lucila akune barreiros investigação genético-molecular de

Instituto de Ciências Biomédicas

Universidade de São Paulo

LUCILA AKUNE BARREIROS

Investigação genético-molecular de pacientes com

Imunodeficiência Combinada Grave

São Paulo

2018

LUCILA AKUNE BARREIROS

Investigação genético-molecular de pacientes com

Imunodeficiência Combinada Grave

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Imunologia do Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade de São

Paulo para obtenção do título de Mestre em

Ciências.

Versão original.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Condino Neto

São Paulo

2018

CATALOGAÇÃO NA PUBLICAÇÃO (CIP)

Serviço de Biblioteca e informação Biomédica

do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo

Ficha Catalográfica elaborada pela autora

Akune Barreiros, Lucila

Investigação genético-molecular de pacientes

com Imunodeficiência Combinada Grave / Lucila Akune

Barreiros; orientador Antonio Condino Neto. -- São

Paulo, 2018.

114 p.

Dissertação (Mestrado) -- Universidade de São

Paulo, Instituto de Ciências Biomédicas.

1. Imunologia. 2. Imunogenética. 3.

Imunodeficiências Primárias (IDPs). 4.

Imunodeficiência Combinada Grave (SCID). I. Condino

Neto, Antonio, orientador. II. Título.

UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS

Candidata: Lucila Akune Barreiros

Título da Dissertação: Investigação genético-molecular de pacientes com Imunodeficiência

Combinada Grave

Orientador: Antonio Condino Neto

A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública

realizada a ........./......../.........., considerou a candidata:

( ) Aprovada ( ) Reprovada

Examinador(a): Assinatura: ...............................................................................

Nome: ......................................................................................

Instituição: ................................................................................


Nome: ......................................................................................

Instituição: ................................................................................


Nome: ......................................................................................

Instituição: ................................................................................

Presidente: Assinatura: ...............................................................................

Nome: ......................................................................................

Instituição: ................................................................................

AGRADECIMENTOS

Agradeço a todos que contribuíram com este trabalho, na forma de apoio científico, financeiro,

acadêmico e emocional.

Ao Instituto de Ciências Biomédicas e ao Departamento de Imunologia pelos recursos

investidos. A todos os professores e professoras que despertaram cada vez mais meu interesse

pela imunologia e a ciência de maneira geral.

À Fundação Jeffrey Modell, que financiou parte deste estudo e minha estadia no Seattle

Children’s Research Institute, na Universidade de Washington. Agradeço à toda a equipe do

Dr. Hans D. Ochs pela ajuda, acolhimento e carinho em Seattle.

Ao meu orientador, Antonio Condino Neto, por ter me aceitado no Laboratório de Imunologia

Humana (LIH) e me proporcionado experiências acadêmicas e científicas únicas.

À toda equipe do LIH, por todo apoio não só intelectual, mas emocional. Os cafés, almoços,

lanchinhos e congressos com meus pares são grande parte dos responsáveis pelo meu

crescimento científico e pessoal. Agradeço especialmente Jusley e Edson, por todos os dias em

que dividiram as tarefas comigo, permitindo que eu pudesse me dedicar à dissertação. E

Christina e Silvana, sem as quais a vida no laboratório seria impraticável.

À Marília Kanegae por ter aberto minha linha de pesquisa, ter sido a minha mentora e me

ensinado (quase) tudo o que precisei para desenvolver não só o estudo, mas minha vida

profissional como um todo.

Aos meus amigos, meus biólogos, pelo apoio e as risadas constantes por 10 anos. O caminho

até aqui seria cinza sem vocês.

Ao Luiz, por todo o amor, carinho, paciência, paciência e paciência.

À minha família, em especial aos meus pais, por me proporcionarem diariamente os exemplos

compromisso e persistência, e por terem me dado total liberdade e apoio para fazer da minha

vida profissional e pessoal absolutamente o que eu quisesse.

Esse trabalho é dedicado a todos vocês.

EPÍGRAFE

(Fernando Gonsales [data desconhecida])

RESUMO

Barreiros, LA. Investigação genético-molecular de pacientes com Imunodeficiência

Combinada Grave.

A imunodeficiência combinada grave (SCID) é uma doença caracterizada por profunda

deficiência de células T, que afeta as imunidades celular e humoral e gera anormalidades graves

no desenvolvimento e funções do sistema imune. Recém-nascidos com SCID apresentam a

doença nos primeiros meses de vida e tem grande susceptibilidade a infecções. Sem tratamento,

essas condições são invariavelmente fatais, porém se reconhecidas precocemente, há a

possibilidade da realização do transplante de células-tronco hematopoiéticas, o tratamento

curativo, o que torna a SCID uma emergência pediátrica. A investigação do defeito genético é

uma prerrogativa para o condicionamento adequado do transplante, a terapia gênica, o

aconselhamento genético e o diagnóstico pré-natal. No Brasil, o conhecimento sobre SCID é

incipiente e não existem dados moleculares sobre pacientes com a doença. Sendo assim, este

estudo teve por objetivo investigar defeitos genético-moleculares de pacientes brasileiros com

SCID. Foram incluídos 13 pacientes, todos com início precoce dos sintomas e manifestações

clínicas esperadas em SCID (principalmente infecções respiratórias, de pele, diarreia crônica e

atraso de crescimento). Os patógenos isolados foram vírus, bactérias e fungos oportunistas

comumente encontrados em pacientes SCID. A partir da quantificação de TRECS e KRECs e

imunofenotipagem de linfócitos, foi montado o perfil imunológico de cada paciente, que guiou

o sequenciamento direto de Sanger dos genes mais frequentemente mutados em cada

imunofenótipo de SCID. Mutações em 3 pacientes foram identificadas por Sanger e,

posteriormente, 8 pacientes cujas mutações não foram encontradas no Sanger, foram

encaminhados para o sequenciamento completo de exoma, que resultou na identificação do

gene afetado em 62,5% dos casos. Ao todo, foram identificadas mutações patogênicas em 8 dos

13 pacientes. Os resultados revelaram 6 alterações em 5 genes de SCID clássica (IL7R, RAG2,

DCLRE1C, JAK3, IL2RG), 1 mutação no gene CD3G e 2 alterações em CECR1. Das 9

mutações encontradas, 5 não possuíam registro na literatura. O estudo genético de SCID em

nosso país é problemático, principalmente porque ainda hoje, a esmagadora maioria dos

pacientes não é diagnosticada. A implementação da quantificação de TRECs e KRECs como

triagem neonatal para linfopenias graves é uma ferramenta fundamental para que os pacientes

SCID possam ser identificados, investigados e tratados adequadamente.

Palavras-chave: imunodeficiência combinada grave (SCID), células T, mutação,

sequenciamento completo de exoma, triagem neonatal.

ABSTRACT

Barreiros, LA. Genetic and molecular investigation of patients with Severe Combined

Immunodeficiency.

Primary immunodeficiencies are a heterogeneous group of genetic diseases that lead to

increased susceptibility to infections and affect mostly children. Severe Combined

Immunodeficiency (SCID) is the most severe of all these diseases and is characterized by

profound T cell deficiency, which affects cellular and humoral immunities and leads to severe

abnormalities in the development and function of the immune system. Newborns with SCID

present the disease in the first months of life and are highly susceptible to infections. Without

treatment, these conditions are invariably fatal, but if recognized early, there is the possibility

of hematopoietic stem cell transplantation, the curative treatment, which makes SCID a

pediatric emergency. Identifying the genetic defect of SCID patient’s is a prerequisite for proper

transplant conditioning, gene therapy, genetic counseling and prenatal diagnosis. Knowledge

about SCID is still incipient in Brazil, and there are virtually no molecular data on patients with

the disease. Therefore, this study aimed to investigate genetic-molecular defects of Brazilian

patients with SCID. Thirteen patients were recruited, all with early onset of symptoms and

clinical manifestations expected of classic SCIDs (mainly respiratory and skin infections,

chronic diarrhea and failure to thrive). The pathogens isolated were opportunistic viruses,

bacteria and fungi often reported in SCID patients. The immunological profile from each patient

was defined by the quantification of TRECS and KRECs and lymphocyte immunophenotyping,

which was meant to guide direct sequencing by Sanger of the most frequently mutated genes

of each SCID immunophenotype. Mutations in 3 patients were identified by Sanger and,

subsequently, 8 patients whose mutations were not identified by Sanger were referred for whole

exome sequencing, which resulted in the identification of the affected gene in 62,5% of cases.

Pathogenic mutations were identified in 8 of the 13 patients. The results revealed 6 mutations

in 5 genes associated to classical SCID genes (IL7R, RAG2, DCLRE1C, JAK3, IL2RG), 1

mutation in the CD3G gene, and 2 mutations in CECR1. Five of the 9 mutations found had no

record in the literature. SCID genetic investigation in our country is troublesome, mainly

because even nowadays, the vast majority of patients are not diagnosed properly. Newborn

screening for SCID and other severe lymphopenias by the quantification of TRECs and KRECs

is key for the identification, investigation and proper treatment of SCID patients.

Keywords: Severe Combined Immunodeficiency (SCID), T cells, mutation, whole exome

sequencing, newborn screening.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 - Sinais de alerta para IDPs em crianças adaptados para o Brasil 16

Figura 2 - Distribuição fenotípica em porcentagens de IDPs do Registro LASID de

2014

17

Figura 3 - Probabilidade de sobrevivência de pacientes SCID ao transplante de

células-tronco hematopoiéticas

22

Figura 4 - Critérios de recomendação de inclusão de uma doença no programa de

triagem neonatal

24

Figura 5 - Formação dos TRECs 25

Figura 6 - Imunofenótipos mais comuns de SCID 28

Figura 7 - Causas de TRECs baixos 30

Figura 8 - Fluxograma de inclusão de pacientes no estudo 35

Figura 9 - Fluxograma do processo de triagem neonatal para linfopenias T e B 39

Figura 10 - Caracterização do defeito genético em IL7R do Paciente 1 49

Figura 11 - Alterações genéticas em RAG2 encontradas na Paciente 5 56

Figura 12 - Sequência de aminoácidos de Rag-2 referência em comparação ao mutante

T250Sfs*17

58

Figura 13 - Investigação genética da mutação de JAK3 encontra na Paciente 6 61

Figura 14 -

Estrutura esquemática dos exons e domínios de Jak-3 com as mutações

conhecidas

62

Figura 15 - Conservação entre espécies da região de JH1 mutada na Paciente 6 62

Figura 16 - Mutação c.241C>T em DCLRE1C encontrada no Paciente 8 66

Figura 17 - Alteração genética em CD3G encontrada no Paciente 9 e segregação familiar 68

Figura 18 - Conservação entre espécies da proteína CD3γ na região mutada em P9 69

Figura 19 - Mutação c.217A>C em IL2RG encontrada nos Pacientes 10 e 11 72

Figura 20 - Estrutura da proteína cadeia γc do receptor de IL-2 e mutações de X-SCID 72

Figura 21 - Conservação entre espécies do domínio CC da proteína γc 73

Figura 22 - Sinais e sintomas dos pacientes estudados 77

Figura 23 - Microrganismos isolados nos pacientes estudados 78

Figura 24 - Genes afetados nos pacientes estudados 80

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Defeitos genéticos das Imunodeficiências Combinadas Graves 29

Tabela 2 - Proveniência dos pacientes e da imunofenotipagem de linfócitos 36

Tabela 3 - Sequência dos primers e sondas utilizados para o qPCR 37

Tabela 4 - Análise dos valores de TREC e KREC para a triagem de

linfopenias T e B graves

38

Tabela 5 - Marcadores de membrana característicos das populações de

células T, B e NK

40

Tabela 6 - Primers utilizados nas amplificações por PCR 44

Tabela 7 - Condições de PCR para cada grupo de primers 46

Tabela 8 - Caracterização imunológica do Paciente 1 47

Tabela 9 - Caracterização imunológica da Paciente 2 50








Tabela 17 - Caracterização imunológica do Paciente 10 e 11 71



LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

ADA – adenosina deaminase

AK2 – adenilato quinase 2

APAE – associação de pais e amigos dos excepcionais

BRAGID – do inglês, Brazilian group for Immunodeficiencies (Grupo Brasileiro de

Imunodeficiências Primárias)

BCG – do francês, Bacillus Calmette-Guérin

BCR – do inglês B cell receptor (receptor de antígenos da célula B)

CD3G/CD3γ - CD3 subunidade gama

CMV – citomegalovírus

Ct – do inglês, cycle threshold

dL - decilitro

DNA –do inglês, deoxyribonucleic acid (ácido desoxirribonucleico)

DNAg – DNA genômico

ESID – do inglês, European Society of Primary Immunodeficiencies (Sociedade Europeia de

Imunodeficiências Primárias)

ExAC – do inglês, Exome Aggregation Consortium

FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

Frameshift – mudança de quadro de leitura

HIV – do inglês, human immunodeficiency virus (vírus da imunodeficiência humana)

HLA –do inglês, human leucocyte antigen (antígeno leucocitário humano)

ICB – Instituto de Ciências Biomédicas

IDCs – imunodeficiências combinadas

IDP – imunodeficiência primária

IF – imunofenotipagem

Igs - imunoglobulinas

IL2RG- cadeia gama do receptor de interleucina 2

IL7R – cadeia alfa do receptor de interleucina 7

IUIS – Internation Union of Immunological Societies (União Internacional das Sociedades de

Imunologia)

JAK3 – janus quinase 3

JH – do inglês, janus homology domain (domínio de homologia de janus)

Kb – quilo-base

KREC –do inglês Kappa-deleting Recobination Excision Circles (círculos de excisão da cadeia

kappa)

LAGID – do inglês, Latin-American Group for Immunodeficiencies (grupo latino-americano

de imunodeficiências primárias)

LASID – do inglês, Latin American Society of Primary Immunodeficiencies (Sociedade Latino-

Americana de Imunodeficiências Primárias)

LIG4 – ligase 4

LIH – Laboratório de Imunologia Humana

m - meses

MAF – do inglês, Minor Allele Frequency (menor frequência alélica)

NF-κB – do inglês, nuclear factor kappa B (fator nuclear kappa B)

µL – microlitro

mL – mililitro

mg - miligrama

mm3 – milímetro cúbico

mRNA – RNA mensageiro

ng – nanograma

nM - nanomolar

NHEJ1 - do inglês non-homologous end-joining factor 1

NI – não informado

NK – do inglês, Natural Killer (assassinas naturais)

nm – nanômetro

NR – não realizado

OMIM – do inglês, Online Mendelian Inheritance in Men

p10 – percentil 10

p90 – percentil 90

PCR –do inglês, polymerase chain reaction (reação em cadeia da polimerase)

qPCR – reação em cadeia da polimerase quantitativa

PIDTC - do inglês Primary Immunodeficiency Treatment Consortium (consórcio de tratamento

de imunodeficiências primárias)

PRKDC – do inglês protein kinase C delta

RAG – do inglês, recombination activation gene (gene de ativação de recombinação)

SCID – do inglês, Severe Combined Immunodeficiency (Imunodeficiência Combinada Grave)

SDG – Síndrome de DiGeorge

SG – sobrevivência global

SIFT – do inglês, Sorting Tolerant From Intolerant (filtrando o tolerável do intolerável)

SJ – do inglês, signal joint (sinal de junção)

SNP –do inglês, Single Nucleotide Polimorfism (polimorfismo de nucleotídeo único)

SO – Síndrome de Omenn

STATs – do inglês, signal transducer of activation (sinal transdutor de ativação)

TA – temperatura ambiente

TAE – tris-acetato EDTA

Taq – Thermus aquaticus

TCR –do inglês, T cell receptor (receptor de antígenos da célula T)

TCTH – transplante de células-tronco hematopoiéticas

TN – triagem neonatal

TREC – do inglês, T-cell Receptor Excision Circles (círculos de excisão do receptor de célula

T)

UNIFESP – Universidade Federal de São Paulo

UCSC – University of California Santa Cruz

USP – Universidade de São Paulo

UTI – unidade de tratamento intensivo

VSR – vírus sincicial respiratório

X-SCID – SCID ligada ao cromossomo X

γc –cadeia gama-comum

BASES NITROGENADA DOS NUCLEOTÍDEOS

Adenina A

Citosina C

Guanina G

Timina T

AMINOÁCIDOS

Código (1 letra) Código (3 letras) Aminoácido

A Ala Alanina

R Arg Arginina

N Asn Asparagina

D Asp Aspartato

C Cys Cisteína

Q Gln Glutamina

E Glu Ácido glutâmico

G Gly Glicina

H His Histidina

I Ile Isoleucina

L Leu Leucina

K Lys Lisina

M Met Metionina

F Phe Fenilalanina

P Pro Prolina

S Ser Serina

T Thr Treonina

W Trp Triptofano

Y Tyr Tirosina

V Val Valina

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 15

1.1 Imunodeficiências Primárias 15

1.2 Imunodeficiência Combinada Grave 17

1.2.1 Diagnóstico 19

1.2.2 Tratamento 20

1.2.3 Triagem Neonatal 23

1.2.4 Defeitos genético-moleculares 26

1.2.5 SCID no Brasil 31

2. OBJETIVOS 33

3. MATERIAL E MÉTODOS 34

3.1 Casuística e amostras 34

3.2 Extração de DNA 36

3.3 PCR quantitativo de TRECs, KRECs e β-actina 36

3.4 Avaliação do PCR quantitativo de TRECs, KRECs e β-actina 38

3.5 Determinação do perfil imunológico dos pacientes 39

3.6 Caracterização genético-molecular dos pacientes 40

3.6.1 Extração do DNA genômico 41

3.6.2 Sequenciamento completo do exoma 41

3.6.2.1 Estratégia de análise do exoma 42

3.6.2.2 Análise in silico das variantes 43

3.6.3 Sequenciamento direto pela metodologia de Sanger 43

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 47

4.1 Análise clínica e investigação genética do Paciente 1 47

4.2 Análise clínica e investigação genética da Paciente 2 49








4.10 Análise clínica e investigação genética dos Pacientes 10 e 11 70



4.13 Caracterização dos pacientes SCID 77

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS 82

6. CONCLUSÕES 85

REFERÊNCIAS 86

ANEXO A - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 95

ANEXO B – Resultados dos sequenciamentos de exoma 96

APÊNDICE – Artigos originais publicados em periódicos 100

15

1. INTRODUÇÃO

1.1 Imunodeficiências Primárias

Defeitos em um ou mais componentes do sistema imunológico podem resultar em

doenças sérias, frequentemente fatais, classicamente caracterizadas por susceptibilidade

aumentada a infecções, nomeadas imunodeficiências. Esse grupo é divido entre as

imunodeficiências congênitas (ou primárias) e adquiridas (ou secundárias). As

imunodeficiências primárias (IDPs) são erros inatos da imunidade, transmitidos

hereditariamente, e que resultam em anormalidades nas funções do sistema imune humano. Já

as imunodeficiências secundárias podem ser adquiridas como consequência de outras doenças,

a mais proeminente delas é a infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV – human

immunodeficiency vírus) e tumores, ou podem ser secundárias a fatores ambientais como

inanição ou imunossupressão iatrogênica, devido a tratamentos para doenças inflamatórias ou

prevenção de rejeição em transplantes (Abbas & Litchman, 2008).

As IDPs são doenças consideradas raras, que podem afetar quaisquer componentes do

sistema imune, formando um grupo heterogêneo de doenças genéticas hereditárias (Casanova,

Abel, 2007). Todas as formas de IDP são caracterizadas pela susceptibilidade a infecções de

repetição, frequentemente de gravidade maior do que o esperado em um indivíduo

imunocompetente; por vezes, há susceptibilidade anormal a patógenos específicos, que depende

da natureza do defeito imune (Casanova, Abel, 2004). Defeitos da resposta imune inata incluem

deficiências de fagócitos, receptores do tipo Toll e componentes do Sistema Complemento. Já

defeitos na resposta imune adaptativa incluem as deficiências de anticorpos - que afeta mais da

metade dos pacientes, e tem como tratamento padrão a reposição de anticorpos (De Vries,

Driessen, 2011) - e imunodeficiências combinadas (IDCs) – que representam defeitos celulares

de linfócitos, com apresentações clínicas geralmente mais graves, cujo tratamento curativo

padrão-ouro é o transplante de células-tronco hematopoiéticas (Pay et al. 2009) e,

alternativamente, a terapia gênica (Touzot et al. 2014). Além disso, há algumas formas de IDP

que apresentam principalmente uma desregulação imune devido à defeitos nos mecanismos de

tolerância, o que pode levar a autoimunidade e malignidades, e também há síndromes de

fenótipo complexo nas quais a imunodeficiência é apenas um dos componentes do espectro da

doença (Sullivan, 2001).

Atualmente há cerca de 320 defeitos genéticos descritos que compõe esse grupo tão

complexo e com manifestações clínicas variáveis (Picard et al., 2018). Na maioria dos casos

16

IDPs são doenças monogênicas com padrão mendeliano de hereditariedade, porém penetrâncias

variáveis, mosaicismos e interações entre fatores genéticos e ambientais podem contribuir para

a diversidade fenotípica dessas doenças (Notarangelo, 2010). O amplo espectro clínico das

IDPs, somado às apresentações variáveis que defeitos em um mesmo gene podem gerar, tornam

essas doenças um grande desafio diagnóstico tanto para médicos quanto para pesquisadores.

A Cruz Vermelha Americana e a Fundação Jeffrey Modell definiram 10 sinais de alerta

para IDPs em crianças, auxiliando clínicos brasileiros no diagnóstico desses pacientes raros e

subnotificados (Figura 1). Foi necessária a criação de sinas de alerta específicos para a

população brasileira porque os patógenos mais comuns em imunodeficientes variam de acordo

com o ambiente ao qual os indivíduos estão expostos. No Brasil, a vacina contra a tuberculose,

a BCG (Bacillus Calmette-Guérin), que contém uma linhagem atenuada de Mycobacterium

bovis, é uma vacina viva atenuada administrada no período neonatal e é a responsável por causar

complicações em pacientes com IDPs (Gonzalez et al., 1989; Norouzi et al., 2012). Sendo

assim, as infecções disseminadas por BCG são características de países que ainda utilizam essa

vacina como ferramenta no combate à tuberculose.

Figura 1 - Sinais de alerta para IDPs em crianças adaptados para o Brasil

10 sinais de alerta para Imunodeficiências Primárias em crianças

1. Duas ou mais pneumonias no último ano

2. Quatro ou mais otites no último ano

3. Estomatites de repetição ou monilíase por mais de dois meses

4. Abcessos de repetição ou eczemas

5. Um episódio de infecção sistêmica grave (meningite, osteoartrite, septicemia)

6. Infecções intestinais de repetição / diarreia crônica

7. Asma grave, doença do colágeno ou doença autoimune

8. Efeito adverso ao BCG e/ou infecção por Micobactéria

9. Fenótipo clínico sugestivo de síndrome associada a imunodeficiência

10. História familiar de imunodeficiência

Fonte: adaptado de BRAGID ( www.bragid.org.br).

