ORGANIZAÇÃO

Coordenação Geral da XI Jornada Acadêmica e Mostra Científica do Curso de Farmácia – UEPG

Profa. Dra. Patrícia Mathias Döll Boscardin Profa. Msc. Ana Paula Weber Coordenação da Mostra Científica Profa. Dra. Jane Manfron Budel

COMISSÃO GERAL Professores: Ana Paula Veber, Patricia Mathias Döll Boscardin Acadêmico: Valter Paes de Almeida

COMISSÃO ESTRUTURAL Prof: Edmar Miyoshi Acadêmicos: Guilherme dos Anjos Camargo, Alexandre Alves de Oliveira, Evelyn Assis de Andrade, Leonardo da Rosa Oliveira, Tatiane Schamne, Paula Olsen Sorgatto, Naiara de Oliveira Pazian, Kamila Agda Becher Lins, Elizabete Munhoz

COMISSÃO DE DIVULGAÇÃO Profa: Stella de Bortoli Acadêmicos: Lohanne Elis Cordeiro Paz, Anatchelyn Juliana Peron Barbosa, Bruna Roberta Kruger

COMISSÃO CIENTÍFICA Profa: Jane Manfron Budel Acadêmicos: Laís Costa Ayub, Luiza Stolz Cruz, Maryana Albino Clavero

COMISSÃO DE PATROCÍNIO Profs: Mariane Ferreira de Faria, Bruno Ribeiro Cruz Acadêmicos: Daiandra Fátima da Rosa Colarites, Mariana Vettorazzi, Letícia Martins, Lislaine Maria Klider

COMISSÃO DE CONFRATERNIZAÇÃO Acadêmicos: Pamella Cristina Oliveira Françóia, Fernanda Cristine Carneiro, Jessica Bianca de Souza

SECRETARIA Prof: Júlio César Miné Acadêmicos: Millena Bayer, Jéssica Schemin, Milena de Oliveira, Larissa Seniv, Bruna Ribeiro da Costa, Andressa Ivoglo Van Mierlo, Ana Paula Mikota Tavela

TESOURARIA Profa: Fernanda Malaquias Barboza Acadêmicos: Claudia Daiane Stefanczak, Lorena Miná Rodrigues

APRESENTAÇÃO

É com grande satisfação que comunicamos a realização da XI Jornada Acadêmica e

Mostra Científica de Farmácia – UEPG no período de 29 de setembro a 01 de outubro de 2015. A Jornada é uma realização do Centro Acadêmico de Farmácia Jayme Gusmann em parceria com o Colegiado do Curso de Farmácia e com os Departamentos de Farmácia e de Análises Clínicas e Toxicológicas da Universidade Estadual de Ponta Grossa.

Este evento é de grande valor para o aprimoramento e atualização dos conhecimentos dos acadêmicos e pós-graduandos do curso de Farmácia, além de proporcionar a troca de saberes e oportunizar o contato com pesquisadores de outras universidades, institutos de pesquisa e indústrias.

Este ano a XI Jornada Acadêmica e Mostra Científica de Farmácia abordará temas relacionados principalmente às novas possibilidades de atuação do profissional farmacêutico.

Profa. Dra. Patrícia Mathias Döll Boscardin Profa. Msc. Ana Paula Weber

PROGRAMA

APRESENTAÇÕES EM POSTERS

TRABALHO 1

Redução enantiosseletiva da acetofenona e p-nitroacetofenona utilizando micro-organismos como biocatalisadores

Raphael Vieira Lopes (IC) E-mail: pharmarapha@gmail.com Tatiane Schamne (G) E-mail: tatianeschamne@hotmail.com

Luciana de Boer Pinheiro de Souza (PQ) E-mail: lucianaboer@gmail.com Sônia Alvim Veiga Pileggi (PQ) E-mail: savpileggi@onda.com.br

Adriana Knob (PQ) E-mail: adriknob@gmail.com Eduardo Sidinei Chaves (PQ) E-mail: eschaves@utfpr.edu.br

Luciano Fernandes (PQ) E-mail: lucofernandes@yahoo.com.br Luciano Moro Tozetto (PG) E-mail: lmtozetto@utfpr.edu.br

G – aluno de graduação; PG – aluno de Pós-Graduação; IC – aluno de iniciação científica regularmente registrado na Instituição de Ensino; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: A obtenção de compostos enantiomericamente puros é alvo das indústrias farmacêuticas, já que as mudanças conformacionais entre enântiomeros acarretam alterações na atividade biológica de fármacos. Um método conhecido para obtenção desses compostos é o uso de enzimas nas reações de síntese, biocatalisadores específicos que apresentam enantiosseletividade e alta eficiência de catálise. A utilização de micro-organismos como fonte de enzimas para reações de redução assimétrica de cetonas pró-quirais, é uma técnica bem estabelecida na área da biocatálise. Nesse contexto, este trabalho visou estudar através das reações de redução da acetofenona e da p-nitroacetofenona, o potencial biorredutor de sete cepas fúngicas isoladas do solo e da Mata Atlântica do Paraná. As reações de biocatálise foram acompanhadas por cromatografia gasosa com coluna capilar quiral e comparadas ao padrão do álcool quiral e da cetona de partida. Através dos cromatogramas calculou-se as porcentagens de conversão e o excesso enantiomérico do produto das reações. Das cepas testadas, cinco converteram a p-nitroacetofenona no respectivo álcool, sendo que três apresentaram cerca de 90% de conversão, variando em seus valores de excesso enantiomérico. No que diz respeito à redução da acetofenona, três cepas realizaram a conversão no álcool correspondente, apresentando valores significativamente baixos nos dois aspectos analisados. Concluiu-se que de todas as reações as que tiveram como substrato a p-nitroacetofenona apresentaram os melhores resultados, destacando-se a cepa fúngica denominada BU, a qual teve excelentes valores de conversão e excesso enantiomérico. Palavras-chave: biocatálise, redução, enantiosseletividade. 1. Introdução Segundo Solomons (2007), uma molécula quiral é definida como aquela que não é idêntica a sua imagem especular, não sendo sobreponíveis uma a outra. Esse atributo geométrico é característico de substâncias que possuem um ou mais centros quirais, que são átomos que em todas as suas ligações possuem substituintes diferentes. Uma molécula quiral e sua imagem no espelho são chamadas de enantiômeros, os quais possuem as mesmas propriedades físicas, diferenciando-se apenas em sua conformação espacial. A maioria das substâncias que compõe os seres vivos são quirais, como por exemplo, enzimas, DNA, anticorpos e hormônios. Atualmente sabe-se que substâncias farmacológicas usadas como princípio ativo de medicamentos, não devem ser empregadas na forma de racematos, já que a diferença entre as formas espaciais de um par de enantiômeros produz alterações em suas propriedades biológicas, influenciando na atividade do fármaco (PILLI, 2001; RODRIGUES, 2001). A obtenção destes compostos em sua forma enantiomericamente pura é, sem dúvida, uma das mais promissoras aplicações da biocatálise.

Um método conhecido para obtenção de compostos enantiomericamente puros é o uso de enzimas, que comumente vêm sendo empregadas na transformação de moléculas bioativas (FABER, 2007). As enzimas são proteínas de alto peso molecular, que atuam como biocatalisadores específicos e eficientes, devido à composição e conformação de seu sítio ativo. São classificadas segundo a União Internacional de Bioquímica e Biologia Molecular em seis grupos principais, conforme as reações por elas catalisadas: oxidoredutases, transferases, hidrolases, isomerases, liases e ligases. A aplicação de enzimas como catalisadores em reações orgânicas tem sido objeto de muitos estudos devido às vantagens que apresentam quando comparados aos catalisadores convencionais. As principais são a alta estereosseletividade dos produtos obtidos, o uso de condições reacionais brandas, e serem ambientalmente aceitáveis, pois são totalmente degradáveis. A utilização de microrganismos como fonte de enzimas para a redução assimétrica de cetonas pró-quirais é uma técnica bem estabelecida na área de biocatálise (PEDRINI, 2009). Embora alguns biocatalisadores sejam extraídos de tecidos animais e vegetais, as enzimas industriais são geralmente obtidas de microrganismos (bactérias, e fungos). Os microrganismos são capazes de produzir milhares de enzimas distintas, já que necessitam delas para suas reações metabólicas. As espécies fúngicas ainda permitem que seu meio de cultivo seja usado como meio reacional, sem que se faça necessário a lise de suas células, pois parte de sua digestão é feita de forma extracelular, onde o organismo secreta enzimas para este meio. O uso dessas enzimas como catalisadores em reações orgânicas, nos permite obter produtos quirais, como álcoois, muitas vezes com grandes proporções de excesso enantiomérico, devido sua enantio, regio e quimiosseletividade. Embora não sejam muito conhecidos por suas atividades farmacológicas, os álcoois quirais são importantes compostos, que podem servir como intermediários ou como blocos de construção quirais (“chiral building blocks”) na síntese de diversos compostos de importância biológica (Figura 1) (TEMBA, 2003). Entre vários exemplos, o (S)-(-)-3-hidróxi-butanoato de etila (1), oticamente ativo, é um dos álcoois quirais mais utilizados como precursor em síntese orgânica; o (S)-(+)-sulcatol (2), é importante insumo para a síntese de outros produtos naturais; o (R)-lavandulol (3), atua como importante aditivo na indústria de perfumes; o (S)-mentol, é um terpeno quiral que possui grande aplicação como aromatizante (4).

CO2Et

OH

(S)-(-) hidróxi-butanoato de etila

(1)

OH

(S)-(+)-sulcatol

(2)

OH

OH

(R)-lavandulol

(3)

OH

(S)-mentol

(4) Figura 1 – Exemplos de álcoois quirais usados nas sínteses orgânicas

O uso de sistemas com células de microrganismos e vegetais, tem conduzido a preparação de álcoois quirais com alta seletividade e rendimento, e na maioria dos casos a formação de compostos com configuração S é observada (CORDELL, 2007). Portanto, é vantajosa a utilização de microrganismos como biocatalisadores alternativos. Na busca pelo biocatalisador ideal, inúmeros estudos de triagem de microrganismos, potenciais produtores de redutases, vêm sendo realizados. A utilização de biocatalisadores em reações de redução de compostos carbonílicos surge como a melhor estratégia para a obtenção de álcoois com alta enantiosseletividade, considerando que as enzimas possuem sítios catalíticos com reconhecimento quiral. 2. Objetivos a) Cultivar cepas fúngicas visando induzir a produção de enzimas desidrogenases; b) Preparar padrões dos alcoóis racêmicos p-nitrofeniletanol e 1-feniletanol via reações de redução com borohidreto de sódio;

c) Utilizar as cepas fúngicas cultivadas em meio líquido como biocatalisadores nas reações de redução da acetofenona e da p-nitroacetofenona, avaliando sua capacidade biorredutora na formação dos seus respectivos alcoóis enantiomericamente puros; d) Propor novas metodologias sintéticas para redução de cetonas a álcoois quirais, utilizando microorganismos como biocatalisadores. 3. Materiais e Métodos 3.1 Meios de cultivo, reagentes, solventes, e biocatalisadores Para os meios de cultivo sólido usou-se batata dextrose Agar (BDA) (Himedia), e para os meios de cultivo líquidos batata comum (adquirida no comércio local), dextrose (Vetec) e água destilada. Como substrato para as reações de redução utilizou-se a p-nitroacetofenona (Aldrich) e a acetofenona (Aldrich) solubilizadas em dimetilsulfóxido (DMSO) (F. Maia). Os padrões racêmicos do (R,S) p-nitrofeniletanol e (R,S) 1-feniletanol foram preparados por redução da p-nitroacetofenona e acetofenona com NaBH4 (Sigma Aldrich) em metanol grau HPLC. Como biocatalisadores para as reações de redução foram utilizadas sete cepas fúngicas, das quais 5 pertencem à coleção da professora Dra. Adriana Knob do departamento de Biologia Geral da UNICENTRO, e outras duas pertencentes à coleção da professora Dra. Sônia Alvim Veiga Pileggi do departamento de Biologia Estrutural e Genética da UEPG, denominadas em: Alt, BU, D6, J3, J38, Mim01 e Tricho. O método de Cromatografia em Camada Delgada (CCD) foi utilizado para acompanhar as reações químicas e biocatalíticas das cetonas. Para isso, utilizou-se cromatofolhas de alumínio em sílica gel (MERCK), como eluente foram utilizados o hexano P.A (Dinâmica) e acetato de etila (Dinâmica) (8:2). Para as extrações líquido-líquido das alíquotas, utilizou-se diclorometano grau HPLC e Sulfato de Sódio Anidro (Sigma Aldrich). Como solvente para análise no cromatógrafo gasoso, foi usado acetato de etila grau HPLC. 3.2 Equipamentos Tanto para a fase de cultivo das cepas fúngicas como para as reações de biorredução foi utilizada incubadora tipo shaker, cedido pela pós-graduação em Biologia Evolutiva da UEPG. As amostras (alíquotas das reações após a extração líquido-líquido) foram analisadas em cromatógrafo de fase gasosa da marca Yang Lin, modelo YL6100, equipado com detector de Ionização de chama – FID, cedido pela Universidade Tecnológica Federal do Paraná, campus de Ponta Grossa, utilizando coluna quiral Cyclosil-B (30m x 0.25mm x 0.25µm de filme) da Agilent J&W CG Colunums. Outros equipamentos utilizados foram: micropipeta, balança analítica, câmara reveladora com lâmpada de UV (254 nm), câmara de fluxo laminar, autoclave, evaporador rotativo e bomba a vácuo. 3.3 Procedimentos 3.3.1 Condições de cultivo das cepas fúngicas Os fungos selecionados foram cultivados em batelada utilizando-se como meio de cultura sólido batata dextrose Agar (BDA). Os meios foram autoclavados a 121ºC durante 20 minutos, e então vertidos em placa de petri estéril. Após resfriamento das placas, foi retirado um fragmento de 5x5 mm de uma cultura já crescida do micro-organismo, e tranferida para uma placa resfriada. Terminado o cultivo de todas as cepas, as placas inoculadas foram levadas à estufa para incubação, e lá permaneceram de 7 a 15 dias, sob temperatura de 28°C. 3.3.2 Procedimento geral para a preparação dos padrões de álcoois quirais. Para obtenção dos alcoóis racêmicos os substratos, p-nitroacetofenona e acetofenona, foram reduzidos com NaBH4 (agente redutor), obtendo-se como produto o (R,S) p-nitrofeniletanol e (R,S) 1-feniletanol . Em um balão de fundo redondo, adicionou-se 2 g (1 equivalente) do substrato cetônico dissolvido em aproximadamente 50 mL de metanol e 5 equivalentes do agente redutor, controlando-se a temperatura do meio reacional (20-25ºC) em banho de gelo. As reações foram acompanhadas por cromatografia em camada delgada (CCD), e após o consumo do material de partida, realizou-se três extrações em funil de separação, com 30mL de diclorometano cada. O resíduo foi submetido à desidratação com NaSO4 anidro, sendo posteriormente rotaevaporado. Os resíduos restantes correspondentes aos alcoóis racêmicos, foram solubilizadados em acetato de etila grau HPLC, e analisados em cromatógrafo em fase gasosa.

3.3.3 Procedimento geral para as reações de biorredução das cetonas Das cepas fúgicas cultivadas em meio sólido tranferiu-se três discos (3,3mm) para erlenmeyers contendo 100 mL de meio líquido, os quais foram levados à agitador orbital tipo shaker a 100 rpm a 28 °C. Após 4 dias do crescimento micelial, adicionou-se 100 mg da p-nitroacetofenona ou 70 µL de acetofenona solubilizadas em 1 mL de DMSO e mantidos sob incubação por mais três dias. Alíquotas foram retiradas dos sistemas reacionais a cada 24 horas, durante três dias, as quais foram submetidas a processo de extração líquido-líquido com acetato de etila grau HPLC. O resíduo gerado foi injetado no cromatógrafo de fase gasosa com coluna quiral, a fim de verificar a formação dos produtos e determinar a eficiência da reação através da porcentagem de conversão (%c) e do excesso enantiomérico (ee). Para cada cepa fúngica foi realizado o procedimento reacional em triplicata. 3.3.4 Análise cromatográfica As análises foram realizadas pela injeção de 1 µL da amostra solubilizada em acetato de etila grau HPLC no cromatógrafo a gás com coluna quiral utilizando métodos diferentes para cada substrato, como demonstra a Tabela 1.

Tabela 1 – Parâmetros para análise em cromatografia de fase gasosa Parâmetro Acetofenona P-nitroacetofenona

Temperatura do injetor 220°C 220°C Temperatura do detector 220°C 220°C

Temperatura inicial 110°C 150°C Taxa de aquecimento 1,5ºC/min 1,5ºC/min

Temperatura final 131°C/min 180°C Tempo final 3 min 5 min

Fonte: do autor

Os compostos foram identificados através da comparação entre os picos dos cromatogramas das amostras e os picos dos cromatogramas dos padrões, verificando os seus respectivos tempos de retenção. 4. Resultados e Discussão Na Tabela 2 apresentam-se as porcentagens de conversão em produto (%c) e as porcentagens de excesso enantiomérico (%ee) para as reações de redução da p-nitroacetofenona biocatalisadas por cepas fúngicas (Figura 2).

O

NO2

p-nitroacetofenona

Cepas fúngicas

28ºC, 100 RPM

OH

NO2

+

OH

NO2

(S)-1-(4-nitrofenil)etanol (R)-1-(4-nitrofenil)etanol Figura 2 – Reação de biorredução da p-nitroacetofenona.

Tabela 2 – Porcentagens de Conversão (%c) e excesso enantiomérico (%ee) obtidas nas reações de biorredução da

p-nitroacetofenona Fungo Tempo (h) %c % ee

BU 24 90,3 70,7 72 92,6 72,1

Alt 24 90,1 6,1 72 92,0 8,8

Tricho 24 - - 72 94,5 43,9

Mim01 24 65,3 42,2 72 65,4 48,1

D6 24 58,4 63,2 72 54,4 64,3

J38 24 - - 72 - -

J3 24 - - 72 - -

Fonte: do autor.

Analisando os dados da tabela 2 observa-se que somente na presença das cepas J3 e J38 não obteve-se formação de produtos. As cepas BU, Alt, Tricho, D6 e Mim01 converteram a p-nitroacetofenona no respectivo álcool quiral, destacando-se as porcentagens de conversão das três primeiras, a qual girou em torno de 90%. Pode-se observar ainda, que já nas primeiras 24 horas de reação as duas primeiras cepas exerceram quase sua capacidade máxima de catálise. No que diz respeito ao excesso enantiomérico, evidentemente a cepa fúngica que teve melhor desempenho foi a BU, com cerca de 71%, seguida das D6, Mim01 e Tricho, que apresentaram cerca de 60%, 48% e 44% respectivamente. Embora tenha uma boa porcentagem de conversão a cepa Alt, apresentou baixos níveis de excesso enantiomérico. As reações foram analisadas por cromatografia gasosa com coluna quiral a fim de verificar a formação dos produtos e determinar a porcentagem de conversão (%c) e o excesso enantiomérico (%ee). Os compostos foram identificados através da comparação com os picos dos padrões nos cromatogramas, verificando os seus respectivos tempos de retenção. As %c e %ee foram determinadas pela área dos picos (Figura 3).

Figura 3 - Cromatogramas das reações da p-nitroacetofenona. a) Padrão químico p-nitroacetofenona; b) Padrão

químico (R,S) p-nitrofeniletanol; c) Reação biocatalítica da p-nitroacetofenona com a cepa BU em 72h.

Para as reações de redução da acetofenona (Figura 4), biocatalisadas pelas mesmas cepas fúngicas, as porcentagens de conversão em produto (%c) e as porcentagens de excesso enantiomérico (%ee) estão apresentadas na Tabela 3.

O

acetofenona

Cepas fúngicas

28ºC, 100 RPM

OH

+

OH

(S)-1-feniletanol (R)-1-feniletanol Figura 4 – Reação de biorredução da acetofenona.

a

b

c

Tabela 3 – Porcentagens de Conversão (%c) e excesso enantiomérico (%ee) obtidas nas reações de biorredução da acetofenona

Fungo Tempo (h) %c % ee

BU 24 - - 72 25,3 63,4

Alt 24 18,7 33,3 72 22,7 76,4

Tricho 24 23,1 30,5 72 37,3 30,4

Mim01 24 - - 72 7,70 100,0

D6 24 - - 72 - -

J38 24 - - 72 - -

J3 24 - - 72 - -

Fonte: do autor Analisando os dados da Tabela 3 observa-se que somente as cepas Alt, BU, Tricho e Mim01 converteram parte da acetofenona no respectivo álcool, apresentando valores de conversão significativamente baixos. A melhor porcentagem de conversão foi observada para a cepa Tricho, seguida da BU, Alt e Mim01, respectivamente. No que diz respeito ao excesso enantiomérico, a cepa que teve melhor resultado foi a Mim01, apresentando 100% de conversão em somente um isômero, embora a conversão em produto tenha sito extremamente baixa. 5. Conclusão Após a análise de todos os dados recolhidos, pode-se concluir que a cepa BU é a mais promissora para a redução dos dois substratos em questão, sendo uma metodologia eficiente na redução de cetonas para formação de álcoois quirais. No que diz respeito a p-nitroacetofenona esta cepa apresentou um dos melhores valores de porcentagens de conversão (92,6%), destacando-se em seu excesso enantiomérico (72,1%). As cepas Tricho e Alt também se mostraram promissoras no que diz respeito as porcentagens de conversão, ficando acima de 90%, embora tenham apresentado baixos excessos enantioméricos. Já em relação à acetofenona, embora o valor de conversão tenha sido pouco expressivo, a cepa BU manteve-se entre as melhores porcentagens de conversão (25,3%), e com um bom excesso enantiomérico (63,4%). Há de se destacar a grande diferença de porcentagens de conversão entre as duas cetonas testadas, fato esse que já era esperado devido à diferença estrutural existente entre elas. A p-nitroacetofenona, apresenta em sua estrutura um grupamento nitro (NO2), que possui como característica a retirada de elétrons do anel aromático, tornando a molécula mais reativa. Referências CORDELL, G.A.; LEMOS, T.L.G.; MONTE, F.J.Q.; MATTOS, M.C. Vegetables as Chemical Reagents. Journal Natural Products. v.70, p.478-492, 2007. FABER, K. Biotransformations in Organic Chemistry. 5 ed. Berlin: Springer-Verlag. p. 402, 2007. PEDRINI, P.; GIOVANNI, P. P.; MANTOVANIA, M.; ANDREOTTI, E.; COLALONGO, C. Reduction screening with endophytic fungi: Synthesis of homochiral secundary alcohols. J. Mol. Cat. B: Enz, v. 60, p. 145-150, 2009. PILLI, R. A. Catálise assimétrica e o prêmio Nobel de química de 2001. Novos paradigmas e aplicações práticas. Quím. Nova na Escola, v. 14, p. 16-24,2001. RODRIGUES, J. A. R.; MORAN, P. J. S. Reduções enantiosseletivas de cetonas utilizando-se fermento de pão. Quím. Nova, v. 24, n. 6, p. 893-897, 2001. SOLOMONS, T. W. G. Química Orgânica, 6. ed. Rio de Janeiro: LTC, v. 1, p.158, 2007. TEMBA, E. S. C.; OLIVEIRA, I. M. F.; DONNICI, C.L. Álcoois quirais: métodos químicos e catalíticos de obtenção por redução assimétrica. Química Nova, v. 26, n. 1, p. 112-122, 2003.

TRABALHO 2

Obtenção de Nanocápsulas contendo óleo essencial de Melaleuca alternifolia e Micropartículas de Polilisina

Rosana Leticia da Rosa (IC) E-mail: rosanaleticia@hotmail.com

Luana Serbai (G) E-mail: lserbai@hotmail.com Daiane Cristine Mirante (PG) daianemirante@hotmail.com

Patricia Mathias Doll Boscardin (PQ) E mail: pattydoll@globo.com Josiane de Fatima Padilha (PQ) E-mail: jopadilha@terra.com.br

G – aluno de graduação; PG – aluno de Pós-Graduação; IC – aluno de iniciação científica regularmente registrado na Instituição de Ensino; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: O desenvolvimento de novos agentes antimicrobianos tem sido alvo de muitas pesquisas devido à resistência constante adaptação dos micro-organismos ao fármaco e consequente resistência bacteriana, além dos efeitos colaterais causados por eles. Algumas alternativas como a nanoencapsulação e microencapsulação de ativos antimicrobianos, que permitem maior tempo do ativo na circulação, menor toxicidade e vetorização do fármaco, têm sido estudadas. Assim, o objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de nanocápsulas poliméricas contendo óleo essencial de Melaleuca alternifolia e micropartículas de ε-poli-L-lisina (ε-PLL). As nanocápsulas revestidas com ε-PLL apresentaram diâmetro médio nanométrico (173,9 nm), potencial zeta positivo e índice de polidispersão de 0,17. As micropartículas foram obtidas pela técnica de secagem por aspersão e apresentaram diâmetro médio de 1099 nm, potencial zeta positivo e índice de polidispersão de 1,00. Palavras-chave: Nanocápsulas; óleo essencial de Melaleuca alternifolia; micropartículas; ε-poli-L-lisina.

1. Introdução Novas alternativas estão sendo pesquisadas como terapia antimicrobiana, pois muitas vezes as já existentes podem provocar efeitos adversos e danos irreparáveis à saúde. Outro fator importante em destaque é a resistência microbiana frente aos diversos agentes antimicrobianos (ANTUNES et al., 2006). Algumas alternativas estão sendo estudadas para que o fármaco seja levado o mais próximo do alvo de ação ou até mesmo intracelularmente, aumentando, assim, a sua ação e diminuindo seus efeitos adversos. Neste sentido, destacam-se as nanocápsulas poliméricas carregadas com antimicrobianos, que promovem a diminuição da toxicidade e, se comparada com formas farmacêuticas convencionais, não resulta em uma perda da eficácia do mesmo (MOHAMMADI et al., 2011). As micropartículas geralmente estão associadas a um polímero, essas apresentam tamanhos que variam de 1 a 1000 micrômetros e podem ser classificadas em microcápsulas ou microesferas conforme sua organização. As microcápsulas formam um sistema do tipo reservatório, onde o núcleo está envolvido por um polímero. Nas microesferas o material a ser microencapsulado pode estar adsorvido, incorporado ou ligado covalentemente a rede tridimensional formada pelo polímero (JAFARI et al., 2008). Segundo kawashima (1993) os sistemas multiparticulas possuem vantagens em relação a sistemas unitários, como redução dos danos locais, uma pequena variação da biodisponibilidade e redução dos riscos de toxicidade, isso se deve a distribuição uniforme e rápida no trato gastrintestinal. Os polimeros e seus derivados estão sendo muito usados para o desenvolvimento de nano e microparticulas encapsuladas de liberação controlada (JAIN, 2000). A ε-poli-L-lisina (ε-PLL) é um homopolimero, esse tem sido muito usado em alimentos devido sua grande atividade antimicrobiana e termoestabilidade. A ε-PLL também está sendo usada em medicamentos, devido sua eficacia em remover seletivamente endotoxinas, reduzindo a toxicidade celular, melhorando a adesão das células, inibindo a atividade da lipase pancreática, e também inibe a produção da

toxina bacteriana bucal (BO, 2014). Segundo Shima a ε-PLL possui uma atividade antimicrobiana contra bactérias gram positivas, negativas e leveduras. A Poli (ε-caprolactona) (PCL) é um poliéster biodegradável, usado na produção de nanoparticulas (KHOEE AND YAGHOOBIAN, 2008). Segundo M. Hakkarainen (2002) a PCL está sendo aplicada em várias formulações de liberação controlada devido sua boa biodegradabilidade e biocompatibilidade com fármacos. Isso garante uma distribuição uniforme do fármaco na matriz e a desejada liberação controlada, podendo levar meses. A nanotecnologia está sendo associada a antimicrobianos, como o óleo da árvore-do-chá (tea tree oil - TTO), também conhecido como óleo essencial de Melaleuca alternifolia (MARKHAM, et al., 2000). Sabe-se que o TTO é obtido através da destilação a vapor das folhas da Melaleuca alternifolia chell (CARSON et al., 2006), dessa forma o óleo essencial de Melaleuca alternifolia chell (MYRTACEAE) tem se mostrado como agente antimicrobiano (Garozzo et al., 2011), antiinflamatório (Brand et al., 2001) e anticancerígeno (Bozzuto et al., 2011). Há poucas evidencias que indicam o TTO com um potencial citotóxico significativo. Existem alguns estudos que avaliam o efeito tóxico do TTO em linhagens de células in vitro, incluindo células epiteliais e fibroblastos (NIELSEN, 2008). Em doses elevadas esse pode se tornar tóxico, ou seja, a toxicidade é dose dependente (HAMMER et.al., 2006). Os queratinócitos são linhagens apropriadas para testes de compatibilidade cutânea (WIEGAND et al., 2009). 2. Objetivo Esse trabalho tem como objetivo desenvolver nanocápsulas contendo óleo de Melaleuca alternifolia chell revestidas com ε-Poli-lisina (ε-PLL) assim como micropartículas de ε-PLL. 3. Materiais e Métodos 3.1 Obtenção da solução de nanocápsulas poliméricas Foram preparadas duas soluções de nanocápsulas, a primeira contendo Poli(ε- caprolactona) (PCL) como parede polimérica. A segunda suspensão foi obtida revestindo a parede polimérica de PCL com ε-Poli-lisina (ε-PLL). As duas suspensões foram obtidas pela técnica de deposição interfacial de um polímero pré-formado, desenvolvida por Fessi et al. (1989). Na preparação das suspensões de nanocápsulas a fase orgânica foi obtida a partir do PCL, onde esse foi solubilizado em acetona a uma temperatura de 40 °C sob agitação magnética constante e seguida da adição de Span 80® e óleo essencial de Melaleuca alternifólia. Essa solução foi gotejada, usando uma bureta (1cm de diâmetro interno) com uma taxa de gotejamento de 1 mL min-1, na fase aquosa constituída por Tween 80®, previamente preparado sob agitação magnética e temperatura de 40°C. Após o termino do gotejamento a agitação foi mantida por mais 10 minutos. O excesso do solvente da suspensão foi evaporado a pressão reduzida em rotaevaporador (Fisatom), a uma temperatura de 40°C, até o volume final de 10 mL, ajustando assim a concentração do óleo essencial de Melaleuca alternifólia em 50 mg mL-1. As suspensões foram mantidas em frasco âmbar sob refrigeração. Para o revestimento catiônico foi preparada uma suspensão de ε-PLL a qual foi mantida sob agitação juntamente com a suspensão de nanocápsulas, preparada previamente, por 30 minutos. 3.2 Caracterização físico-química das nanocápsulas poliméricas 3.2.1 Determinação do potencial Zeta e diâmetro médio O potencial zeta e o tamanho das nanocápsulas de PLL foram determinados em espectrômetro de auto-correlação a laser (MALVERN INSTRUMENTS, modelo Zetasizer Nanoseries ZS90). A solução foi diluída (1:100 v/v) em água Mili-Q. O diâmetro e o índice de polidispersão foram realizados no mesmo equipamento com a mesma proporção de diluição. 3.2.2 Determinação do pH O pH foi determinado em potenciômetro digital (Hanna Instruments), previamente calibrado com tampão 4,0 e 7,0.

3.3 Análise por microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo (FEG)

A avaliação morfológica e de superfície das nanocápsulas foi realizado no microscópio eletrônico de varredura com emissão de campo (TESCAN, modelo Mira3). Foi adicionado 10 µL nas placas de suporte do equipamento e secas a 40 °C na estufa microbiológica (QUIMIS, modelo Q316M4), por 24 horas. As imagens foram obtidas após analise das amostras e os registros ocorreram por meio de software específico. 3.4 Obtenção de micropartículas de ε-poli-L-lisina (ε-PLL) Foi preparada um solução de ε-PLL com concentração de 10 mg mL-1, em seguida essa foi atomizada em um mini Spray -Dryer MSD 0.5 (Labmaq), levando em conta os parâmetros previamente estudados, sendo: fluxo de alimentação 0,15 mL min-1, fluxo de ar 35 L min-1, pressão de ar comprimido de 4 bar, temperatura de entrada do ar de secagem de 60 °C ± 5°C e temperatura de saída do ar de secagem de 90 °C ± 5 °C. 3.5 Análises físico-químicas das micropartículas de ε-PCL 3.5.1 Determinação do pH O pH foi determinado em potenciômetro digital (Hanna Instruments) previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0, diretamente na solução das micropartículas com concentração de 4 mg mL-1. 3.5.2 Potencial Zeta O potencial Zeta foi determinado com solução de micropartículas (1:500 v/v) em água MiliQ no equipamento Zetasizer Nanoseries ZS90 (MALVERN INSTRUMENTS). 4. Resultados e discussão 4.1 Preparação e caracterização das suspensões de nanocápsulas com óleo essencial Melaleuca alternifolia revestidas e não com ε-PLL A obtenção das nanocápsulas de óleo de Melaleuca alternifolia se deu por meio da metodologia proposta. Em seguida essas passaram pelo processo de revestimento com a solução de ε-PLL. A eficiência do revestimento foi avaliado através do potencial zeta (PZ), diâmetro médio (DM) e índice de polidispersão (IPD) das nanocápsulas. Os resultados obtidos estão demonstrados na tabela 1, assim como o das nanocápsulas não revestidas. Tabela 1. Características físico-químicas das nanocápsulas não revestidas e revestidas

PZ DM IPD Nanocápsulas não revestidas - 33 mV 252,2 nm 0,21 Nanocápsulas revestidas com ε-PLL + 11,6 mV 173,9 nm 0,17 Fonte: a autora A figura 1 está demonstrando o PZ das nanocápsulas não revestidas e a figura 2 a mesma analise para nanocápsulas revestidas com ε-PLL. Segundo Avadi et al. (2010) os valores de IPD podem variar entre 0 e 1, onde os próximos a 0 indicam uma dispersão homogênea e os acima de 0,5 heterogêneos. Assim todas as dispersões foram consideradas homogêneas. Em relação ao PZ, Neves et al. (2013) relata que valores absolutos próximos a |30| mV são considerados estáveis, sendo que o fenômeno de floculação ocorre mais facilmente com valores próximos a 0 e 5 mV. O valor positivo +11,6 mV obtido nas nacocápsulas revestidas indica que houve adsorção da ε-PLL na superfície das partículas. De acordo com Calvo et. al. (1997) esse valor refere-se aos grupos aminos da ε-PLL.

Figura 1- Potencial Zeta das nanocápsulas não revestidas

Figura 2- Potencial zeta das nanocápsulas revestidas com

As nanocápsulas apresentaram pH ácido de 5,07, formato esconforme as figuras abaixo, essas foram caracterizados por FEG.

Figuras 3 e 4 - Nanocápsula de óleo de

Figuras 5 e 6 - Nanocápsulas de óleo de 4.3 Preparação e caracterização das As micropartículas de ε-PLL foram preparadas conforme descrito anteriormente. A avaliação se deu pelo meio do potencial zeta, diâmetro médio, índice de polidispersão apresentados na tabela 2.

0

100000

200000

300000

400000

500000T

otal

Cou

nts

Potencial Zeta das nanocápsulas não revestidas

Potencial zeta das nanocápsulas revestidas com ε-PLL

As nanocápsulas apresentaram pH ácido de 5,07, formato esférico e superfície irregular, conforme as figuras abaixo, essas foram caracterizados por FEG.

Nanocápsula de óleo de Melaleuca alternifólia revestida com ε-

Nanocápsulas de óleo de Melaleuca alternifolia não revestidas.

4.3 Preparação e caracterização das micropartículas de ε-PLL PLL foram preparadas conforme descrito anteriormente. A avaliação se

deu pelo meio do potencial zeta, diâmetro médio, índice de polidispersão e pH, os valores estão

-100 0 100 200

Zeta Potential (mV)

Zeta Potential Distribution

Record 8: nano 4 1

férico e superfície irregular,

-PLL.

não revestidas.

PLL foram preparadas conforme descrito anteriormente. A avaliação se e pH, os valores estão

Tabela 2. Avaliação das micropartículas de ε-PLL

PZ DM IPD pH Microparticulas de ε-PCL 14,8 mV 1099 nm 1,00 5,07 Fonte: a autora Os valores obtidos de PZ e pH das micropartículas eram esperados devido aos grupos aminos protonados. A figura 7 está demonstrando o PZ das micropartículas de ε-PLL.

Figura 7- Potencial zeta de micropartículas de ε-PLL.

5. Conclusão

A obtenção das nanocápsulas de PCL com óleo essencial de Melaleuca alternifolia a partir da deposição interfacial foi adequada, pois obteve-se potencial zeta negativo e diâmetro médio de 252,2 nm. Após a adsorção da ε-PLL o esse tornou-se positivo, indicando eficácia do método. Em relação ao índice de polidispersão pode-se considerar a dispersão de nanocápsulas homogêneas. As micropartículas poliméricas obtidas através do processo de secagem por aspersão apesentaram potencial zeta de +14,8 mV e diâmetro médio de 1099 nm. Referências ANTUNES, R. M. P. et al. Atividade antimicrobiana “in vitro” e determinação da concentração inibitória mínina (CIM) de fitoconstituintes e produtos sintéticos sobre bactérias e fungos leveduriformes. Brazilian Journal of Pharmacognosy, v. 16, n. 4, p. 517–524, 2006. AVADI, M. R. et al. Preparation and characterization of insulin nanoparticles using chitosan and Arabic gum with ionic gelation method. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine, v. 6, p. 58–63, 2010. BO, T. et al. Metabolomic Analysis of Antimicrobial Mechanisms of ε Poly L lysine on Saccharomyces cerevisiae. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 62, p. 4454–4465, 2014. CARSON, C. F.; HAMMER, K. A.; RILEY, T. V. Melaleuca alternifolia (Tea Tree) oil: a review of antimicrobial and other medicinal properties. Clinical Microbiology Reviews, v. 19, n. 1, p. 50–62, 2006. COX, S. D., C. M. MANN, J. L. MARKHAM, H. C. BELL, J. E. GUSTAFSON, J. R. WARMINGTON, AND S. G. WYLLIE. 2000. The mode of antimicrobial action of the essential oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil). J. Appl. Microbiol. 88:170-175. FESSI, H. et al. Nanocapsule formation by interfacial polymer deposition following solvent displacement. International Journal of Pharmaceutics, v. 55, n. 1, p. R1–R4, 1989. JAIN, R. A. The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices. Biomaterials, Amsterdam, v. 21, p. 2475-2490, 2000. JAFARI, S. M.; ASSADPOOR, E.; HE, Y.; BHANDARI, B. Encapsulation Efficiency of Food Flavours and Oils during Spray Drying. Drying Technology, v. 26, p. 816–835, 2008. KAWASHIMA, Y.; IWAMOTO, T.; NIWA, T.; TAKEUCHI, H; HINO, T. Uniform and Improved Bioavailability of Newly Developed Rapid and Sustained Release Suspensions of Ibuprofen Microspheres. International Journal of Pharmaceutics, v. 89, p. 9-17, 1993. KHOEE, S., YAGHOOBIAN, M., 2008. An investigation into the role of surfactants in controlling particle size of polymeric nanocapsules containing penicillin-G in double emulsion. Eur. J. Med. Chem., doi:10.1016/j.ejmech.2008.09.045. M. HAKKARAINEN, A.C. ALBERTSSON. Heterogeneous biodegradation of polycaprolactone — low molecular weight products and surface changes, Macromol. Chem. Phys. 203 (2002) 1357–1363. MOHAMMADI, G. et al. Physicochemical and anti-bacterial performance characterization of clarithromycin nanoparticles as colloidal drug delivery system. Colloids and surfaces. B, Biointerfaces, v. 88, n. 1, p. 39–44, 2011. NEVES, A. R. et al. Novel resveratrol nanodelivery systems based on lipid nanoparticles to enhance its oral bioavailability. Int Journal of Nanomedicine, v. 8, p.177-187, 2013. NIELSEN JB. What you see may not always be what you get –Bioavailability and extrapolation from in vitro tests. Toxicol In Vitro. 2008; 22: 1038-42.

SAKATA, S.; UCHIDA, K.; KAETSU, I.; KITA, Y. Programming control of intelligent drug releases in response to single and binary environmental stimulation signals using sensor and electroresponsive hydrogel. Radiat. Phys. Chem., Amsterdam, v.76, p.733-737, 2007. SHIMA, S.; MATSUOKA, H.; IWAMOTO, T.; SAKAI, H. Antimicrobial action of ε-poly-L-lysine. J. Antibiot. 1984, 37, 1449−1455. V.R. SINHA, K. BANSAL, R. KAUSHIK, R. KUMRIA, A. Trehan, Poly-epsilon caprolactone microspheres and nanospheres: an overview, Int. J. Pharm. 278 (1) (2004) 1–23. WIEGAND C, HEINZE T, HIPLER UC. Comparative in vitro study on cytotoxicity, antimicrobial activity, and binding capacity for pathophysiological factors in chronic wounds of alginate and silver-containing alginate. 2009.

TRABALHO 3

Contribuição ao estudo farmacognóstico de Tropaeolum majus L.

Camila Dias Machado (G) E mail: camiladiasmachado@hotmail.com Jane Manfron Budel (PQ) E mail: janemanfron@hotmail.com

G – aluna do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa; PQ – professora do departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa, responsável pela orientação do trabalho.

Resumo: Tropaeolum majus L. caracteriza-se por apresentar propriedades medicinais. É conhecida como capuchinha, capucine, etc. É utilizada popularmente como antiescorbútica, antimicrobiana, anti-inflamatória, anti-hipertensiva, antidepressiva e cicatrizante. Este trabalho teve como objetivo determinar os parâmetros farmacobotânicos presentes nesta planta, a fim de fornecer subsídios anatômicos para serem utilizados na indústria de fitoterápicos. O material foi coletado no horto medicinal da Universidade Estadual de Ponta Grossa e submetido as pesquisas microquímica, microscópica (luz e eletrônica de varredura) e análise do pó. A análise anatômica da lâmina foliar, evidenciou epiderme uniestratificada, sendo as células da face adaxial maiores que as da face abaxial. A cutícula evidenciou-se delgada e lisa. A folha apresenta estômatos do tipo anomocíticos e anisocíticos. Foram observados inúmeros tricomas tectores pluricelulares unisseriados cônicos. Drusas de oxalato de cálcio foram observadas na epiderme foliar e na epiderme da nervura, além disso, cristais prismáticos foram encontrados na epiderme da nervura. O mesofilo é dorsiventral. No caule foram observadas 2 camadas de córtex e 3 camadas de células lignificadas, que reagiram positivamente frente ao reativo floroglucina clorídrica, sendo uma característica jamais visto na literatura. O sistema vascular é constituído por feixes vasculares colaterais livres. A análise do pó atende a todas as exigências estabelecidas para a espécie. As características farmacobotânicas fornecem subsídios para o controle da qualidade na indústria de fitoterápicos. Palavras-chave: Anatomia, controle da qualidade, Tropaeolaceae. 1. Introdução Tropaeolum majus L. (Tropaeolaceae) é uma planta medicinal que apresenta ação antimicrobiana, sendo matéria-prima na indústria de fitoterápicos (ZANETTI et al., 2003; LOURENÇO et al., 2011). É conhecida popularmente como capuchinha, capuchinho, capucine, cinco chagas, nastúrcio, chaguinha, mastruço-do-peru, flor-de-sangue, agrião-do-méxico e papagaios (ALONSO; DESMARCHELIER, 2006; LORENZI; MATOS, 2008; BARBOSA et al., 2012). É considerada uma planta herbácea, perene, cujas folhas são grandes, simples e alternas, com aspecto circular. As flores são membranáceas e lisas, podendo ser de amarelo-alaranjada a vermelho-escuro (RIBEIRO; BARBOSA; COSTA, 2012). A capuchinha é atualmente cultivada em todo mundo, especialmente na Colômbia, Brasil e Perú. É utilizada na medicina tradicional como antiescorbútica, antimicrobiana, anti-inflamatória, anti-hipertensiva, antidepressiva e cicatrizante (ZANETTI, et al., 2003; ALONSO; DESMARCHELIER, 2006; LOURENÇO et al., 2011). Quimicamente contém isotiocianato de benzila e este componente está relacionado à atividade antimicrobiana, antiviral e antitumoral. Além disto, apresenta ácido erúcico, que demonstrou atividade antimicrobiana (ZANETTI et al., 2003, 2004; LOURENÇO et al., 2011). 2. Objetivos Considerando que a primeira análise no controle da qualidade da droga vegetal é a análise anatômica, objetivou-se determinar os parâmetros farmacobotânicos presentes em Tropaeolum majus L., a fim de fornecer subsídios farmacognósticos para serem utilizados na indústria de fitoterápicos. Essa pesquisa faz parte do projeto de extensão intitulado “Horto medicinal do curso de Farmácia: um espaço para o aprendizado farmacognóstico”, no qual estão sendo identificadas e descritas botanicamente todas as espécies cultivadas. 3. Materiais e Métodos Amostras de Tropaeolum majus L. foram coletadas em setembro de 2014, no horto medicinal do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa, campus Uvaranas, Ponta Grossa (30º 10´ S e 51º 20´ W, 27m). Foi realizada a confecção da exsicata, e um representante da espécie se encontra depositado no Herbário da Universidade de Ponta Grossa sob o número HUPG 6782.

O material botânico foi fixado em solução de FAA 70 e armazenados em álcool etílico a 70% (JOHANSEN, 1940; BERLYN; MIKSCHE, 1976). Lâminas semipermanentes foram preparadas com o material seccionado nos sentidos tcoloração de azul de astra e fucsina básica (ROESER, 1972).Para a pesquisa microquímica foram utilizados os seguintes reativos: solução de floroglucina clorídrica para verificação de lignina, Sudan IIIcompostos fenólicos, lugol para amido e ácido sulfúrico para verificação da natureza química dos cristais (JOHANSEN, 1940; FOSTER, 1949; SASS, 1951; BERLYN; MIKSCHE, 1976; OLIVEIRA; AKISUE, 1991). A microscopia eletrônica de varredura da superfície foliar e caulinar foi realizada em alto vácuo e para tal procedimento, as amostras foram desidratadas em série etanólica crescente e pelo ponto crítico e, após montagem em suporte, submetidas à metalização com oumicroscópio eletrônico VEGA3 TESCAN no Laboratório Multiusuários CUniversidade Estadual de Ponta Grossa. Para análise do pó, folhas e caules foram secos a 40ºC e moídos em moinho analítico. O material foi padronizado em tamanhos iguais, cerca de 300mm/µm e analisado em microscopia de luz no laboratório de Farmacognosia da UEPG (BARRETO et al., 2015). 4. Resultados e Discussão 4.1 Análise anatômica da folha

Figura 1

A análise anatômica da lâmina foliar, em secção transversal, evidenciou epiderme uniestratificada, sendo as células da face adaxial maiores que as da face abaxial. Em vista frontal, o revestimento epidérmico apresentou formato sinuoso com paredes anticlinais relativamente delgadas, em ambas as faces. Células volumosas da base dos tricomas podem ser observadas.

Figura 2

A cutícula evidenciou-se delgada e lisa. A folha apresenta estômatos do tipo anomocíticos e anisocíticos em ambas as faces, e estes se localizam no mesmo nível das demais células epidérmicas. Inúmeros tricomas tectores pluricelulares unisseriados cônicos, formados por cerca de 5 células, de ápice agudo e de base bastante alargada podem ser observados na face abaxial. Drusoxalato de cálcio foram observadas na epiderme foliar.

O material botânico foi fixado em solução de FAA 70 e armazenados em álcool etílico a 70% (JOHANSEN, 1940; BERLYN; MIKSCHE, 1976). Lâminas semipermanentes foram preparadas com o material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, à mão livre, e submetido à coloração de azul de astra e fucsina básica (ROESER, 1972). Para a pesquisa microquímica foram utilizados os seguintes reativos: solução de floroglucina clorídrica para verificação de lignina, Sudan III para compostos lipofílicos, cloreto férrico para compostos fenólicos, lugol para amido e ácido sulfúrico para verificação da natureza química dos cristais (JOHANSEN, 1940; FOSTER, 1949; SASS, 1951; BERLYN; MIKSCHE, 1976; OLIVEIRA;

copia eletrônica de varredura da superfície foliar e caulinar foi realizada em alto vácuo e para tal procedimento, as amostras foram desidratadas em série etanólica crescente e pelo ponto crítico e, após montagem em suporte, submetidas à metalização com ou

VEGA3 TESCAN no Laboratório Multiusuários C-LABMU/PROPESP, da Universidade Estadual de Ponta Grossa. Para análise do pó, folhas e caules foram secos a 40ºC e moídos em moinho analítico. O material

tamanhos iguais, cerca de 300mm/µm e analisado em microscopia de luz no laboratório de Farmacognosia da UEPG (BARRETO et al., 2015).

Figura 1 - Tropaeolum majus L. no hábito.

da lâmina foliar, em secção transversal, evidenciou epiderme uniestratificada, sendo as células da face adaxial maiores que as da face abaxial. Em vista frontal, o revestimento epidérmico apresentou formato sinuoso com paredes anticlinais relativamente

lgadas, em ambas as faces. Células volumosas da base dos tricomas podem ser observadas.

Figura 2 - Vista frontal da epiderme abaxial.

se delgada e lisa. A folha apresenta estômatos do tipo anomocíticos e aces, e estes se localizam no mesmo nível das demais células

Inúmeros tricomas tectores pluricelulares unisseriados cônicos, formados por cerca de 5 células, de ápice agudo e de base bastante alargada podem ser observados na face abaxial. Drusoxalato de cálcio foram observadas na epiderme foliar.

O material botânico foi fixado em solução de FAA 70 e armazenados em álcool etílico a 70% (JOHANSEN, 1940; BERLYN; MIKSCHE, 1976). Lâminas semipermanentes foram preparadas

ransversal e longitudinal, à mão livre, e submetido à

Para a pesquisa microquímica foram utilizados os seguintes reativos: solução de floroglucina para compostos lipofílicos, cloreto férrico para

compostos fenólicos, lugol para amido e ácido sulfúrico para verificação da natureza química dos cristais (JOHANSEN, 1940; FOSTER, 1949; SASS, 1951; BERLYN; MIKSCHE, 1976; OLIVEIRA;

copia eletrônica de varredura da superfície foliar e caulinar foi realizada em alto vácuo e para tal procedimento, as amostras foram desidratadas em série etanólica crescente e pelo ponto crítico e, após montagem em suporte, submetidas à metalização com ouro e paládio no

LABMU/PROPESP, da

Para análise do pó, folhas e caules foram secos a 40ºC e moídos em moinho analítico. O material tamanhos iguais, cerca de 300mm/µm e analisado em microscopia de luz no

da lâmina foliar, em secção transversal, evidenciou epiderme uniestratificada, sendo as células da face adaxial maiores que as da face abaxial. Em vista frontal, o revestimento epidérmico apresentou formato sinuoso com paredes anticlinais relativamente

lgadas, em ambas as faces. Células volumosas da base dos tricomas podem ser observadas.

se delgada e lisa. A folha apresenta estômatos do tipo anomocíticos e aces, e estes se localizam no mesmo nível das demais células

Inúmeros tricomas tectores pluricelulares unisseriados cônicos, formados por cerca de 5 células, de ápice agudo e de base bastante alargada podem ser observados na face abaxial. Drusas de

Figura 3

O mesofilo é dorsiventral, sendo constituído por uma camada de parênquima paliçádico típico e por 4 estratos de parênquima esponjoso. Na região mediacolaterais de pequeno porte são envoltos por bainha parenquimática.

Em secção transversal, a nervura central mostra formato praticamente planoepiderme uniestratificada é revesticlorênquima se interrompe e são encontradas 1 camada de colênquima angular e face adaxial e 2-3 na face abaxial. O sistema vascular é formado por um único feixe vascular colateral na região mediana do parênquima fundamental. Cristais prismáticos e drusas de oxalato de cálcio são observados na epiderme da nervura.

Figura 4

O caule apresenta a epiderme uniestratificada com cutícula delgada e estriada. Em secção transversal, este, mostra-se circular e adjacentemente à epiderme, 2 camadas de colênquima angular são observadas. Na sequência, são observadas 2 camadas de córtex e 3 camadas de células lignificadas, que reagiram positivamente frente ao reativo floroglucicaracterística não foi observada nessa espécie em estudo de Zanetti et al., (2004).

Figura 3 - Tricoma tector de base alargada

O mesofilo é dorsiventral, sendo constituído por uma camada de parênquima paliçádico típico e por 4 estratos de parênquima esponjoso. Na região mediana do mesofilo, colaterais de pequeno porte são envoltos por bainha parenquimática.

Figura 3 - Mesofilo foliar.

Em secção transversal, a nervura central mostra formato praticamente planoepiderme uniestratificada é revestida por cutícula delgada e lisa e, subjacentemente, o clorênquima se interrompe e são encontradas 1 camada de colênquima angular e face adaxial e

3 na face abaxial. O sistema vascular é formado por um único feixe vascular colateral na região rênquima fundamental. Cristais prismáticos e drusas de oxalato de cálcio são

observados na epiderme da nervura.

Figura 4 - Nervura central em secção transversal.

O caule apresenta a epiderme uniestratificada com cutícula delgada e estriada. Em secção se circular e adjacentemente à epiderme, 2 camadas de colênquima

angular são observadas. Na sequência, são observadas 2 camadas de córtex e 3 camadas de células lignificadas, que reagiram positivamente frente ao reativo floroglucina clorídrica. Essa característica não foi observada nessa espécie em estudo de Zanetti et al., (2004).

O mesofilo é dorsiventral, sendo constituído por uma camada de parênquima paliçádico típico e feixes vasculares

Em secção transversal, a nervura central mostra formato praticamente plano-convexo. A da por cutícula delgada e lisa e, subjacentemente, o

clorênquima se interrompe e são encontradas 1 camada de colênquima angular e face adaxial e 3 na face abaxial. O sistema vascular é formado por um único feixe vascular colateral na região

rênquima fundamental. Cristais prismáticos e drusas de oxalato de cálcio são

O caule apresenta a epiderme uniestratificada com cutícula delgada e estriada. Em secção se circular e adjacentemente à epiderme, 2 camadas de colênquima

angular são observadas. Na sequência, são observadas 2 camadas de córtex e 3 camadas de na clorídrica. Essa

característica não foi observada nessa espécie em estudo de Zanetti et al., (2004).

Figura 5

O sistema vascular é representado por feixes vasculares colaterais livres (cerca de 9). O floema apresenta forma de U. A medula ocupa o maior volume do caule é formada por células isodiamétricas e de parede delgada. Grãos de amido podem ser encontrados na medula.

Figura 6

O pó atende a todas as exigências estabelecidas para a esde tricoma tector, fragmentos de mesofilo contendo parênquima paliçádico e/ou parênquima esponjoso, fragmentos de esclerênquima, células epidérmicas com paredes anticlinais sinuosas, estômatos anomocíticos. 5. Conclusão As características farmacobotânicas evidenciadas nesse estudo contribuem para a diagnose da droga vegetal e fornecem subsídios para o controle da qualidade na indústria de fitoterápicos. Referências ALONSO, J. & DESMARCHELIER, C. Plantas Medicinales aplicación en atención primaria de la salud. 1.ed. Buenos Aires: Fitociencia, 2006.BARBOSA, A.B. et al.Capuchinha (Tropaeolum majusBARRETO, I.F. et al. Pharmacobotanical Study of the Leaves and Stems of Baccharis ochracea Spreng. for Quality Control. Latin American Journal of Pharmacy, Vol. 34, n.8, 2015.BERLYN, G.P & MIKSCHE J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry1976. FOSTER, A.S. Practical plant anatomy. 2.ed. Princeton: D. Van Nostrand, p. 218, 1949.JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: McGraw Hill Book, p. 41, 1940.LORENZI, H. & MATOS, F.J. Plantas Medicinais no Brasil: nativosPlantarum, 2008. LOURENÇO, E.L.B. et al. Atividade de Tropaeolumde bolsão inflamatório. Arq.Ciênc.Saúde UNIPAR, Vol.15, n.3, p.243OLIVEIRA,F. & AKISUE, G. Fundamentos de farmacobotânciaRIBEIRO, W.S.; BARBOSA, J.A. & COSTA, L.C.D.Brasília: Editora Kiron, 2012. ROESER, K.R. Die Nadelder Schwarzkiefer1972. SASS, J.E. Botanical microtechnique. 2.ed. Ames:Iowa State College, p.97, 1951.ZANETTI, G.D. et al. Toxicidade aguda e atividade antibacteriana dos extratos de Farm.Bonaerense., Vol.22, n.2, p.159-62, 2003.ZANETTI, G.D.; MANFRON, M.P. & HOELZEL, S.C.S.(Tropaeolaceae). Sér.Bot., Porto Alegre, Vol.59, n.2, p.173

Figura 5 - Caule em secção transversal.

O sistema vascular é representado por feixes vasculares colaterais livres (cerca de 9). O floema forma de U. A medula ocupa o maior volume do caule é formada por células

isodiamétricas e de parede delgada. Grãos de amido podem ser encontrados na medula.

Figura 6 - Detalhe do feixe vascular.

O pó atende a todas as exigências estabelecidas para a espécie. São características: fragmentos de tricoma tector, fragmentos de mesofilo contendo parênquima paliçádico e/ou parênquima esponjoso, fragmentos de esclerênquima, células epidérmicas com paredes anticlinais sinuosas,

As características farmacobotânicas evidenciadas nesse estudo contribuem para a diagnose da droga vegetal e fornecem subsídios para o controle da qualidade na indústria de fitoterápicos.

