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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E BIOFÍSICA
PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: FISIOLOGIA E
FARMACOLOGIA
ANA PAULA CORRÊA OLIVEIRA BAHIA
LIPOSSOMAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE FÁRMACOS
HIDROFÍLICOS POR VIAS NÃO-INVASIVAS:
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E
FARMACOCINÉTICA USANDO CALCEÍNA COMO
MARCADOR FLUORESCENTE
Belo Horizonte
2009
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ANA PAULA CORRÊA OLIVEIRA BAHIA
LIPOSSOMAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE FÁRMACOS
HIDROFÍLICOS POR VIAS NÃO-INVASIVAS:
CARACTERIZAÇÃO FÍSICO-QUÍMICA E
FARMACOCINÉTICA USANDO CALCEÍNA COMO
MARCADOR FLUORESCENTE
Tese apresentada ao programa de Pós Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia e Farmacologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas, área de concentração: Fisiologia e Farmacologia.
Orientador: Prof. Dr. Frederic Frezard
Belo Horizonte
2009
À minha mãe, Leila, meu exemplo de vida, por toda a sua dedicação, garra,
amizade, carinho e amor;
ao meu irmão, Márcio Antônio, por toda a sua paciência e amizade, sempre me
ensinando a dar prioridades;
ao meu marido Enderson, por tudo o que ele é para mim: amor, confiança,
amizade e companheirismo;
à Sara, por todos os sorrisos, alegrias e beijos;
a vocês, que sempre estiveram do meu lado com muito amor, me apoiando,
incentivando, ajudando, perdoando e principalmente, acreditando na minha capacidade,
eu dedico todo este trabalho.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Frezard, pela excelência na orientação do trabalho, pelos ensinamentos,
paciência, respeito, confiança, amizade e por toda a sua ajuda nos momentos mais
difíceis.
Aos colegas de laboratório: Fernanda, Millen, Bruna, Rubens, Cláudio, Flaviana,
Kelly, Vicente, Weverson e Raul pela convivência, amizade, carinho e ajuda nos
experimentos.
Aos alunos de iniciação científica Larissa e Warley, que muito me ensinaram e me
ajudaram com os experimentos.
Aos colegas Erly Azevedo e Fernanda Lemos, pela imensa ajuda com os ensaios
de Células de Difusão de Franz.
Ao Prof. Lucas Ferreira, da Escola de Farmácia, pela grande colaboração neste
trabalho, principalmente com os ensaios de Células de Difusão de Franz, assim como os
colegas do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica.
À Profa. Sílvia Andrade e suas alunas Juliana, Paula, Fernanda e Monalisa, pela
ajuda nos ensaios in vivo, pelo empréstimo do biotério e laboratório e pela amizade.
À Profa. Miriam Lopez, do Departamento de Farmacologia, por ter cedido os
camundongos sem pêlos.
Ao Prof. Valbert, da Escola de Farmácia, pela ajuda nas tentativas de marcar um
peptídeo radioativamente.
Ao Prof. Robson dos Santos, pelas discussões e ensinamentos durante o trabalho.
À Ilma, por ter acolhido e cuidado dos camundongos no biotério.
Aos colegas do laboratório de Hipertensão pela convivência e amizade.
Ao Prof. Ruben Sinisterra, do Departamento de Química, pelo empréstimo do
equipamento para as medidas de tamanho.
À Celinha, por ter auxiliado na parte burocrática do doutorado.
A todos os colegas da pós-graduação que conviveram comigo.
Ao CNPq pelo auxílio financeiro.
À Vovó Vera, pelo enorme apoio e incentivo, que apesar dos poucos anos de
estudo, sempre soube da importância deste trabalho.
A toda minha família: ao Gil, tios e tias, primos e primas, em especial a Bia, Fava,
Carol e Nanda, pelo apoio, incentivo e amizade.
RESUMO
A principal vantagem da administração de medicamentos por vias não invasivas,
como oral, nasal, pulmonar e tópica, é a facilidade de aplicação, o que contribui para
aumentar a adesão do paciente ao tratamento. Fármacos hidrofílicos de massa molar
intermediária (>300-500 Da) geralmente são pouco permeáveis através das membranas
biológicas, e, por isto, apresentam baixa biodisponibilidade por essas vias. Estratégias
estão sendo procuradas para superar esta limitação, e, entre as mais promissoras,
destacam-se o uso de sistemas transportadores de fármacos, como os lipossomas.
Os lipossomas ultradeformáveis, preparados com combinações específicas de
fosfolipídios e tensoativos, permitindo a formação de vesículas altamente deformáveis ou
elásticas, foram apresentados na literatura como um sistema carreador capaz de
promover a absorção transdérmica de fármacos. Porém, o modo de atuação destas
vesículas, quanto ao mecanismo de carreamento de fármacos e os fatores que
determinam o nível de profundidade que os fármacos atingem após aplicação tópica,
ainda não foi elucidado.
Os lipossomas mucoadesivos, preparados com lipídios carregados negativamente
e revestidos com polímeros catiônicos, mostraram-se capazes de aderirem na mucosa do
trato gastrointestinal, resultando no aumento da biodisponibilidade dos fármacos
encapsulados. Entretanto, há controvérsias se estes lipossomas permanecem estáveis no
suco gástrico e na presença dos sais biliares, e, portanto, são capazes de controlar a
liberação do fármaco encapsulado.
Diante deste contexto, o objetivo dessa tese foi estudar aspectos físico-químicos e
farmacocinéticos de lipossomas ultradeformáveis e mucoadesivos, visando esclarecer o
modo de atuação e avaliar o verdadeiro potencial de utilização destas vesículas,
principalmente para administração de fármacos hidrofílicos de massa molar intermediária.
Neste trabalho, a calceína foi utilizada como marcador fluorescente e modelo de fármaco
hidrofílico e de baixa permeabilidade através das membranas.
Lipossomas ultradeformáveis, com diâmetro hidrodinâmico médio de 100 nm,
foram preparados a partir de fosfatidilcolina de soja e colato de sódio, contendo calceína.
A habilidade do íon Co2+ de apagar a fluorescência da calceína permitiu a determinação
da taxa de encapsulação e da permeabilidade da membrana dessas vesículas à calceína.
Relatamos pela primeira vez que os lipossomas ultradeformáveis apresentam elevada
permeabilidade à calceína, que foi explicada pelo efeito combinado do colato de sódio e
do etanol na membrana dessas vesículas. Observamos ainda que a evaporação da água
na formulação resulta no aumento da taxa de encapsulação da calceína, sugerindo que
este fenômeno pode estar ocorrendo após aplicação tópica da formulação em condição
não oclusiva. Tanto no estudo de absorção transdérmica da calceína para a circulação
sanguínea, realizado em camundongos sem pêlo, quanto nos ensaios de permeação
cutânea in vitro, utilizando Células de Difusão de Franz, as vesículas ultradeformáveis
reduziram a taxa de calceína permeada. Leituras de fluorescência do fluido receptor, no
ensaio de Células de Franz, na presença e ausência de Co2+, mostraram que a calceína
permeada pela pele encontra-se essencialmente na forma não encapsulada. Os
resultados sustentam o modelo de que as vesículas ultradeformáveis não penetrariam nas
camadas mais profundas da pele de forma intacta promovendo absorção transdérmica de
calceína, mas atuariam como sistema de liberação sustentada, limitando tanto a
permeação cutânea quanto a absorção transdérmica de calceína para a circulação.
Lipossomas mucoadesivos, com diâmetro hidrodinâmico médio de 200 nm,
contendo calceína, foram preparados a partir de diestearoilfosfatidilcolina, dicetilfosfato e
colesterol, na razão molar de 8:2:1 e recobertos com o polímero catiônico, quitosana. O
estudo de estabilidade mostrou que os lipossomas, tanto na presença ou ausência da
quitosana, retiveram mais que 90% da calceína encapsulada, quando armazenados a 4ºC
por até 14 dias. O estudo absorção por via oral, realizado em camundongos Swiss, indica
que a calceína encapsulada em lipossomas sem e com quitosana mostrou a mesma
farmacocinética plasmática que a calceína administrada na forma livre, sugerindo uma
instabilidade dos lipossomas. Esta interpretação foi confirmada pelos ensaios de liberação
da calceína in vitro, que mostraram que o pH ácido e a adição do tensoativo deoxicolato
de sódio, como modelo de sal biliar, aumentaram a liberação de calceína dos lipossomas.
Estes resultados deixam dúvidas em relação ao potencial destes lipossomas como
sistema de liberação controlada de fármaco hidrofílico e de massa molar intermediária por
via oral.
Palavras-chave: lipossomas ultradeformáveis, absorção transdérmica, permeação
cutânea, lipossomas mucoadesivos, absorção oral, calceína, farmacocinética,
permeabilidade, quitosana.
ABSTRACT
The main advantage of the administration of drugs by non-invasive routes such as
oral, nasal, pulmonary and topical, is the ease of application, which helps to increase
adherence to the treatment. Hydrophilic drugs with intermediate molecular weight (> 300-
500 Da) generally are poorly permeable across biological membranes and show a low
bioavailability by these routes. Strategies are being developped to overcome these
limitations, and, among the most promising, is the use of drug carriers, such as liposomes.
Ultradeformable liposomes, made from a specific combination of phospholipids and
surfactants, allowing the formation of highly deformable and elastic vesicles were were
presented in the literature as a unique carrier system capable of promoting transdermal
drug absorption. The mode of action of these vesicles with respect to their mechanism of
carrying and the factors that determine the depth of drug penetration after topical
application, have not been elucidated so far.
Mucoadhesives liposomes, prepared from negatively charged lipids and coated
with cationic polymers, were found to adhere to the gastrointestinal mucosa, resulting in
increased drug bioavailability. However, there is a controversy on whether or not these
liposomes remain stable in the gastric fluid and in the presence of bile salts, being able to
control the release of encapsulated drug.
In this context, the goal of this thesis was to investigate the physico-chemical and
pharmacokinetic characteristics of the ultradeformable and mucoadhesive liposomes, in
order to clarify the mode of action and the therapeutic potential of these vesicles, mainly
for the administration of hydrophilic drugs of intermediate molecular weight. In this work,
calcein was used as fluorescent marker and a model of hydrophilic and low membrane
permeability drug.
Ultradeformable liposomes, with average hydrodynamic diameter of 100 nm, were
prepared from soya phosphatidylcholine and sodium cholate in the presence of calcein.
The ability of Co2+ ion to quench the fluorescence of calcein allowed determining the drug
encapsulation efficiency and the membrane permeability to calcein of ultradeformable
vesicles. For the first time, we report that ultradeformable liposomes exhibited high
membrane permeability to calcein, which was explained by the combined effect of sodium
colate and ethanol on the liposome membrane. We observed that the evaporation of water
in the formulation resulted in increasing the calcein encapsulation efficiency, suggesting
that this phenomenon may occur after topical application of the formulation under non-
occlusive condition. In both the in vivo transdermal (percutaneous) absorption of calcein to
the blood circulation, carried out in mice Hair Less, and the in vitro percutaneous skin
permeation, using Franz Diffusion Cells, the ultradeformable vesicles reduced the rate of
calcein permeated. The fluorescence measurements of the receptor fluid of the Franz
diffusion cell in the absence and presence of Co2+ revealed that the permeated calcein
existed essentially under the non-encapsulated form. Our results supports the model that
ultradeformable vesicles do not penetrate intact into the deeper layers of the skin, but act
as sustained release system, limiting both the cutaneous permeation and the transdermal
absorption of calcein to the blood circulation.
Mucoadhesives liposomes, with average hydrodynamic diameter of 200 nm,
containing calcein were prepared from distearoylphosphatidylcholine, dicetylphosphate
and cholesterol, at molar ratio of 8:2:1, and coated with the chitosan cationic polymer. The
stability study showed that the liposomes, both in the presence and absence of chitosan,
were able to retain more than 90% of calcein encapsulated when stored at 4° C for 14
days. The oral absorption study, performed in Swiss mice, evidenced that liposome
encapsulated calcein, with and without chitosan, showed plasma pharmacokinetics similar
to the free calcein, suggesting instability of these liposomes. This interpretation was
supported by in vitro release study of calcein from the liposome suspension, which showed
that the acidic pH or the addition of sodium deoxycholate, used as a model of bile salt,
increased the release of calcein from liposomes. Our results support the model that these
liposomes, given orally, are not stable enough to act as a sustained release of hydrophilic
drug of intermediate molecular weight.
Keywords: ultradeformable liposomes, transdermal absorption, cutaneous permeation,
mucoadhesive liposomes, oral absorption, pharmacokinetics, calcein, permeability,
chitosan.
Lista de Figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática da estrutura da pele ................................. 16
Figura 2: Representação esquemática do estrato córneo e de duas vias para a
absorção de substâncias pela pele . ..................................................................... 18
Figura 3: Representação esquemática das camadas do trato gastrointestinal ..... 22
Figura 4: Características estruturais dos lipossomas. ........................................... 30
Figura 5: Transição de fases das membranas lipídicas e o efeito do colesterol. .. 32
Figura 6: Lipossomas incorporando diferentes substâncias funcionalizantes. ...... 34
Figura 7: Representação esquemática de uma vesícula ultradeformável ............. 36
Figura 8: Estrutura química da quitosana.............................................................. 41
Figura 9: Estrutura da calceína no pH 7. ............................................................... 44
Figura 10: Representação esquemática do modo de preparo dos lipossomas
ultradeformáveis.................................................................................................... 50
Figura 11: Representação esquemática do método utilizado para determinação da
permeabilidade da membrana dos lipossomas à calceína. ................................... 55
Figura 12: Representação esquemática do procedimento para avaliação in vivo da
absorção transdérmica da calceína....................................................................... 62
Figura 13: Representação esquemática de uma Célula de Difusão de Franz....... 64
Figura 14: Cinética de incorporação de calceína em lipossomas ultradeformáveis
de diferentes composições.................................................................................... 69
Figura 15: Deformabilidade de lipossomas de diferentes composições lipídicas. . 73
Figura 16: Relação entre a intensidade de fluorescência e a concentração de
calceína em plasma de animais.. .......................................................................... 74
Figura 17: Absorção transdérmica de calceína para a circulação sistêmica quando
aplicada topicamente em camundongos sem pêlo em diferentes formas.. ........... 77
Figura 18: Absorção transdérmica de calceína para a circulação sistêmica quando
aplicada topicamente em camundongos sem pêlo a partir de lipossomas
ultradeformáveis constituídos de SPC ou EPC.. ................................................... 78
Figura 19: Farmacocinéticas plasmáticas de calceína quando aplicada
topicamente em camundongos sem pêlo a partir de diferentes formulações. ...... 80
Lista de Figuras
Figura 20: Quantidades de calceína incorporada na derme e depositada na
superfície do estrato córneo em camundongos sem pêlo ..................................... 83
Figura 21: Porcentagens acumuladas de calceína permeada através da pele do
dorso de camundongos sem pêlo nos experimentos de Células de Franz.. ......... 85
Figura 22: Curvas de regressão linear para as relações de % de calceína
permeada em função de t ou em função de √(t) em experimentos de Células de
Franz. .................................................................................................................... 88
Figura 23: Sinais de fluorescência dos líquidos receptores antes e após a adição
de CoCl2 e Triton X-100......................................................................................... 91
Figura 24: Representação esquemática do modo de preparo dos lipossomas
aniônicos e mucoadesivos. ................................................................................... 97
Figura 25: Representação esquemática do ensaio de estabilidade dos lipossomas
mucoadesivos ....................................................................................................... 99
Figura 26: Representação esquemática do procedimento utilizado para o estudo
da absorção da calceína por via oral................................................................... 100
Figura 27: Cinéticas de liberação de calceína a partir de lipossomas armazenados
a 4ºC com e sem quitosana. ............................................................................... 103
Figura 28: Farmacocinéticas plasmáticas da calceína, em camundongos Swiss,
após administração oral de diferentes formulações.. .......................................... 105
Figura 29: Efeito do deoxicolato na taxa (%) de calceína liberada de lipossomas
aniônicos (sem quitosana) ou de lipossomas mucoadesivos (com quitosana), em
meios de diferentes pHs...................................................................................... 108
Figura 30: Influência do pH do meio na taxa (%) de calceína liberada de
lipossomas mucoadesivos ou de lipossoma sem quitosana ............................... 110
Lista de Tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Fosfatidilcolina utilizadas no preparo de lipossomas: temperatura de
transição de fase e estado físico da membrana formada a 37ºC. ......................... 31
Tabela 2: Composição química das vesículas ultradeformáveis utilizadas para a
administração transdérmica de diferentes fármacos. ............................................ 37
Tabela 3: Meios utilizados para avaliação da interferência dos componentes das
vesículas ultradeformáveis em ensaios in vitro e in vivo. ...................................... 52
Tabela 4: Eficiência de encapsulação da calceína em suspensões de lipossomas
ultradeformáveis preparados em diferentes concentrações. ................................. 68
Tabela 5: Permeabilidade à calceina, a 25°C, de dif erentes membranas: influência
da razão fosfolipídio/colato, da concentração total da suspensão e do tipo de
fosfolipídio. ............................................................................................................ 70
Tabela 6: Dados relativos à precisão do método de dosagem da calceína no
plasma de animais ................................................................................................ 75
Tabela 7: Valores médios ± DP dos coeficientes de regressão linear para as
relações de % de calceína permeada in vitro em função de t (modelo 1) ou em
função de √(t) (modelo 2). ..................................................................................... 87
Tabela 8: Frações de calceína encapsulada (não acessível ao íon cobalto)
determinadas no fluído receptor da Célula de Franz 2 e 8 horas após aplicação
tópica de calceína encapsulada em lipossomas ultradeformáveis ou livre em colato
e etanol, em pele de camundongos sem pêlo. ...................................................... 90
Lista de Abreviaturas
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Ce: concentração molar do fármaco no fluido doador
Ci : concentração molar do fármaco no fluido receptor
CHOL: colesterol
COL: colato de sódio
CV: coeficiente de variação
DMPC: dimiristoilfosfatidilcolina
DP: desvio padrão
DPPC: dipalmitoilfosfatidilcolina
DSPC: distearoilfosfatidilcolina
EPC: fosfatidilcolina natural de ovo
J: fluxo do fármaco através da pele
LD: limite de detecção
LQ: limite de quantificação
M: concentração média
P: coeficiente de permeabilidade
SPC: fosfatidilcolina natural de soja
Tf: temperatura de transição de fase
Sumário
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... 1
LISTA DE TABELAS ............................................................................................. 11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ................................................................ 12
SUMÁRIO.............................................................................................................. 13
INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 15
1. VIAS NÃO INVASIVAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE MEDICAMENTOS..... 15
1.1. Via tópica ................................................................................................. 15
1.2. Via oral..................................................................................................... 21
2. Lipossomas como carreadores de fármacos ................................................. 28
2.1. Lipossomas: estrutura, composição e propriedades básicas................... 29
2.2. Lipossomas ultradeformáveis .................................................................. 36
2.3. Lipossomas mucoadesivos...................................................................... 41
3. Calceína como marcador de lipossomas ....................................................... 44
OBJETIVOS .......................................................................................................... 47
CAPÍTULO 1: LIPOSSOMAS ULTRADEFORMÁVEIS PARA ADMINISTRAÇÃO
TRANSDÉRMICA DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS ............................................ 48
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 48
2. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 49
2.1. Preparação das formulações de calceína................................................ 49
2.2. Caracterização físico-química dos lipossomas ultradeformáveis............. 51
2.3. Validação do método fluorimétrico de dosagem da calceina presente em
plasma de animais.......................................................................................... 58
2.4. Avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína a partir de
lipossomas ultradeformáveis .......................................................................... 61
2.5. Avaliação da permeação cutânea in vitro da calceína a partir de
lipossomas ultradeformáveis .......................................................................... 63
2.6. Aspectos éticos no manuseio dos animais .............................................. 66
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................... 66
3.1. Caracterização físico-química dos lipossomas ultradeformáveis............. 66
Sumário
3.2. Validação do método de dosagem por fluorimetria da calceína em plasma
de animais ...................................................................................................... 74
3.3. Avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína a partir de
lipossomas ultradeformáveis .......................................................................... 76
3.4. Avaliação da permeação cutânea da calceína in vitro a partir dos
lipossomas ultradeformáveis .......................................................................... 85
3.5. Avaliação da porcentagem de encapsulação da calceína após permeação
pela pele ......................................................................................................... 89
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 91
CAPÍTULO 2: LIPOSSOMAS MUCOADESIVOS PARA ADMINISTRAÇÃO ORAL
DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS.......................................................................... 94
1. INTRODUÇÃO............................................................................................... 94
2. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 95
2.1. Preparação da solução de quitosana....................................................... 95
2.2. Preparação da formulação de lipossomas mucoadesivos ....................... 96
2.3. Caracterização físico-química dos lipossomas mucoadesivos ................ 98
2.4. Avaliação da absorção de calceína por via oral a partir de lipossomas
mucoadesivos................................................................................................. 99
2.5. Liberação da calceína a partir das formulações de lipossomas em
diferentes meios simulando os fluídos biológicos ......................................... 101
2.6. Aspectos éticos no manuseio dos animais ............................................ 101
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................... 102
3.1. Caracterização físico-química dos lipossomas mucoadesivos .............. 102
3.2. Avaliação da absorção de calceína por via oral em camundongos a partir
de lipossomas mucoadesivos ....................................................................... 104
3.3. Liberação da calceína a partir de formulações de lipossomas em
diferentes meios simulando os fluídos biológicos ......................................... 106
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS ......................................................................... 111
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 113
ANEXOS ............................................................................................................. 122
Introdução 15
INTRODUÇÃO
1. VIAS NÃO INVASIVAS PARA ADMINISTRAÇÃO DE MEDICAM ENTOS
A principal vantagem da administração de medicamentos por vias não
invasivas, como oral, tópica, nasal, e pulmonar, é a facilidade de aplicação,
contribuindo para aumentar a adesão do paciente ao tratamento. Além do mais, as
vias oral e tópica oferecem uma grande área superficial, aumentando o fluxo e a
extensão da absorção dos fármacos administrados.