A incidência real das IDPs é desconhecida devido a deficiências na capacidade de

diagnóstico temporalmente apropriado dos portadores. Com exceção da deficiência de IgA

(prevalência de 1: 2.000), todas as outras formas de IDPs são consideradas raras e estima-se

uma prevalência geral de 1 em cada 10.000 nascimentos (Condino-Neto et al., 2015). Todavia,

http://www.bragid.org.br/

17

taxas maiores são observadas em populações com alta consanguinidade ou geneticamente

isoladas (Notarangelo, 2010).

Estudos recentes têm mostrado que as IDPs são mais comuns do que se imaginava, o

que pode ser notado pelo crescente número de diagnósticos pelo mundo (Modell et al., 2011;

Bousfiha et al., 2013). Estima-se que até 2% da população mundial pode ser afetada por uma

IDP quando todas as formas das doenças são consideradas (Modell et al., 2016). A frequência

dessas doenças registrada no ano de 2014 pela Sociedade Latino-Americana de

Imunodeficiências Primárias (LASID, do inglês Latin-American Society for

Immunodeficiencies) pode ser observada na Figura 2.

Figura 2 - Distribuição fenotípica em porcentagens de IDPs do Registro LASID de 2014

Fonte: adaptado de Condino-Neto et al., 2014.

1.2 Imunodeficiência Combinada Grave

A primeira descrição de crianças com linfopenias graves e de desfecho fatal, o que hoje

acredita-se que fosse Imunodeficiência Combinada Grave, foi feita em 1950 na Suíça, quando

dois patologistas descreveram duas crianças aparentadas com uma progressiva diminuição de

52%

19%

9%

9%

6%

3%1% 1%

Deficiências predominantemente de

anticorpos

Síndromes com imunodeficiência

Imunodeficiências Combinadas

Defeitos congênitos de fagócitos

Doenças autoinflamatórias

Deficiências de complemento

Defeitos na imunidade inata

Doenças de desregulação imune

18

linfócitos, o que sugeriram ser uma consequência direta de infecções graves por Candida

albicans, em uma interpretação errônea de causa e efeito (Glanzmann, Riniker, 1950). Oito

anos mais tarde, dois grupos suíços, de Berna e Zurique, reportaram casos de quatro crianças

que morreram de infecções fúngicas e bacterianas graves cujas autópsias mostraram atrofia ou

ausência de órgãos linfáticos, com um timo também atrofiado e deslocado de seu lugar original

(Hitzig et al., 1958; Tobler, Cottier, 1958); dois desses pacientes eram primos daqueles

descritos por Glanzmann e Riniker, sugerindo que a doença poderia ter origem genética. Ambos

os grupos suíços descreveram desenvolvimento anormal de plasmócitos e linfócitos, com

linhagem mielóide normal, e propuseram que a combinação da agamaglobulinemia com a

linfopenias resultava em um defeito imune celular-humoral combinado, culminando em um

desfecho fatal. Devido aos achados clínicos e patológicos, a doença foi originalmente chamada

de “deficiência celular-humoral combinada”. Em 1970, um comitê da Organização Mundial da

Saúde cunhou a doença como Imunodeficiência Combinada Grave, ou SCID (do inglês, Severe

Combined Immunodeficiency).

Atualmente, as SCID são consideradas um grupo de doenças caracterizado por

anormalidades graves no desenvolvimento e funções do sistema imune adaptativo. Apesar da

heterogeneidade genética, todos os pacientes possuem defeitos na timopoiese, maturação e

função das células T, gerando uma deficiência numérica de linfócitos T, que pode ser

acompanhada por deficiências de células B e Natural Killer (NK), dependendo do gene

envolvido (Fischer et al. 1997). Entretanto, mesmo nos casos em que não existam defeitos

intrínsecos nos linfócitos B, a produção de imunoglobulinas depende em grande parte da ajuda

das células T, o que resulta no comprometimento funcional das células B, mesmo que seus

números estejam normais (Bousfiha et al., 2013).

A incidência estimada de SCID, de acordo com estudos americanos, é de

aproximadamente 1: 58.000 nascidos vivos (Verbsky et al., 2012; Kwan et al., 2014; Vogel et

al., 2014). As primeiras manifestações aparecem precocemente, com idade de apresentação

variável, mas que na maioria ocorre entre 3 e 6 meses de vida, quando os efeitos protetores das

imunoglobulinas maternas começam a diminuir (Notarangelo, 2010). Clinicamente, pacientes

com SCID são susceptíveis a infecções recorrentes ou oportunistas graves, atraso no

crescimento e morte precoce (Buelow, Verbsky, Routes, 2016). Sem o diagnóstico e tratamento

adequados, o portador de SCID vai a óbito em até 24 meses de vida (Noratangelo, 2010). Por

este motivo, as SCID são consideradas emergências pediátricas que necessitam de diagnóstico

precoce e tratamento agressivo.

19

1.2.1 Diagnóstico

O diagnóstico de um indivíduo com infecções recorrentes frequentes, um indicador da

presença de algum tipo de IDP, normalmente envolve a avaliação clínica, acompanhada de

perfil de leucócitos no sangue periférico e, dependendo da suspeita, também pode ser feita uma

análise funcional de tipos celulares específicos (Costabile, Quash, Ferrante, 2006).

Primeiramente, a investigação deve se basear em um indivíduo com suspeita clínica de IDP

baseando-se nos 10 Sinais de Alerta para Imunodeficiências Primárias em Crianças e a presença

de HIV deve ser descartada. A SCID clássica tem seu diagnóstico definitivo se a criança afetada

possuir menos de 2 anos de idade e número de células T CD3+ menor que 300 células por

milímetro cúbico de sangue, ou com número maior de 300, porém sem células T naïve

(CD3+CD45+) (Buelow, Verbsky, Routes, 2016). Já o diagnóstico provável se dá em pacientes

com menos de 2 anos de idade com: a) menos do que 20% de células T CD3+ com contagem

absoluta de linfócitos abaixo de 3000/mm3 e resposta linfoproliferativa a mitógenos de menor

do que 10% quando comparado a um controle saudável ou, b) presença de linfócitos maternos

na circulação. Além disso contagem diferencial de leucócitos em um hemograma acompanhado

pela citometria de fluxo para determinar as subpopulações de linfócitos T, B e NK são os

exames necessários para se fechar um diagnóstico (Illoh, 2004). É importante ressaltar que um

diagnóstico final sempre requer a avaliação clínica e laboratorial por um imunologista.

Os pacientes que caem no diagnóstico provável por apresentarem níveis intermediários

de linfopenia, com células T virgens entre 300 e 1500 por microlitro de sangue são considerados

SCID atípicos, ou Leaky SCIDs (Shearer et al., 2014). Esse fenômeno pode se dever à presença

de células maternas ou também a defeitos hipomórficos que levam à formação residual de

linfócitos, que não necessariamente são funcionais, mas que podem passar por expansão

oligoclonal. Esses casos podem ser mais elusivos ao diagnóstico e fenotipicamente, o curso da

doença nesses pacientes pode ser menos grave ou de apresentação mais tardia; sendo assim,

exames adicionais são necessários para garantir a proveniência das células T do recém-nascido

e testes genéticos podem ser necessários para definir a causa da linfopenia persistente (Buelow

et al., 2016).

O Consórcio de Tratamento de Imunodeficiências Primárias (PIDTC, do inglês Primary

Immunodeficiency Treatment Consortium) estabeleceu em 2014 que, adicionalmente à SCID

clássica, as formas variantes de SCID incluem a já citada Leaky SCID e também a Síndrome de

Omenn (SO) e a Disgenesia Reticular (Shearer et al., 2014). A Síndrome de Omenn é uma

doença inflamatória de manifestação precoce, caracterizada por sintomas típicos de SCID como

20

diarreia crônica, atraso de crescimento e infecções de repetição, juntamente com outros

sintomas diferenciais derivados da expansão oligoclonal de células T autorreativas:

eritrodermia generalizada com descamação e alopecia, hepatoesplenomegalia, adenomegalia e

hipereosinofilia (Villa et al., 1999). Assim como a Leaky SCID, a SO pode ser causada por

defeitos hipomórficos em genes autossômicos recessivos de SCID, em especial dos genes

ativadores de recombinação 1 e 2 (RAG1 e RAG2), responsáveis por parte do processo de

recombinação gênica dos receptores de células T (Notarangelo et al., 1999). Já a Disgenesia

Reticular, umas das formas mais raras e graves de SCID, é caracterizada por ausência de

neutrófilos, células T e NK e surdez bilateral sensorial (hemácias, plaquetas e células B também

podem estar diminuídas) (Fischer et al., 2015). É causada por defeitos no gene mitocondrial

adenilato quinase 2 (AK2), autossômico recessivo, que participa do metabolismo de adenosina

na mitocôndria e é expresso em diversos tecidos e em todas as células hematopoiéticas

(Pannicke et al., 2009). Na ausência de AK2, ocorre apoptose dos precursores mieloides e

linfoides, provavelmente devido à alta exigência energética de células-tronco hematopoiéticas

durante seu desenvolvimento (Ito, Suda, 2014).

Infantes com suspeita de SCID devem passar por um regime profilático com intuito de

protege-los de infecções bacterianas, fúngicas e virais (Dorsey et al., 2017). Imunoglobulina

subcutânea ou intravenosa deve ser administrada para prevenir a aquisição de infecções (Gaspar

et al., 2013). Além disso, pacientes com suspeita de SCID não devem receber nenhum tipo de

vacina viva ou atenuada (no Brasil, chama-se a atenção para as vacinas contra tuberculose,

poliomielite e rotavírus), já que o efeito protetor não existe (Gaspar et al., 2013).

Independentemente da forma apresentada, todos os pacientes SCID, após o diagnóstico, devem

ser encaminhados para o TCTH (Pai et al., 2014).

1.2.2 Tratamento

O primeiro transplante de medula óssea para SCID foi realizado em 1968 e mostrou que

o procedimento possibilitou a correção efetiva do sistema imune do paciente (Gatti et al., 1968).

Desde essa época até hoje, o desfecho da doença como um todo melhorou muito. Um número

crescente de estudos retrospectivos internacionais tem documentado um aumento na

sobrevivência de modo geral e na recuperação imune (Antoine et al., 2003; Gennery et al.,

2010; Fernandes et al., 2012). A melhora se deve a diferentes fatores, como a tipagem de HLA

(human leukocyte antigen), estabelecida graças à formação de grandes bancos de medula óssea

e de sangue de cordões umbilicais, que disponibilizaram doações compatíveis de voluntários

21

não aparentados, desenvolvimento de novas terapias contra a doença do enxerto-versus-

hospedeiro, diagnóstico precoce, melhores cuidados e suporte antes e após o transplante, e

regimes quimioterápicos com menor toxicidade, utilizados no preparo dos pacientes (Ochs,

Hitzig, 2012). Além disso, avanços tecnológicos agora permitem o diagnóstico genético para a

maioria dos pacientes SCID e cada vez mais a estratégia de condicionamento do TCTH tem se

baseado no defeito genético específico encontrado (Gaspar et al., 2013).

Os fatores que influenciam o sucesso de TCTH em pacientes SCID são o tipo de doador

(irmãos compatíveis são preferíveis), tipo de SCID (T-B- tem a pior taxa de sucesso),

comorbidades pré-existentes ao procedimento (pneumonias, septicemia, infecções virais),

idade no momento do transplante (pacientes com menos de 6 meses possuem as melhores taxas

de sucesso), realização do transplante em ambiente protegido e uso de profilaxia com o

antibiótico Cotrimoxazol (Gaspar, 2013).

Em 2007, resultados do programa de transplante de medula óssea para pacientes SCID

da Universidade de Duke, nos Estados Unidos, mostraram que pacientes diagnosticados no

período pré-natal ou logo ao nascimento, antes do aparecimento de infecções, possuem a maior

chance de sucesso e também menores gastos durante o tratamento quando comparados a

pacientes diagnosticados mais tardiamente, que possuem maior mortalidade e internações

hospitalares mais longas, devido a infecções graves, em particular devido a vírus (Puck, 2007).

Entre os pacientes tratados antes de 3,5 meses de vida a sobrevivência global (SG) foi de 96%

(n=46), já entre os pacientes transplantados após 3,5 meses de vida, caiu para 66% (n=113).

Em uma atualização desses dados feita pelo PIDTC (Pai et al., 2014), com 100 pacientes

tratados, a SG foi de 90%, porém a sobrevivência de pacientes com menos de 3,5 meses e sem

infecções ativas no momento do transplante foi de 95%, contra 81% nos pacientes também com

menos de 3,5 meses, mas com infecções ativas (Figura 3). Esses trabalhos mostram que, mesmo

com todas as melhorias citadas nos procedimentos de transplante para pacientes SCID, a

existência de infecções continua sendo o maior fator de risco para o sucesso do tratamento.

22

Figura 3 - Probabilidade de sobrevivência de pacientes SCID ao transplante de células tronco

hematopoiéticas

m = meses de vida

Fonte: adaptado de Pai et al., 2014.

Na ausência de doadores compatíveis, existem protocolos de terapia gênica em uso em

alguns países, em especial para pacientes X-SCID (SCID ligada ao X, devido a deficiência do

gene que codifica a cadeia gama-comum do receptor de IL-2, IL2RG) e ADA-SCID (SCID

autossômica recessiva, causada por deficiência de adenosina deaminase, ADA) (Bordignon,

2017). X-SCID é a mais frequente das SCIDs e foi a primeira a ser estudada clinicamente em

humanos, o estudo resultou em reconstituição imune de sucesso em 22 dos 23 pacientes

incluídos, tratados em Paris e Londres; porém, 5 deles desenvolveram leucemia linfoblástica

aguda, devido à inserção do vetor de integração perto do proto-oncogene LMO2 (Hacein-Bey-

Abina et al, 2003). Esse evento mostrou a complexidade e os potenciais perigos da terapia

gênica em humanos e levou a comunidade científica a um período de reflexão e novos vetores

vêm sendo desenvolvidos visando aumentar a segurança deste tipo de procedimento. A primeira

terapia gênica de sucesso para ADA-SCID foi publicada em 2002 e, ao contrário dos pacientes

incluídos no estudo de X-SCID, nenhum dos indivíduos do estudo de ADA desenvolveu

malignidades (Aiuti et al., 2002). E assim, após mais duas décadas dos primeiros tratamentos,

a terapia gênica ex-vivo para ADA-SCID chegou ao mercado no ano de 2016 (GSK Press

release: www.gsk.com/en-gb/media/pressreleases/strimvelistm-receives-european-marketing-

authorisation-to-treatvery-rare-disease-ada-scid).

23

Apesar disso, a opção de terapia gênica para paciente SCID ainda não é uma realidade

em nosso país. O TCHT é a terapia padrão-ouro disponível no Brasil e é o recomendado para

SCID, inclusive para os casos atípicos (Buelow, Verbsky, Routes, 2016).

As complicações infecciosas levam grande parte dos pacientes SCID à óbito antes do

diagnóstico, durante a espera ou logo após o transplante. Por causa disso é imprescindível que

os pacientes sejam identificados precocemente, passem por investigação de patógenos

minuciosa e caso haja uma infecção, ela deve ser tratada rápida e agressivamente (Gaspar,

2013). Entretanto, como a maioria dos casos não possui histórico familiar declarado da doença,

e os sintomas iniciais são infecções comuns, o diagnóstico precoce torna-se um desafio.

Visando a identificação precoce, alguns países têm adotado a triagem neonatal para linfopenias

T, que é capaz de identificar pacientes com perfil de SCID, que são então encaminhados para

imunologistas para avaliação e diagnóstico. Esse rastreamento universal pode ser muito

vantajoso, pois permite encontrar pacientes ao nascimento, antes do estabelecimento de

infecções, potencialmente salvando vidas e diminuindo drasticamente os custos do tratamento

futuro (Modell, Knaus, Modell, 2014).

1.2.3 Triagem Neonatal para SCID

Programas de rastreamento populacional previnem a morbidade e mortalidade de

doenças genéticas tratáveis através de detecção precoce, antes das manifestações clínicas dessas

doenças, permitindo um tempo oportuno para a intervenção adequada. Atualmente, no Brasil,

a triagem neonatal (TN) permite o rastreamento de até 50 doenças congênitas diferentes ao

nascimento (APAE de São Paulo, 2016).

Em 1968, Wilson e Jungner publicaram princípios para a inclusão de doenças em

programas de TN (Figura 4). Apesar de terem sido estabelecidos há décadas, esses princípios

foram evoluindo com os programas de rastreamento e continuam sendo de grande importância

como um auxílio na decisão de incluir ou não uma doença na TN. De acordo com esses

princípios, a SCID se encaixaria perfeitamente em programas de rastreamento, por ser uma

emergência pediátrica, de história natural que pode ser prevenida e interrompida com o

diagnóstico precoce, possui tratamento disponível e tem um custo muito menor quando o

paciente ainda não manifestou os sintomas da doença.

24

Figura 4 - Critérios de recomendação de inclusão de uma doença no programa de triagem

neonatal

Critérios para inclusão em programa de triagem neonatal

1. A condição deve ser um importante problema de saúde

2. Deve haver um tratamento estabelecido para a doença

3. Deve haver instituições para diagnósticos e tratamento acessíveis

4. Deve haver um estágio sintomático reconhecível latente ou precoce

5. Deve haver um teste ou exame adequado

6. O teste deve servir à população geral

7. A história natural da condição, incluindo o desenvolvimento de doença latente a ativa, deve ser

bem estabelecida.

8. Deve haver um regulamento claro de quem oferecerá tratamento aos pacientes

9. O custo do paciente (incluindo diagnóstico e tratamento) deve ser economicamente balanceado

em relação aos possíveis gastos do tratamento médico como um todo.

10. Rastreamento deve ser um processo contínuo e sistemático.

Fonte: adaptado de Wilson & Jungner, 1968.

O manejo do paciente com SCID é tão crucial para o desfecho da doença quanto o

próprio transplante. Gaspar e cols. (2013) relataram que antes do advento da TN para SCID,

com exceção dos indivíduos com histórico familiar da doença, todos os pacientes eram

diagnosticados por causa de infecções recorrentes ou oportunistas ou problemas relacionados à

infecção, e mesmo com o aumento da conscientização da comunidade médica sobre a doença,

boa parte dos pacientes morrem antes do transplante devido a complicações infecciosas. Por

isso é tão importante o uso de um método que permita o rastreamento de portadores dessa

doença na população como um todo.

A observação de que todos os pacientes com SCID, independente da causa, não

possuíam ao nascimento linfócitos T virgens emigrados do timo na circulação, levou ao

desenvolvimento de uma técnica eficiente e simples, capaz rastrear neonatos com esta doença.

A maturação normal das células T no timo envolve o processamento do DNA codificante do

receptor de célula T (TCR). Esse processo gera pequenos círculos de DNA do locus α do TCR,

os chamados círculos excisados de receptor de células T (do inglês T cell receptor excision

circles - TRECs) (Figura 5). Esse pequeno DNA não se multiplica nas divisões celulares,

podendo ser utilizado para determinação do número de células emigrantes do timo. Como o

indivíduo com SCID possui baixo número de linfócitos T – independente de qual gene

apresente mutação – ele também apresenta menor quantidade de TRECs.

25

Figura 5 - formação dos TRECs

O gene TCRD está intercalado entre segmentos do gene TCRA ao longo do cromossomo 14 (14q11). A

excisão do locus D forma um círculo de DNA epissomal, os chamados TRECs.

Fonte: adaptado de Somech & Etzioni, 2014.

TRECs podem ser identificados por PCR utilizando manchas de sangue seco sobre

papel de filtro (Guthrie, Susie, 1963; Puck, 2012), normalmente coletadas de sangue venoso

obtido do calcanhar de recém-nascidos. A coleta de sangue em papel filtro é utilizada

corriqueiramente no Brasil pois existem doenças que são triadas em toda a população pelo

nosso Sistema Único de Saúde, o que traz a vantagem de que não é necessário o estabelecimento

de um novo processo de coleta para a realização do teste de triagem específico para SCID.

Desde o desenvolvimento e recomendação da técnica de triagem neonatal para SCID

em 2005 (Chan & Puck), já houve muito avanço na implementação do processo em diversos

países. Ao longo desse tempo, foram realizados programas pilotos e, em alguns países, já foram

estabelecidos programas de triagem para SCID por recomendação do próprio governo. Já foram

publicados trabalhos validando e recomendando a TN para SCID em todo o território dos

Estados Unidos (Kwan et al. 2014), e diversos outros países, como Japão (Morinishi et al.,

2009), China (Chien et al., 2012), Israel (Somech et al., 2013), Inglaterra (Adams et al., 2014),

França (Audrain et al., 2014), Espanha (Olbrich et al., 2014), Irã (Fazlollahi et al., 2017) e

26

Brasil (Kanegae et al., 2016; Kanegae et al, 2017). Todas essas iniciativas concluíram que esse

teste se mostrou sensível para a detecção de recém-nascidos portadores de SCID (Buelow,

Verbsky, Routes, 2016), e de vantagem econômica ao se comparar os gastos para o manejo de

um paciente SCID antes e após o aparecimento de infecções (Chan, Davis, Pai, 2011; Kubiak

et al., 2014; Modell, Knaus, Modell, 2014; Gardulf, 2016).

Além disso, também é possível investigar deficiências de células B, utilizando-se a

mesma metodologia da quantificação por PCR, porém dos KRECs (do inglês, kappa-deleting

recombination excision circles), subprodutos da formação do receptor de célula B, que se

originam de maneira similar aos TRECs e que também podem ser quantificados por PCR e

usados na identificação de pacientes portadores de agamaglobulinemia ligada ao X (van Zelm

et al. 2011; Borte et al. 2012). Em conjunto, a quantificação de TRECs e KRECs pode dar pistas

sobre quais tipos celulares estão afetados em cada paciente, ajudando a direcionar a

investigação genético-molecular de SCID.

Quando falamos em TN para SCID, é importante ter em mente que no Brasil, a BCG é

especialmente perigosa para os indivíduos afetados, que em geral são assintomáticos no

momento da administração, que é feita nas primeiras horas de vida, ainda na maternidade. Por

causa disso, em todos os países que realizam a TN para SCID, é recomendado que a vacina seja

aplicada somente com o resultado da TN em mãos. No Brasil, foi constatado que entre 70

pacientes diagnosticados entre 1996 e 2011, 65% apresentam complicações devido à vacinação

com BCG, sendo que destes, 74% apresentaram BCG disseminada e essa forma da doença foi

responsável, sozinha ou acompanhada por outros fatores, pelas 35 mortes registradas no estudo

(Mazzucchelli et al., 2014). Portanto, uma vez que a TN para SCID é possível ao nascimento,

deve-se tomar muito cuidado em impedir a aplicação de BCG e outras vacinas atenuadas aos

indivíduos com resultados positivos.

