detoxification by inhibition of glutathione system, enhancing reactive oxygen species. Lead can also inhibit some important enzymes involved in heme synthesis leading to hematological symptoms. Lead interferes with calcium metabolism, through activation
of protein kinase C and calmodulin, and by inhibition of adenylate cyclase and voltage-gated calcium channels, which are key proteins related to signal transduction and activation of second messengers. Lead can interact with nuclear proteins, such as transcription factors and DNA repair enzymes. Finally, lead can
be chelated by cytosolic proteins and endoplasmic reticulum proteins.
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Figure 3. Hypothetical mechanism of inclusion bodies formation.
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Figure 4. Effects of lead on the nervous system. Most of the studies about lead poisoning focus on explaining the mechanisms underlying the clinical manifestations and the developmental consequences of lead exposure. Evidence so far shows that lead interferes with glutamatergic pathways, one of the main
excitatory pathways of the nervous system. It has a great importance on memory consolidation due to the ionotropic receptors, mostly NMDA receptors, which mediate the synaptic plasticity by stimulation of Long-Term Potentiation and Long-Term Depression on hippocampus. Lead also might inhibit the current on
nicotinic receptors, an ionotropic cholinergic receptor. Additionally, lead can interrupt the currents mediated by voltage-gated calcium channels. Lead binds to synaptotagmin, but apparently, it is not related to
neurotransmitter release. It is not well described how lead can access neuron cytoplasm, but it is possible that lead crosses the hydrophobic membrane through ion channels such as the ionotropic receptors mentioned above. Within the cell, lead can mimic essential ions and trigger secondary pathways that
regulate important neuronal processes.
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Planilha1
Protein Pathway ID Pathway Name
hsa04261 Adrenergic signaling in cardiomyocytes
hsa04925 Aldosterone synthesis and secretion
hsa04371 Apelin signaling pathway
hsa04976 Bile secretion
hsa04020 Calcium signaling pathway
hsa04024 cAMP signaling pathway
hsa04022 cGMP-PKG signaling pathway
hsa04062 Chemokine signaling pathway
hsa04725 Cholinergic synapse
hsa04713 Circadian entrainment
hsa04728 Dopaminergic synapse
hsa04961 Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption
hsa01522 Endocrine resistance
hsa04915 Estrogen signaling pathway
hsa04727 GABAergic synapse
hsa04540 Gap junction
hsa04971 Gastric acid secretion
hsa04922 Glucagon signaling pathway
hsa04724 Glutamatergic synapse
hsa04912 GnRH signaling pathway
hsa04750 Inflammatory mediator regulation of TRP channels
hsa04911 Insulin secretion
hsa04211 Longevity regulating pathway
hsa04720 Long-term potentiation
hsa04916 Melanogenesis
hsa04740 Olfactory transduction
hsa04114 Oocyte meiosis
hsa04913 Ovarian steroidogenesis
hsa04921 Oxytocin signaling pathway
hsa04972 Pancreatic secretion
hsa04072 Phospholipase D signaling pathway
hsa04611 Platelet activation
hsa04914 Progesterone-mediated oocyte maturation
hsa00230 Purine metabolism
hsa04015 Rap1 signaling pathway
hsa04923 Regulation of lipolysis in adipocytes
hsa04924 Renin secretion
hsa04723 Retrograde endocannabinoid signaling
hsa04970 Salivary secretion
