lívia do carmo silva
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
E SAÚDE PÚBLICA
LÍVIA DO CARMO SILVA
Resposta de Paracoccidioides a compostos candidatos a antifúngicos: Ensaios in
vivo e in vitro
Goiânia 2014
ii
TERMO DE CIÊNCIA E DE AUTORIZAÇÃO PARA DISPONIBILIZAR AS TESES
E
DISSERTAÇÕES ELETRÔNICAS (TEDE) NA BIBLIOTECA DIGITAL DA UFG
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1. Identificação do material bibliográfico: [x] Dissertação [ ] Tese
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Autor (a): Lívia do Carmo Silva
E-mail: [email protected]
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Vínculo empregatício do autor Aluna de Pós-graduação
Agência de fomento: Conselho Nacional de desenvolvimento
Cientifico
Sigla:
CNPQ
País: Brasil UF: Goiás CNPJ:
Título: Resposta de Paracoccidioides a compostos candidatos a antifúngicos: Ensaios in vivo e in vitro
Palavras-chave: Paracoccidioides spp, transcritoma, tiosemicarbazida, Morita-Baylis-Hillman
Título em outra língua: Response to Paracoccidioides candidates antifungal compounds: In vivo
and in vitro assay
Palavras-chave em
outra língua:
Paracoccidioides spp, transcriptome, Thiosemicarbazide, Morita-Baylis-
Hillman
Área de concentração: Microbiologia
Data defesa: (12/03/2014)
Programa de Pós-
Graduação:
Medicina Tropical e Saúde Pública
Orientador (a): Maristela Pereira
E-mail: [email protected]
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disponibilizados durante o período de embargo.
iii
LÍVIA DO CARMO SILVA
Resposta de Paracoccidioides a compostos candidatos a
antifúngicos: Ensaios in vivo e in vitro
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás para obtenção do Título de Mestre em Medicina Tropical e Saúde Pública.
Orientadora: Dra Maristela Pereira
Goiânia 2014
iv
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação na (CIP)
Do Carmo Silva, Livia
Resposta de Paracoccidioides a compostos candidatos a antifúngicos:
Ensaios in vivo e in vitro [manuscrito] / Livia Do Carmo Silva. - 2014.
XI, 77 f.: il.
Orientador: Profa. Dra. Maristela Pereira.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Goiás, Instituto de Patologia
Tropical e Saúde Pública (IPTSP) , Programa de Pós Graduação em Medicina
Tropical e Saúde Pública, Goiânia, 2014.
Bibliografia. Anexos.
Inclui siglas, abreviaturas, símbolos.
1. Paracoccidioides. 2. Transcritoma. 3. Tiossemicarbazida. 4. Morita-
Baylis-Hillman. I. Pereira, Maristela, orient. II. Título.
v
Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás
BANCA EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
Aluna: Lívia do Carmo Silva
Orientadora: Dra. Maristela Pereira
Membros
Dr. Alexandre Melo Bailão - Instituto de Ciências Biológicas II - UFG
Dra. Célia Maria de Almeida Soares - Instituto de Ciências Biológicas II - UFG
Suplentes
Dr. Clayton Luiz Borges - Instituto de Ciências Biológicas II - UFG
Dra. Lilian Cristiane Baeza - Instituto de Ciências Biológicas II – UFG
Dra. Patrícia Fernanda Zambuzzi Carvalho
Data: 12.03.2014
vi
Aos meus pais e a minha graciosa família,
vii
AGRADECIMENTOS
À Deus e a minha Nossa Senhora Aparecida pela oportunidade de viver, pela
grande proteção e por responderem aos meus clamores.
Aos meus pais, exemplo de luta, força e caráter. Mãe e pai, obrigada por
sonhar, chorar, vibrar comigo.
Ao meu irmão Wender, lindo homem, de coração cheio de ternura.
À minha irmã Letícia e Silvio pela força. Letícia obrigada pela mensagem no
dia da minha prova de mestrado, que me acalmou tanto... “acredite é hora de vencer. É
essa força que vem dentro de você. Você pode até tocar o céu se crer”.
À Francielle, exemplo de humildade e perseverança. Obrigada por essas duas
pérolas Lalesca e Lerrander que tornam meus dias tão cheios... de alegria. Obrigada
por torcer por mim.
À meu maravilhoso companheiro, meu anjo Daniell, seus lindos olhos verdes me
enlouquecem, sua inteligência e perspicácia me inspiram.
Ao meu avô Aramizo, pelos financiamentos... quero você assim pertinho de mim,
desse jeitinho assustado, mesmo na falta de mobilidade, só para poder cuidar de você.
À minha vozinha, Dona nenzica, que mesmo não estando perto de mim
fisicamente, tenho certeza de que está recebendo estes agradecimentos e torcendo por
mim. Vó não virei médica, mas estou quase virando Doutora. Saudade!!!
Ao meu sogro e sogra, por terem me recebido em sua casa com todo carinho no
início de minha caminhada;
À minha amiga Rosângela, pela força e informações sobre como fazer um
mestrado. Obrigada pelos momentos de conversa.
Aos meus amigos, meus irmãos de coração, Daniele, Dr. Neto, Felipe, Isabela
Cristina, Joyce, Kleber, Thaylla, Juliana De curcio, Leandro, Lucas Nojosa, Lucas
Oliveira, Sheylla, Paulinha, Carla, Igor, meus companheiros de bancada,
À minha flor Renata, quanta paciência ao ensinar, quanta sensibilidade ao
ouvir, quanta luz reflete de você FLOR! Obrigada linda por ter me ensinado a dar os
primeiros passos na bancada!
Aos companheiros do Laboratório de Biologia Molecular, que considero como
minha segunda família.
Ao professor Sinji, pela atenção e disponibilidade.
Aos professores do Laboratório de Biologia Molecular que muito contribuíram
para o desenvolvimento dos experimentos durante o mestrado.
À professora Célia Maria, pela eficiência na administração do Laboratório.
À professora Maristela, minha orientadora, exemplo de compromisso e
dedicação. Agradeço pelas suas orientações, não apenas as orientações para obtenção
destes resultados do mestrado, mas orientações que mudaram meu jeito de pensar e
agir. Você abriu um caminho da verdadeira prosperidade, a constante reflexão interior.
Minha admiração e carinho me faz almejar sempre estar ao seu lado.
viii
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
1.1 Paracoccidioides spp. 1
1.2 Paracoccidioidomicose 3
1.3 Abordagens terapêuticas da PCM 5
1.4 Transcritoma na elucidação dos mecanismos de ação 8
de antifúngicos e potenciais alvos terapêuticos de Paracoccidioides
1.5 Adutos Morita-Baylis-Hillman 10
1.6 Tiossemicarbazida 11
2. JUSTIFICATIVA 12
3. OBJETIVO GERAL 13
3.1 Objetivos específicos 13
4. MANUSCRITO 14
Transcriptional profile of Paracoccidioides in response to
terpene Thiosemicarbazide
5. ANEXO 1
Morita Baylis Hillman: Atividade biológica em células de Paracoccidioides 62
6. DISCUSSÃO 82
7. CONCLUSÃO 87
8. PERSPECTIVAS
7.1 Tiossemicarbazida derivada do canfeno 88
7.2 Adutos Morita-Baylis-Hillman 88
9. REFERÊNCIAS 89
ix
SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIATURAS
ADP: adenosina difosfato
ATP: adenosina trifosfato
CFM: Concentração Fungicida Mínima
CIF: Concentração Inibitória Fracionada
CIM: Concentração Inibitória Mínima
CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute
DMSO: Dimetilsulfóxido
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
FADH2: flavina-adenina dinucleotideo
HIV: human immunodeficiency vírus
ICL: Isocitrato liase
MBHA: Adutos Morita-Bayllis-Hillman
MLS: Malato sintase
NADH: nicotinamida adenina dinucleotideo
PAS: Periodic acid-Schiff
PBS: Phosphate buffered saline
PCM: Paracoccidioidomicose
ROS: reactive oxygen species
RPMI: Roswell Park Memorial Institute
SD: standard deviation
SPP: espécies
TCA: Ciclo do ácido tricarboxílico
XTT: 2,3-Bis-(2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl)-2H-Tetrazolium-5-Carboxanilide
x
RESUMO
Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose humana granulomatosa sistêmica
causada por fungos do gênero Paracoccidioides, geograficamente restrita aos países da
América Latina. A inalação de conídios e fragmentos de micélios, formas infectantes
do fungo, é a frequente via de infecção. O tratamento da PCM é realizado com a
administração por tempo prolongado de antifúngicos anfotericina B, sulfonamidas e da
classe dos azólicos, os quais são tóxicos. Nesse sentido, surge a necessidade de
identificação e caracterização de novos alvos para drogas antifúngicas em
Paracoccidioides bem como a busca de novos compostos antifúngicos obtidos de fontes
naturais ou através de síntese química. Com o objetivo de elucidar a resposta de
Paracoccidiodies à tiossemicarbazida derivada do canfeno, foi realizada a análise do
perfil transcricional do fungo após 8 horas de contato com tiossemicarbazida. Os
resultados demonstram que Paracoccidioides induziu genes relacionados ao
Metabolismo, ciclo celular e processamento de DNA, Biogêneses de componentes
celulares, mecanismo de transdução de comunicação celular / sinal, defesa e virulência,
energia, síntese de proteínas, destino de proteínas (Enovelamento, modificação pós-
traducional), transcrição e proteínas não classificadas. Em adição inibiu intensamente
genes relacionados à síntese proteica. Com o objetivo de conhecer a atividade biológica
de seis compostos sintetizados através da reação de Morita-Baylis-Hillman, foi
realizado ensaios de concentração inibitória mínima, citotoxidade e potencial
hemolítico, interação com antifúngicos já utilizados no tratamento da PCM. Os adutos
Morita-Baylis-Hillman interferiram no crescimento do fungo de forma dose-
dependente, promoveu a diminuiu a atividade de desidrogenases mitocondriais e
apresentou interação sinérgica com Bactrim. Nenhuma atividade hemolítica foi
observada apesar da alta toxicidade encontrada e nenhuma inibição da malato sintase.
Os resultados demostram a potencialidade destes compostos como candidatos a
antifúngicos.
xi
ABSTRACT
Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous human mycosis
caused by fungi of the genus Paracoccidioides, geographically restricted to Latin
America. Inhalation of spores and fragments of mycelia, infective forms of the fungus,
is a common route of infection. The PCM treatment is performed with the prolonged
administration of antifungal amphotericin B, the class of sulfonamides and azoles,
which are toxic. In this sense, there is a need for the identification and characterization
of novel targets for antifungal drugs in Paracoccidioides well as the search for new
antifungal compounds from natural or obtained by chemical synthesis sources. In order
to elucidate the response of Paracoccidiodies the thiosemicarbazide derivative of
camphene, analysis of the transcriptional profile of the fungus was performed after 8 hs
of contact with thiosemicarbazide. The results demonstrate that Paracoccidioides
induced genes related to metabolism, cell cycle and DNA processing, Biogenesis of
cellular components, cell transduction / signal, defense communication and virulence,
energy, protein synthesis, protein fate (folding, modification, destination mechanism),
translation, and proteins not classified. In addition intensely inhibited genes related to
protein synthesis. In order to evaluate the biological activity of six compounds
synthesized by the reaction of Morita- Baylis- Hillman was realized to minimal
inhibitory concentration assays, cytotoxicity and hemolytic potential, interaction with
antifungal agents already used in the treatment of PCM. The Morita-Baylis-Hillman
adducts interfered on fungal growth in a dose-dependent manner, promoted the
decreased activity of mitochondrial dehydrogenases and showed synergistic interaction
with bactrim. No hemolytic activity was observed despite the high toxicity found and no
inhibition of Malate sintase. The results demonstrate the potential of these compounds
as candidates antifungal.
12
1 INTRODUÇÃO
1.1 Paracoccidioides spp.
O fungo patogênico Paracoccidioides spp., descrito por Adolfo Lutz em 1908, é
o agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica que afeta
humanos, caracterizada como uma infecção granulomatosa e crônica, sendo
geograficamente restrita aos países da América Latina (Shikanai-Yasuda et al. 2006).
O fungo é pertencente ao reino Fungi, filo Ascomycota, subdivisão
Euascomycotina, classe Plectomyceto, subclasse Euascomycetidae, ordem Onygenales,
família Onygenaceae, subfamília Onygenaceae Anamórficos, gênero Paracoccidioides
(San-Blas et al. 2002). Após análises morfológicas e moleculares, quatro espécies estão
classificadas no gênero Paracoccidioides: S1 e PS2 com ocorrência restrita às áreas
geográficas da Argentina, Brasil, Peru, Paraguai e Venezuela, PS3 à Colômbia e
Paracoccidioides lutzii, também conhecido como ‘Pb01-like’ à região central do Brasil
(Matute et al. 2006, Theodoro et al. 2008, Teixeira et al. 2009) e PS4 (Teixeira et al.
2014). No Brasil, o fungo é frequentemente encontrado nas regiões Sul, Sudeste e
Centro-Oeste (Paniago et al. 2003, Bittencourt et al. 2005, Bellissimo-Rodrigues et al.
2011).
Figura 1. Distribuição geográfica de Paracoccidioides spp.. Ocorrência das espécies S1, PS2, PS3 e
P. lutzii. Fonte: Modificado de Theodoro et al. 2012.
13
O nicho ecológico de Paracoccidioides spp. não está totalmente elucidado, mas
evidências levam a determinar que o fungo viva saprofiticamente na natureza,
preferencialmente em áreas subtropicais da América Central e do Sul, onde o ambiente
é úmido, com temperaturas médias anuais entre 18ºC a 24ºC e índices pluviométricos
elevados (Restrepo 1985, Lacaz et al. 2002, Bagali et al. 2008), e que o solo seja um
elemento importante na ecologia do patógeno devido aos isolamentos constantes do
fungo neste ambiente (Terçarioli et al. 2007). A participação de espécies de animais
domésticos e selvagens na ecoepidemiologia da PCM não é conclusiva, sendo restrita
apenas a relatos de isolamento do fungo em pinguins (Garcia et al.1993), tatus (Vergara
et al. 1999, Corredor et al. 2005), cachorros (Ricci et al. 2004, De Farias et al. 2011) e
primatas (Corte et al. 2007).
Paracoccidioides spp. apresentam termodimorfismo, crescendo na forma
miceliana em condições saprófitas ou quando cultivado à temperatura ambiente (18-
23°C) e na forma leveduriforme nos tecidos do hospedeiro ou quando cultivado à 36°C
(Restrepo et al. 1985, Brummer et al. 1993, Bagagli et al. 2006). Além da temperatura,
outro fator que influência esta transição é o hormônio 17-β-estradiol (Salazar et al.
1998) o qual modula a expressão de genes relacionados à categorias funcionais, tais
como resposta ao choque térmico, manutenção e remodelação da parede celular,
metabolismo energético, sinalização celular e fatores de virulência (Shankar et al.
2011). O processo de transição morfológica de Paracoccidioides spp. é foco de várias
análises transcricionais, sendo caracterizado pela indução de genes relacionados à
remodelação da parede celular e membrana, metabolismo e fatores de virulência que são
potenciais candidatos a alvos para novos fármacos (Felipe et al. 2005, Bastos et al.
2007, Parente et al. 2008).
Morfologicamente, Paracoccidioides spp. assume a forma leveduriforme no
hospedeiro, definida como fase parasitária, e a forma de micélio no ambiente, fase
infecciosa (Bagagli et al. 2006). As células leveduriformes, no aspecto microscópico,
são multinucleadas, arredondadas, com brotamentos múltiplos e parede celular
birrefringente. A forma miceliana apresenta uma organização pluricelular formada por
filamentos de células, as hifas, que são finas, septadas, podendo apresentar esporos
terminais. Células com blastoconídios simples ou múltiplos, gerados por germinação
conferem ao fungo a característica primordial em sua identificação: o aspecto de “roda
de leme” (Restrepo et al.1989, Brummer et al. 1993).
14
Figura 2. Microscopia confocal demonstrando a morfologia de Paracoccidioides isolado Pb01. As
figuras A e B demonstram o aspecto leveduriforme, enquanto C e D revelam a forma miceliana do fungo
Paracoccidioides (Fonte: Henrique Leonel Lenzi & Benedito R. da Silva Neto).