1.2.4 Defeitos genético-moleculares de pacientes com SCID

Apesar de resultarem de uma grande variedade de defeitos genético-moleculares,

mutações em diversos genes acabam culminando em uma apresentação clínica muito similar,

devido à ausência ou baixo número de linfócitos T no recém-nascido (Gaspar, Gilmour, Jones,

2001). Por ser uma condição muito grave, a identificação do defeito genético específico não é

necessária para o início do tratamento do paciente, no entanto, é um pré-requisito para a terapia

gênica, o aconselhamento genético e o diagnóstico pré-natal e é importante para um

condicionamento eficiente para o transplante de medula óssea (Gilmour et al. 2001).

27

O estudo molecular de pacientes com fenótipo SCID começou com a descoberta do gene

que codifica a enzima ADA (Giblett et al. 1972; Wiginton et al. 1986). A deficiência de ADA

é uma condição hereditária rara do metabolismo das purinas, caracterizada pelo acúmulo de

substratos metabólicos que levam a anomalias de desenvolvimento e função do sistema imune

e uma variedade de defeitos sistêmicos (Gaspar et al. 2009). Anormalidades características em

subpopulações de linfócitos T, B e células NK podem fornecer pistas sobre o defeito molecular

envolvido. Por exemplo, o imunofenótipo T-B-NK- sugere defeito em ADA, que é comum ao

metabolismo de todos os tipos de linfócitos; a falta de linfócitos T e B com a presença de células

NK sugere mutações nos genes envolvidos na recombinação dos receptores de linfócitos T e B,

TCR e BCR, respectivamente (como RAG1, RAG2 e ARTEMIS), sem os quais a formação de

um receptor funcional fica prejudicada e as células sofrem morte celular programada.

Apesar de alguns autores relatarem a possibilidade do imunofenótipo indicar o possível

defeito genético (Puck, 2007), a análise genética de coortes de pacientes com SCID levou à

descoberta de que diferentes defeitos genéticos também podem resultar em fenótipos clínicos

idênticos, se os genes envolvidos forem parte da mesma via de sinalização. Por exemplo,

mutações nos genes de IL2RG e JAK3 resultam em um perfil idêntico de SCID T-Bhigh/lowNK-,

uma ligada ao cromossomo X e a outra, autossômica recessiva, respectivamente. Por outro lado,

mutações em um gene podem resultar em fenótipos clínicos variados, como ilustrado pelas

consequências de mutações RAG1/RAG2, que podem se apresentar como SCID clássica se

forem mutações nulas (T-B-) ou como Síndrome de Omenn (Tlow B low) no caso de mutações

hipomórficas (Ochs, Hitzig, 2012). Os defeitos mais comuns de SCID clássica e seus

imunofenótipos podem ser vistos na Figura 6.

Numa recente revisão (Kwan, Puck, 2015), a distribuição dos diferentes defeitos

genéticos na população sugere que a SCID ligada ao X e outras formas T-B+ representem

aproximadamente 40-50% de todas as formas de SCID. Formas T-B-, resultantes de defeitos

da recombinação V(D)J seriam responsáveis por 25-37% e deficiência de ADA, 10-18%.

28

Figura 6 - Imunofenótipos mais comuns de SCID

ADA, adenosina deaminase; IL, interleucina; NK, natural killer; RAG, gene ativador de recombinase;

ARTEMIS, proteína do reparo de DNA.

Fonte: adaptado de Gaspar, Gilmour, Jones 2000.

Até o momento, 17 genes diferentes já foram identificados como mutados em pacientes

com SCID (Picard et al., 2018). Tais defeitos podem ser caracterizados de acordo com a via

afetada pelo defeito molecular ou pelo fenótipo específico gerado pela mutação (Tabela 1).

A classificação de pacientes SCID com base nos imunofenótipos é muito útil quando o

paciente tem um quadro clínico clássico e o defeito genético caracteriza uma mutação nula, ou

seja, uma mutação que oblitera a função daquele gene na qual está inserida. Entretanto, com a

adoção da quantificação de TRECs e da disseminação de informações sobre a doença e do

sequenciamento de nova geração, novos fenótipos clínicos e imunológicos têm sido

classificados como Imunodeficiência Combinada Grave e associados a novos genes, ou a

mutações hipomórficas nos genes já conhecidos (Cirillo et al., 2015).

29

Tabela 1 - Defeitos genéticos das Imunodeficiências Combinadas Graves

AR = autossômico recessivo; LX – ligado ao X

Obs.: Painel expandido de IDCs: DOCK2, CD40, CD40LG, ICOS, CD3G, CD8A, ZAP70, TAP1, TAP2,

TAPBP, B2M, CIITA, RFX5, RFXANK, RFXAP, DOCK8, RHOH, STK4, TRAC, LCK, MALT1, CARD11,

BCL10, BCL11B, IL21, IL21R, OX40, IKBKB, MAP3K14, RELB, MSN, TFRC.

Fonte: adaptado de Picard et al., 2018.

Imuno

fenótipo Gene Herança Produto Gênico Função

Características

associadas

T-B+

IL2RG

LX

Cadeia γ-comum

dos receptores de

IL-2, 4, 7, 9 e 15

Ativação de JAK3 quinase e

consequente sinalização

intracelular

ausência de células

NK

JAK3 AR Tirosina janus

quinase 3

Diferenciação de células

hematopoiéticas


NK

IL7RA

AR

Cadeia α do

receptor de IL-7

Crescimento e sobrevivência

de progenitores linfoides e

LT no timo; ativação JAK3

-

CD45

(PTPRC) AR

Proteína tirosina

fosfatase

Regula quinases necessárias à

transdução de sinal do TCR e

BCR

-

CD3D,

CD3E, CD3Z

AR

Componentes δ, ε,

ζ do complexo

TCR

Transdução de sinal do

complexo do TCR


T γ/δ

CORO1A AR Coronina 1A

Regulador de actina;

importante papel na saída de

linfócitos do timo e

linfonodos

timo detectável,

infecções por EBV

LAT AR

Ligação para

ativação de

células T

Proteína adaptadora

necessária à sinalização do

TCR

adenopatia,

esplenomegalia,

infecções

recorrentes,

autoimunidade

T-B-

RAG1 e

RAG2 AR

DNA

recombinases

Medeiam a recombinação não

homóloga V(D)J -

DCLRE1C

AR ARTEMIS

Reparo do DNA dupla fita

por recombinação não

homóloga

sensibilidade à

radiação (SR)

PRKDC

(PKcs) AR

Subunidade

catalítica da

quinase

dependente de

DNA

Idem SR, microcefalia

XLF

(NHEJ1) AR Cernunnos Idem SR, microcefalia

LIGIV AR Ligase IV Idem SR, microcefalia

AK2 AR Adenilato quinase

2 Metabolismo de purina

granulocitopenia e

surdez

ADA AR Adenosina

deaminase 1

Metabolismo de purinas;

remoção de metabólitos

tóxicos em células linfoides

ausência de NK,

defeitos ósseos,

defeito cognitivos

e proteinose

pulmonar

30

O aumento do número de estudos utilizando a quantificação de TREC para triagem

neonatal tem mostrado que os ensaios possuem 100% de sensibilidade para SCID, mas que nem

todo TREC abaixo do valor de corte é necessariamente um indivíduo com SCID, também são

identificados pacientes com linfopenias devido a outras condições (Comeau et al., 2010;

Verbsky et al., 2012; Fronkova et al., 2014; Kwan et al., 2014; Patel et al., 2014; de Felipe et

al., 2016). Em 2017, foi publicada uma revisão sistemática da literatura compilando as causas

de TRECs baixos, nela os autores analisaram 100 publicações, com um total de resultados de

TRECs para 6.093.942 de indivíduos, destes 1553 (0,02%) apresentaram quantificações de

TRECs consistentemente abaixo do valor de corte (Figura 7). Destas, 40% foram classificadas

como IDPs, sendo a maioria destes casos pacientes com Síndrome de DiGeorge (SDG); dentre

os 60% restantes, 3% se deveram a síndromes conhecidas (principalmente Trissomia do 21,

Trissomia do 18, Síndrome de Jacobsen) e os outros 57% foram condições sem causa genética

aparente; destas 31% não foram especificadas, 36% normalizaram espontaneamente, 8% eram

neonatos prematuros e 25% tiveram causas diversas como timectomia, defeitos cardíacos,

gastrointestinais, entre outros (Maraucher et al., 2017).

Figura 7 - causas de TRECs baixos

Fonte: adaptado de Maraucher et al., 2017.

Devido aos novos genes sendo associados ao que é clinicamente definido como um

SCID, optou-se por englobar no estudo, não só os genes classicamente descritos como

causadores de SCID típica, mas também os genes envolvidos com OS, Leaky SCIDs e todos os

genes associados às Imunodeficiências Combinadas.

31

1.2.5 SCID no Brasil

O primeiro registro de Imunodeficiências Primárias da América Latina foi criado em

1994 pelo então Grupo Latino Americano de Imunodeficiências Primárias (LAGID, Latin-

American Group for Immunodeficiencies), que depois se tornaria o LASID. Desde então, com

as publicações do grupo (Zelazko et al., 1998; Leiva et al., 2007; Condino-Neto et al., 2011;

Leiva et al., 2011) foi sendo constatado que existe uma subnotificação importante dos casos de

IDPs na América Latina.

No Brasil, o cenário segue a mesma tendência. Em 2001 foi criado o Grupo Brasileiro

de Imunodeficiências primárias (BRAGID, do inglês Brazilian Group for Immunodeficiency),

com o objetivo de melhorar o diagnóstico de IDPs através de atividades educacionais e

estimular a pesquisa de IDPs no país. Apesar da melhora no atendimento e tratamento feito por

imunologistas, para a comunidade médica no geral, as IDPs continuam sendo um tópico

obscuro. Uma pesquisa feita pelo BRAGID com 3047 pediatras mostrou que 97% deles já havia

atendido pelo menos um paciente com infecções recorrentes, porém apenas 63% realizou algum

tipo de investigação para IDPs e apenas 50% conheciam imunologistas para referenciar o

paciente (Rosario-Filho et al., 2013). Estudos publicados posteriormente com médicos de

diferentes especialidades da cidade de São Paulo (Dantas et al., 2013) e de todo o Brasil (Dantas

et al., 2015) apresentaram resultados muito similares.

De acordo com um estudo multicêntrico (Mazzucchelli et al. 2014), em um período de

15 anos (1996 a 2010), apenas 70 casos de SCID foram diagnosticados em 73 centros

contatados pelo país. Considerando a provável incidência de 1 caso de SCID para 58.000

nascidos vivos e a média de 3 milhões nascidos vivos/ano de 1996 a 2010, esperávamos 775

casos neste período. O diagnóstico de apenas 70 pacientes (9,3% do esperado) revela um

número alarmante de casos de SCID não diagnosticados no Brasil. Além disso, a investigação

dos defeitos genético-moleculares não é facilmente alcançada em nosso país. Mazzucchelli e

colegas reportaram que apenas 10% dos pacientes suspeitos foram definidos como portadores

de SCID com descrição do defeito genético. O grande número de casos não diagnosticados se

deve em parte a falhas no treinamento médico (Dantas et al. 2015), à indisponibilidade de testes

diagnósticos acessíveis à população e à dificuldade do diagnóstico genético em casos de alguns

defeitos específicos, já que na maioria dos casos não há uma relação fenótipo-genótipo clara

(Nijman et al. 2014). O maior problema nas falhas de conhecimento sobre SCID é que, devido

à gravidade da doença, os pacientes vão à óbito em decorrência das infecções sem o diagnóstico,

ou seja, um diagnóstico tardio significa um aumento na morbimortalidade (Pai et al., 2014).

32

Outro fator a ser considerado é a heterogeneidade genética da população brasileira. A

maioria dos estudos de novas mutações em IDPs foca em populações com altos índices de

consanguinidade, normalmente do Oriente Médio, em que consanguinidade média de pacientes

com IDP é de 65,7%, contra 5,6% na Europa e 2,3% na região da Ásia-Pacífico. Nas décadas

de 50 e 60 foram realizados diversos estudos de consanguinidade na população Brasileira

(Freire-Maia, 1957, 1958; Salzano, Freire-Maia, 1967, Freire-Maia 1989, 1990), que

constataram a média de frequência de consanguinidade para o país como um todo foi de 4,8%,

variando desde estados com as menores frequências no Sudeste (menos de 1% em São Paulo)

até estados do Nordeste com frequências variando de 6 a 12%. Ou seja, apesar de existirem

regiões com maior consanguinidade, somos uma população bastante miscigenada, formada

principalmente por uma mistura entre caucasianos, africanos e ameríndios, sendo que as últimas

duas são população sem informações sobre IDPs. Sendo assim, é possível que a distribuição

das mutações de SCID em pacientes brasileiros seja diferente da distribuição reportada pela

literatura.

Diante do panorama apresentado, este estudo visou investigar os defeitos genéticos de

indivíduos com SCID, verificando quais são as mutações e genes afetados, além das

características clínicas dos pacientes brasileiros em comparação com as informações de outros

países. Com isso, espera-se expandir o conhecimento sobre essa doença, a fim de aumentar sua

visibilidade, possibilitando tratamento adequado aos pacientes e aconselhamento genético às

famílias.

33

2. OBJETIVOS

Este estudo teve como objetivo a caracterização do perfil genético-molecular de

pacientes brasileiros com Imunodeficiência Combinada Grave, visando verificar quais são os

genes afetados, mutações e manifestações clínicas específicas do nosso grupo de pacientes.

São objetivos específicos:

a) realização da quantificação de TRECs e KRECs, para corroboração de dados da

imunofenotipagem de linfócitos e direcionamento da análise genética;

b) investigação genética de pacientes afetados por sequenciamento direto e de nova

geração;

c) caracterização clínica geral dos pacientes.

34

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Casuística e amostras

Foram incluídos no estudo 13 pacientes, 7 meninos e 6 meninas, todos com

características clínicas de SCID (infecções graves de início precoce, frequentemente

recorrentes e por patógenos oportunistas) ou por histórico familiar. Os pacientes foram

encaminhados por médicos da região Sul e do estado de São Paulo; 9 pacientes eram

provenientes de São Paulo (São Paulo, Campinas e Taubaté), 1 do Paraná (Curitiba) e 3 do Rio

Grande do Sul (Porto Alegre e Caxias do Sul).

Para a inclusão no estudo, além da suspeita clínica de SCID (clássica ou não), foram

necessários dois exames, a triagem neonatal e a imunofenotipagem de pelo menos células T

CD3+CD4+ (este último necessita de um hemograma para fazer a contagem de células absolutas,

que foi sempre realizado por serviços terceiros). Pacientes que tinham quadro clínico, triagem

neonatal e número de células T condizentes com SCID, foram convidados a participar do

estudo, doando entre 1 e 3 ml de sangue venoso periférico para extração de DNA a ser utilizado

em sequenciamentos. Foi realizada investigação genético-molecular dos pacientes após a

concordância dos pais ou responsáveis com o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

(Anexo A), aceito pelo Comitê de Ética do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade

de São Paulo, ICB-USP (CAAE: 54324416.5.000.5467). Os passos de inclusão dos pacientes

no estudo podem ser vistos na Figura 8.

As amostras foram obtidas em dois momentos. Os pacientes 1 à 8 já possuíam material

em um banco de DNA de pacientes suspeitos de SCID do Laboratório de Imunologia Humana

(LIH), que foram coletadas ao longo de um projeto de pós-doutorado da Dra. Marilia Pyles

Patto Kanegae, intitulado “Doenças gênicas e anomalias congênitas com repercussões graves

sobre o sistema imunológico: um modelo de triagem neonatal por meio de desenvolvimento e

validação de testes diagnósticos e estudo epidemiológico” (processo FAPESP: 2011/50436-4),

que visava o estabelecimento da triagem neonatal para SCID no Brasil. Já os pacientes 9 à13

foram incluídos durante o andamento do presente estudo.

35

Figura 8 - Fluxograma de inclusão de pacientes no estudo

*realizada antes ou depois da triagem neonatal

Fonte: autora.

Os pacientes suspeitos percorreram diferentes caminhos. Foram encaminhados para

triagem devido a histórico familiar de IDP (P6), ou foram encaminhados já com sintomas e

suspeita de IDP, sendo que alguns alinda não tinham realizado a imunofenotipagem de

linfócitos, que foi feita no LIH ou disciplina de Alergia, Imunologia Clínica e Reumatologia da

Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), sob supervisão da Dra. Beatriz Tavares Costa-

Carvalho; e outros já possuíam todos os exames e foram encaminhados para a triagem neonatal

e para a investigação genética diretamente (Tabela 2).

36

Tabela 2 - proveniência dos pacientes e da imunofenotipagem de linfócitos

Origem do

encaminhamento Local de realização dos exames

P1 São Paulo, SP UNIFESP

P2 Porto Alegre, RS laboratório Zanol de Porto Alegre

P3 Porto Alegre, RS Hospital das Clínicas de Porto Alegre

P4 Curitiba, PR Hospital das Clínicas da Univ. Fed. Do Paraná

P5 Porto Alegre, RS Hospital das Clínicas de Porto Alegre

P6 São Paulo, SP Univ. Federal do ABC e LIH

P7 Taubaté, SP Hospital Universitário de Taubaté

P8 São Paulo, SP UNIFESP

P9 Campinas, SP LIH

P10 São Paulo, SP Laboratório Delboni Auriemo

P11 São Paulo, SP Laboratório Delboni Auriemo

P12 São Paulo, SP LIH

P13 São Paulo, SP LIH

Fonte: autora.

3.2 Extração de DNA (Baker, Grossman et al. 2009)

A partir do papel filtro com as amostras de sangue já secas, foram picotados discos de

32 mm de diâmetro. Os discos foram adicionados a uma placa de polipropileno de 96 poços

onde foi realizado o procedimento de eluição a seguir: a cada poço contendo o picote de amostra

foram adicionados 150 μL de Generation DNA Purification Solution 1 (Qiagen), a placa foi

centrifugada por 5 minutos a 1400 g e incubada por mais 10 minutos à temperatura ambiente

(TA); após a incubação o sobrenadante foi descartado e repetiu-se o processo. Depois, foram

adicionados 120 μL de Generation DNA Elution Solution 2 (Qiagen), a placa foi centrifugada

a 1400 g por 5 min. e incubada à TA por 10 min. O sobrenadante foi descartado e adicionou-se

24 μL da mesma solução, que foi eluída por 25 min a 99 °C. As amostras de DNA foram

utilizadas imediatamente ou armazenadas a 4 °C para uso no dia seguinte.

3.3 PCR quantitativo de TRECs, KRECs e β-actina

A PCR quantitativa (qPCR) multiplex em tempo real para SJ TRECs (SJ = signal joint)

e SJ KRECs foi realizada a partir de sequências de primers, sonda e de um plasmídeo controle

contendo as sequências conforme descrito em dois artigos (Douek et al., 2000; Sottini et al.,

37

2010). Todos os reagentes utilizados foram adquiridos da Thermo Fisher Scientific (Foster City,

CA). As sequências de primers e sondas encontram-se na Tabela 3.

Tabela 3 - Sequência dos primers e sondas utilizados para o qPCR

Alvo Sequência 5’- 3’

TRECs Primer F:

Primer R:

CACATCCCTTTCAACCATGCT

TGCAGGTGCCTATGCATCA

Sonda: ACACCTCTGGTTTTTGTAAAGGTGCCCACT

KRECs Primer F: TCCCTTAGTGGCATTATTTGTATCACT

Primer R: AGGAGCCAGCTCTTACCCTAGAGT

Sonda: TCTGCACGGGCAGCAGGTTGG

Beta-actina Primer F: ATTTCCCTCTCAGGCATGGA

Primer R: CGTCACACTTCATGATGGAGTTG

Sonda: GTGGCATCCACGAAACTA

Fonte: autora.

As reações foram padronizadas para 20 μL de volume final. Os alvos TREC e KREC

foram feitos em multiplex e a β-actina foi realizada separadamente. A reação para o qPCR de

TREC e KREC consistiu de 1X Gene Expression Master Mix, primers de TRECs e KRECs nas

concentrações finais de 300 nM e 600 nM, respectivamente e sondas a 200 nM, solução de

DNA de concentração média 50 ng/µL, totalizando aproximadamente 400 ng na reação. A

qPCR para o controle de expressão com β-actina também foi padronizada para um volume final

de 20 μL, contendo 1X Gene Expression Master Mix, primers na concentração final de 200 nM

e sonda a 150 nM, com solução de DNA final de 50 ng. As condições de ambas qPCRs foram

95 °C por 10 minutos seguidos de 40 ciclos de: 95 ºC por 30 segundos, 62 ºC por 1 minuto

(StepOne Plus Thermo Fisher Scientific). O número de cópias de TRECs, KRECs e β-actina

foi calculado em relação às curvas-padrão geradas a partir das diluições dos plasmídeos de peso

molecular já conhecido, contendo sequências para os alvos descritos (plasmídeos sintetizados

e doados pelos pesquisadores Alessandra Sottini e Mei W. Baker, para TREC-KREC e β-actina,

respectivamente).Os valores de β-actina foram normalizados para serem comparáveis aos de

TREC e KREC, pois que a concentração inicial de DNA não foi igual nas duas reações.

Além das amostras, toda corrida teve um controle positivo, que foi sangue de um

adulto saudável, que possui com baixos níveis de TRECs e KRECs, ou pacientes com SCID T-

B-; e um controle sem alvo, um pedaço do papel filtro sem amostra.

38

3.4 Avaliação do PCR quantitativo de TRECs, KRECs e β-actina

A análise dos dados foi feita no próprio programa de corrida de qPCR, no software

StepOne Plus (Life Technologies). A avaliação se baseia nos valores de Ct (cycle threshold)

obtidos após determinação de um valor de threshold (reta de valor estabelecido no início da

fase exponencial de amplificação do DNA, que vai gerar os Cts, valores nos quais a

amplificação cruza o threshold) específico para cada alvo, estabelecido durante projeto já

encerrado (Kanegae et al., 2016). Com os valores de Ct é possível calcular para cada amostra,

por regressão linear, a concentração de TRECs, KRECs e β-actina por microlitro de sangue, a

partir da equação da reta gerada pela curva-padrão das sequências de TREC, KREC e β-actina

contida em plasmídeos.