hsa04726 Serotonergic synapse
hsa04742 Taste transduction
hsa04918 Thyroid hormone synthesis
hsa04270 Vascular smooth muscle contraction
hsa04962 Vasopressin-regulated water reabsorption
Aminolevulinate
Dehydratasehsa00860 Porphyrin and chlorophyll metabolism
Apurinic/apyrimidinic
Endodeoxyribonuclease 1hsa03410 Base excision repair
hsa04261 Adrenergic signaling in cardiomyocytes
hsa04925 Aldosterone synthesis and secretion
hsa04020 Calcium signaling pathway
hsa04024 cAMP signaling pathway
hsa04973 Carbohydrate digestion and absorption
hsa04260 Cardiac muscle contraction
Supplemental table S1. Kegg Pathways of lead interacting proteins
Adenylate Cyclasea
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For Peer Review O
nly
Planilha1hsa04022 cGMP-PKG signaling pathway
hsa04725 Cholinergic synapse
hsa04713 Circadian entrainment
hsa04728 Dopaminergic synapse
hsa04727 GABAergic synapse
hsa04724 Glutamatergic synapse
hsa04912 GnRH signaling pathway
hsa04911 Insulin secretion
hsa04730 Long-term depression
hsa04720 Long-term potentiation
hsa04010 MAPK signaling pathway
hsa04921 Oxytocin signaling pathway
hsa04924 Renin secretion
hsa04723 Retrograde endocannabinoid signaling
hsa04726 Serotonergic synapse
hsa04721 Synaptic vesicle cycle
hsa04742 Taste transduction
hsa04530 Tight junction
hsa04270 Vascular smooth muscle contraction
hsa04261 Adrenergic signaling in cardiomyocytes
hsa04925 Aldosterone synthesis and secretion
hsa04371 Apelin signaling pathway
hsa04020 Calcium signaling pathway
hsa04024 cAMP signaling pathway
hsa04022 cGMP-PKG signaling pathway
hsa04713 Circadian entrainment
hsa04728 Dopaminergic synapse
hsa04915 Estrogen signaling pathway
hsa04971 Gastric acid secretion
hsa04922 Glucagon signaling pathway
hsa04912 GnRH signaling pathway
hsa04750 Inflammatory mediator regulation of TRP channels
hsa04910 Insulin signaling pathway
hsa04720 Long-term potentiation
hsa04916 Melanogenesis
hsa04722 Neurotrophin signaling pathway
hsa04740 Olfactory transduction
hsa04114 Oocyte meiosis
hsa04921 Oxytocin signaling pathway
hsa04070 Phosphatidylinositol signaling system
hsa04744 Phototransduction
hsa04015 Rap1 signaling pathway
hsa04014 Ras signaling pathway
hsa04924 Renin secretion
hsa04970 Salivary secretion
hsa04270 Vascular smooth muscle contraction
hsa04020 Calcium signaling pathway
hsa05204 Chemical carcinogenesis
hsa04725 Cholinergic synapse
hsa04080 Neuroactive ligand-receptor interaction
Thymosin Beta 4 hsa04810 Regulation of actin cytoskeleton
Diazepam Binding
Inhibitorhsa03320 PPAR signaling pathway
Early Growth Response 1 hsa04371 Apelin signaling pathway
hsa04020 Calcium signaling pathway
hsa04024 cAMP signaling pathway
Voltage-Gated
Calcium Channelsb
Calmodulinc
Nicotinic Acetylcholine
Receptorsd
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For Peer Review O
nly
Planilha1hsa04713 Circadian entrainment
hsa04728 Dopaminergic synapse
hsa04724 Glutamatergic synapse
hsa04720 Long-term potentiation
hsa04080 Neuroactive ligand-receptor interaction
hsa04015 Rap1 signaling pathway
hsa04014 Ras signaling pathway
hsa05322 Systemic lupus erythematosus
hsa00480 Glutathione metabolism
hsa04918 Thyroid hormone synthesis
hsa03060 Protein export
hsa04141 Protein processing in endoplasmic reticulum
hsa04612 Antigen processing and presentation
hsa04918 Thyroid hormone synthesis
Metallothioneinf hsa04978 Mineral absorption
hsa00230 Purine metabolism
hsa00240 Pyrimidine metabolism