1.1. Via tópica
A administração de fármacos por via tópica apresenta a vantagem da grande
área superficial da pele, já que este é o maior órgão do corpo humano. Os
fármacos presentes nas formulações podem acumular-se na epiderme,
promovendo um efeito local, ou sofrerem absorção transdérmica, promovendo
ações farmacológicas sistêmicas. A maior limitação desta via de administração é a
baixa permeabilidade de substâncias através da pele, já que esta tem a função de
atuar como uma barreira entre o corpo e o ambiente exterior.
1.1.1. Estrutura e funções da pele
A função da pele é proteger o organismo das agressões do meio externo,
como poluição, variações de temperatura, umidade e radiação. Devido à sua
estrutura, a pele limita a entrada de substâncias no corpo, atuando como uma
barreira à entrada de microorganismos e substâncias químicas, preservando os
órgãos internos. Promove regulação da temperatura corporal, mantendo o corpo a
37ºC, protege o organismo de radiações e choques elétricos e media as
sensações de calor, frio, toque e dor (Barry, 2007).
Como ilustrado na Figura 1, a estrutura da pele é complexa, composta de 3
camadas: epiderme, derme e camada subcutânea. A epiderme é uma camada
estratificada e avascular, e pode ser dividida em várias sub-camadas, onde
encontra-se células em diferentes estágios de diferenciação celular. Na camada
Introdução 16
basal as células proliferam e migram em direção à superfície da pele, alcançando
a camada espinhosa, onde inicia o processo de diferenciação celular. Acima desta
região, encontra-se a camada granulosa, e, na interface com o estrato córneo,
ocorre o final da diferenciação, no qual as células viáveis se transformam em
células mortas queratinizadas. A camada externa da epiderme é chamada de
estrato córneo, sendo considerada a principal barreira à passagem de substâncias
pela pele (Bowstra e col., 2002; Barry 2007; Guzzo e col., 1996).
Figura 1: Representação esquemática da estrutura da pele compreendo as 3 camadas:
epiderme, derme e camada subcutânea. (Adaptado de B ouwstra e col., 2002)
O estrato córneo é composto por camadas densas de células mortas,
chamadas de corneócitos, contendo proteínas fibrosas e queratina. Estas células,
produzidas pela epiderme, estão constantemente se soltando em finas escamas e
sendo substituídas por novas. Os corneócitos são constituídos por queratina e seu
espaço intercelular é composto por múltiplas camadas de lipídios, ceramidas,
ácidos graxos, colesterol e ésteres de colesterol, formando regiões de diferentes
tipos de domínios (semicristalino, gel ou cristal líquido). A presença do estrato
córneo limita as absorções cutânea e percutânea de substâncias, impede a
evaporação de água dos tecidos mais profundos e atua como uma barreira para
grandes quantidades de água e substâncias que estão em contato com a pele; a
ausência desta camada, devido a alguma doença, cortes ou danos, favorece o
Introdução 17
aumento da absorção de fármacos através da pele (Verma e col., 2003; Bouwstra
e col., 2002; Barry, 2001; Cevc e col., 1996, 2004).
A derme é constituída por tecido conjuntivo contendo proteínas fibrosas
como colágeno, elastina e reticulina. Esta camada é altamente vascularizada com
presença de nervos, vasos sanguíneos e linfáticos. Nesta camada encontram-se
os apêndices, constituídos pelas glândulas sudoríparas, glândulas sebáceas,
folículos pilosos e as unhas. Por ser uma camada constituída de células viáveis, a
derme pode metabolizar e inativar fármacos, além de converter nutrientes,
remover substâncias e regular pressão e temperatura.
A camada subcutânea ou hipoderme é constituída basicamente por
gordura, sendo responsável por formar uma barreira térmica e mecânica (Barry,
2007; Bouwstra e col., 2002; Cevc e col., 1996).
1.1.2. Vias de penetração de substâncias na pele
Como mostrado na Figura 2, existem três vias potenciais para a passagem
das substâncias pela pele: através dos apêndices como os folículos pilosos,
glândulas sebáceas e ductos de secreção de suor; a via transcelular, isto é,
passando pelas células do estrato córneo; ou a via intercelular, compreendendo a
passagem de substâncias entre os corneócitos.
Os pêlos e os apêndices estão distribuídos na pele de maneira não uniforme,
correspondendo a apenas 0,1 a 0,5% da sua superfície total. Devido à sua
pequena área disponível, pode-se considerar que esta rota contribui muito pouco
para o transporte de substâncias pela pele.
Como o estrato córneo é uma camada de células mortas, pode-se considerar
que não existe transporte ativo de substâncias, desta forma, a via transcelular
contribui pouco para a passagem de substâncias pela pele.
A maioria das moléculas penetra na pele através da via intercelular e a
principal limitação à permeação de substâncias é a presença do estrato córneo
(Barry, 2001; Cevc e col., 1996).
Introdução 18
Figura 2: Representação esquemática do estrato córn eo e de duas vias (intercelular e
transcelular) para a absorção de substâncias pela p ele (Adaptado de Barry, 2001).
1.1.3. Fatores que afetam a passagem de substâncias pela pele
Vários fatores governam a permeação de substâncias pela pele quando
aplicadas topicamente: as características físico-químicas da substância como
tamanho, solubilidade, coeficiente de partição; o local de aplicação e as condições
da pele; o tipo de formulação; e os componentes presentes no veículo.
Em relação às condições da pele, a hidratação do estrato córneo é o fator
considerado mais importante. Quando a pele está hidratada ocorre um aumento
da permeação de substâncias através da pele. Geralmente, o estrato córneo é
resistente a variações de temperatura e pH, suportando alterações sem alterar sua
permeabilidade (Barry, 2007).
Em relação às características físico-químicas do fármaco, a taxa de absorção
está inversamente relacionada ao tamanho da molécula, isto é, moléculas
menores penetram mais facilmente que moléculas maiores (Barry, 2001, 2007;
Verma e col., 2003, Cevc e col., 1996, 2004). Outra característica físico-química
Introdução 19
importante do fármaco é o coeficiente de partição óleo/água, que determina o seu
fluxo através do estrato córneo. Este deve ter um valor balanceado, pois um valor
muito alto significa que o fármaco é lipossolúvel e não passa facilmente pelo
estrato córneo devido a presença de água nos tecidos mais profundos e um valor
muito baixo indica que a molécula é muito hidrossolúvel para se difundir através
do componente lipídico do estrato córneo (Barry, 2007).
Geralmente, moléculas com massa molar intermediária (>300-500 Da),
coeficiente partição óleo/água muito baixo, ou moléculas iônicas, não penetram
facilmente pela pele (Barry, 2001, 2007; Cevc e col., 1996, 2004).
1.1.4. Estratégias para aumentar a penetração de fármacos na pele
A maioria dos fármacos não é absorvida pela pele, porém vários métodos
têm sido empregados para aumentar o transporte destas substâncias através da
pele.
O grau de hidratação do estrato córneo é um fator importante que influencia
a penetração de substâncias na pele. Assim, agentes emulsificantes, filmes
oclusivos (filmes plásticos), materiais lipofílicos (parafinas, óleos, ácidos graxos,
silicones) e patches transdérmicos, que aumentam o grau de hidratação do estrato
córneo, permitem aumentar a biodisponibilidade de alguns fármacos na pele
(Barry, 2001, 2007).
Métodos elétricos, como eletroporação (aplicação de vários pulsos elétricos
curtos), iontoforese (aplicação de um pulso elétrico curto e contínuo) e ultrasom,
promovem a formação de poros aquosos entre as bicamadas lipídicas ou
favorecem a ruptura da camada lipídica presente nos espaços intercelulares do
estrato córneo, contribuindo para aumentar o transporte de substâncias através da
pele. Uma das limitações dessas técnicas é a necessidade de validar a segurança
e a eficácia nos pacientes. Outro problema é que estes equipamentos não estão
disponíveis para uso doméstico (Prausnitz, 1999; Guy, 1998; Mitragotri e col.,
1995; Barry, 2001).
Algumas substâncias químicas, quando aplicadas topicamente, podem atuar
como promotores de absorção. Estas substâncias devem ser inertes, atóxicas,
Introdução 20
não irritantes, não alergênicas e compatíveis com a formulação. Devem também
ter ação imediata e, quando retiradas da pele, esta deve retornar às suas
condições normais. Alguns exemplos de promotores de absorção: água, sulfóxidos
como o dimetilsulfóxido; pirrolidonas; lipídios como os ácidos oléico e graxos;
alcoóis e glicóis; tensoativos aniônicos, catiônicos e não iônicos; e amidas como
uréia e seus derivados. Entre as substâncias a serem utilizadas no presente
trabalho de tese e que já foram descritas como promotores de absorção, podemos
citar o colato de sódio (Borg, 2000) e o etanol (Berner e col., 1995).
Estes promotores de absorção podem interagir com os lipídios do estrato
córneo desorganizando sua estrutura, formando, por exemplo, poros, tornando o
estrato córneo mais permeável a algumas substâncias. Podem também mudar as
propriedades físico-químicas do fármaco, aumentando seu coeficiente de partição
no estrato córneo ou interagir com a queratina presente nos corneócitos, abrindo a
estrutura densa de camada de células (Barry, 2001, 2007).
Outra estratégia utilizada para aumentar a absorção cutânea ou transdérmica
de fármacos é a utilização de sistemas carreadores de fármacos. Entre os
sistemas carreadores existentes, destacam-se: as vesículas ultradeformáveis, que
são obtidas pela mistura de fosfolipídios e tensoativos, formando os
Transfersomes® (Cevc e col., 1998, 2001); os etossomas, obtidos pela inclusão
de etanol em suspensão de vesículas lipídicas (Touitou e col., 2000, 2001); ou os
niossomas, formados por tensoativos não iônicos, (Schreier e col., 1994; Fang e
col., 2001). Essas vesículas apresentam a característica única de promover a
absorção dérmica ou transdérmica de fármacos, facilitando sua passagem pela
pele.
1.1.5. Modelos para a permeação de fármacos pela pele a partir de uma
formulação
Na absorção percutânea de um fármaco a partir de uma formulação tópica,
essencialmente duas situações distintas podem ser encontradas. Na primeira
situação, a etapa limitante para a permeação do fármaco pela pele é a sua
Introdução 21
passagem através da pele, e mais especificamente, pelo estrato córneo. Nessa
condição, a lei geral de difusão prevalece: eCPJ *= , onde J representa o fluxo
do fármaco através da pele, Ce representa a concentração molar do fármaco no
veículo em contato com a pele, e P representa o coeficiente de permeabilidade do
fármaco através do estrato córneo. Podemos prever que o fluxo do fármaco
manter-se-á constante enquanto Ce não variará significativamente. Neste
contexto, esperamos uma relação linear entre a percentagem do fármaco
permeado e o tempo.
Na segunda situação, a etapa limitante para a permeação do fármaco pela
pele é a difusão do fármaco no próprio veículo e não sua passagem através do
estrato córneo. Nessa condição, a relação entre a percentagem de fármaco
permeada e o tempo não é linear, mas espera-se que exista uma relação linear
entre a percentagem de calceína permeada e a raiz quadrada do tempo (Barry
2007).
Quando a formulação atua alterando a permeabilidade da pele ao fármaco,
não se espera que haja concordância com os dois modelos apresentados acima.
1.2. Via oral
A via oral é a forma de administração mais comum, sendo considerada a
mais segura e econômica, além das formulações orais serem de fácil produção
industrial. A absorção de medicamentos ocorre no trato gastrointestinal e depende
de vários fatores como o estado físico do medicamento (solução, suspensão,
comprimidos, cápsulas), o fluxo sanguíneo, o tempo de esvaziamento gástrico, a
concentração do fármaco no local da absorção e as características físico-químicas
do fármaco. De maneira geral, fármacos não ionizados ou lipofílicos são bem
absorvidos (Benet e col., 1996).
Introdução 22
1.2.1. Estrutura do trato gastrointestinal
O trato gastrointestinal é um tubo muscular dividido em 4 partes: esôfago,
estômago, intestino delgado e intestino grosso (cólon).
Como ilustrado na Figura 3, a parede de todas as partes do trato
gastrointestinal é constituída de 4 camadas: a serosa, a musculatura externa, a
submucosa e a mucosa. A serosa é a camada mais externa, constituída por
tecido conjuntivo. Sob esta camada encontra-se a musculatura externa constituída
por tecido muscular liso. A submucosa é constituída por tecido conjuntivo
contendo tecido secretório, vasos sanguíneos e linfáticos e células nervosas. Após
esta camada, encontra-se a mucosa. Toda a superfície do trato gastrointestinal é
revestida pela mucosa, que é composta por 3 camadas: uma camada de tecido
muscular, uma camada de tecido conjuntivo e uma camada epitelial, cuja
superfície é caracterizada pela presença de muco (Smart, 2005; Ashford, 2007a).
Figura 3: Representação esquemática das camadas do trato gastrointestinal (Adaptado de
Ashford, 2007a).
O muco está presente na forma de um gel aquoso translúcido aderido na
superfície da camada epitelial ou pode encontrar-se no lúmen do trato
gastrointestinal. É composto de 95% de água com presença de glicoproteínas,
sais inorgânicos e lipídios. As mucinas são as glicoproteínas mais importantes
presentes no muco, sendo responsáveis por suas propriedades de formação do
gel e adesão; possuem carga negativa, podendo interagir com moléculas com
carga positiva. A espessura do muco pode variar de 50 a 500 µm no estômago e
Introdução 23
de 15 a 150 µm no cólon, e suas principais funções são proteção, lubrificação e
adesão de substâncias (Smart, 2005; Woodley, 2001; Ponchel e col., 1998).
1.2.2. Trânsito de fármacos no trato gastrointestinal
Os medicamentos administrados por via oral passam rapidamente pelo
esôfago, sendo a velocidade dependente do tipo de formulação farmacêutica.
Formulações líquidas passam mais rapidamente que formulações sólidas, como
comprimidos e cápsulas.
Ao chegar no estômago, o tempo de permanência do fármaco pode variar de
5 minutos a 2 horas, dependo da dosagem, da forma farmacêutica e da presença
de alimentos. Os movimentos peristálticos, isto é, as contrações do estômago, são
responsáveis por misturar e quebrar os alimentos e os medicamentos, liberando
os fármacos e por mover estas substâncias para o intestino delgado. Em geral,
alimentos contendo gorduras diminuem o esvaziamento gástrico, reduzindo a
absorção dos fármacos. Estes, quando administrados na presença de água,
alcançam o intestino mais rapidamente quando o estômago está sem alimentos
(Ashford, 2007a).
O intestino delgado é o principal local de absorção da maioria dos fármacos
e nutrientes. O trânsito das substâncias nesta região leva cerca de 3 horas. O
tempo de permanência das substâncias no intestino é importante para a
biodisponibilidade dos fármacos.
O trânsito de fármacos no intestino grosso é longo e variável, podendo durar
de 2 a 48 horas, dependendo do tipo de forma farmacêutica, dos alimentos
presentes e do tipo de doença associada (Ashford, 2007a).
1.2.3. Mecanismos de absorção de fármacos pelo trato gastrointestinal
A principal barreira à absorção de fármacos é a membrana celular do trato
gastrointestinal. Esta membrana comporta-se como uma barreira lipídica, cujo
meio externo é aquoso, sendo permeável a aminoácidos, açúcares, ácidos graxos,
e outros nutrientes, porem é impermeável às proteínas plasmáticas. Ela permite a
Introdução 24
passagem de moléculas lipofílicas, água e moléculas hidrofílicas de baixa massa
molar, tipicamente inferior a 500 Da (Ashford, 2007a).
Existem duas vias de passagem diferentes das moléculas através do epitélio
do trato gastrointestinal: a via transcelular (através das células) e a via paracelular
(entre as células). A maioria dos fármacos é absorvida pela rota transcelular de
forma passiva.
A via transcelular é a via mais utilizada, e pode ser realizada por 2
mecanismos: difusão passiva ou transporte mediado por carreadores. A difusão
passiva é a via preferencial para moléculas lipofílicas pequenas, na qual as
moléculas passam através da membrana celular de uma região de alta
concentração (lúmen) para uma região de baixa concentração (circulação
sanguínea). A taxa de transporte é determinada pelas características físico-
químicas do fármaco, pela natureza da membrana e pela concentração do
fármaco no local de absorção, que está relacionado à sua dissolução. Algumas
substâncias, como açúcares, eletrólitos, vitaminas, sais biliares, fármacos, são
absorvidas pela via transcelular através do mecanismo de transporte mediado por
carreadores. Neste caso, a molécula forma um complexo com o transportador na
superfície da membrana celular, este complexo se move através da membrana, e
libera a substância do outro lado da membrana. Neste tipo de transporte, as
substâncias podem ser transportadas contra o gradiente de potencial
eletroquímico da substância.
A via paracelular é importante para o transporte de íons como cálcio,
açúcares, aminoácidos e peptídeos. Moléculas hidrofílicas pequenas (até 200 Da)
e ionicamente carregadas, que não se distribuem muito bem na membrana celular,
são absorvidas pela via paracelular. O transporte de fármacos nesta via ocorre
pelos poros aquosos existentes entre as células, ocupando apenas 0,01% da área
superficial do epitélio (Ashford, 2007a).
Existem também, no epitélio do trato gastrointestinal, sistemas de transporte
ativo capazes de expelirem fármacos de volta para o lúmen do trato
gastrointestinal após terem sido absorvidos. O responsável por esta atividade de
transporte são proteínas transmembranas pertencentes à família ABC (ATP
Introdução 25
binding cassette), que são expressas em altos níveis nas células da região do
jejuno. Estas proteínas estão presentes em outros órgãos do organismo e está
associada à resistência de vários fármacos quimioterápicos por inibir o acúmulo
intracelular do fármaco nos tumores (Ashford, 2007a; Loftson e col., 2004).
Os fármacos, do tipo ácido ou base fracos, encontram-se na forma não
ionizada ou ionizada. Quando estão na forma não ionizada, os fármacos são
lipossolúveis e podem se difundir pela membrana celular, porém na forma ionizada
não conseguem penetrar na membrana lipídica. Um fator importante para a
absorção desses fármacos é o gradiente de pH transmembrana. O pH do plasma
é 7,4 e do suco gástrico é 1,4, isto cria um gradiente de pH transmembrana, que
influencia a distribuição do fármaco, que dependerá do seu pKa (Benet e col.,
1996).
1.2.4. Barreiras à absorção de fármacos
Existem algumas barreiras que dificultam a absorção de fármacos pelo trato
gastrointestinal que pode estar relacionadas ao trato gastrointestinal ou às
características físico-químicas dos fármacos.
Em relação ao trato gastrointestinal, o pH e a presença de várias enzimas
como lípases, amilases, pepsina e proteases podem influenciar a absorção dos
fármacos por alterar a estabilidade química de algumas substâncias, podendo
levar à sua degradação no meio gastrointestinal antes de serem absorvidos. Os
valores de pH variam ao longo do trato gastrointestinal. O fluido gástrico é
extremamente ácido, com valores de pH entre 1 (na presença de alimento) a 3,5
(na ausência de alimento). No intestino, os valores de pH são maiores que no
estômago por serem neutralizados por bicarbonatos secretados nesta região.
Estes valores vão aumentando ao longo do trato gastrointestinal, variando de 4,9,
6,5 e 7,4 no duodeno, jejuno e íleo, respectivamente, na ausência de alimentos. O
fluido intestinal é composto por secreções pancreáticas que contém bicarbonato
de sódio, enzimas como proteases, amilases e lípases e por bile secretada pelos
hepatócitos. A bile é uma mistura complexa que contém ácidos biliares (derivados
do ácido cólico), fosfolipídios, colesterol, bilirrubina, sódio e potássio, cuja principal
Introdução 26
função é emulsificar e solubilizar os ácidos graxos provenientes da dieta, para
serem absorvidos. Estes valores de pH e a presença dos constituintes do fluido
intestinal são importantes pois podem alterar a estabilidade química dos fármacos
e influenciar na taxa e extensão da absorção.
A presença de alimento pode influenciar a absorção de fármacos, pois pode
ocorrer complexação com os alimentos, formando complexos insolúveis, que não
serão absorvidos. Os alimentos podem alterar o pH do estômago e do intestino,
alterando as características físico-químicas do fármaco ou podem alterar os
movimentos peristálticos, diminuindo o tempo de permanência dos fármacos no
intestino (Ashord, 2007 b; Ponchel et al, 1998).
As propriedades físico-químicas dos fármacos podem também limitar sua
absorção. Para ser bem absorvido através da mucosa, o fármaco deve possuir
boa solubilidade em água, para estar dissolvido na superfície da mucosa, mas ao
mesmo tempo deve ter certa lipofilicidade, isto é, ter partição do meio externo
aquoso para a membrana da mucosa lipofílica. Desta forma, a baixa solubilidade
de alguns compostos nos fluidos do trato gastrointestinal pode resultar na
eliminação do fármaco antes de sua absorção. Além do mais, moléculas
hidrofílicas com massa molar maior que 500 Da não são bem absorvidas pela
mucosa gastrointestinal. Algumas substâncias apresentam baixa permeabilidade
através da mucosa intestinal ou uma permeabilidade restrita a somente algumas
regiões do trato gastrointestinal (Ashord, 2007 b; Ponchel e col., 1998; Loftsson e
col., 2004).
Todos estes fatores podem comprometer a disponibilidade do fármaco,
tornando até mesmo inviável a utilização desta via de administração para certos
bioativos.
1.2.5. Estratégias para aumentar a absorção de fármacos no trato
gastrointestinal
Para que um fármaco seja absorvido, é necessário que, após sua
administração, ele passe pelo esôfago e chegue ao estômago. Ele deve passar
pelo estômago sem sofrer degradação pelas enzimas ou pelo pH ácido, sem
Introdução 27
perder sua estabilidade química. O fármaco deve chegar ao intestino, dissolvido
em solução, e deve permanecer ali por tempo suficiente para que seja absorvido.
Qualquer modificação neste processo pode alterar a biodisponibilidade do
fármaco.
Diversas estratégias podem ser usadas para aumentar a absorção e a
biodisponibilidade dos fármacos quando administrados por via oral, seja
protegendo os fármacos da degradação causada pelo pH ácido e pela ação das
enzimas presentes no trato gastrointestinal ou promovendo o aumento da
absorção através da mucosa gastrointestinal (Silva e col., 2002; Arhewoh e col.,
2005; Sarmento, 2008).