O valor de corte para determinar se uma amostra é anormal ou inconclusiva foi

estabelecido durante projeto já encerrado (Kanegae et al., 2017) de maneira que as amostras

verdadeiramente alteradas não deixassem de ser detectadas (100% de sensibilidade) e houvesse

reduzido número de repetições. Os valores de corte a o resultado indicado no exame podem ser

vistos na Tabela 4.

Tabela 4 - Análise dos valores de TREC e KREC para a triagem de linfopenias T e B graves

Níveis de TRECs Níveis de KRECs Níveis de β-actina Resultado

>25/μL >20/μL - Normal

<25/μL <20/μL > 8000/μL Anormal

<25/μL <20/μL < 8000/μL Inconclusivo

Fonte: autora.

Na primeira análise, somente TRECs e KRECs foram avaliados. Nos casos em que um

dos dois alvos apresentou resultado inferior aos valores de corte acima, um segundo picote da

mesma amostra foi analisado para ambos os alvos em conjunto com a quantificação de β-actina.

Em casos anormais, caso o paciente ainda não houvesse realizado testes confirmatórios

(hemograma e análise do perfil fenotípico por citometria de fluxo), ele foi encaminhado para o

serviço da UNIFESP para avaliação por um imunologista. O fluxograma da triagem neonatal,

anterior à investigação genética, pode ser visualizado na Figura 9.

39

Figura 9 - Fluxograma do processo de triagem neonatal para linfopenias T e B

Fonte: autora.

3.5 Determinação do perfil imunológico dos pacientes

Pacientes com resultados anormais na TN para linfopenias T e B precisam também da

caracterização fenotípica de linfócitos CD3+ para o diagnóstico de SCID. Espera-se que sejam

caracterizadas as subpopulações de linfócitos T (totais CD3+, auxiliares CD3+CD4+ e

citotóxicos CD3+CD8+), linfócitos B (CD19+) e células NK (CD16+CD56+) o que ajuda a

construir o imunofenótipo do paciente, dando pistas sobre o possível defeito genético por trás

da doença; adicionalmente o ideal é que sejam discriminadas as subpopulações naïve e de

memória dentre os linfócitos T e B (Tabela 5). Ao todo, 6 pacientes fizeram o perfil completo

de linfócitos e os 7 restantes fizeram um reduzido, pois esse exame foi realizado em laboratórios

40

e hospitais variados, dependendo da cidade onde o paciente residia e também do acesso ao

exame, que é considerado um procedimento especializado, caro e, portanto, de difícil acesso.

Além disso, alguns pacientes foram a óbito entre o envio de amostras para triagem neonatal e

a constatação do resultado alterado.

Tabela 5 - Marcadores de membrana característicos das populações de células T, B e células NK

Subpopulação LT LT auxiliares LT citotóxicos LB Células NK

Total CD3+ CD3+CD4+ CD3+CD8+ CD19+ CD16+CD56+

Naïve CD45RA+CD27+ CD45RA+CD27+ CD19+CD27-

Memória CD45RA-CD27+/- CD45RA-CD27+/- CD19+CD27+

Efetora CD45RA+CD27- CD45RA+CD27-

Fonte: autora.

Apesar da classificação clássica de SCID como número de células T autólogas abaixo

de 300 por microlitro de sangue, o imunofenótipo construído levou em consideração também

número de células T auxiliares naïve (CD3+CD4+ CD45+CCR7+) abaixo do p10, com o intuito

de incluir os SCIDs atípicos em nossa classificação. Em relação à quantidade de células B e

NK, foram inicialmente considerados negativos aqueles abaixo do percentil 10 (p10) para a

idade, porém no decorrer do estudo, percebeu-se que o valor mais adequado para considerar

células B e NK ausentes seria menor do que o p3, entretanto não existem valores de referência

nessa faixa para indivíduos brasileiros. Os valores de referência de cada população de linfócitos

de acordo com a idade foram definidos com base em trabalho baseado na população brasileira

(Moraes-Pinto et al., 2014).

Além disso, 9 dos 13 pacientes incluídos também realizaram dosagem de

imunoglobulinas (Igs), que é um exame acrescenta informações sobre a presença de células B.

Os valores de referência de Igs para a população brasileira foram baseados na tese de M. D.

Fujimura (1991).

3.6 Caracterização genético-molecular dos pacientes

Nos pacientes, 1-2 e 8-13 foi realizado primeiro o sequenciamento direto por

metodologia de Sanger dos genes suspeitos mais frequentes, dependendo do imunofenótipo

(vide Figura 6). Nos casos em que o sequenciamento direto não apresentou nenhuma alteração,

41

realizou-se o sequenciamento completo de exoma.

Os pacientes 3-7 foram encaminhados diretamente para o sequenciamento completo de

exoma. Uma vez encontrada alteração no exoma, a mesma foi confirmada por sequenciamento

de Sanger.

3.6.1 Extração de DNA genômico

As amostras de DNA genômico (DNAg) foram extraídas de sangue periférico, com o

kit de extração Wizard® Genomic DNA purification (Promega Corporation, Madison, WI,

EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

Após a eluição do DNA, as amostras foram armazenadas a – 20 ºC até a sua utilização.

A quantidade e qualidade do DNAg foram aferidas por espectrofotometria, no comprimento de

onda de 260 nm, utilizando-se o espectrofotômetro NanoDrop 2000 (Thermo Fisher Scientific).

Após a leitura quantitativa estimada, a integridade do DNAg foi analisada por eletroforese em

gel com 1,5% de agarose (SIGMA-ALDRICH, St Louis, MO, EUA) em tampão Tris-Acetato-

EDTA (TAE) corados com SYBR® Green II RNA stain (Invitrogen, Eugene, Oregon, EUA)

sendo comparada com um padrão de massa molecular de 1Kb (Invitrogen, Eugene, Oregon,

EUA).

3.6.2 Sequenciamento completo do exoma

O sequenciamento completo do exoma humano foi realizado a partir de DNA genômico

extraído de sangue periférico e uma biblioteca foi preparada com o Ion Ampliseq Library Kit

(Life Technologies). O sequenciamento foi realizado Ion Proton sequencer (Life Technologies)

no laboratório da Profa. Dra. Ester Sabino no Instituto de Medicina Tropical da Universidade

de São Paulo. Todas as chamadas com uma cobertura de leitura duas vezes ou menos e uma

qualidade Phred-scaled de 20 ou menos, foram excluídas. O alinhamento e processamento de

análise das variantes para seleção dos genes suspeitos foi realizado com a ferramenta Ion

Reporter TM (Thermo Fisher), assim como a análise inicial das variantes reportadas, nas quais

todas as variações genéticas encontradas foram cruzadas com informações de bancos de dados

como o OMIM (http://www.omim.org), Ensembl (http://ensembl.org) e o Genome Browser da

UCSC (https://genome.ucsc.edu), que em conjunto fornecem informações referentes às

variantes encontradas, como sua posição na sequência gênica e proteica, sua frequência em

http://ensembl.org/

42

relação ao alelo de referência na população geral e comparam a bancos de dados para saber se

a variante já foi descrita como um benigna ou patogênica.

3.6.2.1 Estratégia de análise do exoma

Após sequenciamento do exoma, no IonReporter, foi criado um filtro referente a um

painel com os 17 genes envolvidos na Imunodeficiência Combinada Grave de acordo com a

última classificação feita pelo comitê de imunodeficiências primárias da IUIS (do inglês,

Internation Union of Immunological Societies), a união internacional de sociedades

imunológicas (Picard et al., 2018). No caso de ausência de variantes potencialmente

patogênicas, a investigação foi ampliada de modo a incluir genes envolvidos nas IDCs (já

citados na Tabela 1).

Posteriormente, foi aplicado um segundo filtro que mostra apenas as alterações com

frequência alélica na população abaixo de 1%, o MAF (do inglês, Minor Allele Frequency), que

é a frequência do segundo alelo mais comum na população global de acordo com projetos de

sequenciamentos realizados nas populações americana, europeia, africana e asiática. Alelos

com uma frequência acima de 1% são classicamente considerados variações comuns do genoma

humano, os chamados polimorfismos, ou SNPs (Brookes, 1999).

Finalmente, todas as variantes filtradas foram comparadas ao banco de dados do UCSC

Genome Browser (http://genome.ucsc.edu), que acumula dados de diferentes projetos de

diferentes consórcios de sequenciamento de genomas e que registra SNPs comuns, ou seja,

considerados polimorfismos. Todas as variantes encontradas no banco de dados USCS Common

SNPs foram excluídas da análise.

As variantes que passaram por todos os filtros de análise foram organizadas em ordem

de prioridade. Alterações em regiões não codificantes, distantes de regiões de splicing,

presentes em heterozigose (de maneira que não formasse um heterozigoto composto), e que não

tivessem sido descritas como mutações patogênicas, foram consideradas polimorfismos, pois

todas as mutações relacionadas a SCID e IDCs possuem herança autossômica recessiva, com a

exceção do gene IL2RG, que é ligado ao X.

Finalmente, ao encontrar uma variante suspeita, parte das sequências foram alinhadas

manualmente às sequências de referência fornecidas pelo IonReporterTM e também foram

cruzadas a referências de outros bancos de dados, como o ExAC (Exome Aggregation

Consortium - http://exac.broadinstitute.org) e Mutation @A Glance (http://harrier.nagahama-i-

bio.ac.jp/mutation/), que reúnem sequências fornecidas por sequenciamentos humanos de

43

vários projetos ao redor do mundo, possibilitando o descarte de potenciais artefatos gerados

pelo software de análise, que usa outros bancos de dados como fonte de sequências referência.

3.6.2.2 Análise in silico das variantes

Para previsão de patogenicidade das alterações encontradas, foi realizada a análise in

silico das alterações. Foram utilizadas as ferramentas SIFT e PolyPhen2 para análise de

variantes de nucleotídeo únicas missense (trocas de nucleotídeo único não sinônimas) e

nonsense (que criam um códon de parada prematuro); e a ferramenta MutationTaster para

análise das alterações missense, nonsense, sinônimas e indels (inserções/deleções).

Tanto o SIFT quanto o Polyphen2 contêm algoritmos que predizem se uma alteração de

aminoácido interfere na função da proteína, baseado no nível de conservação de resíduos em

alinhamentos entre espécies relacionadas (Kumar, Henikoff & Ng, 2009; Adzhubei et al.,

2010). Ambos geram valores entre 0 e 1, porém para o SIFT, quanto mais próximo 1, maior a

probabilidade de uma mutação ser benigna, enquanto para o PolyPhen2, quanto mais próximo

de 1, maior a predição de patogenicidade.

O MutationTaster é uma ferramenta mais complexa e abrangente, pois foi desenhada

para prever as consequências funcionais não só de substituições únicas de um aminoácido, mas

também de alterações intrônicas, sinônimas, pequenas inserções ou deleções (até 12 pares de

base), frameshifts (mudança de quadro de leitura) e variantes que se encontram nas bordas

intrônicas; também gera valores entre 0 e 1 e quanto mais próximo a 1, maior a probabilidade

de patogenicidade. Além dos algoritmos que preveem patogenicidade baseado em conservação

de regiões, essa ferramenta agrupa informações de diversos projetos genoma e exoma para

excluir variantes já descritas como polimorfismos e realçar aquelas já conhecidamente

patogênicas (Schwarz et al., 2014).

3.6.3 Sequenciamento direto pela metodologia de Sanger

Inicialmente, todos os pacientes tiveram os genes suspeitos sequenciados por Sanger.

Dependendo do imunofenótipo, foram sequenciados os genes RAG1, RAG2 e DCLRE1C (SCID

T-B-NK+), IL2RG e/ou JAK3 dependendo do sexo do paciente (SCID T-B+NK-) e IL7R (SCID

T-B+NK+).

Pacientes em que não foi possível encontrar o defeito por Sanger, foram para o exoma

e, posteriormente, variantes indicadas como patogênicas no exoma foram confirmadas por

44

sequenciamento direto, para verificação de potenciais artefatos da tecnologia de

sequenciamento de nova geração. Em ambos os casos, quando disponível, também foi

sequenciado material genético dos pais para mapear a segregação familiar e verificar se a

mutação foi herdada ou de novo.

O DNA genômico foi extraído como previamente descrito. Foi realizada reação de PCR

com a enzima Taq polimerase recombinante (Thermo Fisher Scientific), de acordo com as

instruções do fabricante. Os produtos de PCR (amplicons) foram purificados com o Illustra

GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification Kit (GE Healthcare), de acordo com as instruções

do fabricante. Finalmente, os amplicons purificados foram enviados, junto com amplicons de

controles saudáveis para comparação, para sequenciamento em serviço terceirizado (Serviço de

sequenciamento do Centro de Estudos do Genoma Humano, no Instituto de Biociências da

Universidade de São Paulo).

Os primers utilizados para o sequenciamento de genes específicos foram desenhados

visando primers entre 20 e 25 nucleotídeos de comprimento, com uma temperatura de

hibridação entre 58 e 62ºC e porcentagem de CG entre 45 e 55%. As sequências foram

comparadas ao genoma humano para garantir a ausência de hibridizações inespecíficas com

outras regiões do genoma humano.

A lista de primers utilizados para confirmação das alterações encontradas nos pacientes

se encontra na Tabela 6 e as condições de PCR para cada grupo de primers, na Tabela 7.

Tabela 6 - Primers utilizados nas amplificações por PCR

Gene Localização Primer Sequência 5' - 3' Tamanho

IL7R 5p13 IL7R e1F CTGTCTTCCTCCCTCCCTCCCTTCC 240 IL7R e1R CCAGTGCCTGACTCAGGTCTGTTAGGG

IL7R e2F CATTACTATTTCATGTCTGCCACAGAGTCTGC 276 IL7R e2R GAGCATATGAAAAGAGAGACAGAGGATGTCTAAGC

IL7R e3F GGAACTCCTACCTGAATCAAGACATATCCCC 247 IL7R e3R CCTACAGAATGTCCAGACACAGTGTTTTCAGG

IL7R e4F GTTGGCCATTTACTGACACAAAAAGGGTC 334 IL7R e4R CCCAGGGGAAATGCACTACTAGGCC

IL7R e5F GAAATGATTTGGGAGATTTAGGCAACACC 294 IL7R e5R CAACAATCTTCCTCTCACTTGCTCCCAC

IL7R e6F CACTGCATGGCTACTGAATGCTCACC 226 IL7R e6R CGTGAAATGCCTTAATCCCCTTTGTG

IL7R e7F GTTCTTCTGATTCCAAGCTCAGAATAAGTGGG 213 IL7R e7R CCTGGAATATCATTCTTGGCCACTGG

IL7R e8F GACCTACTCCTGAACTGAACATTTGATGGTG 988 IL7R e8R GGAGTGAGACAAGGTGCGCAGAGC

RAG1 11p13 RAG1 145 F GGTCTTAATATGACTTGTTTTCATTGTTCTCAGG 285 RAG1 403 R GCTGAGTTGGGACTGGCTTCTGACC

(continua)

45

(continuação)

RAG1 325 F GCTCAAAAGGAAAAGAAGGATTCCTTTGAGG 299 RAG1 595 R CCTTCTTTCGTAAAAGGCCTAGGGTTTTACC

RAG1 1070 F GCCAGATCTGTGAACACATTCTGGCTGACC 475 RAG1 1099 R GCAAAAGACATGCTTACAGTTGGTCTCCACAGG

RAG1 1694 F GCTGTTTGCTTGGCCATCCGTGTCAACACC 595 RAG1 1626 R CCTGTACATCTTGTGGTACTGACTGCAGCTGAGG

RAG1 2137 F CCTAACTCTGAACTGTGTTGCAAGCCATTGTGC 511 RAG1 2178 R CGTCTCGTGGTCAGACTCATCTGCC

RAG1 2744 F GGATGAATGGCAACTTTGCCAGGAAGC 566 RAG1 2769 R GCATCCACAGTCTCTTTGGTCATGAGC

RAG1 3185 F CCTCCAAATACCTCCAGAAGTTTATGAATGC 416 RAG1 3233 R GGTTCATGGTAAACCCAGAGGTTTTTAATGC

RAG2 88 F GGAGGACTTAAAAAAATGCTATTCACATGTGAAGG 217 RAG2 305 R GGATCTTTTGGGCCAGCCTTTTTGTCC

RAG2 11p13 RAG2 336 F GGAGTTTTCCATCTGGATGTAAAGCATAACC 424 RAG2 760 R GCACACCCAAATTCAAAATCCACCAGG

RAG2 726 F GGAATAGTGTAGCTGACTGCCTGC 653 RAG2 1379 R GGTGTCAAATTCATCATCACCATCAAAACTATTTGC

RAG2 1235 F GGATTCTATTTCTATATGTTGAAATGTGC 767 RAG2 2002 R CCTCAGTGAAGAATAAATTAGTAAATTGAGTATTTGG

DCLRE1C Art_e1F CGCGGCTTCCCGGAAGTGGC 286

(Artemis) Art_e1R CCCTCGCTGGCTTCCCACAGGCT

Art_e2/3F CAGCCGGTCCTGTTCTGAGGAGGATTC 4299

Art_e2/3R GTGTAAGCCACCATGTCCGGCCAGAG Art_e4F GAGTGGTAGGGATGGGGAGATGAAGGAGG

434 Art_e4R GGTATAGCTGAGGGGTGGAGCATCTGACTG Art_e5F GTGGCCATCGGTTTTCGCTTATCTTGGTT

392 Art_e5R CAGACATGTGCCACTGCACCCAGCC Art_e6F GCTGAGTGCCTGGTGTGGTTCAAATTACTGT

382 Art_e6R GCTGGGCGTGGTGGCACGTACCT Art_e7F GGTGGAGGAGGTGGTAGTGAGCAGACATTG

302 Art_e7R CCAACAGTCCCAGGTACTCACACCTACGG Art_e8F GGAGGAACAGGGTTATCATCTGGGTGTGC

452 Art_e8R CCAGCTACTCAGGAGGCTGAGCCAGGAG Art_e9F GTCAGCCTTGTGCCTGTTGACATGCTG

508 Art_e9R GCCTGGGCGACAGAGTGAGACTCCAT Art_e10/11F CGTTTGTCTAGCCTTTTGCTTGTCTTCACATTG

1626 Art_e10/11R CATAGAAACAGAGATGCTTCTGAGAGTCAGGGGAC Art_e12F CGTGCAGCCAGCATTGAGAACCACAG

389 Art_e12R GGAGAAGCTGACAACACTACCTATACCTTCTGCCAC Art_e13F CTGCTTTTCAATCCTCCAAAGTAGTTGTGTGATTTC

383 Art_e13R GTACTTCCTGAGACCATGTGTCAAGTCTGACCTG Art_e14F GGATGGCAGTTAAATTGTTCAGCATATCCCAAG

1194 Art_e14R GATTACAAGTGTGAGCCACCACACCCAACC IL2RG-e1F GTGGGTGGGGAGGGGTAGTGG

292 IL2RG-e1R AGGCACCAGATCTCTGTACG IL2RG-e2F CATTTCTCTTTCCCTCCCTGC

297 IL2RG-e2R GAGAAAACAGTGGGGTACCTGG IL2RG-e3F TGCAGTACCCAGATTGGCC

291 IL2RG-e3R TCCAATGTCCCACAGTATCCC

IL2RG IL2RG-e4F GGTATTAGGGGCACTACCTTCAGG 254 IL2RG-e4R GGCCTTAGCTGCTACATTCACG

IL2RG-e5F AGTAGCAGAGATGACACTGGTGG 312

(continua)

46

(continuação) IL2RG-e5R TAGAAAGGCTGGGGTGTTGG IL2RG-e6F CAGTGCCTGGCATGTAGTAGG

225 IL2RG-e6R ACCCTCCTCTGCTATTGTCAGC IL2RG-e7F TTTGGTGATGGAAGGAAGCC

271 IL2RG-e7R ACACTCTGTCTGTCTTGCTGGC IL2RG-e8F TCCTGCCCCTAATTGACCC

276 IL2RG-e8R CTTAGGGCTACAGGACCCTGG JAK3 e2-5 F GCCTCCAGCACTCCTTTCCATGCCCTC

1567 JAK3 e2-5 R GCTTGCAGGAGAACTCCATGGTGGGAGC JAK3 e6-8 F CTGGGCTAAAGCCTGGGTTTGTGTGTGTCC

1440 JAK3 e6-8 R GGCTCCTGGAAGGTGAGGACACTGAGGC JAK3 e9-10 F GAGGGTGTCACCTGGCAAGGATCCCAG

1065 JAK3 e9-10 R CTTGCCACCCACACAGGAGCTGTCACAG

JAK3 19p13.1 JAK3 e11-13 F CCCTGAAGTCTTCATCTCAGGGTCGGCTTC 1522 JAK3 e11-13 R GGTAATGAACACGGCTCCCATCCAGGGT

JAK3 e14-17 F GAGACCCTGAGAGCCAGGGTGTTGGCAG 1680

JAK3 e14-17 R CCCTCCAACCTCACCAGACACACAGGGC

JAK3 e18-20 F GGCCCTGCCATAATGCACAGAGAGGGTC 1467 JAK3 e18-20 R CCACTCCTCAGCCTTCACCGCGACCT

JAK3 e21-23 F CAGTGGAGGATGGCTCGGGGGTAGGGTTATAG 1532 JAK3 e21-23 R CGGCCTCACACTCTAGCCTTTCTTCTCAGTACAGAGAC

JAK3 e24 F CAAATACGCTGAATGGGAGTTGTGTCCTTTGGAC 377 JAK3 e24 R CAAATGCAATGTCATGGGGGTGTTCCTGAA

CD3G 11q23.3 CD3G e4 F CGCAACCTGAAGGTTTGTCTC 201

CD3G e4 R GCTCTTAGATGAGAGATGGGAC

Fonte: autora.

Tabela 7 – condições dos PCR para cada grupo de primers

Ciclos Temperatura

Tempos

JAK3 / DCLRE1C

(ex.2/3, 10/11 e 14)

Tempo

(restante)

Desnaturação 1 x 95 ºC 2’ 30’’ 2’ 30’’

Desnaturação

35 x

95 ºC 40’’ 30’’

Hibridação 68 – 0,3ºC / ciclo 30’’ 30’’

Extensão 72 ºC 2’ 30’’ 30’’

Extensão 1 x 72 ºC 4’ 4’

Hold 1 x 4 ºC infinito infinito

Fonte: autora.

