llJIIipIMe IJ'-I'J .4 ;aqç,.,.

AGRADECIMENTOS

Ourante a elaboração desta tese houve sempre a colabo­

ração de inúmeras pessoas e Instituições a quem expresso o meu

mais profundo agradecimento. Entre elas gostaria de salientar:

-- O Prof. Or. Francisco J.S. Lara, orientador desta

tese, que não poupou esforços em criar tôdas as condições ne­

cessárias para o desenvolvimento dêste trabalho, assim como, pe­

lo continuo estimulo a mim proporcionado.

-- O Sr. Antônio G. de Bianchi com quem dividi o en­

tusiasmo e as frustações da maior parte dêste trabalho.

-- O Sr. Ângelo G. Gambarini com quem realizei os es­

tágios iniciais dêste trabalho.

-- A srta. Yolanda Tavares e Sra. ~alkyria H. Lara, a~

bas do Instituto Adolfo Lutz, pela colaboração em campos de sua

especialidade.

O Or. Gerhard Malnic, Ora. Rebeca C. de Angelis e

Sra. Ilza C. M. Terra, todos do Instituto de Ciências Biomédicas

da Universidade de são Paulo e Or. Herval P. Ribeiro do Hospital

Central da Santa Casa de Misericôrdia de são Paulo, pela preste­

za com que me emprestaram equipamentos de sua responsabilidade.

-- Os meus colegas do Instituto de Química da Univer­

sidade de são Paulo: Or. Fernando Galembeck, Jane Balsamo, Júlia

M. Alves, Manuel T. Pueyo, Marila Cordeiro, Nelson Marques, Or.

Rogério Meneghini, Roberto V. Santelli, que colaboraram em algu­

mas das fases experimentais ou contribuíram com valiosas .críti­

cas e sugestões.

-- A Ora. Eline s. Prado em cujo curso de pés-gradua­

çao em química de proteínas aprendi várias técnicas que se torn~

ram úteis durante a realização dêste trabalho.

-- A Ora. Carrninda da C. Landim que através de seu cur­

so de Morfologia de Insetos muito contribuiu para uma boa inter­

pretação de muitos resultados por mim obtidos.

o Or. Gilberto B. Oomont do Instituto de Química da

Universidade Federal do Rio de Janeiro que me introduziu nas téc­

nicas de cromatografia de aminoácidos.

A sra. Mirian O. Marques que além de ter colaborado

em uma das fases experimentais, forneceu numerosas informações'

nao publicadas de seu trabalho.

-- A srta. Hiromi Tamaki e Sr. José Coelho sem cuja

assistência técnica teria sido muito difícil a realização desta

tese.

-- A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de são PaE

lo que através de uma bôlsa de Iniciação Científica e duas bôlsas

de Doutoramento me possibilitou ingressar na vida cientIfica.

-- A srta. Yvone de Abreu responsável pela eficiente da

tilografia desta tese.

List

INT~

MeTO

através de seu cur­

para uma boa inter- íNDICE

1. Considerações iniciais " .•••. " • . • • • . • . . • . • • . . . • • • • • . 2

2. Contrôle hormonal do desenvolvimento dos insetos.... 6

3. Origem das proteínas do inseto adulto ...•••••..•.•. 9

4. Sêdas e casulos ••.••••.•.•...•.•••.••..•••'......... 14

5. Finalidades dêste trabalho •....•....•.••••....•••.• 16

tituto de Química da

introduziu nas téc-

m de ter colaborado

umerosas informações-

sé Coelho sem cuja

1 a realização desta

Lista de Abreviaturas emoregadas

INTRODt!ÇÃO •••.••••• ~ •••••••••••.•••.••.••••.•..•••.••.•••••

pág.

1

2

ia Estado de são PaE

tIfica e duas bÔ1sas

"ida cientIfica.

~l pela eficiente da

r~TODOS •...•.•••..••.•••••.••..••.••.•....•••.•........••. 20

1. Cultura de Rhynchosciata ••••••••...••.•••••••.••.••.. 20

2. Determinação da idade fisiológica larval .•.....•.'.. 20

3. Coleta de hemolinfa .•.••...•••••.•••.•.••...•....•. 23

4. Determinação do volume ocupado pelos hemocitos na

hemolinfa •••••••••••••••••.•••.••••••.••.•....•...• 23

5. Métodos de estudo da coagulação e escurecimento

da hemolinfa •• • • • • • . . • . • • • . • • • • . • • • . . • • . • . • . . • . • . . 24

6. Determinação da osmolaridade, densidade, volume

e pêso-sêco da hemolinfa . • • • • • . • • • . • . • • . • . • . . . . . . . 24

7. Determinação de p02' pC02 , pH e HC03- na hemo-

linfa ••••••••.•••••....•••..•.•••••••..•••.•••.•.•• 25

8. Determinações químicas na hemolinfa ••••..•.......•• 25

9. Cromatografia de troca iônica dos compostos ni~~i-

drina-po~itivos ácidos~solúveis na hemolinfa •....•• 29

10. Preparação dos pigmentos da hemolinfa •.•••••••.•••• 30

11. Identificação dos carotenóides •.••••••.••.•...•.••• 31

12. Preparação do casulo I, II e III e determinação da

massa produzida por indivíduo •••.••••.•••••..•••••• 32

13. Dete~inação da solubilidade do casulo .•••..••••••. 32

14. Determinações químicas do casulo •••••...•••.••••..• 33

15. Cromatografia em papel de carboidratos do casulo .•• 35

16. Cromatografia de troca iônica de aminoácidos da

fração insolúvel do casulo ••••..••••••••..••.•.•••• 36

pág.

REAGEh'TES •..•••.•.•.•.•...•.•..•....•.•.•....•..•.••.•..• 38

A. Química da hemolinfa •••••.•..•..••.••..•••••...•••.. 85

A. Química da hemolinfa de larvas de R. "americana ..•.• 39

B.

REFERt

RESUMO

ABSTRA

85

39

58

37

37

1. Apresentação geral dos resultados 58

2. Solubilidade, conteúdo de cinzas e metais 59

3 . Carboidratos •..................•........•........ 6].

4. Compost9s nitrogenados .....•..................•.. 65

5. Produção e composição do casulo em função do tp.mpo 68

1. Resultados gerais ....•......•••.....•.......•.... 39

2. Cromatografia dos compostos ninhidrina-positivos

solúveis em ácido ....••. , ....•....•......•...... ' 40

3. Apresentação dos resultados das análises químicas. 48

4. Pigmentos .....•....•......•..•.•................. 50

1. Extensão da análise realizada .••.........•...•... 85

2. Componentes orgânicos da hemolinfa ••.•...•....... 87

3. Composição molar da hemolinfa e seus componentes

inorgânicos. • . . • . . • • • . . • . . . . . . . . . . . . . . • • . . • . . . • . • . 93

4. Coagulação e escurecimento .•.....•.....••.•...... 99

5, Pigmentos ...••.•..............•••.....•......•... 100

1. Massa corpórea e volume de hemolinfa •.•........•. 72

2. Determinações químicas na hemolinfa .••.•.•....•.• 76

3. pêso-sêco e glicogênio no corpo gorduroso •....... 81

4. pêso-sêco e metais nos túbulos de Malpighi •...... 82

B. Química do casulo coletivo de R. americana

C. Aspectos químicos e fisiológicos durante o 49 estádio

de R. americana ..... , •. . . . . • •. .• •. . •. ..•. . •.. ... .. • 72

17. Determinação de pêso-sêco e metais nos tubos de

Malpighi .••.....•......•.•.•.•••.••••..•...•......

18. Determinação de glicogênio e pêso-sêco do corpo

gorduroso ...••.........••.....••..•................

RESULTADOS ..•.••••••.•.•..........•.••••..........•......

DISCUSSÃO

pág.

~ubos de

pág.

· .~o corpo

• a••••••••••

· .

· .

37

37

38

39

B. Produção do casulo coletivo por ~arvas de R. ame-

ricana

1. Quími ca do casulo ...•••.••.••..•......•.••..•••

2. Origem dos componentes do casulo ....••.........

3. Mecanismos e regulação da produção do casulo ...

RESUMO •••••••••••••••• •••••••••••••• '. =• • • • • • • • • • • • •• • • ••

102

102

104

111

114~icana ....• 39

· . 39 ABSTRACT 116

l-positivos

• . •• • • • • . • • . 40

;es químicas. 48

••••• " • .. .. 50

~ .......... 58

·........... 58ais ........ 59·........... 61

· ............. 65:rão do tAmpo 68

) 49 estádio

·................. 72

, ............. 72

·.............. 76)So ........ 81.ghi •...... 82

• . . . . . . • . • . 85

• . • . • . . • • • . 85

· . • . • . . • . . • 85

• • •• • • • • • • • 87

nponentes

· • • • • • . • . • • 93

· • • • • • • • • •. 99

.•••••.••• ' 100

REFERtNéIAS BIBLIOGRÂFICAS •••••••••••••••••••••••••••••• 118

ABREVIATURAS

TCA - Âcido tricloroacético

19P - Primeiro período do 49 estádio de R. americana (ver Tabe­

la I). Da mesma forma 29P, 39P, 49P, 59P e 69P, corres­

pondem aos demais períodos do 49 estádio.

p.e. - POnto de ebulição

O.V. - Luz ultravioleta

RNA - Âcido ribonucléico

DNA - Âcido desoxirribonucléico

Cf. - Confrontar com

PAS - Periodic Acid Schiff, teste para carboidratos

A - Comprimento de onda

p.ex.- Por exemplo

p/p - péso por pêso

p/V - pêso por volume

V/V - Volume por volume

SDS - Dodecil sulfato de sódio

.Ác. - Âcido

EC - Numeração das enzimas conforme recomendações feitas pela

Enzyme Commission da International Union of Biochemistry

em 1964.

INTRODUÇÃO

1. CONSIDERAÇÕES INICIAIS

A classe Insecta constitui o grupo com o maior número

conhecido de espécies no reino animal; cêrca de 900.000 para um

total descrito de 1.200.000. Sua distribuição abrange tôda a

superfície do planêta, com exceção das profu~dezas do oceano e

está representada mesmo entre os poucos animais que habitam per­

manentemente a região do Polo Sul. Essa enorme distribuição ec~

lógica e a variedade de formas que assume, a torna excelente pa­

ra o estudo das relações organismo-meio e certamente seria mui~o

interessante conhecer as razões morfológicas, fisiológicas e bio

químicas de seu sucesso.

A importáncia econômica dos insetos, pode ser avalia­

da quando se considera o montante de prejuízos causados por êles

anualmente; sõmente nos Estados Unidos, como consequência de

seus ataques a colheitas, produtos armazenados, domésticos e sim~

lares, além das doenças e desconfôrto causados ho homem e nos a­

nimais: 15 biliões de dólares! (ROSS, 1965). Ainda dentro do

prisma econômico, sua importância se faz sentir também na indús­

'tria da sêda natural, do mel, da cêra, etc.

O estudo dos insetos não tem sido estimulado apenas

pelo seu número e sucesso biológico ou pelas possibilidades dês­

se conhecimento contribuir para o aperfeiçpamento dos métodos de

contrôle de pragas. Os insetos tem-se mostrado excelentes mode­

los para estudos de problemas genéticos e citogenéticos (SINNOT,

DUNN & DOBZHANSKY, 1958), bioquímicos (GILMOUR, 1961), fisioló­

gicos (WIGGLESWORTH, 1948, 1965), etc.

Todos os insetos, com exceção dos Ametabola, sofrem

uma metamorfose. Esta pode ser definida, segundo WIGGLESWORTH

(1965), como a mudança mais ou menos marcada de form~, que ocor­

re quando o inseto torna-se adulto; independente do fato dessa

modificação requerer duas mudas e um estágio pupal como nos Holo

-3-

metabola, ou uma única muda final, como nos Hemimetabola.

Existem várias teorias para explicar a origem da me­

tamorfose completa em insetos. Aquela de maior aceitação en­

tre os especialistas é a de POYARKOFF-HINTON (Cf. NOVÃK, 1966).Segundo esta teoria a adaptação da larva e adulto a nichos ecol2

gicos distintos os tornou muito diferentes morfolõgicamente. A

pupa poderia ser interpretada corno um meio de intercalar uma se­

gunda muda entre a larva de último estádio e o adulto, permitin­

do o estabelecimento das ligações musculares imaginais em apóde­

mas cuticulares do adulto, que são completamente diferentes da­

queles da larva, em duas etapas. A primeira muda permitiria o

descolamento e histólise da musculatura larval e a segunda seria

necessária para a ligação dos músculos imaginais.

Segundo WIGGLESWORTH (1965, 1970) a metamorfose, do

ponto de vista ontogenético, poderia ser considerada como um ti­

po particular de polimorfismo. Os insetos Holometabola possui­

riam três sistemas genéticos distintos, enquanto que os Hernime­

tabola p~ssuiriam dois sistemas; correspondentes no primeiro ca­

so à larva, pupa e adulto e no segundo caso à ninfa e adulto. Du

rante a metamorfose ocorreria a inibição de um sistema genético

e a indução de outro.

Ó fato da profunda reorganização de tecidos e órgãos

que caracteriza a metamorfose de insetos estar sob contrõle hor­

monal (ver item ~ abaixo), tem levado a se considerar êsse fe­

nõmeno um excelente modélo para o estudo da reguYação horrnonal

da expressão genética e seu papel na morfogênese. Isso tem ins­

pirado um número crescente de trabalhos em bioquímica do desen­

volvimento de insetos,que foram revistos recentemente por alguns

autores (AGRELL, 1964; GILBERT, 1967b; WYATT, 1968).

A metamorfose nos insetos Holometabola inicia-se por

ocasião da muda pupal, embora naqueles insetos que produzem um

pupar~o ou tecem um casulo para a pupa, a metamorfose inicia-se

mais precisamente com a produção dessas estruturas (WIGGLESWORTH

1965),

A respiração dos insetos durante a metamorfose segue

uma curva em forma de U, indicando uma respiração mais intensa

no iní

inicia

gênese

tológi

os doi

indica

mente

níveis

portan

adulto

nor de

maior

as est

metamo

ocorre

biossí

larva,

protei

tuição

cie te

devido

balhar

manho.

forese

difere

visao

CHI, 1

* HINT

que es

mo "ph

to por

design

confor

(1946)

dentro

-4-

s Hemimetabola.

plicar a origem da me­

3 maior aceitação en­

ON (Cf. NOVÃK, 1966).

adulto a nichos ecol§

morfolõgicamente. A

de intercalar uma se­

e o adulto, permitin-

!s imaginais em apóde­

~ente diferentes da­

:a muda permitiria o

:val e a segunda seria

~nais.

I) a metamorfose, do

'nsiderada corno um ti­

Holometabola possui­

uantoque os Hemime­

entes no primeiro ca­

à ninfa e adulto. D~

e um sistema genético

o de tecidos e órgãos

tar sob contrõle hor­

3 considerar êsse fe­

a reguTação hormonal

~nese. Isso tem ins­

)ioquímica do desen­

~entemente por alguns

r, 1968).

~tabola inicia-se por

ietos que produzem um

~tamorfose inicia-se

~uturas (WIGGLESWORTH

a me~amorfose segue

ipiração mais intensa

no início e no fim do processo. Êste fenõmeno foi interpretado

inicialmente corno refletindo sucessivamente a histólise e histo­

gênese dos tecidos (Cf. AGRELL, 1964). Entretanto, estudos his­

tológicos mostraram que essa interpretação não era correta, pois

os dois fenômenos ocorriam simultâneamente. Estudos posteriores

indicaram que a curva em U da taxa de respiração era principal­

mente uma consequência do contrôle das vias respiratórias pelos

níveis de ADP, ATP e fosfato inorgânico celular, refletindo,

portanto, as demandas energéticas do inseto. Como a pupa ou o*adulto faratopossuem pequena atividade muscular, a maior ou m~

nor demanda energética na metamorfose tem sido relacionada com a

maior ou menor atividade biossintética de proteínas(~NATT,1968).

Os resultados comentados acima indicam, portanto, que

as estruturas imaginais começam a ser formadas desde o início da

metamorfose e que subjacentemente à formação dessas estruturas

ocorrem processos que demandam energia e que devem incluir a

biossíntese de proteínas.

As estruturas imaginais diferem bastante daquelas da

larva, sugerindo que deve haver uma diferença notável entre as

proteínas imaginais e as larvais. A extensão em que a consti­

tuição protéica do adulto difere daquela qa larva da mesma espé­

cie tem sido estudada principalmente nas proteínas da hemolinfa,

devido às facilidades de sua coleta e pela dif~culdade_de se tr~

halhar com órgãos de larvas de insetos, devido ao seu pequeno t~

manho. Êsses estudos foram realizados principalmente com eletr~

forese de gel de poliacrilamida e mostraram que existe algumas

diferenças de padrão protéico entre a larva e o adulto (ver re­

visão em ~NATT, 1968. No caso de R. americana, consultar BIAN­

CHI, 1972).

* HINTON (1946) propôs o têrmo "pharate" para designar o estádio

que está fechado dentro da cutícula do estádio anterior. O têr­

mo "pharate" é derivado do grego "pharata" que significa "cober­

to por um véu". Como não existe nenhum têrmo em português para

designar "pharate" será usado aqui o têrmo "farata" ou "farato",

conforme o caso, que utiliza a mesma raiz grega usada por HINTON

(1946). Dessa forma adulto farato corresponde ao adulto fechado

dentro da cutícula pupal.

~~

-5-

Eletroferogramas em gel de poliacrilamida de homogen~

tos de tecido, que devem ser mais significativos do que a hemo­

linfa na representação da constituição protéica do inseto, mos­

traram a existência de algumas diferenças entre larvas e adultos.

Entretanto, devido ao número relativw~ente pequeno de bandas el~

troforetican~nte resolvidas (cêrca de 20), em relação às cente­

nas de proteínas qüe devem estar presentes nas células, êsses r~

sultados são pouco ccnclusivos na avaliação do grau de diferença

existente entre a constituição protéica larva1 e imaginaI.

Uma outra maneira de atacar o problema é isolar pro­

teínas homólogas de diversos estágios do desenvolvimento do ins~

to e compará-las quimicamente. Poucos estudos foram realizados

nesse sentido para se ter uma idéia clara a respeito (ver revi­

são em WYATT, 1968). A questão da origem das proteínas do adul­

to, isto é, se elas originam-se integralmente por síntese "de

novo" a partir de aminoácidos livres ou se parte das proteínas

larvais são conservadas intactas no adulto, está intimamente re­

lacionada ao problema da extensão em que a~ proteínas do inseto

adulto diferem daquela~ larvais. O problema encontra-se ainda

relativamente pouco estudado e os resultados obtidos até o pres~n

te, err~ora conflitantes, sugerem que as proteínas imaginais po­

deriam originar-se em :9arte por síntese "de novo" e em parte a

partir de proteínas lar:vais que se conservariam intactas no adul

to (ver ítem 3, a seguir).

Abaixo será mostrado que a produção do casulo em B.*americana representa um modelo interessante para o estudo da o-

rigem das proteínas do adulto durante a metamorfose e quais obj~

tivos dentro desse estudo se pretende atingir especificamente com

esta tese. Antes disso, porém, será conveniente um comentário

breve a respeito dos conhecimentos atuais sóbre o contróle horm~

nal do desenvolvimento dos insetos, origem das proteínas do inse

to adulto e sôbre a química ~e casulos e sedas naturais.

* Rhynchosciara americana Wiedernann, 1821 (Diptera Nematocera

Sciaridae), foi redescrita por NONATO & PAVAN (1951) como ange­

~ e essa denominação foi usada em numerosas publicações até

ser demonstr~a sua sinonímia com americana por BREUER (1969).

-6-

2. CONTROLE HORMONAL DO DESE~TVOLVlMENTO DOS INSETOS

O estudo da regulação hormonal do desenvolvimento pós­

embrionário dos insetos foi iniciado há mais de 50 anos. Os es­

forços conjugados de numerosos pesquisadores, permitiram estabele

cer na década de 50 ma modêlo, hoje clássico, dessa regulação.

Posteriormente êste modêlo foi ampliado para todos os insetos e

enriquecido de detalhes porém sem nenhuma alteração substancial.

As pesquisas básicas que levaram ã ?roposição dêsse modêlo foram

revistas minuciosamente por vários autores (o. ex.,GILBERT, 1964;

SCHNEIDERMAN & GILBERT, 1964; HIGGLESI·mRTH, 1964 ; NOVÃK, 1966; HER­

MAN, 1968; lvIGGLESWORTH, 1970) e não serão apreciadas aqui. O mo­

dêlo clássico da regulação hormonal dos insetos pode ser resumido

como segue abaixo.

As células neurossecretoras localizadas no "pars inter

cerebralis" secretam o "hormônio cerebral", que se acumula nas

"corpora cardiaca", de onde se difunde para a hemolinfa, estimu­

lando as glândulas protoráxicas a secretar a ecdisona (hormônio

da muda). Sob influência dêste hormônio o processo de muda se

inicia. O nível de hormônio juvenil, que é produzido nas "cor­

pora allata", determina o tipo de muda. A presença de um título

elevado de hormônio juvenil e ecdisona resulta em muda larva-lar­

va; um decréscimo no tItulo de hormônio juvenil leva à muda lar­

va-pupa am Holometabola e as mudas para adulto ocorrem quando

ecdisona está presente, mas o hormônio juvenil ausente.

Depois de estabelecido o modêlo descrito acima, grande

esfôrço foi realizado na identificação química dos três hormônios

envolvidos. Graças aos trabalhos de vários pesquisadores, entre

os quais se destacou KARLSON, a ecdisona foi cristalizada, iden­

tificada como sendo um esteróide e essa identificação foi confir­

mada por síntese. Estas descobertas foram amplamente revistas por

KARLSON & SEKERIS (1966). Mais tarde foi identificado nas prepa­

rações de ecdisona um componente presente em menores quantidades,

com atividade similar à ecdisona, ao qual se denominou inicialmen

te de B-ecdisona e que, após a determinação de sua estrutura, ve­

rificou-se tratar-se da 20-hidroxi-ecdisona. Esta substância foi

demonstrada ser idêntica ao composto denominado ecdisterona e ao

hormônio da muda de crustáceos, a crustecdisona(WIGGLESWORTH,1970).

-7-

: INSETOS

lizadas no "pars inte!

que se acumula nas

a hemolinfa, estimu­

a ecdisona (hormônio

processo de muda se

é produzido nas "cor­

presença de um título

lta em muda larva-lar­

enil leva à muda lar-

.0 desenvolvimento pós­

s de 50 anos. Os es­

s, permitiram estabel~

o, dessa regulação.

a todos os insetos e

Iteração substancial.

ão dêsse modêlo foram

(D. eX.,GILBERT, 1964;

1964;NOVÂK,1966; HER­

apreciadas aqui. O mo­

etos pode ser resumido

descrito acima, grande

ica dos três hormônios

pesquisadores, entre

i cristalizada, iden­

ntificação foi confir­

amplamente revistas por

dentificado nas prepa-

TI menores quantidades,

= denominou inicialme~

de sua estrutura, ve­

Esta substância foi

nado ecdisterona e ao

sona (I"lIGGLESWORTH,1970).

do hormônio juvenil de extratos de

derivado terpenóide foi realizada

sua confirmação por síntese por

A identificação

Hyalophora cecropia como um

por ROLLER et alii (1967) e

DAHM, TROST & ROLLER (1967).

Além dos três hormônios mencionados acima são conheci

dos numerosos outros, mas como não estão diretamente envolvidos

no contrôle do desenvolvimento e metamorfose, não serão discuti­

dos aqui. Os conhecimentos existentes sôbre êsses hormônios fo­

ram revistos. por: GILMOUR (1965), NOVÂK (1966), \\'IGGLES\·lORTH,

(1970), LAW & REGNIER (1971).

A natureza química do hormônio cerebrál ainda está m~

definida, embora resultados recentes indicam tratar-se de um peE

tídeo ou proteína de baixo pêso-molecular e que talvez seja for-

mado por várias espécies de proteínas ou polipeptídeos (Cf.

WIGGLESWORTH, 1970).

O modo de ação dos hormônios morfogenéticos dos ins~

tos tem sido muito estudado. Entre êles o melhor estudado é a­

quêle da ecdisona e nêsse sentido merecem uma ênfase especial os

estudos realizados em glândulas salivares de Diptera. Estas

glândulas, possuem cromossomos politênicos que apresentam um pa­

drão de "puffs" (expansões globulares dos cromossomos politêni­

cos) que são típicos do estágio de desenvolvimento do inseto,a~

sim como, do tecido em que se encontram (Cf. BREUER & PAVAN,1955;

BEERMAN,1956). Êsses " puffs" cromossômicos parecem representar

gens em atividade (BEERMAN, 1963) e alguns " puffs" podem ser i~

,duzidos especificamente por injeção de ecdisona em larvas de

Chironomus (CLEVER & KARLSON, 1960). Essa indução de "puffs"

cromossômicos pela ecdisona parece ocorrer mesmo nas condições

normais de desenvolvimento larval. Isso foi demonstrado pelo f~

to de larvas de Drosoohila divididas em dois compartimentos por

uma ligadura apresentar um padrão de "puffs" da época de forma­

ção do pupário, sõmente nos cromossomos de células das glândulas

salivares presentes no mesmo comnartimento que contém as glându­

las protoráxicas. Por outro lado implantes de glândulas saliva­

res de pré-pupas de Drosophila em larvas de último estádio reve!

tem a um padrão de "puffs" correspondente à época do início da

formação do pupârio (BECKER, 1962). Mais recentemente AMABIS &

quandolto ocorrem

nil ausente.

:"8-

CABRAL (1970) mostraram, em experimentos similares aos de BECKER

(1962), que os "puffs" da glândula salivar de R. americana tam­

bém devem estar sob contrô1es hormonal.

KARLSON e colaboradores conseguiram, em uma série de

trabalhos, mostrar que ecdisona injetada em larvas de Calliphora

erythrocephala dirige-se ao núcleo das células epidérmicas, onde

in~uz a síntese preferencial de RNAs mensageiros para a síntese

de dopa descarboxilase (EC 4.1.26), enzima chave para o início'

do processo de esclerotização na formação do pupário e, baseando­

se nêsses resultados e nos discutidos anteriormente, propuse­

ram um modêlo para o mecanismo de ação da ecdisona (ver revisão

em KARLSON & SEKERIS,1966). ~ste modêlo consiste em assumir um

mecanismo de regulação das células de :nsetos similar ao propos­

to por JACOB & MONOD para bactérias e o papel da ecdisona seria

combinar-se com repressores específicos, liberando secções espe­

cíficas do DNA para transcrição. Êsse modêlo apresenta várias

dificuldades, entre elas a não indução de síntese de dopa descaE

boxilase (EC 4.1.26) na pupa de Calliphora, quando há elevação

do título de eC01sona, o que torna mais provável admitir que a

ação da ecdisona sôbre o material genético seja mais complexa que

a proposta por KARLSON & SEKERIS (1966), denendendo do tecido e

do seu estágio de desenvolvimento (ver discussão mais ampla em

WIGGLESWORTH, 1970).

o hormônio juvenil parece agir sôbre o metabolismo de

ácidos nucléicos, embora não exista ainda informação precisa sô­

bre o seu mecanismo (sLÁMA, 1971).

Os estudos de endocrinologia de insetos descritos aci

ma, além de terem permitido o estabelecimento de um excelente mo

dêlo para estudo da regulação hormonal da expressão genética,que

é o desenvolvimento dos insetos, estão fadados a criarem as ba­

ses de uma revolucionária tecnologia de combate aos insetos dani

nhos. Esta tecnologia está assentada no fato do hormônio juve­

nil impedir o desenvolvimento da pupa em adulto. Assim, pupas

de insetos submetidas ao contato, ou mesmo vapores do hormônio

juvenil, acabam morrendo por não serem canazes de se desenvolve­

rem até adultos ou, caso se desenvolvam, originam adultos esté­

reís (sLÂMA, 1971).

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-9-

; similares aos de BECKER

'ar de R. americana tam-

,guiram, em uma série de

em larvas de Cal1iphora

'é1ulas epidérmicas, onde

sageiros para a síntese

ma chave para o início

o do pupário e, baseand~

nteriormente, propuse­

a ecdisona (ver revisão

consiste em assumir um

setos similar ao propos­

papel da ecdisona seria

liberando secções espe­

~dêlo apresenta várias

e síntese de dopa descaE

~, quando há elevação

?rovável admitir que a

:0 seja mais complexa que

deDendendo do tecido e

Intensas pesquisas estão sendo realizadas atualmente

no sentido de se conseguir uma síntese química econômica de aná­

logos do hormônio juvenil, quimicamente estáveis e altamente at~

vos, e assim criar uma nova geração de inseticidas que não te­

nham efeitos tóxicos sóbre as plantas e animais, incluindo o

homem, mas que sejam altamente eficazes contra os insetos (sLÃMA

1971~ CRUICKSHANK. e PALMERE, 1971)0 Os análogos do hormônio

juvenil possuem, entretanto, uma desvantagem em relação aos ins~

ticidas porque, enquanto êstes matam os insétos em poucas horas,

os análogos do hormónio juvenil simplesmente impedem a reprodu­

ção da oraga. Em comoensação, o~ análogos do hormônio juvenil

agem em oeaueníssimas quantidades, o que permitirá uma ooluição

ambiental bem men9r do que ocorre com os inseticidas atuais,além

do fato de alguns análogos do hormônio juvenil terem ação selet!

va contra determinados insetos daninhos (SLÂMA, 1971). Recente­

mente uma firma industrial foi constituída com o exclusivo prop~

sito de desenvolver essa nova geração de inseticidas que ela de­

nominou "Entocon" CCf. boletins técnicos da Zoecon Corporation

975 California Avenue, PaIo Alto, Califórnia 94304).

Lscussão mais ampla em3. ORIGEM DAS FROTErNAS DO INSETO ADULTO

pazes de se desenvolve­

originam adultos esté-

- sôbre o metabolismo de

i informação precisa sô-

A origerndas proteínas do inseto adulto é um dos pr2

blemas bioquímicos mais fundamentais da metamorfose dêstes orga­

nismos. A maneira mais simples de considerar o problema (levan­

do em conta o fato de que a pupa e o adulto faratosão sistemas

fechados que trocam apenas gases com o meio ambiente), é admitir

que as proteínas larvais são hiurolizadas paulatinamente durante

a histólise dos tecidos larvais, desde o início do estágio pu­

paI, e que concomitantemente as proteínas do adulto são sinteti­

3adas "de novo" a partir de aminoácidos livres nos tecidos imag.:!:.

nais em desenvolvimento. Visto assim, esquemàticamente a solu­

ção do problema' se resumiria' na demonstração de como é feita a

repressão paulatina dos' sistema gen~ticos responsáveis pela siQ

tese das proteínas larvais e a indução daquêles sistemas envolvi

dos na síntese das proteínas imaginais, assim como, do mecanismo

de contrôle da hidrôlise das proteínas larvais. Existem, entre­

::"tnto, algumas evidências a indicar que o processo poderia ser

juve-

pupas

hormônio

le insetos descritos ac!

lento de um excelente m2

l expressão genética,que

ldados a criarem as ba­

dani

10 val?ores do

:ombate aos insetos

fato do hormônio

adulto. Assim,

-10-

mais complexo, envolvendo a utilização de proteínas larvais na

formação das proteínas do adulto sem hidró1ise prévia.

As considerações acima mencionadas passaram a serem

feitas com base experimental ao se verificar o papel das proteí­

nas da hemo1infa na vitelogênese. ~ste estudo iniciou-se quando

TELFER (1954) mostrou que uma proteína de hemo linfa é tomada pe­

los ovócitos em desenvolvimento e usada diretamente na constitui

çao do vitela em Hya10phora (Lepidoptera). Resultados similares

foram obtidos por numerosos autores em difo.rentes ordens de inse

tos, mostrando que o fenômeno é geral em insetos (Co1eoptera: De

LOOF e WILDE, 1970. Dictyoptera: ADIYODI, 1967; NIELSEN e

MILLS, 1968. Orthoptera: HILL, 1962. Diptera: STRANGWAYS­

DIXON, 1962; ORR, 1954a, b). O contrô1e hormona1 dêsse processo

foi estudado principalmente em Orthoptera, onde as células neu­

rossecretoras do protocérebro estão implicadas no estímulo à sí~

tese de proteínas da hemo1infa pelo corpo gorduroso, enquanto

que a "corpora allata" estimula a tomada pinocitótica dessas prQ

teínas pelos ovócitos em desenvolvimento (TELFER, 1965). Estudos

realizados em outras ordens de insetos mostraram, entretanto,

que pode haver variações no mecanismo proposto em Orthoptera,

havendo uma alteração na importância relativa das células neuros

secretoras e "corpora a11ata" na vite10gênese, conforme o inseto

estudado (WIGGLESWORTH, 1970).

As proteínas da hem01infa, além de serem utilizadas na

constituição do vitelo, são tomadas por um processo pinocitótico

para vârios outros órgãos, no inicio da pupação (LOUGHTON e t~ST

1965; LOCKE e COLLINS, 1966, 1967; TOBE e LOUGHTON, 1969;

CHIPPENDALE e KILBY, 1969) onde forneceriam aminoácidos para a

síntese "de novo" de proteínas imaginais (LOCKE e COLLINS,

1966, 1967) e/ou transportariam nutrientes essenciais que lhes

estão conjugados corno: carboidratos, 1ipídeos. ou cromóforos

(LOUGHTON e WEST, 1965). Alguns resultados sugerem que a tomada

pelos tecidos, pelo menos no caso do corpo gorduroso em Lepidop­

tera, seria estimulada pela ecdisona (COLLINS, 1969).

