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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis
ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO FEDERAL
LORENA FERNANDES ARRUDA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS
BRASÍLIA / DF
MAIO / 2006
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO
FEDERAL
LORENA FERNANDES ARRUDA
ORIENTADOR: JOSÉ RENATO JUNQUEIRA BORGES
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PUBLICAÇÃO: 224/2006
BRASÍLIA/DF
MAIO/2006
ii UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO
FEDERAL
LORENA FERNANDES ARRUDA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO SUBMETIDA À FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA DA UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA, COMO PARTE DOS REQUISITOS NECESSÁRIOS À OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS NA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO DE DISCIPLINAS DE PRODUÇÃO ANIMAL. APROVADA POR: ___________________________________________ JOSÉ RENATO JUNQUEIRA BORGES, DOUTOR (UnB) CPF: 400975447 - 87 E-mail: [email protected] ___________________________________________ SIMONE PERECMANIS, DOUTORA (UnB) CPF: 010126137 - 39 E-mail: [email protected] ___________________________________________ TÂNIA MARIA DE PAULA LYRA, DOUTORA (UNIPLAC) CPF: 059611221-15 E-mail: [email protected]
BRASÍLIA/DF, 04 de MAIO de 2006.
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Arruda, Lorena Fernandes GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO FEDERAL / Lorena Fernandes Arruda; orientação de José Renato Junqueira Borges. – Brasília, 2006. 41 p. : il. Dissertação de Mestrado (M) – Universidade de Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2006.
1. Corynebacterium pseudotuberculosis. 2. Linfadenite Caseosa. 3. Genotipagem. 4. Ovinos. I. Borges, J.R.J. II. Doutor.
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ARRUDA, L. F. Genotipagem de amostras de Corynebacterium pseudotuberculosis originadas de casos de Linfadenite Caseosa no Distrito Federal. Brasília: Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2006, 41 p. Dissertação de Mestrado. CESSÃO DE DIREITOS NOME DO AUTOR: Lorena Fernandes Arruda TÍTULO DA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO: Genotipagem de amostras de Corynebacterium pseudotuberculosis originadas de casos de Linfadenite Caseosa no Distrito Federal. GRAU: Mestre ANO: 2006 É concedida à Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta dissertação de mestrado e para emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e nenhuma parte desta dissertação de mestrado pode ser reproduzida sem a autorização por escrito do autor. _______________________________________ Lorena Fernandes Arruda CPF: 832523631-00 QNB 11 casa 09 – Taguatinga Norte CEP – 72115-110 - Brasília / DF - Brasília (61) 33515521 / 92759361 [email protected] , [email protected]
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus por ter concedido proteção, sabedoria, misericórdia e
perseverança para a realização de mais um objetivo em minha vida, sempre ao
meu lado mostrando o caminho correto a seguir.
Aos meus pais, Diva e Francisco, e as minhas irmãs, Andréa e Sandra,
pelo apoio, oportunidade de estudo e incentivo.
Ao professor Dr. José Renato Junqueira Borges por ter acreditado em
meu trabalho, por ter sido um exemplo profissional e humano e a oportunidade
de crescimento científico.
A professora Dra. Simone Perecmanis pelo auxílio durante todo o
desenvolvimento dos experimentos, sempre apoiando com os conhecimentos
intelectuais, morais e amigos, nunca deixando o cansaço e o desespero atingir
o desenrolar da dissertação. Obrigada pelo tempo dedicado e a convivência
almejando o fim de mais uma etapa.
Ao professor Dr. Bergmann Moraes Ribeiro por ter concedido o espaço e
a tecnologia de seu laboratório para o desenvolvimento dos experimentos
moleculares.
Ao Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade de Brasília pelo
espaço cedido para a realização da parte molecular da dissertação.
Aos técnicos Hudson, Nara e Daniela do Laboratório de Microbiologia
Veterinária da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade
de Brasília pelo apoio técnico nos ensaios microbiológicos.
Aos colegas de trabalho, Alice, Bruno, Luis Alberto, Luis Finotti e Silvio
pelo auxílio a campo.
Aos colegas do Laboratório de Microscopia Eletrônica, Raimundo Wagner,
Roberto, Mariana, Greice, Ramon e Suzane, pelo apoio técnico e amizade na
parte molecular dos experimentos.
E aos sempre e eternos amigos de qualquer hora e situação, Alice, Ana,
André, Caroline, Daniel, Camila, Fabio, Juliana, Leandro, Liandra, Marceli,
Marcos, Simone, Teresinha, Wilson, por sempre me apoiarem a dedicação ao
trabalho, aceitarem os estresses, as ausências de tempo e as crises!
“Feliz do homem que encontrou a sabedoria, daquele que adquiriu a
inteligência, porque mais vale este lucro que o da prata, e o fruto que se obtém
é melhor que o fino ouro”.
(PROVERBIOS 3:13-14)
v ÍNDICE
Capítulos/Sub-capítulos Página 1. INTRODUÇÃO GERAL 1
2. OBJETIVOS 2
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3
3.1. A Ovinocultura no Mundo e no Brasil 3
3.2. Fatores Sanitários que Interferem com a Criação 4
3.3. Descrição da Doença 5
3.4. Prevalência da Doença e Diagnóstico 6
3.5. Caracterização do Microorganismo 7
3.6. Vias de Entrada e Patogenia 8
3.7. A Utilização de Técnicas Moleculares para o Estudo Genômico de Microorganismos
10
3.7.1. Reação de Polimerização em Cadeia 10
3.7.2. Análise de Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos de Restrição (RFLP) na Modalidade de RFLP locus Específico
13
4. MATERIAL E MÉTODOS 16
4.1. Coleta das Amostras 17
4.2. Cultivo e Estocagem 20
4.3. Atividade Bioquímica 20
4.4. Extração do DNA Genômico 21
4.5. Reação de Amplificação e Digestão do DNA 22
5. RESULTADOS 23
5.1. Cultivo e Identificação Bioquímica 23
5.2. Extração Genômica e PCR 26
5.3. Análise de Restrição de Fragmentos de Polimorfismo em locus Específico
29
6. DISCUSSÃO 33
7. CONCLUSÕES 37
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 38
vi
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura PáginaFigura 1 Método de extração de ácidos nucléicos. 12
Figura 2 Reação de Polimerização em Cadeia. 15
Figura 3 Aprisco visitado em uma das coletas. 16
Figura 4 Imagem dos Linfonodos caseosos fechados. 17
Figura 5 Etapas do procedimento das coletas. 19
Figura 6 Placa de ágar sangue com crescimento de colônias de
Corynebacterium pseudotuberculosis
23
Figura 7 Lâmina corada pelo método de Gram de células
bacterianas em paliçada características de
Corynebacterium pseudotuberculosis ao microscópio
óptico (1000X).