Uma estratégia baseia-se na administração de inibidores das enzimas
proteolíticas, juntamente com o fármaco. A maioria dos inibidores disponíveis
apresenta a desvantagem de ser tóxico a nível sistêmico e irritante da mucosa
intestinal, ocasionando efeitos colaterais importantes, o que limita o seu uso.
Alguns exemplos de inibidores enzimáticos são: aprotinina, mesilato de camostato,
inibidores flavonóides, quimostatina, elastatina, EDTA, derivados do poliacrilato,
conjugados quitosana-EDTA, bestatina, amastatina, puromicina, glicolato de sódio,
derivados do ácido α-animoborônico (Langguth e col., 1997).
Modificações químicas podem ser feitas no fármaco com objetivo de obter
compostos mais lipofílicos, evitando assim degradação proteolítica ou aumentar a
absorção (Bungaard, 1992).
A utilização de promotores de absorção como agentes quelantes (EDTA,
salicilatos, ácido cítrico), tensoativos aniônicos (dodecilsulfato de sódio, lauril
sulfato de sódio), tensoativos catiônicos, tensoativos não iônicos (Tween 80),
ácidos graxos (ácido oléico, caprílico, palmitoilcarnitina), uréias cíclicas e sais
biliares (deoxicolato de sódio, glicolato sódico, taurocolato de sódio) pode alterar a
permeabilidade da membrana do trato gastrointestinal, aumentando a absorção
dos fármacos (Zhou, 1994; Aungst, 2000).
A utilização de sistemas carreadores de fármacos como emulsões, partículas
poliméricas ou lipídicas, lipossomas ou ciclodextrinas pode ser utilizada para
proteger os fármacos da degradação enzimática e para aumentar a absorção dos
Introdução 28
fármacos através da mucosa gastrointestinal. O problema da utilização de
lipossomas é sua baixa estabilidade no meio ácido e na presença de sais biliares
(Allemann e col., 1998; Chen e col., 1998; Shao e col., 1994; Trenktrog e col.,
1995).
Outra estratégia para aumentar a absorção de fármacos baseia-se na
utilização de polímeros bioadesivos, de origem natural ou sintética, que atuam
como promotores de adesão por possuirem a capacidade de aderir na mucosa
intestinal. Alguns exemplos de polímeros mucoadesivos são os carbômeros
(carbopol), a quitosana, o alginato de sódio e os derivados de celulose
(carboximetilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose), que podem ser usados no
preparo de diferentes tipos de formulações como comprimidos, patches,
micro/nanopartículas, pomadas, pastas e lipossomas (Woodley, 2001; Ponchel et
al, 1998; Smart, 2005; Fogueri e col.,2009).
Essas duas últimas estratégias podem ser combinadas objetivando uma
maior biodisponibilidade do fármaco. Lipossomas podem ser preparados e serem
revestidos com polímeros mucoadesivos como a quitosana, promovendo ação
mais efetiva e prolongada, após administração oral de peptídeos (Takeuchi, 2005,
2001). O desenvolvimento de formulações baseadas em polímeros mucoadesivos
torna-se uma estratégia interessante para aumentar a biodisponibilidade de
determinadas substâncias pela via oral, incluído fármacos hidrofílicos.
2. LIPOSSOMAS COMO CARREADORES DE FÁRMACOS
As vias não invasivas são geralmente procuradas, para administração de
fármacos, por permitirem uma maior facilidade de aplicação. Entretanto, como
mostramos previamente para as vias tópica e oral, certos fármacos, dependendo
das suas características físico-químicas, podem apresentar biodisponibilidade
insuficiente. Isto é o caso dos fármacos hidrofílicos de massa molar maior que 500
Da, principalmente aqueles ionizados. Fazem também parte desta categoria os
Introdução 29
biofármacos, incluindo os peptídeos, as proteínas e os ácidos nucléicos, que
representam a nova geração de fármacos emergindo no mercado farmacêutico.
Nesse contexto, estratégias estão sendo procuradas para superar estas
limitações. Entre as estratégias mais promissoras, destaca-se o uso de sistemas
transportadores de fármacos. Estes sistemas incluem os lipossomas, as
ciclodextrinas, as micro e nano-emulsões, as micro e nano-esferas e as micro e
nano-cápsulas. Estes sistemas transportadores podem ser usados para liberação
controlada de fármacos, permitindo manter seus níveis terapêuticos por tempo
prolongado. Podem também aumentar a absorção do fármaco, resultando em
maior biodisponibilidade e efeitos biológicos de maior intensidade (Kaparissides e
col., 2006; Jiang e col., 2007; Langer, 1990; Marcato e col., 2008).
Os lipossomas foram descritos pela primeira vez por Bangham e col. (1965)
na década de 60 e utilizados inicialmente como modelo lipídico de membranas
biológicas. A partir da década de 70, os lipossomas começaram a ser estudados
como sistemas carreadores de fármacos. Desde então, importantes aplicações
biomédicas deste sistema foram desenvolvidas baseadas na alteração da
farmacocinética do fármaco, resultando na melhora de suas ações farmacológicas
e na redução de seus efeitos colaterais (Samad e col.,2007; Frézard, 1999;
Nounou e col., 2008; El Maghraby e col., 2008; Torchilin, 2005; Sharma e col.,
1997).
Descreveremos a seguir as características básicas dos lipossomas, dando
ênfase ao seu uso como carreadores de fármacos para administração por vias não
invasivas, principalmente as vias tópica e oral.
2.1. Lipossomas: estrutura, composição e propriedad es básicas
2.1.1. Características físico-químicas e estruturais dos lipossomas
Os lipossomas são vesículas esféricas artificiais compostas de bicamadas
concêntricas de lipídios que separam um ou vários compartimentos aquosos
interno do meio externo. A principal característica destes lipídios é sua natureza
Introdução 30
anfifílica: uma cabeça polar está covalentemente ligada a uma ou duas cadeias de
hidrocarboneto hidrofóbicas (Figura 4).
Os lipossomas são formados espontaneamente quando lipídeos são
dispersos em solução aquosa. As moléculas lipídicas se organizam expondo a sua
cabeça polar em direção a fase aquosa enquanto que as porções hidrofóbicas
dispõem-se juntas na bicamada, formando uma película lipídica concêntrica,
separada pelos compartimentos aquosos. Desta forma, substâncias de caráter
polar podem ser encapsuladas nos compartimentos aquosos e substâncias
anfifílicas ou lipofílicas podem ser incorporadas na bicamada lipídica. Uma grande
vantagem dos lipossomas, com relação a outros sistemas transportadores de
fármaco, é a sua elevada biocompatibilidade, especialmente quando estes são
formados de lipídeos naturais ou derivados deles (Frézard, 1999; Frezard e col.,
2005).
Figura 4: Características estruturais dos lipossoma s (Frézard e col., 2005).
Além disso, os lipossomas são sistemas altamente versáteis, cujo tamanho,
lamelaridade, superfície, composição lipídica, volume e composição do meio
aquoso interno podem ser manipulados em função dos requisitos farmacêuticos e
farmacológicos.
Introdução 31
2.1.2. Composição das membranas dos lipossomas e propriedades físico-
químicas das membranas
Classicamente, a composição básica dos lipossomas é bastante parecida
com a bicamada lipídica das membranas das células vivas, que são constituídas
em sua maior parte por fosfolipídeos.
Os lipídeos utilizados no preparo dos lipossomas para a veiculação de
fármacos devem apresentar duas características básicas: se organizarem em
fases lamelares e serem biocompatíveis. O fosfolipídeo mais utilizado para formar
lipossomas é a fosfatidilcolina (lipídeo de base), porém outros lipídeos e
substâncias podem ser incluídos na sua composição, produzindo assim
lipossomas com diferentes características funcionais. A fosfatidilcolina utilizada na
formação dos lipossomas pode ser de origem natural, sendo obtida de soja ou de
ovo, ou de origem sintética. A Tabela 1 mostra os principais tipos de
fosfatidilcolina utilizadas no preparo de lipossomas, sua temperatura de transição
de fase e o estado físico da membrana formada a 37ºC.
Tabela 1: Fosfatidilcolina utilizadas no preparo de lipossomas: temperatura de transição de
fase e estado físico da membrana formada a 37ºC.
Nome
(número de carbono por cadeia) Abreviação
Temperatura de
transição de fase (Tf)
Estado físico da
membrana a 37ºC
Fosfatidilcolina natural de soja SPC <0ºC cristal liquido
Fosfatidilcolina natural de ovo EPC <0ºC cristal liquido
Dimiristoilfosfatidilcolina (14) DMPC 23ºC cristal liquido
Dipalmitoilfosfatidilcolina (16) DPPC 42ºC gel
Distearoilfosfatidilcolina (18) DSPC 55ºC gel
A bicamada lipídica dos lipossomas pode se encontrar em dois estados
físicos diferentes, na fase “gel” ou na fase “cristal-líquido”, dependendo da
temperatura de transição de fases dos lipídeos. Os fosfolipídeos possuem uma
temperatura de transição de fase (Tf) característica, a qual depende da natureza
do grupo polar, além do comprimento e grau de insaturação da cadeia carbonada
dos ácidos graxos que compõem a sua estrutura. Abaixo da Tf, os lipídeos têm
Introdução 32
mobilidade reduzida e se apresentam de maneira mais ordenada, com ligações
carbono-carbono na conformação todo “trans”. Neste estado físico, dito “gel”, a
bicamada se encontra mais rígida e apresenta baixa permeabilidade. Acima da Tf,
os fosfolipídeos apresentam elevadas difusões rotacional e lateral e suas cadeias
encontram-se em estado desordenado, com ligações carbono-carbono na
conformação “trans” ou “gauche”. Neste estado, chamado de fase “cristal-líquida”,
a membrana é considerada fluida e apresenta elevada permeabilidade (Frezard e
col., 2005). A Figura 5 ilustra a transição de fase das membranas lipídicas (fase
“gel” à fase “cristal-líquido”) e o efeito do colesterol quando adicionado na
formação das membranas.
Figura 5: Transição de fases das membranas lipídica s (fase gel à fase cristal-líquido) e o
efeito do colesterol. (Adaptado de Frezard e col., 2005).
Introdução 33
O colesterol pode ser incluído na composição lipídica da membrana dos
lipossomas, influenciando a fluidez das membranas, alterando a permeabilidade e
a interação dos lipossomas com os fluidos biológicos. Atua como estabilizador da
membrana, sendo responsável pelo aumento da rigidez das membranas no estado
“cristal-líquido”, diminuindo a sua fluidez e permeabilidade, ou pela diminuição da
rigidez das membranas no estado “gel”, aumentando sua fluidez e permeabilidade.
Outros lipídeos podem entrar na composição dos lipossomas, como lipídios
de carga positiva ou negativa, que contribuem para diminuir a agregação e a fusão
das vesículas, melhorando a estabilidade das formulações, servindo também para
favorecer a interação das vesículas com moléculas de carga oposta e para
modular o destino dos lipossomas no organismo (Frezard e col, 2005).
2.1.3. Classificação dos lipossomas
Os lipossomas podem ser classificados quanto à sua morfologia, em
relação ao seu tamanho e ao número de bicamadas (lamelaridade), que depende
principalmente do seu procedimento de preparo. Podem ser classificados como
MLVs, SUVs, ou LUVs (Frezard, 1999; Torchilin, 2005).
MLVs (Multilamellar Vesicles) são lipossomas grandes com diâmetro
variando entre 400 a 5000 nm, possuem várias bicamadas fosfolipídicas
concêntricas, intercaladas por vários compartimentos aquosos.
SUVs (Small Unilamellar Vesicles) são lipossomas cujo diâmetro varia de
20 a 100 nm, possuem apenas uma bicamada e tem uma baixa taxa de
encapsulação.
LUVs (Large Unilamellar Vesicles) são lipossomas constituídos por apenas
uma bicamada, porém com alta capacidade de encapsulação, pois possuem
diâmetro maior que 100 nm.
Os lipossomas podem ser classificados também em função de suas
propriedades de interação, que dependem de sua constituição química,
responsável pela sua funcionalidade e especificidade (Figura 6). Os lipossomas
convencionais, formados tipicamente por fosfatidilcolina e colesterol, são
caracterizados por apresentarem reatividade não específica com o meio externo.
Introdução 34
Os lipossomas furtivos (Stealth Liposomes), que têm a sua superfície recoberta
com polímero de etilenoglicol (PEG) tornando-os estabilizados estericamente,
possuem uma baixa reatividade com o meio. Os lipossomas direcionados
(Targeted Liposomes) apresentam reatividade específica devido à ligação de
moléculas em sua estrutura que vão direcionar os lipossomas para um sítio
específico (anticorpos, por exemplo). Lipossomas de fusão possuem agentes
específicos que, sob estímulo externo, mudam a permeabilidade, fase ou
integridade da membrana. Um exemplo são os lipossomas sensíveis ao pH, que
se agregam, desestabilizam e/ou fundem com a membrana celular, após o
abaixamento do pH do meio (Frezard, 1999; Frezard e col., 2005; Sharma e col.,
1997).
Figura 6: Lipossomas incorporando diferentes substâ ncias funcionalizantes (Frézard e col.,
2005).
2.1.4. Encapsulação de substâncias nos lipossomas
Substâncias farmacologicamente ativas podem ser encapsuladas no
compartimento aquoso interno (substâncias hidrossolúveis, peptídeos, proteínas)
ou serem incorporadas nas membranas dos lipossomas (substâncias lipossolúveis
ou anfifílicas, proteínas de membrana).
Outros modos de associação contemplam a interação eletrostática de
ácidos nucléicos com a superfície de lipossomas catiônicos e a conjugação de
Introdução 35
ligantes ou toxinas na cabeça polar de certos lipídios ou polímeros (Frezard e col.,
2005; Sharma e col., 1997).
2.1.5. Principais aplicações dos lipossomas
Os lipossomas podem ser utilizados como modelo lipídico de membrana
com objetivo de elucidar a estrutura e a dinâmica das membranas lipídicas, bem
como estrutura e função de proteínas de membrana reconstituídas. Estes
permitem ainda investigar os mecanismos de interação de fármacos com
membranas biológicas e de transporte através delas (Verly e col., 2008).
Podem ser utilizados para proteger peptídeos endógenos encapsulados de
uma degradação rápida, aumentando a meia vida destes peptídeos em fluídos
biológicos, prolongando suas ações biológicas, permitindo assim que o efeito
destas substâncias possa ser estudado em tecidos específicos (Frezard e col.,
2006; Silva-Barcellos e col., 2004).
Atualmente, os lipossomas vêm sendo empregados na terapia do câncer
(doxorubicina e daunorubicina), no tratamento de infecções fúngicas sistêmicas e
da leishmaniose visceral (Anfotericina B) e como sistema imunoadjuvante no
desenvolvimento de vacinas (Sharma e col., 1997; Torchilin, 2005; Frezard, 1999).
Os lipossomas apresentam-se também como sistema carreador promissor
para os medicamentos antimoniais no tratamento das leishmanioses e da
esquistossomose. No caso dos antimoniais pentavalentes, níveis de atividade
espetaculares foram alcançados em modelo experimental de leishmaniose
visceral, após sua administração na forma encapsulada em lipossomas. A
encapsulação de antimonial trivalente em lipossomas promoveu redução de sua
toxicidade aguda (Frezard e col., 2000; de Melo e col., 2003; Ribeiro e col., 2008;
Schettini e col., 2006).
Desenvolvimentos futuros quanto à aplicação dos lipossomas são esperados
para diversas áreas na medicina tais como agentes de contraste para diagnóstico,
terapia gênica, imunomodulação, tratamento de alergias e terapia pulmonar.
Muitos estudos também têm sido realizados com objetivo de desenvolver
Introdução 36
lipossomas para administração de fármacos por vias não invasivas como tópica,
oral, nasal e pulmonar (Torchilin, 2005; Sharma e col., 1997).
2.2. Lipossomas ultradeformáveis
Os lipossomas ultradeformáveis foram apresentados na literatura como um
sistema vesicular único capaz de promover a absorção transdérmica de fármacos,
independente de suas características físico-químicas (Cevc, 2004).
2.2.1. Composição lipídica e propriedades dos lipossomas ultradeformáveis
Lipossomas podem ser preparados com combinações específicas de
fosfolipídios e tensoativos, permitindo a formação de vesículas altamente
deformáveis ou elásticas.
Estas combinações de fosfolipídios e tensoativos dão origem a vesículas
suficientemente deformáveis que tem a capacidade de atravessarem poros
consideravelmente menores que seu próprio tamanho (Figura 7). Foi proposto que
estas vesículas, quando aplicadas topicamente sob condição não oclusiva,
penetrariam e atravessariam a pele espontaneamente, promovendo absorção
transdérmica de fármacos encapsulados (Cevc et al, 1998, 1995; Gupta et al,
2005a, b).
Figura 7: Representação esquemática de uma vesícula ultradeformável passando através de
um poro menor que seu próprio tamanho (Adaptado de Cevc e col., 1995).
Introdução 37
Na maioria dos trabalhos realizados com vesículas ultradeformáveis, os
fosfolipídeos utilizados na preparação destas vesículas eram a fosfatidilcolina de
soja ou a fosfatidilcolina de ovo. Por outro, diferentes tensoativos foram utilizados
na obtenção dessas vesículas, incluindo o colato de sódio, deoxicolato de sódio,
Span 80 e Tween 80. A utilização do colato de sódio torna-se interessante por ser
um tensoativo biocompatível; além do mais, em estudos comparativos com outros
tensoativos, o colato de sódio apresentou resultados satisfatórios em relação à
absorção transdérmica de fármacos (Lee e col., 2005; Jain e col., 2003). A Tabela
2 mostra a composição química das vesículas ultradeformáveis e os fármacos
encapsulados de alguns trabalhos de referência encontrados na literatura.
Tabela 2: Composição química das vesículas ultradef ormáveis utilizadas para a
administração transdérmica de diferentes fármacos.
Composição química Razão molar Fármaco encapsulado Referência
SPC/colato 87:13 insulina Cevc e col., 1998
SPC/colato 87:13 diclofenaco Cevc e col., 2001
SPC/colato 84:16 5-fluorouracil El Maghraby e col., 2001
SPC/deoxicolato 85:15 dexametasona Jain e col., 2003
SPC/Tween 80 85:15 dexametasona Jain e col., 2003
SPC/Span 80 85:15 dexametasona Jain e col., 2003
SPC/glicirrizanato de
potássio 4:1 glicirrizanato de potássio Trotta e col., 2002
SPC/colato 84:16 oestradiol El Magharaby e col., 2000a,b
SPC/Span 80 84:16 oestradiol El Magharaby e col., 2000a,b
SPC/Tween 80 84:16 oestradiol El Magharaby e col., 2000a,b
SPC/ácido oleico 84:16 oestradiol El Magharaby e col., 2000a,b
2.2.2. Modo de atuação dos lipossomas ultradeformáveis
A pele é o maior órgão do nosso corpo, atuando como uma barreira entre o
corpo e o ambiente exterior. O estrato córneo é a camada mais externa da pele e
sua presença limita a absorção percutânea de bioativos. Dois mecanismos
distintos foram propostos para explicar a capacidade dos lipossomas
ultradeformáveis promoverem a absorção transdérmica de fármacos.
Introdução 38
De acordo com o primeiro mecanismo, as vesículas atuariam como
sistemas carreadores de fármacos, atravessando o estrato córneo de forma
intacta e carregando o fármaco para os tecidos mais profundos e para a circulação
sanguínea. As vesículas penetrariam na pele sob efeito do gradiente de hidratação
(as camadas mais profundas sendo mais hidratadas) e, por terem a capacidade de
se deformarem, passariam por interstícios entre as células do estrato córneo sem
se desintegrarem (Cevc e col., 1992). Um estudo da localização de lipossomas
ultradeformáveis marcados com sonda fluorescente lipofílica usando a técnica de
microscopia laser confocal sugeriu que o estrato córneo apresenta dois caminhos
diferentes de penetração dos lipossomas, o caminho “intercluster” e o
intercorneócito; e que estas regiões contêm irregularidades na organização
estrutural dos lipídios que poderiam funcionar como canais virtuais pelos quais os
lipossomas contendo fármacos passariam para em seguida atingirem a circulação
sanguínea (Schätzlein e col., 1998).
De acordo com o segundo mecanismo, as vesículas atuariam como
promotores de absorção dos fármacos associados, em que as bicamadas das
vesículas modificariam os lipídios intercelulares do estrato córneo, facilitando a
passagem do fármaco livre através da pele (Elsayed e col., 2007). O surfactante
presente na formulação poderia se fundir na interface do estrato córneo,
aumentando a concentração local do fármaco e a sua permeação pela pele (Fang
e col., 2001). Já o etanol, muitas vezes presente nas formulações, provocaria
desorganização das bicamadas lipídicas da pele aumentando a fluidez do estrato
córneo, permitindo que o fármaco penetre nas camadas profundas da pele
(Touitou e col., 2000).
Ainda há controvérsias sobre qual desses dois mecanismos predomina na
passagem de fármacos pela pele quando estes são aplicados em suspensão de
lipossomas ultradeformáveis. Acredita-se que o modo de atuação dessas
vesículas depende tanto das características das vesículas (tamanho, composição
lipídica) quanto das propriedades físico-químicas do fármaco (Elsayed e col.,
2007). Entretanto, até hoje, não foi realizado nenhum estudo sistemático visando
elucidar a influência desses diferentes fatores.
Introdução 39
2.2.3. Nível de penetração do fármaco na pele após aplicação em
lipossomas ultradeformáveis
Outra questão também controversa diz respeito ao nível de penetração dos
fármacos quando aplicados topicamente na forma encapsulada em lipossomas
ultradeformáveis. A penetração do fármaco pode ser restrita ao tecido cutâneo,
pode ser um pouco mais profunda, envolvendo seu acúmulo no tecido próximo ao
local da aplicação (Cevc e col., 2001), ou pode alcançar a circulação sistêmica
(Cevc e col., 1998).