Os trabalhos referidos acima sôbre metabolismo de pro­

teínas durante a metamorfose dão uma idéia apenas qualitativa

dos fenômenos envolvidos. Um estudo quantitativo dêsse metabo­

lismo foi realizado por BOYD e MITCHELL (1966). ~stes autores

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-11-

~ proteínas larvais na

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~r o papel das proteí­

:udo iniciou-se quando

lemolinfa é tomada pe­

:etamente na constitu~

Resultados similares

!rentes ordens de ins~

lsetos (Coleoptera: De

1967; NIELSEN e

Diptera: STRANGWAYS­

'rmonal desse processo

onde as células neu-

das no estímulo à sí~

gorduroso, enquanto

nocitótica dessas prQ

ELFER, 1965). Estudos

straram, entretanto,

oposto em Orthoptera,

va das células neuros

se, conforme o inseto

:las passaram a serem

injetaram proteínas da hemolinfa previamente marcadas em larvas

de Drosophila melanogaster e verificaram que o. seu "turnover"

era bastante elevado, o que os levou a propor que as proteínas

da hemolinfa seriam intermediários importantes pelos quais pass~

ria a maior parte do "turnover" protéico total do inseto em me­

tamorfose. Uma situação completamente diferente foi encontrada

em Phormia regina por CHEN e LEVENBOOK (1966). Êstes autores

injetaram proteínas marcadas da hemolinfa em larvas, pupas e a­

dultos de Phormia regina e verificaram que a velocidade de degr~

dação das proteínas era sempre baixa e demonstraram também que a

injeção de proteínas da hemolinfa marcadas em larvas maduras de

Phormia regina pouco antes de puparem leváva à recuperação de

3/4 da radioatividade total em proteínas nos tecidos do adulto.

A partir dêsse resultado propuseram que as proteínas da hemolin­

fa passavam para os tecidos e eram em seguida usadas intactas

na formação das estruturas do adulto. Essa proposição foi cri­

ticada por WYATT (1968) que argumentou que não é necessário ad­

mitir a transformação direta de proteínas da hemolinfa (ou ou­

tras proteínas larvais) em proteínas do adulto para explicar os

resultados obtidos, bastando admitir que as proteínas tomadas

pelos tecidos seriam ali degradadas e os aminoácidos resultan­

tes permaneceriam dentro dos tecidos, onde seriam ràoidamente u­

tilizados na ress!ntese protéica.

~ serem utilizadas na

?rocesso pinocitótico

~ção (LOUGHTON e WEST

e LOUGHTON, 1969;

un aminoácidos para a

(LOCKE e COLLINS,

essenciais que lhes

:deos. ou cromóforos

sugerem que a tomada

rorduroso em Lepidop-

rS,1969).

! metabolismo de pro­

a apenas qualitativa

tativo desse metabo­

.966). Êstes autores

l~.

DINAMARCA e LEVENBOOR (1966) medindo a incorporação de

alanina e lisina durante a metamorfose de Phormia regina, esti­

maram a síntese protéica "de novo" durante a sua metamorfose em

apenas 2% do total das proteínas do adulto. Embora esse cálculo

esteja baseado na hipótese simplificativa de que o "pool" de á­

minoácidos é homogêneo em todo o inseto,os autores sugeriram, de

forma similar a CHEN e LEVENBOOK (1966), que uma parte das pro­

teínas larvais seria conservada intacta no adulto sem degradação

e ressíntese.

Devido às dificuldades envolvidas no estudo do metabo­

lismo de proteínas durante a metamorfose, como pode-se avaliar

dos trabalhos comentados acima, seria interessante o uso de téc­

nicas mais refinadas, envolvendo o isolamento de proteínas esp~

cíficas de tecidos individuais e o seu acompanhamento durante a

~etamorfose. Dentro dêsse prisma são muito interessantes os es­

tudos relacionados com a califorina.

-12-

Califorina é uma proteína isolada de Calliphora ery­

~rocephala, sintetisada pelo corpo gorduroso larval, armazenada

principalmente na hemolinfa e que corresponde a 60, 40 e 10% das

proteínas extraíveis de insetos com 4 dias após a eclosão, 2

dias após a formação do pupário e 3 dias após a emergência do

adulto, respectivamente, indicando que deve ser uma proteína de

armazenamento usada na formação dos tecidos imaginais (MUNN,

FEIN5TEIN e GREVILLE, 1967; MUNN, PRICE e GREVILLE, 1969; MUNN e

GREVILLE, 1969).

A presença de califorina foi pesquisada em outrcos in­

setos, utilizando-se técnicas imunológicas e os resultados indi

cam a ocorrência de reações de identidade completa ou parcial em

4 gêneros de outrOG Diptera Cyclorrhapha, de identidade parcial

em 4 gêneros de Brachycera, apenas uma reação de identidade par­

cial em 3 gêneros de Nematocera e nenhuma reação em insetos de

ordem diferente de Diptera, embora ocorressem part~culas seme­

lhantes (ao microscópio eletrônico) à califorina em várias espé­

cies de insetos, especialmente Lepidoptera (MUNN e GREVILLE,

1969). ~sses resultados sugerem a ocorrência generalizada de

proteínas do tipo da califorina, que seriam armazenadas princi­

palmente na hemolinfa e mais tarde seriam tornadas pelos tecidos

no início da pupação (como discutido acima) e, após hidrólise,

forneceriam os precursores para a síntese das proteínas do adul­

to. Essas proteínas poderiam então ser vistas como uma grande

reserva de aminoácidos, que ocorreriam na forma de proteínas e

nao livres, para evitar aumentar a osmolaridade do animal.

Embora os estudos com a califorina indiquem claramente

a existência em vários insetos de proteínas larvais com função

de simples reServa aminoácidos, nao excluem a possibilidade da

ocorrência de proteínas larvais que permaneçam intactas no adul­

to, como comentado anteriormente.

A utilização de proteínas larvais específicas, sem hi­

drólise prévia, é demonstrada nos dois trabalhos que serão comen

tados a seguir.

LAUFER e NAKA5E (1965) na base de estudos imunoquími­

cos e radioautográficos propuseram que a maioria das proteínas

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iso~ada de Calliphora ery­

juroso larval, armazenada

~ponde a 60, 40 e 10% das

dias após a eclosão, 2

2S após a emergência do

deve ser uma proteína de

tecidos imaginais (Mm~N,

~ e GREVILLE, 1969; MUNN e

lesquisada em outrcos in­

:as e os resultados ind!

:de completa ou parcial em

de identidade parcial

reação de identidade par­

uma reação em insetos de

rressem partLculas seme­

aliforina em várias espé-

e GREVILLE,

generalizada de

eriam armazenadas princi­

3.1TI tornadas pelos tecidos

na) e, após hidrõlise,

,e das proteínas do adul­

ristas como uma grande

i forma de proteínas e

iridade do animal.

:ina indiquem claramente

dnas lar.rais com função

:luem a possibilidade da

meçam intactas no adul-

.is específicas, sem hi­

rabalbos que serão comen

de estudos imunoquími­

maioria das proteínas

i....

r-13-

da secreçao da glândula salivar de Chironomus tentans nao sao

ali sintetizadas, mas são sequestradas da hemolinfa. Êsses re­

sultados foram confirmaóos e a evidência a seu favor extendida

pelo estudo das proteínas da hemolinfa e glândula por eletrofor~

se de disco em gel de po~iacrilarnida, por estudos imunológicos da

secreção salivar e por experimentos de incorooração de aminoáci~

dos marcauos realizados por DOYLE e LAUFER (1969).

Os resultados evidenciam que o processo de secreçao s~

livar'em Chironomus envolve o sequestro de proteínas da hemolin­

fa de forma similar àquela que ocorre durante a vitelogênese'~

Duas diferenças importantes devem ser, entretanto, assinaladas.

A primeira delas é que o sequestro de proteínas da hemolinfa

na formação da secreção salivar tem que ser específico, afim àe

assegurar que as propriedades químicas e físicas dessa secreção

sejam as mesmas, enquanto que na vitelogênese isso não é tão ne­

cessário, porque o papel das proteínas sequestradas parece ser o

de compor uma reserva de aminoácidos para o desenvclviment? do

futuro embrião (geralmente uma proteína é tomada específicamen~"

te, enquanto que as outras são tomadas com menor especificidade,

Cf. TELFER, 1965). A outra diferença notável é que a secreção

é produzida e utilizada na confecção do casulo em que vive a laE

va do Chironomus enquanto, êle ainda estâ se alimentando (S~GUY,

1951; IMMS, 1957), não há necessidade, portanto, dêle lançar mão

de suas reservas, como ocorre na vitelogênese que se realiza na

vida pupal ou no imago recém emergido.

Essa mesma diferença entre a formação da secreção em

Chironomus e a vitelogênese é também um obstáculo na considera­

ção dessa formação como ID~ modêlo da produção das proteínas ima­

ginais porque, diferentemente destas~ a secreção é formada en­

quanto as larvas estão se alimentando e em um ambiente hormonal

muito distinto daquele em que se inicia a formação das proteínas

imaginais •

::\;

-14-

4. StDAS E CASULOS

As sédas, definidas como um material fibroso secreta­

do por certas espécies de Insecta e Arachnida (SEIFTER e GALLOP,

1966), apresentam vários tipos estruturais conhecidos. Segundo

RUDALL (1962) é possível distinguir pelo menos 3 tipos princi­

pais de sédas. Existem sêdas que são constituídas principalme~

te por fibroína (comum em Leoidoptera), colágeno (ocorrem em

Hymenoptera) ou quitina (observado em Dictyoptera). Os estudos

dêsse último tipo ioram realizados apenas com difração de

raios-X, mas revelam a existência de um-componente protéico as­

sociado à qui tina que deve-se asemelhar à proteína cuticular

(RUDALL, 1962).

Um quarto e um quinto tipo de sêda foram reconheci­

dos mais tarde em Neuroptera cujos componentes principais sao:

um composto do tipo cuticulina e uma póliglicina, respectivamente

(RUDALL e KENCHINGTON, 1971).

As sêdas melhor estudadas sao aquelas constituídas

principalmente de e-fibroína e produzidas por Lepidoptera. Aná­

lises de aminoácidos realizadas em fibroínas de 74 Arthrcpoda,

principalmente Lepidoptera, mostraram que o conteúdo molar de

aminoácidos pequenos (alanina, glicina e serina) varia entre

46,2 e 94,6% do total (LUCAS, SHAlv e SMITH, 1958, 1960) o que e~

plica uma série de características típicas de difração de raios­

X que apresentam, e sua conformação e com cadeias polipeptídicas

antiparalelas.

Além da conformação e, outras conformações foram reco­

nhecidas nas fibroínas, usando difração de raios-X: conformação

a, observada em Hymenoptera e "cross-e" t::ffi alguns Hymenoptera

e em Arachnocampa luminosa (Diptera). O primeiro tipo de con­

formação referido permitiu a demonstração de outro caso de tran­

sição de conformação a para e por estiramento, além da queratina

e o segundo forneceu o primeiro caso conhecido de transformação

"cross-e" para - e-paralela (RUDALL e KENCHINGTON, 1971).

Análises de aminoácidos realizadas nas sêdas com cons

tituição diferente das e-fibroínas já referidas, permitiram uma

melhor compreensão das sêdas tipo colágeno, poliglicina,fibroína,

"cross·

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-15-

Além da sêdn, os casulos de insetos podem conter t~

bém sais, geralmente originaõos dos túbulos de Malpighi. Êsses

Os resultados acima referidos levaram RUDALL (1962)a

afirmar que as proteínas da sêda representam modêlos biológicos,

convenientes para o estudo dos mecanismos evolucionários envol­

vidos nas transições de conformação de proteínas, além de ilus­

trar tipos intermediários de proteínas estruturais entre o colá­

geno e o grupo das proteínas fibrosas afins formado pela quera­

tina, miosina, epidermina e fibrinogênio.

Os estudos sôbre as proteínas da sêda tiveram e têm i~

portante papel no conhecimento da confo~ação de proteínas, além

da contribuição ao conhecimento dos produtos naturais de insetos.

Os trabalhos de MEYER e MARK (1928) em fibroína da séda estabel~

ceram o conceito de cadeias polipept!dicas completamente extend!

das, além de fortalecer a visão das proteínas como cadeias lon­

gas de a-aminoácidos unidos por ligações peptldicas. Os traba­

lhos de MA.R8H,PATJL:NG e COREY (1955a, b) com o mesmo material

foram importantes, no estabelecimento do conceito da fôlha :ore­

gueada em estrutura protéica. A séda rara de Chrysopa permitiu

a demcnstração da existência da confcrma.ção protéica "Cross 13" e

da transição "Cross 13" -->B-paralp.la (PARKER e RUDAL:S, 1957) •

Por fim a sêda de Nematus ribesii, permitiu a demonstração de

proteínas com conformação de colágeno serr. apresentar, entretanto,

hidroxiprolina na molécula (LUCAS e PUDALL, 1968; RUDALL e

KENCHINGTON, 1971).

"cross-B" e a-fibroína. As sidas do tipo colágeno se caracteri­

zam por um alto conteúdo de glicina, prolina e pela ocorrência

de hidroxilisina; aquelas de tipo poliglicina ãpresentarn cêrca

de 66% dos aminoácidos corno glicina; a-fibroínas mostram um con­

teúdo de glicina baixo e um alto conteúdo de aminoácidos ácidos

em relação às B-fibroínas e por .fim, as sêdas do tipo "cross-B li

caracterizam-se por ~~ alto sonteúdo de serina que chega a 43%

do total (LUCAS e RUDALL, 1968).

Os componentes não protéicos da sêda forfu~ pouco est~

dados, como pode-se ver pelo fato das hexosaminas só terem sido

determinadas na sêda de Bo~byx mori, que é a sêda mais estudada,

em 1965 (SMITH e CLARK, 1965).

conformação

Hymenoptera

tipo de con-

erial fibroso secreta­

da (SEIFTER e GALLOP,

conhecidos. Segundo

nos 3 tipos princi­

tituídas principalme~

colágeno (ocorrem em

optera). Os estudos

nas com difração de

omponente protéico as-

protelna cuticular

~da foram reconheci­

1tes principais são:

lcina, respectivamente

I alguns

imeiro

outro caso de tran­

o, além da queratina

do de transformação

NGTON, 1971).

lformações foram reco­

raios-x:

s nas sêdas com con~

das, permitiram uma

poliglicina,fibroína,

aquelas constituídas

)r Lepidoptera. Aná­

las de 74 Arthrcpoda,

o conteúdo molar de

serina) varia entre

1958, 1960) o que e~

ledifração de raios­

:adeias polipeptídicas

-16-

sais podem ser de oxalato de cálcio(OHNISHI et alii, 1968) ou

carbonato de cálcio (CLARK, 1958; WIGGLESWORTH, 1965).

5. FINALIDADES D~STE TRAB~~HO

o estudo da origem das proteínas imaginais seria muito

facilitada se fôsse conhecida alguma estrutura do adulto formada

por um pequeno número de proteínas, porém presentes em massa su­

ficiente, para poderem ser isoladas, caracterizadas e ter a sua

origem traçada com segurança ao longo da metamorfose. No desco­

nhecimento de uma estrutura imaginaI com as características des

critas, seria talvez proveitosa a utilização de um modêlo.

Um modêlo adequado parece ser a produção do casulo por

R. americana. Êsse casulo possui uma massa considerável, deve

possuir um número pequeno de proteínas e é feito depois que a

larva parou de comer. Como a glândula salivar da larva nao pos­

sui um reservatôrio para acúmulo de secreção, com a qual é feita

pelo menos em parte o casulo, essa tem de ser sintetizada a par­

tir das reservas do animal. Portanto, esta síntese dá-se de for

ma análoga àquela que ocorre durante a metamorfose, quando o ani

mal sintetiza tôdas as proteínas imaginais a partir de reservas

(não importa de que origem), porque nesta ocasião o inseto é um

sistema fechado. A produção das proteínas da secreção, ainca de

forma análoga àquela na metamorfose, deve ser específica a fim

de manter inalteradas as propriedades físicas, químicas e bioló­

gicas do casulo.

Um outro aspecto importante do modêlo em questão é a

produção do casulo ter início no fim do estágio larval, no come­

ço da metamorfose, em ambiente hormonal similar àquele em que

tem início a produção das proteínas imaginais (ver ítem l,acima).

~ste aspecto é muito importante porque, considerando-se a meta

- morfose um tipo particular de polimorfismo (ver ítem 1), onde os

sistemas ge!'léticos da larva, pUJ:)a e adulto seriam ativados um a­

pós o outro pelo ambiente hormonal interno do animal, se houves­

se uma diferença muito grande entre a cronologia da produção do

casulo e do início da formação das proteínas imaginais,o que nao

acontece neste caso, isso poderia corresponder também a um ambi-

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-17-

~SHI et alii, 1968) ou

SlVORTH,1965).

~s imaginais seria muito

rutura do adulto formada

n presentes em ~assa su­

icterizadas e ter a sua

metamorfose. No desco­

\ as características de~

lção de um modêlo.

l produção do casulo por

ssa considerável, deve

é feito àepois que a

livar da larva não pos­

ção, com a qual é feita

ser sintetizada a par­

ta síntese dá-se de for

tamorfose, qUwldo o an!

~ a partir de reservas

ocasião o inseto é um

; da secreção, ainca de

ser específica a fim

.cas, químicas e hioló-

lodêlo em questão é a

;tágio larval, no come­

milar àquele em que

ais (ver ítem l,acima).

nsiderando-se a met~

(ver ítem 1), onde os

seriam ativados um a­

do animal, se houves-

ologia da produção do

as imaginais,o que não

~der também a um ambi-

L

ente hormonal muito distinto e, provàvelmente, implicaria em pr~

cessos radicalmente 4iferentes.

A produção do casulo em R. americana é feita de forma

sincrônica e coordenada por larvas oriundas de uma mesma postura

e sujeitas às mesmas condições ambientais, o que garante a poss!

bilidade de se estudar larvas em diferentes estágios do desenvo!

vimento, apresentando um mínimo de variações individuais. Além

do ma~s, a correlação de resultados é facilitada pela existência

de um método de datar fisiolõgicamente as larvas, após o início

da produção do casulo, baseado nos "puffs" . cromossômicos das

glândulas salivares (GUARACIABA e TOLEDO, 1967) que foi ligeira­

mente reformulado nesta tese (ver Métodos). Como êsses "puffs"

são regulados por hormônios, assim como todo o desenvolvimento

larval,conforme foi comentado no ítem 2 acima, o referido méto­

do de datação é extremamente adequado. E' importante acrescen­

tar ainda o fato de que todos os estudos bioquímicos do desenv01

vimento de R. americana são facilitados, em relação aos demais

insetos Holometabola, com exceção de Lepidoptera, devido ao tama

nho de sua larva, que permite com relativa facilidade o estudo

de órgãos isolados por dissecção. A dificuldade de se estudar §rgãos isolados em larvas da maioria dos Holometabola é a respons~

vel pela incidência maior dêsses estudos em Lepidoptera, que po~

suem larvas maiores que as encontradas nas demais ordens de in­

setos (Cf. r~ATT, 1968).

R~ vista de tôdas as características comentadas acima,

a produção do casulo por R. americana representa, provàvelmente,

~~ modêlo mais prorrQssor para o estudo da formação das proteínas

imaginais do que a formação da secreção salivar em Chironomus e

a vitelogênese referidos no ítem 3, acima.

A intenção básica dêste trabalho é contribuir para o

estudo da origem das proteínas do inseto adulto, utilizando como

modêlo a produção do casulo coletivo por larvas de R. americana.

Entretanto, devido à carência quase abas luta de dados fisiológ!

cos e bioquímicas fundamentais em R. americana durante essa pro­

dução, êste trabalho orientou-se mais especificamente para a ob­

tenção dêstes dados. Com êsse objetivo, dois tópicos principais

foram selecionados para estudo:

"';18-

a) a composição química da hemolinfa ao longo do de­

senvolvimento larval;

b) composição química do casulo coletivo e suas alte

rações durante a sua proGução.

~nfase foi dada ao estudo da hemolinfa por várias ra-

zoes:

a) a hemolinfa corresponde a porção considerável do

animal (37% do seu pêso-Úffiido, 26% de seu peso­

sêco) e é fácil de se obter;

b) a hemolinfa deve refletir as principais ~lterações

bioquímicas dos tecidos, porque os insetos pos­

suem um sistema de circulação aberto, em que o ú­nico fluído corpóreo é a hemo linfa e sõ~ente atr~

vés da qual muitos órgãos podem trocar compostos

entre si;

c) a participação da hemolinfa em muitos eventos bi2

químicos no final da vida larval já foi documenta

da em vários insetos (WYATT, 1961; "YATT, 1968;

ver tarooém ítem 3), o que abre a possibilidade d~

la participar na produção do casulo de R. ameri­

cana.

o estudo químico da hemolinfa foi feito com mais deta

lhe em larvas no fim da vida larval, pouco antes de iniciarem a

produção do casulo (idade de 45-48 dias, quando mantidas a 20oC)

pozque nessa ocasião o volume de hemolinfa é maior.

o conhecimento da composição do casulo orienta a pes­

quisa sôbre a origem de seus componentes e eventualmente sôbre o

mecanismo e regulação de sua síntese. Além disso, devido ao fa­

to do c~8ulo ser constituído oelo menos em parte por séda, puacomposição química apresenta um elevado interêsse, conforme foi

chamado a atenção no ítem 4 acima. ~ste interêsse ainda é mais

acentuado porque êsse tipo de produto natural foi muito po~co e~

tudado em Diptera, se fôr excluído o trabalho de GROSSBACH(1969), realizado com a secreção salivar de duas espécies de

Ca~ptochironomus. Nêste caso a secreção é responsável pela pro-

dução

rios I

a lar'

lo ve:

que o

mal (:

-19-

,linfa ao longo do de-

I coletivo e suas alte~.

,linfa por várias ra-

,rção considerável do

lo, 26% de seu pêso-

principais aIterações

:que os insetos pos­

io aberto, em que o ú­

lolinfa e sõ;nente atr~

,dem trocar compostos

em muitos eventos bi2

rval já foi docurnent~

1961; HYATT, 1968;

re a possibilidade ã~

casulo de R. ameri-

feito co~ mais deta

antes de iniciarem a

ando mantidas a 20oC)

é maior.

~sulo orienta a pcs­

~ve~tualmente sôbre o

disso, devido ao fa­

parte por sêda, pua

~rêsse, conforme foi

:erêsse ainda é mais

.1 foi muito pouco e~

abalho de GROSSBACHduas espécies de

"esponsável pela pro-

~,t

L

dução de um fio, semelhante à sêda, que prende partículas de v~

rios materiais, fcrmando um tubo no interior do qual permanece

a larva dêsse animal, não se constituindo, portanto, em um cas~

lo verdadeiro, em contraste com o que ocorre em R.americana,poE

que o tubo não é constituído inteiramente de secreções do ani­

mal (S~GUY, 1951; IMMS, 1957).

·1

~TODOS

1. Cultura de Rhynchosciara

Rhynchosciara americana (Diptera Nematocera Sciaridae)

foi cultivada nas condições previamente descritas por LARA, TAMA

KI e PAVAN (1965). Só foram utilizadas larvas de um mesmo sexoem tôdas as determinações para simplificar a interpretação dos

resultados. O sexo utilizado foi sempre o feminino devido ao

seu tamanho maior.

2. Determinação da idade fisiológica larval

O presente trabalho procura entre outras coisas o cor­

reiacionamento de eventos fisiológicos com alterações químicas

em alguns tecidos. Torna-se imperioso então a utilização de mé­

todos adequados para a comparaçao de resultados obtidos em lar­

vas oriundas·de grupos de postura diferentes. Embora a compara­

çao por idade cronológica seja a mais fácil de ser realizada, não

é a mais adequada, mesmo em animais submetidos a idénticas condi

çôes de cultura. Pequenas diferenças na velocidade de desenvol­

vimento em grupos da mesma idade cronológica são frequentemente

observadas. De maneira geral essas pequenas diferenças não sao

de importância, entretanto, em alguns casos, nos quais se inclu­

em muitos daquêles descritos nesse trabalho, essas diferenças EOdem levar a resultados de interpretação difícil.

Um método de datação fisiológica para R. americana foi

desenvolvido por GUARACIABA e TOLED0 (1967) para o 49 estádio,

o qual corresponde a 70% da ,vida larval e onde ocorrem os princ!

pais e mais vislveis eventos larvais. Abaixo será apresentado o

ciclo vital de R. americana afim de facilitar as discussões pos­

teriores e uma tabela das subdivisões do 49 estádio segundo GUA­

RACIABA e TOLEDO (1967) com modificações baseadas em observações

feitas durante a realização desta tese. A notação aqui apresen­

tada será empregada em tôda a extensão dêste trabalho.

ecll

vai:

mudo

pec1

dia:

49 I

ra (

cio

aprl

gia

~

-. vem

aquj

esq\

sere

da (

cutj

da j

últj

mo n

nestvime

de 4

uma

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res

da i

dem

LED(

-21-

,a Nematocera Sciaridae)

iescritas por LARA, T~

Larvas de um mesmo sexo

Ir a interpretação dos

o feminino devido ao

~

re outras coisas o cor­

om alterações químicas

tão a utilização de mé­

ltados obtidos em lar­

teso Embora a compara­

il de ser realizada, não

tidos a idênticas condi

~elocidade de desenvol­

ica são frequentemente

)as diferenças não são

)s, nos quais se inclu­

lho, essas diferenças EOLfícil.

l para R. americana foi

1) para o 49 estádio,

onde ocorrem os princ!

lixo será apresentado o

.tar as discussões pos­

9 estádio segundo GUA­

,aseadas em observações

. notação aqui apresen­

te trabalho.

t

As fêmeas de R. americana poem de 1500 a 2000 ovos que

eclodem cêrca de 13 dias após a postura, a 200 C. As mudas lar­

vais ocorrem aos 7, 13 e 21 dias após a eclosão, enquanto que a

muda pupal e a emergência do adulto se dão aos 64 e 70 dias res-.

pectivamente. A postura das fêmeas fecundadas inicia-se aos 75

dias. A Tabela I descreve os principais eventos fisiológicos do

49 estádio e a nomenclatura usada para a sua datação. De manei­

ra geral, os eventos fisiológicos descritos (mudança de côr, in!

cio da produção de casulo, etc.) oscilam em tôrno da cronologia

apresentada nessa tabela de cêrca de 1 a 2 dias. Essa cronolo­

gia corresponde a animais se desenvolvendo a 200 C.

Algumas observações quanto à terminologia empregada d~

vem ser feitas,em relação à tabela I. O têrmo "apélise·" usado

aqui corresponde ao descolamento das células epidérmicas do exo­

esqueleto antigo, corno propôsto por JENKIN e HlNTON (1966). Muda

será entendida aqui corno o processo pelo qual o inseto se despe

da cutícula antiga.

Pupa farata corresponde à pupa fechada no interior da

cutícula do último estádio larval, corno foi comentado no rodapé

da introdução (p. 3). Apupa farata é formada, portanto, após a

última apólise larval e é chamada também, muitas vêzes, pelo têr·

mo menos preciso de pré-pupa.

A expressão larva madura que será usada frequentemente

nesta tese, refere-se, à larva que atingiu o seu máximo desenvol

vimento, isto é, uma larva que está no fim do 29 período (cêrca

de 45-48 dias de idade).

GUARAClABA e TOLEDO (1967) reportaram a existência de

uma muda entre o 59 período e a muda pupal. Entretanto, nenhuma

muda verdadeira parece ocorrer nesse intervalo de tempo; os autQ

res devem estar chamando de muda à última apólise larval referi­

da acima .

O~tras informações sôbre a biologia de R.americana po­

dem ser encontradas em DREYFUS et alii (1951) e GUARACIABA e TO­

LEDO (1967) .

Subdivisão do 49 estádio de R.

Idade Cronológica

aproximada (dias)

21

32

49

54

57

58

59

61-64

-22-

TABELA I

Eventos Fisiológicosou

Aparência da larva

3~ muda larva1, lar­

vas claras

Larvas começam a se

tornarem avermelha­

das

Larvas iniciam a te­

cer o casulo

Início da formação

do "puff" B-2 da

glândula salivar. Ca

sulo consistente

Máximo desenvolvimen

to do "puff" B-2 lar

vas quietas, em po­

sição curva

Máximo desenvolvimen

to do "puff" C-3.

Larvas curvas, mas

já envolvidas por c~.

lulas individuais

do casulo

Última apólise lar

vaI. Túbulos de

Malpighi livre~ de

caC0 3

Muda pupal

americana

Correspondente ao

início do período

19

29

39

49

59

69

Pré-Pupal

(pupa farata)

3. Coleta de hemolinfa

As larvas era

cada para ficarem imóve

picadas na porção termi

fa era recolhida em tub

centrifugação a 3.200g

tos tissulares, a hemol

ções químicas.

Para a deterrn

hemolinfa era recolhida

noS tubos de centrífuga

(EC 1.10.3.1) endógena

tais, o estilete usado

vidraria usada era prev

Hcl e âgua bidestilada

4. Determinação do volu

Hemolinfa col

minação com fragmentos

rada para capilares de

Microcaps), conservand

dos. Por.êsse lado, os

cool e em seguida, cent

ças de centrífuga com t

correspondentes a 1500g

da da altura do capilar

ta ocupada pelos hemoci

permitia calcular o vol

hemocitos corresponden

permitiram calcular fàc

hemocitos na hemolinfa.

-23-

3. Coleta de hemolinfa

americana

Correspondente ao

início do período

19

29

39

49

59

69

Pré-Pupal

(pupa farata)

l

As larvas eram lavadas com água, dispostas sóbre gêlo pi

cado para ficarem imóveis, sê"cas em papel de filtro e em seguida

picadas na porção terminal do abdome com um estilete. A hemolin­

fa era recolhida em tubos de centrífuga mantidos em gêlo. Após

centrifugação a 3.200g a 40 C, para sedimentar hemocitos e fragmen­

tos tissulares, a hemolinfa sobrenadante era usada nas determina­

ções quimi cas .

Para a determinação de compostos ninhidrina-positivos, a

hemolinfa era recolhida sôbre cristais de feniltiouréia colocados

nos tubos de centrífuga a fim de inibir a atividade da tirosinase

(EC 1.10.3.1) endógena (LEVENBOOK, 1966). Nas determinações de m~

tais, o estilete usado para picar a larva era de vidro e tóda a

vidraria usada era previamente lavada extensivamente com H2S04 ,

HCl e água bidestilada e deionizada.

4. Determinação do volume ocupado pelos hemocitos na hemolinfa

Hemolinfa coletada com todo o cuidado para evitar conta­

minação com fragmentos tissulares e sem ser centrifugada foi aspi­

rada para capilares de 25 lJl ("disposable micropipettes", DRUMOND

Microcaps), conservando-se cêrca de 4 mm de altura não preenchi­

dos. Por êsse lado, os capilares foram selados em lâmpada a ál­

cool e em seguida, centrifugados envolvidos por algodão, em cabe­

ças de centrífuga com tubos basculantes. Foram usad?s rotações

correspondentes a 1500g ou 3200g com resultados idênticos. A medi

da da altura do capilar ocupado pela hemolinfa e a altura da calo­

ta ocupada pelos hemocitos, realizada sob uma lupa esteroscópica,

permitia calcular o volume de hemolinfa no capilar e o volume de

hemocitos correspondente a essa hemolinfa. Êsses dois resultados

permitiram calcular fàcilmente o volume porcentual ocupado pelos

hemocitos na hemolinfa.

I,·

".,.

I',

-24-

5. Métodos de estudo da coagulação e escurecimento da hemolinfa

Cinco capilares de 15 111 ("disposablp. micropipettes" ,

DRUMMOND Microcaps) foram preenchidos com hemolinfa total e cin­

co outros preenchidos com hernoliL~a cent=ifugada de larvas de 29

P, 45 dias de idade. Após 1, 2, 5, 10 e 15 horas, os capilares

eram observados quanto à cór, presença de sedimentos e fluidez.

Paralelamente eram f~itas observações similares em urro tubo de

ensaio com cêrca àe e,5 ml de hemolinfa total.

6. Determinação da osmolaridade, densidade, volume e pêso-sêco

da hemolinfa

As determinações de osmolaridade foram tôdas realiza­

das utilizando-se o método crioscépico em um Fiske Osmometer,ge~

tilrnente cedido pelo Dr. Gerhard Malnic.

A densidade foi seropre determinada pesanão-se "dispo­

sable micropipettes" ,(Drurnrnond Microcaps) de 15 111 com e sem he­

molinfa. Os desvios observados entre as determinações foram in­

feriores a 1%.

Os volumes de hemolinfa foram todos determinados pelo

método de exanguinação (RICFJUmSON, BURDETTE e EAGLESON, 1931).0

método de diluição de corante (PRICE, 1961) foi também, tentado,

produzindo-se nos casos favoráveis (larvas jovens), resultados

muito semelhantes aos de exanguinacão corno pode ser visto em re­

sultados (Tabela XVII). Êsse método foi entretanto abandonado

porque em larvas maduras os resultados variavam muito dependendo

do intervalo de tempo entre a injeção e a coleta de hemolinfa.Es

sa variabilidade deve ser consequência de excreção do corante

pelos tUbulos de Malpighi, corno demonstrado em Schistocerca gre­

garia por LEE (1961). Corno nenhuma excreção de corante foi ob­

servada em larvas jovens isso parece sugerir que a eliminação de

corante varia com a idade. e que portanto, seria necessário de­

terminar cuidadosamente os tempos máximos a serem usados entre i~

jeção de corante e coleta de hemolinfa para cada idade. Em vis­

ta disso preferiu-se utilizar sõmente o método de exanguinação.

A massa de sólidos da hemolinfa foi obtida aquecendo-

se amostras de hemolinfa centrifugada a 800 C at~ atingir pêso

çonstante.

7. Determinação de p

Amostras· d,

vas, limpas corno des

de óleo de parafina.

para a determinação .

Analyser Model 113" I

Massachusetts", cedi.

determinaçoes foram :

370C~

As concent,

das determinações de

do-se que as constan1

plasma sanguíneo hum,

e 6,10 respectivamen1

moles por litro :e pC

1958).

pH =

O pH de hen

dido a 250 C, em condi

de vidro de um "Metrc

lo Dr. Gerhard Malnic

B. Determinações guín

Aminoácidos

damente no item 9.

a-amino-N t

hemolinfa foram adiei

da a 45009 por 10 min

se 0,5ml de HCI04 IN

se 10 minu~os a 11500

ml de HCI04 0,5N. Os

venientemente e usado

cido solúvel pelo rnét

feita com DL-leucina.

:urecimento da hemolinfa

:posablp. micropipettes" ,

Im hemolinfa total e cin­

,=ifugada de larvas de 29

15 horas, os capilares

e sedimentos e fluidez.

milares em UIT. tubo detotal.

