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Luciana de Lourdes Souza
“ESTUDO DO REPARO DAS LESÕES INDUZIAS
PELA RADIAÇÃO UVB (UVB) NO DNA DE
Escherichia coli E Saccharomyces cerevisiae”
TESE SUBMETIDA À UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO
DE JANEIRO VISANDO A OBTENÇÃO DO GRAU DE
DOUTOR EM CIÊNCIAS
Universidade Federal do Rio de Janeiro Centro de Ciências da Saúde Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho 2 0 0 9
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Ficha Catalográfica
Souza, Luciana de Lourdes Estudo do Reparo das lesões induzidas pela radiação Ultravioleta B (UVB) no DNA de Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae. Rio de Janeiro, UFRJ, IBCCF, 2009. x..., 94f.
Tese: Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica)
1. Reparo 2. Ultravioleta B
3. DNA 4. Lesão
5. Tese
I Universidade Federal do Rio de Janeiro
II Título
Este trabalho foi desenvolvido sob orientação dos professores Alvaro Augusto da
Costa Leitão e Marcelo de Pádula no Laboratório de Radiobiologia Molecular do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de
Janeiro, com auxílios concedidos por: CNPq (Conselho Nacional d
Desenvolvimento Científico e tecnológico), FINEP (Financiadora de Estudos e
Projetos), FAPERJ (Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio de Janeiro), PRONEX (Programa de Núcleos de Excelência) e
CEPG-UFRJ (Conselho de Ensino para Graduados da Universidade Federal do
Rio de Janeiro).
Tua caminhada ainda não terminou A realidade te acolhe
dizendo que pela frente o horizonte da vida necessita
de tuas palavras e do teu silêncio.
Se amanhã sentires saudades,
lembra-te da fantasia e sonha com tua próxima vitória.
Vitória que todas as armas do mundo jamais conseguirão obter...
É certo que irás encontrar situações
tempestuosas novamente, mas haverá de ver sempre
o lado bom da chuva que cai e não a faceta do raio que destrói.
Não faças do amanhã o sinônimo de nunca,
nem o ontem te seja o mesmo que nunca mais.
Teus passos ficaram. Olhes para trás... mas vá em frente
pois há muitos que precisam que chegues para poderem seguir-te.
- Charles Chaplin –
Agradecimentos
Por tudo o que tens feito...
Por tudo que vais fazer...
Por tuas promessas e tudo que és
Eu quero te agradecer com todo o meu ser.
Te agradeço Senhor.
“Quando tudo diz que não tua voz me encoraja a prosseguir...”.
Ao meu pai, por ter em vida transmitido importantíssimos ensinamentos como:
enfrentar as dificuldades e não desanimar. Obrigada por ter construído a minha
base para que eu possa construir os degraus.
À minha mãe Lourdes e meu padrasto Messias por sempre me incentivarem.
Às minhas irmãs Renata, Jessica e meu cunhado Elber por acreditarem em
mim.
Às minhas tias Maria e Ivanilda por todo amor e cuidado dados a mim.
A minha amiga e praticamente irmã gêmea, Ivy Ribeiro por estar do meu lado
em todos os momentos da minha vida.
Aos meus orientadores Alvaro Leitão e Marcelo de Pádula, pelos
ensinamentos, orientação, mas principalmente pela paciência e confiança dadas
desde a minha iniciação científica.
A todos os amigos do Laboratório de Radiobiologia Molecular: Barbara pelo
carinho que tem comigo, Claudia Lage por transmitir “ricos” conhecimentos,
Janine por ter aberto as portas da pesquisa para mim, Rita pela amizade,
companheirismo e agradáveis conversas, Roberto pelo amigo que sempre
demonstrou ser desde a faculdade, Tatiana por sempre me dar força nos
momentos de insegurança, Claudia Ribeiro, Elder, Eliza, Gabriel, Glória, Ivan,
Larissa, Léo, Marcus, Mariana, Tula e Viviana pela preciosa amizade no dia a dia
de trabalho.
Siglas e Abreviaturas
ºC- graus Celsius
AP- apurínico ou apirimidínico
ATP- adenosina tri-fosfato
BER- reparo por excisão de base
Can- canavanina
DIP- dipiridil (2,2’-Bipyridyl)
DL- Dose Letal
DNA- ácido desoxirribonucléico
E. coli- Escherichia coli
Endo- endonuclease
ERO- espécies reativas de oxigênio
Exo- Exonuclease
g- grama
h- hora
J- Joules
L- litro
Lac- Lactose
LB- meio rico de crescimento bacteriano
M9- tampão para diluição de células
mg- miligrama
min- minuto
mL- mililitrp
mM- milimolar
µg- micrograma
µL- microlitro
nm- nanômetro
NIR- reparo por incisão de nucleotídeo
NUV- near UV, UV longo
O2•- radical superóxido
OH•- radical hidroxila
Rif- rifampicina
RNA- ácido ribonucléico
S. cerevisiae- Saccharomyces cerevisiae
SOD- Superóxido Dismutase
UFC- Unidade formadora de colônia
UV- Ultravioleta
UVA- Ultravioleta A
UVB- Ultravioleta B
UVC- Ultravioleta C
%- porcentagem
Resumo
O espectro da radiação eletromagnética está dividido em três regiões do
comprimento de onda: ultravioleta (UV), visível e infravermelho. A radiação UV
está dividida em três seções, cada uma com distintos efeitos biológicos: UVA
(320-400 nm), UVB (290-320 nm) e UVC (200-290 nm). O comprimento de onda
do espectro solar que corresponde ao UVB é absorvido pela pele, produzindo
eritema, queimaduras e eventualmente câncer de pele.
A luz UVB estimula a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO). ERO
são importantes mensageiros na indução de vários genes em diversas condições
fisiológicas e patológicas. UVB induz lesões oxidativas e não oxidativas. O
mecanismo de reparo por excisão de bases tem um importante papel no reparo de
lesões oxidativas.
Exo III e Endo IV apresentam importante papel no reparo por excisão de bases
(BER) de Escherichia coli. Ambas possuem atividade AP endonucleolítica
clivando a ligação 5’ fosfodiéster adjacente ao sítio abásico espontâneo ou
induzido. Mutantes deficientes na Exo III (xthA) são hipersensíveis a agentes
oxidantes como por exemplo peróxido de hidrogênio, UV longo e UV médio,
raios X, enquanto que mutantes deficientes em nfo não são sensíveis como a cepa
xthA. Nós avaliamos a sensibilidade e mutagênese das cepas xthA e nfo após
tratamento com UVB e comparamos com UVC. O uso do quelante de Fe+2
(dipiridil) antes da irradiação protegeu completamente o mutante xthA dos efeitos
letais do UVB, sugerindo a geração de lesões oxidativas tóxicas, via reação por
metal de transição. A cepa nfo apresentou aumento na mutagênese induzida por
UVB. Este aumento foi significativamente suprimido pelo pré - tratamento com
dipiridil. Entretanto, a cepa xthA não apresentou aumento de mutagênese após
tratamento com UVB e UVC. Após a irradiação com UVB o espectro de
substituição de base da cepa nfo, revelou aumento de transição AT→GC e aumento
de transversão CG→GC, este aumento é suprimido após o pré – tratamento com
quelante de Fe+2.
Em Sacharomyces cerevisiae, as AP endonucleases codificadas pelos genes APN1
e APN2 participam do reparo de sítios abásicos. A Endo IV de E. coli é similar à
proteína Apn1 de Sacharomyces cerevisiae. A segunda família de classe II das AP
endonuclease inclui exonuclease III (Exo III) de E. coli, cuja proteína similar é
Apn2 de S. cerevisiae. Nossos resultados revelaram aumento na mutagênese para
a cepa apn1 após tratamento com UVB. Este aumento foi significativamente
suprimido após o pré – tratamento com dipiridil. O mesmo foi observado com o
gene similar de E. coli. Com base nas diferenças de sensibilidade e mutagênese
para UVB e UVC nós propomos um importante papel de ExoIII e Endo IV de E.
coli assim como para Apn1 e Apn2 de S. cerevisiae no reparo de lesões oxidativas
geradas pelo UVB.
Abstract
The spectrum of electromagnetic radiation is divided into three main regions of
wavelengths: ultraviolet (UV), visible and infrared. The UV radiation is divided into three
sections, each one producing distinct biological effects: UVA (320-400 nm), UVB (290-
320 nm) and UVC (200-290 nm). UVB wavelengths are absorbed by the skin, producing
erythematic lesions, burns, and eventually skin cancer.
UVB light stimulates the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are
important messengers for the induction of several genes in a variety of physiological and
pathological conditions. UVB induces non oxidative and oxidative lesions. Base excision
repair (BER) has an important role in the repair of oxidative lesions.
Exonuclease III (Exo III) and endonuclease IV (Endo IV) play a critical role in the
base excision repair (BER) of Escherichia coli. Both are endowed with AP endonucleolytic
activity, cleaving the 5’ phosphodiester bond adjacent to spontaneous or induced abasic
sites in DNA. Although mutants defective in Exo III (xthA) are usually hypersensitive to
oxidative agents such as hydrogen peroxide, near-UV-light and X rays, mutants defective in
Endo IV (nfo) are not as sensitive as the xthA strain. We evaluated the sensitivity and
mutagenesis of xthA and nfo strains after UVB treatment and comparison with
UVCirradiation. The use of Fe+2 ion chelator (dipyridyl), prior to irradiation, completely
protected the xthA mutant against UVB lethal lesions, suggesting the generation of toxic
oxidative lesions mediated by transition metal reactions. Although xthA strain did not
display increased mutagenesis after UVC and UVB treatments. After UVB irradiation, the
base substitution spectra of nfo strain revealed a bias towards AT→GC transitions and
CG→GC transversions, which were also suppressed by previous treatment with the iron
chelator. In Sacharomyces cerevisiae, the AP endonucleases encoded by the APN1 and
APN2 genes provide alternate pathways for the removal of abasic sites. The endonuclease
IV of E. coli is similar to the Apn1 protein of Sacharomyces cerevisiae. The second family
of class II AP endonucleases includes exonuclease III (Exo III) of E. coli, which
similar is the Apn2 protein of S. cerevisiae. Our results with yeast revealed the apn1 strain
displayed increased UVB induced mutagenesis, which was significantly suppressed by pre-
treatment with dipyridyl. The same was observed to similar gene in E. coli. In sum, based
on the differential sensitivities and mutational spectra displayed after UVC and UVB
treatments, we propose a role for Endo IV and Exo III to counteract DNA damage induced
by the oxidative counterpart of UVB in Escherichia coli as to Apn1 and Apn2 in
Sacharomyces cerevisiae.
ÍNDICE
1-Introdução........................................................................................................................01 1.1- Radiação Ultravioleta....................................................................................................01 1.1.2- Lesões induzidas pelas Radiações UV........................................................................04 1.1.3- UV e câncer de pele....................................................................................................06 1.2- Fototerapia.....................................................................................................................09 1.2.1- Fotobiologia................................................................................................................10 1.3- Mutagênese....................................................................................................................12 1.4- Estresse Oxidativo.........................................................................................................14 1.4.1- Oxidação de lipídeos..................................................................................................15 1.5- Principais Mecanismos de Reparo.................................................................................17 1.5.1- Reparo por Excisão de Bases......................................................................................17 1.5.1.1- DNA-N- glicosilase.................................................................................................18 1.5.1.2- AP endonuclease relevantes neste trabalho.............................................................21 1.5.1.2.1- Exonuclease III.....................................................................................................21 1.5.1.2.2- Endonuclease IV...................................................................................................23 1.5.2- AP endonucleases de leveduras..................................................................................26 1.5.2.1- Apn1.........................................................................................................................26 1.5.2.2- Apn2.........................................................................................................................26 1.5.3- Reparo por Incisão de Nucleotídeos...........................................................................27 2-Objetivos...........................................................................................................................29 3- Material e Métodos.........................................................................................................30 3.1- Cepas utilizadas.............................................................................................................30 3.1.1- Manutenção das cepas................................................................................................32 3.1.2- Obtenção das culturas para os experimentos..............................................................33 3.2- Meios de cultura e tampões para bactéria......................................................................34 3.2.1- Meio Seletivo para Mutagênese Lactose....................................................................35 3.3- Meios de cultura para levedura......................................................................................36 3.4- Construção de cepas.......................................................................................................36 3.5- Competência e transformação bacteriana......................................................................38 3.6- Sobrevivência e mutagênese bacteriana........................................................................39 3.7- Sobrevivência e Mutagênese de leveduras....................................................................41 3.8- Lipoperoxidação (TBARS)............................................................................................42
4- Resultados........................................................................................................................44 5.1- Resultados com bactéria................................................................................................44 5.1.1- Mutagênese induzida pela radiação UVB...................................................................47 5.1.2- Resultados com TBARS (Lipoperoxidação)..............................................................58 5.2- Resultados com levedura...............................................................................................60 5.2.1- Resultados de Mutagênese..........................................................................................65 5-Discussão...........................................................................................................................70 6-Conclusão..........................................................................................................................78 6.1- Comclusões-Bactéria.....................................................................................................78 6.2- Conclusões-Levedura.....................................................................................................79 7-Perspectiva........................................................................................................................80 8- Referências Bibliográficas..............................................................................................81 9-Anexo.................................................................................................................................94
1-Introdução
1.1-Radiação Ultravioleta
→→→→ Histórico
Em 1801, a radiação ultravioleta foi descoberta pelo físico Johannw Wilhelm Ritter.
Ao fazer a dispersão de um feixe de luz visível através de um prisma, ele deslocou uma
chapa fotográfica ao longo do espectro obtido e demonstrou que em uma região situada
acima do violeta, ou seja, de maior energia, ocorria maior enegrecimento da chapa
fotográfica. Devido ao fato desta região do espectro ser mais energética do que a do violeta,
Ritter denominou-a de ULTRAVIOLETA.
→→→→ Definição e Considerações
A radiação ultravioleta é uma radiação eletromagnética não ionizante para
moléculas biológicas, que ao ser absorvida pelas substâncias químicas produz excitação dos
elétrons dos átomos e moléculas, produzindo, como conseqüência, quebras de ligações
químicas modificação de moléculas, etc (Pfeifer et al., 2005).