47

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Análise clínica e investigação genética do Paciente 1

Paciente 1, V.H.L.S., sexo masculino, nascido a termo, primeiro filho de pais não

consanguíneos, sem histórico de óbitos precoces na família. Apresentou os primeiros sintomas

com 2 meses de idade, reação adversa à vacina BCG com adenomegalia axilar bilateral. Aos 3

meses teve uma infecção do trato urinário (sem isolamento de patógeno) e posteriormente,

apresentou duas pneumonias com 4 e 6 meses (sem isolamento do patógeno), e

desenvolvimento pondero-estatural menor do que o p10 aos 5 meses. Adicionalmente, aos 6

meses, desenvolveu eczema de pele e alopecia global. Foi referenciado ao serviço da UNIFESP

com 5 meses, onde foi formalizada a suspeita de IDP e foi realizada a imunofenotipagem de

linfócitos, que apontou número de células T CD3+ normal, mas com baixo número de células

CD4+, em especial células naïve (Tabela 8), o que é um forte indicativo de SCID. O paciente

foi então encaminhado ao LIH, já com 8 meses de vida, quando foi realizada a quantificação

de TRECs e KRECs, acusando valores praticamente indetectáveis de ambos (Tabela 8).

Tabela 8 – caracterização imunológica do Paciente 1

Triagem TRECs (cutoff < 25) 3

(moléculas / µL de sangue) KRECs (cutoff < 20) 4 Linfócitos totais 6783 (57%) CD3 3615 (53,3%) * CD4 462 (6,8%) * CD4+CD45RA+CCR7+ (naïve) 3 (0,6%)* CD4+CD45RA-CCR7+ (memória central) 31 (6,6%)* CD4+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 400,5 (86,7%)

Imunofenotipagem CD4+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 28 (6,1%)*

(células / mm3) CD8 2815 (41,5%)** CD8+CD45RA+CCR7+ (naïve) 2 (0,08%)* CD8+CD45RA-CCR7+ (memória central) 3 (0,1%)* CD8+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 2550 (90,6%)** CD8+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 260 (9,2%) CD19 441,6 (6,5%) * CD16 CD56 2204,5 (32,5%) **

Dosagem de

Imunoglobulinas

(mg / dl)

IgM 149,9**

IgG 852**

IgA 11,3

IgE 10,3

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas = 6 – 12 meses (P1 com 5m). * abaixo do p10 para a idade; ** acima do p90 para a idade

Fonte: autora.

48

Devido à caracterização clínica, esse paciente foi diagnosticado com Síndrome de

Omenn, uma doença causada por mutações hipomórficas em genes envolvidos com SCID

(Picard et al., 2018). A Síndrome de Omenn (SO) é uma imunodeficiência combinada

caracterizada por eritrodermia precoce e generalizada, infecções graves, hepatoesplenomegalia

e linfadenopatia com infiltração de células T oligoclonais autólogas nos tecidos afetados.

Pacientes com SO tem profunda hipogamaglobulinemia, mas IgE normalmente elevado e, em

geral, linfócitos B circulantes estão ausentes (Villa et al., 1999), pois a maioria dos casos se

deve a mutações hipomórficas no genes RAG1 ou RAG2, que podem levar à atividade residual

de recombinação V(D)J e à presença de células T com repertórios oligoclonais (Rieux-Laucat

et al., 1998; Brooks et al., 1999). Sendo assim, P1 foi inicialmente classificado como um SCID

T-B- e foram sequenciados os genes RAG1, RAG2 e ARTEMIS, porém nenhuma alteração foi

detectada. Assim, apesar do baixo número de células B, P1 foi reclassificado como T-B+, pois

havia uma população significativa de células B (>300 células autólogas por microlitro de

sangue), e normalmente pacientes SCID com defeitos intrínsecos em linfócitos B apresentam

números irrisórios dessas células, como pode ser visto nos pacientes T-B- incluídos nesse

estudo (vide Tabelas 10-12 e 14-16). De qualquer forma, como a detecção do defeito genético

não é necessária para o transplante e pacientes SCID encontram-se em situações emergenciais,

P1 foi submetido ao TCTH aos 2 anos e 7 meses e o procedimento foi bem-sucedido.

O Paciente 1 foi então encaminhado para sequenciamento completo do exoma

(resultados completos no Anexo B), e foi encontrada uma variante suspeita em homozigose no

exon 3 do gene IL7R (c.353G>A), que acarreta em uma troca de cisteína por tirosina no resíduo

118 (Cys118Tyr) da proteína IL-7Rα, correspondente à porção extracelular da cadeia alfa do

receptor de IL-7 (Figura 10).

A alteração encontrada já havia sido descrita anteriormente como patogênica e

causadora de Síndrome de Omenn (Giliani et al., 2005; Giliani et al., 2006; Butte et al., 2007).

A mutação Cys118Tyr em homozigose foi descrita pela primeira vez por Giliani e cols. (2005)

em dois irmãos espanhóis de pais consanguíneos, e posteriormente também por Giliani e cols.

(2006), em um paciente brasileiro. De acordo com os autores, a mutação missense permite a

formação da proteína IL7-Rα, porém a mesma não é funcional. Adicionalmente, dados de nosso

grupo (Flores, 2016) de outro paciente com esta mesma mutação, constataram que há um

aumento da concentração de IL-7 plasmática, indicando excesso desta citocina, que é

produzida, porém não consegue realizar sua função.

49

Figura 10 - Caracterização do defeito genético em IL7R do Paciente 1

A

B

Análise da sequência do exon 3 do gene IL7R, evidenciando uma substituição única de nucleotídeo em

homozigose (c.353G>A) (A). Efeito da mutação na proteína IL-7R (B)

Fonte: (A) autora; (B) Giliani et al., 2006.

Somando-se os dados clínicos, moleculares e genéticos do paciente, conclui-se que a

mutação Cys118Tyr no gene IL7R é a responsável pelo fenótipo de P1. Os médicos

responsáveis pelo encaminhamento de P1 foram contatados para obtenção de amostras de DNA

dos pais para verificar a segregação familiar, porém não foi possível encontrá-los.


Paciente 2, A.M.S., sexo feminino, nascida a termo, primeira filha de pais não

consanguíneos, sem histórico de óbitos precoces não família. Apresentou a primeira

manifestação clínica no primeiro mês de vida, eczema acompanhado de dificuldade de ganho

de peso. Aos 5 meses teve uma diarreia após a vacinação contra rotavírus. Foi internada aos 7

Peptídeo sinal (aa1-20)

Extracelular (aa21-239)

Transmembranar (aa240-264)

Intracitoplasmática (aa265-459)

50

meses de idade por eczema inespecífico, com desnutrição proteico-calórica e pneumonia

(positiva para Pneumocystis jirovecii). Durante a internação foi constatada presença de Candida

albicans e Morganella morganii na urina e fezes. Iniciou-se tratamento com antibioticoterapia

e antifúngicos, porém sem sinais de melhora. Após constatação de imunoglobulinas diminuídas,

a paciente e foi encaminhada para investigação de IDPs (Tabela 9) e iniciou-se a reposição de

Igs, mostrando melhora gradual do quadro.

Tabela 9 – caracterização imunológica da Paciente 2

Triagem TRECs (cutoff < 25) indetectáveis

(moléculas / µL de sangue) KRECs (cutoff < 20) 31 Linfócitos totais 2115 (22,5%) * CD3 510 (24,1%) *

Imunofenotipagem CD4 239 (11,3%) *

(células / mm3) CD8 53 (2,5%) * CD19 1294,4 (61,2%) CD16 CD56 171,3 (8,1%)

Dosagem de Imunoglobulinas

(mg / dl)

IgM 56,3

IgG 173*

IgA 53

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas 6 – 12 meses (P2 com 7m)

* abaixo do percentil 10 para a idade; ** acima do percentil 90 para a idade

Fonte: autora.

P2 apresentou TRECs indetectáveis e células T abaixo do p10. Normalmente espera-se

de um SCID clássico, um valor menor do que 300 células CD3+ / mm3, portanto a suspeita era

de que essa paciente fosse um Leaky SCID, com perfil T-B+NK+.

Com 1 ano e 3 meses, foi realizado o TCTH a partir de material do cordão, com

quimerismo em ascensão, porém mais lento do que o esperado. Com 1 ano e 7 meses a paciente

evoluiu com sepse por Klebisiela sp. devido à contaminação do cateter e foi a óbito.

Inicialmente, foi realizado sequenciamento direto dos genes IL7R, no qual estão

localizadas as mutações autossômicas mais frequentes no imunofenótipo T-B+ (Kwan, Puck,

2015). Contudo, não foram encontradas alterações e a amostra prosseguiu para o

sequenciamento completo de exoma. Os dados resultantes (Anexo B) não acusaram variantes

em genes esperados do fenótipo T-B+, como PTPRC (CD45), CORO1A e as subunidades do

complexo CD3 (CD3 δ, ε e ζ). Portanto, abriu-se o leque para estudar os genes de IDCs, que

normalmente possuem fenótipo mais brando, porém existem casos de mutações mais graves

que acarretam em um fenótipo clínico de SCID (Cirillo et al., 2015), não havendo até hoje um

limiar de separação entre essas duas classes de doenças.

51

Todas as variantes encontradas em genes de SCID e de IDCs no exoma de P2 não foram

condizentes com a clínica, além de serem todos prováveis SNPs, pois foram encontradas apenas

variantes em heterozigose, em regiões não codificantes, longe de sítios de splicing e de locais

com mutações patogênicas descritas. Portanto, a análise do exoma com enfoque em genes de

IDCs não foi informativa sobre qual o defeito genético por trás do fenótipo clínico de P2.

4.3. Análise clínica e investigação genética da Paciente 3

Paciente 3, M.T.F.T., sexo feminino, nascida a termo, segunda filha de pais não

consanguíneos, com irmã hígida. Apresentou os primeiros sintomas aos 3 meses de idade, com

sibilância, tosse seca, por vezes tosse produtiva, acompanhada de ganho de peso inadequado.

P3 foi internada 4 vezes devido a quadros respiratórios (1 bronquiolite viral aguda, 2

pneumonias e uma disfunção respiratória não definida). Ao 1 ano e 3 meses, P3 interna pela

quanta vez, com quadro de diarreias, vômitos e dispneia moderada/grave; desenvolveu na

internação varicela com piora do quadro respiratório e também foi detectado P. jirovecii e

Moraxella catarrhalis no lavado bronco-alveolar, anticorpos anti-CMV na urina, candidíase

oral, esofágica e perianal; além disso, também durante esta internação, surgiram pápulas difusas

pelo corpo (em especial nos membros superiores).

Os médicos descreveram erupção dos incisivos inferiores, de aparência conóide, e

cabelo finos, levantando a suspeita de displasia ectodérmica anidrótica, uma doença causada

por defeitos em genes específicos da via do NF-κB, que causam uma síndrome associada à

imunodeficiência (Pannicke et al., 2013). Com 1 ano e 7 meses, P3 foi transferida de hospital,

mantendo inúmeras intercorrências infecciosas, colonizada por Klebisiela pneumoniae, com

adenomegalia e diagnóstico de linfoma difuso de células B grandes, estádio IV. Apenas com 1

ano e 11 meses a paciente realizada a investigação para IDPs, com quantificação de TRECs e

KRECs e a imunofenotipagem de linfócitos com células de memória (Tabela 10), cujos

resultados indicaram um perfil T-B-NK-.

Devido aos números muito baixos de linfócitos, a Paciente 3 seria classificada como

perfil T-B-NK-. Entretanto, o ideal seria a realização dos exames na ausência de tratamento

quimioterápico, pois o mesmo influencia as contagens de células hematopoiéticas. Contudo,

não foi possível a realização de novos exames na ausência de quimioterápicos pois a paciente

faleceu, aos 2 anos de idade, por causa do linfoma difuso de células B.

52

Tabela 10 - caracterização imunológica do Paciente 3

Triagem TRECs (cutoff < 25) indetectáveis

(moléculas / µL de

sangue) KRECs (cutoff < 20) indetectáveis

Linfócitos totais 871 (13,62%)* CD3 105 (12,05%)* CD4 20 (2,3%)* CD4+CD45RA+CCR7+ (naïve) 2 (9,2%)* CD4+CD45RA-CCR7+ (memória central) 7 (34,3%)* CD4+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 9 (46,6%)*

Imunofenotipagem CD4+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 2 (9,8%)*

(células / mm3) CD8 91 (10,42%) * CD8+CD45RA+CCR7+ (naïve) 1 (0,9%)* CD8+CD45RA-CCR7+ (memória central) 16 (17,9%) CD8+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 57 (62,8%)* CD8+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 16,5 (18,3%) * CD19 4,9 (0,57%)* CD16 CD56 14,8 (1,7%)*

Dosagem de

Imunoglobulinas #

(mg / dl)

IgM 570 / 862 **

IgG 1350 / 1460**

IgA 445 / 748 **

IgE 8 / 4,1

Idade de de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas: 1-2 anos (P3 com 1a1m).

* abaixo do p10 para a idade; ** acima do p90 para a idade # dosagens de Igs de paciente sob reposição de imunoglobulinas; 1ª dosagem com 9m e 2ª com 1a4m.

Fonte: autora.

Em conjunto, a clínica e a caracterização de linfócitos de P3 eram um forte indício de

uma paciente com SCID ou outra IDC grave e a amostra foi encaminhada para sequenciamento

de exoma. Genes de ambos os grupos foram investigados, com especial atenção ao gene

IFKBIA, que codifica a proteína IκBA, responsável pela displasia ectodérmica anidrótica

autossômica recessiva. Entretanto, não foram encontradas mutações exônicas ou mesmo

intrônicas em homozigose ou heterozigose composta. Sendo assim, não foi possível encontrar

o defeito genético causador do quadro clínico da paciente 3.

Em casos como esse, é importante lembrar que o sequenciamento de exoma não é

infalível. Alterações no meio de íntrons e alguns tipos de deleções maiores podem passar

desapercebidas nesse tipo de sequenciamento. Portanto, a ausência de variáveis potencialmente

patogênicas no exoma não descarta a possibilidade de que a paciente tivesse uma mutação

diferente nos genes estudados (Patel et al., 2017).

53


Paciente 4, I.V.P.J.M., sexo feminino, nascida a termo, sem consanguinidade ou óbitos

precoces na família. Aos 3 meses foi internada devido a quadro compatível com encefalite viral

(febre com crise convulsiva). A paciente recebeu alta, porém foi internada novamente 7 dias

depois com febre alta (40 ºC) e insuficiência respiratória. Permaneceu internada até os 10 meses

de idade, com diversos episódios infecciosos respiratórios e sanguíneos (único patógeno isolado

foi Stafilococcus sp.), com necessidade de ventilação mecânica. Tomografia mostrou atrofia

cerebral difusa, múltiplos hematomas subdurais e área de gliose, sugerindo evento hipóxico-

esquêmico anterior. Devido a linfopenia em hemograma e os episódios de infecções de

repetição, foi realizada dosagem de imunoglobulinas, que mostrou IgG abaixo de 200 mg/dl

(abaixo do p3 para a idade); começou reposição a cada 21 dias, porém manteve níveis baixos.

Com 10 meses evoluiu com piora do padrão respiratório, acúmulo de linfa no espaço pleural

com cultura positiva para Stenotrophomonas maltophilia. Com 11 meses evoluiu com sepse

grave, mas respondendo bem ao tratamento. Com 1 ano realiza a imunofenotipagem de

linfócitos, que acusa baixos números de células T e B e nova dosagem de imunoglobulinas, já

sob reposição (Tabela 11). Adicionalmente, na mesma época foi realizada biópsia medular, a

qual mostrou uma linfopenia intensa na medula óssea.


Triagem

(moléculas / µL de sangue) TRECs (cutoff < 25) 0

KRECs (cutoff < 20) 9

Imunofenotipagem

(células / mm3)

Linfócitos totais 388 (6%)*

CD3 140 (36%)*

CD4 18 (12,80%)*

CD8 20 (14,40%)*

CD19 3 (0,7%)*

CD16+CD56+ 225 (57,9%)

Dosagem de

Imunoglobulinas #

(mg / dl)

IgM 11 *

IgG 320 *

IgA < 5 *

IgE NR

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas = 1-2 anos (P4 com 12 m).

* abaixo do p10 para a idade; ** acima do p90 para a idade # dosagem realizada após reposição de imunoglobulinas.

Fonte: autora.

P4 foi classificada como SCID T-B-NK+ e foi encaminhada para o TCTH, tendo a mãe

como doadora haploidêntica. Inicialmente evoluiu bem, porém após 3 meses foi internada na

54

UTI pediátrica devido à dificuldade da retirada da ventilação mecânica. Após colocar um

marca-passo diafragmático, P4 teve alta e retornou para sua cidade natal. Entre 7 a 8 meses

mais tarde foi informado à equipe médica que a paciente foi à óbito, sem informações sobre a

causa.

Durante as investigações imunológicas, DNA da paciente foi coletado e foi realizado o

sequenciamento completo do exoma. Imunodeficiências graves associadas a defeitos

neurológicos são normalmente causadas por defeitos em proteínas envolvidas no processo de

reparo de DNA, como LIGIV (O' Driscoll et al., 2001) e NHEJ1 (Buck et al., 2006). Porém já

foram descritos defeitos em outros genes, PRKDC (Woodbine et al., 2013). Entretanto, não

foram encontradas variantes em homozigose ou heterozigose composta em nenhum gene de

SCID ou IDCs, apenas algumas variantes em heterozigose e em genes que não condiziam com

o fenótipo clínico de P4 (Anexo B).

Em análises posteriores, foram encontradas 2 variantes no gene CECR1, que codifica a

proteína ADA2 (c.1358>A>G, p.Tyr453Cys ; c.1042T>A, p.Leu351Gln). ADA2, assim como

ADA1 (ou apenas ADA, causadora de SCID T-B-NK-) participa do metabolismo de purinas,

porém possui menor afinidade por seus substratos e em pacientes com deficiência de ADA2,

não há acúmulo de metabólitos tóxicos; acredita-se que ADA2 seja secretada e também possua

alguma atividade como fator de crescimento (Meyts, Aksentijevich, 2018).

A deficiência de ADA2 (DADA2) foi reportada pela primeira vez recentemente, em

2014, quando dois grupos publicaram simultaneamente seus achados (Zhou et al., 2014; Navon

Elkan et al., 2014). Inicialmente, a doença foi caracterizada por uma síndrome que se manifesta

com febres, poliartrite nodosa, livedo racemoso, acidentes vasculares precoces e

imunodeficiência moderada. Entretanto, o fenótipo clínico foi expandido desde então,

manifestações clínicas e idade dos primeiros sintomas variam muito, hipogamaglobulinemia

foi reportada em 25% dos pacientes e linfopenia, em 15%; as manifestações mais graves

registradas foram aplasia medular, aplasia de eritrócitos, neutropenia, doença hepática e

problemas de desenvolvimento neurológico (Meyts, Aksentijevich, 2018).

Ambas variantes de encontradas em CECR1 localizam-se no domínio catalítico de

ADA2. Uma delas (Tyr453Cys) já foi previamente descrita como patogênica (Zhou et al.,

2014), enquanto a outra ainda não está descrita na literatura. Análise in silico previu a segunda

mutação como provavelmente patogênica (PolyPhen2 1 = provavelmente patogênico; SIFT 0

= patogênico; MutationTaster 0,99 = patogênico). A dos pacientes com defeitos em ADA2 tem

mutações missense em heterozigose composta (Meyts, Aksentijevich, 2018). Levando em

consideração as manifestações neurológicas, a imunodeficiência e as mutações encontradas, é

55

possível que a DADA2 seja responsável pelo fenótipo de P4. Entretanto, outras análises seriam

necessárias para a confirmação dessa alteração, como dosagem de ADA, o que não seria

possível devido ao falecimento da paciente. Não foi possível realizar a confirmação da mutação

por sequenciamento direto devido à finalização do presente estudo.


Paciente 5, M.E.S.M., sexo feminino, nascida a termo, segunda filha de pais não

consanguíneos, irmão hígido, sem histórico de mortes precoces na família. Primeira

manifestação com 1 mês de idade, eritrodermia extensamente pruriginosa com descamação

grosseira em todo o tegumento da cabeça. Melhorou após tratamento, porém foi internada

novamente 1 dia após a alta devido a bronquiolite. Na evolução, apresentou nódulo axilar com

isolamento do vírus BK e perda de peso. Durante a hospitalização, foram detectados S. aureus

no líquor, Enterococcus sp. no trato urinário, Acinetobacter sp. no sangue (único pico febril) e

Mycobacterium tuberculosis em biópsia de linfonodo.

Iniciou investigação para IDP com 2 meses de idade realizando primeiramente a

dosagem de imunoglobulinas, que revelou IgG e IgM abaixo do percentil 3 para a idade (Tabela

12) e valores extremamente elevados de IgE. Além disso, o hemograma mostrou leucocitose,

com marcada eosinofilia, características de Síndrome de Omenn.


Triagem

(moléculas / µL de sangue) TRECs (cutoff < 25) 5


Imunofenotipagem

(células / mm3)

Linfócitos totais NI

CD3 3410 (93%)

CD4 2350 (64%)

CD8 1096 (30%)

CD19 3,6 (0,1%) *

CD16+CD56+ NR

Dosagem de imunoglobulinas

(mg / dl)

IgM 29*

IgG 169*

IgA 6 IgE > 3000

NR = não realizado; NI = não informado

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas = 3-6 meses (P5 com 3m).

* abaixo do p10 para a idade; ** acima do p90 para a idade Fonte: autora.

56

Com o perfil imunológico indicando Síndrome de Omenn grave, a médica responsável

indicou a Paciente 5 para o TCTH. Porém, a paciente estava internada em estado grave e não

pode ser transferida para Porto Alegre, único centro do Sul do país onde é realizado o

procedimento. Ela permaneceu internada por 2 meses, tratando sepse, até que foi à óbito antes

do encaminhamento para transplante.

Como parte da investigação genética, foi obtida amostra de sangue e o DNA extraído

para o sequenciamento completo de exoma no momento da triagem neonatal de P5. Devido à

suspeita de SO, foi dada primeira importância a variantes presentes nos genes ligados à

recombinação V(D)J. As únicas variantes exônicas em genes ligados à SCID encontradas nessa

paciente foram duas alterações no gene RAG2 (c.686G>A; c.749_750delCA). As mutações

foram confirmadas por sequenciamento de Sanger (Figura 11).

Figura 11 - alterações genéticas em RAG2 encontradas na Paciente 5

Sequência de DNAg de P5 comparada a indivíduo controle, evidenciando a troca c.686G>A em heterozigose

(A) e a deleção c.749_750delCA, também em heterozigose, causando o frameshifts em um alelo (B).

Fonte: autora.