-25-

7. Determinação de P02' pC02 , pH e HC0 3- na hemolinfa

Amostras de hemolinfa foram colhidas picando-se as laE

vas, limpas como descrito anter~ormente, sob uma espêssa camada

de óleo de parafina. Essas amostras foram em seguida utilizadas

para a determinação anaeróbica de p02' pC02 e pH em um "pH/Gas

Analyser Model 113" da "Instrumentation Laboratory Inc., Boston,

Massachusetts", cedido pelo Dr. Herval P. Ribeiro. Tódas essas

determinações foram realizadas com o aparelho termoestatisado a

370C~

As concentrações de HC03 foram calculadas.a partir

das determinações de pH e pc02 usando a equação abaixo, assumin­

do-se que as constantes ~ e pK são idênticas na hemolinfa e

plasma sanguíneo humano. Neste os valores de ~ e ~ são 0,0310

e 6,10 respectivamente, a 370 C, quando HC03- é medido em mili­

moles por litro :e pC02 em milímetros de mercúrio (DAVENPORT,

1958).

ie, volume e pêso-sêco

1e foram tódas realiza­

1 um Fiske Osmometer,ge~

,ada pesandO-se "dispo­

de 15 ~l com e sem he­

determinações foram in-pH = pK + log

[HC03-]

a (pC02 )

~dos determinados pelo

rTE e EAGLESON, 1931).0

1) foi também, tentado,

jovens), resultados

) pode ser visto em re­

!ntretanto abandonado

"iavam muito dependendo

coleta de hemolinfa.Es

excreção do corante

o em Schistocerca gre­

ão de corante foi ob­

rir que a eliminação de

seria necessário de­

a serem usados entre ig

a cada idade. Em vis­

todo de exanguinação.

:oi obtida aquecendo-

)C at~ atingir pêsoII,

II

~

° pH de hemolinfa coletada como descrito acima foi me­

dido a 25°C, em condições anaeróbicas, usando um microeletrodo

de vidro de um "Metroiun Herisau pH Meter", gentilmente cedido p~

lo Dr. Gerhard Malnic.

8. Determinações guímicas na hemolinfa

Aminoácidos e peptideos livres serão discutidos separ~

damente no item 9.

a-amino-N total-ácido solúvel. Amostras de 80 vl de

hemolinfa foram adicionadas a 0,72 ml de NaCl O,lM e centrifuga­

da a 4500g por 10 minutos, 'para a remoção de hemocitos. Juntou­se 0,5ml de HCI0 4 lN a 0,5ml do sobrenadante acima. Centrifugou-

se 10 minutos a 1l500g e lavou-se duas vêzes o sedimento com 0,5

ml de HCI0 4 0,5N. Os sobrenadantes reunidos foram diluídos con­

venientemente e usados para a determinação de a-amino N total-á­

cido solúvel pelo método de ROSEN (1957). A padronização foi

feita com DL-leucina.

"I-,-r-

-26-

Carboidrato e trealose. Alíquotas de 0,15 ml de hemo­

linfa centrifugada eram reunidas com 1 ml de etanol 60% v/v, dei

xados a 75 0 C por 10 minutos e após atingir a temperatura ambien­

te eram centrifugadas. Após recolher o sobrenadante, o sedimen­

to era novamente aquecido oom etanol 60% v/v e .centrifugado como

acima. Essa operação era repeti~a mais uma vez. Os sobrenadan­

tes reunidos eram diluídos convenientemente com etanol 60% v/v e

alíquotas dêsses eram usadas, depois de evaporadas em. estufa a

600 C para a determinação de carboidratos com reagente de antro­

na segundo MOKRASCH (1954). A massa de carboidratos era calcul~

da como glicose.

O extrato alcoólico preparado acima foi usado também

para o isolamento químico e determinação quantitativa de trealo­

se de acôrdo com a metodologia de \VYATT e KALF (1957).

Cloreto. Tôdas as determinações foram feitas com hemQ

linfa centrifugada total usando a técnica de SHALES e SHALES

(1941) •

Cinzas. Essas foram determinadas por incineração de ~

mostras de 1 rol de hemolinfa centrifugada em cápsulas de plati~

na, em mufla a 560oC, até produzir cinzas brancas.

Citrato. Foi determinado em amostras de hemolinfa ce~

trifugada e desproteinizacas de acôrdo com ETTINGER, GOLDBAUM e

SMITH Jr. (1952).

Fôsforo total, inorgânico, ácido solúvel, lipídico e

protéico. O método empregado para a ceterminação de fósforo to­

tal, inorgânico, lipídico e- ácido solúvel foi aquêle descrito

por CHEN, TORIBARA e WARNER (1956). As amostras para a determi­

n~ção de fósforo protéico foram preparadas por duas técnicas di­

férentes: uma envolvendo precipitação das proteínas por TCA e

outra.por sulfato de amônia. A primeira preparação consistia em

tomar alíquotas de 0,2 ml de hemolinfa centrifugadae adicionar

0,8 ml de TCA 10% P/V. Após a centrifugação e desprêzo do sobr~

nadante, o sedimento era lavado com 1 ml de TCA 5% P/V e o sobre

nadante novar.~nte desprezado. O sedimento ~ra então suspenso em

1,5 ml de etanol-éter (3:l, .v/v), aquecido à ebulição, centrifu-

o sobrenadante dI

vêzes. O sedimento era

depois incinerado e usal

técnica referida acima.

A determinaçã.

tação das proteínas com

alíquotas de O, 2 ml de J

0,6 ml de sulfato de am'

230 C). Após a centrifu

mento foi lavado com 1,'

pós nova centrifugação

foi suspenso em 3,8 ml

ebulição, centrifugado

passo foi repetido uma

ção, foi usado para a d

O conteúdo do

raçao das proteínas por

ma, é o mesmo.

Glicogênio. A

da eram desproteinizada

obtido por centrifugaçâ

todos os sobrenadantes

tanol absoluto e incube

Em seguida, o material

do. O sedimento era er

80%, evaporado em estui

carboidratos pela reaç~

massa de glicogênio eré

a fração assim isolada

na-positivas diferentes

e CLARINGBOLD, 1956).

Lipídeos. ts1

mostras centrifugadas (

e SLOANE-STANLEY (1957:

vaporação do solvente (

tura ambiente, até se (

..i

-27-

IS de 0,15 rol de hemo­

e etanol 60% v/v, de.!.

a temperatura ambien­

renadante, o sedimen­

v e .centrifugado como

vez. Os sobrenadan­

com etanol 60% v/v e

poradas em. estufa a

~ reagente de antro­

boidratos era calCUla

Lma foi usado também

~ntitativa de trealo­

CALF (1957).

:oram feitas com hemo

gado e o sobrenadante desprezado. O último passo era repetido 3- "

vêzes. O sedimento era em seguida lavado com 1,5 ml de acetona e

depois incinerado e usado para a determinação de fósforo pela

técnica referida acima.

A determinação de fósforo protéico, envolvendo precipi­

tação das proteínas com sulfato de amônio foi realizada tomando­

alíquotas de 0,2 ml de hemolinfa centrifugada e lhes adicionando

0,6 ml de sulfato de amônio saturado (à temperatura ambiente,

230C). Após a centrifugação e abandono do sobrenadante, o sedi­

mento foi lavado com 1,0 ml de sulfato de amônio 75% saturado. A­

pós nova centrifugação e desprêzo do sobrenadante, o sedimento

foi suspenso em 3,8 ml de etanol-éter (3:1, v/v), aquecido até a

ebulição, centrifugado e o sobrenadante, descartado. O último

passo foi repetido uma vez e o sobrenadante final, após incinera­

ção, foi usado para a determinação de fósforo.

ras de hemolinfa ceg

TTINGER, GOLDBAUM e

por incineração de ~

I cápsulas de plati..,.

"ancas.

olúvel, lipídico e

nação de fósforo to­

i aquéle descrito

~ras para a determi­

)r duas técnicas di­

)teínas por TCA e

)aração consistia em

.fugadae adicionar

e desprezo do sobr~

~CA 5% P/V e o sobr~

·a então suspenso em

ebulição, centrifu-

SP.ALES e SHALES O conteúdo do fósforo protéico determinado após a prep~

ração das proteínas por qualquer das duas técnicas descritas aci­

ma, ê o mesmo.

Glicogênio. Amostras de 0,4 ml de hemolinfa centrifuga­

da eram desproteinizadas com 0,1 ml de HCI04 2,5N. O sedimento

obtido por centrifugação era lavado com 0,5 ml de HCl04 0,5N e

todos os sobrenadantes reunidos. A éstes juntava-se 2,5 ml de e­

tanol absoluto e incubava-se a preparação a 370 C por 15 minutos.

Em seguida, o material era centrifugado e o sobrenadante desprez~

do. O sedimento era então lavado duas vézes com 0,5 ml de etanol

80%, evaporado em estufa a 600C e usado para as determinações de

carboidratos pela reação de antrona segundo MOKRASCH (1954). A

massa de glicogenio era calculada como giicose. E l possível que

a fração assim isolada e determinada contenha substâncias antro­

na-positivas diferentes do verdadeiro glicogenio (BALMAIN,BIGGERS

e CLARINGBOLD, 1956).

Lipídeos. Êstes foram isolados quantitativamente de a­

mostras centrifugadas de hemolinfa pela técnica de FOLCH, LEE

e SLOANE-STANLEY (1957) e determinados gravimetricamente, após e­

vaporação do solvente da extração por pressão reduzida, à temper~

tura ambiente, até se obter peso-constante.

I''i!i

11111

-28-

Metais. A matéria orgânica de amostras de hemolinfa cen

trifugada com as precauções já descritas, era destruída e'o mate

rial remanescente, após diluições convenientes em água bidestila­

da e deionizada era usado para as determinações de metais por es­

pectroscopia de absorção atõmica. Para essa finalidade foi empr~

gado um "Atomic Spectrometer" da "Perkin-Elmer" operàdo pela srta

Yolanda Tav~res.

As determinações de sódio e potássio, entretanto, .foram

realizadas sem destruição prévia da matéria orgânica, por espec­

troscopia de chamas, em um "Flame Photometer Evans" da "Electro­

selenium Ltd.", gentilmente cedido pelo Dr. Gerhard Malnic.

Três técnicas distintas foram utilizadas para a destr~

ição da matéria orgânica. A primeira delas consistia em incine­

rar a hemolinfa em cápsula de platina ou porcelana (os resultados

foram idênticos) em uma mufla a 5600 C até a formação de cinzas

brancas. Outra técnica consistia em destruir a matéria orgânica

da mesma forma que a descrita por CHEN, TORIBARA e WARNER (1956)

antes de determinar fõsforo total. Por fim outra técnica utiliza

da consistia em aplicar a hemolinfa em quadrados de papel \Vhatman

n91 de cêrca de 4cm de lado e colocar o sistema em um frasco de"combustão de Schoniger para a sua destruição por radiação infra-

vermelha.

Como os resultados obtidos com as três técnicas de des­

truição foram idênticos passou-se a utilizar a técnica que fôsse

mais conveniente na ocasião.

Proteínas. Estas foram determinadas utilizando-se o

procedimento de LOvlRY et ali i (1951). Afim de se eliminar inter­

ferências de compostos não protêicos, a absorbância de cada amos­

tra foi corrigida pela absorbância do sobrenadante de uma duplic~

ta desproteinizada com HCl0 4, em concentração final de 0,5Ni am­

bas absorbâncias medidas após a reação colorimétrica. Os títulos

de proteína foram calculados tendo albumina cristalina de sôro

bovino como padrão.

9. cromatografia de .

vos ácido-solúvei:

A preparaç;

descri to antes, para

tos ninhidrina-posit:

to não hidrolizadas,

A, cromatogJ

Analyser, Model 120C'

Angelis, utilizando c

necido junto com o eç

pequena modificação c

A identific

ta baseando-se em se.

sorbância 440/570 m~

tamento na hidrõlise.

permitia a sua identi

lizados com uma amost

ros adquiridos de "Ma

gramas pub2icados (SP

TALLEY, 1962; HAMILTO

to dos compostos na h

cima) e cromatogramas

les de amostras não h

~os não foi possIvel

sos, a identificação

Os resultad

çao da área sob os pi

tes de cor para cada

gramas padrões. No c

mistura padrão, usou­

fatôres fornecidos pe

cada modêlo de equipa

caso de.peptídeos uso

te média é obtida tom

cor para os aminoácid

na, prolina e cisteIn

-29-

~ostras de hemolinfa ceg

era destruída e'o mat~

entes em água bidestila­

nações de metais por es­

'ssa finalidade foi empr~

Elrner" operádo pela srta

ássio, entretanto, foram

ia orgânica, por espec­

ter Evans" da "Electro­

r. Gerhard Malnic.

tilizadas para a destr~

~s consistia em incine­

Jorcelana (os resultados

a formação de cinzas

ruir a matéria orgânica

)RIBARA e WARNER (1956)

Lm outra técnica utiliz~

tdrados de papel ~Vhatman

;istema em um frasco de

;ão por radiação infra-

lS três técnicas de des­

:ar a técnica que fôsse

9. Cromatografia de troca iônica dos compostos ninhidrina-positi­

vos ácido-solúveis da hernolinfa

A preparação das amostras de hemolinfa, coletadas corno

descrito antes, para a identificação e quantificação dos compos­

tos ninhidrina-positivos ácido solúveis, tanto hidrolizadas quan­

to não hidrolizadas, foi feita segundo LEVENBOOK e OINAMARCA(1966)

A, cromatografia fo~ realizada em um "Beckman Arninoacid

Analyser, Model 120C", gentilmente cedido pela Ora. Rebeca C. de

Angelis, utilizando o procedi~ento para fluídos fisiológicos for­

necido junto com o equipamento da Beckman e que consiste em uma

pequena modificação do-método de SPACKMAN, STEIN e MOORE(195B).

A identificação de cada pico nos cromatogramas foi fei­

ta baseando-se em seu tempo relativo de eluição, sua razão de ab­

sorbância 440/570 m~ (ZACHARIUS e TALLEY, 1962) e em seu compor­

tamento na hidrólise. O tempo relativo de eluição dos compostos

permitia a sua identificação por comparação com cromatogramas re~

lizados com uma amostra de 17 aminoácidos, cromatogràficamente p~

ros adquiridos. de "Mann' Research Laboratories~', ou/e com cromato­

gramas pub2icados (SPACKMAN, STEIN e MOORE, 1958; ZACHARIUS e

TALLEY, 1962; HAMILTON, 1963). Para a observação do comportamen­

to dos compostos na hidrólise, amostras eram hidrolizadas (ver a­

cima) e cromatogramas obtidos com essas eram comparados com aquê-.

les de amostras não hidrolizadas. Na identificação de vários pi­~os não foi possível utilizar todos êsses critérios. Nesses ca­

sos, a identificação foi considerada apenas tentativa.

.adas utilizando-se o

m de se eliminar inter­

sorbância de cada amos­

enadante de uma duplic~

ção final de 0,5N; am­

orirnétrica. Os títulos

a cristalina de sôro

i!!.,\l.

Os resultados quantitativos foram obtidos por integra­

çao da área sob os picos dos cromatogramas e utilizando constan­

tes de côr para cada aminoácido, conforme determinado nos cromat2

gramas padrões. No caso de compostos que não estavam presentes na

mistura padrão, usou-se a constante de côr média, corrigida por

fatôres fornecidos pela "Beckrnan Instruments Inc." adequados para

cada modêlo de equipamento e correspondentes a cada composto. No

caso depeptídeos usou-se a constante de côr média. Essa consta~

te média é obtida tornando-se a média de tôdas as constantes de

côr para os aminoácidos comuns exceto: histidina, lisina, argini­

na, prolina e cisteína.

i 11

I1:·::lii I,

IIlIn

-30-

As concentrações de serina, treonina, tirosina e proli

na nas amostras hidrolizadas foram elevadas de 15, 5, 6 e 5% re~

pectivamente para compensar as perdas durante a hidrólise ácida.

As.correções foram calculadas para o tempo de hidrólise de 18

horas utilizado aqui, a partir dos resultados de HIRS, STEIN e

MOORE (1954).

10. Preparação dos pigmentos da hemolinfa

Um volume de hemolinfa centrifugado era reunido a 19

volumes de ~lorofór~io-metanol'2:1 (v/v, ambos redestilados) be~

agitados e filtrados em papel de filtro quantitativo, pré-lavado

com clorofórmio;metanol. Ao filtrado adicionou-se 0,2 volumes

de água deionizada e após agitação o material foi centrifu~ado a

11500g por 10 minutos. A fase superior aquosa continha um pig­

mento de côr limão, enquanto que a fase lipídica apresentava uma

côr alaranjada. A fase aquosa após ser evaporada ã pressão red~

zida e ao abrigo da luz, teve o seu resíduo dissolvido em meta­

nol 90% (v/v) e lavado por agitação com igual volume de éter de

petróleo (p.e. 30-S00 C) duas vezes, DeP9is disso o pigmento cor

de limão teve o seu solvente novamente evaporado e foi conserva­

do no vácuo e ao abrigo da luz até a sua utilização. Essa ~rep~

ração é chamada daqui para diante de pigmento limão.

A fase lipídica foi evaporada à pressão reduzida e ao

abrigo da luz e em seguida, seu resíduo foi dissolvido em éter

de petróleo (p.e. 30-S00 C). Essa di~solução foi imediata e com­

pleta o que indicava, juntamente com a côr alaranjada, que se

tratava de carotenóides. O material dissolvido em éter de petr~

leo, após duas lavagens por agitação com igual volume de água

deionizada, foi recolhido, evaporado e conservado no vacuo, ao

abrigo da luz até a sua utilização. Essa preparação é denomina­

da daqui para diante de carotenóides da hemolinfa.

A saponificação dos carotenóides da hemolinfa foi rea­

lizada essencialmente como recomendado por KARRER e JUCKER(1950).

A amostra foi dissolvida em 2 mlde ROH 12% em metanol,transferi

do para tubo de ensaio, ao qual,juntou-se alguns cristais de pi­

rogalol e deixou-se 2S minutos a 7S oC,após fechar o tubo com al­

dogão. Esfriou-se o tubo em gêlo e adicionou-se 6ml de água deio

nizada e 4 ml de éter d

gitar bem, a fase do ét

agitações com água e us

abrigo da luz,. após eva

11.'I'de'ntific'ação dos c

A identificaç

tada utilizando~se: par

sorção em hidroxiapatit

Partição. A s

caroten5ides epifásicos

treéter de petróleo (p

e JUCRER,19S0). Com ess

ter de petróleo (p.e. 3

metanol 90% v/v, agitad

Cromatografia

foi feita como se segue

metro foi preenchida in

da de 2 em de altura.

acetona e §ter de petró

adicionou-se uma suspen

leo, suficiente para pr

de altura. Seguiu-se a

ter de petróleo, para p

As amostras d

dfsselvidas em éter de

coluna. A separação do

droxiapatita era feita

quanto que a sua eluiçã

solventes aplicados na

-SOoC), acetona 7% em é

Teste qualita

zado como descrito por

de potássio usado no te$CHNEIDER (19631.

-31-

nina, tirosina e pro11

s de 15, 5, 6 e 5% re~

nte a hidrólise ácida.

de hidrólise de 18

dos de HIRS, STEIN e

- - ( 0 5 0) . dnizada e 4 ml de eter de petroleo p.e. 30 - O C. Dep9~s e a-

gitar bem, a fase do éter de petróleo foi recuperada, lavada por

agitações com água e usada em seguida ou conservada no vácuo, ao

abrigo da luz, após evaporação do solvente.

se

petrQ

águaAs amostras de carotenóides saponificadas ou nao eram

digselvida~ em éter de petróleo (p.e. 300 -50oC) e aplicadas na

coluna. A separação dos carotenóides ao longo da coluna de hi­

droxiapatitaera feita com éter de petróleo (p.e. 30o-50oC), en­

quanto que a sua eluição para fora da coluna era realizada com

solventes aplicados na seguinte ordem: éter de petróleo (p.e.30o0__

-50 C), acetona 7% em eter de petroleo e acetona.

Partição. A separação dos carotenóides da hemolinfa em

carotenóides epifásicos e hipofásicos foi feita por partição en­

treéter de petróleo (p.e.300 -50oC) e metanol 90% v/v (Cf.KARRER

e JUCKER,1950). Corrl essa finalidade, a amostra dissolvida em é­ter de petróleo (p.e. 30o -500 C) foi juntada a igual volume de

metanol 90% v/v, agitada e deixada a repousar.

ll.'I'dentificação dos carotenó:ides

A identificação dos 9arotenóides da hemolinfa foi ten­

tada utilizando~se: partição em duas fases, cromatografia de ad­

sorção em hidroxiapatita e um teste qualitativo para astaxantina.

Teste qualitativo para astaxantina. O teste foi real!

zado como descrito por GOODWIN e SRISUKH (1949). O t-butóxido

de potássio usado no teste foi preparàdo segUndo JOHNSON e$CHNEIDER (1963).

. Cromatografia. A montagem da coluna de hidroxiapatita

foi feita como se segue. Uma coluna de vidro de 1,2 em de diâ­

metro foi preenchida inferiormente com algodão formando uma cam~

da de 2 ~ de altura. ~ste algodão foi previamente lavado com

acetona e ~ter de petróleo. Após fechar a extremidade inferior,

adicionou-se uma suspensão de hidroxiapatita em éter de petró­

leo, suficiente para produzir uma coluna de sedimento de 8,0 cm

de altura. Seguiu-se a adição de urnà suspensão de Na2S04 em é­·ter de petróleo, para produzir um sedimento de 1,0 em de altura.

com-

e ao

éter

ao

reparação é denomina­olinfa.

lressão reduzida

dissolvido em

:0 foi imediata e

alaranjada, que

vida em éter de

ual volume de

ervado no vácuo,

da hemolinfa foi rea­

KARRER e JUCKER(1950).

em metanol,transfer!

19uns cristais de pi­

fechar o tubo com al­

u-se 6ml de água deio

ado era reunido a 19

nbos redestilados) bem

antitativo, pré-lavado

Lonou-se 0,2 volumes

lal foi centrifuqado a

losa continha um pig­

)idica apresentava uma

,parada à pressão red~

) dissolvido e~ meta­

lal volume de éter de

l disso o pigmento côr

>orado e foi conserva­

:ilização. Essa prep~

ltO limão.

PI'li I

I,ll' i,

~ i'

Iil

, ;:,iillll,,~:i[i:H,:::;

-32-

12. Preparação do casulo I, 11 e 111 e determinação da massa pro­

duzida por indivíduo

Diferentes grupos de larvas maduras limpas em número co

nhecido foram colocadas em recipientes forrados com um papel de

filtro mantido sempre úmido. Os grupos após iniciar a produção

de casulo tinham as suas larvas removidas em tempos adequados, o

pêso-sêco do casulo produzido até a ocasião era determinado e ~~~

partir do número de larvas presentes era calculada a produção

por larva. Para facilitar o estudo, o período de produção do ca­

sulo foi dividido em 3 fases. A primeira fase corresponde à pro­

dução do casulo do início até o começo do 49 período do 49 está­

dio; a segunda, do começo do 49 período até 59 período e a tercei

ra fase do 59 período até a muda pupal. O casulo produzido do iní

cio até o fim da primeira fase foi denominado de casulo I; do iní

cio até o fim da segunda fase, de casulo 11; e do início até o

fim da terceira fase, de casulo 111. Evidentemente, pela nomen­

clatura usada o casulo 111 corresponde ao casulo terminado, en­

quanto que os demais correspondem ao casulo em fases anteriores

de produção;

13. Determinação da solubilidade do casulo

Amostras sêcas e trituradas de casulo pesando cêrca de

100 mg foram colocadas em tubos de centrífuga previamente levados

a pêso-constante. Essas amostras eram lavadas 3 vêzes com 5 ml

de água deionizada cada vez. A recuperação do material insolúvel

foi sempre realizada por centrifugação a 11500g. O material re­

manescente após as lavagens foi pesado depois de ter sidosêco a- - o -peso-constante em estufa a 100 e. A diferença de peso observada

em relação às amostras antes de serem lavadas, foi considerada co

mo a massa de material hidrossolúvel.

Amostras de cêrca de 100 mg de casulo, lavadas com água

Como descrito acima, foram colocadas em tubos de centrífuga pre­

viamente levados a pêso-constante. Adicionou-se em cada tubo 5ml

de ácido acético 10% (v/v), agitando com bastão até a efervescên­

cia observada desaparecer. Após centrifugação a 11500 g, o sedi­

mento foi lavado duas vêzes com 1 ml de ácido acético 10% e uma

vez com 1 ml de água. O sedimento remanescente das lavagens foi

sêco a pêso consté

inicial foi assumi

do acético solúvel

nado fração insolú

14. Determinações'

Aminoáci.

ítem 16.

lI-amino-l

50 mg da fração in~

hidrolizadas em lOC

diluídas do hidroli

tico glacial e o cc

nica de ROSEN (1957

"carboidra

Amostras sêcas de c

ram hidrolizadas em

2 ml de Hel 3N, a 1

nada a hidrólise, a

e filtradas em lã &ra a determinação d,

tros e para a purif:

As hexosaI

uma modificação do r

Dowex-50, como descl

drão galactosamina 1

Os açúcarE

hidrolizados pela rE

DUBOIS et alii (195l

na presença e ausênc

tra foi a diferença­

tomado para eliminal

cífica de côr resu11

utilizada como padri

-33-

jeterrninacão da massa pro-

iduras limpas em número c~

:orrados com um papel de

após iniciar a produção

IS em tempos adequados, o

:ião era determinado e ~~a

-a calculada a produção

'errado de produção do ca­

'a fase corresponde à pro­

a 49 período do 49 está­

até 59 período e a terce~

O casulo produzido do ini

inado de casulo I; do ini

lI; e do início até o

identemente, pela nomen­

ia casulo terminado, en­

;ulo em fases anteriores

,o

casulo pesando cêrca de

fuga previamente levados

vadas 3 vêzes com 5 ml

ão do material insolúvel

11500g. O material re­

?ois de ter sido sêco a

rença de pêso observada

idas, foi considerada co

:asulo, lavadas com água

mos de centrífuga prê­

'nou-se em cada tubo 5ml

astão até a efervescên­

ação a 11500 g, o sedi­

ido acético 10% e uma

cente das lavagens foi'

sêco a pêso constante e pesado. A diferença do último pêso e o

inicial foi assumido como massa de material hidroinsolúvel e áci­

do acético solúvel. O sedimento remanescente no final foi denomi

nado fração insolúvel do casulo.

14. Determinações químicas do casulo

Aminoácidos da fração insolúvel serão discutidos no

ítem 16.

a-amino-N total insolúvel. Amostras sêcas de cêrca de

50 mg da fração insolúvel, preparadas como descrito acima foram

hidrolizadas em 100ml de NaOH 5N a lOOoe por 8 horas. Alíquotas

diluídas do hidrolizado eram acertadas para pH 6,0 com.ácido acé­

tico glacial e o conteúdo de a-amino N foi determinado pela téc­

nica de ROSEN (1957), usando como padrão DL-leucina.

Carboidratos insolúveis e purificação de melanoidinas.

Amostras sêcas de cêrca4e 10 mg da fra~ão insolúvel do casulo f2

ram hidrolizadas em balões volumétricos de lO ml, com cêrca de

2 ml de Hel 3N, a loooe, durante vários períodos de temoo. Termi

nada a hidrólise, as amostras eram acertadas para lO ml com água

e filtradas em lã de vidro. ~sses filtrados foram utilizados pa­

ra a determinação de hexosaminas, ácidos urônicQs, açúcares neu­

tros e para a purificação e isoiamento de melanoidinas.

As hexosaminas foram determinadas nos filtrados usando

uma modificação do méto~o de ELSON-MORGN~, após purificação em

Dowex-SO, como descrito por BOAS (1953). Foi utilizado como pa­

drão gaIactosamina HeI purificada em Dowex-SO como as amostras.

Os açúcares neutros foram determinad~s nos filtrados dos

hidrolizados pela reação de fenol-H 2S04 , segundo a técnica de

DUBOIS et alii (19S6). Tôdas as determinações foram realizadas

na presença e ausencia de fenol. O valor aceito para cada amos­

tra foi a diferença entre as duas determinações. ,~sse cuidado foi

tomado para eliminar as interferências devido à ~odução inespe­

cífica de côr resultante do aquecimento com H2S04 . Glicose foi

utilizada como padrão nessas determinações. Deve-se notar que o

1

J·.ill"

:111.

Iilüll:

IIIIJO

-34-

método de fenol-H 2S04 é empregável para açúcares neutros e ácidos

uron1COS. Entretanto, corno no presente material o conteúdo de á­cidos urônicos é insignificante em relação ao conteúdo de carboi­

dratos total medido com fenol-H 2S04 (ver Resultados), a presente

determinação pode ser considerada uma determinação de açúcares

neutros.

Os ácidos urônicos foram determinados nos filtrados dos

hidrolizados após reação com carbazol, segundo GALAMBOS (1967)

utilizando ácido glicurônico corno padrão.

o isolamento de melanoidinas dos filtrados dos hidroli­

zados foi conseguido corno se segue. Amostras dos filtrados fo­

ram aplicados em uma coluna de Dowex-50 preparada. como descri­

to por BOAS (1953) e eluídas com 10 ml de água, seguido de 5 ml

de HCl 2N. Nessas condições os carboidratos ácidos e neutros, a­

minoácidos e hexosaminas são liberados da coluna, enquanto que o

pigmento ainda fica retido. ~sse foi então eluído com NaOH 2N.

Após neutralização o eluato foi submetido à reaçao de ELSON-MOR­

GAN na modificação proposta por BOAS (1953) e seu espectro de ab­

sorção realizado. A absorbância em cada comprimento de onda foi

corrigida pela absorbância do pigmento purificado e na mesma di­

luição queaquêle medido após a reaçao de ELSON-MORGAN.

Carboidratos solúveis. Foram determinados segundo DUBOIS

et alii (1956) usando o mesmo cuidado para eliminar interferênci

as descrito acima.

Carbonato. Foi identificado no casulo como descrito em

seguida. Cêrca de 50 mg de casulo foi colocado em um sistema fe­

chado, 2 ml de H2S04

O,lN foram adicionados e o frasco aquecido

em banho-maria. O gás liberado foi recolhido em solução saturada

de Ca(OH)2' Afim de evitar qualquer dúvida quanto à identidade do

precipitado branco formado na solução de Ca(OH)2' cêrca de 50 mg

de casulo foi previamente tratada com H20 2 100 volumes e em se­

guida o procedimento acima foi repetido.

Cinzas. Foram determinadas após o aquecimento em cadi­

nho de porcelana a aoooc, em mufla, até produzir cinzas brancas.

Foram usadas amostras de casulo sêco (determinação de cinzas to-

de casulo apó 9(determinação dI

Lipídeos. Fo:

li:

Metais. Foral

linfa, com exceção de K'

tais, isto é, por espec'

truição da matéria orgã:

Nitrogênio-to

terminado segundo o mét

ALBANESE e ORTO (1963).

Proteínas sol

por LOWRY et ali i (19~1

vina corno padrão.

15. Cromatografia em pa

!Unostras de c

ácido (ver Item 3) for

horás a 100oC. Os hidr

plicados diretamente no

O sistema de

te em cuba pré-saturada

senvolver o cromatogram

solventes: um dêles con

v/v/v) com um tempo cor

piridina-água (3:1:1, v

papel para cromatografi

casO foi usado papel Wh

coso

A revelação cligeira modificação de

por pAR'!'RIDGE e WESTALI

r-35-

~úcares neutros e ácidos

iterial o conteúdo de á­

) ao conteúdo de carboi­

~esultados), a presente

~rminação de açúcares

Lnados nos filtrados dos

~gundo GALAMBOS (1967)

; filtrados dos hidroli­

.tras dos filtrados fo­

:eparada. como descri­

água, seguido de 5 ml

~s ácidos e neutros, a­

coluna, enquanto que o

.0 eluído com NaOH 2N.

à reação de ELSON-MOR-

e seu esPectro de ab­

omprimento de onda foi

ificado e na mesma di­

ELSON-MORGAN.

=rminados segundo DUBOIS

eliminar interferênci

lsulo como descrito em

lado em um sistema fe­

; e o frasco aquecido

do em solução saturada

quanto à identidade do

. (OH) 2' cêrca de 50 mg

100 volumes e em se-

aquecimento em cadi­

juzir cinzas brancas.

ninação de cinzas to-

tais) e de casulo apó~ lavagens em água e ácido como descrito no

ítem 13 (determinação de cinzas insolúveis).

Lipídeos. Foram determinados como descrito para hemo­

linfa.

Metais. Foram determinados como descri~o para hemo­

linfa, com exceção de K+ que foi determinado como os outros me­

tais, isto é, por espectroscopia de absorção atômica, após des­

truição da matéria orgânica.

Nitrogênio-total da fração insolúvel do casulo foi de­

terminado segundo o método de Kjeldahl, como recomendado por

ALBANESE e ORTO (1963).

Proteínas solúveis. Foram determinadas como descrito

por LOWRY et alii (19~1), usando albumina cristalina de sôro bo­

vina como padrão.

15. Cromatografia em papel de carboidratos do casulo

~ostras de cêrca de 7 mg de casulo lavado em água e

ácido (ver ítem 3) foram hidrolizados em 1 ml de HCl 3N por 2

horás a 1000C. Os hidrolizados .filtrados em lã de vidro foram ~

plicados diretamente no papel de cromatografia.

O sistema de cromatografia usado foi sempre o descenden

te em cuba pré-saturada com o ~olvente a ser empregado para de­

senvolver o cromatograma. Foram usados dois tipos de si~temas

solventes: um.dêles consistia embutanol-etanol-ág~a (10:1:2,

v/v/v) com um tempo corrido de 92-94 horas e o outro em butanol

piridina-âgua (3:1:1, v/v/v) com uma corrida de 27-29 horas. O

papel para cromatografia usado foi Whatman n9 1 e em apenas um

caso.foi usado papel Whatman 3MM que produziu resultados idênti­

cos.

A revelação dos cromatogramas foi realizada usando uma

ligeira modificação do sistema de nitrato de prata introduzido

por PARTRIDGE e WESTALL (1948). Foi·usado também um sistema de

rl!~II::

111 IIli li

-36:"

revelação específico para hexosaminas, baseando-se em uma modifi

cação do método de ELSON-MORGAN desenvolvido por PARTRIDGE e

WESTALL (1948).