A literatura mostra trabalhos em que os lipossomas ultradeformáveis
favorecem a absorção transdérmica de moléculas ou de macromoléculas,
permitindo ações farmacológicas sistêmicas. Insulina aplicada topicamente em
lipossomas deformáveis mostrou ação hipoglicemiante sistêmica, em ensaios com
ratos e humanos, com eficácia comparada à administração subcutânea, porém
com retardo no início do efeito (Cevc e col., 1998, Cevc e col., 1995). Uma mistura
de lipossomas deformáveis vazios e toxina tetânica foi testada para imunização
tópica, em ensaios in vivo. A resposta imune, medida pelos níveis séricos de IgG,
foi comparável àquela alcançada com a mesma dose de toxina administrada por
via intramuscular, mostrando o grande potencial dos lipossomas ultradeformáveis
para imunização percutânea (Gupta e col., 2005b).
Estudos farmacocinéticos do diclofenaco, em ratos, camundongos e porcos,
mostraram que os lipossomas deformáveis promoveram concentração de fármaco
10 vezes maior nos tecidos subcutâneos e uma penetração mais profunda nos
tecidos próximos ao local de aplicação, quando comparados à formulação
comercial baseada em gel (Cevc e col., 2001; 2008).
Por outro lado, alguns trabalhos mostram que os lipossomas
ultradeformáveis podem aumentar a deposição de fármacos na pele, sugerindo
que estes sejam úteis na liberação dérmica destas moléculas. Os níveis de
permeação do glicirhizanato de potássio através da pele ficaram abaixo do limite
detectável, quando este fármaco foi aplicado na forma encapsulada em
lipossomas deformáveis, porém houve um aumento dos valores de deposição do
fármaco na pele em relação ao controle aquoso (Trotta e col., 2002). Lipossomas
Introdução 40
ultradeformáveis contendo 5-fluorouracil, em ensaios de permeação percutânea in
vitro, promoveram um aumento de deposição do fármaco na pele, mas tiveram um
pequeno efeito na velocidade de permeação através da pele (El Maghraby e col.,
2001). Essa tendência foi também observada com lipossomas deformáveis
contendo cetotifeno, em que houve um aumento na deposição na pele, mas não
na permeação transdérmica, sugerindo serem mais úteis para liberação dérmica
que transdérmica desse fármaco (Elsayed e col., 1997).
Os estudos realizados até hoje sugerem que o nível de penetração do
fármaco, quando administrado na forma encapsulada em lipossomas
ultradeformáveis, depende das características físico-químicas do fármaco,
principalmente de sua lipofilicidade e sua massa molar. Entretanto, deve ser
considerada também a possível influência das características dessas vesículas
(tamanho, composição lipídica, deformabilidade, fluidez da membrana,
permeabilidade), já que lipossomas de características diferentes foram utilizados
nos estudos citados acima.
2.2.4. Pontos críticos relacionados aos lipossomas ultradeformáveis
Apesar do grande interesse nas vesículas ultradeformáveis e do grande
número de trabalhos publicados sobre este tema, dois pontos precisam ainda ser
elucidados: o modo de atuação destas vesículas e os fatores que determinam o
nível de profundidade que os fármacos atingem após aplicação tópica.
Vale ressaltar também que a permeabilidade da membrana destas
vesículas não foi ainda caracterizada e que muito poucos estudos
farmacocinéticos foram realizados para os fármacos administrados a partir destas
vesículas.
Introdução 41
2.3. Lipossomas mucoadesivos
2.3.1. Composição lipídica e papel do polímero catiônico
Os lipossomas podem também ser preparados com lipídios carregados
negativamente e, após seu preparo, serem revestidos com polímeros catiônicos,
modificando assim suas propriedades de superfície e sua interação com as
mucosas.
Estes polímeros, de origem natural ou sintética, revestem a superfície dos
lipossomas formando sistemas particulados, contribuindo para aumentar a adesão
destes na mucosa do trato gastrointestinal. Este fenômeno de mucoadesão pode
aumentar o tempo de permanência dos lipossomas nos locais de absorção dos
bioativos, contribuindo para melhorar a absorção de fármacos encapsulados
(Takeuchi e col., 2001, 2005; Jain e col., 2007).
Entre os vários polímeros que possuem a capacidade de promover
mucoadesão, a quitosana merece destaque (Figura 8).
É um polímero de origem natural, biodegradável, biocompatível, não tóxico e
mucoadesivo, obtido a partir da desacetilação da quitina presente no exoesqueleto
de crustáceos.
A quitosana, por apresentar vários grupos amina (Figura 8), é catiônica em
soluções ácidas (pH<6,5) e torna-se capaz de estabelecer interações
eletrostáticas com superfícies e polímeros que possuem carga negativa. Em
soluções alcalinas ou na presença de poliânions, pode precipitar ou formar géis
(Illum e col., 2001; Sinha e col., 2004).
Figura 8: Estrutura química da quitosana.
Introdução 42
As propriedades mucoadesivas da quitosana foram atribuídas das
seguintes características deste biopolímero: 1) o seu caráter policatiônico que
favorece sua interação eletrostática com os grupos carregados negativamente
presentes nas superfícies das mucosas do trato gastrointestinal e nasal; 2) sua
capacidade de formar gel em solução de pH > 6,5; 3) sua elevada massa molar,
sua alta flexibilidade e sua elevada capacidade de formar pontes de hidrogênio
devido aos seus grupos hidroxila (Sinha e col., 2004).
2.3.2. Aumento de absorção dos fármacos pelo trato gastrointestinal
Alguns trabalhos relatam o uso de nanopartículas aniônicas recobertas com
quitosana para promoverem a absorção de proteínas bioativas por via oral.
Entretanto não há consenso sobre a real contribuição dos lipossomas (Smart,
2005; Takeuchi e col., 2001, 2005; Prego e col, 2006).
Estudos mostraram uma redução acentuada e prolongada (até 12 horas)
nos níveis plasmáticos de glicose de ratos Wistar, após administração oral de
insulina encapsulada em lipossomas aniônicos associados à quitosana, o que não
foi observado após a administração oral dos mesmos lipossomas sem a quitosana
(Takeuchi et al, 2001). Um estudo por microscopia confocal das vesículas
marcadas com a sonda fluorescente lipofílica DiI permitiu estabelecer as
propriedades mucoadesivas dos lipossomas associados à quitosana, em todas as
porções do intestino, quando comparados aos lipossomas sem o polímero. Nestes
experimentos, a mucoadesividade foi relacionada não somente com a presença da
quitosana, mas também com o tamanho dos lipossomas, sendo que lipossomas
considerados pequenos (diâmetro médio de 182nm) tiveram mucoadesividade
maior quando comparados aos lipossomas de tamanho maior (diâmetro médio de
4,1µm). Neste mesmo trabalho, a administração por via oral de lipossomas
pequenos contendo calcitonina e incorporados em solução de quitosana
promoveram uma redução mais acentuada na concentração plasmática de cálcio
quando comparada à administração de calcitonina nas formas livre ou
encapsulada em lipossomas sem quitosana (Takeuchi et al, 2005).
Introdução 43
Por outro lado, Prego e col, 2006, sugeriram que o aumento da absorção
pelo intestino deve-se essencialmente à presença da quitosana, pois uma
importante redução nos níveis de cálcio sérico foi encontrado, após administração
oral de calcitonina, tanto na forma encapsulada em nanocápsulas recobertas com
quitosana quanto na forma livre em solução de quitosana.
As propriedades mucoadesivas podem ser exploradas também para
melhorar a administração nasal de fármacos (Mainardes et al, 2006). Alguns
trabalhos mostram a viabilidade da utilização de quitosana como sistema de
liberação controlada de vacinas por via nasal. Ensaios in vivo mostraram que a
administração nasal de antígenos, incorporados em uma solução de quitosana,
promoveu uma resposta imune similar àquela induzida pela administração
parenteral. Esse efeito foi demonstrado no caso de vacinas para influenza e
difteria (Illum et al, 2001). Vale mencionar ainda que a administração por via nasal
de insulina, encapsulada em lipossomas aniônicos e recobertos com quitosana, foi
capaz de reduzir os níveis plasmáticos de glicose por um longo período de tempo
(até 48 horas), mostrando a eficácia dessa forma e via de administração para a
entrega de proteínas na circulação sistêmica (Jain et al, 2007).
2.3.3. Pontos críticos relacionados aos lipossomas mucoadesivos
A literatura mostra vários trabalhos em que os lipossomas mucoadesivos
encapsulando proteínas tiveram uma excelente eficácia quando administrados por
vias oral ou nasal, entretanto, o modo de atuação destas vesículas precisa ainda
ser esclarecido.
Há controversa se os lipossomas são capazes de reter o fármaco
encapsulado no trato gastrointestinal, principalmente por causa do efeito
desestabilizante dos sais biliares.
Foi mostrado que a presença de sais biliares, na concentração de 10mM,
pode levar a formação de poros nas membranas, favorecendo a ruptura dos
lipossomas e liberação do material encapsulado (Ariën e col., 1993; Kokkona e
col., 2000; Freund e col., 2000). Lipossomas com a membrana na fase “gel” são
Introdução 44
mais resistentes à ação dos sais biliares e podemos sugerir que este tipo de
lipossomas seja capaz de reter moléculas na presença da bile.
Neste contexto, o potencial de aplicação dos lipossomas mucoadesivos
precisa ser esclarecido, principalmente no que diz respeito a substâncias
hidrofílicas de massa molar intermediária.
3. CALCEÍNA COMO MARCADOR DE LIPOSSOMAS
Como ilustrado na Figura 9, a calceína é uma molécula altamente solúvel
em solução aquosas de pH > 6, que apresenta múltiplas cargas e uma massa
molar intermediária (623 Da). Esta pode ser considerada como um modelo de
fármaco hidrofílico.
Por ser impermeável através de membranas lipídicas, a calceína já foi
utilizada previamente como marcador fluorescente em estudos físico-químicos e
farmacocinéticos de lipossomas (Allen, 1993; Kendall e col., 1983; Touitou e col.,
2001; Simões e col, 2004; Li e col, 1996), apresentando como vantagens uma
elevada estabilidade nos sistemas biológicos e um elevado rendimento quântico
de fluorescência independente de pH na faixa de 6-8,5. Na faixa de pH nos locais
de absorção (entre 5,4 a 9), a calceína possui uma carga efetiva negativa.
Figura 9: Estrutura da calceína no pH 7.
Introdução 45
Na faixa de pH fisiológico (entre 6 a 9), alguns íons metálicos como cobre,
cobalto, paládio, bismuto, ferro, tálio e níquel interagem com a calceína apagando
sua fluorescência. A propriedade do íon cobalto de se ligar à calceína em pH
neutro, formando um complexo não fluorescente foi explorada no estudo das
propriedades de fusão dos lipossomas (Kendall e col., 1983).
Os íons cálcio e magnésio, presentes no fluídos biológicos, não afetam a
fluorescência da calceína na faixa do pH fisiológico, não interferindo com o uso da
calceína em experimentos contendo estes íons. Porém no pH 12, a calceína
interage fortemente com o íon cálcio, tornando-se altamente fluorescente,
permitindo o seu uso em método fluorimétrico para a dosagem do íon cálcio.
A calceína foi encapsulada em etossomas e lipossomas convencionais com
o objetivo de avaliar a capacidade dessas vesículas de promoverem a passagem
transdérmica de fármaco hidrofílico através da pele (Touitou e col., 2001; Li e col.,
1996).
No estudo dos etossomas, foram utilizados Células de Difusão de Franz e
pele do dorso de camundongos sem pêlo; o compartimento receptor foi composto
por solução alcoólica 30%. O nível de profundidade alcançado pela calceína na
pele foi avaliado por microscopia confocal e os resultados mostraram que os
etossomas foram capazes de liberar a calceína para as camadas mais profundas
da pele quando comparada à forma livre (Touitou e col., 2001).
No estudo dos lipossomas convencionais (Li e col., 1996), a calceína foi
aplicada no dorso de camundongos pré-barbeados, seja em solução ou na forma
encapsulada, e foram determinadas as concentrações de calceína na pele e no
plasma dos animais. Os resultados mostram que a maior parte de calceína
liberada dos lipossomas acumulou-se na pele, sem atingir a circulação sanguínea
sistêmica.
A calceína foi utilizada também como marcador fluorescente visando
investigar o efeito permeabilizante do colato de sódio quando adicionado em
concentrações crescentes a uma suspensão de lipossomas formados de
fosfatidilcolina contendo calceína encapsulada. Os resultados deste estudo
mostram que o efeito permeabilizante do colato ocorre em relações
Introdução 46
colato/fosfolipídio bem superior aquele encontrado nas vesículas ultradeformáveis
(Simões e col., 2004).
Devido às características físico-químicas e espectroscópicas da calceína,
torna-se interessante a sua utilização como modelo de fármaco hidrofílico de
massa molar intermediária, que são pouco absorvidos na forma livre, tanto na
aplicação tópica quanto por via oral. Vale ressaltar que a calceína ainda não foi
usada na caracterização físico-química e farmacocinética tanto dos lipossomas
ultradeformáveis quanto dos lipossomas mucoadesivos, o que é proposto na
presente tese.
Objetivos 47
OBJETIVOS
Diante do contexto exposto, o objetivo dessa tese foi estudar aspectos
físico-químicos e farmacocinéticos dos lipossomas ultradeformáveis e
mucoadesivos, visando esclarecer o modo de atuação e as potencialidades de
aplicação destes sistemas para administração de fármacos hidrofílicos de massa
molar intermediária (500 a 1000 Da) por vias não invasivas.
Os objetivos específicos do estudo abordam os seguintes aspectos:
1. Preparação e caracterização físico-química de formulações de lipossomas
ultradeformáveis contendo calceína, com relação à distribuição de tamanho,
eficiência de encapsulação e permeabilidade e deformabilidade das
membranas.
2. Avaliação da permeação cutânea in vitro da calceína usando pele do dorso
de camundongos sem pêlo a partir de lipossomas ultradeformáveis de
fosfatidilcolina de soja.
3. Estudo in vivo da absorção transdérmica da calceína após aplicação tópica
nas formas livre e encapsulada em lipossomas ultradeformáveis em
camundongos sem pêlo.
4. Preparação e caracterização físico-química de formulações de lipossomas
mucoadesivos contendo calceína, com relação à distribuição de tamanho,
eficiência de encapsulação e estabilidade em condições fisiológicas
modelo.
5. Estudo in vivo da absorção da calceína, em camundongos Swiss, após
administração por via oral na forma encapsulada em lipossomas
mucoadesivos.
Lipossomas Ultradeformáveis 48
CAPÍTULO 1: LIPOSSOMAS ULTRADEFORMÁVEIS PARA
ADMINISTRAÇÃO TRANSDÉRMICA DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS
1. INTRODUÇÃO
A pele é o maior órgão do nosso corpo, atuando como uma barreira seletiva
entre o corpo e o ambiente exterior. A camada externa da pele é o estrato córneo,
considerada a principal barreira à passagem de substâncias exógenas (Verma e
col., 2003).
Os lipossomas ultradeformáveis são vesículas que têm capacidade de se
deformarem e passarem por poros de diâmetros menores que seu diâmetro
original. Esses lipossomas apresentam essa propriedade devido à sua
composição lipídica específica, isto é, uma combinação de fosfolipídeos com
tensoativos, tipicamente fosfatidilcolina de soja e colato de sódio. Essas vesículas
foram apresentadas inicialmente como um sistema vesicular capaz de promover a
absorção transdérmica de fármacos encapsulados (Cevc et al, 1992, Gupta et al,
2005a).
Entretanto, os resultados obtidos com diferentes fármacos e lipossomas
ultradeformáveis de diferentes composições mostram que, após aplicação tópica,
o fármaco pode atingir níveis de profundidade diferentes na pele: fica retido nas
camadas mais superficiais (tecido cutâneo); penetra mais profundamente e atinge
tecidos próximos ao local da aplicação; ou alcança a circulação sistêmica (Cevc et
al, 1998; Cevc et al, 2001; El Maghraby et al, 2001).
Vale ressaltar que ainda não está claro se os lipossomas ultradeformáveis
atravessam o estrato córneo de forma intacta, atuando como sistemas
carreadores de fármacos ou promovem a permeação dos fármacos, modificando
os lipídios intercelulares do estrato córneo, facilitando a passagem do fármaco
livre através da pele (Cevc et al, 1992; Elsayed et al, 2007).
Apesar dos resultados extremamente promissores obtidos com certas
formulações de vesículas ultradeformáveis para a administração transdérmica de
Lipossomas Ultradeformáveis 49
fármacos, duas questões precisam ainda ser esclarecidas: o mecanismo de
atuação destas vesículas quanto ao carreamento do fármaco e os fatores que
determinam o nível de profundidade que os fármacos atingem após aplicação
tópica. A resposta a essas questões é importante para se conhecer a verdadeira
potencialidade de uso destas vesículas para liberação transdérmica de fármacos.
Nesta parte do trabalho, os lipossomas ultradeformáveis foram preparados
e caracterizados do ponto de vista da distribuição de tamanho, da eficiência de
encapsulação da calceína e da deformabilidade das membranas. Foi avaliada
ainda, pela primeira vez, a permeabilidade dessas membranas, o que permite
inferir sobre a capacidade de carreamento das vesículas ultradeformáveis. O
modo de atuação destas vesículas foi investigado através do estudo in vitro da
permeação cutânea da calceína utilizando células de Franz e do estudo in vivo da
absorção transdérmica da calceína em camundongos sem pêlo. Como ferramenta
de trabalho, foi realizada a validação do método fluorimétrico para dosagem de
calceína em plasma de animais.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Preparação das formulações de calceína
2.1.1. Lipossomas ultradeformáveis contendo calceína
As vesículas ultradeformáveis foram preparadas pela injeção de uma
solução etanólica do fosfolipídeo em uma solução aquosa de tampão HEPES 20
mM / NaCl 150 mM pH7,4 contendo o colato de sódio e a calceína, sob agitação
magnética em temperatura ambiente, conforme método descrito por Cevc e col.,
1998. A Figura 10 representa o modo de preparo dos lipossomas
ultradeformáveis.
Lipossomas Ultradeformáveis 50
Figura 10: Representação esquemática do modo de pre paro dos lipossomas
ultradeformáveis.
Os fosfolipídios utilizados foram fosfatidilcolina de soja (SPC, Avanti Polar,
95% grau de pureza) ou fosfatidilcolina de ovo (EPC, Sigma Aldrich, 100% grau de
pureza) na concentração final de 8,8% p/v. A concentração final de etanol (Merck)
foi de 9% v/v. A concentração de colato de sódio (Sigma) foi de 1,2% p/v e a de
calceína (Sigma) foi 0,1 mM nos estudos físico-químicos e 10 ou 30 mM, nos
estudos de absorção percutânea in vitro e in vivo, respectivamente.
O tamanho das vesículas foi calibrado por filtrações repetidas (7 vezes) da
suspensão de lipossomas em membrana de policarbonato com poro de 0,1 µm, na
temperatura ambiente, com pressão de 200 psi, usando um extrusor (Lipex
Biomembranes, Canadá), conforme proposto por Mayer et al, 1986.
Foram preparadas também vesículas ultradeformáveis sem etanol. Nesta
preparação, o fosfolipídeo foi dissolvido em clorofórmio e, após evaporação no
rotaevaporador, foi obtido um filme lipídico. Este foi hidratado com uma solução
aquosa de tampão HEPES 20 mM / NaCl 150 mM pH7,4 contendo o colato de
sódio e a calceína. A suspensão de vesículas multilamelares resultante foi então
submetida a 8 ciclos de congelamento-descongelamento (Mayer e col., 1985). Em
seguida, o tamanho foi calibrado por filtrações repetidas (7 vezes) da suspensão
de lipossomas em membrana de policarbonato com poro de 0,1 µm, na
temperatura ambiente, com pressão de 200 psi, usando um extrusor (Lipex
Biomembranes, Canadá).
Lipossomas Ultradeformáveis 51
Vale ressaltar que os lipossomas contendo a calceína não foram separados
da calceína não encapsulada.
2.1.2. Solução de calceína livre
A solução estoque de calceína foi preparada de acordo com Kendall e col.,
1983. A solução foi preparada pela adição de NaOH 1 M ao pó de calceína, em
temperatura ambiente, até o pH final da solução atingir um valor na faixa de 7 a
7,5. Esta solução foi armazenada a 4ºC protegida da luz.
A partir da solução estoque, foi preparada uma solução de calceína livre em
tampão HEPES 20 mM / NaCl 150 mM pH7,4.
Uma formulação de calceína livre na presença de colato e etanol foi
também preparada pela adição de etanol (na ausência de lipídeos) a uma solução
aquosa de calceína, contendo colato de sódio, ambas nas mesmas concentrações
finais que na suspensão de vesículas ultradeformáveis (item 2.1.1.).
2.1.3. Lipossomas convencionais contendo calceína
Lipossomas convencionais foram preparados seguindo o mesmo processo
e com a mesma concentração de fosfolipídio que as vesículas ultradeformáveis,
como descrito no item 2.1.1., porém sem a adição do surfactante colato de sódio.
2.2. Caracterização físico-química dos lipossomas u ltradeformáveis
2.2.1. Determinação da distribuição de tamanho das partículas
A distribuição de tamanho das partículas foi avaliada através de
espalhamento dinâmico de luz, utilizando equipamento Zetasizer 3000HS marca
Malvern, UK. Esta técnica permite a determinação do diâmetro hidrodinâmico
médio das vesículas e do índice de polidispersidade. A suspensão das vesículas
foi diluída 75 vezes em tampão HEPES 20 mM / NaCl 150 mM pH7,4.
Lipossomas Ultradeformáveis 52
2.2.2. Avaliação da interferência dos componentes dos lipossomas na
fluorescência da calceína
Este experimento teve como objetivo avaliar a interferência dos
componentes das vesículas ultradeformáveis na intensidade de fluorescência da
calceína nas condições dos ensaios físico-químicos e dos ensaios de absorção
percutânea. Neste estudo foram preparados 4 meios diferentes: tampão HEPES
20 mM / NaCl 150 mM pH7,4; tampão HEPES contendo colato e etanol; vesículas
ultradeformáveis vazias e lipossomas convencionais, conforme descrito na Tabela
3. Os lipossomas foram preparados conforme descrito no item 2.1.1.
Tabela 3: Meios utilizados para avaliação da interf erência dos componentes das vesículas
ultradeformáveis em ensaios in vitro e in vivo.