A radiação ultravioleta apresenta três denominações em função do comprimento de
onda. A faixa de comprimento de onda que compreende 320-400 nm é classificada como
UVA, entre 290-320 nm é classificada como UVB e a faixa de 190-290 nm é denominada
UVC ou UV germicida (Pfeifer et al., 2005).
A luz solar está envolvida no surgimento de câncer de pele e diversas evidências
experimentais indicam que dentre os comprimentos de onda da radiação solar que
atravessam a camada de ozônio, o responsável pela carcinogênese na pele é o UVB,
contudo os mecanismos envolvidos no reparo das lesões e na indução de mutações que
causam câncer de pele induzido por esta faixa de comprimento de onda ainda não foram
completamente esclarecidos (Armstrog & Kunz, 1990). De fato, desordens humanas como
o xeroderma pigmentosum; que conduzem ao câncer de pele entre outros, estão
correlacionadas com defeitos no reparo de lesões induzidas por UV (Armstrog & Kunz,
1990).
As macromoléculas de DNA absorvem, com maior intensidade, na região UVC
entre 240 e 280 nm. Há alguns anos atrás, foi detectado que o UVC poderia ocasionar
mutações e letalidade através da absorção da radiação pelos ácidos nucléicos (Eisenstark,
1987). Todavia, a região que compreende UVA e UVB é absorvida com menor intensidade
pelos ácidos nucléicos e proteínas, e consequentemente, a absorção por outros cromóforos
torna-se relativamente importante (Eisenstark, 1987).
A letalidade mediada pelas radiações UVA e UVB não é totalmente devida a danos
diretos no DNA, mas sim por dependência do oxigênio (Eisenstark, 1989). Isto sugere que
os efeitos das radiações UVA e UVB podem envolver espécies reativas de oxigênio (ERO),
como peróxido de hidrogênio (H2O2), oxigênio singleto (1O2), radical superóxido (O2·-
) e
radical hidroxil (OH•), todas estas espécies são tóxicas para a célula (Shennan et al., 1996).
O comprimento de onda ideal para estudar os efeitos que possivelmente estão
envolvidos com câncer de pele seria na região do UVC, o comprimento de onda de 260 nm,
já que é nessa faixa que ocorre o pico de absorção dos ácidos nucléicos. Entretanto, a
camada de ozônio que envolve o planeta filtra com bastante eficiência o UVC, permitindo
apenas a passagem do UVB e UVA, caracterizando-os, com relação ao que atinge a
superfície terrestre como UV solar ou NUV (near UV) (Eisenstark, 1987).
A radiação NUV pode ter influências em vários sistemas biológicos como
microrganismos, plantas e animais.
Diferentes estudos indicam que os comprimentos de onda mais eficientes na geração
de carcinogênese e eritema na pele humana compreendem a faixa de 290-320 nm, portanto
UVB. Há fotoprodutos produzidos por estes comprimentos de onda diferentes daqueles
produzidos pelo UVC e, além disso, estas radiações podem atuar em outros sítios além do
DNA, como a membrana celular (Brash, 1988).
Os mecanismos de ação da radiação são bastante diferentes quanto aos efeitos
celulares, assim sendo, a resposta a estes agentes é provavelmente bastante complexa, pois
várias moléculas de importância biológica podem ser atingidas. Deve-se ressaltar, porém,
que o DNA e os mecanismos de reparo que resguardam sua integridade devem ser os alvos
mais importantes para o comprometimento da viabilidade celular (Brash, 1988).
Na figura 1 está representado o espectro das diferentes radiações destacando a
radiação UV.
Figura 1: Espectro de diferentes radiações.
100 150 200 250 300 350 400
Raios - X Luz Visível
Radiação Ultravioleta
UVC UVB UVA
1.1.2- Lesões induzidas pelas Radiações UV
A radiação UVC é conhecida como sendo capaz de induzir principalmente dímeros
ciclobutano de pirimidina (CPD), além de fotoprodutos do tipo 6-4. A dimerização ocorre
principalmente entre timinas (T^T) e em menor proporção entre timinas e citosinas (T^C) e
entre citosinas (C^C), além disso, a dimerização é fortemente influenciada pelas seqüências
adjacentes. CPDs são formados entre as ligações 5,6 de duas pirimidinas adjacentes e os
fotoprodutos são formados por ligações instáveis entre os carbonos 6,4 de bases vizinhas.
Destas as que se formam com maior freqüência são 5’TC e 5’ CC, no entanto, estes
fotoprodutos se formam em níveis menores quando comparados aos CPDs (Pfeifer et al.,
2005). Em quantidades mais restritas, a radiação UVC de 254 nm também pode induzir
hidratos de pirimidina (Sage, 1993).
A radiação UVB pode induzir a formação de dímeros de pirimidina em menor
proporção do que a radiação UVC, se compararmos doses iguais de cada radiação. A
formação de fotoprodutos 6,4 existe igualmente assim como uma fotoisomerização
concomitante destas lesões gerando os fotoprodutos de Dewar (Taylor & Cohrs, 1987.,
Sage, 1993).
O UVA pode induzir CPDs no DNA e, também através de mecanismos indiretos,
pode promover a formação de radicais oxigenados que reagem com o DNA, levando à
formação de bases oxidadas, podendo gerar quebras, ligações DNA-proteína, hidratos, etc
(Pfeifer et al., 2005). Esta produção de radicais ocorre através da participação de moléculas
fotossensibilizadoras, presentes na própria célula ou de moléculas exógenas, capazes de
captar a energia fotônica e de transferi-la para outras moléculas (como a água ou oxigênio,
por exemplo) que vão poder causar lesões na célula. A este fenômeno damos o nome de
fotossensibilização (Piette et al., 1986).
Os CPDs são produzidos em frequência três vezes maior que os fotoprodutos 6-4
(Tornaletti & Pfeifer, 1996). Ambas as lesões ocorrem mais frequentemente em resíduos
pirimidínicos conhecidos como ‘hot spots’ de mutações induzidas por UV (Kanjilal &
Ananthaswamy, 1996). Embora ambas as lesões sejam potencialmente mutagênicas, os
CPDs são considerados os maiores contribuidores de mutações em mamíferos (Matsumura
& Ananthaswamy, 2003); fotoprodutos 6,4 são reparados muito mais rapidamente que os
CPDs em células de mamíferos (Mitchell & Nairm, 1989).
Se não reparadas, as lesões induzidas por UV podem aumentar as mutações nas
sequências de DNA. Estas mutações são transições de C→T e CC→TT. A regra do “A” tem
explicado o aumento das mutações a partir das lesões induzidas por UV (Tessman et al.,
1992). De acordo esta regra, a DNA polimerase insere adenina (A) em frente à lesão que
não pode ser interpretada. O dímero TT não resulta em mutação, pois A normalmente é
pareado com T. Entretanto, com CPDs CC, uma transição dupla CC→TT ocorre pois dois
resíduos de A são colocados opostos ao dímero no lugar de dois resíduos de guanina
(Kanjilal & Ananthaswamy, 1996).
Sabe-se que UVA não induz significativamente transições C→T e CC→TT, estas
mutações são específicas para UVB e não se verificam transversões T→G (Pfeifer et al.,
2005) como pode ser visto na figura 2.
G→C+C→G
G→T+C→A
G→A+C→T
GG→AA+CC→TT
T→A+A→T
T→C+A→G
T→G+A→C
múltiplas substituições debasesdeleção/inserção
Figura 2: Espectro de mutagênese do UVB que se caracteriza pela predominância de C→T
e CC→TT. Adaptado de Pfeifer et al., 2005.
1.1.3- UV e câncer de pele
Câncer de pele é o mais comum dos tumores diagnosticados e o número dos
cânceres não melanoma e melanoma tem aumentado dramaticamente nas últimas décadas
(Houghton & Polsky, 2002).
Melanoma é a forma mais letal de câncer (Gilchrest et al., 1999). Há evidências
epidemiológicas sugerindo que um histórico de queimadura e intermitente exposição à forte
luz solar, particularmente durante a infância pode promover o desenvolvimento de
melanoma (Gilchrest et al., 1999).
A principal conclusão de vários estudos é que UVB está claramente relacionado
com o câncer não melanoma e que UVA tem um papel importante na indução de melanoma
(Pfeifer et al., 2005). Enquanto, UVB domina os efeitos carcinogênicos da luz solar,
estima-se que UVA contribua com apenas 10-20% dos efeitos carcinogênicos da luz solar
(Pfeifer et al., 2005).
A exposição contínua e por longo tempo à luz solar acarreta danos progressivos às
várias estruturas da pele, como: queratinócitos, melanócitos, vasos, fibras e glândulas, entre
outras. Aparentemente, isto ocorre como resultado do acumulo de lesões no DNA e de
efeitos inflamatórios crônicos, que resultariam no câncer de pele (Pfeifer et al., 2005).
A irradiação UV causa mutações e aumento na proliferação celular e é capaz de
ocasionar o câncer de pele sem que iniciadores ou promotores adicionais estejam presentes
e é, de fato, denominada como um “completo carcinógeno” (Matsuma & Ananthaswamy,
2003), (ver figura 3).
Figura 3: Efeitos da radiação UV na pele (Matsuma & Ananthaswamy, 2003).
Efeitos do UV
Queimadura, Bronzeamento, Hiperplasia Epidérmica
Lesões no DNA
Indução de p53
Imuno supressão
Controle do ciclo celular
Apoptose
Manutenção da estabilidade genômica
Replicação do DNA e reparo
Inibição da angiogênese
O gene p53 é o mais freqüente alvo de alterações genéticas identificados em
cânceres humanos (Hollstein et al., 1991). A perda ou mutação de p53 foi identificada em
aproximadamente 50% de todos os cânceres humanos examinados, contudo a freqüência de
mutações varia dependendo do tipo de câncer. A função básica da proteína p53 é manter a
célula em estado normal contra vários estresses extracelulares, incluindo a irradiação ou a
indução de apoptose quando o DNA é severamente lesado, para poder prevenir a
carcinogênese (Matsumura & Ananthaswamy, 2003).
Além de contribuir para a estabilidade genômica, p53 promove a replicação correta
do DNA, o reparo e inibe a angiogênese, que é um fator crítico na progressão da
malignidade. Desta forma, p53 tem um papel relevante na proteção do genoma, células e
pele contra a irradiação UV (Matsumura & Ananthaswamy, 2003).
Os cânceres de pele são influenciados por vários fatores (Matsumura & Ananthaswamy,
2003):
• Tempo total de exposição ao sol
• Intensidade e duração do componente UV
• Predisposição genética
O câncer ocorre nas áreas expostas ao sol e há maior incidência em indivíduos de pele
clara. A exposição intensa à luz solar, com queimadura pode ser fatal ao indivíduo, quando
este ingerir algum produto (medicamento por exemplo) fotossensibilizante, o qual é capaz
de aumentar o efeito da radiação solar no DNA (Matsumura & Ananthaswamy, 2003).
1.2-Fototerapia
A fototerapia é uma modalidade terapêutica empregada para tratamento de várias
dermatoses. O início de sua utilização data da antiguidade, e sua classificação é feita
segundo o tipo de irradiação utilizada (UVA ou UVB), variável de acordo com os
comprimentos de onda (Roelandts, 2002).
As primeiras descrições do uso da fototerapia datam de 1400 e dizem respeito à
prática dos hindus no emprego de plantas medicinais associadas à exposição ao sol para
tratamento de vitiligo. Foi, porém, a partir de 1903, quando Niels Finsen recebeu o prêmio
Nobel pelo sucesso do tratamento de lúpus com a radiação UV, que a fototerapia começou
a ser realmente estudada e praticada para o tratamento de várias dermatoses (Roelandts,
2002).
→→→→ Indicações do UV (Yashar et al., 2003):
• Acne, alopecia;
• Casos de alterações circulatórias periféricas e
• Pele com infecções bacterianas, infecções por fungos, feridas infectadas.
→→→→ Contra Indicações do UV (Yashar et al., 2003):
• Tuberculose pulmonar;
• Eczema;
• Dermatites agudas e
• Pessoas muito sensíveis à luz solar, com pele branca, olhos claros (fotofobia).
1.2.1-Fotobiologia
A radiação UVA atinge a epiderme, derme superficial e média e o UVB atinge
principalmente a epiderme. Tanto UVB como UVA agem sobre os queratinócitos.
PUVA (psoraleno + ultravioleta A) e a terapia UVB são bastante usados no
tratamento de muitas desordens na pele incluindo psoríases, dermatites atópicas, vitiligo e
linfomas cutâneos. O uso reduzido de PUVA deve-se à intenção de diminuir a incidência de
doenças de pele por repetições do tratamento e para controlar reações fototóxicas. Estas
reações ocorrem somente quando psoralenos são ativados por UVA. A fototerapia UVB
também vem sendo usada com muito sucesso principalmente no tratamento de doenças
inflamatórias de pele. A radiação UVB é considerada por exercer efeitos terapêuticos por
inibição da proliferação celular, indução de apoptose e imunossupressão (Matsumura &
Ananthaswamy, 2003).
Além disso, a foterapia pode ser utilizada associada a vários outros medicamentos
sistêmicos, como os retinóides e outros (Roelandts, 2002).
Como em toda fototerapia, o potencial fotocarcinogênico do UVB está presente. O
potencial fotocarcinogênico foi identificado após a observação da produção de lesões como
CPD e 8-oxoguanina. Estas lesões causam mutações em oncogenes e genes supressores de
tumores aumentando a fotocarcinogênese. Avaliando a formação dessas lesões pelo
Narrowband, banda estreita de UVB (311-312 nm) e Broadband, banda larga de UVB
(290-320 nm), após a exposição a equivalentes doses terapêuticas foi verificado que a
proporção de formação de CPD é similar no Narrowband UVB e no Broadband UVB, no
entanto, a formação de 8-oxo-7,8-dihydro-2’-deoxiguanina (8 oxoguanina) é até 3 vezes
maior após o tratamento com Narrowband UVB (Budiyanto et al., 2002).
Os efeitos colaterais do tratamento são temporários, sendo o mais comum um
eritema transitório. Pessoas submetidas ao tratamento têm maior probabilidade de
desenvolver câncer de pele (Yashar et al, 2003).
O Narrowband UVB permite que os pacientes recebam o tratamento com menos
riscos de queimaduras ou exposição ao UV em níveis prejudiciais e evita os efeitos
colaterais de psoralenos usados no tratamento com PUVA (Psoraleno + UV-A) (Yashar et
al, 2003).