1.2 Paracoccidioidomicose
Paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose que manifesta comumente como
uma pneumopatologia de curso crônico, associada a lesões da mucosa e pele, podendo
disseminar através da corrente sanguínea ou linfática acometendo outros órgãos e
sistemas como fígado, baço, ossos e sistema nervoso central (Valera et al. 2008, Silva -
Vergara et al. 2014, Barbosa et al. 2014). A inalação de conídios e fragmentos de
micélios, formas infectantes do fungo, é a frequente via de infecção (McEwen et al.
1987, Brummer et al. 1993, San Blas et al. 2002). Nos pulmões, sob efeitos da
temperatura corpórea do hospedeiro, uma série de proteínas são ativadas, conduzindo a
uma reorganização metabólica, o que permite a transformação da forma infectante para
parasitária (Borges-Walmsley et al. 2002, Rezende et al. 2011, Borges et al. 2011).
Em indivíduos com resposta imunológica eficiente, o desenvolvimento da
infecção pode ser contido, não havendo nenhuma manifestação. Porém o fungo é capaz
de permanecer no hospedeiro, em estado latente e após um período, progredir e dar
origem as formas crônicas no adulto (reativação endógena). Menos frequentemente, a
doença pode progredir já do foco primário originando a forma aguda-subaguda na
infância e adolescência (Londero 1986, Grossklaus et al 2009). A PCM é classificada
em forma aguda e subaguda (tipo juvenil) predominante em pessoas jovens de ambos os
sexos e forma crônica (tipo adulta) predominante em indivíduos adultos (Franco et al.
15
1987, Marques 2003). A forma aguda ou subaguda pode ser moderada ou severa,
destacando a presença de linfonodomegalias superficiais e profundas,
hepatoesplenomegalia, anemia, febre e emagrecimento. A forma crônica pode ser uni ou
multifocal dependendo da evolução e da localização das lesões; apresenta um amplo
espectro de manifestações clínicas com lesões predominantes no pulmão e mucosa
orofaríngea, podendo também causar lesões granulomatosas no sistema nervoso central
(Almeida et al. 2004, Yasuda et al. 2006, Ramos e Silva et al. 2008, Queiros- Telles et
al. 2011).
A PCM tem caráter incapacitante e com alta taxa de mortes prematuras, o que
faz dela um problema de saúde pública, de grande repercussão socioeconômica (Mendes
et al. 2003, Shikanai-Yasuda et al. 2006). O maior número de casos ocorre
principalmente em indivíduos entre 30 a 50 anos de idade, do sexo masculino (Londero
& Ramos 1990, Blotta et al. 1999, Marques et al. 2007) e trabalhadores rurais
residentes em áreas endêmicas, que estão em contato direto com a terra e vegetais,
inalando aerossóis contendo conídios fúngicos (Franco et al. 2000, Shikanai-Yassuda et
al. 2006).
Na clínica, o diagnóstico de PCM é considerado simples, porém o grande
número de outras afecções com as quais pode ser confundida acaba dificultando o
diagnóstico conclusivo. A forma crônica exige diagnóstico diferencial com doenças que
envolvem as mucosas como câncer, leishmaniose, cutâneo-mucosa, sífilis secundária ou
terciária, sarcoidose, histoplasmose e tuberculose (Pato et al. 2007, Quagliato et al.
2007), além dos tumores intra-abdominais (Lima et al. 2013).
O diagnóstico laboratorial é através de culturas e isolamento do fungo. O exame
direto utilizando colorações de Groccott - Gomori e PAS permite a visualização de
formas leveduriformes com múltiplos brotamentos (De Souza Vianna et al. 2013). A
sorologia, além de diagnóstica, tem a função de acompanhamento durante e pós-
tratamento, através do exame laboratorial de imunodifusão dupla em gel de ágar e
ensaio imunoenzimático (ELISA), que tem demonstrado alta sensibilidade (Del Negro
et al. 2000, Lacaz et al. 2002). O substrato antigênico, parte fundamental da técnica, é a
glicoproteína de 43kDa - gp 43 (De Camargo, 2008). Esse antígeno está presente em
grandes concentrações em pacientes acometidos com a forma aguda da PCM,
consequentemente, estes pacientes apresentam elevadas concentrações de anticorpos
anti-gp 43 (Mendes Giannini et al. 1990, Blotta & Camargo 1993).
16
Acredita-se que a incidência anual de PCM em áreas rurais endêmicas varia
entre 1-3 novos casos/100.000 habitantes, sendo considerada a terceira maior causa de
morte por doença infecciosa crônica; a taxa de mortalidade por PCM é de 1,65 casos /
população 1.000.000 habitantes (Shikanai-Yasuda et al. 2006). O Brasil é responsável
pela maioria dos casos de PCM descritos na literatura. De 1980 a 1999 foi evidenciado
no estado de Mato Grosso do Sul 422 casos (Paniago et al. 2003). Em Goiás no período
de 2000 a 2006 foram diagnosticados 77 casos de PCM (Ferreira et al. 2012), no Paraná
de 1980 a 1998 foram reportadas 551 mortes por PCM e102 casos de 2008 a 2009
(Bittencourt et al. 2005, Loth et al. 2011), em São Paulo 1000 casos foram descritos de
1960 a 1999 (Bellissimo et al. 2011). Esta análise é relevante para entender a real
situação da PCM no Brasil, pois não há notificação obrigatória dos pacientes
diagnosticados com esta micose no sistema oficial de saúde (Martinez 2010). Em Goiás
deverá ser elaborada uma ficha de investigação de casos, e estes deverão ser notificados
à SES, como já ocorre em alguns estados, como Paraná, Rondônia e Mato Grosso do
Sul (SCG Goiás, 2012).
1.3 Abordagens Terapêuticas da PCM
A problemática do tratamento da PCM está na toxidade, custo e o tempo do
tratamento. Apesar de eficazes, os fármacos disponíveis apresentam vários efeitos
adversos, além de serem prescritos por meses e anos, ocasionando frequente desistência
dos pacientes (Marques 2003, Hahn et al. 2003 ). O sucesso da terapia depende tanto do
antifúngico utilizado, como do grau de disseminação das lesões e da capacidade
imunológica do paciente. A regressão das alterações clínicas é observada entre um e seis
meses após o início do tratamento. A erradicação do fungo nos tecidos é lenta, sendo
necessária a avaliação periódica dos pacientes quanto aos sintomas e desaparecimento
das lesões ativas, para evitar reincidivas (Araújo et al. 2009).
O tratamento contra a PCM é realizado com administração de anfotericina B,
sulfonamidas e antifúngicos da classe dos azólicos, tais como cetoconazol, itraconazol e
fluconazol (Yasuda et al. 2006, Travassos et al. 2008). Além dos antifúngicos, o
suporte nutricional, tratamento de eventuais sequelas e a prevenção de doenças
oportunistas devem ser consideradas no paciente (Yasuda et al. 2006, Ramos-e-Silva &
Saraiva 2008, Fiol et al. 2013).
17
Os derivados sulfamídicos são usados desde a década de 40. Atualmente, a
forma mais amplamente utilizada é a associação de sulfametoxazol-trimetoprim, que
apesar da menor eficácia em comparação com os demais antifúngicos utilizados na
terapia da PCM, possuem custo relativamente baixo e disponível na rede pública. A
sulfametoxazol-trimetoprim é indicada nos casos mais leves da doença, prescrita por
dois a cinco anos, e também como terapia de manutenção, seguindo o esquema de
administração: dose inicial com 3 comprimidos (80/400 mg) a cada 12 h por 21 dias, 2
comprimidos a cada 12 h por 21 dias ou 1 comprimidos a cada 12 h por 2 anos.
(Brummer et al. 1993, Marques 2003, Shikanai-Yasuda et al. 2006). As sulfonamidas
atuam inibindo a síntese de ácido fólico competindo com o ácido p-aminobenzóico na
reação catalisada pela dihidropteroato sintase, que envolve a condensação de ácido p-
aminobenzóico e 6-hidroximetil-dihidropterina pirofosfato para produzir
dihidropteroato. A inibição dessa reação leva à depleção de folato intracelular, o qual é
essencial para o crescimento do organismo patogênico (Hong et al.1995).
A anfotericina B, segundo fármaco introduzido no tratamento da PCM é
indicada nos casos mais graves da doença devido a sua elevada toxicidade sistêmica,
administrando a dose de 1 mg/kg/dia, sendo possível até 1-2 g. Juntamente com
sulfametaxazol é indicada como manutenção pelo período de 1 a 3 anos (Shikanai-
Yasuda et al. 2006). Anfotericina B apresenta baixa seletividade, podendo causar
nefrotoxicidade e distúrbios eletrolíticos, levando à morte por falência renal e por
arritmia cardíaca (Sabra et al. 1990, Carrilho-Munõz et al. 2006, Samuel et al. 2011).
Anfotericina B atua aumentando a permeabilidade da membrana plasmática por se
ligarem ao ergosterol, esterol presente na membrana de fungos, comprometendo a
integridade da membrana, e levando à morte celular (Beauvais & Latgé 2001, Gallis et
al. 2001). Novas formulações de anfotericina B foram desenvolvidas com o objetivo de
diminuir a nefrotoxicidade, enquanto se mantém a eficácia. A primeira destas
formulações lipídicas é a anfotericina B em dispersão coloidal. A segunda formulação é
a anfotericina lipossomal. A terceira formulação é o complexo lipídico de anfotericina
B. No entanto, essas formulações são mais caras que a anfotericina convencional (Barrat
al. 2007, Lewis et al. 2010, Hamill et al. 2013, Jyotsna et al. 2013).
Outro fármaco comumente usado no tratamento da PCM é o itraconazol, agente
antifúngico pertencente à classe dos azóis. Altas doses são administradas por longo
período, 200 mg/dia por 6-9 meses, causando hepatotoxicidade e efeitos colaterais como
náusea, cólica abdominal, diarreia e dores de cabeça. (Catalán et al. 2006). O
18
itraconazol age no citocromo P450 fúngico, o qual está envolvido na 14α-demetilação
da molécula de lanosterol, é fundamental para a biossíntese de ergosterol, que mantém
a estabilidade da membrana plasmática (Shikanai-Yasuda et al. 2006, Sanglard, 2002).
É fato que vários problemas relacionados aos antifúngicos atuais têm sido
evidenciados, principalmente no que diz respeito à toxicidade (Gullo et al. 2013).
Apesar da existência de potentes agentes antifúngicos, isolados resistentes ou multi-
resistentes continuam surgindo (Hahn et al. 2003, Lelièvre et al. 2013). Em
Paracoccidiodies spp. foram encontrados homólogos para CDR1, CDR2 e MDR1 de
Candida albicans, PDR5 de Saccharomyces cerevisiae e o gene AtrF de Aspergillus
spp., todos eles relacionados com a resistência a azóis. Assim, como o tratamento atual
para PCM utiliza principalmente derivados azólicos, esses genes podem desempenhar
um papel similar em Paracoccidioides spp. com possibilidade do surgimento de isolado
resistente (Costa et al. 2005), tornando-se necessária a busca permanente por novos
candidatos a antifúngicos e consequente pesquisa por novas substâncias bioativas.
Nesse sentido, nosso grupo tem investido esforços na identificação e
caracterização de novos alvos para drogas antifúngicas em Paracoccidioides spp. bem
como na busca de novos compostos antifúngicos obtidos de fontes naturais ou através
de síntese química (Zambuzzi et al. 2013, Santana et al. 2012, Tomazett et al. 2010).
Entre os compostos sob investigação está oenoteína B, obtido da planta Eugenia
uniflora, o qual apresenta efeito antiproliferativo em Paracoccidioides spp., inibindo a
expressão do transcrito de 1,3--glicana sintase e induzindo alterações morfológicas no
fungo (Zambuzzi et al. 2013). Em adição, estudos estão sendo desenvolvidos com
tiossemicarbazida derivada do canfeno, a qual inibiu consideravelmente o crescimento
de Paracoccidioides spp.. Essa inibição foi maior na presença dos antifúngicos
anfotericina B, itraconazol e sulfametoxazol. Outro composto em estudo é a
argentilactona, obtido da planta Hyptis ovalifolia, que inibiu a atividade da enzima
isocitrato liase de Paracoccidioides spp. (PbICL) nativa e recombinante (Vilar et al.
submetido; Patente n 221005214888). Isocitrato liase é uma enzima chave do ciclo do
glioxilato, presente em fungos e ausente em humanos. PbICL é induzida em
Paracoccidioides spp. durante o processo infeccioso (Costa et al. 2007) e durante
transição de micélio para levedura (Bastos et al. 2007). Argentilactona também inibiu a
transição de micélio para a fase de levedura, processo necessário para o estabelecimento
da infecção.
19
1.4 Transcritoma na elucidação dos mecanismos de ação de
antifúngicos e potenciais alvos terapêuticos de
Paracoccidioides spp.
O mecanismo de ação de agentes antifúngicos é variado, necessitando de
informações a respeito do modo de atuação. Novas abordagens para caracterizar o
mecanismo de ação de agentes antifúngicos e de novos protótipos bioativos são úteis no
processo de desenvolvimento de fármacos alvo específicos. Análises proteômicas e
transcritômicas, modelagem molecular e biossimulação agregam valores no
desenvolvimento racional de fármacos (Rodriguez et al. 2007, Dopazo 2013).
Um dos caminhos pelos quais as células se ajustam a mudanças ambientais é
através da alteração do padrão de expressão de genes. Assim, a medida de mudanças na
expressão de genes em exposição a antifúngicos pode ajudar a determinar como os
antifúngicos e candidatos a antifúngicos trabalham em células e organismos. Nesse
sentido, alterações no perfil de expressão de genes de fungos têm sido estudadas (Liu et
al. 2005, Ferreira et al. 2006). A análise do transcritoma de Aspergillus fumigatus
exposto ao voriconazol auxiliou no entendimento da resistência a este antifúngico
(Ferreira et al. 2006). Estudos utilizando microarranjos avaliaram o perfil transcricional
de Trichophyton rubrum em resposta a cetoconazol e anfotericina B, interligando os
resultados com os mecanismos de ação conhecidos (Yu et al. 2007). Análise do perfil
genômico foram realizadas para avaliar o efeito da anfotericina B em Saccharomyces
cerevisiae (Bammert et al. 2000) e de itraconazol em Trichophyton rubrum (Diao et al.
2009). Zambuzzi et al. (2009) utilizou a análise transcritômica para avaliar a resposta de
Paracoccidiodies spp. na presença de oenoteína, o que auxiliou no entendimento do
modo de atuação deste composto.
O mapeamento dos genes expressos por Paracoccidioides spp. em diferentes
condições tem sido constantemente descritos, levando ao conhecimento do seu genoma
e potenciais alvos para antifúngicos (Felipe et al. 2005, Bailão et al. 2006, Costa et al.
2007, Borges et al. 2011). Assim, inibidores para esses genes/proteínas podem gerar
antifúngicos mais efetivos, seguros e com menos efeitos colaterais para o homem.
Em Paracoccidioides spp. há duas enzimas, malato sintase (PbMLS) e isocitrato
liase (PbICL), as quais são promissores alvos de antifúngicos, por existirem apenas no
patógeno e não no hospedeiro humano (Selitrennikoff &Nakata 2003). Estas enzimas
são únicas do ciclo do glioxilato, o qual utiliza compostos de 2 carbonos para a síntese
20
de glicose, disponibilizando substratos para as reações de biossíntese (Lorenz & Fink
2001). PbMLS é importante no processo infeccioso do Paracoccidioides spp., visto que
sua transcrição é induzida durante a transição de micélio para levedura no processo de
fagocitose por macrófagos murinos. Ainda, PbMLS atua como uma adesina mediando a
ligação de células fúngicas ao hospedeiro contribuindo para a adesão do fungo aos
tecidos do hospedeiro e para a disseminação da infecção (Neto et al. 2009). Além disso,
PbMLS interage com as proteínas que se encontram em diferentes categorias
funcionais, tais como transporte celular, a síntese proteica, a modificação e degradação
de proteínas e transdução de sinal, sugerindo que ela desempenhe diferentes papeis no
fungo (Oliveira et al. 2013).
Outro alvo promissor para ação dos antifúngicos é a parede celular de
Paracoccidiodies spp. que desempenha um importante papel na interação com o
hospedeiro, de modo que a sua composição e estrutura podem determinam o curso da
infecção. Genes envolvidos no metabolismo da parede celular de Paracoccidiodies spp.
foram identificados como candidatos a alvos de antifúngicos tais como quitina sintases,
expressas durante a transição dimórfica (Nino-Vega et al. 2000), hidrofobinas,
(Albuquerque et al., 2004), manosil transferase, induzida principalmente na fase
parasitária de Paracoccidioides spp. (Costa et al. 2002), glucana sintase (Pereira et al.,
2000) e quitina deacetilase (Felipe et al. 2005).