Meios SPC Etanol Tampão Colato
Tampão HEPES 20 mM/NaCl 0,15 M pH7,4 1mL
Tampão HEPES + colato e etanol 0,1mL 1mL 12mg
Tampão HEPES + Vesículas ultradeformáveis 88mg 0,1mL 1mL 12mg
Tampão HEPES + Lipossomas convencionais 88mg 0,1mL 1mL
Para avaliar a possível interferência dos componentes das vesículas
ultradeformáveis na intensidade de fluorescência da calceína, simulando as
condições dos ensaios físico-químicos, adicionou-se a calceína na concentração
de 0,1 mM aos diferentes meios. No tempo zero (após adição da calceína) e após
incubação a 25ºC por 1 hora, 20 µL de meio foi acrescentado em cubeta de
quartzo (1 x 1 cm) contendo 2 mL do tampão HEPES 20 mM / NaCl 150 mM
pH7,4 e a leitura da fluorescência foi realizada no espectrofluorímetro (marca
Varian, modelo Cary Eclipse) usando os seguintes parâmetros: λexcitação = 490
nm; λemissão = 515 nm; fendas de excitação e emissão de 2,5 nm.
Na avaliação da possível interferência dos componentes das vesículas
ultradeformáveis na intensidade de fluorescência da calceína nos ensaios de
absorção percutânea, adicionou-se a calceína na concentração de 10 mM aos
diferentes meios. No tempo zero (após adição da calceína) e após incubação a
37ºC por 1 hora, as amostras foram diluídas (3 µL de meio em 5 mL do tampão
Lipossomas Ultradeformáveis 53
HEPES) e 5 µL da amostra diluída foi acrescentada na cubeta contendo 2 mL do
tampão HEPES 20 mM / NaCl 150 mM pH7,4. A leitura da fluorescência foi
realizada no espectrofluorímetro usando os seguintes parâmetros: λexcitação =
490 nm; λemissão = 515 nm; fendas de excitação e emissão de 2,5 nm.
2.2.3. Determinação da eficiência de encapsulação da calceína
Duas metodologias distintas foram empregadas para determinar a eficiência
de encapsulação da calceína nas vesículas elásticas, ambas através de leitura no
espectrofluorímetro (marca Varian, modelo Cary Eclipse) das intensidades de
fluorescência correspondente à calceína encapsulada e total (λexc = 490 nm, λem
= 515 nm, fendas = 5 nm).
A primeira metodologia consiste na separação da calceína não encapsulada
dos lipossomas ultradeformáveis por cromatografia de filtração em gel Sephadex
G-50 usando mini colunas submetidas a centrifugação (Jain et al, 2003). Colunas
de gel Sephadex G-50, previamente equilibradas com tampão HEPES 20 mM /
NaCl 150 mM pH7,4, foram preparadas em seringas de 1 mL e o excesso de
tampão foi eliminado por centrifugação (800 rpm, 3 minutos, temperatura = 20ºC).
Em seguida, foram aplicadas 200 µL de suspensão de lipossomas no topo da
coluna. Nessa separação, a calceína não encapsulada fica retida na coluna
enquanto os lipossomas são eluídos no volume de exclusão da coluna. A
vantagem desta técnica é que permite a purificação dos lipossomas com diluição
mínima da suspensão. A partir das leituras da intensidade de fluorescência da
amostra antes da separação (calceína total) e da amostra eluída (calceína
encapsulada) pôde-se determinar a eficiência de encapsulação da calceína em
lipossomas.
A segunda metodologia baseia-se na propriedade do íon cobalto de apagar
a fluorescência da calceína. O íon cobalto (Co2+) forma um complexo de
coordenação com a calceína, apagando sua fluorescência, e é impermeável
através das bicamadas lipídicas convencionais (Kendall e col, 1983). A suspensão
de lipossomas foi diluída 100 vezes em tampão HEPES 20 mM / NaCl 150 mM
pH7,4 e a intensidade de fluorescência foi registrada em cubeta de quartzo (1 x 1
Lipossomas Ultradeformáveis 54
cm), correspondendo à fluorescência da calceína total (Ftotal). Em seguida foi
adicionado 10 µL de solução de cloreto de cobalto 40 mM, e a fluorescência foi
medida, correspondendo desta vez à calceína encapsulada (Fencapsulada) nas
vesículas, ou seja, à calceína que está inacessível ao íon Co2+. Após adição de 10
µL de Triton X-100 (20% p/v), ocorre lise dos lipossomas, a calceína liberada das
vesículas é quelada pelo cobalto presente no meio e a fluorescência fica apagada.
A fluorescência que permanece é uma fluorescência remanescente
(Fremanescente), que não se apaga e representa 1,5% da fluorescência da
calceína total. A equação 1 é utilizada para cálculo da eficiência de encapsulação
de calceína nos lipossomas.
100*%nteFremanesceFtotal
nteFremanescedoFencapsulaãoencapsulaç
−−= Equação 1
Esta metodologia permitiu avaliar também, nos experimentos de absorção
percutânea in vitro (Células de Franz), se a calceína estava na forma livre ou
encapsulada após permeação pela pele.
A suspensão de vesículas deformáveis, quando aplicada topicamente de
forma não oclusiva, sofre evaporação e torna-se mais concentrada em relação aos
seus componentes. Portanto, para avaliar a influência deste aumento da
concentração dos componentes lipossomais na eficiência de encapsulação, foi
determinada também a eficiência de encapsulação da calceína em vesículas
deformáveis quando preparadas em concentração mais elevada.
Duas formulações foram preparadas com concentração maior de seus
componentes: a primeira foi preparada com concentração 2 vezes maior de
fosfolipídio (SPC) e colato, quando comparada à formulação original; a outra foi
preparada da maneira clássica porém foi submetida a evaporação no
rotaevaporador, a 50ºC, até redução do volume em 3 vezes, resultando desta
forma, em uma preparação com componentes 3 vezes mais concentrados. A
eficiência de encapsulação foi determinada pelo método de adição do íon cobalto,
como descrito acima.
Lipossomas Ultradeformáveis 55
2.2.4. Avaliação da permeabilidade à calceína das membranas dos
lipossomas ultradeformáveis
A permeabilidade das membranas dos lipossomas ultradeformáveis foi
avaliada pela determinação da eficiência de incorporação da calceína em
diferentes intervalos de tempo após a adição de calceína a uma suspensão de
lipossomas vazios.
Os lipossomas vazios foram preparados conforme item 2.1.1. A calceína foi
adicionada à suspensão de vesículas na concentração de 0,1 mM. Em intervalos
de tempo pré determinados (tempo zero, 10, 20, 30, 45, 60 e 90 minutos), 20 µL
da suspensão foi retirado e acrescentado em 2 mL de tampão HEPES 20 mM /
NaCl 0,15 M pH7,4. Esta etapa de diluição tem o papel de promover a
transferência do colato de sódio da membrana para a fase aquosa, resultando na
impermeabilização da membrana à calceína. A eficiência de encapsulação da
calceína foi determinada pela leitura das fluorescências antes e após a adição do
íon cobalto (Co2+), como descrito no item 2.2.3. . A Figura 11 ilustra o método
utilizado no estudo de permeabilidade das membranas à calceína.
Figura 11: Representação esquemática do método util izado para determinação da
permeabilidade da membrana dos lipossomas à calceín a.
Após determinação da cinética de incorporação da calceína nas vesículas
ultradeformáveis, foi calculado o coeficiente de permeabilidade da calceína,
segundo a Lei Geral de Difusão (Equação 2), onde J é o fluxo da substância
através da membrana, P é o coeficiente de permeabilidade da substância, Ce e Ci
são as concentrações molares nos meios extra e intra vesicular respectivamente.
Lipossomas Ultradeformáveis 56
)( ie CCPJ −= Equação 2
Considerando que o fluxo representa o número de moles de substância que
atravessa a membrana por unidade de tempo e unidade de área da membrana,
temos a Equação 3, onde Ni é o nº de moles de substância no meio intravesicular
e S é a área superficial total das vesículas:
)( iei CCP
Sdt
dN −= Equação 3
Considerando a relação entre o número de moles, a concentração e o
volume, isto é ViCiNi *= , onde Vi é o volume intravesicular total, e que este
volume é constante, isto é, não altera com a incorporação da calceína, temos que:
)( ieii CCP
Sdt
dCV −= Equação 4
Reescrevendo a Equação 4, temos que:
dtPV
S
CC
dC
iie
i **)(
=− Equação 5
Como S é a área superficial total das vesículas, temos que 24 rS πη= e Vi
é o volume intravesicular total, temos que 3
3
4rVi πη= (desprezando a espessura
da membrana), onde η é o número de vesículas e r é o raio médio de uma
vesícula. Reescrevendo a Equação 5, temos que:
dtr
P
CC
dC
ie
i *3
)(=
− Equação 6
Integrando a Equação 6 no intervalo de tempo de 0 a t e na faixa de
concentração intravesicular de 0 a Ci, e assumindo que Ce não varia
Lipossomas Ultradeformáveis 57
significativamente nos intervalos de tempo e/ou nas condições do estudo,
podemos deduzir:
tr
P
C
CC
e
ie 3ln −=
− Equação 7
Definindo a fração encapsulada (Fenc) como e
ienc N
NF = , podemos escrever
que i
eenci V
NFC
*= , temos que i
eeenci V
VCFC **= (Equação 8).
A partir das Equações 7 e 8, temos a Equação 9, que permite a
determinação do coeficiente de permeabilidade da calceina através da membrana
das vesículas ultradeformáveis.
tr
P
V
VF
i
eenc
31ln −=
− Equação 9
2.2.5. Determinação do grau de deformabilidade dos lipossomas
ultradeformáveis
A capacidade de deformação dos lipossomas ultradeformáveis foi
determinada baseada no fluxo de uma suspensão de vesículas permeada através
de um sanduíche de membranas de policarbonato de poros de diâmetro calibrado,
com aplicação de uma pressão constante, conforme metodologia descrita por Jain
et al, 2003. O grau de deformabilidade pode ser calculado de acordo com a
seguinte equação:
2
=
p
vv r
rJD Equação 10
Sendo que Jv é o fluxo de suspensão permeada, isto é, o volume de
suspensão de lipossomas permeada por uma unidade de tempo; rv é o raio médio
Lipossomas Ultradeformáveis 58
das vesículas após passagem pela membrana e rp é o raio médio dos poros da
membrana.
Formulações de lipossomas ultradeformáveis preparadas com SPC ou
EPC, conforme descrito no item 2.1.1., foram colocadas no Extrusor (unidade de
filtração sob pressão e temperatura controladas, Lipex Biomembranes, Canadá).
As membranas de filtração consistiram em um sanduíche de 3 membranas de
policarbonato, de diâmetro de 13 mm, com poros de diâmetro de 200 nm, 100 nm
e 30 nm. Foi aplicada uma pressão constante de 400 psi e, após 10 minutos, o
volume da suspensão de lipossomas permeado foi medido. Durante todo o
experimento a temperatura foi mantida controlada em 37ºC. O diâmetro
hidrodinâmico médio das vesículas após a passagem pelos poros da membrana
foi determinado de acordo com o item 2.2.1. e o grau de deformabilidade
calculado.
2.3. Validação do método fluorimétrico de dosagem d a calceina
presente em plasma de animais
A validação de um método tem por objetivo demonstrar que este é
apropriado para determinar qualitativamente e/ou quantitativamente determinada
substância em um meio específico, garantindo que este é capaz de detectar e
dosar substâncias com confiabilidade dos resultados.
Desta forma, foi realizada a validação do método de dosagem da calceína
presente no plasma de animais. Foram avaliados os parâmetros de linearidade,
precisão e os limites de detecção e de quantificação, e, como se trata de matriz
biológica, os parâmetros de referência utilizados foram os que se aplicam a
métodos bioanalíticos (ANVISA, 2003).
Foi utilizado plasma de camundongos SWISS, machos, com peso entre 28
a 32 g. O sangue destes animais foi coletado pela artéria aorta abdominal e
colocado em frascos contendo o anticoagulante heparina, e, após centrifugação, o
plasma foi obtido. 30 µL de plasma foram incubadas com diferentes concentrações
de calceína (0,000 µM, 0,022 µM, 0,044 µM, 0,065 µM, 0,087 µM, 0,131 µM e
Lipossomas Ultradeformáveis 59
0,182 µM) a 37°C por 1 hora. Após este período, as amostras foram diluídas em
solução de NaCl 0,15 M (11,5 µL das amostras em 2,2 mL de salina) e foi feito
leitura da fluorescência (λexcitação:490 nm, λemissão:515 nm, fendas:5 nm) em
cubetas de quartzo (1x1 cm) no compartimento de amostras do
espectrofluorímetro. Foi feito um grupo controle, utilizando o mesmo procedimento
descrito acima, porém a calceína foi incubada com solução de NaCl 0,15 M.
2.3.1. Linearidade
Linearidade é a capacidade de uma metodologia demonstrar que as leituras
obtidas são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra,
dentro de um intervalo especificado.
Para determinação da linearidade, quantidades crescentes de calceína
foram adicionadas no plasma de animais (n=7, para cada concentração), o gráfico
de regressão linear foi construído com a média dos resultados para cada ponto e o
coeficiente de regressão linear foi determinado.
2.3.2. Precisão
A precisão é um parâmetro que se refere à avaliação da proximidade dos
resultados obtidos em várias medidas de uma mesma amostra. Pode ser
expressa como o coeficiente de variação (CV%) de uma série de medidas,
levando em consideração o desvio padrão (DP) e a concentração média (M),
segundo a fórmula:
( ) 100∗= MDPCV
O valor aceitável para o coeficiente de variação é de, no máximo, 15%, para
que o método seja considerado preciso (ANVISA, 2003).
Para determinação da precisão do método foram realizados cálculos das
médias (M) e desvios padrões (DP) das leituras de fluorescência (n=7) nas
diferentes concentrações de calceína presente no plasma de animais.
Lipossomas Ultradeformáveis 60
2.3.3. Limites de Detecção e Quantificação
Limite de detecção (LD) é a menor quantidade do analito presente em uma
amostra que pode ser detectado, não sendo necessariamente quantificado, nas
condições experimentais pré-estabelecidas. Pode ser determinado através da
média (M) e do desvio padrão (DP) das leituras de fluorescência do branco
(amostra contendo a matriz sem o analito), utilizando a equação (INMETRO,
2003):
DPMLD fluo *3+=
Para obter-se o LDconcentração, o LDfluo foi dividido pela inclinação da reta,
relacionando a fluorescência à concentração de calceína e foi feita a correção pelo
fator de diluição do plasma.
Limite de quantificação (LQ) é a menor quantidade de analito que pode ser
determinada com precisão e exatidão nas matrizes biológicas nas condições
experimentais estabelecidas. Pode ser determinado, também pela média e desvio
padrão das leituras de fluorescência do branco, através da seguinte equação
(INMETRO, 2003):
DPMLQ fluo *10+=
Para obter-se o LQconcentração, o LQfluo foi dividido pela inclinação da reta,
relacionando a fluorescência à concentração de calceína e foi feita a correção pelo
fator de diluição do plasma.
Em ambos os casos, amostras do plasma de animais (n=10) foram
incubadas sem calceína, a média e o desvio padrão foram determinados, e os
limites de detecção e de quantificação foram calculados.
Lipossomas Ultradeformáveis 61
2.4. Avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína a partir de
lipossomas ultradeformáveis
A avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína foi realizada
utilizando camundongos sem pêlo (Hairless, linhagem HRS/J, obtidos
originalmente de Jackson Laboratories, Ben Harbor, ME, USA) machos de 8
semanas, pesando de 25 a 30 g, gentilmente cedidos pela Profa. Miriam Tereza
Paz Lopes (Departamento de Farmacologia, Instituto de Ciências Biológicas,
UFMG). Durante os experimentos, os animais foram mantidos em caixas
individuais e tiveram livre acesso a água e ração.
Os animais (n=6) foram anestesiados com uma mistura de quetamina (57
mg/Kg) e xilazina (8,6 mg/Kg) administrada por via intraperitonial. O dorso dos
animais foi limpo com água destilada e foi aplicado 100 µL de formulação
lipossomal (lipossomas ultradeformáveis ou convencionais) contendo calceína ou
de solução de calceína livre (na presença ou na ausência de colato e etanol),
sendo a concentração de calceína de 10 ou 30 mM, em área delimitada de 2,25
cm2, garantindo desta forma, homogeneidade na aplicação. A Figura 12 ilustra o
procedimento para avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína.
Após intervalos de tempo pré-determinados, 15 µL de sangue foram
retirados da cauda dos animais com ponteira heparinizada e adicionados a 3 mL
de solução de NaCl 150 mM. Após homogeneização, a solução era centrifugada
por 5 minutos a 975 xg (3000 rpm) a 4ºC para sedimentação das hemácias. O
sobrenadante era separado e a medida de sua fluorescência foi realizada pela
leitura direta (λexcitação = 490 nm, λemissão = 515 nm, fendas de 5 nm). Em
cada ensaio foi feita uma curva de calibração relacionando a intensidade de
fluorescência com a concentração de calceína no plasma dos animais.
Lipossomas Ultradeformáveis 62
Figura 12: Representação esquemática do procediment o para avaliação in vivo da absorção
transdérmica da calceína.
Para determinar a fluorescência residual proveniente da matriz e verificar a
ausência da interferência do procedimento de coleta de sangue na fluorescência
das amostras, foi feito um grupo controle no qual foi aplicada lipossomas vazios,
ou seja, formulação lipossomal preparada sem calceína.
Após a última coleta de sangue (48 horas), os animais foram sacrificados
por deslocamento cervical. O dorso destes animais, no local da aplicação das
formulações, foi limpo usando 4 cotonetes molhados com Tampão HEPES 20
mM/NaCl 0,15 M pH7,4 que foram colocados em 2 mL de Tampão HEPES 20
mM/NaCl 0,15 M pH7,4. As amostras foram diluídas 1000 vezes em tampão e foi
feita leitura da fluorescência (λexcitação=490 nm, λemissão=515 nm, fendas=5
nm). Em cada ensaio foi feita uma curva de calibração, relacionando a intensidade
de fluorescência com a concentração de calceína, que foi usada para quantificar a
calceína que ficou aderida na superfície da pele. Pela relação entre o número de
moles total de calceína aplicados e o número de moles presentes nos cotonetes,
pôde-se calcular a porcentagem de calceína que ficou aderida na superfície da
pele.
Lipossomas Ultradeformáveis 63
Após a limpeza da superfície, a pele destes animais foi retirada e, através
de um punch de 3 mm, foi feita uma punção de um fragmento de pele no local de
aplicação das formulações, conforme descrito por Li e col, 1996. Cada fragmento
foi colocado em 2,5mL de tampão HEPES 20 mM / NaCl 0,15 M pH7,4, e a
suspensão foi sonicada por 3 minutos e, em seguida, centrifugada por 14000 xg /
30 minutos. Após este procedimento, foi feita leitura de fluorescência do
sobrenadante (λexcitação=490 nm, λemissão=515 nm, fendas=5 nm) e através da
curva de calibração, foi calculada a quantidade de calceína que ficou retida no
fragmento de derme dos animais. Esta quantidade refere-se à calceína presente
na área retirada pelo punch, equivalente a 0,071 cm2 , e, por uma relação direta,
pôde-se então calcular a quantidade de calceína retida na derme no local de
aplicação, cuja área equivale a 2,25 cm2 . Pela relação entre o número de moles
total de calceína aplicados e o número de moles encontrados na derme, pôde-se
calcular a porcentagem de calceína que ficou retida na derme dos animais. Neste
experimento, foi retirado um fragmento de pele de cada animal, em um local onde
não foi aplicada formulação, para verificar a ausência de interferência dos
possíveis componentes da pele na intensidade de fluorescência da calceína,
servindo como controle do experimento.
2.5. Avaliação da permeação cutânea in vitro da cal ceína a partir de
lipossomas ultradeformáveis
Os estudos in vitro para avaliação da permeação cutânea da calceína foram
realizados em colaboração com o Prof. Lucas Antônio Miranda Ferreira
(Departamento Produtos Farmacêuticos, Faculdade de Farmácia, UFMG).
Foram utilizadas células de difusão de Franz, que são constituídas por um
compartimento superior e um inferior com volume aproximado de 6 mL. A área de
superfície da membrana foi 1,76 cm2 (Figura 13). A membrana utilizada foi pele do
dorso de camundongos sem pêlo (Hair Less, linhagem HSR/J), sendo os
experimentos realizados na presença do estrato córneo, representando uma pele
intacta.
Lipossomas Ultradeformáveis 64
Para obtenção das peles, os camundongos sem pêlo (machos de 8
semanas, pesando de 25 a 30 g), foram sacrificados por deslocamento cervical,
seu dorso foi limpo com água destilada e a pele foi retirada. Após remoção do
tecido adiposo subcutâneo com o auxílio de bisturi e inspeção visual, a pele foi
colocada nas células de Franz.
Figura 13: Representação esquemática de uma Célula de Difusão de Franz.
O compartimento receptor foi preenchido com o tampão HEPES 5 mM /
NaCl 0,15 M pH 7,4, ficando em contato com a pele pelo período de 1 hora para
promover equilíbrio do sistema. Após este período, o tampão foi retirado e o
compartimento receptor foi novamente preenchido com tampão. Foram aplicados
100 µL de formulação de calceína (suspensão de lipossomas ultradeformáveis
contendo calceína, suspensão de lipossomas convencionais contendo calceína ou
solução de calceína livre preparada na presença e na ausência de colato e etanol)
sob a superfície da pele de camundongo sem pêlo. A concentração de calceína
presente nas formulações foi 10 mM. As formulações foram espalhadas com
bastão de vidro até secagem, garantindo desta forma homogeneidade da
distribuição das formulações sobre a pele.
Durante o procedimento, o fluido receptor foi mantido a 37,0 ± 0,5oC e
agitado continuamente com uma barra magnética. O compartimento doador foi
Lipossomas Ultradeformáveis 65
mantido aberto, permitindo a evaporação da fase aquosa volátil das formulações
(condição não oclusiva). Em diferentes intervalos de tempo (2, 4, 6 e 8 horas)
após a aplicação da formulação, o fluido receptor foi coletado, o compartimento
receptor foi preenchido com tampão novo e a concentração de calceína permeada
pela pele foi determinada através da leitura direta da intensidade de fluorescência
do fluido receptor coletado, em comprimentos de onda de excitação e de emissão
de 490 nm e 515 nm, respectivamente, com fendas de 5 nm.