Além de o UVB ser menos maléfico que o PUVA, ele também tem ação benéfica já
que age na pele promovendo a ativação da pró-vitamina D e no máximo de absorção de 297
nm ocorre em maior quantidade a síntese da vitamina D3. Esta vitamina se liga ao cálcio
(Ca++) e o conduzem à matriz óssea. Este fenômeno de absorção e deposição do Ca++ nas
células ósseas previne o raquitismo, a osteomalácea e a osteoporose (Yashar et al, 2003).
1.3- Mutagênese
Os efeitos em longo prazo das lesões no DNA envolvem indução de mutações via
replicação do DNA lesado que podem levar à transformação neoplásica das células. A
radiação UVB induz câncer em mutantes com predisposição à síndrome de Cockayne e
pode levar também ao envelhecimento precoce observável em pessoas cronicamente
expostas ao sol. Em termos de saúde coletiva, o risco mais significativo da irradiação UV é
a fotocarcinogênese (Van der Host et al., 2002).
As mutações C→T foram identificadas como sequências dipirimidínicas nos genes
ras e p53 isolados de cânceres de pele e transições em tandem C→T também foram
detectados nos genes p53. Contudo, o mecanismo preciso de como a luz UV causa
transições de citosinas em sítios dipirimidínicos ainda não é conhecido (Pfeifer et al.,
2005).
O CPD é considerado como a lesão mais importante devido à sua abundância,
reparo lento e conhecida mutagenicidade (Lee & Pfeifer, 2003). Já foi observado que duas
citosinas metiladas formam 15 vezes mais CPD após exposição ao UVB quando comparado
ao UVC Lee & Pfeifer, 2003). O fotoproduto 6-4 parece ser muito mais mutagênico do que
o CPD em experimentos com lesões sítio específica (Pfeifer et al., 2005). A frequência de
mutação obtida com um sítio específico 5’-TT-CPD é geralmente baixa (Taylor & O’Day,
1990), ainda que o dímero de TT cis-syn não seja altamente mutagênico (1% TT→TC, 5%
TT→TC (Smith et al., 1996). O isômero de “Dewar” é menos mutagênico, causando
somente 32-42% de mutações, das quais 20-30% também são mutações TT→TC (LeClerc et
al., 1991).
A excisão de nucleotídeo (NER) constitui mecanismo envolvido no reparo de CPD
e fotoproduto 6-4. Sabe-se que NER também participa do reparo das lesões induzidas por
UVB (Souza, 2004).
Resíduos de guaninas lesadas oxidativamente podem estar envolvidos na
mutagênese induzida por UVB. Há evidências que este componente da luz solar pode ser
capaz de produzir ERO através de um processo que envolve absorção de luz e subseqüente
transferência de energia para o átomo de oxigênio. Interessantemente, a 8 oxoguanina, uma
forma de guanina lesada oxidativamente, pode originar uma transversão G→T, C→A (Kunz
& Armstrong, 1998).
Há fortes evidências sugerindo que as lesões causadas por NUV sejam substratos
para Exo III, devido à sensibilidade dos mutantes xthA. A lesão no DNA pode ser uma
quebra simples com um terminal 3’ que pode ser ativado pela Exo III para permitir a síntese
pela DNA polimerase I. Isto é consistente com as observações de mutantes de E. coli xthA
(deficientes em exonuclease III) e polA (deficientes em DNA polimerase I) sejam sensíveis
a H2O2 e NUV. Algumas características das lesões no DNA são semelhantes para NUV e
H2O2, porém há algumas que são específicas de NUV. Isto provavelmente deve-se ao fato
do fotoefeito de NUV poder ocasionar lesões indiretas do DNA, talvez via lesões na
membrana (Kelland et al, 1984), tRNA (Blanchetot et al, 1984) e/ou outros fotorreceptores
(Blanchetot et al, 1984).
1.4- Estresse Oxidativo
Todos os organismos aeróbios vivem em função do oxigênio molecular, utilizando-
o como aceptor final de quatro elétrons da cadeia respiratória. No entanto, se a redução do
oxigênio for incompleta, espécies reativas desta molécula irão se formar (Rocha et al.,
1996). Quando a cadeia respiratória não está com sua eficiência máxima, há a produção de
uma quantidade insuficiente de elétrons podendo fazer com que muitas moléculas de O2
sofram uma redução incompleta, levando à geração de formas intermediárias chamadas de
espécies reativas de oxigênio (ERO) (Halliwell & Gutteridge, 1984). Há três tipos de ERO:
• radical superóxido (O2•-), formado a partir do recebimento de um simples elétron pela
molécula de O2, podendo também ser gerado pela oxidação do peróxido de hidrogênio,
• peróxido de hidrogênio (H2O2), o radical O2•- pode receber um segundo elétron dando
origem ao íon O2-- . Este íon captura dois prótons gerando peróxido de hidrogênio.
• Radical hidroxila (OH•), sua formação pode se dar através da fissão da ligação O-O do
H2O2 gerando dois radicais hidroxila OH•.
Estas formas de oxigênio causam danos aos constituintes celulares como DNA, lipídeos
e proteínas e, portanto, para sobreviverem os organismos tiveram que desenvolver
mecanismos de proteção antioxidantes (Cooke et al., 2003). Além do processo de
respiração, espécies reativas de oxigênio podem ser geradas por outros processos
metabólicos como na síntese de ácidos graxos insaturados da membrana citoplasmática
(Cooke et al., 2003). ERO também podem ser formadas pela exposição das células à
radiação ionizante, a agentes químicos ou a metais pesados (Asad et al., 1998). Portanto,
através destes mecanismos todo organismo aeróbio é constantemente exposto a agentes
pró-oxidantes. Quando a concentração destes agentes ultrapassa a capacidade antioxidante
da célula ocorre o que se chama de estresse oxidativo, que se caracteriza pelo acúmulo
intracelular de ERO (Heck et al., 2003).
O estresse oxidativo tornou-se de grande interesse para inúmeros grupos de
pesquisa, uma vez que está associado a várias enfermidades, como o câncer, doenças
cardiovasculares, artrite, doença de Alzheimer, síndrome de Down, Parkinson e mostrou
estar envolvido no aumento da expressão e replicação do HIV-1 (Schreck et al., 1991).
1.4.1- Oxidação de lipídeos
A oxidação das membranas é uma outra consequência bastante frequente em
decorrência do ataque de qualquer espécie reativa de oxigênio. Este ataque pode ter como
alvo os ácidos graxos livres, lipídeos de membrana ou proteínas de membrana (integrais ou
não). A taxa de peroxidação lipídica é diretamente proporcional ao número de ligações
insaturadas C=C, ou seja, uma membrana celular rica em ácidos graxos poli-isaturados é
mais susceptível ao ataque das espécies reativas de oxigênio (Mahmutoglu & Kappus,
1985).
Os ácidos graxos celulares são oxidados prontamente por espécies ativas de
oxigênio para produzir os radicais peróxidos de lipídeos e hidroperóxidos de lipídeos (Rice-
Evans e Burdon, 1993). Hidroperóxidos de lipídeos são reduzidos através de glutationas
peroxidases para formas alcoólicas de ácidos graxos não reativos ou eles reagem com
metais para produzir uma variedade de produtos que são reativos (por exemplo, epóxidos,
aldeídos, etc.). Os principais aldeídos produtos de peroxidação de lipídeos são
malondialdeído (MDA) e 4-hidroxinonenal (HNE) (Shauenstein & Esterbauer, 1978).
A peroxidação de lipídeos pode resultar em vários possíveis danos, inclusive
oxidação de proteínas (Rice-Evans e Burdon, 1993).
Pode-se dividir a peroxidação lipídica em 3 fases: iniciação, propagação e
terminação. Kappus, em 1985, propôs um mecanismo cujas reações em cadeia levam a
peroxidação lipídica. O processo é iniciado com a abstração de um átomo de hidrogênio de
um ácido graxo poli-insaturado, dando origem a um radical lipídico.
lipídeo-H + OH• → lipídeo· + H2O
Este radical lipídico tende a se estabilizar através de um rearranjo molecular para produzir
um conjugado dieno, que então reage rapidamente com O2 produzindo um radical lipídico.
lipídeo· + O2 → lipídeo-O2·
Esta reação é propagada através do ataque deste radical a outros ácidos graxos, abstraindo
destes o átomo de hidrogênio para formar o radical hidroperóxido (Lipídio- O2H).
lipídeo- O2· + lipídeo-H→ lipídeo- O2H + lipídeo
Estes radicais hidroperóxicos parecem sofrer ainda fragmentação na presença de
O2,- metais de transição ou por aumento de temperatura, gerando novos radicais peróxi-
lipídicos (LOO·) ou radicais alcoxi lipídicos, capazes de iniciar nova peroxidação lipídica
(Mahmutoglu & Kappus, 1985).
1.5-Principais Mecanismos de Reparo de DNA Envolvidos Neste Estudo
1.5.1- Reparo por Excisão de Bases O reparo por excisão de bases é provavelmente o mais importante sistema de
reparação de lesões oxidativas, bases modificadas, sítios com perda de bases, quebras
simples e pequenas lacunas de DNA. Tanto procariotos como eucariotos possuem uma
grande variedade de DNA glicosilases, enzimas hidrolíticas responsáveis pela retirada de
bases alteradas do DNA, cada qual possuindo especificidade para um ou alguns tipos de
lesão ( revisto por Cunningham, 1997).
Dependendo da lesão, o reparo pode ser iniciado por enzimas que hidrolisam a
ligação N-glicosídica que une a base nitrogenada ao DNA. Como resultado, é gerado um
sítio apurínico ou apirimidínico (AP). O reparo de sítio AP pode ser feito de duas formas: a
ligação fosfodiéster pode ser clivada do lado 5’ do mesmo por uma AP endonuclease de
classe II [(Exo III) ou (Endo IV)], e o resíduo de desoxirribose 5’-fosfato remanescente é
removido por uma 5’ desoxirribofosfodiesterase (dRPase). A outra via de reparo de sítios
AP ocorre pela clivagem da ligação fosfodiéster por um mecanismo de β-eliminação
promovido por uma AP endonuclease de classe I ou AP liase [(Fpg) ou (Endo III)] (esta
atividade AP liase está presente em algumas DNA glicosilases), gerando terminais 5’-
fosfato e resíduos 3’ contendo um aldeído α, β insaturado. Nesta segunda via (pelas AP
liases), pode ocorrer ainda δ-eliminação do aldeído, mediada pela enzima Fpg, deixando
um terminal 5’-fosfato e um terminal 3’-fosfato. Tanto o terminal 3’-fosfato como o aldeído
insaturado, podem ser removidos pela atividade 3’ fosfodiesterásica presente nas AP
endonucleases de classe II (Demple e Harrison, 1994).
Ambas as vias culminam com a excisão da base lesada e do resíduo de
desoxirribose fosfato, deixando uma lacuna que pode ser preenchida pela enzima DNA
polimerase I e o (s) nucleotídeo (s) incorporado (s) será (ão) ligados ao restante da cadeia
fosfodiéster pela ação da DNA ligase, desta forma, completando o reparo (Demple e
Harrison, 1994).
.
1.5.1.1- DNA- N-glicosilases Na categoria de BER estão incluídas as enzimas que apenas retiram a base
nitrogenada danificada através da quebra da ligação glicosídica, gerando sítios AP no DNA.
As DNA glicosilases são capazes de romper a ligação entre a base e a desoxirribose. Muitas
DNA glicosilases reconhecem somente um tipo particular de lesão e a maioria das DNA
glicosilases é altamente específica para classes de bases oxidadas. Elas são proteínas
pequenas, com aproximadamente 30 kDa e o aparecimento de bases livres após tratamento
do DNA com agentes genotóxicos é a maior demonstração da atividade das DNA
glicosilases (Friedberg et al., 2006). Sítios AP também podem ocorrer a partir da
depurinação ou depiridiminação do DNA devido à hidrólise espontânea da ligação
glicosídica (Friedberg et al., 2006). O reparo de sítios AP requer sucessivos eventos
bioquímicos para completar o processo. A remoção dos sítios AP é iniciada por uma
segunda classe de enzimas envolvidas no BER, conhecidas como AP endonucleases, que
reconhecem os sítios AP. Diversos estudos estimaram que aproximadamente 20.000 sítios
AP são gerados por dia por célula humana em condições fisiológicas normais (Friedberg et
al., 2006). AP endonucleases produzem incisões ou quebras na dupla fita de DNA por
hidrólise de uma ou outra ligação fosfodiéster. Como será discutido, a maioria das AP
endonucleases têm especificidade pela ligação 5’ fosfodiéster. É importante frisar que as
endonucleases que realizam a incisão do lado 3’ adjacente ao sítio AP, não são verdadeiras
AP endonucleases, pois não realizam a hidrólise da ligação fosfodiéster, mas sim uma
reação de β-eliminação sem deixar uma extremidade 3’OH livre. As enzimas da classe I
clivam a ligação 3’, e as de classe II clivam a ligação 5’ do açúcar abásico. Todas as
enzimas de classe I conhecidas são glicosilases com AP liases associadas (Friedberg et al.,
2006).
Dentre as DNA glicosilases conhecidas em bactérias podemos citar: as 3-metil
adenina DNA glicosilases (I e II), responsáveis pela eliminação de bases metiladas ou com
radicais maiores (Bjelland & Seeberg, 1987); a uracil DNA glicosilase, responsável pela
eliminação de uracil no DNA (Cone et al., 1977). É importante lembrar que estes dois
exemplos possuem seus similares em leveduras e em células humanas. A atividade
correspondente a uma 3-metil adenina DNA glicosilase em células humanas é codificada
pelo gene AAG (3-alquiladenina DNA glicosilase) ou MPG (N-metil purina DNA
glicosilase) (O’ Connor e Laval, 1990). Já em leveduras, encontramos o gene MAG de
Saccharomyces cerevisiae (Chen et al., 1989).
Existem em diversos organismos, assim como no homem, DNA glicosilases que
possuem uma atividade AP liase associada. A proteína MutY bacteriana possui uma
atividade glicosilase que remove adenina emparelhada com guanina, além de ser uma AP
liase (Boiteux et al., 2004). O homólogo da proteína MutY em levedura ainda não foi
encontrado, entretanto, o homólogo funcional de mutY humano (hMYH) já foi identificado
e possui grande homologia de seqüência com o gene bacteriano. Porém a atividade tipo
Mut Y em levedura está a cargo do mismatch repair MSH2 e MSH6 (Memisoglu &
Samson., 2000).