A identificação dos carboidratos foi realizada corren­

do amostras de carboidratos conhecidos no mesmo cromatograma e

comparando-se as migrações. A comparação da migração de um com­

posto em cromatogramas diferentes foi feita pelo seu RG, defini­

do pela razão entre sua migração e a da glicose no mesmo cromat~

grama.

16. Cromatografia na troca iônica de aminoácidos da fracão inso­

lúvel do casulo

Amostras de 6-9 mg da fração insolúvel do casulo secas

e finamente pulverizadas, foram pesadas em ampolas. Adicionou­

se 2 ml de HCI 6N em cada ampola. Estas foram seladas à vácuo

(110 mrn Hg) e 3 delas aquecidas a 10SoC por 22 horas, enquanto

que 3 outras por 70 horas. Então 0;( conteúdo das ampo·las e as

lavagens dessas foram filtrados em lã de vidro. Os filtrados fo

ram recolhidos, liofilizados e depois dissolvidos em 4,0 ml de

tampão citrato de sódio pH 2,20 (0,2N em sódio). Alíquotas de

0,25 ml dêsses foram aplicados em um "Beckman Aminoacid Analyser

Model 120C", gentilmente cedido pela Dra. Rebeca C. de Angelis, e

as cromatografias foram realizadas usando o procedimento de 2

horas para hidrolizados protéicos, descritos em boletins técni­

cos fornecidos juntamente com o equipamento.

A identificação e quantificação de cada pico presente

nos cromatogramas foi feita como descrito no ítem 9 acima. Os

títulos dos aminoácidos instáveis em ácido foram extrapolados p~

ra tempo zero de hidrólise, como descrito por HIRS, STEIN e

MOORE (1954), a partir dos resultados obtidos nos dois tempos de

hidrólise empregados.

17. Determinação de

As larvas E

Malpighi removidos,

mitir o escorrimento

eram colocados em pef

tante e sêcos até pÉ

lninação de seu pêSC-f

man n9 1 e usados paI

no ítem 8, com exceçc

pectroscopia de absel

gânica.

18. Determinação de 9

As larvas e

durosos centrais eram

dos de maneira a perrn

em tubos mantidos no

as determinações de 9

sêcos até pêso-consta

seu pêso-sêco.

O glicogêni

tir de hidrolizado aI

descrita por BELL e Y

gênio foi quantificad

(1954), usando glicos

sim isolada e deterrni

diferentes do verdade

BOLD, 1956).

-37-

e

baseando-se em uma modif!

,lvido por PARTRIDGE e

tos foi realizada corren­

no mesmo cromatograma e

io da migração de um com­

~ita pelo seu RG, defini-

glicose no mesmo cromat2

noácidos da fracão inso-

nsolúvel do casulo secas

em ampolas. Adicionou-

foram seladas à vácuo

)or 22 horas, enquanto

lteúdo das ampolas e as

vidro. Os filtrados f2

solvidos em 4,0 ml de

sódio). Alíquotas de

kman Aminoacid Analyser

Rebeca C. de Angelis, e

J o procedimento de 2

:os em boletins técni­:0.

• de cada pico presente

no ítem 9 acima. Os

foram extrapolados p~

por HIRS, STEIN

jos nos dois tempos de

17. Determinação de peso-sêco e metais rios tubos de Malpighi

As larvas eram dissecadas em NaCl 0,1M, os túbulos de

Malpighi removidos, lavados em NaCl e deixados de maneira a per­

mitir o escorrimento da solução de lavagem. Depois disso eles

eram colocados em pesa-filtros previamente levados a peso-cons-- - - otante e secos ate peso-constante, em estufa a 100 C, para deteE

lrinação de seu pêso-seco ou aplicado em quadrados de papel What­

man n9 1 e usados para a determinação de metais, como descrito

no item 8, com excp.ção do K, que também foi determinado por es­

pectroscopia de abserção atômica, após destruiçao da matéria or­

gâr.ica.

18. Determinação de glicogenio e peso-sêco do corpo gorduroso

As larvas eram dissecadas em NaCl O,lM, os corpos gor­

durosos centrais eram removidos, lavados- em NaCl 0,1M e deixa­

dos de maneira a permitir o escorrimento da solução de lavagem,

em tubos mantidos no gêlo. Depois disso eles eram usados para

as determinações de glicogênio ou colocados em Pesa-filtros e

secos até pêso-constante em estufa a lOOoC, para determinação de

seu peso-sêco.

o glicogênio do corpo gorduroso foi preparado a par­

tir de hidrolizado alcalino do tecido de forma similar àquela

descrita por BELL e YOUNG (1934). Após a sua preparação o glic~

gênio foi quantificado por reação com antrona, segundo MOKRASCH

(1954), usando glicose como padrão. E' possível que a fração ~

sim isolada e determinada contenha subsêâncias antrona-positivas

diferentes do verdadeiro glicogênio (BALMAIN, BIGGERS e CLARING­

BOLD, 1956).

,li

: :111

li!!

ili;;t:1IIIIijHI

REAGENTES

Os aminoácidos usados eram produtos cromatogràficamen­

te puros da Mann Research Labor~tories.

A hidroxiapatita empregada era produto especial para

cromatografia em coluna (Bio Gel HTP) fornecida pelo Bio Rad La­

boratories, Richmond, California.

tter de petróleo foi obtido por destilação fracionada

(fração de p.e. 30o-S0o C) do produto técnico.

Etanol também foi obtido do produto técnico por desti­

lação simples.

Clorofórmio, metanol e butanol eram produtos analíti­

cos da British Drug Houses e eram redestilados antes de usar.

As resinas de troca iônica Dowex empregados foram obti

das da Sigma Chemical Company.

Todos os demais reagentes empregados foram produtos a­

nalíticos obtidos principalmente da British Drug Houses, E.Merck

A. G. e J. T. Baker.

Qulmica da bemolinfa

1. Resultados Gerais

A hemolinfa d

quido escurc, avermelha

, de substâncias sólidas.

com o ar é de 7,27, aoutros Diptera Neli

o abaixamentc

-o, 4020C, que

~sse abaixe

setos, com exceção de

1953J. TOKUMARU, FERI

laridade correspondentE

R. americana, utilizan<

tamanho de" gotas de 1

das por camadas de ar c

çóes conhecidas por 24

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drollticas como amil

etc. (FLORKIN e JEUNIA

tenha havido intensa h

tão longo e à tempe

osmolaridade de cêrca

com sucesso para a inc

ricana (LARA e TOLED

1969; TERRA et a1ii, rn

A densidade

1,043 que é um valor e

A hemolinfa

em circulação que pode

RESULTADOS

utos cromatogràficamen_

)roduto especial para

lecida pelo Bio Rad La-

destilação fracionada.co.

luto técnico por desti-

ram produtos analíti­

ados antes de usar.

empregados foram obti

idos foram produtos a­

1 Drug Houses, E.Merck

A. Química da hemolinfa de larvas de R. americana

1. Resultados Gerais

A hemolinfa de larvas maduras de R. americana é um lí­

quido escure, avermelhado, formado por 89% em massa de água e 11%

de substâncias sólidas. Seu pH medido sem entrar em contacto

com o ar é de 7,27, a 250 C ou 370 C e é similar ao determinadopara outros Diptera Nematocera (Cf. BUCK, 1953).

O abaixamento do ponto de congelação observados em m~

dia é de -0,4020 C, que corresponde a uma osmolaridade de 216 mi

liosmoles. ~sse abaixamento é pequeno em relação aos demais in­

setos, com exceção de larvas aquáticas de Diptera (Cf. BUCK,

1953~. TOKUMARU, FERRI eWORSMANN (1968) encontraram uma osmo­

laridade correspondente a 320 miliosmoles para a hemolinfa de

R. americana, utilizando método baseado na alteração ou não do

tamanho de· gotas de hemolinfa fechadas em capilares e separa­

das por camadas de ar de gotas de soluções de KCl de concentra­

Qões conhecidas por 24 horas. ~sses resultados são, entretanto ,

de valor duvidoso porque a hemolinfa possui numerosas enzimas h!

drolíticas como amilases, esterases, proteases, fosfatases,

etc. (FLORKIN e JEUNIAUX, 1964) e é difícil se assegurar que não

tenha havido intensa hidrólise de compostos durante um período

tão longo e à temperatura ambiente Além do mais, meios com

osmolaridade de cêrca de 216 miliosmoles foram feitos e usados

com sucesso para a incubação de glândulas salivares de R. ame­

ricana (LARA e TOLEDO, citado em ARMELIN, MENEGHINI e LARA,

1969; TERRA et alii, manuscrito em preparação).

A densidade média da hemolinfa de larvas maduras é de

1,043 que é um valor elevado entre insetos (Cf. BUCK, 1953).

A hemolinfa da maioria dos insetos apresenta hemocitos

em circulação que podem ocupar volumes de até 15% do volume to~

:~

.~ I

:--;;

-40-

tal da hemolinfa, em certas ocasiões como na muda (BUCK, 1953).

Em R. americana, o volume ocupado pelos hemocitos é de cerca

de 0,3% do volume total da hemolinfa, o que dispensa a necessi­

dade de se corrigir os tItulos dos compostos determinados no

plasma (hemolinfa centrifugada) para hemolinfa total. O valor

de 0,3% obtido concorda com a maioria dos determinados para he­

molinfa de insetos (Cf. BUCK, 1953).

A hemolinfa de larvas de R. americana deixada em re­

pouso por períodos de até 15 horas à temperatura ambiente, na

auséncia ou presença de hemocitos, nao coagula e escurece muito

pouco. Por outro lado, amostras de hemolinfa centrifugadas e

diluídas 10 vézes com água deionizada, mesmo mantidas no gêlo,

escurecem e floculam intensamente após 2 horas, resultando em

espêsso sedimento cinzento escuro. Entretanto, se uma centri­

fugação fór' feita logo após a diluição, resulta em sedimento ama

relado, correspondente a apenas 3% das proteInas da hemolinfa.

2. Crbmatografia dos compostos ninhidrina-positivos solúveis

em ácido

A figura 1 mostra um cromatograma típico de uma amos­

tra de compostos ninhidrina-positivos ácidos solúveis, não hidr~

lizada, de hemolinfa de larvas de R. americana do 29 período

(45-48 dias de idade). Para facilitar a visualização, alguns

picos foram ampliados, ficando fora da escala que é 1:4.

Aidentificaçao dos picos apresentados a seguir foi

feita utilizando os critérios referidos em Métodos: 7, ácido

aspártico; 8, treonina; 9,. serina; 12, prolinai 13, ácido glu­

tâmico; 14, glicinai 15, alanina; 18, va1inai 19, cistatio­

nina; 20, metionina; 21, isoleucinai 22, leucina; 25, tiro­

sina; 26, fenilalanina; 29, ornitina; 30, amônia; 32, lisi­

na; 34, histidinai 35, triptofano; 36, arginina (Ver figura

1) •

O pico n9 10 (figura 1) poderia ser identificado como

asparagina e/ou glutamina porque o método utilizado não permite

a resolução dos dois componentes. Entretanto, como TUNDISI et

alii (1964), encontraram em um estudo qualitativo da hemolinfa de

R. americana os dois compostos, utilizando cromatografia em pa­

pel, o pico foi atribuldo a ambos os compostos.

O.

tídeos num

A identifi

relativos

nhidrina-p

ridos em M

O

mente base

foserina;

tioninas

amino-n-bu

y-amino-bu

p,

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Os tItulO!

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(MOORE e :

la (EDeR, 1953).

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.nados para he-

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'a ambiente, na

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:entrifugadas e

ltidas no gélo,

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I sedimento ama

la hemolinfa .

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. do 29 periodo

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é 1:4.

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dos: 7, ácido

13, ácido glu-

19, cistatio-

na: 25, tiro­

.i 32, 1isi­

na (Ver figura

.entificado como

ado não permite

como TUNDISI et

da hemo1infa de

.tografia em pa-

Os picos n9 5, 11, 23, 31 e 33 foram atribuídos a pep­

tídeos numerados respectivamente 1, 2, 3, 4e 5 (ver figura 1).

A identificação désses picos baseia-se no fato de seus tempos

relativos de eluição não corresponderem a nenhum composto ni­

nhidrina-positivo encontrável nos cromatogramas publicados refe

ridos em Métodos e desaparecem por hidrólise.

Os picos que se seguem foram identificados tentativa­

mente baseando-se nos seus tempos relativos de eluição: 1, fo~

foserina: 2, f06foetanolamina: 3, taurina; 4, uréia i 6, m~

tioninas sulfóxidos: 16, ácido a-amino-adípicoi 17, ácido a_

amino-n-butíricoi 24, glicosaminai 27, B-alanina; 28, ácido

y-arndno-butírico (figura 1).

A quantificação dos picos dos cromatogramas foi reali­

zada corno descrito em Métodos e a Tabela II apresenta a média

dos resultados obtidos em 3 determinações independentes. O des­

vio médio observados nas determinações ficou na maioria dos ca­

sos entre 5 e 15%. Variações dessa ordem e até. maiores foram

observadas em determinações semelh~rites realizadas em outros in

setos (LEVENBOOR e DINAMARCA, 1966).

O valor apresentado para o titulo de triptofano deve

ser inferior ao que ocorre "in vivo", porque ésse aminoácido s2

fre destruição parcial durante as desproteinizações da hemolin

fa, na preparação da amostra para análise (MOORE e STEIN,l954).

Os títulos encontrados para ácido glutâmico devem estar ligeir~

mente superestimados e aquéles da glutamina + asparagina, sube~

timados, devido a hidrólise parcial das amidas, especialmen­

te glutamina, durante a preparação e análise das ~IDstras

(MOORE e STEIN, 1954).

••I'I.

1-

TABELAII

Compostos ninhidrina-positivos, solúveis em ácidos, da hemo1infa

de larvas de R. americana, 29 período, de 45-48 dias de idade 1

1. Para maiores detalhes, consultar o texto.

2. Determinado na fração ácido solúvel da hemolinfa como descritoem Métodos.

3. Traços são denominados os compostos que nas diluições emprega­das (ver Métodos) não podem ser convenientemente estimados.Correspondem a concentrações inferiores a 0,05 mM. O sinal(+++) indica que o composto foi encontrado 3 vêzes em 3 análi­ses e (++) indica que foi encontrado 2 vêzes em 3 análises.

ConcentraçuomM

"

'.'I;.

+++

++

++

++

+++

+++

+++

++

94,0

0,20

1,18

9,01

0,95

1,38

12,78

26,25

1,31

102,96

Q-amino-N tota12

Tra-ços3

Composto

Taurina

Uréia

Metionina<3 su1fóxidos

ÂC., Q-amino adípico

Âc. Q-amino-n-butírico

Glicosamina

a-alanina

Âc. y-amino-butírico

Amônia

Fosfoetanolamina

total geral

Peptídeo-l

PeptIdeo-2

Peptídeo-3

Peptídeo-4

PeDtIdeo-5

total de peptIdeos

0,07

0,35

13,15

5,30

8,05

7,65

0,96

2,11

3,92

0,41

0,61

1,78

2,06 .

0,27

2,42

4,67

2,76

1,40

0,89

0,63

3,22

62,62

concentraçãomM

Composto

Fosfoserina

Âc. aspático

Treonina

Serina

Prolina

Âc.glutâmico

Glicina

Alanina

Valina

Metionina

Isoleucina

Leucina

Tirosina

Feni1alanina

Ornitina

Lisina

Histidina

Triptofano

Arginina

Cistationina

Glutamina+asparagina

Total de aminoácidos

'M I <tilI~r--N-.-I~,

~ ~ " ~ OI ttS"r-t-IJ, ••.•• I::4JO'I <ti O--i ='-.-1IS:::UU..Q~, -.-I -ri =' I 4Ju01o.QJOI <ti '.-I ~ s::: 'u~'O -.-ILtl

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I ~ S::S::: <ti••• ··..-1.0 I:;: tJl " O I:; E:: O tO U <tl ltl ltl''C s::: -.-I Ul lol'..-1..-1 ~ O '<ti'X~~ UOQ.,"0 O 4J -.-I M~ l-I =' ~:~o....QO'l""

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\C> 0." ro 0., u s::

:;:1

",]I

A concentração dos ~~noácidos é elevada, como é ca­

racterístico de insetos, especialmente os Endopterygota (FLORKIN

e JEUNIAUX, 1964). Os aminoácidos predominantes na hemolinfa

são: treonina; prolina, ácido glutámico e serina, que juntos

perfazem mais do que 50% da concentração total de aminoácidos

livres da hernolinfa. A ocorrência de ácido glutârnico e prolina

entre os aminoácidos mais concentrados é típico de inse­

tos Endopterygota (FLORKIN e JEUNIAUX, 1964). E '. interessante

assinalar a ausência, até mesmo de traços,d~ cisteína ou cistina

e citrulina. Cisteína, entretanto, tambérn não foi detectado

em vários outros Diptera como: Gastrophilus intestinalis (LEVEN­

BOOK, 1950a), Phormia regina (LEVENBOOK, 1966). E' notável tam­

bém a concentração relativamente elevada da ornitina e a ocor­

rência de cistationina na hemolinfa, embora esta já tenha sido

identificada em outros insetos (WYATT, 1961).

Os peptídeos ocorrem em pequeno número, embora a sua

concentração total seja considerável. Dois dêles são ácidos e

3 dêles, representando cêrca de 87% do total dos peptídeos, sao

neutros ou básicos, a julgar pelos seus tempos relativos de e­

luição. A concentração do peptídeo 3, que corresponde a 70%

do total dos peptídeos, só é superada entre os aminoácidos pela

treonina.

Vários insetos apresentam concentrações muito baixas

de amônia na hemolinfa circulante, mas depois que essa é retira­

da da larva a sua concentração cresce ràpidamente a partir de

precursores desconhecidos (WIGGLESWORTH, 1965;LEVENBOOK, 1950a).

Como nenhum estudo foi feito nesse sentido em R. americana, a e­

levada concentração de amônia atribuída à hemolinfa nesta tese

deve ser considerada com certa reserva. Outro motivo para essa

reserva é o fato da concentração de amônia determinada na hemo­

linfa, 26,3 ~~, exceder de cinco vêzes aquela concentração consi

derada tóxica, que é 5 mM (CRAIG, 1960).

A razoável concordáncia observada entre a soma dos

compostos ninhidrina-positivos e a determinação direta de a-ami­

no N, indica que nenhuma fração quantitativamente importante da­

queles compostos deixou de ser analisada.

Aminoáci

americana

Aminoácid

Histidina

Âcido aspár:

Âcido glutâJ

Lisina

Prolina

Glicina

Leucina

Ornitina

Serina

l.

2.

A

cido solúvel

cida é de 95

ácida aument,

Assumindo qUI

peptídeos da

peptídeos na

aminoácl dos 1

ponde a uma !

identificado!

número médio

rando as cone

estimar o n1Ír1

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na hemolinfa

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de aminoácidos·

ltâmico e prolina

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I. interessante

:eína ou cistina

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E' notável tam­

nitina e a ocor­

~ já tenha sido

~, embora a sua

les são ácidos e

peptídeos, são

relativos de e­

~rresponde a 70%

~inoácidos pela

s muito baixas

3 essa é retira­

3nte a partir de

ilENBOOK, 1950a).

americana, a e-

nfa nesta tese

~tivo para essa

cminada na hemo-

ncentração consi

re a soma dos

direta de a-ami­

e importante da-

TABELA !II

Aminoácidos da fração ácido solúvel da hemolinfa de R.

americana, 29 período,45-4B dias de idade, após hidrõlise l

Aminoácido - 2 Aminoácido - 2Concentraçao ConcentraçaomM mM

Histidina 19,87 . Isoleucina 1,26

Âcido aspárt:ico 8,72 Fenilalanina 0,84

Âcido glutâmico 10,13 Arginina 1,42

Lisina 6,73 Alanina 2,60

Prolina 9,57. Valina 4,11

Glicina 2,03 Metionina 0,56

Leucina 2,84 I Tirosina 2,17

Ornitina 3,11

ITreonina 13,45

Serina 5,99 Total 95,40

1. Para maiores detalhes, consultar Métodos.

2. Média de duas determinações.

A concentração dos aminoácidos presentes na fração á~

cido solúvel da hemolinfa (aminoácidOS livres) após hidrólise á­

cida é de 95,40 mM (Tabela 111). Isso significa que ahidrólise

ácida aumenta a concentração de aminoácidos livres de 32,70 mM.

Assumindo que êsse incremento. é consequência da hidrólise dos

peptídeos da hemolinfa, a razão entre êsse valor e o título de

peptídeos na hemoiinfa corresponde ao número médio de resíduos de

aminoácidos presentes por peptídeo. tsse número é 2,56 e corres­

ponde a uma superestimativa, porque havendo outros peptídeos não

identificados, êles fariam o núrr.ero obtido baixar. Utilizando o

número médio de resíduos de aminoácidos, por peptídeo e conside­

rando as concentrações relativas dos vários peptídeos, é possível

estimar o número de resíduos presente em vários peptídeos identi­

ficados. Assim, opeptídeo 3 que corresponde ã 70% dos peptídeos

deve ser um dipeptídeo, caso contrário a média de resíduos de

aminoácidos seria certamente superior àquela observada~ Além di~

so, como já foi acentuado acima, a média de 2,56 possivelmente d~

J

I••Ii

~-.,

;:11

-46-

ve estar superestimada, o que reforça ainda mais a conclusão

acima. Assumindo que o peptídeo 3 é um dipeptídeo, os peptídeos

2, 4 e 5 devem ter no máximo 10 resíduos, enquanto que o peptí­

deo 1, por ocorrer em baixa concentração, não permite nenhuma es

timativa segura.

A Tabela IV,mostra a participação porcentual dos vá

rios aminoácidos no incremento arninoacídico total, após a hidró­

lise ácida da porção ácido solúvel da hemolinfa. Se fôr admiti­

do, corno foi feito acima, que o referido incremento é resultan­

te da hidrólise dos peptídeos da hemolinfa, a Tabela IV é uma

boa estimativa da composição porcentual molar dos aminoácidos pep

tídicos.

A presença de ornitina, na Tabela IV deve ser conse­

quência de variações amostrais, porque a ornitina é um aminoáci­

do tipicamente livre. Variações amostrais devem ~er responsá­

veis também pela presença na Tabela de vários aminoácidos cuia

participação no incremento é pequena corno: tirosina, metionina,

etc. A participação do ácido aspártico e glutâmico no incremen­

to rea~ é menor do ~ue o indicado na Tabela, porque parte dêles

se originaram da hidrólise das aroidas correspondentes. Apesar

de tôdas as restrições acima, a Tabela IV permite concluir que

os peptídeos são compostos principalmente de histidina e ácido

aspártico, e em menor grau de ácido glutámico, lisina e outros.

A ocorrência generalizada de histidina explica porque os peptí­

deos presentes em concentrações mais significativas sao neutros

ou básicos, a julgar pelos seus tempos relativos de eluição.

Participaç

Aminoácido

Histidina

Acido aspártico

Acido glutâmico

Lisina

Prolina

Glicina

Leucina

Ornitina

Serina

* Dados calcula,

O pl

peptídeo e,

hidrólise dev,

tais liberado:

iguais deverá

l:e 55% dos am:

que se os doil

nos doi s aminc

tais. Uma inl

sultados são :

consti tuido p<

histidina e 01

ção do peptidE

j a formado pOJ

co.

a conclusão

's oeptídeos

le o peptí­

, nenhwna es

ltual dos va

'ós a hidró­

fôr admiti-

é resultan­

IV é wna

.noácidos peE

! ser conse­

un aminoáci­

responsá­

:idcs cuia

rnetionina,

10 incremen­

larte dêles

~s. Aoesar

lCluir que

la e ácido

l e outros.

os peotí­

lao neutros

!luição.

TABELA IV

ParticiEação porcentual dos vários aminoácidos no incremento

aminoacldico total, após hidrólise ácida*

Aminoácido % do Aminoácido % doincremento total incremento total

Histidina 45,0 Isoleucina 1,7

Acido aspártico 22,0 I Fenilalanina 1,5

Acido glutâmico 6,5 Arginina 1,4

Lisina 5,4 Alanina 1,3

Prolina 4,0 Treonina 0,8

Glicina 2,8 Valina 0,5

Leucina 2,8 Metionina 0,4

Ornitina 1,8 Tirosina 0,3

Serina 1,8 Total 100,0

* Dados calculados a partir das Tabelas II e III.

o peptídeo-3 como foi discutido acima, deve ser um di­

peptídeo e, consequentemente, os aminoácidos derivados de sua

hidrólise devem corresponder a cerca de 55% dos aminoácidos to­

tais liberados por hidrólise. Caso seus dois resíduos sejam

iguais deverá ocorrer um aminoácido que perfaça aproximadamen­

te 55% dos aminoácidos totais liberados por hidrólise, enquanto

que se os dois resíduos· forem diferentes, deverá haver pelo me­

nos dois aminoácidos que correspondam a 27% dos aminoácidos to­

tais. Uma inspeção na Tabela IV permite observar que os re­

sultados são favoráveis à hipótese de que o peptldeo~3 seja

constituído por dois reslduos de histidina ou por um resíduo de

histidina e outro de ácido aspártico. O tempo relativo de elui­

ção do peptídeo-3 (Figura 1) favorece a hipótese de que ele se­

ja formado por um resíduo de h1"stidina e outro de ácidoaspárti

co.

TABELA V

-48--

Composiçãoguímica da hemolinfa da larva de R.

americana, 29 período, 45-48 dias de idade*

o (~ é elevac

gânicos ácidc

ta (WYATT, l~

do solúvel OJ

O resultado

perestimado

da proteína c

sentar o mesn

ácidos, indic

taminado com

dições salim

te em concent

conforme foi

citoplasmátic

Tre

O t

tretanto, tít

e em outros i

uma caracteri

HOLLIS, 1961)

como ocorre

e JEUNIAUX,

concentração.

As

larvas de ins

de grandeza d

A c

de R. americ

larvas dos de

o que já pode

densidade e

outros inseto

110

12,9

0,49

0,81

1,60

77,5

67,6

9,7

55,4

10,2

2,8

65,5

42,1

47,6

6,9 g/lOO ml

201

1401,4

520

391

460

mg/lOO mlComposto

Mg

Ca

Cu

Zn

Fe

Na

K

P-inorgânico

P-ácido-solúvel

P-lipídico

P-protéico

P-total

HC03

- (pH 7,270)

Cl

Proteína

Carboidrato total

Trealose

Glicogênio

Lipídeo total

Ácido cítrico**Cinzas

3. Apresentação dos resultados das análises químicas

As concentrações de Ca, Na, K e Cl na hemolinfa de

larvas maduras de R. americana (Tabela V) são similares às de­

terminadas para grande número de insetos, enquanto que a concen­

tração de Mg é muito elevada, sõmente comparável com aquelasen­

contradas em alguns Lepidoptera e Coleoptera (BUCK, 1953; PROS­

SER e BROWN, 1961). Concentrações semelhantes às apresentadas

na Tabela V para Cu e Zn foram determinadas em outro Diptera :

Gastrophilus -intestinalis (LEVENBOOK, 1950a).

'*

**

Os resultados referentes a ~mpostos ninhidrina­positivos encontram-se nas Tabelas 11 e 111. Para maiores detalhes consultar o texto.

Apenas uma determinação.

As

terminações)

lado (ver Mét

(micas

la hemolinfa de

ni lares às de­

) que a concen­

:om aquelas ·en­

C, 1953: PROS-

apresentadas

lutro Diptera :

le R.

~

o conteúdo de fósforo total na hemolinfa de R. ameri­

~ é elevado e a maior parte dêste está ligado a compostos or­

gânicos ácido-solúveis, o que é característico da classe Insec­

ta (WYATT, 1961). Só foram identificados na fração fósforo áci­

do solúvel orgânico: fosfoetanolamina e fosfoserina (Tabela 11).•

O resultado apresentado para fósforo protéico poderia estar su­

perestimado se ocorressem ácidos nucléicos na hemo1infa. O fato

da proteína obtida por precipitação com sulfato de amônio apre­

sentar o mesmo conteúdo em fósforo que aquela precipitada por

ácidos, indica que o fósforo considerado protéico não está con­

taminado com fósforo de ácidos nucléicos. Isso porque nas con

dições salinas empregadas DNA não se precipitaria e RNA presen­

te em concentrações de pelo menos até 100 pg/ml, também não,

conforme foi observado em exp~riência contrôle utilizando RNA

citoplasmático de glândula salivar de R. americana.

O título de citrato encontrado é bastante elevado, en­

tretanto, títulos elevados como êsse ocorrem em outros Diptera

e em outros insetos, o que levou a se considerar ésse fenômeno

uma característica de larvas da Classe Insecta (LEVENBOOK e

HOLLIS, 1961).

Trealose é o carboidrato predominante da hemo1infa,

como ocorre em grande número de insetos (~~ATT, 1961: FLORKIN,

e JEUNIAUX, 1964), enquanto que glicogênio ocorre em pequena

concentração.

00 ml

As determinações para

larvas de insetos (BUCK, 1953:

de grandeza do valor encontrado

lipídeos totais na hemo1infa de

WYATT, 1961) são da mesma ordem

em R.americana.

["ina­Pa

A concentração de proteínas encontrada na hemo1infa

de R. americana é superior à média determinada na hemo1infa de

larvas dos demais insetos (Cf. BUCK, 1953: ENGLE e WOODS, 1960),

o que já poderia ser antecipado por sua osmo1aridade baixa, mas

densidade e conteúdo de sólidos mais elevados que a média dos

outros insetos.

As determinações de pC02 a 37°C deram em média (3 de­

terminações) 15,7 mmHg. A partir dessa determinação foi calcu­

lado (ver Métodos) o valor para bicarbonato apresentado na Ta-

A

HEMOLINI'A TOTAL

SOBRENAOAt,lTE ~CIO ...

SOBRENAOANTE A(;IOO

SULI'OSSALICILI CO

\\\\ ,.,~ \

\

\ \ ,-.,,-....' " .....--, .,,~, 0••-', " ....................

......... _-..... .. ............-.._--- --_.~.::::...-_-- -.._-

0,200

0.800

~ \

~, 0,/300

,)--~

0....00

!m média (3 de­

; um período de

!ffi equilíbrio.

.ei turas não se

l deve ser cau­

.tes na hemolin

lfa é retirada,

medidas corre­

liretamente no

ferir um pouco

ácido carbôni­

.ssumidos serem

pode não ser

em que foi de­

animal normal­

'alores obtidos

fornecidos por

'ivo" seria 46%

o pH da hemo­

a temperatura

admitido nêsse

depende apenas

a temperatura,

'in vivo'" seria

!ssa forma, em­

.ferir do valor

loa estimativa

"

11li

I'

+004580a202804-e0 &20

A (m)! I

Figura 2 - Espectro de absorção da hemolinfa de larvas madurasde R. americana. O espectro da hemolinfa total foi feito apósdiluição de 50 vêzes em água deionizada e aquêles dos. sobrena­dantes de desproteinização com HCl0 4 0,5N ou ácido sulfossali­cílico 3% (P/V) foram realizados apos neutralização com NaOH

e numa diluição final de 50 vêzes.

.1 de larvas de

o: um em 270­

o a 270-280 mil

e triptofano

s aminoácidos,

eia de um pico

~IH

-52-

nessa mesma posição em amostras desproteinizadas com HCI04 O,SN

(figura 2). O pico a 310 m~ deve estar ligado ã existência de

proteínas, pois êle quase desaparece após a desproteinização. O

Dica a 460 m~, parece corresponder a carotenóides ligados a pro­

teínas, conforme será mostrado abaixo. E' interessante observar

ainda o fato de que o sobrenadante da desproteinização com áci­

do sulfossalicílico apresenta absorção nos comprimentos de onda

mais curtos do espectro visível, contràriamente ao sobrenadante

de HCI04 (figura 2). A referida absorção confere ao sobrena­

dante ácido sulfossalicílico uma cor limão, enquanto que o so­

brenadante HCI0 4 é incolor.

o sobrenadante de amostras desproteinizadas com TCA

10% (p/v) ou com ácido tungístico (Van SLYKE e HA~VKINS, 1928),

apresenta um espectro de absorção semelhante àquele obtido após

precipitação das proteínas com HCI04 , O,SN, enquanto que aque­

las amostras desproteinizadas com 100% de saturação em (NH4)2S04

ou com um volume de clorofórmio apresentam sobrenadantes cujos

espectros são idênticos àqueles obtidos após precipitação com

ácido sulfossalicílico 3% (P/V). ~sses resultados indicam que

a maior parte dos pigmentos deve estar ligada a proteínas, pois

são precipitadas por todos precipitantes de proteínas usados.

Deve-se assinalar, entretanto, o fato de um pigmento de cor li~

mao nao ser precipitado por ácido sulfossalicílico 3% (ver fi­

gura 2), sulfato de amônio saturado e clorofórmio.

A figura 3 mostra o espectro de absorção do .pigmento

de cor limão após a sua preparação e purificação como descrito

em Métodos. O seu resíduo obtido após a evaporação de seu sol­

vente por pressão reduzida ao abrigo da luz é solúvel em: água

deionizada, NaCl O,lM, etanol 60% (V/V), ROH 5% (P/V) em meta­

nol e NaOH O,lN. Oresiduo nao é solúvel em éter de petróleo

(p.e. 30o-S0oC) e acetona.

O resíduo do pigmento cor de limão solubilizado em a­

gua é precipitável em HCI04 O,SN, mas mantém-se solúvel em eta­

nol 60% após aquecimento a 7SoC por lO minutos ou após adição de

um volume de clorofórmio.

L O'

O'toN

-53-

oIIUo-com HCI0

4 O,SNlU1-1xistência de lUo.'teini zação. 0- (I)° ~::t.1-1o.ligados a pro-

~Ul

'0sante observar0-< o.

lUzação áci- If)com10

mentos de onda:>

.0 sobrenadanteo ~

sobrena- iõaodi'otanto que o so- m

O .-IOI O.,. CU!

lUO401'0lizadas com TCA(1)0

o 8401A\'JI<INS, 1928) , '(1),...8::E:.,.le obtido após(I) e0(1)nto que aque- IlU

o 8010 .... 401o em (NH4 ) 2S04 ... .-I ....