Plantas Medicinales Autóctonas de la Argentina: bases científicas para su . 1.ed. Buenos Aires: Fitociencia, 2006.

Tropaeolum majus L.): classificação morfológica. Brasília: Editora Kiron, 2012.Pharmacobotanical Study of the Leaves and Stems of Baccharis ochracea Spreng. for Quality

. Latin American Journal of Pharmacy, Vol. 34, n.8, 2015. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: Iowa Stat

. 2.ed. Princeton: D. Van Nostrand, p. 218, 1949. . New York: McGraw Hill Book, p. 41, 1940.

Plantas Medicinais no Brasil: nativos e exóticas. 2.ed. Nova Odessa, SP: Instituto

Tropaeolum majus L. sobre a mobilização e migração leucocitária em modelo . Arq.Ciênc.Saúde UNIPAR, Vol.15, n.3, p.243-256, set./dez.,2011.

Fundamentos de farmacobotância. 2.ed. São Paulo: Atheneu, 1991.RIBEIRO, W.S.; BARBOSA, J.A. & COSTA, L.C.D. Capuchinha (Tropaeolum majus L.): classificação morfológica

der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der Natur. Mikrokosmos, Vol. 61, p.33

. 2.ed. Ames:Iowa State College, p.97, 1951. Toxicidade aguda e atividade antibacteriana dos extratos de Tropaeolum majus

62, 2003. ZANETTI, G.D.; MANFRON, M.P. & HOELZEL, S.C.S. Análise morfo-anatômica de Tropaeolum majus

Sér.Bot., Porto Alegre, Vol.59, n.2, p.173-178, jul./dez., 2004.

O sistema vascular é representado por feixes vasculares colaterais livres (cerca de 9). O floema forma de U. A medula ocupa o maior volume do caule é formada por células

isodiamétricas e de parede delgada. Grãos de amido podem ser encontrados na medula.

pécie. São características: fragmentos de tricoma tector, fragmentos de mesofilo contendo parênquima paliçádico e/ou parênquima esponjoso, fragmentos de esclerênquima, células epidérmicas com paredes anticlinais sinuosas,

As características farmacobotânicas evidenciadas nesse estudo contribuem para a diagnose da droga vegetal e fornecem subsídios para o controle da qualidade na indústria de fitoterápicos.

Autóctonas de la Argentina: bases científicas para su

Brasília: Editora Kiron, 2012. Pharmacobotanical Study of the Leaves and Stems of Baccharis ochracea Spreng. for Quality

. Ames: Iowa State University, p.121,

. 2.ed. Nova Odessa, SP: Instituto

L. sobre a mobilização e migração leucocitária em modelo

. 2.ed. São Paulo: Atheneu, 1991. L.): classificação morfológica.

. Mikrokosmos, Vol. 61, p.33-36,

ropaeolum majus L. Acta

Tropaeolum majus L.

TRABALHO 4

A importancia da adequação da amostra na citopatologia cervicovaginal

Autor 1 (G) Bruna Ribeiro da Costa E-mail: bruunarc@hotmail.com Autor 2 (G) Flávia Ferrari Zlzebiela E-mail: flaviaferraizlzebiela@hotmail.com

Autor 3 (G) Caroline Wosniack E-mail: carolinewkro@gmail.com Autor 4 (PQ) Ednéia Peres Machado E-mail: edpmach@ig.com.br

G – aluno de graduação; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: O câncer do colo uterino deve ser detectado na fase inicial. O Ministério da Saúde preconiza que o exame seja realizado em mulheres entre 25 a 64 anos, ou sexualmente ativas. Após dois exames consecutivos negativos, um exame a cada três anos. O exame de Papanicolaou é o método de escolha para esse trabalho preventivo. Porém, erros de coleta, preparação do esfregaço, presença de sangue, infiltrado leucocitário, sobreposição de células e artefatos de fixação podem influenciar na sensibilidade e especificidade do teste podendo resultar em exame falso-negativo. Tendo ciência desses fatores que afetam a qualidade do exame o objetivo deste trabalho foi averiguar a adequabilidade dos esfregaços cervicovaginais coletados nas Unidades Básicas de Saúde Antero de Mello, Cezar Milleo e Antônio Saliba, no município de Ponta Grossa. As análises foram realizadas pelo projeto “Prevenção e educação na atenção à saúde da mulher: coleta de exame Papanicolaou”, no período de 2014. Foram analisadas 116 amostras, das quais apenas 21 foram consideradas satisfatórias por apresentaram células endocervicais no preparado citológico. O presente trabalho demonstra a importância do projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde mulher: coleta de Papanicolaou”, na educação em saúde, no tocante ao preenchimento de lacunas na formação de profissionais, quanto à coleta de material cervicovaginal. Palavras-chave: esfregaço vaginal, neoplasias do colo do útero, junções intercelulares. 1. Informações Gerais - Introdução O colo do útero é revestido por várias camadas de células epiteliais pavimentosas, que podem sofrer alterações e evoluir para uma lesão cancerosa em um período de 10 a 20 anos. O câncer em sua maioria tem evolução lenta passando por fases pré-clínicas que, se identificadas, podem ser tratadas e curadas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). O câncer do colo uterino é o terceiro mais incidente na população feminina brasileira, com uma estimativa para 2014 de 15.590 casos novos. É caracterizado pela replicação desordenada das células do epitélio que reveste o órgão, podendo se estender a órgãos próximos. Existem dois tipos de câncer do colo do útero: carcinoma epidermoide (80% dos casos) e adenocarcinoma (20% dos casos), sendo o último mais raro e mais grave. Em sua fase inicial normalmente não ocorrem sintomas podendo evoluir para sangramento vaginal, secreção anormal e dor abdominal (INCA 2014). Os principais fatores de risco para o desenvolvimento do câncer do colo do útero são: idade precoce na primeira relação sexual, múltiplos parceiros, histórico de infecções sexualmente transmissíveis, HPV, tabagismo, alimentação pobre em alguns nutrientes e uso de anticoncepcional. O pico de incidência desse câncer está entre os 40 e 60 anos de idade (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002). A detecção do câncer é muito importante principalmente em sua fase inicial, para que a intervenção possa ser feita e o tratamento iniciado. O Ministério da Saúde preconiza que o exame seja realizado anualmente em mulheres entre 25 a 64 anos (BRASIL, 2014), ou sexualmente ativas e, após dois exames consecutivos negativos, um exame a cada três anos (AMARAL et al., 2008).

O exame de Papanicolaou é o teste preconizado no Brasil para o rastreamento do câncer do colo uterino. É realizado por raspagem de amostra da ectocérvice com espátula de Ayre e da endocérvice com o auxílio da escovinha cervical. O material é colocado em lâmina, em esfregaço unidirecional, e logo em seguida fixado com álcool 95% ou polietilenoglicol, para manter a integridade das células. Os fixadores reagem com os componentes celulares, sendo que o álcool fixa e o polietilenoglicol protege as amostras através da formação de uma película impedindo a desidratação (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2002; MANRIQUE et al., 2009). Erros de coleta e preparação da lâmina podem influenciar na sensibilidade e especificidade do teste. Fatores como a presença de sangue, infiltrado leucocitário e artefatos de fixação podem comprometer a análise citopatológica. O esfregaço deve ser uniforme sobre a lâmina para evitar a sobreposição de células, e não deve ser hipocelular, podendo resultar em exame falso-negativo (MANRIQUE, et al., 2009). Deve-se atentar para indicadores de qualidade dos esfregaços como: a espessura, obscurecimento por sangue e/ou infiltrado leucocitário e dessecamento (GILL, 2005). Apesar do exame citopatológico ser considerado uma estratégia segura e eficiente na detecção precoce do câncer do colo uterino, a alta taxa de resultados falsos-negativos (2% a 62%) causa questionamentos sobre a validade deste serviço na prevenção e detecção precoce da doença. As principais causas dos resultados falsos-negativos estão relacionadas a erros na coleta de material (62%), no escrutínio do esfregaço (16%) e na interpretação dos diagnósticos citopatológicos (22%). O câncer do colo do útero tem incidência elevada quando comparada a países desenvolvidos com programas de detecção precoces bem estruturados. Com base nesses dados, o Brasil criou o Sistema de Informação do Controle do Câncer do Colo do Útero (SISCOLO) o qual registrou um aumento do número de municípios que realizaram a coleta do exame citopatológico de 89,5% (2004/2005) para 95% (2007/2008). É o reflexo da política de expansão da estratégia de saúde da família, com um aumento considerável na demanda de exames realizados pelo Sistema Único de Saúde (SUS) (BRASIL, 2011; INCA, 2010). Porém o programa gerou sobrecarga do número de exames preventivos do câncer do colo do útero que acarretou em dois problemas graves detectados em todo o país: um foi a delonga no repasse dos resultados dos exames, e o outro a colheita de material mal realizada, demonstrada estatisticamente pela crescente quantidade de amostras insatisfatórias para uma análise citopatológica, principalmente no tocante à representatividade e celularidade dos esfregaços cervicovaginais, diminuindo consideravelmente a sensibilidade e especificidade do teste, tornando necessárias repetições de exames, tardando ainda mais o processo de diagnóstico e tratamento em casos de neoplasias (INCA, 2014). Um levantamento realizado pelo Instituto Nacional do Câncer (INCA) aponta que no Paraná entre os anos de 2010 até 2013 houve um constante crescimento no número de amostras insatisfatórias fundamentadas em hipocelularidade, de 42,19% em 2010 para 46,33% em 2013. Baseando-se nesses dados, é de fundamental relevância que se busque um progresso no que cerne à qualidade das amostras, tanto quanto à sua celularidade como representatividade celular, assegurando a obtenção de elementos celulares do local onde se situa quase que a totalidade dos cânceres do colo do útero. Dessa maneira é possível expandir a amplitude de detecção de anormalidades já que a extensão de células analisadas é aumentada, trazendo como benefício a identificação precoce da ocorrência de células cancerosas e maior agilidade no tratamento da paciente (BRASIL, 2013). Torna-se explícita a necessidade de busca por excelência na qualidade das análises, a fim de que o Brasil alcance patamares mais próximos aos países desenvolvidos, já que é possível reduzir a ocorrência de novos casos de óbito com o diagnóstico e tratamento adequado das lesões iniciais (BRASIL, 2013; TEIXEIRA et. al., 2012). Segundo Bethesda, uma amostra satisfatória deve conter de 8 a 12 mil células escamosas e no mínimo 10 células endocervicais e/ou metaplásicas, e não apresentarem sobreposição celular e obscurecimento hemácias ou leucócitos (SOLOMON & NAYAR, 2005). Pela importância da adequabilidade da amostra no resultado final do exame preventivo do câncer do colo uterino, o projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde da mulher:

coleta de Papanicolaou” expandiu suas ações às Unidades Básicas de Saúde de Ponta Grossa, inserindo no seu trabalho a capacitação do quadro de enfermeiros dessas unidades que atuam na coleta de material cérvico vaginal, na prevenção do câncer do colo do útero. 2. Objetivo Averiguar a adequabilidade dos esfregaços cervicovaginais realizados em três Unidades Básicas de Saúde em Ponta Grossa. 3. Materiais e Métodos No período de 2014 foram analisadas 116 amostras cervicovaginais colhidas nas Unidades Básicas de Saúde (UBS) de Ponta Grossa: Antônio Saliba, Antero de Mello e Cezar Milleo. As pacientes passaram pela anamnese e consulta de enfermagem. Após isso, o material cérvicovaginal foi coletado da junção escamocolunar por raspagem com espátula de Ayre e o material do canal endocervical com o uso da escovinha endocervical. O material foi coletado em duplicata, sendo um dos materiais encaminhado normalmente ao SUS e outro para o projeto. O exame citopatológico foi realizado no Laboratório Universitário de Análises Clínicas da UEPG, onde foi corado pelo método de Papanicolaou e a montagem entre lâmina e lamínula foi realizada com Entellan. Para a análise da celularidade e representatividade, tomou-se por base os critérios de Bethesda, que considera uma amostra adequada quanto à celularidade aquela que apresenta uma estimativa de cerca de 8.000 a 12.000 células escamosas bem preservadas e visualizadas no esfregaço. Quanto à representatividade, os critérios de qualidade obedeceram à regra que determina a obrigatoriedade na amostra em análise de no mínimo 10 células endocervicais bem preservadas e/ou metaplásicas na amostra. Também foram analisadas a sobreposição celular e/ou obscurecimento por hemácias e leucócitos. 4. Resultados e Discussão Foram analisadas 116 amostras cérvicovaginais em 2014. Ao inserir os dados obtidos num gráfico de colunas (Figura 1), observou-se que em números absolutos, quanto à celularidade, 93 amostras apresentaram esfregaços que continham de 8.000 a 12.000 células escamosas na preparação. Ao se considerar a celularidade juntamente com a representatividade (satisfatório), ou seja, a observação de células escamosas e endocervicais, esses números caíram para 21, representando uma queda em 77% na qualidade das amostras. Duas amostras foram consideradas insatisfatórias por apresentarem hipocelularidade com sobreposição de leucócitos e hemácias.

Figura 1 – Adequabilidade das Amostras

0

20

40

60

80

100

120

140

CÉLULAS ESCAMOSAS

SATISFATÓRIO INSATISFATÓRIO TOTAL

Ao se analisar isoladamente cada Unidade Básica de Saúde (UBS), a Unidade Básica de Saúde Antonio Saliba apresentou 62 exames com celularidade ótima, 13 satisfatórios e um insatisafório. A Unidade de Saúde Cezar Milleo apresentou 23 esfregaços com celularidade ótima, 4 satisfatórios e um insatisfatório. A Unidade de Saúde Antero de Mello apresentou 8 esfregaços com boa celularidade, 4 satisfatórios e nenhum insatisfatório. Comparando as Unidades Básicas de Saúde (Tabela 1), observou-se que as amostras satisfatórias apresentaram um percentual de 17% das amostras colhidas na Unidade Básica Atonio Saliba, 14% da Unidade Básica Cezar Milleo e 33% da Unidade Básica Antero de Mello. Levando-se em conta que para a detecção de adenocarcinomas cervicovaginais faz-se necessário a presença de células edocerviais, observou um alto percentual de possibilidade de falha na detecção desse tumor em 83% na Unidade Antonio Saliba, 85% na Unidade Cezar Milleo e 67% na Unidade Antero de Mello.

Tabela 1 – Comparação da adequabilidade da amostra por UBS estudadas

Adequabilidade Unidades Básicas UB. Antonio Saliba UB. Cezar Milleo UB. Antero de Mello

Células escamosas 62 23 8 Satisfatório 13 4 4 Insatisfatório 1 1 0 Percentual de satisfatórios

17% 14% 33%

Percentual de falhas para pesquisa de adenocarcinomas

83% 85% 67%

5. Conclusão O presente trabalho demonstra a importância do projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção da saúde da mulher: coleta de Papanicolaou” na educação em saúde, no tocante ao preenchimento de lacunas na formação de profissionais que atuam na coleta de material cervicovaginal. A qualidade na coleta de material para exame preventivo do câncer do colo uterino são cruciais para que se obtenha uma boa sensibilidade e especificidade no exame citopatológico. Referências AMARAL, R. G., MANRIQUE, E.J.C., GUIMARÃES, J. V. et al. Influência da adequabilidade da amostra sobre a detecção das lesões precursoras do câncer cervical. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., Rio de Janeiro, v. 30, 2008. BRASIL. Ministério da Saúde. Profissionais de saúde. Brasília, 2002. BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Departamento de Atenção Básica. Controle dos cânceres do colo do útero e da mama / Ministério da Saúde, Secretaria de Atenção à Saúde, Departamento de Atenção Básica. – 2. ed., Brasília : Editora do Ministério da Saúde, 2013. BRASIL. Ministério da Saúde. Cadernos de Atenção Básica – Controle dos Cânceres de Colo do Útero e da Mama. 2 ed. Brasília - DF, 2013. FRANCO, R., AMARAL, R. G., MONTEMOR, E. B. L. et al. Fatores associados a resultados falso-negativos de exames citopatológicos do colo uterino. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., Vol.8, n. 28, p. 479-85, 2006. GILL, G. W. Blinded review of Papanicolaou smears. Cancer, Vol.22, n.105, p 53-5, 2005. INCA – INSTITUTO NACIONAL DO CÂNCER. Síntese de Resultados e Comentários. Disponível em: <http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/sintese-de-resultados-comentarios.asp> Acesso em: 05 de junho de 2014. SOLOMON, D.; NAYAR, R. Sistema Bethesda para citopatologia cervicovaginal: definições, critérios e notas explicativas. 2. ed., Rio de Janeiro: Revinter, 2005.

TRABALHO 5

Determinação de marcadores anatômicos para a folha e caule de

Rubus idaeus L., visando o controle da qualidade

Matheus Saukoski Pauzer1 (IC) E-mail: matheus18sp@hotmail.com Valter Paes de Almeida1 (IC) E-mail: valterp_almeida@hotmail.com

Vanessa Barbosa Bobek2 (PG) E-mail: vanessabarbosa273@bol.com.br Rosi Zanoni da Silva3 (PQ) E-mail: rosizanoni@bol.com.br

Inês Janete Matozzo Takeda4 (PQ) E-mail: inestakeda@yahoo.com.br Jane Manfron Budel5 (PQ) E-mail: janemanfron@hotmail.com

1 Aluno de iniciação científica do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa; 2 Doutoranda em Ciências Farmacêuticas da UFPR; 3 Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa; 4 Pós-doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa; 5 Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela orientação do trabalho.

Resumo: O gênero Rubus compreende cerca de 700 espécies nativas do norte da Ásia, Europa e América do Norte, predominando em áreas de clima temperado. Rubus deriva do latim ruber, que significa vermelho, em alusão à cor da fruta. O nome da espécie idaeus, refere-se ao Monte Ida, localizado no que hoje é noroeste da Turquia. A família Rosaceae inclui cerca de 100 gêneros e 3000 espécies, sendo uma das maiores famílias de Angiospermas. Rubus idaeus L. denominada popularmente de framboesa, framboesa europeia e raspberry é usada na medicina popular em muitos países para o tratamento de feridas, cólicas e algumas outras doenças, tais como diarréia, doença renal, aumentando a micção. Possui atividades antioxidante e anticancerígena. As folhas são adstringentes (antidiarreicas e cicatrizantes), antiinflamatórias e diuréticas. Esse trabalho faz parte do projeto de extensão: “Horto medicinal do curso de Farmácia: um espaço para o aprendizado farmacognóstico”, onde todas as espécies vegetais presentes estão sendo identificadas e descritas botanicamente. Desta forma, o objetivo do trabalho foi analisar a arquitetura foliar e caulinar de Rubus idaeus L., a fim de fornecer descrições botânicas mais detalhadas da folha e descrever o caule, que ainda não foi estudado anatomicamente. As características botânicas determinadas nesse estudo para folha e caule de Rubus idaeus L., auxiliam na identificação da espécie e fornecem subsídios para o controle da qualidade de drogas vegetais, uma vez que diferenciam essa espécie dos adulterantes Rubus fruticosus L. e Rubus ulmifolius Schott. Palavras-chave: anatomia, farmacobotânica, morfologia, Rosaceae. 1. Introdução Rosaceae inclui cerca de 100 gêneros e 3000 espécies, sendo uma das maiores famílias de Angiospermas. No Brasil ocorrem 8 gêneros e cerca de 25 espécies. Em geral são plantas com acúleos ou espinhos frequentes, folhas alternas, simples ou compostas com margem inteira ou serreada (SÁNCHEZ RODRÍGUEZ. et al., 2008); (SOUZA; LORENZI., 2008). Rubus compreende cerca de 700 espécies nativas do norte da Ásia, Europa e América do Norte, predominando em áreas de clima temperado. O termo rubus deriva do latim ruber, que significa vermelho, em alusão à cor da fruta. O nome da espécie idaeus, refere-se ao Monte Ida, localizado no que hoje é o noroeste da Turquia (GESTEIRA. et al., 2008). Rubus idaeus L., denominada popularmente de framboesa, framboesa europeia e raspberry é adulterada no comércio por Rubus fruticosus L. e Rubus ulmifolius Schott. É usada na medicina popular em muitos países para o tratamento de feridas, cólicas e algumas outras doenças, tais como diarreia e doença renal. É utilizada também topicamente em ulcerações na pele, bucais ou na córnea (GESTEIRA. et al., 2008); (ZHANG. et al., 2011). Estudos químicos revelaram a presença de taninos (10%), ácidos orgânicos, flavonóides e pectinas nas folhas. Os frutos contêm vitaminas, ácidos orgânicos (1,5-2%): ácido málico, oxálico e tartárico (GESTEIRA. et al., 2008). O teor flavonoídico total é de 0,46 a 1,05% e até 5% e são derivados de canferol e quercetina. Polifenois como galotaninos e elagitaninos (2,06 a 6,89% e até 10%). Outros constituintes presentes como compostos voláteis (E-2-hexenal e Z-3-hexenol), glicosídeos de C13-norisoprenoides e vitamina C. As bagas contêm antocianinas, taninos

hidrolisáveis, um elagitanino dimérico, triterpenoides, estigmasterol, campesterol, cicloartenol, colesterol e frambinona (BARNES, JOANNE. et al., 2012). Possui atividades antioxidante e anticancerígena (WARGOVICH, 2006); (SALGADO, 2003). As folhas são adstringentes (antidiarreicas e cicatrizantes), anti-inflamatórias e diuréticas (GESTEIRA. et al., 2008). Apresenta atividade anti-proliferativa contra células de carcinoma de cólon e antibacteriana (ZHANG. et al., 2011). Rubus idaeus tem um efeito profilático potente sobre a formação de cálculos renais de oxalato de cálcio, confirmando o folclore sobre a sua atividade anti-litíase (GHALAYINI. et al., 2011). 2. Objetivos Esse trabalho faz parte do projeto de extensão: “Horto medicinal do curso de Farmácia: um espaço para o aprendizado farmacognóstico”, onde todas as espécies vegetais presentes estão sendo identificadas e descritas botanicamente. Nesse sentido, objetivou-se analisar a arquitetura foliar e caulinar de Rubus idaeus L., a fim de fornecer subsídios farmacobotânicos para a espécie medicinal, além de fornecer descrições botânicas mais detalhadas da folha e descrever o caule, que ainda não foi estudado anatomicamente. 3. Materiais e Métodos A coleta de partes aéreas do material vegetal ocorreu no Horto Medicinal do Curso de Farmácia, na Universidade Estadual de Ponta Grossa (PR), Campus Uvaranas, Av. General Carlos Cavalcanti, 4748 (25°5'23"S 50°6'23"W). Os exemplares de Rubus idaeus L. foram submetidos à confecção de exsicatas, identificadas por taxonomista e os representantes se encontram registrados no Herbário do Museu Botânico de Curitiba sob o número 306073. 3.1 Análises Anatômicas Foram coletadas amostras a partir de 5 cm do ápice da planta. Folhas e caules de Rubus idaeus L. foram fixados em solução de FAA 70 (formol 5%, ácido acético 5% e etanol 70ºGL 90% v/v) (Johansen, 1940), durante uma semana e armazenados em álcool etílico a 70% (BERLYN & MIKSCHE, 1976). O material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, efetuado à mão livre, foi submetido à coloração de azul de astra e fucsina básica (Roeser, 1972) e de azul de toluidina (O'Brien et al., 1964) em lâminas semi-permanentes preparadas para tal fim. A montagem das lâminas foi realizada com glicerina diluída a 50% (v/v) (BERLYN, MIKSCHE, 1976) e para a lutagem foi utilizado esmalte incolor. Fotomicrografias foram capturadas por microscópio de luz Olympus CX31 equipado por uma unidade de controle C7070. As lâminas semi-permanentes foram analisadas no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa. 3.2 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) O material foi desidratado em uma série etanólica crescente e pelo ponto crítico no aparelho Balzers CPD-030. A microscopia eletrônica de varredura da superfície foliar e caulinar de Rubus idaeus L. foi realizada em alto vácuo, utilizando-se a metodologia de Souza (1998). As eletromicrografias foram realizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3 TESCAN no C-LABMU/PROPESP, na Universidade Estadual de Ponta Grossa. 4. Resultados e Discussão A análise anatômica da lâmina foliar de R. idaeus, em vista frontal, mostra células epidérmicas com parede anticlinal de contorno levemente ondeadas e a ornamentação cuticular é ligeiramente estriada em ambas as faces. Os estômatos são do tipo anomocítico e restritos à face abaxial, caracterizando a folha como hipoestomática. Em secção transversal, a epiderme apresenta-se uniestratificada e coberta por cutícula delgada. As células da epiderme adaxial são comparativamente maiores que as da face abaxial. Característica também relatada por Gesteira et al. (2008). Os estômatos estão localizados no mesmo nível das demais células epidérmicas. Na face abaxial são encontrados tricomas tectores flageliformes bicelulares, formados por uma pequena célula basal e uma célula apical alongada e

afilada. Na face adaxial esses tricomas são raros. Tricomas tectores estrelpara R. ulmifolius Schott., espécie utilizada como adulterante de 2008). O mesofilo é dorsiventral, formado por duas camadas de parênquima paliçádico e 2parênquima esponjoso. No parênquima paliçádico drusas de oxalato de cálcio. Os feixes vasculares colaterais são circundados por uma bainha e estão mergulhados na região mediana do mesofilo. A nervura central tem formato côncavomencionadas para o limbo foliar, entretanto, na face adaxial, são observados raros tricomas glandulares capitados, formados por pedicelo e cabeça multicelular. Esses tricomas não foram observados no gênero Rubus no trabalho de Gesteira observa-se 2-3 camadas de colênquima angular na face adaxial e 1vascular está representado por feixe vascular colateral único. Inúmeros idioblastos contendo drusas de oxalato de cálcio são observados.O caule tem formato irregular e a epiderme evidencia cutícula levemente espessada e levemente estriada. Poucos tricomas tectores com as mesmas características descritas para a folha são observados. Subjacentemente à epiderme,lamelar. Abaixo do colênquima são observadas cerca de 3 camadas de células corticais maiores que as do colênquima. Os feixes vasculares colaterais são organizados circundando toda a medula e uma calota de fibras perivasculares bem desenvolvidamedula ocupa a maior parte do caule e é formada por células isodiamétricas de parede delgada. Idioblastos contendo drusas de oxalato de cálcio são encontrados região cortical e medular.

Figura 1 - Rubus idaeus L. no hábito em Horto Medicinal do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa

afilada. Na face adaxial esses tricomas são raros. Tricomas tectores estrelados foram descritos Schott., espécie utilizada como adulterante de R. idaeus (GESTEIRA. et al.,

O mesofilo é dorsiventral, formado por duas camadas de parênquima paliçádico e 2parênquima esponjoso. No parênquima paliçádico são observados grandes idioblastos contendo drusas de oxalato de cálcio. Os feixes vasculares colaterais são circundados por uma bainha e estão mergulhados na região mediana do mesofilo. A nervura central tem formato côncavo-convexo. A epiderme tem as mesmas características mencionadas para o limbo foliar, entretanto, na face adaxial, são observados raros tricomas glandulares capitados, formados por pedicelo e cabeça multicelular. Esses tricomas não foram

no trabalho de Gesteira et al. (2008). Adjacente à epiderme, 3 camadas de colênquima angular na face adaxial e 1-2 na face abaxial. O sistema

vascular está representado por feixe vascular colateral único. Inúmeros idioblastos contendo observados.

O caule tem formato irregular e a epiderme evidencia cutícula levemente espessada e levemente estriada. Poucos tricomas tectores com as mesmas características descritas para a folha são observados. Subjacentemente à epiderme, ocorrem 2-3 camadas contínuas de colênquima lamelar. Abaixo do colênquima são observadas cerca de 3 camadas de células corticais maiores

Os feixes vasculares colaterais são organizados circundando toda a medula e uma calota de m desenvolvidas é evidenciada aposta ao floema em todos os feixes. A

medula ocupa a maior parte do caule e é formada por células isodiamétricas de parede delgada. Idioblastos contendo drusas de oxalato de cálcio são encontrados região cortical e medular.

L. no hábito em Horto Medicinal do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa

ados foram descritos (GESTEIRA. et al.,

O mesofilo é dorsiventral, formado por duas camadas de parênquima paliçádico e 2-3 de são observados grandes idioblastos contendo

drusas de oxalato de cálcio. Os feixes vasculares colaterais são circundados por uma bainha e

mas características mencionadas para o limbo foliar, entretanto, na face adaxial, são observados raros tricomas glandulares capitados, formados por pedicelo e cabeça multicelular. Esses tricomas não foram

et al. (2008). Adjacente à epiderme, 2 na face abaxial. O sistema

vascular está representado por feixe vascular colateral único. Inúmeros idioblastos contendo

O caule tem formato irregular e a epiderme evidencia cutícula levemente espessada e levemente estriada. Poucos tricomas tectores com as mesmas características descritas para a folha são

s contínuas de colênquima lamelar. Abaixo do colênquima são observadas cerca de 3 camadas de células corticais maiores

Os feixes vasculares colaterais são organizados circundando toda a medula e uma calota de é evidenciada aposta ao floema em todos os feixes. A

medula ocupa a maior parte do caule e é formada por células isodiamétricas de parede delgada. Idioblastos contendo drusas de oxalato de cálcio são encontrados região cortical e medular.

L. no hábito em Horto Medicinal do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa

5. Conclusão As características farmacobotânicas descritas para folha e caule de Rubus idaeus L., auxiliam na identificação da espécie e fornecem subsídios para o controle da qualidade de drogas vegetais, uma vez que diferenciam essa espécie dos adulterantes Rubus fruticosus L. e Rubus ulmifolius Schott. Referências ANDREUCCETTI MAEDA, JOCELY; BONILHA MARCONDES C., SONIA MARIA. GERMINAÇÃO E DORMÊNCIA DE SEMENTES DE FRAMBOESA (Rubus idaeus L.). Revista Brasileira de Sementes, Vol. 17, n. 1, p. 101-106, 1995. Disponível em: <http://www.abrates.org.br/revista/artigos/1995/v17n1/artigo16.pdf> Acesso em: 18 fev. 2015. BARNES, JOANNE. et al. Fitoterápicos. 3. ed. Porto Alegre: Artmed, p. 720, 2012. BERLYN, G.P.; MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: Iowa State University, Vol. 276, p.121, 1976. GHALAYINI, IBRAHIM F. et al. Prophylaxis and Therapeutic Effects of Raspberry (Rubus idaeus) on Renal Stone Formation in Balb/c mice. Irbid, Jordan: Int. Braz. J. Urol. Vol. 37, n. 2, p. 259-67, 2011. JOHANSEN, D. A. Plant microtechnique. New York: McGraw Hill Book, 193, p. 41, 1940. L. BANDONI, ARNALDO. Evaluación farmacopeica de lacalidad de drogas vegetales y productos relacionados. Estado actual em lãs farmacopeas argentina y brasilera. Dominguezia: Buenos Aires, Argentina, Vol. 27, n. 2, 2011. Disponível em: <http://www.dominguezia.org.ar/volumen/articulos/2724.pdf> Acesso em: 18 fev. 2015. MATTOS GESTEIRA, EDSON. et al. PLANTAS MEDICINALES ESPAÑOLAS. FAMILIA ROSACEAE. Stud. bot.: Salamanca, España, Vol. 2, p. 9-142, 2008. Disponível em: <http://campus.usal.es/~revistas_trabajo/index.php/0211-9714/article/viewFile/7338/7865>Acesso em: 18 fev. 2015. O’BRIEN, T.P.; FEDER N.; MCCULLY, M.E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O. Protoplasma, 59, p. 368-373, 1964. PAGLIETTA, R. El frambueso. Ediciones Mundi-Prensa: Castelló-Madrid, p. 131, 1986. ROESER, K.R. Die Nadel der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der Natur. Mikrokosmos, 61, p. 33-36, 1972. SALGADO, M. J. O emprego da amora, framboesa, mirtilo e morango na redução de risco de doenças. Anais. Vacaria RS: I Seminário de Pequenas Frutas no Brasil, n. 1, p. 36, 2003. SÁNCHEZ RODRÍGUEZ, GUILLERMO. et al. Sistema de Inteligencia de Mercados para el Desarrollo Competitivo Del Sector Agropecuario del Estado de Michoacán. Fundación PRODUCE Michoacán, A. C. / LA RED DE VALOR ZARZAMORA. El Cluster de los Reyes Michoacán, un Ejemplo de Reconversión Competitiva. Morelia, Michoacán, México, Vol. 6, 1. ed, 2008. Disponível em: <http://www.siac.org.mx/tecnos/14mich.pdf> Acesso em: 18 fev. 2015. SOUZA, V. C.; LORENZI, H. Botânica sistemática: guia ilustrado para identificação das famílias de Fanerógamas nativas e exóticas no Brasil, baseado em APG II. 2. ed. Nova Odessa, São Paulo: Instituto Plantarum, 2008. SOUZA, W.Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicadas às Ciências Biológicas. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrônica, p.1-44, 1998. The Plant List – a working list of all plant species. Disponível em: <http://www.theplantlist.org/tpl1.1/record/rjp-310> Acesso em: 18 fev. 2015. Tropicos.org. Missouri Botanical Garden. Disponível em: <http://www.tropicos.org/Name/27800177> Acesso em: 18 fev. 2015. WARGOVICH, M. J. Red fruits s functional foods for the prevention of cancer. EMBRAPA: Doc 167, Pelotas, RS, 2006. ZHANG, YING. et al. Diuretic Activity of Rubus idaeus L (Rosaceae) in Rats. Tropical Journal of Pharmaceutical Research, Benin City, Nigeria, Vol. 10, n. 3, p. 243-248, 2011. Disponível em: <http://www.ajol.info/index.php/tjpr/article/view/67933/56030> Acesso em: 18 fev. 2015.

TRABALHO 6

Arquitetura foliar e caulinar de Mikania sessilifolia DC., visando o controle da qualidade da matéria-prima

Paola Aparecida Raeski 1 (IC) E-mail: paola.ap.raeski@gmail.comr

Inês Janete Mattozo Takeda 2 (PQ) E-mail: inestakeda@yahoo.com.br Jane Manfron Budel 3 (PQ) E-mail: janemanfron@hotmail.com

1 Aluna de Iniciação Científica, Curso de Ciências Farmacêuticas - UEPG 2 Aluna de Pós-doutorado, Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas – UEPG 3 Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas, orientadora do trabalho.

Resumo: Mikania sessilifolia, popularmente conhecida como orelha-de-onça ou guiné, é uma planta pertencente a família Asteraceae muito utilizada na medicina popular como antifebril, tônica, no combate a tosses e resfriados. Devido ao uso medicinal amplamente difundido de espécies de Mikania, suas diferenças morfológicas pouco expressivas e a ausência de estudos farmacobotânicos sobre M. sessilifolia justificam a importância de se realizar um estudo sobre a morfologia e anatomia desta planta. O presente trabalho teve por objetivo analisar a arquitetura foliar e caulinar de Mikania sessilifolia e pesquisa microquímica. O material coletado foi fixado e seccionado transversalmente. Os cortes foram submetidos à coloração com fucsina básica e azul de astra para o estudo anatômico. O material vegetal foi também submetido à técnica de microscopia eletrônica de varredura. Para o estudo microquímico foram realizadas secções transversais do caule e da folha e avaliadas frente aos reativos: floroglucina clorídrica, Sudam III, cloreto férrico e lugol. Por meio das características morfológicas e anatômicas evidenciadas no presente estudo, pode-se fornecer caracteres para identificação da espécie, bem como diferencia-lá de outras espécies do gênero Mikania. Palavras-chave: Anatomia, Asteraceae, microquímica, morfologia. 1. Introdução Asteraceae compreende cerca de 1.100 gêneros e aproximadamente 25.000 espécies distribuídas em regiões tropicais, subtropicais e temperadas. Constitui-se em uma das famílias mais evoluídas do reino vegetal, bem como uma das maiores, desenvolvendo-se bem em diferentes habitats. No Brasil há aproximadamente 180 gêneros de Asteraceae, as quais estão representadas por espécies herbáceas anuais ou perenes, substratos ou arbustos e, em casos mais raros, algumas espécies arbóreas (SILVA, 2000). Mikania é muito comum no Brasil, onde cerca de 150 a 300 espécies ocorrem na forma de ervas perenes ou arbustos, geralmente volúveis, raramente eretos. As folhas são geralmente opostas e pecioladas e suas corolas brancas ou arrouxeadas. As espécies do gênero são popularmente conhecidas como “guaco”, sendo empregadas na medicina popular para o tratamento de tosses, febres, reumatismos, resfriados e afecções respiratórias. Caracterizam-se pela produção de várias classes de metabólitos secundários, entre os quais se destacam a ocorrência de triterpenos, diterpenos, em especial de esqueleto caurano e de sesquiterpenos (PRADOet al., 2011). Mikania sessilifolia DC. é popularmente conhecida como orelha-de-onça e utilizada na medicina tradicional como tônica, antifebril e no combate a tosses e resfriados. (RIBEIRO, 2010). 2. Objetivos A diagnose de espécies medicinais baseia-se primeiramente na análise morfoanatômica dos órgãos vegetativos e reprodutivos, mostrando-se relevante na identificação de drogas pulverizadas ou rasuradas, contribuindo para o controle da qualidade de drogas vegetais (DONATO & MORRETES, 2005). Desta forma, objetivou-se analisar a morfologia externa, a anatomia e a microquímica da folha e do caule de Mikania sessilifolia DC., a fim de fornecer características farmacobotânicas para identificação da espécie medicinal, bem como diferenciá-la de outras espécies do gênero Mikania.

3. Materiais e Métodos A coleta do material vegetal ocorreu na região dos Campos Gerais do Estado do Paraná (24º 18’ S e 49º 37’ W). O material vegetal foi submetido à confecção de exsicata, identificado por taxonomista sob o número de registro 10208 no herbário da UEPG. 3.1 Estudo anatômico As pesquisas referentes aos caracteres morfoanatômicos foram efetuadas com o material vegetal coletado a partir de 10 cm do ápice da planta. Folhas e caules de M. sessilifolia foram fixados em solução de FAA 70 (JOHANSEN, 1940) e armazenados em álcool etílico a 70% (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Foram preparadas lâminas semipermanentes com o material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal à mão livre. As secções foram submetidas à coloração de azul de astra e fucsina básica (ROESER, 1972). As lâminas foram montadas com glicerina diluída a 50% (v/v) (BERLYN, MIKSCHE, 1976) e para a lutagem foi utilizado esmalte incolor. 3.2 Testes microquímicos Foram realizadas secções transversais à mão livre de folhas e caules de Mikania sessilifolia paraverificação de lignina, utilizando-se floroglucina clorídrica (FOSTER, 1949), Sudam III para substâncias lipofílicas (SASS, 1951), cloreto férrico para compostos fenólicos (JOHANSEN, 1940) e lugol para amido (BERLYN & MIKSCHE, 1976). 3.3 Microscopia eletrônica de varredura – MEV A microscopia eletrônica de varredura da superficie foliar e caulinar de Mikania sessilifolia foi realizada em alto vácuo, sendo as amostras submetidas ao processo de desidratação em série etanólica crescente e pelo ponto crítico de plasma e, após montagem em suporte, foram submetidas à metalização com ouro e paládio (SOUZA, 1998). As eletromicrografias foram visualizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3 TESCAN. Para realização do ponto crítico e microscopia eletrônica de varredura, o material foi analisado no C-LABMU/PROPESP, na Universidade Estadual de Ponta Grossa. 4. Resultados e Discussão Morfologicamente, Mikania sessilifolia encontra-se como um subarbusto de 0,4 a 1,5m de altura, com ramos cilíndricos, costados, tomentosos. As folhas são simples, opostas, sésseis, o limbo tem cerca de 10 a 35 x 6 a 27mm, orbicular a cordado, o ápice é de obtuso a arredondado, as margens são desde inteiras a onduladas, base truncada a cordada. A face adaxial é estrigosa, glanulosa, enquanto a face abaxial é hirsutotomentosa, glandulosa. Capítulos discóides, pedunculados, em panículas. O invólucro é obcônico, variando de 2,5 a 3mm de comprimento e 1,5 a 2mm de diâmetro, brácteas involucrais unisseriadas, 2,5 a 3 x 0,7 a 1mm, oblongas, tomentosas, glandulosa, o ápice é arredondado e as margens são inteiras. As flores são creme, monóclinas, com corola tubulosa, tubo 2mm de comprimento, 0,8mm de diâmetro, glanduloso, inteiramente glabro, fauce campanulada, lobos de 0,5 x 0,4mm, glandulosos. As anteras se encontram com apêndice apical obtuso e base obtusa. Os ramos do estilete são lineares, papilosos e agudos. A cipsela é obcônica com 1,2mm de comprimento e 0,3mm de diâmetro e glandulosa. O papilho é cerdoso, unisseriado, 2,3mm. (HATTORI, 2008) Anatomicamente, M. sessilifolia apresenta lâmina foliar com epiderme uniestratificada, onde as células possuem paredes anticlinais ligeiramente onduladas em vista frontal em ambas as faces. Uma cutícula delgada e levemente estriada é observada recobrindo o sistema de revestimento. A sua folha é anfiestomática, com a presença de estômatos anisocítico e anomocítico, que tem localidade no mesmo nível das demais células epidérmicas. Os tricomas glandulares observados se inserem em depressão naepiderme e mostram-se capitados e unisseriados, com pedicelo formado por 3-4 células e cabeça globoide. Tricomas tectores pluricelulares, com aproximadamente 5-8 células, do tipo cônicos, unisseriados, de base alargada e célula terminal afilada são circundados por células epidérmicas dispostas em roseta. Sendo a cutícula deste tricoma estriada.Tricomas glandulares e tectores descritos neste estudo

foram relatados em outras espécies de ARAÚJO et al., 2015). O mesofilo tende à dorsiventral, constituído por parênquima paliçádico, com células dispostas em cerca de 2 camadas junto à epiderme adaxial; o parênquima esponjoso é formado por cerca de 6 camadas. Feixes vasculares colaterais de pequeno porte, distribuídos na região mediana do mesofilo, são envoltos por bainha parenquimática. Dutos secretores podem ser observados próximos aos feixes vasculares. O gênero apresentam dutos secretores e tricomas glandulares (BUDEL et al., 2009; AMORIN et al., 2014; ARAÚJO et al., 2015). A nervura central, em secção transversal, possui formato praticamente planoepiderme é uniestratificada e, subjacentemente, o clorênquima se interrompe e são encontradas aproximadamente 3 camadas de colênquima do tipo angular em ambas as faces. Um feixe vascular único do tipo colateral encontrade fibras esclerenquimáticas aparece junto ao floema e ao xilema.O caule, apresenta contorno hexagonal, com 6 costelas conspícuas, em secção transversal. Mikania laevigata evidenciou caule circular (BUDEL et al., 2009), enquanto apresentou caule hexagonal (ARAÚJ

Figura 1. Corte transversal do caule, podendo observar o seu contorno hexagonal.

A epiderme e os tricomas mostram as mesmas características citadas para a folha. Na região das costelas, em posição adjacente à epidcélulas esclerenquimáticas. Limitando internamente o córtex, observaestrias de Caspary evidentes. O cilindro vascular é típico e em aposição ao sistema floemático notam-se calotas de fibras perivasculares. No xilema, os elementos traqueais distribuemfileiras separadas por células parenquimáticas. A região medular ocupa um pequeno volume do caule e possui parênquima com células relativamente grandes e com paredes delgadas.

Figura 2. Tricoma glandular de

foram relatados em outras espécies de Mikania (BUDEL et al., 2009; AMORIN et al., 2014;

O mesofilo tende à dorsiventral, constituído por parênquima paliçádico, com células dispostas em cerca de 2 camadas junto à epiderme adaxial; o parênquima esponjoso é formado por cerca de 6 camadas. Feixes vasculares colaterais de pequeno porte, distribuídos na região mediana do mesofilo, são envoltos por bainha parenquimática. Dutos secretores podem ser observados próximos aos feixes vasculares. O gênero Mikania é produtor de óleo essencial apresentam dutos secretores e tricomas glandulares (BUDEL et al., 2009; AMORIN et al., 2014;

A nervura central, em secção transversal, possui formato praticamente planocentemente, o clorênquima se interrompe e são encontradas

aproximadamente 3 camadas de colênquima do tipo angular em ambas as faces. Um feixe vascular único do tipo colateral encontra-se mergulhado no parênquima fundamental. Uma calota

imáticas aparece junto ao floema e ao xilema. O caule, apresenta contorno hexagonal, com 6 costelas conspícuas, em secção transversal.

evidenciou caule circular (BUDEL et al., 2009), enquanto apresentou caule hexagonal (ARAÚJO et al., 2015) em secção transversal.

Figura 1. Corte transversal do caule, podendo observar o seu contorno hexagonal.

A epiderme e os tricomas mostram as mesmas características citadas para a folha. Na região das costelas, em posição adjacente à epiderme, encontram-se faixas de colênquima do tipo angular e células esclerenquimáticas. Limitando internamente o córtex, observa-se a endoderme sem estrias de Caspary evidentes. O cilindro vascular é típico e em aposição ao sistema floemático

s de fibras perivasculares. No xilema, os elementos traqueais distribuemfileiras separadas por células parenquimáticas. A região medular ocupa um pequeno volume do caule e possui parênquima com células relativamente grandes e com paredes delgadas.

Figura 2. Tricoma glandular de M. sessilifolia visualizado em face abaxial.

(BUDEL et al., 2009; AMORIN et al., 2014;

O mesofilo tende à dorsiventral, constituído por parênquima paliçádico, com células dispostas em cerca de 2 camadas junto à epiderme adaxial; o parênquima esponjoso é formado por cerca de 6 camadas. Feixes vasculares colaterais de pequeno porte, distribuídos na região mediana do mesofilo, são envoltos por bainha parenquimática. Dutos secretores podem ser observados

é produtor de óleo essencial e várias espécies apresentam dutos secretores e tricomas glandulares (BUDEL et al., 2009; AMORIN et al., 2014;

A nervura central, em secção transversal, possui formato praticamente plano-convexo. A centemente, o clorênquima se interrompe e são encontradas

aproximadamente 3 camadas de colênquima do tipo angular em ambas as faces. Um feixe se mergulhado no parênquima fundamental. Uma calota

O caule, apresenta contorno hexagonal, com 6 costelas conspícuas, em secção transversal. evidenciou caule circular (BUDEL et al., 2009), enquanto M. micrantha

Figura 1. Corte transversal do caule, podendo observar o seu contorno hexagonal.

A epiderme e os tricomas mostram as mesmas características citadas para a folha. Na região das se faixas de colênquima do tipo angular e

se a endoderme sem estrias de Caspary evidentes. O cilindro vascular é típico e em aposição ao sistema floemático

s de fibras perivasculares. No xilema, os elementos traqueais distribuem-se em fileiras separadas por células parenquimáticas. A região medular ocupa um pequeno volume do caule e possui parênquima com células relativamente grandes e com paredes delgadas.

Figura 3. Tricoma tector em face abaxial da folha de M. sessilifolia.

5. Conclusão Dentre os vários caracteres anatômicos observados em M. sessilifolia, podem ser destacados: tricomas tectores cônicos pluricelulares unisseriados revestidos por cutícula estriada, tricomas glandulares capitados unisseriados, tricomas glandulares não capitados unisseriados, estômatos predominantemente anomocíticos, nervura central praticamente plano-convexa, caule hexagonal evidenciando 6 costelas conspícuas em secção transversal, que analisados em conjunto fornecem dados complementares para a caracterização da droga vegetal com aplicação na indústria de fitoterápicos. Referências AMORIN, M.; PAULA, J. P.; SILVA, R. Z.; FARAGO, P. V.; BUDEL, J. M.Pharmacobotanical study of the leaf and stem of Mikania lanuginosa for its quality control. Revista Brasileira de Farmacognosia, Vol.24, p.531-537, 2014. ARAÚJO, F. F.; AMORIN, M.; SANTOS, V. L. P.; FRANCO, C. R. C.; FOLQUITTO, D.. G..; SILVA, R. Z.; FARAGO, P. V.; TAKEDA, I. J. M.; NAKASHIMA, T.; BUBDEL, J. M.Pharmacobotanical Characteres of Mikania micrantha (Asteraceae) and its Support for Quality Control.Latin American Journal of Pharmacy.Vol.34, n.3, p.437-442, 2015. BERLYN, G. P. Miksche JP. Botanical microtechnique and cytochemistry. Iowa State University, Ames, p. 121 – 276, 1976. BUDEL, J.M. et. al. Contribuição ao estudo farmacognóstico de Mikania laevigata Sch. Bip. ex Baker (guaco), visando o controle de qualidade da matéria-prima. Rev. Bras. Farmacogn. Vol.19, p.545-552, 2009. DONATO, A. M.; MORRETES, B. L.Estudo anatômico das folhas de Psidium widgrenianum Berg. (Myrtaceae), uma potencial espécie medicinal. Rev. Bras. Farm. Vol.86, n.2, p.65-70, 2005. FOSTER, A.S. Practical plant anatomy. 2. ed D. Van Nostrand, Princeton, 1949. HATTORI, E. K. O.; NAKAJIMA, J. N.A Família Asteraceae na Estação de Pesquisa e Desenvolvimento Ambiental Galheiro, Perdizes, Minas Gerais, Brasil. Rodriguésia. Vol..59, n.4, p.687-749, 2008. JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. McGraw Hill Book, New York, p. 41–93, 1940. PRADO, B. L.; et al. Análise da composição química dos óleos voláteis das folhas e flores de Mikania sessilifolia DC. (Asteraceae). Sociedade Brasileira de Química (SBQ), 2011. RIBEIRO, A. O.; SILVA, A.F.; CASTRO, A.H.F. Identificação de espécies da família Asteraceae, revisão sobre usos e triagem fitoquímica do gênero Eremanthus da Reserva Boqueirão, Ingá-MG. Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.12, n.4, p.456-465, 2010. ROESER, K. R.Die Nadel der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der Natur.Mikrokosmos v.61 p.33-36, 1972. SASS J. E. Botanical microtechnique. 2 ed Iowa State College, Ames, p. 97, 1951. SILVA, R. Z. Estudo Fitoquímico e Biológico das Partes Aéreas da Mikania lanuginosa DC. (ASTERACEAE).Programa de Pós Graduação em Química UFSC, Florianópolis p. 7-9, 2008. SOUZA W. Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicadas às Ciências Biológicas.Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrônica, Rio de Janeiro, p. 1-4, 1998.

TRABALHO 7

Análise comparativa dos tricomas presentes em folhas de espécies de Calea spp.

Evelyn Assis de Andrade (IC) Email: evelyn.aandrade@gmail.com

Inês Janete Matozzo Takeda (PQ) Email: inestakeda@yahoo.com.br Paulo Vitor Farago (PQ) Email: pvfarago@gmail.com

Márcia do Rocio Duarte (PQ) Email: mrduarte@ufpr.br Jane Manfron Budel (PQ) Email: janemanfron@hotmail.com

IC – aluno de iniciação científica regularmente registrado na Instituição de Ensino; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: O gênero Calea pertence à família Asteraceae e apresenta 316 espécies de plantas. Calea serrata Less., Calea uniflora Less., Calea longifolia Gardn. e Calea triantha (Vell.) Pruski são espécies analisadas neste estudo. Calea serrata Less., é usada popularmente para tratar úlceras e problemas hepáticos e apresenta atividade acaricida e inibidora de acetilcolinesterase. Calea uniflora Less. possui atividade antifúngica e tripanosomicida. Calea longifolia Gardn. é empregadas na medicina popular como cicatrizante e adstringente. Calea triantha (Vell.) Pruski é uma espécie pouco estudada e com potencial terapêutico. Objetivou-se investigar o sistema de revestimento, a fim de identificar e diferenciar as espécies vegetais para aplicação no controle da qualidade de drogas vegetais. As espécies vegetais foram coletadas, submetidas à confecção de exsicata e identificadas por taxonomista. Os estudos foram realizados em folhas adultas das quatro espécies, através de secções paradérmicas e diafanização, posteriormente coradas com azul de Astra e safranina. A caracterização foi complementada com microscopia eletrônica de varredura. A análise do sistema de revestimento das espécies de Calea permite concluir que as 4 espécies apresentam 3 tipos de tricomas cada uma. Os tricomas dos tipos III e V são os mais comuns. O tipo dos tricomas, quando avaliados em conjunto, diferenciam as 4 espécies analisadas. Palavras-chave: Asteraceae, Calea serrata, Calea uniflora, Calea longifolia, Calea triantha. 1. Introdução Asteraceae apresenta 1.535 gêneros, incluindo aproximadamente 25.000 espécies, representando cerca de 10% da flora mundial (BREMER, 1996). Nakajima et al. (2015) reconhecem 278 gêneros e 2.065 espécies aceitas na Flora do Brasil. No reconhecimento prático de Asteraceae, utiliza-se como referencial a presença de inflorescência em capítulo, anteras sinânteras e cipsela geralmente com um pápus (ROQUE & BAUTISTA, 2008). Calea apresenta 316 espécies de plantas, sendo 152 espécies aceitas, de acordo com http://theplantlist.org (2015), das quais, 82 são aceitas na Lista de Espécies da Flora do Brasil (MONDIN et al., 2015). Espécies desse gênero apresentam compostos ativos que despertam interesse por suas diversas ações, sendo conhecidas pelas atividades farmacológicas de extratos e substâncias isoladas, tais como atividades antimicrobiana (DO NASCIMENTO et al., 2004), anti-hipertensiva e vasodilatadora (GUERRERO et al., 2002), anti-inflamatória (GÓMEZ et al., 2011), entre outras. A presença de flores do raio pistiladas e pápus composto de páleas livres são caracteres diagnósticos do gênero (ROQUE & CARVALHO, 2011). Dentre as espécies analisadas neste estudo estão: Calea serrata Less., Calea uniflora Less., Calea longifolia Gardn. e Calea triantha (Vell.) Pruski. Calea serrata Less., conhecida popularmente como erva-de-cobra, chá-amargo e quebra-tudo, é encontrada no sul do Brasil, sendo usada na medicina tradicional para tratar úlceras e problemas hepáticos. Apresenta estudos farmacológicos que demonstram atividade acaricida (RIBEIRO et al., 2008; RIBEIRO et al., 2011) e inibidora de acetilcolinesterase (RIBEIRO et al., 2012). Estudos realizados por Nascimento et. al (2002; 2004) demonstram a atividade antifúngica e tripanosomicida de Calea uniflora Less.

Calea longifolia Gardn. é subarbustiva, cujas folhas são empregadas na medicina popular como cicatrizante e adstringente (TAKEDA, I.J.M. & FARAGO, P.V., 2001). Calea triantha (Vell.) Pruski é uma espécie nativa com distribuição nas regiões Sul e Sudeste do Brasil (MONDIN et al., 2015), pouco estudada e com potencial terapêutico, tendo em vista as propriedades farmacológicas das demais espécies do gênero. A descrição do sistema de revestimento auxilia na identificação e diferenciação de espécies vegetais. A presença e os tipos dos tricomas muito podem contribuir na diagnose vegetal rápida e fidedigna. 2. Objetivos Investigar o sistema de revestimento de espécies pertencentes ao gênero Calea spp., consistindo em subsídio farmacognóstico de identificação botânica, a fim de caracterizar e diferenciar as espécies do gênero Calea, para aplicação no controle da qualidade de drogas vegetais. 3. Materiais e Métodos A coleta de Calea uniflora e Calea serrata foi realizada na Fazenda São Maximiano, situada na região da Serra do Sudoeste, em Guaíba, Rio Grande do Sul, em outubro e dezembro de 2003. As exsicatas foram identificadas por taxonomista e encontram-se depositada no Herbário do Instituto de Ciências Naturais da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, sendo Calea uniflora sob o número ICN 49024 e Calea serrata sob o número ICN 51057. A espécie Calea longifolia foi coletada nas proximidades do Parque Estadual de Vila Velha, em Ponta Grossa, Paraná, em janeiro de 2004. A exsicata foi identificada por taxonomista e encontra-se depositada no Herbário da Universidade Estadual de Ponta Grossa sob o número 10209. A espécie Calea triantha foi coletada na Universidade Estadual de Ponta Grossa, no campus Uvaranas, em Ponta Grossa, Paraná, em agosto de 2015. Foi identificada por taxonomista e encontra-se depositada no Herbário da Universidade Estadual de Ponta Grossa sob o número de registro ICN 19062. Os estudos morfoanatômicos foram realizados em folhas adultas das quatro espécies. O material foi fixado com solução de formol, ácido acético e álcool (FAA 70) segundo Johansen (1940), e após uma semana, estocado em uma solução de etanol a 70% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE, 1976). A nomenclatura para descrever os caracteres está baseada em Radford (1974). Secções paradérmicas foram realizadas à mão livre, com auxílio de lâmina comum de tricotomia. A diafanização foliar seguiu a técnica de Fuchs (1963) e a descrição do padrão de venação adotou critérios de Hickey (1973). As lâminas semi-permanentes foram coradas com safranina e azul de Astra (GERLACH, 1969), montadas com glicerina a 50% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE, 1976) e lutadas em esmalte incolor (BEÇAK & PAULETE, 1976). A caracterização morfológica da superfície foliar foi complementada com microscopia eletrônica de varredura, segundo Souza (1998), no Complexo de Laboratórios Multiusuários. As lâminas foram examinadas e as fotomicrografias foram registradas no microscópio fotônico Olympus CX 31 acoplado à câmera digital Olympus, modelo C-7070, no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa. 4. Resultados e Discussão Metcalfe e Chalk (1988) afirmam que os tricomas podem ser utilizados com finalidades taxonômicas e estão presentes na família Asteraceae. A análise anatômica do sistema de revestimento de Calea spp. evidenciou as seguintes características: Calea longifolia apresenta dois tipos de tricomas glandulares localizados em criptas (face abaxial) (Figura 1) ou em pequenas depressões na epiderme (face adaxial). O primeiro é um tricoma glandular capitado, formado por cerca de 6 células no pedicelo e cabeça claviforme (Tipo I), enquanto que o outro tricoma, também capitado, é formado por pedicelo contendo cerca de 4 células e com cabeça globoide (Tipo II). Também ocorre um tipo de tricoma tector pluricelular (5 a 8 células), unisseriados, de base alargada e célula terminal afilada (Tipo III).