A proteína Fpg codificada pelo gene fpg, é uma DNA glicosilase com função AP
liase que reconhece principalmente lesões geradas em purinas oxidadas (Memisoglu &
Samson., 2000).
É importante frisar que em bactérias existe um sistema responsável pela proteção
contra mutações espontâneas devido a danos oxidativos. Neste sistema, as proteínas MutY,
Fpg e MutT tomam parte impedindo transversões. Este é o chamado sistema GO que
impede a presença de 8-oxoguanina no DNA ou sua inserção a partir do “pool” de dGTP
intracelular contendo dGTP oxidada (Memisoglu & Samson, 2000).
Em E. coli também podemos encontrar uma DNA glicosilase/ AP liase capaz de
reconhecer produtos oxidado de pirimidina: a endonuclease III (Nth) ou timina glicol DNA
glicosilase codificada pelo gene nth.
A MutY-DNA-glicosilase que catalisa a remoção de adenina de um pareamento 8-
oxoguanina-adenina, mostra significativa homologia com a Endo III (Michaels et al.,
1990).
Em leveduras encontramos duas proteínas que partilham funções similares às da
proteína Nth bacteriana: as proteínas Ntg1 e Ntg2 (Memisoglu & Samson., 2000).
Algumas AP liases, como a Endo III, incisam o DNA por uma reação de β-
eliminação o que produz resíduos de desoxinucleosídeo 5’- fosfato 5’- terminais e aldeídos
alfa beta-insaturados 3’ terminais (Cunningham & Weiss, 1985).
1.5.1.2-AP endonucleases relevantes neste trabalho
Exonuclease III (Exo III), codificada pelo gene xthA, e Endonuclease IV (Endo IV),
codificada pelo gene nfo, possuem importante papel no reparo das lesões induzidas por
UVB (Souza et al., 2006). Ambas apresentam atividade AP endonucleolítica clivando a
ligação 5’ fosfodiéster adjacente ao sítio AP (Souza et al., 2006).
Estudaremos a seguir a atividade destas enzimas a fim de compreender suas
importâncias em nosso trabalho.
1.5.1.2.1- Exonuclease III (Exo III)
A Exo III, produto do gene xthA, é uma proteína de ~ 28kDa com atividade
endonucleásica dependente de Mg2+, sendo inibida em presença de EDTA. A enzima
catalisa a hidrólise, em hélice dupla, de sítios AP no lado 5’ da perda da base, deixando
terminais 3’ OH e 5’P (o 5’P ficando no açúcar abásico). É geralmente aceito que a função
AP endonucleásica da Exo III reconhece sítios AP oriundos da perda de pirimidinas ou
purinas do DNA com igual facilidade; contudo, comparações quantitativas deste parâmetro
não foram relatadas. A enzima é menos ativa no DNA que contem sítios AP reduzidos com
borohidrato de sódio como um substrato, sugerindo que o grupo aldeído do C-1 na
deoxirribose não está sendo necessário para a ação da enzima. O mecanismo de ação da
enzima é distinto das reações de β-eliminação catalisada por álcalis ou AP liases (Friedberg
et al., 2006).
O gene xthA foi clonado e sequenciado (Lehmann et al., 1993). O cálculo do peso
molecular e a seqüência amino terminal do polipeptídeo estão em concordância com as da
proteína purificada. Um gene homólogo (exoA), que não codifica uma exonuclease com
muitas das propriedades da Exo III, foi isolado a partir de Streptococcus pneumoniae
(Lavin & Schroeder, 1988).
A presença de diversas funções catalíticas associadas a uma pequena proteína
sugere que um único sítio ativo catalisa todas as reações enzimáticas da Exo III, através de
três importantes domínios em sua estrutura. Um é o sítio ativo que catalisa a clivagem das
ligações fosfodiéster em uma das hélices do DNA. O segundo reconhece a estrutura de
dupla hélice e o terceiro reconheceria o espaço deixado pela base retirada, facilitando a
função AP endonuclease (Doetsch & Cunningham, 1990).
A hidrólise da ligação 5’ fosfodiéster de um sítio AP gera um resíduo 5’deoxirribose
fosfato. A remoção deste resíduo durante o reparo por excisão de bases requer uma outra
classe de enzimas: nucleases que podem iniciar a degradação deste terminal. Estas enzimas
são conhecidas como exonucleases. Ao contrário das DNA-N-glicosilases e AP
endonucleases, as exonucleases não são enzimas específicas de reparo. Elas podem
degradar terminações de DNA em uma variedade de processos do DNA, incluindo reparo,
recombinação e replicação (Doetsch & Cunningham, 1990).
O resíduo 5’deoxirribose fosfato originado pela atividade da Exo III pode ser
clivado por uma deoxiribofosfodiesterase (dRPase) gerando uma lacuna no DNA. Esta
lacuna pode ser facilmente reparada pela DNA polimerase I e DNA ligase. Durante o
reparo do DNA a eliminação de bases oxidadas por uma DNA glicosilase origina sítios AP
que são substratos da Exo III (Doetsch & Cunningham, 1990).
1.5.1.2.2- Endonuclease IV (Endo IV)
Há uma outra enzima codificada, pelo gene nfo, que é responsável por uma pequena
parte da atividade AP endonucleolítica. A Endo IV reconhece e cliva o DNA da mesma
maneira que a Exo III, ela atuaria na ausência da Exo III ou complementando sua atividade.
Semelhante à atividade da Exo III, a Endo IV ataca as ligações fosfodiéster no lado
5’ do sítio AP, deixando grupos 3’OH. Adicionalmente, ela também pode remover
fosfoglicoaldeído 3’-fosfato, desoxirribose -5-fosfato e resíduos 4-hidroxi-2-pentenal do
terminal 3’ do DNA dupla fita. Ela também tem uma ação sobre resíduos de uréia. Em
verdade, a única diferença é que a Exo III tem uma ação 3’ exonuclease que não está
presente na Endo IV. A enzima Endo IV parece servir como “reserva” em relação a Exo III
para uma série de substratos (Friedberg et al., 2006).
Os mutantes deficientes em Endo IV são sensíveis a metil metano sulfanato (MMS),
mitomicina C e aos agentes oxidantes tert-butil hidroperóxido e à bleomicina. Em presença
da mutação xthA a sensibilidade a estes agentes e às radiações ionizantes é aumentada. Os
mutantes nfo são mais sensíveis ao tert-butil hidroperóxido e à bleomicina que os mutantes
xthA sugerindo que a Endo IV pode reconhecer algumas lesões que não são reconhecidas
pela Exo III (Friedberg et al., 2006).
A Endo IV está presente nas células em níveis dez vezes menores que a Exo III após
tratamento das células com agentes que geram superóxido ou pelo óxido nítrico, que ativam
o regulon SoxRS (Nickoloff & Hoekstra, 1998).
A redundância das atividades de AP endonuclease em E. coli comprova a sua
fundamental importância no reparo por excisão de bases no DNA (Friedberg et al., 2006).
Agentes químicos como paraquat e menadiona, que são reduzidos
enzimaticamente in vivo via transferência de um elétron e então auto-oxidados gerando
radicais superóxido, induzem um aumento de 10 a 20 vezes no nível de Endo IV (Chan &
Weiss, 1987). A Endo IV também é induzida quando as células deficientes em superóxido
dismutase são cultivadas em presença de oxigênio puro e esta indução é independente do
gene oxyR que controla o regulon do estresse oxidativo induzido por peróxido (Friedberg et
al., 2006).
Sabe-se que a ausência de Endo IV também interfere na sensibilidade de células
deficientes no mecanismo de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) após tratamento
com UVB. Estudos realizados com duplos mutantes nfo uvrA, nfo uvrB e nfo uvrC
mostraram que os duplos mutantes são mais sensíveis que o simples mutante nfo e o
simples mutante uvrC apresentou sensibilidade semelhante ao duplo mutante nfo uvrC.
Estes resultados sugerem a participação da proteína UvrA e UvrB de maneira independente
de Endo IV. Esta estaria atuando de maneira semelhante à proteína UvrC (Souza, 2004).
Figura 4: Esquema proposto para o BER em E. coli adaptado de Nickoloff & Hoekstra.,
1998.
5’-AP Endonuclease (Classe II) *
3’5’
5’3’
5’
5’3’
3’
5’
5’
3’
3’
OH5’ 3’
3’ 5’
3’
3’
5’
5’
OH
3’
3’
5’
5’
5’
5’
3’
3’
MODIFICAÇÃO DE BASE (EX.: ALQUILAÇÃO, OXIDAÇÃO)
(DNA GLICOSILASE OU PERDA ESPONTÂNEA)
3’-AP Liase (Classe I)
Desoxirribofosfodiesterase 3’-Diesterase de reparo *
Ligação (DNA ligase)
P
P
REMOÇÃO DA BASE
Polimerização (DNA pol I)
1.5.2- AP endonucleases de leveduras
1.5.2.1- Apn1
Possui aproximadamente 97% da atividade AP-endonuclease e 3’-fosfodieterase em
leveduras. Em células humanas encontramos também conservada esta atividade que é
codificada pelo gene HAP1 (Memisoglu & Samson, 2000). O gene APN1 está localizado
no cromossomo XI (Boiteux & Guillet, 2004). Apn1 é uma enzima monomérica composta
de 367 aminoácidos com peso molecular de 41.4 kDa e tem homologia com Endo IV de E.
coli. Apn1 é uma proteína nuclear, porém estudos revelaram que ela também pode estar
localizada na mitocôndria (Vongsamphanh et al., 2001). O mesmo estudo mostra que a
translocação de Apn1 dentro da mitocôndria requer uma interação física entre Apn1 e Pir 1,
uma proteína inicialmente descrita como constituinte da parede celular (Vongsamphanh
etal., 2001).
1.5.2.2- Apn2
A inativação de Apn1 não resulta em uma instabilidade genética para a célula visto
que, Apn2 apresenta cerca de 3% da atividade AP endonuclease/3’ fosfodiesterase que
pode atuar na ausência da proteína Apn1. Apn2 apresenta homologia com Xth de E. coli
(Exo III) e Ape 1 em humanos (Boiteux & Guillet, 2004). Além disso, Apn2 também
possui uma porção carboxi terminal presente em Ape 2 de humanos e ausente em ExoIII e
Ape1. Isto classifica Ape 2 como uma subfamília dentro das proteínas homólogas de Apn2
(Unk et al., 2002).
O gene APN2 está localizado no cromossomo II e codifica uma proteína com 520
aminoáciddos com massa molecular de 59.4 kDa. Quanto à sua localização estudos
bioquímicos indicam uma localização nuclear (Unk et al., 2002).
1.5.3- Reparo por Incisão de Nucleotídeos (NIR)
Evidências sugerem a existência de uma via alternativa de reparo em que a Endo IV
incisa ligações fosfodiéster no lado 5’ das bases lesadas, gerando 3’-hidroxil e 5’ fosfato
terminal. Entre algumas bases modificadas incluem-se a 5,6 dihidrotimina, 5,6
dihidrouracil, 5-hidroxiuracil e 2,6 diamino-4-hidroxi-5-N-metilformamidopirimidina
(Ischenko & Saparbaev, 2002). Radicais hidroxila reagem predominantemente com
carbonos 5 e 6 da dupla ligação de pirimidinas formando timina e uracil glicóis (Tg e Ug),
5-hidroxiuracil (5OHU), 5-hidroxicitosina (5OHC) e com carbono 8 de purinas formando
7,8-dihidro-8-oxo-2’guanina (8oxoG). 5,6 dihidroxiuracil (DHU) e resíduos α anômero de
2’-deoxiadenosina (α dA) constituem os principais adutos gerados pela radiação ionizante
em condições anóxicas. Os α anômeros de 2’-deoxinucleosídeos (α dN) incluindo α dA, α T
e α C são gerados por abstração de um átomo de hidrogênio do C1 por um radical hidroxila
(Daviet et al., 2006).
Endo IV promove uma incisão a 5’ do DNA nas bases lesadas de maneira
independente de uma DNA glicosilase (Daviet et al., 2006).
A via NIR é evolutivamente conservada em E. coli, leveduras e células de
mamíferos. Em células humanas a principal AP endonuclease, Ape1/Ref 1/HAP-1, incisa
oligonucleotídeo duplex contendo DHU, 5ohU, α dA e α T. Ape 1 foi descrita como uma
AP endonuclease homóloga da proteína Xth de E. coli (Daviet et al., 2006).
O homólogo da proteína Nfo de E. coli foi identificado em Saccharomyces
cerevisae. Trata-se da AP endonuclease Apn1 que contribui com mais de 90% da atividade
AP endonucleolítica da célula. Assim como Nfo a Apn1 tem atividade 3’ diesterase e 3’
fosfatase. Mutantes Apn1 são hipersensíveis a agentes oxidantes como H2O2 e tert-butil-
hidroperóxido (Ishchenko et al., 2004).
Ishchenko e colaboradores em 2002 mostraram que as AP endonucleases Nfo em E.
coli, Apn1 em Saccharomyces cerevisiae em levedura e Ape1 em humanos estão
envolvidas no reparo por incisão de nucleotídeos. Ainda que NIR seja evolutivamente
conservado desde bactérias até humanos, esta via é proposta como um “backup” de DNA
glicosilase na via BER e que α dA e α T quando presentes no DNA são reconhecidas por
Nfo e Apn1. Porém, o reparo não é finalizado, a enzima incisa no lado5’ da lesão gerando
uma quebra simples (Ishchenko et al., 2004).
2-Objetivos
→→→→ Geral
Estudos demonstraram que o UVB causa efeitos letais em Escherichia coli,
sobretudo nas cepas deficientes no mecanismo de reparo por excisão de bases. Deste modo
objetivamos estudar os efeitos letais e mutagênicos nestas células bem como em
organismos eucarióticos usando como modelo Saccharomyces cerevisiae. A similaridade
que possui a levedura (Saccharomyces cerevisiae) com as células de mamíferos em relação
aos genes de reparação do DNA (Friedberg et al., 2006) justificam a escolha desse modelo
para o estudo proposto.
→→→→ Abordagens
1- Realizar um estudo de mutagênese específica no gene lacZ de E. coli que
permite a determinação de substituição de seis bases por monitoramento
da reversão para Lac + (Cupples & Miller, 1989).