24
Figura 8 Perfil da reação de nitrato – resultado negativo para
todas as amostras.
25
Figura 9 Padrão não inoculado das atividades bioquímicas:
sacarose, uréia, glicose, gelatina, trealose, arginina,
controle da arginina, maltose e lactose respectivamente.
25
Figura 10 Perfil das atividades bioquímicas com os meios
inoculados com as amostras de C. pseudotuberculosis.
(sacarose, uréia, glicose, gelatina, trealose, arginina,
controle da arginina, maltose e lactose respectivamente).
26
Figura 11 Confirmação da extração do DNA genômico 27
Figura 12 Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) das
amostras testadas.
28
Figura 13 Digestão do gene 16S com a enzima EcoRV. 30
Figura 14 Digestão do gene 16S com a enzima Hind III. 31
vii
ÍNDICE DE QUADROS
Quadro PáginaQuadro 1 Padrão dos testes de atividades bioquímicas realizadas
com as amostras testadas.
24
Quadro 2 Resultados das amostras em todos os procedimentos
realizados.
32
viii
Lista de Símbolos e Abreviações
ASCOB – Associação de Criadores de Ovinos de Brasília.
C. pseudotuberculosis – Corynebacterium pseudotuberculosis.
DF – Distrito Federal.
DNA – Ácido Desoxirribonucléico.
EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético.
PCR - Reação de Polimerização em Cadeia
RFLP – Polimorfismos do Comprimento de Fragmentos de Restrição. RNA – Ácido Ribonucléico.
rDNA - Ácido Desoxirribonucléico ribossômico.
rRNA – Ácido Ribonucléico ribossômico.
RESUMO GERAL
GENOTIPAGEM DE AMOSTRAS DE Corynebacterium pseudotuberculosis
ORIGINADAS DE CASOS DE LINFADENITE CASEOSA NO DISTRITO
FEDERAL
O Corynebacterium pseudotuberculosis é amplamente distribuído entre as
populações de ovinos em todo o mundo causando a linfadenite caseosa.
Raramente infecta humanos, mesmo que aqueles tenham contato direto com
os animais infectados e é responsável por sérias perdas econômicas na
produção indústria de ovinos. A alta variabilidade nas características de cultura
e bioquímica do Corynebacterium pseudotuberculosis tem sido investigada pela
análise por endonucleases de restrição. O objetivo do estudo foi caracterizar os
isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis no Distrito Federal, com base
na sua cultura, características bioquímicas e a genotipagem para estabelecer
se há a diversidade genética e através desta traçar uma correlação com a
origem dos rebanhos utilizados, para a elaboração de um programa de
rastreamento da doença. Através da amplificação do gene 16S por PCR
observou-se dois padrões distintos. A partir de 31 amostras analisadas 22
foram amplificadas e submetidas à análise de RFLP obtendo-se dois padrões
entre as digestões dos produtos amplificados por EcoRV e de digestão com
Hind III. Foram encontrados assim, três diferentes perfis entre as cepas de C.
pseudotuberculosis das amostras analisadas. A autora conclui que através da
biologia molecular é possível evidenciar amostras epidemiologicamente
relacionadas, e que deve ser usado para controlar a disseminação do
Corynebacterium pseudotuberculosis e reduzir os prejuízos causados pela
linfadenite caseosa. Palavras Chaves Corynebacterium pseudotuberculosis, linfadenite caseosa, genotipagem.
ABSTRACT
GENOTYPING of Corynebacterium pseudotuberculosis ISOLATED from
CASEOUS LYMPHADENITIS CASES in DISTRITO FEDERAL
Corynebacterium pseudotuberculosis is widely distributed among animal
populations, causing caseous lymphadenitis in sheep and goats. Commonly
causes suppurative lymphadenitis domestic animals but only rarely infects
humans, even those having close contact with infected animals and is
responsible for serious economic losses to the sheep industry. Caseous
lymphadenitis is prevalent worldwide but incidence is higher in areas where
intensive husbandry is practiced. Sheep industries worldwide suffer significant
economic loss due to the culling of infected animals, carcass condemnation,
and decreased wool production. Extensive variability in the cultural and
biochemical characteristics of Corynebacterium pseudotuberculosis has been
investigated by restriction endonuclease analysis. The aims of the study were to
characterize isolates of Corynebacterium pseudotuberculosis on the basis of
their culture, biochemical and genotyping to establish whether there was
genetic diversity and through this drawn up a correlation with the origin of the
flock to elaborate a program of tracking disease. Through the gene 16S
amplification by PCR observed two different patterns. From 31 samples
analyzed 22 amplified e were submitted by a RFLP analysis obtain two patterns
among the digestion of the amplicons by EcoRV and Hind III digestion.
Therefore obtain 3 different profiles among Corynebacterium C.
pseudotuberculosis strains analyzed samples. The author concluded that
through molecular biology its possible evidence samples related
epidemiologically and must use to control the dissemination of Corynebacterium
pseudotuberculosis and to reduce losses caused by caseous lymphadenitis.
Key words Corynebacterium pseudotuberculosis, caseous lymphadenitis, genotyping.
1. INTRODUÇÃO GERAL
A ovinocultura desde que racionalmente explorada e conduzida em
sintonia com os aspectos de ambiente, econômico e social, é uma excelente
alternativa para os diferentes ecossistemas existentes no Brasil (SIMPLÍCIO,
2001). Esta atividade foi melhor desenvolvida e apresenta maior concentração
nas regiões semi-áridas dos Estados Nordestinos.
Nos últimos anos, a criação da espécie vem sendo incrementada em
outras regiões do país, como alternativa econômica e nutricional de populações
de baixa renda, visando a produção de lã e pele e o consumo de leite e carne,
bem como na fabricação de queijos e sucedâneos lácteos para pacientes com
intolerância ao leite bovino.