Em todos os experimentos, uma alíquota das formulações aplicadas na pele
de camundongos, foi diluída na concentração final de 0,01 µM e a intensidade de
fluorescência foi registrada. Esta medida serviu como padrão nos experimentos
realizados, relacionando a intensidade de fluorescência com esta concentração de
calceína. Foi verificada a linearidade da relação entre a fluorescência e a
concentração de calceína na faixa de trabalho.
Foram utilizados ainda os fluídos receptores obtidos de uma célula de
difusão que não recebeu formulação para verificar a ausência de interferência dos
possíveis componentes da pele na intensidade de fluorescência da calceína e na
eficiência de apagamento dessa fluorescência pelo íon cobalto.
A determinação da taxa de calceína permeada pela pele foi feita em duas
etapas. Inicialmente, foi dosada a quantidade de calceína efetivamente aplicada
nas peles de camundongos, isto é, a calceína presente na epiderme após
aplicação das formulações e homogeneização com os cotonetes de vidro. Estes,
após espalhamento das formulações, foram colocados em 5 mL de tampão
HEPES 20 mM / NaCl 150 mM pH7,4, e após leitura de sua fluorescência,
utilizando a leitura da fluorescência da amostra padrão de calceína, pôde-se
determinar as concentrações e os números de moles de calceína retidos nos
cotonetes de vidro. Pela diferença entre o número de moles total de calceína
aplicados e o número de moles retidos nos cotonetes, pôde-se calcular o número
de moles de calceína aplicadas efetivamente na pele.
Depois, pela medida de fluorescência do fluído receptor, foi determinada a
concentração de calceína a partir da relação da leitura da fluorescência da
amostra padrão de calceína correspondente a 0,01 µM de calceína. Pelo
Lipossomas Ultradeformáveis 66
conhecimento do volume do líquido presente no compartimento receptor e da
concentração de calceína, o número de moles permeados na pele pôde ser
calculado. Através da relação entre o número de moles de calceína efetivamente
aplicados na pele e presentes no fluido receptor, a taxa de calceína permeada
pela pele, nos diferentes intervalos de tempo, pôde ser determinada.
2.6. Aspectos éticos no manuseio dos animais
Os procedimentos envolvendo uso e manuseio dos animais foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal-CETEA da
Universidade Federal de Minas Gerais, protocolo número 044/07.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Caracterização físico-química dos lipossomas u ltradeformáveis
3.1.1. Determinação da distribuição de tamanho das vesículas
O diâmetro hidrodinâmico médio das vesículas ultradeformáveis compostas
de fosfatidilcolina de soja e de colato de sódio, na relação molar 1:0,25, foi 90,1 ±
2,8 nm (n=11), com índice de polidispersidade de 0,073 ± 0,009 (n=11), indicando
homogeneidade do tamanho da população de vesículas. Índices de
polidispersidade menores que 0,2 indicam distribuição monodispersa de
partículas, isto é, a amostra é constituída por uma única população de vesículas.
O diâmetro hidrodinâmico médio das vesículas compostas de fosfatidilcolina
de ovo e de colato de sódio, na relação molar 1:0,25, foi 99,9 ± 2,7 nm, com índice
de polidispersidade de 0,064 ± 0,008 (n=7), mostrando também a homogeneidade
da distribuição de tamanho das vesículas.
Lipossomas Ultradeformáveis 67
3.1.2. Avaliação da interferência dos componentes dos lipossomas na
fluorescência da calceína
A avaliação da interferência dos componentes das vesículas
ultradeformáveis na intensidade de fluorescência da calceína para os ensaios
físico-químicos e de absorção percutânea foi realizada através de leituras na
ausência (tampão HEPES 20 mM / NaCl 0,15 M pH7,4) e na presença dos
componentes (colato e etanol, lipossomas ultradeformáveis e lipossomas
convencionais). As concentrações de calceína adicionadas nestes meios foram
0,1 mM ou 10 mM, simulando os ensaios físico-químicos e de absorção
percutânea, respectivamente.
Os valores de fluorescência foram semelhantes em todos os meios
estudados, mostrando não haver interferência de nenhum componente da
formulação das vesículas ultradeformáveis na leitura de fluorescência, nas
condições usadas nos experimentos.
3.1.3. Eficiência de encapsulação (%) da calceína nos lipossomas
A porcentagem de encapsulação de calceína nas vesículas
ultradeformáveis determinada pelo método da adição de Co2+ foi 18,0 ± 2,4%
(n=5) e a determinada pelo método de filtração em gel Sephadex G-50 foi cerca
de 14,4 ± 3,1% (n=4). Portanto, os valores encontrados pelos dois métodos foram
parecidos, mostrando que ambos podem ser usados para determinação da
eficiência de encapsulação da calceína em lipossomas. Porém, o método de
adição de Co2+ apresenta as vantagens de ser mais simples e de não sofrer
influência de uma possível diluição da amostra.
A Tabela 4 mostra os valores da eficiência de encapsulação da calceína em
suspensões de vesículas, determinados pelo método de adição do Co2+, quando
preparadas em diferentes concentrações.
Lipossomas Ultradeformáveis 68
Tabela 4: Eficiência de encapsulação da calceína em suspensões de lipossomas
ultradeformáveis preparados em diferentes concentra ções.
Formulação Concentração de
Fosfolipídio (p/v)
% de calceína encapsulada
± EP (n=3-5)
EPC ultradeformáveis (original) 8,8% 17,2 ± 1,5
SPC ultradeformáveis (original) 8,8% 18,0 ± 2,4
SPC ultradeformáveis concentrado 2 vezes 17,6% 31,0 ± 9,9
SPC ultradeformáveis concentrado 3 vezes* 26,4% 38,4 ± 7,3
SPC convencional (sem colato) 8,8% 7,1 ± 1,5
*Obtida por evaporação da formulação original sob vácuo em rotaevaporador.
Os resultados mostram que não houve diferença entre os valores da
eficiência de encapsulação da calceína nos lipossomas ultradeformáveis
preparados com SPC e EPC. Por outro lado, os lipossomas convencionais,
preparados na ausência de colato de sódio, tiveram valores menores da eficiência
de encapsulação de calceína, quando comparados aos lipossomas
ultradeformáveis.
Os valores encontrados mostram ainda que a eficiência de encapsulação
da calceína em lipossomas ultradeformáveis depende da concentração da
suspensão e que ocorre um aumento dessa taxa com o aumento da concentração
dos componentes da formulação.
Nossos resultados indicam também que ocorre um aumento da eficiência
de encapsulação da calceína durante o processo de evaporação da formulação
original. Isto sugere que a permeabilidade da membrana dos lipossomas
ultradeformáveis à calceína é alta, o que permitiria o re-equilíbrio da calceína entre
os meios extra e intra-vesiculares durante o processo de evaporação da
formulação. Esta situação simula o fenômeno de evaporação da formulação que
ocorre quando esta é aplicada topicamente em condição não oclusiva e sugere,
portanto, que a secagem da formulação na superfície da pele é acompanhada de
um aumento da encapsulação da calceína.
Esta observação está de acordo com um estudo de Cevc e col., 2008, que
relatam que ocorre um aumento da taxa de associação do cetoprofeno nas
vesículas ultradeformáveis com o aumento da concentração da suspensão. Como
Lipossomas Ultradeformáveis 69
o cetoprofeno é um fármaco lipossolúvel que interage com a membrana dos
lipossomas, nosso estudo estende essa propriedade das formulações de vesículas
ultradeformáveis aos fármacos hidrofílicos de massa molar intermediária.
3.1.4. Avaliação da permeabilidade à calceína das membranas dos
lipossomas ultradeformáveis
A permeabilidade das membranas ultradeformáveis à calceína foi avaliada
pela determinação da cinética de incorporação da calceína quando adicionada na
concentração de 0,1 mM a uma suspensão de lipossomas vazios, conforme
descrito em Materiais e Métodos 2.2.4.
0 20 40 60 80 1000
5
10
15
20
Colato/SPC 0,25 com etanol
Colato/SPC 0,125 com etanol
Colato/EPC 0,25 sem etanol
Colato/EPC 0,25 com etanol
Tempo (min)
% d
e in
corp
oraç
ão d
e ca
lceí
na
Figura 14: Cinética de incorporação de calceína (0, 1mM), a 25ºC, em lipossomas
ultradeformáveis de diferentes composições: colato de sódio/SPC 0,25 mol/mol, colato de
sódio/SPC 0,125 mol/mol, colato de sódio/EPC 0,25 m ol/mol e colato de sódio/EPC 0,25
mol/mol na ausência de etanol. A concentração final de fosfolipídio foi 8,8% (p/v).
Como ilustrado na Figura 14, no caso das vesículas ultradeformáveis
compostas de SPC ou de EPC contendo etanol, a incorporação da calceína foi tão
rápida que não foi possível acompanhar a cinética. Por outro lado, no caso dos
lipossomas ultradeformáveis preparados com metade da quantidade de colato em
relação à formulação original (razão colato de sódio/SPC igual a 0,125 mol/mol) a
incorporação foi tão lenta que não foi possível observar um aumento significativo
Lipossomas Ultradeformáveis 70
de incorporação no intervalo de tempo estudado (0-90 minutos). No primeiro caso,
o coeficiente de permeabilidade foi considerado como ‘alto’ e no segundo caso,
este foi considerado como ‘baixo’.
Quando os lipossomas ultradeformáveis foram compostos de EPC
preparados na ausência de etanol, foi possível observar uma cinética de
incorporação de calceína no intervalo de tempo estudado. A partir destes dados e
usando a Equação 9 (item 2.2.4.), foi possível determinar um valor de coeficiente
de permeabilidade da calceína.
A Tabela 5 resume os resultados de avaliação da permeabilidade à
calceína de membranas preparadas com diferentes proporções fosfolipídio/colato,
diferentes concentrações de lipídios e diferentes fosfolipídios.
Tabela 5: Permeabilidade à calceina, a 25°C, de di ferentes membranas: influência da razão
fosfolipídio/colato, da concentração total da suspe nsão e do tipo de fosfolipídio.
Tipo de
Fosfolipídio
Concentração de
Fosfolipídio (p/v)
Colato de sódio
(p/v)
Colato/fosfolipídio
(mol/mol)
Coeficiente de
permeabilidade*
(cm/s)
8,8% (com etanol) 1,2% 0,25 Alto
8,8% (com etanol) 0,9% 0,19 Alto
8,8% (com etanol) 0,6% 0,125 Baixo
8,8% (com etanol) 0,3% 0,0625 Baixo
4,4% (com etanol) 0,6% 0,25 Baixo
17,6% (com etanol) 2,4% 0,25 Alto
SPC
17,6% (com etanol) 1,2% 0,125 Baixo
8,8% (com etanol) 1,2% 0,25 Alto
8,8% (sem etanol) 1,2% 0,25 2,2 X 10-10 EPC
17,6% (com etanol) 2,4% 0,25 Alto
*’Alto’ significa que o equilíbrio de incorporação da calceína nas vesículas foi atingido
rapidamente (entre 0 e 1 minuto após adição de calc eína); ‘Baixa’ significa que não houve
incorporação significativa de calceína nas vesícula s deformáveis no intervalo de tempo
estudado (0 a 90 minutos). O coeficiente de permeab ilidade (P) foi determinado pela
equação: ln[1-F*(V e/Vi)]=-(3P/r)t, onde F é a fração de calceína encapsul ada no tempo t, V e é
o volume aquoso externo da suspensão de vesículas, Vi é o volume total interno da
suspensão de vesículas e r é o raio médio das vesíc ulas.
Lipossomas Ultradeformáveis 71
Os resultados mostram que a diminuição da concentração do colato na
formulação das vesículas, isto é, a redução da relação colato/fosfolipídio,
promoveu uma redução na permeabilidade destas vesículas, mostrando o papel
deste surfactante na elevada permeabilidade dessas vesículas.
Quando foi preparada uma suspensão de vesículas com concentrações de
SPC e colato 2 vezes menor, isto é, com concentração total reduzida, mantendo-
se a relação de colato/fosfolipídio, ocorreu uma diminuição da permeabilidade à
calceína. A explicação mais provável para este dado é que, quanto maior a
diluição da suspensão, menor a taxa de colato associado à membrana das
vesículas e menor o efeito desse tensoativo na permeabilidade da membrana.
Quando foi preparada uma suspensão de vesículas com concentrações de
fosfolipídios e colato 2 vezes maior, isto é, com concentração total aumentada,
mantendo-se a relação de colato/fosfolipídio, a permeabilidade à calceína
manteve-se alto.
As vesículas preparadas com EPC na ausência do etanol mostraram uma
permeabilidade menor que as vesículas preparadas com etanol (formulação
original), sendo possível determinar um coeficiente de permeabilidade da calceína
(2,2 X 10-10 cm/s). Este resultado indica que o etanol, mesmo em pequena
proporção (9% p/v), contribui para a elevada permeabilidade das vesículas
ultradeformáveis.
O conjunto desses dados indica que a elevada permeabilidade à calceína
das membranas ultradeformáveis é o resultado do efeito do etanol presente na
formulação e da quantidade de colato associado à membrana das vesículas, que
depende da diluição e da razão entre colato e fosfolipídio.
A importância deste estudo reside no fato que relata-se, pela primeira vez, a
elevada permeabilidade da membrana das vesículas ultradeformáveis, assim
como o papel de ambos componentes: colato de sódio e etanol. Esta alta
permeabilidade da membrana levanta dúvidas sobre a capacidade das vesículas
ultradeformáveis atuarem como carreador de fármacos de massa molar
intermediária, como proposto por Cevc e col. (1998, 2001).
Lipossomas Ultradeformáveis 72
Vale ressaltar que esses resultados não estão de acordo com aqueles
obtidos por Simões e col. 2004, que sugerem que as membranas das vesículas
ultradeformáveis formadas de SPC e colato seriam impermeáveis à calceína. Para
chegar a esta conclusão, os autores deste trabalho estudaram a taxa de retenção
da calceína em lipossomas de SPC, após a adição de colato de sódio em
diferentes quantidades. Neste estudo, a liberação da calceína foi observada a
partir de uma relação molar colato/SPC igual a 7 (com concentração de SPC igual
a 138mM), que é bem maior que a relação colato/SPC de 0,25 na suspensão de
vesículas ultradeformáveis.
A diferença entre nossos resultados e aqueles encontrados por Simões e
col. 2004, pode ser explicado pelo fato desses autores não terem usado etanol no
ensaio de permeação e da metodologia utilizada ser diferente. O sistema utilizado
por esses autores, diferentemente daquele usado em nosso estudo, não consiste
de membrana com os componentes em equilíbrio.
3.1.5. Determinação do grau de deformabilidade dos lipossomas
ultradeformáveis
O grau de deformabilidade das vesículas ultradeformáveis foi determinado
baseado no fluxo da suspensão de lipossomas permeada através de um
sanduíche de membranas de policarbonato de poros de diâmetro de 200 nm, 100
nm e 30 nm, sob pressão constante (400 psi) e temperatura controlada (37ºC). A
Figura 15, Gráfico A, compara os valores do grau de deformabilidade dos
lipossomas preparados com SPC e àqueles dos lipossomas preparados com EPC.
Os resultados indicam que estes dois lipídios associados ao surfactante colato de
sódio produzem membranas com a mesma capacidade de deformação (P>0,05,
Teste t Student). O Gráfico B mostra os valores médios de grau de
deformabilidade dos lipossomas contendo fosfatidilcolina e colato de sódio e dos
lipossomas contendo apenas fosfatidilcolina (sem colato de sódio). Os dados
confirmam a importância da presença do surfactante para conferir deformabilidade
às vesículas (P<0,001, Teste t Student).
Lipossomas Ultradeformáveis 73
LU-SPC com colato LU-EPC com colato0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
grau
de
defo
rmab
ilida
de
(A)
LU-SPC com colato LU-SPC sem colato0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
***
grau
de
defo
rmab
ilida
de
(B)
Figura 15: Deformabilidade de lipossomas de diferen tes composições lipídicas. Gráfico A:
lipossomas ultradeformáveis contendo colato de sódi o com fosfatidilcolina de soja (LU-
SPC, n=12) ou de ovo (LU-EPC, n=18). Gráfico B: lip ossomas de fosfatidilcolina de soja com
(n=3) e sem colato (n=3). A deformabilidade foi det erminada a partir do fluxo de permeação
de suspensão de vesículas através de um sanduíche d e membranas de poros de diâmetro
de 200 nm, 100 nm e 30 nm, a 37°C. Os dados são mos trados como as médias ± erro padrão.
***p<0,001 para comparação do grau de deformabilida de médio com e sem colato (Teste t de
Student).
Lipossomas Ultradeformáveis 74
3.2. Validação do método de dosagem por fluorimetri a da calceína em
plasma de animais
Os resultados abaixo referem-se aos parâmetros avaliados para validar o
método de dosagem da calceína no plasma de animais.
3.2.1. Linearidade
A Figura 16 mostra a relação entre a intensidade de fluorescência e a
concentração de calceína no plasma de animais.
0.00 0.05 0.10 0.15 0.200
1
2
3
4
5
concentração de calceina ( µµµµM)
Fluo
resc
ênci
a (u
.a.)
Figura 16: Relação entre a intensidade de fluorescê ncia e a concentração de calceína (µM)
em plasma de animais. Calceína foi acrescentada no plasma de animais em diferentes
concentrações. Após 1 hora de incubação a 37ºC, as amostras foram diluídas em solução de
NaCl 150mM e a fluorescência foi medida no espectro fluorímetro ( λλλλexc=490nm, λλλλem-515nm,
fendas de 5nm). Os pontos representam a média de 7 medidas independentes.
O coeficiente de regressão linear calculado foi de 0,998, e o critério mínimo
aceitável, segundo a ANVISA, é de 0,98. Como o valor obtido foi maior que o valor
aceitável, os resultados mostram que o método é linear para as concentrações de
calceína variando entre 0,022 µM e 0,182 µM, sendo esta considerada o intervalo
de trabalho nas dosagens de calceína no plasma de animais.
A equação da reta encontrada para determinar as concentrações de
calceína na faixa estudada é:
Lipossomas Ultradeformáveis 75
1937,20
1289,0)(.
−= ciaFluorescênMcalceínaConc µ
3.2.2. Precisão
Os valores das médias, dos desvios padrões e dos coeficientes de variação
(CV) para as leituras de fluorescência nas diferentes concentrações de calceína
em plasma de animais são mostradas na Tabela 6.
Tabela 6: Dados relativos à precisão do método de d osagem da calceína no plasma de
animais
Concentração de
calceína no plasma
Média da intensidade
de Fluorescência Desvio padrão CV (%)
0,022 µM 0,608 0,174 28,6
0,044 µM 1,022 0,144 14,1
0,065 µM 1,386 0,138 9,9
0,087 µM 1,887 0,205 10,9
0,131 µM 2,642 0,248 9,4
0,182 µM 3,912 0,226 5,8
Analisando os resultados podemos considerar que o método é preciso para
determinação da calceína no plasma de animais, nas concentrações de 0,044 a
0,182 µM, pois os valores do CV, nesta faixa de concentração, foram menores que
15%, critério mínimo de aceitação pela ANVISA.
3.2.3. Limites de Detecção e Quantificação
A média das leituras de fluorescência das amostras diluídas de plasma sem
calceína foi 0,1660 e o desvio padrão foi 0,0959 para 10 amostras independentes.
Desta forma, utilizando as equações descritas no item 2.3.3., o limite de detecção
foi 0,4535, que corresponde a uma concentração de 0,0161 µM de calceína no
plasma de animais. O limite de quantificação foi de 1,1245, correspondendo à
concentração de calceína de 0,0493 µM.
Lipossomas Ultradeformáveis 76
Os resultados mostraram que o método é linear e preciso para a dosagem
de calceína no plasma de camundongos na faixa de concentração de 0,044 µM a
0,182 µM, de acordo com as normas estabelecidas pela ANVISA e pelo
INMETRO.
3.3. Avaliação in vivo da absorção transdérmica da calceína a partir de
lipossomas ultradeformáveis
Visando avaliar a capacidade dos lipossomas ultradeformáveis promoverem
a absorção transdérmica de calceína para a circulação sanguínea, estudos in vivo
foram realizados usando camundongos sem pêlo. Após aplicação tópica de
formulação, a farmacocinética plasmática de calceína foi determinada pela medida
de fluorescência do plasma de acordo com o método validado.
Em um primeiro ensaio, comparamos os valores de fluorescência dos
plasmas diluídos em diferentes tempos (1, 2, 4, 7 e 24 horas) após aplicação
tópica de 100 µL de suspensão de lipossomas ultradeformáveis contendo calceína
10 mM, de 100 µL de solução de calceína 10 mM na presença de colato e etanol
(nas mesmas concentrações que nos lipossomas ultradeformáveis) ou de 100 µL
de suspensão de lipossomas ultradeformáveis vazios (sem calceína), usada como
controle deste experimento. A Figura 17 mostra os valores de fluorescência
(gráfico A) e a concentração de calceína plasmática (gráfico B) em função do
tempo.
Lipossomas Ultradeformáveis 77
0 2 4 60
1
2
3
4
5
6
8 16 24
Lipossomas vazios
Calceína livre com colato e etanol
Calecína em Lipossomas Ultradeformáveis
*** ***
##
Tempo (horas)
Fluo
resc
ênci
a (u
.a.)
(A)
0 2 4 60.0
0.1
0.2
0.3
8 16 24
Lipossomas vazios
Calceína livre com colato e etanol
Calceína em Lipossomas Ultradeformáveis*** ***
# #
Tempo (horas)
Con
cent
raçã
o de
cal
ceín
a (
µµ µµ M)
(B)
Figura 17: Absorção transdérmica de calceína para a circulação sistêmica quando aplicada
topicamente em camundongos sem pêlo em diferentes f ormas: 100 µL de solução de
calceína 10 mM, seja com colato e etanol ou na pres ença de vesículas ultradeformáveis
constituídas de SPC. Um grupo recebeu lipossomas ul tradeformáveis sem calceína
(Lipossomas vazios) como controle do experimento. O gráfico A mostra a fluorescência da
calceína no plasma de animais ( λλλλexc=490 nm, λλλλem=515 nm, fendas=5 nm) e o gráfico B
mostra a concentração plasmática de calceína permea da (µM) em função do tempo.