!-lnadantes cujos !-lO.0 U!cipitação 0(1)como 'Otf) CIls indicam que~ '00

Eoternas, 00pois4010cternas usados. o (1)0

i EII\l0">0-nto de cor li.,.

.... lU0.0::0 3% (ver fi- ....

o 0'1-1OI 'O ....tf) l-l

0::1IlU o-o- lllI:> do 'pigmento 1-1(1)

o odescrito ,... U! I.comoIf) .Cl

lU JIIio de seu s01-CIllúve1 água 'O

f

era:o11) o(P/V) em meta-l') l-l401

~r de petróleo [)Glo. 11o U! 'II')~o o o o ,.,o o o o

.1izado em á- ~ ct III 6!.IIN N

~~úve1 em eta-

<t

I'IpÓS adição de

I

1111. -54-

'111

IHll

o pigmento côr de limão após solubilização em água,

adição de um volume de HCl04 4N produz um sedimento que após la­

vagens com HCl0 4 0,5N dá reação positiva em testes colorimétri­

cos para proteína (LOWRY et alii, 1951) e para carboidrato (DU­

BOIS et alii, 1956).

As preparações do pigmento de cor limão apresentam uma

intensa fluorescência amarelo-esverdeado quando expostos a U.V.

de comprimento de onda longo (315-380 mp), enquanto que com U.V.

de comprimento de onda curto (200-280 mp), nenhuma fluorescên­

cia é observada.

A fluorescência das preparações é mantida mesmo em

H2S0 4 0,5N, NaOH O,lN ou em meios aquosos com ditionito de só­

dio em quantidades supersaturantes.

s ao predomina

quena concent

Amo

ou não, separ

de hidroxiapa

tróleo. A cc

o isolamento

pondentes às

gundo migraçã

petróleo elui

enquanto que

IV•.. ~sses re

te com inforrn

posição das b

após desenvo

e 6 são muito

mas, embora

nenhuma tenta

ções 111 e IV

NQ da bandal

1

2

.3

4

5

6

L Numeraçãopetróleo

A b

A banddas.

O pigmento que permanece no sobrenadante após as des­

proteinizações da hemolinfa com ácido sulfossalicílico, 3% ou

sulfato de amônto 100% saturado, depois de purificado por preci­

pitação com HCl04 0,5N, lavagens com o mesmo ácido e dissolução

em etanol 60% produz um espectro de absorção idêntico àquele

do pigmento côr de limão, discutido acima. Além disso, êsse pi~

mento apresenta o mesmo tipo de fluorescência que o pigmento li­

ma0. Isso permite concluir que o pigmento da hemolinfa precipi­

tável com sõmente alguns precipitantes de proteína deve ser o

pigmento cor de limão.

As propriedades observadas do pigmento de côr limão su

gerem que êsse seja uma cromoglicoproteína. Os resultados mais

indicativos dessa hipótese são: a sua solubilidade em etanol 60%

e sulfato de amônio saturado, além da reação positiva observada

para proteínas e carboidratos. Os resultados indicam ainda que

a molécula cromógena do pigmento deve ser muito estável e que

grupos ionizáveis não devem estar comprometidos com a estrutura

responsável pela fluorescência, porque essa não é al~erada na

presença de um redutor como ditionito de sódio e nem em meios

ácidos ou básicos.

Os resultados obtidos com a partição dos carotenóides

da hemolinfa entre éter de petróleo (p.e. 30o-50oC)e metano1

90% corno descrito em Métodos, indicam' que êsses carotenóides

.11'1n

ao em agua,

que após la­

olorimétri­

idrato (DU-

resentam uma

stos a U.V.

que com U.V.

fluorescên-

ida mesmo em

rüto de só-

-55-

são predominantemente epifásicos, embora ocorra também uma p~

quena concentração de pigmentos amarelados hipofásicos.

Amostras de carotenóides da hemolinfa, saponificadas

ou nao, separam-se em 6 bandas coloridas ao longo de uma coluna

de hidroxiapatita (ver Métodos), durante eluição com éter de pe­

tróleo. A continuação da eluição com éter de petróleo permite

o isolamento de duas frações distintas (Fração I e 11) corres­

pondentes às bandas 1 e 2 respectivamente (bandas numeradas se­

gundo migração decrescente). A adição d~ acetona 7% em éter de

petróleo elui as bandas 3 e 4 em uma única fração (Fração III),

enquanto que adição de acetona elui as bandas 5 e 6 na fração

IV•.. Êsses resultados estão sumarizados na Tabela VI, juntamerr

te com informações sôbre as côres correspondentes a cada banda.

1. Numeração segundo ordem decrescente de migração com éter depetróleo (p.e. 300 -500 C).

A banda 2 é bem mais intensa que tôdas as demais reuni

das. A banda 1 é de intensidade intermediária, as bandas 3, .~e 6 são muito fracas e a banda 4 é mais intensa do que as últi­

mas, embora menos que a banda 1. Em vista dess~observações

nenhuma tentativa foi feita de se isolar os pigmentos das fra­

ções III e IV.

:l.pÓS as des­

lico, 3% ou

::> por preci­

~ dissolução

Lco àquele

;0, êsse pi.9:

)igmento li­

lfa precipi­

~ve ser o

:or limão su

Ltados mais

n etanol 60%

'l observada

:l.ffi ainda que

;tável e que

a estrutura

al~erada na

am em meios

=arotenóides

::lC)e metanol

:l.rotenóides

fraç,ões

N9 da bandal Côr da banda

1 amarela

2 vermelha

3 amarela

4 alaranjada

5 amarela

6 alaranjada

TABELA VI

Eluente

éter de petróleo

éter de petróleo

acetona 7% em éter

acetona 7% em éter

acetona

acetona

Fração recolhida

I

Ir

IIr

IIr

IV

IV

u

j

li -56-

I~

xantofilas,

tuintes à h

hipofásicos

tanol 90%.

;I~

UI

A

I e lI, ap

e ao abrigo

vamente. A

carotenóide

suposição di

posição é fi

ficar adsor'

Nenhuma idel

ça ao pigmel

lhança de SE

aplicado à

traídos da

cia visava

astaxantina

ção II não t

xantina e ne

sultado foi5/0 550

J..lm)))470430390

---- l"'RAÇÃO I__ FRAçÃon li.

I \I \

I \I \

I \I ,_," '-' ,

" ",--'--~/" \I I

I \I I/ ,

I ,I I

I I// I

/ ,I \

/ \/ \.. " \.. \

~.. \

/ \...... _--*' "\

350

0,020

A

0,100

O,OGO

0,060

•

11. Figura 4 - Espectro de absorção daê frações I e II dos carote-!~ noides da hemolinfa, após preparaçao e cromatografia em hi.dro-

xiapatita, como descrito em Métodos. O espectro da fração Ifoi realizado em hexano e o da fração II em piridina.

n

'I

;10 660

A ( mJJ)

dos carote­.a em hj,dro­la fração Iridina.

A fração IV e possIvelmente também a fração 111 contém

xantofilas, devido a intensa adsorção de seus pigmentos' consti­

tuintes à hidroxiapatita, que devem corresponder aos pigmentos

hipofásicos observados na partição entre éter de petróleo e me­

tanol 90%.

A figura 4 mostra os espectros de absorção 'das frações

I e lI, após evaporação do éter de petróleo a pressão reduzida

e ao abrigo da luz e redissolução em pexano e piridina, respecti­

vamente. A confrontação dos espectros obtidos com aquêles dos

carotenóides mais conhecidos (KARRER e JUCKER,l950)perrnite a

suposição de que o pigmento da fração I seja a-caroteno. Essa su­

posição é fortalecida pelo fato daquele pigmento pràticarnente não

ficar adsorvido na coluna, como seria de se esperar do fl-caroteno ..

Nenhuma identidade póde, entretanto, ser atribuída com seguran­

ça ao pigmento da fração 11. E' interessante assinalar aseme­

lhança de seu espectro com aquêle do astaceno em piridina.

Um teste qualitativo para astaxantina (ver Métodos) foi

aplicado à fração 11 (fração predominante) de carotenóides ex­

traídos da hemolinfa e. cromatografados no mesmo dia. A experiên­

cia visava testar a afirmação de TUNDISI et alii (1964) de que a

astaxantina é o pigmento predominante na hemolinfa, embora a fr~

ção 11 não tivesse o comportamento na coluna esperado para asta­

xantina e nem o seu espectro (Cf. KUHN e SORENSEN, 1938). O re­

sultado foi negativo.

t

-58-

B. Química do casulo coletivo de R. americana

1. Apresentação geral dos resultados

A composição geral do casulo 111 calculada a partir

das análises quantitativas apresentadas nos ítens seguintes, émostrada na Tabela VII. Os valores apresentados sao médias de

3 determinações.

TABELA VII

composição química do casulo coletivo de R. americanal

A ansulo, exceçãcpresentes em q

notável do cas

e carboidratosxo).

2. Solubili

Apena(Tabela VIII).

do pêso sêco à

terial lúdrossConstituinte

Material hidrossolúvel nao identificado

Carboidrato solúve12

Proteína solúve12

3CaC03Galactosamina insolúve1 4

Âcidos ur6nicos insolúveis4

Açúcares neutros insolúveis 4

Proteína insolúveIS

~, Cinzas insolúveis 6

Lipídeos

Total 7

% docasulo em pêso

4,3

2,4

4,4

43,S

1,9

0,2

8,2

33,6

4,3

<1,0

102,8

A maa lavagem com

0,8%,em pêso s

é proteína. 11

deve correspon

Após45,4% do casul

casulo (ve~ Mé

guintes solven

peratura ambie50% (P/V), HCl

Solubi

1. A composição se refere ao casulo 111, isto é, ao casulo acabado. Maiores detalhes no texto.

2. Proteínas ou carboidratos determinados na, lavagem com água a­dicionados àqueles medidos na lavagem com ácido acético.

3. Assumindo corresponder ao material hidroinsolúvel e ácido a­cético solúvel. A massa de proteínas e carboidratos solúvelnessas condições foi subtraída.

4. Extraoolado para tempo zero de hidrólise ácida da fração docasulo remanescente após as lavagens em água e ácido (fraçãoinsolúvel do casulo).

5. Calculado a partir jos aminoácidos de hidrolizado ácido dafração insolúvel, extrapolado para tempo zero de hidrólise.

6. Determinadas na fração insolúvel do casulo.7. Excluído lipídeos.

Massa hidross

Massa hidroin

Âcido acético

Massa insolúvl

Cinzas totais

Cinzas insolú'* Para maiores

de :3 determil** Determinadas

a partir

lintes, é

lédias de

-59-

A análise abrangeu a totalidade dos componentes do ca­

sulo, exceção feita naturalmente a compostos que possam estar

presentes em quantidades insignificantes. A característica mais

notável do casulo é o seu alto contéudo em CaC03 e em proteínas

e carboidratos insolúveis em todos solventes utilizados (ver abai

xo).

2. Solubilidade, conteúdo dei cinzas e metais

~1

Apenas uma pequena parcela do cas~lo é hidrossoluve1

(Tabela VIII). Dessa fração 2,5% correspondem a proteínas e 1,6%

do pêso sêco do casulo a carboidratos, remanescendo 4,3% de ma­

terial hidrossolúvel não identificado.

!m peso A massa de material solúvel em ácido acético 10% após

a lavagem com água é de 46,2% do pêso-sêco do casulo. Cêrca de

0,8%,em pêso sêco do casulo, dessa fração é carboidrato e 1,9~

é proteína. A massa resultante de 43,5% do pêso sêco do casulo

deve corresponder a caC0 3 (ver abaixo).

Após as lavagens com água e ácido acético 10% sobram

45,4% do casulo. Essa fração foi denominada fração insolúvel do

casulo (ver Métodos). ~sse material permanece insolúvel nos ~e··

guintes solventes empregados, tanto a quente (37oC) quanto ~ tem­

peratura ambiente (22 0 C): SDS 10% (p/V), uréia 6M, ácido formico

50% (P/V), HCl 2N, KOH 1M e NaHC03 1M.

TABELA VIII

Solubilidade e conteúdo de cinzas do casulo 111 de

*. Rhynchosciara americana

% emEéso-sêco do casulo

,

sao mediãs

8,4

45,4

32,5

4 L 3

46,2

resultados

Determinação

Massa hidrossolúvel

Massa hidroinsolúvel,

Âcido acético solúvel

Massa insolúvel

Cinzas totais**Cinzas insolúveis

* Para maiores detalhes consultar Metodos. Osde 3 determinações.

** Determinadas na fração insolúvel do casulo.

J

;cido daldrólise.

3

fração doio (fração

::om água a­;tico.

:! ácido a­:>s solúvel

:lsulo acaba

-60-

Os resultados mostram que existe massa considerá­

vel de cinzas no casulo e que a maior parte dessas é solúvel em

ácido acético 10%, enquanto que a fração insolúvel é essencial­

mente orgânica. As análises de metais do casulo (Tabela IX)

indicam que cálcio e o metal predominante, correspondendo

a 19% do pêso-sêco do casulo~ consequentemente, as cinzas das

lavagens em ácido acético devem ser correspondentes a compostos

de cálcio.

TABELA IX

*Metais no casulo 111 de R. americana

Metal % do casulo (P/P)

Ca 19,0

Fe 0,108

Zn 0,024

Mg 0,602

Cu 0,002

K 0,001

*

3.~

A

ronzeamento ,

5) dá uma idi

amarronzado.

menta é form;

O

hidrólise e

guintes propJ

seu comportai

U. V. de compJ

cência fraca,

curto {200- 21

com reagente

e spectro de c

As propriedac

"reação de r­em uma reaçãc

menta. Desse

rante a hidré

uma destruiçã

pois de 6 hOI

zero de hidré

amostra de ca

da hidrÓlise.

das a aquecirr

HANNAN e GREl\

A f

carboidratos

rios tempos d

aoos 4 horas

admitirmos g

locidade desd

vel, a melhor

la extrapolaç

de hidrólise.

neutros prese

'"

Para maiores detalhes consultar Métodos.Os resultados são médias de 3 determina­çoes.

Um teste qualitativo para carbonatos realizado como

descrito em Métodos, indicou a presença de quantidades conside­

ráveis de carb~natos no casulo. ~sse resultado juntamente com

os apresentados acima sugerem que porção hidroinsolúvel e ácido

acético solúvel do casulo é carbonato de cálcio. Os cálculos a­

presentados a seguir mostram que a hipótese referida é bastante

verossimel. Calculando todo o Ca presente no casulo como CaC03resulta em 47,5%,que é similar à massa determinada como material

hidroinsolúvel e ácido acético solúvel, após subtrair a massa

de proteínas e carboidratos solúveis. Por outro lado, calculan­

do as cinzas correspondentes a todo Ca presente no casulo resul­

ta em 26,6%, que é bem próximo dos 28,8% presente nas lavagens

do casulo, como seria de se esperar se pràticamente todo Ca es­

tivesse na forma de CaC0 3 •

dina. E' pc

considerá­

é solúvel em

é essencial-

=> (Tabela IX)

)rrespondendo

cinzas das

a compostos

Lizado como

'ies conside­

'ltamente com

ível e ácido

cálculos a­

:l. é bastante

) como CaC0 3)mo material

rair a massa

), calculan­

:l.sulo resul-

lavagens

:odo Ca es-

-61-

3. Carboidratos

A hidrólise ácida do casulo é acompanhada por um amar­

ronzeamento da solução. A curva de absorbância a 400 m~ (Figura

5) dá uma idéia da progressão de formação de um pigmento amarelo

amarronzado. E' interessante observar que a maior parte do pig~

mento é formado nas primeiras 6 horas de hidrólise.

o pigmento amarelado (melanoidina) produzido durante a

hidrólise e purificado como descrito em Métodos apresenta as se­

guintes propriedades: caráter altamente básico, a julgar pelo

seu comportamento em Dowex-50, fluorescência azulada intensa em

U.V. de comprimento de onda longo (315-380 m~) e uma fluores­

cência fraca, mas também azulada em U.V. de comprimento de onda

curto (200-280 m~). Além disso o pigmento dá reação positiva

com reagente de ELSON-MORGAN para hexosaminas, apresentando um

espectro de absorção nessas condições com dois picos (Figura 6)

As propriedades dêsse pigmento são similares aos produtos da

"reação de Maillard" (Cf. ELLIS, 1959). Essa reação consiste

em uma reação entre proteínas e carboidratos durante o aqueci­

mento. Dessa form~, o incremento em melanoidinas observado d~

rante a hidrólise do casulo (Figura 5) deve ser acompanhado de

uma destruição désses, mais intensa no início e decrescendo de­

pois de 6 horas. E' interessante observar que mesmo no tempo

zero de hidrólise já existe uma pequena quantidade de melanoi­

dina. E' possível que essa tenha sido formada ao se secar a

amostra de casulo afim de se determinar o seu pêso-sêco antes

da hidrólise. Reação de Maillard em amostras úmidas submeti­

das a aquecimento é fenómeno conhecido há já algum tempo (LEA,

HANNAN e GREAVES, 1950; ELLIS, 1959).

A figura 5 mostra o resultado das determinações de

carboidratos neutros na fração insolúvel do casulo III após vá­

rios tempos de hidrólise. A destruição dos açúcares neutros

aoós 4 horas de hidrólise .segue uma cinética de l~ ordem. Se

admitirmos que a destruição dos carboidratos segue a mesma ve­

locidade desde o início da hidrólise, o que é bastante prov~

vel, a melhor determinação para açúcares neutros seria dada pe­

la extrapolação gráfica da curva de cinética para tempo zero

de hidrólise. Dessa forma a porcentagem em massa de açúcares

neutros presentes na fração insolúvel seria de cêrca de 18%. A

1

-62-

OIt>o.o

J>CIlUlo

0,200:llCil1>,ZoI>

I>0,100

~

oo

3-c:

0,050

0,030

0,020

o

12

o

AÇUCARES NEUTROS

I

4 e 10

TE M PO OE HID ROLIS~ (HORAS)

o

ÁCIDOS URÔNICOS

ti

2

Â

,,,,,,,,,,,\ ,,,

\\ ,,,,

~

20,0

10,0O.J::lcn~(,.)

O 5,0o.JllJ>::l.JOCIlZ

~ 0,7

~S

0,5:;!llJ

:lillJ(!)

~z...Lo)

c::~ 0,2

Oc~

(,.)o

~

a:lL

~ 1,0­o

Figura 5 - Recuoeração de açúcares neutros e ácidos urônicosapôs vários tempos de hidrólise_da fra~ão insolúvel do casu­lo 111 de R. americana e produçao de melanoidinas nos mes-

mos tempos. Ver texto.

A

Figura 6 - Espectro de absorção do pigmento amarronzado (melanoidina) formado durante a hidróliseácida da fração insolúvel do casulo 111, após purificação em Dowex-50 e reação de Elson-Morgan.

Ver detalhes em Métodos.

I0'1'wI

690

A (m}J1

670650630610590570550530510490470450

::l ~u ~o o _o ~oo Q, ~ o o ã o NUI O ti N C>I (Jl OO, O O O O OO ::lri W OOt>!3 llJ 1-'.

\' VIONVS!:tOSev(1) UI O"UI ~ O

I I UI

0,025~

0,050

••

-64-

5,0

--~----.,• ---..,.~. a ~

210L---'L.----I.---6L..---!.---,l.O--.J'2:---:'~4---:1:6--~'8:---;:20TEhlPO DE HIDRÓLISE (HORAS)

Figura 7 - Recuperação da galactosamina após var10S temposde hidrólise da fração insolúvel do casulo 111 de R. ameri­

cana .

validade deltar de acôrcção das mel,

carboidrato!

ofica a aceit

se, como a

galactosamir.

casulo (ver

cos e galaet

insolúvel dc

Os

dois sistema

sistema) per

1actosamina

sulo. Uma

togramas e CI

mo nenhum di

g1icose, gali

ti19li cosamil

lactosamina I

confirmada eI

MORGAN.

4. Compos1

A1.É

rer nenhum cc

nos hidrolizc

fato" da soma

cados excedel

ção de dois :I

do de Kj eldar.

uma recuperaç

o método do t

recuperações

método de KjE

-J

18 20

( HORAS)

-65-

validade dessa extrapolação é apoiada ainda pelo fato dela es­

tar de acôrdo com a previsão feita acima, baseando-se na for.m2

ção das melanoidinas, de que a maior parte da destruição dos

carboidratos deveria ocorrer antes de 6 horas de hidrólise.

o mesmo tipo de argumentação apresentado acima justi­

fica a aceitação das extrapolações, para tempo zero de hidróli­

se, como a melhor determinação de ácidos urônicos (Figura 5) e

galactosamina (Figura 7), que é a única hexosamina presente no

casulo (ver abaixo). Os valores extrapolados para ácidos urôni­

cos e galactosamina são, respectivamente: 0,45% .. e 4,1% da fração

insolúvel do casulo.

Os resultados de cromatografias em papel feitas em

dois sistemas solventes diferentes (2 cromatogramas em cada

sistema) permitiram a identificação de glicose, galactose e ga­

lactosamina nos hidrolizados ácidos da fração insolúvel do ca­

sulo. Uma mancha pouco intensa, mas constante de todos croma­

togramas e com elevada migração, não ·._pôde ser identificada co­

mo nenhum dos carboidratos: ribose, xilose, manose, frutose,

glioose, galactose, galactosamina, glicosamina, sorbose, N-ace­

tilglicosaminae N-acetilgalactosamina. A identificação de ga­

lactosamina como única hexosamina presente.nos ·hidrolizados foi

confirmada em 2 cromatogramas revelados com reagente de ELSON­

MORGAN.

I

ios tempose R. ameri-

4. Compostos nitroqenados

Além de aminoácidos e galactosamina parece não ocor- ,li

rer nenhum composto ni~ogenado em quantidades significantes

nos hidrolizados da fração insolúvel do casulo (Tabela X). O ,

fato da soma do nitrogênio dos compostos nitrogenados identifi­

cados exceder o conteúdo de N total deve ser devido a conjug~­

ção de dois fatôres. O primeiro dêles é o fato de que o méto­

do de Kjeldàhl clássico empregado, de tubo aberto, não permitir

uma recuperação de N rigorosamente quantitativa, como corre com

o método do tubo selado e nem tão precisa (JACOB,196S). Aliás,

recuperações relativamente baixas de nitrogênio determinado pelo

método de Kjeldahl foram também observados éIn cutIculas de inse-

••

-66-

tos (HACKMAN e GOLDBERG, 1971) e em vários outros produtos naturais

(STITCHER, citado em HACKMAN e GOLDBERG, 1971). Em vista disso, os

valores para N-total mais exatos seriam mais elevados do que aquê­

les obtidos. O segundo fator a ser considerado é uma possível su­

perestimativa do nitrogênio de arninoácidcscomo consequência de va­

riações amostrais.

TABELA X

Compostos nitrogenados da fração insolúvel do casulo 111

de R. americana

Determinação % em N da fração insolúvel

N de aminoácidos 1 10,0

N de galactosamina 2 0,3

Soma dos anteriores 10,3

N-total (Kjeldahl) 3 8,7

1. Calculado a partir da análise de aminoácidos, apóscorreção para tempo zero de hidrólise. Ver Métodos.

2. Calculado a partir do valor extrapolado para zeroda Figura 7.

3. Média de 3 determinações realizadas como descritoem Métodos.

Acido glutâmico, ácido aspártico, serina e treoni­

na são os aminoácidos mais abundantes da fração insolúvel do ca­

sulo, juntos correspondendo a 42% do total de aminoácidos (Tabela

XI). A composição de aminoácidos da fração insolúvel do casu­

lo assemelha-se mais àquela do pupário de L. cuprina do que a

qualquer outra apresentada na Tabela XI.

Composicão

do casulo

Cal

Aminoácido ~

. Ac. glutàmico

Ac.aspártico

Serina

Treonina

Glicina

Leucina

Alanina

Valina

Isoleucina

1/2 Cistina

Lisina

Tirosina

Fenilalanina

Prolina

Arginina

Histidina

Metionina

a-alanina

Hidroxilisi~a

L As determinedas por pere

2. Calculado a

3. Segundo GROS

4. Calculado a

5. Segundo LUCJl

Composicão porcentual molar dos aminoácidos da fração insolúvel

do casulo IIr de R. americana e de outros produtos de insetos

TABELA XI

~67-

% em moles

secreção Fibroína4Salivar 3 P.cynthia

C.tentans

PupárioL: cU2~

Casulo 111R. amertca­

naAminoácido

dutos naturais

-ista disso, os

s do que aquê-

possível su­

uência de va-

ulo 111

solúvel

, aoósétodos.

zero

crito

a e treoni­

Lúvel do ca­

:::idos (Tabela

.,el do casu-

do que a

- Ác. glutâmico 11,6 10,9 12,79 0,8 9,8

Ác.aspártico 10,9 9,1, 6,18 3,5 5,8

Serina 10,2 8,3 9,39 - - 5,1 11,0

Treonin.a 9,3 4,7 2,96 0,6 3,5

Glicina 8,1 13,1 4,51 31,4 27,5

Leucina 7,3 4,1 1,88 cr,2 2,2

Alanina 6,4 8,0 10,54 47,8 13,8

Valina 6,0 ~,6 2,84 0,6 3,8

Isoleucina 5,5 2,3 -1,96 0,3 2,0

1/2 Cistina 4-,5 1,5 12,88 ...

Lisina 4,2 2,9 11,09 0,3 1,7

Tirosina 4,0 3,2 - 5,6 2,5

Fenilalanina 3,4 3,1 - 0,1 0,4

Prolina 3,1 7,8 2,49 0,3 9,7li

Arginina 2,5 3,8 13,02 1,9 4,0 ill

Histidina 2,0 3,9 --- 1,5 0,5

Metionína 1,0 0,3 7,42

e-alanina - 6,4 --ªidroxilisi~a - - - - 1,8

1. As determinações foram realizadas em hidro1izados ácidos e corrigidas por perdas devido à hidró1ise como descrito em Métodos.

2. Calculado a partir de GILBY e McKELLAR (1970).

3. Segundo GROSSBACH (1969) •

4. Calculado a partir de-LUCAS, SHAW e SMITH (1960) •

5. Segundo LUCAS e RUDALL (1968).

-6-8-

5. Produção e composição do casulo em funçã~ do tempo

° pêso-sêco do casulo em distintas fases de sua pro­

dução é mostrado na TABELA XII. Conforme já foi apresentado emMétodos, o casulo III correspondente ao casulo já terminado, en­

quanto que o casulo 11 e casulo I correspondem ao casulo produ­

zido até o início do 59 período e início do 49 período, respec­

tivaroente.

TABELA XII

- - *Aumento do peso-seco do casulo ao longo do desenvolvimento

Deterr

Material

Ca

a-aroino-N

* Os valores determinados são médiasde 3 determinações. Detalhes sãoencontrados em Métodos.

A alteração mais evidente que ocorre no casulo durante

o desenvolvimento é um aumento percentual da fração hidroinso­

lúvel-ácido acético solúvel, que foi admitida corresponder ao

caC03

(Tabela XIII). Ocorre também um grande aumento no conteú­

do de Ca, como seria de se esperar na base do que já foi assumido

acima e dos resultados apresentados no ítem B.2 anterior. Isso

parece indicar que a deposição de CaC03 no casulo ocorre prefe­

rencialmente após o 49 período do 49 estádio.

••

pêso-sêco do casulo

mq!produzido/larva

0,43

1,53

3,47

Casulo

I

Ir

IIl

Fração im

1. Tôdas metrês det

2. Assumidcacéticolúvel ne

3. Determi~

drólisetados safoi apli

4. MaterialáCido co

E

drossolúvel

pode estar

fim do peri

de remoção

sarnento de

Dessa forma

derivado do

o animal el

que, conseq

111. Confo

componente

sa forma as

tempo

:s de sua pro­

.presentado em

rminado, en­

'asulo produ­

Iodo, respec-

*::>lvimento

:ulo durante

LO hidroinso­

londer ao

~o no conteú­

foi assumido

'ior. Isso

,rre prefe-

TABELA XIII

composição química do casulo em três- 1

etapas do desenvolvimento

Porcentagem do pêso-sêco do casulo

Determinação Casulo I Casulo 11 Casulo 111

Material hidrossolúvel 3,0 3,1 8,4

CaC032 11,0 40,4 43,5

Ca 7,5 19,5 19,0

a-amino-N insolúve1 3 5,18 2,49 2,46

Fração insolúvel 4 84,2· 54,5 45,4

1. Tôdas medidas, salvo indicação em contrário, são médias detrês determinações. Procure Métodos para detalhes.

2. Assumido corresponder ao material hidroinsolúvel e ácidoacético solúvel. A massa de proteínas e carboidratos so­lúvel nessas condições já foi subtraída.

3. Determinado por reação de ninhidrina após 8 horas de hi­drólise alcalina da fração insolúvel do casulo. Os resul­tados são médias de duas determinações e nenhuma correcãofoi aplicada devido a destruição de aminoácidos sensívêis.

4. Material do casulo remanescente após lavagens com água eácido conforme descrito em Métodos.

E' interessante notar também um aumento na fração hi­

drossolúvel do casulo 111 quando comparado com o 11 ou I. Isso

pode estar relacionado com o fato do casulo 111 ser obtido no

fim do período pré-pupal (pupa~farata), quando as larvas são

de remoção difícil do casulo, sendo impossível evitar extrava­

samento de flu~exuvial de umas ou de hemolinfa de outras.

Dessa forma, o incremento em material hidrossolúvel poderia ser

derivado dos fluIdos acima referidos, assim como das fezes que

o animal elimina normalmente durante todo o feitio do casulo e

que, consequentemente, ocorrem em maior quantidade no casulo

111. Conforme já foi apresentado anteriormente, proteína é o

componente majoritário da fração insolúvel do casulo 111. Des­

sa forma as determinações de a-amino N insolúvel, permitem uma

I

,.'•

-70-

comparação preliminar da composição da fracão insolúvel nas

três fases estudadas. Os resultados da Tabela XIII permitem

calcular que a porcentagem de a-amino N na fração insolúvel dos

casulos I, 11 e 111 é: 6,16, 4,57 e 5,40 respectivamente. Dessa

forma pode-se admitir tentativamente que a com~osição da fração

insolúvel do casulo varia um pouéo com o desenvolvimento, sendo

a fração do casulo I mais rica em proteínas e aquela do casulo

11 a mais pobre porcentualmente.

Tentar obter valores para o conteúdo de proteínas in­

solúveis a partir dêsses dados de a-amino N é arriscado. Entre­

tanto, partindo dos valores de a-amino N para o casulo 111, ass~

mindo um pêso-molecular médio para o resíduo de aminoácido de

120 e considerando que a recuperação em um hidrolizado alcalino

de aibumina realizado e calculado corno essas amostras de casulo

é de 74%, obtemos um valor de cêrca de 28,6% para as proteínas

insolúveis. Êsse valor concorda de forma razoável com aquêle

obtido de forma mais rigorosa apresentado na Tabela VII.

A Tabela XIV mostra a massa produzida dos principais

componentes do casulo nas três fases estudadas, enquanto que a

Tabela XV_ mostra a velocidade de produção désses componentes,

nas mesmas fases.

TABELA XIV

Produção dos componentes do casulo ao lonqo do*desenvolvimento

Intervalos estudados

Composto 39P--149P 49P-159P 59P-lpupa Total

Proteína insolúvel 268 350 552 1170

Carboidrato insolúvel 82 106 170 358

CaC0 3 47 572 891 1510

* Os dados foram calculados das Tabelas XII e XIII, assumindoque a fração insolúvel dos casulos I eII tem a mesma compo­sição que aquela do casulo 111. Todos os resultados estãoexpressos em ~g produzido/larva.

Oiz

dia anterior ide velocidade

tervalo do 59

deração baseie

na~se uma pupc

corno uma pupa

a produzir caE

los: 39P -:., 4<;

dias respecti"

dura 3 dias.

Tabela XV cor!

superestimadas

Velocidade Ir

Composto

Proteína inso

Carboidrato i

cac03

* Dados calculvem.·.ser procem lIg produz

** ~sses valore

Os res

ponentes do casu

mente entre o 59

de que enquanto

duas vêzes maior

a produção de Ca'

entre os process,

teínas e carbOid

dução de CaC0 3 , !

maneira idênticapu~e.. farata.

olúvel nas

11 permitem

solúvel dos

fite. Dessa

éla fração

nto, sendo

do casulo

oteínas in­

do. Entre­

o 111, ass~

noácido de

do alcalino

s de casulo

as proteínas

com aquêle

II .

principais

anto que a

:lmponentes,

° intervalo de produção de casulo do 59 periodo até o

dia anterior à.muda pupal foi considerado, para fins de cálculo

de velocidade de produção do casulo, como correspondente ao in­

tervalo do 59 periodo até a última apólise larval. Essa consi­

deração baseia-se no fato de que após essa apólise o inseto tor­

na~se uma pupa farata, funcionando do ponto de vista fisiológico

como uma pupa (HINTON, 1946), . sendo en tão incapaz de continuar

a produzir casulo. ° número de dias correspondente aos interva­

los: 39P --I 49P, 49P --I 59P e 59P -4 pupa farata são: 5, 3 e 2

dias respectivamente. Às vêzes o inter~alo 59P ~ pupa farata

dura 3 dias. Consequentemente as velocidades apresentadas na

Tabela XV correspondentes a êsse intervalo podem estar um pouco

superestimadas.

TABELA XV

Velocidade média de produção dos diferentes constituintes do

casulo em três etapas de sua formação*

Intervalos estudados

39P=-J 49P 49P=-J 59P 59P -4 pupa farata**Composto

Proteina insolúvel 54 117 276

Carboidrato insolúvel 16 35 85

CaC03 9,4 191 446

I

:lo*

**

Dados calculados a partir da Tabela XIV. Maiores informações devem ser procuradas no texto. Todos os resultados estão expressõsem ~g produzidos/individuo/dia.

~sses valores podem estar um pouco superestimados. Ver texto.