Figura 1. Tricomas na folha de Calea longifolia

Em Calea serrata são evidenciados 3 tipos de tricomas (Figura 2), sendo um glandular e dois tectores. O glandular é classificado como capitado séssil (Tipo IV). O primeiro tector é igual ao tipo III, citado para C. longifolia. O outro tipo de trformado por 6-8 células (Tipo V).

Figura 2. Tricomas na epiderme abaxial de

A espécie Calea triantha (Vell.) Pruski apresenta 3 tipos de tricomas (Figura 3), o primeiro é glandular capitado bisseriado (Tipo VI), o segundo é tector cônico (Tipo V) e o outro é tector do tipo III, também encontrado em C. serrata

Figura 3. Calea triantha (Vell.) Pruski, evidenciando tricomas em vista frontal da face abaxial epidérmica.

Calea longifolia Gardn., evidenciando os tricomas do tipo I (à esquerda) e tipo II (à

são evidenciados 3 tipos de tricomas (Figura 2), sendo um glandular e dois tectores. O glandular é classificado como capitado séssil (Tipo IV). O primeiro tector é igual ao

. O outro tipo de tricoma tector é cônico, pluricelular e unisseriado

Figura 2. Tricomas na epiderme abaxial de Calea serrata Less.

(Vell.) Pruski apresenta 3 tipos de tricomas (Figura 3), o primeiro é apitado bisseriado (Tipo VI), o segundo é tector cônico (Tipo V) e o outro é tector do

C. serrata.

(Vell.) Pruski, evidenciando tricomas em vista frontal da face abaxial epidérmica.

Gardn., evidenciando os tricomas do tipo I (à esquerda) e tipo II (à direita).

são evidenciados 3 tipos de tricomas (Figura 2), sendo um glandular e dois tectores. O glandular é classificado como capitado séssil (Tipo IV). O primeiro tector é igual ao

icoma tector é cônico, pluricelular e unisseriado

(Vell.) Pruski apresenta 3 tipos de tricomas (Figura 3), o primeiro é apitado bisseriado (Tipo VI), o segundo é tector cônico (Tipo V) e o outro é tector do

(Vell.) Pruski, evidenciando tricomas em vista frontal da face abaxial epidérmica.

Em Calea uniflora, os tricomas glandulares estão inseridos em pequena depressão na epiderme e podem ser do tipo VI (Figura 4B), também encontrado em capitados com pedicelo unicelular e cabeça alongada (Tipo VII) (Figura 4A). Tricomas tectores pluricelulares (5 a 8 células), unisseriados, de base alargada e célula terminal afilada (Figura 4C) são circundados por células epidérmicas dispostas em roseta e correspondem ao tipo V encontrado em

Figura 4 - Calea uniflora Less. A. Tricoma glandular do tipo VII . B. Tricoma glandular do tipo VI. C. Tricoma tector do tipo V.

A distribuição dos tricomas presentes nas espécies de 1.

Quadro 1. Presença e tipo de tricomas encontrados em

Tipos de Tricomas Espécies de

C. longifolia

I Presente

II Presente

III Presente

IV Ausente

V Ausente

VI Ausente

VII Ausente

5. Conclusão Considerando a análise do sistema de revestimento das espécies de que as 4 espécies apresentam 3 tipos de tricomas cada uma. Os trsão os mais comuns. O tipo dos tricomas, quando avaliados em conjunto, diferencia as espécies analisadas. Referências BEÇAK, W. & PAULETE, J. Técnicas de Citologia e Histologia.de Janeiro. Vol. 1, 1976. BERLYN, G.P. & MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistryUniversity, v. 276, p. 121, 1976. BREMER, K. Major clades and grades of the Asteraceae.Proceedings of the International ComposBeentje, eds.) Royal Botanic Gardens, Kew, v. 1, p. 1DO NASCIMENTO, A.M.; SALVADOR, M.J.; CANDIDO, R.C.; ITO, I.Y. & DE OLIVEIRA, D.C.Antimicrobial activity of extracts and some compounds from Cp. 514–519, 2004. FUCHS, C.H. Fuchsin staining with NaOH clearing for lignifi ed elements elements of whole plants or plants organs. Stain Technology, 38: 141GERLACH, G. Botanishe Microtechnik.

A

os tricomas glandulares estão inseridos em pequena depressão na epiderme e podem ser do tipo VI (Figura 4B), também encontrado em capitados com pedicelo unicelular e cabeça alongada (Tipo VII) (Figura 4A). Tricomas

es (5 a 8 células), unisseriados, de base alargada e célula terminal afilada (Figura 4C) são circundados por células epidérmicas dispostas em roseta e correspondem ao tipo V encontrado em C. serrata e C. triantha.

. A. Tricoma glandular do tipo VII . B. Tricoma glandular do tipo VI. C. Tricoma tector do tipo V.

presentes nas espécies de Calea está sumarizada no quadro

Quadro 1. Presença e tipo de tricomas encontrados em Calea spp. Espécies de Calea

C. longifolia C. serrata C. triantha C. uniflora

Presente Ausente Ausente Ausente

Presente Ausente Ausente Ausente

Presente Presente Presente Ausente

Ausente Presente Ausente Ausente

Ausente Presente Presente Presente

Ausente Ausente Presente Presente

Ausente Ausente Ausente Presente

Considerando a análise do sistema de revestimento das espécies de Caleaque as 4 espécies apresentam 3 tipos de tricomas cada uma. Os tricomas dos tipos III e V são os mais comuns. O tipo dos tricomas, quando avaliados em conjunto, diferencia as

Técnicas de Citologia e Histologia. Livros Técnicos e Científicos, Rio

Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: Iowa State

Major clades and grades of the Asteraceae. In Compositae: Systematics. Proceedings of the International Compositae Conference, Kew, 1994 (D. J. N. Hind & H. J. Beentje, eds.) Royal Botanic Gardens, Kew, v. 1, p. 1-7, 1996. DO NASCIMENTO, A.M.; SALVADOR, M.J.; CANDIDO, R.C.; ITO, I.Y. & DE OLIVEIRA, D.C.Antimicrobial activity of extracts and some compounds from Calea platylepis. Fitoterapia. Vol. 75,

Fuchsin staining with NaOH clearing for lignifi ed elements elements of whole plants Stain Technology, 38: 141-144, 1963.

Botanishe Microtechnik. Eine Einfürhrung George Thiem, Stuttgard, 1969.

B C

os tricomas glandulares estão inseridos em pequena depressão na epiderme e podem ser do tipo VI (Figura 4B), também encontrado em C. triantha ou capitados com pedicelo unicelular e cabeça alongada (Tipo VII) (Figura 4A). Tricomas

es (5 a 8 células), unisseriados, de base alargada e célula terminal afilada (Figura 4C) são circundados por células epidérmicas dispostas em roseta e

. A. Tricoma glandular do tipo VII . B. Tricoma glandular do tipo VI. C. Tricoma tector do tipo V.

está sumarizada no quadro

C. uniflora

Ausente

Ausente

Ausente

Ausente

Presente

Presente

Presente

Calea, conclui-se icomas dos tipos III e V

são os mais comuns. O tipo dos tricomas, quando avaliados em conjunto, diferencia as

Livros Técnicos e Científicos, Rio

. Ames: Iowa State

In Compositae: Systematics. itae Conference, Kew, 1994 (D. J. N. Hind & H. J.

DO NASCIMENTO, A.M.; SALVADOR, M.J.; CANDIDO, R.C.; ITO, I.Y. & DE OLIVEIRA, D.C. Fitoterapia. Vol. 75,

Fuchsin staining with NaOH clearing for lignifi ed elements elements of whole plants

hrung George Thiem, Stuttgard, 1969.

GÓMEZ, M. & GIL, J.F. Topical anti-inflammatory activity of Calea prunifolia HBK(Asteraceae) in the TPA model of mouse ear inflammation. J. Braz. Chem. Soc. 22, p. 2391–2395, 2011. GUERRERO, M.F.; PUEBLA, P.; CARRÓN, R.; MARTÍN, M.L.; ARTEAGA, L. & ROMÁN, L.S. Assessment of the antihypertensive and vasodilator effects of ethanolic extractsof some Colombian medicinal plants. J. Ethnopharmacol, p. 37–42, 2002. HICKEY, L.J., Classification of the Architecture of Dicotyledonous Leaves. American Journal of Botany, Vol. 60, n. 1, p. 17-33, 1973. JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: McGraw Hill Book, p. 41-193, 1940. METCALFE, C. R. & CHALK, L. Anatomy of the dicotyledons: systematic anatomy of the leaf and stem. 2 ed. Oxford: Clarendon Press, Vol. 1, p. 276, 1988. MONDIN, C.A.; ROQUE, N. & BRINGEL JR., J.B.A. Calea in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB103751>. Acesso em: 03 Jun. 2015. NAKAJIMA, J.N.; LOEUILLE, B.; HEIDEN, G.; DEMATTEIS, M.; HATTORI, E.K.O.; MAGENTA, M.A.G.; RITTER, M.R.; MONDIN, C.A.; ROQUE, N.; FERREIRA, S.C.; BORGES, R.A.X.; SOARES, P.N.; ALMEIDA, G.; SCHNEIDER, A.; SANCHO, G.; SAAVEDRA, M.M.; LIRO, R.M.; PEREIRA, A.C.M.; MORAES, M.D.; SILVA, G.A.R.; MEDEIROS, J.D.; LORENCINI, T.S.; TELES, A.M.; MONGE, M.; SINISCALCHI, C.M.; SOUZA-BUTURI, F.O.; BRINGEL JR., J.B. A.; CARNEIRO, C.R.; PASINI, E. & OLIVEIRA, C.T. Asteraceae in Lista de Espécies da Flora do Brasil. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em: <http://floradobrasil.jbrj.gov.br/jabot/floradobrasil/FB55>. Acesso em: 03 Jun. 2015. NASCIMENTO A.M., SALVADOR, M.J., CANDIDO, R.C.; ALBUQUERQUE, S. & OLIVEIRA, D.C. Trypanocidal and antifungal activities of p-hidroxyacetophenone derivatives from Calea unifl ora (Heliantheae, Asteraceae), 2004. NASCIMENTO, A.M.; OLIVEIRA, D.C.R. & ALBUQUERQUE, S. Evaluation of trypanocidal activity from Calea uniflora (Heliantheae-Asteraceae) extracts. Revista Brassileira de Farmacognosia 12 (Supl), p. 49-50, 2002. RADFORD, A.E.; DICKSON, W.C.; MASSEY, J.R. & BELL, C.R. Vascular Plant Systematics. Harper & Row Publischers, New York, 1974. RIBEIRO, V.L.; AVANCINI, C. & GONÇALVES, K. Acaricidal activity of Calea serrata (Asteraceae) on Boophilus microplus and Rhipicephalus sanguineus, Vet Parasitol. 14(151): 351-354, 2008. RIBEIRO, V.L.; SANTOS, J.C.; MARTINS, JR.; SCHRIPSEMA, J.; SIQUEIRA, I.R.; VON POSER, G.L., et al. Acaricidal properties of the essential oil and precocene II obtained from Calea serrata (Asteraceae) on the cattle tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari: Ixodidae). Vet Parasitol. 30(179): 195-198, 2011. RIBEIRO, V.L.; VANZELLA, C.; MOYSÉS, F.S.; SANTOS, J.C.; MARTINS, J.R.S.; VON POSER, G.L., et al. Effect of Calea serrata Less n-hexane extract on acetylcholinesterase of larvae ticks and brain Wistar rats. Vet Parasitol. 26(189): 322-326, 2012. ROQUE, N. & CARVALHO, V.C. Estudos taxonômicos do gênero Calea (Asteraceae, Neurolaeneae) no estado da Bahia, Brasil. Rodriguésia, Vol. 62, p. 547–561, 2011. ROQUE, N. & BAUTISTA, H.P. Asteraceae - caracterização e morfologia floral. Salvador: EDUFBA, 2008. SOUZA, W. Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicada às Ciências Biológicas. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrônica, p. 1-44, 1998. TAKEDA, I.J.M. & FARAGO, P.V. Vegetação do Parque Estadual de Vila Velha - Guia de Campo. Gráfica Plastipel, Curitiba, 2001.

TRABALHO 8

Operação Rondon-UEPG: Um relato Multiprofissional em Ibaiti-PR

Guilherme dos Anjos Camargo (G) DEFAR-UEPG E-mail: guuicamargo.gc@gmail.com Janice Caroline Hardt (G) DEQUIM-UNIOESTE E-mail: janice.hardt@hotmail.com

Camila Thomaz dos Santos (PG) HURCG-UEPG E-mail: camithomazs@hotmail.com Silvio Luiz Rutz da Silva (PQ) DEFIS-UEPG E-mail: slrutz@gmail.com

Luciana de Boer Pinheiro de Souza (PQ) DEQUIM-UEPG E-mail: lucianaboer@gmail.com

Resumo: A Operação Rondon UEPG é um projeto de integração social envolvendo participação de universitários voluntários em busca de soluções para o desenvolvimento sustentável em comunidades paranaenses. A Operação ocorreu em seis municípios do Paraná, no período de 19 a 29 de julho de 2015. Este é um relato de experiência de três estudantes dos cursos de Química Licenciatura (UNIOESTE), Farmácia (UEPG) e Residência Multiprofissional em Saúde do Idoso – Cirurgiã Dentista (HURCG - UEPG), participantes da Operação Rondon UEPG no município de Ibaiti – PR. O relato trata da realização da oficina intitulada “Mostra de Ciências”, com o intuito de aproximar os alunos dos processos relacionados as ciências, por meio de atividades experimentais voltadas à área da química, criando problemas reais que permitiram a contextualização e o estímulo de questionamentos de investigação. A oficina foi realizada em três colégios de Ibaiti: Colégio Estadual Aldo Dallago, Colégio Estadual Martins de Mello e Centro Estadual de Educação Profissional; atingindo cerca de 260 alunos do Ensino Fundamental ao Médio. Observou-se que a experimentação motivou os participantes, que perceberam que atividades simples do cotidiano estão relacionadas com a ciência. Para os rondonistas, a experiência da oficina foi de suma importância visto que estes conseguiram compartilhar e construir conhecimentos de forma multiprofissional, relacionando as áreas da Química, Farmácia e Odontologia, e reconhecendo que sem a participação na Operação Rondon, esta experiência não existiria. Palavras-chave: Multiprofissionalidade, Interdisciplinaridade, Projeto de Extensão, Operação Rondon. 1. Introdução A atuação multiprofissional consiste em uma modalidade de trabalho onde o coletivo é a principal característica, ou seja, baseia-se na reciprocidade e na interação dos profissionais, buscando intervenções múltiplas individuais ou coletivas. A comunicação verbal é o centro para ocorrer o trabalho multiprofissional, onde se compartilham conhecimentos com interação mútua no momento de planejar e colocar em prática as ações multiprofissionais de promoção à saúde e de prevenção contra doenças e agravos (PEDUZZI, 2001). A interdisciplinaridade vem sido discutida há algum tempo, mas segundo relatos não é possível obter um conceito específico para tal. A ciência está subdivida em três grandes áreas: humanas, sociais e exatas, caracterizando a disciplinaridade. Há a possibilidade de um diálogo interdisciplinar que aproxime os saberes específicos, vindos das diversas áreas do conhecimento, de modo que seja compreensível a todos os envolvidos (JAPIASSU, 1976; LANGOSKI et al., 2015). O trabalho interdisciplinar em saúde é essencial como uma prática dentro do enfoque filosófico multiprofissional, pois a ciência não é exclusiva para uma área em específico. O paciente, os conhecimentos compartilhados e o impacto das ações também devem ser considerados assuntos relevantes à equipe multiprofissional. Este grupo de profissionais diferenciados terão diferentes pontos de vista, favorecendo a prática científica. A construção dessa prática acontece quando pensamos juntos, agimos em equipe, colaboramos para que todas as ideias e experiências sejam expostas e associadas às vivências de cada profissional. Não se limita à metodologia de ser somente uma ciência. Há a busca de diversos fragmentos que se concentram em um único conhecimento, pelo compartilhamento de saberes e vivências (ALVES, E. D., 2010; JAPIASSU, 1976).

Durante a Operação Rondon UEPG os conceitos de acidez e basicidade de produtos do nosso cotidiano foi trabalhado de forma interdisciplinar. A Operação Rondon UEPG é um projeto de integração social, que envolve universitários voluntários com o objetivo de buscar soluções para o desenvolvimento sustentável em comunidades do estado do Paraná. A Operação ocorreu em seis municípios paranaenses, no período de 19 a 29 de julho de 2015. Os conceitos de acidez e basicidade podem ser trabalhados por diversas áreas do conhecimento, não apenas pela Química, tratada neste trabalho também pela Farmácia e Odontologia. Algumas observações que são feitas pela maioria das pessoas por meio do senso comum já foram utilizadas pelos químicos para classificar as substâncias como ácidos e bases, conforme Bruice (2006):

Inicialmente os químicos chamavam qualquer substância de que tinha gosto azedo de ácido (do latim acidus, azedo). Alguns ácidos eram familiares, como ácido cítrico (encontrado no limão e em outras frutas cítricas), ácido acético (encontrado no vinagre) e ácido hidroclórico (presente no estômago ácido – o gosto azedo associado ao vômito). Substâncias que neutralizam ácidos, como cinza de madeira e outras cinzas de plantas, eram chamadas de bases, ou substâncias alcalinas (cinzas, em árabe, é al kalai). Limpadores de vidros e soluções designadas a desentupir esgotos são soluções alcalinas (BRUICE, 2006, p. 39).

Este é um relato de experiência de estudantes dos cursos de Química Licenciatura (UNIOESTE), Farmácia (UEPG) e Residência Multiprofissional em Saúde do Idoso – Cirurgiã Dentista (HURCG - UEPG), participantes da Operação Rondon UEPG no município de Ibaiti – PR, da oficina intitulada “Mostra de Ciências”. 2. Objetivos A oficina “Mostra de Ciências” teve por objetivo aproximar os alunos dos processos relacionados as ciências, com atividades experimentais voltadas à área da química utilizando materiais que a maioria dos alunos tem em casa e assim criar problemas reais que permitam a contextualização e o estímulo de questionamentos de investigação. 3. Materiais e Métodos A Oficina foi realizada em três colégios de Ibaiti: Colégio Estadual Aldo Dallago, Colégio Estadual Martins de Mello e Centro Estadual de Educação Profissional. Houve a participação total de cerca de 260 alunos do Ensino Fundamental ao Médio. A Mostra de Ciências teve como foco principal relacionar os conceitos de acidez e basicidade com o cotidiano dos alunos e orientá-los sobre os perigos de utilizar essas substâncias sem cuidados prévios. Para isso, verificou-se os conhecimentos dos estudantes em relação a esses conceitos de ácido e base, a partir de alguns produtos utilizados de forma rotineira (Figura 1 – vinagre, suco de limão, água sanitária, solução de bicarbonato de sódio e sabão em pó) e em seguida, questionamentos foram realizados sobre as propriedades destes produtos:

“Qual desses produtos é ácido e qual é básico?” “Vocês sabem nos dizer a diferença entre ácido e base?”

“Qual o gosto de uma substância ácida? E de uma substância básica?”

Figura 1 – Produtos utilizados para a Mostra de Ciências

Na sequência, testou-se a acidez e basicidade destes produtos utilizando um indicador ácido-base caseiro de beterraba (Figura 2) e discutiu-se os conceitos químicos envolvidos.

Figura 2 – Indicador caseiro (confeccionado com extrato de beterraba)

Após a experimentação, os participantes foram novamente questionados em relação a outras substâncias de seu cotididiano.

“Conhecem alguém próximo a vocês que faz sabão em casa?” “O que eles utilizam para realizar o sabão?”

“É uma substância ácida ou básica?” “Quem ajuda a mãe a lavar o banheiro?”

“O que ela utiliza de produtos para limpeza?” “Ela fecha a porta no momento da limpeza do banheiro?”

Depois de todas as orientações realizadas ao final das perguntas, passou-se para o último experimento: bexiga na garrafa (Figura 3). Neste experimento, ocorre uma reação ácido-base, por existir uma

quantidade de vinagre (ácido acético) dentro da garrafa e bicarbonato de sódio (base) no interior da bexiga, que ao entrarem em contato, reagem e tem como um de seus produtos um gás, o dióxido de carbono (CO2), o qual irá encher a bexiga. A equação química (01) que representa esta reação esta apresentada a seguir:

NaHCO3(s) + CH3COOH(aq) → CH3COONa(aq) + H2O(l) + CO2(g) (01) Assim, pode-se explicar de forma mais simples as perguntas anteriormente realizadas.

Figura 3 – Experimento da Bexiga na Garrafa (reação ácido-base: pelo contato entre o vinagre e

o bicarbonato de sódio, formando um gás)

Para finalizar os experimentos na Mostra de Ciências, realizaram-se outros questionamentos.

“Quais outras substâncias que vocês conhecem que são ácidas ou básicas?” “E o refrigerante?”

Após as devidas respostas, foi realizada orientação sobre a ingestão em excesso de refrigerante, partindo dos princípios da existência de ácido fosfórico elevado e pH baixo, finalizando com as consequências que essas substâncias podem causar ao organismo. 4. Resultados e Discussão Após o questionamento sobre quais seriam as substâncias ácidas e básicas, sem uma orientação prévia sobre os conceitos, percebeu-se que a maioria dos participantes sabiam responder quais eram as substâncias ácidas – limão e vinagre –, porém havia certa dificuldade de entenderem o que seria uma substância considerada básica. Considerando essa constatação esclareceu-se as diferenças entre as duas características, com o auxílio de uma tabela de orientação de pH que uma substância ácida possui pH menor que 7,0 e uma básica pH maior que 7,0. Em seguida, utilizou-se o indicador caseiro em todas os produtos. Nas substâncias ácidas, a coloração violeta da beterraba ficava mais intensa, e nas substâncias básicas – sabão, água sanitária e bicarbonato de sódio – permanecia incolor ou não alterava a intensidade da coloração. Em relação ao questionamento do sabão, a maioria dos participantes relataram que conheciam algum familiar que produzia sabão caseiro a base de soda cáustica (NaOH). Ao serem indagados, todos os alunos responderam que NaOH (hidróxido de sódio) era um ácido, pois é uma substância perigosa e que provoca queimaduras na pele. Explicou-se, então, que não são somente os ácidos são perigosos e responsáveis por causarem queimaduras na pele, mas que as substâncias básicas, como o NaOH, também podem ser extremamente prejudiciais ao organismo.

Quanto a limpeza do banheiro, a maioria dos participantes relataram que eles ou seus familiares, na maioria dos casos as mães, misturam diferentes produtos de limpeza e fecham a porta do banheiro para lavar o mesmo. Orientou-se, então, quanto aos perigos de se misturar os produtos de limpeza e de manter o ambiente fechado durante a limpeza. Pode-se exemplificar os perigos com o mesmo princípio do experimento da bexiga na garrafa, pois vários dos componentes misturados podem reagir e liberar gases tóxicos para aqueles que os aspirarem, mesmo que o gás que foi produzido na bexiga não era tóxico. Ainda mais porque quando misturam as substâncias, a maioria dos alunos e seus familiares não conseguem saber se há formação de produtos tóxicos. Cinco crianças (das diferentes escolas) relataram que a intoxicação já aconteceu com algum familiar e que precisou de atendimento médico hospitalar. Em relação a ingestão de produtos ácidos, orientou-se sobre a ingestão de refrigerante, sendo que cada Rondonista relatou experiências químicas realizadas em laboratório para comprovar as possibilidades de risco a saude das substâncias que compõem os refrigerantes. A rondonista acadêmica de Química explicou sobre a quantidade de ácido fosfórico isolada de um refrigerante e esclareceu sobre o risco que altas quantidades do mesmo podem causar, como por exemplo a descalcificação óssea. O rondonista acadêmico de Farmácia relatou sobre o experimento da determinação do pH do mesmo refrigerante (pH 2,3) e explicou que pacientes com quadro clínico de gastrite e úlcera gástrica devem evitar o consumo já que estão debilitados e, portanto, a ingestão da substância pode agravar o problema. Por sua vez a rondonista da Odontologia esclareceu ainda que o pH baixo da substância, acidifica o pH da saliva e com isso a pessoa que ingere o refrigerante (ou outro alimento qualquer) fica mais suscetível a formação de doenças bucais, como a cárie, demonstrando a importância da higiene bucal (responsável por manter o pH da saliva dentro da neutralidade). Portanto, durante a realização da Mostra de Ciências foi possível relacionar a Química com as áreas da saúde como Farmácia e Odontologia, favorecendo o trabalho multiprofissional. 5. Conclusão Observou-se que a experimentação proporcionou o interesse dos alunos, que puderam perceber que atividades simples do cotidiano estão relacionadas com a ciência. Para os Rondonistas, a experiência da oficina foi de suma importância visto que estes conseguiram compartilhar e construir conhecimentos, relacionando as áreas da Química, Farmácia e Odontologia. A Operação Rondon UEPG foi um projeto de extensão essencial para a formação profissional destes estudantes que puderam aprender sobre o conceito de trabalho multiprofissional e sua aplicabilidade. Referências ALVES, E.D. Curativos, estomias e dermatologia: uma abordagem multiprofissional. Malagutti, W. Kakihara, C.T. (orgs.) São Paulo: Martinari, ISBN 978.85.89788.62-5 2010, 544p. BRUICE, P. Y. Química Orgânica. 4. ed. v. 1. São Paulo: Pearson Prentice Hall, 2006. JAPIASSU, H. Interdisciplinaridade e patologia do saber. Rio de Janeiro: Imago, p.01-220, 1976. LANGOSKI, J.L., SANTOS, C.T., RODRIGUES, A.L. Atividades lúdico interativas a um grupo de idosos: relato de experiência de residentes multiprofissionais. Anais VI CONGRESSO IBERO-AMERICANO DE PROGRAMAS UNIVERSITÁRIOS PARA ADULTOS MAIORES – Eixo: Saúde, Nutrição e Qualidade de Vida – Comunicação Oral. Ponta Grossa: RIPUAM, v.1, p. 1-19, 2015. PEDUZZI, M. Atualização - Equipe multiprofissional de saúde: conceito e tipologia. Rev Saúde Pública, v.35, n.1, p.103-109, 2001.

TRABALHO 9 Análise farmacobotânica comparativa de Mikania cordifolia (L.f.) Willd. e

M. microptera DC.

Valter Paes de Almeida1 (IC) E-mail: valterpaesdealmeida@gmail.com Inês Janete Matozzo Takeda2 (PQ) E-mail:inestakeda@yahoo.com.br

Jane ManfronBudel3 (PQ) E-mail: janemanfron@hotmail.com 1Aluno de iniciação científica do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa; 2 Pós-doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa; 3 Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela orientação do trabalho.

Resumo: Mikania Willd. pertence à família Asteraceae e apresenta várias atividades farmacológicas. Mikania cordifolia e M. microptera, popularmente conhecidas como “guaco", ocorrem no Sul do Brasil, a morfologia externa é muito semelhante. O objetivo deste estudo foi investigar as características farmacobotânicas de folha e caule de M. cordifoliae M. microptera a fim de fornecer suporte adicional para diferenciar esses taxa. As folhas e caules foram investigados por microscopia eletrônica de varredura e de microscopia de luz. Estas espécies apresentam diferenciação morfoanatômica na forma da folha e da base foliar; na presença de estômatos; na forma da nervura central, pecíolo e caule em secção transversal; no padrão vascular do pecíolo, na presença do anel esclerenquimático e na presença dos dutos secretores e cristais na medula. Palavras-chave: Asteraceae, droga vegetal, controle de qualidade. 1. Introdução MikaniaWilld. pertence à família Asteraceae e à tribo Eupatorieae. É composto por 198 espécies, no Brasil habitam de Norte a Sul do país, sendo encontradas principalmente em São Paulo, Rio de Janeiro, Minas Gerais e Rio Grande do Sul. Mikania spp. apresenta uma vasta gama de atividades farmacológicas promissoras principalmente como expectorante, anti-inflamatório, broncodilatador, anti-hemorrágico, antiasmático, analgésico, antimutagênico antimicrobiano antifúngico, relaxante muscular e anti-reumático. O uso inadequado de nomes populares é, definitivamente, uma causa de graves erros na identificação de drogas vegetais. Uma mesma espécie muitas vezes têm vários nomes comuns e, assim como um nome popular pode designar várias outras espécies. Mikania cordifolia e M. microptera, conhecidas popularmente como "guaco", ocorrem no Sul do Brasil e sua morfologia externa é semelhante, podendo ocasionar equívocos durante o uso da planta medicinal. Os dados anteriores revelaram que M. cordifolia tem ação anti-inflamatória, insecticida, tripanocida, genotóxica e anti-proliferativa. Mikania microptera é semelhante à M. cordifolia na sua morfologia externa. No entanto, nenhuma caracterização farmacológica ou química está foi determinada para M. microptera. 2. Objetivos Considerando a morfologia externa semelhante de M. cordifolia e M. microptera, o objetivo deste trabalho foi estudar as características farmacobotânicas de folhas e caules de M. cordifolia e M. microptera a fim de fornecer suporte adicional para diferenciar esses taxa, contribuindo para o controle da qualidade de drogas vegetais e fitoterápicos. 3. Materiais e Métodos 3.1 Materiais botânicos As partes aéreas de pelo menos cinco espécimes de M. cordifolia e M. microptera foram coletadas na Fazenda São Maximiano, que está localizado na região da Serra do Sudoeste, na cidade de Guaíba, Estado do Rio Grande do Sul, Brasil (coordenadas 30 ° 10 'S e 51 ° 20' W e 27 m de altura).

Mikania cordifolia foi coletada em setembro de 2012 e M. microptera em dezembro de 2003. Os materiais botânicos foram identificados e registrados na Universidade Federal do Rio Grande do Sulsob os números ICN 116,543 e 129,447, para M. cordifolia e M. microptera, respectivamente. 3.2 Análises anatômicas As folhas e caules de M. coridifolia e M. microptera foram seccionadas em cerca de cinco centímetros a partir do ápice. Em seguida, foram colocados em recipientes contendo solução de FAA 70 (JOHANSEN, 1940), e armazenados em etanol a 70% (BERLYN et al., 1976). As plantas foram seccionadas à mão livre. Algumas seções foram coradas utilizando azul de astra e/ou fucsina básica (ROESER, 1972). Algumas fotomicrografias foram capturadas por microscópio de luz Olympus CX31 equipado por uma unidade de controle C7070. As lâminas semi-permanentes, foram analisadas no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa para permitir uma descrição detalhada dos tecidos da folha e do caule. 3.3 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) O material foi desidratado em uma série etanólica crescente e pelo ponto crítico no aparelho Balzers CPD-030. Após a desidratação, o material foi revestido com ouro, utilizando-se o aparelho Balzers-Sputtering SCD-030. O microscópio de varredura Jeol JSM-6360LV foi utilizado para capturar micrografias eletrônicas (SOUZA, 1998). Os resultados foram realizados no Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do Paraná. 4. Resultados e Discussão Várias espécies de Mikaniamostram morfologia semelhante, a exemplo de M. Glomerata Spreng. e M. laevigata Sch. Bip. ex Baker, M. lanuginosa DC. e M. hirsutissima DC., M. confertissima Sch. Bip. ex Baker, M. hatschbachii G.M. Barroso e M. glomerata, Mikania hirsutissima e M. microlepsis Baker. Tal como no caso dos outras, a morfologia de M. cordifolia e M. microptera é semelhante. Mikania cordifolia possui folhas que tem 4,5-7 cm de comprimento e 3,5-6,5 cm de largura. As folhas são simples, pecioladas com 5 veias visíveis e opostas. A forma do limbo é deltoide, o ápice acuminado, a base hastado-cordada e a margem é paucidenteada. As folhas de M. microptera têm 6,5-13 cm de comprimento e 5,5-13 cm de largura, pecioladas com 5 veias visíveis e opostas. São simples, de forma triangular e têm um ápice acuminado, a base hastada e margem paucidentada. Anatomicamente, em vista frontal da lâmina foliar, as paredes celulares da epiderme são anticlinais e finas, sinuosas na face abaxial e ligeiramente onduladas na face adaxial em ambas as espécies. Além disso, a epiderme é coberta por uma cutícula lisa, mas está ligeiramente estriada perto dos estômatos. Mikania cordifolia só exibe estômatos anomocíticos no lado abaxial e M. microptera mostra o mesmo padrão em ambos os lados. Estômatos anomocíticos são comuns em Mikania. No entanto, anisocíticos (BUDEL et al., 2009) e actinocíticos (NEVES & SÁ, 1991) foram descritos para espécies de Mikania. No que diz respeito à ocorrência de estômatos, M. cordifolia mostra folhas hipoestomáticas e M. microptera tem folhas anfiestomáticas. Folhas hipoestomáticas são comuns em Mikania, como M. glomerata, M. laevigata, M. confertissima, M. hatschbachii DC., M. hookeriana, M. microlepsis e M. smilacina DC. No entanto, folhas anfiestomáticas foram encontradas na M. congesta DC. (OLIVEIRA et al., 1994), M. lanuginosa (AMORIM et al., 2014) e M. micrantha Kunth (ARAÚJO et al., 2015). A lâmina foliar, em corte transversal, tem uma epiderme unisseriada coberta por cutícula delgada e os estômatos estão localizados no mesmo nível que as outras células da epiderme, em ambas as espécies. No que diz respeito aos tricomas glandulares, o primeiro é bisseriado capitado e estão localizados em depressão na epiderme. Neste estudo, tricomas semelhantes são mais abundantes em M. microptera. Outro tipo de tricoma glandular é o unisseriado multicelular, que pode se apresentar curvado.

O tricoma tector é cônico e pode ser longo ou curto. Os três tipos relatados foram encontrados em espécies de Mikania (OLIVEIRA et al., 1994; RODRIGUES et al., 1996; OLIVEIRA et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2000; OLIVEIRA & AKISUE, 2005; AMORIM et al., 2014; ARAÚJO et al., 2015). O mesofilo das folhas de M. cordifolia e M. microptera é do tipo dorsiventral. O parênquima paliçádico é composto por uma camada e o parênquima esponjoso exibe várias camadas e tem alguns pequenos espaços intercelulares. A forma da nervura central de ambas as espécies, em secção transversal, é biconvexa em ambos os lados. No entanto, M. cordifolia tem uma forma redonda e M. microptera tem proeminências obtusas. A epiderme é unisseriada, coberta por uma cutícula lisa em ambas as espécies. Existem 4 camadas de colênquima angular no lado adaxial e 1-2 camadas no lado abaxial para ambas as espécies. Há 5-6 feixes vasculares colaterais em arco aberto. Dutos secretores ocorrem entre os feixes vasculares e são compostas de 4-12 células com um epitélio unisseriadas em ambas as espécies. O colênquima angular e o tipo e distribuição do feixe vascular colateral são características comuns de Mikania (NEVES & SÁ, 1991; RODRIGUES et al., 1996; BUDEL et al., 2009; GASPARETTO et al., 2010; AMORIN et al., 2014; ARAÚJO et al., 2015). Neste estudo, as características do pecíolo podem ajudar a diferenciar estes taxa. Mikania cordifolia tem uma forma côncava-convexa em secção transversal e M. microptera tem uma forma plana-convexa. Adicionalmente, existe uma forma arredondada no lado abaxial em M. cordifolia, duas nervuras na face adaxial e 3 nervuras no lado abaxial em M. microptera. A epiderme tem as mesmas características anteriormente descritas para a lâmina foliar. Na face abaxial, há 3-4 camadas contínuas de colênquima angular em M. cordifolia e 1-2 em M. microptera. O sistema vascular tem feixes colaterais vasculares, com 8-9 feixes vasculares em arco aberto em M. cordifolia e 10-12 feixes vasculares em forma de U em M. microptera. O caule em secção transversal tem formato hexagonal em ambas às espécies, embora tenha alas em M. microptera. A forma do caule cilíndrico parece ser o padrão em Mikania (RITTER, MIOTO, 2005), embora M. malacolepsis e M. micrantha tenham forma hexagonal (RODRIGUES et al., 1996). A epiderme do caule é muito semelhante ao da epiderme da folha para essas espécies, uma vez que possui estômatos, cutícula lisa, e ambos os tricomas glandulares e tector. No entanto, os estômatos estão localizados acima das outras células epidérmicas em M. cordifolia. Oliveira et al. (2000), descreveram este complexo estomático como parecendo uma torre. Abaixo da epiderme, há 2-3 camadas contínuas de colênquima angular em M. cordifolia e um em M. microptera, exceto nas costelas, onde existem várias camadas de colênquima. Mikania cordifolia tem um anel esclerenquimático no córtex, onde as células têm paredes de espessura reduzida e um lúmen. No entanto, Mikania microptera não têm quaisquer sinais deste achado. A endoderme liga o córtex internamente e contêm grãos de amido em ambas as espécies. Calotas de fibras perivasculares podem ser observadas ao lado do floema. A zona cambial é evidente e forma mais xilema do que floema. Em ambas as espécies, a medula é bem desenvolvida e compreende células parenquimáticas de paredes finas e isodiamétricas. Ductos secretores podem ser encontrados no córtex e perto do floema em ambas as espécies, no entanto, eles só aparecem na região perimedular em M. cordifolia. A presença ou ausência de cristais e seu tipo pode ser caracterizada como uma característica taxonômica (LERSTEN & HORNER, 2000; MERIC, 2009) e cristais não têm sido citados no gênero Mikania (OLIVEIRAet al., 1994; RODRIGUES et al., 1996; OLIVEIRA et al., 1999; OLIVEIRA et al., 2000; OLIVEIRA & AKISUE, 2005; BUDEL et al., 2009; AMORIM et al., 2014; ARAÚJO et al., 2015). Em contraste com esta informação, cristais prismáticos só foram observados na região perimedular de M. cordifolia. A ocorrência de cristais é comum em plantas, embora o seu tamanho e número sofram alterações da concentração de cálcio no ambiente (NAKATA, 2003).

5. Conclusão Embora as espécies estudadas apresentem características morfoanatômicas semelhantes, algumas características podem ser consideradas como diagnóstico. Como, a forma do limbo que na M. cordifolia é deltoide e na M. microptera é triangular, a forma da base do limbo é hastato-cordada em M. cordifoliae hastada em M. microptera. Quanto à presença de estômatos, a folha de M. cordifolia é classificada como hipoestomática e da M. microptera é anfiestomática. Mikaniacordifolia, em secção transversal, possui proeminências arredondadas na nervura central e em M. microptera, essas proeminências são obtusas. A forma do pecíolo em secção transversal é côncava-convexa, com uma forma arredondada na face abaxial em M. cordifolia é plano-convexa, com duas costelas na face adaxial e três na abaxial em M. microptera. O arranjo do feixe vascular do pecíolo em M. cordifolia é em arco aberto e em M. microptera em forma de U. A forma do caule em secção transversal nas duas espécies estudadas é hexagonal, masM. micropterapossui alas. Quanto ao anel esclerenquimático, ductos secretores e cristais na medula, M. cordifolia é presente, mas em M. microptera é ausente. Essas características morfoanatômicas descritas para folha e caule das espécies analisadas, auxiliam na diferenciação e identificação, fornecendo subsídios farmacobotânicos para o controle de qualidade de drogas vegetais e fitoterápicos. Referências: AMORIN, M., et al.Pharmacobotanical study of the leaf and stem of Mikanialanuginosa for its quality control.Braz. J.Pharm.,Vol.24, p.531-537, 2014. APPEZZATO-DA-GLÓRIA, B., et al.Glandular trichomes on aerial and underground organs in Chrysolaena species (Vernonieae – Asteraceae): Structure, ultrastructure and chemical composition.Flora, Vol.207, p.878–887, 2012. ARAÚJO, F.F., et al.Pharmacobotanical Characters of Mikaniamicrantha (Asteraceae) and its Support for Quality Control.Lat., Am., J., Pharm., Vol.34(3), p.437-42, 2015. ARIAS, A.R., et al.Mutagenicity, insecticidal and trypanocidal activity of some Paraguayan Asteraceae.J.,Ethnopharmacol., Vol.45, p.35-41, 1995. BERLYN, G.P.; MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry.Eames: Iowa StateUniversity, Vol.276, p.121, 1976. BUDEL, J.M., et al.Caracteres anatômicos de folha e caule de CaleaunifloraLess.,Asteraceae. Braz., J., Pharm., Vol.16(1), p.53-60, 2006. BUDEL, J.M., et al.Contribuição ao estudo farmacognóstico de Mikanialaevigata Sch. Bip. ex Baker (guaco), visando o controle de qualidade da matéria-prima.Braz., J.,Pharm., Vol.19, p.545-552, 2009. BUDEL, J.M.; DUARTE, M.R. Estudo farmacobotânico de partes vegetativas aéreas de BaccharisanomalaDC.,Asteraceae. Braz., J., Pharm., Vol.18, p.761-768, 2008. CAMILOTTI, J.G., et al.Anatomical Characters of Leave and Stem of CaleaserrataLess.,Asteraceae.Braz., Arch., Biol., Technol., Vol.57(6), p.867-873, 2014. CASTRO, M.M., et al.Utilização de estruturas secretoras na identificação dos gêneros de Asteraceae de uma vegetação de cerrado. Braz., J., Bot., Vol.20(2), p.163-174, 1997. DEGEN, R., et al.Problemática de nombrescomunes de plantas medicinales comercializadas enParaguay.Dominguezia, Vol. 21(1), 2005. DIAS, M.G.,et al.Efeito genotóxico e antiproliferativo de Mikaniacordifolia (L.F.) Willd. (Asteraceae) sobre o ciclo celular de Allium cepa L. Rev., Bras., Pl., Med., Campinas, Vol.16(2), p.202-208, 2014. EMPINOTTI, C.B.; DUARTE, M.R.Estudo anatômico de folha e caule de ElephantopusmollisKunth (Asteraceae).Rev.,Bras.,Farmacogn., Vol.18(1), p.108-116, 2008. GASPARETTO, J.C., et al.MikaniaglomerataSpreng. e M. laevigata Sch. Bip. ex Baker, Asteraceae: estudos agronômicos, genéticos, morfoanatômicos, químicos, farmacológicos, toxicológicos e uso nos programas de fitoterapia do Brasil.Braz., J.,Pharm., Vol.20(4), p.627-640, 2010. JASINSKI, V.C.G., et al.Morpho-anatomical characteristics of Baccharisgraziovii in support of its pharmacobotany.Braz., J., Pharm., Vol.24, p.609-616, 2014. JOHANSEN, D.A.Plant microtechnique. New York (NY): MacGraw Hill Book, p.41, 193, 1940. KING, R.M.; ROBINSON, H.The genera of the Eupatorieae (Asteraceae). St. Louis: Missouri Botanical Garden, Vol.22, 1987. LERSTEN, N.R.; HORNER, H.T.Calcium oxalate crystal types and trends in their distribution patterns in leaves of Prunus (Rosaceae: Prunoideae).Plant.,Syst.,Evol., Vol.224, p.83-96, 2000. LORENZI, H.; MATOS, F.J. de A., editors.Plantas medicinais no Brasil: nativas e exóticas.2nd. ed. – Nova Odessa: InstitutoPlantarum, 2008. MERIC, C.Calcium oxalate crystals in some species of the tribe Inuleae (Asteraceae).ActaBiol.,Cracov., Ser., Bot., Vol.51, p.105-110, 2009. MILAN, P., et al.Comparative Leaf Morphology and Anatomy of Three Asteraceae Species.Braz.,Arc., Biol., Technol., Vol.49(1), p.135-144, 2006. MOURÃO, V.B., et al. Anti-hemorrhagic effect of hydro-alcoholic extract of the leaves of Mikaniaglomerata in lesions induced by Bothropsjararaca venom in rats.ActaCirúrgicaBrasileira, Vol.29(1), 2014.

MUELAS-SERRANO, S., et al.In vitro screening of American plant extracts on Trypanosomacruziand Trichomonasvaginalis.J.,Ethnopharmacol., Vol.71, p.101-107, 2000. NAKATA, P.A.Advances in our understanding of calcium oxalate crystal formation and function in plants.Plant Science, Vol.164, p.901-909, 2003. NEVES, L.J.; SÁ, M.F.A.Contribuição ao estudo das plantas medicinais MikaniaglomerataSpreng. Rev., Bras., Farm., Vol.72, p.42-47, 1991. OLIVEIRA, F.; AKISUE, G.Fundamentos de farmacobotânica. 2nd. ed. – São Paulo: Atheneu, 2005. OLIVEIRA, F., et al.Caracterização morfo-histológica e verificação da atividade microbiológica da espécie vegetal MikaniacordifoliaWilld.Lecta, Vol.18, p.33-63, 2000. OLIVEIRA, F., et al.Estudo farmacognóstico da almécega-da-praia – MikaniaconfertaGardn.Lecta, Vol.17, p.43-68, 1999. OLIVEIRA, F., et al.Morfologia externa das partes aéreas e anatomia foliar das espécies brasileiras de MikaniaWilldenow secção Globosae Robinson: visão farmacognóstica.Lecta, Vol.12, p.23-65, 1994. PAUL, R.K.; JABBAR, A.; RASHID, M.A.Antiulcer activity of Mikaniacordata.Fitoterapia, Vol.71, p.701-703, 2000. PELUSO, G., et al.Studies on the inhibitory effects of caffeoylquinic acids on monocyte migration and superoxide ion production.J., Nat., Prod., Vol.58(5), p.639-649, 1995. PEREIRA, C.B., et al.A New Contribution to the Pharmacognostic Study of Carquejas: BaccharismillefloraDC.,Asteraceae.Lat., Am., J., Pharm., Vol.33(5), p.841-7, 2014. PÉREZ-AMADOR, M.C., et al.Phytochemical and pharmacological studies on Mikaniamicrantha H.B.K (Asteraceae).Int., J., Exp., Bot., Vol.79, p.77-80, 2010. RÍOS, V.E., et al.Sesquiterpene lactones from Mikaniamicranta and Mikaniacordifolia and their cytotoxic and anti-inflammatory evaluation.Fitorerapia, Vol.94, p.155-163, 2014. RITTER, M.R.; MIOTTO, S.T.S.Taxonomia de MikaniaWilld. (Asteraceae) no Rio Grande do Sul, Brasil.Hoehnea, Vol.32(3), p.309-359, 2005. RODRIGUES, R.F.O.; OLIVEIRA, F.; KATO, E.T.M.Morfodiagnose da droga conhecida como cipó-almécega – Mikaniamalacolepsis Robinson.Rev.,Farm., e Bioquím., Vol.32(1), p.37-44, 1996. ROESER, K.R. Die nadel der schwarzkiefermassenproduktundkunstwerk der natur.Mikrokosmos, Vol.61, p.33-36, 1972. SOUZA, W.Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicada as Ciências Biológicas.Rio de Janeiro (RJ): Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrônica, p.1-44, 1998. The Plant List – a working list off all plant species. [cited 2015 May 22]. Available from: http://www.theplantlist.org/. TRINDADE, L.M.P.; FERNANDES, Y.S.; GONÇALVES, L.A. Diversidade e desenvolvimento dos tricomas glandulares de Lomatozonaartemisiifolia Baker (Asteraceae - Eupatorieae) - uma planta endêmica do Cerrado de Goiás.Iheringia, Vol.69(2), p.235-243, 2014. YOUSSEF, J., et al.Gochnatiapolymorpha: macro- and microscopic identification of leaf and stem for pharmacognostic quality control. Braz., J., Pharm., Vol.23(4), p.585-591, 2013.

TRABALHO 10

Caracterização de tumor primário e lesões metastáticas em modelos xenográficos de cancer de mama HER2+ e triplo negativo por PET-FDG

Laís Costa Ayub1 (IC) E-mail: l.costaayub@gmail.com

Raquel de Souza2 (PQ) E-mail: raquel.desouza@utoronto.ca Christine Allen3 (PQ) E-mail: cj.allen@utoronto.ca

1 Acadêmica de Farmácia na Universidade Estadual de Ponta Grossa. 2 Pesquisadora da Universidade de Toronto 3 Professora da Universidade de Toronto

Resumo: O câncer de mama hoje é o mais diagnosticado entre os demias tipos de câncer, e representou a maior porcentagem de mortes por câncer no Canada, em 2014. Os métodos de diagnóstico por imagem, são populares e frequentemente usados por não serem invasivos. O uso de fluorodeoxygluse (FDG) como marcador é bastante descrito na literatura, e apesar de não ser específico (podendo ser metabolisado em órgãos saudáveis) ele é o mais utilizado na clínica. O presente trabalho teve por objetivo identificar o tumor e as lesões metastáticas e quantificar o metabolismo dos mesmos, nos diferentes modelos utilizados. Para isso as linhagens celulares dos modelos triplo-negativo e HER2+(LM2-4 e H2N respectivamente) foram cultivadas em meio de cultura até atingirem a confluência adequada para a inoculação em fêmeas imunocomprometidas. As análises foram realizadas em dois pontos por FDG-PET/CT.A metodologia atingiu o objetivo de identificar e quantificar o metabolismo dos tumores primários e das lesões metastáticas.Houve uma correlação moderada (r2=0,7) entre o tamanho dos tumores primários e a quantidade de FDG acumulada, em ambos os modelos. Já as lesões metastáticas não apresentaram esta correlação entre lesões de um mesmo animal, nem entre lesões do mesmo modelo. A caracterização de modelos clínicos como este é importante para acelerar e facilitar a pesquisa realizada com os mesmos. Palavras-chave: Câncer de mama, caracterização, PET-FDG. 1. Introdução O câncer de mama, atualmente, é o o tipo de câncer mais diagnosticado, e tem a maior porcentagem de mortes por câncer, de 14% das mulheres Canadenses dignosticadas em 2014 (PUBLIC HEALTH AGENCY OF CANADA, 2014). Este tipo de câncer é dividido em quatro grupos: luminal, HER2-positivo (HER2+), normal, e o basal (SORLIE et al., 2001). O presente trabalho é focado nos grupos basal e HER2+. O grupo basal é assim denominado por não apresentar expressão dos receptores de estrogênio (ER), de progesterona (PR) e de fator de crescimento epidermal (HER2), porém expressa genes comumente encontrados em células basais e mioepiteliais da mama. Devido ao status dos receptores de hormônios, o grupo basal também é conhecido como triplo-negativo (TAN et al., 2008).O grupo HER2+ é caracterizado por ter a expressão do oncogene ERBB2 aumentada (REVILLION et al., 1998). As técnicas de mutimodalidade de imagem são de grande relevância para a pesquisa e a clínica, promovendo o diagnóstico, avaliação da terapia e monitoramento da doença. A terapia de emissão de positrões (PET) foi desenvolvida para captar a radiação proveniente do ojeto de estudo. A radiação provém do marcador que é fornecido ao objeto (ALAZRAKI et al., 1995). A PET fornece informações sobre o metabolismo da área de estudo, podendo ter a concentração do marcador, acumulado em um órgão ou tecido, calculada via software que converte o pixel da imagem em concentração de radiação (MBq). O marcador mais popular para essa área de estudo é o 2-[18F]fluoro-2-deoxy-d-glucose (FDG), um análogo da glucose capaz de entrar nas células por meio dos transportadores de glucose (GLUT) e ser parcialmente metabolizado pela via glicolítica. O composto formado que é incapaz de sair da célula é o FDG-6-fosfato (HESS et al., 2014, MACHEDA et al., 2005, VALLABHAJOSLUA, 2007). A tomografia computadorizada (CT) é caracterizada por prover informação tridimensional com alta resolução espacial sobre o objeto de estudo. A radiação provém do equipamento que envia raios-X sobre o objeto, os quais são absorvidos pelos receptores e transformado em imagem (GOLDMAN et al., 2008). Quando as duas modalidades são usadas em conjunto (PET/CT), as informações adquiridas com cada equipamente se complementam, e o que se obtém é uma

imagem coregistrada, com informação sobre a função metabólica de órgãos e tecidos e sua localização espacial dentro do objeto (PURANDARE et al., 2010, SCHODER et al., 2008, HESS et al., 2014). O presente trabalho é parte de um trabalho mais amplo que tem por objetivo caracterizar os modelos triplo-negativo e HER2+ por meio de multiplas modalidades de imagem. As modalidades utilizadas foram: bioluminescência, CT de alto contraste, ressonância magnética, fluorescência, microscopia ótica. 2. Objetivos Este trabalho possui dois objetivos principais: (1) identificar os tumores primários e as lesões metastáticas e (2) caracterizar o metabolismo dos tumores primários e das lesões. 3. Materiais e Métodos 3.1 Cultura de células As linhagens LM2-4 e H2N foram doadas pelo Dr Robert Kerbel, do Instituto de Pesquisa Sunnybrook, Toronto. Elas foram cultivadas em monocamadas em meio de Dulbecco, com 10% de soro fetal bovino. Foram mantidas em estufa à 37oC, com 5% de CO2, até que a confluência de 70-80% fosse atingida. Então as células foram colhidas usando tripsina (0,25% EDTA-tripsina) e suspendidas em novo meio.A quantificação de células viáveis foi feita usando o BIO-RAD TC10TM. 3.2 Modelo animal Foram utilizadas doze fêmeas imunocomprometidas (SCID), de 6-7 semanas de idade. Os animais foram comprados do Instituto de Câncer de Ontario, Toronto, e aleatóriamente divididas em dois grupos com seis animais cada. Uma suspensão de 4x106 células foi inoculada na glândula mamária inguinal direita, para cada animal. 3.3 FDG-PET/CT Duas sessões de imagem foram realizadas, a primeira 15 a dias após a inoculação das células, quando os tumores primários atingiram 150-250 mm3. Esta primeira sessão é descrita adiante como semana 1. Após a sessão os tumores primários foram cirurgicamente retirados, para que as lesões metastáticas pudessem ser formadas sem que o animal sofresse por causa do tamanho do tumor primário. Então, no 35o dia após a inoculação a segunda sessão foi realizada, a fim de avaliar o aparecimento das lesões metastáticas. 3.4 Processamento e análise das imagens Todas as imagens foram reconstruídas usando um algorítimo de projeção, e foram analisadas e co-registradas usando o software Inveon Research Workplace (IRW). As imagens do PET e do CT foram sobrepostas usando o software, para que as imagens do PET pudessem ser analisadas em contexto anatômico. Contornos dos tumores primários e lesões metastáticas foram feitas usando uma ferramenta de contorno do IRW, para criar as regiões de interesse (RDI). Com o RDI, obtem-se o volume e a radioatividade emitida. A dose injetada (%DI/g) foi calculada, corrigindo a concentração da dose em relação ao seu tempo de meia-vida. O músculo da perna esquerda foi considerado o tecido base para o consumo de FDG. Assim sendo, os RDIs foram normalizados, antes de serem analisados para a discussão. 3.5 Análise estatística Para os tumores primários, utilizou-se a regressão linear para avaliar a correlação entre volume e consumo de FDG.Com relação as lesões metastáticas realizou-se ANOVA (p<0,05). 4. Resultados e Discussão 4.1 Tumores primários Um animal do grupo LM2-4 morreu antes da segunda sessão, devido a uma complicação após a cirurgia, e por isso não foi incluído na análise estatística.

Todos os animais produziram tumores primários, dentro dos primeiros 7 dias após a inoculação das células. Na figura 1 é possível identificar o períminvasão da cavidade peritoneal.

Figura 1. Cópia de como as imagens são vistas no software IRW. Na imagem PET/CT podedo tumor, e a esquerda o contorno com o RDI.

No modelo LM2-4, os animais tiveram volumes de tumores primários de 215.9 ± 44.0 mm259.4 mm3) e consumo de FDG entre 4.51tiveram volume médio de tumor primário de 161.6 ± 48.5 mmFDG entre 3.41-14.70. Em teoria, espera-se que os tumores em geral tenham o consumo aumentado em comparação com os tecidos-base, pois como descrito na literatura células tumorais contém uma maior concentração de hexokinase, favorecendo maior concentração de glucose e FDG intracelular (MACHEDA et al., 2005, VALLABHAJOSULA et al., 2007). Porém, o microambiente dos tumores é muito heterogênio e a necrose, assim como a hipóxia pode interferir com o consumo e distribuição de FDG dentro do tumor, afetando o resultado (CLSHA et al., 2013). O gráfico abaixo mostra a correlação entre volume (mmtumores primários, e ambos tiveram valores de rquanto mais o tumor cresce, menor é

Figura 2. Gráfico de correlação entre consumo de FDG e volume dos tumores primários de ambos os modelos.