***P<0,001 para comparação nos tempos de 1 e 2 hs entre o grup o calceína livre com
colato/etanol e os outros grupos (TWO WAY ANOVA seg uido de Bonferroni, n=6). # P<0,05
para comparação dos tempos 1 e 2 hs com o tempo zer o para o grupo calceína livre com
colato/etanol (ONE WAY ANOVA seguido de Dunnet, n=6 ). Os dados são mostrados como
as médias ± erro padrão.
Lipossomas Ultradeformáveis 78
Os resultados mostram um aumento significativo da fluorescência da
calceína no plasma dos animais nos tempos 1 e 2 horas, em relação ao tempo
zero, no caso do grupo em que foi aplicado calceína livre com colato e etanol. Por
outro lado, não foi encontrada variação significativa das fluorescências no grupo
que recebeu a formulação de lipossomas ultradeformáveis. Os resultados
mostram também que as concentrações plasmáticas de calceína nos tempos de 1
e 2 horas foram significativamente mais elevadas no grupo que recebeu a calceína
livre com colato e etanol do que no grupo que recebeu a formulação de calceína
com lipossomas ultradeformáveis. Podemos concluir que os lipossomas
ultradeformáveis reduziram a absorção transdérmica da calceína para a circulação
em comparação com o sistema colato/etanol.
Em um segundo experimento, comparamos as taxas de absorção
transdérmica da calceína a partir de lipossomas ultradeformáveis, constituídos de
SPC e EPC, quando a calceína foi aplicada na concentração inicial de 10 mM. A
Figura 18 mostra que os valores de fluorescência, em ambos os grupos, ficaram
abaixo do limite de detecção do método. Além disso, não foram observadas
diferenças significativas entre os valores obtidos com as duas formulações
(P>0,05, Two Way ANOVA).
0 2 4 60.0
0.1
0.2
0.3
0.4
8 16 24
Calceína em lipossomas ultradeformáveis preparados com SPC
Calceína em lipossomas ultradeformáveispreparados com EPC
Tempo (horas)
Flu
ores
cênc
ia (
u.a.
)
Figura 18: Absorção transdérmica de calceína para a circulação sistêmica quando aplicada
topicamente em camundongos sem pêlo a partir de lip ossomas ultradeformáveis
constituídos de SPC ou EPC. A concentração inicial de calceína nas formulações foi de 10
mM. Os dados são mostrados como as médias ± erro pa drão (n=3).
Lipossomas Ultradeformáveis 79
Como alguns estudos na literatura relatam que o colato de sódio e o etanol
podem atuar como promotores de absorção de fármacos através da pele (Borg,
2000; Berner e Liu, 1995), procuramos verificar o efeito “promotor de absorção” do
sistema colato/etanol e avaliar se a adição de fosfolipídios a este sistema, levando
à formação de vesículas ultradeformáveis, inibia apenas a ação promotora deste
sistema ou era capaz de reduzir efetivamente a absorção de calceína para a
circulação.
Portanto, em um terceiro estudo, comparamos os níveis de absorção
transdérmica de calceína a partir de uma solução aquosa com aqueles obtidos a
partir do sistema micelar colato/etanol e dos sistemas vesiculares lipossomas
ultradeformáveis e lipossomas convencionais constituídos de SPC. Nesses
experimentos, a concentração inicial de calceína aplicada foi de 30 mM. A Figura
19 mostra os valores de concentração plasmática de calceína, em diferentes
intervalos de tempo, após aplicação tópica dessas formulações.
Lipossomas Ultradeformáveis 80
0 2 4 6 80.0
0.2
0.4
0.6
0.8
Calceína livre com colato e etanol
Calceína livre em tampão
Tempo (horas)
Con
cent
raçã
o de
cal
ceín
a (
µµ µµ M)
(A)
0 2 4 6 80.00
0.05
0.10
0.15Calceína livre em tampão
Calceína em lipossomas ultradeformáveis
Calceína em lipossomas convencionais
*
*
Tempo (horas)
Con
cent
raçã
o de
cal
ceín
a (
µµ µµ M)
(B)
Figura 19: Farmacocinéticas plasmáticas de calceína quando aplicada topicamente em
camundongos sem pêlo a partir de diferentes formula ções: calceína livre em tampão HEPES
20 mM/NaCl 0,15 M pH7,4; calceína livre em tampão H EPES na presença de colato e etanol;
calceína com lipossomas ultradeformáveis (SPC); cal ceína com lipossomas convencionais
(EPC). A concentração inicial de calceína nas formu lações foi de 30 mM. * P<0,05 para
comparação nos tempos de 2 e 4 horas entre o grupo Calceína livre em tampão e os outros
grupos (TWO WAY ANOVA seguido de Bonferroni). Os da dos são mostrados como as
médias ± erro padrão (n=4 a 7).
Lipossomas Ultradeformáveis 81
Todas as formulações promoveram um pico plasmático de calceína no
tempo de 2 horas. Como mostrado no gráfico A (Figura 19), as concentrações
plasmáticas foram mais elevadas para a calceína aplicada na presença do colato
e etanol do que para a calceína aplicada na sua ausência. Entretanto, a análise
estatística desses dados mostra não haver diferença significativa entre os dois
grupos (P>0,05, Two Way ANOVA).
Como mostrado no gráfico B (Figura 19), a calceína aplicada na forma livre
promoveu concentrações plasmáticas de calceína significativamente mais
elevadas nos tempos de 2 e 4 horas, quando comparada à calceína aplicada com
os lipossomas ultradeformáveis e os lipossomas convencionais. Os resultados
mostram também que não houve diferença significativa entre os grupos que
receberam lipossomas ultradeformáveis e lipossomas convencionais.
Portanto, o presente estudo demonstra que tanto os lipossomas
convencionais quanto os lipossomas ultradeformáveis reduzem a taxa de
absorção transdérmica de calceína para a circulação sanguínea.
O resultado obtido com os lipossomas convencionais está de acordo com o
relato prévio da redução da taxa de absorção transdérmica de calceína a partir
deste tipo de lipossomas (Li e col, 1996). Entretanto, no caso dos lipossomas
ultradeformáveis, o resultado obtido pode ser considerado como surpreendente,
especialmente se considerarmos os trabalhos de Cevc e col. (1995, 1998) com a
insulina.
No entanto, vale mencionar os estudos prévios com formulações de
cetoprofeno e diclofenaco em lipossomas ultradeformáveis, que mostram um
acúmulo preferencial do fármaco nos tecidos subcutâneo e muscular próximos ao
local de aplicação (Cevc e col., 2001, 2008). Foi proposto por esses autores que a
absorção transdérmica desses fármacos para a circulação, a partir das vesículas
ultradeformáveis, seria limitada, não pela passagem pela pele, mas sim pela
penetração reduzida dessas vesículas nos vasos sanguíneos, por sua capacidade
de atravessarem intactas na pele e de atuarem como sistemas de liberação
sustentada de fármaco. Para verificar se o modelo proposto por esses autores
Lipossomas Ultradeformáveis 82
aplica-se ao caso da calceína, torna-se necessário estudar o efeito das vesículas
ultradeformáveis na penetração e permeação cutânea de calceína.
No experimento cujos resultados estão apresentados na Figura 19, os
animais foram sacrificados 48 horas após a aplicação e as formulações
depositadas, mas não absorvidas na pele, foram retiradas com cotonetes
impregnados com solução salina para quantificação da calceína por fluorimetria.
Após lavagem da pele no local de aplicação das formulações, foi também
realizada uma punção de 3 mm neste local para quantificar a calceína retida na
derme.
A Figura 20 mostra as porcentagens que ficaram retidas na derme (gráfico
A) e as porcentagens da calceína que permaneceu aderida, sem ser absorvida, na
superfície do estrato córneo (gráfico B) dos camundongos.
Lipossomas Ultradeformáveis 83
calce
ína e
m ta
mpão
calce
ína co
m colato
e e
tano
l
lipos
som
as ul
tr adef
ormáv
e is
lipos
s omas
conve
ncion
ais
0.00
0.05
0.10
0.15
% d
e m
oles
de
calc
eína
inco
rpor
ada
na d
erm
e no
loca
l de
aplic
ação
(A)
calc
eína
em ta
mpão
calceín
a co
m co
lato
e et
anol
liposs
omas
ultr
adef
ormáv
eis
lipos
som
as co
nven
cionais
0
5
10
15
20
25
*
% d
e m
oles
de
calc
eína
depo
sita
da n
a su
perf
ície
da
pele
(B)
Figura 20: Quantidades de calceína (% em relação à quantidade aplicada) incorporada na derme
(gráfico A) e depositada na superfície do estrato c órneo (gráfico B) em camundongos sem pêlo, 48
horas após a aplicação tópica de diferentes formula ções de calceína na concentração de 30 mM:
soluções de calceína em tampão na presença ou ausên cia de colato e etanol; e suspensões de
lipossomas ultradeformáveis ou convencionais conten do calceína. Os dados referem-se à média ±
erro padrão das porcentagens de calceína. ( λλλλexc=490 nm, λλλλem=515 nm, fendas=5 nm). * P<0,05 para
comparação entre os lipossomas ultradeformáveis e a calceína livre em tampão com ou sem colato e
etanol (ONE WAY ANOVA, seguido de Bonferroni, n=4-8 ).
Lipossomas Ultradeformáveis 84
Os resultados mostram que ocorreu uma maior deposição de calceína na
superfície da pele quando foi aplicada na forma encapsulada em lipossomas,
quando comparada à forma livre em tampão na ausência ou presença de colato e
etanol (P<0,05, ONE WAY ANOVA, seguido de Bonferroni), sendo que o nível de
calceína depositado foi aproximadamente 8 vezes menor.
Por outro lado, em relação à penetração de calceína nas camadas mais
profundas da pele, isto é, a quantidade que fica retida na derme dos
camundongos, não foi possível evidenciar diferenças significativas entre as
diferentes formulações.
Duas interpretações distintas podem ser propostas para explicar este
resultado. As maiores quantidades de calceína aderida na pele com as
formulações de lipossomas pode ser atribuída seja a uma menor absorção
cutânea de calceína ou a uma maior adesão da formulação na pele.
As baixas taxas de calceína permeada através da pele, tipicamente
inferiores a 3% após 8 horas, como mostraremos em seguida no estudo de
permeação cutânea in vitro a partir dessas formulações, sugerem que a absorção
cutânea de calceína altera de forma mínima a quantidade total de calceína
superficial. Portanto, acreditamos que a diferença na adesão das formulações seja
a explicação mais provável.
Esses dados sugerem também que os lipossomas ultradeformáveis e os
lipossomas convencionais reduzem a partição de calceína na pele quando
comparados à soluções com e sem colato/etanol, pois, apesar de que quantidades
equivalentes de calceína foram encontradas na derme, a quantidade de calceína
depositada na superfície da pele foi 8 vezes maior quando foi aplicada com os
lipossomas.
Lipossomas Ultradeformáveis 85
3.4. Avaliação da permeação cutânea da calceína in vitro a partir dos
lipossomas ultradeformáveis
Visando avaliar se a redução da absorção transdérmica de calceína pelos
lipossomas ultradeformáveis se deve à redução da taxa de permeação pela pele
ou à retenção das vesículas em tecidos mais profundos, como sugerido por Cevc
e col. (2001), estudos de permeação cutânea in vitro foram realizados utilizando
Células de Difusão de Franz e pele de dorso de camundongos sem pêlo.
A Figura 21 mostra as quantidades de calceína permeada pela pele, em
porcentagens acumulada, com relação à calceína aplicada, nos tempos de 2, 4, 6
e 8 horas após a aplicação das seguintes formulações de calceína na
concentração inicial de 10 mM: soluções de calceína livre em tampão (com ou
sem colato/etanol) ou suspensões de lipossomas ultradeformáveis ou
convencionais contendo calceína.
0 2 4 6 80.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Calceína com colato e etanol
Calceína livre em tampão
Lipossomas ultradeformáveis
Lipossomas convencionais
*
#
Tempo (horas)
% a
cum
ulad
a de
cal
ceín
ape
rme
ada
pe
la p
ele
/ c
m2
Figura 21: Porcentagens acumuladas de calceína perm eada através da pele do dorso de
camundongos sem pêlo, no período de 2, 4, 6 e 8 hor as, em relação à calceína aplicada
inicialmente a partir de diferentes formulações: ca lceína em tampão com colato e etanol, calceína
livre em tampão, calceína na presença de lipossomas convencionais e calceína na presença de
lipossomas ultradeformáveis nos experimentos de Cél ulas de Franz. A concentração inicial de
calceína nas formulações foi 10 mM. Os dados são mo strados como as médias ± erro padrão.
*P<0,05 para comparação entre o grupo calceína em tam pão com colato/etanol com o grupo
calceína livre em tampão nos tempos de 4, 6 e 8 hor as. #P<0,05 para comparação do grupo
calceína livre em tampão com o grupo lipossomas ult radeformáveis nos tempos de 6 e 8 horas.
(TWO WAY ANOVA seguido de Bonferroni, n=4-7).
Lipossomas Ultradeformáveis 86
No caso de todas as formulações, cinéticas bifásicas foram obtidas,
mostrando um fluxo elevado no período de 0 a 4 horas seguido de um fluxo
reduzido no período de 4 a 8 horas.
Os resultados indicam que a quantidade de calceína permeada foi maior
para a calceína livre aplicada na presença de colato e etanol, quando comparada
à calceína livre em tampão (P<0,05, Two way ANOVA seguido de Bonferroni) e à
calceína apresentada com lipossomas convencionais e ultradeformáveis (P<0,001
Two way ANOVA seguido de Bonferroni), nos tempos de 4, 6 e 8 horas.
Portanto, o presente estudo demonstra a ação da mistura colato/etanol
como promotor de absorção percutânea da calceína. Estes resultados estão de
acordo com os trabalhos de Borg, 2000 e Berner e Liu, 1995, que mostraram que
o colato e o etanol podem aumentar a permeação de fármacos através da pele. A
observação do aumento da permeação cutânea da calceína na presença de colato
e etanol é também consistente com o aumento da permeabilidade das membranas
de fosfatidilcolina na presença dos mesmos compostos. Os resultados indicam
ainda que o efeito da mistura como promotor colato/etanol de absorção foi inibido
pela presença de fosfolipídio.
Vale ressaltar que a permeação cutânea da calceína foi menor nos tempos
de 6 e 8 horas quando aplicada encapsulada em lipossomas ultradeformáveis do
que quando aplicada na forma livre em tampão (P<0,05, Two way ANOVA seguido
de Bonferroni). Por outro lado, não houve diferença entre as quantidades de
calceína permeada a partir dos lipossomas, ultradeformáveis e convencionais.
Portanto, de acordo com os nossos resultados, os lipossomas
ultradeformáveis reduzem a quantidade de calceína permeada pela pele,
sugerindo que a passagem desta molécula através da pele é controlada e limitada
pela formulação. Em outras palavras, a etapa limitante para a passagem pela pele
não seria a difusão através do estrato córneo.
Nesse contexto, podemos propor que os lipossomas ultradeformáveis
reduzem a absorção transdérmica de calceína para a circulação sanguínea
através da redução da taxa de permeação da calceína pela pele, sem que seja
necessário propor a retenção da calceína em tecidos mais profundos. A nossa
Lipossomas Ultradeformáveis 87
interpretação é reforçada ainda pela observação de que o período de maior
intensidade do fluxo de permeação percutânea no estudo in vitro (0 a 4 horas)
corresponde ao período de maior concentração plasmática de calceína no estudo
in vivo.
Para confirmar que a permeação cutânea da calceína a partir dos sistemas
vesiculares é limitada pela difusão da calceína no veículo e não pela difusão
através do estrato córneo, determinamos os coeficientes de regressão linear
médios para as relações de % de calceína permeada em função de t ou de √(t).
Os resultados obtidos estão apresentados na Tabela 7 e as curvas de regressão
linear estão mostradas na Figura 22 para as diferentes formulações, como
ilustração. Lembramos que uma relação linear entre a % de calceína permeada e
o tempo suporta a hipótese de que a etapa limitante é a passagem da calceína
pela pele (modelo 1), enquanto que uma relação linear entre a % de calceína
permeada e a raiz quadrada do tempo sugere que a formulação limita o fluxo de
passagem da calceína pela pele (modelo 2).
Tabela 7: Valores médios ± DP dos coeficientes de r egressão linear para as relações de %
de calceína permeada in vitro em função de t (model o 1) ou em função de √(t) (modelo 2).
Calceína livre com
colato e etanol
Calceína livre
em tampão
Calceína em
vesículas
ultradeformáveis
Calceína em
lipossomas
convencionais
Modelo 1* 0,7719 ± 0,0967 0,7917 ± 0,0456 0,8997 ± 0,0745 0,9210 ± 0,0354
Modelo 2* 0,8440 ± 0,0766 0,8646 ± 0,0391 0,9457 ± 0,0538 0,9639 ± 0,0231
*P<0,01 para comparação entre o modelo 1 e o modelo 2 para todas as formulações (Teste t
pareado)
Lipossomas Ultradeformáveis 88
0 2 4 6 8 100
1
2
3
4Calceína com colato e etanol
Calceína livre em tampão
t (h)
% c
alce
ina
perm
eada
(acu
mul
ada)
0 1 2 30
1
2
3
4
√√√√ (t)
% c
alce
ina
perm
eada
(acu
mul
ada)
0 2 4 6 8 100.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05Lipossomas ultradeformáveis
t (h)
% c
alce
ina
perm
eada
(acu
mul
ada)
0 1 2 30.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
√√√√ (t)
% c
alce
ina
perm
eada
(acu
mul
ada)
0 2 4 6 8 100.0
0.1
0.2
0.3Lipossomas convencionais
t (h)
% c
alce
ina
perm
eada
(acu
mul
ada)
0 1 2 30.0
0.1
0.2
0.3
√√√√ (t)
% c
alce
ina
perm
eada
(acu
mul
ada)
(A) (B)
Figura 22: Curvas de regressão linear para as relaç ões de % de calceína permeada em
função de t (modelo 1, gráficos A) ou em função de √(t) (modelo 2, gráficos B) para os
grupos de calceína livre em tampão (na presença e a usência de colato e etanol) e calceína
encapsulada em lipossomas (deformáveis ou convencio nais) em experimentos de Células
de Franz.
Os dados de regressão linear indicam uma baixa concordância dos dados
experimentais com os dois modelos no caso das formulações de calceína livre na
ausência e presença de colato e etanol. Isto pode ser explicado pelo fato de
ocorrer uma precipitação do fármaco durante a secagem da formulação na
Lipossomas Ultradeformáveis 89
superfície da pele, que foi observada tanto nos ensaios in vitro de Células de
Franz quanto nos ensaios in vivo com camundongos sem pêlo. No caso específico
da mistura colato/etanol, que atua como promotora de permeação cutânea, o
caráter transitório dessa ação poderia contribuir também para o desvio dos dados
experimentais com relação a esses modelos teóricos.
No caso das formulações de lipossomas ultradeformáveis e convencionais,
os valores de coeficiente de regressão linear indicam que há uma melhor
concordância dos dados com o modelo 2 de que com o modelo 1, reforçando a
nossa interpretação de que a permeação cutânea da calceína a partir dessas
formulações seria controlada pelo veículo e não pelo estrato córneo.
Vale ressaltar que nenhum dos dois modelos de permeação prevê a
possibilidade de interação do veículo com a pele. Nesse contexto, não podemos
descartar a possibilidade de que a redução do fluxo de difusão da calceína seja
decorrente da interação das vesículas com o estrato córneo, resultando na
redução da sua permeabilidade à calceína.
No caso dos lipossomas convencionais, espera-se que a secagem da
formulação na pele leve à agregação, coalescência e desestabilização das
vesículas (Schubert e col., 1993). O componente lipídico liberado poderia então
reduzir a permeabilidade do estrato córneo, como relatado em estudos prévios
(Dayana e col., 2000; El Maghraby e col., 2001).
3.5. Avaliação da porcentagem de encapsulação da ca lceína após
permeação pela pele
Para avaliar se a calceína permeada através da pele a partir da formulação
de lipossomas ultradeformáveis encontrava-se na forma livre ou encapsulada, foi
determinada a fração de calceína encapsulada no fluído receptor usando o
método de adição do íon cobalto, conforme descrito no item 2.2.3.. Estes ensaios
foram realizados para as formulações de calceína em lipossomas ultradeformáveis
e de calceína livre em colato e etanol (controle), com os líquidos receptores
colhidos nos tempos de 2 e 8 horas. A Tabela 8 mostra os resultados de
Lipossomas Ultradeformáveis 90
porcentagem de calceína encapsulada. A Figura 23 mostra o resultado de um
ensaio típico com os valores de fluorescência dos líquidos receptores antes e após
a adição de CoCl2 e Triton X-100 nos tempos de 2 e 8 horas, após aplicação da
formulação de calceína em lipossomas ultradeformáveis.
Os valores médios da eficiência de encapsulação da calceína foram muito
baixos para a calceína em lipossomas ultradeformáveis e equivalentes àqueles
encontrados com a calceína livre, indicando que o marcador fluorescente se
encontra no fluido receptor na forma não encapsulada. Desta forma, os resultados
sugerem que a calceína é permeada na forma livre ou é liberada durante ou após
sua passagem pela pele.
Vale ressaltar que o conjunto destes resultados contradiz o modelo
proposto por Cevc e col (1998, 1995, 2001), segundo o qual as vesículas
ultradeformáveis atravessariam o estrato córneo de forma intacta carreando os
fármacos através da pele e controlando sua liberação para a circulação.
Tabela 8: Frações de calceína encapsulada (não aces sível ao íon cobalto) determinadas no
fluído receptor da Célula de Franz 2 e 8 horas após aplicação tópica de calceína
encapsulada em lipossomas ultradeformáveis ou livre em colato e etanol, em pele de
camundongos sem pêlo.
Formulação % Encapsulação (média ± erro padrão)
2 horas 8 horas
Calceína livre com colato e etanol 1,77 ± 0,47 1,70 ± 0,41
Calceína em lipossomas ultradeformáveis 1,40 ±1,01 3,90 ± 0,38
Lipossomas Ultradeformáveis 91
2 horas
0 2 4 6 8
0
30
60
90
120
150
adição de CoCl2
adição de Triton X100
tempo (minutos)
Fluo
resc
ênci
a (u
.a.)