:Idos--

-Ipupa Total

552 1170

l70 358

391 1510

3.ssumindo3. compo-

estão

Os resultados indicam que a produção de todos os com­

ponentes do casulo é mais intensa em tõrno do 59 periodo, especial

mente entre o 59P e pupa farata. E' interessante assinalar o fato

de que enquanto a produção de proteinas e carboidratos insolúveis é

duas vêzes maior no intervalo 49P ~ 59P em relação ao 39P ~ 49P,

a produção de caC03 é 20 vêzes maior. Isso sugere uma independência

entre os processos de produção de CaC0 3 e aquêles de produçao de PEo

teinas e carboidratos insolúveis. Entretanto, a velocidade de pro­

dução de caC0 3 , proteínas e carboidratos insolúveis é aumentada de

maneira idêntica ao se passar do intervalo 49P ~ 59P para 59P -1pu~a farata.

!.

-12-

C. Aspectos químicos e fisiológicos durante o 4~ estádio de

R. americana

1. Massa cor~órea e volume de hemolinfa

A larva de R. americana aumenta ràpidamente de pêso

até alguns dias depois da 3~ muda, isto é, até cêrca de 26 dias

de idade (Figura 8). Em seguida ainda cresce logaritmicamente

até ficar madura, isto é, atingir o máximo desenvolvimento lar­

vaI. A~partir de então o inseto pára de comer e começa a prod~

zir o casulo e a perder massa até a emergência do adulto (70

dias de idade). Uma inspecção na figura 8 mostra que os desvios

das médias de massas medidas em larvas com menos do que 48 dias

(com uma exceção) são pequenos. Êsse fato torna possível a uti­

lização da presente curva para a estimativa da idade fisiológi­

ca de larvas, a partir da medida de sua massa. Essa estimativa

é muito útil, especialmente para insetos recolhidos na natureza,

porque antes dos 48 dias de idade existe apenas um marcador da

idade fisiológica larval: a mudança de côr da larva, que ocor­

re em tôrno dos 32 dias de idade.

TOKU~~U, FERRI e WORSM1U~ (1968) obtiveram resulta­

dos muito discrepanteS dos aqui apresentados, chegando a pe­

sar indivi~u0s ainda na fase larval com 80 dias de idade, em

contraste também com as observações de outros autores (Cf. GUA~

CIABA e TOLEDO, 1969). Essas diferenças encontradas por TOKUMA­

RU, FERRI e WORSMANN, podem ser explicados por uma má termoesta­

tização do ambiente de criação das larvas.

A determinação dos volumes de hemolinfa presente nas

larvas e pupas de ~_americana foi sempre realizado pelo método

de exanguinação (Tabela XVI). Isto justifica-se pelo fato (ver

comentários em Métodos) de que os resultados obtidos por esta

técnica e pela técnica de diluição de corante serem semelhantes

em larvas com idades inferiores a 35 dias (Tabela XVII). Figura 8 - COs traços vecadas, obtidnimo de 5 deidade em diaperíodos do

assim CI

:;> estádio de I

~, que ocor-

presente nas

pelo método

1,0

0.7~

Jli

o.'f I39/4i1fp: IPv~110,4- II~ I 22

0.3

10 2:0 JO +O 60 60 70

OiAS APOS A fCLOSÃO

+0,0

30,0

60,0

20,0

70,0

10,0

-.c:n 7,0E...,

6,0<If)

~of)

<I

E",O

2,0

Figura 8 - Crescimento e~ massa de fêmeas de R. americana a 200 C.Os traços verticais representam o desvio padrão das médias indicadas, obtidas em 3 grupos independentes de insetos, após um mí­nimo de 5 determinações em cada. Embaixo são indicados,além daidade em dias após a eclosão. os intervalos correspondentes aosperíodos do 49 estádio; 19, 29, 39, 49, 59, 69, prê-pupal (PP),- assim como do período pupal (ver detalhes em Métodos).

(ver.0 fato

por esta

semelhantes

'Ir) •

~ram resulta­

~gando a pe­

~ idade, em

!S (Cf. GUAR?;

; por TOKUMA­

lá termoesta-

nte de peso

ca de 26 dias

aritmicamente

lvimento lar­

omeça a prod~

::> adulto (70

Lle os desvios

::> que 48 dias

:;sível a uti-

:1e fisiológi­

:;a estimativa

na natureza,

n marcador da

-74-

TABELA XVI

Volume, proteína, a-amino-N ácido solúvel e densidade na hemo­*linfa de R. americana durante o desenvolvimento larval

Est! Período Idade Volume de Massa de ~-aminb N Densidade da

dio (dias) hemo1infa proteína p moles hemo1infa Idade\l11 larva ;\lg/larva larva g/ml

IIr 20 3,28 18 0,32 1,013

**19P 22 6,0 32 0,53

19P 27 9,5 54 0,91 1,023 *** De

-19P 30 13,6

29P 32 14,8 96

** A ra29P 34 16,8 151 2,02

(0,401 :!:** tante29P 35 17,2 201 tádio, isto é,29P 38 16,7 267 fato permite a

29P 41 19,2 542 1,53 1,026 vas nao madura

IV29P 44 20,6 1,89 A ra

29P 45 20,6 887 2,00 1,032 vas maduras é

e 59 ela é de29P 48 24,6 1700 2,31 1,043 de-se concluir

39P 49 17,9 1790 2,29 1,037 damente do que

49P 54 14,3 1890 1,30 1,058 nidades. Isso

ra pupa deve h59P 57 9,4 1190 0,93 1,057 tecidos. Ess

64 4,0 488 1,025 vantada abaixopupa

de água para o

* A metodologia empregada está descrita em Métodos.

** Volumes estimados usando a razão volume de hemolinfa (vermassa da larva

texto) •

TABELA XVII

:idade na hemo­*I larval

Densidade dahemolinfa

g/ml

1,013

Volumes de hemolinfa em larvas de R. americana*usando duas técnicas difere~tes

Volume (~l/larva)

Idade (dias) Exanguinação Diluição de corante

27 9,5 9,3

32 14,8 17,7

1,023* Detalhes em Métodos.

1,026

1,032

1,043

1,037

1,058

1,057

1,025

~ (ver'a

A razão volume de hemolinfa e massa de larva é cons­

tante (0,401 : 0,009 ~l/mg) durante considerável parte do 49 es­

tádio, isto é, de larvas com 22 dias até 42 dias de idade. ~sse

fato permite a estimativa rápida do volume de hemolinfa de lar­

vas não maduras, conhecendo sua massa.

A razão volume de hemolinfa e massa corpórea de lar­

vas maduras é de 0,31 - 0,39 ~l/mg, durante os períodos 39, 49

e 59 ela é de 0,24 - 0,32 ~l/mg e na pupa 0,11 - 0,15 ~l/mg. P~

de-se concluir então que o volume de hemolinfa diminui mais ràp!

damente do que o pêso-sêco do animal em pelo menos duas oportu­

nidades. Isso indica que de larvas- maduras para 39P e de 59P p~

ra pupa deve haver transferência de água da hemolinfa para os

tecidos. Essa interpretação está de acôrdo com a hipótese le­

vantada abaixo da hemolinfa servir como importante reservatório

de água para o animal.

11

IÚ

TABELA XVIII

pêso-sêco e conteúdo de água das larvas de R. americana imedia­

tamente antes do início e após o término do casulo

2. Determinações químicas na hemolinfa

Os resultados das determinações de proteína, carboi­

dratos e a-amino-N ácido solúvel e densidade da hemolinfa en­

contram-se na Tabela XVI e Tabela XIX. ~sses mesmos· resulta­

dos estão também representados na figura 9.

Os resultados apresentados na Tabela XVIII permitem

calcular que a hemolinfa é respónsável por 37% do pêso-fresco

e 26% do pêso-séco de larvas maduras, o que lhe garante urna

imoortância, pelo menos quantitativa, na vida do inseto. Além

disso, êsses resultados levam à conclusão de que a hemolinfa

é importante reservatório de água para o animal, pois contém

39% da água das larvas maduras e contribui com 53% da água

perdida pela larva durante a produção do casulo, isto e, entre

o fim do 29 período e o período pré-pupal.

OnO}II'O"'1

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1.,II

I.. OI

'"

3,7

6,5

22,4

pré-pupal, 63

10,7

58,7

22,9

Período e idade (dias)

29P, 48

Média de duas determinações. Resultados ex­pressos em . mg/larva.

- Calculado a partir da diferença entre pêso­fresco e pêso-sêco da larva ou hemolinfa.

1<Determinação

pêso-sêco da larva

*

**Âgua, total

**Âgua, hemolinfa

**

o o o oOnOllllOWI 16(( "1l13.l01:ld o o o o. UI ~ co •

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1.,II

I..

(dias)

6,5

2,4

3,7

t:ados ex-

lupal, 63

XVIII permitem

lo pêso-fresco

garante uma

inseto. Além

e a hemolinfa

pois contém

53% da água

isto é, entre

unericana imedia­

) do casulo

re pêso­linfa.

-78-

TABELA XIX

Conteúdo de carboidratos na hemolinfa durante o

desenvolvimento de R. americana

Idade jJg/indivíduoPerIodo (dias) Carboidrato Trealose Glicogênio

19P 30 13.,1 li,4 0,0

29P 32 32,3 26,2 0,2

29P 48 49,4 34,4 0,3

39P 49 35,8 24,4 0,3

49P 54 46,5 28,2 0,2

59P 57 47,5 29,4 0,3

Pupa 64 34,6 27,6

Durante o 39 estádio e 49 estádio até a idade de 48

dias ocorre um acúmulo generalizado de compostos na hemolin­

fa, resultando em um aumento de sua densidade. Após o início da

produção do casulo ocorre ainda um ligeiro aumento na massa de

proteínas, seguido de uma queda grande até o fim do período est~

dado (pupa). Os compostos ninhidrina-positivos ácido solúveis (a­

amino-N ácido solúvel} diminuem em massa desde o início da produ­

ção do casulo até a fase de pupa. Carboidrato total cai no iní­

cio da produção do casulo (39P), em seguida retorna ao valor ini­

cial e se mantém estável até a transformação em pup~ quando cai

novamente. Trealose é o carboidrato predominante na hemolinfa de

R. americana durante todo o desenvolvimento larval, enquanto

que glicogênio ocorre em massa insignificante.

o início da elevação do conteúdo de proteínas na hem~

linfa (cêrca de 30 dias de idade), coincide com a acentuação da

côr avermelhada das larvas o que marca o inIcio do 29 período do

49 estádio.

Composição de ar

de R. amE

Componente

Arginina

Âcido aspárticl

Treonina

Serina

Prolina

Âcido glutâmic·

Glicina

Alanina

Valina

Metionina

Isoleucina

Leucina

Tirosina

Fenilalanina

Glutamina + Ai!:

Amônia

Lisina

Histidina

Triptofano

Fosfoetanolamj

Cistationina

Fosfoserina

Ornitina

Peptídeos

Total de amin<

Total geral

* Os valores

** Os numeros I

em dias apó

! o

3"ênio

3

ldade de 48

na hemolin­

início da

massa de

1:!ríodo est~

solúvois(a­

j da produ­

:li no iní-

valor ini­

uando cai

:amo1infa de

enquanto

nas na hemo

:antuação da

período do

-79-

TABELA XX

Composição de aminoácidos e peptídeos na hemo1infa de larvas

de R. americana em vários períodos do 49 estádio*

-2~ moles.lO jlarva

** ** **Componente 39P (49 dias) 49P (54 dias) 59P(57 dias)

Arginina 1,38 0,86 0,75

Âcido aspártico 0,52 0,26 0,32

Treonina 24,28 12,60 8,35

Serina 7,13 2,54 0,85

Prolina 8,75 4,31 2,85

Âcido glutâmico 1,33 3,69 6,92

Glicina 2,70 2,09 1,36

Alanina 1,97 1,03 0,56

Valina 6,54 3,82 2,28

Metionina 0,38 0,22 0,17

Isoleucina 1,75 0,59 0,56

Leucina 2,68 1,13 1,04

Tirosina 5,26 3,68 3,06

Fenilalanina 0,39 0,30 1,37

Glutamina + Asparagina 5,60 5,42 2,71

Amônia 43,80 21,60 24,60

Lisina 4,09 2,56 3,44

Histidina 7,16 4,96 5,20

Triptofano 2,18 2,32 1,23

Fosfoetanolarnina 0,49 0,18 0,37

Cistationina 0,30 0,57 0,57

Fosfoserina 0,24 0,12 0,15

Ornitina 4,55 2,45 1,47

Peptídeos 29,60 25,80 18,90

Total de aminoácidos 89,18 55,52 45,21

. Total geral 163,07 103,10 89,08

* Os valores apresentados são médias de 3 determinações.

** ~ - -Os numeros entre parenteses representam a idade cronologicaem dias apôs a eclosão.

1

-80-

Os aminoácidos e peptídeos encontrados nos períodos

39, 49 e 59 sao os mesmos encontrados em larvas do 29 período

com 45-48 dias. Nenhuma modificação qualitativa importante foi

verificada.

Urna inspeção na Tabela xx permite a certificação de

que a queda de a-amino N ácido solúvel observada durante a pro­

dução do casulo (figura 9) realmente correspondam a uma queda na

massa de aminoácidos e peptídeos.

dividuais, c

ce realmente

Os

rante o dese

Osmolaridade

Os aminoácidos cuja massa mais cai entre 39P e 59P,

sao: treonina, prolina, serina e valina. Juntos êstes aminoáci­

dos respondem por 70% da queda total dos aminoácidos (em moles)

nesse intervalo de tempo. E' interessante notar que os referi­

dos quatro aminoácidos, correspondem juntos a 29% em moles da

protéina insolúvel do casulo 111.

Período

39P

49P

59P

I,(d.

TABELA XXI

o final da vida larva, como pode ser observado na Tabela XXI.

Os metais diminuem continuamente em massa durante"I<

Todos os v,naçoes comminação re,

Massa de metais na hemolinfa de R. americana em várias fases*do desenvolvimento larval 3. pêso-sÉ

Os resultados da Tabela XXII mostram que a despeito de

alterações na composição química da hernolinfa de R. americana d~

rante o final do desenvolvimento larval, a osmolaridade permane-

Período Idade )Jg/larva

(dias) Mg Ca Cu Zn Fe Na K

39P 49 6,57 3,46 0,103 12,40 9,92

49P 54 4,86 2,47 0,049 0,086 0,272 11,51 8,08

59P 57 2,90 1, 63 0,036 0,057 0,152 7,45 5,20

pré-pupal 63 1,06 0,59 0,045 0,032 0,081

* Todos os valores apresentados representam médias de três de-terminações.

ce contante. As variações de pH estão dentro das variações in-

o c

porções princ

férica dispos

segmentarment

pequena em re

di fici I em la

roso central

todo o desenv

quando então

(Tabela XXIII

bola (WIGGLES

o c

vel, crescenà

responde a 18

guida até pup

nos períodos

lo 29 período

.mportante foi

~tificação de

'ante a pro­

uma queda na

-81-

dividuais, com a possível exceção daquela do 49 P, cujo pH pare­

ce realmente ser ligeiramente mais baixo que dos demais períodos.

Os valores par.a cloreto e amônia sofrem alterações du­

rante o desenvolvimento.

TABELA XXII

Osmolaridade, pH, cloreto e amônia na hemolinfa de R. americana*em diferentes idades

Concentração (mM)Cloreto NH3

39P e 59P,

es aminoáci-

s (em moles)

e os referi­

em moles da

Periodo

39P

49P

59P

Idade(dias)

49

54

57

18,3

25,0

23,0

24,5

15,1

26,2

Osmolaridade(m. osmoles)

217

216

209

pH

7,31

7,18

7,28ssa durante

Jela XXI.

Las fases

K

40 9,92

51 8,08

45 5,20

três de-

despeito de

mericana d,!!

de permane­

riações in-

* - -Todos os valores da Tabela representam medias de tres determi-nações com exceção de pH, que corresponde a apenas uma deter­minação realizada a 250 C.

3. pêso-sêco e glicogênio no corpo gorduroso

O corpo gorduroso de R. americana é formado por duas

porções principais: uma central bastante volumosa e outra peri­

férica disposta em pequenos aglomevados laterais organizados

segmentarmente. Essa porção periférica apresenta massa muito

pequena em relação ao corpo gorduroso central e é de dissecção

dificil em larvas jovens. .Devido a isso, sômente o corpo gordu­

roso central foi pesquisado. ~sse aumenta em pêso-sêco duran­

todo o desenvolvimento da larva até essa atingir a maturidade,

quando então passa a corresponder a 38% do pêso-sêco da larva

(Tabela XXIII). Valores dessa magnitude são comuns em Holomet~.

bola (WIGGLESWORTH, 1965).

O conteúdo de glicogênio do corpo. gorduroso é apreciá­

vel, crescendo até atingir um máximo no 49 período, quando cor­

responde a 18% do pêso-sêco do corpo gorduroso, declinando em s~

guida até pupa (Tabela XXIII).

-82-

TABELA XXIII

pêso-sêco e glicogênio do corpo gorduroso central durante o*desenvolvimento de R. americana

Pe.

Pré·

pêso-sêc

Glicogênio

\lg/indivíduo

pêso-sêco

Idade

(dias)Período

19P

29P

30

32

610

1170 85

* CóSI

29P

29P

39P

49P

44

48

49

54

2400

4100

4060

4100

578

678

756

A Te

pighi repleto!

seu total eSVi

rença entre OI

branco: 1,30 r

o/<Os resultados apresentados são médias de três de-terminações. Maiores informações, ver Métodos.

59P

Pupal

57

64

3820

3200

602

266o c(

fervescente ell

bonatos. A o(

Malpighi já f(

clusive Diptel

4. pêso-sêco e metais nos túbulos de Malpighi

Os túbulos de Malpighi ocorrem em número de 4, desem­

bocam dois a dois no tubo digestivo de R. americana e apresentam

um conteúdo branco na sua porção proximal. ~sse conteúdo aumen­

ta durante o desenvolvimento larval, atingindo um máximo na lar­

va madura (29P, 48 dias de idade) e a partir daI começa a dimi­

nuir. Por ocasião da última apólise larval (início do período

pré-pupal, cêrca de 59 dias de idade) os túbulos~de Malpighi a­

presentam-se completamente vazios.

A me;

bastante granê

dessa determir.

··sente nos túb\;

cia dêsse vale

referido (Tab

realmente CaCO

A ma

presente nos t

conteúdo de Ca

sulo (Tabela X

lo 111 e nos t

'cerm1nada expe.

ver os túbulos

seu conteúdo.

lrante o

de-

4, desem­

apresentam

údo aumen­

mo na lar­

ça a dimi­

do período

lpighi a-

-il3­

TABELA XXIV

pêso-sêco dos tUbulos de Malpighi antes e após a formação

do casulo

Período Idade mg/indivíduo*(dias) pêso-sêco caC0

32QP 48 1,39 1,35

Pré-pupal í3 0,09

* Calculado a partir do conteúdo de Ca apre­sentado na Tabela XXV.

A Tabela XXIV mostra o pêso-sêco dos tUbulos de Mal­

pighi repletos com o conteúdo branco na larva madura, e após o

seu total esvaziamento, depois da última apólise larval. A dif~

rença entre os dois valores permite estimar a massa do conteúdo

branco: 1,30 mg/indivíduo.

o conteúdo branco dos tUbulos de Malpighi torna-se e­

fervescente em ácido acético 10%, o que sugere a presença de ca~

bonatos. A ocorrência de carbonato de cálcio em tUbulos de

Malpighi já foi documentada em larvas de numerosos insetos, in­

clusive Diptera (CLARK, 1958).

A massa de cálcio presente nos túbulos de Malpighi é

bastante grande, como pode ser vista na Tabela XXV. A partir

dessa determinação de Ca pode-se estimar a massa de CaC03, pre-

··sente nos tUbulos de Malpighi: 1,35 mg/indivíduo. A concordân­

cia dêsse valor com a massa de conteúdo dos túbulos de Malpighi

referido (Tabela XXIV), reforça a hipótese de que o conteúdo érealmente CaC0 3 .

A massa de Ca presente no casulo III é similar àquela

presente nos túbulos de Malpighi e muito superior à queda no

conteúdo de Ca verificada na hemolinfa durante a produção do ca­

sulo (Tabela XXV). A semelhança entre o conteúdo de Ca no cas~

lo III e nos tllbulos de Malpighi deve ser ainda maior que a de­

term~nada experimentalmente, devido à impossibilidade de se rem2

ver os túbulos de Malpighi sem perda de uma pequena fração de

seu conteúdo.

;;'84-

TABELA XXV

Determinação de metais nos túbulos de Malpighi em larvas maduras

de R. americana e comparação com o conteúdo de metais do casulo

111 e com a queda dêsses verificada na hemolinfa durante a pro-

dução do casulo

Jlg!individuo

Metais Hemolinfa 1 Malpighi 2 Casulo 111 3

Zn 1,30 0,83

Cu 0,058 0,17 0,056

Ca 2,61 540 660

K 36 0,031

Mg 5,51 76 0,056

Fe 5,0 3,75

1. Queda durante a produção do casulo. Calculado a par­tir das Tabelas V, XVI e XXI.

2. Determinado em animais do 29 período, 48 dias de ida­de. Maiores informações, ver Métodos.

3. Calculado a partir das Tabelas IX e XII.

A. Quími ca de

1. Extens~

A '1

já" apresentac

a extensão cc

maduras de B..de 88% do pês

tre os inse

mori e Hyal

cerca de 96

1"961) .

A f

na deve corre

dos orgânicos

proteínas. E:

proteínas con:

vadas em inse"

ser responsávl

te como g li co<

LHO (1969) qUE

cas separadas

1arvas de R. e

larvas maduras

ais do casulo

durante a pro-

:lsulo III 3

0,83

0,056

i60

0,031

0,056

3,75

llado a par-

ias de ida-

DISCUSSÃO

A. Química da hemolinfa

1. Extensão da análise realizada

A Tabela XXVI apresenta uma compilação de resultados

já apresentados, porém agora na forma adequada para se estimar

a extensão coberta pela análise realizada da hemolinfa de larvas

maduras de R. americana. Como se vê, a análise abrangeu cêrca

de 88% do pêso-sêco da hemolinfa, o que coloca R. americana en­

tre os insetos de hemolinfa melhor conhecida, próximo a Bombyx

mori e Hyalophora cecropia cujas hemolinfas são conhecidas· em

cêrca de 96 e 92% de seu pêso-sêco, respectivamente (WYATT,

1"961) .

A fração não identificada da hemolinfa de R. america­

~ deve corresponder, entre possíveis outros compostos, a áci­

dos orgânicos (ver abaixo, ítem 3) ea carboidratos ligados às

proteínas. Esta última suposição está baseada no fato de que·

proteínas conjugadas a carboidratos ocorrem em concentrações el~

vadas em insetos (SIAKOTOS, 1960a). Tais carboidratos parecem

ser responsáveis por parte dos componentes determinados usualme~

te como glicogênio (WYATT, 1961) e pela observação de TOLEDO FI­

LHO (1969) que encontrou reação PAS positiva nas 9 bandas protéi

cas separadas poreletroforese em gel de agar da hemolinfa de

larvas de R. americana.

composição porcentual em massa do resíduo sêco da hemolinfa de

larvas maduras de R.americana*

Os valores apresentados foram calculados a partir das ta­belas 11 e V. A concentração dos compostos fosforiladosorgânicos não identificados foi calculada a partir de de­determinação de P-orgânico ácido· solúvel (P-ácido solú­vel-P-inorgânico) da Tabela V, assumindo que êste represen-~té:15% em pêso dos referidos compostos, seguido da subtra­ção do título de fosfoetanolamina e fosfoserina. Ver dis­cussão no texto.

-86-

TABELA XXVI

Composto

Proteína

Aminoácidos

Lipídeos

Peptídeos

.Citrato

Compostos fosforilados orgânicos

não identificados

Metais

Carboidratos

Cloreto

Ortofosfato

Fosfoetanolamina

Glicogênio

. Total

pêso-sêco

*

mg/ml % pêso-sêco

69;00 61,5

8,22 7,3

5,20 4,6

4,23 3,8

3,91 3,5

2,77 2,5

2,71 2,4

2,01 1,8

0,48 0,4

0,30 0,3

0,18 0,2

0,01 0,0

99,02 88,3

112,30 100,0

2. componentes

TUNDI

aminoácidos liv

matografia em 1=

Seus resultados

gura 1, embora

tídeos por êles

figura. ° fate

nina, fenilalan

nina alêm de 11

te se deve à me

liti co em relaç

° coné bastante elev

les merecem uma

Cista

em concentraçõe

não se detecta

11). Isso pode

deriva-se da me

moserina devido

o caso de Boinby

teina é um amin

demonstrado no

1948).

Argin

dos, podendo se

por ornitina, o

ornitina -->

tina completo e:

por INOKUCHI, Ri

dão uma evidênc.

lo menos em Bom

ser explicada, ,

na exógena, pore

rosos de vários

deria ser forma,

olinfa de

êso-sêco

61,5

7,3

4,6

3,8

3,5

2,5

2,4

1,8

0,4

0,3

0,2

0,0

88,3

00,0

s ta­ri1adosde . de-

solú­presen­subtra­r dis-

-87-

2. Componentes orgânicos da hemolinfa

TUNDISI et alii (1964) em uma análise qualitativa dos

aminoácidos livres da hemolinfa de R. americana utilizando cro­

matografia em papel, identificaram 15 aminoácidos e 2 peptídeos.

Seus resultados estão de acõrdo com aquêles apresentados na fi­

gura 1, embora nenhuma correlação possa ser feita entre os pep­

tideos por êles identificados e· aquêles apresentados na referida

figura. O fato dos referidos autores não terem encontrado metiQ

nina, fenilalanina, triptofano, arginína, fosfoserina, cistatio­

nina além de 11 outros compostos ninhidrina-positivos, certamen­

te se deve à menor resolução e sensibilidade de seu sistema ana­

lítico em relação ao utilizado nesta tese.

O conteúdo de aminoácidos na hemolinfa de R. americana

é bastante elevado, como foi indicado em Resultados e vários dê­

les merecem uma discussão particular.

Cistationina acumula-se na hemolinfa de R. americana

em concentrações superiores até que ametionina, enquanto que

não se detecta nem mesmo traços de cisteína ou cistina (Tabela

lI). Isso poderia ser explicado admitindo-se que a cistationina

deriva-se da metionina e que ela não é clivada em cisteina e ho­

moserina devido a ausência da enzima apropriada, como parece ser

o caso de Bombyx mori (GILMOUR, 1965). Isso indicaria que cis­

teina é um aminoácido essencial para R. americana como já foi

demonstrado no Diptera Nematocera~· (GOLDBERG e De MEILLON,

1948) •

Arginina é ~equerida na dieta de todos insetos estuda­

dos, podendo ser substituída parcialmente por citrulina, mas não

por ornitina, o que levou a se propor a não ocorrência do passo

ornitina ----> citrulina e consequentemente de um ciclo da orni­

tina completo em insetos (GILMOUR, 1961). Os resultados obtidos

por INOKUCHI, HORIE e ITO (1969) usando marcadores radioativos

dão uma evidência direta de que o referido passo não ocorre, pe­

lo menos em Bombyx mori. A presença de ornitina e uréia poderia

ser explicada, entretanto, pela ação da arginase sõbre a argini­

na exégena, porque arginase (EC 3.5.3.1) ocorre nos corpos gord~

rosos de vários insetos pesquisados (GILMOUR, 1965). A uréia po­

deria ser formada ainda a partir de ác~do a1antéico sob ação da

J••

-88-

alantoicase (EC 3.5.3.4), como ocorre com o grilo Acheta domes­

~ (GILMOUR, 1965). Nenhuma informação existe sôbre a possi­

bilidade da ornitina se derivar do ácido glutâmico ou prolina,

como acorre em vários animais (Cf. GLIMOUR, 1965).

A partir do exp.:'sto acima, pode-se admitir que o acú­

mulo de ornitina verificado na hemolinfa de R. americana e a au­

sência de traços de citrulina seja consequência da formação de

ornitina a p~rtir da arginina exógena e sua impossibilidade de

poder dar origem à arginina, devido a inexistência do passo ornl

tina ---> citrulina. A uréia presente em traços de hemolinfa

poderia ter surgido pela arginase (EC 3.5.3.1) ou, menos provà­

velmente, pela alantoicase (EC 3.5.3.4), como descrito acima.

As concentrações de tirosina.na hemolinfa de R. ameri­

~ sao bastante elevadas, chegando a 3,26 mM no 59 período,

que corresponde aproximadamente ao limite de solubilidade da ti­

rosina em água a 250 C (0,05% p/P). Entretanto, concentrações

ainda mais elevadas foram encontradas na hemolinfa de larvas de

outros Diptera como Calliphora auqur (7,41 mM, segundo HACKMAN,

1956) e na larva inteira de Phormia regina, onde a concentra­

ção da tirosina livre é tão elevada, cêrca de lO vêzes o limite

de solubilidade da tirosina em água, que LEVENBOOK e DINAMARCA

(1966) propuseram que "in vivo" a tirosina deve ocorrer no esta

do sólido. Essas concentrações elevadas de tirosina devem estar

relacionadas com o papel dêsse aminoácido como precursor cos fe­

nóis que intervém na formação do pupário e/ou de nova cutícula

(GILMOUR, 1965). Como Ca11iphora e Phormia produzem um pupário,

enquanto que R. americ~~a não o faz, seria mesmo de se esperar

que as primeiras possuíssem um conteúdo maior de tirosina em re­

lação a essa última.

Taurina é encontrada frequentemente na hemolinfa ce iQ

setos e deve-se originar a partir da descarboxilação do derivado

oxidado da cisteína, o ácido cisteico, e não possui nenhuma fun­

ção conhecida em insetos (GILMOUR, 1965). Recentemente vários

eXperimentos tem sugerido a possibilidade de taurina atuar como

um neurotransmissor semelhante ao ácido y-amino butírico em ma­

míferos (Cf. DAVISON e KACZI~REK, 1971). E' possível que o mes­

mo ocorra em insetos, ewbora ainda não exista nenh~~ ,estudo a

,respeito.

o ãtação vegetal

tionina (GILM

o ádo ácido glut

da biossíntes,

missoras do s.

e S- alanina t,

tização de cu'

Fos:

devem estar 1

deos. E I intl

tídeo predoro.:

~ (BIEBER et

1963).

A f\

das concentraç

(CHEN~ 1966),

culares como t

ram' entretant

e, segundo CE

participação e

morregulação.

dos livres da

na biossíntese

aminoácidos n

fato dos inset

gânicos (FLORK

Adiante, ítem

que os aminoá

pam na síntese

A oc

setos é fenô

existem, entre

presentes. En

te ácidos,

SIMMONS, 1962)

) Acheta domes­

sôbre a possi­

) ou prolina I

.tir que o acú­

,ricana e a au­

da formação de

ssibilidade de

do passo orn.!.

de hemolinfa

menos provã-

rito acima.

a de R. ameri­

) 59 período,

Llidade da ti-

concentrações

1 de larvas de

fundo HACKMAN,

! a concentra­

'êzes o limite

'K e DINAMARCA

'orrer no est~

a devem estar

ursor dos fe~

nova cutícula

m um pupário,

de se esperar

rosina em re-

nolinfa de i12

) do derivado

nenhuma fun­

!mente vários

I atuar como

:írico em ma­

,1 que o mes-

estudo a

-89-

o ácido a-amino-n-butírico deve originar-se da alimen­

tação vegetal, embora possa surgir a partir da degradação da me­

tionina (GILMOUR, 1965).

o ácido y-amino-n-butírico, resulta da descarboxilação

do ácido glutâmico, enquanto que nenhum dado existe a respeito

da biossíntese'da B-alanina; ambos devem ser substâncias trans­

missoras do sistema nervoso central em insetos (GILMOUR,1965)

e e-alanina t~ sido implicada também nos processos de esclero

tização de cutículas (HACKMAN e GOLDBERG, 1971).

Fosfoetanolamina e possivelmente fosfoserina também

devem estar relacionados com a síntese e degradação de fosfatí­

deos. E' interessante notar que fosfatidiletanolamina é o fosf~

tídeo predominante em Diptera, como por exemplo: Phormia regi­

~ (BIEBER et alii, 1961) e Musca domestica (CRONE e BRIDGES,

1963) .

A função dos aminoácidos livres presentes em tão elev~

das concentrações na hemolinfa ainda não está bem esclarecida

(CHEN~ 1966), exceptuando-se aquela de alguns aminoácidos parti­

culares como tirosina, como já foi comentado. Algumas funções fQ

ram, entretanto, atribuídas aos aminoácidos livres da hemolinfa

e, segundo CHEN (1966), são: precursores de síntese protéica,

participação em mecanismos de detoxificação, tamponamento e os­

morregulação. O caso mais conhecido da utilização dos aminoáci­

dos livres da hemolinfa como precursores de síntese protéica é

na biossíntese da sêda por Bombyx (WYATT, 1961). O papel dos

aminoácidos na osmorregulação parece estar relacionado com o

fato dos insetos possuírem uma baixa concentração de íons inor­

gânicos (FLORKIN e JEUNIAUX,1964; ver também ítem A3, abaixo).

Adiante, ítem B2, será apresentada alguma evidência indireta de

que os aminoácidos livres da hemolinfa de R. americana partici­

pam na síntese do seu casulo.

A ocorréncia de peptídeos na hemolinfa de larvas de i12setos é fenômeno generalizado (CHEN, 1966). Entre os Diptera

existem, entretanto, diferenças quanto aos tipos de peptídeos

presentes. Enquanto que em Drosophila os peptídeos são geralme12

te ácidos, de cadeia re1ativamente longa (Cf. MITCHELL e

SIMMONS, 1962), aquêles presentes em Phormia reqina são de cará-

-90-

(1950b) as proteínas da hemo­

62% do poder tamoonante to-

ter básico ou neutro e predominantemente compostos de dois ami­

noácidos (Cf. LEVENBOOK, 1966).

Os peptídeos oresentes na hemolinfa de R. americana

são do tipo observado em Phormia regina, isto é, predominante­

mente básicos ou neutros e compostos de pequeno número de resí­

duos de aminoácidos.

O significado bioquímico dos peptídeos da hemolinfa

não é ,conhecido com segurança. LEVENBOOK (1966) a oartir da

observação do desaparecimento dêsses peptídeos em Phormia regina

por ocasião da pupação sugeriu a possibilidade dêstes funciona­

rem como uma reserva de aminoácidos, que seriam utilizados nos

processos de histogênese na pupa. E' possível, entretanto,

que êsses peptídeos tenham também funções mais específicas, como

por exemplo o peptídeo sexual de Drosophila melanogaster,que é

produzido nas glândulas ;acessórias do macho e transferido para

as fêmeas na cópula, aumentando a ovoposição nessas (CHEN e"BUHLER, 1970).