O Centro Oeste, principalmente o Distrito Federal, tornou-se um grande
centro produtor de ovinos, e muitos rebanhos em formação são encontrados na
região.
Estes rebanhos apresentam em sua composição animais oriundos do
nordeste e do sul do Brasil, e trouxeram para a região doenças típicas da
ovinocultura dessas regiões como a Linfadenite caseosa dos ovinos.
O estudo e a diferenciação de cepas de Corynebacterium
pseudotuberculosis, microorganismo causador da linfadenite caseosa, pode vir
a auxiliar a criação de um programa local de controle da doença e de
rastreamento da mesma em nível nacional, sendo, portanto o tema principal
deste trabalho.
2. OBJETIVO
O objetivo do trabalho foi caracterizar diferentes amostras de
Corynebacterium pseudotuberculosis isoladas de ovinos no Distrito federal
provenientes de diversos Estados a partir da técnica de Análise de
Polimorfismos do Comprimento de Fragmentos de Restrição de locus
específico com a utilização da PCR do gene 16S ribossomal.
3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1. A Ovinocultura no Mundo e no Brasil
Os rebanhos mundiais de caprinos e ovinos são de aproximadamente
898.132 mil cabeças. O Brasil detém 22.487 mil cabeças, sendo 37% de
caprinos e 63% de ovinos. Em 1970 o rebanho de ovinos era da ordem de 18,3
mil animais, passando para 14,2 mil cabeças em 2001. Em termos de
distribuição por região, o rebanho ovino se encontra dividido da seguinte forma:
2,8% encontram-se na Região Norte, 49% no Nordeste, 2,8% no Sudeste, 40%
no Sul e 4,9% no Centro-Oeste. A Região Nordeste, detentora do maior
rebanho brasileiro de ovinos, abrange uma área total de 166,2 milhões de
hectares, dos quais 95,2 milhões (57%) estão inseridos na zona semi-árida. A
ovinocultura se apresenta mais importante nas microrregiões do Médio
Jaquaribe (CE) e Serrinha (BA). Cerca de 50% do rebanho de caprinos e
ovinos do Nordeste estão localizados em propriedades com menos de 30
hectares (VASCONCELOS; VIEIRA, 2004).
A atividade de ovinocultura também oferece perspectivas de negócios aos
criadores do Distrito Federal. A atividade conta hoje com um plantel de mais de
sete mil cabeças, contando com um mercado seguro para a sua produção. Em
1998, o consumo de carne de carneiro foi de 291,6 toneladas, equivalentes a
25.247 cabeças, representando um consumo per capita anual em torno de
0,150kg. Este mercado se apresenta como um centro consumidor bastante
atrativo uma vez que grande parte da população se origina do Nordeste, onde
o consumo de carnes ovinas e caprinas é uma tradição, alem disso, em Brasília
se concentra uma das mais elevadas rendas per capita do Brasil. Esta
demanda pode ser ainda substancialmente aumentada: estima-se que pode
chegar a 1.020,3 toneladas, ou 88.337 cabeças/ano (Emater, 2004).
3.2. Fatores Sanitários que Interferem com a Criação
Diferentes fatores sanitários são indicados como responsáveis pela
redução da produtividade. Parasitoses ou doenças multissistêmicas como a
micoplasmose, a listeriose, a artrite e encefalite caprina a vírus e a Linfadenite
Caseosa são alguns deles (ROSA, 1996).
Dentre estas doenças pode ser destacada a linfadenite caseosa – também
denominada “Mal do Caroço”, em virtude dos prejuízos provocados com a
queda na produção de leite e do comprometimento da pele, lã e carcaça,
chegando a causar uma redução de 4 a 7% na produção de lã, a qual resulta
em uma perda anual de aproximadamente R$ 15 milhões para a indústria de
ovinos (PATON et al, 2003).
A presença de abscessos nos linfonodos superficiais acarreta
desvalorização da pele para fins industriais. Os abscessos internos podem
freqüentemente provocar problemas respiratórios, hepáticos e com menor
freqüência, reprodutivo e nervoso. Nestes casos, os animais apresentam-se
extremamente caquéticos (ROSA, 1996).
No Rio Grande do Sul a linfadenite caseosa se apresenta como uma
doença subclínica, encontrada freqüentemente em frigoríficos, razão pela qual
causa perdas econômicas por condenação total ou parcial de carcaças e pode
significar uma limitante para a exportação de carne ovina. Foi observado
também que a freqüência da enfermidade aumenta à medida que aumenta a
idade dos animais (RIET-CORREA, 2001).
3.3. Descrição da Doença
A linfadenite caseosa ou mal do caroço é uma doença infecciosa causada
por uma bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis, manifestando-se por
abscedação caseosa dos linfonodos superficiais de caprinos e ovinos. A
doença é caracterizada pela formação de lesões necróticas encapsuladas ou
caseosas. Comumente são afetados os linfonodos submaxilares, pré-
escapulares, pré-femorais, supramamários e poplíteos, embora o agente
também esteja associado a casos de mastite, pneumonia crônica, linfadenite
mesentérica e pielonefrite, bem como o desenvolvimento de abscessos
subcutâneos e / ou em órgãos internos. O período de incubação é cerca de três
meses, (RIBEIRO et al, 2001; WALKER et al, 1994; GARCIA et al, 1987). A
mobilização das fontes de infecção é como um dos principais fatores que
interferem na difusão da doença.
Desta forma pode-se caracterizar como um importante determinante
epidemiológico da ocorrência da Linfadenite Caseosa, o trânsito dos animais
infectados.
A infecção do homem com o C. pseudotuberculosis é considerada
ocasional, e é caracterizada como zoonose ocupacional de ovinocultores, bem
como de profissionais ligados à criação destas espécies. A transmissão do
agente para o homem pode ocorrer pelo contato manual com material
purulento procedente de abscessos de pele, linfonodos, e ocasionalmente, pela
ingestão de leite de animais com mastite (RIBEIRO et al, 2001).