2- Construir cepas mutantes nos genes de interesse em cada uma das seis
cepas utilizadas para detecção de trocas de bases supracitadas.
3- Avaliar a participação de íons Fe+2 nas cepas que apresentarem elevado
índice de mutagênese.
4- Avaliar também os efeitos lesivos provocados pelas EAO nos lipídeos de
membrana através da técnica TBAR.
5- Avaliar a sensibilidade da cepa selvagem de Saccharomyces cerevisiae
bem como dos simples mutantes apn1, apn2 e do duplo mutante
apn1apn2 deste organismo às radiações UVC e UVB.
6- Obtenção das colônias de mutantes CanR (células passam a ser resistentes
ao antibiótico canavanina) tratadas com UVB.
3-Material e Métodos
3.1- Cepas Utilizadas: →→→→ Cepas Bacterianas e plasmídeo:
Foram utilizadas, nos experimentos, cepas bacterianas derivadas de E. coli K12. No
quadro abaixo encontram-se relacionadas todas as cepas, bem como suas características
genéticas mais relevantes para este estudo.
Designação Substituição de
Bases
Genótipo Relevante Origem
AB1157 - WT P.Howard-Flanders
(Univ. of Yale,
USA)
BW9091 - xthA B. Weiss (Univ.of
Emory, USA)
BW9116 ∆ xthA B. Weiss (Univ.of
Emory, USA)
BW527 - nfo B. Weiss
BW544 - xthA nfo B. Weiss
CC101 AT→ CG WT J.H. Miller (UCLA)
CC102 GC → AT WT J.H. Miller
CC103 GC → CG WT J.H. Miller
CC104 GC → TA WT J.H. Miller
CC105 AT → TA WT J.H. Miller
CC106 AT → GC WT J.H. Miller
CC101 xthA AT→ CG xthA Este Trabalho
CC102 xthA GC → AT xthA Este Trabalho
CC103 xthA GC → CG xthA Este Trabalho
CC104 xthA GC → TA xthA Este Trabalho
CC105 xthA AT → TA xthA Este Trabalho
CC106 xthA AT → GC xthA Este Trabalho
CC101 nfo AT→ CG nfo Este Trabalho
CC102 nfo GC → AT nfo Este Trabalho
CC103 nfo GC → CG nfo Este Trabalho
CC104 nfo GC → TA nfo Este Trabalho
CC105 nfo AT → TA nfo Este Trabalho
CC106 nfo AT → GC xthA nfo Este Trabalho
CC101 xthA nfo AT→ CG xthA nfo Este Trabalho
CC102 xthA nfo GC → AT xthA nfo Este Trabalho
CC103 xthA nfo GC → CG xthA nfo Este Trabalho
CC104 xthA nfo GC → TA xthA nfo Este Trabalho
CC105 xthA nfo AT → TA xthA nfo Este Trabalho
CC106 xthA nfo AT → GC xthA nfo Este Trabalho
pBW21 - nfo B. Weiss (Univ.of
Emory, USA)
Quadro 1: Cepas de E. coli utilizadas neste trabalho.
Os antibióticos foram acrescentados ao meio de cultivo das cepas bacterianas
resistentes nas concentrações abaixo (Quadro 2).
Antibióticos Cepas Concentração Final
Estreptomicina AB1157, BW9091, BW544 100 µg/ml
Kanamicina BW527, BW544 e CCs nfo 40 µg/ml
Tetraciclina CC xthA 15 µg/ml
Quadro 2: Antibióticos utilizados. Fornecedor-Sigma-Aldrich.
Cepas de Levedura:
Foram utilizadas, nos experimentos, cepas de levedura de Saccharomyces cerevisae.
No quadro abaixo encontram-se relacionadas todas as cepas, bem como suas características
genéticas mais relevantes para este estudo.
Designação GENÓTIPO
RELEVANTE
ORIGEM
FF 18733 MATa, his7, leu2, lys1,
ura3, trp1
F. Fabre (CEA-França)
BPS1088 apn1::URA3 S. Boteux (Fontenary aux
Roses, France)
BPS 1085 apn2::KANMX S. Boteux (Fontenary aux
Roses, France)
BPS 1087 apn1:: URA3 apn2::KANMX S. Boteux (Fontenary aux
Roses, France)
Quadro 3: Cepas de Saccharomyces cerevisiae cerevisae utilizadas neste trabalho.
KANMX é o gene responsável pela resistência ao antibiótico Geneticina (G418),
cuja concentração final é 200 µg/ml.
3.1.1- Manutenção das cepas
As cepas utilizadas neste estudo foram mantidas em estoques tipo “slants”, que
consistem de meio LB (Miller, 1992) suplementado com timina 50 µg/ml e solidificado
com ágar 0,75%, à temperatura ambiente. Para utilização freqüente das cepas, as culturas
foram transferidas dos “slants” com auxílio de alça de platina, para Erlenmeyers contendo
meio LB líquido com os antibióticos apropriados, mantidas a 37ºC sob agitação por 24
horas (pernoite) e então transferidas, na proporção de 1:1 para “criovials” contendo glicerol
85% (Merck).
No caso das leveduras as cepas foram crescidas a 30ºC sob agitação até a fase estacionária
e então transferidas para “criovials” contendo glicerol 85% (Merck). Estas culturas estoque
foram então mantidas sob refrigeração à temperatura de –70º C.
3.1.2- Obtenção das culturas para os experimentos
→ Bactérias
Para as culturas utilizadas nos experimentos foram transferidos, alíquotas com
auxílio de micropipetas, dos estoques a –70ºC para Erlenmeyers contendo 10 mL de LB
líquido, com ou sem antibiótico dependendo da cepa, sendo incubadas a 37ºC com agitação
(150 rpm) durante a noite, atingindo desta forma, a fase estacionária de crescimento
(aproximadamente 109 células/mL). Os antibióticos foram acrescentados ao meio de cultivo
das cepas resistentes nas concentrações descritas no quadro 2. Inóculos na proporção de
1:40 foram feitos em meio líquido a partir dessas culturas em fase estacionária e cultivadas
até a fase exponencial de crescimento (1-2x108 células/mL) a 37º C com agitação.
→ Leveduras
Para cada experimento realizou-se uma pré-cultura a partir do estoque em 10 mL de
meio rico incubadas a 30ºC com agitação por 24 h. Após este período (a cultura atingiu a
fase exponencial de crescimento) foi realizado um outro repique em um meio de cultura
novo (10 mL de YPG líquido), deixando-as incubadas a 30ºC por 48 h com agitação.
3.2- Meios de cultura e soluções tampões para bactérias
• Meio LB (Miller, 1992)
NaCl 1% (Merck);
Bacto-triptona 1% (Difco Laboratories);
Extrato de levedura 0,5% (Difco Laboratories);
• Meio LB sólido-meio LB solidificado com ágar 1,5% (Difco Laboratories)
•Tampão M9 pH 7,0 (Miller, 1992)
Na2HPO4 anidro 0,6%
KH2PO4 0,3%
NH4Cl 0,1%
NaCl 0,05%
Água deionizada (q.s.p) 1000 ml
•••• Tampão
•••• Citrato de Sódio 1 M
Na3C6H5O7. 2H2O -----------------------------------------------------2,94 g 10 ml de H2O
•••• Sais MMM-10X
Fosfato de Potássio dibásico (K2HPO4) -------------------------------105 g
Fosfato de Potássio monobásico (KH2PO4) ---------------------------45 g
Sulfato de amônio (NH4)2SO4 ------------------------------------------10 g
Citrato de Sódio (Na3C6H5O7.2H2O)-----------------------------------5 g
Água destilada-------------------------------------------------------------ajustar até 1000 ml
Os meios LB, líquido e sólido, após preparação, eram autoclavados por 20 min a
120ºC, assim como os componentes do tampão M9, dos sais MMM e citrato, acima
mencionados. Após autoclavagem do tampão M9, adicionou-se 100 µL de MgSO4 7 H2O 1
mM () e 100 µL CaCl2 0,1 mM a cada 100 ml de tampão. Os sais foram obtidos das
Indústrias Químicas Merck.
3.2.1-Meio seletivo para a mutagênese que utiliza a lactose como fonte de
carbono (Lac- /Lac+ ).
Ágar Difco----------------------9 g
Água destilada-----------------533 ml
Após autoclavação acrescenta-se:
Sais MMM-10X---------------------------------60 ml
Tiamina (1%) (Merck)--------------------------0,300 ml
Lactose(20%) (Merck)---------------------------6 ml
Casaminoácido (10%) (Merk)-------------------0,240 ml
MgSO4.7H2O (1M) (Merck)---------------------0,600 ml
3.3- Meios de cultura para levedura
•••• YPG – meio rico de crescimento contendo:
Estrato de levedura 1% (Difco)
Peptona 1% (Difco)
Glicose 2% (Merck)
•••• YNBG – meio mínimo de crescimento contendo:
YNB 0,7% (Difco)
Glicose 2% (Merck)
Aminoácidos (Sigma) conforme as necessidades nutricionais das cepas
•••• Quelante de Fe++ (2,2’-dipiridil)
Foi utilizado o 2,2’-dipiridil (Sigma) 100 mM, solubilizado em etanol absoluto
(Merck) e após solubilização foi adicionada H2O deionizada estéril, até a solução de etanol
atingir 30%.
3.4-Obtenção de cepas mutantes
Os simples e duplos mutantes das cepas CC101 a CC106 foram construídos através
da técnica de transdução com os fagos P1 (Miller, 1992). Para isso, as cepas selvagens
foram cultivadas até a fase estacionária, centrifugadas a 7.710 x g por 10 minutos e
ressuspensas em 2 mL de Mcbis (MgSO4 10 mM e CaCl2 5 mM) e em seguida incubadas
com os fagos de interesse. Para a construção do simples mutante xthA utilizou-se o P1
obtido da cepa BW9116 (∆xthA), que possui resistência ao antibiótico tetraciclina,
seguindo a proporção de fago e bactéria de 1: 10. Os fagos carreiam o DNA bacteriano, que
contém a mutação de interesse associada a um marcador (normalmente de resistência a um
antibiótico). Para a construção do simples mutante nfo foi utilizado o P1 obtido da cepa
BW527 (nfo), que possui resistência ao antibiótico kanamicina.
Posteriormente, após um período de 30 minutos de incubação a 37ºC sem agitação
(fase de infecção), as células foram centrifugadas e ressuspensas em LB contendo 250 µL
de citrato de sódio 1 M para impedir a reinfecção dos fagos, permanecendo a cultura por
mais uma hora a 37ºC sem agitação. Depois de todo esse processo a cultura foi centrifugada
a 7710 g por 10 minutos e ressuspensas em 1 mL de LB contendo 20 mM de citrato de
sódio. Em seguida, as células foram espalhadas em placas de LB, contendo citrato de sódio
1 M e o antibiótico de seleção. Após 24 h de incubação, as células que recombinaram seu
DNA com o fragmento de DNA veiculado pelo vírus de interesse formaram colônias na
placa contendo o antibiótico, as quais foram, isoladas e repicadas, para então serem
estocadas e mantidas em glicerol a –20ºC (Miller, 1992) e posterior verificação dos
fenótipos. Os duplos mutantes foram construídos inserindo o P1 obtido da cepa ∆ xthA nas
cepas CC nfo já construídas como mencionado anteriormente.
3.5- Competência e transformação bacteriana
Para realizar a metodologia de competência foi feito um inóculo de 1 ml da cultura
bacteriana BW527 (nfo) na fase estacionária em 50 ml de meio rico (LB). Após atingir a
fase exponencial 40 ml da cultura foram centrifugados a 5000 rpm por 10 minutos a 4 ºC, o
sobrenadante foi retirado e ressuspenso em 20 ml de CaCl2 100 mM gelado e deixado por
20 minutos no gelo. Após esse período as células foram novamente centrifugadas a 5000
rpm por 10 minutos a 4 ºC, ressuspensas em 2 ml de CaCl2 e incubadas no gelo por no
mínimo 1 h para então tornarem-se competentes.
Na etapa da transformação 2 µl do plasmídeo pBW21 nfo, resistente à ampicilina,
foram adicionados a 100 µl da suspensão de bactérias competente. Essa mistura foi então
incubada 20 minutos no gelo, após esse período foi efetuado um choque térmico incubando
a mistura em banho Maria a 42ºC durante 90 segundos e imediatamente após foram
colocadas no gelo por 1 minuto e em seguida foram adicionados 500 µl de LB para então a
cultura ser plaqueada em LB sólido com o antibiótico de resistência do plasmídeo. No dia
seguinte os clones foram isolados e inoculados em LB líquido com ampicilina.
3.6- Sobrevivência e mutagênese bacteriana
Após a obtenção das culturas em fase exponencial de crescimento, as culturas foram
centrifugadas a 7710 x g por 10 minutos entre 4 –10ºC e ressuspensas em tampão M9. Uma
alíquota então era retirada para ser diluída apropriadamente em M9, a fim de se obter o
número inicial de células viáveis, antes do tratamento. As culturas eram irradiadas com
uma lâmpada Vilber Lourmat Ultravioleta, duplo comprimento de onda 312/365 nm 15
Watts com filtro Mod. VL - 215 LM de amplo espectro. Utilizamos a lâmpada de UV-B,
com pico de 312 nm, nas doses de 2, 4, 6 e 8 kJ/m2 para bactéria e nas doses 2,5; 5; 10; 15 e
20 kJ/m2 para as leveduras. Para evitar contaminação e o efeito de comprimento de onda
inferior a 300 nm utilizamos um filtro de PVC (poli cloreto de vinila) capaz de barrar 100%
desses comprimentos. Após cada dose, alíquotas foram retiradas para determinação da
sobrevivência celular. Essas alíquotas, então, foram diluídas em tampão M9 e semeadas em
placas de Petri contendo LB sólido no caso das bactérias e espalhadas em duplicata em
meio YPG sólido a 30º C por um período de aproximadamente 96 h no caso das leveduras.
A fonte de UVC era uma lâmpada GE G15T8 15W, com emissão predominante em
254nm com taxa de dose 1 J.m-2.s-1.
A sobrevivência celular N/N0 (ordenadas) é o quociente obtido pela divisão do nº de
células sobreviventes após cada dose (N) pelo nº inicial de células (N0) plotada contra as
diferentes doses de UV-B. Cada curva de sobrevivência foi obtida a partir da média de três
experimentos.