hsa00760 Nicotinate and nicotinamide metabolism
hsa04261 Adrenergic signaling in cardiomyocytes
hsa04960 Aldosterone-regulated sodium reabsorption
hsa04925 Aldosterone synthesis and secretion
hsa04360 Axon guidance
hsa04662 B cell receptor signaling pathway
hsa04020 Calcium signaling pathway
hsa04973 Carbohydrate digestion and absorption
hsa04062 Chemokine signaling pathway
hsa04725 Cholinergic synapse
hsa04713 Circadian entrainment
hsa04728 Dopaminergic synapse
hsa01521 EGFR tyrosine kinase inhibitor resistance
hsa04961 Endocrine and other factor-regulated calcium reabsorption
hsa04012 ErbB signaling pathway
hsa04664 Fc epsilon RI signaling pathway
hsa04666 Fc gamma R-mediated phagocytosis
hsa04510 Focal adhesion
hsa04727 GABAergic synapse
hsa04540 Gap junction
hsa04971 Gastric acid secretion
hsa04724 Glutamatergic synapse
hsa04912 GnRH signaling pathway
hsa04066 HIF-1 signaling pathway
hsa04750 Inflammatory mediator regulation of TRP channels
hsa04931 Insulin resistance
hsa04911 Insulin secretion
hsa04670 Leukocyte transendothelial migration
hsa04730 Long-term depression
hsa04720 Long-term potentiation
hsa04010 MAPK signaling pathway
hsa04916 Melanogenesis
hsa04150 mTOR signaling pathway
hsa04650 Natural killer cell mediated cytotoxicity
hsa04064 NF-kappa B signaling pathway
hsa04921 Oxytocin signaling pathway
hsa04972 Pancreatic secretion
hsa04070 Phosphatidylinositol signaling system
hsa04072 Phospholipase D signaling pathway
NMDA Receptorse
Gluthatione Reductase
Heat Shock 70kD Protein 5
(Glucose-Regulated Protein, 78kD)
5'-Nucleotidase
Protein Kinase C
(Conventional)g
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For Peer Review O
nly
Planilha1hsa04151 PI3K-Akt signaling pathway
hsa04015 Rap1 signaling pathway
hsa04014 Ras signaling pathway
hsa04723 Retrograde endocannabinoid signaling
hsa04970 Salivary secretion
hsa04726 Serotonergic synapse
hsa04071 Sphingolipid signaling pathway
hsa04919 Thyroid hormone signaling pathway
hsa04918 Thyroid hormone synthesis
hsa04270 Vascular smooth muscle contraction
hsa04370 VEGF signaling pathway
hsa04310 Wnt signaling pathway
hsa01522 Endocrine resistance
hsa04350 TGF-beta signaling pathway
hsa04915 Estrogen signaling pathway
Synaptotagmin 1 hsa04721 Synaptic vesicle cicle
e The pathways are from GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, GRIN2C, GRIN2D, GRIN3A, GRIN3B genes of NMDA receptors.f The pathways are from MT1A, MT1B, MT1E, MT1F, MT1G, MT1H, MT1HL1, MT1M, MT1X, MT2A, MT3 and MT4 genes of metallothionein.
gThe pathways are from PRKCA, PRKCB and PRKCG genes of the conventional isoform of protein kinase C, which has the C2 domain. This domain has a calcium
binding site that can be replaced by lead ions.
SP1 Transcription Factor
ª The pathways are from ADCY1, ADCY2, ADCY3, ADCY4, ADCY5, ADCY6, ADCY7, ADCY8, ADCY9 and ADCY10 genes of adenylate cyclase.
bThe pathways are from CACNA2D1, CACNA2D2, CACNA2D3, CACNA2D4, CACNB1, CACNB2, CACNB3, CACNB4, CACNG1, CACNG2, CACNG3,
CACNG4, CACNG5, CACNG6, CACNG7, CACNG8, CACNA1A, CACNA1B, CACNA1C, CACNA1D, CACNA1E, CACNA1F, CACNA1G, CACNA1H,
CACNA1I and CACNA1S genes of voltage-gated calcium channels. c The pathways are from CALM1, CALM2 and CALM3 genes of calmodulin.
dThe pathways are from CHRNA1, CHRNA2, CHRNA3, CHRNA4, CHRNA5, CHRNA6, CHRNA7, CHRNA9, CHRNA10, CHRNB1, CHRNB2, CHRNB3,
CHRNB4, CHRND, CHRNE and CHRNG genes of nicotinic acetylcholine receptors.