0

5

10

15

20

25

0 50

Tu

mo

ur-

to-m

usc

le R

ati

o

Tumour Volume (mm3)

Correlation between tumour volume

and tumour

Todos os animais produziram tumores primários, dentro dos primeiros 7 dias após a inoculação das células. Na figura 1 é possível identificar o perímetro do tumor, sugerindo que não houve

Figura 1. Cópia de como as imagens são vistas no software IRW. Na imagem PET/CT pode-se perceber o contorno do tumor, e a esquerda o contorno com o RDI.

tiveram volumes de tumores primários de 215.9 ± 44.0 mm

) e consumo de FDG entre 4.51-22.33. Enquanto isso, os animais do modelo H2N tiveram volume médio de tumor primário de 161.6 ± 48.5 mm3 (94.1-201.4 mm

se que os tumores em geral tenham o consumo aumentado em comparação base, pois como descrito na literatura células tumorais contém uma maior

concentração de hexokinase, favorecendo maior concentração de glucose e FDG intracelular (MACHEDA et al., 2005, VALLABHAJOSULA et al., 2007). Porém, o microambiente dos tumores é muito heterogênio e a necrose, assim como a hipóxia pode interferir com o consumo e distribuição de FDG dentro do tumor, afetando o resultado (CLAUSEN et al., 2013,

O gráfico abaixo mostra a correlação entre volume (mm3) e consumo de FDG no interior dos tumores primários, e ambos tiveram valores de r2 de aproximadamente 0,72. O que sugere que quanto mais o tumor cresce, menor é o consumo do FDG.

Figura 2. Gráfico de correlação entre consumo de FDG e volume dos tumores primários de ambos os modelos.

y = -0,129x + 42,22R² = 0,726

y = -0,086x + 22,41R² = 0,725

100 150 200 250 300

Tumour Volume (mm3)

Correlation between tumour volume

and tumour-to-muscle ratio

LM2

H2N

Linear (LM2

Todos os animais produziram tumores primários, dentro dos primeiros 7 dias após a inoculação etro do tumor, sugerindo que não houve

se perceber o contorno

tiveram volumes de tumores primários de 215.9 ± 44.0 mm3 (174.9-22.33. Enquanto isso, os animais do modelo H2N

201.4 mm3) e consumo de

se que os tumores em geral tenham o consumo aumentado em comparação base, pois como descrito na literatura células tumorais contém uma maior

concentração de hexokinase, favorecendo maior concentração de glucose e FDG no meio intracelular (MACHEDA et al., 2005, VALLABHAJOSULA et al., 2007). Porém, o microambiente dos tumores é muito heterogênio e a necrose, assim como a hipóxia pode interferir com o

AUSEN et al., 2013,

) e consumo de FDG no interior dos de aproximadamente 0,72. O que sugere que

Figura 2. Gráfico de correlação entre consumo de FDG e volume dos tumores primários de ambos os modelos.

0,129x + 42,22R² = 0,726

0,086x + 22,41R² = 0,725

LM2-4

H2N

Linear (LM2-4)

O declínio no consumo de FDG pode estar relacionado com a presença de hypóxia. Com o crescimento da massa tumoral, a vascularização do núcleo é prejudicada. O tumor perde a capacidade de prover nutrientes para esta região. Para tentar reverter o quadro, sinais para angiogênese são liberados, porém os vasos produzidos são porosos e de estrutura muito frágil.Com sistema linfático também inadequado no microambiente, os fluídos se acumulam, e aumentam a pressão do núcleo o que favorece a hipóxia (BARONZIO et al., 2000, POUYSSEGUR et al., 2006). 4.2 Lesões metastáticas Dois animais, um de cada grupo, não produziram lesões metastáticas e foram retirados da análise estatística. Dos animais restantes, todos desenvolveram de 3 à 4 lesões detectáveis, independentemente do modelo de câncer. As lesões do modelo LM2-4 que tiveram volumes superiores a 50 mm3, tiveram um baixo consumo de FDG (<10). No modelo H2N volumes, de lesões, superiores a 80mm3, também tiveram consumo reduzido. Os gráficos de correlação das lesões de cada animal foram plotados, porém não houve correlação entre volume e consumo de FDG entre lesões de um mesmo animal, ou entre lesões do mesmo grupo. Sugere-se que a avaliação da presença de necrose ou hipóxia seja feita, para avaliar melhor o microambiente. Notou-se que algumas regiões onde as lesões se desenvolveram, era frequente para os animais de ambos os grupos (Figura 3).

Figura 3. Localizações das lesões metastáticas mais frequentes observadas entre os modelos estudados.

Levando essas localizações em consideração, notou-se que somento o modelo H2N teve consumo de FDG maior que 20, em relação ao modelo LM2-4 (Figura 4).

Figura 4. Gráfico de consumo pela localização das lesões metastáticas. A linha pontilhada representa uma divisão

para a melhor visualização da diferença entre os modelos estudados.

O resultado do ANOVA mostraram que não há diferença estatística entre os modelos. Mas ao investigar o grupo H2N, apenas 3 animais (de 5) tiveram as lesões com o consumo maior do que 20. Na verdade, todas as lesões destes animais foram acima de 20 (Figura 5). Examinando o perfil destess animais, foi constatado que eles não tiveram nenhuma diferença física (como peso (g))em relação aos animais do mesmo grupo, e nem com os animais do grupo LM2-4.A quantidade de célula inoculada foi a mesma para todos os animais. Ambos os modelos são conhecidos por serem altamente metastáticos, sendo a única diferença a expressão dos receptores para o fator de crescimento epidermal.

Figura 5. Gráfico de correlaçã de consumo de FDG por localização de lesão de cada animal de ambos os modelos

estudados.

Na literatura já foi declarado que as células, para poderem sobreviver à viagem pelo corpo, precisam se adaptar ao novo microambiente. A mudança é necessária, pois o novo ambiente não necessariamente produz a mesma matriz extracelular que o local do tumor primário (WOOD et al., 2014). As células são dependentes da receptividade do estroma, e são comumente encontradas nos primeiros órgãos/tecidos nos quais seus capilares que possam aparecer em seu caminho durante a circulação (KUMAR et al. 2013). Com isso, os resultados sugerem que as lesões são atraídas para os locais ricamente vascularizados, os quais terão condições de nutri-las. 5. Conclusão A metodologia utilizada atingiu o objetivo de identificar os tumores primários e as lesões metastáticas, bem como quantificar o consumo de FDG específico de cada RDI criada. Referências ALAZRAKI, N.P. Nuclear medicine. JAMA vol. 273, p.1697-1698, 1995. BARONZIO, G.F.; GRAMAGLIA, A.; BARONZIO, A. et al. Influence of tumor microenvironment in thermoresponse: biological and clinical applications. Madame Curie Bioscience Database. Disponível em www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK62/42Acessibilidade verificada em Setembro de 2015. CLAUSEN, M.M.; HANSEN, A.E.; ROSENSCHOLD, P.M. et al. Dose escalation to high-risk sub-volumes based on non-invasive imaging of hypoxia and glycolytic activity in canine solid tumors: a feasibility study. Oncology vol. 8, p.262-265, 2013. HESS, S.; BLOMBERG, B.A.; ZHU, H.J. et al.The pivotal role of FDG-PET/CT in modern medicine.Academic Radiology vol. 21, p.232-249, 2014. MACHEDA, M.L.; ROGERS, R. & BEST, J.D. Molecular and cellular regulation of glucose transporter (GLUT) proteins in cancer. Journal of Cellular Phisiology vol. 202, p.654-662, 2005. POUYSSEGUR, J.; DAYAN, F.& MAZURE, N.M. Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumor regression. Nature vol. 441, p.437-443, 2006. PUBLIC HEALTH AGENCY OF CANADA. http://www.phac-aspc.gc.ca/cd-mc/cancer/breast_cancer-cancer_du_sein-eng.php Acessibilidade verificada em Setembro de 2015. PURANDARE, N.C. & RANGARAJAN, V. PET-CT in oncology. Journal of Postgrad.Med. vol 56, p.103-108, 2010.

REVILLON, F.; BONETERRE, J. & PEYRAT J.P. ERBB2 oncogene in human breast cancer and its clinical significance.European Journal of Cancer vol. 34, p. 791-808, 1998. SCHODER, H.; LARSON, S.M. & YEUNG, H.W.D. PET/CT in oncology: integration into clinical management of lymphoma, melanoma, and gastrointestinal malignancies. SORLIE, T.; PEROU, C.M.; TRIBSHIRANI, R. et al. Gene expression patterns of breast cancer carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci USA vol. 98 p. 10869-10874, 2001. SHA, W.; IWAMOTO, K.S.; WONG, K.P. et al. Factors affecting tumor 18F-FDG uptake in longitudinal mouse PET studies.EJNMMI Research vol. 3, p.51-55, 2013. WOOD, S.L.; PERNEMALM, M.; CROSBIE, P.A. et al.The role of tumor-microenvironment in lung cancer-metastasis relationship to potential therapeutic targets. Cancer Treatment Review vol. 40, p. 558-566, 2014. TAN, D.S.P.; MARCHIÓ, C.; JONES, R.L. et al. Triple-negative breast cancer: molecular features, pathogenesis, treatment and current lines of research. Cancer Treatment Reviews vol. 36, p.206-215, 2010. VALLABHAJOSULA, S. 18-F-labeled positron emission tomographic radiopharmaceuticals in oncology: an overview of radiochemistry and mechanisms ot tumor localization. Journal Sem Nucl. Med. doi:10.1053, 2007.

TRABALHO 11

Caracteres macro e microscópicos de caule e folha de Mikania hastato-cordata Malme, visando o controle da qualidade

Beatriz Eloise Mika (IC) E-mail beatriz_elo@hotmail.com

Jane ManfronBudel(PQ) E-mail janemanfron@hotmail.com

IC – aluno de iniciação científica regularmente registrado na Instituição de Ensino; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: Dentre os gêneros de Asteraceae destaca-se Mikania, que compreende cerca de 450 espécies distribuídas em regiões tropicais e subtropicais. São popularmente conhecidas como “guaco” e muito utilizadas na medicina popular no tratamento de tosses e resfriados por apresentarem atividades expectorante, broncodilatadora, e antissépticas das vias respiratórias. Objetivou-se analisar a morfologia externa e a anatomia do caule e da folha de Mikania hastato-cordata, a fim de fornecer características farmacognósticas para identificação e diferenciação de outras espécies do gênero Mikania, visando o controle de qualidade da matériaprima. O material vegetal foi submetido as técnicas usuais de microscopia de luz e eletrônica de varredura, além de testes microquímicos. Em relação aos caracteres anatômicos, a lâmina foliar apresenta, em vista frontal, células de contorno levemente ondeadas, de paredes anticlinais delgadas. A folha apresenta estômatos do tipo anomocítico somente na face abaxial, caracterizando a folha como hipoestomática e estes se localizam no mesmo nível das demais células epidérmicas. Evidencia-se tricomas glandulares pluricelulares unisseriados, formados por cerca de 5 células, além de tricoma glandularcapitado. O mesofilo é do tipo dorsiventral, sendo constituído por uma camada de parênquima paliçádico e aproximadamente 6 estratos de parênquima esponjoso. A nervura central, em secção transversal, apresenta-se plano-convexa e o sistema vascular está representado por 3 feixes vasculares livres em arco aberto. O pecíolo tem formato cônvavo-convexo, enquanto que o caule tem formato circular, em secção transversal. As características morfoanatômicas descritas para a folha e para o caule de Mikania hastato-cordata auxiliam na identificação da espécie vegetal, além de fornecer dados farmacobotânicos para o controle da qualidade da droga vegetal e de fitoterápicos. Palavras-chave: Anatomia, Asteraceae, farmacobotânica, morfologia.

1. Introdução Dentre os principais gêneros de Asteraceae está Mikania Willd., que pertence à tribo Eupatorie e apresenta cerca de 430 espécies, distribuídas em regiões tropicais quentes e subtropicais dos continentes Americano e Asiático. Aproximadamente 198 espécies ocorrem no Brasil, de Norte a Sul, especialmente nos estados do São Paulo, Rio de Janeiro e Minas Gerais (Ritter& Mioto, 2005; The PlantList, 2014). Várias espécies de Mikania são muito semelhantes morfologicamente e conhecidas pela designação popular de guaco e cipó-cabeludo e amplamente utilizadas pela população para o tratamento de tosses e resfriados. Nesse sentido, vários estudos morfoanatômicos de espécies de Mikania têm sido conduzidos a fim de auxiliar no controle da qualidade da droga vegetal e de fitoterápicos (Budel et al., 2009; Amorin et al., 2014; Araújo et al., 2015). Mikania hastato-cordata Malme, conhecida tradicionalmente como guaco, é uma espécie trepadeira volúvel que apresenta os ramos cilíndricos, estriados, podendo apresentar poucos tricomas ou não. No Brasil, pode ser encontrada nas regiões Sudeste e Sul, em bordas de matas e crescendo sobre vegetação arbustiva, em restinga (Ritter & Mioto, 2005). Na medicina popular, espécies de Mikania são amplamente utilizadas devido aos seus efeitos terapêuticos, a exemplo de expectorante, anti-inflamatório, broncodilatador, antiasmático, antisséptico das vias respiratórias, analgésico, anticarcinogênico, antimutagênico, antimicrobiano, antifúngico, antiulcerogênica, relaxante da musculatura lisa, sudorífero e antireumático (Muellas-Serrano, 2000; Paul et al., 2000; Budel et al., 2009; Gasparetto et al., 2010).

As semelhanças morfológicas e a ausência de informações acerca da caracterização morfoanatômica de espécies vegetais pode acarretar em coletas equivocadas, utilizações incorretas e malefícios à saúde, principalmente devido a intoxicações ou ingestão de subdoses, muitas vezes decorrentes de confusão entre as diferentes espécies pertencentes a um mesmo gênero. Considerando que não existem dados farmacobotânicos de Mikaniahastato-cordata, objetivou-se analisar a morfologia e a anatomia da espécie vegetal a fim de auxiliar na identificação, além de fornecer dados para o controle da qualidade da droga vegetal e de fitoterápicos 2. Materiais e Métodos 2.1. Material vegetal A coleta do material vegetal foi realizada na Fazenda São Maximiano, Guaíba, Rio Grande do Sul. O material vegetal foi submetido à confecção de exsicata, identificado por taxonomista e o representante foi depositado em Herbário da UEPG. 2.2. Análises anatômicas O material vegetal foi coletado a partir de 5 cm do ápice da planta. Folhas e caules de M. hastato-cordata foram fixados em solução de FAA 70 (Johansen, 1940) e armazenados em álcool etílico a 70% (Berlyn&Miksche, 1976). O material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, efetuado à mão livre, foi submetido à coloração de azul de astra e fucsina básica (Roeser, 1972) em lâminas semi-permanentes preparadas para tal fim. Algumas fotomicrografias foram capturadas por um microscópio Olympus CX 31 equipado com uma unidade de controle C 7070. As lâminas semi-permanentes, em seguida, foram analisadas no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa para permitir uma descrição detalhada dos tecidos da folha e do caule. 2.3.Testes microquímicos Para a realização dos testes microquímicos foram feitas secções transversais à mão livre do material e os reativos empregados foram: solução de floroglucina clorídrica para verificação de lignina (Foster, 1949), Sudam III para substâncias lipofílicas (Sass, 1951), cloreto férrico para compostos fenólicos (Johansen, 1940) e lugol para amido (Berlyn; Miksche, 1976). 2.4. Microscopia Eletrônica de Varredura A análise ultra-estrutural de superfície (microscopia eletrônica de varredura - MEV)(Souza, 1998) foi realizada em lâmina foliar e caule e, para tal procedimento, as amostras foram fixadas em FAA 70, desidratadas em série etanólica crescente e pelo ponto crítico no equipamento Balzers CPD-010 e, após montagem em suporte, submetidas à metalização com ouro no aparelho BalzersSputtering SCD-030. As eletromicrografias foram realizadas no microscópio eletrônico de varredura Jeol JSM 6360 LV. 3. Resultados e Discussão Mikania hastato-cordata é um sub-arbusto trepador que apresenta caule cilíndrico e lenhoso. A região dos nós é, frequentemente, acompanhada por folhas de disposição opostas, estas se caracterizam por serem deltoides a triangulares em forma, de ápice acuminado e base hastato a cordada, de margem inteira e pecioladas. As folhas apresentam de 2 a 6 cm de comprimento e de 2 a 4,5 cm de largura em média. Em relação aos caracteres anatômicos, a lâmina foliar apresenta, em vista frontal, células de paredes anticlinais levemente ondeadas e delgadas, cobertas por cutícula lisa, que reagiu com Sudam III. A folha apresenta estômatos do tipo anomocítico somente na face abaxial, caracterizando a folha como hipoestomática e, em secção transversal, estes se localizam no mesmo nível das demais células epidérmicas. Sobre o sistema de revestimento, ocorre presença de cutícula delgada e cera epicuticular esparsa e em forma de rosetas. Mikania hastato-cordata evidencia tricomas glandulares pluricelulares unisseriados, curvos ou não, formados por cerca de 5 células, além de tricoma glandular capitado. Esses anexos

epidérmicos aparecem em depressão na epiderme. Esses anexos epidérmicos são comuns em espécies de Mikania (Budel et al., 2009; Amorin et al., 2014; Araújo et al., 2015).observados tricomas tectores unisseriados côAraújo et al., 2015). O mesofilo é do tipo dorsiventral, sendo constituído por uma camada de paaproximadamente seis estratos de parênquima esponjoso, que evidencia pequenos espaços intercelulares. Feixes vasculares colaterais estão mergulhados na região mediana do mesofilo eaparecem envoltos por uma bainha parenquimática e fresecretores, estes são formados por cerca de seis células, podendo apresentar estrato único ou duplo. A nervura central, em secção transversal, apresentauniestratificada, recoberta por cutícula delgada e levemente estriada. O colênquima é do tipo angular e é representado por cerca de dois estratos em ambas as faces. O sistema vascular está representado por três feixes vasculares do tipo colateral, dispostos em arco aberto, sendo o central de maior porte. Dutos secretores são observados nas proximidades dos feixes vasculares e apresentam características semelhantes às anteriormente descritas. O xilema é constituído por elementos traqueais dispostos em fileira. O pecíolo, quando seccionado traconvexo, e evidencia epiderme uniestratificada coberta por cutícula estriada. Subjacentemente à epiderme, observa-se uma camada de colênquima angular. Cerca de nove feixes vasculares livres, do tipo colateral, em arco aberto, estão mergulhados no parênquima fundamental. O caule, em secção transversal, apresenta formato circular. A epiderme é uniestratificada e revestida por cutícula estriada e apresenta os mesmos tricomasAdjacentemente à epiderme, cerca de seis camadas de colênquima angular são observados. Limitando internamente o córtex, observaamiloplastos, constituindo a bainha amilífera. Os grãos de amido reagiram pospesquisa com lugol. Nas proximidades da bainha, em direção aos feixes vasculares, dutos secretores de estrato único, formados por cerca de oito células podem ser encontrados. O cilindro vascular é constituído por floema em direção centrífuga estabelecendo uma região medular. Calotas de fibras perivasculares são encontradas na região próxima ao sistema floemático e reagiram à pesquisa de lignina. O parênquima medular compõese de células de diversos tamanhos e O contorno do caule, em secção transversal, auxilia na diagnose do fármaco. Nesse sentido, contorno circular também foi observado em (Neves and Sá, 1991) and malacolepsis(Rodrigues et al., 1996) e hexagonal. A espécie em estudo não apresentou dutos secretores na medula, como ocorre em glomerata (Neves and Sá, 1991) e glandulares e dutos secretores incentivam estudos microbiológicos com o óleo essencial presente nessas estruturas.

Figura1 – Vista frontal da face adaxial, evidenciando tricoma glandular unisseriado.

epidérmicos aparecem em depressão na epiderme. Esses anexos epidérmicos são comuns em al., 2009; Amorin et al., 2014; Araújo et al., 2015).

as tectores unisseriados cônicos, comuns em Mikania spp. (Amorin et al., 2014;

O mesofilo é do tipo dorsiventral, sendo constituído por uma camada de parênquima paliçádico e aproximadamente seis estratos de parênquima esponjoso, que evidencia pequenos espaços intercelulares. Feixes vasculares colaterais estão mergulhados na região mediana do mesofilo eaparecem envoltos por uma bainha parenquimática e frequentemente estão associados adutos secretores, estes são formados por cerca de seis células, podendo apresentar estrato único ou

A nervura central, em secção transversal, apresenta-se plano-convexa. A epiderme écula delgada e levemente estriada. O colênquima é do tipo

angular e é representado por cerca de dois estratos em ambas as faces. O sistema vascular está representado por três feixes vasculares do tipo colateral, dispostos em arco aberto, sendo o

maior porte. Dutos secretores são observados nas proximidades dos feixes vasculares características semelhantes às anteriormente descritas. O xilema é constituído por

elementos traqueais dispostos em fileira. O pecíolo, quando seccionado transversalmente na região mediana, tem formato côncavoconvexo, e evidencia epiderme uniestratificada coberta por cutícula estriada. Subjacentemente à

se uma camada de colênquima angular. Cerca de nove feixes vasculares teral, em arco aberto, estão mergulhados no parênquima fundamental.

O caule, em secção transversal, apresenta formato circular. A epiderme é uniestratificada e revestida por cutícula estriada e apresenta os mesmos tricomas mencionados para o limbo foliar.Adjacentemente à epiderme, cerca de seis camadas de colênquima angular são observados. Limitando internamente o córtex, observa-se um estrato de células parenquimáticas contendo amiloplastos, constituindo a bainha amilífera. Os grãos de amido reagiram pospesquisa com lugol. Nas proximidades da bainha, em direção aos feixes vasculares, dutos secretores de estrato único, formados por cerca de oito células podem ser encontrados. O cilindro vascular é constituído por floema em direção centrífuga e xilema formado centripetamente,estabelecendo uma região medular. Calotas de fibras perivasculares são encontradas na região próxima ao sistema floemático e reagiram à pesquisa de lignina. O parênquima medular compõese de células de diversos tamanhos e de parede delgada. O contorno do caule, em secção transversal, auxilia na diagnose do fármaco. Nesse sentido, contorno circular também foi observado em M. lanuginosa (Amorinet al., 2014),

M. Laevigata (Budel et al., 2009). Entretanto, (Rodrigues et al., 1996) e M. cordifolia (Oliveira et al., 2000) mostraram contorno

hexagonal. A espécie em estudo não apresentou dutos secretores na medula, como ocorre em (Neves and Sá, 1991) e M. laevigata (Budelet al., 2009). A presença de tricomas

glandulares e dutos secretores incentivam estudos microbiológicos com o óleo essencial presente

l, evidenciando Figura 2. Secção transversal da nervura central e limbo foliar.

epidérmicos aparecem em depressão na epiderme. Esses anexos epidérmicos são comuns em al., 2009; Amorin et al., 2014; Araújo et al., 2015). Não foram

spp. (Amorin et al., 2014;

rênquima paliçádico e aproximadamente seis estratos de parênquima esponjoso, que evidencia pequenos espaços intercelulares. Feixes vasculares colaterais estão mergulhados na região mediana do mesofilo e

quentemente estão associados adutos secretores, estes são formados por cerca de seis células, podendo apresentar estrato único ou

convexa. A epiderme é cula delgada e levemente estriada. O colênquima é do tipo

angular e é representado por cerca de dois estratos em ambas as faces. O sistema vascular está representado por três feixes vasculares do tipo colateral, dispostos em arco aberto, sendo o

maior porte. Dutos secretores são observados nas proximidades dos feixes vasculares características semelhantes às anteriormente descritas. O xilema é constituído por

nsversalmente na região mediana, tem formato côncavo-convexo, e evidencia epiderme uniestratificada coberta por cutícula estriada. Subjacentemente à

se uma camada de colênquima angular. Cerca de nove feixes vasculares teral, em arco aberto, estão mergulhados no parênquima fundamental.

O caule, em secção transversal, apresenta formato circular. A epiderme é uniestratificada e mencionados para o limbo foliar.

Adjacentemente à epiderme, cerca de seis camadas de colênquima angular são observados. se um estrato de células parenquimáticas contendo

amiloplastos, constituindo a bainha amilífera. Os grãos de amido reagiram positivamente na pesquisa com lugol. Nas proximidades da bainha, em direção aos feixes vasculares, dutos secretores de estrato único, formados por cerca de oito células podem ser encontrados. O cilindro

e xilema formado centripetamente, estabelecendo uma região medular. Calotas de fibras perivasculares são encontradas na região próxima ao sistema floemático e reagiram à pesquisa de lignina. O parênquima medular compõe-

O contorno do caule, em secção transversal, auxilia na diagnose do fármaco. Nesse sentido, (Amorinet al., 2014), M. glomerata

009). Entretanto, M. (Oliveira et al., 2000) mostraram contorno

hexagonal. A espécie em estudo não apresentou dutos secretores na medula, como ocorre em M. A presença de tricomas

glandulares e dutos secretores incentivam estudos microbiológicos com o óleo essencial presente

o transversal da nervura central e limbo foliar.

Figura 3– Secção transversal do peciolo.

4. Conclusão As características morfoanatômicas descritas para a folha e para o caule de auxiliam na identificação da espécie e na difqualidade da matéria prima vegetal. Referências AMORIN, M.; PAULA, J.P.; SILVA, R.Z.; FARAGO, P.V.; BUDEL, J.M.stem of Mikania lanuginosa for its quality controlARAUJO, F.F.; AMORIN, M.; SANTOS, V.L.P.; FRANCO, C.R.C.; FOLQUITTO, D.G.; SILVA, R.Z.; FARAGO, P.V.; TAKEDA, I.J.M.; NAKASHIMA, T.; BUDEL, J.M.and its Support for Quality Control.Lat. Am. J. Pharm., v. 34, n. 3, p.437BERLYN, G.P.; MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry1976, p. 121. BUDEL, JANE.M.; DUARTE, MÁRICA R.; KOSCIUV INP.Contribuição ao estudo farmacognóstico de Mikanialaevigata Sch. Bip. ex Baker (guaco), visando o controle de qualidade da matéria-prima. Rev. Bras. Farmacogn., v. 19, 2009, p. 545GASPARETTO, J.C.; FRANCINETE R. CAMPOS; JANE M. BUDEL; PONTAROLO RM. laevigata Sch. Bip. ex Baker, Asteraceae: estudos agronômicos, genéticos, morfoanatômicos, químicos, farmacológicos, toxicológicos e uso nos programas de fitoterapia do BrasilRev. Bras. Farmacogn., v. 20, 2010, p. 627-JOHANSEN,DONALDA. Plant microtechniqueMALME, G.O.A.N.DieCompositen der zweitenRegnellchenReise.Arkiv fur Botanik 24: 1MUELLAS-SERRANO, NOGAL JJ, MARTÍNEZBARRIO A.S.et. al. In vitro screening of American plant extracts on Trypanosomacruzi and TrichomonasvaginalisEthnopharmacol, v. 71, 2000, p. 101-107. NEVES, L.J., SÁ, M.F.A.,Contribuição ao estudo de plantasmedicinais 72,42-47. 1991. OLIVEIRA, F., RODRIGUES, R.F.O., BASTOS, D.H.M., PEREIRA, F.Hda atividademicrobiológica da espécie vegetal RITTER, M.R.R., MIOTTO, S.T.S. Taxonomia de MikaniaWilld. (Asteraceae) no Rio Grande do Sul.Sul: Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, 2005.RODRIGUES, R.F.I.O., OLIVEIRA, F., KATO, E.T.MMikaniamalacolepsisRobinson. Rev. Farm. Bioquim. 32, 37ROESER, K.R. Die Nadel der Schwarzkiefer36. PAUL, R.K.; JABBAR, A.; RASHID, M.A2000, p. 701-703. The Plant List – a working list off all plant

Figura 4 - Secção transversal do caule.

As características morfoanatômicas descritas para a folha e para o caule de Mikania hastatoauxiliam na identificação da espécie e na diferenciação das demais Mikania e dão suporte ao controle da

AMORIN, M.; PAULA, J.P.; SILVA, R.Z.; FARAGO, P.V.; BUDEL, J.M.Pharmacobotanical study of the leaf and ontrol. Rev. Bras. Farmacogn., v. 24, 531-537, 2014.

ARAUJO, F.F.; AMORIN, M.; SANTOS, V.L.P.; FRANCO, C.R.C.; FOLQUITTO, D.G.; SILVA, R.Z.; FARAGO, P.V.; TAKEDA, I.J.M.; NAKASHIMA, T.; BUDEL, J.M.Pharmacobotanical Characters of Mikaniamicrantha

Lat. Am. J. Pharm., v. 34, n. 3, p.437-442, 2015. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: Iowa State University, v. 276,

BUDEL, JANE.M.; DUARTE, MÁRICA R.; KOSCIUV INDIANARA,MORAIS TATIANE B.; FERRARI LILIAN ontribuição ao estudo farmacognóstico de Mikanialaevigata Sch. Bip. ex Baker (guaco), visando o controle de

. Rev. Bras. Farmacogn., v. 19, 2009, p. 545-552. E R. CAMPOS; JANE M. BUDEL; PONTAROLO R.. MikaniaglomerataSpreng e

M. laevigata Sch. Bip. ex Baker, Asteraceae: estudos agronômicos, genéticos, morfoanatômicos, químicos, farmacológicos, toxicológicos e uso nos programas de fitoterapia do Brasil

-640. Plant microtechnique.New York: McGraw Hill Book, p. 41, 193, 1940.

DieCompositen der zweitenRegnellchenReise.Arkiv fur Botanik 24: 1-89. 1931MARTÍNEZ-DÍAZ RA, ESCARIO JA, MARTÍNEZ-FERNÁNDEZ AR

In vitro screening of American plant extracts on Trypanosomacruzi and Trichomonasvaginalis

Contribuição ao estudo de plantasmedicinais MikaniaglomerataSpreng.

OLIVEIRA, F., RODRIGUES, R.F.O., BASTOS, D.H.M., PEREIRA, F.H..Caracterizaçãomorfohida atividademicrobiológica da espécie vegetal Mikaniacordifolia(Lf) Willd.Lecta 18, 33-63. 2000

Taxonomia de MikaniaWilld. (Asteraceae) no Rio Grande do Sul.Rio Grande do Sul, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, 2005.

RODRIGUES, R.F.I.O., OLIVEIRA, F., KATO, E.T.M.Morfodiagnoseda droga conhecida como cipó. Rev. Farm. Bioquim. 32, 37-44. 1996

ie Nadel der Schwarzkiefer-MassenproduktundKunstwerk der Natur.Mikrokosmos

PAUL, R.K.; JABBAR, A.; RASHID, M.A. Antiulceractivityos Mikania cordata.

a working list off all plant species. Available from: http://www.theplantlist.org/.

transversal do caule.

Mikania hastato-cordata e dão suporte ao controle da

Pharmacobotanical study of the leaf and

ARAUJO, F.F.; AMORIN, M.; SANTOS, V.L.P.; FRANCO, C.R.C.; FOLQUITTO, D.G.; SILVA, R.Z.; FARAGO, P.V.; Mikaniamicrantha(Asteraceae)

Ames: Iowa State University, v. 276,

DIANARA,MORAIS TATIANE B.; FERRARI LILIAN ontribuição ao estudo farmacognóstico de Mikanialaevigata Sch. Bip. ex Baker (guaco), visando o controle de

MikaniaglomerataSpreng e

genéticos, morfoanatômicos, químicos, farmacológicos, toxicológicos e uso nos programas de fitoterapia do Brasil.

1931

FERNÁNDEZ AR, GÓMEZ-In vitro screening of American plant extracts on Trypanosomacruzi and Trichomonasvaginalis. J.

Spreng. Rev. Bras. Farm.

.Caracterizaçãomorfohistológica e verificação

Taxonomia de MikaniaWilld. (Asteraceae) no Rio Grande do Sul. Rio Grande do Rio Grande do Sul, Departamento de Botânica, Instituto de Biociências, 2005.

Morfodiagnoseda droga conhecida como cipó-almécega –

MassenproduktundKunstwerk der Natur.Mikrokosmos, v.61, 1972, p. 33-

. Fitoterapia, v. 71,

species. Available from: http://www.theplantlist.org/.

TRABALHO 12 Citotoxicidade de nanopartículas de ácido hialurônico e lisina/polilisina

em fibroblastos 3T3 Angélica Maria Duda (IC) Email:angelicamariaduda@hotmail.com

Rosana Letícia da Rosa (G) Email: rosanaleticia@hotmail.com Luana Serbai (IC) Email: lserbai@hotmail.com

Jaqueline Carneiro (PG) Email: jaquelinec89@gmail.com Josiane Padilha de Paula (PQ) Email: jopadilha@terra.com.br

Patrícia Mathias Döll Boscardin (PQ) Email: pattydoll@globo.com

G – aluno de graduação; PG – aluno de Pós-Graduação; IC – aluno de iniciação científica regularmente registrado na Instituição de Ensino; PQ – professor responsável pela orientação. Resumo: Os complexos iônicos de ácido-hialurônico/lisina e ácido-hialurônico/polilisina possuem potencial para serem utilizados como preenchedores cutâneos de aplicação tópica. Dessa forma, faz-se necessário investigar a citotoxicidade das nanopartículas de ácido-hialurônico e lisina/polilisina por meio do ensaio de viabilidade celular, sendo utilizado o método de redução do MTT em células 3T3. As nanopartículas foram obtidas pelo método de gotejamento sob agitação. A análise dos resultados de avaliação da citotoxicidade demonstrou que as nanopartículas de ácido hialurônico e lisina (AH-LIS) não reduziram a viabilidade celular dos fibroblastos testados enquanto que as nanopartículas de ácido hialurônico e polilisina (AH-PLIS) foram citotóxicas nas concentrações de 2,5 e 1,25 mg/mL. Palavras- chave: citotoxicidade, nanopartículas, ácido hialurônico, lisina, polilisina. 1. Introdução Segundo Sakata (2007) a nanotecnologia é a área das ciências farmacêuticas que tem como finalidade o desenvolvimento de partículas terapêuticas nas escalas nanométricas ou micrométricas. As nanopartículas poliméricas são aquelas que apresentam tamanho inferior a 1 µm. Podem estar organizadas na forma de nanocápsulas, onde o fármaco encontra-se em um núcleo oleoso rodeado por um invólucro polimérico; ou na forma de nanoesferas, onde o fármaco apresenta-se disperso numa matriz polimérica (SCHAFFAZICK et al., 2003).

Figura 1 – Representação de nanocápsulas e nanoesferas poliméricas

Fonte: Schaffazick et al. (2003) As nanopartículas poliméricas são capazes de alterar as propriedades físico-químicas de formulações melhorando a liberação e a permanência de ativos na pele, dependendo da composição, encapsulação, entre outros (GUTERREZ; ALVEZ; POHLMANN, 2007). Os complexos iônicos de ácido-hialurônico/lisina e ácido-hialurônico/polilisina apresentam-se na forma de pó branco, possuindo potencial para serem utilizadas como preenchedor cutâneo de aplicação tópica. O ácido hialurônico (AH) é um glicosaminoglicano e um polímero de ocorrência natural composto por ligações alternadas entre resíduos de ácido D-glicurônico e N-acetilglicosamina (NELSON; COX, 2011). É altamente hidrofílico e por apresentar grande capacidade de se ligar a água, possui alto poder de hidratação e manutenção da viscoelasticidade da matriz da derme. É

encontrado na pele, sendo as fontes mais comuns: crista de galo, cordão umbilical, tendões, pele e culturas bacterianas (BRANDT; CAZZANIGA, 2007; BORN ,2006). A lisina (LIS) é um aminoácido essencial, ou seja, não é sintetizado pelo organismo sendo preciso obtê-lo por meio da alimentação, possuindo características hidrofílicas. Polilisina (PLIS) é o polipeptídeo formado quando várias moléculas de lisina se unem formando ligações peptídicas (NELSON; COX, 2011). A polilisina é aplicada para liberação de fármacos, remoção de endotoxinas e formação de hidrogéis (SHIH; SHEN; VAN, 2006). 2. Objetivos Investigar a citotoxicidade de nanopartículas de ácido-hialurônico/lisina e nanopartículas de ácido-hialurônico/polilisina por meio do ensaio de viabilidade celular pelo método de redução do MTT em fibroblastos de camundongos (3T3). 3. Material e métodos 3.1. Síntese das nanopartículas As nanopartículas de ácido hialurônico–polilisina (AH-PLIS) e ácido hialurônico–lisina (AH-LIS) foram preparadas de acordo com o método proposto por Oyarzun-Ampuero (2011), com modificações. A relação molar foi calculada utilizando os valores médios de massa molar para o AH e para a PLIS, sendo para o AH, 20000 g.mol-1, para a PLIS, 9500 g.mol-1, e para a LIS, 146,18 g.mol-1.

Tabela 1 – Concentrações utilizadas para as composições AH-PLIS e AH-LIS ____________________________________________ Complexo iônico AH (mol) PLIS (mol) LIS (mol)

AH-PLIS 1 2,5 - AH-LIS 1 - 16400

As soluções de AH e PLIS, ou LIS, foram colocadas em béqueres distintos. A PLIS, ou LIS, foi gotejada utilizando bureta, sobre o AH sob agitação (1700 rpm), com uma taxa de gotejamento de 2,5 mL/minuto. A solução, então, foi seca em estufa a 40º C. O procedimento foi realizado em triplicata.

Figura 2 - Esquema da preparação dos compostos AH-PLIS e AH-LIS

3.1.1 Diâmetro médio de partícula O diâmetro médio de partícula foi determinado no ZetaSizer Nano ZS90 (Malvern) a 25oC, na concentração de 1 mg.ml-1, em triplicata. As amostras foram levadas para análise de tamanho de partícula em suspensões aquosas (água Milli-Q), e utilizou-se uma cubeta Glass cell 12mm (PCS1115 Malvern). 3.1.2 Análises morfológicas e de superfície A avaliação morfológica e de superfície foi realizada por microscopia eletrônica de varredura (MEV), em microscópio SSX-550 (Shimadzu Co.). As amostras secas foram levadas para a estufa a vácuo TE 395 (Tecnal), fixadas em suporte metálico e, então, submetidas à metalização com ouro no equipamento IC–50 Ion Coater (Shimadzu Co.). As micrografias foram obtidas em diferentes magnificações, de acordo com cada amostra, empregando voltagens de aceleração de 10 ou 15 kV.

3.2. Ensaio de viabilidade celular pelo método de redução do MTT A linhagem celular de fibroblastos de camundongos 3T3 foram cultivadas rotineiramente em garrafas de 25 ou 75 cm2 com meio Dulbecco Mem (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 24 mmol.L-1 de bicarbonato de sódio e antibiótico (penicilina 10000 UI e estreptomicina 10 mg.mL-1 ). As garrafas foram mantidas a 37º C em estufa com atmosfera úmida e 5 % de CO2. O método de redução do MTT foi empregado para a avaliação da citotoxicidade do ácido hialurônico, lisina/polilisina em fibroblastos 3T3. O método determina a capacidade das células reduzirem o sal solúvel brometo 3-(4,5)dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2il-tetrazólico formando cristais insolúveis de coloração violeta. As células 3T3, em meio Dulbecco Mem (DMEM) contendo 10% de SFB, foram semeadas em placas de 96 poços (2,5 x 105 células/poço) e mantidas sob condições de cultura (37 ºC em estufa com atmosfera úmida e 5 % de CO2) por 24 horas. Posteriormente, foram adicionadas diferentes concentrações de nanopartículas de ácido-hialurônico/lisina e ácido-hialurônico/polilisina (2,5 mg.mL-1, 1,25 mg.mL-1, 0,625 mg.mL-1 e 0,3125 mg.mL-1). Essas concentrações foram obtidas a partir da diluição das amostras em meio de cultivo DMEM suplementado com 10% de SFB. As células foram incubadas por 24 horas consecutivas a 37º C em estufa com atmosfera úmida e 5 % de CO2. Após o período de incubação, o sobrenadante foi desprezado e às células foi adicionado uma solução de MTT a 0,5 mg.mL-1. Em seguida, as culturas foram incubadas a 37 ºC durante 60 minutos e ao abrigo da luz. Para a solubilização dos cristais de formazan, produto da redução do MTT, o dimetilssulfóxido (DMSO) foi adicionado e a leitura espectrofotométrica da absorbância, em comprimento de onda de 550 nm, foi realizada em leitor de placas (Biotek, µQuant). Meio DMEM suplementado com 10% de SFB foi empregado como controle negativo. A viabilidade celular foi determinada pela comparação dos valores de absorbância obtidos para células tratadas e não tratadas. 4. Resultados e discussão Os complexos iônicos formados apresentaram-se na forma de pó branco. O tamanho nanométrico das partículas, visto pelas imagens de MEV, condizem com os dados de tamanho médio de partícula obtidos pelo Zetasizer, de 117,5 nm e 134,1 nm, para as partículas AH-PLIS e AH-LIS, respectivamente.

Figura 3 – Aspecto morfológico das nanopartículas (a) AH-PLIS (b) AH-LIS por microscopia eletrônica de varredura

O efeito das nanopartículas de ácido hialurônico e lisina (AH-LIS) e das nanopartículas de ácido hialurônico e polilisina (AH-PLIS) sobre a viabilidade das células 3T3 foi avaliado por meio do ensaio do MTT durante 24 horas. As concentrações utilizadas foram: 2,5 mg.mL-1, 1,25 mg.mL-1,

0,625 mg.mL-1 e 0,3125 mg.mL-1. O controle negativo foi feito empregando meio de cultivo sobre as células aderidas. Os resultados da citotoxicidade estão apresentados nas Figuras 4 e 5. As nanopartículas de ácido hialurônico e polilisina (AH-PLIS) apresentaram toxicidade para as células, pois houve diminuição significativa na porcentagem de células viáveis nas concentrações de 2,5 mg.mL-1 e 1,25 mg.mL-1. As nanopartículas de ácido hialurônico e lisina (AH-LIS) não reduziram a viabilidade celular dos fibroblastos testados, sendo que estas nanopartículas promoveram inclusive um aumento significativo na viabilidade celular na concentração de 2,5 mg.mL-1.

2,5

1,25

0,62

5

0,31

25

contro

le

0

50

100

150

*** *

Via

bili

dad

e ce

lula

r (%

)

Figura 4 – Efeito das nanopartículas de AH-PLIS sobre a viabilidade de fibroblastos 3T3, após 24 horas, pelo ensaio de redução do MTT. As concentrações testadas estão em mg/mL. Os resultados estão expressos como média ± EPM (erro padrão da média) (n=8). Os testes estatísticos utilizados foram Anova, seguida pelo teste post-hoc de Tukey. * P<0,05 e *** P<0,001 quando comparados ao grupo controle.

2,5

1,25

0,62

5

0,31

25

contro

le

0

50

100

150

*

Via

bili

dad

e ce

lula

r (%

)

Figura 5 – Efeito das nanopartículas de AH-LIS sobre a viabilidade de fibroblastos 3T3, após 24 horas, pelo ensaio de redução do MTT. As concentrações testadas estão em mg/mL. Os resultados estão expressos como média ± EPM (erro padrão da média) (n=8). Os testes estatísticos utilizados foram Anova, seguida pelo teste post-hoc de Tukey. * P<0,05 quando comparado ao grupo controle.

5. Conclusão Nanopartículas de AH-PLIS, nas concentrações mais elevadas, reduziram a viabilidade celular e precisam ser reavaliadas quanto ao seu possível efeito citotóxico. Nanopartículas de AH-LIS não apresentaram potencial citotóxico para os fibroblastos 3T3 e ainda foram capazes de estimular a proliferação celular. Referências BORN, T. Hyaluronic Acids. Clinics in Plastic Surgery. v.33. p.525-538, 2006. BRANDT, F.S.; CAZZANIGA, A. Hyaluronic acid fillers: Restylane and Perlane. Facial Plastic Surgery Clinics of North America. v.15. p.63-76, 2007. GUTERREZ, S. S.; ALVEZ, M. P.; POHLMANN, A. R. Polymeric nanoparticles, nanospheres and nanocapsules, for cutaneous aplications. Drug Target Insights. v.2. p.147-157, 2007. NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2011. 1273p. SAKATA, S.; UCHIDA, K.; KAETSU, I.; KITA, Y. Programming control of intelligent drug releases in response to single and binary environmental stimulation signals using sensor and electroresponsive hydrogel. Radiat. Phys. Chem., Amsterdam, v.76, p.733-737, 2007. SCHAFFAZICK, S. R. et al. Caracterização e estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados para administração de fármacos. Química Nova. v.26. n.5. p.726-737, 2003. SHIH, I-L; SHEN, M-H; VAN, Y-T. Microbial synthesis of poly(e-lysine) and its various applications. Bioresource Technology. v.97. p.1148-1159, 2006.

TRABALHO 13

DESENVOLVIMENTO E VALIDAÇÃO DE MÉTODO CLAE PARA DETERMINAÇÃO DA EFICIÊNCIA DE ENCAPSULAÇÃO DE EFAVIRENZ

EM MICROPARTÍCULAS POLIMÉRICAS

Amanda Martinez Lyra (PG) E-mail amandinhamlyra@gmail.com Traudi Klein (PQ1) E mail traudiklein@yahoo.com.br Paulo Vitor Farago (PQ) E mail pvfarago@gmail.com

PG – aluna de Pós-Graduação; PQ1 – responsável pela co-orientação. PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: Um método simples de CLAE/UV foi desenvolvido e validado para a quantificação de efavirenz (EFV) em micropartículas poliméricas. Condições cromatográficas: coluna C-18 acoplada à pré-coluna, fase móvel metanol:água (87:13, v/v) em modo isocrático, fluxo de 1,0 mL.min-1, detecção UV a 252 nm. Foram avaliados os seguintes parâmetros: especificidade, linearidade, limites de detecção e de quantificação, precisão, exatidão e robustez. O método foi específico, linear (r = 0,9983) numa faixa de 8,0 a 50,0 µg.mL-1, com limites de detecção e quantificação de 0,099 e 0,30 µg.mL-1, respectivamente. A precisão foi demonstrada por um desvio padrão relativo médio inferior 1 %. Foi obtida % exatidão de 100,08 ± 0,62. O método demonstrou ser simples, rápido, robusto e adequado para quantificação de EFV em micropartículas poliméricas. Palavras-chave: CLAE, Validação analítica, Eudragit® L100, Eudragit® S100 1. Introdução Efavirenz (EFV) é um dos antirretrovirais de primeira escolha para o tratamento da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (SIDA/AIDS) (DE CLERQ, 2011). É um inibidor da transcriptase reversa não análogo de nucleotídeo, frequentemente utilizado em combinação com outros antirretrovirais como parte da terapia antirretroviral altamente ativa e é a primeira escolha para o tratamento de crianças acima de 3 anos (ALVES et al., 2010; BOYD, 2011; HOFFMAN, et al., 2014). O fármaco pertence ao grupo II do Sistema de Classificação Biofarmacêutico, com baixa solubilidade em água, o que gera uma baixa e errática biodisponibilidade oral (40 – 45 %). A dose terapêutica para adultos é de 600 mg, que são tomados antes de dormir devido aos efeitos colaterais, como tontura, dor de cabeça, sonolência, amnésia, agitação, depressão e estado mental alterado. Também são reportados casos de alterações laboratoriais (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2012; STORPIRTIS et al., 2011). Com o objetivo de minimizar os efeitos colaterais da terapia, a nanomedicina tem desenvolvido estratégias que podem aumentar a solubilidade e biodisponibilidade de fármacos pouco solúveis em água, como por exemplo, os sistemas microparticulados de liberação de medicamentos. Micropartículas de polímeros biocompatíveis e biodegradáveis tem um ótimo potencial devido à capacidade dos polímeros encapsularem fármacos hidrofóbicos, aumentando a taxa de dissolução nos fluidos biológicos (CHIAPPETTA et al., 2010; TSHWEU et al., 2014). A literatura mostra vários métodos analíticos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), a maioria voltada à quantificação de EFV associado a outros antirretrovirais ou seus metabólitos em fluidos biológicos (SARASA-NACENTA et al., 2001; MATTHEWS et al., 2002); VOLOSOV et al., 2002). Um método desenvolvido para analisar EFV matéria prima e cápsulas, usando coluna de ciano e fase móvel gradiente, com diferentes proporções de metanol, água e ácido trifluoracético, resultou em uma corrida de 40 min (MONTGOMERY et al., 2001). Outros métodos isocráticos para quantificação de EFV foram publicados: para EFV matéria prima e comprimidos, usando acetonitrila:água:H3PO4 (70:30:0,1, v/v) como fase móvel e temperatura a 30 °C (VIANA et al., 2011) e para quantificação em nanopartículas usando acetonitrila:água (70:30, v/v) como

fase móvel (SEREMETA; CHIAPPETTA; SOSNIK, 2013). Entretanto, não há trabalhos na literatura sobre quantificação de EFV matéria prima e em micropartículas, usando metanol em modo isocrático. 2. Objetivo O presente trabalho tem como objetivo o desenvolvimento e validação de um método de CLAE/UV simples, rápido e de baixo custo para quantificação de Efavirenz, matéria prima e micropartículas poliméricas, com o intuito de facilitar a rotina do controle de qualidade da indústria farmacêutica. 3. Material e Métodos Efavirenz foi gentilmente doado pelo Laboratório Farmacêutico Federal Farmanguinhos – FIOCRUZ (Rio de Janeiro, Brasil). Eudragit® L 100 e Eudragit® S 100 (poli(ácido metacrílico co-metacrilato de metila)) foi gentilmente doado pela Evonik Industries (Darmstadt, Alemanha). Etanol PA foi adquirido da Vetec (Rio de Janeiro, Brasil), metanol grau HPLC foi adquirido da Sigma-Aldrich (St Louis, MO, Estados Unidos). Para análises em cromatógrafo líquido foi utilizada água purificada em sistema de purificação Milli-Q Plus, Millipore (Bedford, MA, Estados Unidos). Para o desenvolvimento dos sistemas microparticulados foi utilizada água destilada em equipamento Fanem LTDA (modelo 724/2-A, São Paulo, Brasil). 3.1 Desenvolvimento e Validação do Método Analítico por CLAE 3.1.1 Equipamentos e condições cromatográficas As análises cromatográficas foram realizadas em cromatógrafo Merck-Hitachi (Lachrom D-7000), equipado com detector UV L-7400, bomba L-7100, degaseificador e injetor manual Rheodyne (volume de 20 µL), software Chromquest. As amostras foram injetadas com seringa de 100 µL (Hamilton, Microliter, 710). Foi utilizada coluna de fase reversa GL Sciences Inertsil® ODS3 (150 mm x 4,6 mm, 5 µm), acoplada a pré coluna GL Sciences Inertsil® ODS3 (10 mm x 4 mm, 5 µm). A eluição foi realizada à temperatura ambiente, em modo isocrático, com fase móvel constituída de metanol:água (87:13, v/v), com vazão de 1,0 mL.min-1

. O tempo de análise foi de 5 minutos e detecção em 252 nm. 3.1.2 Preparo das soluções padrão A solução padrão estoque de EFV foi preparada em metanol:água (87:13, v/v) 500 µg.mL-1. Diluições foram realizadas com objetivo de obter soluções com concentração entre 8 e 50 µg.mL-1, onde a concentração de 20 µg.mL-1 foi definida como 100 %. Antes de serem injetadas no cromatógrafo, as soluções foram filtradas em filtro de politetrafluoretileno (PTFE, Cromafil® Xtra, 0,45 µm x 22 mm, Macherey-Nagel GNBH & Co. KG, Düren, Alemanha). 3.1.3 Obtenção dos Sistemas Poliméricos Contendo Efavirenz Após a solubilização do fármaco puro em etanol, o polímero foi acrescentando e a solução foi mantida sob agitação magnética por 15 minutos. Em seguida, foi adicionada água e manteve-se a agitação por mais 15 minutos. A preparação foi então conduzida à secagem por aspersão, utilizando o Spray Dryer Labmaq, modelo MSD 1.0, sob as seguintes condições: pressão 2,0 bar, fluxo 0,2 mL.min-1, 60 °C. A composição das formulações está descrita na Tabela 1. Foram também preparadas formulações sem o fármaco, para controle negativo. Todas as formulações foram obtidas em triplicata.

Tabela 1 – Composição das micropartículas contendo efavirenz

Formulação Fármaco Polímero M1 10 % Eudragit® L100 M2 20 % Eudragit® L100 M3 10 % Eudragit® S100 M4 20 % Eudragit® S100

3.1.4 Desenvolvimento e Validação do Método para Quantificação do Efavirenz Encapsulado às Micropartículas Para avaliar a melhor condição para a corrida cromatográfica, foi realizado um experimento em gradiente exploratório, variando a concentração de metanol de 5 a 100 % em 60 minutos. Após isso, as condições cromatográficas foram otimizadas para se obter uma melhor resolução do pico para EFV. Um controle negativo foi injetado antes das análises para todas as amostras. A validação do método analítico por CLAE foi realizada segundo os critérios propostos pelo International Conferenceon Harmonization of Technical Requirements for the Registration of Pharmaceuticals for Human Use (ICH, 2005) e pela Resolução 899 de 29 de maio de 2003 (ANVISA, 2003). Foram avaliados os seguintes parâmetros: especificidade, linearidade, limites de detecção e de quantificação, precisão, exatidão e robustez. A especificidade foi determinada por análise dos cromatogramas das micropartículas com fármaco em comparação àqueles obtidos das formulações sem fármaco, com o objetivo de confirmar que nenhum componente da formulação interfere na quantificação do EFZ. A linearidade do método foi avaliada por regressão linear usando o método dos mínimos quadrados através da média dos pontos de três curvas de calibração autênticas, nas concentrações de: 8, 14, 20, 26, 32 e 50 µg.mL-1. A inclinação e outros parâmetros das curvas de calibração foram calculadas por regressão linear e análise de variância (ANOVA). Avaliação de cada ponto foi realizada em triplicata. Os limites de detecção (LD) e de quantificação (LQ) foram calculados com base no desvio padrão (DP) e inclinação (S) das curvas de calibração, por meio das Equações 1 e 2.

S

xDPLD

3= (1)

S

xDPLQ

10= (2)

A precisão do método foi determinada seguindo o guia do ICH (ICH, 2005). A precisão foi avaliada em dois níveis: repetibilidade e precisão intermediária. Para repetibilidade, três concentrações (17, 23 e 29 µg.mL-1) foram avaliadas em triplicata. A precisão intermediaria foi avaliada por desvio padrão (DP) e desvio padrão relativo (DPR) de seis injeções a 17 µg.mL-1, analisadas intra-dia, inter-dia e com diferentes analistas. A exatidão foi determinada por análises de recuperação, adicionando-se a quantidade de 3 mg de EFV à solução padrão de EFV (500 µg.mL-1). Alíquota de 60 µL da solução padrão EFV (500 µg.mL-1 ou 800 µg.mL-1) foi diluída para 1,5 mL com fase móvel, em triplicata, resultando em amostras à 20 µg.mL-1 ou 32 µg.mL-1, respectivamente. A % de exatidão do método foi calculada, em triplicata, segundo a Equação 3.

1002032

2032% x

CCExatidão

−

−= (3),

onde, C32 e C20 correspondem ao valor da concentração experimental A robustez foi avaliada nas amostras a 20 µg.mL-1, por variações na taxa de fluxo para 0,995 e 1,005 mL.min-1, e a concentração da fase móvel metanol:água para 86:14 (v/v) e 88:12 (v/v). Teste Tukey de ANOVA foi realizado para avaliar se as variações alteram o resultado das análises cromatográficas. Os resultados foram analisados utilizando o DPR comparando com os valores obtidos para a condição padrão (taxa de fluxo de 1,000 mL.min-1 e fase móvel metanol:água 87:13 (v/v). 3.1.5 Avaliação da Eficiência de Encapsulação Para a determinação da eficiência de encapsulação, as micropartículas foram pesadas (quantidade equivalente a 20 mg de EFV), colocadas em balões volumétricos com 8 mL de metanol:água (87:13, v/v) e mantidas sob agitação magnética por 24 horas. Após, as amostras foram submetidas a banho de ultrassom por 30 minutos, os volumes foram completados para 10 mL, filtrados em PTFE (0,45 µm) e diluídas para 20 µg.mL-1.

4. Resultados e Discussão 4.1 Desenvolvimento e Validação do Método para Quantificação do Efavirenz Encapsulado às Micropartículas O melhor resultado da corrida em gradiente exploratório foi obtido com a fase móvel metanol:água 87:13 (v/v) e fluxo de 1,000 mL.min-1, sendo estas consideradas condições padrão para o restante das análises. O tempo de análise e o tempo de retenção foram 5,0 e 3,5 minutos, respectivamente, o que é adequado para análises de rotina. A especificidade foi demonstrada por comparação dos cromatogramas das micropartículas com e sem fármaco (Figura 1). Os resultados mostram que não há interferência na quantificação e no tempo de retenção do EFV. Sendo assim, é possível confirmar a especificidade do método proposto.

Figura 1 – Cromatogramas do padrão efavirenz e das micropartículas

Onde: A) padrão efavirenz 20 µg.mL-1; B) M1; C) M1 sem fármaco; D) M2; E) M2 sem fármaco; F) M3; G) M3 sem fármaco; H) M4; I) M4 sem fármaco A linearidade do método foi avaliada por meio de seis níveis de concentração. Os resultados estão apresentados na Tabela 2.