3.4. Prevalência da Doença e Diagnóstico
A prevalência atual da Linfadenite Caseosa em pequenos ruminantes é
usualmente subestimada, porque esta não é uma doença de notificação em
muitos países e também pelo fato de que os proprietários dos animais não
estão conscientes dos impactos econômicos e normalmente não aplicam as
orientações veterinárias para o manejo dos abscessos superficiais. Entretanto,
há uma taxa de 8 a 90% de casos reportados em alguns países referente ao
rebanho total (ÇETINKAYA et al, 2002).
A doença é prevalente em locais como Austrália, Nova Zelândia, Oriente
Médio, Ásia, África e partes da América do Norte e da América do Sul. A
linfadenite caseosa está sendo relatada mais frequentemente em países
britânicos e europeus (QUINN et al, 2005).
No Brasil os relatos mais comuns são localizados na região Nordeste com
uma alta prevalência nos rebanhos de ovinos e caprinos (COSTA, 2002). A
prevalência no Rio Grande do Sul, na região de Campanha, em ovinos
abatidos em frigoríficos foi de 8,09% em ovelhas e 1,53% em carneiros
castrados. No Rio de Janeiro foram estudados 13 rebanhos, 10 dos quais
estavam infectados, com uma prevalência média de 12,2% de animais com
sinais clínicos e 22,5% de animais infectados (RIET-CORREA, 2001).
O diagnóstico da doença é geralmente clínico, podendo ser também
sorológico (DERCKSEN et al, 2000), através de punção aspirativa (RIBEIRO et
al, 2001) ou através do cultivo do agente em meios enriquecidos, devendo a
coleta ser realizada com a drenagem dos abscessos.
3.5. Caracterização do Microorganismo
O gênero Corynebacterium é constituído por bactérias Gram-positivas,
pleomórficas, pequenas, que aparecem em forma cocóide, clavas ou bacilos,
imóveis e não esporuladas. As corinebactérias podem se apresentar em
esfregaços corados individualmente, em pares ou paliçadas e em grupos
angulares semelhantes a letras chinesas. São parasitas obrigatórios das
membranas de mucosas ou de pele de mamíferos e ocasionalmente podem ter
outra origem. Quanto ao requerimento de oxigênio podem ser aeróbias,
microaerófilas e anaeróbias facultativas. Crescem bem na maioria dos meios
de cultivo, mas algumas espécies requerem meios de cultura enriquecidos com
soro ou sangue e podem sobreviver por meses no meio ambiente. A maioria
das corinebactérias são catalase – positivas, oxidase – negativa. (QUINN et al,
2005; HIRSH e ZEE, 2003; MADIGAN et al, 1997; COYLE e LIPSKY, 1990) e
cresce no período de 48 a 72 horas em meio ágar sangue, formando colônias
pequenas (0,5 mm de diâmetro), esbranquiçadas, ressecadas com hemólise
nítida (www.nogueirafilho.com.br/corynebacterium.pdf - 24/09/04)
O C. pseudotuberculosis pode ser considerado um parasita intracelular
facultativo (www.nogueirafilho.com.br/corynebacterium.pdf - 24/09/04).
Os isolados de C. pseudotuberculosis originados de animais domésticos
são fenotipicamente heterogêneos, mas duas biovariedades (biovars) podem
ser diferenciadas. A maioria de isolados de eqüinos reduzem nitrato em nitrito
(biovar equi) enquanto as amostras de ovinos falham ao reduzir nitrato em
nitrito (biovar ovis). A análise por enzimas de restrição do DNA destes grupos
identifica diferenças entre isolados de biovares equi e ovis, mas as bases
fenotípicas e genotípicas diferenciais para a escolha do hospedeiro de
preferência do microorganismo não foram definidas (COSTA et al, 1998;
SONGER et al, 1990 e SONGER et al, 1988).
3.6. Vias de Entrada e Patogenia
O patógeno penetra no organismo através de ferimentos, arranhões ou
mesmo de pele intacta e alcança a linfa e atinge os linfonodos regionais. A
partir destes, podem ocorrer infecções sistêmicas. Em menores proporções
podem ser observadas as infecções por via respiratória, digestiva, genital e
cordão umbilical. O C. pseudotuberculosis produz uma exotoxina, a fosfolipase
D, que tem efeito vasogênico e ataca as células endoteliais, causando uma
reação necro-hemorrágica e, em conseqüência da lesão vascular há um
aumento da permeabilidade do vaso, que predispõe a disseminação da
bactéria do local da infecção primária para outros órgãos (ROSA, 1996; PUGH,
2002).
Outra atividade atribuída a fosfolipase D é a capacidade de hidrolisar
lisofosfatidilcolina e esfingomielina além de lisar eritrócitos de ovelha em
sinergismo com a colesterol oxidase e a fosfolipase C (SONGER et al, 1990).
Pesquisas mais recentes apontam como fatores de patogenicidade
também, proteínas como a PC 40 (protease corinebacteriana com 40kDa), cuja
caracterização preliminar é de serinoprotease, tem sido identificada como uma
proteína imunogênica em ovinos infectados e em uma experiência a campo
com preparações semipurificadas deste antígeno secretado mostrou que esta é
responsável por uma alta proteção relacionada a resposta mediada por células
(WILSON et al, 1995).
Após a invasão preliminar do sitio de entrada o C. pseudotuberculosis
atinge o sistema linfático e, os linfonodos, que ao serem afetados ficam
aumentados e exibem abscessos encapsulados característicos que, ao corte,
se parecem com “anéis de cebola”. O período de incubação até o abscesso
ser notado em linfonodos superficiais é tipicamente entre dois a seis meses ou
mais. O abscesso pode romper e drenar espontaneamente, contaminando o
meio ambiente (QUINN et al, 2005; SMITH E SHERMAN, 1994).
3.7. A Utilização de Técnicas Moleculares para o Estudo Genômico do
Microorganismo
Diferentes técnicas moleculares foram utilizadas para caracterizar
genotipicamente o C. pseudotuberculosis como a ribotipagem (SUTHERLAND
et al, 1996, COSTA et al, 1998), a eletroforese de campo pulsado (CONNOR et
al, 2000), reação de polimerização em cadeia (ÇETINKAYA et al, 2002) e a
técnica de análise de Fragmentos de Restrição rDNA específica
(VANEECHOUTTE et al, 1995).