A via de síntese de ergosterol tem sido muito utilizada como alvo para a busca
de antifúngicos. O ergosterol é o principal esterol das membranas de fungos, diferente
do esterol de mamíferos, sendo essencial para o seu crescimento e desenvolvimento,
tornando um importante alvo para a ação de quimioterápicos (Alcazar-Fuoli et al.
2013). Vários antifúngicos de uso clínico como os polienos, inibidores da síntese de
∆(24) esterol C-metiltransferase, e outros derivados azólicos, inibidores de lanosterol
14-α-desmetilase, alteram a permeabilidade e fluidez da membrana, deixando o fungo
vulnerável a danos (Dupont et al. 2012).
Moléculas que se comportam como adesinas são descritas como alvo de
antifúngicos, uma vez que o processo de adesão de micro-organismos às proteínas da
matriz extracelular é importante para o estabelecimento do processo infeccioso nos
tecidos do hospedeiro (Muller et al. 1999). Em Candida albicans, a deleção dos genes
ALS1 e ALS3, os quais codificam para proteínas capazes de influenciar na aderência do
fungo (Sheppard et al. 2004, Filler 2006), resultou na redução da capacidade de
aderência dos mutantes às células endoteliais da veia umbilical humana e células de
21
epitélio bucal, em relação ao tipo selvagem (Zhao et al. 2004). Paracoccidioides spp.
possui adesinas, tais como, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase (Barbosa et al. 2006),
malato sintase (Silva-Neto et al. 2009), triosefosfato isomerase (Pereira et al. 2007),
enolase (Donofrio et al. 2009).
1.5 Tiosemicarbazidas
O emprego de pequenas moléculas de origem natural como fármacos ou como
protótipos de fármacos é um tema bem estabelecido no desenvolvimento de novos
medicamentos (Wilson & Danishefsky 2006). O sucesso desta estratégia reside na
especialização inerente à evolução bioquímica dos metabólitos secundários, resultado de
um longo processo de seleção natural para fins biológicos. Assim, características como
seletividade, potência e farmacocinética, entre outros, colocam os produtos naturais e
seus derivados em posição de vantagem quando do desenvolvimento de novos
medicamentos. Entretanto, para que um fármaco derivado de bioproduto seja inserido
na cadeia produtiva, o produto natural deve ser facilmente disponível por método
extrativo ou facilmente preparado. Neste contexto, os terpenos assumem papel de
destaque devido à sua disponibilidade no mercado nacional (Silva Santos et al. 2006).
Apesar destes aspectos, o emprego de terpenos no desenvolvimento de fármacos ainda é
tênue.
O canfeno é um produto natural extraído da espécie Cinnamomum camphora,
popularmente conhecida como cânfora. A tiosemicarbazida é obtida a partir do produto
natural canfeno, um derivado terpeno sintético. A tiosemicarbazida inibe o crescimento
de Trichophyton mentagrophytes danificando a estrutura da parede celular ou
interferindo na sua formação durante o processo de divisão celular, crescimento ou
morfogênese (Yamaguchi et al. 2009).
Em função do reconhecido potencial farmacológico de tiosemicarbazida, a
associação deste importante grupo farmacofórico com bioprodutos que apresentem
características de evolução bioquímica especializada, emerge como estratégia
promissora no desenvolvimento de novos fármacos. Seguindo a estratégia de combinar
moléculas ativas para estudar o efeito cooperativo buscando novas moléculas com
atividades biológicas, o grupo de Síntese Orgânica do Instituto de Química da UFG em
colaboração com o grupo de Síntese Orgânica da Universidade Estadual de Maringá
22
sintetizou em laboratório as tiosemicarbazidas derivadas do canfeno (Soares et al.
2007).
1.6 Adutos Morita-Baylis-Hillman
A reação, conhecida desde 1972, pode ser definida como uma reação que resulta
na formação de uma ligação carbono-carbono entre carbonos eletrofílicos (geralmente
um aldeído) e a posição α de uma olefina contendo um grupo retirador de elétrons,
EWG, ativada por um catalisador (Morita et al.1968, Baylis & Hillman 1972),
fornecendo moléculas polifuncionais conhecidas como adutos Morita-Baylis-Hillman
(MBHA) (Das et al. 2006). As suas características experimentais refletem aspectos
relevantes, quando da elaboração de uma proposta sintética, tais como o custo e
disponibilidade dos reagentes, com vantagens de economia de átomos, já que todos os
átomos são incorporados no produto (Marcelli et al. 2006), e a possibilidade de
execução da reação em meio aquoso ou na ausência de solvente, conferindo assim, o
título de reação limpa (“green chemistry” ou química sustentável) (Lenardão et al.
2003).
Alguns MBHAs tem mostrado ativos contra Plasmodium falciparum (Kundu et
al. 1999, Narender et al. 2005), Biomphalaria glabrata (Vasconcellos et al. 2006) e
Leishmania amazonenses (De Souza et al. 2007). A compreensão dos mecanismos
biológicos de ação desta nova classe de moléculas está ainda em fase inicial e o foco
está na seleção de experimentos verdes e mais baratos para o desenvolvimento de
fármacos. O interesse em trabalhar com os MBHAs se deu pela potencialidade destes
compostos como inibidores de proliferação celular de micro-organismos e devido à
semelhança estrutural com compostos inibidores da enzima PbMLS como alvo
promissor a candidatos antifúngicos (Neto et al. em preparação).
23
2. JUSTIFICATIVA
As limitações dos antifúngicos terapêuticos têm se tornando cada vez mais
evidentes na clínica, devido à sua moderada eficácia contra infecções fúngicas
sistêmicas, potencialmente fatais. Esses antifúngicos pertencem a apenas algumas
classes estruturais que afetam uma pequena gama de alvos; alguns são muito tóxicos em
humanos, enquanto o uso de outros, particularmente os medicamentos azólicos, tem
incentivado o surgimento de isolados clínicos resistentes. No Brasil, as mortes causadas
por micoses sistêmicas atingiram um número de 3.583 entre 1996-2006, sendo a PCM
responsável por 51,2% dos casos. Atualmente a terapia da PCM é um processo lento,
realizada com a administração, por meses ou anos de antifúngicos que apresentam
limitações em relação à eficácia e toxicidade, causando uma frequente desistência do
paciente, o que torna a pesquisa por novos potenciais antifúngicos extremamente
relevantes para a saúde pública.
A descoberta ou síntese de uma molécula com potencial ativo e a sua correlação
com o alvo biológico apropriado constitui o início do processo de pesquisa e
desenvolvimento racional de fármacos. Assim, técnicas genômicas estão sendo
aplicadas a fungos com o objetivo de obter uma visão integrada da biologia e de extrair
alvos adequados para a descoberta de drogas.
O fato de a tiosemicarbazida inibir o crescimento de Paracoccidiodies spp. e ter
baixa citotoxidade sugere que esse composto possa ser um bom candidato a agente
antifúngico, tornando-se relevante a elucidação do seu mecanismo de ação.
Devido ao baixo custo de síntese, os potenciais efeitos bioativos dos compostos
sintetizados através da reação verde de Morita-Baylis-Hillman, e ao fato desses
compostos serem ativos contra outros organismos, surge a necessidade de conhecer seu
potencial frente à Paracoccidiodies spp..
24
3 OBJETIVO GERAL
Analisar os efeitos e resposta de Paracoccidioidess sp. à tiossemicarbazida e MBHAs.
3. 1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Visando analisar a resposta de Paracoccidioides sp. à tiossemicarbazida, os
seguintes objetivos específicos são propostos:
Realizar a anotação funcional dos genes induzidos e reprimidos na
presença do composto tiossemicarbazida;
Validar os genes alterados em Paracoccidioides sp. na presença
tiossemicarbazida através de PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR);
Avaliar a atividade da enzima superóxido dismutase;
Detectar espécies reativas de oxigênio;
Avaliar a fragmentação do DNA de Paracoccidioides sp.;
Analisar o ciclo celular de Paracoccidioides sp.;
Medir o potencial de membrana mitocondrial.
Visando avaliar o potencial dos MBHAs como agente inibidor do crescimento
de Paracoccidioides sp. são propostos os seguintes objetivos específicos:
Avaliar a atividade antifúngica dos MBHAs em Paracoccidioides;
Avaliar a citotoxidade dos MBHAs,
Avaliar a inibição da atividade da desidrogenases mitocondrial pelos
MBHAs;
Determinar o tipo de interação do MBHA-E1 com os antifúngicos
itraconazol, anfotericina b, bactrim e sulfametaxazol;
Avaliar a viabilidade de Paracoccidioides sp. na presença dos MBHAs;
Avaliar a atividade de PbMLS na presença dos MBHA.
MANUSCRITO
RESEARCH ARTICLE
Transcriptome Profile of the Response ofParacoccidioides spp. to a CampheneThiosemicarbazide DerivativeLívia do Carmo Silva1, Diana Patrícia Tamayo Ossa2, Symone Vitoriano daConceição Castro1, Ludmila Bringel Pires3, Cecília Maria Alves de Oliveira3,Cleuza Conceição da Silva4, Narcimário Pereira Coelho4, Alexandre Melo Bailão1, JulianaAlves Parente-Rocha1, Célia Maria de Almeida Soares1, Orville Hernández Ruiz2, Juan G.McEwen Ochoa2, Maristela Pereira1*
1 Laboratório de Biologia Molecular, Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública Universidade Federalde Goiás, Goiânia, Brazil, 2 Unidad de Biología Celular y Molecular, Corporación para InvestigacionesBiológicas (CIB) and Facultad de Medicina Universidad de Antioquia, Medellín, Colombia, 3 Laboratório deProdutos Naturais, Instituto de Química, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Brazil, 4 Laboratório deFitoquímica e Síntese Orgânica, Departamento de Química, Universidade Estadual de Maringá, Paraná,Brazil
AbstractParacoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous human mycosis caused by
fungi of the genus Paracoccidioides, which is geographically restricted to Latin America. Inha-
lation of spores, the infectious particles of the fungus, is a common route of infection. The
PCM treatment of choice is azoles such as itraconazole, but sulfonamides and amphotericin
B are used in some cases despite their toxicity to mammalian cells. The current availability of
treatments highlights the need to identify and characterize novel targets for antifungal treat-
ment of PCM as well as the need to search for new antifungal compounds obtained from natu-
ral sources or by chemical synthesis. To this end, we evaluated the antifungal activity of a
camphene thiosemicarbazide derivative (TSC-C) compound on Paracoccidioides yeast. Todetermine the response of Paracoccidioides spp. to TSC-C, we analyzed the transcriptional
profile of the fungus after 8 h of contact with the compound. The results demonstrate that
Paracoccidioides lutzii induced the expression of genes related to metabolism; cell cycle and
DNA processing; biogenesis of cellular components; cell transduction/signal; cell rescue,
defense and virulence; cellular transport, transport facilities and transport routes; energy; pro-
tein synthesis; protein fate; transcription; and other proteins without classification. Addition-
ally, we observed intensely inhibited genes related to protein synthesis. Analysis by
fluorescence microscopy and flow cytometry revealed that the compound induced the pro-
duction of reactive oxygen species. Using an isolate with down-regulated SOD1 gene expres-
sion (SOD1-aRNA), we sought to determine the function of this gene in the defense of
Paracoccidioides yeast cells against the compound. Mutant cells were more susceptible to
TSC-C, demonstrating the importance of this gene in response to the compound. The results
presented herein suggest that TSC-C is a promising candidate for PCM treatment.
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 1 / 25
a11111
OPEN ACCESS
Citation: do Carmo Silva L, Tamayo Ossa DP, CastroSVdC, Bringel Pires L, Alves de Oliveira CM,Conceição da Silva C, et al. (2015) TranscriptomeProfile of the Response of Paracoccidioides spp. to aCamphene Thiosemicarbazide Derivative. PLoS ONE10(6): e0130703. doi:10.1371/journal.pone.0130703
Editor: Oscar Zaragoza, Instituto de Salud Carlos III,SPAIN
Received: February 3, 2015
Accepted: May 23, 2015
Published: June 26, 2015
Copyright: © 2015 Silva et al. This is an openaccess article distributed under the terms of theCreative Commons Attribution License, which permitsunrestricted use, distribution, and reproduction in anymedium, provided the original author and source arecredited.
Data Availability Statement: The ESTs obtainedwere submitted to the National Center forBiotechnology Information (NCBI) under accessionnumbers: LIBEST_028508 Paracoccidioidesthiosemicarbazide Library.
Funding: This work performed at UniversidadeFederal de Goiás was supported by MCTI/CNPq(Ministério da Ciência e Tecnologia/ConselhoNacional de Desenvolvimento Científico eTecnológico), FNDCT (Fundo Nacional deDesenvolvimento Científico e Tecnológico), FAPEG(Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de
IntroductionParacoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis geographically restricted to LatinAmerica caused by thermodimorphic fungi of the genus Paracoccidioides. The fungi usuallyinfect the host through the respiratory tract by inhalation of conidia, which are the infectiouspropagules found in the environment. In the lungs, these propagules differentiate into thepathogenic form in a temperature-dependent manner, corresponding to the yeast phase ofthe fungus, and spreads to other organs through lymphohematogenous dissemination.Because this mycosis affects mainly rural males of working age between the ages of 30 and 50years, the disease has socioeconomic repercussions due to its potential to debilitate. In addi-tion to the lungs, PCM frequently compromises the mucous membranes, lymph nodes, liver,spleen and bone marrow [1,2].
Treating PCM remains a challenge due to the toxicity of the antifungals commonly usedto treat this mycosis—sulfonamides, azoles and polyenes [3,4]. Additionally, despite the useof antifungals, individuals with PCM have persistent latent foci, which slow down treatmentand may extend it over months or years depending on the severity of the disease and the siteof injury [5,6,7]. Thus, the need to research and develop new therapeutic approaches isincreasingly evident. With this aim, our group has invested effort into identifying and charac-terizing novel targets for antifungal drugs against Paracoccidioides spp. [8–16] and searchingfor new antifungal compounds obtained from natural sources or their synthetic derivatives[17,18,19].
The monoterpenoids are the components of essential oils, which are produced in largequantities by plants. These molecules are significant due to their therapeutic potential, lowcost as well as the commercial availability, being used as starting material for synthesis of bio-active compounds [20,21]. Following this approach a series of thiosemicarbazides and thiose-micarbazones deriving from bisabolol, kaurenoic acid, limonene and camphene weresynthetized by our research group [22,23,24]. Among them, the tiosemicarbazide camphenederivative (TSC-C) showed remarkable antifungal activity. The previous study showed thatTSC-C inhibited the growth of Trichophyton mentagrophytes by damaging the cell wall struc-ture or interfering with its formation during the process of cell division, growth or morpho-genesis [24]. Based on these results, we elected TSC-C to study its activity and mode of actionon Paracoccidioides brasiliensis.
We constructed a cDNA library to obtain expressed sequences tags (ESTs) from P. lutzii inresponse to TSC-C with the ultimate aim to identify the likely mode of action of the compoundin the fungus. We performed assays to confirm the transcriptome data to P. lutzii and Paracoc-cidioides brasiliensis, such as quantitative real-time PCR (qRT-PCR), fluorescence microscopy,DNA fragmentation, cell cycle analysis by flow cytometry and enzymatic assays.
Materials and Methods
General procedure for the preparation of compoundsThe TSC-C was prepared as described by Yamaguchi [24].
Microorganism and cell cultureThe P. lutzii ATCCMYA 826 and P. brasiliensis ATCC 60855 strains were used in the assays.Yeast cells were maintained in Fava-Netto liquid medium [25] for 3 days. The cells were thentransferred and grown overnight in McVeigh Morton (MMcM) liquid medium overnight [26]and subsequently used in experiments.
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 2 / 25
Goiás), CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamentode Pessoal de Nível Superior), FINEP (Financiadorade Estudos e Projetos), and INCT-IF (InstitutoNacional de Ciência e Tecnologia para InovaçãoFarmacêutica). Additionally, LCS was supported byfellowship from CNPq and SVCC, LBP, NPC fromCAPES. The funders had no role in study design,data collection and analysis, decision to publish, orpreparation of the manuscript.
Competing Interests: The authors have declaredthat no competing interests exist.
Determination of inhibitory concentration (IC50)Preparation of resazurin. Resazurin powder (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) was
dissolved in sterile distilled water at a final concentration of 0.02%, sterilized by filtration andstored at 4°C until use.