BC

DE

FG

HI

BC

DE

A

Tabela 2 – Resumo dos parâmetros da curva de calibração

Efavirenz Faixa linear 8,0 – 50,0 Limite de Detecção 0,099 Limite de Quantificação 0,30 Dados de regressão N 3 Inclinação (α) 61130 Desvio Padrão da Inclinação 1828,027 Desvio Padrão Relativo da

Inclinação (%) 2,99 Intercepto (b) -134350 Coeficiente de correlação (r) 0,9983 *y = ax + b, onde x é a concentração do composto e y é a área do pico

Foi observada relação linear entre a área do pico e a concentração de EFV em uma faixa de concentração de 8,0 a 50,0 µg.mL-1. A equação linear obtida foi y = 61130x – 134350, r = 0,9983. O DPR da inclinação foi de 3 %, estando de acordo com o limite proposto pelo ICH e pela ANVISA de até 5 %. O valor negativo de b foi com intervalo de confiança de 95% da curva de calibração, pelo teste ANOVA. Estes resultados (DPR e valor negativo de b) indicam que a linearidade do método e a pureza do composto estão dentro dos limites aceitáveis (KLEIN; LONGHINI; DE MELLO, 2012). De acordo com o Analytical, Methods Committee (AMC), um valor de coeficiente de correlação próximo a 1 não é necessariamente o resultado de relação linear, e por isso, deve ser aplicado o teste de falta de ajuste (lack of it). Este teste avalia a variação dos valores residuais (HADAD; EMARA; MAHMOUD, 2009). O teste ANOVA para a linearidade está apresentado na Tabela 3. Para a falta de ajuste, o valor de F foi menor que o valor de F tabelado, para o intervalo de 95 % de confiança (α = 0,05), portanto, a regressão linear não apresentou falta de ajuste (KLEIN; LONGHINI; DE MELLO, 2012).

Tabela 3 – Resultados de ANOVA para linearidade do método

Efavirenz SS DF MS F Ftab Modelo 1,2443 x 1013 1 1,2443 x 1013 28,3250 4,494 Resíduo 4.1916 x 1010 16 2,6198 x 109 Linear Falta de ajuste 7,3023 x 109 4 1,8255 x 1010 0,6328 3,259 Erro puro 3.4614 x 1010 12 2,8845 x 109 Não há falta de ajuste Onde: SS: soma dos quadrados; DF: graus de liberdade; MS: soma dos quadrados, F: valor F

do teste; Ftab: valor do F tabelado A menor concentração onde o EFV pode ser detectado (LD) e quantificado (LQ) com aceitável precisão e exatidão foi 0,099 e 0,30 µg.mL-1, respectivamente. Repetibilidade expressa a precisão sob as mesmas condições de operação durante um curto intervalo de tempo. Foi avaliada a precisão intermediária, expressa como variação inter-dia e com diferentes analistas. O teste Tukey avalia a existência de qualquer diferença entre os diferentes níveis de um fator. Até 5 % não há diferença significante na área do pico e no tempo de retenção do EFV. O DPR para repetibilidade nas concentrações 17, 23 e 29 µg.mL-1 foram de 0,33 %, 0, 47 % e 0,17 %, respectivamente. Quanto a precisão intermediária, os valores de DPR foram de 0,62 %, 0,73 % e 1,05 % para intra-dia, inter-dia e segundo analista, respectivamente. Os resultados são apresentados na Tabela 4, confirmando a precisão do método desenvolvido.

Tabela 4 – Dados da repetibilidade e precisão intermediária

Concentração

Teórica (µg.mL-1) Concentração Experimental

(µg.mL-1, Média ± DP*) DPR**

(%) Repetibilidade (n = 9) 17 16,95 ± 0,06 0,33 23 23,05 ± 0,11 0,47 29 29,11 ± 0,05 0,17 Precisão intermediária Intra-dia (n = 3) 17 17,12 ± 0,11 0,62 Inter-dia (n = 3) 17 17,22 ± 0,13 0,73 Diferentes analistas (n = 3) 17 16,99 ± 0,18 1,05 Média ± DP* (n = 9) 17 17,11 ± 016 0,92 *DP: desvio padrão; ** DPR: desvio padrão relativo

A exatidão do método por ensaios de recuperação foi determinado pela preparação de uma amostra com quantidade conhecida de EFV. A % média de recuperação ± DP e DPR foram 100,08 ± 0,62 e 0,62 %, respectivamente. Portanto, estes resultados indicam que o método proposto é considerado exato. Para a avaliação da robustez, o fluxo de 1,000 mL.min-1 e a fase móvel metanol:água 87:13 (v/v) foram consideradas condições padrão. O teste Tukey a nível de 5 % mostrou que não houve diferença significativa na área do pico e o tempo de retenção do EFV quando a taxa de fluxo variou de 1,000 mL.min-1 para 0,995 mL.min-1 (DPR = 0.96 %) e para 1.005 mL.min-1 (DPR = 1.36 %), e quando a concentração da fase móvel variou de 87:13 (v/v) para 86:14 (v/v) (DPR = 1.88 %) e para 88:12 (v/v) (DPR = 0.78 %). Portanto, o método provou ser robusto para o fármaco analisado, sob as condições avaliadas. 4.2 Avaliação da Eficiência de Encapsulação Todas as formulações apresentaram EE maior que 80% com baixos valores de desvio padrão e desvio padrão relativo para as análises em triplicata (Tabela 5). Sendo assim, o método validado foi aplicado com sucesso para a determinação da eficiência de encapsulação em micropartículas carregadas com EFV.

Tabela 5 – Eficiência de Encapsulação das Micropartículas

Micropartículas Eficiência de

Encapsulação (% ± DP*) DPR**

M1 104,25 ± 1,81 1,74 M2 90,34 ± 3,27 3,62 M3 99,65 ± 1,04 1,04 M4 94,01 ± 4,41 4,69 *DP: desvio padrão; ** DPR: desvio padrão relativo

5. Conclusão O método de CLAE foi desenvolvido e validado de acordo com os critérios do ICH e RE 899/2003 da ANVISA e provou ser um ensaio alternativo para quantificação de EFV matéria prima e em micropartículas. Além disso, o método envolve o uso de uma fase móvel simples, sem uso de solução tampão e com mínimo preparo de amostra. Neste estudo, o método provou ser simples, específico, linear, preciso, exato e robusto, com picos bem definidos e boa resolução. O método desenvolvido oferece vantagens sobre outros métodos descritos na literatura e representa uma alternativa para rotina laboratorial de uma indústria farmacêutica, particularmente aquelas de desenvolvimento e produção de formas farmacêuticas antirretrovirais. Referências ALVES, L. D. S. et al. Desenvolvimento de método analítico para quantificação do efavirenz por espectrofotometria no UV-Vis. Quim. Nova, v. 33, p. 1967-1972, 2010. BRAZIL, AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA – ANVISA (2003). Resolution RE nº 899, of May 29, 2003: Guia para Validação de Métodos Analíticos e Bioanalíticos. Disponível em: (http://www.anvisa.gov.br/hotsite/genericos/legis/resolucoes/2003/899_03re_e.pdf).

BOYD, S. D. A Review of recommendations and treatment options regarding the management of HIV infection. American journal of health-system pharmacy: AJHP: official journal of the American Society of Health-System Pharmacists, v. 68, n. 11, p. 991, 2011. BRUNTON, L.L.; CHABNER, B.A.; KNOLLMANN, B.C. As Bases Farmacológicas da Terapêutica – Goodman & Gilman, 12ª ed. McGraw Hill, 2112 p., 2012. CHIAPPETTA, D. A. et al. Efavirenz-loaded polymeric micelles for pediatric anti-HIV pharmacotherapy with significantly higher oral bioavailability. Nanomedicine (Lond), v. 5, n. 1, p. 11-23, 2010. DE CLERCQ, E. Antiviral drugs: current state of the art. J. Clin. Virol., v. 22, n. 1, p. 73-89, 2001. HADAD, G. M.; EMARA, S.; MAHMOUD, W. M. Development and validation of a stability-indicating RP-HPLC method for the determination of paracetamol with dantrolene or/and cetirizine and pseudoephedrine in two pharmaceutical dosage forms. Talanta, v. 79, n. 5, p. 1360-1367, 2009. HOFFMAN, J. T. et al. Determination of efavirenz in human dried blood spots by reversed-phase high-performance liquid chromatography with UV detection. Ther. Drug Monit., v. 35, n. 2, p. 203-208, 2013. INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONIZATION (ICH) of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use (2005) Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology, ICH Steering Committee: Geneva. Dispon(http://www.ich.org/fileadmin/Public_Web_Site/ICH_Products/Guidelines/Quality/Q2_R1/Step4/Q2_R1__Guideline.pdf). KLEIN, T.; LONGHINI, R.; DE MELLO, J. C. P. Development of an analytical method using reversed-phase HPLC-PDA for a semipurified extract of Paullinia cupana var. sorbilis (guaraná). Talanta, v. 88, p. 502-506, 2012. MATTHEWS, C. et al. Determination of efavirenz, a selective non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor, in human plasma using HPLC with post-column photochemical derivatization and fluorescence detection. J. Pharm. Biomed. Anal., v. 28, n. 5, p. 925-934, 2002. MONTGOMERY, E. R. et al. Development and validation of a reverse-phase HPLC method for analysis of efavirenz and its related substances in the drug substance and in a capsule formulation. J. Pharm. Biomed. Anal., v. 25, n. 2, p. 267-284, 2001. SARASA-NACENTA, M. A. et al. Determination of efavirenz in human plasma by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and Applications, v. 763, n. 1, p. 53-59, 2001. SEREMETA, K. P.; CHIAPPETTA, D. A.; SOSNIK, A. Poly(epsilon-caprolactone), Eudragit(R) RS 100 and poly(epsilon-caprolactone)/Eudragit(R) RS 100 blend submicron particles for the sustained release of the antiretroviral efavirenz. Colloids Surf. B. Biointerfaces, v. 102, p. 441-449, 2013. STORPIRTIS, S. et al. Biofarmacotécnica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, cap. 18, p. 187 – 201, 2011. TSHWEU, L. et al. Enhanced oral bioavailability of the antiretroviral efavirenz encapsulated in poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles by a spray-drying method. Nanomedicine (Lond), v. 9, n. 12, p. 1821-1833, 2014. VIANA, O. D. S. et al. Development and validation of a HPLC analytical assay method for efavirenz tablets: a medicine for HIV infections. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 47, p. 97-102, 2011. VOLOSOV, A. et al. Simple rapid method for quantification of antiretrovirals by liquid chromatography—tandem mass-spectrometry. Clin. Biochem., v. 35, n. 2, p. 99-103, 2002.

TRABALHO 14

A importância do exame citopatológico pelo método de Papanicolaou na detecção de alterações inflamatórias cervicovaginais

Autor 1 (G) Caroline Orejana Ghizzi Bentos E-mail: carolorejanaa@gmail.com Autor 2 (G) Maria Carolina Catapan de Assis E-mail: carolcatapn@gmail.com

Autor 3 (G) Camila Vida Selski E-mail: camilaselski@hotmail.com Autor 4 (PQ) Ednéia Peres Machado E-mail: edpmach@ig.com.br

G – aluno de graduação; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: O câncer do colo uterino é uma das principais causas de morte em mulheres economicamente ativas. Foram criados protocolos de rastreamento dessa neoplasia, baseado no método de Papanicolaou, padronizado pelo Ministério da Saúde. Esta metodologia também se mostra útil no rastreamento de inflamações e infecções do trato reprodutivo feminino, muitas vezes identificando agentes causadores de infecções, viabilizando o norteamento terapêutico. Baseado nisto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a relação entre o exame clínico e o citológico de Papanicolaou. Mediante o exposto, esse trabalho teve como objetivo determinar a prevalência de inflamações no exame citopatológico pelo método de Papanicolaou. Foram avaliadas 501 amostras, sendo constatados 351 (70%) casos inflamatórios, um (0,1%) adenocarcinoma endocervical “in situ”, um (0,1%) ASC-H e 144 (29%) normais. A porcentagem de alterações inflamatórias detectadas no exame citopatológico cervicovaginal é alta, demonstrando a importância do exame Papanicolaou na informação dessas alterações como ferramenta no diagnóstico laboratorial de vaginites. Palavras-chave: Teste de Papanicolaou, inflamação, vaginite. 1. Informações Gerais - Introdução O câncer do colo uterino é uma das principais causas de morte por neoplasia em pacientes do sexo feminino, atingindo grande número de mulheres em idade social e economicamente ativa. Na teoria todas as neoplasias cervicais são curáveis em sua fase pré-invasiva, pois o desenvolvimento do carcinoma escamoso invasor é lento, aproximadamente 10 a 12 anos. Com isso foram criados protocolos de rastreamento baseados na analise das células obtidas do colo do útero conforme o que foi proposto por Papanicolaou em 1940. O estudo citológico do esfregaço cervical permite a identificação de um conjunto de alterações classificadas de acordo com a presença e o grau das atipias celulares (PEDROSA et al., 2003). A primeira proposta da avaliação citológica das células obtidas do colo uterino e da vagina por Papanicolaou foi: classe I - ausência de células atípicas ou anormais; classe II - citologia atípica, porém sem evidência de malignidade; classe III - citologia sugestiva, mas não conclusiva para malignidade; classe IV - citologia fortemente sugestiva de malignidade; classe V - citologia conclusiva para malignidade. Um dos problemas dessa classificação é a utilização não homogênea por diferentes laboratórios de citopatologia e a não existência de correspondência com os achados histológicos de biópsias cervicais (PEDROSA et al., 2003). No decorrer dos anos, outros sistemas surgiram, estabelecendo o conceito de neoplasia intraepitelial cervical (NIC), subdivididas em três graus (NIC I, NIC II e NIC III), contudo também apresentavam problemas relacionados ao grande número de definições e à impossibilidade de alcançar consenso entre os especialistas sobre os critérios morfológicos necessários para os diagnósticos (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003). Diante da necessidade de uma nova classificação em 1988, uma oficina de trabalho promovida pelo Instituto Nacional de Câncer (EDA) em Bethesda, criou o sistema Bethesda (TBS), com o objetivo de desenvolver uma descrição dos esfregaços de Papanicolaou que representasse a interpretação citológica de um modo claro (ENGLER, 2012). Com o TBS foram introduzidos os termos lesões intraepiteliais escamosas de baixo (LSIL), que compreende alterações celulares associadas ao HPV e a NIC I e lesões intraepiteliais escamosas de alto grau (HSIL) o qual inclui a NIC II e a NIC III. Também foi criado o termo atipia escamosa

de significado indeterminado (ASCUS), para os casos que não se enquadram na morfologia de processo reativo e não se pode afirmar alteração celular neoplásica, a qual foi dividida em duas subcategorias em 2011: ASC-US para células escamosas atípicas e (ASC-H) nas quais não se pode excluir lesão de alto grau (AGUIAR et al., 2011). A avaliação da adequabilidade da amostra também foi introduzida e é um processo de garantia de qualidade. Uma amostra satisfatória para avaliação deve conter pelo menos 5.000 células pavimentosas bem conservadas em amostras de citologia líquida e de 8.000 a 12.000 células pavimentosas bem preservadas em amostras de citologia convencional. Qualquer amostra com células anormais deve ser considerada satisfatória para avaliação, independentemente do número de células pavimentosas presentes. A amostra é considerada insatisfatória quando possui um número insuficiente de células e/ou tem obscurecimento (em mais de 75% das células) por sangue / artefatos de secagem (ao ar) / excesso de citólise / lubrificante / muco / excesso de células inflamatórias. O sistema Bethesda de 2001 incluiu alterações que se baseiam no acúmulo de dados e nos avanços na compreensão da biologia do câncer cervical (NCI BETHESDA SYSTEM, 2011). Um diagnóstico final da paciente e seu plano terapêutico integram não somente o resultado da citologia cervical, mas também a história, os achados clínicos e outros resultados laboratoriais como as interpretações da biopsia. O método de Papanicolaou foi padronizado pelo Ministério da Saúde, no Brasil, para rastreamento de lesões e neoplasias cervicais, porém também se mostra como uma importante ferramenta no rastreamento de inflamações e infecções do trato reprodutivo feminino, além de contribuir na avaliação da microbiota vaginal normal ou patogênica (ALVES et al, 1991). Permite muitas vezes identificar agentes causadores de infecções, viabilizando o norteamento terapêutico mesmo na ausência de sintomas característicos de inflamação e/ou infecção, proporcionando a diminuição da proliferação do agente microbiano contribuindo indiretamente para a diminuição da cadeia de transmissão humana do HPV (SILVA, 2004). O próprio Papanicolaou apontou, no seu trabalho original, a observação de certas formas bacterianas com limitado valor diagnóstico para câncer, classificando como Classe II em 1954 (KLINE, 1997). O Sistema Bethesda introduziu novos termos como Alterações Celulares Benignas que caracterizam largo espectro de processos não neoplásicos e reativos que ocorrem na cérvice raramente associados displasias ou carcinoma cervical . No relatório do Exame de Citopatologia Vaginal do SUS, dois tópicos constituem as Alterações Celulares Benignas: infecções e alterações reativas, que não devem ser substituídas apenas pela indicação "Negativo para lesão intra-epitelial ou malignidade", proposta pelo TBS 2001 (ABREU & LIMA, 2001) A detecção de inflamações e agentes causais é importante, levando-se em conta que a taxa de mulheres infectadas por algum tipo de microrganismo é frequentemente elevada. Os microrganismos mais comumente encontrados em exames citopatológicos são Gardnerella vaginalis, Trichomonas vaginalis, Candida sp. (MUSIAL, 2009). A importância da identificação de microrganismos causadores de inflamação e/ou lesão é pelo fato destes agentes comumente acometerem o colo uterino vindo a atuar na chamada zona de transformação, estimulando a substituição do tecido glandular em mucosa recoberta por epitélio escamoso, processo conhecido por metaplasia escamosa. Sugere-se que neste processo de diferenciação ocorra maior propensão à gênese do carcinoma do colo uterino, pois essas células são mais permissivas a infecção por HPV. Maximizar a eficiência morfológica é fundamental para atender às expectativas do diagnóstico citológico das infecções cérvico-vaginais, como vaginites e vaginoses (ANJOS, 2010). Pelas análises microbiológicas apresentarem maior especificidade e sensibilidade diagnóstica, o teste de Papanicolaou não as substitui, porém é um método relevante no estudo da microbiologia vaginal, por ser amplamente usado em saúde pública (BIBBO, 1976) Os microbiologistas reconhecem que o diagnóstico de inflamação através do exame de Papanicolaou é seguro (ECKERT et al.,1995 ). A avaliação de alterações oriundas de processo inflamatório de intensidade leve, moderada ou acentuada pode ser aferida através da análise de alterações citoplasmáticas ou nucleares e podem ser seguramente identificados microrganismos tais como Lactobacillus sp., Gardnerella vaginalis, Leptotrix vaginalis, Actinomyces sp.,

Trichomonas vaginalis e Candida sp., além das alterações citopáticas pelo papiloma vírus humano, o HPV e herpes simplex, o HSV. (AMSEL et al, 1983 ) Por considerar relevante a contribuição do exame Papanicolaou no diagnóstico laboratorial de alterações inflamatórias, o projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde da mulher: coleta de Papanicolaou”, elabora laudos citopatológicos descritivos, relatando tanto as alterações reativas celulares oriundas de processo inflamatória como descreve detalhadamente as alterações da microbiota vaginal. 2. Objetivo Determinar a prevalência de inflamações do epitélio cervicovaginal no exame citopatológico pelo método de Papanicolaou. 3. Materiais e Métodos Foram coletados resultados do banco de dados do projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde da mulher: coleta de exame Papanicolaou”, no período de 2011 a 2014. Neste período foram atendidas 501 mulheres nos seguintes locais: Ambulatório da UEPG, Hospital Universitário Regional dos Campos Gerais e Unidades de Saúde Antônio Saliba, Antero de Mello e Cesar Milleo, no município de Ponta Grossa. As pacientes passaram pela anamnese e consulta de enfermagem. O material cervicovaginal foi coletado da junção escamocolunar por raspagem com espátula de Ayre e o material do canal endocervical com o uso da escovinha. O esfregaço em lâmina foi realizado unidirecionalmente e fixado com propilenoglicol. O material foi coletado em duplicata, sendo um dos materiais encaminhado normalmente ao SUS e outro para o projeto. O exame citopatológico foi realizado no Laboratório Universitário de Análises Clínicas da UEPG, onde foi corado pelo método de Papanicolaou e a montagem entre lâmina e lamínula foi realizada com Entellan. 4. Resultados e Discussão Das 501 amostras analisadas no período de 2011 a 2014 pelo projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde mulher: coleta de exame Papanicolaou, 144 (29%) foram reportados como normal, 351 (70%) como inflamatório, 4 (0,8%) insatisfatório e 1 (0,1%) caso de adenocarcinoma endocervical “in situ” 1 (0,1%) caso de ASC-H (Figura 1). Optou-se por utilizar a classificação de Bethesda, onde ASC-H significa a presença de células escamosas atípicas, com características mistas, que podem ser suspeitas de uma lesão maligna.

Figura 1 – Resultado em percentual dos exames citopatológicos no período de 2011 a 2014

0

10

20

30

40

50

60

70

80

Das 351 (70%) amostras analisadas classificadas como inflamatórias, foram subdivididas em alterações inflamatórias leve, moderada e acentuada. Segundo critérios de Bethesda, pode-se fazer esta separação partindo-se da quantidade de infiltração leucocitária e também da análise das alterações celulares reativas oriundas de inflamação, as quais podem gerar agressões às células, podendo ou não serem fatores de risco para câncer do colo do útero. Das amostras com alterações inflamatórias, foram relatadas como leve 191 (54%), moderada 144 (41%) e acentuada 16 (5%) (Figura 2).

Figura 2 – Percentual de resultado inflamatório classificado quanto ao grau da lesão

5. Conclusão Diante do quadro exposto, na qual 70% das análises realizadas pelo projeto de extensão “Prevenção e educação na atenção à saúde da mulher: coleta de exame Papanicolaou presentaram alterações inflamatórias, fica explicita a importância do laudo citopatológico relatar essas informações a fim de contribuir na resolução de vaginites, vindo a evitar complicações futuras, em prol da manutenção da integridade dos órgãos do trato genital feminino. Referências ABREU E., LIMA, M. C. C. O Sistema Bethesda versão 2001 – para o diagnóstico citológico cérvico-vaginal: grandes acertos e pontos polêmicos. Jornal da Sociedade Brasileira de Cancerologia. Ano IX,nº 39, nov / dez, 2001. AGUIAR., et al. Avaliação crítica das nomenclaturas diagnósticas dos exames citopatológicos cervicais utilizadas no Sistema Único de Saúde (SUS). Revista Brasileira de Ginecologia e Obstetrícia. Vol. 33, n.3 Rio de Janeiro, 2011. AMSEL, R., TOTTEN, P. A., SPIEGEL,C. A., CHEN, K. C. S., ESCHENBACH, D., HOLMES, K. K. Nonespecific vaginitis: diagnostic criteria and epidemiologic associations. Am. J. Med , n.74, p.14-22,1983. ANJOS, S. J. S. B. et al. Fatores de risco para câncer do colo do útero segundo resultados de IVA, citologia e cervicografia. Rev. Esc. Enferm. USP, São Paulo, Vol.44, n.4, p. 912-920, 2010. ALVES, V. A. F., LIMA, M. A. N.,UTAGAWA, M. L., MAEDA, M. Y. S. Programa de controle de qualidade em citologia ginecológica do Instituto Adolpho Lutz: estratégias e análise critica dos resultados de sua implantação-piloto. Rev.Ass.Med.Bras. v.1, n.37, p.36-42,1991. BIBBO, M., HARRIS, M. J., WIED, G. L. Microbiology and inflamation of the female genital tract in Compendium on diagnostic Cytology. 4 ed. Tutorials of Cytology, Chicago, Illinois,1976. ECKERT, L. O., KOUTSKY, L. A., KIVIAT, N. B., KRONE, M. R., STEVENS, C. E., ESCHENBACH, D. A. The inflammatory Papanicolaou smear: what does it means? Obstet. Gynecol. v. 3, n.86, p360-366,1995. ENGLER, M, S, S. Análise crítica entre as classificações de Papanicolaou, Richart e Sistema de Bethesda e aplicações no sistema de saúde brasileiro. São Paulo, 2012. KLINE,T. S. The Papanicolaou smear: a brief historical perspective and where we are today. Arch. Pathol.Lab Med., n. 121, p. 205-209,1997. MINISTÉRIO DA SAÚDE. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto Nacional de Câncer. Nomenclatura brasileira para laudos citopatológicos cervicais e condutas clínicas preconizadas. Rio de Janeiro: INCA; 2003. Disponível em: http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/ Nomenclatura_Internet.pdf. Acesso:> 07/06/2015. MUSIAL, D. C. et al. Frequência De Leveduras Em Exames Colpocitológicos Oferecidos Pelo Sus Em Duas cidades

41

54

5

moderado

leve

acentuado

Do Norte Paranaense. Rev. Saúde e Biol., Campo Mourão, Vol. 4, n.2, p.1-5, jul./dez. 2009. NCI Bethesda System. The 2001 Bethesda System. 2011. Disponível em:>http://nih.techriver. net/bethesdaTable.php. Acesso:> 06/06/2015. PEDROSA, et al. Perfil epidemiológico de mulheres portadores de atipias escamosas de significado indeterminado atendidas pelo programa de controle do câncer de colo uterino no município do Rio de Janeiro. Fundação Oswaldo Cruz Escola Nacional de Saúde Pública Departamento de Epidemiologia. Rio de Janeiro, p. 1-83, 2003. SILVA, M. P. S. Alcances e limites do exame citopatológico com a coloração de Papanicolaou no diagnóstico das cérvico-vaginites: um estudo citológico e um microbiológico de 2.169 casos de um total de 10.064 exames citopatológicos. 2004. 189 f. Dissertação (Mestrado em Anatomia Patológica) - Universidade Federal de Pernambuco, Pernambuco, 2004.

TRABALHO 15

Caracterização Morfológica e Espectroscópica de Nanocápsulas Poliméricas contendo Cilostazol

Mona Lisa Simionatto Gomes (PG): mlgsimionatto@yahoo.com.br

Débora Maria Borsato (PQ): dmborsato@yahoo.com.br Paulo Vitor Farago (PQ): pvfarago@gmail.com

Resumo O cilostazol (CIL) é um inibidor da agregação plaquetária com propriedades vasodilatadoras e amplamente empregado no tratamento do sintoma da claudicação intermitente por doença arterial obstrutiva periférica. O fármaco encontra-se na classe II do sistema de classificação biofarmacêutica, apresentando pouca solubilidade em água, HCl 0,1N e NaOH 0,1N e alta permeabilidade no trato gastrointestinal, porém lenta e incompleta. Apresenta como efeitos adversos mais comuns cefaleia, taquicardia, palpitações, fezes amolecidas e diarreia. O objetivo deste trabalho foi caracterizar suspensões de nanocápsulas poliméricas contendo cilostazol obtidas a partir dos polímeros poli(ε-caprolactona) (PCL), poli(D,L-ácido láctico-co-ácido glicólico) (PLGA) e de blendas com polietilenoglicol (PEG), PCL-PEG e PLGA-PEG, contendo concentrações de 0 a 3 mg/mL de CIL por meio de análisesmorfológicas e espectroscópicas. As fotomicrografias,obtidas por microscopia eletrônica de varredura, comprovaram as dimensões nanométricas nas suspensões de nanocápsulas poliméricas. As análises de difração de raios X para o CIL demonstraram picos característicos, indicadores de cristalinidade, assim como para os polímeros PCL e PEG. Os resultados obtidos para PLGA demonstram que ele é um polímero de caráter amorfo.As análises obtidas por espectroscopia vibracional de absorção na região do infravermelho confirmaram os principais grupos químicos dos compostos nas formulações como verificaram a integridade do CIL após sua encapsulação. O uso de nanopartículas pode ser uma estratégia interessante na promoção do aumento da solubilização aparente do cilostazol melhorando seu perfil de dissolução e, consequentemente, sua ação farmacológica. Palavras-chave:Nanotecnologia farmacêutica, microscopia eletrônica de varredura, análise por difração de raios X, espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier.

1.Introdução O cilostazol, 6-[4-(1-ciclohexil-1H-tetrazol-5-il)butoxi]-3,4-diidro-2(1H)-quinolinona, é um inibidor da atividade da fosfodiesterase III, com efeitos antitrombóticos e vasodilatadores, sendo usado no tratamento de doenças vasculares periféricas (PRATT, 2001). Foi lançado no Japão e em outros países asiáticos em 1988 e aprovado nos Estados Unidos da América, em 1999, para o tratamento clínico da claudicação Intermitente (CI) por doença arterial obstrutiva periférica (DAOP), causada pela aterosclerose de membros inferiores. Tornou-se o medicamento de primeira escolha para esse fim, de acordo com as diretrizes atuais (BORGES, 2009). A dose recomendada de cilostazol para tratar os sintomas de CI é de 100 mg, duas vezes ao dia e os efeitos adversos mais frequentes incluem cefaleia, taquicardia, palpitações, fezes amolecidas e diarreia (ROSA et al., 2006). Considerando o esquema posológico e os efeitos colaterais indesejáveis associados ao uso de diversos fármacos, em que se inclui o cilostazol, o uso de nanocarreadores pode oferecer numerosas vantagens, quando comparado às formas farmacêuticas convencionais. Tais sistemas são úteis por proteger os fármacos frente à degradação no meio biológico, por carrear fármacos hidrofóbicos e por reduzir os efeitos colaterais indesejáveis, visando otimizar a ação farmacológica.

2. Objetivos O objetivo desse trabalho foi desenvolver e caracterizar, por meio de análises morfológicas e espectroscópicas, nanocápsulas poliméricas contendo cilostazol para uso potencial no tratamento farmacológico da claudicação intermitente. 3. Materiais e Métodos 3.1 Caracterização das suspensões de nanopartículas poliméricas 3.1.1Análises morfológicas e de superfície por microscopia eletrônica de varredura (MEV) A avaliação morfológica e de superfície das nanocápsulas foi realizada em microscópico eletrônico de varredura SSX–550 Superscan (SHIMADZU). As amostras foram fixadas em suporte metálico e levadas à estufa a vácuo (TECNAL, modelo TE 395). Após, foram submetidas à metalização com ouro no equipamento IC–50 IonCoater (SHIMADZU). As fotomicrografias foram obtidas empregando voltagens de aceleração de 10 ou 15 kV e registradas por meio da utilização desoftware específico. 3.1.2 Análise por difração de raios X (DRX) As suspensões de nanocápsulas poliméricas foram depositadas sobre lamínula de vidro e secas em temperatura ambiente. O CIL, os polímeros puros e as misturas físicas não receberam tratamento prévio à análise. Na sequência, as amostras foram examinadas em difratômetro de raios X (RIGAKU, modelo Ultima IV), scan de 2º.min–1 e 2θde 5º a 80º, radiação Kα de cobre (λ=1.5418Å), corrente de 40 mA e voltagem 30 kV, para a observação de possíveis picos indicativos de cristalinidade.

3.1.3 Avaliação por espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (IVTF) As suspensões de nanocápsulas poliméricas contendo CIL, após serem liofilizadas, foram analisadas por espectroscopia na região do infravermelho, em pastilha com KBr, empregando 4 mg de cada amostra e 196 mg de KBr grau espectroscópico (2% m/m),noequipamentoIRPrestige-21(SHIMADZU), 32 scans.min–1, resolução de 4 cm–1. Os espectros obtidos por infravermelho com transformada de Fourier das amostras preparadas foram avaliados frente aos espectros do fármaco puro, dos polímeros de partida e das respectivas misturas físicas. 4. Resultados e Discussão 4.1 Análise por microscopia eletrônica de varredura (MEV) Por meio das análises das fotomicrografias foram comprovadas as dimensões nanométricas nas suspensões de nanocápsulas poliméricas. Foi observado que mesmo alterando a concentração do fármaco nas formulações e o revestimento com os diferentes polímeros de partida, as estruturas apresentaram-se morfologicamente similares, como demonstrado nas figuras 1 e 2. Foram visualizados aglomerados polidispersos de superfície lisa e tamanhos similares aos resultados encontrados no método de espectroscopia de correlação de fótons para o tamanho de partícula e índice de polidispersão.

Figura 1: (A) Fotomicrografia da suspensão de nanocápsulas NC3-PLGA em aumento de15000 x e (B) NC3-PLGA/PEG em aumento de 30000 x

Figura 2: (C)Fotomicrografias obtidas por MEV da suspensão de nanocápsulas NC2-PCL (C) e (D) NC2

4.2 Análise por difração de raios X (DRX)A difração de raios X demonstra a característica do fármaco quanto à cristalinidade ou amorfismo, o que é de extrema importância quanto ao potencial de solubilidade e a velocidade de dissolução do fármaco. Substâncias cristalinas possuem picos bem definidos em relação às substâncias amorfas, entretanto, sólidos amorfos são mais solúveis devido à disposição aleatória de suas moléculas, precisando de pouca energia para separá-los (RIEKES et. al., 2011).A Figura 3 apresenta os difratogramas p(D) utilizados na obtenção das suspensões de nanocápsulas.

Figura 3: Difratogramas do cilostazol (A) e dos polímeros PCL (B), PLGA (C)e PEG (D)

As análises de difração de raios X para o CIL demonstraram picos bem característicos em aproximadamente 2θ = 12,61°, 15,51°, 17,84°, 18,61°, 22,08°, 23,44°, além de outros de menores intensidades. Esses resultados são compatíveis com os estudos de SHIMIZU et al. (1985) e PATEL; RAJUD (2009). Para os polímeros PCL e PEG, foram obtidos alguns indicativos de cristalinidade. Os resultados obtidos para PLGA demonstram que ele é um polímero de caráter amorfo (REZENDE et al., 2005; KURTI et al., 2011).As figuras difratogramas comparativos entre o fármaco puro (CIL), os polímeros de partida (PEG), a mistura física (MF) e as suspensões de nanocápsulas preparadas em diferentes concentrações (NC0, NC1, NC2 e NC3).

10 20 30 40

100

200

300

400

500

600

700

In

ten

sid

ade

2θ

C

10 20 30 40

0

400

800

1200

1600

2000

2400

2800

2θ

12.6

1

15.5

1 23

.44

17.8

418

.61

22.0

8

A

Inte

nsi

dade

Figura 2: (C)Fotomicrografias obtidas por MEV da suspensão de PCL (C) e (D) NC2-PCL/PEG em aumento de 15000 x

de raios X (DRX) A difração de raios X demonstra a característica do fármaco quanto à cristalinidade ou amorfismo, o que é de extrema importância quanto ao potencial de solubilidade e a velocidade de dissolução do fármaco.

icos bem definidos em relação às substâncias amorfas, entretanto, sólidos amorfos são mais solúveis devido à disposição aleatória de suas moléculas, precisando de pouca

los (RIEKES et. al., 2011). A Figura 3 apresenta os difratogramas para o fármaco puro (A) e os polímeros PCL (B), PLGA (C) e PEG (D) utilizados na obtenção das suspensões de nanocápsulas.

Figura 3: Difratogramas do cilostazol (A) e dos polímeros PCL (B), PLGA (C)

ção de raios X para o CIL demonstraram picos bem característicos em = 12,61°, 15,51°, 17,84°, 18,61°, 22,08°, 23,44°, além de outros de menores

intensidades. Esses resultados são compatíveis com os estudos de SHIMIZU et al. (1985) e PATEL; RAJUD (2009). Para os polímeros PCL e PEG, foram obtidos alguns indicativos de

stalinidade. Os resultados obtidos para PLGA demonstram que ele é um polímero de caráter amorfo (REZENDE et al., 2005; KURTI et al., 2011).As figuras 4, 5, 6 e 7difratogramas comparativos entre o fármaco puro (CIL), os polímeros de partida (PEG), a mistura física (MF) e as suspensões de nanocápsulas preparadas em diferentes concentrações (NC0, NC1, NC2 e NC3).

10 20 30 40 50

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

In

ten

sid

ad

e

2θ

21.

34 B

23.7

6

10 20 30 40 50

0

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1000

1500

2000

2500

3000

3500

Inte

nsi

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2θ

19.3

9

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3

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50

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50

A

A difração de raios X demonstra a característica do fármaco quanto à cristalinidade ou amorfismo, o que é de extrema importância quanto ao potencial de solubilidade e a velocidade de dissolução do fármaco.

icos bem definidos em relação às substâncias amorfas, entretanto, sólidos amorfos são mais solúveis devido à disposição aleatória de suas moléculas, precisando de pouca

ara o fármaco puro (A) e os polímeros PCL (B), PLGA (C) e PEG

ção de raios X para o CIL demonstraram picos bem característicos em = 12,61°, 15,51°, 17,84°, 18,61°, 22,08°, 23,44°, além de outros de menores

intensidades. Esses resultados são compatíveis com os estudos de SHIMIZU et al. (1985) e PATEL; RAJUD (2009). Para os polímeros PCL e PEG, foram obtidos alguns indicativos de

stalinidade. Os resultados obtidos para PLGA demonstram que ele é um polímero de caráter 4, 5, 6 e 7 apresentam os

difratogramas comparativos entre o fármaco puro (CIL), os polímeros de partida (PCL, PLGA, PEG), a mistura física (MF) e as suspensões de nanocápsulas preparadas em diferentes

10 20 30 40 50

2θ

CIL

PCL

MF

NC0-PCL

NC2-PCL

NC3-PCL

NC1-PCL

Inte

nsid

ade

(u.a

.)

A análise por difração de raios X detecta picos indicativos de cristalinidade correlacionados às estruturas cristalinas de sólidos, portanto a presença de halos amorfos em baixas intensidades confirma a ausência de cristalinidade e é condizente com a estrutura de nanocápsulas. Para todas as formulações preparadas, os perfis obtidos são similares entre si e apresentam grande redução da cristalinidade dos seus componentes em decorrência do processo de nanoencapsulação. Esses resultados sugerem a dispersão molecular entre o CIL e os polímeros, resultando em nanopartículas de caráter amorfo, para as quais se espera melhores características de solubilidade em relação ao fármaco puro.Conclusões semelhantes foram obtidas por Patel e Rajput (2009), os quais obtiveram um aumento na taxa de dissolução do CIL por meio de complexos de inclusão em ciclodextrinas.

4.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IVTF) As análises obtidas por espectroscopia vibracional de absorção na região do infravermelho permitem a identificação e elucidação estrutural de substâncias orgânicas em função da detecção de suas ligações e grupos funcionais. Também apontam possíveis interações moleculares entre o fármaco encapsulado e o polímero, pela comparação de deslocamentos, variações de intensidade, alargamento ou aparecimento de novas bandas com espectro característico ao da amostra (LOPES; FASCIO, 2004). Para tanto, os espectros obtidos visaram confirmar os principais grupos químicos dos compostos nas formulações como verificar a integridade do CIL após sua encapsulação.

10 20 30 40 50

2θ

CIL

PCL

PEG

NC3-PCL/PEG

NC2-PCL/PEG

NC0-PCL/PEG

MF

NC1-PCL/PEG

Inte

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10 20 30 40 50

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10 20 30 40 50

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NC2-PLGA/PEG

NC3-PLGA/PEG

Inte

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4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Número de onda (cm-1)

28

90

11

08

35

24

Tra

nsm

itân

cia

(%

)

O espectro IVTF obtido a partir da análise do CIL, representado na Figura 8, demonstrou bandas em 3185 cm-1, referente à vibração de estiramento N – H de amida secundária e em 3054 cm-1 correspondente à vibração de estiramento da ligação C – H do anel aromático. As vibrações simétrica e assimétrica de CH2 foram demonstradas em 2933 e 2864 cm-1, respectivamente. O estiramento C = O de amida levou a uma forte absorção em 1660 cm-1, enquanto o estiramento da ligação C = C do anel aromático foi detectado em 1500 cm-1. Por fim, as vibrações de C – O, do arilalquil éter, são visualizadas em 1239 e 1034 cm-1. Esses resultados são consistentes com os apresentados por Shimizu et al. (1985) e Patel e Rajput (2009), indicando que as ligações químicas encontradas são compatíveis com a estrutura química do CIL.Para o poliéster PCL, o espectro (Figura 9) exibiu uma banda intensa em 1725 cm–1, correspondente à vibração de deformação axial do grupamento C = O de ésteres alifáticos simples. As bandas em 2944 e 2860 cm–1 correspondem às vibrações simétricas e assimétricas do grupamento – CH2, respectivamente. Bandas observadas em 1171 e 1044 cm-1 são referentes ao estiramento C – O (HOIDY et al., 2010; PAVIA et al., 2010).

Figura 8: Espectro IVTF do cilostazol Figura 9: Espectro IVTF do polímero PCL

O polímero PLGA, representado na Figura 10 apresentou uma banda em 1758 cm-1 atribuída à frequência de estiramento de grupos carbonilas C = O de ésteres. O estiramento dos grupos metila CH3 são apresentados nas bandas em 2999 e 2947 cm-1, enquanto as bandas em 1460 e 1090 cm-1 representam o estiramento das ligações C – O presentes na molécula (YANG et al., 2007; SILVA et al., 2014).O espectro do polímero PEG (Figura 11), demonstrou absorções características em 3524 cm-1 referente aos grupos hidroxilas terminais –OH associados por ligações de hidrogênio. O grupamento C – H da cadeia alifática exibe uma banda em 2890 cm-1e a vibração do estiramento assimétrico C – O – C de éteres dialquílicos está representadaem1108cm-1(BISWALet al., 2008; PAIVA et al., 2012).

Figura 10: Espectro IVTF do polímero PLGA Figura 11: Espectro IVTF do polímero PEG

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Número de onda (cm-1)

166

0

150

0

2933

318

530

54

1239

103

4

Tra

nsm

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%)

286

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4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

286

02

944

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nsm

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cia

(%

)

Número de onda (cm -1)

172

5

104

41

171

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

109

0

1454

1760

2999 29

47

Tra

nsm

itân

cia

(%)

Número de onda (cm -1)

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

NC3-PLGA/PEG

NC2-PLGA/PEG

NC1-PLGA/PEG

NC0-PLGA/PEG

MF

CIL

PLGA

Número de onda (cm-1)

PEGTra

nsm

itân

cia

(u.a

.)

Os espectros comparativos de IVTF para o fármaco puro, os polímeros e blendas poliméricas, as misturas físicas e as suspensões de nanocápsulas (em diferentes concentrações) estão demonstrados nas Figuras 12 e 13.As análises espectrais das amostras demonstraram que não houve alteração dos grupos funcionais específicos dos componentes das formulações, sugerindo que não ocorreram interações químicas entre eles. Para as misturas físicas, suas bandas correspondem à soma das bandas encontradas para os compostos individuais (LOPES; FASCIO, 2004).

5. Conclusão As imagens fornecidas por microscopia eletrônica de varredura demonstraram-se concordantes entre si, apresentando nanocápsulas de formas esféricas, com superfícies lisas e homogeneidade na distribuição de tamanho. Os resultados de difração de raios X revelaram a ausência de cristalinidade das nanocápsulas, evidenciando que o processo de nanoencapsulação conduziu a uma amorfização do fármaco. Os espectros revelados por espectroscopia na região do infravermelho demonstraram que não ocorreram interações químicas entre o CIL e os polímeros durante o processo de nanoencapsulação. Agradecimentos À CAPES, Fundação Araucária e CNPq, pelo auxílio financeiro. Referências BISWAL, S. et al. Enhancement of dissolution rate of gliclazide using solid dispersions with polyethylene glycol 6000. AAPS PharmSciTech, v. 9 n.2, p. 563-570. Jun. 2008. BORGES, J. L.Cilostazol e aterosclerose. Revista Brasileira Médica, v. 66, n. 11, p. 390-404, nov. 2009. KÜRT, L. et al.Study of the parameters influencing the co-grinding process for the production of meloxicam nanoparticles. Powder Technology, v. 212, p. 210-217, 2011. LOPES, W. A.; FASCIO, M. Esquema para interpretação de espectros de substâncias orgânicas na região do infravermelho. Química Nova, vol. 27. n. 4, p. 670-673, 2004. PATEL, S.G., RAJPUT, S.J.Enhancement of oral bioavailability of cilostazol by forming its inclusion complexes.AAPS PharmSciTech, v. 10, n. 2, p. 660-669, 2009. PAVIA, D.L. et al. Introdução à Espectroscopia. 4. ed. São Paulo: Cengage Learning, 2010, 716 p. PRATT, C.M.Analysis of the Cilostazol Safety Database. The American Journal of Cardiology Vol. 87, n. 12, p.28D–33D, 2001. REZENDE, C. A. et al. Membranas de poli (ácido lático-co-ácido glicólico) como curativos para pele: degradação in vitro e in vivo. Polímeros, v. 15, n. 3, p. 232-238, jul. 2005. RIEKES, M. K. et al.Evaluation of oral carvedilolmicroparticles prepared by simple emulsion technique using poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) and polycaprolactone as polymers.Materials Science andEngineering , v. 31, p. 962-968, 2011.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

NC3-PCL/PEG

NC2-PCL/PEG

NC1-PCL/PEG

NC0-PCL/PEG

MF

CIL

PCL

Número de onda (cm-1)

PEGTra

nsm

itân

cia

(u.a

.)

ROSA, M. P.; BARONI, G. V.; PORTAL, V. L. Contribuição na prevenção da isquemia cerebral pelo cilostazol, um inibidor da fosfodiesterase III: revisão de literatura. Jornal Vascular Brasileiro, v. 7, n. 1, p. 49-55, 2008. SHIMIZU, T.; OSUMI, T.; NAKAGAWA, K.,Physico-chemical properties and stability of cilostazol.Arzneimittelforschung, v. 35, p. 1117– 1123, 1985. SILVA, A. T. C. R. et al.Síntese e caracterização do copolímero PLGA e sua produção em nanofibras contendo o fármaco atenolol. XII Congresso Internacional de Polímeros, Porto de Galinhas, 2014.

TRABALHO 16

Caracteres microscópicos de folha, caule e raiz de Philodendron appendiculatum Nadruz & Mayo

Juliane Nadal Dias Swiech 1(PG) E-mail: juliswiech@yahoo.com.br

Vanessa Barbosa Bobek 2(PG) E-mail vanessabarbosa273@bol.com.br Daniela Gaspardo Folquitto 3(PG) E mail danielafolquitto@gmail.com

Rosi Zanoni da Silva 4(PQ) E-mail: rosizanoni@bol.com.br Jane Manfron Budel 5(PQ) E-mail: janemanfron@hotmail.com

Paulo Vitor Farago 6(PQ) E-mail: pvfarago@gmail.com Marilis Dallarmi Miguel 7(PQ) E-mail: dallarmi@ufpr.br Obdulio Gomes Miguel 8(PQ) E-mail: obdulio@ufpr.br

1 - Aluno de Pós-Graduação de Doutorado pela Universidade Federal do Paraná; 2 - Aluno de Pós-Graduação de Doutorado pela Universidade Federal do Paraná; 3 - Aluno de Pós-Graduação de Doutorado pela Universidade Federal do Paraná; 4- Professora Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela co-orientação do trabalho; 5- Professora Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela co-orientação do trabalho; 6 - Professor Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela co-orientação do trabalho; 7 - Professora Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná responsável pela co-orientação do trabalho; 8- Professor Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná responsável pela orientação do trabalho;

Resumo: Philodendron é o segundo maior da família Araceae, e por sua beleza apresenta amplo uso ornamental. O presente estudo apresenta as características anatômicas e o resultado de testes microquímicos realizados em raiz, caule e folhas da espécie Philodendron appendiculatum, a fim de identificar e diferenciar das demais Philodendron. Para tanto, foram preparadas lâminas semipermanentes com o material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, à mão livre e realizou-se o uso de reativos específicos, conforme literatura. Os caracteres anatômicos evidenciados neste estudo caracterizam a espécie Philodendron appendiculatum. As evidências botânicas, como idioblastos cristalíferos contendo drusas ou ráfides de oxalato de cálcio que reagiram à pesquisa com solução de ácido sulfúrico, a presença de dutos resiníferos e células de conteúdo fenólico incentivam estudos químicos e farmacológicos com a espécie em questão. Palavras-chave: anatomia, Liliopsida, Philodendron 1. Introdução O nome Philodendron vem do grego philos (amigo) e dendron (árvore). Philodendron constitui plantas hemi-epífitas ou hepífitas e poucas são heliófitas, raramente arborescentes. Caracteriza-se pelo caule composto de unidades simpodiais de uma única folha, e da inflorescência na qual a zona estéril, entre a zona estaminada e pistilada, é mais curta que a zona estaminada (COELHO e MAYO, 1998). As folhas com lâmina foliar elíptica a lanceolada, oblanceolada, ovada ou cordada, inteira ou pinatifida, em geral coriácea. Espata persistente na frutificação, com tubo basal e lâmina apical. Sementes uma a muitas em cada fruto (DISLICH e MANTOVANI, 1998).

Philodendron, pertence à família Araceae, com cerca de 500 espécies distribuídas em três subgêneros: Philodendron, Meconostigma e Pteromischum (SAKURAGUI, 2001). Pela beleza de suas grandes folhas, apresentam um amplo uso ornamental, mas estudos vêem sendo realizados em busca de suas atividades terapêuticas (MISHRA, KOVACHICH, 1984; MUELAS SERRANO et al., 1999; MENEZES et al., 2004). No Brasil, Philodendron apresenta dois centros de diversidade genética: um centrado no sudeste do país, na região da mata atlântica e outro na Amazônia. Estes dois centros refletem um padrão geográfico ligado a aspectos morfológicos do grupo: o grupo da Amazônia apresenta lóculos do ovário uniovulados com placentação basal, enquanto o grupo do Sudeste Brasileiro apresenta lóculos do ovário pluriovulados com placentação sub-basal (SAKURAQUI, 2001). Este gênero possui distintos padrões de morfologia, anatomia e distribuição (MAYO, 1988) sendo que neste trabalho apresentamos as características anatômicas e o resultado de testes microquímicos realizados em raiz, caule e folhas da espécie Philodendron appendiculatum. 2. Objetivos Considerando que não existem estudos anatômicos de Philodendron appendiculatum e que as evidências microquímicas indicam que a espécie vegetal possa ter potencial terapêutico, o presente trabalho objetivou analisar anatomicamente as partes vegetativas aéreas desse táxon com finalidade de identificação e diferenciação das demais Philodendron. 3. Materiais e Métodos Foram coletadas pelo menos 5 exemplares de Philodendron appendiculatum, na Rua Estados Unidos, número 150, no município de Piçarras – Santa Catarina (Latitude -26.7334963/ Longitude -48.682338). Os exemplares foram submetidos à confecção de exsicatas, identificadas por especialista e os representantes equivalentes estão registrados no Herbário do Museu Botânico de Curitiba sob o número 390354. O material coletado foi devidamente processado para a realização do estudo anatômico. 3.1 Estudo anatômico As pesquisas referentes aos caracteres anatômicos foram efetuadas com folhas, caules e raízes de Philodendron appendiculatum , a partir de 5cm do ápice da planta. O material vegetal foi fixado em FAA 70 (formol 5%, ácido acético 5% e etanol 70ºGL 90% v/v) (JOHANSEN, 1940), e estocados em solução de etanol a 70% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Foram preparadas lâminas semipermanentes com o material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, à mão livre, submetido à coloração de azul de astra e fucsina básica (ROESER, 1972). As lâminas foram montadas com glicerina diluída a 50% (v/v) (BERLYN, MIKSCHE, 1976) e para a lutagem foi utilizado esmalte incolor. 3.2 Testes microquímicos Foram realizadas secções transversais à mão livre de folhas e caules de Philodendron appendiculatum e os reativos empregados foram solução de floroglucina clorídrica para verificação de lignina (FOSTER, 1949), Sudam III para substâncias lipofílicas (SASS, 1951), cloreto férrico para compostos fenólicos (JOHANSEN, 1940), ácido sulfúrico para a verificação da natureza dos cristais (OLIVEIRA, 2005) e lugol para amido (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Os resultados dos testes microquímicos e da análise anatômica foram registrados por meio de fotomicrografias em microscópio fotônico Olympus CX31, acoplado à câmera digital Olympus model C-7070, no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa. 3.3 Microscopia eletrônica de varredura – MEV A caracterização morfológica das superfícies foliares, caulinares e radiculares de Philodendron appendiculatum foi realizada com análise ao microscópio eletrônico de varredura. Para tal procedimento, as amostras foram fixadas em FAA 70 e desidratadas em série etanólica crescente. As eletromicrografias foram realizadas em alto vácuo e visualizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3 TESCAN (SOUZA, 1998). Para realização do ponto crítico e

microscopia eletrônica de varredura, o material foi analisado no C-LABMU/PROPESP, na Universidade Estadual de Ponta Grossa. 4. Resultados e Discussão 4.1 Caracteres foliares A análise anatômica da lâmina foliar de Philodendron appendiculatum, em vista frontal, mostra células epidérmicas com parede anticlinal de formato poligonal e delgadas em ambas as faces. A cutícula ocorre em faixas sobre a epiderme, acompanhando as paredes anticlinais das células, em ambas as faces. Essa característica também foi encontrada em Philodendron melanochrysum Linden & André (KLIMKO et al., 2014). Nesse estudo, a cutícula reagiu positivamente à pesquisa de compostos lipofílicos. Os estômatos são do tipo paracítico aparecendo somente na superfície abaxial, caracterizando a folha como hipoestomática. Estômatos tetracíticos foram encontrados em Philodendron bipinnatifidum Schott ex Endl. Em secção transversal, a epiderme apresenta-se uniestratificada e coberta por cutícula espessa. Os estômatos estão localizados no mesmo nível das demais células epidérmicas. Folhas hipo e anfiestomáticas foram encontradas em espécies de Philodendron (KLIMKO et al., 2014). O mesofilo é dorsiventral, sendo constituído por duas camadas de parênquima paliçádico de células curtas, e pelo parênquima esponjoso formado por cerca de 8-10 camadas de células, formando várias cavidades aeríferas. Dispersos por todo o mesofilo são observados idioblastos cristalíferos contendo drusas ou ráfides de oxalato de cálcio que reagiram à pesquisa com solução de ácido sulfúrico. Também são observadas células com conteúdo fenólico e que reagiram positivamente à pesquisa com cloreto férrico. Feixes vasculares de pequeno porte, do tipo colateral, estão distribuídos na região mediana do mesofilo e podem estar associados a células com conteúdo fenólico. Calotas de fibras perivasculares podem ocorrer apostas ao floema e ao xilema. A nervura principal, em secção transversal, possui formato plano-convexo. A epiderme uniestratificada é revestida por cutícula levemente estriada. Vários feixes vasculares estão dispersos pelo parênquima fundamental. Este apresenta espaços intercelulares de tamanhos variáveis constituindo cavidades aeríferas que caracterizam o aerênquima. As grandes cavidades aparecem separadas por porções unisseriadas de parênquima fundamental. Dispersos pelo aerênquima são encontrados idioblastos cristalíferos contendo drusas ou ráfides e células com conteúdo fenólico. Também foram encontrados dutos resiníferos e grãos de amido. Idioblastos cristalíferos foram amplamante citados em espécies de Philodendron (KLIMKO et al., 2014). O pecíolo, em secção transversal, tem formato arredondado. A epiderme é uniestratificada com as mesmas características da folha e, subjacentemente, são encontradas 2 camadas de parênquima fundamental e logo abaixo, cordões isolados, formados por cerca de 6 camadas de colênquima angular. O parênquima fundamental é formado por células que delimitam câmaras de tamanhos variáveis e que na região mediana, formam o aerênquima. Vários feixes vasculares do tipo colateral estão dispersos no parênquima fundamental, sendo o floema orientado para o perímetro externo. Também são observados idioblastos cristalíferos contendo drusas ou ráfides de oxalato de cálcio e células com conteúdo fenólico. Células de conteúdo fenólico, contendo antocianidina, foram encontradas em outras Philodendron spp. (SAITO, LIMA, 2009). 4.2 Caracteres caulinares O caule, seccionado transversalmente, apresenta formato circular. A epiderme caulinar apresenta-se uniestratificada e pode aparecer lignificada. O felogênio instala-se internamente à epiderme e forma em direção à periferia, células alongadas anticlinalmente. Epiderme lignificada também foi observada em P. oblongum (Vell.) Kunth e P. propinquum Schott (TENORIO et al., 2012). Pode ocorrer hipoderme lignificada, como observado nas espécies P. cordatum Kunth ex Schott, P. appendiculatum Nadruz & Mayo e P. ornatum Schott. A cutícula do caule é delgada, levemente estriada e reagiu positivamente à pesquisa de compostos lipofílicos. Adjacente à epiderme, em secção transversal, encontra-se de 6 camadas

de colênquima angular. Dispersos no parênquima, são encontrados idioblastos cristalíferos contendo drusas ou rafídeos, dutos resiníferos e células contendo substâncias fenólicas. Os traços foliares e os feixes vasculares são colaterais e estão dispersos por todo o cilindro central, sendo o floema voltado para a periferia. Aposto ao floema ocorre uma calota de fibras perivasculares bem desenvolvida. Essa característica foi encontrada no caule de Philodendron hederaceum (Jacq.) Schott. Todavia, pode não ser verificada em Philodendron (TENORIO et al., 2012). 4.3 Caracteres radiculares A raiz, em secção transversal, tem formato circular, evidenciando algumas depressões na epiderme. A epiderme é uniestratificada com cutícula moderadamente espessa. Ocorre hipoderme lignificada. O felogênio instala-se internamente à hipoderme e forma em direção à periferia, células alongadas anticlinalmente. O córtex é formado por várias células isodiamétricas, onde são observados tubos resiníferos circundados por células lignificadas, células com conteúdo fenólico e cavidades aeríferas. Delimitando internamente o córtex, surge a endoderme sem estrias de Cáspary visíveis. O cilindro vascular é tipico de liliopsida e a medula é formada por células isodiamétricas de paredes delgadas, que centralmente, pode evidenciar células lignificadas. 5. Conclusão Os caracteres anatômicos evidenciados neste estudo caracterizam a espécie Philodendron appendiculatum e fornecem dados botânicos para diferenciação das demais Philodendron. As evidências botânicas, como a presença de dutos resiníferos e células de conteúdo fenólico incentivam estudos químicos e farmacológicos com a espécie em questão. Referências BERLYN, G.P.; MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: Iowa State University. Vol. 276, p. 121, 1976. DISLICH, R.; MANTOVANI, W. A flora de epífitas das reservas vasculares da cidade universitária “Armando de Salles Oliveira”. Boletim de Botânica, Brasil, v. 17, p. 61-88, jun. 1998. ISSN 2316-9052. Disponível em: < http://www.revistas.usp.br/bolbot/article/viewFile/57986/pdf_3>. Acesso em: 20 Fev. 2014. doi:http://dx.doi.org/10.11606/issn.2316-9052.v17i0p47-60. FOSTER, A. S. Practical plant anatomy. 2. ed. Princeton: D. Van Nostrand, 1949. JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: McGraw Hill Book. p. 41-193, 1940. MENEZES, P.R. ; SCHWARZ, E.A. ; SANTOS, C.A.M. In vitro antioxidant activity of species collected in Paraná Fitoterapia, Vol.75, n.3, p.398-400, 2004. MISHRA, O. P., KOVACHICH, G.B. Inhibition of ascorbate autoxidation by a dialyzed, heat-denatured extract of plant tissues. Life sciences. Vol:34, n.22, p.2207 -2212, 1984. MUELAS-SERRANO, S.; NOGAL, J.J.; MARTINEZ-DIAZ, R.A.; ESCARIO, J.A.; MARTINEZ-FERNANDEZ, A.R.; GOMEZ-BARRIO, A. In vitro screening of American plant extracts on Trypanosoma cruzi and Trichomonas vaginalis. Journal of ethnopharmacology. Vol.71, n.1 p. 101 -107, 2000. O'BRIEN, T.P.; FEDER, N.; MCCULLY, M.E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O. Protoplasma. Vol.59, p. 368-373, 1964. ROESER, K.R. Die Nadel der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der Natur. Mikrokosmos. Vol. 61, p. 33-36, 1972. SAITO, S.R.M.; LIMA, V.F.G.A.P. Estudo anatômico e variação na concentração de idioblastos com ráfides em folhas de Araceae, mantidas sob diferentes condições de luminosidade. Saúde, Vol.3, n.2, p. 25-32, 2009. SAKURAGUI, C.M. Biogeografia de Philodendron seção Calostigma (Schott) Pfeiffer (Araceae) no Brasil. Acta Scientiarum, Maringá, Vol. 23, n. 2, p. 561-569, 2001. SASS, J.E. Botanical microtechnique. 2. ed. Ames: Iowa State College, p. 97, 1951. SOUZA, W. Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicadas às Ciências Biológicas. Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrônica, Rio de Janeiro, p. 1-44, 1998.