Controle

P5

A

Controle

P5

B

57

A variante missense de troca de G por A no nucleotídeo codificante de posição 686,

acarreta em troca de aminoácido Arg229Gln (ou R229Q) e já havia sido descrita anteriormente

como patogênica (Schwarz et al., 1996), porém quando em homozigose, que não é o caso do

achado nessa paciente. Neste primeiro trabalho, Schwarz e colegas descrevem um paciente do

sexo masculino no qual foi identificada heterozigose composta, com um alelo com a mutação

R229Q herdada da mãe, e o outro alelo, herdado do pai, com uma deleção grande que obliterava

tanto RAG1 quanto RAG2, pois esses genes tem uma região de sobreposição, cada um é lido

em uma fita de DNA complementar. Foi criado então um plasmídeo mutante RAG2 R229Q

que, quando transfectado em uma linhagem humana de fibroblastos, foi capaz de induzir a

expressão de Rag-2 em níveis similares ao constructo selvagem, porém em ensaio in vitro que

media a atividade de recombinação V(D)J, o mutante R229Q apresentou perda dramática de

atividade de recombinação, o que significa que a mutação permite que a proteína seja formada,

porém a mesma não desempenha sua função eficientemente. Também foi descrita anos mais

tarde a mesma mutação (Signorini et al., 1999) em um paciente com fenótipo de SO, e outra na

mesma posição, porém com outra troca, acarretando em Arg229Glu (Corneo et al., 2000). Neste

último trabalho, os autores fizeram uma predição conformacional da proteína Rag-2 e

mostraram que a mutação está no domínio catalítico da proteína, e atualmente já se sabe que

essa é uma região de contato com a Rag-1 (resíduo D546), que participa da formação do

complexo Rag-1/Rag-2 (Callebaut, Mornon, 1998; Kim et al., 2015). Portanto, devido à

alteração nesse resíduo, o completo Rag-1/Rag-2 não seria formado e a recombinação V(D)J

não ocorreria de maneira eficiente.

A outra variante em RAG2 encontrada em P5 é uma deleção de dois nucleotídeos que

causa uma mudança do quadro de leitura (frameshift, fs) a partir do resíduo 250, que gera um

novo códon de parada prematuro, 17 nucleotídeos à jusante da mutação (T250Sfs*17). Essa

alteração foi predita como patogênica pela ferramenta MutationTaster, pois a geração de um

códon de parada prematuro acarretaria na formação de um RNA mensageiro (mRNA) truncado,

muito mais curto que o selvagem (Figura 12), levando à degradação desta molécula antes da

tradução da proteína. A estrutura cristalizada de Rag-2 ainda não está tão esclarecida (Kim et

al., 2015), porém essa alteração também se encontra no sítio catalítico da proteína, o que indica

que mesmo que um produto proteico fosse formado, há poucas chances de que ele exerceria sua

função eficientemente.

58

Figura 12 – Sequência de aminoácidos de Rag-2 referência e do mutante T250Sfs*17

Fonte: output do site www.mutationtaster.org

Juntas, essas duas alterações potencialmente configuram um heterozigoto composto, e

explicariam o fenótipo clínico de Síndrome de Omenn da Paciente 5. Os pais foram contatados

para obtenção de amostras para confirmação da segregação das alterações encontradas, porém

não se dispuseram a ceder material genético para o estudo.

4.6 Análise clínica e investigação genética do Paciente 6

Paciente 6, A.R.R., sexo feminino, nascida a termo, segunda filha de pais consanguíneos

(primos de primeiro grau). Pais apresentavam histórico de primeiro filho falecido aos 6 meses

de idade que apresentava baixo ganho ponderal associado a diarreia, evoluindo com quadro

séptico grave refratário ao tratamento, falência de múltiplos órgãos e óbito após 80 dias de

internação, já com a suspeita de SCID. Foi feito diagnóstico posterior de aplasia medular, mas

não houve tempo de diagnosticar a SCID.

Devido ao histórico familiar, P6 não recebeu nenhuma vacina viva atenuada ao

nascimento. Porém, aos 2 meses de idade, apresentou um eczema no rosto, sinal de possível

infecção, e foi prontamente encaminhada para uma imunologista para a investigação de IDP, a

qual requisitou o exame de TRECs e KRECs e os outros exames pertinentes (Tabela 13).

A triagem neonatal indicou uma paciente com total ausência de células T naïve e

números normais de células B, indicando um T-B+. A primeira imunofenotipagem (IF)

apresentou baixos números de linfócitos T. Foi realizada uma segunda IF para

acompanhamento um mês depois, que revelou uma queda nos números de células T CD4+,

http://www.mutationtaster.org/

59

valores normais de células B (condizente com a triagem neonatal), além de poucas células NK,

levantando a suspeita de um SCID T-B+NK-.

Com esses resultados em mãos, aos 5 meses, P6 foi referenciada para o TCTH. Foram

realizadas novas IFs de acompanhamento na espera pelo transplante, nas quais foi possível

observar a queda progressiva dos linfócitos T e células NK, consolidando o perfil T-B+NK-. O

TCTH foi realizado com 1 ano e 3 meses, 10 meses após o diagnóstico, e foi bem-sucedido,

com 100% de quimerismo atingido. A paciente atualmente está com 3 anos e 9 meses e segue

bem.


Idade 2m 3m 11m 12m

Triagem


sangue)

TRECs (cutoff < 25) NR Indetectáveis NR NR

KRECs (cutoff < 20) NR 158 NR NR

Imunofenotipagem

(células / mm3)

Linfócitos totais 2213 * 2760 * 1820 * 1207 (55%)*

CD3 875 (36%)* 1529 (55%)* 311 (17%)* 181 (15%)*

CD4 260 (10%)* 61 (4%)* 16 (5%)* 23,5 (13%)*

CD4+CD45RA+CCR7+

(naïve) NR NR 0 * 0,3 *

CD4+CD45RA-CCR7+

(memória central) NR NR 4,5 * 12 *

CD4+CD45RA-CCR7-

(memória periférica) NR NR 5 * 9 *

CD4+CD45RA+CCR7-

(diferenciação terminal) NR NR 0,2 * 2,4 *

CD8 90 (3,7%) * 162 (11%)* 66 (21%)* 25 (14%)*

CD8+CD45RA+CCR7+

(naïve) NR NR 0,3 * 0,7 *

CD8+CD45RA-CCR7+

(memória central) NR NR 4 * 1,4 *

CD8+CD45RA-CCR7-

(memória periférica) NR NR 30 * 13 *

CD8+CD45RA+CCR7-

(diferenciação terminal) NR NR 9 * 10 *

CD19 NR 1145 (41%) 1072 (59%) 299 (25%)*

CD16+CD56+ NR 38,64 (1%)* 47 * 13 (1%)*

Dosagem de

Imunoglobulinas

( mg / dl )

IgM 57,7 NR NR NR

IgG 625,6 NR NR NR

IgA 1 NR NR NR

IgE < 2 NR NR NR

NR = não realizado

* abaixo do p10 para a idade; ** acima do p90 para a idade Fonte: autora.

60

Este foi o único caso deste estudo no qual foi possível o diagnóstico precoce, que só

ocorreu devido ao histórico familiar positivo. Infelizmente, dada a atual situação da TN para

linfopenias no Brasil, que está disponível apenas no mercado privado ou como pesquisa

científica, e a falta de conhecimento médico sobre as IDPs, é esperado que diagnósticos

precoces e a possibilidade do procedimento de transplante antes do aparecimento de sintomas

e sequelas, só seja possível em casos de pacientes com histórico familiar da doença, que se

estima corresponder a menos de 20% dos casos de SCID (Chan et al., 2011).

Devido ao histórico familiar e o perfil T-B+NK-, suspeitou-se de defeito autossômico,

no gene JAK3. No exoma, foi encontrada variante homozigota nesse gene, uma troca

c.2350G>A, localizada no último nucleotídeo o exon 17. Essa troca poderia acarretar em uma

troca de aminoácidos (p.Asp784Asn), correspondente a um aminoácido que se inicia no exon

17 e termina no 18 (a trinca AAC é separada em GA no exon 17 e C no exon 18). Porém Walshe

e colegas (2009) relataram um paciente SCID com uma mutação missense c.2351+1G>T, que

corresponde ao nucleotídeo seguinte ao afetado em P7, a qual causa um defeito de splicing.

Portanto, além da confirmação da mutação no genoma por sequenciamento de Sanger, também

foi realizado o sequenciamento do cDNA desta paciente, que mostrou a total ausência do exon

17 de JAK3 em P6 (Figura 13), caracterizando a mutação como uma alteração do processo de

splicing do mRNA.

JAK3 é uma tirosina-quinase não receptora que se associa à cadeia gama-comum (γc) e,

quando ativada por estímulo de certas citocinas, ativa complexos de transcrição (STATs) assim

como outras quinases (Gilmour et al, 2011). Essa proteína é expressa em células de linhagem

hematopoiética e estudos indicam que as mutações em JAK3 são esporádicas, sem preferências

por certos locais do gene, ou seja, não existem hot-spots de mutação (Figura 14) e até onde se

sabe, grande parte dos pacientes são heterozigotos compostos que herdaram um tipo de mutação

de cada pai (O’Shea et al., 2004). A maioria das mutações descritas afetam a expressão ou

estabilidade da proteína e, menos frequentemente, resultam em uma Jak-3 expressa, porém não

funcional. Mutações missense e pequenas deleções sem mudança do quadro de leitura podem

permitir a expressão da proteína, mas interferir com a atividade da quinase, sua ligação à cadeia

γc que faz parte do receptor das citocinas que utilizam Jak-3 na sua via de sinalização, ou seu

deslocamento intracelular (O’Shea et al., 2004).

61

Figura 13 - Investigação genética da mutação de JAK3 encontrada na Paciente 6

Comparação entre controle saudável e P6 na sequência do DNA genômica, mostrando a troca c.2350G>A

(A) e sequencia do cDNA, evidenciando no controle a sequência esperada com os exons 16, 17 e 18 e, em

P6, o skipping do exon 17.

Fonte: autora.

62

p.M1V p.G36fsX146

p.Q39X p.A58del p.A58P

p.Y100C

p.H141PfsX149 p.P151R p.D169E p.C193Y

c.421-10G>A

p.Q286insfsX302 p.Q286X

p.T391fsX408 p.R403C

p.R445X p.L462insfsX519

p.E481-482delfsX483 p.E481G

p.K482S596del

p.W523X p.C565X p.R582W p.G589S

p.V590-S596del p.K641X p.R651W p.P689S p.E694K p.E698X p.T714M p.V722I

p.K734-D484delfsX844 p.C759R p.Q766X p.R771X

c.1787-1G>A c.1786+3G>T c.2351+1G>T

p.Y886X p.904X p.L910S p.Y929X

p.G987fsX1031 p.Y1023X

p.C1024fsX1037 p.C1066R

c.2680+89C>T c.2680+3G>C c.3208-1G>A

Figura 14 - Estrutura esquemática dos exons e domínios de Jak-3 com as mutações conhecidas

JH = domínios de homologia janus. JH1, quinase; JH2, pseudo-quinase, regulação da atividade quinase; JH3

e JH4, domínio SH2 (domínio de homologia Src 2), cujo papel é obscuro; JH5-JH7 medeiam a ligação à

cadeia γc do receptor de citocinas e também regula a atividade catalítica. Mutações em sequência codificantes

são precedidas pela letra p; mutações em regiões não codificantes são precedidas por c e sublinhadas.

Fonte: autora, baseado em Brooimans et al., 1999; Bogaert et al., 2016; Sato et al, 2016; Stepensky et al.,

2016.

A mutação c.2350G>A (p.Asp784Asn) encontrada em P6 causa a excisão do último

exon do domínio JH1, que é a porção catalítica da proteína e, portanto muito conservada entre

diferentes espécies (Figura 15).

Figura 15 – Conservação entre espécies da região de JH1 mutada na Paciente 6

Destacado em vermelho o resíduo mutado na Paciente 6. Que é conservado mesmo em espécies que não

pertencem à classe dos mamíferos (X. tropicalis e G. gallus),

Fonte: autora.

63

Em conjunto, os dados de sequenciamento e as análises in silico indicam a

patogenicidade da mutação Asp784Asn encontrada no gene JAK3 de P7. A médica responsável

pelo acompanhamento do caso foi contatada para coleta de sangue dos pais para confirmação

da segregação da mutação, porém não foi possível obter as amostras.


Paciente 7, G.A.C.M., sexo masculino, nasceu prematuro de 31 semanas. Os pais não

eram consanguíneos, porém possuíam histórico de um óbito neonatal do primeiro filho, que

nasceu com apenas 900 gramas e foi a óbito no mesmo dia, contudo os pais não souberam

informar se haviam infecções envolvidas.

P7 apresentou sepse neonatal com cultura positiva para E.coli, que permaneceu

refratária a tratamentos. A mãe estava com infecção do trato urinário, mas não foi isolado o

agente. Durante a internação, também foi detectada má formação na separação dos átrios do

coração com escape do fluxo sanguíneo do átrio esquerdo para o direito e a formação de um

trombo. No 25º dia de vida iniciou-se a investigação para IDP (Tabela 14) e o paciente recebeu

infusão de imunoglobulinas; porém uma semana depois houve piora do quadro clínico devido

à insuficiência renal.


Triagem

(moléculas / µL de sangue)

TRECs (cutoff < 25) 3


Imunofenotipagem

(células / mm3)

Linfócitos totais NI

CD3 312

CD4 223

CD8 85

CD19 19

CD16+CD56+ NR

Dosagem de

Imunoglobulinas

(mg / dl)

IgM indetectável

IgG 552

IgA 198

IgE NR

NR = não realizado; NI = não informado.

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas = 0-3 meses (P7 com 25 dias).

* abaixo do p10 para a idade; ** acima do p90 para a idade

Fonte: autora.

64

Com os resultados do perfil de linfócitos, P7 foi classificado como perfil T-B-. Porém

o paciente foi à óbito antes da conclusão do diagnóstico definitivo de SCID.

Deficiência imune e defeitos cardíacos normalmente estão ligados à Síndrome de Di

George, causada pela deleção 22q11.2, que é uma deleção de extensão variável, mas que em

10% dos casos acarreta em pacientes com atimia completa (Picard et al., 2018). Portanto nesse

caso também foi investigado o gene TBX, que é o principal gene ausência em pacientes com

SDG . Entretanto, os resultados de exoma de P7 em genes SCID, IDCs e no TBX não

apresentaram nenhuma variante que pudesse ser associada ao quadro clínico do paciente

(Anexo B).

A cardiopatia apresentada por P7 não é incomum, estima-se que aproximadamente 25%

da população adulta possua algum grau de comunicação entre os compartimentos cardíacos

(Hagen, Scholz, Edwards, 1984), que normalmente só são descobertas em investigações devido

a ocorrência de acidentes vasculares cerebrais (Homma, Sacco, 2005; Khan et al., 2016).

Levando em consideração a prematuridade do Paciente 7, a abertura poderia estar presente

devido ao estágio de desenvolvimento do recém-nascido.

Problemas cardíacos e prematuridade são fatores que podem afetar o desenvolvimento

de linfócitos. Já foi constatado em diversos estudos que indivíduos prematuros possuem um

sistema imune mais imaturo e quanto menor a idade gestacional, maior o comprometimento

imune e, portanto, os valores de TRECs e KRECs também são estatisticamente menores (Chan,

Puck, 2005; Verbsky et al., 2012; Adams et al., 2014; Kanegae et al., 2017). Os valores de

TRECs e KRECs de prematuros são menores do que os de recém-nascidos a termo, porém

geralmente não são tão baixos quanto os de pacientes SCID. Portanto, a prematuridade pode ter

contribuído para a apresentação extremamente precoce de sintomas, mas não exclui a existência

de uma imunodeficiência primária neste paciente.


Paciente 8, A.S.M., sexo masculino, segundo filho de pais não consanguíneos, sem

histórico de imunodeficiências na família, irmã 7 anos mais velha hígida. Aos 2 meses

apresentou dermatite difusa e aos 5 meses foi referenciado para o serviço de imunologia

pediátrica da UNIFESP, com dermatite atópica grave e dermatite seborreica de difícil controle,

monilíase oral, descamação e hiperemia na região genital e perianal, granuloma umbilical

secretivo. Os pais relataram duas infecções respiratórias, 6 otites e diarreias durante o uso de

65

antibioticoterapia. P8 apresentou reação cutânea à vacina BGC desde os 2 meses, com crosta e

secreção na região ainda aos 5 meses; além disso, houve piora das lesões de pele a cada vacina.

Aos 7 meses foi realizada a triagem neonatal e a imunofenotipagem de linfócitos

(Tabela 15). A triagem acusou ausência de TRECs (a quantificação de KRECs ainda não estava

disponível na época em que o paciente foi encaminhado), e a IF revelou ausência de células T

naïve e raras células B, indicando um SCID T-B-.



(moléculas / µL de sangue) KRECs (cutoff < 20) NR

Linfócitos totais 5676 (33%)

CD3 3320 (58%)

CD4 2390 (42%)

CD4+CD45RA+CCR7+ (naïve) 6 (0,2%) *

CD4+CD45RA-CCR7+ (memória central) 294 (12%)

CD4+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 1995 (83%) **

Imunofenotipagem CD4+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 94 (4%) *

(células / mm3) CD8 258 (4,5%) *

CD8+CD45RA+CCR7+ (naïve) 0,3 (0,1%) *

CD8+CD45RA-CCR7+ (memória central) 0 *

CD8+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 165 (64%)

CD8+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 92 (36%)

CD19 23 (0,4%)*

CD16+CD56+ 1861 (33%) **

NR = não realizado.

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas = 6-12 meses (P8 com 7 m).


Fonte: autora.

Com o diagnóstico, P8 foi encaminhado para o TCTH, haploidêntico (pai foi o doador),

que foi realizado com 1 ano de idade. Houve reação enxerto-versus-hospedeiro após o

transplante e aparecimento de lesões no couro cabeludo, que foram controladas com medicação.

De acordo com o perfil de SCID T-B-, foram sequenciados diretamente os genes RAG1,

RAG2 e DCLRE1C (ARTEMIS). O sequenciamento mostrou variante em homozigose no exon

3 do gene DCLRE1C, c.241C>T (Figura 16).

66

Figura 16 - Mutação c.241C>T em DCLRE1C encontrada no Paciente 8

Sequência de controle saudável e P8, evidenciando em vermelho a alteração c.241C>T.

O gene DCLRE1C corresponde à proteína ARTEMIS, que participa ubiquitinamente do

processo de reparo de DNA, mas que também tem papel importante no processo de

recombinação V(D)J (Moshous et al., 2001). Pacientes com deficiência completa de ARTEMIS

sofrem de SCID T-B-, enquanto a deficiência hipomórficas pode gerar formação residual

linfócitos T e B oligoclonais, correspondendo a SCID TlowBlow ou de Síndrome de Omenn. Em

ambos os casos, devido ao defeito na via de reparo não homólogo de DNA, pode haver

sensibilidade à radiação ionizante (Pannicke et al., 2010).

A alteração encontrada foi uma das primeiras a ser descrita na literatura (p.R81X), ela

é uma mutação nonsense, que causa troca o resíduo arginina por um códon de parada prematuro.

Essa mutação foi registrada em um paciente com fenótipo clínico de SCID, porém sem

sensibilidade aparente à radiação (Moshous et al., 2011), o que condiz com os achados de P8.

Em um trabalho in vitro de avaliação da atividade de recombinação de ARTEMIS mutadas,

verificou-se que a mutação R81X gera níveis de recombinação V(D)J 81% menores do que o

controle e reparo de DNA 84% menos eficiente (Felgentreff et al., 2015).

Portanto fechou-se o defeito genético do Paciente 8 como uma mutação em ARTEMIS.

Não foi possível encontrar os pais do paciente para realizar o estudo de segregação da mutação.

67


Paciente 9, M.S.S., sexo masculino, primogênito de pais não consanguíneos. Histórico

de pneumonias de repetição e diarreia crônica a partir dos 3 meses de vida, com diversas

internações, somando 8 pneumonias e febre recorrente. Baixo ganho pondero-estatural, sem

cicatriz da vacina BCG. Os exames iniciais, com 5 e 10 meses, mostraram valores normais de

linfócitos e imunoglobulinas para a idade. Com 13 meses, sem melhoras clínicas, P9 foi

encaminhado para um imunologista, que suspeitou de uma IDP e requisitou o exame de TRECs

e KRECs e imunofenotipagem de linfócitos com as subpopulações de memória (Tabela 16).

Tabela 16 – caracterização imunológica do Paciente 9

Triagem TRECs (cutoff < 25) 1 NR


sangue) KRECs (cutoff < 20) 52 NR

Linfócitos totais NI NI CD3 1093 (62%) 864(76%)*

CD4 214 (20%)* 341

(39%)* CD4+CD45RA+CCR7+ (naïve) 64* 159* CD4+CD45RA-CCR7+ (memória central) 25* 72* CD4+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 46 48

Imunofenotipagem CD4+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 79** 62

(células / mm3) CD8 693 (63%) 398(46%)* CD8+CD45RA+CCR7+ (naïve) 317 182* CD8+CD45RA-CCR7+ (memória central) 184 133 CD8+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 159 67 CD8+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 31 17* CD19 361 (20%)* 154(18%)* CD16+CD56+ 37 (2,1%)* 42 (5%)*

Dosagem de

Imunoglobulinas

(mg / dl)

IgM 191 NR

IgG 1060** NR

IgA 80,9** NR

IgE 19,6** NR

NR -= não realizado; NI = não informado.

Foram realizadas 2 IFs, ambas com 1a3m, com uma semana de diferença.

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas = 1-2 anos.


Fonte: autora.

O perfil de linfócitos mostrou baixos números de toda série linfocítica, em especial

poucas células T CD4+ naïve e também baixos números de células NK. O paciente foi

68

primeiramente classificado como T-B+NK-, porém não foram encontradas mutações nos genes

IL2RG e JAK3, mais comuns nesse tipo de perfil, e então foi realizado o sequenciamento do

exoma. Foi então encontrada uma substituição de 2 nucleotídeos no gene CD3G

(c.390_391delTGinsCT), localizada no exon 4, que foi confirmada em heterozigose nos

parentais (Figura 17).

Figura 17 – Alteração genética em CD3G encontrada no Paciente 9 e segregação familiar

As sequências mostram o controle de sequência TG em homozigose, P8 com a troca c.390_391 TG > CT em

homozigose (evidenciado pelo quadrado vermelho) e os pais, cada um heterozigoto para a mutação.

Fonte: autora.

Essa alteração não foi previamente descrita na literatura, porém foi predita como

patogênica pelas análises in silico (MutationTaster patogênico, Polyphen2 0,986 –

provavelmente patogênico). A alteração gera a substituição de um aminoácido (p.Val131Phe),

e está localizada na região citoplasmática, próxima à região de interação com o TCR (Ohtani et

al., 2011), em uma região altamente conservada da proteína (Figura 18).

Controle

P9

Mãe P9

Pai P9

69

Figura 18 - Conservação entre espécies da proteína CD3γ na região mutada em P9

Indicado em vermelho o resíduo alterado em P8 e a conservação do mesmo entre diferentes espécies de

mamíferos.