Preparation of the camphene thiosemicarbazide derivative. The stock solution ofTSC-C was prepared in dimethyl sulfoxide (10% DMSO) and diluted to obtain the evaluatedconcentrations (316 μM, 158 μM, 79 μM, 39.5 μM and 19.5 μM).
The determination of IC50 was performed according to the micro-dilution methoddescribed in the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) [27] and De Paula et al.[28]. Were inoculated 1x106 cells/mL of P. lutzii yeast cells per microplate well in MMcM liq-uid medium supplemented with 316 μM, 158 μM, 79 μM or 39.5 μMTSC-C. To determine themaximum growth rate (positive control), some wells received culture medium in place of the100 mL of test compound dilution. The plates were incubated at 36°C with shaking at 150 rpmfor 48 h. Each well then received 15 μL of the resazurin solution, and the plate was re-incubatedfor 24 h. The IC50 was defined as the concentration of compound capable of inhibiting 50% ofcell growth of the fungus according to the absorbance at 600 nm.
Determination of the susceptibility of P. lutzii to the camphenethiosemicarbazide derivativeThe TSC-C sensitivity test was carried out on plates containing Fava-Netto semi-solid mediumsupplemented with TSC-C. The concentrations tested were 316 μM, 158 μM, 79 μM and39.5 μM. Negative control plates were prepared in the absence of TSC-C. A total of 105, 106
and 107 yeast cells were inoculated on each plate. The plates were incubated for 7 days at 36°Cand photographed.
Viability curveCell viability was determined using trypan blue staining and standard cell count techniques ina Neubauer chamber. We inoculated 1x106 cells/mL of P. lutzii yeast cells in MMcM liquidmedium supplemented with TSC-C at 79 μM—the IC50 concentration—for 0, 1, 2, 3, 4, 8 and24 h of incubation. The negative control was performed in the absence of TSC-C. For counting,samples were collected at specific time points, and 10 μL of the cell solution was added to190 μL trypan blue solution and diluted to a final volume of 1 mL. Yeast cells were observedunder light microscopy with a 40X lens.
RNA extraction and purification of mRNATotal RNA was extracted after the incubation of Paracoccidiodies spp. yeast with TSC-C at79 μM for 8 h of cultivation. The RNA was extracted with Trizol reagent (Invitrogen), precipi-tated with isopropanol, and resuspended with diethyl pyrocarbonate- (DEPC-) treated water.The mRNA was purified using the GenElute mRNA kit (Sigma Aldrich).
cDNA library construction and DNA sequencingThe cDNA library was built using the SuperScript Plasmid System with Gateway Technologyfor cDNA Synthesis and Cloning kit (Invitrogen). The cDNA was cloned into the pCMV.SPORT6 plasmid vector and transformed into E. coli (XL1blue) cells. The cDNA library wasplated at approximately 200 colonies per plate (150 mm Petri dish). The colonies were ran-domly selected and transferred to a 96-well polypropylene plate containing LB medium andgrown overnight. Plasmid cDNA was isolated and purified.
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
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cDNA inserts were sequenced from the 5’ end by employing standard fluorescence labelingwith the DYEnamic ET dye terminator kit with an M13 flanking vector primer. Automatedsequence analysis was performed in a MegaBACE 1000 DNA sequencer (GE Healthcare, Upp-sala, Sweden).
Pipeline processing and annotation of ESTsPHRED [29], Crossmatch (http://www.macvector.com/Assembler/trimmingwithcrossmatch.html) and CAP3 [30] tools were integrated into a pipeline (http://www.lbm.icb.ufg.br/pipelineUFG/). Only sequences with at least 50 nucleotides and a PHRED quality greater orequal to 20 were considered for assembly and cluster formation. ESTs were screened for vectorsequences against the UniVec data. All of the clustered sequences were queried for similarityusing BLASTX (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) sequence comparison software againstthe nucleotide database generated from the P. lutzii Pb01 structural genome (http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/paracoccidioides_brasiliensis/MulHome.html). Sequenceswere grouped into functional categories with the PEDANT3 database (http://pedant.helmholtz-muenchen.de/index.jsp). Similarities with E-values� 10−5 were considered signifi-cant. The Munich Information Center for Protein Sequences (MIPS) (http://mips.gsf.de/) data-base was used to assign functional categories. EC numbers were obtained by the EnzymeDatabase-Brenda (http://www.brenda-enzymes.info)
In silico determination of up-regulated genesTo assign a differential expression character, ESTs from contigs formed from yeast cells treatedwith TSC-C were statistically evaluated using the method by Audic and Claverie [31]. Overex-pressed genes, determined by comparison to the P. lutzii transcriptome database (https://dna.biomol.unb.br/Pb/), were determined with a 95% confidence rate.
Generation of P. brasiliensis SOD1-aRNA isolateDNA from the P. brasiliensis wild-type strain ATCC 60855 (WT) was extracted from yeastcultures during exponential growth. We employed a high-fidelity Platinum Taq DNA poly-merase (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) to amplify aRNA oligonucleotides designed on thePABG_03954 (www.broadinstitute.org) sequence of the SOD1 gene. P. brasiliensis plasmidconstruction for aRNA and Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation were per-formed as previously described [32]. Briefly, the amplified SOD1-aRNA oligonucleotideswere inserted into the pCR35 plasmid under the control of the Calcium Binding Protein 1(CBP-1) promoter region from Histoplasma capsulatum [33]. The pUR5750 plasmid wasused as a parental binary vector to harbor the aRNA cassette within the transfer DNA(T-DNA). The constructed binary vectors were introduced into A. tumefaciens LBA1100ultracompetent cells by electroporation as described previously [34] and isolated by kanamy-cin selection (100 mg/mL).
P. brasiliensis and A. tumefaciens were combined in a 1:10 ratio and incubated for 3 days ofco-culture at 28°C. Selection of P. brasiliensis transformants was performed in BHI solid mediacontaining hygromycin B (Hyg; 200 mg/mL) over a 15 day incubation period at 36°C. Ran-domly selected Hyg resistant transformants were tested for mitotic stability. P. brasiliensisyeast cells transformed with the empty parental vector pUR5750 (EV) were used as controlsalongside the experimental yeast in the assays carried out in this study. The integration of thea-RNA cassette in the P. brasiliensis genome was confirmed by PCR analysis.
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 4 / 25
Determination of the susceptibility of P. brasiliensis and the SOD1-aRNAisolate to TSC-CTo evaluate the susceptibility of P. brasiliensis to TSC-C, the WT, EV and SOD1-aRNA isolatestrains were grown in Fava-Netto liquid medium for 72 h under constant shaking at 150 rpmand 36°C. Yeast were then transferred into MMcM liquid medium and cultured overnight.Yeast cells were then washed with 1X PBS, and the assays were performed with 1x106 cells. Thedifferent isolates were distributed in solid BHI medium supplemented with 316 μM, 158 μM,79 μM and 39.5 μMTSC-C. The controls were carried out in the same medium without theaddition of TSC-C. The SOD1-aRNA isolated was growth in the presence of TSC-C added ofascorbic acid aiming to validate the influence of TSC-C as indutor agente of ROS. Initially, theconcentrations from 0.08 to 100 mM ascorbic acid were used to determinate IC50 (data notshown). So, 0.2 mM ascorbic acid was added at 316 μM, 158 μM, 79 μM and 39.5 μMTSC-C.All plates were incubated for 6 days at 36°C before being photographed.
Gene expression analysis by qRT-PCRTotal RNA was obtained from Paracoccidioides spp. yeast cells grown in the presence or absenceof TSC-C for 8 h. After treatment with DNase, the cDNA was synthesized from total RNAusing Superscript II reverse transcriptase (Invitrogen) according to the manufacturer's instruc-tions. The primers for, ATP synthase, Superoxide dismutase (SOD1) [PABG_03954 (www.broadinstitute.org)], Heat shock protein 30 kDa (HSP30), alcohol dehydrogenase (ADH), alde-hyde dehydrogenase (ALDH) and α-tubulin genes were designed using the Primer Express soft-ware (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The sequences of the oligonucleotideprimers are shown in Table 1. The qRT-PCR analyses were performed in triplicate with the Ste-pOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems). The expression values were calculatedusing the alpha tubulin transcript (XM_002796593) as the endogenous control as reported pre-viously [35]. For transcripts of interest, relative expression levels were calculated using the stan-dard curve method for relative quantification [36]. The relative standard curve was generatedby pooling cDNAs from all conditions and serially diluting them from 1:5 to 1:625.
Preparation of protein extracts from P. lutziiProtein extracts were obtained after 8 h incubation in MMcM in the presence of 79 μMTSC-Cor in its absence. Yeast cells were centrifuged at 10,000 x g for 10 min at 4°C, and the proteinswere extracted using extraction buffer (20 mM Tris-HCl pH 8.8; 2 mM CaCl2) with a mixtureof protease inhibitors (GE Healthcare). After the addition of glass beads (0.45 mm), the cellswere lysed in a bead-beater, followed by centrifugation at 10,000 x g for 15 min at 4°C. Thesupernatant was collected and used in enzyme activity assays. The protein concentrations weredetermined using the Bradford reagent (Sigma-Aldrich), as previously described [37].
Table 1. Oligonucleotide primers used in qRT-PCR.
Sequence Name Forward primer (5’-3’) Reverse primer (5’-3’) Tm (GC+AT)
Alpha-Tubulin ACAGTGCTTGGGAACTATACC GGGACATATTTGCCACTGCC 62
Superoxide dismutase 1 ACTGCGCAAGTTATGATGGAA CACGGGAAGGGTCCATTTTC 62
ATP synthase AAGCAGCGAAAATAATGGGATC GCAAATAATCCTGTAGCTTCTG 62
Heat shock protein 30 kDa GGCCTTGACAGCATTCTGG CTGGCGATAAAGGGCAGAAG 62
Alcohol dehydrogenase ACCTTGTTGTGCTGGAGTAGA GGAGTCTGGAATCGGGGTG 62
Aldehyde dehydrogenase CCTCTTACGGCCTTGCTGC CGGACGCCCTTGATCTGAG 62
doi:10.1371/journal.pone.0130703.t001
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 5 / 25
Determination of enzymatic activitySOD activity was measured using a commercially available kit (SOD assay Kit Sigma-Aldrich)following the manufacturer's instructions. The SOD assay kit utilizes the water-soluble tetrazo-lium salt-WST-1 (2-[4- Iodophenyl]-3-[4-nitrophenyl]-5-[2,4-disulfophenyl]-2H-tetrazolium,monosodium salt), which produces a water-soluble formazan dye upon reduction with a super-oxide anion, and the product can be detected by a colorimetric method at 440 nm. 1 μg/mL ofproteins was used in assay, and the levels of SOD activity were quantified by measuring thedecrease in absorbance.
Reactive oxygen species (ROS) detectionIntracellular H2O2 was measured by detecting the fluorescence intensity of 2`,7`-dichloro-fluorescein, the oxidation product of 2`,7`-dichlorofluorescein diacetate. After treatmentwith 79 μM TSC-C for 4, 8 and 12 h, yeast cells were centrifuged and incubated with 20 μM2`,7`- dichlorofluorescein diacetate for 30 min at 37°C. After washing with PBS, yeast cellswere resuspended in 1 mL PBS and analyzed with a BD Accuri C6 flow cytometer (AccuriCytometers, Ann Arbor, MI, USA). A total of 10,000 cells per sample were acquired with theFL1-H channel.
Fluorescence microscopyYeast cells were inoculated in 100 mL MMcMmedium at 1x106 cells/mL. The cultures wereincubated overnight at 36°C with gentle shaking. Cells were then centrifuged at 5,000 x g for5 min and transferred into MMcMmedia containing 79 μM TSC-C for 4, 8 and 12 h. Controlcells were incubated in MMcM without TSC-C. To detect ROS, cells were centrifuged andincubated with 20 μM 2`,7`- dichlorofluorescein diacetate for 30 min at 37°C. The specimenswere analyzed with an Axio Scope A1 microscope and Axio Vison LE software (Carl ZeissAG, Germany).
DNA fragmentation assayYeast cells were treated with 79 μMTSC-C for 4, 8 and 12 h. Samples were centrifuged, the cellpellet was resuspended in 300 mL of cell lysis buffer (10 mM Tris, 0.5% Triton X-100, pH 7.5),and the sample was incubated on ice for 30 min. The lysates were centrifuged at 12,000 x g for10 min at 4°C, and the supernatants were extracted once with buffered phenol and once withchloroform. DNA was precipitated with 3 M sodium acetate and butanol. DNA samples wereresuspended in 50 μL Tris-EDTA buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.5) treated with RNa-seA. Extracted DNA was electrophoresed through a 2% agarose gel and stained with ethidiumbromide.
Cell cycle analysisThe DNA content of yeast cells in the G0/G1, S and G2/M phases was measured using a BDAccuri C6 flow cytometer (Accuri Cytometers). Cells were incubated with 79 μMTSC-C for 4,8 and 12 h. After treatment, the cells were collected, washed with PBS 1X, and 1x106 cells/mLwere fixed with cold absolute ethanol overnight at 4°C. After two washes with PBS 1X, the cellswere incubated with 1 mL propidium iodide staining solution (2 μg/mL) and 50 μL RNase (10mg/mL) and incubated for 30 min at room temperature in the dark. A total of 10,000 cells persample were acquired with the FL2-H channel. Data were collected using FCS Express 4 PlusResearch Edition software (Denovo Software, Los Angeles, CA, USA).
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 6 / 25
Mitochondrial membrane potential measurementThe mitochondrial membrane potential was measured using rhodamine 123 (Rho123). Yeastcells were treated with 79 μMTSC-C for 4, 8 and 12 h. After treatment, the cells were collectedby centrifugation and incubated with 20 μM Rho123 for 20 min at room temperature. After aPBS wash, the cells were resuspended in 1 mL PBS and analyzed using a BD Accuri C6 flowcytometer (Accuri Cytometers) with excitation and emission wavelengths of 488 and 530 nm,respectively.
Statistical analysisDescriptive statistics were calculated from the results, and charts were created in MicrosoftOffice Excel 2003 (Microsoft, Redmond, WA, USA). In this study, all of the values wereexpressed as arithmetic means with S.D. of triplicates. The significant differences between thegroups were analyzed by Student’s t-test and p-values�0.05 were considered statisticallysignificant.
Results and Discussion
The camphene thiosemicarbazide derivative affects Paracoccidioidesspp. growth and viabilityHere, we aimed to evaluate the effect of TSC-C on P. lutzii. The cells were incubated in thepresence of TSC-C. Fig 1A demonstrates that TSC-C inhibited yeast growth in a dose-depen-dent manner. TSC-C at a concentration of 79 μM inhibited the cellular growth by 50% andbecame the IC50 value of TSC-C for Paracoccidioides yeast. Additionally, the cellular viabilityof the fungus was monitored in the presence of 79 μMTSC-C for 24 h. Fig 1B reveals that theyeast cell viability drops to 85% after 8 h of exposure to TSC-C, time used for the transcrip-tomic analysis. The dose-dependent inhibition was also observed in yeast cells grown on thesolid medium supplemented with different concentrations of TSC-C (Fig 2). TSC-C (79 μM)was not toxic to Balb 3T3 cells (data not shown), These results confirmed the antifungal activityof this compound.
cDNA library construction and overview of ESTs from P. lutzii exposed toTSC-CA cDNA library was constructed to determine the expression profile of Paracoccidioides spp.exposed to TSC-C. The dosage and duration of antifungal treatment are known to be criticalsteps in adaptive gene expression [38]; thus, the choice of these parameters was necessary forthe construction of a cDNA library. The concentration used in the experiments was 79 μM cor-responding to IC50 of TSC-C for P. lutzii. The fungus was exposed to TSC-C for 8 h, sinceexhibited 85% viability.
We obtained a total of 2,012 clones, and 1,844 of these were successfully sequenced. Allsequences were arranged into 68 contigs and 686 singlets representing different transcripts. Ofthese, 33 genes were down-regulated and 84 genes were up-regulated when compared to thetranscriptome P. lutzii yeast cells grown in vitro. A total of 64 genes were unique to TSC-C-treated P. lutzii yeast cells. The ESTs obtained were submitted to the National Center for Bio-technology Information (NCBI) under accession numbers: LIBEST_028508 Paracoccidioidesthiosemicarbazide Library.