TRABALHO 17

DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DA PERMEAÇÃO CUTÂNEA IN VITRO DE NANOCÁPSULAS POLIMÉRICAS

CONTENDO ÁCIDO FERÚLICO

Jessica Mendes Nadal (PG) E-mail: jessicabem@hotmail.com André Rabelo Peixoto Bertocco (G) E-mail andrerabelo89@hotmail.com

Sandra Maria Warumby Zanin (PQ) E mail sandrazanin@ufpr.com Paulo Vitor Farago (PQ) E mail pvfarago@gmail.com

Resumo: O ácido ferúlico (AF) é um composto químico que apresenta umaatividade terapêutica diversificada, inclusive fotoprotetora, quando aplicado sobre a pele. No entanto, o AF apresenta características desfavoráveis, como sua baixa solubilidade aquosa, fácil oxidação e fotossensibilidade. Levando-se em conta que a exposição prolongada e demasiada ao sol pode trazer sérios problemas à saúde, este trabalho teve como objetivo desenvolver e caracterizar uma suspensão de nanocápsulas obtida a partir do polímero poli-(ε-caprolactona) (PCL) contendo AF, preparada pelo procedimento de deposição interfacial do polímero pré-formado. A determinação do AF incorporado às nanocápsulas apresentou eficiência de encapsulação superior a 80%. Os valores de pHmantiveram-se estáveis após 100 dias. As nanocápsulas apresentaram médias de diâmetro e potencial zeta de 208,57 nm e -32,8 mV, respectivamente.A avalição da espectroscopia por infravermelho evidenciou que tanto a formulação Nano_AF como a Nano_0 apresentaram uma banda característica na região de 1643 cm–1, referente ao óleo usado na formulação. As nanocápsulas de PCL contendo AF apresentaram resultados satisfatórios com relação à permeação in vitro, realizada em célula de Franz, que mostraram a grande eficiência das nanocápsulas em carrear o ativo através das camadas epidérmicas. Os resultados obtidos sugerem que as nanocápsulas poliméricas elaboradas a partir da PCL contendo AF têm viabilidade como um sistema de liberação percutânea. Palavras-chave: antioxidante,ácido ferúlico,fotoprotetor, poli-(ε-caprolactona) 1. Introdução O ácido ferúlico (AF) ou ácido 4-hidroxi-3-metoxi-cinâmico é um composto químico extremamente abundante no reino vegetal, que tem baixa toxicidade e é sintetizado pela via do chiquimato, a partir da fenilalanina ou da L-tirosina (WANG et al., 2011; ITAGAKI et al., 2009). Estudos anteriores demonstram que o AF tem atividade terapêutica diversificada, incluindo efeitos anti-inflamatório, antioxidante, antitrombótico, anticancerígeno, neuroprotetor e cardioprotetor. Quando aplicado sobre a pele pode apresentar um efeito fotoprotetor (MERLIN et al., 2012; STANIFORTH et al., 2012; WANG et al., 2011). A capacidade antioxidante, ligada à capacidade fotoprotetora, se deve a dois motivos estruturais distintos: presença de grupamentos doadores de pares de elétrons no anel benzênico e a insaturação na cadeia lateral (ITAGAKI et al., 2009). Estudos in vitro como o de Luceroet al (2012) comprovam sua capacidade fotoprotetora, ao promover a fotoestabilização de extrato de camomila dobrando sua meia-vida de dissipação. No entanto, o AF apresenta características desfavoráveis, como sua baixa solubilidade aquosa e sua fácil oxidação e fotossensibilidade, características responsáveis pela conversão parcial do isômero trans para o isômero cis, muito menos ativo. Portanto, torna-se desejável a sua estabilização, pretendendo-se com este estudo, o desenvolvimento e caracterização de nanocápsulas de poli-ε-caprolactona (PCL) contendo AF, com o objetivo de se alcançar a fotoestabilidade do fármaco e quantificar o potencial de fotoproteção das nanocápsulas de ácido ferúlico (Nano_AF) veiculadas em uma formulação cosmética.

2. Objetivos Desenvolver e caracterizar uma suspensão de nanocápsulas obtida a partir do polímero poli-ε-caprolactona (PCL) contendo ácido ferúlico, preparado pelo procedimento de deposição interfacial do polímero pré-formado (nanoprecipitação) e proceder à avaliação da permeação cutânea in vitro. 3. Materiais e Métodos 3.1 Obtenção das nanopartículas poliméricas contendo ácido ferúlico Suspensões de nanocápsulas obtidas a partir do polímero poli(ε-caprolactona) (PCL)contendo ácido ferúlico foram preparadas pelo procedimento de deposição interfacial do polímero pré-formado descrito porQuintanar-Guerreroet al. (1988). Resumidamente, 100 mg do polímero (PCL) foram solubilizados em 27 mL de acetona com auxílio de agitação magnética, juntamente com 75 mg de ácido ferúlico, 77 mg de Span 80® e 300 mg de triglicerídeos de ácido cáprico/caprílico. A solução orgânica resultante foi gotejada em 54 mL de uma solução aquosa contendo 77 mg de Tween 80®, previamente preparada e mantida sob constante agitação magnética e temperatura controlada de 40 ºC. A acetona foi, então, eliminada da nanossuspensão sob pressão reduzida em rotaevaporador até o volume final de 10 mL, para obter a formulação Nano_AF. O experimento foi realizado em quintuplicata além do desenvolvimento de uma nanossuspensão de controle negativo (Nano_0), com a ausência do fármaco.

3.1.1 Mistura física A mistura física entre o polímero utilizado e o AF foi preparada para a caracterização comparativa da nanossuspensão em estudo na proporção, em massa, de 1:1 (AF:PCL) (50%).

3.1.2 Determinação do ácido ferúlico incorporado às nanocápsulas de PCL e eficiência de encapsulação A concentração de fármaco incorporado na nanosuspensão (mg.g–1) e a eficiência de encapsulação (%) foi determinada pelo método indireto, o qual determina a concentração de fármaco não associado ao sistema carreador no ultrafiltrado das nanosuspensões, após o procedimento de ultrafiltração/centrifugação (Hitachi, Himac CR21GII), a 2200Хg durante 30 minutos, em dispositivo Amicon® (10.000, Millipore). As amostras foram analisadas por espectrometria na região do ultravioleta (UV), em espectrofotômetro Genesys 10 UV Scanning (Thermo Fisher Scientific). A eficiência de encapsulação (EE%) foi calculada a partir da Equação 1:

100% xinicialAF

livreAFinicialAFEE

−= (Equação 1)

Onde, AF inicial corresponde à concentração do fármaco adicionada inicialmente à formulação e, AFlivre, à concentração de ácido ferúlico não incorporado às nanocápsulas, quantificado por UV-Vis. Os valores de EE% foram expressos como média ± DP.

3.2 Caracterização das suspensões de nanopartículas poliméricas 3.2.1 Determinação do pH A determinação do pH foi realizada em potenciômetro digital, previamente calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0, diretamente nas suspensões coloidais, após a preparação. Os resultados representam a média de três amostras diferentes. 3.2.2. Determinação do diâmetro médio e do potencial zeta O tamanho médio de partícula e o índice de polidispersão (distribuição de tamanho) foram medidos (n=3) por espectroscopia de correlação de fótons após a diluição de uma alíquota de suspensão de nanocápsulas em água purificada (1:500) (Zetasizer Nanoseries, Malvern Instruments, Reino Unido).

3.2.3 Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão por efeito de campo (MEV-FEG) A caracterização morfológica das nanossuspensões contendo AF foi realizada usando microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão por efeito de campo, com aumentos de 20 a 200 kx (MEV-FEG – TESCAN, modelo MIRA 3, Brno, República Checa). As amostras foram depositadas sobre o stub polido e posteriormente recobertas com ouro usando o equipamento de recobrimento (Quorum Technologies Ltda, modelo SC7620, East Sussex, BN8 6BN, Reino Unido), durante 1 minuto e 10 mA. 3.2.4 Avaliação por espectroscopia na região do infravermelho Na avalição na região do infravermelho, as amostras foram gotejadas sem diluição em pastilha de KBr, empregando 4 mg de cada amostra e 196 mg de KBr grau espectroscópico (2% em massa). A leitura feita no modo de transmitância (T) com 32 scans.min–1 e resolução de 4 cm–1, no espectrômetro infravermelho com transformada de Fourier (Shimadzu, modelo IR Prestige-21, Quioto, Japão). Os espectros foram analisados frente à comparação com o os espectros obtidos do fármaco, do polímero e da mistura física. 3.3 Estudo de permeação in vitro A célula de difusão in vitro consistiu de um compartimento receptor de 7 mL, uma área disponível para a difusão de 1,77 cm2, acoplados a um sistema de agitação magnética. O sistema de difusão encontrava-se acoplado a um banho-maria, termostatizado com circulação externa para a manutenção da temperatura em 37 °C. No estudo foi empregada membrana natural (pele dissecada da orelha de porco, sem pêlo e sem o tecido subcutâneo e gorduroso presente abaixo da derme). Uma solução tampão fosfato pH 7,4 foi colocada no compartimento receptor. Sobre a extremidade das células foram esticadas as membranas, com a derme voltada para a solução receptora, garantindo a condição “sink”. Espalharam-se uniformemente sobre toda a área da membrana 1,0 g de gel de hidroxietilcelulose a 0,5% contendo as amostras a serem testadas (fármaco livre, e as nanosuspensões Nano_AF e Nano_0) em concentrações equivalentes a 0,5% de AF. O sistema de agitação foi acionado e alíquotas de 1,0 mL da fase receptora foram coletadas nos tempos de 1, 2, 6, 8 e 12h. Para manter o volume constante, a cada coleta foi reposto ao sistema o mesmo volume retirado da solução receptora. O experimento foi realizado em triplicata e como controle negativo, foi utilizada a formulação de nanosuspensão que não continha o AF (Nano_0). A quantidade de AF permeado foi determinada por espectrofotometria no ultravioleta, comprimento de onda de 320 nm a partir de uma curva padrão de AF (0,3; 0,5; 0,7; 1,0; 5,0; 7,0 µg.mL–1) em tampão fosfato pH 7,4. Para esta análise, as alíquotas das soluções receptoras, removidas das células de difusão foram diluídas (1:10) com tampão fosfato pH 7,4. 4. Resultados e Discussão O método de deposição interfacial de polímero (nanoprecipitação) aplicado se mostrou satisfatório no preparo das nanocápsulas. Imediatamente após adicionar a fase orgânica sobre a fase aquosa, todas as formulações se tornaram opacas como leite, sendo uma característica originada no efeito Tyndall que resulta da reflexão de luz pela formação das nanopartículas (SCHAFFAZICK et al., 2003). 4.1 Determinação do AF incorporado às nanocápsulas de PCL e eficiência de encapsulação A concentração de fármaco incorporado na nanocápsula (mg.g-1) e a eficiência de encapsulação (%) para as nanocápsulas desenvollvidas são resumidos na Tabela 1. A formulação desenvolvida apresentou valores adequados de EE, superior a 80%. Este valor pode ser justificado, principalmente, devido à baixa solubilidade aquosa (6,63 mg.dL–1 em pH 7,2) (SAIJA, 2000) do AF, que acarretou um aumento da concentração de fármaco no interior da nanopartícula.

Tabela 1- Características físico-químicas das suspensões de nanocápsulas

Formulação Teor

(mg.g–1)

AF incorporado

(mg.g–1)*

EE (%)* pH

(100 dias)

Tamanho de partícula

(nm)

Índice de polidispersão

Potencial Zeta (mV)

Nano_0 0 — — 4,39 ± 0,30 381,52 ±2,27 0,12 ± 0,018 -51,1 ± 3,45

Nano_AF 75 61,6 ± 1,77 82,13 ± 0,56 3,46 ± 0,37 208,10±1,65 0,27 ± 0,52 -32,8 ± 2,23

*Média± desviopadrão (n=5) 4.2 Caracterização das suspensões de nanopartículas poliméricas 4.2.1 Determinação depH A avaliação do pH das nanossuspensões preparadas foi realizada no dia daobtenção da formulação e 100 dias após o preparo a fim de avaliar o comportamento e estabilidade. Os valores de potenciais hidrogeniônicos determinados podem ser visualizados na Tabela 1, constatando-se que o AF deixa a formulação levemente mais ácida (3,52), devido a sua característica de doador de prótons. Também se pode observar o que polímero (PCL) não é capaz de acidificar o microambiente, pois o pH da formulação se mantém praticamente inalterado durante os 100 dias de armazenamento. 4.2.2 Determinação de tamanho médio e potencial zeta Os resultados de diâmetro médio e índice de polidispersão (IP) das nanocápsulas de PCL contendo ácido ferúlico e da formulação controle encontram-se na Tabela 1. Foram obtidas, em maior parte, populações monodispersas de nanopartículas, produzindo formulações que apresentaram baixos valores de IP (> 0,3). As nanopatículas Nano_AF apresentaram diâmetro médio de 208,10 nm e a Nano_0 de 381,52nm.Estes resultados estão em conformidade com trabalhos prévios descritos aplicando a técnica de nanoprecipitação que apresentam valores menores que 300 nm (FESSI et al.,1989; SANTOS et al., 2011). Os valores medidos na avaliação do potencial zeta das amostras ficaram entre -32,8 e -51,1 mV e podem ser observado na Tabela 1. Em geral, as partículas podem ser consideradas estáveis quando o valor absoluto do potencial zeta for superior a +30 mV ou inferior a –30 mV, enquanto que potenciais próximos a 0 e 5 mV podem produzir o fenômeno de floculação mais facilmente (NEVES et al., 2013). 4.2.3 Microscopia eletrônica de varredura com fonte de emissão por efeito de campo (MEV-FEG) A Figura 1,A mostra as Nano_0, aglomeradas e isoladamente, em especial na imagem da nanopartícula isolada, pode-se comprovar suas dimensões nanoméricas, apresentando aproximadamente 200 nm, o que condiz com os resultados obtidos pelo equipamento Zeta-sizer Nano Series (Malvern Instruments, NANO ZS 90, Malvern, Reino Unido). Da mesma forma, a Figura 1,B mostra as Nano_AF, e ao analisar suas dimensões pode-se perceber que também possuem dimensões nanoméricas, variando entre 300 e 500 nm. Em ambas as micrografias, a escala foi tão pequena, que não foi possível obter imagens nítidas. As fotomicrografias obtidas não demonstraram a formação de cristais. Cristais podem ocorrer quando o composto a ser nanoencapsulado está presente em excesso no meio de dispersão ou devido a uma grande polidispersão no tamanho das nanopartículas obtidas.

b

Figura 1 - Fotomicrografias das nanopartículas obtidas por MEV

4.2.4 Espectroscopia na região do infravermelhoA Figura 2 representa os espectros obtidos para o polímero (PCL), o fármaco puro (AF), a mistura física (MF) e as nanosuspensões na região do infravermelho entre 400 a 4000 cmO espectro IVTF do ácido ferúlico puro indicou uma banda típica referente à vibração de deformação axial do grupamento OH em 3437 cm-1. A ocorrência de uma banda em 3016 cmestiramento assimétrico do grupamento Cestiramento do grupamento carbonila conjugado ao anel aromático e três bandas intensas e características em 1618, 1598 e 1518 cmaromático. Absorção em 1464 cm-1 é indicativo da deformação axial do grupamento CA banda em 1272 cm-1 é atribuída à deformação axial do grupamento C804 e 832 cm-1 são devidas a dois átomos dA PCL apresentou uma banda forte em 1727 cmgrupamento C=O e duas bandas em 2943 e 2864 cmgrupamento –CH2, respectivamente. A mistura física na proporção 1:1 apresentou espectro condizente com as bandas encontradas tanto na avaliação da PCL quanto do AF puro. Tanto a formulação Nano_AF como a Nano_0 apresentaram uma banda característica na regiãocm–1, provavelmente característica do óleo utilizado na formulação, o triglicérides de ácido cáprico/caprílico, que está em maior quantidade na composição, (aproximadamente 80%) e que forma o núcleo oleoso onde o fármaco encontrananocápsula.

Figura 2 - Espectros de IVTF da polinanossuspensões (Nano_0 e Nano_AF)

4000 3500

Espectro IVTF (4 cm

T

rans

mitâ

nci

a (%

)

Fotomicrografias das nanopartículas obtidas por MEV-FEG: Nano_0, aumento de 140 kx (A) e Nano_AF,

aumento de 50 kx (b).

Espectroscopia na região do infravermelho A Figura 2 representa os espectros obtidos para o polímero (PCL), o fármaco puro (AF), a mistura física

do infravermelho entre 400 a 4000 cm–1. O espectro IVTF do ácido ferúlico puro indicou uma banda típica referente à vibração de deformação axial

. A ocorrência de uma banda em 3016 cm-1 no espectro é atribuída ao ssimétrico do grupamento C-H. O evento de uma banda em 1713 cm

estiramento do grupamento carbonila conjugado ao anel aromático e três bandas intensas e características em 1618, 1598 e 1518 cm-1, correspondentes às vibrações de deformação axial

é indicativo da deformação axial do grupamento C-H do anel aromático. é atribuída à deformação axial do grupamento C-O-C. Ainda, as bandas nítidas em

são devidas a dois átomos de hidrogênio adjacentes no anel fenil (WANGA PCL apresentou uma banda forte em 1727 cm–1, correspondente à vibração de deformação axial do grupamento C=O e duas bandas em 2943 e 2864 cm–1, devido as vibrações simétricas e assimétricas do

A mistura física na proporção 1:1 apresentou espectro condizente com as bandas encontradas tanto na

Tanto a formulação Nano_AF como a Nano_0 apresentaram uma banda característica na região, provavelmente característica do óleo utilizado na formulação, o triglicérides de ácido

cáprico/caprílico, que está em maior quantidade na composição, (aproximadamente 80%) e que forma o núcleo oleoso onde o fármaco encontra-se disperso, evidenciando a formação de uma estrutura de

Espectros de IVTF da poli-(ε-caprolactona) (PCL), ácido ferúlico (AF), mistura física (MF), e

nanossuspensões (Nano_0 e Nano_AF)

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Espectro IVTF (4 cm-1, 32 scans, pastilha com KBr)

Numero de onda (cm-1)

PCL

AF

MF

Nano_0

Nano_AF

FEG: Nano_0, aumento de 140 kx (A) e Nano_AF,

A Figura 2 representa os espectros obtidos para o polímero (PCL), o fármaco puro (AF), a mistura física

O espectro IVTF do ácido ferúlico puro indicou uma banda típica referente à vibração de deformação axial no espectro é atribuída ao

H. O evento de uma banda em 1713 cm-1 se deve ao estiramento do grupamento carbonila conjugado ao anel aromático e três bandas intensas e

, correspondentes às vibrações de deformação axial do anel H do anel aromático.

C. Ainda, as bandas nítidas em e hidrogênio adjacentes no anel fenil (WANGet al., 2011).

, correspondente à vibração de deformação axial do , devido as vibrações simétricas e assimétricas do

A mistura física na proporção 1:1 apresentou espectro condizente com as bandas encontradas tanto na

Tanto a formulação Nano_AF como a Nano_0 apresentaram uma banda característica na região de 1639 , provavelmente característica do óleo utilizado na formulação, o triglicérides de ácido

cáprico/caprílico, que está em maior quantidade na composição, (aproximadamente 80%) e que forma o enciando a formação de uma estrutura de

caprolactona) (PCL), ácido ferúlico (AF), mistura física (MF), e

4.3 Permeação cutânea in vitro A Figura 3 mostra o perfil de permeação do AF puro e da formulação desenvolvida Nano_AF, em tampão fosfato 7,4 utilizando uma membrana natural (pele dissecada da orelha de porco) em condições não oclusivas, utilizando-se células de Franz. Esses estudos foram realizados com o objetivo de se avaliar a influência deste nanocarreador sobre a penetração cutânea do AF. Para a determinação da quantidade de AF permeada foi utilizada uma curva padrão em tampão fosfato pH 7,4, obtida em comprimento de onda de 320 nm, onde obteve-se o r = 0,9999 e equação da reta y = 0,1652 x + 0,021. A permeação do fármaco puro, que encontrava-se apenas disperso no gel de hidroxietilcelulose pode ser considerada insignificante durante o período de tempo analisado, sendo o valor permeado de apenas aproximadamente 0,50% no final de 12 horas. A formulação Nano_AF apresentou um total de 34,10% de permeação cutânea que aumentou ao decorrer do tempo do teste, o que comprova a capacidade das nanopartículas poliméricas de atravessar as barreiras cutânaeas, demonstrando que estas podem ser consideradas excelentes carreadoras provavelmente devido ao fato de que o processo de nanoencapsulação promoveu uma melhora na solubilidade do AF. Os carreadores coloidais apresentam vantagens para aplicação tópica, uma vez que a liberação sustentada é importante para suprir a pele com o fármaco por um período prolongado. O mecanismo de ação das nanopartículas pode ser atribuído à associação com a superfície da pele. O pequeno tamanho da partícula e a elevada área de superfície asseguram um maior contato com o estrato córneo. O agente encapsulado penetrando na pele viável facilita o transporte do fármaco por alterar o coeficiente de partição veículo/estrato córneo. A habilidade do fármaco em uma formulação tópica de permear a pele e exercer seu efeito depende de dois eventos consecutivos: o fármaco deve primeiro difundir do veículo para a superfície da pele e então deve permear essa barreira. A função dessas nanopartículas é liberar um ingrediente ativo nas camadas superiores da pele e, em aplicações ótimas, prolongar o tempo no qual este fármaco permanece sobre a pele (ALVES et al., 2007).

Figura 3 - Representação gráfica do percentual de permeação cutânea in vitrodo AF puro e nanoencapsulado nos

tempos pré-determinados (horas) 5. Conclusão Os resultados deste trabalho demonstram que nanocápsulas poliméricas contendo ácido ferúlico podem ser preparadas utilizando o polímero pré-formado PCL pela técnica de deposição interfacial, um método simples e rápido para obter nanocápsulas adequadas à liberação tópica, sendo possível sugerir que as nanopartículas poliméricas elaboradas com o polímero PCL proporcionam a vetorização do ácido ferúlico em nanocápsulas, o que poderia controlar a liberação percutânea do fármaco, garantindo eficácia em tempo prolongado além de minimizar a degradação pela luz, ar e calor.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

0 5 10 15

Pe

rme

açã

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lico

(%

)

Tempo (h)

AF puro

Nano_AF

Referências FESSI, H.; F. PUISIEUX, J.P. DEVISSAGUET, N. AMMOURY & S. BENITA. Nanocapsule formation by interfacial polymer deposition following solvent displacement. International Journal of Pharmaceutics 55: R1-R4, 1989. ITAGAKI, S.; KUROKAWA, T.; NAKATA, C.; SAITO, Y.; OIKAWA, S.; KOBAYASHI, M.; HIRANO, T. & ISEKI, K.In vitro and in vivo antioxidant properties of ferulic acid: A comparative study with other natural oxidation inhibitors.Food Chemistry v. 114, p. 466-471, 2009. LUCERO, A.; REBOLLEDO, C. &BUONO-CORE, G.E.Effect of some natural UV-absorbers on the photostabilization of active ingredients in german chamomile floral extracts.Part I. Journal of the Chilean Chemical.Society. v. 57 n. 3, 2012. MERLIN, J.P.J.; PRASAD, N.R.; SHIBLI, S.M.A. &SEBEELA, M.Ferulic acid loaded Poly-d,l-lactide-co-glycolide nanoparticles: Systematic study of particle size, drug encapsulation efficiency and anticancer effect in non-small cell lung carcinoma cell line in vitro. Biomedicine & Preventive Nutrition v. 2, p. 69-76, 2012. NEVES, A. R.; LUCIO, M.; MARTINS, S.; LIMA, J. L. &REIS, S.Novel resveratrol nanodelivery systems based on lipid nanoparticles to enhance its oral bioavailability. International Jounal of Nanomedicine, v. 8, p. 177-187, 2013. QUINTANAR-GUERRERO, D.; ALLEMANN, E.; DOELKER, E. & FESSI, H. Preparation and Characterization of Nanocapsules from Preformed Polymers by a New Process Based on Emulsification-Diffusion Technique.Pharmaceutical Research Vol. 15, n. 7, p. 1056-1062, 1998. SAIJA, A.; TOMAINO, A.; TROMBETTA, D.; PASQUALE, A.; UCCELLA, N.; BARBUZZI, T.; PAOLINO, D. & BONINA, F.In vitro and in vivo evaluation of caffeic and ferulic acids as topical photoprotective agents.International Journal of Pharmaceutics v. 199, p. 39–47, 2000. SANTOS, S. S.; LORENZONI, A.; FERREIRA, L. M.; ADAMS, A. I. H.; DENARDI, L. B.; ALVES, S. H.; SCHAFFAZICK, S. R. & CRUZ, L.Clotrimazole-loaded Eudragit® RS100 nanocapsules: Preparation, characterization and in vitro evaluation of antifungal activity against Candida species. Materials Science and Engineering: C. Vol. 33, n. 3, p. 1389-1394, 2013. SCHAFFAZICK, S. R.; GUTERRES, S. S.; FREITAS, L. L. &POHLMANN, A. R.Caracterização e estabilidade físico-química de sistemas poliméricos nanoparticulados para administração de fármacos. Química Nova, Vol. 26, n. 5, p. 725-737, 2003. STANIFORTH, V.; HUANG, W-C.; ARAVINDARAN, K. &YANG, N-S.Ferulic acid, a phenolic phytochemical, inhibits UVB-induced matrixmetalloproteinases in mouse skin via posttranslational mechanisms.Journal of Nutritional Biochemistry v. 23, p. 443-451, 2012. WANG, J.; CAO,Y.; SUN,B. & WANG, C.Characterisation of inclusion complex of trans-ferulic and hydroxypropyl-beta-cyclodextrin. Food Chemistry v.124, p. 1069-1075, 2011.

TRABALHO 18

Avaliação da qualidade de vida das funcionárias de uma instituição de ensino na cidade de Ponta Grossa, PR.

FRANÇÓIA, P. C. O. (G) E-mail: pamella_francoia@hotmail.com

GRIMM, R. C. (PG) E-mail:rcgrimm@hotmail.com MACIEL, M. A. S. (PQ) E mail:msalina@uepg.br

SIMIONATTO, M. (PQ) E mail: mackelly_simionatto@hotmail.com

G – acadêmica de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa - UEPG; PG – aluno de pós-graduação em Administração Pública do Centro Universitário CESUMAR - UNICESUMAR; PQ – docente do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa – UEPG e professora orientadora; PQ – docente do curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa – UEPG e professora orientadora.

Resumo: A qualidade de vida abrange conceitos de ordem econômica, social, cultural e política e não apenas a ausência de doença ou enfermidade. O objetivo do presente estudo foi levantar as condições sócio-econômica-cultural e avaliar a qualidade de vida no trabalho (QVT) de funcionárias de uma instituição de ensino, na cidade de Ponta Grossa. Os dados foram obtidos em evento realizado por um projeto extensionista da Universidade Estadual de Ponta Grossa.A amostra foi composta por 12 mulheres com idades entre 31 e 59 anos. Foram empregados dois questionários abordando aspectos sócio-econômico-cultural e QVT (Questionário SF-36). Os resultados do questionário sócio-econômico-cultural foram bem variados, por envolver questões pessoais, funções diferenciadas e variações na idade e tempo de serviço. As perguntas relacionadas a patologias de caráter crônico como anemia, parasitose, diabetes, hipertensão arterial e problemas cardíacos mostraram certo grau de incerteza nas respostas, mas possibilitou a detecção destas bem como fatores hereditários evidentes. Pelo cálculo de índices de massa corporal, apenas 25% das mulheres apresentaram peso saudável, as demais, evidenciaram sobrepeso ou obesidade. O questionário SF-36 demonstrou valores adequados (≥ 50) para7 dos 8 domínios analisados variando de 58,3 a 85,7. Somente o domínio de dor no corpo foi considerado inadequado como dor importante e limitante (valor de 41,7). De forma geral, a QVT para estas mulheres é boa, refletindo em boa convivência familiar, social e com os menores da instituição. Ações educativas a respeito de enfermidades e hábitos saudáveis e auxílio profissional são necessários para a manutenção da QVT dessas funcionárias. Palavras-chave: Qualidade de vida, questionário SF-36, funcionárias, realidade social, extensão. 1. Introdução Qualidade de vida é um conceito muito amplo e gera entendimentos de forma diferenciada pelos indivíduos na sociedade. A partir da literatura sobre o tema, é possível perceber que embora cada época venha a apresentar um enfoque diferente para conceituar qualidade de vida no trabalho, algo que parece comum a todos é o fato de que os interesses dos indivíduos e das organizações seguem o mesmo caminho, isto é,quando melhora a satisfação do trabalhador há melhora na produtividade da empresa (FERNANDES, 1997). A qualidade de vida é uma discussão de natureza econômica, social, cultural e política, constituindo o seu discurso uma linha de pensamento em conflito com o discurso tradicional. Chiavenato (1999) menciona que, embora qualidade de vida seja considerada por diversos autores como conceito abstrato, difícil de operacionalizar, ela equivale a "bem-estar" no domínio social; a "status de saúde", no domínio da medicina; a nível de satisfação, no domínio psicológico.

A Organização Mundial da Saúde (OMS) define a qualidade de vida como um estado de completo bem-estar físico, mental e social, não consistindo apenas na ausência de doença ou enfermidade. A qualidade de vida relacionada à saúde (QVRS) é mencionada como a noção que o indivíduo tem em relação a possíveis doenças que possam acometê-lo e seus efeitos na própria vida e compreende a satisfação pessoal, bem estar físico, funcional, emocional e social (LANA et al., 2007). O termo qualidade de vida vem sendo empregado no ambiente de trabalho devido ao fato das pessoas dedicarem o maior tempo de sua vida nesses lugares. Portanto, a qualidade de vida no trabalho (QVT) refere-se à renda capaz de satisfazer as necessidades pessoais e sociais motivando o sentimento de orgulho pelo trabalho realizado; satisfazendo a vida emocional; promovendo a auto-estima e a imagem positiva da empresa/instituição junto à opinião pública; de modo a obter o equilíbrio entre trabalho e lazer; aos horários e condições adequadas de trabalho; a ter possibilidade de oportunidades e perspectivas de carreira; bem como, possibilidade de demonstração de uso do potencial; respeito aos direitos adquiridos; e recompensas justas pelo trabalho realizado(SUCESSO, 2002). Em contrapartida, se faz necessário salientar que QVT assimila duas posições antagônicas: de um lado, a reivindicação dos empregados quanto ao bem-estar e satisfação no trabalho; e, de outro, o interesse das organizações quanto aos seus efeitos potenciais sobre a produtividade e a qualidade (CHIAVENATO, 1999). Cavassiniet al. (2006) ressalta que é relevante cuidar do bem-estar e segurança dos indivíduos resultando em uma maior produtividade e qualidade no trabalho e ainda, contentamento na vida familiar e pessoal. Especificamente abordando um dos temas relacionados à QVT, neste caso a saúde, e com o intuito de mensurar a qualidade de vida de trabalhadores, faz-se necessário a utilização de instrumentos que possam quantificar a percepção do individuo sobre seu estado de saúde. O questionário Medical OutcomesStudy 36-Item short-Form Health Survey (SF-36) é um meio pelo qual, avalia-se a qualidade de vida de forma ampla e completa. Esse instrumento avalia tanto aspectos positivos como bem-estar, quanto aspectos negativos como doença (FERNANDES et. al., 2009). O SF-36 é composto por 36 itens de auto-resposta de modo a ser dividido em oito dimensões para avaliação dos conceitos de saúde que representam valores humanos básicos significativos ao desempenho funcional e ao bem-estar individual (ABRUNHEIRO, 2005). Além dos aspectos de qualidade de vida, esse tipo de instrumento pode ser complementado com outras questões, como os dados demográficos do indivíduo, tais como sexo, idade, estado civil, grau de instrução, tipo de empresa/instituição em que trabalha e tempo de trabalho na empresa/instituição. Para atingir os objetivos de estudos com o uso de entrevista em profundidade e questionários adota-se uma abordagem qualitativa por meio de estudo de caso que segundo Fachin (2003), é um tipo de pesquisa que lida com interpretações da realidade social.

2. Objetivos O presente estudo tem por objetivo levantar as condições sócio-econômica-cultural e avaliar a qualidade de vida de funcionárias de uma instituição de ensino, na cidade de Ponta Grossa, por meio de abordagem individual e aplicação de questionários. 3. Materiais e Métodos O estudo foi realizado no Instituto João XXIII de Ponta Grossa, entidade de acolhimento que faz parte da Vara da Infância e do Adolescente local e exerce atividades de ensino e profissionalizantes para crianças, adolescentes e jovens internos e/ou de contra-turno, com idades entre 6 e 18 anos. Para tanto, 29 adultos fazem parte do quadro funcional sendo destes, 15 mulheres e 14 homens.

Participaram do estudo funcionárias vinculadas por regime de contrato de trabalhodo Instituto João XXIII em evento realizado em julho de 2015 pelo projeto de extensão “Avaliação e acompanhamento do estado de saúde dos alunos do Instituto João XXIII, na cidade de Ponta Grossa, Paraná” que conta com a participação de acadêmicos do curso de Farmácia e de professoras supervisoras do Laboratório Universitário de Análise Clínicas (LUAC). A amostra foi composta por 12 mulheres com faixa etária compreendendo entre 31 e 59 anos. Com base no método proposto, foram elaborados e realizados dois questionários aplicados, sendo um sócio-econômico-cultural com perguntas relacionadas às questões como: estado civil, escolaridade, renda familiar, moradia, saneamento básico, hábitos higiênicos e ainda, dados antropométricos, de saúde e funcionais; e outro sobre qualidade de vida no trabalho, conforme a versão brasileira do Questionário SF-36 proposto por Ware&Sherboune (1992), onde são levantadas 11 questões que abordam saúde, esforço físico, problemas emocionais, dor, energia e vigor e atividades sociais, e que são avaliadas em 8 grupos de domínios (WARE, et al.,1997). Sendo eles: funcionamento físico (limitações em atividades físicas), limitações de desempenho consequentes a problemas físicos, dor no corpo, percepção geral de saúde, vitalidade, funcionamento social (limitações em atividades sociais), limitações de desempenho decorrentes de problemas emocionais, e ainda, saúde mental. A interpretação dos domínios da versão brasileira do questionário por Martinez, Paraguay e Latorre (2004) atualmente ocorre por uma escala de 0 (zero) a 100 (cem), onde zero é pior domínio e cem, o melhor. Aplica-se uma fórmula para o cálculo de cada domínio e para o mesmo existe um limite inferior e variação pré-determinados, conforme descrito na figura 1.

���í��� =Valor�obtido�nas�questões�correspondentes − Limite�inferior

Variaçãox�100

Onde: ● Valor obtido nas questões correspondente é a razão da soma de todos os escores das questões referentes a esse domínio pela população/amostragem;

● Limite inferior e variação (Score Range) são valores constantes.

Figura 1 – Fórmula para obtenção dos domínios da versão brasileira do questionário SF- 36

Considerou-se significado baixo ou ruim de desempenho de domínio, valores até 49,9 e em contrapartida, significado alto ou bom com valores iguais ou maiores a 50. No inquérito original, a interpretação é realizada por meio de uma tabela de informação com o significado dos valores altos e baixos de escores e/ou desempenho de domínio que são obtidos pela pontuação das questões transformadas em porcentagem (%) também calculadas por fórmula. Para o cálculo do Índice de Massa Corporal (IMC) utilizou-se a fórmula preconizada pela OMS, aonde o IMC do indivíduo é a razão do seu peso em kg pela sua altura em metros ao quadrado (WHO, 2004). As atividades funcionais realizadas pelas mulheres desta instituição estão intimamente relacionadas ao cuidado dos menores atendidos pelo abrigo, tais como, cuidadora, educadora, cozinheira, lavadeira, auxiliar de limpeza e de leiteria e técnica administrativa. Sendo assim, sabe-se que o desempenho profissional está intimamente relacionado ao seu bem-estar físico e social e que refletirá diretamente no atendimento adequado às crianças, adolescentes e jovens da comunidade. 4. Resultados e Discussão As respostas referentes ao questionário sócio-econômico-cultural foram bem variadas, por envolver questões pessoais e pelo fato das trabalhadoras exercerem funções diferentes dentro da instituição, bem como, idade e tempo de serviço. Em relação ao estado civil, 2 (16,67%) eram solteiras, 6 (50%) casadas formalmente, 2 (16,67%) casadas porém de modo não formal, 2 (16,67%) divorciadas ou separadas e nenhuma em viuvez.

Quanto à escolaridade, 1 (8,33%) era alfabetizada, 6 (50%) tinham o ensino fundamental incompleto, 1 (8,33%) com o ensino fundamental completo, 1 (8,33%) com o ensino médio incompleto, 2 (16,67%) com o ensino médio completo, 1 (8,33%) com o ensino superior completo e nenhuma analfabeta ou com ensino superior incompleto. Os resultados sobre a renda familiar foram mais homogêneos, sendo que 10 (83,33%) delas apresentam de 1 a 2 salários mínimos, 1 ( 8,33% ) entre 3 a 5 salários mínimos e 1 (8,33%) com renda superior a 5 salários mínimos. Em relação à ocupação, 8 (66,67%) delas tinham moradia própria, 2 (16,67%) moravam em local alugado e 2 (16,67%) em moradia cedida. Apenas 2 (16,67%) mulheres responderam que se tratava de zona urbana e 1 (8,33%) possuía horta em casa. Todas (100%) mencionaram que havia coleta de lixo, água e esgoto tratados. Apenas 1 (8,33%) relatou ter poço na moradia e nenhuma com fossa. Os resultados quanto aos hábitos higiênicos,que se referiam à lavagem das mãos antes das refeições, após ir ao banheiro e andar descalço e obteve-se respectivamente, 12 (100%), 11 (91,67%) e zero. Como dados funcionais, foram avaliados o tempo de serviço e o turno das funcionárias na instituição apenas 11 funcionáriasresponderam essa questão,conforme a tabela 1. Duas funcionárias haviam iniciado as atividades há 2 e 6 meses e todas as outras com mais de 2 anos de trabalho (91,67%). Percebeu-se uma média de tempo de serviço de cinco anos e meio e períodos de trabalho de até 17 anos, demonstrando estabilidade empregatícia. Todas (100%) trabalham pela manhã e a tarde.

Tabela 1. Valores referentes ao tempo de serviço (em anos) das funcionárias da instituição

TEMPO DE SERVIÇO (em anos) FREQUÊNCIA % menor que 1 ano 2 16,67

1 a 3 3 25,0 4 a 6 3 25,0

10 ou mais 3 25,0 TOTAL 11 91,67

Fonte: Dados da pesquisa. Com os dados antropométricos como peso e altura, foram calculados os índices de massa corporal – IMC, e que resultou em 3 (25%) das mulheres apresentando peso saudável, 5 (41,67%) em estado de sobrepeso, 3 (25%) com obesidade de grau I e 1 (8,33%) com obesidade de grau II, dados elucidados na tabela 2.

Tabela 2. Índice de massa corporal das funcionárias da instituição

CATEGORIA FREQUÊNCIA (n)

%

Subnutrição IMC: abaixo de 18,5

0 0

Peso saudável IMC: 18,5 – 24,9

3 25,0

Sobrepeso IMC: 25,0 – 29,9

5 41,7

Obesidade grau I IMC: 30,0 – 34,9

3 25,0

Obesidade grau II IMC: 35,0 – 39,9

1 8,3

Obesidade grau III IMC: 40,0 e acima

0 0

TOTAL 12 100 Fonte: IMC adaptado do WHO, 1995, WHO, 2000 e WHO, 2004e dados da pesquisa.

Os resultados encontrados para o sobrepeso, obesidade grau I e grau II (75%) alertam para as condições de hábitos alimentares inadequadas e que acarretam em diminuição da qualidade de vida e consequentes problemas de saúde. Para as perguntas sobre os dados de saúde, as respostas não foram completas, o que demonstrou desconhecimento ou incerteza. As perguntas estavam relacionadas a patologias como anemia, parasitose, diabetes, hipertensão arterial e problemas cardíacos, com complemento de tratamento quando da sua existência e conhecimento de casos na família nas três últimas propostas. Quanto aos casos de anemia, 7 (58,33%) que responderam a questão não relataram a anormalidade e das 3 (25%) que apresentaram o quadro de anemia, somente 2 (16,67%) realizaram o tratamento. De todas as mulheres, 9 (75%) mencionaram nunca ter apresentado parasitose. Mesmo que 4 (33,33%) delas apresentavam casos de diabetes familiar, apenas 1 (8,33%) apresentou tal alteração no metabolismo dos carboidratos. Em relação à hipertensão arterial, 4 (33,33%) disseram-se hipertensas, mas somente 3 (25%) relataram que estão em tratamento. Entretanto, 5 (41,66%) apresentaram casos de familiares com hipertensão. Já em relação a problemas cardíacos, somente 1 (8,33%) delas sabia da sua patologia e se tratava, porém 7 (58,33%) mencionou o problema em familiares. Os resultados indicam que, de modo geral, trabalhos educativos com as mulheres e acompanhamento clínico parecem necessários. Os resultados da versão brasileira do questionário SF-36 para a qualidade de vida das funcionárias do Instituto João XXIII estão representados na tabela 3. Numa escala de 0 (zero) a 100 (cem), demonstraram valores de 68,3 para o domínio de funcionamento físico, 83,3 para limitações de desempenho consequentes a problemas físicos, 41,7 para o domínio de dor no corpo, 63,3 para a percepção de saúde em geral, 58,3 para o domínio de vitalidade, 64,5 funcionamento social, 85,7 de limitações de desempenho consequentes a problemas emocionais, e 72,9 de saúde mental. Com base nos resultados obtidos para os todos os domínios, de modo geral, as mulheres se encontram sem limitações ou problemas físicos, sociais e mentais que impedem a realização das suas atividades diárias. Apresentam-se saudáveis e com vitalidade, porém em contrapartida, o domínio da dor demonstrou valores abaixo do escore desejável, demonstrando que a dor corporal pode limitar suas atividades normais.

Tabela 3. Avaliação dos resultados dos escores do Questionário SF-36 para as funcionárias da instituição

DOMÍNIO FREQUÊNCIA DE

DESEMPENHO SIGNIFICADO DOS ESCORES

BAIXO (<49,9) ALTO (≥50,0)

Funcionamento físico (limitações em atividades físicas)

68,3

Grande limitação ao desempenhar as atividades físicas, incluindo tomar banho ou vestir-se, devido à saúde

Sem limitação de saúde para realizar todas as atividades físicas, incluindo as mais rigorosas

Limitações de desempenho consequentes a problemas físicos

83,3

Problemas com o trabalho ou outras atividades diárias como resultado da saúde física

Sem problemas no trabalho ou em outras atividades diárias

Dor no corpo 41,7 Dor importante e muito limitante

Sem dor ou limitações decorrentes de dor

Percepção de saúde em geral

63,3 Avalia a sua saúde como ruim e acredita que vai piorar

Avalia a sua saúde como excelente

Domínio de vitalidade

58,3 Sente-se cansado e esgotado todo o tempo

Sente-se animado e com energia todo o tempo

Funcionamento social

64,5

Interferência extrema e frequente em atividades sociais normais devido a problemas físicos e emocionais

Atividades sociais normais sem interferência de problemas físicos e emocionais

Limitações de desempenho consequentes a problemas emocionais

85,7

Problemas no trabalho ou em outras atividades diárias como consequencia de problemas emocionais

Sem problemas no trabalho ou em outras atividades diárias

Saúde mental 72,9 Sentimento de nervosismo e depressão todo o tempo

Sentimentos de paz, calma, felicidade todo o tempo

Fonte: Dados da pesquisa segundo o questionário de Ware et al., 1997. Adaptado para a versão brasileira demonstrada por Martinez, Paraguay e Latorre, 2004. Vários estudos são realizados utilizando o questionário SF-36 porque é de fácil compreensão, do tipo auto administrado e visa a percepção pelo próprio paciente/entrevistado do seu estado atual de saúde.Como por exemplo, o estudo de Fernandes et al. (2009) avaliou a qualidade de vida da gerência de assistência nutricional da Santa Casa de Misericórdia do Pará e obteve resultados muito similares aos encontrados neste trabalho e concluiu que seus funcionários apresentavam uma boa qualidade de vida. A evolução clínica de pacientes também pode ser acompanhada por este método, assim como o efeito da terapia empregada e analisar a influência de co-morbidades na QVRS (AYDEMIR et al., 2005).

5. Conclusão A análise de qualidade de vida das funcionárias do Instituto João XXIII, realizada por meio de projeto de extensão, proposta neste estudo demonstrou pelo levantamento sócio-econômico-cultural diferenças expressivas em relação às respostas, principalmente, as que dizem respeito à idade, escolaridade, atividade funcional e tempo de serviço na instituição. As mulheres apresentaram dificuldades para responder aos dados de saúde, parecendo alheias aos apontamentos, porém os resultados do cálculo do IMC alertaram categorias de sobrepeso e obesidades grau I e II. Portanto, demonstra a necessidade de ações educativas a respeito de enfermidades e hábitos saudáveis, bem como, auxílio profissional. Quanto ao questionário de qualidade de vida SF-36 adaptado à realidade brasileira, para todos os domínios avaliados apenas o que se referia à dor resultou em níveis preocupantes com grande potencial de interferir nas atividades diárias comuns, mas de forma geral, a QVT para estas mulheres é boa e as mesmas encontram-se em adequado estado de saúde física, emocional e mental sem comprometimento de suas atividades funcionais e sociais refletindo na convivência dos seus familiares e dos menores atendidos na instituição. Referências ABRUNHEIRO, L. M. M. A satisfação com o suporte social e a qualidade de vida no doente após transplante hepático, 2005. http://www.psicologia.pt/artigos/textos/A0255.pdf Acesso em: 01 de setembro de 2015. AYDEMIR, O.; OZDEMIR, C.; KOROGLU, E.The impact of co-morbid conditions on the SF-36: A primary-care-based study among hypertensives. Arch. Medical Research, vol. 36, p.136-141, 2005. CAVASSINI, A. P.; CAVASSINI, E. B.; BIAZIN, C. C.Qualidade de vida no trabalho: fatores que influenciam as organizações. In: XIII Simpósio de Engenharia de Produção – SIMPEP, Bauru – SP,2006. CHIAVENATO, I.Gestão de pessoas: o novo papel dos recursos humanos nas organizações. RIO DE JANEIRO: CAMPUS, 1999. FACHIN, O. Fundamentos de Metodologia. São Paulo: Saraiva, 2003. FERNANDES, I. L. B.; VASCONCELOS, K. C.; SILVA, L. L. L. Análise da qualidade de vida segundo o questionário SF-36 nos funcionários da gerência de assistência nutricional (GAN) da Fundação Santa Casa de Misericórdia do Pará. Trabalho de conclusão de curso de fisioterapia da UNAMA, p. 1-79, 2009. FERNANDES, E. C. Qualidade de vida no trabalho: como medir para melhorar.Salvador: Casa da Qualidade, 1997. LANA, R. C.; ÁLVARES, L. M. R. S.; NASCIUTTI-PRUDENTE, C.; GOULART, F.R.P.; TEIXEIRA-SALMELA, L.F.; CARDOSO, F. E.Percepção da qualidade de vida de indivíduos com doença de parkinson através do PDQ-39Revista Brasileira de Fisioterapia, São Carlos, vol. 11, n. 5, p. 397-402, set-out. 2007. MARTINEZ, M. C.; PARAGUAY, A. I. B. B.; LATORRE, M. do R. D. de O.Relação entre satisfação com aspectos psicossociais e saúde dos trabalhadores. Revista de Saúde Pública[online], vol. 38, n. 1, p. 55-61, 2004. SUCESSO, E. de P. B.Relações interpessoais e qualidade de vida no trabalho.Rio de Janeiro: Qualitymark, 2002. WARE, J.E., SHERBOURNE, C.D. The MOS – 36 item Short Form Health Survey (SF – 36) conceptual framework and item selection. Med Care, n. 30, p. 473-483, 1992. WHO/OMS, World Health Organization. BMI classification. http:/apps.who.int/bmi/index.jsp?introPage=intro_3.html Acessoem 01 de setembro de 2015.

TRABALHO 19 Estudo farmacobotânico comparativo de duas espécies de Baccharis L.

da Região dos Campos Gerais

Vanessa Barbosa Bobek1 (PG) E-mail: vanessabarbosa273@bol.com.br Valter Paes de Almeida 2(IC) E mail valterp_almeida@hotmail.com

Tomoe Nakashima3(PQ) E mail tomoenak@gmail.com Jane ManfronBudel4 (PQ) E-mail janemanfron@hotmail.com

1 Mestranda do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná; 2 Aluno de iniciação científica do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa; 3 Professora Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná responsável pela co-orientação do trabalho; 4 Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela orientação do trabalho

Resumo: Baccharis compreende muitas espécies medicinais. Baccharis caprariifolia DC. e Baccharis erioclada DC., popularmente conhecidas como “vassouras”, ocorrem no Sul do Brasil e sua morfologia externa é muito semelhante. Objetivou-se neste trabalho investigar as características farmacobotânicas de folhas e caules destas espécies. Foram feitos cortes transversais à mão livre de folhas e caules das duas espécies. Utilizou-se a dupla coloração azul de astra e fucsina básica. Os resultados foram registrados através de fotomicrografias em microscópio de luz. As duas espécies estudadas apresentam características morfológicas muito semelhantes. Algumas características anatômicas podem ser consideradas como elementos diferenciais de diagnóstico: a ocorrência de estômatos nas folhas e o tipo detricomanão-glandular. Palavras-chave: Asteraceae, Baccharis, morfoanatomia. 1. Introdução Entre as diversas famílias botânicas com destaque para uso medicinal encontra-se Asteraceae Dumort que apresenta aproximadamente 1.600 gêneros e 25.000 espécies. Dentre os gêneros de Asteraceae, destaca-se Baccharis L., que inclui mais de 400 espécies, sendo 178 encontradas no Brasil. São frequentemente utilizadas na medicina popular para controle e tratamento de diversas enfermidades (CORRÊA, 1984; HEIDEN et al., 2010). Numerosas espécies de Baccharis são produtoras de óleo essencial. Estudos químicos relataram a composição dos seus óleos voláteis e vários componentes do óleo essencial têm demonstrado atividade biológica, tais como β-pineno, limoneno, β-cariofileno, espatulenole (E) – nerolidol (FLORÃO et al., 2012; BUDEL et al., 2012). Baccharis caprariifolia DC. e Baccharis erioclada DC., popularmente conhecidas como "vassoura", ocorrem no Sul do Brasil e sua morfologia externa é muito semelhante. Estudos anteriores revelaram que β-cariofileno e (E)-nerolidol são os componentes principais do essencial óleo das partes aéreas de Baccharis caprariifoliaDC. Enquanto que β-pineno e limoneno são os compostos majoritários do óleo essencial de B. erioclada DC. (FERRACINI et al., 1995). 2. Objetivos Objetivo deste trabalho foi estudar os caracteres farmacobotânicos de folhas e caules de B. caprariifolia e B. eriocladapara fornecer suporte adicional para diferenciar estas espécies vegetais. 3. Materiais e Métodos Partes aéreas de B. caprariifolia e B. erioclada foram coletadas na região dos Campos Gerais, Ponta Grossa, Paraná, Brasil (coordenadas 25 ° 08 'S e 50 ° 27 'W) durante o verão de 2013. Os materiais botânicos foram identificados e os comprovantes foram depositados no Herbário de Universidade Estadual de Ponta Grossa e Universidade Federal do Rio Grande do Sul sob os

números ICN 59353 e ICN 20412, respectivamente para B. caprariifolia e B. erioclada. O material vegetal foi fixado em FAA 70 (JOHANSEN, 1940) e estocado em etanol a 70% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE, 1976). As lâminas semipermanentes foram obtidas através de secções transversais à mão livre (OLIVEIRA & AKISUE, 1997). Para a montagem das lâminas foi utilizada glicerina a 50% (BERLYN & MIKSCHE, 1976) e a lutagem feita com esmalte incolor (BEÇAK & PAULETTE, 1976). Para os testes microquímicos foram feitas secções transversais à mão livre do material fixado. A verificação de lignina foi feita com floroglucina clorídrica (FOSTER, 1949). Para compostos lipofílicos foi empregado o reativo de Sudam III (SASS, 1951). Compostos fenólicos foram detectados com cloreto férrico e lugol para amido (JOHANSEN, 1940; BERLYN & MIKSCHE, 1976). Os resultados foram registrados através de fotomicrografias em microscópio óptico. A análise ultraestrutural de superfície foi realizada por microscopia eletrônica de varredura em alto vácuo. As eletromicrografias foram realizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3 TESCAN, no C-LABMU/PROPESP da UEPG. 4. Resultados e Discussão As folhas de B. caprariifolia medem 1,5- 3 cm de comprimento e 0,5 cm de largura, possuem ápice obtuso, base atenuada e margem foliar denteada no terço superior. Baccharis erioclada apresenta folhas com 1-2 cm de comprimento e 0,3-0,5 cm de largura, ápice agudo, base atenuada e margem foliar denteada no terço superior. Ambas as espécies evidenciaram folhas sésseis e com formato oblongo. Baccharis geralmente apresenta folhas com filotaxia do tipo alternada, como observado em B. caprariifolia e B. erioclada. De acordo com a literatura (BARROSO & BUENO, 2002), um pequeno número de Baccharis pode exibir umadisposição oposta das folhas, conforme relatado para B. lymannii G.M. Barroso e B. spicata (Lam.) Baill. Quanto à margem foliar, comumente em Baccharis ocorrem folhas com a porção média superior provida de dentes triangulares como se encontra nasespécies em estudo, bem como em B. spicata (BARROSO & BUENO,2002; OLIVEIRA et al., 2011). No entanto, em B. singularis (Vell.) G.M. Barroso (SOUZA et al., 2011) e B. uncinella DC. (BUDEL & DUARTE, 2008a), a margem foliar é desprovida de dentes. Na análise anatômica da lâmina foliar, em vista frontal, as células epidérmicas apresentam parede anticlinal com formato ondulado na face abaxial e reto na face adaxial, em B. caprariifolia assim como em B. megapotamica (BUDEL, 2009). Enquanto que em B. erioclada o formato das células apresentou-se ligeiramente ondulado na face adaxial e ondulado na face abaxial. É comum em Baccharis as células epidérmicas apresentarem-se com formato poligonal em vista frontal (FREIRE et al., 2007; BUDEL & DUARTE, 2007; PEREIRA et al., 2014). No entanto, os formatos ondulado (OLIVEIRA et al., 2011; BUDEL et al., 2013) e sinuoso (BUDEL & DUARTE, 2008b) também podem ser encontrados. Medri & Lleras (1980) sugeriram que o formato sinuosodas células da parede celular, pode ser atribuído às características de adaptação da planta com objetivo de diminuir a perda excessiva de água. Em secção transversal, a epiderme apresentou-se uniestratificada com células isodiamétricas para as duas espécies. Baccharis caprariifolia revelou-se anfiestomática e os estômatos presentes em ambas asfaces são classificados como anomocíticos e anisocíticos. No entanto B. erioclada apresentou-se hipoestomática com estômatos anomocíticos e anisocíticos presentes apenas na face abaxial. Segundo Metcalfe e Chalk (1950), o aspecto do estômato, em vista frontal, tem valor diagnóstico para a família Asteraceae, e dois tipos podem ser encontrados: anomocítico e anisocítico, sendo o primeiro mais comum. Outros tipos de estômatos também foram descritos para o gênero Baccharis tais como, ciclocítico(FREIRE et al., 2007; BUDEL et al., 2013), estaurocíticos, tetracíticos (FREIRE et al., 2007) e actinocítico (PEREIRA et al., 2014).