3.7.1. Reação de Polimerização em Cadeia
A capacidade de isolar ácidos nucléicos de células em quantidade, pureza
e integridade suficiente representam um requerimento essencial de
praticamente todas as análises de biologia molecular e manipulações
recombinantes do DNA. A reação de polimerização em cadeia (PCR) pode
utilizar quantidades diminutas de ácido nucléico impuro e degradado, de tal
forma que a simples fervura de células pode ser suficiente para liberar DNA em
quantidades adequadas. A primeira etapa envolve a ruptura ou lise das células
para liberar os componentes citoplasmáticos e/ou nucleares intracelulares. A
segunda etapa consiste na desnaturação ou inativação de proteínas, tais como
nucleases degradativas (WALKER e RAPLEY, 1999).
Todos os métodos de extração de ácido nucléico (Figura 1) são realizados
a baixas temperaturas, o que reduz a atividade da proteína. Uma ampla
variedade de compostos químicos que retardam a atividade da DNAse é
frequentemente incluída nos tampões de extração do DNA. Assim, os agentes
quelantes, citrato e EDTA (acido etilenodiaminotetracético) são comumente
usados, pois removem eficazmente cátions divalentes (por exemplo, íons de
magnésio), necessários às atividades de nucleases. Soluções de fenol /
clorofórmio / álcool isoamílico são usados para desnaturar ainda mais as
nucleases e coagular proteínas, durante extrações de DNA (WALKER e
RAPLEY, 1999).
Etapas da Extração de DNA
Lise Celular Detergente / Lisozima
Agente proteinase Proteinase K
Extração com fenol Fenol / Clorofórmio
Precipitação com álcool
Etanol 70% / 100%
DNA
Figura 1 - Método de extração de ácidos nucléicos.
Assim que forem desnaturadas ou inativadas, as proteínas podem ser
separadas do DNA em lisados. Estas se baseiam em extração por solvente,
precipitação e / ou centrifugação. Um método de recuperação de DNA emprega
a solubilidade diferencial de proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos, no potente
solvente orgânico desproteinizante fenol. Após a centrifugação do lisado /
mistura com fenol, observam-se três fases: uma fase superior contendo todos
os ácidos nucléicos, uma fase inferior contendo componentes hidrofóbicos da
célula, por exemplo, fragmentos de membranas e organelas intracelulares e
uma camada intermediária, com a proteína frequentemente concentrada na
interface superior (WALKER e RAPLEY, 1999).
A maior parte dos ácidos nucléicos pode ser recuperada da fase superior.
Estes devem ser removidos cuidadosamente sem alterar a interface, para
evitar contaminação com proteínas. A solução de DNA recuperada é submetida
à precipitação e lavagem com álcool, sendo o DNA ressuspendido em água
deionizada estéril. Todos os traços de fenol devem ser eliminados, antes do
DNA ser utilizado para analise subseqüente ou manipulação (WALKER e
RAPLEY, 1999).
A amplificação cadeias simples de DNA pela PCR, proporciona suficiente
DNA para análise e / ou manipulação subseqüente. A PCR replica igualmente o
DNA através de ciclos repetidos em três etapas, como mostra a Figura 2,
envolvendo o uso de diferentes temperaturas de reação (WALKER e RAPLEY,
1999).
3.7.2. Análise de Polimorfismo do Comprimento de Fragmentos de
Restrição (RFLP) na Modalidade de RFLP locus Específico.
A PCR tem permitido um locus genético específico ser amplificado e
examinado para indicar diferenças de variação em cepas. O locus específico
para ser examinado é amplificado com um primer específico para o gene e
submetido à análise por RFLP. Este DNA anteriormente amplificado pode ser
isolado e utilizado como molde para análise de Polimorfismo do Comprimento
de Fragmentos de Restrição (RFLP) na modalidade de RFLP locus específico
(quando geralmente o locus a ser analisado pode ser o gene 16S ribossomal)
onde microorganismos pertencentes a uma mesma espécie e subespécie, mas
com cepas diferentes, podem ser diferenciados através desta técnica de
biologia molecular que permite a observação de bandas com diferentes
padrões de massa molecular, baseados em pequenas diferenças na seqüência
de DNA após a digestão por enzimas de restrição e a separação dos
fragmentos desta forma obtidos por eletroforese em gel de agarose com
evidenciação das bandas de DNA pela coloração com brometo de etídio. A
ribotipagem pode ser aplicada com sucesso para a diferenciação de cepas
bacterianas que exibem um alto grau de heterogeneidade (COSTA 2002;
OLIVE e BEAN, 1999).
Figura 2 - Reação de Polimerização em Cadeia. (1) Etapa de desnaturação: As
seqüências do gene alvo são tomadas disponíveis para cópia, através de
desnaturação por temperatura elevada das fitas do DNA. (2) Etapa de
anelamento: As extremidades da seqüência gênica particular a ser copiada são
definidas pela hibridização de dois oligonucleotídeos sintéticos curtos,
denominados iniciadores da amplificação. Isto possibilita a ligação subseqüente
e ativação da DNA polimerase. (3) Etapa de extensão onde as seqüências
gênicas específicas são copiadas, normalmente como um DNA em dupla – fita,
através da adição de novas bases as extremidades 3’ livres dos iniciadores, por
uma DNA polimerase. Isto é usualmente realizado a 70°C, que representa a
atividade ótima da DNA polimerase (modificado, WALKER e RAPLEY, 1999).
4. MATERIAIS E MÉTODOS
Foram visitadas 11 propriedades de criação de ovinos, a maioria da raça
Santa Inês, no Distrito Federal e entorno para a identificação de animais
acometidos pela Linfadenite Caseosa e subseqüente coleta do conteúdo dos
abscessos.
As propriedades visitadas foram escolhidas a partir de uma relação de
criadores de ovinos cadastrados na ASCOB (Associação dos Criadores de
Ovinos de Brasília). Nove propriedades apresentavam apriscos ao nível do solo
e duas apriscos suspensos.
Figura 3 - Aprisco visitado em uma das coletas.
4.1. Coleta das Amostras
O material destinado ao isolamento foi coletado de abscessos localizados
em linfonodos (Figura 4) de ovinos positivos para Linfadenite Caseosa. Foram
coletadas inicialmente 34 amostras de conteúdo purulento caseoso dos
abscessos.