Para determinação da mutagênese induzida, de cada cultura eram também retirados
100 µl após cada dose e novamente inoculados em meio LB líquido por 48 h. Após este
período, 200 µl foram espalhados em meio LB contendo 100 µg/mL de rifampicina (LB-
RIF) em duplicata. As placas foram incubadas a 37ºC entre 18 e 24 h e as colônias
contadas.
No caso da mutagênese Lac-/Lac+, além dos 100 µl retirados para sobrevivência,
800 µl foram também retirados, centrifugados durante 1 minuto por 12 000 rpm e
ressuspendidos em metade do volume. Deste volume foram retirados 200 µl e incubados
em 2 ml de LB por 24 hs para então serem plaqueados (duplicata) em meio seletivo para
lactose já as células viáveis eram plaqueadas em LB. As células plaqueadas em meio
seletivo para lactose foram incubadas durante 48 ou 72 hs a 37ºC e as células viáveis
durante 24 hs.
Para os experimentos com dipiridil as células foram pré-tratadas com dipiridil 1mM
por 20 minutos, para então serem submetidas às doses de UVB.
3.7- Sobrevivência e mutagênese de leveduras
Com a cultura em fase estacionária, as células foram concentradas a 107 células/mL,
lavadas duas vezes com água, centrifugadas, ressuspensas e submetidas às doses descritas
anteriormente para levedura. Após cada tratamento foram realizadas diluições seriadas as
quais foram plaqueadas em duplicata em meio YPG sólido a 30ºC por um período de
aproximadamente 96 h.
Para analisar a mutagênese foi utilizado o sistema de resistência a canavanina. É um
sistema de “mutagênese direta” (“forward mutation”) que detecta todas as mutações que
inativam o gene da arginina permease, CAN1, que permite a entrada de arginina para o uso
da célula. Porém, com a presença de altas concentrações de canavanina no meio de cultivo
haverá incorporação deste antibiótico que irá inativar a célula. As células que possuem o
gene CAN1 não funcionante irão sobreviver, pois não utilizarão a canavanina da placa. Este
sistema de seleção é possível, uma vez que as cepas utilizadas em nosso trabalho são
prototróficas para arginina. Este sistema permite identificar todos os eventos moleculares:
substituição de bases, deslocamento de quadro de leitura (frameshift), deleções, inversões,
etc.
A mutagênese induzida era determinada a partir de alíquotas retiradas nas doses
indicadas e plaqueadas em meio YNBG sólido com canavanina (60mg/L) por 96 h a 30 ºC.
Na seleção de clones CanR após 96 h a 30 ºC, cerca de 40 colônias foram estriadas
em placas de YNBG sólido com canavanina e novamente incubadas por igual período. Em
seguida as leveduras de cada estria foram colocadas para crescer em meio rico líquido
(2ml) por 48 h. Após este período a cultura foi centrifugada durante 1 minuto por 12 000
rpm, o sobrenadante foi descartado e o pellet congelado para posterior análise.
Esta metodologia foi empregada com todas as cepas, selvagens e mutantes,
espontâneo e após tratamento com UVB, com dipiridil e sem dipiridil.
3.8- Lipoperoxidação (TBARS)
Para obtermos uma medida de lipoperoxidação utilizamos o método TBARS
(“ thiobarbturic acid reactive substances”), que se baseia na reação da amostra com ácido
tio-barbitúrico (TBA), gerando uma marcação colorimétrica, que pode ser medida em
espectrofotômetro a 535 nm. Em paralelo, foi feita uma curva padrão de MDA
(malondialdeído) (figura 4) para a estimativa dos níveis de lipoperoxidação nas diferentes
amostras. O MDA é um dos produtos formados pela ação de ERO sobre lipídeos (Fraga et
al., 1988).
Curva Padrão MDA
y = 0,1359x + 0,0249
R2 = 0,965
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0 0,5 1 1,5 2 2,5
concentração MDA (nmoles/tubo)
Abs
orbÂ
ncia
(535
nm
)
Figura 5: Curva de MDA (malondialdeído) em diferentes concentrações.
A metodologia TBARS é utilizada como medida de estresse oxidativo de lipídeos
em muitos organismos (Semchyshyn et al., 2005). Para esta técnica as células na fase
estacionária foram crescidas em 60 ml de LB até a fase exponencial de crescimento
(repique 1:40) e centrifugadas 3 vezes. Na terceira centrifugação as células eram
ressuspensas em 600 µl de tampão de lise (Tris HCl 25 mM, pH 7,6; EDTA 0,1 M; NaCl
0,25 M; PMSF 1 mM) e 600 µl de bilhas (microesferas de vidro de 212-300 µm) e
vortexadas 6 vezes por 30 segundos com intervalo de 1 minuto no gelo. Foi feita uma
centrifugação de 10 000 rpm por 1 minuto para coletar as bilhas, o sobrenadante foi
recuperado e novamente centrifugado por 1 h a 14 000 rpm, para separar os restos
celulares. As amostras foram então utilizados para a reação.
Reação: 300 µl de cada amostra + 20 µl de butil hidroxi-tolueno (agente antioxidante) 8
mM + 700 µl de TBA 0,375% ( em HCl 0,25).
As reações foram levadas a banho a 100ºC por 15 minutos, deixadas em temperatura
ambiente por mais 15 minutos e quantificadas em espectrofotômetro. Os resultados foram
expressos após padronização pela concentração de proteínas através da metodologia de
Bradford (Bradford, 1976).
4-Resultados
4.1- Resultados com bactérias
Inicialmente realizamos estudos da sobrevivência celular ao UVB e UVC com a
cepa selvagem e cepas deficientes nas enzimas que realizam atividade AP endonucleolítica
no mecanismo de reparo por excisão de bases.
Diferentemente dos resultados obtidos com o mutante xthA, o mutante nfo se
mostrou resistente ao tratamento, apresentando sensibilidade próxima à da cepa selvagem.
Interessantemente, o duplo mutante xthA nfo apresentou sensibilidade intermediária
entre o mutante xthA e o mutante nfo, indicando que a ausência de Endo IV protege o
mutante xthA da inativação pela radiação UVB.
Isto indica que Exo III tem um papel crucial no reparo das lesões produzidas por
UVB. A hipersensibilidade de xthA após o tratamento com UVB se assemelha aos
resultados obtidos com peróxido de hidrogênio (Asad et al., 1998), que gera lesões
oxidativas, nos levando a sugerir mais uma vez que estas lesões podem ser geradas pela
radiação UVB (Souza et al., 2006). In vivo, a geração de ERO ocorre frequentemente via
reação de Fenton através de metais de transição (Gutteridge et al., 2000).
Sobrevivência ao UV-B
Dose kJ/m 2
0 2 4 6 8
Fra
ção
de S
obre
vivê
ncia
1e-6
1e-5
1e-4
1e-3
1e-2
1e-1
1e+0
AB1157 (selvagem)BW527(nfo)BW544(xthA nfo)BW9091 (xthA)
WT
nfo
xthA
xthA nfo
Figura 6: Sobrevivência das cepas AB1157 (Selvagem), BW527 (nfo), BW544 (xthA nfo)
e BW9091 (xthA) após tratamento com UVB nas doses indicadas acima. Estes resultados
representam média de no mínimo três experimentos.
Esta hipersensibilidade da cepa xthA, bem como a supressão parcial de sensibilidade
do duplo mutante são resultados vistos somente para UVB. Uma vez que quando tratadas
com UVC todas as cepas se mostram tão resistentes quanto à cepa selvagem, como pode ser
visto na figura 7.
Sobrevivência ao UVC
UVC J/m2
0 20 40 60 80 100
Fra
ção
de S
obre
vivê
ncia
1e-5
1e-4
1e-3
1e-2
1e-1
1e+0
WTnfoxthA nfoxthA
Figura 7: Sobrevivência das cepas AB1157 (Selvagem), BW527 (nfo), BW544 (xthA nfo) e
BW9091 (xthA) após tratamento com UVC nas doses indicadas acima. Estes resultados
representam média de no mínimo três experimentos.
4.1.1-Mutagênese induzida pela radiação UVB
Nós verificamos anteriormente (Souza et al., 2006) que a ausência de mecanismo de
reparação de bases interferia na indução de mutagênese pela radiação UVB. Isto foi
verificado determinando o número de mutantes que adquiriu resistência a rifampicina.
Neste trabalho, para UVB verificou-se um elevado índice de mutagênese na cepa nfo sendo
este índice da ordem de 236 vezes para DL10 comparado ao espontâneo que foi de 2 vezes,
enquanto a cepa xthA apresentou um aumento da ordem de 59 vêzes em relação ao
espontâneo que apresentou índice de 0,4. Já o duplo mutante xthA nfo apresentou um
aumento de 151,2 em relação ao espontâneo que apresentou valores na ordem de 3,1. Os
mutantes nfo e xthA nfo não apresentaram semelhante aumento de mutagênese com relação
à cepa selvagem para UVC.
Abaixo no quadro 4 temos os valores do número de Rifr/108 céls para UVB.
UVB Selvagem nfo xthA nfo xthA
Espontâneo 2,0 ± 0,3 2,0 ± 1,6 3,1 ± 0,2 0,4 ± 0,2
DL10 176,2 ± 14,5 472,7 ± 99,2 460,8 ± 102,7 23,8 ± 1,1
Quadro 4: Mutagênese das cepas AB 1157 (Selvagem), BW527 (nfo), BW544 (xthA nfo) e
BW9091 (xthA) após tratamento com UVB. Destaque em negrito para o aumento do
número de mutantes para as cepas nfo e xthA nfo.
Na figura 8 podemos observar que as cepas deficientes no gene nfo apresentaram
níveis de mutagênese superiores à cepa selvagem para UVB. Já a cepa deficiente no gene
xthA apresentou baixos índices de mutagênese para os tratamentos UVB e UVC.
Rif
R/1
08 cél
s
0
200
400
600
UVB UVC
xthA nfo
xthA
nfo
WT
nfo
xthA nfo
*
WT
Figura 8: Mutagênese das cepas AB 1157 (Selvagem), BW527 (nfo), BW544 (xthA nfo) e
BW9091 (xthA) após tratamento com UVB e UVC. O asterisco indica o baixo valor da
mutagênese para xthA após tratamento com UVC, este valor foi da ordem de 2 vêzes, não
sendo possível visualizar no gráfico. Estes resultados representam média de no mínimo três
experimentos.
Na figura 9 podemos observar que quando complementamos a cepa BW527 com o
plasmídeo nfo o número de mutantes RifR/108 células diminui, ficando esta cepa com níveis
de mutagênese próximos da cepa selvagem.
Rif
R/1
08 cél
s
0
200
400
600
WT
BW527(nfo)
BW 527 +plasmídeo nfo
UVB
Figura 9: Mutagênese induzida por UVB: cepas AB 1157 (Selvagem), BW527 (nfo) e
BW527 complementada com plasmídeo nfo. Estes resultados representam média de no
mínimo três experimentos.
Objetivando avaliar a mutagênese induzida pela radiação UVB resolvemos construir
diferentes mutantes em seis cepas de Escherichia coli com diferentes mutações no códon
461 do gene lacZ que codifica a enzima β galactosidase. Com esta técnica poderíamos
avaliar qual troca de base estaria ocorrendo após o tratamento com UVB, já que uma vez
com a substituição de base teríamos o códon 461 restaurado, como podemos ver abaixo.
Cupples and Miller, 1989.
Analisando a mutagênese lactose, muagênese na qual as células adquirem a
proficiência de utilizar a lactose como fonte de carbono, mutantes no gene nfo observamos
que as cepas CC103 nfo e CC106 nfo apresentaram um aumento na mutagênese, que
corresponde as troca de bases CG→GC e AT→GC respectivamente, quando comparado à
cepa selvagem, como pode ser visto na figura 10 a seguir.
M
utan
tes
Lac
+ /108 c
éls
0
50
100
150
200
250
300
350 1) CC101(WT) AT::CG2)CC102(WT) GC::AT3)CC103(WT) GC::CG4)CC104(WT) GC::TA5)CC105(WT) AT::TA6)CC106(WT) AT::GC
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
7)CC101(nfo) AT::CG8) CC102(nfo) GC::AT9) CC103(nfo) GC::CG10) CC104(nfo) GC::TA11) CC105(nfo) AT::TA12) CC106(nfo) AT::GC
Figura 10: Número de mutantes Lac+/108 céls após tratamento com UVB. A dose de UVB
para todas as cepas foi de 8 kJ/m2, o que corresponde à DL10 das 12 cepas tratadas. Os
números de 1 a 6 correspondem às cepas selvagens e os números de 7 a 12 correspondem
às cepas deficientes em nfo. Este resultado representa média de no mínimo três
experimentos.
Este aumento de mutantes Lac + nas cepas CC103 nfo e CC106 nfo correspondendo
as trocas AT→GC e CG →GC é característico da radiação ultravioleta B, uma vez que, o
mesmo não foi observado para UVC, como pode ser visto na figura 11 a seguir.
Mut
ante
s La
c+ /1
08 cél
s
0
50
100
150
200
1 2 3 4
1)CC1032)CC103 nfo
3)CC1064)CC106 nfo
A B
Figura 11: Mutagênese induzida (Lac-→Lac +) por UVC. A dose de UVC para todas as
cepas foi de 60 J/m2, o que corresponde à DL10 das 4 cepas tratadas. Na figura A temos as
cepas que correspondem as trocas CG →GC e na figura B temos cepas que correspondem às
trocas AT→GC. Este resultado representa média de no mínimo três experimentos.
Objetivando avaliar se a geração de radicais OH•, bem como de outras ERO
estariam contribuindo para o aumento no número de mutantes após tratamento com UVB,
as células foram pré-tratadas com dipiridil na concentração de 1 mM, no sentido de
verificar se os efeitos mutagênicos do UVB seriam dependentes da reação de Fenton.
Verificamos que após o pré-tratamento ocorreu uma diminuição no número de revertentes
Lac+ para as cepas CC103 nfo e CC106 nfo. Os metais provavelmente mais envolvidos na
reação de Fenton in vivo são os íons ferro e cobre (Kehrer, 2000), como pode ser visto
abaixo:
Fe2+ + H2O2 →Fe3+ + OH· + OH-
Cu+ + H2O2 → Cu2+ + OH·
+ OH-
Enquanto o dipiridil não tem efeito na indução de revertentes Lac+ nas cepas
selvagens após o tratamento com UVB, o pré-tratamento com o quelante foi capaz de
diminuir as substituições GC → CG e AT → GC induzidas por UVB nos mutantes nfo,
como pode ser visto na figura 12.