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 7 / 25
Functional annotation and analysis of sequencesAll up- and down-regulated ESTs were compared to Paracoccidioides Pb01 genes in the BroadInstitute database with the Blast X program. Only ESTs with e-value< 10−5 were considered inthis analysis. All contigs and singlets were annotated with Blas2GO. The ESTs were groupedaccording to the MIPS functional annotation scheme (Munich Information Center for ProteinSequences) into general functional categories affected by TSC-C. The ESTs were related to
Fig 1. Effect of TSC-C on P. lutzii yeast cell growth. (A) Inhibition of Paracoccidioides cell growth after treatment with TSC-C. The inhibition was visualizedby addition of resazurin reagent to culture and measuring the absorbance at 600 nm. To calculate the IC50 value, two absorbance readings were performed;‘1° day’ refers to reading at the beginning of the experiment, ‘3° days’ refers to reading after 3 days of incubation with 316 μM, 158 μM, 79 μM and 39.5 μMTSC-C. The positive control was performed in the absence of the compound. (B) Cell viability after 1, 2, 3, 4, 8 and 24 h exposure to TSC-C. The data arepresented as percentage of cell viability. The Student’s t-test was used for statistical comparisons, and the observed differences were statistically significant(p� 0.05). The error bars represent the standard deviation of three biological replicates.
doi:10.1371/journal.pone.0130703.g001
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 8 / 25
Fig 2. Susceptibility of P. lutzii yeast cells exposed to TSC-C. Samples containing 1x107, 1x106 and1x105 yeast cells were spotted on Fava-Netto plates supplemented with TSC-C at the concentrationsindicated above. The plates were incubated for 7 days at 36°C before photo documentation.
doi:10.1371/journal.pone.0130703.g002
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 9 / 25
metabolism; cell cycle and DNA processing; biogenesis of cellular components; cellular com-munication/signal transduction mechanism; cell rescue, defense and virulence; energy; proteinsynthesis; protein fate; translation; and unclassified proteins (Table 2).
Graphs were plotted to demonstrate the statistically enriched MIPS functions with up- ordown-regulated genes after exposure to the compound. A total of 51% (161 ESTs) were associ-ated with proteins of unknown function (Fig 3A). Transcriptome analysis revealed that ESTsassociated with metabolism (9%) and protein synthesis (9%) were the most highly representedafter 8 h of TSC-C exposure (Fig 3B). The TSC-C treatment resulted in the up- and down-regu-lation of genes involved in different biological processes (Table 2; Fig 3C and 3D). The groupswith the highest percentage of up-regulated genes were unclassified proteins (50%); metabo-lism (12%); cell cycle and DNA processing (8%); energy (6%); transcription (5%); protein fate(5%); cellular transport, transport facilities and transport routes (5%); biogenesis of cellularcomponents (2%); protein synthesis (1%); and cell rescue, defense and virulence (1%) (Fig 3C).The highest percentage of down-regulated genes were grouped within protein synthesis (43%);unclassified proteins (27%); cellular transport, transport facilities and transport routes (9%);energy (6%); and cell rescue, defense and virulence (3%) (Fig 3D).
We analyzed transcript occurrence by determining the number of ESTs found for each tran-script. The transcripts with the highest occurrence of up-regulated ESTs were as follows: hypo-thetical protein PAAG_02996 (18 ESTs), histone H 4.1 (8 ESTs), hypothetical proteinPAAG_03567 (6 ESTs), hypothetical protein PAAG_07875 (5 ESTs), histone H2a (5 ESTs),membrane-associated progesterone receptor component 1 (5 ESTs), 3-demethylquinone-93-methyltransferase (5 ESTs), hydroxymethylglutaryl-CoA lyase (5 ESTs) and superoxide dis-mutase (5 ESTs). For down-regulated ESTs, the highest abundance were as follows: hypotheti-cal protein PAAG_04431 (7 ESTs), hypothetical protein PAAG_03385 (5 ESTs), nucleosidediphosphate kinase (5 ESTs) and ribosomal protein 60S –L31 (5 ESTs).
Description of transcripts changed during exposure to TSC-CABC transporter CDR4 was induced in TSC-C-treated P. lutzii yeast cells. These are transmem-brane proteins that utilize energy generated by the hydrolysis of adenosine triphosphate (ATP)to carry out biological processes including the translocation of various substrates across mem-branes [39]. In addition, they are involved in multidrug resistance in other human pathogenssuch as Candida albicans [40,41] Aspergillus fumigatus [42,43] and Cryptococcus neoformans[44]. Notably, its induction has been correlated with the protection of Aspergillus nidulansagainst cytotoxic agents [45].
Similarly, most genes related to protein fate were induced in the presence of TSC-C. Con-versely, genes related to protein synthesis, mainly ribosomal proteins, were inhibited. It is wellestablished that ribonuclease inhibitors such as the vanadyl ribonucleoside complex (VRC) caninhibit RNases involved in ribosomal subunit formation, resulting in a decreased rate of ribo-somal subunit synthesis [46].
Another gene strongly repressed in the presence of TSC-C was the endoplasmic reticulumand nuclear membrane protein NPL4. In Saccharomyces cerevisiae, the Npl4p protein is part ofa highly conserved protein complex required for the proteasome-mediated processing and acti-vation of ER-membrane-bound transcription factors, resulting in proper membrane fluidityand organelle function. Furthermore, the perturbation of membrane composition in mutantnpl4 cells leads to the loss of ER/nuclear envelope integrity, which in turn causes the observeddefects in nuclear transport [47].
Here, we observed the down-regulation of a high affinity copper transporter (Table 2), sug-gesting that TSC-C could interfere with copper homeostasis on Paracoccidioides spp. Copper is
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 10 / 25
Table 2. Functional classification of up and down-regulated genes from P. lutzii yeast cells in the presence TSC-C.
Functional classification/ Accessionnumber
Gene product ECnumber
Number of occurencesESTs
Metabolism
Amino acid metabolismPAAG_00468.2 4-aminobutyrate aminotransferase 2.6.1.19 +3
PAAG_04052.2 Homoserine O-acetyltransferase 2.3.1.31 +2
C-compound and carbohydrate metabolism
PAAG_00771.2 Enolase 4.2.1.11 -1
PAAG_05580.2 NAD dependent epimerase/dehydratase family protein 5.1.3.2 +2
PAAG_08949.2 GPI Mannosyltransferase 2.4.1 +2
Lipid, fatty acid and isoprenoid metabolism
PAAG_05837.2 Palmitoyl-protein thioesterase 3.1.2.22 +2
PAAG_06329.2 3-hydroxybutyryl-CoA dehydrogenase 1.1.1.157 +1
PAAG_06215.2 Hydroxymethylglutaryl-coa lyase 4.1.3.4 +5
PAAG_08410.2 Acyl-coenzyme A:6-aminopenicillanic-acid-acyltransferase 40kDa form
2.3.1.164 +2
PAAG_03203.2 Protoheme IX farnesyltransferase 2.5.1 +2
Nitrogen, sulfur and selenium metabolismPAAG_00954.2 Urease 3.5.1.5 +2
Nucleotide/nucleoside/nucleobase metabolismPAAG_04291.2 Nucleoside diphosphate kinase 2.7.4.6 -5
Cell cycle and DNA processing
DNA recombination and DNA repairPAAG_04357.2 DNA mismatch repair protein +2
PAAG_05988.2 DNA-repair protein rad2 +2
PAAG_04646.2 Mold-specific protein MS95 +2
Cell cyclePAAG_02186.2 Nuclear segregation protein Bfr1 +2
PAAG_00513.2 Cell division control protein +2
PAAG_07814.2 Subunit of condensin complex +2
PAAG_03188.2 Nuclear movement protein NUDC +2
Biogenesis of cellular componentes
Cytoskeleton/structural proteinsPAAG_05855.2 Ankyrin repeat domain containing protein +2
Cellular communication/signal transduction mechanism
Cellular signalling
PAAG_03783.2 GAF domain nucleotide-binding protein +3
PAAG_03386.2 cAMP—Dependent protein kinase catalytic subunit 2.7.11.11 +3
PAAG_03923.2 TRAF-type zinc finger protein +2
PAAG_01861.2 Membrane associated progesterone receptor component 1 1.6.2.2 +5
Cell rescue, defense and virulence
Stress response
PAAG_00871.2 Heat shock protein 30 kDa -1
PAAG_04164.2 Superoxide dismutase 1.15.1.1 +5
Cellular transport, transport facilities and transport routes
Transport routes
PAAG_00782.2 Small COPII coat GTPase sar +2
PAAG_07328.2 Transport protein SEC61 subunit alpha +4
(Continued)
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PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 11 / 25
Table 2. (Continued)
Functional classification/ Accessionnumber
Gene product ECnumber
Number of occurencesESTs
PAAG_09049.2 ENTH domain-containing protein +2
PAAG_05643.2 Endoplasmic reticulum and nuclear membrane proteinc Npl4 -3
PAAG_08587.2 GPR1/FUN34/yaaH family protein -1
PAAG_05251.2 High affinity copper transporter -1
Transported compounds (substrates)
PAAG_00635.2 ABC transporter CDR4 3.6.3.44 +3
Energy
Glycolysis and gluconeogenesisPAAG_00403.2 Alcohol dehydrogenase 1.1.1.1 -4
Energy conversion and regenerationPAAG_04570.2 ATP synthase D chain, mitochondrial 3.6.3.14 -2
Respiration
PAAG_08901.2 Glyoxylate reductase 1.1.1.26 +2
PAAG_05249.2 Aldehyde dehydrogenase 1.2.1.3 -2
Electron transport and membrane-associated energy conservationPAAG_06595.2 3-demethylubiquinone-9 3-methyltransferase +5
PAAG_05031.2 NADH-ubiquinone oxidoreductase 40 kDa subunit 1.6.5.3 +3
PAAG_01307.2 NADH dehydrogenase iron-sulfur protein 1.6.99.3 +2
PAAG_07593.2 Cytochrome-c oxidase chain VIIc 1.9.3.1 +2
Protein synthesis
Ribosome biogenesisPAAG_09043.2 Ribossomal protein 40S—S2 -1
PAAG_01785.2 Ribossomal protein 40S—S3 -1
PAAG_05017.2 Ribossomal protein 40S—S10-A -3
PAAG_01433.2 Ribossomal protein 40S—S14 -1
PAAG_00088.2 Ribossomal protein 60S—L3 -2
PAAG_07955.2 Ribossomal protein 60S—L18 -1
PAAG_00205.2 Ribossomal protein 60S—L24 -1
PAAG_04965.2 Ribossomal protein 60S—L31 -5
PAAG_07841.2 Ribossomal protein 60s—P1 -2
PAAG_03664.2 Ribossomal protein L28e -2
PAAG_00206.2 Ribossomal protein S30 -2
PAAG_07649.2 Ribossomal protein S36 -2
PAAG_03828.2 Ribossomal protein 40 S-S9 -1
TranslationPAAG_02024.2 Elongation factor 1-alpha -2
PAAG_07105.2 Isoleucyl-tRNA synthetase 6.1.1.5 +2
Protein fate (folding, modification, destination)
Assembly of protein complexesPAAG_05879.2 Complex I intermediate-associated protein -2
PAAG_02594.2 Phosphoprotein phosphatase 2C 3.1.3.16 +2
Protein folding and stabilization
PAAG_05788.2 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase A2 5.2.1.8 +2
Protein/peptide degradationPAAG_05052.2 AAA Family ATPase +2
Protein modification
(Continued)
Response of Paracoccidioides to Camphene Thiosemicarbazide Derivative
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 12 / 25
Table 2. (Continued)
Functional classification/ Accessionnumber
Gene product ECnumber
Number of occurencesESTs
PAAG_05777.2 Dual specificity phosphatase catalytic domain containingprotein
+2
Transcription
RNA synthesisPAAG_07098.2 Histone H4.1 +8
PAAG_08917.2 Histone H2a +5
PAAG_08532.2 Ribonuclease Z 3.1.26.11 +2
PAAG_00891.2 AT hook motif Family protein +2
Unclassified Proteins
PAAG_04823.2 Hypothetical protein +3
PAAG_03567.2 Hypothetical protein +6
PAAG_05112.2 Hypothetical protein +2
PAAG_04156.2 Hypothetical protein +2
PAAG_01567.2 Hypothetical protein +3
PAAG_03475.2 Hypothetical protein +2
PAAG_03684.2 Hypothetical protein +4
PAAG_03129.2 Hypothetical protein +3
PAAG_06864.2 Hypothetical protein +2
PAAG_01497.2 Hypothetical protein +2
PAAG_07875.2 Hypothetical protein +5
PAAG_04268.2 Hypothetical protein +3
PAAG_02546.2 Hypothetical protein +4
PAAG_08699.2 Hypothetical protein +3
PAAG_04869.2 Hypothetical protein +4
PAAG_02037.2 Hypothetical protein +2
PAAG_02676.2 Hypothetical protein +3
PAAG_07947.2 Hypothetical protein +3
PAAG_08808.2 Hypothetical protein +2
PAAG_00149.2 Hypothetical protein +2
PAAG_01940.2 Hypothetical protein +3
PAAG_07462.2 Hypothetical protein +3
PAAG_01216.2 Hypothetical protein +2
PAAG_02607.2 Hypothetical protein +3
PAAG_05412.2 Hypothetical protein +2
PAAG_05607.2 Hypothetical protein +4
PAAG_05415.2 Hypothetical protein +2
PAAG_07420.2 Hypothetical protein +2
PAAG_07885.2 Hypothetical protein +3
PAAG_00947.2 Hypothetical protein +2
PAAG_02407.2 Hypothetical protein +2
PAAG_08549.2 Hypothetical protein +3
PAAG_08355.2 Hypothetical protein +2
PAAG_02237.2 Hypothetical protein +2
PAAG_02996.2 Hypothetical protein +18
PAAG_07710.2 Hypothetical protein +3
PAAG_04455.2 Hypothetical protein +4
(Continued)
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an essential cofactor for a wide variety of enzymes in crucial biological processes critical for cellgrowth, differentiation and survival [48,49]. Some studies suggest that copper acquisition playsan important role in the virulence of C. neoformans [50]. However, at high intracellular concen-trations, copper can be toxic due to the perturbation of the cellular redox potential, whichincreases production of reactive free radicals and indirectly increases oxidative stress [51]. In S.cerevisiae, the high-affinity copper transport proteins, which play an important role in regulatingcopper homeostasis, are induced by copper deprivation and repressed by copper excess [52,53].
The mitochondrial electron transport chain performs the transfer of electrons from glycoly-sis and the Krebs cycle and thereby creates an electrochemical gradient and energy, which isused for a variety of vital processes that include, ATP synthesis [54], ion homeostasis [55], pro-tein import [56] and programmed cell death [57]. Because energy metabolism and redox stateare potential targets, the development of drugs that specifically compromise the structural andfunctional integrity of mitochondria may provide novel opportunities to combat fungal infec-tions [58]. Studies in vitro have demonstrated the interaction between drugs and mitochondriathat may prove useful in several therapies [59,60,61]. In this sense, mitochondrial insult or fail-ure can rapidly lead to the inhibition of cell survival and proliferation [62]. Furthermore, herewe uncovered that genes related to electron transport, such as NADH-ubiquinone oxidoreduc-tase 40 kDa subunit, NADH dehydrogenase iron-sulfur protein and cytochrome-c oxidasechain VII c, were induced in the presence of TSC-C; however, the expression of the ATPsynthase D chain was inhibited (Fig 4A), suggesting that TSC-C could destabilize the electrontransport chain and, as a consequence, decrease the production of ATP in P. lutzii.
TSC-C induces SOD1 up-regulation as a consequence of TSC-C-induced ROSSuperoxide dismutases (SODs) constitute the primary antioxidant defense against ROS, pro-moting dismutation of the superoxide radical (O2−) into molecular oxygen and H2O2, which
Table 2. (Continued)
Functional classification/ Accessionnumber
Gene product ECnumber
Number of occurencesESTs
PAAG_06704.2 Hypothetical protein +2
PAAG_08976.2 Hypothetical protein +2
PAAG_04152.2 Hypothetical protein +2
PAAG_05097.2 Hypothetical protein +2
PAAG_06142.2 Hypothetical protein +2
PAAG_01456.2 Hypothetical protein +2
PAAG_04691.2 Hypothetical protein -2
PAAG_04913.2 Hypothetical protein -1
PAAG_04707.2 Hypothetical protein -2
PAAG_03385.2 Hypothetical protein -5
PAAG_07334.2 Hypothetical protein -4
PAAG_04431.2 Hypothetical protein -7
PAAG_08722.2 Hypothetical protein -2
PAAG_00415.2 Hypothetical protein -3
PAAG_03232.2 Hypothetical protein -2
Genes in bold correspond to single genes in condition TSC-C. The signs + and - represent induced and repressed genes, respectively.
doi:10.1371/journal.pone.0130703.t002
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are less toxic for the cell. ROS-generating agents induce fungal SODs, among other proteins[63]. SOD3 protects H. capsulatum yeast cells from host-derived oxidative stress by detoxifyingROS produced by macrophages and neutrophils, thereby enabling the survival of the fungus[64]. In the case of Paracoccidioides spp., the induction of SOD1 protein is similarly observed incells exposed to H2O2 [65]. In C. albicans, another fungal pathogen, the inactivation of ROSdetoxifying enzymes has been shown to attenuate its virulence [66].