O tipo do tricoma é uma característica relevante para o controle da qualidade de drogas vegetais, visto que elas são comercializadas na forma rasurada ou pulverizada. Vários autores relataram que o tipo de tricoma pode ser utilizado como um parâmetro de diagnóstico para Asteraceae (FREIRE et al., 2007; OLIVEIRA et al., 2011). Neste estudo foram encontrados tricomas glandulares capitados e bisseriados com 8-12 células de base para ambas espécies. A ocorrência desses tricomasfoi amplamente descrito em Baccharis (SOUZA et al., 2011; BUDEL, et al., 2013; PEREIRA et al., 2014). Foram observados tricomas tectores em B. caprariifoliae B. erioclada. Esses tricomas são classificados como flageliformes simples em B. caprariifolia os quais possuem 3-4 células de base e em tricomasflageliformes ramificados os quais foram encontrados em B. erioclada com 2 células de base. Tricomasflageliformes foram observadas em B. anômala (BUDEL & DUARTE, 2008b), B. cognata (BUDEL et al., 2013), B coridifolia (BUDEL & DUARTE, 2007), B. singularis (SOUZA et al., 2011), B. spicata (OLIVEIRA et al., 2011), e B. rufescens var. tenuifolia (SOUZA et al., 2013).Tricomas flageliformes ramificados foram encontradas em B. coridifolia (BUDEL & DUARTE, 2007), B. dracunculifolia (BUDEL et al., 2004) e B. uncinella (BUDEL & DUARTE, 2008a). As folhas de B. caprariifolia e B. erioclada mostraram mesofilo isobilateral, evidenciando parênquima paliçádico composto por 2-3 camadas de células e parênquima esponjoso formado por 2-3 camadas de células. Mesofilo isobilateral foi relatado em diversas espécies de Baccharis (BUDEL & DUARTE, 2010; BUDEL et al., 2013; SOUZA et al., 2013). A nervura central em secção transversal evidenciou formato plano na face adaxial e ligeiramente convexo na face abaxial em B. caprariifolia e formato ligeiramente côncavo na face adaxial e convexo na face abaxial em B. erioclada. A epiderme é unisseriada e coberta por uma cutícula delgada e ligeiramente estriada. Há duas camadas de colênquima angular em ambas as faces para as duas espécies e um único feixe vascular do tipo colateral. Foram observadas calotas de fibras esclerenquimáticas, as quais reagiram com floroglucina clorídrica nos testes microquímicos. No xilema, os elementos traqueais estão dispostos em fileiras. Dutos secretores com epitélio unisseriado compostos de 4-12 células ocorrem próximo ao floema em ambas as espécies. O caule apresenta formato praticamente circular evidenciando 3-4 costelas. A epiderme caulinar é uniestratificada. Uma a cinco camadas de colênquima angular podem ser encontradas subjacente à epidermede ambas as espécies, principalmente nas costelas. O córtex possui uma camada de colênquima angular contínuo subjacente à epiderme. Colênquima alternando com clorênquima nas demais camadas. Essa característica foi observada em B. anomala, B. megapotamica, B. microcephala, B. ochracea, B. spicata e B. uncinella (BUDEL, 2009). A endoderme limita o córtex internamente com estrias de Caspary visíveis. Dutos secretores e calotas de fibras perivasculares são observados junto ao floemaconforme amplamente divulgado para várias espécies de Baccharis (BUDEL et al., 2004; RODRIGUEZ et al., 2008; SOUZA et al., 2011). Os elementos traqueais do xilema estão dispostos em fileiras, de forma organizada e são separados por células do parênquima e fibras. Várias espécies do gênero evidenciam a presença de cristais de oxalato de cálcio (BUDEL et al., 2004; RODRIGUEZ et al., 2008; SOUZA et al., 2011). Nesse estudo, numerosos cristais de oxalato de cálcio do tipo ráfides, prismáticos e estilóidesforam encontrados na região perimedular de ambas as espécies. 5. Conclusão Os estudos morfoanatômicos realizados neste trabalho auxiliam no reconhecimento da flora nativa brasileira e, quando tomados em conjunto, contribuem na caracterização farmacobotânica (macro e microscópica) dessas espécies. Referências BARROSO, G. M. & BUENO, O.Compostas: subtribo Baccharidinae. Itajaí: Herbário Barbosa Rodrigues, 2002. BEÇAK, W.& PAULETE, J.Técnicas de citologia e histologia. Rio de Janeiro: Livros Técnicos e Científicos, 1976. BERLYN, G. P. & MIKSCHE, J. P. Botanical microtechnique and cytochemistry.Ames: Iowa StateUniversity, 1976.

BUDEL, J.M., DUARTE, M. R. & SANTOS, C.A.M.Morfoanatomia foliar e caulinar de Baccharis dracunculifolia DC.,Asteraceae. Latin American Journal of Pharmacy. Vol. 23, n. 4, p. 477-83, 2004. BUDEL, J. M. & DUARTE, M. R.Caracteres Morfoanatômicos de Partes Vegetativas Aéreas de Baccharis coridifoliaDC. (Asteraceae-Astereae). Latin American JournalofPharmacy. Vol. 26, p. 731, 2007. BUDEL, J. M. & DUARTE, M. R.Estudo Farmacobotânico de Folha e Caule de Baccharis uncinella DC.,Asteraceae. Latin American Journal of Pharmacy. Vol. 27, p.746, 2008a. BUDEL, J. M. & DUARTE, M. R.Estudo farmacobotânico de partes vegetativas aéreas de Baccharisanomala DC.,Asteraceae. Revista Brasileira de Farmacognosia. Vol. 18, n. 768, p.761-768, 2008b. BUDEL, J. M.Análise morfoanatômica de partes vegetativas aéreas de espécies de BaccharisL. (Asteraceae) do sul do Brasil.155f. Tese (Doutorado em Ciências Farmacêuticas) Universidade Federal do Paraná, 2009. BUDEL, J.M. & DUARTE, M.R.Macro and Microscopic characters of the aerial Vegetative organs of carqueja: BaccharisusteriiHeering. Brazilian Archives of biology and Technology. Vol. 53, n. 1, p. 123-131, 2010. BUDEL, J. M.; DUARTE, M. R.; DOLL-BOSCARDIN, P. M.; FARAGO, P. V.; MATZENBACHER, N.I.; SARTORATTO, A. & MAIA, B. H. L. N. S.Composition of essential oils and secretory structures of Baccharisanomala, B. megapotamica and B. ochracea.The Journal of Essential Oil Research.Vol. 24, p.19-24, 2012. BUDEL, J.M., FARAGO, P.V. & DUARTE, M.R.Pharmacobotanical study of BacchariscognataDC. (Asteraceae: Astereae).Latin American Journal ofPharmacy.Vol. 32, n. 4, p. 550-554, 2013. CORRÊA, M. P.Dicionário das plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas.Rio de Janeiro: IBDF, Vol. 2, 1984. FEDER, N. & O’BRIEN, T. P.Plant microthecnique: some principles and new methods.American Journal of Botany.Vol. 55, n. 1, p. 123-142, 1968. FERRACINI, V. L.; PARAIBA, L. C.; LEITÃO-FILHO, H. F.; SILVA, A. G.; NASCIMENTO, L. R.&MARSAIOLI, A. J. Essential oils of seven Brazilian Baccharis species.Journal of Essential Oil Research.Vol. 7, n. 4, p. 355-367, 1995. FLORÃO, A.; SANTOS, C. A. M.; BUDEL, J. M.; DUARTE, M. R.; MARCONDES, A.; RODRIGUES, R. A. F.; RODRIGUES, M. V. N.; SANTOS, C. A. M. & WEFFORT-SANTOS, A. M. Essential oils from species (Asteraceae) have anti-inflammatory effects for human cells.The Journal of Essential Oil Research.Vol. 24, p. 561-570, 2012. FOSTER, A. S.Practical plant anatomy. 2. ed. Princeton: D. Van Nostrand, 1949. FREIRE, S. E., URTUBEY, E. & GIULIANO, D. A. Epidermal characters of Baccharis(Asteraceae) species used in traditional medicine. Caldasia.Vol. 29, p. 23-38, 2007. HEIDEN, G.; BAUMGRATZ, J. F.A. & ESTEVES, R. L.Notas nomenclaturais sobre espécies brasileiras de Baccharis(Asteraceae).Rodriguésia.Vol. 61, p. S47-S50, 2010. JOHANSEN, D. A. Plant microtechnique. New York: McGraw Hill Book, 1940. MEDRI, M. E. & LLERAS, E.Aspectos da anatomia ecológica de folhas de Hevea brasiliensis Müll. ActaAmazônica.Vol. 10, n. 3, p. 463–493, 1980. METCALFE, C. R.& CHALK, L.Anatomy of dicotyledons: leaves, stem, and woods in relation to taxonomy with notes on economic uses. Oxford: Clarendon Press, Vol. 2, 1950. O’BRIEN, T. P., FEDER, N. & MCCULLY, M. E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O.Protoplasma, v. 59, n. 2, p 368-373, 1964. OLIVEIRA, F. & AKISUE, G.Fundamentos de farmacobotânica. 2. ed. São Paulo: Atheneu, 1997. ORTINS, G. M. M.& AKISUE, G. Estudo morfo-histológico, screening fitoquímico, constantes físicas e análise cromatográfica da droga e extrato fluido visando controle de qualidade da espécie Baccharis articulata Pers. Lecta. v. 18, n. 2, p. 9-32, 2000. OLIVEIRA, A.M.A., SANTOS, V.L.P., FRANCO, C.R.C., FARAGO, P.V., DUARTE, M.R. & BUDEL, J.M.Comparativemorpho-anatomical study of Baccharis curitybensisHeeringexMalme and Baccharis spicata(Lam.) Baill.Latin American Journal ofPharmacy.Vol. 30, n.8, p. 1560-1566, 2011. PEREIRA,C. B., FARAGO, P. V., BUDEL, J. M., DE PAULA, J. P., FOLQUITTO, D. G., MIGUEL, O. G. & MIGUEL, M. D.A.New Contribution to the Pharmacognostic Study of Carquejas: Baccharis milleflora DC., Asteraceae. Latin American Journal ofPharmacy. v. 33, n.5, p.841-7, 2014. PEREZ, C. & ANESINI, C. Screening of plants used in Argentine folk medicine for antimicrobial activity.Journal of ethnopharmacoly. v. 39, n.2, p. 119-128, 1993. PEREZ, C. & ANESINI, C. Inhibition of pseudomonas aeruginosa by argentinean medicinal plants.Fitoterapia. Vol. 65, n. 2, p. 169-172, 1994. RODRIGUEZ, M. V.; GATTUSO, S. & GATTUSO, M.Baccharis crispa y Baccharistrimera(Asteraceae): revisión y nuevos aportes para sunormalizaciónmicrográfica.Latin American Journal of Pharmacy.Vol. 27, n. 3, 387-397, 2008. SASS, J. E. Botanical microtechnique. 2 ed. Ames: Iowa State College, 1951. SOUZA, C. A., FARAGO, P.V., DUARTE, M.R. & BUDEL, J.M. Pharmacobotanical study of Baccharis singularis (Vell.) G.M. Barroso, Asteraceae.Latin American Journal of Pharmacy.Vol.30, p. 311-7, 2011. SOUZA, J. P.; FRANCO, C. R. C.; SANTOS, V. L. P.; BORTOLOZO, E. A. F. Q.; FARAGO, P. V.; MATZENBACHER, N. I. & BUDEL, J. M. Baccharis rufescens Spreng. var.tenuifolia (DC.) Baker: contribuição ao estudo farmacognóstico. Revista Brasileira de Plantas Medicinais. v. 15, p. 566-574, 2013.

TRABALHO 20

Investigação anatômica e microquímica de caule e folha de Sambucus australis Cham & Schltdl

Thamires Aparecida Dzirba1 (IC) E-mail: thami_dzirba@hotmail.com

Daniela Gaspardo Folquitto 2 (PG) E-mail: danielafolquitto@gmail.com Jane Manfron Budel 3 (PQ) E-mail: janemanfron@hotmail.com

1 Aluna de iniciação científica do Curso de Farmácia da Universidade Estadual de Ponta Grossa; 2 Mestranda do Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal do Paraná. 3 Professora do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual de Ponta Grossa responsável pela orientação do trabalho. Resumo: Sambucus australis Cham & Schltdl pertencente à família Caprifoliaceae e é conhecida popularmente no Brasil como sabugueiro-do-rio-grande e sabugueiro-do-brasil. É nativa no Brasil, ocorrendo nas Regiões Nordeste e Sudeste até o Rio Grande do Sul. As flores, cascas e folhas são utilizadas na medicina tradicional sob a forma de infusão ou decocção para o tratamento de reumatismos, inflamações e queimaduras. Objetivou-se analisar a anatomia e a microquímica das partes vegetativas aéreas de Sambucus australis, a fim de fornecer características farmacobotânicas para a identificação da espécie medicinal, bem como para a diferenciação de outras espécies do gênero. O material botânico foi submetido às microtécnicas fotônicas e eletrônicas de varredura usuais. Dentre as características observadas, destacam-se: tricoma tector cônico unicelular, tricoma glandular capitado com cabeça multicelular, estômato anomocítico, folha hipoestomática, mesofilo dorsiventral, forma ovalada da nervura central com feixe vascular colateral único, pecíolo bicôncavo-convexo com 5 feixes vasculares dispostos em U e caule circular com costelas, que analisadas em conjunto auxiliam na identificação da espécie medicinal e diferenciação das demais Sambucus. Palavras-chave: Anatomia, Caprifoliaceae, controle da qualidade, microquímica, sabugueiro. 1. Introdução Caprifoliaceae compreende 18 gêneros e 450 espécies distribuídas principalmente nas regiões temperadas do Hemisfério Norte e com uma menor distribuição no Hemisfério Sul (HEYWOOD, 1993). Entre os importantes gêneros dessa família, encontra-se Sambucus, que apresenta 25 espécies, destacando-se Sambucus canadenses L., Sambucus ebulus L., Sambucus nigra L. e Sambucus australis Cham. & Schltdl. (REITZ, 1985; TÔRRES et al., 2005; AGRA et al., 2007). O único gênero com espécies nativas na América do Sul é Sambucus, com duas espécies: Sambucus peruviana Kunth e S. australis (BACIGALUPO, 1974; DIMITRI, 1980; REITZ, 1985). Autores recentes sugerem que o gênero Sambucus seja realocado para a família Sambucaceae (TAKHTAJAN, 1997), ou para Adoxaceae (JUDD et al., 1999), enquanto outros ampliam a circunscrição de Caprifoliaceae (APG II, 2003). Sambucus australis, conhecida popularmente no Brasil como sabugueiro-do-rio-grande e sabugueiro-do-brasil, é uma espécie medicinal que consta apenas da primeira edição da Farmacopeia Brasileira (SILVA, 1929). É nativa no Brasil, ocorrendo nas Regiões Nordeste e Sudeste até o Rio Grande do Sul (TORRES et al., 2005; AGRA et al., 2007). Sendo uma planta medicinal que consta apenas da primeira edição da Farmacopéia Brasileira (SILVA, 1929; BRANDÃO et al., 2006). As flores, as cascas e as folhas são utilizadas na medicina tradicional sob a forma de infusão ou decocção para o tratamento de reumatismos, inflamações e queimaduras. Atividades farmacológicas de extratos ou de substâncias isoladas têm sido investigadas, sendo relatadas as atividades diurética, antipirética, anti-inflamatória e laxativa (REITZ, 1985; LORENZI & MATOS, 2002).

2. Objetivos Considerando que somente a Farmacopeia brasileira I apresenta a monografia da flor de S. australis, objetivou-se investigar anatomicamente e microquimicamente a folha e o caule dessa espécie, a fim de fornecer características farmacobotânicas para identificação da espécie medicinal, bem como diferenciá-la de outras espécies de Sambucus. 3. Materiais e Métodos Foram coletadas partes aéreas floridas de 5 exemplares de Sambucus australis Cham & Schltdl., no Horto Medicinal de Plantas Medicinais do Curso de Farmácia da UEPG (Campus Uvaranas, Av. General Carlos Cavalcanti, 4748; CEP 84030-900; GPS: 25°5'23"S 50°6'23"W). Os exemplares foram submetidos à confecção de exsicatas, identificadas por especialista e os representantes equivalentes estão registrados no Herbário do Museu Botânico de Curitiba sob o número 21145. O material coletado foi devidamente processado para a realização do estudo anatômico. 3.1 Estudo anatômico As pesquisas referentes aos caracteres farmacobotânicos foram efetuadas com folhas e caules de Sambucus australis, a partir de 10 cm do ápice da planta. O material vegetal foi fixado em FAA 70 (formol 5%, ácido acético 5% e etanol 70ºGL 90% v/v) (JOHANSEN, 1940), e estocados em solução de etanol a 70% (v/v) (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Foram preparadas lâminas semipermanentes com o material seccionado nos sentidos transversal e longitudinal, à mão livre, submetido à coloração de azul de astra e fucsina básica (ROESER, 1972) ou de azul de toluidina (O'BRIEN, FEDER, MCCULLY, 1964). As lâminas foram montadas com glicerina diluída a 50% (v/v) (BERLYN, MIKSCHE, 1976) e para a lutagem foi utilizado esmalte incolor. 3.2 Testes microquímicos Foram realizadas secções transversais à mão livre de folhas e caules de Sambucus australis e os reativos empregados foram solução de floroglucina clorídrica para verificação de lignina (FOSTER, 1949), Sudam III para substâncias lipofílicas (SASS, 1951), cloreto férrico para compostos fenólicos (JOHANSEN, 1940), ácido sulfúrico para a verificação da natureza dos cristais (OLIVEIRA, AKISUE, 1997) e lugol para amido (BERLYN & MIKSCHE, 1976). Os resultados dos testes microquímicos e da análise anatômica foram registrados por meio de fotomicrografias em microscópio fotônico Olympus CX31, acoplado à câmera digital Olympus model C-7070, no Laboratório de Farmacognosia da Universidade Estadual de Ponta Grossa. 3.3 Microscopia eletrônica de varredura – MEV A caracterização morfológica das superfícies caulinares e foliares de Sambucus australis foi realizada com análise ao microscópio eletrônico de varredura. Para tal procedimento, as amostras foram fixadas em FAA 70 e desidratadas em série etanólica crescente. As eletromicrografias foram realizadas em alto vácuo e visualizadas no microscópio eletrônico de varredura VEGA3 TESCAN (SOUZA, 1998). Para realização do ponto crítico e microscopia eletrônica de varredura, o material foi analisado no C-LABMU/PROPESP, na Universidade Estadual de Ponta Grossa. 4. Resultados e Discussão Anatomicamente, o folíolo de S. australis em vista frontal mostra as paredes anticlinais das células epidérmicas levemente ondeadas na face adaxial e sinuosas na face abaxial. Estômatos anomocíticos são encontrados somente na face abaxial, caracterizando a folha como hipoestomática. Em secção transversal, a epiderme é uniestratificada coberta por cutícula ligeiramente espessa e estriada e os estômatos estão situados no mesmo nível das demais células epidérmicas. As células da camada epidérmica adaxial são maiores que as células da camada abaxial. Essas características também forma relatadas por Jorge et al. (1999) para a lâmina foliar de S. australis. São observados dois tipos de tricomas, um tricoma tector cônico unicelular de parede espessada e um tricoma glandular capitado com pedicelo formado por cerca de 4 células e cabeça

multicelular. Esses tricomas são frequentes na nervura central e na face adaxial do pecíolo. Divergindo dessa constatação, Jorge et al. (1999) descreveu o tricoma glandular dessa espécie como tendo cabeça septada. A organização dos parênquimas fotossintetizanparênquima paliçádico e cerca de 7 camadas de parênquima esponjoso. Feixes vasculares de pequeno porte, envoltos por bainha parenquimática, são observados na região mediana do mesofilo. A nervura central tem formaproximadamente 3 camadas de colênquima angular. O sistema vascular é representado por um único feixe vascular do tipo colateral. No parênquima fundamental são observadas células contendo compostos fenólicos, areia cristalina e grãos de amido.O pecíolo, em secção transversal, tem formato bicôncavoencontradas cerca de 3 camadas de colênquima angular. O sistema vascular é representado por 5 feixes colaterais livres organizados em U, sendo o central mais desenvolvido. No parênquima fundamental, próximas aos feixes, são frequentes células contendo compostos fenólicos, células com areia cristalina e células contendo grãos de amido.O caule, seccionado transversalmente, apresentavaléculas. Subjacentemente ao sistema de revestimento são observadas várias camadas de colênquima angular e de parênquima cortical. Limitando internamente o córtex, uma endoderme amilífera está presente. O sistema vascular é típico e, aposto ao floema, podem ser observadas calotas de fibras esclerenquimáticas. A medula apresenta células isodiamétricas e de paredes finas, sendo também encontradas células com conteúdo fenólico. A caracterização farmacobotânica de plantas medicinais é fundamental para a identificação de espécies medicinais e está entre as análises mais acessíveis. Os dados anatômicos e microquímicos obtidos podem ser utilizados para detectar adulterações e contaminações acidentais ou intencionais, contribuindo para o controle da qualidade da matéria

Fig. 1 Secção transversal do caule. Fig. 2. Grãos de amido presentes no córtex.

Fig. 4. Secção transversal do pecíolo. Fig. 5.

icelular. Esses tricomas são frequentes na nervura central e na face adaxial do pecíolo. Divergindo dessa constatação, Jorge et al. (1999) descreveu o tricoma glandular dessa espécie

A organização dos parênquimas fotossintetizantes é dorsiventral, ocorrendo uma camada de parênquima paliçádico e cerca de 7 camadas de parênquima esponjoso. Feixes vasculares de pequeno porte, envoltos por bainha parenquimática, são observados na região mediana do mesofilo. A nervura central tem formato ovalado e adjacente à epiderme são observados aproximadamente 3 camadas de colênquima angular. O sistema vascular é representado por um único feixe vascular do tipo colateral. No parênquima fundamental são observadas células

s, areia cristalina e grãos de amido. O pecíolo, em secção transversal, tem formato bicôncavo-convexo. Adjacente à epiderme são encontradas cerca de 3 camadas de colênquima angular. O sistema vascular é representado por

os em U, sendo o central mais desenvolvido. No parênquima fundamental, próximas aos feixes, são frequentes células contendo compostos fenólicos, células com areia cristalina e células contendo grãos de amido. O caule, seccionado transversalmente, apresenta formato circular, evidenciando várias arestas e valéculas. Subjacentemente ao sistema de revestimento são observadas várias camadas de colênquima angular e de parênquima cortical. Limitando internamente o córtex, uma endoderme

istema vascular é típico e, aposto ao floema, podem ser observadas calotas de fibras esclerenquimáticas. A medula apresenta células isodiamétricas e de paredes finas, sendo também encontradas células com conteúdo fenólico.

de plantas medicinais é fundamental para a identificação de espécies medicinais e está entre as análises mais acessíveis. Os dados anatômicos e microquímicos obtidos podem ser utilizados para detectar adulterações e contaminações

s, contribuindo para o controle da qualidade da matéria

Fig. 1 Secção transversal do caule. Fig. 2. Grãos de amido presentes no córtex.

Fig. 4. Secção transversal do pecíolo. Fig. 5. Secção transversal da nervura central.

icelular. Esses tricomas são frequentes na nervura central e na face adaxial do pecíolo. Divergindo dessa constatação, Jorge et al. (1999) descreveu o tricoma glandular dessa espécie

tes é dorsiventral, ocorrendo uma camada de parênquima paliçádico e cerca de 7 camadas de parênquima esponjoso. Feixes vasculares de pequeno porte, envoltos por bainha parenquimática, são observados na região mediana do

ato ovalado e adjacente à epiderme são observados aproximadamente 3 camadas de colênquima angular. O sistema vascular é representado por um único feixe vascular do tipo colateral. No parênquima fundamental são observadas células

convexo. Adjacente à epiderme são encontradas cerca de 3 camadas de colênquima angular. O sistema vascular é representado por

os em U, sendo o central mais desenvolvido. No parênquima fundamental, próximas aos feixes, são frequentes células contendo compostos fenólicos, células

formato circular, evidenciando várias arestas e valéculas. Subjacentemente ao sistema de revestimento são observadas várias camadas de colênquima angular e de parênquima cortical. Limitando internamente o córtex, uma endoderme

istema vascular é típico e, aposto ao floema, podem ser observadas calotas de fibras esclerenquimáticas. A medula apresenta células isodiamétricas e de paredes

de plantas medicinais é fundamental para a identificação de espécies medicinais e está entre as análises mais acessíveis. Os dados anatômicos e microquímicos obtidos podem ser utilizados para detectar adulterações e contaminações

s, contribuindo para o controle da qualidade da matéria-prima vegetal.

Fig. 1 Secção transversal do caule. Fig. 2. Grãos de amido presentes no córtex.

Secção transversal da nervura central.

5. Conclusão As características farmacobotânicas observadas, a exemplo de tricoma tector cônico unicelular, tricoma glandular capitado com cabeça multicelular, estômato anomocítico, folha hipoestomática, mesofilo dorsiventral, forma ovalada da nervura central com feixe vascular colateral único, pecíolo bicôncavo-convexo com 5 feixes vasculares colaterais dispostos em U e caule circular; e as microquímicas, como presença de compostos fenólicos, de areia cristalina, de amido na nervura central, pecíolo e caule, quando analisadas em conjunto auxiliam na identificação da espécie medicinal e na diferenciação das demais Sambucus. Referências AGRA MF, FRANÇA PF, BARBOSA-FILHO JM. Synopsis of the plants known as medicinal and poisonous in Northeast of Brazil. Rev Bras Farmacogn 17: p.114-140, 2007. APG II 2003. The Angiosperm Phylogeny Group. An Update of the angiosperm phylogeny group classification for the orders and families of flowering plants: APG II. Bot J Linn Soc 441: 399-436. BACIGALUPO NM. Caprifoliaceae. In: Burkart, A Flora Ilustrada de Entre Rios (Argentina). Buenos Aires: INTA, v.6, pt.6, p.50-52, 1974. BERLYN, G.P.; MIKSCHE, J.P. Botanical microtechnique and cytochemistry. Ames: Iowa State University, v. 276, p. 121, 1976. DIMITRI MJ. Enciclopedia Argentina de Agricultura y Jardineria. 3.ed. Buenos Aires: ACME v.2, 1980. FOSTER AS 1949. Practical plant anatomy. 2. ed. Princeton: D. Van Nostrand, p. 218. HEYWOOD VH. Flowering Plants of the World. Nova Iorque: Oxford University Press, 1993. JOHANSEN, D.A. Plant microtechnique. New York: McGraw: Hill Book, p. 41, 193, 1940. JORGE LIF, GRACIANO RAS, PRADO SPT, PEREIRA U. Identificação histológica de Sambucus australis Cham. & Schlecht. (sabugueiro). Revista de Ciências Farmacêuticas, 20: p.117-123,1999. JUDD WS, CAMPBELL CS, KELLOG EA, STEVENS PF. Plant Systematics: a Phylogenetic Approach. Massachusetts: Sinauer Associates, 1999. LORENZI H, MATOS FJA. Plantas Medicinais no Brasil: Nativas e Exóticas. Nova Odessa: Plantarum, 2002. O'BRIEN, T.P., FEDER, N., MCCULLY, M.E. Polychromatic staining of plant cell walls by toluidine blue O. Protoplasma, v.59, p. 368-373, 1964. OLIVEIRA, F.; AKISUE, G. Fundamentos de farmacobotânica. 2 ed. São Paulo: Atheneu, p.216, 1997. REITZ R. Caprifoliáceas. In: Flora Ilustrada Catarinense. Itajaí. Fasc. CAPR, 1985. ROESER, K.R. Die Nadel der Schwarzkiefer-Massenprodukt und Kunstwerk der Natur. Mikrokosmos, v. 61, p. 33-36, 1972. SILVA RAD. Pharmacopeia dos Estados Unidos do Brasil. 1.ed. São Paulo: Nacional, 1929. SOUZA, W. Técnicas básicas de microscopia eletrônica aplicadas às Ciências Biológicas. Rio de Janeiro: Sociedade Brasileira de Microscopia Eletrônica, p. 1-44, 1998. TAKHTAJAN AL. Diversity and Classification of Flowering Plants. Nova Iorque: Columbia University Press, 1997. TÔRRES AR, OLIVEIRA RAG, DINIZ MFFM, ARAÚJO EC. Estudo sobre o uso de plantas medicinais em crianças hospitalizadas da cidade de João Pessoa: riscos e benefícios. Rev. Bras Farmacogn 15: p. 373-380, 2005.

TRABALHO 21

Pesquisa Fitoquímica de Neolignanas da Espécie Medicinal Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum (PIPERACEAE) e Mortalidade de

larvas de Plutella xylostella

Talita Correa (G) E-mail prof.talitacorrea@gmail.com Marina Delgobo (G) E-mail: marina_delgobo@hotmail.com

Vanessa Lima Gonçalves Torres (PQ) E mail vlgtorres@uepg.br Adalci Torres (PQ) E mal: adalcitorres@gmail.com

Rosi Zanoni da Silva (PQ) E mail:rosizanoni@bol.com.br

G – aluno de graduação; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: Brassica oleracea var. acephala cultivar Manteiga é um dos alimentos importantes na nutrição humana, sendo rica em minerais e vitaminas. Sua cultura é danificada por diversas pragas em especial pela traça-das crucíferas (Plutella xylostella). O controle desta praga é feito geralmente com inseticidas. A aplicação de extratos de plantas no controle de pragas é uma alternativa atrativa por apresentar diminuicao na contaminacao residual. Este trabalho teve como objetivo a pesquisa fitoquimica de neolignanas e a avaliação biológica do extrato etanólico e frações das folhas de Piper solmsianum C.DC. variedade solmsianum conhecida popularmente como Pariparoba.O extrato bruto assim como as frações foram analisadas por cromatografia em camada delgada (CCD) usando padrão de neolignanas. O extrato etanólico obtido por maceração e as frações hexânica, diclorometano, acetato de etila a 5% foram utilizadas para avaliação na mortalidade de larvas de Plutella xylostella. Discos foliares de couve foram pulverizados com as soluções até preenchimento total das folhas e oferecidos sem chance de escolha a larvas de 1º. Instar de P. xylostella. As CCDs do extrato bruto e da fração hexânica quando reveladas com anisaldeído revelaram manchas características de neolignanas. As CCDs das frações diclorometano, acetato de etila e etanol reveladas com KOH a 5% em metanol e irradiação com luz UV apresentaram fluorescências características de cumarina. A placa da fração etanólica revelada com cloreto férrico a 3% apresentou mancha sugestiva de flavonoides. Na avaliação da mortalidade o extrato bruto, a fração hexânica e fração diclorometano apreentaram 100% de mortalidade das larvas de P. xylostella. A espécie Piper solmsianum C.DC. variedade solmsianum apresenta potencial como controle da praga em estudo. Palavras-chave: Pariparoba, Plutella xylostella, mortalidade, neolignanas. 1. Introdução As florestas tropicais são consideradas frequentemente como o mais promissor habitat para a descoberta de novos medicamentos devido à alta biodiversidade e o endemismo. Estima-se que existam cerca de 250 mil espécies de plantas superiores no globo terrestre e que mais da metade destas está concentrada nestas florestas (BRESSOLIN & CECHINEL FILHO, 2003; DAVID & NASCIMENTO & DAVID, 2004). Diante desta realidade, nos deparamos com o interesse cada vez maior da indústria farmacêutica mundial pelo potencial medicamentoso das florestas tropicais brasileiras. Visto sermos detentores de uma exuberante flora, riquíssima em espécies vegetais, as quais são constituídas por moléculas bioativas (PINTO, 2002). Neste contexto, produtos naturais de origem vegetal constituem uma estratégia para a inovação farmacêutica e competitividade do setor, tendo em vista a singularidade estrutural dessas substâncias e patenteabilidade (CALIXTO,2000). Entre a diversidade de espécies medicinais presentes na flora brasileira empregadas pela população em virtude das suas propriedades terapêuticas, destacamos a Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum conhecida popularmente por pariparoba ou caapeba. O gênero Piper é constituído por aproximadamente 700 espécies, as quais encontram-se

distribuídas em regiões tropicais e subtropicais, onde a população nativa tem usado algumas destas plantas como condimento, agentes no controle de pestes e no tratamento de muitas doenças. Estas espécies vegetais apresentam elevados valores comerciais, econômicos e grande importância medicinal (SILVA, 2010). Uma revisão sobre metabólitos secundários de espécies do gênero Piper relatou a presença das seguintes classes de compostos bioativos: alcalóides, amidas, chalconas, diidrochalconas, flavonas, flavanonas, terpenos, esteróides, kavapironas, fenilpropanóides, lignanas e neoliganas

(PAMAR, 1997; SILVA, 2010). MOREIRA et al.(1995) submeteu a investigação fitoquímica os caules e folhas da espécie vegetal Piper solmsianum C.DC. que foram coletados no município de Teresópolis-RJ. No presente trabalho, foi possível isolar e identificar no extrato hexânico das folhas, a neolignana Eupomatenóide-6. A espécie medicinal Piper solmsianum C. DC., foi novamente estudada no aspecto químico por MARTINS, et al. (2000) e nesta investigação fitoquímica, isolaram do extrato acetato de etila das folhas e dos caules coletados no mês de junho na cidade de São Paulo/SP, cinco fenilpropanóides, bem como, a tetrahidrofurano lignana tetrahidrofurânica denominada de (-)-Grandisina e (7R,8R,7’S,8’R)-3’,4’-metilenodioxi-3,4,5,5’- tetrametoxi-7,7’- epoxilignana (MARTINS, et al.,2000; MARTINS, et al.,2003). Recentemente, a Piper solmsianum C.DC. variedade solmsianum investigada fotoquimicamente por SILVA (2006) o qual envolveu processo de extração, isolamento, purificação e identificação dos constituintes químicos das folhas de outono da Piper solmsianum. Da fração hexânica foram isoladas três neolignanas benzofurânicas denominadas de euponatenóide-3, eupomatenóide-5 e conocarpano. Da fração diclorometano foi isolado o conocarpano. Na fração acetato de etila foram detectados as flavonas 7-metoxi-apigenina (genkwanina) e a orientina e duas flavanonas hesperidina e luteolina-7-rutinosídeo. Todos estes compostos foram identificados por análises de espectroscopia no IV, de RMN 1H, de RMN 13C e por comparação com os dados existentes na literatura. As lignanas e neolignanas têm atraído o interesse dos pesquisadores nestes anos devido a sua larga distribuição na natureza, pois parecem exercer um papel importante na defesa das plantas, atuando como agentes antimicrobianos, antifúngicos e inseticidas. Esta classe de compostos também tem despertado grande interesse biológico em virtude de suas propriedades terapêuticas, como: antitumoral, antiviral, antihipertensiva, sedativa, antibacteriana, inibidora do crescimento de plantas, antifúngica, antiinflamatória, citotóxica, anti-PAF (fator de agregação plaquetária) e anti –LTB4 (mediador químico da inflamação, leucotrieno) (OLIVEIRA, 2003). A traça- das-crucíferas, Plutella xylostella (Linnaeus,1758) (Lepidoptera: Plutellidae) é considerada a praga mais danosa aos cultivos de brássicas, nas diversas regiões do mundo. No Brasil foi feito o primeiro registro de ataque desta praga no estado da Bahia, por volta de 1927, época em que inviabilizou o cultivo de brássicas em algumas regiões do estado (BARROS, 1998). O seu alto potencial reprodutivo somado ao grande número de espécies hospedeiras resulta em um elevado número de gerações ao longo do ano, nas regiões produtoras de hortaliças. Especula-se que a P. xylostella, tenha origem na região do Mediterrâneo, pois muitas espécies de brássicas possuem origem nessa região. O adulto da P. xylostella é um microlepidóptero que mede cerca 10 mm de comprimento, apresentando coloração parda. As fêmeas da P. xylostella ovipositam após a realização da cópula, ovipositam preferenciamente na face dorsal das folhas e os ovos são de coloração alaranjados; as lagartas de primeiro instar possuem coloração verde clara, destacando-se pelo hábito minador e nos estágios posteriores, hábito desfolhador, provocando maiores danos (BARROS, 1998). Para minimizar os prejuízos causados pela traça-das-crucíferas em brássicas a grande maioria dos produtores opta apenas pelo uso de inseticidas sintéticos, na tentativa de manter a população da praga, abaixo do nível de dano econômico. Somado ao grande número de pulverizações e as práticas manejo incorretas, como plantios sucessivos de uma mesma espécie e a não eliminação dos restos culturais, tem contribuído para o aumento dos danos causado pela traça-das-crucíferas, além de afetar os inimigos naturais e contribuir para o aparecimento de populações resistentes (TORRES et al, 2006). Diante deste cenário, a busca de alternativas, como emprego de produtos naturais extraídos de

diferentes espécies de plantas, poderá contribuir de forma relevante no manejo da P. xylostella. O uso de planta inseticida no manejo de pragas, como as da família, Rutaceae, Asteraceae e Meliaceae, tem dado resultados significantes, devido à baixa toxicidade ao ser humano e a eficiência na redução de população de insetos pragas. Dessa forma, estudos com diferentes espécies botânicas, que apresentem substancias bioativas danosas a P. xylostella, podem contribuir para o manejo integrado desta praga (TORRES, 2004). 2. Objetivos A utilização de plantas em diversas áreas da saúde é muito comum. Deseja-se com este trabalho isolar compostos bioativos que possam ser utilizados como controle de pragas em substituição a inseticidas como forma de controle a agressão ao meio ambiente. a) Coletar e dessecar as folhas de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum; b) Preparar extratos etanólicos das folhas de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum por maceração; c) Fracionar os extratos etanólicos de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum por partição líquido/líquido com extrações sucessivas utilizando solventes de polaridades crescentes; d) Caracterizar as moléculas bioativas isoladas nas frações hexânica e diclorometano por cromatografia em camada delgada (CCD) comparativa utilizando padrões autênticos de neolignanas e) Avaliar o potencial do extrato e frações de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum no indice de mortalidade de larvas de Plutella xylostella. 3. Materiais e Métodos 3.1 Material Vegetal 3.1.1 Coleta, Identificação e Preparação do Extrato Etanólico As folhas de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum foram coletadas no bairro Vila Estrela, Ponta Grossa/Paraná, no mês de março de 2015. A identificação ocorreu no Museu botânico do Rio de Janeiro pela botânica sistemática Drª. Elsie Franklin Guimarães. Uma exsicata está depositada sob o número RB 368597. O extrato com as folhas secas e fragmentadas foi preparado por maceração usando etanol como agente extrator e foi mantido fechado ao abrigo de luz por uma semana. Após este período o extrato foi filtrado e concentrado em rotaevaporador a pressão reduzida e banho-maria com temperatura controlada a 45 ºC até a completa eliminação do solvente. 3.1.2 Partição Líquido/líquido Para a obtenção das frações hexânica, diclorometano e acetato de ertila, o extrato etanólico bruto das folhas foi submetido a extrações sucessivas com os solventes hexano, diclorometano, acetato de etila e etanol, em funil de separação. Na fração hexânica precipitou um sólido em meio a uma impureza de coloração verde escura. A impureza apresentou-se solúvel em hexano: diclorometano (1:1mL) e o sólido em diclorometano. Na fração diclorometano houve também presença de precipitado e ambos foram separados por filtração. Estas frações foram analisadas por CCD em placas DC-Fertigfolien ALUGRAM® SIL G, MARCHEREY-NAGEL®. 3.2 Métodos Cromatográficos Marcha sistemática analítica por Cromatografia em camada delgada (CCD) - a fração hexânica, diclorometano e acetato de etila foram submetidas ao procedimento analítico por CCD comparativa para se detectar a presença de neolignanas, usando como padrão Conocarpano, eupomatenoide-3, eupomatenoide -5, por meio revelação em câmara com luz ultravioleta nos comprimentos de onda 254 e 366 nm e reveladores químicos específicos, como: a)Lignanas e neolignanas – anisaldeído sulfúrico e aquecimento a 100oC. Observado o desenvolvimento de manchas azuladas para lignanas e neolignanas; b)Cumarinas – KOH 5% em metanol - observado o aparecimento de fluorescência em luz UV (366nm); c)Polifenóis – Cloreto férrico 3% - observado aparecimento de mancha marron escura.

3.3 Criação dos Insetos O experimento foi realizado no Laboratório de Entomologia Aplicada da Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG) em Ponta Grossa-PR, em sala climatizada sob condições controladas de temperatura (25 ± 2°C) e umidade 66 ± 10% e foto fase de 14 horas. Para o estabelecimento da criação, foram coletados insetos em lavouras de brássicas no município de Ponta Grossa-PR. Lagartas de primeiro instar foram colocadas em recipientes plásticos retangulares (15 x 10 x 5 cm), sendo alimentados com folhas de couve manteiga da Geórgia (Brassica oleracea L. var. acephala) adquiridas em plantações com sistema de produção orgânico no município de Ponta Grossa, previamente sanitizadas. As folhas de couve foram substituídas diariamente, até que as lagartas atingissem a fase pupal, em seguida as pupas foram transferidas para células de placas de Elisa, permanecendo fechadas com filme plástico. Após a emergência, os adultos foram transferidos para gaiolas de plásticos transparentes, no interior de cada gaiola foram colocados discos de folha de couve, medindo 8 cm de diâmetro sobre papel filtro, umedecidos com água deionizada, para que ocorresse a postura das fêmeas. No interior da gaiola foi adicionado um pequeno algodão embebido com solução a 10% de diluição à base de mel para alimentação dos adultos. Os discos de couve foram trocados a cada 24h, sendo em seguida colocados em placas de Petri, até a eclosão das lagartas. 3.4 Bioensaio Para montagem do bioensaio foram preparadas soluções etanólicas na concentracao 5% (p/v) do extrato bruto seco e das frações hexânica, diclorometano e acetato de etila das folhas de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum. Após a obtenção das soluções, foram cortados discos de couve medindo 8 cm de diâmetro e pulverizados com cada solução até o total preenchimento da folha. Os discos de couve usados como testemunha foram pulverizados com água deionizada, alcool, hexano, diclorometano e acetato de etila. Em seguida os discos foram colocados na câmara de fluxo de ar por 20 minutos, para perda do excesso dos solventes. Em seguida, foram colocadas em cada placa de Petri, 10 larvas de 1º. instar em esquema inteiramente casualizado com oito tratamentos e 4 repetições. As placas foram mantidas no laboratório em condições controlada de temperatura e umidade, sendo as folhas substituídas diariamente por outras sem tretamento. Nesta troca de folhas foi anotado o numero de larvas mortas.Tal procedimento foi realizado até que as larvas atingissem o estágio de pupa. 3.5 Análise Estatistica Os resultados obtidos da deterrência e da mortalidade de larvas foram submetidos a análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa ESTAT. 4. Resultados e Discussão O extrato bruto seco, bem como suas frações, foi submetido ao procedimento analítico por CCD comparativa usando padrões das neolignanas conocarpano, eupomatenóide-3 e eupomatenóide-5 e revelação com anisaldeído sulfúrico seguida de aquecimento a 100ºC em estufa revelando manchas caracteristicas de neolignanas. As CCDs das frações diclorometano, acetato de etila e etanol reveladas com KOH a 5% em metanol e irradiação com luz UV (366 nm) apresentaram fluorescências características de cumarina. A placa da fração etanólica revelada com cloreto férrico a 3% apresentou mancha sugestiva de flavonoides. Estes resultados estão de acordo com SILVA (2006), que realizou a identificação e caracterização das neolignanas de Piper solmsianum C.DC. var.solmsianum. Em relação a mortalidade larval (Tabela 1), as larvas que se alimentaram de folhas de couve tratadas com o extrato bruto , fração diclorometano, fração hexano apresentaram alto indice de

mortalidade com poucas larvas atingindo a fase de pupa. O extrato bruto e a fração diclorometano apresentaram 100 % na mortalidade larval podendo ser associado a presença das neolignanas. Tabela 1. Porcentagem média de mortalidade larval de Plutella xylostella em discos de couve tratados com extrato de folha de Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum à concentração de 5% (peso/volume). T (ºC) = 25 ± 2; UR (%) = 66 ± 10; fotofase = 14 horas. Ponta Grossa (PR). TRATAMENTO MÉDIA DE MORTALIDADE LARVAL(%) EXTRATO BRUTO 100,00 a FRAÇÃO DICLOROMETANO 100,00 a FRAÇÃO HEXANO 95,00 a HEXANO 47,50 b FRAÇÃO ACETATO 35,00 bc ACETATO 27,50 cd ALCOOL 22,50 cd ÁGUA 20,00 cd DICLOROMETANO 15,00 d C.V (%) 14,62

5. Conclusão Pela realização das CCDs comparativas foi possível identificar tanto no extrato da folha como no do caule. Foi observada influência dos extratos no comportamento de P. xylostella tanto na ovoposição como na alimentação da praga. Conclui-se que as partes aéreas da T. diversifolia possuem propriedades fitoquimicas com potencial para emprego no manejo de P. xylostella. Referências BARROS, R. Efeito de cultivares de repolho Brassica oleracea var. capitata (L.) nabiologia da traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (L., 1758) e do parasitoide Trichogramma pretiosum Riley, 1879. 1998. 98 f. Tese (Doutorado em CiênciasBiológicas) - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de SãoPaulo, Piracicaba, 1998. BRESOLIN,T.M.B. & CECHINEL-FILHO, V. Ciências Farmacêuticas: Contribuição ao Desenvolvimento de Novos Fármacos e Medicamentos. Editora da UNIVALI, 1a ed. p. 239, 2003. CALIXTO, J.B. Efficacy, Quality, Control, Marketing and Regulatory Guidelines for Herbal Medicines (Phytotherapeutics Agents). Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.33, n.2, p.179 – 189, 2000. DAVID, J.P.L.; NASCIMENTO, J.A.P.; DAVID, J.M. Produtos Fitoterápicos: Uma Expectativa de Negócio para a Indústria, um Campo Pouco Explorado Pelos Farmacêuticos. Infarma. Vol.6, n.9-10, p.71 – 80, 2004. MARTINS, R.C.C. et al. Phenylpropanoids and Tetrahydrofuran Lignans from Piper solmsianum. Phytochemistry, Vol.55, p. 843-846, 2000. MARTINS, R.C.C.; LAGO, J.H.G.; ALBUQUERQUE, S.; KATO, M.J. Trypanocidal Tetrahydrofuran Lignans from Inflorescences of Piper solmsianum. Phytochemistry, Vol.64, p. 667 – 670, 2003. MOREIRA, D.L.; KAPLAN, M.A.C.; GUIMARÃES, E.F. Constituintes Químicos de Piper solmsianum C.DC.(PIPERACEAE). Revista Brasileira de Farmácia, Vol.76, n.4, p.106 – 109, 1995. OLIVEIRA, A.B.; BRAGA, F. C. Produtos Naturais Bioativos de Plantas Brasileiras e sua Contribuição para o Desenvolvimento da Química Medicinal. Arquivos Brasileiros de Fitomedicina Científica, Vol.1, p. 49-58, 2003. PARMAR, V.S. et al. Phytochemistry of the Genus Piper. Phytochemistry, Vol.46, n. 4, p. 597-673, 1997. PINTO, A. C. et al. Produtos Naturais: Atualidade, Desafios e Perspectivas. Química Nova, Vol.25, n.1, p. 45-61, 2002. SILVA, R.Z. Estudo fitoquímico e biológico da Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum ( PIPERACEAE ). Florianópolis, 2006,250p. Tese de Doutorado em Química – Programa de Pós-graduação em Química, Universidade Federal de Santa Catarina. SILVA, R. Z. et al. Antinociceptive properties of conocarpan and orientin obtained from Piper solmsianum C.DC. var. solmsianum (PIPERACEAE). Journal of Natural Medicines, Vol. 64, n.4, p. 402-408, 2010. TORRES, A. L. et al.Efeito de extratos aquosos de Azadirachta indica, Melia azedarach e Aspidosperma pyrifolium no desenvolvimento e oviposição de Plutella xylostella. Bragantia. Vol. 65, p.447-457, 2006. TORRES, A.L. Efeitos de cultivares de repolho e extratos vegetais na biologia de Plutella xylostella (L.) e no parasitóide Oomyzus sokolowskii (Kurdjumov). 2004. Tese (Doutorado)–Faculdade de Ciências Agrárias eVeterinárias, Universidade Estadual Paulista, Jaboticabal,

TRABALHO 22 Pesquisa Fitoquímica da EspécieTithonia diversifolia (HEMSL.) A. GRAY,

ASTERACEAE e EFEITO COMO PROMOTORES DE DETERRÊNCIA NA OVIPOSIÇÃO E MORTALIDADE DE Plutella xylostella

Marina Delgobo (G) E-mail: marina_delgobo@hotmail.com Guilherme Lopes Gonçalves (G) E-mail: fulano@hotmail.com

Juliana Colman Ribeiro (G) E-mail beltrano@hotmail.com Vanessa Lima Gonçalves Torres (PQ) E mail vlgtorres@gmail.com

Adalci Torres (PQ) E mal: adalcitorres@gmail.com Rosi Zanoni da Silva (PQ) E mail:rosizanoni@bol.com..br

G – aluno de graduação; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: A traça-das-crucíferas, Plutella xylostella (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera: Plutellidae) é considerada a praga mais danosa aos cultivos de brássicas. As fêmeas de P. xylostella ovipositam preferencialmente na face dorsal das folhas e ao eclodirem as lagartas de primeiro ínstar destacam-se pelo hábito minador dificultando o controle químico e que nos estágios posteriores, hábito desfolhador, provocam maiores danos. A busca de alternativas, como emprego de produtos naturais extraídos de diferentes espécies de plantas, pode contribuir de forma relevante no manejo deP. xylostella. Esta pesquisa objetivou avaliar o efeito dos extratos etanólicos e frações de partes aéreas deThitonia diversifolia(girassol mexicano)como promotores de deterrência na oviposição e mortalidade de larvas de P. xylostella. Os extratos etanólicos da folha e caule da T. diversifolia foram obtidos por maceração e as frações obtidas por partição líquido/líquido. Discos foliares de couve (Brassica oleracea var. acephala) cultivar Manteiga foram pulverizados com soluções dos extratos das folhas e caule à concentração de 5% até preenchimento total das folhas e oferecidos com chance de escolha para oviposição de P. xylostella. Para o índice de mortalidade, as folhas de couve foram pulverizadas com soluções do extrato da folha e frações à concentração de 5% até preenchimento total das folhas e colocadas em cada tratamento 10 larvas de 1º.Instar. Na análise fitoquímica os extratos analisados apresentaram presença de terpenos e esteroides assim como cumarinas, flavonoides, antronas e taninos. O extrato bruto do caule da T. diversifolia proporcionaram efeito deterrente na oviposição de P. xylostella superiore a 92 %. A fração diclorometano apresentou 100 % na mortalidade larval podendo ser associado a presença de maior quantidade de terpenos. A espécie T.diversifolia apresenta potencial para o uso no manejo da praga P. xylostella. Palavras-chave: P. xylostella,Thitonia diversifolia, fitoquimica. 1. Introdução O uso de substâncias bioativas extraídos de plantas, para o controle de pragas, tem mostrado grande potencial, devido ação que algumas substâncias apresentam. Apesar de ser uma prática milenar, o uso de plantas com ação inseticida, ainda não é muito utilizada no manejo de pragas, a sua utilização apresenta inúmeras vantagens em relação ao controle convencional que preconiza o uso de inseticidas sintéticos, dentre essas vantagens estão a rápida degradação, baixo custo e a baixa toxicidade em mamíferos (JESUS et al, 2011). As plantas inseticidas são capazes de provocar inibição alimentar nos insetos, redução da motilidade intestinal, interferência na síntese do ecdisônio, inibição da biossíntese da quitina, deformações em pupas e adultos, redução da fecundidade, longevidade, esterilização, inibição na ovoposição e mortalidade de formas imaturas e adultas (BOIÇA JUNIOR et al., 2005;JESUS et al., 2011). Muitos resultados indicam os efeitos de extratos vegetais de algumas espécies botânicas, sobre o desenvolvimento da traça-das-crucíferas. No Brasil existe muitas espécies com elevado potencial de utilização com planta inseticida, com destaque as pertencentes às famílias das Meliaceae, Rutaceae, Asteraceae, Annonaceae, Labiateae e Canellaceae (MEDEIROS, 2005).

O girassol mexicano (Tithonia diversifolia) é uma planta herbácea originária da América Central. Pertence à Divisão: Sphermatophyta, Classe: Dicotiledoneae, Subclasse: Metaclamídeas, Ordem: Campanuladas, Família Asteraceae, Gênero: Tithoniae Espécie: Tithonia diversifolia (Hemsl.) Gray (CHAGAS-PAULA,2012). Várias classes de metabólitos secundários foram isoladas de espécies de Tithonia, incluindo sesquiterpenos e diterpenos, fitoesteróis como também flavonoides e cumarinas(CHAGAS-PAULA,2012). Mais de 150 compostos foram isolados da T. diversifolia, que é a espécie mais estudada do gênero Tithonia. Esta espécie é rica em lactonas sesquiterpênicas, especialmente tagitininas A, C e F. As lactonas sesquiterpênicas apresentam uma infinidade de atividades biológicas, e devido ao seu número de anéis e substituintes, são utilizados como marcadores químicos em vários estudos quimiossistemáticos com Asteraceae (FERREIRA et al., 2005). As tagitininas são as lactonas sesquiterpênicas mais estudadas do gênero, principalmente devido ao seu amplo espectro de atividades biológicas e farmacológicas.Um estudo recente com uma população de T. diversifolia brasileira, mostrou que as tagitininas A, C e F são os principais constituintes dos tricomas glandulares encontrados na superfície foliar desta planta. Entretanto, a tagitinina C foi o composto majoritário (AMBRÓSIO et al., 2008). Uma grande variedade de mono e sesquiterpenos foram isolados como compostos voláteis do óleo essencial das folhas e flores da T. diversifolia. O óleo da folha contém apineno, β-cariofileno, germacreno D, β-pineno e 1,8-cineol, enquanto que os sesquiterpenos germacreno D, β-cariofileno e biciclogermacreno são encontrados no óleo das flores (MORONKOLA et al., 2007). As atividades biológicas de extratos vegetais brutos ou constituintes isolados de T. diversifolia são amplamente estudadas apresentando atividades antiinflamatória e analgésica, antiviral, antidiabética, antimicrobiana, antidiarreica, citotóxica, antiespasmódica, inseticida e repelente. Uma atenção especial deve ser dada à obtenção do extrato bruto, porque pode apresentar efeitos biológicos diferentes dependendo do tipo de extração e do solvente utilizado (CHAGAS-PAULA,2012). 2.Objetivos

a) Coletar e dessecar as folhas e caule de Tithonia diversifolia; b) Preparar extratos etanólicos das folhas e caules de Tithonia diversifoliapor maceração; c) Fracionar os extratos etanólicos de Tithonia diversifolia por partição líquido/líquido com extrações

sucessivas utilizando solventes de polaridades crescentes; d) Avaliar o potencial dos extratos de Tithonia diversifoliana oviposição de Plutella xylostella; e) Avaliar o potencial do extrato e frações de Tithonia diversifoliano índice de mortalidade de

larvas de Plutella xylostella. 3. Materiais e Métodos 3.1 Material Vegetal 3.1.1 Coleta, Identificação e Preparação do Extrato Metanólico As folhas e caules de Tithonia diversifolia foram coletadas no Horto Medicinalda Universidade Estadual de Ponta Grossa no mês de abril de 2015. O extrato com as folhas secas e fragmentadas e o extrato do caule seco e fragmentado foram preparados por maceração usando etanol como agente extrator e mantidos fechados ao abrigo de luz por uma semana. Após este período os extratos foram filtrados e concentrados em rotaevaporador a pressão reduzida e banho-maria com temperatura controlada a 45 ºC até a completa eliminação do solvente. 3.1.2 Partição Líquido/líquido Para a obtenção das frações hexânica, diclorometano e acetato de ertila, o extrato etanólico bruto das folhas e o o extrato etanólico bruto do caule foram submetidos a extrações sucessivas com os solventes hexano, diclorometano,acetato de etila e etanol, em funil de separação.