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70
3 DISCUSSÃO
3.1 Biologia de sistemas e repositórios públicos de informação
A biologia molecular clássica dominou a pesquisa biológica por cerca de
um século, focando na identificação do funcionamento de componentes celulares
individuais. Esta abordagem reducionista permitiu o estudo de muitos protagonistas
da manutenção da homeostase celular e foi importante para o avanço do
conhecimento da maquinaria celular. Apesar de relevante, o esclarecimento sobre o
intrincado mecanismo da vida requer o entendimento sobre como estes atores atuam
em conjunto, de modo que as características moleculares são resultado de interações
complexas entre os constituintes celulares, como DNA, RNA, proteínas e pequenas
moléculas. Ganhando destaque principalmente com o surgimento das novas
tecnologias de sequenciamento de DNA, a biologia de sistemas é um campo recente
da biologia, o qual emprega integração de dados, métodos matemáticos e
computacionais para entender de forma holística o funcionamento de sistemas
biológicos complexos (BARABASI; OLTVAI, 2004; WALHOUT; VIDAL; DEKKER,
2013).
Os dados provenientes de estudos moleculares em conjunto com aqueles
provenientes de novas tecnologias permitiram a obtenção de volumes de dados
massivos, os quais demandam vastos recursos humanos e computacionais para a
análise completa da informação biológica ali contida. Com o objetivo de organizar a
informação proveniente destas análises, bancos de dados especializados foram
criados e passaram a ter importância central na biologia molecular, funcionando como
repositórios do conhecimento. Alguns bancos possuem a finalidade de abrigar
informações biológicas acerca do funcionamento de processos metabólicos e como
os agentes destes processos relacionam-se. Dentre estes bancos, podemos citar o
Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Gene Ontology (GO) e o
Reactome (ASHBURNER et al., 2000; CROFT et al., 2011; KANEHISA et al., 2016)
Apesar de descreverem inúmeros mecanismos celulares, há uma lacuna
de conhecimento sobre como os metais pesados interagem com o metabolismo
celular. Especificamente, estes repositórios não possuem informações organizadas
de forma sistemática sobre como o chumbo interage como metabolismo celular e
sobre como esta interação pode estar ligada aos sintomas decorrentes da intoxicação.
71
3.2 Metais pesados e sua relação com o metabolismo celular
O termo “metal pesado” é amplamente difundido, mas não há um consenso
quanto à sua definição. A definição mais utilizada, entretanto, remete à densidade: o
critério de classificação possui um intervalo de 3 a 7,5 g/cm3, acima do qual um
elemento pode ser considerado um metal pesado (DUFFUS, 2002). Outra definição
importante leva em consideração o efeito do metal sobre a saúde humana. Assim,
desde que o elemento químico seja conhecido por causar intoxicação, qualquer metal
pode ser classificado como metal pesado, independente da sua massa atômica ou
densidade (SINGH et al., 2011). Dentre os metais pesados mais importantes, temos
o chumbo, cádmio, arsênio e o mercúrio.
Os metais pesados foram utilizados durante a humanidade por milênios e
continuam sendo importantes para as atividades econômicas. O crescimento da
produção de metais pesados ocorreu de forma abrupta a partir da Revolução
Industrial, com concomitante aumento da contaminação ambiental. Apesar dos efeitos
adversos da exposição aos metais pesados ser conhecido há bastante tempo, a
exposição e os casos de intoxicação permanecem como problemas de saúde pública
em muitos países, especialmente os países em desenvolvimento (JARUP, 2003).