Here, we confirmed the up-regulation of SOD1 in P. lutzii and P. brasiliensis by qRT-PCR(Figs 4A and 6D) and by enzymatic activity assay in P. lutzii (Fig 4B), suggesting that TSC-Ccould induce the formation of ROS leading to oxidative stress in Paracoccidioides spp. yeastcells. Thus, to confirm our hypothesis, we evaluated the production of ROS by means of
Fig 3. Statistically enrichedMIPS functions. (A) Total ESTs represented by classified and unclassified categories. (B)Genes expressed differentially inthe presence of camphene thiosemicarbazide derivate. Up- (C) or down- (D) regulated P. lutzii genes after exposure of yeast cells to TSC-C. The functionalclassification was based on the MIPS functional annotation scheme. Each functional class is represented as a color-coded segment and expressed as apercentage of the total number of ESTs.
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Fig 4. Effect of TSC-C on the genes and SOD1 activity of P. lutzii (A)Gene expression profile of yeast cells exposed to TSC-C for 8 h. Changes in the geneexpression levels were calculated by the relative standard curve method using the non-treated control samples to calibrate. Each error bar represents thestandard error of the mean (±SD), and significant fold changes are denoted by asterisks in the figure (*p�0.05). Data were normalized with the transcriptencoding the α-tubulin protein. (B) SOD1 activity. Yeast cells were grown in the presence of TSC-C for 8 h, and total protein was extracted to measure SOD1activity. The Student’s t-test was used for statistical comparisons, and the observed differences were statistically significant (p�0.05). Error bars representthe standard deviation of three biological replicates.
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Fig 5. Formation of ROS by TSC-C. (A) Fluorescence microscopy of P. lutzii yeast cells stained with 2`,7`-dichlorofluorescein diacetate. Yeast cells weregrown in the absence of TSC-C for i) 4 h, ii) 8 h and iii) 12 h and in the presence of TSC-C for iv) 4 h, v) 8 h and vi) 12 h. (B) Flow cytometry analysis of yeastcells grown in the absence or in the presence of TSC-C. The cells were monitored for i) 4 h, ii) 8 h and iii) 12 h stained with 2`,7`-dichlorofluoresceindiacetate. Black histograms represent control yeast cells, and green histograms represent yeast cells treated with TSC-C.
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fluorescence microscopy and flow cytometry. In yeast cells treated with TSC-C, we observed anincrease in fluorescence in a time-dependent manner, indicating that this compound could beinducing the formation of ROS in P. lutzii (Fig 5A and 5B). The main classes of antifungaldrugs used in the treatment of invasive fungal infections, such as azoles, polyenes and echino-candins, are also capable of inducing ROS production [67,68].
Taking into account the above results, we inquired about the importance of SOD1 duringTSC-C treatment. To validate our assumption, we created a P. brasiliensis isolate (SOD1-aRNA) with down-regulated SOD1 gene expression (Fig 6A and 6B). The PCR analysis wasperformed to confirm the integration of the a-RNA cassette in the P. brasiliensis genome (Fig6C). SOD1-aRNA was obtained to ATCC 60855 isolate since SOD1 was also induced in thisisolate (Fig 6D) and the protocol to obtainment of mutant to P. brasiliensis has not yet stan-dardized. The susceptibility of ATCC60855 and SOD1-aRNA to TSC-C was evaluated (Fig 7).When SOD1-aRNA isolate cells were exposed to TSC-C, we observed a reduced growth raterelative to WT and EV yeast cells. The growth was restored in the presence of antioxidant,ascorbic acid. This result corroborates our transcriptional data that indicate an up-regulationof SOD1 during TSC-C treatment and suggests that the up-regulation of this gene is importantfor Paracoccidioides survival in the presence of the compound.
Fig 6. Gene silencing of SOD1 in P. brasiliensis. (A) Transfer DNA (T-DNA) inserted into the genome of P. brasiliensis yeast cells via ATMT in order tosilence the SOD1 gene. The antisense oligonucleotide was directed to exon 3 (black box) that amplify a length of 85 bp. This AS oligonucleotide was placedunder the control of the calcium binding protein (CBP-1) with a terminator (CAT-B); the plasmid contained hygromycin B phosphotransferase (HPH) under thecontrol of glyceraldehyde 3-phosphate of Aspergillus nidulans (PGPDA) with a terminator (TTRCP). (B) PbSOD1 gene expression levels obtained by RT-qPCR. The measurement was normalized with the housekeeping gene alpha-tubulin in WT, EV and SOD1-aRNA yeast cells growing in the exponentialphase. Mitotic stability was confirmed by sub-culturing P. brasiliensis SOD1-aRNA yeast cells and testing for low expression levels in this isolate aftersuccessive sub-cultures. (C) Validation by PCR of the presence and integration of the Transfer DNA (T-DNA) into the genome of P. brasiliensis transformant.The genomic DNA from the SOD1-aRNA isolate was tested by PCR using specific primers for the alpha-tubulin gene TUB (Tub, lane 3), for thetransformation constructs pCR35 (pCR, lane 4) and pUR5750 (pUR, lane 5) and for the hygromycin resistance gene (hph, lane 6). (D) SOD1 expressionprofile in P. brasiliensis after exposure to TSC-C. RNA was extracted after 8 h of exposure of yeast cells to TSC-C. Changes in gene expression levels werecalculated by the relative standard curve method using the non-treated control samples to calibrate.
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TSC-C-induced ROS leads to the collapse of the P. lutziimitochondrialmembraneMitochondrial ROS production can lead to the oxidative damage of mitochondrial proteins,membranes and DNA, thereby impairing the ability of this organelle to synthesize ATP andcarry out its wide range of metabolic functions; such functions include the tricarboxylic acidcycle, fatty acid oxidation, the urea cycle and amino acid metabolism, which are pivotal for thenormal function of most cells [69]. Furthermore, ROS also would cause a transition in mito-chondrial permeability. This transition consists of the loss of the mitochondrial membrane
Fig 7. Susceptibility of P. brasiliensis SOD1-aRNA to TSC-C. 1x106 yeast cells of P. brasiliensisWT60855, EV60855 and SOD1-aRNA were spotted onsolid BHI supplemented with 39.5, 79 and 158 μM TSC-C. Control cells were spotted on BHI without TSC-C or with 39.5, 79 and 158 μM TSC-C and ascorbicacid. The plates were incubated for 7 days at 36°C before photo documentation.
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potential, resulting from the formation of pores, and subsequent cell death [70]. BecauseTSC-C induces the production of ROS, we evaluated the mitochondrial membrane integrity byestimating the electric potential (ΔCm) with fluorescence in yeast grown in the presence ofTSC-C for 4, 8 and 12 h. Flow cytometry analysis revealed a ΔCm decrease in the yeast cellsexposed to the compound relative to control cells (Fig 8), suggesting that the TSC-C-inducedROS lead to the collapse of the mitochondrial membrane.
TSC-C inhibits cell proliferation by changing the expression profile ofgenes related to the cell cycleCell cycle and DNA processing were among the major classes of overexpressed genes in P. lut-zii cells exposed to TSC-C. From these, 8 were unique to yeast cells grown in the presence ofTSC-C, and these included DNA mismatch repair protein and DNA repair protein RAD2.Therefore, we explored the possibility that the induction of these genes was associated withDNA damage through a DNA fragmentation assay. In fact, we did not observe DNA fragmen-tation in the samples cultured in the presence of TSC-C for any of the times tested (S1 Fig).
Considering the identity of the genes differentially regulated by the presence of the com-pound, we evaluated the P. lutzii cell cycle by analyzing DNA content by flow cytometry. Thephase of the cell cycle was determined by the difference in DNA content between cells in thepre-replicative (G0 and G1) phases, the replicative (S) phase (DNA synthesis) and the post-replicative plus mitotic (G2+M) phases [71]. The results showed that the percentage of yeastcells in the G1 phase increased in a time-dependent manner after exposure to TSC-C; further-more, the number of cells in the S and G2 phases decreased (Fig 9). Altogether, these resultsindicate that TSC-C inhibits cell proliferation by changing the expression profile of genesrelated to the cell cycle.
ConclusionTSC-C seems to induce the formation of ROS in Paracoccidioides spp., leading to the collapseof the mitochondrial membrane, and also to inhibit cell proliferation by changing the expres-sion of genes related to the cell cycle. Relevant genes related to protein synthesis, copperhomeostasis and cellular response induced by drugs or stress conditions were also observed in
Fig 8. Effect of TSC-C on the mitochondrial membrane potential of P. lutzii. The mitochondrial membrane potential (ΔΨm) was determined by flowcytometry analysis of yeast cells treated with TSC-C for A) 4 h, B) 8 h andC) 12 h and stained with rodhamine123. Histograms in black represent thecontrols, and red histograms represent cells treated with TSC-C.
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Fig 9. Effect of TSC-C on the P. lutzii cell cycle. The DNA content of yeast in each cell cycle phase wasanalyzed by flow cytometry in the absence of TSC-C for A) 4 h,B) 8 h andC) 12 h or in the presence ofTSC-C for D) 4 h, E) 8 h and F) 12 h and subsequently stained with ethidium iodide as represented byhistograms.
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Paracoccidioides yeast cells exposed to TSC-C. The high percentage of unclassified proteinsfound here indicates that further studies are needed in order to better understand how TSC-Caffects Paracoccidioides spp.
Supporting InformationS1 Fig. DNA fragmentation assay. DNA fragmentation was carried out in P. lutzii yeast cellsexposed to TSC-C at 79 μM for 4, 8 and 12 h. The controls were performed with yeast cellsincubated in the absence of TSC-C.(TIF)
Author ContributionsConceived and designed the experiments: LCS MP OHR JGMO CMAO CCS. Performed theexperiments: LCS DPTO SVCC LBP NPC. Analyzed the data: LCS CMAO AMB JAPR CMASMP. Contributed reagents/materials/analysis tools: CCS CMAS OHRMP. Wrote the paper:LCS DPTO CMAO AMB JAPR OHR JGMOMP.
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PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0130703 June 26, 2015 25 / 25
51
5. Anexo
Morita Baylis Hillman: Atividade biológica em células de Paracoccidioides
Lívia do Carmo Silva1, Mario Luiz Araújo de Almeida Vasconcellos
2, Cecília Maria
Alves de Oliveira3, Célia Maria de Almeida Soares
1, Maristela Pereira
1
1Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia
Molecular, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Goiás, Goiânia,
GO, Brasil. 2Laboratório de Síntese Orgânica Medicinal, Universidade Federal da
Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brasil. 3Laboratório de Produtos Naturais, Instituto de
Química, Universidade Federal de Goiás, Goiânia, Goiás, Brasil.
Autor correspondente:
Maristela Pereira
Laboratório de Biologia Molecular, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Instituto de Ciências Biológicas, Campus II, Universidade Federal de Goiás, C.P. 131,
74001-970, Goiânia, GO, Brasil.
E-mail: [email protected]
Tel./fax: 55 62 35211110
52
Resumo
Paracoccidioidomicose (PCM), micose endêmica e restrita à América Latina, é
causada pelos fungos termodimórficos do gênero Paracoccidioides spp.. O tratamento é
um processo lento e pode prolongar-se por meses ou anos, realizado com a
administração de antifúngicos tóxicos. Assim, reduzir o tempo, a toxicidade e os efeitos
colaterais do tratamento é o grande interesse da pesquisa por novos potenciais
antifúngicos. A reação de Morita Baylis Hillman gera compostos polifuncionalizados,
os quais têm sido amplamente utilizados como intermediários na síntese de produtos
naturais e sintéticos com interesse biológico. Neste trabalho, propomos estudar a ação
inibitória de seis MBHA em células leveduriformes de Paracoccidioides e na enzima
malato sintase recombinante de Paracoccidioides (PbMLSr). Além disso, investigamos
o potencial hemolítico, a inibição da atividade da desidrogenase mitocondrial e
interação com itraconazol, anfotericina B, sulfametaxazol e bactrin. O composto
interferiu no crescimento do fungo de forma dose-dependente, diminuiu a atividade de
desidrogenase mitocondrial e apresentou interação sinérgica com bactrim. Nenhuma
atividade hemolítica foi observada, apesar da alta toxicidade encontrada. Os MBHAs
inibiram a viabilidade de Paracoccidioides, mas alterações nas estruturas, com o intuito
de diminuir a citotoxicidade deverão ser realizadas.
Introdução
O gênero Paracoccidioides spp. compreende um complexo de quatro espécies
crípticas distintas denominadas S1, PS2, PS3 e Paracoccidioides lutzii, que apesar de
não serem distinguidas por características morfológicas, são geneticamente distintas e
isoladas reprodutivamente [1,2]. Paracoccidioides spp. apresentam característica
termodimórfica, crescendo na forma leveduriforme nos tecidos do hospedeiro ou in
vitro a 36 ºC e na forma miceliana em condições saprófitas ou quando cultivado à
temperatura ambiente (18-23°C) [3]. Sua ocorrência é restrita às áreas geográficas da
Argentina, Brasil, Peru, Paraguai e Venezuela (S1 e PS2) e Colômbia (PS3) [4]. O
Brasil é responsável pela maioria dos casos descritos na literatura, sendo a doença
frequentemente encontrada nos estados das regiões Sul, Sudeste e Centro-Oeste [5,6,7].
53
Integrantes do complexo Paracoccidioides são fungos patogênicos, agentes
etiológicos da paracoccidioidomicose (PCM), micose infecciosa, granulomatosa, de
caráter incapacitante [8]. A PCM é predominante em indivíduos entre 30 e 50 anos de
idade, do sexo masculino [9,10] e trabalhadores rurais residentes em áreas endêmicas,
os quais inalam os aerossóis contendo propágulos fúngicos, durante o trabalho com a
terra [11].
A inalação de conídios e fragmentos de micélios, formas infectantes do fungo, é
a via de infecção mais frequente [12]. A partir dos pulmões, o fungo pode se disseminar
por todo o corpo, através da corrente sanguínea ou linfática acometendo outros órgãos e
sistemas como fígado, baço, ossos e sistema nervoso central [13, 14]. Após a penetração
no hospedeiro, sob os efeitos da temperatura corpórea do hospedeiro, uma série de
proteínas do patógeno é ativada [16], permitindo a transformação da forma infectante
para parasitária, sendo esse processo considerado fundamental para a fase inicial da
interação parasito-hospedeiro e estabelecimento da infecção [17].
Os fármacos indicados são as sulfonamidas, anfotericina B e derivados
imidazólicos, tais como cetoconazol, itraconazol e fluconazol [19,20]. O tratamento da
PCM permanece um desafio, dispondo de um arsenal de fármacos considerados
eficazes, mas com limitações de toxicidade, interação medicamentosa e de custo
elevado [18]. O tratamento é um processo longo, podendo se estender por meses ou
anos, causando frequente desistência dos pacientes [21]. Em adição, isolados resistentes
ou multi-resistentes continuam aparecendo [23], tornando necessária a busca
permanente por novos candidatos antifúngicos.
Paracoccidioides spp apresenta o ciclo do glioxilato como alvos para candidatos
antifúngicos. Uma das enzimas chaves desse ciclo é a Malato sintase, descrita como ser
uma adesina [32] e também participante da via de degradação da alantoína [47]. Assim,
a pesquisa por inibidores dessa enzima ganha relevância no cenário de desenvovimento
de novos antifungicos
Os adutos Morita-Baylis-Hillman (MBHA) vêm se destacando no âmbito da
síntese química, uma reação de ligações carbono-carbono que envolve a ligação de
alquenos com acetonas, aldeídos e iminas, resultando em moléculas polifuncionais [24].