Figura 4 - Imagem dos Linfonodos caseosos fechados.
Após a localização do animal infectado, foi realizada uma higienização da
área do abscesso com água e sabão e desinfecção do local com álcool iodado
para o procedimento de coleta. Os abscessos foram seccionados no sentido
vertical (de cima para baixo). Para a coleta do pus (Figura 5), um swab foi
introduzido no abscesso e o material coletado foi transferido para um tubo com
meio de transporte STUART® (OXOID®), produzido segundo as normas do
fabricante. Após a coleta retirava-se todo o material purulento e realizava-se a
limpeza interna do abscesso com pinça e gaze, retirando todo o pus restante.
Como antisséptico para o interior esvaziado do abcesso foi utilizada uma
solução de iodo a 10%. Recomendou-se em todas as propriedades visitadas o
isolamento do animal até a completa cicatrização do processo. As amostras
colhidas eram encaminhadas para o Laboratório de Microbiologia Médico
Veterinária da Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade
de Brasília para a caracterização microbiológica.
AB
DC
Figura 5 - Etapas do procedimento das coletas. (A) localização do Abscesso.
(B) Secção do Abscesso. (C) Introdução do swab para coleta do pus. (D)
Eliminação do restante do material caseoso.
4.2. Cultivo e Estocagem
As amostras dos abscessos dos linfonodos foram inoculadas em meio
ágar sangue (BIOBRÁS®), preparado segundo as normas do fabricante, e
suplementado com 5% de sangue de ovelha desfibrinado, usando a técnica de
esgotamento por estrias que facilita o crescimento de colônias isoladas e
incubadas em estufa a 37ºC por 48 horas e armazenadas em meio SKIM
MILK® (DIFCO®), produzido segundo as normas do fabricante.
4.3. Atividade Bioquímica
Após o crescimento bacteriano positivo, as amostras eram testadas
bioquimicamente para confirmar se eram Corynebacterium pseudotuberculosis.
Foram realizados testes de: catalase, oxidase, uréia, maltose, lactose, trealose,
arginina, controle, gelatina, glicose, sacarose e reação de redução de nitrato.
4.4. Extração do DNA Genômico
As amostras positivas no teste bioquímico para C. pseudotuberculosis
prosseguiam para o procedimento da extração de DNA. Foi utilizada para a
extração do DNA genômico o protocolo de Çetinkaya et al, 2002.
As colônias selecionadas e isoladas da cultura em ágar sangue foram
transferidas para um tubo de Eppendorf contendo 200 μl de água destilada.
Esta suspensão foi incubada a 56°C por 30 minutos. As amostras foram
tratadas depois com 200 μl de tampão TNES (20 mM Tris pH 8.0, 150 mM
NaCl, 10 mM EDTA, 0.2% SDS) e proteinase K® (200 μl/ml). E em seguida
foram colocadas por 30 minutos em boiling, e após foram adicionadas a
mesma quantidade de fenol (saturado com Tris – HCl) à suspensão. A mistura
foi agitada vigorosamente por cinco minutos na mão e depois centrifugada a
11600 g por 10 minutos. A fase sobrenadante foi transferida para outro tubo de
Eppendorf e teve adicionado ácido acético (0.1 volume) e etanol (2.5 volumes)
sendo então submetida a -20°C overnight para precipitar o DNA. O pellet,
obtido a partir da centrifugação em alta velocidade por 10 minutos, foi lavado
duas vezes com etanol 70%, cada passo intercalado com 5 minutos de
centrifugação. Finalmente o pellet foi seco e ressuspendido em 30 μl de água
destilada.
4.5. Reação de Amplificação e Digestão do DNA
A reação foi realizada em um termociclador com um volume de reação
final de 50 μl contendo 5 μl de tampão para PCR 10X (10 mM Tris – HCl, pH
9.0, 50 mM KCl, 0.1% Triton X –100), 5 μl 25 mM MgCl2, 250 μM de cada
deoxinucleotídeo trifosfato, 2 U de Taq DNA polimerase, 1 μM de cada primer e
5 μl do DNA a ser analisado. A amplificação foi obtida com 30 ciclos contendo
um passo de desnaturação inicial a 94°C por 5 minutos. E cada ciclo envolve
uma desnaturação a 94°C por 1 minuto, um anelamento a 56°C por 1 minuto e
a síntese a 72°C por 2 minutos (ÇETINKAYA et al, 2002).
Os primers de oligonucleotídeos foram derivados de regiões conservadas
presentes em cortes do 16S rDNA. A seqüência dos primers foram 5’ –
ACCGCACTTTAGTGTGTGTG (forward) e 5’ – TCTCTACGCCGATCTTGTAT
(reverse) (ÇETINKAYA et al, 2002).
Os produtos amplificados foram detectados pelo brometo de etídio (0.5 μg
/ ml) corando depois da eletroforese a 80 V por 1 hora e 30 minutos em gel de
agarose 1%.
O DNA ribossomal foi digerido com endonucleases de restrição EcoRV e
Hind III a 37°C por três horas e duas horas respectivamente. Os fragmentos da
restrição do DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose 1%
contendo brometo de etídio (0.5 μg / ml).
5. RESULTADOS
5.1. Cultivo e Identificação Bioquímica
Após a estriagem do pus dos abscessos coletados, as placas foram
incubadas a 37ºC por 48 horas em meio ágar sangue e observou-se que das
34 amostras apenas três não possuíam colônias características de
Corynebacterium pseudotuberculosis. As demais 31 amostras apresentaram
colônias pequenas, esbranquiçadas, ressecadas com hemólise nítida, como
mostra a Figura 6, o que caracterizam as amostras esperadas de C.
pseudotuberculosis. Após o crescimento foi realizado um esfregaço das
colônias para a evidenciação de células Gram positivas pleomórficas,
pequenas, em forma cocóide, clavas ou bacilos, imóveis e não esporuladas em
esfregaços corados individualmente, em pares ou paliçadas típicas do
microorganismo (Figura 7).
Figura 6 - Placa de ágar sangue com crescimento de colônias de
Corynebacterium pseudotuberculosis.
Figura 7 - Lâmina corada pelo método de Gram de células bacterianas em
paliçada características de Corynebacterium pseudotuberculosis ao
microscópio óptico (1000X).