Mut
ante
s La
c+ /1
08 cel
ls
0
50
100
150
200
250
300
3501)GC::CG (WT)
2)GC::CG (WT com dip)
3)AT::GC (WT)
4)AT::GC (WT com dip)
5)GC::CG (nfo)
6)GC::CG (nfo com dip)
7)AT::GC ( nfo)
8)AT::GC ( nfo com dip)
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 12: Efeito do quelante dipiridil na mutagênese induzida por UVB nas cepas CC103
e CC106 selvagens, números de 1 a 4, CC103 e CC106 (nfo), números de 5 a 8. A dose de
UVB para todas as cepas foi de 8 kJ/m2, o que corresponde à DL10 das 8 cepas pré-tratadas
ou não com dipiridil 1 mM. Este resultado representa média de no mínimo três
experimentos.
Como na mutagênese lactose, verificamos aumento de transversão GC →CG e
transição AT→GC nas cepas nfo, objetivamos analisar a mutagênese lactose também com as
cepas xthA e o duplo mutante xthA nfo.
Como pode ser visto na figura 13 as cepas com mutação no gene xthA não
apresentaram aumento de revertentes Lac+ após o tratamento com UVB. O índice de
mutagênese foi baixo para mutantes Lac+, o que também foi observado anteriormente para
os níveis de mutantes RifR com o mutante xthA.
Mut
ante
s La
c+ /1
08 cél
s
0
5
10
15
20
CC101xthA (1)CC102 xthA (2)CC103 xthA (3)CC104 xthA (4)CC105 xthA (5)CC106 xthA (6)
1 2 3 4 5 6 1
Figura 13: Mutagênese induzida por UVB. A dose de UVB para todas as cepas foi de 2
kJ/m2, o que corresponde à DL10 das 6 cepas tratadas. Este resultado representa média de
no mínimo três experimentos.
Interessantemente também foi observado um aumento no número de troca de bases
GC →CG e AT→GC com o duplo mutante xthA nfo, (figura 14), assim como foi visto na
mutagênese com as cepas CC103 nfo e CC106 nfo. O mesmo não foi observado para as
cepas CC103 xthA e CC106 xthA. Assim este aumento deve-se exclusivamente à ausência
do gene nfo.
Mut
ante
s La
c+ /1
08 cél
s
0
100
200
300
400
CC101xth nfo (1)CC102 xth nfo (2)CC103 xth nfo (3)CC104 xth nfo (4)CC105 xth nfo (5)CC106 xth nfo (6)
1 2 3 4 5 6
Figura 14: Mutagênese induzida por UVB. A dose de UVB para todas as cepas foi de 6
kJ/m2, o que corresponde à DL10 das 6 cepas tratadas. Este resultado representa média de
no mínimo três experimentos.
4.1.2- Resultado com TBARS (Lipoperoxidação)
Como marcador molecular de estresse oxidativo foi utlilizado o parâmetro de
indicação de lipoperoxidação (TBARS). Esta técnica nos permitiu avaliar se as lesões
oxidativas induzidas por UVB em Escherichia coli estariam ocorrendo somente no DNA ou
se este agente também estaria ocasionando estresse oxidativo na membrana da célula. Nós
verificamos que houve um pequeno aumento nos níveis de TBARS, indicador de
lipoperoxidação para todas as cepas tratadas. E este aumento na concentração de MDA,
produto da peroxidação, foi semelhante para as todas as cepas como pode ser visto na
figura 12. Houve um aumento significativo para as cepas tratadas com UVB. Este aumento
nos níveis de lipoperoxidação já foi visto por Semchyshyn e colaboradores em 2005
quando observaram um aumento da ordem de 2,1 vezes para células tratadas com peróxido
de hidrogênio 5 µM em relação ao não tratado e aumento da ordem de 3,7 vezes para
células tratadas com peróxido a 20 µM. É importante lembrar que os resultados expressos
na figura 15 foram padronizados com a concentração de proteínas.
TBARSC
once
ntra
ção
MD
A (
nmol
es/m
g de
ptn
)
0
2
4
6
WT
WT + UVB xthA + UVB
nfo
nfo + UVB
xthA
Figura 15: Medida de concentração de MDA das cepas AB1157 (Selvagem), BW9091
(xthA) e BW527 (nfo) após tratamento com UVB
4.2- Resultados com Leveduras.
4.2.1- Sobrevivência celular
Os primeiros estudos sobre a reparação foram realizados em procariotos e
eucariotos unicelulares. Dentre estes últimos figura a levedura, um organismo eucarioto,
dado o grande número de mutantes disponíveis, deficientes nas diversas vias metabólicas e
de reparação. Vale frisar que as leveduras apresentam similaridade com as células de
mamíferos, por exemplo, vários genes de reparação de DNA de leveduras possuem seus
similares funcionais em células de mamíferos (Friedberg et al., 2006).
Nos resultados que seguem foram utilizados os similares funcionais dos genes nfo,
xthA e nfo xthA de bactéria, que são os genes de grande importância na reparação das lesões
induzidas por UVB no DNA de Escherichia coli. Há duas famílias de AP endonucleases
que estão envolvidas no reparo dessas lesões. Uma dessas é a AP endonuclease IV (nfo)
que possui cerca de 10% do total da atividade AP endonucleolítica em células bacterianas,
cujo homólogo funcional em levedura é apn1 que possui cerca de 90% da atividade AP
endonucleolítica em células de leveduras. A segunda família inclui a Exonuclease III (xthA)
de E. coli cujo homólogo funcional em levedura é apn2 e em humanos é a proteína Ape1
(Unk et al., 2001).
Na figura 16 podemos observar que a cepa apn2 se mostrou mais sensível ao
tratamento com UVB quando comparada com as demais cepas. O duplo mutante apn1 apn2
apresentou sensibilidade intermediária aos simples mutantes apn1 e apn2. Assim como foi
visto com os genes similares em bactéria.
Sobrevivência ao UVB
Dose kJ/m 2
0 5 10 15 20
Fra
ção
de S
obre
viên
cia
1e-5
1e-4
1e-3
1e-2
1e-1
1e+0
apn1
apn2 apn1 apn2
WT
WT
apn1
apn1 apn2
apn2
Figura 16: Sobrevivência das cepas FF 18733 (Selvagem), BPS1088 (apn1), BPS 1085
(apn2) e BPS 1087 (apn1 apn2) após tratamento com UVB. Estes resultados representam
média de no mínimo três experimentos.
Na figura 17 podemos observar que as cepas apresentaram níveis semelhantes de
sensibilidade ao UVC diferentemente do que foi visto após o tratamento com UVB.
Sobrevivência ao UVC
Dose J/m 2
0 20 40 60 80 100 120
Fra
ção
de S
obre
vivê
ncia
0,0001
0,001
0,01
0,1
1
WT apn 1apn 2
apn1 apn2
Figura 17: Sobrevivência das cepas FF 18733 (Selvagem), BPS1088 (apn1), BPS 1085
(apn2) e BPS 1087 (apn1 apn2) após tratamento com UVC. Estes resultados representam
média de no mínimo três experimentos.
Quando pré–tratamos as cepas com dipiridil o que observamos foi uma significativa
diminuição da sensibilidade da cepa apn1 e apn2. A cepa apn1 se apresentou próxima à
cepa selvagem enquanto que para a cepa apn2 verificamos que houve uma pequena
diminuição na sensibilidade, como pode ser visto na figura 18. Na figura 16 observamos
que a sensibilidade das cepas é maior quando não pré - tratadas com dipiridil. A cepa apn2,
após o pré – tratamento com dipiridil (figura 18) apresenta uma sensibilidade semelhante a
sensibilidade da cepa apn1 com dipiridil (figura 16).
Sobrevivência após pré - tratamento com dipiridil
Dose kJ/m 2
0 5 10 15 20
Fra
ção
de S
obre
viên
cia
1e-5
1e-4
1e-3
1e-2
1e-1
1e+0
apn1
apn2 apn1 apn2
WT
WT
apn1
apn1 apn2
apn2
Figura 18: Sobrevivência das cepas FF 18733 (Selvagem) BPS1088 (apn1), BPS 1085
(apn2) e BPS 1087 (apn1 apn2) pré-tratadas com dipiridil 1 mM e submetidas à radiação
UVB. Estes resultados representam média de no mínimo três experimentos.
4.2.2- Resultados de mutagênese
No trabalho feito com bactérias foi verificado um aumento na mutagênese das cepas
nfo e xthA nfo, o mesmo não foi visto com o simples mutante xthA. Desta forma,
verificamos que o aumento de mutantes resistentes ao antibiótico rifampicina deve-se
essencialmente à mutação nfo. Interessantemente, quando fomos avaliar a mutagênese para
levedura verificamos um aumento na mutagênese das cepas apn1 e apn1 apn2, que
correspondem aos similares de bactéria nfo e xthA nfo, respectivamente, (Quadro 5 e figura
19).
Abaixo temos um quadro com os valores do número CanR/107 céls para UVB.
UVB Selvagem apn1 apn1 apn2 apn2
Espontâneo 3,0 ± 0,3 4,5 ± 0,6 1,5 ± 0,1 1,0 ± 0,2
DL10 2250 ± 250 3533,9 ± 351,9 3127,4 ± 47,0 335,4 ± 123,2
Quadro 5: Mutagênese das cepas FF 18733 (Selvagem), BPS1088 (apn1), BPS 1085
(apn2) e BPS 1087 (apn1 apn2) após tratamento com UVB. Destaque em negrito para o
aumento do número de mutantes para as cepas apn1 e apn1apn2.
CA
NR m
utan
tes/
107 c
els
0
1000
2000
3000
4000
5000
WT
apn1
apn2
apn1apn2
Figura 19: Mutagênese das cepas FF 18733 (Selvagem), BPS1088 (apn1), BPS 1085
(apn2) e BPS 1087 (apn1 apn2) após tratamento com UVB. Estes resultados representam
média de no mínimo três experimentos.
O pré–tratamento dessas cepas com 2,2’ dipiridil e posterior tratamento com UVB
resultou na diminuição significativa do número de mutantes CanR como pode ser visto na
figura abaixo.
CA
NR m
utan
tes
/107 c
éls
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
40001)WT sem dip
2)WT com dip
3)apn1 sem dip
4)apn1 com dip
5)apn2 sem dip
6)apn2 com dip
7)apn1 apn2 sem dip
8)apn1 apn2 com dip
1 2 3 4 5 6 7 8
Figura 20: Mutagênese das cepas FF 18733 (Selvagem), BPS1088 (apn1), BPS 1085
(apn2) e BPS 1087 (apn1 apn2) após tratamento com UVB, pré –tratadas ou não com
dipiridil 1 mM. Estes resultados representam média de no mínimo três experimentos.
Este aumento da ordem de 3000 mutantes/107 céls para as cepas apn1 e apn1apn2 é
especifica para UVB. Como pode ser visto na figura a seguir o mesmo não acontece para
UVC. O aumento de mutagênese para UVC é pequeno quando comparado com os níveis de
mutagênese para UVB.
Mutagênese UVC
CA
NR m
utan
tes/
107 c
éls
0
100
200
300
400
500
WT
apn1
apn2
apn1 apn2
Figura 21: Mutagênese das cepas FF 18733 (Selvagem), BPS1088 (apn1), BPS 1085
(apn2) e BPS 1087 (apn1 apn2) após tratamento com UVC. Estes resultados representam
média de no mínimo três experimentos.
4.3- Obtenção de clones de mutantes CanR
A maneira mais direta e mais completa de se obter um espectro de mutações
espontâneas ou induzidas consiste no sequênciamento do gene alvo do DNA cromossômico
em um sistema de mutagênese direta (forward mutation). Os mutantes CanR correspondem
a esta definição. Para isto foram obtidos os seguintes números de clones:
Cepas Espontâneo
sem dipiridil
Espontâneo
com dipiridil
DL10
sem dipiridil
DL10
com dipiridil
Selvagem 43 36 35 43
apn1 41 34 37 40
apn2 38 40 45 35
apn1 apn2 39 40 35 37
Quadro 5: Número de colônias CanR selecionadas para posterior sequenciamento.
5- Discussão
Quando analisamos o sistema de reparo de organismos procarióticos e eucarióticos
podemos observar uma grande similaridade nas vias que estes organismos utilizam para
reparar as lesões no DNA. O genoma de ambas as espécies de organismos está sujeito às
mesmas reações químicas gerando os mesmos substratos lesados para as proteínas
envolvidas no reparo (Augusto-Pinto et al., 2003).
AP endonucleases têm um papel importante no reparo das lesões no DNA. A perda
de purinas e pirimidinas origina o surgimento de sítios apurínicos e apirimidínicos, sítios
AP, que são reparados após a ação de AP endonucleases, que catalisam a incisão adjacente
aos sítios AP preparando o DNA para as próximas etapas do reparo como excisão e ligação.
Esta via é a mesma em bactérias e leveduras. Contudo, há diferenças no sistema de reparo
de bactérias e organismos eucarióticos. Neste último o cenário metabólico é mais complexo
e possui participação de um número maior de proteínas envolvidas no reparo das lesões
(Augusto-Pinto et al., 2003).
A fim de compararmos o sistema de reparo desses dois organismos diferentes este
trabalho vem avaliar a participação das proteínas envolvidas no reparo das lesões
originadas pelo agente ultravioleta B no DNA de um organismo procariótico, Escherichia
coli e outro eucariótico, Saccharomyces cerevisiae.
Iniciamos este estudo analisando a relativa importância das lesões oxidativas na
genotoxicidade induzida por luz ultravioleta B utilizando cepas de E. coli deficientes nas
duas principais AP endonucleases envolvidas no reparo por excisão de bases. Com objetivo
de discriminar o efeito oxidativo do UVB foi utilizado como controle a radiação
ultravioleta C, cuja lesão clássica e o dímero de pirimidina.
Trabalhos anteriores têm sugerido que a radiação UVB é capaz de gerar espécies
oxidativas ocasionando lesões no DNA (Heck et al., 2003).