As proteínas da hemolinfa sao sintetizadas principal­

mente pelo corpo gorduroso (SHIGEMATSU, 1958; 1960; PRICE e

BOSMAN, 1966), embora outros órgãos como o intestino aparente­

mente sejam também responsáveis pela síntese de pelo menos parte

dessas proteínas (ROTH e PORTER, ·1964; CHIPPENDALE, 1970).

Várias funções tem sido atribuídas às proteínas da he­

molinfa. Segundo SIAKOTOS (1960a, b) as proteínas da hemolinfa

transportam carboidratos e lipídeos dos sítios que os armazenam

para outros em que serão utilizados. Pelo menos em alguns inse­

tos, as proteínas da hemolinfa funcionam corno fornecedoras de

aminoácidos para a manutenção da osmolaridade da hemolinfa

(WYATT, 1961).

De acôrdo com LEVENBOOK

linfa sao responsáveis por cêrca de

tal da hemolinfa de Gastrophilus.

A presença de numerosas enzimas entre as bandas prote!

cas separadas por eletroforese de amostras de hemolinfa foi de­

monstrada primeiramente por LAUFER {1960a, b), embora atividades

enzimáticas já tivessem sido detectadas na hemolinfa por numero-

sos outros in

1964; CHEN, 196

um complexo muI

ce ser tomado i

para a degradaç

tanto, uma das

atraído a atenç

como precursora

durante a metam

contribuírem.na

to, conforme já

Em B.:..proteínas da he

que será discut

dos de BIANCHI

proteínas da he:

se, como ocorre

demonstração po

cas da hemolinf.

gel de agar dão

dicar uma parti

rido por SIAKOTI

Os li]ciados a proteíl

te na forma de I

1967a), embora (

dos principalmel

tados desta tesE

predominante na

de fosfolipídeo!

Os fo!

parte do P-lipic

aproximadamente

de fosfolipídeo~

mente multipliccV) por 25. ~s~

de hemolinfa.

de dois ami-

R. americana

redominante­

ero de resí-

a hemolinfa

a partir da

ormia regina

es funciona­

ilizados nos

entretanto,

íficas, como

aster ,que éferido para

(CHEN e

s principal­

60; PRICE e

no aparente­

menos parte

1970).

eínas da he­

da hemolinfa

os armazenam

alguns inse­

necedoras de

a hemolinfa

nas da hemo­

oonante to-

andas prote!.

nfa foi de­

:i atividades

por -numero-

sos outros investigadores anteriores (Cf. FLORKIN e JEUNIAUX,

1964; CHEN, 1966). Mais recentemente foi detectado e purificado

um complexo multienzimático da hemolinfa de maripôsas, que pare­

ce ser tomado intacto por tecidos em histólise, contribuíndo ali

para a degradação do DNA (RIECHERS, MEYERS e BERRY, 1969). Entr~

tanto, uma das funções das proteínas da hemolinfa que mais tem

atraído a atenção dos pesquisad~res recentemente é a de servirem

como precursoras diretas ou indiretas das proteínas tissulares

durante a metamorfose, para a constituição do adulto, além de

contribuírem na formação do vitelo dos ovócitos em desenvolvimen

to, conforme já foi comentado na Introdução.

Em R. americana a função melhor estabelecida para as

proteínas da hemolinfa é sua participação na produção do casulo,

que será discutida em detalhe, no ítem 2B, abaixo. Os resulta­

dos de BIANCHI (1972) sugerem ainda a possibilidade de uma das

proteínas da hemolinfa de R. americana participar na vitelogêne­

se, como ocorre com grande número de insetos. Por outro lado a

demonstração por TOLEDO FILHO (1969) de que as 9 bandas protéi­cas da hemolinfa de R. americana separáveis por eletroforese em

gel de agar dão reações positivas para carboidratos poderiam in­

dicar uma participação no transporte de carboidratos, como suge­

rido por SIAKOTOS (l960a, b) em Periplaneta americana.

Os lipídeos encontram-se na hemolinfa de insetos asso­

ciados a proteínas, através de ligações específicas principalmen

te na forma de diglicerídeos (CHINO e GILBERT, 1965; GILBERT,

1967a), embora ocorra exceções onde os lipídeos são transporta­

dos principalmente como triglicerídeos (MARTIN, 1969). Os resu!

tados desta tese não permitem concluir qual é a forma lipídica

predominante na hemolinfa de R. americana,embora uma estimativa

de fosfolipídeos e lipídeos neutros possa ser feita.

Os fosfatídeos são de regra responsáveis pela. maior

parte do P-lipídicoem Diptera (GILBY, 1965) e como êles contém

aproximadamente 4% em pêso de fósforo é possível estimar a massa

de fosfolipídeos presentes na hemolinfa de R. americana, simple~

mente multiplicando o conteúdo de P-lipídico determinado (Tabela

v) por 25. tsse cálculo resulta em 2,55 mg de fosfolipídeos!ml

de hemolinfa.

Os compostos fosforilados presentes na hemolinfa de

larvas maduras de R. americdna são fosfolipIdeos (discutidos

acima), ortofosfato, fosfOProteInas e componentes da fração or­

gânica ácido solúvel. Nesta fração sõmente dois compostos fos­

forilados foram identificados e quantificados nesta tese; fosf~

serina e fosfoetanolamina (Tabela 11): Os compostos organ~cos

fosforilados ácidos solúveis não identificados podem ser, entr~

tanto, estimados se for assumido que êles possuem um conteúdo

médio de P similar ao observado em compostos dessa fração em o~

tros insetos, isto é, 15% em pêso (WYATT, 1961). O resultado

dêsse cálculo é apresentado na Tabela XXVI.

-92-

A concentração de lipIdeos neutros por sua vez,

ser calculada a partir do conteúdo lipídico total (Tabela

da estimativa de fosfolipídeos feita acima, resultando em

mg de lipídeos neutros/ml de hemolinfa.

pode

v) e

2,05

3. Composiç~

A

tribuição pc

tal da hemo]

dos para a h

f.0InPosição IIi

Aminoácidos

Mg

Na

Os compostos fosforilados orgãn~éos.e ácido solúveis

sao muito importantes para o tamponamento da hemolinfa de inse­

tos (LEVENBOOK, 1950b) e para o seu balanço ãnion-cátion

(WYATT, LOUGHHEED e ~VYA'rl', 1956; LEVENBOOK, 1950a). A importãg

cia dêsses compostos no balanço ânion-cátion da hemolinfa de ~.

americana pode ser apreciada na. Tabela XXVIII uma vez que fosf~

to ácido solúvel é um dos principais ãnions da hemolinfa e éconstituído principalmente de compostosorgân~cos como pode ser

demonstrado a partir da Tabela V.

A concentração de citrato na hemolinfa de larvas de

R. americana é bastante elevada e êste ânion corresponde a cêr­

ca de 47% de todos ânions detectados na hemolinfa dêste inseto

(Tabela XXVIII) •. Concentrações elevadas de citrato na hemolinfa

foram observadas em vários outros insetos e trabalhos realiza­

dos em Prodenia eridaniaindicam que o citrato é de origem eg

dógena e que seria acumulado juntamente com outros ácidos orgâ~

nicos devido a uma desproporção entre a biossIntese e a oxida­

ção e/ou utilização dêsses ácidos {LEVENBOOK e HOLLIS, 1961 ;

LEVENBOOK, 1961).

1\.ci do cI tri

K

Cloreto

Compos tos fI

nao;

Peptideos

HC03

­

Trealose

Carboidratol

Ca

Ortofosfato

Fos foetanoli

Total

Osmolaridad!

1. Os valorel11 e V, cc

2. Calculado

3. Calculadotrações dEbela V.

sua vez, pode

L (Tabela v) e

:ando em 2 ,05

hemolinfa de

)s (discutidos

da fração or­

:ompostos fos­

:a tese~ fosf9­

:05 orgânicos

tem ser, entr~

I um conteúdo

fração em 0O!!

O resultado

cido solúveis

infa de inse­

ânion-cátion

A importâ!!

molinfa de R.

vez que fosf~

9molinfa e écomo pode ser

de larvas de

3ponde a cêr­

dêste inseto

) na hemolinfa

Lhos realiza­

de origem e!!

ácidos orgâ;"

;e e a oxida-

lLLIS, 1961 ~

3. Composição molar da hemolinfa e seus componentes inorgânicos

A composição molar da hemolinfa permite estimar a con­

tribuiçãoporcentual de cada componente para a osmolaridade to­

tal da hemolinfa. A Tabela XXVII mostra os resultados calcula­

dos para a hemolinfa de R.americana.

TABELA XXVII

C9mposição molar da hemolinfa de larvas maduras de R. americanal

Composto mM % do total

Aminoácidos 62,62 26,2

Mg 45,30 19,0

Na 33,70 14,1

Acido cítrico 18,60 7,8

K 17,30 7,2

Cloreto 13,40 5,6

Compostos fosforilados orgânicos

não identificados2 13,32 5,5

Peptídeos 12,78 5,4

HC03- 6,90 2,9

Trealose 4,10 1,7

Carboidratos não identificados 3 3,39 1,4

Ca 3,23 1,4

Ortofosfato 3,13 1,3

Fosfoetanolamina 1,31 0,5

Total 239,08 100,0

Osmolaridade (mi liosmoles) 216

1. Os valores apresentados foram calculados a partir das tabelas11 e V, com as exceções indicadas. Ver discussão no texto.

2. Calculado a partir da Tabela XXVI~

3. Calculado como glicose, a partir da diferença entre as concentrações de carboidrato total e trealose, apresentadas na Ta=bela V.

f,ll

-94-

Amônia nao se encontra representada na Tabela XXVII,

devido à possibilidade de que o seu elevado título seja um arte­

fato (ver Tabela 11 e comentários a ela referente em Resultados).

Similarmente ali não se encontram os valores para Fe, Cu e Zn,

por ocorrerem em concentrações muito baixas (ver Tabela V). As

protefnas, embora presentes em elevada concentração, quando ex­

pressas em massa por volume, são osmõticamente de efeito desprezi

vel, em relação aos componentes representados na Tabela XXVII e

por isto também nao foram ali apresentadas.

A soma das concentrações molares dos componentes da he­

molinfa é maior do que a sua osmolaridade total. Essa diferença

deve ser real, porque possíveis superestimativas dos compos­

tos não determinados diretamente, como os compostos fosforilados

orgânicos não identificados e os carboidratos não identificados,

nao seriam suficientes para corresponder à diferença observada.

Além disso, se amônia 0correr realmente na concentração determi­

nada, ou o seu eventual precurser, a diferença entre a concen­

tração molar total e a osmolaridade da hemolinfa seria ainda

maior. A explicação mais simples para essa diferença é admitir

que alguns componentes não sejam osmõticamente ativos por esta­

rem complexados a outros. Essa possibilidade voltará a ser ex­

plorada abaixo ao se discutir o balanço ânion-cátion da hemolinfa.

A contribuição osmótica dos íons inorgânicos e amino­

ácidos da hemolinfa pode ser analisada~ com maior facilidade

através da figura 10. Nesta ~lgura A, B, e D representam os

principais padrões iônicos inorgânicos nos insetos pterygota,

segundo SUTCLIFFE, conforme citado por FLORKIN e JEUNIAUX (1964).

Segundo êsse mesmo autQr, A representa o tipo considerado mais

primitivo, caracterizado por concentração elevada de íons inor­

gânicos e baixa concentração de arninoácidoS1 D é considerado o

tipo mais evoluído, apresentando elevada concentração de amino­

ácido~ e baixa concentração de íons inorgânicos e, finalmente,B

é um tipo intermediário que é usual nas ordens: Megaloptera,

Neuroptera, Mecoptera, Trichoptera e Diptera. R. americana re­

presentada por C, possui um padrãq bem de acôrdo com aquêle u­

sual para Diptera (B) isto e, quase 50% da pressão osmótica é

devido a cátions inorgânicos, cloreto'é um ânion de importância

relativamente pequena e o papel osmótico dos aminoácidos é ele­

vado.

A

Atol 11'10 Ácroos !

Nn

k

P04

H-

ei

EPHE 111EROPTEI

OOONATAPl.EOOPTERAOICTVOPTERAHETEROPTERA

Figura lO - Ef,dos como porce:de insetos pteduas seções veconcentração ID<tions são ilusà direita. Osvel em igual prespondem a CO!

tados de acôrd,C f,

da hemolinfa.

abela XXVII,

eja um arte­

Resultados) .

, Cu e Zn,

ela V) • As

quando ex­

eito desprezi

ela XXVII e

nentes da he­

5sa diferença

dos compos­

fosforilados

lentificados,

~a observada.

~ção determi­

:re a concen­

~ seria ainda

lça é admitir

TOS por esta-

~á a ser ex-

A

,AMINO ACID05

k

04-

ti.

çe

B

,AMINO ACIDOS

Mg

e.",

k

N~

P04

cf

c

,AMINO ACIDOS

l1li9

Ca

K

N~

cf

o

I

AMINO ACIDOS

NaCá

De POA

e!Na

111'JII:

::~lI"

r,:

Figura lO - Efeitos osmóticos de co~ponentes inorgânicos ilustr~dos como porcentagens da concentraçao molar total da hemolinfade insetos pterygota. Cada bloco na figura é visualizado comoduas seções verticais, cada uma destas correspondendo a 50% daconcentração molar total. As contribuições porcentuais dos cá­tions são ilustrados na seção à esquerda, enquanto que os ânionsà direita. Os aminoácidos são representados, na medida do possível em igual proporção em ambas seções. As áreas em branco cor=respondem a componentes não indicados. A, B e D estão represen­tados de acôrdo com SUTCLIFFE segundo FLORKIN e JEUNIAUX(1964).

C foi calculado a partir da Tabela XXVII.

)s e amino­

facilidade

~presentam os

Pterygota,

IIAUX (1964).

derado mais

.e íons inor­

'onsiderado o

ão de amino­

finalmente,B

Megaloptera,

mericana re­

om aquêle u­

o osmótica é

importância

cidos é ele-

EPHEMEROPTERA

OOONATA

PLECOPTERA

DICTYOPTERAHETEROPTERA

MEGALOPTERA

HEUROPTIERA

IIIIECOPTERA

TIIUCHOPTERADIPTER A

R. AWI ERICANALEPIDOPTERA

HYMENOPTERA

:11'

a maior parte dos cá­

devem ser neutrali-

-96-

Algumas diferenças notáveis existem, entretanto, entre

R. americana e o padrão de Diptera apresentado. são elas: um ní­

vel muito elevado de Mg e K,e um nível relativamente baixo de

Na. Segundo BON~ (1944), insetos carnívoros tenderiam a ter um

conteúdo elevado de Na, enquanto que os insetos fitófagos, um

conteúdo elevado de K e Mg em sua hemolinfa de tal forma que a

razão" molar Na/K nos insetos fi tófagos é menor ou próximo de 1,

e nos carnívoros bem acima de 1 (cêrca de 5 a 15 de regra). Essa

explicação -dietética para os diferentes padrões catiônicos "exis­

tentes encontra, entretanto, várias exceções, conforme ressaltado

pelo próprio BO~. Apesar disso, essa hipótese é aplicável a nu­

merosos insetos e é possível que o alto conteúdo de K e Mg na he­

molinfa de R. americana, em relação ao padrão de Diptera apresen­

tado (figura 10,B), seja devido aos seus hábitos fitôfagos, en­

quanto que a maioria dos insetos utilizados para a elaboração do

padrão de Diptera apresentado são carnívoros (Cf. FLORKIN e JEU­

NIAUX, 1964).

A razão molar Na/Kna hemolinfa de_ larvas maduras de

R. americana é de 1,95, que é relativamente próximo da unidade,

como seria de se esperar para um inseto fitôfago.

A elevada concentração de K presente na hemolinfa de

muitos insetos parece incompatível com uma função neuromuscular

normal, especialmente porque, segundo CARRINGTON e TENNEY (1959),

todo K encontra-se na forma livre e fisiolõgicamente ativo na

hemolinfa. Experimentos electrofisiológicos indicaram, entretan­

to, que a bainha em tôrno das fibras nervosas dos insetos a­

tua como eficiente barreira de difusão, fazendo com que o fluído

imediatamente em contacto com as fibras nervosas possua uma comp~

sição iónica diferente daquela da hemolinfa (Cf. NARAHASHI, 1963).

Mais tarde foi demonstrado que essa diferen~e composição era man­

tida pela bainha não por ser esta impermeável aos íons, mas por

ser capaz de manter um equilíbrio dinámico adequado entre os íons

da hemolinfa e do fluído circundante das fibras nervosas (Cf.

NARAHASHI, 1963). Entretanto, mesmo a existência dessa bainha

nao explica a insensibilidade de certos insetos a variações iôni­cas extremas (GILMOUR, 1965).

A figura 10 permite observar que

tions presentes na hemolinfa de R. americana

zados por' ân:gânicos é mu:

tanto, me:Lho:

Balanço ânior

Composto

Mg++

Na+

Ca++

Fe++

Total

1. Os valoresXXVII e ar

2. Calculadosecundária

3. Estimado ada hemolinda hemolinta. Nos cáTER (1960)

As

deradas apena

taria na form

razões que nã

da alta conce

mostra clar

dos orgânicos

TABELA XXVIII

Balanço ânion-cátionna hemolinfa de larvas maduras de R.americana-

zados por"ânions orgânicos, porque a contribuição de ânions inor­

gânicos é muito pequena. O balanço ânion-cátion pode ser, entre­

tanto, melhor analisado pela Tabela XXVIII.

23

13

47

% totalComposto meq/l

Ânions

proteinat03 16

Citrato 56

Fosfato ácido

solúve12 27

4

23

11

61

% total

6

34

17

91

meq/l

Cátions

Na+

Mg++

Ca++

K+

Composto

3 fitófagos, um

:al forma que a

)U próximo de 1,

ntretanto, entre

são elas: um ní­arnente baixo de

~deriam a ter um

ieregra) . Essa

ltiônicos ,-_exis­

:orme ressaltado

aplicável a nu­

"e K e Mg na he­

'iptera apresem­

itófagos, en-

elaboração do

FLORl<IN e JEU-

\Tas maduras de

imo da unidade,

++Fe

Total

1

149

1

100

Cloreto-

HC03

-

13

7

11

6

Total 119 100

1 hemolinfa de

) neuromuscular1. Os valores apresentados foram calculados a partir da Tabela

XXVII e arredondados para o número inteiro mais próximo.

3. Estimado assumindo que a carga líquida por mal das proteínasda hemolinfa fôsse igual â albumina plasmática bovina no pHda hemolinfa e que seu pêso molecular fôsse idêntico ao des­ta. Nos cálculos foram utilizados os dados revistos por FOS­TER (1960), para albumina bovina plasmática.

As estimativas de fosfato e proteinato devem ser consi­

deradas apenas aproximativas. Amônia, que no pH da hemolinfa es­

taria na forma de NH4+, não foi incluída na Tabela pelas mesmas

razõés que não o foi na Tabela XXVII, isto é, pela possibilidade

da alta concentração encontrada ser um artefato. A Tabela XXVIII

mostra claramente que o principal ânion é constituído por áci­

dos orgânicos,principalmente citrato. E' interessante notar que

TENNEY (1959),

lmente ativo na

lram, entretan­

los insetos a­

l que o fluído

,s s ua uma comp~

RAHASHI, 1963).

sição era man-

íons, mas por

entre os íonsnervosas (Cf.

a dessa bainha

ariaçóes iôni-

2. Calculado assumindo uma dissociação primária de 100% esecundária de 50%.

uma

~1111

parte dos cã­

ser neutrali-

-98-

hâ um excesso de câtions em relação ao de ânions,que poderia ser

exolicado pela ocorrência de cátions ligados a proteínas·ou ami­

noácidos e pela ocorrência de compostos ácidos não determinados.

Os aminoácidos poderiam contribuir muito pouco no valor do pH da

hemolinfa :essa contribuição seria para os cátions, não para os

ânions. A demonstração de que 15-20% do cálcio e magnésio da

hemolinfa estão ligados a proteínas em Telea polyphemus (CARRINQ

TON e TENNEY, 1959) favorece à idéia de que o desbalanço iônico

observado é devido principalmente a uma fração dos cátions que

nao estaria livre.

Se fôr admitido que a diferença observada entre cátions

e ânions da Tabela XXVIII corresponde a cátions que não estão l~

vres, seria possível explicar também a discrepância entre a con­

centração molar total estimada da hemolinfa e sua determinação

direta, apresentada na Tabela XXVII.

A osmolaridade da hemolinfa permanece constante duran­

te a produção do casulo, embora haja uma queda generalizada em

massa por indivIduo dos comoonentes da hemolinfa (Tabela XXII) .

Essa constância parece ser consequência da pequena variação, que

é ainda mutuamente compensada, da concentração molar dos compo­

nentes que juntos perfazem cérca de 80% da osmolaridade total da

hemolinfa (Tabela XXIX). Deve-se notar, entretanto, que os me­

tais sofrem uma redução, nao balanceada pelo aumento de outros cgn

ponentes da hemolinfa, entre o 29P e 39P sem haver uma queda cor­

respondente na osmolaridade da hemolinfa. ~ste resultado estâ

de acôrdo com a hipótese levantada acima de que parte dos cátions

não está na forma livre, mas ligada a outras moléculas e seria

explicado se o decréscimo no conteúdo de metais ocorrer devido à

perda dos cátions ligados.

1

Osmolaridade e

mente mais ati-

Período Idade

(dias) -Ml

29 P 48 1<

39 p 49

49 p 54

59 p 57

* Valores reprodl

4. Coagulaç;

A heI

pontâneamente.

reações observi

cri to por G::lliGC

teroptera, al~

adultos, embori

outro padrão, E

TAGNON, 1962).

A hen

cipalmente peJ

forma aparenten

mamíferos atrc

TAGNON, 1962).

O esc

çao com água de

de B.:.. americanc

1971), mas o f

poderia ser

.nas . ou ami­

,terminados.

or do pH da

não para os

nésio da

~ (CARRINQ

nço iônico

tions que

ntre cátions

não estão l!ntre a con­

determinação

TABELA XXIX

Osmolaridade e concentracão rnilirnolar dos comoonentes osmôtica~

mente maiS ativos da hemolinfa de larvas de R. americana duran­

te o desenvolvimento*

Período Idade m!'1 miliosmoles

(dias) Metais Aminoácidos Peptídeos Cloreto Osmolaridade

29 P 48 100,0 62,6 12,8 13,4 216

39 P 49 64,3 56,1 16,5 18,3 217

49 P 54 68,3 38,8 18,0 25,0 216

59 P 57 66,2 48,1 20,1 23,0 209

* Valores reproduzidos ou calculados das Tabelas lI, V, XX, XXI e XXII.

II

llltl

i1~1Ij~ t

maduras

YOUNG,explic~

4. Coagulação e escurecimentu

/li

dilui-

A hemolinfa de larvas de R. americana nao coagula es­

pontâneamente. Êsse comportamento é semelhant~ ao padrão IV de

reações observadas na hemolinfa após a sua retirada do inseto de~

crito por G~GO~RE (1951). Êsse padrão é ccrr.~~ em ~emipt€ra He­

teroptera, alguns Coleoptera, alguns Hymenoptera e em Diptera

adultos, embora as poucas larvas de Diptera estudadas apresentam

outro padrão, envolvendo coagulação da hemolinfa (Cf. GRÉGOlRE e

TAGNON, 1962).

A hemostasia no padrão IV de insetos é realizada prin­

cipalmente pela formação de hemocitos aglutinados na ferida, de

forma aparentemente análoga àquela verificada na hemostasia de

mamíferos através da ag~utinação de plaquetas (GRÉGOIRE e

TAGNON, 1962).

o escurecimento e floculação da hemolinfa após

ção com água destilada, similar ao observado em larvas

de ~ americana, foi reportado em Choristoneura (SCKMIDT e

1971), mas o fenômeno permanece obscuro. Uma hipótese

ante duran­

ralizada em

abela XXII) .

riação, que

dos compo­

3.e total da

iue os me­

3.e outros can

3. queda. cor­

:ado está

dos cátions

e seria

~r devido à

-100-

tiva, pelo menos para o escurecimento, é admitir a ocorrência em

condições normais de um inibidor da tirosinase (EC 1.10.3.1) que

deixaria de ser efe~Lvo após a diluição, de forma análoga ao ini

bidor de trealase (EC 3.2.1.28) da hemolinfa da Phormia regina

por FRIEDMAN (1961).

5. Pigmentos

A hemolinfa de larvas de R. americana maduras possuem

pelo menos 7 pigmentos ligados a proteínas. Os mais importan­

tes quantitativamente são: uma cromoglicooroteína de côr limão,

cujo pigmento fluorescente de natureza desconhecida está forte­

mente ligado à proteína e dois carotenóides prêsos por ligações

fracas a proteinas. Um dêsses carotenóides parece ser o S-car~

teno e o outro, mais abundante, possui um espectro similar, mas

não idêntico,ao do astaceno. TUNDISI et alii (1964) propuseram

baseando-se em resultados cromatográficos, e espectrográficos

que o principal pigmento da hemolinfa de larvas maduras seria

astaxantina e outro pigmento também importante seria um similar

ao e-caroteno. A presença dêsse último foi confir~ado no pre­

sente trabalho, enquanto que a ocorrência de astaxantina não foi

observada. Urna explicação possível para a discrepância poderia

ser uma má interpretação dos resultados por TUNDISI et alii

(1964), corno consequência de ter feito os espectros em dissulf~

to de carbono, onde astaxantina e astaceno apresentam espectros

similares de uma única banda e não em oiridina, onde astaceno

apresenta um único oico de absorcão, enquanto que astaxantinali •

apresenta três (KUHN e SORENSEN, 1938). Urna outra possibilidade

seria da astaxantina ter sido oxidada a astaceno nas condições

usadas de extração e cromatografia nesta tese, o mesmo nao ocor­

rendo com os citados autores. Esta possibilidade, entretanto, émuito remota porque a oxidação da astaxantina oelo ar é favoreci

da sàmente em meio alcalinq e, com exceção das experiências em

que as amostras foram previamente saponificadas os meios usados

eram sempre neutros.

BASILE et alii (1970) identificaram três pigmentos na

hemolinfa de larvas selvagens de R. americana, usando eletrofo­

rese em agarose, cujas côres eram: limão, tijolo e violeta.

Isolou também um mutante recessivo, ligado ao sexo que apresen-

1tava apenas

côr de limão

cor de limão

tijolo e vio

nas associad

no. A refer

alii (1970)

cretas e com

Os

diretamente,

1954; CROMAR

~ provàvelm

tenóide simi

ele maneira a

é derivada d

ce to- caroten,

derivados do

1970). A

veis para

J:)rimeira int,

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pigmentoS ca:

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to. Por fim

eia de uma m'

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seu favor o

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Os

nhecida em il

devido a sua

valor duvido:

lO ão amare10-,

ocorrência em

1.10.3.1) que

náloga ao in~

ormia regina

tava apenas o pigmento cór de limão da hemolinfa. O pigmento

côr de limão observado deve corresponder à cromoglicoproteína

côr de limão descrita nesta tese, enquanto que o pigmento côr de

tijolo e violeta devem corresoonder, respectivamente, a prote!

nas associadas ao l3-caroteno e ao carotenóide similar a astace­

no. A referidn associação deve ser específica, porque BAST.LE et

alii (1970) encontraram os pigmentos distribuídos em bandas dis­

cretas e com migração ~eproduzível na eletroforese.

~~lfl' .

~ll~~I

W'MII1(,1,

pigmentos na

do eletrofo­

e violeta.

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:mo nao ocor­

:ntretanto, é

Ir é favorec~

-iências em

leios usados

~ill:

",W-~I'"

,

Os carotenóid~s de insetos são derivados do alimento

diretamente, ou após ligeiras alterações na molécula (GOODWIN,

1954; CROMARTIE, 1959). O l3-caroteno de hemolinfa de R. america

~ provàvelmente deve provir da dieta, enquanto que o caro­

tenóide similar- ao astaceno poderia ser derivado do e-caroteno,

ne maneira análoga à astaxantina que, segundo GOODWIN (1949),

é derivada do l3-caroteno em Schistocerca gregaria ou como os

ceto-carotenóides de Leptinotarsa decemlineata que são todos

derivados do B-caroteno recebido na dieta (LEUENBERGER e THOMMEN,

1970). A partir dêsses fatos, três interpretações são possí­

veis para a mutação limão de R. americana, referida acima. A

primeira interpretação pode ser imaginada admitindo-se que a mu­

tação tenha afetado a capacidade da larva de absorver os dois

pigmentos carotenóides. Entretanto, corno essa absorçao é geral­

mente específica (GOOpWIN, 1954) é pouco provável que uma única

mutação tenha causado essa situação. A segunda interpretação

possível é admitir que se trate de urna dupla mutação afetando a

capacidade da larva de absorver os dois carotenóides do alimen­

to. Por fim, a terceira interpretação é considerá-la consequên­

cia de uma mutação afetando a capacidade da larva absorv~r l3-ca~

roteno, admitindo ainda, que o carotenóide similar ao astaceno

seja derivado do B-caroteno. Esta última interpretação tem a

seu favor o fato de admitir apenas uma mutação para explicar

toda a situação encontrada, o que está mais de acôrdo com o com­

portamento de fator mendeliano simples dessa mutação.

Os carotenóides não tem nenhuma função específica co­

nhecida em insetos, embora seja admitido um paoel na reprodução,

devido a sua presença nos ovos (GOODl1IN, 1954). Êsse papel é de

valor duvidoso em R. americana, porque no mutante limão, os ovos

são amarelo-limão (BASILE, 1970), denunciando a ausência de caro

pre-~do no

que apresen-

102-

tenóides (os ovos de fêmeas selvagens sao alaranjados).

A origem e função do pigmento fluorescente de côr li­

mão é completamente obscura,principalmente porque a sua natureza

química é desconhecida. E' interessante notar.que a sua presen­

ça foi detectada na secreção salivar de larvas de R. americana

(BIANCHI, 1972) e é possível que se encontre também nos ovos,

a julgar pela coloração dêstes no mutante limão.

B. Produção do casulo coletivo por larvas de R. americana

1. Química do casulo

A fiação do casulo inicia-se com a formação de fila­

mentos bem definidos junto aos quais a larva deposita um mate­

rial semelhante a fezes. Mais tarde o espaço entre fios sao pr~

enchidos por um material amorfo, membranoso, visível mesmo de­

pois da retirada de Cac03

por ácido acético. Êste material mem­

branoso, juntamente com o filamentar fazem parte, portanto, do

que tem sido chamado fração insolúvel do casulo. Esta fração c~

responde à sêda de R. americana (ver ítem 2 abaixo), e a Tabela

XI representa a sua composição aminoacídica. BIANCHI (1972)

fêz a determinação da composição aminoacídica da secreção sali­

var da larva madura de R. americana. Esta secreção é responsá­

vel pela origem dos filamentos que são formados logo no início

da produção do casulo, referidos acima. Como os seus resultados

sao similares àqueles obtidos com o casulo terminado isso sugere

que a parte fibrosa e membranosa da fração insolúvel do casulo

tem a mesma composição ou que a parte fibrosa predomina de tal

forma sôbre a amorfa que mascara a eventual composição peculiar

deSta última.

Os tipos principais de sêda conhecidos sao constituí­

dos principalmente de fibroína, colágeno, qui tina, cuticulina ou

poliglicina (RUDALL e KENCHINGTON, 1971). A composição da sêda

de R. americana, representada pela composição da fração insolúvel

do casulo, é principalmente protéica, não podendo portanto, ser

do tipo cuticulina ~ ou quitina. A Tabela XI mostra que a sêda

de R. american

menos do que 6

ser também do

a semelhança d

res, a julgar

do pupário de

rio de Dipte

tícula externa

que a sêda de

to de sêda, em

sêdas qui tinos

adas com prote

de R. american

hexosaminas au

te seja galact

levado em cons

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A se

acíclica mui to

bora os dois g

te. Isso talv

mus não produz

quáticos bem d

gundo LUCAS, S

te em que o in

que a diversid

A fu

pupaçao é a de

variações de

(IMMS, 1957).

do casulo em R

baseando-se no

as larvas dêst

procedéncia, p

tes úmidos, os

em locais sêco

,} .

~ de côr li­

;ua natureza

sua presen­

americana

nos ovos,

~

de fila-

um mate­

ios são pr~

mesmo de­

terial mem­

tanto, do

3. fração cQ:

= a Tabela

(l972)

~çao sali­

responsá­

lO início

resultados

.sso sugere

lo casulo

la de tal

peculiar

constituí­

iculina ou

o da sêda

insolúvel

tanto, ser

que a sêda

-103-

de R. americana não pode ser do tipo poliglicina, pois tem muito

menos do que 66% dos aminoácidos como glicina, bem como não pode

ser também do tipo fibroína ou colágeno. E' notável, entretanto,

a semelhança de sua composição com aquela de proteínas cuticula­

res, a julgar pela sua semelhança com a composição aminoacídica

do pupário de Lucilia cuprina (Tabela XI). Como se sabe o pupá­

rio de Diptera Cyclorrhapha é derivado da epicutícula e endocu­

ticula externa da larva madura (WHITEN, 1957). Parece, portanto,

que a sêda de R. americana representa um tipo ainda não descri­

to de sêda, embora guarde semelhanças com a porção protéica das

sêdas quitinosas, as quais segundo RUDALL .(l962) estariam assoc!

adas com proteínas similares àquelas da cutícula. O fato da sêda

de R. americana apresentar um conteúdo relativamente elevado de

hexosaminas aumenta estas semelhanças, embora a hexosamina prese~

te seja galactosamina e não N-acetilglicosamina e deva ainda ser

levado em consideração o seu conteúd~ relativamente elevado de

carboidratos neutros.

A sêda de Camptochironomus possui uma composição aminQ

acidica muito diferente daquela de R. americana (Tabela XI), em­

bora os dois gêneros estejam relativamente próximos taxonómicame~

te. Isso talvez esteja relacionado com o fato ãe Camptochirono­

~ não produzir um casulo sedoso verdadeiro e possuir hábitos .a­

quáticos bem distintos, portanto, daquêles de R. americana. Se­

gundo LUCAS, SHAW e SMITH (1960) é possível que o tipo de ambien­

te em que o inseto pupe e suas características peculiares expli­

que a diversidade das sêdas.