Fonte: autora.

Ainda existem poucos relatos de pacientes com deficiência de CD3γ na literatura. A

perda de função desta proteína em humanos parece permitir o desenvolvimento de células T

policlonais com sinalização do complexo TCR/CD3 presente, porém prejudicada (Rowe et al.,

2018). Deficiências de CD3γ estão associadas a fenótipos clínicos variados, porém geralmente

mais brandos do que os gerados por deficiências de CD3δ e CD3ε, acompanhados de

susceptibilidade variada a infecções e ocorrência de doenças autoimunes (Recio et al., 2007;

Gokturk et al., 2014; Rowe et al., 2018).

Récio e colegas (2007) relataram o caso de dois irmãos com deficiência completa de

CD3γ que possuíam TRECs baixos persistentes, porém linfopenia leve e níveis normais de

imunoglobulinas, ambos com fenótipo clínico de SCID clássica (apresentação precoce,

infecções recorrentes e graves), porém ambos eram mais novos do que P9. Os autores concluem

que a falta de CD3γ afeta a produção tímica, mas não a expansão clonal e acúmulo de células

T maduras policlonais, o que se correlaciona com a presença de timos com tamanho reduzido

em pacientes descritos na literatura (Regueiro et al., 2007). Assim, a ausência de CD3γ acabaria

gerando um perfil imunológico superficialmente normal, apesar do amplo espectro de sintomas

clínicos.

P9 estava extremamente debilitado e com grande déficit de crescimento, o que pode ter

contribuído para os valores mais baixos de linfócitos dele em relação a outros pacientes da

literatura. O diagnóstico final de SCID foi realizado ainda em vida, porém o paciente não

sobreviveu a tempo da reconstituição de medula óssea.

70

4.10 Análise clínica e investigação genética dos Pacientes 10 e 11

Paciente 10, J.G.B.F., sexo masculino, gêmeo univitelínico do paciente 11, primeiros

filhos de pais não consanguíneos. Mãe relatou mortes precoces por infecção na família, tios e

primos do avô. O paciente 10, logo após o nascimento, apresentou espasmos e foi internado na

UTI, teve icterícia neonatal e teve alta em 7 dias devido às intercorrências. Apresentava bastante

secreção com engasgos frequentes e diarreia desde o nascimento. Com 15 dias, teve

sangramento nas fezes, que foi diagnosticado como alergia à proteína do leite de vaca, passou

a receber fórmula especial e não teve mais sangramentos. Aos 2 meses apresentou febre e foi

internado, porém não foi descoberto o foco. Uma semana depois, ainda internado, surgiram

lesões avermelhadas na pele e febre, que piorou com o surgimento de nódulos pelo corpo (coxa

direita, perna esquerda, cotovelo esquerdo, couro cabeludo e local de aplicação da vacina BCG).

Aos 3 meses e meio apresenta bronquiolite e diarreia; é constatada infecção das vias aéreas por

Parainfluenza 3 e Rhinovirus além de hepatoesplenomegalia e diversos nódulos subcutâneos

causados por tuberculose vacinal (positivos para M. bovis), configurando BCGíte disseminada.

Com 6 meses, inicia-se a investigação para IDP e amostras são encaminhadas para

quantificação de TRECs e KRECs e imunofenotipagem (Tabela 17). Com 7 meses é fechado o

diagnóstico de P10 como SCID T-B+NK-, um imunofenótipo normalmente caracterizado por

células T e NK virtualmente ausentes e números normais ou elevados de linfócitos B, que

embora presentes, não produzem imunoglobulinas adequadamente (Pepper et al., 1995).

Paciente 11, J.M.B.F., gêmeo univitelínico de P10. Não teve intercorrências ao

nascimento, diferente do irmão. Porém também apresentou sangue nas fezes com menos de 1

mês, também foi diagnosticado como alergia à proteína do leite de vaca e cessou após a

implementação de alimentação por fórmula. Tomou a vacina BCG no berçário e teve reação

com formação de crosta e posterior queloide, mas não teve supuração no local. Com quase 6

meses foi internado com infecção respiratória positiva para infecção por Parainfluenza 3 e

Rhinovirus, assim como P10. Foi diagnosticado com SCID com base no quadro clínico e

posterior diagnóstico do irmão gêmeo.

71

Tabela 17 - caracterização imunológica dos Paciente 10 e 11

P10 (4m) P10

(7m)

P11

(7m)

Triagem TRECs (cutoff < 25) NR 0 0


sangue) KRECs (cutoff < 20) NR 231 267

Linfócitos totais 1400 * 2749 * 3303 * CD3 43 * 1 * NI CD4 8 * NR NI CD4+CD45RA+CCR7+ (naïve) NR NR NI CD4+CD45RA-CCR7+ (memória central) NR NR NI CD4+CD45RA-CCR7- (memória periférica) NR NR NI

Imunofenotipagem CD4+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) NR NR NI

(células / mm3) CD8 26 * NR NI CD8+CD45RA+CCR7+ (naïve) NR NR NI CD8+CD45RA-CCR7+ (memória central) NR NR NI CD8+CD45RA-CCR7- (memória periférica) NR NR NI CD8+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) NR NR NI CD19 3668 ** 1086 NI CD16+CD56+ 31 * 1 * NI

Imunoglobulinas

(mg / dl)

IgM 14 * NR NR

IgG 129 * 733 # 733 #

IgA < 6 * NR NR

NR = não realizado; NI = não informado. As imunofenotipagens completas de P10 e P11 foram realizadas

pela equipe de transplante, porém não foi possível obter esses dados.

* abaixo do p10 para a idade; ** acima do p90 para a idade # valor com reposição de Igs

Fonte: autora.

Ambos pacientes foram encaminhados para o TCTH e o procedimento foi realizado

aproximadamente 2 meses após o diagnóstico, a partir de doadora haploidêntica (mãe). P10 e

P11 foram a óbito após o transplante, não foi possível obter a causa das mortes.

Após o diagnóstico, iniciou-se a investigação genética, que foi feita por sequenciamento

direto do gene IL2RG, ligado ao X, que é o principal suspeito em casos de meninos classificados

imunologicamente como T-B+NK- (Sugamura et al., 1996). O sequenciamento revelou uma

mutação homozigota missense no exon 2 (c.217A>C), resultando em uma troca Tre73Pro

(Figura 19).

72

Figura 19 – Mutação c.217A>C em IL2RG encontrada no Paciente 10

Fonte: autora.

Não foi encontrado registro na literatura da mutação T73P encontrada em P10, porém

essa alteração foi predita como patogênica por todas as ferramentas utilizadas na análise in

silico (SIFT 0 = patogênico, PolyPhen2 0,997 = patogênico, MutationTaster = patogênico).

Apesar de ter 2 hotspots de mutações patogênicas, existem diversas mutações distribuídas ao

logo de todo o gene IL2RG (Figura 20).

Figura 20 - Estrutura da proteína cadeia γc do receptor de IL-2 e mutações de X-SCID

Fonte: Belmont and Puck, 2018.

73

A troca de resíduo T73P está localizada no domínio CC, em uma região altamente

conservada da proteína (Figura 21), e está justaposta a uma das cisteínas conservadas que dão

nome a esse domínio proteico.

Figura 21 – Conservação entre espécies do domínio CC da proteína γc

Resíduo 73 mutado no paciente indicado pelo retângulo vermelho. Resíduo cisteína conservados indicados

pelas setas em vermelho.

Fonte: autora.

Apesar dessa mutação específica não ter sido registrada ainda, alterações nos resíduos

vizinhos já foram descritas e comprovadas como patogênicas (Puck et al., 1997; Niemela et al.,

2000; Notarangelo et al., 2000); nesses casos, havia mRNA presente, porém total ausência da

proteína na membrana celular. Portanto, é predito que mutações no exon 2, que envolvam ou

estejam justapostas aos resíduos de cisteína, conservados em todas as proteínas da família de

receptores de citocina, interfiram na configuração e função da proteína γc (Puck et al., 1997).

Clinicamente, é comum em pacientes com deficiência da cadeia γc, infecções virais

persistentes, frequentemente associadas a diarreia crônica e atrasos de crescimento (Stepensky

et al., 2018), achados consistentes com a clínica dos pacientes. Somando-se as informações

genéticas à clínica dos pacientes 10 e 11, a alteração T73P encontrada é a provável mutação

causadora do fenótipo de SCID, fechando o diagnóstico de X-SCID.

74

4.11 Análise clínica e investigação genética da Paciente 12

Paciente 12, H.S.S., sexo feminino, primeira filha de pais não consanguíneos, sem relato

de mortes precoces por infecção nas famílias. Apresentava bom ganho pondero-estatural até os

2 meses, quando apresentou infecção respiratória grave e de difícil resolução, causada por vírus

sincicial respiratório (VSR). A partir daí, ocorreram idas frequentes ao pronto-socorro devido

a quadro de desconforto respiratório, com 2 novas internações devido a exacerbação da

condição. Com 3,5 meses é internada novamente, por insuficiência respiratória secundária a

bronquiolite por VSR, com evolução grave com pneumonia; nessa internação é isolado M. bovis

e detectada linfopenia, surgindo a suspeita de uma IDP. Os resultados da investigação

imunológica podem ser vistos na Tabela 18.




sangue) KRECs (cutoff < 20) 73

Linfócitos totais 690 *

CD3 0 *

CD4 0 *

CD4+CD45RA+CCR7+ (naïve) 0 *


CD4+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 0 *

Imunofenotipagem CD4+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 0 *

(células / mm3) CD8 0 *

CD8+CD45RA+CCR7+ (naïve) 0 *


CD8+CD45RA-CCR7- (memória periférica) 0 *

CD8+CD45RA+CCR7- (diferenciação terminal) 0 *

CD19 681 (99%)* CD16+CD56+ 2 (0,3%)*

Dosagem de

Imunoglobulinas

(mg / dl)

IgM 31

IgG 71 *

IgA < 7

IgE < 2

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas = 3-6 meses (P12 com 4m).


Fonte: autora.

Com esses resultados, a paciente foi classificada como um SCID T-B+NK- que, em

pacientes do sexo feminino, é atribuído apenas ao gene JAK3, autossômico recessivo. Esse gene

75

foi sequenciado por Sanger, porém não foram encontradas variantes em homozigose ou

heterozigose composta em sequências codificantes ou próximas às bordas intrônicas.

Após nova discussão com a médica responsável, foi levantada a questão de que a

paciente esteve sob uso praticamente contínuo de corticoides e que isso poderia ter afetado o

resultado dos exames. De acordo com a literatura sobre a triagem neonatal utilizando TRECS

e KRECs, recém-nascidos de mães que usavam continuamente drogas imunossupressoras

possuíam valores de TRECs e KRECs abaixo dos valores de corte (Maraucher et al., 2017;

Barbaro et al., 2017), indicando diminuição do número de linfócitos circulantes; e a linfopenia

desses pacientes normalizava após algumas semanas. Portanto é possível que o uso contínuo de

corticoides de P12 pudesse ter interferido na quantidade de células aferidas. Mesmo assim,

devido à inexistência de células T, a paciente foi referida para o TCTH. No condicionamento

pré-transplante foram retirados os corticoides e P12 manteve-se com ausência de linfócitos T,

e valores baixos de células B (400 células / mm3), porém houve recuperação dos números de

células NK (450 cél. / mm3), revelando o perfil real de P12 como SCID T-B+NK+.

A paciente foi transplantada pouco antes da finalização do estudo e segue bem, em

condicionamento pós-transplante. No caso de pacientes T-B+NK+ existem muito genes

envolvidos e o ideal seria um sequenciamento de nova geração, porém não houve tempo hábil

para a conclusão da investigação genética de P12.

Esse caso ilustra a importância de um acompanhamento longitudinal de pacientes com

suspeita de SCID, porque existem diversos fatores que podem contribuir para o resultado

alterado, como medicações, prematuridade, infecção, defeitos cardíacos e outras anomalias

congênitas (Routes, Verbsky, 2018). O ideal é esperar que certas condições sejam resolvidas

ou melhoradas para uma investigação imunológica adequada.


Paciente 13, B.C.D.S., sexo masculino, primeiro filho de pais consanguíneos (primos

de primeiro grau). Apresentou os primeiros sintomas com 2 meses, com baixo ganho ponderal,

recusa das mamadas e náuseas; foi introduzida fórmula como complemento, porém sem grande

sucesso. Aos 4 meses apresentou nodulação da cicatriz da BCG e adenomegalia axilar no braço

da vacinação, além de bronquiolite (isolados Coronavírus e Metapneumovírus). Aos 5 meses

apresentou diarreia e sangue nas fezes (isolado rotavírus) e continuou apresentando recusa de

76

alimentação apesar da troca de fórmulas. Com 6 meses começaram as investigações de IDP,

cujos resultados podem ser vistos na Tabela 19, abaixo.


Triagem TRECs (cutoff < 25) NR 0

(moléculas / µL de sangue) KRECs (cutoff < 20) NR 137

Linfócitos totais 2480 * 717 *

CD3 1910 (77%) * 17 (2,4%) *

CD4 33 (1,3%) * NR

(células / mm3) CD8 1660 (67%) NR

CD19 435 (18%) * 495 (69%) * CD16+CD56+ 124 (5%) * 50 (7%) *

Dosagem de

Imunoglobulinas

(mg / dl)

IgM 21,1 * NR

IgG 91,9 * NR

IgA NR NR

IgE NR NR

NR = não realizado.

Ambas IFs foram realizadas aos 6 meses de idade, com 2 semanas de diferença entre a 1ª e a 2ª.

Idade de referência para imunofenotipagem e dosagem de imunoglobulinas = 3-6 meses.

* abaixo do p10 para a idade.

Fonte: autora.

P13 também realizou a proliferação de linfócitos após estímulo (feito na UNIFESP,

dados não mostrados), que verificou a ausência de proliferação em relação a controle saudável,

forte indicativo de SCID. Com esse resultado, ele foi classificado como um SCID T-B+NK- e

encaminhado para o TCTH, realizado 3 meses depois (pouco antes da conclusão deste estudo),

a partir de doador não aparentado. O Paciente 13 segue bem, em condicionamento pós-

transplante.

Devido ao perfil T-B+NK- e P13 ser do sexo masculino, foi realizado sequenciamento

direto do gene IL2RG, porém não foram encontradas alterações. Seguiu-se com o

sequenciamento de JAK3, que causaria o mesmo fenótipo, porém também não foram

encontradas alterações em sequências codificantes ou próximo às bordas intrônicas. Como o

paciente estava internado na segunda imunofenotipagem, existe a possibilidade de que isso

possa ter influenciado na diminuição de células, e mascarado a quantidade de células NK.

Porém não foi possível obter informações sobre imunofenotipagens posteriores que possam ter

sido realizadas pela equipe de transplante e não houve tempo hábil para realização de

sequenciamento completo de exoma.

77

4.13 Caracterização dos pacientes SCID

Dos 13 pacientes incluídos neste estudo, a média de apresentação da primeira

manifestação clínica foi de 1,8 meses (mediana = 2; mínimo = 1 dia; máximo = 3 meses). As

manifestações clínicas mais frequentes foram infecções respiratórias (85%), seguidas de

infecções de pele e gastrointestinais (54% dos casos cada), acompanhadas de atraso no

desenvolvimento pondero-estatural (54%) (Figura 22). O perfil das infecções está de acordo

com a literatura, que preconiza que, independentemente do fenótipo imunológico, pacientes

SCID apresentam clínicas similares, incluindo infecções de trato respiratório precoces e graves,

diarreia crônica e falha de crescimento (Notarangelo, 2009).

Figura 22 – Sinais e sintomas dos pacientes estudados

Fonte: autora.

Pacientes com SCID apresentam precocemente pneumonias causada por Pneumocystis

jiroveci, citomegalovírus (CMV), adenovírus, VSR ou vírus parainfluenza tipo 3; além disso, a

maioria dos afetados tem diarreia crônica, que leva à atrasos de crescimento (Notarangelo,

2009). Dermatites podem refletir a reação do enxerto-versus-hospedeiro causada por linfócitos

maternos, que atacam os tecidos do neonato, ou por infiltração de linfócitos autólogos

oligoclonais ativados, frequentemente observados na Síndrome de Omenn (Villa et al., 2008;

Palmer et al., 2007). Todos esses sintomas foram observados na maioria dos pacientes

analisados por esse estudo (Figura 23).

78

Figura 23 – Microrganismos isolados nos pacientes estudados

Fonte: autora.

A maioria dos patógenos isolados foram bactérias (48%), seguidas de vírus (43%), e os

fungos foram os menos frequentes (9%). A reação à vacina BCG ocorreu em apenas 4 casos

(31%), porém a ausência de reação adversa não significa que o patógeno não está presente no

organismo do paciente, o que pode ser visto pelo isolamento de M. bovis em 46% dos pacientes.

Foi reportada consanguinidade em 17% dos pacientes, e outros 17% apresentavam

algum histórico de mortes precoces na família, sendo que apenas a Paciente 6 está em ambos

os grupos e foi a única a ser diagnosticada antes do aparecimento de sintomas graves e

transplantada sem nenhuma infecção ativa. É importante notar que devido ao histórico familiar,

esta foi a única paciente que não apresentou sintomas graves e não recebeu nenhuma vacina

viva atenuada.

Dois dos 13 pacientes possuíam fenótipo de Síndrome de Omenn (15%), contra

aproximadamente 2% encontrados por outros pesquisadores (Kwan et al., 2014). Entretanto, o

valor de 2% foi encontrado em uma população de pacientes que foi identificada por meio da

TN para SCID, enquanto nossos pacientes passaram por longos processos de diagnóstico

baseado em infecções e não em um rastreamento neonatal. Pacientes com SO chamam a atenção

devido à eritrodermia, portanto é possível que mais desses pacientes sejam identificados

corretamente como indivíduos imunodeficientes do que os pacientes com SCID clássica, que

manifestam infecções de repetição apenas.

79

A média de idade no momento do diagnóstico de SCID ou SO foi de 8,1 meses (mediana

= 7; amplitude 1 – 23 m). O que revela um tempo médio entre o primeiro sintoma e o

diagnóstico foi de pouco mais de 6 meses (amplitude 2 – 20 m). Comparação a literatura

mostrou que a idade média de diagnósticos encontrada ficou um pouco acima do esperado,

mesmo tendo como base o único trabalho epidemiológico sobre SCID no Brasil (Mazzucchelli

et al., 2014). O tempo entre os primeiros sintomas e o diagnóstico também foi mais longo do

que as referências tanto de países desenvolvidos (Rozmus et al., 2013; Dvorak et al., 2013)

quanto em países menos desenvolvidos (Mazzucchelli et al., 2014; Pasic et al., 2014).

Três pacientes foram a óbito antes de realizarem o tratamento curativo. Dos 10 que

realizaram (77%), todos tinham mais do que 6 meses de vida e infecções, e apenas metade

sobreviveu ao procedimento. O tempo médio entre o diagnóstico e o transplante foi de pouco

mais de 6 meses (mediana = 4m; amplitude 1 – 23 m).

A sobrevivência global dos 13 pacientes estudados foi de 38%, valor menor do que os

de trabalhos publicados nos Estados Unidos (Puck et al., 2007; Pai et al., 2014), que tiveram

sobrevida de aproximadamente 50% para crianças com mais de 3,5 m e infecções ativas no

momento do transplante. Porém esses estudos são de um país em que atualmente existe a

triagem neonatal universal, portanto é de se esperar que os diagnósticos e tratamentos sejam

realizados mais precocemente e hajam menos sequelas no momento do transplante.

Além disso, existem outros dois fatores que interferem na realização do transplante no

Brasil, a escassez de doadores nos bancos de medula óssea e a falta do diagnóstico genético dos

pacientes com SCID, porque o condicionamento para o transplante muda de acordo com o

defeito genético (Gaspar, 2013), tornando-o mais eficiente para um paciente específico. Por

exemplo, pacientes com Síndrome de Di George completa não possuem timo e, portanto,

precisam de um transplante de timo e não apenas de células-tronco hematopoiéticas (Daguindau

et al., 2008). SCID causada por defeitos de reparo de DNA, como nos genes LIG4 e NHEJ,

tornam o indivíduo altamente sensível à radiação e agentes quimioterápicos, o que pode

influenciar os regimes de condicionamento.

Com esses dados podemos concluir que o processo de diagnóstico e tratamento

adequado de pacientes SCID no Brasil é mais lento do que o esperado. O diagnóstico demorado

é uma ocorrência comum em países sem a triagem neonatal universal e com uma comunidade

médica despreparada para reconhecer e tratar imunodeficiências primárias (Dantas et al., 2015).

Apesar de todos os pacientes estudados terem iniciado sintomas precocemente, a grande

maioria foi internada diversas vezes e passada entre especialistas de diferentes áreas por meses

80

antes de surgir a suspeita de uma imunodeficiência primária. Com isso, a maioria dos casos de

SCID passam desapercebido pelo sistema de saúde.

A investigação genética teve sucesso em 8 dos 13 paciente, revelando 6 mutações em

5 genes de SCID clássica em 6 pacientes (IL7R, RAG2, JAK3, DCLRE1C, IL2RG), 1 mutação

em CD3G, que faz parte do grupo de IDCs, e 2 mutações em CECR1 (ADA2), que atualmente

está no grupo das síndromes auto-inflamatórias (Picard et al., 2018).

Figura 24 – Genes afetados nos pacientes estudados

Fonte: autora.

Em 11 pacientes, foi realizado primeiro o sequenciamento direto dos genes mais

prováveis de estarem afetados de acordo com o imunofenótipo, porém foi possível encontrar a

mutação de apenas 1 dos pacientes desta maneira (9% de sucesso). Nos 8 pacientes em que foi

realizado o exoma, em 5 foram encontradas mutações (62,5%). Esse valor ainda está abaixo do

estudo americano, em que foi possível apontar aproximadamente 75% das mutações em SCID

clássicos e 80% em Leaky SCIDs, que foram identificados por triagem neonatal (Routes,

Verbsky, 2018).

81

Devido ao pequeno número amostral, não é possível afirmar se a distribuição de

mutações encontrada neste estudo reflete a realidade dos pacientes SCID no Brasil. Porém, é

possível que os paciente cujas mutações não foram encontradas no exoma utilizando o filtro

para SCID e IDCs (3/8) possuam defeitos em outros genes de IDPs, que não foram avaliados

pelo presente estudo. Apesar disso, das 9 mutações encontradas, 5 (55,6%) não haviam sido

descritas na literatura, mostrando que a população brasileira pode ter especificidades em relação

a populações de outros países. Contudo, ainda há muito a ser estudado para uma caracterização

fiel da nossa população.