Os testes de atividade bioquímica revelaram que todas as cepas isoladas
eram catalase – positivas, oxidase – negativa e falhavam na redução de nitrato,
características do Corynebacterium pseudotuberculosis. Os resultados dos
demais testes realizados para confirmação bioquímica estão relacionados na
quadro 1, assim como nas Figuras 8, 9 e 10.
Quadro 1 - Padrão dos testes de atividades bioquímicas realizadas com as
amostras testadas. (V: crescimento variável, + : crescimento positivo e - :
crescimento negativo).
Uréia Gelatina Maltose Lactose Glicose Sacarose Trealose Arginina Controle Nitrato
Amostras Testadas
+ - + V + V - + - -
Figura 8 - Perfil da reação de nitrato – resultado negativo para todas as
amostras.
Figura 9 - Padrão não inoculado das Atividades bioquímicas: sacarose, uréia,
glicose, gelatina, trealose, arginina, controle da arginina, maltose e lactose
respectivamente.
Figura 10 - Perfil das atividades bioquímicas com os meios inoculados com as
amostras de C. pseudotuberculosis. (sacarose, uréia, glicose, gelatina,
trealose, arginina, controle da arginina, maltose e lactose respectivamente).
5.2. Extração Genômica e PCR
Com as 31 amostras já caracterizadas como Corynebacterium
pseudotuberculosis foi realizado o processo de extração de DNA para a
obtenção do DNA genômico bacteriano utilizado para posterior Reação de
Polimerização em Cadeia (Figura 11). Seguindo o protocolo, já descrito, foi
obtida a amplificação de 22 amplicons (equivalentes ao gene 16S ribossomal
DNA) dentro do total das 31 amostras utilizadas (Figura 12). Estes amplicons
receberam o número correspondente a amostra da qual se originaram para
facilitar a identificação.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Bandas da extração de DNA genômico
A
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 26 M
Bandas da extração de DNA genômico
B
Figura 11 (A e B) - Confirmação da extração do DNA genômico. Gel de
Agarose 1 % contendo bandas de DNA genômico extraídas das 31 amostras
numeradas respectivamente pelas linhas correspondentes. M – marcador 1kb
DNA ladder (Promega®).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
818 pb
A
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 M
818 pb B
Figura 12 (A e B) - Reação de Polimerização em Cadeia (PCR) das amostras
testadas. Gel de agarose a 1% contendo amplicons de uma reação de PCR
com primers específicos para o gene 16S. M – marcador 1kb DNA ladder
(Promega®) e linhas 1 a 31 representam amostras de mesmo número.
Observa-se que as amostras contidas nas linhas 1, 5, 6 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 24, 28, 29, 30, 31 foram amplificados, ao contrário
das amostras 2, 3,4,17, 22, 23, 25, 26 e 27 .
5.3. Análise de Restrição de Fragmentos de Polimorfismo em locus
Específico
O gene 16S ribossomal do DNA das 22 amostras amplificadas foi digerido
com endonucleases de restrição Eco RV e Hind III a 37°C por três horas e duas
horas respectivamente. Foi possível observar diferentes perfis de restrição
obtidos na digestão (Figuras 13 e 14).
Os vinte e dois amplicons obtidos com a utilização dos primers
específicos, foram submetidos à digestão pelas enzimas EcoRV e Hind III. A
partir da análise dos fragmentos obtidos nesta digestão com EcoRV e Hind III
observou-se a presença de dois padrões entre as amplificações; um deles
onde o fragmento amplificado não foi digerido (1, 9, 10, 11, 12, 18, 21, 24) pela
enzima EcoRV (Figura 13) e outro padrão, cuja digestão mesmo parcial
originou dois fragmentos de 506 pb e 312 pb (6, 7, 8, 13, 14, 18, 19, 28, 29, 30,
31). A digestão com Hind III não apresentou perfis de digestão diferentes entre
os amplicons (Figura 14).
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
818 pb 506 pb 312 pb
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 M
A
818 pb 506 pb 312 pb
B
Figura 13 (A e B) – Digestão do gene 16S com a enzima EcoRV. Gel de
agarose 1% apresentando a digestão das amostras amplificadas anteriormente
com a enzima EcoRV. M – marcador 1kb DNA ladder (Promega®). Observa-se
que os amplicons 6, 7, 8, 13, 14, 18, 19, 28, 29, 30, 31 foram digeridas
liberando três fragmentos correspondendo a 818 pb, 506 pb, 312 pb. A amostra
1 não foi digerida pela enzima assim como 9, 10, 11, 12, 18, 21, 24.
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
A
818 pb 546 pb 272 pb
17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 M
818 pb 546 pb 272 pb
B
Figura 14 (A e B) - Digestão do gene 16S com a enzima Hind III. Gel de
agarose 1% apresentando a digestão das amostras amplificadas anteriormente
com a enzima Hind IIII. M – marcador 1kb DNA ladder (Promega®). Observa-
se que as amostras 1, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 17, 18, 19, 28, 29, 30, 31
foram digeridas liberando três fragmentos correspondendo a 818pb, 546 pb,
272 pb.
O quadro 2 resume os resultados nos procedimentos realizados com
todas as amostras testadas.
Quadro 2 – Resultados das amostras em todos os procedimentos realizados. Amostras Cultivo Extração
de DNA PCR Digestão
EcoRV Digestão Hind III
01 Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo 02 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 03 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 04 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 05 Negativo ----------- ----------- ----------- ----------- 06 Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo 07 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 08 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 09 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 10 Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo 11 Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo 12 Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo 13 Positivo Positivo Positivo Negativo Positivo 14 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 15 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 16 Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo 17 Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo 18 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 19 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 20 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 21 Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo 22 Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo 23 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 24 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 25 Positivo Positivo Positivo Negativo Negativo 26 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 27 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 28 Positivo Positivo Negativo ----------- ----------- 29 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 30 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 31 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 32 Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo 33 Negativo ----------- ----------- ----------- ----------- 34 Negativo ----------- ----------- ----------- -----------
6. DISCUSSÃO
Embora Pimentel (2004), em informação pessoal, cite que a origem da
maior parte dos rebanhos do Distrito Federal serem dos estados da Bahia e
Sergipe, a criação de ovinos no Distrito Federal não está devidamente
organizada quanto ao controle da origem dos animais que estão formando o
plantel do DF, ou seja, os registros de compra dos animais não existiam em
nenhuma das propriedades visitadas. Isto impossibilitou a construção de um
mapa epidemiológico comparativo com a relação da incidência da doença com
a origem do animal, buscando assim a origem de um foco disseminador, onde
poderíamos instalar uma provável barreira sanitária contra a infecção de um
estado com poder de disseminação maior. Não foi possível uma comparação
entre a incidência da patologia e a origem dos animais entre estados
diferentes.