3.2 Métodos Cromatográficos Marcha sistemática analítica por Cromatografia em camada delgada (CCD) - a fração hexânica, diclorometano e acetato de etila foram submetidas ao procedimento analítico por CCDpor meio revelação em câmara com luz ultravioleta nos comprimentos de onda 254 e 366 nm e reveladores químicos específicos, como: a) esteroides e terpenos: anisaldeído sulfúrico e aquecimento a 100oC. Observado o desenvolvimento de manchas azuladas ou roxas; b)Cumarinas – KOH 5% em metanol - observado o aparecimento de fluorescência em luz UV (366nm); c)Polifenóis – Cloreto férrico 3% - observado aparecimento de mancha marron escura. 3.3 Ensaio sistemático de análise fitoquímica O ensaio visa detectar a presença dos principais grupos de metabólitos secundários na espécie vegetal em estudo, sendo avaliada a sua presença pela formação de precipitados ou coloração característica para cada reação. 3.3.1 Pesquisa de alcalóides Para a preparação do extrato, foi colocado em um béquer 1g do material vegetal em estudo, seco e fragmentado com 40mL de ácido sulfúrico a 1% e levado à fervura por 5 min. Posteriormente, filtrado em algodão e resfriado. Em seguida, alcalinizado o extrato até pH 10 com hidróxido de amônia a 40%, usando papel indicador de pH. Depois, foi transferido o extrato alcalinizado para um funil de separação e extraido os alcaloides com 20mL de éter etílico, agitando cautelosamente. Foi coletado a camada etérea e filtrado em sulfato de sódio anidro. Transferir o extrato etéreo para uma cápsula de porcelana e aquecer em banho-maria para concentração até secura. Posteriormente, dissolver o resíduo em 2mL de ácido sulfúrico a 1% e distribuí-lo para 3 tubos de ensaio pequenos e gotejando os reativos gerais: Dragendorff, Meyer e Bourchardart. 3.3.2 Pesquisa de antraderivados 3.3.2.1Pesquisa de antraderivados por microsublimação Foi colocadouma lâmina de microscopia sobre tela de amianto em suporte e sobreposto um anel de vidro na lâmina. Em seguida adicionado 0,1g de material vegetal em estudo seco e moído no interior do anel então colocado sobre o anel outra lâmina e aquecido. Realizada a trocada lâmina superior repetidamente até obter várias preparações (resíduo amarelo). Observado ao microscópio óptico. 3.3.2.2 Pesquisa de antraderivados livres com solventes orgânicos Em um erlenmeyer com tampa foram colocados 4g do material vegetal em estudo seco e fragmentado com 30mL de éter etílico, agitado e deixado em repouso por 15 minutos. Em seguida foi filtrado, transferido para um tubo de ensaio e adicionado 2mL de hidróxido de amônio a 40%. Os antraderivados livres são aglicônicos, que reagem com bases formando íons fenolatos resultando em complexos coloridos. 3.3.2.3 Pesquisa de O-heterósidos antraquinônicos Foram fervidos 4g do material vegetal em estudo seco e fragmentado com 50mL de álcool etílico a 25% por 5 min. Em seguida, filtrado e acidificado com 30mL de ácido sulfúrico a 10% e fervido novamente por mais 5 minutos. Resfriado e transferido o extrato para um funil de separação com 20mL de clorofórmio. Foi agitado vagarosamente para a decantação da camada clorofórmica, filtrado com sulfato de sódio anidro e transferido para um tubo de ensaio sendo adicionado 2mL de hidróxido de amônio a 40%. 3.3.2.4 Pesquisa de C-heterósidos antraquinônicos Foram fervidos 4g do material vegetal em estudo seco e fragmentado em 10mL de transferir o extrato para um funil de separação com 20mL de clorofórmio. Agitado e deixado decantar a camada clorofórmica Em seguida foi lavado com H2O destilada. Filtrado o extrato com sulfato de sódio anidro e transferido para tubo de ensaio. Sendo adicionado 2mL de hidróxido de amônio a

40%. 3.3.3 Pesquisa de cumarinas Foi colocado uma lâmina de microscopia sobre tela de amianto em suporte e sobreposto anel de vidro na lâmina. Adicionado 0,1g de material vegetal em estudo seco e moído no interior do anel e coberto por outra lâmina e aquecico. A lâmina superior foi trocada repetidamente até obter várias preparações (sublimado na forma de gotas incolores ou cristais aciculares). O sublimado obtido foi diluido com 0,5mL de clorofórmio. Foi colocado 5 gotas do sublimado em duas regiões distintas de uma fita de papel de filtro. Depois de seco adicionado uma gota de solução etanólica de hidróxido de potássio a 10%. Observar sob luz UV (365nm). 3.3.4Pesquisa de esteróides e terpenos (Reação de Liebermann Bouchard) Em cápsula de porcelana, foi dissolvido uma pequena porção da fração hexano e com clorofórmio e evaporou-se o solvente até secura. Em seguida, foi dissolvido os resíduos com 1mL de anidrido acético e transferidopara tubo de ensaio onde cuidadosamente, pelas paredes do tubo, foi adicionado 1mL de ácido sulfúrico concentrado, sem agitar. 3.3.5 Pesquisa de flavonóides Foram aquecidos em banho-maria por 5 minutos, 3g do material vegetal em estudo, seco e fragmentado, com 20mL álcool etílico 70%. Posteriormente, filtrado com algodão e transferido para 3 tubos de ensaios e 2 cápsulas de porcelana para executar as reações de identificação. 3.3.5.1 Reação de Shinoda Foram adicionados 2mL do extrato hidroalcoólico em um tubo de ensaio e inserido três fragmentos de magnésio metálico. Adicionado 1mL de ácido clorídrico concentrado pelas paredes do tubo. Observado o desenvolvimento de coloração vermelha. 3.3.5.2 Reação com cloreto de alumínio (AlCl3) Foi umedecido duas áreas diferentes de uma tira de papel de filtro com o extrato hidroalcoólico obtido. Em seguida foi colocado sobre uma das regiões uma gota de solução etanólica de AlCl3 5% e visualizado a fluorescência em câmera fechada com luz ultravioleta a 365nm. 3.3.5.3 Hidróxido alcalino Foram adicionadosem um tubo de ensaio 3mL do extrato aquoso e adicionado pelas paredes do tubo 1mL de solução aquosa de NaOH 1N. 3.3.5.4 HCl concentrado No mesmo tubo de ensaio, após a adição de base, adicionar pelas paredes do tubo 1mL de HCl concentrado. 3.3.5.5 Pesquisa de Taubouk Em cápsula de porcelana foram adicionados 3mL do extrato aquoso e aquecido em banhomaria para a concentração do extrato até secura. Após resfriado, o resíduo foi umedecido com cinco gotas de acetona e alguns cristais de ácido bórico e ácido oxálico. Evaporado novamente em banho maria até secura, evitando aquecimento prolongado. O resíduo foi dissolvido em 3mL de éter etílico e observado sob a luz UV 365nm. 3.3.5.6 Pesquisa de PEW Em cápsula de porcelana foram adicionados 3mL do extrato aquoso e levado ao banhomaria para concentração até secura.Em seguida foram adicionados 3mL de metanol e transferido o conteúdo para tubo de ensaio e adicionado alguns fragmentos de zinco metálico e três gotas de HCl concentrado.

3.3.5.7 Cloreto férrico Em tubo de ensaio foram adicionados 2mL do extrato aquoso, 1mL de H2O destilada e três gotas de solução aquosa FeCl3 1%. 3.3.6 Pesquisa de saponinas Foram fervidos5g do material vegetal em estudo seco e fragmentado com 10mL de H2O destilada por 2 min. Em seguida foi filtrado em algodão em um tubo de ensaio e agitado por 15 seg. Foi marcada a altura da espuma e observado s presistencia daespuma por 15 min. 3.3.7 Pesquisa de taninos Foram fervidos 2g do material vegetal em estudo, seco e fragmentado com 30mL de H2O destilada em um béquer por 5 min. Em seguida, filtrado em algodão e resfriado. O extrato aquoso foi distribuido para nove tubos de ensaio identificados para a realização das provas de identificação para taninos. 3.3.7.1 Reação com a gelatina Foram adicionados 0,5mL; 1mL e 2mL do extrato aquoso em três tubos de ensaio e uma gota de HCl 10%. Em seguida, 2mL de solução de gelatina a 2,5%. 3.3.7.2 Reação com acetato de cobre Foram adicionados 2mL do extrato aquoso em um tubo de ensaio e dez gotas de solução aquosa de acetato de cobre a 4%. 3.3.7.3 Reação com acetato de chumbo Foram adicionado 2mL do extrato aquoso em um tubo de ensaio e dez gotas de solução aquosa de acetato de chumbo 10%. 3.3.8 Pesquisa de taninos hidrolisáveis 3.3.8.1 Reação com acetato ácido de chumbo Em um tubo de ensaio foram adicionados 3mL do extrato aquoso e 5mL de ácido acético glacial a 10% e 3mL de solução de acetato de chumbo a 10%. 3.3.8.2 Reação com FeCl3 Em um tubo de ensaio foram adicionados 2mL do extrato aquoso e diluido com 1mL de H2O destilada. Em seguida adicionado três gotas de solução de FeCl3 1%. 3.3.9 Pesquisa de taninos condensados 3.3.9.1 Água de bromo Em tubo de ensaio foram adicionados 2mL do extrato aquoso e cinco gotas de água de bromo. 3.4 Criação dos Insetos O experimento foi realizado no Laboratório de Entomologia Aplicada da Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG) em Ponta Grossa-PR, em sala climatizada sob condições controladas de temperatura (25 ± 2°C) e umidade 66 ± 10% e foto fase de 14 horas. Para o estabelecimento da criação, foram coletados insetos em lavouras de brássicas no município de Ponta Grossa-PR. Lagartas de primeiro instar foram colocadas em recipientes plásticos retangulares (15 x 10 x 5 cm), sendo alimentados com folhas de couve manteiga da Geórgia (Brassica oleracea L. var. acephala) adquiridas em plantações com sistema de produção orgânico no município de Ponta Grossa, previamente sanitizadas.

As folhas de couve foram substituídas diariamente, até que as lagartas atingissem a fase pupal, em seguida as pupas foram transferidas para células de placas de Elisa, permanecendo fechadas com filme plástico. Após a emergência, os adultos foram transferidos para gaiolas de plásticos transparentes, no interior de cada gaiola foram colocados discos de folha de couve, medindo 8 cm de diâmetro sobre papel filtro, umedecidos com água deionizada, para que ocorresse a postura das fêmeas. No interior da gaiola foi adicionado um pequeno algodão embebido com solução à 10% de diluição à base de mel para alimentação dos adultos. Os discos de couve foram trocados a cada 24h, sendo em seguida colocados em placas de Petri, até a eclosão das lagartas. 3.4 Bioensaio 3.4.1Preparação dos discos Para montagem do bioensaio foram preparadas soluções etanólicas na concentração 5% (p/v) do extrato bruto seco e das frações hexânica, diclorometano e acetato de etila das folhas e caule de T.diversifolia. Após a obtenção das soluções, foram cortados discos de couve medindo 8 cm de diâmetro e pulverizados com cada solução até o total preenchimento da folha. Os discos de couve usados como testemunha foram pulverizados com água deionizada, álcool, hexano, diclorometano e acetato de etila. Em seguida os discos foram colocados na câmara de fluxo de ar por 20 minutos, para perda do excesso dos solventes. 3.4.2 Efeito na ovoposição de P. xylostella Os discos foram cortados em quatro partes iguais e remontados,sendo dois triângulos tratados com os extratos e testemunhas e dois tratados com água deionizada em esquema inteiramente casualizado com 4 tratamentos (extrato bruto seco das folhas, extrato bruto seco do caule, etanol e hexano) e 4 repetições Em cada gaiola, foi introduzido um casal de P. xylostella com 24 horas de idade, oriundos da criação do laboratório, mantidos por dois dias para oviposição, realizando-se diariamente a contagem dos ovos. 3.4.2 Efeito na biologia da P. xylostella Após o preparo dos discos, eles foram colocadas em cada placa de Petri, juntamente com 10 larvas de 1º. instar em esquema inteiramente casualizado com 9 tratamentos (extrato bruto das folhas, extrato bruto do caule, frações hexano, diclorometano e acetato de etila das folhas) e 4 repetições. As placas foram mantidas no laboratório em condições controlada de temperatura e umidade, sendo as folhas substituídas diariamente por outras sem tratamento. Nesta troca de folhas foi anotado o número de larvas mortas.Tal procedimento foi realizado até que as larvas atingissem o estágio de pupa. 3.5 Análise Estatistica O efeito deterrente foi avaliado através da fórmula: PD = (NC – NT)/(NC+ NT) x 100, adaptada de OBENG-OFORI (1995), sendo PD, a porcentagem média de deterrência; NC, onúmero de ovos no tratamento com água deionizada ; e NT,o número de ovos em cada tratamento. Classificado-se da seguinte forma: Deterrente PD> 0 e Neutro: PD < 0. Cada gaiola contendo um casal da praga correspondia a uma repetição. Os resultados obtidos da deterrência e da mortalidadede larvas foram submetidos a análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade, utilizando-se o programa ESTAT. 4. Resultados e Discussão O extrato bruto seco das folhas e caule, bem como suas frações, foram submetidos ao procedimento analítico por CCD e revelação com anisaldeído sulfúrico seguida de aquecimento a 100ºC em estufa revelando manchas caracteristicas de terpenos (lactonas sesquiterpênicas). As CCDs das frações diclorometano, acetato de etila e etanol reveladas com KOH a 5% em metanol e irradiação com luz UV (366 nm) apresentaram fluorescências características de

cumarina. A placa da fração etanólica revelada com cloreto férrico a 3% apresentou mancha sugestiva de flavonoides e taninos. O ensaio sistemático de análise fitoquímica, representado na Tabela 1, mostra os principais componentes encontrados no extrato bruto da folha e extrato bruto do caule. Conforme estudos de Chagas-Paulaet al (2012), a espécie T. diversifolia apresenta lactonas sesquiterpênicas, antraderivados, cumarinas, taninos e flavonóides.

Tabela 1 – Ensaio sistemático de análise fitoquimica dos extratos de Folha e caule de T. diversifolia Grupo Análise Folha Caule Alcaloides Draggendorf - - Meyer - - Bouchardart - - Antraderivados Borntraeger (C- heterósido) - - Borntraeger (O-heterósido) +

Antrona +

Antrona Cumarinas CCD (KOH 10% + Fluorescência 365 nm) + + Esteroides/Terpenos Liebermann Bouchard + + Flavonoides Shinoda - - AlCl3 + + Hidróxido Alcalino + + HCl Concentrado + + Taubouk + + PEW - - FeCl3 + + Saponinas Espuma Persistente - - Taninos Acetato de Cobre + + Acetato de Chumbo + + Taninos Hidrolisáveis Acetato Ácido de Chumbo - - FeCl3 + + Taninos Condensados Água de Bromo - -

Fonte: os autores Na avaliação do efeito deterrente (Tabela 2) houve uniformidade da postura sobre os discos de folha de couve imersos em água deionizada, uma vez que a porcentagem de deterrência (PD) foi igual a 4,47 %, significando que a quantidade de ovos colocados foi similar nos triângulos de folhas de couve expostos à oviposição da praga, resultando em índice baixo em relação aos demais tratamentos. O extrato bruto do caulede Tithonia diversifoliapromoveu efeito deterrente de 92,85% na oviposição de P. xylostella, enquanto o extrato bruto das folhas proporcionou baixa porcentagem de deterrência (38,32 %) quando comparado com o extrato de caule da mesma planta.Os solventes hexano (27,42 %) e álcool etílico (23,20 %) exerceram influência na oviposição de P. xylostella uma vez que foram semelhantes ao extrato de folhas de T. diversifolia e diferiram da testemunha (4,47 %), porém com baixa porcentagem de deterrência. Tabela 2. Porcentagem média (± IC) de deterrência para oviposição de Plutella xylostella em discos de couve tratados com extratos de espécies vegetais à concentração de 5% (peso/volume). T (ºC) = 25 ± 2; UR (%) = 66 ± 10; fotofase = 14 horas. Ponta Grossa (PR). Tratamento Porcentagem de deterrência (PD)* Tithonia diversifolia (Caule) 92,85 ± 2,17 a Tithonia diversifolia (Folhas) 38,32 ± 0,80 b Hexano 27,42 ± 3,24 b Álcool 23,20 ± 2,93 bc Testemunha (água) 4,47 ± 2,53 c C.V.(%) 18,62 *Médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

Jesus et al (2011), estudaram o efeito de plantas inseticidas, Azadirachta indica, Sapindus saponária, Dimorphandra molis e Stryphnodendron adstringens, em teste com chance de escolha e observaram redução do número de ovos de P. Xylostella. Efeito semelhante foi observado por Torreset al. (2006). Um efeito antialimentar utilizando o extrato CH2Cl2 das folhas frescas de T. diversifolia, em concentrações de 1 a 5%, foi observado na larva Chlosyne lacinia (Lepidoptera). As larvas evitaram os discos umedecidos com o extrato e o efeito deterrente foi atribuído à presença de lactonas sesquiterpênicas (AMBRÓSIO et al., 2008). Em relação a mortalidade larval (Tabela 3), as larvas que se alimentaram de folhas de couve tratadas com o extrato bruto, fração diclorometano, fração hexano, fração acetato de etila apresentaram alto indice de mortalidade com poucas larvas atingindo a fase de pupa. A fração diclorometano apresentou 100 % na mortalidade larval podendo ser associado a presença de maior quantidade de terpenos. Tabela 3. Porcentagem média de mortalidade larvalde Plutella xylostella em discos de couve tratados com extrato da folha de Tithonia diversifolia à concentração de 5% (peso/volume). T (ºC) = 25 ± 2; UR (%) = 66 ± 10; fotofase = 14 horas. Ponta Grossa (PR). TRATAMEMTO MÉDIA DE MORTALIDADE LARVAL(%) * FRAÇÃO DICLOROMETANO 100,00 a FRAÇÃO HEXANO 97,50 a EXTRATO BRUTO 95,00 a FRAÇÃO ACETATO 92,50 a HEXANO 47,50 b ACETATO 27,50 bc ALCOOL 22,50 c TESTEMUNHA 20,00 c DICLOROMETANO 15,00 c C. V. 14,62% *Médias seguidas pela mesma letra, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

5. Conclusão Pela análise fitoquímica foi possível verificar a presença de terpenos, cumarinas, flavonoides, antronas e taninos tanto no extrato da folha como no do caule. Foi observada influência dos extratos no comportamento de P. xylostella tanto na ovoposição como na alimentação da praga. Conclui-se que as partes aéreas da T. diversifoliapossuem propriedades fitoquímicas com potencial para emprego no manejo de P. xylostella. Referências AMBROSIO, S.R. et al.Constituents of glandular trichomes of Tithonia diversifolia: relationships to herbivory and antifeedant activity. Phytochemistry, Vol. 69, p. 2052-2060, 2008. BOIÇA-JUNIOR, A.et al. Efeito de extratos aquosos de plantas no desenvolvimento de Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae) em couve.Arquivos do Instituto Biológico. Vol. 72,n.1,p.45-50,2005. CHAGAS-PAULA, D.A. et al.Ethnobotany, Chemistry, and Biological Activities of the Genus Tithonia(Asteraceae).Chemistry & Biodiversity Vol.9, 2012. FERREIRA, M.J.P. et al.Neural Networks in Chemosystematic Studies of Asteraceae: A Classification Based on a Dichotomic Approach.Chemistry & Biodiversity. Vol.2, p.633- 644, 2005. JESUS, F.G. et al.Efeito de plantas inseticidas no comportamento e biologia de Plutella xylostella (L.) (Lepidoptera: Plutellidae). Arquivos do Instituto Biológico. Vol. 78,n.2,p.279-285,2011. MEDEIROS, C. A. M.; BOIÇA JUNIOR, A. L.; TORRES, A. L. Efeito de extratos aquosos de plantas na oviposição da traça-das-crucíferas, em couve.Bragantia, Vol.64, n.2, p.227-232, 2005. MORONKOLA,D.O. et al. Identification of the main volatile compounds in the leaf and flower of Tithonia diversifolia (Hemsl) Gray. Journal of Natural Medicine. Vol 61,p.63–66, 2007. TORRES, A. L.et al.Efeito de extratos aquosos de Azadirachta indica, Melia azedarach e Aspidosperma pyrifolium no desenvolvimento e oviposição de Plutella xylostella. Bragantia. Vol. 65, p.447-457, 2006.

TRABALHO 23

Perfil de ação antioxidante do cetoprofeno, associado ou não ao flavonóide rutina, frente aos modelos HOCl e Ânion Superóxido.

Anderson Gustavo Santos (G) E-mail: ander-gustavo@hotmail.com

Caroline Belló (PG) E-mail: carol.belloh@gmail.com José Carlos Rebuglio Vellosa (PQ) E-mail: josevellosa@yahoo.com.br

Resumo: Estudos recentes têm demonstrado que citocinas, como o TNF-α e IL-1β, produzidas durante a resposta inflamatória, promovem aumento na síntese de espécies reativas de oxigênio participantes do estresse oxidativo. A utilização de anti-inflamatórios, como o cetoprofeno em associação com antioxidantes naturais, como a rutina, podem ser uma alternativa viável na defesa do organismo contra estas espécies deletérias.Desta forma, é objetivo deste trabalho a investigação da ação do cetoprofeno diante de diferentes espécies reativas, e se a associação deste fármaco com a rutina altera este perfil. Para isso foram empregados os ensaios modelos de espécies reativas de oxigênio: HOCl e Ânion Superóxido in vitro, em diferentes concentrações. Os resultados são expressos como inibição radicalar máxima alcançada.Verificou-se atividade antioxidante significativa da rutina nas metodologias utilizadas, corroborando com pesquisas semelhantes. O cetoprofeno, entretanto, não apresenta atividade antioxidante significativa. Isso pode ser observado através dos valores de inibição máxima sobre as espécies reativas, obtendo-se 36,9% (±2,7%) e 31,74% (±0,68%) de inibição máxima pelo cetoprofeno e 61,25% (±2,7%) e 61,64% (±2,5%) pela rutina, nas metodologias HOCl e Ânion Superóxido, respectivamente. Quando estes compostos são associados, a inibição máxima alcançada frente o HOCl foi de 92,22% (±0,3%) e no Ânion Superóxido foi de 44,3%(±0,68%). Por meio destes resultados, pode-se concluir que o cetoprofeno não possui atividade scavenger nos modelos experimentais utilizados. Estes dados sugerem que o cetoprofeno interfere na capacidade antioxidante da rutina e a associação destes compostos pode ser uma alternativa viável ao combate do estresse oxidativo. Palavras-chave: Antioxidantes, Cetoprofeno, Rutina, Estresse oxidativo. 1. Introdução Os anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) estão entre os medicamentos mais vendidos no mundo. Sua comercialização atinge um montante de cerca de 73 milhões de prescrições anuais em todo o mundo. Diante disto é possível identificar sua ampla aplicabilidade na clínica médica, principalmente no tratamento da dor, febre e inflamação (LASTRAet al. 2002). O cetoprofeno exerce os seus efeitos por inibição não seletiva da COX-1 e COX-2, as enzimas-chave que convertem o ácido araquidônico em prostaglandinas e tromboxanos (LIUet al. 2010). Os AINEs afetam uma grande variedade de sistemas antioxidantes enzimáticos, incluindo glutationa peroxidase, glutationa redutase, xantina oxidase, superóxido dismutase e da mieloperoxidase, resultando no aumento da concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) dentro da célula, causando danos irreversíveis (LASTRAet al. 2002; CHENGet al. 2013). Estudos epidemiológicos indicam que os usuários AINEs têm um maior risco de ulceração gastrointestinal do que os pacientes que não estão tomando AINEs (CHENGet al.2013). A geração de EROs e apoptose associada foram mostrados por induzir toxicidade gastrointestinal (KUSUHARAet al. 1999). Assim, o estresse oxidativo no trato gastrintestinal é considerado cada vez mais ocasionador de úlceras (ASENSIOet al. 2007). A geração do processo de estresse oxidativo decorre de um desequilíbrio entre os compostos oxidantes e antioxidantes, resultando no aumento excessivo da produção de radicais livres, ou na diminuição da velocidade de eliminação destes. Estes processos conduzem a oxidação de biomoléculas que acabam perdendo sua função biológica levando a um desequilíbrio homeostático. A produção excessiva e crônica de radicais livres tem papel importante sobre o processo fisiológico de diversas patologias. (BARBOSA et al. 2010). A rutina, também conhecida como vitamina P, um derivado natural de flavonas, foi descoberta no trigo mourisco no século XIX. É um composto polifenólico de baixo peso molecular que é amplamente distribuído entre os vegetais e frutas. O trigo mourisco é o alimento com maior teor

de rutina. (JIANGet al. 2007). Ela é amplamente utilizada no tratamento de doenças, possuindo várias atividades farmacológicas incluindo atividade antialérgica, anti-inflamatória, vasoativa, antitumoral, antiviral, antibacteriana e antiprotozoária (CALABRÒet al.2005). Estudos em modelos animais também indicaram que ela é utilizada para proteção da mucosa gástrica, uma vez que previne o estresse oxidativo. (BARNAULOW, MACHINEVA& KAMISSARENKO, 1983). Todos estes efeitos são resultado da sua alta capacidade de eliminação de radicais e da sua atividade antioxidante (GUO, WEI, & LIU, 2007). Estas propriedades são de alta importância na prevenção de doenças e na proteção da estabilidade do genoma. Alguns estudos também indicam o efeito dose-resposta da rutina sobre a diminuição da concentração de colesterol LDL em animais. (JIANG et al. 2007). O aumento da concentração de colesterol HDL também foi observado através de experimentos animais, sendo este fato explicado pela atividade inibitória da enzima superóxido dismutase. (RODRIGUES et. al. 2003). Produtos naturais são, em geral, capazes de agir sobre oxidantes e radicais livres e, desta forma, a associação entre a rutina e o cetoprofeno parece promissora na atenuação de efeitos tóxicos relacionados ao estresse oxidativo ou ainda na intensificação da ação anti-radicalar por meio de sinergismo sobre estas espécies reativas. 2. Objetivos O objetivo deste trabalho foi comparar o perfil da atividade antioxidante da rutina, do cetoprofeno e da associação entre a rutina e o cetoprofeno. 3. Materiais e Métodos 3.1 Preparo das Soluções de Rutina e Cetoprofeno Para cada teste foram preparadas soluções com 3 concentrações diferentes para cada substância. Estas soluções foram preparadas através da diluição da rutina ou do cetoprofeno em metanol, sendo que tal solvente foi utilizado por Araújo (2012) para a dissolução da rutina, na realização dos modelos experimentais utilizados em sua pesquisa. Foram pesados 5mg de cetoprofeno, marca Fragon®, com 100% de pureza, e adicionado a 5 ml de metanol, resultando numa solução de 1mg/ml de cetoprofeno. Após o preparo desta solução, se preparou a solução de 0,1mg/ml onde foram retirados 500 microlitros da solução 1mg/ml e adicionados a 4,5ml de metanol. Seguinte ao preparo desta, foi realizado o preparo da solução de 0,01mg/ml onde se seguiu o mesmo raciocínio da diluição anterior, retirando 500 microlitros da solução 0,1mg/ml e adicionando a 4,5ml de metanol. As soluções contendo rutina, marca Sigma-Aldrich®, foram realizadas da mesma maneira, porém foram pesados 5,3mg uma vez que a pureza desta era de 95%. 3.2 Atividade Scavenger do Ácido Hipocloroso (HOCl) O ácido hipocloroso é um forte agente oxidante que está presente em células humanas como os neutrófilos, e que por isso, contribui para a destruição de bactérias. Ele é produzido através das mieloperoxidases, que catalisam as reações de oxidação dos íons cloro com o H2O2, resultando na formação do HOCl. (SÁNCHEZ-MORENO, 2002). O modelo experimental foi realizado segundo Costa et al. (2004), com algumas modificações, o qual cita que o princípio do teste se baseia no fato de que o composto testado só é um bom scavenger do HOCl quando ele é capaz de competir com o TMB (ácido 5-tio-2-nitrobenzoico) pela oxidação causada pelo HOCl. O experimento foi realizado através da incubação das amostras durante 10 minutos contendo tampão fosfato de sódio (50mM e pH 7,4), rutina, TMB (2,8mM) e HOCl (30µM). O mesmo foi realizado para as amostras contendo cetoprofeno e associação de cetoprofeno e rutina. A avaliação do teste foi realizada através da determinação da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 652nm.

3.3 Atividade Scavenger do Ânion Superóxido (O2-)

O ânion superóxido é o primeiro produto da redução da molécula de O2. Segundo Robak; Gryglewski (1988), o O2

-, que é produzido pelo NADH e MSF (metossulfato de fenazina), ao entrar em contato com a solução de NBT (nitro-blue tetrazolium), reduz este composto formando o cromóforo formazana. E a adição de qualquer composto que reaja com o O2

-, inibe a formação do formazana, reduzindo a formação de coloração. A metodologia utilizada foi segundo o mesmo autor citado acima na descrição deste teste. Os testes foram realizados através da incubação das amostras durante 2 minutos contendo tampão fosfato de sódio (100mM e pH 7,4), MSF, NBT (68,4 µM), rutina e NADH. O mesmo foi realizado para as amostras contendo cetoprofeno e associação de cetoprofeno e rutina. A incubação não foi realizada nas amostras “branco”. A avaliação do teste foi realizada através da determinação da absorbância em espectrofotômetro no comprimento de onda de 560nm. 4. Resultados e Discussão Através dos resultados obtidos em absorbância, pode-se calcular os valores de inibição radicalar máxima utilizando-se o software GraphPrisma. 4.1 Ácido Hipocloroso Flavonóides como a rutina e a quercetina podem inibir a atividade de mieloperoxidases em neutrófilos, e consequentemente, previnem a liberação do ácido hipocloroso. (FREI, 2012). A rutina, frente ao modelo do HOCl, apresentou percentuais de inibição radicalar máxima de 61,25% (±2,7%).

Figura 1. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de rutina

isoladamente, obtidos no teste do Ácido Hipocloroso (HOCl).

O cetoprofeno apresentou valores de inibição radicalar máxima de 36,9% (±2,7%), coincidindo com os resultados apresentados por Manente et al. 2011, onde esta cita que o cetoprofeno apresentou 31,2% de inibição máxima numa concentração de 20µg/ml.

Figura 2. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de cetoprofeno

isoladamente, obtidos no teste do Ácido Hipocloroso (HOCl).

A associação entre a rutina e o cetoprofeno se mostrou benéfica, uma vez que aumentou o percentual de inibição radicalar máxima em relação ao cetoprofeno isoladamente, resultando em 92,22% (±0,3%).

Figura 3. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de associação entre

a rutina e o cetoprofeno, obtidos no teste do Ácido Hipocloroso (HOCl).

4.2 Ânion Superóxido Estudos recentes têm demonstrado que compostos fenólicos como as catequinas e flavonóides, como a rutina, são importantes antioxidantes e scavengers do ânion superóxido. (BENAVENTE-GARIA et al. 1997) Através dos valores de absorbância foi obtido os valores de inibição radicalar máxima, aonde a rutina isoladamente apresentou 61,64% (±2,5%) de inibição. Tal resultado se encontra compatível com os resultados apresentados por J. Yang et al.(2008), o qual demonstrou uma inibição de aproximadamente 55% para uma concentração de 0,2mg/ml de rutina.

Figura 4. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de rutina

isoladamente, obtidos no teste do Ânion Superóxido.

O cetoprofeno, por outro lado, apresentou valores de 31,74% (±0,68%)de inibição radicalar máxima, o que contrasta com o que foi proposto por Manente et al. 2011, que apesar de ter utilizado concentrações menores, propõe que o cetoprofeno isoladamente não apresenta atividade antioxidante significativa se comparado com o branco, no modelo do ânion superóxido.

Figura 5. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml de solução de

cetoprofeno isoladamente, obtidos no teste do Ânion Superóxido.

Já a associação entre o cetoprofeno e a rutina apresentou um resultado superior ao demonstrado pelo cetoprofeno isoladamente, obtendo um valor de 44,3% (±0,68%) de inibição radicalar máxima, o que indica que a associação entre a rutina e o cetoprofeno é mais eficiente do que o cetoprofeno isolado.

Figura 6. Gráfico relacionando os valores de absorbância com a concentração por ml da solução de associação entre

a rutina e o cetoprofeno, obtidos no teste do Ânion Superóxido.

5. Conclusão Através dos resultados obtidos, podemos observar que a rutina apresentou percentual de inibição radicalar máxima maior do que o cetoprofeno nos dois testes realizados, indicando que esta apresenta uma maior capacidade scavenger dentro dos modelos propostos. A associação entre a rutina e o cetoprofeno apresentou-se benéfica no modelo do HOCl, aumentando a inibição máxima em relação ao cetoprofeno e à rutina isoladamente, o que contrasta com o resultado obtido no modelo do Ânion Superóxido, que apesar de a associação obter uma inibição maior que o cetoprofeno isoladamente, esta se comportou de maneira menos eficaz que a rutina isoladamente, o que pode sugerir que por algum mecanismo não conhecido a rutina interfere na capacidade de captura desta espécie reativa provocado pelo cetoprofeno. Referências ASENSIO et al.Irreversible inhibition of glucose-6-phosphate dehydrogenase by the coenzyme A conjugate of ketoprofen: a key to oxidative stress induced by non-steroidal anti-inflammatory drugs. Biochem Pharmacol. Vol.73, p.405–416, 2007. FREI, Balz.Natural Antioxidants in Human Health and Disease. Academic Press. 588 páginas, 2012. Disponível em <https://play.google.com/books/reader?id=GYUXAAAAQBAJ&printsec=frontcover&output=reader&hl=pt_BR&pg=GBS.PR14>. Acessado em agosto de 2015. BARNAULOW, O.D.; MACHINEVA O.A.; KAMISSARENKO N.F. Comparative evaluation of the effect of some flavonoids on change in the gastric wall of reserpine treated or immobilized mice. Khim Farmatserticheskii Zh. Vol.17, p.946-951, 1983. BARBOSA et al. Estresse oxidativo: conceitos, implicações e fatores modulatórios. Campinas: Revista de Nutrição, vol. 23, p. 629-643, 2010. BENAVENTE-GARIA et al. Use and properties of citrus flavonoids. Journal of Agricultural and Food Chemistry, vol. 45, p. 4505-4515, 1997. CALABRÒ et al. The rutin/β-cyclodextrin interactions in fully aqueous solution: spectroscopic studies and biological assays. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, Vol. 36, p. 1019-1027, 2005. CHENG, Y.T; WU, C.H; HO, C.Y; YEN, G.C. Catechin protects against ketoprofen-induced oxidative damage of the gastric mucosa by up-regulating Nrf2 in vitro and in vivo. Journal of Nutritional Biochemistry. Vol. 2, p.475-83, 2013. COSTA, M.; XIMENES, V. F.; FONSECA, L. M. Hypochlorous acid inhibition by acetoacetate: implications on neutrophil functions. Biological and Pharmaceutical Bullettin, Vol. 27, p.1183-1187, 2004. GUO, R; WEI, P.; LIU, W. Combined antioxidante effect of rutin and vitamin c in Triton X-100 micelles. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. Vol. 43, p.1580-1586, 2007. JIANG et al. Rutin and flavonoid contents in three buckwheat species Fagopyrum esculentum, F. tataricum, and F. homotropicum and their protective effects against lipid peroxidation. Food Research International, vol. 40, p. 356-364, 2007. KUSUHARA, H.; KOMATSU, H.; SUMICHIKA, H.; SUGAHARA, K.Reactive oxygen species are involved in the apoptosis induced by nonsteroidal anti-inflammatory drugs in cultured gastric cells. Eur J Pharm., 383: 331–7, 1999. LASTRA, C. et al.Gastric toxicity of racemic ketoprofen and its enantiomers in rat Oxygen radical generation and COX-expression. Inflammation Research. Vol. 51(2): 51-57, 2002. LIU, S.; MIZU, H.; YAMAUCHI, H.Photoinflammatory responses to UV-irradiated ketoprofen mediated by the induction of ROS generation, enhancement of cyclooxygenase-2 expression, and regulation of multiple signaling pathways. Free Radic Biol Med, Vol. 48(6), p.772-80, 2010.

RODRIGUES et al. Suplementação nutricional com antioxidantes naturais: efeito da rutina na concentração de colesterol-HDL. Revista de Nutrição, Vol.16, p.315-320, 2003. ROBAK, J.; GRYGLEWSKI, R. J. Flavonoids are scavengers of superoxide anions. Biochemical Pharmacology, v.37, n.5, p.837-841, 1988. SÁNCHEZ-MORENO, C. Review: Methods Used to Evaluate the Free Radical Scavenging Activity in Foods and Biological Systems. Food Science and Technology International Journal, vol. 8, p. 121-137, 2002. YANG, J.; GUO, J.; YUAN, J. In vitro antioxidant properties os rutin. LWT - Food Science and Technology. vol. 41, p. 1060-1066, 2008.

TRABALHO 24

Desenvolvimento de um Método Qualitativo para Detecção de Adulterantes no Leite

Autor 1 (G) Geisamara Janaina Carneiro E-mail: geisamarajc@hotmail.com

Autor 2 (PQ) Júlio Miné E-mail: juliomine@gmail.com Autor 2 (PQ) Stella Bortoli E-mail: stellabortoli@gmail.com

G – aluno de graduação; PQ – professor responsável pela orientação.

Resumo: O leite é um dos alimentos mais utilizados pela população em todas as faixas etárias, muito importante para o crescimento e desenvolvimento, principalmente pelo seu alto teor de cálcio, vitaminas e minerais; além de ser fonte de energia e proteínas com grande poder nutritivo. Por este motivo tanto a produção de leite quanto o controle da sua qualidade são pontos importantes para a economia. Recentemente foram reportados casos de adulteração, o que é relevante para a saúde pública. Esses casos são notificados pelas agências responsáveis pelo controle de qualidade do leite e noticiados à população pela imprensa. As adulterações configuram fraude e algumas delas representam risco de intoxicação para o consumidor. Existem diferentes tipos de adulterações, com diversas finalidades, seja para aumentar a qualidade do produto final ou mascarar alguns aspectos que comprometem a integridade quando este está próximo da sua validade. O objetivo dessa pesquisa é uma análise prática compilando as principais adulterações no leite encontradas ultimamente com relevância toxicológica. Neste trabalho foram analisados a presença de formaldeído, peróxido de hidrogênio, hipocloritos e hidróxido de sódio em diferentes concentrações por metodologia colorimétirca. O desenvolvimento dos métodos propostos permitiu a detecção de concentrações mínimas de alguns adulterantes encontrados em fraudes do leite. A possibilidade de utilização desses métodos em campo é de grande ajuda como indicativo de detecção de alteração. Assim tornou-se possível a análise da qualidade do leite comercializado, a fim de fornecer uma metodologia simples, rápida e segura para identificação da fraude no leite. Palavras-chave: Leite, adulteração, toxicidade, desenvolvimento de metodologia, colorimetria. 1. Introdução O leite é um alimento natural, com alta concentração de água, com composição química variada entre as espécies, sendo a composição do leite de bovinos em média: 87% de água; 3,7 % de gorduras; 4,9 % de lactose; 3,5 % de proteínas variadas, entre elas: caseína, β-lactoglobulina, α-lactoalbumina, soroalbumina e imunoglobulina e 0,7 % de minerais. Destinado a produzir um rápido desenvolvimento dos mamíferos recém-nascidos (PRATA, 2001). Entende-se por leite, sem outra especificação, o produto oriundo da ordenha completa, ininterrupta em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas (BRASIL, 2002). Sendo o Brasil um grande produtor de leite é de suma importância que haja métodos que garantam a correta detecção de adulteração do alimento, para melhoria da qualidade de vida do ser humano. E assim se garantam alimentos saudáveis, com alto valor nutricional, disponíveis e acessíveis à população. Desde o nascimento do ser humano, o leite apresenta-se quase indissociável de sua alimentação. Os avanços nas técnicas relacionadas às etapas de produção, processamento e distribuição do leite têm favorecido ainda mais o seu consumo humano. Essas etapas, porém, induzem a alterações bioquímicas, físico-químicas, microbiológicas, nutricionais, sensoriais e reológicas (no comportamento mecânico) que podem comprometer a qualidade do produto final. A análise do leite tornou-se muito importante para a garantia de qualidade do produto.

A produção de leite de boa qualidade é um desafio que pode ser alcançado desde que alguns cuidados sejam tomados na fonte de produção. A qualidade deve ser vista como um somatório de esforços que inclui melhoramento genético, bom manejo nutricional, controle sanitário, práticas higiênicas de ordenha, resfriamento do leite em baixa temperatura nas propriedades, transporte rápido e em condições apropriadas até as indústrias (Cerqueira et al. 2009). A Rede Brasileira de Qualidade do leite, foi criada pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento - MAPA em 18 de abril de 2002 pela Instrução Normativa nº 37, com a finalidade de dar suporte analítico aos leites crus refrigerados, visando à ampliação da Instrução Normativa nº 51, no Brasil (MAPA, 2002). O Brasil é um grande produtor e consumidor de leite e com esse consumo muitos casos de adulteração são observados. Esses casos são notificados pelas agências responsáveis pelo controle de qualidade do leite e alguns são noticiados à população pela imprensa. As adulterações configuram fraude e consequente risco de intoxicação para o consumidor. Existem diferentes tipos de adulterações, com diversas finalidades, tais como: aumentar o volume, mascarar acidez, recompor a aparência; objetivando sempre lucro para empresas e distribuidores. Com a regulamentação da produção de leite e definição de parâmetros de qualidade, o desenvolvimento de métodos analíticos quantitativos e qualitativos foi um dos pilares para o processo de busca por alimentos seguros, e o incentivo para os pesquisadores. A adulteração pode ser feita ao produto em diferentes fases da cadeia de produção, por isso uma preocupação é identificar a adulteração assim que ela é desenvolvida, pelo histórico fica evidente o perfil reativo, ou seja, a adulteração precisa ocorrer primeiro para que depois os métodos sejam desenvolvidos para identificá-la. Vários são os aspectos avaliados nas análises de rotina do leite, entre eles: características sensoriais (odor, cor, sabor); características físico químicas (densidade, pH, acidez, teor de gordura e proteínas); controle microbiológico; pesquisa de neutralizantes de acidez e reconstituintes de densidade, pesquisa da presença de resíduos de antibióticos e outros medicamentos de uso veterinário, entre outros (MAPA, 2006). Os principais adulterantes encontrados no leite são a adição de soro, adição de água, alteração da composição, adição de reconstituintes, adição de neutralizantes, adição de conservantes, adição de leite em espécies diferentes, adição de gorduras não lácteas. O uso fraudulento de hidróxido de sódio tem a finalidade de substituir as boas práticas na produção/processamento do leite, pois a intenção é enquadrar um leite fora do padrão em relação a acidez, em um leite padronizado. É considerado agente tóxico para ingestão. Não é permitido para uso em leite por induzir a fraude e mascarar as boas práticas de fabricação (ANVISA, 2007). O hipoclorito é utilizado como conservante, exercendo ação sobre o desenvolvimento de microrganismos, retardando a multiplicação (TRONCO, 2008). O peróxido de hidrogênio pode ser adicionado de forma fraudulenta ao leite com a função de prevenir a proliferação de microrganismos, naturalmente presentes no leite. (MAPA, 2014). O formol possui ação antimicrobiana, usado como conservante no leite (TRONCO, 2010). Atualmente as adulterações no leite ficaram mais sofisticadas e outros produtos passaram a ser adicionados com diferentes finalidades. Além disso, a adulteração passou a ser praticada por diferentes elos da cadeia de produção, como produtores, transportadores e indústrias. Alguns casos de adulteração no leite ganharam destaque nos jornais nos últimos meses deflagrando inclusive a “Operação Leite Compensado” pelo Governo Federal e Ministério da Agricultura e Pecuária onde o objetivo foi intensificar a fiscalização e identificar os fraudadores. Por este motivo é de extrema importância a detecção dos contaminantes de interesse toxicológico por um método prático, rápido e de fácil execução de modo que possa ser usado em campo, com a finalidade de proteger o consumidor final.

2. Objetivo O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método qualitativo para detecção da menor concentração possível de alguns adulterantes presentes no leite que tenham interesse toxicológico por conferir risco para saúde humana. Para isso foi realizado levantamento dos principais adulterantes do leite e desenvolvido métodos colorimétricos, semi-quantitativos para a detecção de peróxido de hidrogênio, formaldeído, hidróxido de sódio e hipoclorito em amostras de leite. 3. Materiais e Métodos 3.1 Materiais Caixa de leite de diferentes marcas, hidróxido de sódio, formaldeído, peróxido de hidrogênio, hipoclorito de sódio, pipetas, pipetadores, tubos de ensaio, estantes para tubos de ensaio, bastão de vidro, solução de azul de bromotimol, iodeto de potássio, solução de ácido acético, banho-maria, termômetro, água destilada, ácido sulfúrico a 1M, solução de reagente de Schiff, fucsina, sulfito de sódio heptaidratado, balão volumétrico, béquer, funil de vidro, carvão ativado, papel de filtro. 3.2 Métodos A amostra de leite utilizada foi comprada no comércio de Ponta Grossa e adulterada com os diferentes compostos empregados para tais práticas em diferentes concentrações. 3.2.1 Pesquisa de Peróxido de Hidrogênio Foi realizado diluições da solução de peróxido de hidrogênio 200 volumes em leite nas seguintes concentrações: 0,5%, 1%, 3%, 6% e 9%. Em um tubo de ensaio foram colocados 2 mL de leite e adicionado gotas de iodeto de potássio a 10%. O preparo do reagente foi realizado pesando 10,05 g de iodeto de potássio, dissolvido em água destilada e completado o volume de 100 ml com água destilada no balão volumétrico. 3.2.2 Pesquisa de Hidróxido de Sódio Foi preparada solução de hidróxido de sódio a 0,05 M e realizada a diluição em leite nas concentrações: 0,05%, 0,10%, 0,15%, 0,25%, 0,5%, 0,75% e 1%. Em tubo de ensaio foram colocados 5 mL de leite e adicionado 4 gotas de solução de azul de bromotimol. A solução do indicador azul de bromotimol foi obtida com o aquecimento de 1 g do indicador com 3,2 ml de solução 0,05 M de hidróxido de sódio e 5 ml de etanol a 90%. Após a dissolução foi completado o volume de 250 ml com etanol a 90%, obtendo uma solução 0,004 mg/ml do indicador (ANVISA, 2010). 3.2.3 Pesquisa de Formaldeído Foi realizado diluições da solução de formaldeído a 37%, em leite, nas concentrações: 0,005%, 0,01%, 0,05%, 0,10%, 0,15% e 0,25%. Foram colocados 2 mL de leite em tubo de ensaio e adicionado gotas de ácido sulfúrico 1 M, em seguida foram adicionados 2 mL do reagente de Schiff. Após agitação, foi deixado em repouso por 5 min. Para o preparo do reagente de Schiff foi pesado 100 mg de fucsina em béquer e dissolvido em 75 ml de água a 80ºC. Após resfriamento foi acrescentado 2,5 g de sulfito de sódio heptaidratado, foi adicionado carvão ativado e posteriormente a solução foi filtrada com papel de filtro e completado o volume para 100 ml com água destilada (ANVISA, 2008).

3.2.3 Pesquisa de Hipoclorito Foi realizado diluições da solução de hipoclorito de sódio a 12%, em leite, nas concentrações: 0,025%, 0,05%, 0,1%, 0,2% e 0,3%, 0,4% e 0,5%. Em tubo de ensaio foi misturado5 mL de leite com gotas de solução de iodeto de potássio à 7,5% e agitado para detecção da presença de cloro livre. Para pesquisa do adulterante hipoclorito foi adicionado ao tubo 4 mL de solução de ácido acético, colocado em banho-maria a 80 ºC por 10 minutos e posteriormente resfriado em água corrente. O reagente iodeto de potássio a 7,5% foi preparado pesando 7,5 g de iodeto de potássio, diluído em água destilada e completado o volume para 100 ml com água destilada. 4. Resultados e Discussão A amostra de leite foi comprada no comércio de Ponta Grossa e adulterada com os diferentes compostos utilizados para fraudar o leite: formaldeído, hidróxido de sódio; hipoclorito de sódio e peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações. O resultado dos métodos propostos foi obtido com sucesso pela reação colorimétrica após reação do leite adulterado no laboratório com os reagentes utilizados em cada metodologia. Após as reações houve mudança da coloração que pode ser observada nas figuras de 1 a 4. Na pesquisa por formaldeído foi possível observar a formação de cor discreta a partir das concentrações de 0,005%, com crescente aumento da tonalidade violeta até a concentração de 0,25% como pode ser observado na figura 1. A formação de cor é resultado da reação do formaldeído com o reagente de Schiff. O surgimento de coloração rosa ou malva após 5 minutos indica presença do adulterante (MARTINS, 2012). Essa metodologia foi adaptada da pesquisa de metanol e aldeídos em diferentes produtos comerciais (MARTINS & SUAREZ, 2012).

Figura 1 – Detecção de formaldeído em amostras de leite.

A pesquisa da presença de hidróxido de sódio no leite foi realizada com a adição de solução de azul de bromotimol 0,004 mg/ml. Foi observada coloração esverdeada a partir da concentração 0,15%, acentuando até a concentração de 1%. Nas concentrações 0,10 e 0,05% foi adquirida coloração amarelada. Essas mudanças de cor podem ser observadas na figura 2. O aparecimento de coloração verde e azul indica a presença do adulterante e coloração amarela indica ausência (ALMEIDA, 2013). A mudança da coloração é decorrente da ação do indicador azul de bromotimol, que em soluções fracamente ácidas fornece coloração amarela, em soluções fracamente alcalinas fornece cor azul e em meio neutro, coloração verde.

Figura 2 – Detecção de hidróxido de sódio em amostras de leite.

A pesquisa do adulterante hipoclorito de sódio foi realizada com adição de solução de iodeto de potássio a 7,5% ao leite adulterado e em foi visualizado nas concentrações de 0,4 e 0,5% imediatamente após a reação, indicando a presença de cloro livre, podendo ser observada na figura 3. Foram adicionados 4 ml de solução de ácido acético e colocado em banhocorrente. Foi observado o aparecimento de cor amarela fraca a partir da concentração 0,2% e acentuada conforme o aumento da concentração, como pode ser observado na figura 3, indicando a presença de hipoclorito (BRASIL, 2006).

Figura 3 – Detecção de hipoclorito de sódio em amostras de leite. A adição de ácido acético e aquecimento.

A presença de peróxido de hidrogênio foi investigada adicionandopotássio a 10% no leite adulterado, sendo possível observar a mudança de coloração a partir da concentração 0,5% e aumentando a tonalidade conforme aumento da concentração, como se pode observar na figura 4; após 30 minutos as coloraçaparecimento de espuma, conforme mostra a figura 4. A mudança de coloração indica presença do adulterante peróxido de hidrogênio (MENDES, 2010).

Figura 4 – Pesquisa de peróxido de hidrogênio em amostras de leite. A imediatamente após a reação; B

5. Conclusão O desenvolvimento do método permite a detecção de alguns adulterantes encontrados em fraudes do leite. A possibilidade de uindicativo de adulteração do produto. Com a pesquisa detectouadulterantes presentes no leite e será possível o desenvolvimento de um kit para detecção de fraudes, com aplicação como indicativo de fraude para auxiliar no controle de qualidade por empresas, distribuidores e também consumidores finais.

A pesquisa do adulterante hipoclorito de sódio foi realizada com adição de solução de iodeto de potássio a 7,5% ao leite adulterado e em seguida agitado. O aparecimento de coloração amarela foi visualizado nas concentrações de 0,4 e 0,5% imediatamente após a reação, indicando a presença de cloro livre, podendo ser observada na figura 3. Foram adicionados 4 ml de solução

olocado em banho-maria a 80 ºC por 10 minutos e resfriado em água corrente. Foi observado o aparecimento de cor amarela fraca a partir da concentração 0,2% e acentuada conforme o aumento da concentração, como pode ser observado na figura 3,

sença de hipoclorito (BRASIL, 2006).

Detecção de hipoclorito de sódio em amostras de leite. A – imediatamente após a reação. B adição de ácido acético e aquecimento.

A presença de peróxido de hidrogênio foi investigada adicionando-se solução de iodeto de potássio a 10% no leite adulterado, sendo possível observar a mudança de coloração a partir da concentração 0,5% e aumentando a tonalidade conforme aumento da concentração, como se pode observar na figura 4; após 30 minutos as colorações foram desaparecendo e houve aparecimento de espuma, conforme mostra a figura 4. A mudança de coloração indica presença do adulterante peróxido de hidrogênio (MENDES, 2010).

Pesquisa de peróxido de hidrogênio em amostras de leite. A - detecção das concentrações 0,5 % a 9 % imediatamente após a reação; B - detecção das concentrações 0,5 % a 9 % após 30 min.

O desenvolvimento do método permite a detecção de alguns adulterantes encontrados em fraudes do leite. A possibilidade de utilização desses métodos em campo é de grande ajuda como indicativo de adulteração do produto. Com a pesquisa detectou-se concentrações mínimas de adulterantes presentes no leite e será possível o desenvolvimento de um kit para detecção de

icação como indicativo de fraude para auxiliar no controle de qualidade por empresas, distribuidores e também consumidores finais.

A pesquisa do adulterante hipoclorito de sódio foi realizada com adição de solução de iodeto de seguida agitado. O aparecimento de coloração amarela

foi visualizado nas concentrações de 0,4 e 0,5% imediatamente após a reação, indicando a presença de cloro livre, podendo ser observada na figura 3. Foram adicionados 4 ml de solução

maria a 80 ºC por 10 minutos e resfriado em água corrente. Foi observado o aparecimento de cor amarela fraca a partir da concentração 0,2% e acentuada conforme o aumento da concentração, como pode ser observado na figura 3,

imediatamente após a reação. B – após a

solução de iodeto de potássio a 10% no leite adulterado, sendo possível observar a mudança de coloração a partir da concentração 0,5% e aumentando a tonalidade conforme aumento da concentração, como se

ões foram desaparecendo e houve aparecimento de espuma, conforme mostra a figura 4. A mudança de coloração indica presença

ção das concentrações 0,5 % a 9 %

detecção das concentrações 0,5 % a 9 % após 30 min.

O desenvolvimento do método permite a detecção de alguns adulterantes encontrados em tilização desses métodos em campo é de grande ajuda como

se concentrações mínimas de adulterantes presentes no leite e será possível o desenvolvimento de um kit para detecção de

icação como indicativo de fraude para auxiliar no controle de qualidade por

Referências AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. (Brasil) (ANVISA). Informe técnico nº 33, 2007. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. (Brasil) (ANVISA). Guia de controle de qualidade de produtos cosméticos / Agência Nacional de Vigilância Sanitária. 2ª edição, revista – Brasília: ANVISA, 2008. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA. (Brasil) (ANVISA). Farmacopeia Brasileira, v.2. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Brasília: ANVISA, 2010. p.546. ALMEIDA, T.V. & NICOLAU, E.S. Detecção de Adulteração em Leite: Análises de Rotina e Espectroscopia de Infravermelho. Goiânia, 2013. CERQUEIRA, M.M.O.P. & SOUZA, M.R. & RODRIGUES, R. Et al. Características Microbiológicas de Leite Cru e Beneficiado em Belo horizonte (MG). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.46, n.6, p.713 – 721, 1994. MARTINS, G. & SUAREZ, P.A.Z. Desenvolvimento de uma metodologia portátil para análise de metanol e aldeídos em produtos comerciais. 35ª Reunião anual da Sociedade Brasileira de Química, 2012. MENDES, C.G. & SAKAMOTO, S.M. & SILVA, J.B. & JÁCOME, C.G..M. & LEITE, A.I. Análises Físico-Químicas e Pesquisa de Fraude no Leite Informal Comercializado no Município de Mossoró. Revista Ciência Animal Brasileira, Volume 11, Número 2, 2010. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. (Brasil) (MAPA). Instrução Normativa n.51. Diário Oficial da União. Brasília: MAPA, 2002; MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. (Brasil) (MAPA) Instrução Normativa n.68, de 12 de dezembro de 2006. Estabelece métodos analíticos físicoquímicos oficiais para leite e produtos lácteos. Diário Oficial da União, 14 dez. 2006, Seção 1, p. 8. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. (Brasil) (MAPA). Pesquisa de Peróxido de Hidrogênio em Leite Fluido pelo Método de Guaiacol. Laboratório Nacional Agropecuário- Método de ensaio. Rio Grande do Sul, 2014. MINISTÉRIO DA AGRICULTURA, PECUÁRIA E ABASTECIMENTO. (Brasil) (MAPA). Instrução Normativa n.37, de 18 de Abril de 2002. TRONCO, V.M. Pesquisa de substâncias estranhas ou fraudulentas. Manual para Inspeção da Qualidade do Leite. Santa Maria: Editora UFSM, 2003. cap. 5, p. 130-140. TRONCO, V.M. Manual de Inspeção da Qualidade do Leite. 4ª ed. Santa Maria: Editora UFSM, 2010.