82

5. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Na última década, melhorias no diagnóstico molecular e no sequenciamento de nova

geração tem adicionado mais e mais informações sobre o funcionamento do sistema imune e os

mecanismos patogenéticos das IDPs, melhorando a qualidade de vida dos pacientes. Com o

avanço nas terapias de suportes e nos protocolos de transplante de células-tronco

hematopoiéticas, crianças com SCID tem oportunidade de cura e sobrevivência a longo prazo,

em especial se as morbidades infecciosas forem minimizadas antes do transplante, o qual deve

ser realizado precocemente. Entretanto, em muitos países, o Brasil incluso, o maior problema

é o oferecimento de um serviço completo de detecção precoce, diagnóstico e tratamento

definitivo para esse grupo de pacientes. É necessária uma rede multicêntrica de colaboração

para que surjam estudos sobre epidemiologia, ônus da doença para os pacientes, familiares e o

sistema público de saúde, e desfechos finais. Com esses dados em mãos, pode-se realizar

campanhas de conscientização para profissionais da saúde, promovendo a identificação precoce

e tratamento. Juntamente a isso, é necessário que se estabeleçam instituições de serviço de

referência, protocolos de tratamento e o serviço de aconselhamento genético para os pacientes

e suas famílias (Griffith et al., 2009).

Pesquisas epidemiológicas sobre SCID são difíceis devido ao déficit de diagnóstico e,

consequentemente, ao subregistro. Existem registros multinacionais que tem contribuído muito

para o acúmulo de informações (Guzman et al., 2007; Gathmann et al., 2009) e também para a

caracterização genética de certas populações. Na América Latina possuímos o Registro LASID;

De acordo com o registro referente a maio de 2018 , foram notificados 129 casos de IDPs neste

mês, sendo que 23% foram casos registrados no Brasil, ficando atrás da Argentina, que é

responsável pela notificação de 34% dos casos, e é o membro do LASID que mais notifica IDPs

(http://bragid.org.br/_download/registro/estatisticas_2018_05.pdf). Levando-se em

consideração o tamanho populacional dos dois países – em 2016, o Brasil possuía

aproximadamente 208 milhões de habitantes, contra 44 milhões na Argentina

(http://www.worldbank.org), uma diferença de 4,7 vezes -, é notável que existe um problema

grave de notificação em nosso país, o que reflete um problema de falta de conhecimento médico

para o diagnóstico e também de acessibilidade a exames para o diagnóstico para esses pacientes.

Grande parte desse problema poderia ser sanado com a implementação do teste de triagem

neonatal utilizando os TRECs e KRECs, já disponível em nosso país.

O advento da TN populacional em alguns países vem permitindo com que a real

incidência de SCID venha à tona, caindo de 1:100.000 para 1:58.000 nascidos vivos, segundo

http://bragid.org.br/_download/registro/estatisticas_2018_05.pdf

83

dados americanos (Kwan, Puck, 2015). Graças aos TRECs, crianças com SCIDs atípicas

começaram a ser diagnosticadas. Sem a TN, indivíduos com um espectro heterogêneo de

mutações hipomórficas seriam diagnosticados tardiamente, tendo desenvolvido outras

complicações como autoimunidades, além dos sintomas clássicos de SCID (Felgentreff et al.,

2011).

O aumento no número de casos identificados devido à TN e a evolução nas técnicas de

sequenciamento acabou por permitir a descoberta de novos genes associados à SCID, entretanto

ainda existem muitos casos de pacientes cujas mutações patogênicas permanecem obscuras

(Kwan, Puck, 2015; Routes, Verbsky, 2018). De acordo com o banco de registro de pacientes

com IDP do ESID (Sociedade Europeia de Imunodeficiências Primárias), até o ano de 2008 -

anterior à implementação em massa da TN em alguns países da Europa -, quase 50% dos

pacientes com SCID não tinham defeito genético definido (Gathmann et al., 2009). Mais

recentemente, em um estudo multicêntrico de TN para SCID conduzido em 11 estados

americanos, foram triados mais de 3 milhões de indivíduos e identificados 52 pacientes com

SCID, sendo que o defeito genético foi definido em apenas 77% dos casos, ou seja, mesmo com

todo o avanço tecnológico e científico atual, quase um quarto dos pacientes continua sem o

diagnóstico genético definitivo (Kwan et al. 2014). Evidenciando que nenhum método de

investigação é infalível. Existem mutações profundas em regiões intrônicas e aberrações de

números de cópia de genes que, muitas vezes, não são detectados pelo sequenciamento

completo de exoma (Bucciol et al., 2017).

Como os estudos acima denotam, mesmo em centros de excelência, mutações nem

sempre são identificadas pois ainda existem defeitos genéticos desconhecidos. Dada a

diversidade genética de mutações em SCID, é improvável que o sequenciamento de variantes

únicas de genes específicos seja informativo (Patel et al., 2017) e o sequenciamento por

metodologia de Sanger de todos os genes associados à SCID é laborioso e custoso. O uso de

painéis multigênicos para IDPs já teve sua utilidade demonstrada (Nijman et al., 2014; Moens

et al., 2014), mas possui como limitação importante a inabilidade de detectar defeitos ainda não

descritos. Mesmo com suas limitações, o sequenciamento completo de exoma tem o maior

potencial de fornecer um diagnóstico genético mais rápido e aumentar o espectro de análise de

variantes, o que é particularmente útil em doenças de clínica e genética tão heterogênea como

as IDPs (Al-Mousa et al., 2016; Yang et al., 2013; Yang et al., 2014).

A identificação de uma mutação específica é importante não apenas para a confirmação

do diagnóstico, mas também para guiar o aconselhamento genético, facilitar a identificação dos

indivíduos portadores e o diagnóstico pré-natal, e também oferecer o condicionamento ótimo

84

para o tratamento por TCTH. Entretanto, é importante ressaltar que nem toda mudança no DNA

é necessariamente patogênica; algumas variantes podem representar polimorfismos, variantes

raras ou variantes que contribuem para a doença, mas não são a causa primária. Tais mudanças

podem contribuir para a heterogeneidade dos fenótipos clínicos e imunes associados à SCID e

às IDPs como um todo, o que fazem com que a correlação genótipo-fenótipo dessas doenças

menos estringente (Notarangelo, 2009).

85

6. CONCLUSÕES

Em suma, os resultados do presente estudo mostraram que no Brasil, os pacientes SCID

possuem manifestações clínicas similares aos pacientes do resto com mundo. A idade de início

dos sintomas é similar, assim como os patógenos apresentados. Além disso, independentemente

das manifestações e momento de apresentação da doença, todos foram identificados com

sucesso pela quantificação de TRECs e KRECs. Os genes afetados também foram

correspondentes à literatura, porém apenas 40% das mutações encontradas já haviam sido

descritas na literatura, mostrando que ainda há muito a ser estudado sobre a genética de

pacientes SCID no Brasil. De todos os dados coletados, o que mais chama a atenção é a baixa

sobrevivência global em comparação a outros países. Nossos pacientes ainda são

diagnosticados muito tarde e poucos encontram doadores totalmente compatíveis devido à

escassez de amostras nos bancos de medula óssea, ambos fatores que interferem diretamente

no sucesso do tratamento curativo.

O Brasil evoluiu nas últimas décadas no diagnóstico e tratamento de pacientes com

IDPs. Porém, a investigação genética de pacientes com SCID ainda é muito difícil porque a

esmagadora maioria desses pacientes acabam morrendo antes da possibilidade de identificação

de um defeito genético. Devido ao número de casos notificados, sabe-se que a maioria dos

pacientes vai à óbito sem sequer a suspeita de uma imunodeficiência primária. Após o

diagnóstico, muitos pacientes morrem antes ou logo após o transplante devido a complicações

infecciosas. É necessário o desenvolvimento de programas educacionais voltados para a

comunidade médica e às famílias de pacientes para aumentar a conscientização a respeito da

doença e da importância do estabelecimento da TN para SCID de maneira universal. Apesar de

todos os desafios de um país em desenvolvimento, a existência da triagem neonatal será

fundamental para o avanço no diagnóstico precoce e tratamento de recém-nascidos com SCID,

permitindo assim que esses pacientes possam ser estudados, tratados, e suas famílias

aconselhadas.

86

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95

ANEXO A – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

ESTUDO: Investigação genético-molecular de pacientes portadores de Imunodeficiência Combinada Grave (SCID)

Seu(sua) filho(a) está sendo convidado(a) a participar do presente estudo. O documento abaixo contém todas as informações necessárias sobre a pesquisa que estamos fazendo. Leia atentamente. Caso tenha dúvidas, teremos prazer em esclarecê-las. Se concordar, o documento será assinado e só então daremos início ao estudo. Sua colaboração será muito importante para nós. Mas, se quiser desistir a qualquer momento, isto não causará nenhum prejuízo, nem a você, nem ao(à) seu(sua) filho(a). Eu ......................................................................................................................................... , RG .............................................................. ,

abaixo assinado (a), concordo de livre e espontânea vontade que meu (minha) filho (a) ................................................................ nascido (a) em _____ / _____ /______ , seja voluntário do estudo Investigação genético-

molecular de pacientes portadores de Imunodeficiência Combinada Grave (SCID). Declaro que obtive todas as informações necessárias e que todas as minhas dúvidas foram esclarecidas. Estou ciente de que: I) O estudo é necessário para que possamos descobrir as possíveis causas genéticas e orientar melhor tratamento de pacientes com Imunodeficiência Combinada Grave. Quando diagnosticadas precocemente, muitas doenças podem ser tratadas antes de apresentar complicações e isto pode melhorar a qualidade de vida da criança; II) Será feita uma coleta de 5 mL a 10 mL de sangue de uma veia do braço do(a) meu(minha) filho(a) para realizar exames de laboratório e/ou uma coleta de 5 mL de sangue de uma veia do(a) meu(minha) filho(a)o para usar o DNA e descobrir defeitos genéticos que podem causar a Imunodeficiências Combinada Grave. III) Os riscos da coleta de sangue são hematoma local (rouxidão), algum desconforto e, raramente, tontura; IV) A participação neste estudo não tem fins terapêuticos e será sem custo algum para mim; V) Tenho a liberdade de desistir ou interromper a colaboração neste estudo no momento em que desejar, sem necessidade de dar qualquer explicação; V) A desistência não causará nenhum prejuízo a mim, nem (a) meu (minha) filho (a), nem interferirá no atendimento ou tratamento médico a que ele (ela) estiver sendo submetido; VI) Os resultados obtidos durante este estudo serão mantidos em sigilo, mas concordo em que sejam divulgados em publicações científicas, desde que nem o meu nome, nem o de meu filho sejam mencionados; VII) Caso eu deseje, poderei tomar conhecimento dos resultados ao final deste estudo; VIII) Poderei entrar em contato com a Secretaria da Comissão de Ética em Pesquisa com Seres Humanos – ICB/USP - no Fone 3091.7733 (e-mail: [email protected]) ou com Lucila Akune Barreiros no tel. 3091-7435 para recursos ou reclamações em relação ao presente estudo. IX) Concordo que o material possa ser utilizado em outros projetos desde que autorizado pela Comissão de Ética deste Instituto e pelo responsável por esta pesquisa. Caso minha manifestação seja positiva, poderei retirar essa autorização a qualquer momento sem qualquer prejuízo a mim ou ao meu (minha) filho (a). ( ) Sim ou ( ) Não X) O sujeito de pesquisa ou seu representante, quando for o caso, deverá rubricar todas as folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE– apondo sua assinatura na última página do referido Termo. XI) O pesquisador responsável deverá da mesma forma, rubricar todas as folhas do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido – TCLE– apondo sua assinatura na última página do referido Termo. XII) Resolução 196/96 – Estou recebendo uma cópia deste Termo de Consentimento Livre e Esclarecido; OBS: Assinalar abaixo com (x): ( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa. ( ) Não desejo conhecer os resultados desta pesquisa.

São Paulo, de de 20...... ( ) Paciente / ( ) Responsável ________________________________________________________________ Testemunha 1 _________________________________________ Testemunha 2 _____________________________________________ Nome / RG / Telefone Nome / RG / Telefone Responsável pelo Projeto: ________________________________________ LUCILA AKUNE BARREIROS

96

Gen

eLocus

MA

FR

efer

ênci

aG

enó

tip

oL

oca

lR

azão

alé

lica

Tro

ca d

e b

ase

Tro

ca d

e A

Aef

eito

d

bS

NP

Co

men

tári

os

AK2

chr1

:334

7635

3-

CC

/Tdo

wns

tream

C=6

5, T

=27

--

-rs

6659

9471

AK2

chr1

:334

7646

8-

GG

/Ado

wns

tream

G=2

6, A

=35

--

--

AK2

chr1

:334

7647

4-

TT

AAT

A/T

Ado

wns

tream

TT

AA=0

, T=0

,

TA=

43, T

AAA=

0-

--

-

PT

PR

Cch

r1:1

9870

0725

0.00

1 (r

ef)

GG

/Tin

troni

cG

=44,

T=2

3-

--

rs18

4611

086

SN

P

IL7R

chr5

:358

6753

9-

GA/

Aex

on 3

G=4

, A=4

3c.

353G

>Ap.

Cys

118T

yrm

isse

nse

rs19

3922

641

mut

ação

pat

ogên

ica

(Gili

ani e

t al.,

200

5

; Gili

ani e

t al.,

200

6 ; B

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l., 2

007;

Mar

quar

dt e

t al 2

016

)

PR

KD

Cch

r8:4

8772

402

0.00

6 (r

ef)

AA/

Gin

troni

cA=

17, G

=18

--

-rs

8178

140

PR

KD

Cch

r8:4

8802

690

-T

ATA

T/T

intro

nic

TAT

A=12

, T=5

2-

--

rs36

1033

07

rs37

0814

055

rs66

6565

26

rs71

8753

62

Arte

fato

da

refe

rênc

ia d

o Io

nRep

orte

r

(SN

P; M

AF =

0,3

-0,4

)

RAG

1ch

r11:

3659

6027

-AG

GG

GG

CAA

GG

GG

C/

AGG

GG

Cex

on 2

AAG

GG

GC

=9,

AGG

GG

C=7

1

c.11

74G

>A,

c.11

74de

lG

p.G

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2Arg

,

p.Ar

g394

fs

mis

sens

e,

fram

eshi

ft

Arte

fato

- se

quên

cia

igua

l a D

NA

cont

role

no

San

ger

LCK

chr1

:327

4036

60.

018

(ref

)G

G/A

exon

3G

=94,

A=1

10c.

134G

>Ap.

Arg4

5Gln

mis

sens

ers

1450

8810

8

RF

X5

chr1

:151

3156

32C

C/T

exon

11

C=1

05, T

=89

c.88

1G>A

p.Ar

g294

Gln

mis

sens

e

MS

T1

chr3

:497

2236

0A

A/G

intro

nic

A=27

5, G

=85

LRB

Ach

r4:1

5123

6830

0.00

8 (r

ef)

CC

/Tin

troni

cC

=18,

T=1

4rs

1154

3323

3

LRB

Ach

r4:1

5150

4012

0.00

4 (r

ef)

CC

/Tin

troni

cC

=58,

T=4

7rs

1153

1656

5

DO

CK

2 /

FAM

196B

chr5

:169

3104

070.

003

(ref

)C

C/G

exon

2C

=34,

G=4

0c.

496G

>Cp.

Val1

66Le

um

isse

nse

rs14

9156

890

DO

CK

8ch

r9:3

0462

80.

002

(ref

)G

G/A

exon

5G

=44,

A=2

9c.

452G

>Ap.

Arg1

51G

lnm

isse

nse

rs14

9918

318

DO

CK

8ch

r9:4

2217

1A

A/G

intro

nic

A=52

, G=3

5rs

3689

6525

4

DO

CK

8ch

r9:4

3214

0C

TT

TC

ATC

/CT

intro

nic

CAT

C=8

, CT

=18

rs34

4396

75

rs79

6804

07

NO

P10

/

NU

TM

1ch

r15:

3463

5241

0.00

3 (r

ef)

CC

/Gup

stre

amC

=45,

G=5

8c.

34G

>Cp.

Asp1

2His

mis

sens

ers

1462

6163

1

ST

AT3

chr1

7:40

4770

640.

009

(ref

)C

C/G

exon

16

C=1

31, G

=103

c.13

81G

>Cp.

Val4

61Le

um

isse

nse

rs14

9214

040

AK2

chr1

:334

7635

3C

C/T

dow

nstre

amC

=22,

T=1

1rs

6659

9471

PR

KD

Cch

r8:4

8697

901

AA/

Gin

troni

cA=

10, G

=10

rs56

2608

936

PR

KD

Cch

r8:4

8805

837

0.0

(ref

)C

C/T

exon

31

C=4

1, T

=35

c.37

09G

>Ap.

Ala1

237T

hrm

isse

nse

rs19

1531

119

Anál

ise

in s

ilico

: pro

vave

lmen

te b

enig

no

DO

CK

2ch

r5:1

6930

9687

0.0

(ref

)G

G/A

intro

nic

G=2

1, A

=12

rs18

7220

094

TAP

2ch

r6:3

2798

229

GG

/Cin

troni

cG

=65,

C=6

1nã

o co

ndiz

fenó

tipo

CIIT

Ach

r16:

1099

5933

AG

/Gex

on 7

A=1,

G=3

9c.

520A

>Gp.

Arg1

74G

lym

isse

nse

rs80

4612

1Ar

tefa

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o Io

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Seq

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stá

cada

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PA

CIE

NT

E 1

PA

CIE

NT

E 2

ANEXO B – resultados dos sequenciamentos de exoma

97

AK2

chr1

:334

7635

3C

C/T

dow

nstre

amC

=102

, T=2

2rs

6659

9471

AK2

chr1

:334

7646

8G

G/A

dow

nstre

amG

=54,

A=4

3

AK2

chr1

:334

7647

4T

TA

T/T

dow

nstre

amT

=87

PR

KD

Cch

r8:4

8802

690

TAT

AT

ATA/

Tin

troni

cT

ATA=

60, T

=39

rs36

1033

07

rs37

0814

055

rs66

6565

26

rs71

8753

62

Arte

fato

da

refe

rênc

ia d

o Io

nRep

orte

r

(SN

P c

om M

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0,3

-0,4

no

1000

geno

mes

fase

3)

PR

KD

Cch

r8:4

8845

457

TT

/Ain

troni

cT

=18,

A=2

9

ADA

chr2

0:43

2489

13T

T/C

intro

nic

T=1

28, C

=88

TN

FR

SF

4ch

r1:1

1474

67G

G/C

exon

5G

=19,

C=2

5c.

489C

>Gp.

Asp1

63G

lum

isse

nse

44Ar

tefa

to -

refe

rênc

ia c

adas

trada

err

ado

ICO

Sch

r2:2

0482

4182

TT

/Ain

troni

cT

=20,

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7

DO

CK

8ch

r9:3

9672

7C

C/T

intro

nic

C=8

9, T

=83

DO

CK

8ch

r9:4

3214

0C

TT

TC

ATC

/CT

intro

nic

CAT

C=9

, CT

=30

rs34

4396

75

rs79

6804

07

RF

XAP

chr1

3:37

3939

040.

007

(ref

)T

T/C

exon

1T

=49,

C=4

2c.

410T

>Cp.

Met

137T

hrm

isse

nse

rs19

3240

312

MAL

T1

chr1

8:56

4145

65G

G/T

intro

nic

G=2

9, T

=13

AK2

chr1

:334

7635

3C

C/T

dow

nstre

amC

=72,

T=1

5rs

6659

9471

MS

T1

chr3

:497

2354

3C

C/T

exon

9C

=83,

T=6

2c.

1099

G>A

p.Al

a367

Thr

mis

sens

e

IL21

chr4

:123

5370

900.

01 (r

ef)

GG

/Ain

troni

cG

=34,

A=3

0rs

4127

8091

DO

CK

8ch

r9:4

3214

0C

TT

TC

ATC

/CT

intro

nic

CAT

C=8

, CT

=14,

CT

T=8

rs34

4396

75

rs79

6804

07re

gião

intrô

nica

pol

iT -

prov

ável

arte

fato

AK2

chr1

:334

7635

3C

C/T

dow

nstre

amC

=104

, T=2

6rs

6659

9471

RA

G2

chr1

1:36

6149

68C

TG

CT

G/C

exon

2C

TG

=64,

C=8

7c.

749_

750d

elC

Ap.

Thr

250f

sfra

mes

hift

prov

avel

men

te p

atog

ênic

a

RA

G2

chr1

1:36

6150

33C

C/T

exon

2C

=90,

T=7

2c.

686G

>Ap.

Arg2

29G

lnm

isse

nse

rs12

1917

894

mut

ação

pat

ogên

ica

(Sch

war

z et

al,

1996

; Cor

neo

et a

l, 20

01)

PN

Pch

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2093

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ef)

GG

/Aut

r_5

G=8

3, A

=82

rs17

8812

06

PN

Pch

r14:

2094

0449

0.00

3 (r

ef)

AA/

Tin

troni

cA=

38, T

=29

rs11

7497

269

JAK

3ch

r19:

1794

8998

AA/

Gin

troni

cA=

161,

G=1

58

CD

8Ach

r2:8

7018

022

0.00

3 (r

ef)

CC

/Gut

r_5

C=3

1, G

=33

rs36

2271

95

DO

CK

2ch

r5:1

6909

6392

CC

/Gin

troni

cC

=27,

G=3

2

CAR

D11

chr7

:298

7113

0.00

5 (r

ef)

AA/

Tin

troni

cA=

88, T

=116

rs41

3484

45

DO

CK

8ch

r9:3

7214

0A

A/G

intro

nic

A=18

, G=1

8rs

3765

1174

2

DO

CK

8ch

r9:3

9927

5A

A/AC

intro

nic

A=19

, AC

=25

rs38

3117

4

DO

CK

8ch

r9:4

3214

0C

TT

TT

CAT

CT

/CT

Tin

troni

cC

ATC

T=9

, C=8

,

CT

T=1

1rs

3443

9675

PA

CIE

NT

E 5

PA

CIE

NT

E 3

PA

CIE

NT

E 4

98

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7635

3C

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T=1

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1ch

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GG

GC

AGG

GG

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GG

GG

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GG

GC

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GG

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4624

49

CAR

D11

chr7

:297

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cG

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5rs

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r16:

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GG

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KD

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AT

ATA/

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chr1

:151

3163

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)C

C/T

exon

9C

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3c.

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:156

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011

(ref

)G

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intro

nic

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9686

77

IL21

Rch

r16:

2745

7265

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5 (r

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CC

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cC

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)C

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1181

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/Cin

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NT

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exo

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trio

100

APÊNDICE - artigos originais publicados em periódicos

lucila akune barreiros investigação genético-molecular de

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