A função dos casulos de insetos formados por ocasião da

pupaçao é a de oferecer proteção à pupa contra choques mecânicos,

variações de temperatura, dessecamento e ataques de predadores

(IMMS, 1957). DREYFUS et alii (1951) puseram em dúvida a função

do casulo em R. americana como um protetor contra o dessecamento,

baseando-se no ambiente úmido em que são normalmente encontradas

as larvas dêste inseto. Entretanto, a sua objeção parece não ter

procedência, porque embora as larvas sejam encontradas. em ambien­

tes úmidos, os casulos muitas vêzes têm sido encontrados no campo

em locais sêcos.

~~.

fdR,Jmlllil':

IQlq

!:llll1~,1111

I~·j

',i:

-104-

2. Orígem dos componentes do casulo

A produção do casulo exige um enorme esfôrço da larva

de "R. americana, pois durante a sua produção essa perde 62% de

seu conteúdo aquoso e 39% de seu pêso-sêco. Sômente a constitu!

çao do casulo em si consome cêrca de 29% de seu pêso-sêco. Re­

sultados surpreendentes como êsse foram observados também em ou­

tros insetos, como Bombyx mori, em que cêrca da metade das pro­

teínas da larva madura é usada para fazer o casulo (WIGGLES­

WORTR, 1965).

Urna consequência do expôsto acima é que a observação

das alterações químicas na hemolinfa e em vários órgãos da lar­

va deve permitir a identificação dos precursores dos componentes

do casulo. Essa identificação seria dificultada se a maior par­

te das secreções formadoras do casulo fóssem sintetizadas e ar­

mazenadas durante o período de alimentação da larva. Entretan­

to, corno será mostrado abaixo, e já foi brevemente referido na

Introdução, êsse não é o caso emR. americana.

Os componentes hidrossolúveis do casulo devem provir,

pelo menos em parte, de contaminações pelo fluído exuvial e/ou

hemolinfa das larvas durante a coleta dos casulos, além das fe­

zes eliminadas pelo animal durante o feitio do casulo, conforme

já comentado em Resultados. Devido a isto, êsses componentes não

mais serão considerados aqui. Os principais componentes do caSE

lo c~ja origem deve então ser traçada são: cac03 e as proteínas

e carboidratos insolúveis~

A hipótese formulada em Resultados de que o composto

efervescente, contendo cálcio, observado nos túbulos de Malpighi

deve ser CaC0 3 , encontrou confirmação nos estudos histoquímicos

de MARQUES (informação pessoal). Esta mostrou a ocorrência de

cristais de carbonato de cálcio no lúrnen da porção proximal dos

túbulos de Malpighi das la~vas de R. americana. A ocorrência

dêsses cristais e com essa mesma localização já havia sido de­

monstrada em outros insetos, inclusive em Diptera (CLARK, 1958).

A partir dessa demonstração e urna inspeção nas Tabelas XXIV e

XXV, torna-se possível admitir com segurança que o CaC03 do

casulo provém dos túbulos de Malpighi. ° acúmulo de "carbonato

de cálcio nos túbulos de Malpighi durante o desenvolvimento lar­

vaI e a sua posterior eliminação encontra paralelo em vários in-

setos e tem:

cálcio, (CLARJ

As

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postos de cá:

com base no E

do casulo qUi

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americana, pl

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pri.ncipalmen1

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da secreção

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com os incren

nos mesmos PE

39P --I 49P,

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3. perde 62% de

te a constitui

~so-sêco. Re­

também em ou­

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! a observação

irgãos da lar­

IS componentes

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!tizadas e ar­

L. Entretan­

:e refe'rido na

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:uvial e/ou

além das fe­

.10, conforme

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entes do cas~

as proteínas

ue O composto

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istoquímicos

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proximal dos

ocorrência

ia sido de­

CLARK, 1958).

elas XXIV e

o Cac03 do

e . carbonato

lvimento lar­

em vários in-

-105-

setos e tem sido interpretado como um mecanismo de excreção de

cálcio. (CLARK, 1958).

As cinzas insolúveis, determinadas no casulo devem pro­

vir também dos túbulos de Malpighi. E' possível que sejam com­

postos de cálcio diferentes de caC03 . Essa hipôtese é levantada

com base no excesso de caC0 3 calculado a partir do conteúdo de Ca

do casulo quando comparado com o caC03 calculado a partir do ma­

terial hidroinsolúvel e ácido acético solúvel do casulo (Tabela

VIII'e IX e texto correspondente). ° composto de cálcio mais

provável a corresponder às cinzas insolúveis é fosfato de cálcio,

que já foi encontrado nos tUbulos de Malpighi de várias larvas de

insetos (CLARK, 1958).

A fração insolúvel do casulo corresponde à sêda de ~.

americana, produzida pelas glândulas salivares. Essa conclusão

resulta da observação direta de que o casulo é feito por urna sêda

produzida por essas glândulas salivares (labiais) e um material

similar a fezes. Êste material similar a fezes deve corresponder

pelo menos em parte, ao CaC03 , que provém dos tÚbulos de Malpi­

ghi, enquanto que a séda deve corresponder ao restante dacomposi

ção do casulo, isto é, à fração insolúv~l. Uma evidência a favor

disto é o fato do casulo I, que apresenta pouco material similar

a fezes e é quase que sômente feito por fios de sêda, ser formado

pr~ncipalmente pela f~ação insolúvel (Tabela XIII). Além do mais,

a composição da sêda, obtida a partir de determinações' químicas

da secreção salivar colhida pouco antes do início do processo de

fiação (fim do 29 período do 49 estádio) mostra que elà é rica em

proteínas com composição aminoacídica similar àquela das protéi­

nas insolúveis do casulo 111 (BIANCHI, 1972). Além disso, a mas­

sa média de proteínas secretadas pela glândula salivar, por dia,

em vários perlodos da produção do casulo, concorda bastante bem

com os incrementos médios diários da proteína do casulo, medidos

nos mesmos períodos. ~sses, incrementos para os intervalos de

39P ~ 49P, 49P ~ 59P e 59P ~ Pupa farata são: 54, 117 e.

276 ~g/dia/larva, respectivamente (Tabela XV), enquanto que as

massas de secreção protéica, produzidas por dia, pela glândula s~

liva~ nos mesmos intervalos são: 42, 102 e 90 ~g/dia/larva, res­

pectivamente (BIANCHI, 1972). A discrepância nos resultados cor­

respondentes ao -último intervalo seguramente é inferior à apre-

III1I1

111'1I~U

U!II~'I

1~11_11,

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l;!ltI~I'"

1111

~~,

II,,~iil!~

,ri

-106-

sentada, porque o resultado obtido no casulo pode estar superesti

mado (Tabela XV) enquanto que aauêle da glândula salivar deve es­

tar subestimado (BIANCHI, 1972).

o conteúdo de carboidratos da secreçao e, entretanto,

be~ inferior ao determinado no casulo III (BIANCHI, 1972). Essa

discrepância parece ser consequência de uma mudança na composi­

ção da fração insolúvel durante o desenvolvimento, no sentido de

aumentar o seu conteúdo de carboidratos (Tabela XIII e texto cOE

respondente). Urna outra hipótese para ~xplicar a diferença no

conteúdo de carboidratos encontrada entre o casulo e secreção s~

livar seria admitir que a larva de R. americana produzisse sêda

também pelo túbulo de Malpighi. Êsse fenômeno ocorre em vários

Coleoptera e Neuroptera (WIGGLESWORTH, 1965) e está relacionado

com modificações do túbulo de Malpighi e no reto, corno as descri

tas por MAZZI e BACCETTI (1956) para Donus crinitus (Coleoptera)~

Corno essas modificações nao ocorrem em R. americana (MARQUES

informação pessoal), o túbulo de Malpighi em R. americana não d~

ve ter nenhuma atividade secretora de compostos para o casulo,

além do CaC0 3 e, portanto, tôda a sêda deve ser produzida nas

glândulas salivares.

Segundo BIANCHI (1972) a glândula salivar no início do

processo de fiação possui no máximo 136 ug de proteínas de secr~

ção acumulada por larva. Corno o casulo produzido por larva con

tém cêrca de 1170 ug de proteínas na fração insolúvel (Tabela XIV)

pode-se concluir que o animal acumula apenas cerca de 10% de tô­

da sêda que vai utilizar para fazer o casulo antes de parar de

comer e iniciar a fiar. A larva de B. mori comporta-se de manei

ra radicalmente diferente, a maior parte d~ secreção de sua sêda

(cêrca de 70%) é sintetizada e armazenada antes do animal parar

de comer (FUKUDA et alii, 1959). Êsse comportamento diferencial

deve estar ligado , pelo menos em parte, às diferenças anatômi­

cas entre as glândulas labiais dos dois insetos. Enquanto que

as glândulas labiais (sericígenas) de B. mori apresentam na sua

porção mediana um reservatório considerável para a secreção (LU­

CAS, SHAW e SMITH, 1958), as glândulas labiais (salivares) de ~.

americana apresentam apenas um lúrnen relativamente estreito e de

diâmetro pouco variável ao longo da glândula (DREYFUS et alii,

1951).

o fa,

após o animal

car a origem (

na hemolinfa e

valo mais adeq'

tes do 49P os

cia de reserva

gir alterações

mação do anima:

A Tal

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são ·formados q\

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seus precursorE

16% do pêso-sêe

mente a cutícu:

vo. Entretant<

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196 4), e as tJ

tina (WIGGLESWC

não estudada q\

abaixo de 16~

como· representé

seus precursore

A Té

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vem, pelo menOE

cimo de todos E

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dos 350 ug/lan

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~, corno foi Se

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\lar deve es-

:ntretanto,

n2l. Essa

la comoosi­

sentido de

! texto co!.

.ferença no

:ecreção s~

lzisse sêda

, em vários

'elacionado

as descri

oleoptera):­

(MARQUES

~ não d~

casulo,

zida nas

início do

3 de secr~

larva co!}.

rabela XIV)

lO% de tô-

)arar de

de manei

sua sêda

\al parar

ferencial

anatômi­

,anto que

am na sua

eção (LU­

es) de ~.

eito e de

et alii,

-107-

o fato de 90% da sêda de R. americana ser sintetizada

após o animal parar de comer, torna razoável procurar identifi­

car a origem de seus componentes através de análises químicas

na hemolinfa e em vários órgãos durante a sua produção. O inte!.

valo mais adequado para êsse estudo é entre o 49P e o 59P. An­

tes do 49P os resultados tendem a ser prejudicados pela existê!}.

cia de reserva de secreção na glândula e após o 59P devem sur­

gir alterações químicas relacionadas com a apólise e transfor­

mação do animal em uma pupa farata .

A Tabela XXX mostra o balanço de proteínas ou seus

precursores na hemolinfa e em órgãos de R. americana que juntos

correspondem a 71% do pêso-sêco total da larva madura. Corno os

tUbulos de Malpighi correspondem a 13% do pêso-sêco da larva e

são 'formados quase que exclusivamente de CaC03 (Tabela XXIV e

discussão acima), pode-se dizer que o balanço de proteínas ou

seus precursores é conhecido em 84% do pêso-sêco da larva. Os

16% do pêso-sêco da larva não estudados correspondem principal­

mente a cutículas, traquéias, parede muscular e tubo digesti­

vo. Entretanto, como as cutículas moles de larvas de Diptera

apresentam cêrca de 50-60% em quitina (RUDALL, 1963, HACKMAN,

1964), e as t~aquéias e o revestimento do intestino contém qui

tina (WIGGLESWORTH, 1965), a porcentagem do pêso-sêco larval

não estudada que pode fornecer precursores de proteínas desce

abaixo de 16%. Dessa forma a Tabela XXX pode ser considerada

como representando um balanço bem completo das proteínas e

seus precursores entre os períodos indicados.

A Tabela XXX e aargurnentação acima tornam muito di­

fícil admitir que as proteínas insolúveis do casulo não deri­

vem, pelo menos em parte, das proteínas da hemolinfa. O decré~

cimo de todos precursores, excluído as proteínas da hemolinfa

é de 199 ~g/larva, enquanto que nêsse período são sintetiza­

dos 350 ~g/larva de proteínas insolúveis do casulo.

Se cisteína for aminoácido essencial para R. america­

~, como foi sugerido no ítem A2 acima, sua presença nas pro­

teínas insolúveis do casulo (Tabela XI) só poderia ser explicada

adequadamente, admitindo-se que essas proteínas s~o feitas, pelo

l~i

1111"1IIHIi,

I~I'

11;t:

I'~II,111;

WIH

Iflll'lili):

11'11..,11

ltl~'""bil

~"i,

-108-

menos parcialmente, a partir das proteínas da hemolinfa. Isso é

necessário porque a hemolinfa não possui cisteína livre (Tabela

11) e nem ligada a peptídeos (Tabela 111).

TABELA XXX

Balanço dos possíveis contribuintes de precursores das proteínas

insolúveis do casulo e incremento dessas, no intervalo do 49P ao

S9P do 49 estádio deR. americanal

BI

secreção sal

em diferente

de incorpora

salivar em à

teínas da

do casulo,

linfa, enqua

glândula.

glângula sal

pos a sua hi

1. Discussão no texto.

2. Segundo BIANCHI (1972).

3. Calculado a partir da hipótese de que a concentração de aminoácidos livres da glândula salivar é a mesma da hemolinfa eque a densidade dessa glândula é 1,00.

4. Calculado a partir da Tabela xx.5. Decrescimo do pêso-sêco do corpo gorduroso, após subtração

do decréscimo do conteudo-de glicogênio no mesmo período.Calculado a partir da Tabela XXIII.

6. Calculado a partir da Tabela XVI.

7. Retirado da Tabela XIV.

Possível contribuinteOu

Proteínas do casulo

Proteína da glândula salivar2

Aminoácidos da glândula salivar3

Aminoácidos da hemolinfa4

peptídeos da hemolinfa4

Corpo gordurosoS

Proteínas da hemolinfa6

Proteínas insolúveis do casul07

llg/larva

decréscimo incremento

o

38

12

23

126

700

350

Se

feita apart

um reflexo d

Em Resultado

ja queda em .

do total da

quêles que p

fôrem consid

dos tornarn-s·

que mais dim

na hemolinfa

leucina (Tab·

que ocorrem '

cente: treon.

se vê, os re

síntese de p:

vres da hemo

nas da hemo1

A·

das larvas d

ria das la

de uma adapt

utilizadas e

A

glândula sal

carboidratos

demais carbo

-109-

Linfa. Isso élivre (Tabela

das proteínas

valo do 49P ao

rva

incremento

350

:ação de amin~lemolinfa e

subtração, período.

BIANCHI (1972) propôs a partir de eletroferogramas da

secreç.ão salivar e da glândula salivar "in vivo" e "in vitro",

em diferentes períodos larvais, assim corno a partir de cinéticas

de incorporação de aminoácidos marcados em proteínas da glândula

salivar em diferentes circunstâncias, que cêrca de 60% das pro­

teínas da secreção salivar (que corresponde à fração insolúvel

do casulo, ver acima) provém diretamente das proteínas da hem~

linfa, enquanto que os outros 40% são sintetizados na própria

glândula. Esta síntese utilizaria os aminoácidos livres da

glângula salivar e/ou hemolinfa ou as proteínas da hemolinfa a­

pós a sua hidrólise.

Se parte da síntese de proteínas da secreção salivar éfeita a partir dos .aminoácidos da hemolinfa, seria de se esperar

um reflexo dessa síntese na composição aminoacídica da hemolinfa.

Em Resultados foi ressaltado o fato de queaquêles aminoácidos cE

ja queda em moles, ao passar do 39P ao 59P correspondem a 70%

do total da queda dos aminoácidos da hemolinfa são justamente a­

quêles que perfazem 29% da proteína insolúvel do casulo 111. Se

fôrem considerados apenas os aminoácidos essenciais, os resulta­

dos tornam-se ainda mais reveladores. Os aminoácidos essenciais

que mais diminuem em moles, por ordem decrescente de grandeza,

na hemolinfa entre o 39P e 59P são: treonina, valina, isoleucina,

leucina (Tabela XX); enquanto que aquêles aminoácidos essenciais

que ocorrem em maior quantidade no casulo são, por ordem decres­

cente: treonina, leucina, valina e isoleucina (Tabela XI). Corno

se vê, os resultados são indicativos de que pelo menos parte da

síntese de proteínas do casulo é feita a partir de aminoácidos li

vres da hemolinfa, enquanto que a outra parte deriva das proteí­

nas da hernolinfa.

A ocorrência de uma concentração protéica na hemolinfa

das larvas de R. americana maior do que a apresentada pela maio­

ria das larvas de insetos (Tabela V), talvez seja consequência

de uma adaptação dêsse animal, pelo fato dessas proteínas serem

utilizadas em parte na produção do casulo.

A síntese dos carboidratos insolúveis do casulo pela

~lli

nu:~iI1

:'II[III!

111111,:

~III

IK~I'I!lll

'1glândula salivax' tem que

carboidratos presentes na

demais carboidratos antes

utilizar, corno precursores imediatos.

glândula salivar ou na hemolinfa. Os

de poderem ser utilizados na síntese

-110-

tem que ser primeiro liberados na hemolinfa. Os carboidratos

que podem ser liberados na hemolinfa após hidrólise incluem a

qui tina cuticular e o glicogênio presente nos vários tecidos co­

rno corpo gorduroso, masculatura e células do tubo digestivo. A

quitina cuticular, entretanto, só é hidrolizada sob a açao do

fluído exuvial e seus produtos transferidos para a hemolinfa,

nas vésperas da muda pupal (BADE e WYATT, 1961). enquanto que o

glicogênio que é mais fàci1mente mobilizado para a hemolinfa na

forma de trealose, pertence ao corpo gorduroso (KILBY, 1963).

·.TABELA XXXI

ga~ta, mantend

linfa (Cf. HOR

hormônio da "c

tração de trea

gorduroso (STE:

do glucagon e:

1965; WIENS e

A ut

facilitada pel

enzima que cli·

1963) •

Balanço dos posslveis contribuintes de precursores dos carboi­

dratos insolúveis do casulo e incremento dêsses no intervalo do

49P ao S9P do 49 estádio de R.americanal 3. Mecanism

1. Ver discussão.2. Segundo BIANCHI (1912)3. Calculado a partir da Tabela XIX4. Calculado a partir da Tabela XXIII5. Retirado da Tabela XIV

\Jg/larva

Glicogênio do

.. ·decrés·cimo

A fi,

lar àquela des

liberação da

da hemolinfa s

tração da musc

te demonstrado

na glàndula sa

secreção por c

secreção da s,

res àquelas da

é, a secreçao

vários solvent,

altamente inso

10,7

106

incremento

18

154.. 4

corpo· ·gorduroso

insolúveis do casuloS

Possível.contribuinteou

Cqrboidratos do casulo

Carboidratos

~lândula salivar 2

Hemolinfa3

A Tabela XXXI mostra o balanço dos possíveis contribu­

intes de precursores dos carboidratos insolúveis do casulo.

Conforme pode-se concluir da Tabela XXXI e da a~gurnentação aci­

ma, oglicogênio do corpo gorduroso é o grande fornecedor de

precursores de carboidratos.

O corpo gorduroso é capaz de sintetisar t.realose e

liberá-la para a hemolinfa na mesma velocidade com que essa é

Estu,

noptera mostra:

te organizada,

raleIas (RUDAL:

ção no fio de :

dêsses filamen·

drodinâmi.cas

tivas e produz.

levanta ainda,

sêda por Bomby:

bre a estrutur,

::arboidratos

~ incluem a

tecidos co­

Lgestivo. A

a ação do

l hemolinfa,

Iuanto que o

!molinfa na

~, 1963).

los carboi­

ntervalo do

ncremento

10,7

106

; contribu­

lo casulo.

ltação aci­

lecedor de

t.realose e

ue essa é

-111-

gaeta, mantendo constante a concentração de carboidratos ha hem~

linfa (Cf. HORIE,l960). Essa conversão está sob contrôle de um

hormônio da "corpora cardíaca" que é capaz de aumentar a concen­

tração de trealose na hemolinfa às custas do glicogênio do corpo

gorduroso (STEELE, 1961) e cujos efeitos são similares àqueles

do glucagon em fígado de mamíferos (STEELE, citado em KILBY,

1965; WIENS e GILBERT, 1967).

A utilização da trealose da hemolinfa pelos tecidos é

facilitada pela ocorrência generalizada da trealase (EC3.2.l.28)

enzima que cliva a trealose em duas moléculas de glicose (KILBY,

1963) •

3. Mecanismo e regUlação da produção do casulo

A fiação da sêda em R. americana ocorre de forma simi­

lar àquela descrita para Bombyx(LUCAS, SHAWe SMITH, 1958). A

liberação da secreção da sêda é feita por pressão hidrostática

da hemolinfa sôbre a glândula salivar como consequência de con­

tração da musculatura corporal da larva. Isso pode ser fàcilmeg

te demonstrado pela constatação da inexistência de musculatura

na glândula salivar (MARQUES; informação pessoal), e obtenção de

secreção por compressão do corpo da larva (BIANCHI, 1972). A

secreção da sêda de R. americana apresenta propriedades simila­

res àquelas da sêda de Bombyx (LUCAS, SHAW e SMITH, 1958), isto

é, a secreção é expelida cómo um fluído esverdeado solúvel em

vários solventes, mas que após ser submetido a tensões torna-se

altamente insolúvel.

Estudos realizados com glândulas sericígenas de Hyme­

noptera mostraram que a secreção da sêda encontra-se ali altameg

te organizada, na forma de filamentos dispostos em fileiras pa­

ralelas (RUDALL, 1965). Segundo êsse mesmo autor, a transforma­

ção no fio de sêda insolúvel seria consequência do deslizamento

dêsses filamentos, uns sôbre os outros, sob ação de fôrças hi­

drodinâmicas e tensões permitindo· o contato de extremidades re~

tivas e produzindo novas ligações entre os filamentos. O autor

levanta ainda a possibilidade de ocorrer o mesmo na produçãó da

sêda por Bombyx mori, embora não exista estudos nêsse animal sô­

bre a estrutura da sêda dentro das glândulas sericígenas e o cog

Ilil

IIII

~:;

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mil"h,

I"!II.;~

~Il~

111"

-112-

ceito mais aceito para a transformação da secreção da sêda em fio

insolúvel nêsse animal seja baseado na alteração da conformação

das moléculas protéicas, de uma forma dobrada, para outra comple­tamente distendida.

Observações preliminares realizadas, durante a elabora­

ção desta tese, com microscópio de fase na glândula salivar de

R. americana, indicaram a presença ali de uma certa organização

do material, embora não no nível observado em Hymenoptera (Cf.

RUDALL, 1965). Essas observações sugerem que a transformação

da secreção da sêda em um fio insolúvel em R.americana pode ocor

rer segundo o mesmo mecanismo descrito por RUDALL (J.965).

A regulação hormonal do processo de fiação é pouco co­

nhecida, embora haja evidências em Lepidoptera de que ecdistero­

na (20-hidroxi-ecdisona) seja um fator importante para a promo­

ção e manutenção da síntese de fibroína na divisão posterior da

glândula sericlgena no período larval (SHIGEMATSU e MORIYAMA,

1970) e de que o início da fiação dependa de um baixo título de

hormônio juvenil (WIGGLESWORTH, 1970).

A liberação de cac03 pelos tÚbulos de Malpighi de ~­

ricana poderia ocorrer pela conjugação de dois fat?rea: pressão

hidrostática da hemolinfa sôbre os. túbulos como consequência de

contraçôes corporais da larva e ação da musculatura presente nos

dutos comuns de cada par de túbulos de Malpighi •. tste tipo de

musculatura é comum entre os Diptera (PATTON, 1953) e,R. america­

na não é exceção (MARQUES, informação pessoal). No início da

fiação, os dutos comuns dos túbulos de Malpighi estariam fechados,

impedindo que a pressão hidrostática da hemolinÍa, consequente de

contrações corporais da larva, ocasionasse a liberação de CaC03 .

Posteriormente, os dutos se abririam, permitindo a saída de cris­

tais de Cac03 , sob ação da pressão hidrostáti~a da hemolinfa. t~

te mecanismo é perfeitamente compatível com os resultados apreseQ

tados na Tabela XV, que mostram uma liberação de caC03 muito pe­

quena no início da fiação, seguido de um grande aumento alguns di

as depois. A Tabela mostra também que a produção da sêda é inte~

sa durante tôda a fiação, o que indica a ocorrência de elevada

pressão hidrostática durante todo êste período, devido ao fato

de que essa pressão é necessária para a liberação da secreção da

sêda (ver acima).

A:

par de túbulc

estado atual

colha entre

é i.nteressan1de Malpighi (

nas "corpora

xemplo, em Lc

WM

túbulos de Mê

intestino con

p.:los túbulos

lar também pc

de loialpighi à

A o

guardar, entre

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Il'~,'

da sêda em fio

da conformação

i outra comple-

mte a elabora­

lula salivar de

·ta organização

lenoptera (Cf.

transformação

~ pode oco!:J.965) •

ão ê pouco co­

que ecdistero­

para a promo­

posterior da

e MORIYAMA,

üxo tí tulo de

)ighi de R. ame­

~es: pressão

;equência de

presente nos

:ste tipo de

e iR. america-

I início da

,riam fechados,

'onsequente de

ão de Caco3 .

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hemolinfa. ts

tados apresen

D3 muito pe­

nto alguns di

sêda é inten

:!e elevada

:!o ao fato

secreção da

I

-113-

A regulação da musculatura dos dutos comuns de cada

par de tUbulos de Malpighi poderia ser nervosa ou hormonal. °estado atual dos conhecimentos em R.americana não permite a es­

colha entre nenhum dos dois processos de regUlação. Contudo,

é j,nteressante notar que a regulação da musculatura dos tUbulos

de Malpighi de alguns insetos é feita por um hormônio produzido

nas "corpora allata", similar à adrenalina, corno ocorre, por e­

xemplo, em Locusta migratoria (CAMERON, 1953)~

WATERHOUSE (1950) propôs que os grânulos presentes nos

tUbulos de Malpighi de Lucilia cuprina seriam descarregados no

intestino como consequência de um aumento na tomada de fluídos

pelos tUbulos de Malpighi no estágio pupal. Um mecanismo simi­

lar também poderia explicar a liberação de caC0 3 pelos tUbulos

de Malpighi de R. americana.

A opçao entre os dois mecanismos propostos deverá a-

guardar,entretanto, a expansão dos estudos de fisiologia dos

tUbulos de Malpighi em R. americana.

illil:

\li'l

:I::~

11''''1

~S~O

Os resultados obtidos nesta tese podem ser distribuídos

em três grandes grupos: composição química da hemolinfa e do casu

lo coletivo e determinação química de alguns componentes princi­

pais do corpo gorduroso e tUbulos de Malpighi ao longo do desen­

volvimento.

Os principais resultados referentes à química da hemo­

linfa de larvas maduras são:

1) A hemolinfa possui uma densidade 1,043, pH = 7,27,

osmolaridade 216 miliosmoles e corresponde a 37% do pêso-úmido

do animal e 26% de seu pêso-sêco. A hemolinfa não se coagula e

possui um volume de células correspondente a 0,3% de seu volume

total.

2) A análise química realizada deu conta de 88% do pe­

so-sêco total da hemolinfa e revelou que entre os componentes pre

sentes mais importantes em massa estão as proteínas, seguidas dos

aminoácidos livres, enquanto que os osmõticamente mais ativos sao* +os aminoácidos livres seguido de Mg e Na. Entre os aminoáci-

dos é notável a presença de ornitina e cistationina em concentra­

ções relativamente elevadas e a ausência, mesmo em traços, de cis

teína e/ou cistina e citrulina.

3) Os peptídeos ocorrem em concentrações eleyadas, mas

em pequeno número, e são compostos de 2 a 3 resíduos de aminoáci­

dos em média; o mais abundante dos quais deve ser U~ dipeptídeo

de histidina e ácido aspártico.

4) Citrato é o ânion mais importante da hemolinfa, se­

guido dos fosfatos orgânicos, enquanto que trealose é-o principal

carboidrato presente.

5) Existem pelo menos 6 carotenóides ligados de forma

não covalente a proteínas da hemol~nfa e uma cromoglicoproteína,

de côr amarelo-limão, fluorescente, de natureza desconhecida. Os

1

carotenóides mai

e um similar ao

A compo

da muda pupal é

34% de proteínas

dos solventes ut

HCl 2N, KOH 1M e

4% de cinzas nao

parcialmente ide

enquanto que 4%

O corre

casulo, tUbulos

volvimento, poss

1) A fr

dratos) correspc

da larva, enquan

Malpighi.

2) As p

nos em parte, da

boidratos devem

Os res~

veis significac

~nfase é dada na

orgânicos e inor

de secreção da s

iIn'

distribuídos

nfa e do cas!:,!

entes princi­

ngo do desen-

mica da hemo-

3, pH = 7,27,

do pêso-úmido

se coagula e

seu volume

:le 88% do pê­

nponentes pr~

seguidas dos

Ls ativos são

)s aminoáci­

~m concentra­

~aços, de cis

Leyadas, mas

de aminoáci­

lm dipeptídeo

!molinfa, se­

,- O principal

dos de forma

icoproteína,

nhecida. Os

l

~1l5-

carotenóides mais importantes quantitativamente sao: a-caroteno

e um similar ao astaceno.

A composição em massa do casulo coletivo na véspera

da muda pupal é a seguinte, em números inteiros: 44% de CaC03

;

34% de protelnas e 10% de carboidratos~ambos insolúveis em to­

dos solventes utilizados (SDS 10%, uréia 6M, ácido fórmico 50%,

HCl 2N, KOH 1M e Na HC03 1M); 10% de material hidrossolúvel e

4% de cinzas não identificadas. O material hidrossolúvel foi

parcialmente identificado como: proteína (4%), carboidratos (2%) ,

enquanto que 4% ainda permanece desconhecido.

O correlacionamento da análise química da hemolinfa,

casulo, túbulos de Malpighi e corpo gorduroso ao longo do desen­

volvimento, possibilitou ainda as seguintes conclusões:

1) A fração insolúvel do casulo (protelnas e carboi­

dratos) corresponde à sêda secretada pelas glândulas salivares

da larva, enquanto que o caC03 presente provém dos túbulos de

Malpighi.

2) As proteínas do casulo devem originar-se, pelo me­

nos em parte, das proteínas da hemolinfa, enquanto que seus car­

boidratos devem provir do glicogênio do corpo gorduroso.

Os resultados são considerados em têrmos de seus possi

veis significados metabólicos e eventualmente fisiológicos.

~nfase é dada na discussão do papel metabólico dos componentes

orgânicos e inorgânicos da hemolinfa, assim corno dos mecanismos

de secreção da sêda e Cac03

e sua possível regulação hormonal.

II~'

1",1

b

ir

ABSTRACT

Theresults of this thesis are concerned to three main

lines of research: the chemical composition of the hemolymph, of

the cornrnunal cocoon, and the chernical deterrnination of some

components in the rat body and Malpighian tubules along larval

development.

The chief results on the hemolymph chemistry of mature

larvae are:

1) The hemolymph has a density = 1.043, pH = 7.27,

osmolarity = 2l~ rniliosmols and corresponds to 37% of the larva

(Wet-Weight) or to 26% ofthe larva (dry weight). The hemolymph

does not clott and the volume of the hemocytes is 0.3% of blood

total volume.

2) The chemical analysis dealt with 88% (dry-weight)

of the hemolymph and sh0wed that proteins are the most important

component in mass, while free arnino acids, Mg++ and Na+ are· the

most osmotically active substances. Arnong the amino acids

is rernarkable the titres of ornithine.and cystathionine, and the

complete absenceof cysteine and/or cystine and citrulline.

3) There are few peptides, but present in high titres.

They are built of two to' three arnino acids residues,and the most

concentrated of them must be a dipeptide of histidine and as­

partic acid.

4) Citrate and organic phosphates are the most im­

portant anions in the hemolymph. Trehalose is the chief car­

bohydrate present.

5) Thereare at least 6 non-covalentely protein-bound

carotenoids and one lemon-yellow, fluorescent chromoglycopro­

tein of unknown nature.

The chemical composition of the communal cocoon of

R. americana expressed in percentage of its total dry weight

(nurnbers r01

proteins an(

used (10% SI

NaHC03 ) ~ 10\

nown nature.

as: protein

nown.

T~

analy'sis of

body during

1)

carbohydrate

livary glanc

2)

from the h

from the fat

Th

tabolic and

in the discu

ganic compon

the silk sec

monal regula

!d to three main

le hemolymph, of

lation of some

.es along larva1

listry of mature

'43, pH = 7.27,

7% of the larva

The hemolymph

s 0.3% of blood

8% (dry-weight)

most important+.

and Na are· the

amino acids

ionine, and the

itrulline.

in high titres.

~s , and the most

Une and as-

the most im­

the chief car-

protein-bound

:hromoglycopro-

Inal cocoon of

.1 dry weight

J

(numbers rounded to the nearest unity) are: 44% of caC03

; 34% of

proteins and 10% of carbohydrates both insoluble in alI solvents

used (10% 50S, 6M urea, 50% forroic acid, 2N HCl, 1M KOH and 1M

NaHC03 ); 10% of water soluble material and 4% of ashes of unk­

nown nature. The water soluble material was identified in part

as: protein· (4%} and carbohydrates (2%), while 4% remained unk­

nown.

The interrelationship among the results of the chemical

analysis of the hemolymph, cocoon, Malpighian tubules and fat

body during larval developmentwas used to draw the conclusions:

1) The insoluble fraction of the cocoon (proteins and

carbohydrates) corresponds to the silk produced by the larval sa­

livary glands, while caC03 comes from Malpighian tubules.

2) The cocoon proteins must come, at least .in part,

from the hemolymph proteins, while its carbohydrates must come

from the fat body glycogen.

The resu~ts are discusseuin terms of its possible me­

tabolic and eventually physiological meanings. Emphasis is given

in the discussion ofthe metabolic role of the inorganic and or­

ganic components of the hemolymph, as yet in the mecanisms of

the silk secretion and caC03 deposition and their possLble hor­

monal regulation.

I1:~I:

li

IHiIIHII

:~

I"

I

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