Nos últimos anos, em virtude da crescente conscientização acerca dos
danos causados pela intoxicação por metais pesados, a dispersão de compostos no
ambiente vem diminuindo. A emissão ocorre por uma ampla gama de processos, os
quais perpassam pelas atividades exploratórias e industriais. Os metais são dispersos
pelo do ar, água e solo, através de processos naturais e, de forma mais importante,
da atividade humana. A dispersão antropogênica aumentou significativamente a
exposição das populações aos metais pesados. Entretanto, a presença dos efeitos
tóxicos de um determinado elemento depende do contato entre o mesmo e as vias de
absorção (aérea, cutânea, intestinal). Isto é, para a exposição ocorrer, determinado
metal deve estar presente em um mesmo espaço e em um mesmo período de tempo
da presença humana (JARUP, 2003).
Alguns metais possuem importância bioquímica e fisiológica para a
homeostase dos organismos. São chamados de elementos traço ou micronutrientes,
os quais atuam na constituição e atividade de moléculas biológicas (KATHARIYA et
al., 2014). O zinco, por exemplo, é um micronutriente e importante cofator de enzimas
de diversos organismos, inclusive do homem. Contudo, existe um limiar de
72
concentração de zinco no organismo acima do qual efeitos tóxicos são observados
(FOSMIRE, 1990).
Há alguns metais os quais não são usados pelo metabolismo humano e a
sua presença no organismo pode resultar em intoxicação. Metais pesados causam
toxicidade celular principalmente através da substituição de metais essenciais dos
seus respectivos sítios nativos de ligação em metaloproteínas. Outro mecanismo de
toxicidade remete ao dano oxidativo causado aos componentes celulares, como
membranas, proteínas e ácidos nucleicos. A interação do metal pesado com o
metabolismo resulta nos sintomas da intoxicação, os quais podem ajudar a determinar
qual o agente tóxico em questão (JAN et al., 2015).
3.3 Grupos de risco acerca da intoxicação por chumbo
Um dos aspectos da gravidade da intoxicação pelo chumbo remete ao
grupo epidemiológico o qual ele atinge. O grupo de maior risco são as crianças,
especialmente aquelas na idade de 1-5 anos. Na década de 1990 e início dos anos
2000, pesquisas mostraram que o chumbo produz efeitos tóxicos até quando em
concentrações no sangue até então consideradas aceitáveis (<10 µg/dL). A principal
preocupação concerne ao detrimento do desenvolvimento completo do sistema
nervoso, sobretudo quanto às capacidades cognitivas de crianças, cujo dano pela
intoxicação mostra-se irreversível. Estudos com coortes de crianças em idade escolar
mostraram a relação entre níveis de chumbo no sangue menores que o limiar
estabelecido e a diminuição do QI (BELLINGER; NEEDLEMAN, 2003; CANFIELD et
al., 2003; JUSKO et al., 2007). Ainda, baixos níveis de chumbo no sangue foram
relacionados ao comprometimento de outras características do desenvolvimento
intelectual das crianças, como o detrimento da capacidade de leitura e escrita e
comportamentos associados ao déficit de atenção e hiperatividade (CHANDRAMOULI
et al., 2009; HONG et al., 2014; NIGG et al., 2010). Modelos animais também
mostraram a relação entre os baixos níveis de chumbo com o comprometimento de
funções cognitivas (LEASURE et al., 2008; RICE, D. C., 2006).
No Brasil, a maior parte dos levantamentos epidemiológicos descreve a
situação de exposição de algumas áreas restritas nas regiões sudeste e sul,
mostrando que em áreas onde não há relação direta com a atividade mineradora, os
níveis de chumbo no sangue da população são baixos (ALMEIDA LOPES et al., 2017;
73
KIRA, 2014; PAOLIELO et al., 1997). Entretanto, os casos de intoxicação por chumbo
no Brasil parecem estar ligados a regiões com atividade mineradora recente. Por
exemplo, em regiões próximas a uma mineradora localizada no vale do rio Ribeira, na
divisa entre os estados de São Paulo e Paraná, registrou-se altos níveis de chumbo
no sangue de crianças que residiam nesta região (PAOLIELLO, 2002; PAOLIELLO et
al., 2002). Além disso, um dos casos de intoxicação ambiental por chumbo mais
impactantes do país foi observado no município de Santo Amaro da Purificação, no
estado da Bahia. Os dejetos provenientes da atividade mineradora realizada pela
Companhia Brasileira de Chumbo (COBRAC) contaminaram os arredores do
município, causando casos graves de intoxicação na população residente, sendo
considerado um dos acidentes ambientais mais importantes da história do país
(SOUZA GUERRA, DE et al., 2015).