Os MBHA possuem vantagens, tais como economia de átomos, já que todos os átomos
são incorporados no produto, e a possibilidade de execução da reação em meio aquoso
ou na ausência de solvente. Devido a essa característica, essa transformação pode ser
54
considerada uma reação limpa (green chemistry ou química sustentada) [25]. Além
disso, MBHAs possuem características que permitem fazer transformações moleculares
e originar um grande número de moléculas que têm sido aplicadas como intermediários
na síntese de produtos naturais [26]. Alguns MBHA são ativos contra P. falciparum
[27,28] e Biomphalaria glabrata [29] e Leishmania amazonenses [30].
A compreensão dos mecanismos biológicos de ação desta nova classe de
moléculas está ainda em fase inicial. O interesse acadêmico e industrial na seleção de
experimentos verdes e mais baratos para o desenvolvimento de fármacos tem
impulsionado os estudos sobre MBHA. Assim, o foco desse trabalho foi avaliar a
atividade antifúngica de seis MBHAs em células leveduriformes de Paracoccidiodies,
avaliar a citotoxicidade dos compostos e seu potencial inibitório da enzima malato
sintase recombinante de Paracoccidioides (PbMLSr).
Metodologia
Soluções de antifúngicos e MBHAs
Os MBHAs foram previamente selecionados utilizando o critério de semelhança
estrutural com inibidores da enzima malato sintase. Os MBHAs foram sintetizados por
Mário Vasconcellos do Laboratório de Síntese Orgânica Medicinal da Paraíba,
departamento de Química, Universidade Federal da Paraíba. Os antifúngicos
itraconazol, anfotericina B, bactrin e sulfametaxazol foram adquiridos (Sigma Aldrich,
Co., St. Louis, MO).
Todos os antifúngicos e MBHAs foram preparados no momento da execução
dos testes, sendo dissolvidos em 10 µl de DMSO e 1 ml de água destilada estéril,
obtendo concentração inicial de 1000 µg/ml. A partir desta concentração, foram feitas
diluições seriadas em razão 2 até alcançar concentração 1,9 µg/ml.
Micro-organismo e condições de cultivo
Paracoccidioides isoladoPb18 foi incubado em meio Fava-Neto líquido [0.3%
protease peptona, 1% peptona, 0.5% (w/v) extrato de carne, 0.5% (w/v) extrato de
levedura, 4% glicose, 0.5% NaCl, pH 7.2] por 3 dias a 37 ºC sob agitação. Em seguida,
com o propósito de adaptação do fungo ao meio quimicamente definido, foi realizada a
transferência das células para meio RPMI, com posterior incubação por 16 horas.
55
Determinação da concentração inibitória mínima (CIM)
A determinação de CIM foi realizada pela técnica de microdiluição, seguindo
recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) e De Paula et al.
[31] Em cada orifício da microplaca, foram adicionadas 100 µl das diluições com
adição de 100 µl das culturas dos fungos a fim de obter a concentração final de 1 x 105
CFU/ml. As placas foram mantidas a 36°C, sob agitação a 150 rpm, por 48 horas. Em
seguida o reagente alamar blue foi adicionado e procedeu-se a incubação por 24 horas.
Para determinação do crescimento máximo (controle positivo) alguns poços com células
receberam meio de cultura em substituição aos 100 µl das diluições dos compostos
testes e para obtenção do valor máximo de inibição (controle negativo) alíquotas das
culturas receberam o antifúngico itraconazol. O crescimento foi mensurado pela
coloração da cultura. A cor azul é definida como crescimento totalmente inibido e a cor
rosa como 100% de viabilidade. A CIM foi definida como a menor concentração do
composto capaz de inibir o crescimento celular do fungo, ou seja, que apresentasse a cor
azul.
Determinação da concentração fungicida mínima (CFM)
Células de Paracoccidioides foram incubadas com os MBHAs, diluídos de
forma seriada, mantendo as mesmas concentrações e condições de cultivo utilizadas no
teste de CIM. Para cada poço foi realizada uma subcultura, transferindo-se, por meio de
ponteiras estéreis 10 µL, material de cada poço da microplaca, para placa contendo
Fava-Neto sólido. As placas foram incubadas em estufa a 37ºC por 7 dias, com posterior
leitura visual. A concentração fungicida mínima foi definida como a menor
concentração que apresentou inibição do crescimento.
Ensaio de citotoxidade
As células BALB/c 3T3 (1x105) foram distribuídas em microplacas de 96 poços, em
meio DMEM, suplementado com 10% de soro fetal bovino e antibiótico. As células
foram expostas às concentrações, variando seriadamente de 4,46 a 571,24 µM) por 48
horas, mantidas em estufa úmida com 5% de CO2, a 37ºC. Em cada micropoço foi
adicionado 25 µg/ml de solução de vermelho neutro e incubado por 4 horas na mesma
condição anterior. O sobrenadante foi removido, e o pellet lavado com PBS com
posterior adição da solução fixadora de vermelho neutro (1% ácido acético, 49% água
56
deionizada, 50% etanol), sendo assim, quantificada por espectrometria a 560 nm. A
absorbância obtida das células-controle foi considerada como 100% de viabilidade
celular. A viabilidade celular foi calculada pela seguinte fórmula:
Atividade hemolítica
O sangue periférico de carneiro heparinizado foi lavado três vezes com PBS. O
teste constitui de solução de eritrócitos a 2% (v/v), branco (PBS), controle negativo
(10% DMSO), controle positivo (Triton X-100) e amostras teste nas concentrações de
3,9 a 500 μM. Após o preparo do branco, dos controles positivo e negativo e das
diluições da amostra, a solução de eritrócitos a 2% foi adicionada a cada micropoço. A
microplaca foi incubada sob agitação constante à temperatura ambiente por 1 hora, e
centrifugada a 3000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi retirado e transferido para
outra microplaca e a absorbância foi quantificada por espectrofotometria, em uma
leitora de microplacas a 540 nm. Foram realizados dois experimentos independentes e
as concentrações em triplicata.
Avaliação da atividade das desidrogenases mitocondriais
O fungo foi exposto aos MBHAs, utilizando concentrações de 1000 – 1,9 µg/ml. Os
compostos foram diluídos de modo seriado em meio de cultura RPMI 1640. Um total de
100 µl das diluições foi adicionado nos poços das microplacas e em seguida, 100 µl da
cultura do fungo foram adicionados para obter a concentração final de 1x103 CFU/ml.
As placas foram mantidas a 36°C sob agitação por 48 horas. Em seguida, 50 µl de XTT
foi adicionado e novamente incubado por 24 horas. Para determinação do crescimento
máximo (controle positivo), alguns poços receberam meio em substituição aos
compostos, e para obtenção do valor máximo de inibição (controle negativo) alíquotas
das culturas receberam o antifúngico Itraconazol.
Indução da proteína recombinante PbMLS
As células de E. coli BL21 (C41) transformadas com o plasmídio pET 32a.
(Amershan Biociences®) contendo o gene PbMLS foram plaqueadas em meio LB sólido
57
com 100 μg/ml ampicilina e 2 M glicose; em seguida, foram incubadas a 37oC por 18
h. Um pré-inóculo foi obtido a partir de uma única colônia de Escherichia coli
transformada e inoculada em meio LB líquido com 100 μg/ml ampicilina e 2 M glicose,
e incubada a 37oC por 18 horas, sob agitação de 150 rpm. Em adição, foram colocados 5
ml de pré-inóculo em 300 ml de meio LB líquido, incubando a 37oC com agitação
vigorosa, até atingir a D.O. de 0,6, no comprimento de onda de 600 nm. Após atingir a
D.O., foi adicionado IPTG para concentração final de 1 mM, prosseguindo-se com
incubação adicional por 2 horas. A cultura foi centrifugada a 8.000 x g por 15 min a
4oC. O sobrenadante foi descartado e as células ressuspensas em 50 μl de PBS 1X
gelado, para cada ml da cultura. Uma alíquota desse material foi analisada em gel de
bis-acrilamida para confirmação da indução. As células induzidas foram incubadas por
60 minutos com 100 µg/ml lisozima. Em seguida, foi adicionado 20% sarkozil na
concentração final de 1% e as células foram lisadas por sonicação (5 ciclos de 10
minutos) e passadas por 10 vezes na agulha. A amostra foi centrifugada a 8000 x g por
15 minutos para obtenção do sobrenadante. A proteína solubilizada foi purificada
utilizando resina de níquel.
Atividade enzimática da Malato sintase
O ensaio de atividade enzimática da PbMLSr foi realizado conforme descrito
anteriormente [32]. A quantidade de grupos tiol livres de CoA foi determinada
utilizando 5, 5'-ditiobis-(ácido 2-nitrobenzóico) - DTNB. A absorção a 415 nm foi
medida em leitor de microplacas. O DTNB foi adicionado a uma concentração final de
2 mM. A mistura padrão possui 2 µg PbMLS, 100 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2, 2 mM
glioxilato, 1 mM acetil-CoA.
Viabilidade celular de Paracoccidioides spp. Na presença do composto E1
A viabilidade das células foi mensurada utilizando o corante iodeto de propídeo.
Após as células serem incubadas, a morte celular foi monitorada nos intervalos de 3 em
3 horas. Um total de 1 ml da cultura foi centrifugada, com posterior adição de 1µl de
iodeto de propídeo (1mg/ml), e armazenado por 15 minutos no escuro. A leitura foi
realizada pelo citômetro de fluxo D Accuri C6 (Accuri Cytometers, Ann Arbor, MI,
USA) no comprimento FLH 2. Células, sem adição dos compostos foram utilizadas
58
como controle positivo. Células mortas por incubação com metanol, foram utilizadas
como controle negativo.
Ensaio de interação com antifúngicos pelo método checkerboard
O efeito combinado dos antifúngicos sintéticos com os MBHA-E1 foi
determinado através da técnica de diluição checkerboard. Inicialmente, 75 µl de cada
antifúngicos em combinação com 75 µl de MBHA-E1, foram dispostos de maneira
ordenada: no sentido horizontal houve um decréscimo das concentrações de MBHA-E1 e
na vertical um decréscimo das concentrações dos antifúngicos sintéticos itraconazol,
anfotericina B, bactrim e sulfametaxazol. Em adição, foram adicionadas 50 µl de células
de Paracoccidioides. na concentração final de 1x103
células/ml. Após dois dias de
incubação a 37 ºC, sob agitação a 150 rpm, foi acrescentado 20 µl de Alamar blue
(0,002%) e novamente incubado por 24 horas. Os poços que mantiveram a coloração
azul foram considerados livres de crescimento fúngico; os poços que apresentarem a
coloração rosa indicaram crescimento fúngico.
A Concentração inibitória Fracionada (FIC) foi calculada através da fórmula:
FICs = FICA + FICB, onde FICA é a CIM do composto A combinada divida pelo CIM do
composto A sozinho; FICB é CIM do composto B combinada divida pela CIM do
composto B sozinho. Os FICIs foram interpretados como a seguir: sinérgico, FIC ≤ 0,5,
aditivo FIC > 0,5 a ≤ 1, indiferente FIC > 1 a ≤ 4, antagônico FIC > 4, como proposto
por Schwarz [29].
Resultados e Discussão
Atividade biológica dos MBHAs
As investigações a respeito da bioatividade dos MBHAs (Figura 1) foram
iniciadas em 1999 por Kundu e colaboradores, realizando a bioavaliação contra
Plamodium falciparum. Todos os adutos avaliados possuíram alguma atividade
antimalarial in vitro. Aqui, observamos que o crescimento de células leveduriformes de
Paracoccidioides foi inibido pelos MBHAs de modo dose-dependente (Tabela 1).
Dentre os adutos avaliados, 2 hidroxi (pirimidina-4-il) metil acrilonitrila e 2
hidroxi(pirimidina-3-il) metil acrilonitrila tiveram as menores CIM. Estes mesmos
adutos também foram os mais ativos frente Plamodium falciparum e Plamodium
59
berghei [33]. Com estes resultados é possível entender a relação entre a estrutura-
atividade destes compostos, bem como detectar os grupos farmacofóricos presentes.
Os resultados do ensaio de CFM (Tabela 1) mostraram que os MBHAs tiveram
atividade fungicida frente às células de Paracoccidiodies, um fato importante, já que a
atividade fungicida é clinicamente mais importante do que a fungistática,
principalmente em pacientes HIV positivos, uma vez que o uso profilático de
fungistáticos é associado à resposta imune do paciente.
A fim de confirmar a inibição do crescimento fúngico e determinar se as células
estavam metabolicamente inativas, foi utilizado o ensaio de XTT. Este ensaio tem
princípio colorimétrico e permite uma estimativa do metabolismo ativo microbiano
[34,35]. A clivagem do anel tetrazol e a consequente produção de cristais de formazan
ocorrem por ação de enzimas pertencentes à cadeia respiratória, como desidrogenases
ou flavoproteínas, o que caracteriza esta reação como exclusiva de células
metabolicamente ativas [36]. A taxa de respiração celular é considerada uma medida de
atividade microbiológica e pode ser estimada indiretamente pela atividade do sistema
transportador de elétrons empregando-se os sais de tetrazol como receptores artificiais
que competem com o oxigênio na captura de elétrons [37]. Diante disso, os resultados
do teste de inibição das desidrogenases mitocondrial por adição de XTT confirmaram
que todos os compostos testados inibiram o crescimento fúngico e que estão
metabolicamente inativas (Tabela 1).
Potencial citotóxico e hemolítico dos MBHAs
A utilização dos testes de citotoxidade in vitro representa uma ferramenta útil e
necessária para definir a citotoxicidade basal, ou seja, a habilidade de um composto
causar alterações e morte celular, como consequência de dano das funções celulares
básicas [38]. Já o teste de hemólise in vitro tem sido utilizado como uma das
metodologias de triagem para avaliação toxicológica de diferentes compostos [39,40].
Dos MBHAs analisados, apenas 2 hidroxi(pirimidina-2-il) metil acrilonitrila (E2)
apresentou citotoxidade baixa, mostrando o impacto diante a mudança da pirimidina -N.
Os MBHAs E1 e E3 não apresentaram atividade hemolítica nas concentrações
correspondentes à CIM (Figura 2). A maior taxa de hemólise foi do MBHA - E6
(6,41%). Os ensaios de citotoxidade e atividade hemolítica visam colaborar de modo a
ampliar os conhecimentos sobre a atividade dos MBHAs, assim como, permitir maior
60
segurança em relação ao usuário ao propor estes compostos como protótipos
antifúngicos.
Modificações na estrutura dos MBHAs ou emprego de nanopartículas podem ser
empregados com a finalidade de reduzir a citotoxidade. Essa abordagem já foi aplicada
ao antifúngico Anfotericina B, no intuito de melhorar o seu índice terapêutico e
diminuir a citotoxidade [41].
Viabilidade celular de Paracoccidiodies frente ao MBHA-E1
Após células de Paracoccidiodies serem expostas ao MBHA-E1, a viabilidade
celular foi avaliada para determinar a cinética de morte celular. Após 9 horas de contato
com o composto, o fungo apresentou 50% de viabilidade, sugerindo desestabilização da
membrana plasmática, já que permitindo a entrada do marcador de viabilidade, iodeto
propídio (Figura 3).
Interação do MBHA-E1 com antifúngicos
O ensaio de interação avaliou o efeito combinatório do MBHA-E1 com
antifúngicos utilizados no tratamento da PCM. Assim, de acordo com os valores de CIF
(Concentração Inibitória Fracionada), o composto E1 potencializou os efeitos de
sulfametaxazol, em que a concentração inibitória do antifúngico sulfametaxazol foi
diminuída de 500 para 250 µg/ml. Bactrim reduziu sua concentração inibitória de 250
para 12,5 µg/ml, interação classificada como sinérgica. Os antifúngicos anfotericina B e
itraconazol não apresentaram interação com o MBHA-E1 (Tabela 2).
Devido aos quimioterápicos utilizados no tratamento da PCM apresentarem
toxidade e efeitos colaterais, métodos para aumentar a sua eficácia estão sendo
reportados. Vários trabalhos investigam compostos que potencializam os
antimicrobianos tradicionais [42,43,44]. Stevens & Vo [45], descreveram o potencial
sinérgico entre trimetropin e sulfametaxazol em Paracoccidioides, os quais são
utilizados conjuntamente no tratamento da PCM, o que reforça a importância do ensaio
de interação na avaliação do efeito potencial dos protótipos antifúngicos.
PbMLS e MBHAs
61
PbMLS é uma enzima requerida no metabolismo de Paracoccidiodes, atuando
na via de degradação da alantoína [46] e no ciclo do glioxilato, possuindo também ação
de adesina. Assim, o desenvolvimento de inibidores específicos contra PbMLS é uma
perspectiva atraente, uma vez que, não está presente em humanos.