Também não foi possível estabelecer uma correlação entre diferentes
tipos de apriscos e a disseminação da doença, ou seja, algumas propriedades
possuíam aprisco suspenso enquanto em outras, o rebanho era criado em
piquetes abertos ou em apriscos ao nível do solo. A maior parte das
propriedades tinham em comum uma produção coletiva de animais, ou seja, no
mesmo ambiente os ovinos tinham contato com aves, bovinos, canídeos e
outras espécies. E sem controle das enfermidades nas propriedades.
Pôde ser constatado que o manejo diferenciado entre as propriedades
analisadas não reduz a incidência do desenvolvimento da doença no plantel.
Este variava desde um aprisco arejado com tamanho suficiente para a
demanda por cabeça e higienização adequada até propriedades sem estrutura
de aprisco, apenas com um cercado, apertado para a demanda de animais e
sem higienização necessária. Não havia o cuidado de isolar os animais
infectados e os curados dos demais. Desta forma variando do mais sofisticado
ao de pior estrutura observou-se uma casuística presente em todas as
propriedades visitadas constatando um descaso sobre o controle da infecção.
Das trinta e quatro amostras coletadas, três não obtiveram crescimento, e
trinta e uma amostras foram classificadas como colônias de Corynebacterium
pseudotuberculosis, com células bacterianas com morfologia característica em
esfregaços corados pela coloração de Gram. Os testes bioquímicos
caracterizando todas as amostras como Corynebacterium pseudotuberculosis
biovariedade ovis foram realizados e para assegurar a ausência de amostras
de Corynebacterium pseudotuberculosis biovariedade equi, entre as cepas
testadas foi incluído o teste de redução de nitrato (cujo resultado é negativo
para o Corynebacterium pseudotuberculosis biovariedade ovis) (SUTHERLAND
et al, 1996).
A utilização de PCR e a utilização concomitante da técnica de análise
de polimorfismos do Comprimento de Fragmentos de Restrição de locus
específico vêm sendo usadas não só para caracterizar a espécie, mas também
para permitir a diferenciação entre cepas, sendo por isso escolhida para este
trabalho.
Das 31 amostras analisadas, apenas 22 (70%) foram amplificadas,
obtendo-se um resultado diferente de ÇETINKAYA et al (2002), que utilizando
os mesmos primers, conseguiram a amplificação de um amplicon de 818 pb de
todas as amostras testadas. O C. pseudotuberculosis biovariedade equi não foi
amplificado no trabalho de ÇETINKAYA et al (2002).
Nestas 22 amostras amplificadas encontrou-se tipos de diferentes perfis
de restrição pelas enzimas Eco RV e Hind III onde amostras não digeridas por
EcoRV são visíveis na figura 13 e podem caracterizar prováveis mutações
pontuais no gene 16S rDNA.
Os primeiros estudos de caracterização genética do Corynebacterium
pseudotuberculosis foram realizados por Songer et al (1988) com a utilização
de análise de restrição por endonucleases no genoma total do microorganismo.
Neste estudo foi encontrada a principal diferença entre os diversos isolados de
Corynebacterium pseudotuberculosis o qual consiste em duas biovariedades
da espécie (equi e ovis), não obtendo dentro da biovariedade ovis nenhuma
diferença visível, divergindo desta forma dos resultados encontrados neste
experimento onde se obteve três diferentes perfis de cepas para as amostras
de C. pseudotuberculosis biovariedade ovis, dois pela digestão com EcoRV e
um com Hind III.
Vaneechoutte et al (1995) também em análises de restrição de rDNA
amplificado do gene 16S rDNA pertencente a diferentes espécies de
corinebactérias, encontraram apenas diferenças visíveis entre os dois biovares
equi e ovis.
Literák et al (1999) encontraram nos seus estudos de ribotipagem de 10
isolados de Corynebacterium pseudotuberculosis uma homogeneidade nas
amostras, onde não houve diferenciação dos padrões genotípicos.
Embora com técnicas diferentes (foi utilizada a eletroforese de campo
pulsado), Connor et al (2000) foram os únicos a observar diferenças, definindo
seis “pulsotipos” do microorganismo e atribuindo esta diferenciação a possíveis
mutações pontuais ou por inserção ou deleção de nucleotídeos como foi
atribuído aos resultados encontrados neste trabalho pela identificação de
diferentes perfis de restrição caracterizando prováveis mutações pontuais no
gene 16S rDNA do C. pseudotuberculosis biovariedade ovis.
7. CONCLUSÃO
A identificação de Corynebacterium pseudotuberculosis é passível de ser
obtida através das suas características morfológicas e de crescimento em
determinados meios de cultura (pelo seu padrão de crescimento) auxiliados por
provas bioquímicas. No caso de diferenciação entre cepas ou de evidenciar
cepas epidemiologicamente relacionadas, se fazem necessários métodos de
biologia molecular. Em especial neste experimento foi possível a identificação e
caracterização de três diferentes perfis de cepas, dentre microorganismos
classificados como Corynebacterium pseudotuberculosis biovariedade ovis, nos
quais a genotipagem se torna essencialmente útil quando se pretende eleger
uma cepa vacinal ou ainda quando se pretende controlar a disseminação de
um determinado foco da doença em uma região, já que as vacinas comerciais
não têm conseguido atingir a imunidade específica.
A conscientização deste problema de sanidade animal é fundamental para
que sejam tomadas medidas adequadas visando diminuir os prejuízos por ela
causados, considerando o impacto econômico desta doença é necessário ter
precauções, tal como o desenvolvimento de programas efetivos de vacinação e
estratégias alternativas de controle. A tentativa deve ser realizada para se obter
suporte aos fazendeiros e cooperação em diminuir a disseminação.
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