Apesar de estudos mostrarem que uma parcela da população brasileira não
possui níveis altos de chumbo no sangue, falta a implementação de ações de
vigilância, a exemplo de outros países, para comprovar se os resultados encontrados
caracterizam a situação de exposição de toda a população. Deve-se considerar ainda
que o nível de exposição aceitável para o chumbo é um parâmetro estabelecido por
agências estrangeiras, cujos manuais de recomendações são usados por muitos
outros países. No entanto, a determinação destas diretrizes baseia-se em
levantamentos epidemiológicos realizados em populações com características
socioeconômicas distintas daquelas encontradas no Brasil.
Ao contrário da exposição ocupacional, existem fontes de contaminação
que são mais sutis e podem ser igualmente importantes para a intoxicação pelo
chumbo, como a presença de chumbo em alimentos de origens animal e vegetal
(PAOLIELLO; CAPITANI, 2005). Outra via de exposição importante ocorre com a
contaminação da água. No estado do Rio Grande do Norte, há relatos do excesso de
metais pesados, em especial o chumbo, em coleções de água doce localizadas no
semiárido potiguar, pondo em risco de contaminação a população que utiliza este bem
para suas atividades (DANTAS et al., 2017).
3.4 Bases moleculares da intoxicação por chumbo
O chumbo é um metal pesado o qual não possui nenhuma função biológica
conhecida no organismo humano. Ainda, o organismo humano não possui sistemas
74
específicos de defesa contra a intoxicação pelo chumbo. Todavia, seres vivos
conseguiram adaptar-se a microambientes ricos em metais pesados, como o chumbo,
através de mecanismos de resistência. Algumas bactérias e leveduras possuem
sistemas bioquímicos especializados em inibir os efeitos tóxicos do chumbo, através
da precipitação do metal na forma de sais insolúveis no meio extracelular, adsorção
dos metais em polissacarídeos de parede celular, presença de transportadores de
membrana que realizam a remoção do metal do interior da célula e quelação dos íons
de chumbo que alcançam o espaço intracelular por proteínas. Tais características são
economicamente importantes uma vez que podem ser usadas no processo de
biorremediação de ambientes contaminados por chumbo (JAROSŁAWIECKA;
PIOTROWSKA-SEGET, 2014; NAIK; DUBEY, 2013).
A base molecular dos sintomas associados à intoxicação pelo chumbo
pode ser explicada pelo estímulo ao estresse oxidativo, ligação aos grupos tiol de
enzimas e, sobretudo, pela substituição dos íons cálcio e zinco em metaloproteínas.
A neurotoxicidade provocada pelo chumbo tem grande relação com as proteínas
ligadoras de cálcio, podendo atuar de três maneiras: através da ligação aos sítios de
cálcio, alterando a conformação da proteína e inibindo sua atividade; através da
ocupação de sítios de ligação ao cálcio e mimetização da atividade deste íon, ativando
a proteína e perturbando as vias a jusante; e através da ligação a outros sítios da
proteína não relacionados ao cálcio, podendo diminuir a afinidade a este íon e interferir
na atividade da proteína (GORKHALI et al., 2016).