Após o screening virtual para busca de compostos com afinidade pelo sitio ativo
da PbMLS, foram encontrados compostos com estruturas similares aos MBHAs.
Devido a este fato, o ensaio de inibição da PbMLS pelos MBHAs foi realizado. Nossos
ensaios mostraram que mesmo estruturalmente similares a inibidores da PbMLS,
nenhum dos MBHAs promoveu a inibição da atividade de PbMLS.
Conclusão
Frente às células de Paracoccidioides, os resultados demonstraram que os
MBHAs atuaram de forma eficiente na inibição da proliferação celular, assim como a
interação com bactrim, antifúngico clássico no tratamento da PCM. Além disso, esse
trabalho é o primeiro a reportar a atividade biológica dos MBHAs, aumentando assim as
informações sobre o potencial bioativo dessa classe de compostos. Os resultados
suportarão trabalhos futuros, quanto à avaliação no âmbito da síntese, levando a
modificações necessárias nas estruturas dos MBHAs visando melhorar a sua
potencialidade e citotoxidade.
62
Figura 1.
Figura 1: Estrutura e respectiva massa molecular dos MBHAs.
63
Figura 2
Figura 2: Percentual de hemólise promovida pelos MBHAs utilizando sangue de carneiro.
64
Figura 3
Cinética de morte de Paracoccidioides na presença do composto E1. A viabilidade de Paracoccidioides
foi monitorada no intervalo de 3 em 3 horas após 15 minutos da adição de iodeto de propídeo. A
concentração utilizada no ensaio foi de 25µg/ml referente à CIM.
65
Tabela 1: Concentração mínima inibitória, fungicida, atividade mitocondrial e citotoxidade dos
MBHAs. As concentrações estão expressas em µM. O valor da citotoxidade é referente à concentração
que foi capaz de impedir o crescimento de 50% das células de fibroblasto murinos. CIM-Concentração
Inibitória Mínima. CFM-Concentração Fungicida Mínima. CIMADM - Concentração Inibitória Mínima
para a atividade Desidrogenases Mitocondrial.
Compostos CIM CIM
50% CIMAMD CFM
Citotoxidade
50%
2 hidroxi(pirimidina-4-il) metil acrilonitrila (E1) 156 87,41 156 156 65,3
2 hidroxi(pirimidina-2-il) metil acrilonitrila (E2) 312 103,7 312 312 426,05
2 hidroxi(pirimidina-3-il) metil acrilonitrila (E3) 156 90,83 156 156 166,5
2 hidroxi(pirimidina-4-il) metil acrilato (E4) 518 186,7 518 518 43,7
2 hidroxi(pirimidina-2-il) metil acrilato (E5) 518 190 518 518 54,1
2 hidroxi(pirimidina-3-il) metil acrilato (E6) 518 139,4 518 518 95,75
66
Tabela 2: Interação do MBHA-E1 com antifúngicos utilizados no tratamento da PCM. As
concentrações inibitórias estão expressas em µg/ml e se referem às concentrações que inibiram totalmente
o crescimento de Paracoccidioides. A classificação obedece aos seguintes parâmetros: sinérgico, FIC ≤
0,5, aditivo FIC > 0,5 a ≤ 1, indiferente FIC > 1 a ≤ 4, antagônico FIC > 4. CIM antifúngicos CIM E1 Interação
Sozinho Combinado Sozinho Combinado FICs
Anfotericina B 0,1 0,1 25 12,5 1,03 Aditivo
Itraconazol 0,009 0,009 25 12,5 1,5 Indiferente
Sulfametaxazol 500 250 25 12,5 1 Aditivo
Sulfametaxazol +
trimetopim
250 15,6 25 6,25 0,31 Sinergismo
67
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71
6 DISCUSSÃO
A incidência das infecções fúngicas tem aumentado consideravelmente, sendo a
PCM uma das micoses sistêmicas que mais matam, em uma porcentagem de 51,2% dos
casos (Prado et al., 2009). Só no Paraná 551 mortes foram reportadas em 10 anos e em
Goiás durante um período de 6 anos, 70 casos foram relatados. Os números são
preocupantes considerando que essa não tem obrigatoriedade de notificação. Além
disso, a PCM incapacita os trabalhadores na fase ainda muito produtiva, considerada
por tanto um problema de saúde pública que necessita de atenção, principalmente no
que diz respeito ao tratamento, realizado com administração prolongada de antifúngicos
considerados tóxicos e de custo elevado. Apenas a associação sulfametaxazol e bactrim
é distribuída gratuitamente, e esta é indicada em casos mais amenos da doença. Dessa
forma, este trabalho torna-se relevante.
5.1 Transcriptional profile of Paracoccidioides spp. in
response to terpene Thiosemicarbazide
A regulação da expressão gênica é vital para todos os organismos e é
especialmente requerida pelos fungos, para que se adaptem rapidamente às condições de
estresse celular, como por exemplo, quando infectam o hospedeiro ou quando na
presença de drogas antifúngicas. Assim, o perfil de expressão gênica de
Paracoccidiodies spp. foi avaliado visando investigar a resposta celular do fungo em
exposição à tiosemicarbazida. Essa abordagem já foi utilizada com sucesso por
Zambuzzi-Carvalho et al. (2013), afim de avaliar a resposta de Paracoccidioides spp. à
oenoteina. Aqui, nosso estudo foi realizado comparando ESTs da fase leveduriforme de
Paracoccidoides spp. na presença de tiossemicarbazida com ESTs da fase
leveduriforme de Paracoccidoides spp. (Felipe et al. 2003).
O crescimento de Paracoccidoides spp. foi inibido dose-dependente por
tiossemicarbazida, IC50 correspondente a 79µM; essa inibição também foi demostrada
nos ensaios de sensibilidade em placa e viabilidade celular. Após 8 horas de contato
com tiossemicarbazida, foram induzidos genes pertencentes à categoria de proteínas não
classificadas 50%, metabolismo 12%, ciclo celular e processamento de DNA 8%,
energia 6%, transcrição 5%, destino de proteinas 5%, transporte celular 5%, biogêneses
72
de componentes 2%, síntese de proteínas 1%, defesa e virulência 1%. Uma grande
porcentagem de genes reprimidos estava entre as categorias funcionais de síntese de
proteínas 43%, proteínas não classificadas 27%, transporte celular 9%, energia 6%,
resgate celular 6% e destino de proteínas 3%.
Paracoccidioides spp. induziu genes potencialmente relevantes relacionados
com transporte de drogas (ABC transporter CDR4) e estresse celular (superóxido
dismutase). Os transportadores ABC estão envolvidos na resistência às drogas em
Candida albicans (Prasad et al. 1995, Franz et al. 1998), Aspergillus (Slaven et al. 2002,
Tobim et al. 2005) e Cryptococcus (Posteraro et al. 2003), além de estarem relacionados
com a proteção contra agentes citotóxicos (Andrade et al. 2000). A enzima superóxido
dismutase possui atividade antioxidante. De Arruda Grossklaus et al. (2013) relataram a
indução de superóxido dismutase após realização de análises proteômicas de células de
Paracoccidoides spp. na presença de H2O2. Campos et al. (2005), avaliando genes
relacionados à resposta ao estresse oxidativo, encontraram genes que codificam
proteínas envolvidas na defesa antioxidante, entre elas a superóxido dismutase. Em
nosso trabalho, os resultados de microscopia de fluorescência, citometria de fluxo e
análise de expressão do gene da superóxido dismutase por qRT-PCR, confirmaram que
tiossemicarbazida induz aumento de espécies reativas de oxigênio em Paracoccidioides.
Rodrigues et al. 2010, descreveram a cadeia transportadora de elétrons como
uma promissora área para o desenvolvimento de drogas antimalarial. A função da
cadeia respiratória é a oxidação de nicotinamida-adenina-dinucleotídeo reduzida
(NADH) e flavina-adenina-dinucleotídeo reduzida (FADH2), provenientes de vias
metabólicas, bem como o transporte de elétrons ao longo de uma série de
transportadores para o aceptor final, o oxigênio. Os complexos I (Cox et al.1970), III e
IV funcionam como bomba de prótons, que acumulam no espaço intermembranar,
criando uma diferença de potencial eletroquímico, utilizado pela ATP sintase na
formação de ATP, a partir de ADP e Pi (Klingenberg 1975, Stuart 2008). Por isso, a
indução dos genes NADH ubiquinona oxidoredutase, Citocromo c oxidase cadeia VII e
diminuição da expressão de ATP sintase cadeia D reforça a hipótese quanto ao colapso
na cadeia respiratória de Paracoccidioides.
A fosforilação oxidativa é a rota final de todas as vias metabólicas para a
produção de energia, portanto qualquer colapso na cadeia respiratória tem
consequências nesse sistema. Em adição, a produção de ROS pela mitocôndria pode
levar a danos oxidativos em proteínas mitocondriais, membranas e DNA, prejudicando
73
a capacidade da mitocôndria de sintetizar ATP e alterando funções metabólicas,
incluindo o ciclo do ácido tricarboxílico, oxidação de ácidos graxos, ciclo da ureia e
metabolismo de aminoácidos, que são fundamentais para o funcionamento da maioria
das células (Murphy 2009). Assim, a indução dos genes na presença de
tiossemicarbazida, relacionados com o metabolismo de lipídio, como tioesterase
palmitoil, hidroximetilglutaril-CoA-liase e 3-hidroxibutiril-CoA-desidrogenase e de
genes relacionados ao ciclo celular, além da repressão da síntese proteica podem ser
devido à diminuição de ATP.
Além disso, ROS pode causar a alteração da permeabilidade mitocondrial. Esta
alteração consiste na perda de potencial de membrana mitocondrial, resultando na
formação de poros e subsequente morte celular (Vercesi et al.1997). A perda do
potencial de membrana mitocondrial de células incubadas com tiossemicarbazida foi
observada, sugerindo que o aumento da ROS em Paracoccidioides spp. conduza ao
colapso do potencial de membrana mitocondrial.
Heat shock protein 30 KDa foi reprimido na presença de tiosemicarbazida. Os
mutantes de Saccharomyces cerevisiae com Hsp 30 apresentaram níveis mais baixos de
ATP, consistentes com maior H (+) atividade ATPase, na fase de privação de glicose,
quando Hsp30 é induzida normalmente. A repressão desse gene estendeu o tempo
necessário para que as células se adaptassem ao crescimento sob várias condições de
estresse, onde a manutenção da homeostase celular exige um uso alto de energia e,
portanto, desempenhando um papel na conservação de energia (Piper et al. 2007).
Aqui foi observada a inibição do gene high affinity cooper transporter, sugerindo
que tiosemicarbazida poderia interferir na homeostase de cobre em Paracoccidioides.
O cobre está envolvido em muitos processos biológicos fundamentais, tal como cofator,
essencial para uma grande variedade de enzimas que são críticas para o crescimento
celular, diferenciação e sobrevivência (Kim et al. 2008, Samanovic et al. 2012). Além
disso, estudos sugerem que a aquisição de cobre desempenha um papel importante na
virulência Cryptococcus neoformans (Waterman et al. 2007). No entanto, o cobre pode
ser tóxico em altas concentrações intracelulares devido à perturbação do potencial redox
celular e produção de radicais livres altamente reativos e aumentando o estresse
oxidativo (Park et al 2012). Em Saccharomyces cerevisiae as proteínas de transporte de
cobre de elevada afinidade, que desempenha um papel importante na regulação da
homeostase de cobre, são induzidos pela privação de cobre e reprimidos por excesso de
cobre (Pena et al.2000, Kuo et al. 2012).
74
Diversos genes relacionados com a síntese de proteínas, principalmente
proteínas ribossomais foram reprimido. Sabe-se que o inibidor de ribonuclease como
vanadil ribonucleósido complexo (VRC) pode inibir as RNases envolvidas na formação
da sub-unidade do ribossoma, resultando numa diminuição da taxa de síntese da
subunidade ribossomal (Frazier et al. 2013). Por outro lado, a maioria dos genes
relacionados com o destino da proteína foi induzida na presença de tiossemicarbazida.
A proteína do retículo endoplasmático e da membrana nuclear Npl4 foi
reprimida. Em S. cerevisiae, essa proteína faz parte de um complexo de proteínas
altamente conservadas necessário para o processamento e ativação do fator de
transcrição ER-associado à membrana, resultando na adequada fluidez da membrana e
função da organela mediada pelo proteassoma. Além disso, a perturbação da
composição da membrana de células mutantes npl4 leva à perda da integridade de
ER/envelope nuclear, debilitando o transporte nuclear (Hitchcock et al. 2001).
Na presença de tiossemicarbazida, Paracoccidioides induziu vários genes
relacionados ao ciclo celular e processamento de DNA. A primeira hipótese levantada
diante desse resultado foi de uma possível fragmentação no DNA, o que não foi
observado nos ensaios de avaliação do perfil do DNA em gel de agarose. Assim, foi
proposto que tiossemicarbazida estivesse afetando o ciclo celular. Essa hipótese foi
confirmada através dos ensaios de avaliação do conteúdo de DNA em células de
Paracoccidioides spp. tratadas com tiossemicarbazida. Os resultados demostraram que
houve um aumento tempo-dependente de células na fase G1 do ciclo celular.
Os resultados obtidos nesse trabalho deverão auxiliar no entendimento do modo
de ação de tiossemicarbazida em Paracoccidioides. Tiosemicarbazida atua na cadeia
respiratória e na indução da formação de ROS, inibindo a proliferação celular de
Paracoccidoides spp.
5.2 Adultos Morita-Baylis- Hillman: Atividade biológica em
células de Paracoccidioides spp.
Os estudos utilizando compostos sintetizados pela reação de Morita-Baylis-
Hillman, estão em fase inicial. Sabe-se que a partir dessa reação vários compostos
polifuncionalizados são gerados, e que alguns desses adutos foram eficientes em inibir o
75
crescimento de Plamodium falciparum, Plasmodium berghei, Biomphalaria glabrata,
Leishmania amazonenses. Entretanto, nenhum estudo relatou sua ação em fungos. Em
Paracoccidiodies, os seis MBHAs estudados inibiram o crescimento in vitro de forma
dose dependente, além de potencializar o efeito da associação com sufametaxazol e
trimetropim, fármaco utilizado no tratamento da PCM. Além disso, ao realizar ensaios
utilizando um indicador de disfunção mitocondrial XTT, foi possível observar que as
concentrações em que o crescimento do fungo foi inibido, não foram capazes de reduzir
o sal tetrazolin, o que pode sugerir um desarranjo redox, característico de uma disfunção
mitocondrial.
Os MBHAs estudados possuem estruturas pequenas, e o fato de terem
apresentado citotoxidade não impossibilita pesquisas futuras, já que mudanças nas
estruturas e a utilização da nanotecnologia podem ser realizadas visando a diminuição
da citotoxidade.
76
7 CONCLUSÃO
Os estudos realizados em Paracoccidioides na presença de tiossemicarbazida
permitem concluir que o fungo está respondendo ao composto alterando a expressão de
genes, com o propósito de diminuir o estresse oxidativo e seus efeitos na
desestabilização dos processos relacionados à mitocôndria e consequente homeostase
celular. Esse estudo auxilia na compreensão do modo de ação deste composto, o qual
possui baixa toxicidade e se mostrou eficiente na inibição do crescimento e viabilidade
de Paracoccidioides.
Os MBHAs inibem o crescimento de Paracoccidioides, além de interagir
com sulfametaxazol e trimetropim, potencializando seus efeitos. Entretanto, seu alto
poder citotóxico, reflete a necessidade de ainda realizar análises direcionadas à
modificação de suas estruturas ou o emprego de nano partículas. Outros estudos deverão
ser realizados visando investigar o modo de ação dos MBHAs.
77
8 PERSPECTIVAS
8.1 Tiosemicarbazida derivada do canfeno
Identificar as proteínas de Paracoccidioides que se ligam à tiossemicarbazida
através de ensaios de interação;
Avaliar a inibição da atividade enzimática de proteínas de Paracoccidioides que
se ligam à tiossemicarbazida;
Realizar a modelagem e docking molecular da tiosemicarbazida com proteínas
alvos de Paracoccidioides;
Realizar ensaios in vivo em camundongos.
8.2 Adutos Morita-Bayllis-Hilman
Envolver os compostos MBHAs em lipossomos com o propósito de diminuir a
citotoxidade,
Avaliar os alvos moleculares através da identificação das proteínas alteradas e
ligantes aos MBHAs, visando compreender o seu mecanismo de ação.
78
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