Em nossos estudos, nós demonstramos que a cepa mutante xthA é rapidamente
inativada por UVB mas não por UVC quando comparada com a cepa selvagem, figura 5 e
6. Isso nos mostra que a sensibilidade do mutante xthA deve-se à toxicidade típica do UVB
e não ao clássico CPD originado pelo UVC. Sabe-se ainda que esta sensibilidade de xthA
pode ser abolida com o quelante dipiridil (Souza et al., 2006). Este fato sugere que a
geração das espécies oxidativas por UVB pode ocorrer via reação de Fenton.
Assim como a Exo III, a Endo IV também está envolvida no reparo dos sítios AP
(Saporito et al., 1989). No entanto, em nosso trabalho observamos que o reparo desses
sítios está sendo realizado fundamentalmente pela Exo III, já que a cepa xthA se mostrou
muito mais sensível quando comparada com a cepa nfo que apresentou sensibilidade
semelhante à da cepa selvagem. Sabe-se que apesar da Endo IV ter um papel AP
endonucleolítico semelhante a Exo III, que consiste em clivar o lado 5’ do sítio AP, a
atividade da Endo IV representa menos de 10%, sendo somente requerida na ausência de
Exo III (Cunningham et al., 1986).
Sítios AP são os principais “ameaçadores” da informação genética, visto que são
capazes de bloquear a replicação do DNA, a transcrição e originar mutações. Sítios AP
podem também originar quebras simples 3’ ou 5’ altamente tóxicas. Estes resultados
sugerem que sítios AP não são compatíveis com a vida na ausência de reparo (Boiteux &
Guillet., 2004).
Endo IV não está sendo requerida para o reparo das lesões letais induzidas por
UVB, mas parece ter grande participação na reparação das lesões mutagênicas induzida por
este agente, figura 7.
Wang et al., 1998 estudaram in vitro lesões aleatórias ou sítio específicas na
molécula de DNA para avaliar interações com várias DNA polimerases e verificaram que
se a lesão promove uma distorção no DNA e bloqueia a progressão da DNA polimerase na
molécula esta lesão é considerada potencialmente letal. Porém, se a lesão não promove uma
distorção estrutural, a DNA polimerase insere bases não complementares e a lesão é
considerada mutagênica (Wallace, 2002). Algumas lesões não são mutagênicas nem letais,
enquanto outras são letais ou mutagênicas. Em nosso trabalho há lesões essencialmente
letais, como pode ser verificado pela sensibilidade da cepa xthA. Entretanto, na cepa nfo
verificamos um elevado nível de mutagênese induzida pelo UV-B. Isto indica que as lesões
substrato para Endo IV têm caráter mutagênico uma vez não reparadas (quadro 4).
Dentre as pirimidinas oxidadas, sabe-se que timina oxidada não tem papel
significativo na indução de mutagênese. Em contraste com a timina, a citosina oxidada é
essencialmente mutagênica (Wallace, 2002). O principal produto resultante da ação do
radical hidroxil na citosina é a citosina glicol, que é altamente instável e desamina
facilmente originando uracil glicol, podendo dehidratar originando 5-hidroxicitosina (5-
OHC) ou 5- hidroxiuracil (5-OHU). Estes produtos não bloqueiam a DNA polimerase,
portanto, citosina oxidada seria uma lesão não letal e principalmente mutagênica (Wallace,
2002).
Com os trabalhos de Ischenko & Saparbaev (2002) foi verificado que a Endo IV
possui outra atividade além da atividade 5’ AP endonucleolítica, podendo também
reconhecer pirimidinas oxidadas e outros produtos como α-deoxiadenosina, que não são
substratos para DNA glicosilase, sugerindo assim, uma nova via de reparo das lesões
oxidativas, no qual Endo IV funcionaria auxiliando as DNA glicosilases, porém incisando a
cadeia fosfodiéster a 5’ da base oxidada.
As cepas CC103 e CC106 deficientes no gene nfo apresentaram aumento na
mutagênese. O aumento de transversões CG→GC pode ser atribuído a 5-hidroxicitosina.
Como foi discutido anteriormente, a radiação UVB pode gerar ERO via reação de Fenton.
Esta reação gera o radical OH• (Cooke et al., 2003). O principal produto resultante do
ataque do radical hidroxil no DNA é a citosina glicol que é altamente instável e
rapidamente dehidrata para 5-hidroxicitosina (5-OHC) (Wallace et al., 2002). O
pareamento de 5-OHC ocorre frequentemente com guanina bem como adenina, e em menor
freqüência com citosina (Purmal et al., 1994). Esta lesão não bloqueia a DNA polimerase
que segue inserindo nucleotídeos, por isto citosinas oxidadas não são classificadas como
lesões letais e sim mutagênicas, aumentando as transições C→T e as transversões C→G
(Susan et al., 2002). Este específico aumento no mutante nfo pode ser atribuído a uma outra
atividade da Endo IV diferente da atividade de AP endonuclease como foi mencionado
anteriormente. Esta atividade é o reparo por incisão de nucleotídeo (NIR), no qual Endo IV
reconhece e incisa DNA contendo pirimidinas oxidadas, incluindo a 5-hidroxicitosina. E a
única proteína de E. coli identificada e envolvida neste reparo é a Endo IV (Ischenko &
Saparbaev., 2002).
Entre os diferentes substratos que podem ser reconhecidos por Endo IV tem-se a α-
deoxiadenosina (αdA). Esta lesão é originada pela abstração do hidrogênio do C1’ por um
radical hidroxil, mas a base permanece totalmente intacta (Shimizu et al., 1997). Nos
trabalho de Ide et al., 1994 verificou-se que no oligonucleotídeo contendo αdA é
incorporado dC e dA, bem como a incorporação correta do nucleotídeo dT sugerindo que
αdA constitui uma lesão pré mutagênica in vivo. Nos trabalhos realizados in vitro por
Shimizu e colaboradores foi verificado que αdA é uma lesão potencialmente mutagênica.
As enzimas Endo IV de Escherichia coli e Apn1 de Saccharomyces cerevisiae são
capazes de reconhecer este tipo de lesão (Shimizu et al., 1997).
Na presença da lesão αdA a capacidade de polimerização in vivo é cerca de 20%
normal, isto significa cerca de 20 vezes mais que a replicação de sítios AP, que é um forte
bloqueador da replicação (Shimizu et al., 1997).
Interessantemente, o uso de dipiridil diminuiu consideravelmente a mutagênese das
cepas CC103 nfo e CC106 nfo induzidas por UVB, corroborando a participação de radicais
OH• na geração das lesões mutagênicas nas células nfo, além de reforçar a idéia da presença
da lesão αdA na origem da substituição de base AT→GC.
O fato das células nfo serem sensíveis a mutação induzidas por UVB está
relacionado à participação desta enzima no reparo das lesões, uma vez que na presença de
nfo os níveis de mutagênese são consideravelmente menores como pode ser visto na figura
12, no qual as células são xthA e possuem o gene nfo funcionante.
Quando o mesmo trabalho foi feito com o duplo mutante xthA nfo a mutagênese
aumenta, semelhante ao que ocorreu com o simples mutante nfo. Sabe-se que Endo IV e
não ExoIII, está envolvida na via de reparo NIR sendo capaz de incisar o DNA contendo
lesões geradas pelo estresse oxidativo (Ishchenko et al., 2005). Diferentemente de Endo IV
a Exo III não reconhece lesões do tipo αdA. Isto sugere que Endo IV pode ser responsável
pelo reparo de uma nova classe de lesão que não é reconhecida por Exo III e nenhuma AP
liase (Ide et al., 1994).
O nível de lipoperoxidação em bactéria foi medido via TBARS. Neste trabalho nós
observamos diferença na concentração de MDA das cepas não tratadas e nas cepas tratadas
com UVB. Indicando que a radiação UVB é capaz de ocasionar oxidação e que esta não
ocorre somente no DNA, mas também na membrana da célula aumentando os níveis de
lipoperoxidação. Uma vez que, níveis elevados de ERO são produzidos em sistemas
celulares, uma resposta enzimática antioxidante é ativada. Entretanto, estes níveis podem
extrapolar a capacidade catalítica das diferentes enzimas responsivas, fazendo com que uma
quantidade significativa de ERO passe a não ser destruída e então reagir com diferentes
biomoléculas do sistema, tais como lipídeos (Goulart et al., 2005).
Nossos resultados indicam que, a radiação UVB é capaz de ocasionar oxidação e
que esta não ocorre somente no DNA e além disso, podemos observar que as diferentes
sobrevivências celulares não são devidas a níveis diferentes de oxidação membranar, mas
sim devido às diferenças de capacidade de reparo de DNA.
Em S. cerevisiae, Apn1 e Apn2 estão envolvidas no reparo de lesões ocasionadas
por agentes oxidantes como H2O2, assim como no reparo de certos tipos de lesão como fita
simples contendo 3’ fosfato ou 3’ fosfoglicolato terminal (Unk et al., 2001). A Endo IV de
E. coli é homóloga da proteína Apn1 de S. cerevisiae. Enquanto em E. coli esta proteína
possui cerca de 10% da atividade AP endonuclease em S. cerevisiae Apn1 constitui mais de
90% da atividade AP endonuclease e uma maior participação no reparo de sítios AP quando
comparada com Apn2 (Unk et al., 2002).
Em nosso trabalho verificamos que Apn1 possui menor sensibilidade ao tratamento
com UVB quando comparada com a cepa Apn2. Este resultado foi ao encontro do
verificado em E. coli com as cepas homólogas. Mostrando a semelhança do efeito de UVB
para organismos procarióticos e eucarióticos, além da especificidade uma vez que, isto
ocorre somente para UVB, já que com UVC todas as cepas se mostraram resistentes ao
tratamento, figura (16 e 17).
Quando as células foram pré–tratadas com o quelante dipiridil observamos que
houve uma significativa proteção para a letalidade.
Nos trabalhos de Melo e colaoradores em 2004, também foi observado que o pré-
tratamento com dipiridil e posterior tratamento com H2O2 não diminui a sensibilidade das
cepas testadas. Provavelmente isto se deve ao fato dos íons de ferro não quelados pelo
dipiridil estarem sendo suficiente para ocasionar a letalidade da cepa Apn2.
Na mutagênese com leveduras foi observado elevado aumento de mutantes das
cepas Apn1 e Apn1 Apn2 assim como ocorreu em bactérias, este aumento foi da ordem de
3000 mutantes/107 células para o tratamento com UVB e da ordem de 400 mutantes/107
após o tratamento com UVC. Mostrando que as lesões que estão elevando os níveis de
mutagênese são específicas da radiação UVB e que estas são reconhecidas principalmente
por Apn1 e, além disso, esta enzima está atuando no reconhecimento de uma classe de
lesão que não é reconhecida pela AP endonuclease Apn2. Esta lesão provavelmente é
originada pela atuação de ERO como o radical OH•, uma vez que na presença do quelante
de ferro este radical não estaria sendo gerado e consequentemente o número de mutantes
diminui drasticamente como pode ser visto na figura 19. Em humanos, a endonuclease que
atua como Endo IV e Apn1 no reparo por incisão de nucleotídeo é Ape 1, porém esta é
homóloga de ExoIII em bactéria (Gros et al., 2004).
As lesões oxidativas são identificadas como importantes causas das desordens
degenerativas tais como: câncer, doenças cardiovasculares e disfunções cerebrais. Sabe-se
que o BER é o principal mecanismo de reparo destas lesões e que este reconhece substratos
em comum com o NIR no reparo das lesões potencialmente mutagênicas e citotóxicas
(Gros et al., 2004). Avaliando o mecanismo de reparo envolvido nas diferentes classes de
lesões podemos sugerir que o NIR seria o principal mecanismo de reparo das lesões
mutagênicas induzidas por UVB. Enquanto para UVA seria o BER e para UVC o NER.
6-Conclusão
6.1- Conclusões – Bactérias
• A sensibilidade xthA → toxicidade típica do UVB e não ao clássico CPD →UVC
• Exo III (xthA) e Endo IV (nfo) → atividade AP endonucleolítica → sítios AP → Exo III
• Endo IV não está sendo requerida para o reparo das lesões letais induzidas por UVB
• O aumento de transversão GC→ CG (CC103 nfo e CC103 xthA nfo) pode ser atribuída a
5-hidroxicitosina (5-OHC)
• UVB gera radicais OH• que podem gerar no DNA produtos como citosina glicol, que é
instável e pode resultar na 5-hidroxicitosina
• O pareamento de 5-OHC ocorre frequentemente com guanina bem como adenina → ↑
transversões C →G e transições C →T
• O específico aumento da mutagênese UVB no mutante nfo deve-se a outra atividade de
nfo diferente da AP endonucleolítica
• NIR reconhece e incisa DNA contendo pirimidinas oxidadas incluindo a 5-
hidroxicitosina (Saparbaev et al., 2004).
• Além de Endo IV de bactéria Apn1 de levedura também participa do reparo de lesões
induzidas pelo UVB, reconhecendo provavelmente a α - deoxiadenosina
• Diferente de Endo IV a Exo III não reconhece lesões do tipo α-dA
6.2- Conclusões – Leveduras
● Há semelhança do efeito do UVB para organismos procarióticos e eucarióticos
● Além da semelhança há uma especificidade para UVB uma vez que todas as cepas se
mostram resistentes ao tratamento com UVC
● Em levedura a cepa mais sensível foi apn2 cujo similar em bactéria é xthA, que foi a
cepa que se mostrou mais sensível ao UVB.
● As lesões mutagênicas são reconhecidas por Apn1
● São lesões originadas provavelmente pela atuação de EAO como o radical OH• , uma vez
que, quando pré-tratamos com dipiridil o número de mutantes diminui.
● O NIR seria o principal mecanismo de reparo que estaria atuando no reparo das lesões
induzidas por UVB
7-Perspectiva
Pretendemos sequenciar um número suficiente (30-40) de mutantes CanR das cepas
selvagem e dos mutantes apn1, apn2 e apn1 apn2.
Este sistema apresenta como vantagens o espectro completo das mutações e
mutações em um gene cromossômico transcrito.
O resultado obtido permitirá analisar se a mutagênese induzida por UVB em
leveduras é semelhante ou não a mutagênese induzida por UVB em bactérias.
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L.L.Souza, I.R.Eduardo, M.Pádula1 and A.C.Leitão* Laboratório de Radiobiologia Molecular, Instituto de Biofisica Carlos
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