A investigação da inibição do receptor glutamatérgico NMDA e a
perturbação da plasticidade sináptica envolvidos na consolidação da memória são
mecanismos propostos para explicar a neurotoxicidade provocada pelo chumbo no
desenvolvimento do sistema nervoso em crianças. O chumbo é capaz de alterar o
padrão de expressão das subunidades do receptor NMDA, a composição destas
subunidades e a sua localização sináptica, resultando na alteração das cascatas de
sinalização de cálcio no neurônio. Além da perturbação das vias glutamatérgicas,
outras vias e proteínas com papel fundamental no processo do desenvolvimento
cognitivo do sistema nervoso podem ser alvo do efeito tóxico do chumbo, como as
vias colinérgicas, os canais de cálcio voltagem-dependentes, a sinaptotagmina e
proteína quinase C (NEAL; GUILARTE, 2010; NEAL; GUILARTE, 2013).
75
Além disso, outro mecanismo relacionado à toxicidade celular causada pelo
chumbo remete a sua interação com as proteínas chamadas “dedos de zinco” (zinc
fingers), as quais são proteínas com um domínio particular composto pelos
aminoácidos histidina e cisteína conhecidos por serem sítios de ligação ao zinco. Elas
compreendem uma família de proteínas presente em muitos seres vivos e que, em
alguns casos, atuam como fatores de transcrição. Evidências mostram que o chumbo
é capaz de substituir o zinco no sítio de ligação de algumas destas proteínas,
interferindo na afinidade de ligação com o DNA e afetando a expressão gênica
(ORDEMANN; AUSTIN, 2016).
Além de interferir diretamente na estrutura e função de proteínas,
evidências suportam o efeito genotóxico do chumbo (JOHNSON, F. M., 1998). Um
dos mecanismos prováveis para a genotoxicidade remete à indução ao estresse
oxidativo, a partir da produção de espécies reativas de oxigênio e da depleção das
reservas antioxidantes. O estímulo ao estresse oxidativo pode estar relacionado ao
aumento dos níveis do ALA, resultado da inibição da via de biossíntese do heme,
tendo-se observado o aumento de eventos de quebra de dupla fita do DNA por este
metabólito (ONUKI et al., 1994). Ainda, leva-se em consideração a inibição da enzima
Ape-1 pelo chumbo, a qual possui a função de promover o reparo no DNA causado
por danos provenientes do estresse oxidativo. Estes fatores podem estar relacionados
com os mecanismos moleculares os quais apontam o chumbo como provável agente
carcinogênico em humanos (BORGHINI; GIANICOLO; ANDREASSI, 2015).
Em suma, à semelhança de outros metais pesados, a toxicidade causada
pela contaminação por chumbo se mostra proveniente da interação deste metal com
diversos componentes celulares, em especial as metaloproteínas. Deste modo, a
perturbação da homeostase iônica, sobretudo dos íons cálcio e zinco, parece ser o
fator preponderante para o surgimento dos amplos efeitos sistêmicos observados na
intoxicação por chumbo.
76
4 CONCLUSÃO
A busca na literatura revelou que o chumbo tem a capacidade de interagir
com diversas proteínas celulares, muitas delas com papéis centrais na manutenção
do metabolismo celular, as quais regulam a entrada de íons na célula, atuam como
mensageiros intermediários, protegem os demais componentes celulares dos danos
causados pelo estresse oxidativo, participam da transmissão do impulso nervoso e
participam da produção de metabólitos essenciais para a homeostase do organismo.
A vasta interferência do chumbo com os componentes celulares pode ser ilustrada
pelas diversas vias as quais as proteínas de interação fazem parte, fato este que pode
estar relacionado aos muitos sintomas associados à intoxicação. Tendo isto em vista,
reuniu-se as informações presentes na literatura e aquelas presentes nos repositórios
especializados para a construção das vias que representam a interação do chumbo
com os componentes celulares. Por fim, conclui-se que o chumbo atua em diversos
componentes celulares produzindo sintomas sistêmicos, de modo que a base
molecular da intoxicação está relacionada à substituição de íons essenciais, como o
cálcio e o zinco, em metaloproteínas.
77
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