8 horas
0 2 4 6 8
0
30
60
90
120
adição de Triton X100
adição de CoCl2
tempo (minutos)
Fluo
resc
ênci
a (u
.a.)
(A) (B)
Figura 23: Sinais de fluorescência dos líquidos rec eptores antes e após a adição de CoCl 2 e
Triton X-100 referentes a formulação de calceína em lipossomas ultradeformáveis, nos
tempos de 2 horas (gráfico A) e de 8 horas (gráfico B) após aplicação na pele de
camundongos sem pêlo, no experimento de Células de Franz ( λλλλexc=490 nm, λλλλem=515 nm,
fendas de excitação e emissão=5 nm).
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Um primeiro objetivo deste trabalho foi caracterizar do ponto de vista físico-
químico as vesículas ultradeformáveis utilizando a calceína como modelo de
fármaco hidrofílico de massa molar intermediária. Outro objetivo era investigar o
mecanismo de absorção percutânea deste marcador a partir das vesículas
ultradeformáveis, através do estudo in vivo da absorção transdérmica em
camundongos sem pêlo e do estudo in vitro da permeação cutânea (Células de
Difusão de Franz).
Em relação à caracterização físico-química, a eficiência de encapsulação
de calceína na suspensão original de lipossomas ultradeformáveis foi cerca de
18%, mas aumentou com o aumento da concentração da suspensão de vesículas.
Demonstrou-se pela primeira vez que a membrana destas vesículas
apresenta uma elevada permeabilidade à calceína, indicando uma baixa
capacidade de retenção. A redução da quantidade de colato de sódio e etanol
Lipossomas Ultradeformáveis 92
levou a uma redução da permeabilidade da calceína, mostrando o papel
importante destes componentes na elevada permeabilidade destas vesículas.
Considerando que, após a aplicação tópica das formulações em condição
não oclusiva a concentração dos componentes da formulação aumenta, os nossos
resultados sugerem que ocorre um aumento da eficiência de encapsulação da
calceína nas vesículas ultradeformáveis após administração tópica deste tipo de
formulação.
O estudo de absorção transdérmica da calceína para a circulação
sanguínea, realizado em camundongos sem pêlo mostra que os lipossomas
reduziram a absorção transdérmica da calceína, quando comparados às soluções
aquosas, com ou sem colato e etanol. Ocorreu também uma maior retenção de
calceína na superfície da pele quando foi aplicada em lipossomas
ultradeformáveis, quando comparada às formas livres, mas que não resultou em
maior quantidade de calceína incorporada na pele.
Os ensaios de permeação cutânea in vitro, utilizando Células de Difusão de
Franz e pele de camundongos sem pêlo, mostraram que a quantidade de calceína
permeada a partir dos lipossomas ultradeformáveis e convencionais foi menor do
que a partir das soluções contendo ou não colato e etanol. Neste estudo foi
claramente demonstrado o efeito promotor de permeação cutânea da mistura
colato/etanol.
Os dados obtidos sugerem ainda que a absorção percutânea da calceína é
controlada pela liberação da calceína do veículo e não por sua difusão através do
estrato córneo. Outra observação importante foi que a calceína permeada pela
pele, a partir dos lipossomas ultradeformáveis, encontrou-se essencialmente na
forma não encapsulada.
Em conclusão, podemos destacar as seguintes contribuições do nosso
estudo para o melhor entendimento do modo de atuação das vesículas
ultradeformáveis:
- a demonstração de que as vesículas ultradeformáveis reduzem a
absorção transdérmica de calceína para a circulação
Lipossomas Ultradeformáveis 93
- a apresentação de evidências experimentais de que a redução da
absorção transdérmica da calceína seria resultado do controle da liberação do
fármaco pela formulação e não da atuação dessas vesículas como carreador,
atravessando a pele e controlando a liberação do marcador no tecido subcutâneo.
- a demonstração da elevada permeabilidade à calceína das vesículas
ultradeformáveis que implica que essas vesículas provavelmente sofram uma
maturação após a aplicação tópica, transferindo o colato e o etanol para a pele,
tornando-se menos permeáveis e menos flexíveis.
Vale ressaltar que os resultados do presente estudo contradizem o modelo
clássico de atuação das vesículas ultradeformáveis proposto por Cevc e col.
(1992, 1998, 2001, 2004), segundo o qual essas vesículas atuariam como
carreador, transportando o fármaco através da pele e controlando sua passagem
para a circulação ao nível subcutâneo.
Vale mencionar ainda que não foi possível evidenciar diferença entre as
vesículas ultradeformáveis e as vesículas convencionais fluidas em relação às
características farmacocinéticas. Isto sugere que esses dois tipos de sistemas
vesiculares apresentam um campo de atuação semelhante, pelo menos no caso
de fármacos hidrofílicos de massa molar intermediária. Nesse contexto, uma
aplicação preferencial desse sistema, no caso de fármacos hidrofílicos de massa
molar intermediária, seria para promover níveis prolongados na derme e níveis
reduzidos nos tecidos mais profundos e na circulação sistêmica.
Lipossomas Mucoadesivos 94
CAPÍTULO 2: LIPOSSOMAS MUCOADESIVOS PARA ADMINISTRAÇÃO
ORAL DE FÁRMACOS HIDROFÍLICOS
1. INTRODUÇÃO
A via oral é a forma mais utilizada para a administração de fármacos devido
à sua praticidade e à elevada adesão dos pacientes. Para que um fármaco seja
absorvido e atinja a circulação sanguínea, várias etapas devem ser vencidas:
primeiro a formulação deve liberar o fármaco no fluido aquoso gastrointestinal;
depois as moléculas do fármaco devem se difundir no fluido gastrointestinal até
alcançarem a superfície da mucosa intestinal; em seguida devem migrar do meio
aquoso externo para dentro da mucosa; para finalmente permearem através da
membrana celular e atingirem a circulação sanguínea (Loftsson e col., 2004).
Existem várias barreiras que dificultam a absorção de fármacos pelo trato
gastrointestinal, contribuindo para uma baixa disponibilidade do fármaco. Isto torna
inviável a utilização desta via para a administração de determinados tipos de
bioativos.
Em relação às características físico-químicas dos fármacos, a literatura
relata que moléculas hidrofílicas com massa molar maior que 500 Da não são bem
absorvidas pela mucosa gastrointestinal (Ashord, 2007 b; Ponchel et al, 1998;
Loftsson e col., 2004; Benet e col., 1996).
Estratégias têm sido procuradas com objetivo de contornar os problemas da
administração oral e aumentar a biodisponibilidade de fármacos. Uma estratégia
interessante explora a presença da mucosa que reveste todo o trato
gastrointestinal. Esta mucosa, devido as suas características físico-químicas,
promove a adesão de macromoléculas, através de interações específicas ou não
específicas. Este processo de adesão de substâncias na mucosa do trato
gastrointestinal chama-se mucoadesão ou bioadesão (Woodley, 2001; Ponchel et
al, 1998).
Lipossomas Mucoadesivos 95
Vários trabalhos na literatura apontam para o potencial dos lipossomas
mucoadesivos para administração oral e nasal de fármacos (Ponche e col., 1998
Takeuchi e col., 2001, 2005; Takeuchi e col., 2005; Jain e col., 2007).
Estes lipossomas são preparados com lipídios carregados negativamente e
revestidos com polímeros catiônicos. Estes polímeros que revestem a superfície
dos lipossomas permitem aumentar a adesão destes na mucosa do trato
gastrointestinal, resultando no aumento da biodisponibilidade dos fármacos
encapsulados. Entre os polímeros utilizados, a quitosana merece destaque por ser
de origem natural, biodegradável, biocompatível e mucoadesiva.
Os lipossomas mucoadesivos mostraram-se capazes de potencializarem as
ações biológicas da insulina e da calcitonina (Takeuchi e col., 2001, 2005; Prego e
col, 2006), porém o modo de atuação deste sistema não está totalmente
elucidado.
Mais especificamente, há controvérsias se os lipossomas são estáveis
quando administrados por via oral e são capazes de reter o fármaco encapsulado.
Há a possibilidade ainda da quitosana proteger os lipossomas de um efeito
desestabilizante do suco gástrico e dos sais biliares. Desta forma, torna-se
importante estudar estas vesículas para avaliar seu verdadeiro potencial de
utilização, principalmente para encapsular e reter substâncias hidrofílicas nesses
fluidos biológicos, bem como aumentar sua absorção por via oral.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Preparação da solução de quitosana
A solução de quitosana, grau de desacetilação de 98%, (Polymar, Ceará,
Brasil) foi preparada na concentração de 0,6% (p/v), em ácido acético 4% (p/v),
com agitação magnética por 3 horas, em temperatura ambiente. Após o preparo,
a solução apresentava um valor de pH de 4,4.
Lipossomas Mucoadesivos 96
2.2. Preparação da formulação de lipossomas mucoade sivos
Os lipossomas mucoadesivos foram preparados com a mesma composição
lipídica que os lipossomas preparados por Takeuchi e col., 2005, com algumas
modificações no modo de preparo, ilustrado na Figura 24.
Inicialmente, lipossomas aniônicos foram preparados a partir da mistura de
lipídios contendo L-α-diestearoilfosfatidilcolina (DSPC, Avanti Polar Lipids),
dicetilfosfato (DCP, Sigma) e colesterol (COL, Sigma) na razão molar de 8:2:1. Os
lipídeos foram dissolvidos em clorofórmio (Merck) e um filme lipídico foi obtido na
parede de um balão após evaporação do solvente em rotaevaporador (Labconco,
UK). Em seguida, o filme lipídico foi hidratado com solução de calceína 30 mM e a
concentração final de lipídios de 80 g/L.
A suspensão de lipossomas resultante foi submetida a congelamento em N2
líquido e descongelamento em temperatura de 60ºC permitindo a obtenção de
lipossomas do tipo FATMLVs (Frozen and Thawed MLVs). O processo de
congelamento e descongelamento foi repetido 8 vezes, de acordo com Mayer e
col., 1985.
A suspensão de FATMLVs foi filtrada repetidamente (7 vezes) em
membranas de policarbonato de poro de 200 nm, na temperatura de 65ºC usando
extrusor (Lipex Biomembranes, Canadá), para a calibração do tamanho das
vesículas (Mayer e col., 1986).
Após esta etapa, os lipossomas foram diluídos, na razão 1:1 (v/v), com
solução de NaCl 0,075M e foram submetidos a diálise, usando membrana de
celulose regenerada (Spectra/Por MWCO=15000 Da), contra solução de NaCl 75
mM, por 36 horas, e depois contra tampão Acetato 100 mM pH4,4, por mais 24
horas, para eliminar a calceína não encapsulada.
Lipossomas Mucoadesivos 97
Figura 24: Representação esquemática do modo de pre paro dos lipossomas aniônicos e
mucoadesivos.
Os lipossomas mucoadesivos contendo calceína foram obtidos a partir da
mistura de uma suspensão de lipossomas aniônicos de tamanho calibrado e
contendo calceína encapsulada com a solução de quitosana 0,6% (p/v), na razão
1:1 (v/v), com incubação por 30 minutos a 25ºC.
Os lipossomas sem quitosana foram preparados diluindo a suspensão de
lipossomas aniônicos de tamanho calibrado contendo calceína com a solução de
ácido acético 100 mM pH4,4, na razão 1:1 (v/v).
A concentração final de lipídios nas formulações a serem aplicadas era de
20 g/L.
Foi também preparada uma solução de calceína livre em tampão acetato
100 mM pH 4,4 para ser utilizada como controle nos experimentos.
Lipossomas Mucoadesivos 98
2.3. Caracterização físico-química dos lipossomas m ucoadesivos
2.3.1. Determinação da distribuição de tamanho das partículas
A distribuição de tamanho das partículas foi avaliada através de
espalhamento dinâmico de luz no equipamento Zetasizer 3000HS (Malvern, UK).
A suspensão de lipossomas, com ou sem quitosana, foi diluída 75 vezes em
tampão acetato 100 mM pH 4,4. Os resultados fornecidos pelo equipamento foram
o diâmetro hidrodinâmico médio e o índice de polidispersidade da população de
lipossomas.
2.3.2. Determinação da eficiência de encapsulação da calceína
A porcentagem de encapsulação da calceína nos lipossomas foi
determinada após quantificação da calceína encapsulada e total por fluorimetria. A
separação dos lipossomas da calceína não encapsulada foi realizada por diálise
da suspensão de lipossomas (item 2.2).
10 µL das amostras (antes e após a diálise) foram misturadas com 20µL de
detergente Triton X-100 20% (p/v) e 70µL de água deionizada. A mistura foi
incubada por 30 minutos a 60ºC para garantir o rompimento dos lipossomas e a
liberação da calceína presente em seu interior. Em seguida, as amostras
resultantes foram diluídas 10 vezes com tampão HEPES 20 mM/NaCl 100 mM
pH7,4. Para as leituras de fluorescência, 100 µL das amostras diluídas foram
adicionadas em cubeta de quartzo (1 x 1 cm) contendo 2,1 mL de tampão HEPES
20 mM/NaCl 100 mM pH7,4 (λexcitação=490 nm; λemissão=515 nm; fendas de
excitação e emissão=5 nm).
A leitura da fluorescência da suspensão de lipossomas antes da diálise
(Fcalceína total) é diretamente proporcional à quantidade total de calceína,
enquanto a leitura após a diálise (Fcalceína encapsulada) é diretamente
proporcional à quantidade de calceína presente no interior dos lipossomas. A
eficiência de encapsulação pode ser então calculada pela seguinte equação:
100*totalFcalceína
aencapsuladFcalceínaãoencapsulaçdemPorcentage =
Lipossomas Mucoadesivos 99
2.3.3. Estabilidade dos lipossomas mucoadesivos em condições de
armazenamento
Para avaliar se a presença da quitosana alterava a estabilidade das
vesículas em condições de armazenamento, foram comparadas as taxas de
calceína liberada na presença e na ausência de quitosana. Amostras de
lipossomas contendo calceína encapsulada foram mantidas a 4ºC, na presença ou
ausência de quitosana e, em determinados intervalos de tempo (tempo zero, 1, 2,
7 e 14 dias), uma alíquota foi retirada e diluída 10 vezes em tampão HEPES 20
mM/NaCl 100 mM pH7,4. Após nova diluição da amostra (0,5 mL da amostra
diluída + 1,7mL de tampão HEPES 20 mM/NaCl 100 mM pH7,4), foram feitas
medidas de fluorescência antes e depois da adição de CoCl2, permitindo a
determinação da concentração de calceína no meio externo (como no Capítulo 1,
ítem 2.2.3).
Desta forma, foram determinados os porcentuais de calceína liberada dos
lipossomas na presença e ausência de quitosana, nos diversos intervalos de
tempo. A Figura 25 ilustra o ensaio de estabilidade dos lipossomas mucoadesivos.
Figura 25: Representação esquemática do ensaio de e stabilidade dos lipossomas
mucoadesivos
2.4. Avaliação da absorção de calceína por via oral a partir de
lipossomas mucoadesivos
A absorção de calceína por via oral a partir das formulações de lipossomas
foi avaliada utilizando camundongos Swiss machos de 8 semanas, pesando de 28
Lipossomas Mucoadesivos 100
a 32 g, adquiridos no Centro de Bioterismo da UFMG . Os animais ficaram em
jejum por 3 horas antes da administração e permaneceram em jejum durante todo
o experimento. A administração foi realizada por gavagem com 200 µL das
formulações. Em intervalos de tempo pré-determinados, foram feitas coletas de
sangue pela cauda dos animais e as concentrações plasmáticas da calceína foram
determinadas a partir das leituras da fluorescência das amostras, conforme
método descrito e validado no Capítulo 1, item 2.4. Em cada experimento foi
realizada uma curva de calibração, relacionando a intensidade de fluorescência
com a concentração de calceína no plasma dos animais. A Figura 26 ilustra o
procedimento utilizado para avaliação da absorção da calceína por via oral.
Neste estudo, foram usados 4 grupos experimentais (n=6) que receberam
as seguintes formulações: tampão acetato 100 mM pH4,4; calceína livre
preparada em tampão acetato 100 mM pH4,4; lipossomas contendo calceína sem
quitosana; e lipossomas contendo calceína e com quitosana. A concentração de
calceína nas formulações administradas foi a mesma em todos os grupos
experimentais (3 mM) e estabelecida em função da eficiência de encapsulação da
calceína nos lipossomas.
Figura 26: Representação esquemática do procediment o utilizado para o estudo da
absorção da calceína por via oral.
Lipossomas Mucoadesivos 101
2.5. Liberação da calceína a partir das formulações de lipossomas em
diferentes meios simulando os fluídos biológicos
Foi avaliada a taxa de liberação de calceína dos lipossomas na presença e
na ausência de quitosana em diferentes meios simulando condições os fluidos
biológicos presentes no trato gastrointestinal: o suco gástrico, caracterizado por
seu pH ácido e a bile, caracterizada pela presença de sais biliares. Os meios
avaliados foram: tampão acetato 100 mM pH4,4; tampão acetato 100 mM pH4,4
contendo deoxicolato de sódio 0,01% (tensoativo utilizado como modelo de sal
biliar); tampão HEPES 50 mM/NaCl 100 mM pH 7,4; tampão HEPES 50 mM/NaCl
100 mM pH 7,4 contendo deoxicolato de sódio 0,01%; e solução de HCl 0,1M.
Alíquotas de 10 µL das amostras de lipossomas contendo calceína
encapsulada, com ou sem quitosana, foram acrescentadas a 1mL desses
diferentes meios e a mistura foi incubada a 37ºC. Em intervalos de tempo
determinados (tempo zero, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora e 3 horas), alíquotas
foram retiradas e diluídas 21 vezes em tampão HEPES 20 mM/NaCl 100 mM pH
7,4. Foram realizadas medidas de fluorescência das amostras diluídas antes e
após a adição de CoCl2, permitindo a determinação da quantidade de calceína
presente no meio externo (conforme descrito no Capítulo 1, item 2.2.3).
O porcentual de calceína liberada dos lipossomas nos diferentes meios
modelos foi determinado a partir do conhecimento da quantidade de calceína no
meio externo (Qe) e da quantidade total de calceína (QT), usando a seguinte
equação:
100*%T
e
Q
Qliberadacalceína =
2.6. Aspectos éticos no manuseio dos animais
Os procedimentos envolvendo o uso e o manuseio dos animais foram
aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal-CETEA da
Universidade Federal de Minas Gerais, protocolo número 044/07.
Lipossomas Mucoadesivos 102
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1. Caracterização físico-química dos lipossomas m ucoadesivos
Lipossomas aniônicos com membrana na fase gel, de tamanho calibrado e
contendo calceína encapsulada, foram preparados a partir de DSPC, DCP e
CHOL na relação molar 8:2:1, em tampão acetato 100 mM pH 4,4, na
concentração lipídica inicial de 80 g/L. Solução de quitosana foi acrescentada na
concentração final de 0,3% (p/v).
Os lipossomas mucoadesivos foram obtidos a partir da mistura de um
volume da suspensão de lipossomas aniônicos com o mesmo volume de solução
de quitosana 0,6% (p/v).
3.1.1. Determinação da distribuição de tamanho das partículas
O diâmetro hidrodinâmico médio dos lipossomas antes da adição de
quitosana foi de 173,2 ± 5,9 nm (n=6), com índice de polidispersidade de 0,158 ±
0,031, indicando homogeneidade da população de vesículas. Após a adição de
quitosana, a suspensão de lipossomas mostrou um diâmetro hidrodinâmico de
251,3 ± 2,3 nm (n=3), com índice de polidispersidade de 0,201 ± 0,006. Já que
índices de polidispersidade inferiores ou iguais a 0,2 indicam uma população de
lipossomas monodispersa, podemos considerar que as suspensões de lipossomas
obtidas são de tamanho homogêneo e constituídas por uma única população.
O aumento do diâmetro médio das vesículas após a adição de quitosana é
indicativo do recobrimento da superfície aniônica das vesículas pelo polímero
quitosana em decorrência da força de atração eletrostárica.
3.1.2. Eficiência de encapsulação da calceína nos lipossomas
A porcentagem de encapsulação da calceína nos lipossomas foi
determinada antes da adição da solução de quitosana, correspondendo a 18,6 ±
4,1% (n=3).
Lipossomas Mucoadesivos 103
3.1.3. Estabilidade dos lipossomas mucoadesivos em condição de
armazenamento
Foi avaliada neste estudo a influência da quitosana na capacidade dos
lipossomas aniônicos de reter a calceína encapsulada em condições de
armazenamento, isto é, solução de ácido acético 100 mM pH4,4, na temperatura
de 4ºC.
A Figura 27 mostra as taxas de calceína liberada dos lipossomas na
presença e ausência de quitosana em função do tempo.
0 2 4 6 8 10 12 140
20
40
60
80
100Lipossomas sem quitosana
Lipossomas com quitosana
Tempo (dias)
% d
e ca
lceí
na li
bera
da
Figura 27: Cinéticas de liberação de calceína a par tir de lipossomas armazenados a 4ºC com
e sem quitosana. Os dados referem-se às médias ± er ro padrão (n=3).
A análise estatística dos dados pelo teste Two-way ANOVA mostra não
haver diferença significativa entre os grupos avaliados, isto é, a presença da
quitosana não altera a estabilidade dos lipossomas contendo calceína. Desta
forma podemos concluir que os lipossomas podem ser armazenados a 4ºC na
presença de quitosana por até 14 dias, mostrando estabilidade satisfatória nestas
condições.
Lipossomas Mucoadesivos 104
3.2. Avaliação da absorção de calceína por via oral em camundongos a
partir de lipossomas mucoadesivos
A avaliação da absorção da calceína por via oral foi realizada pela leitura da
fluorescência do plasma de camundongos Swiss após administração oral
(gavagem) de diferentes formulações: lipossomas aniônicos contendo calceína
(sem quitosana); lipossomas mucoadesivos contendo calceína (recobertos com
quitosana); tampão acetato 100 mM pH 4,4 (controle); e calceína livre preparada
em tampão acetato 100 mM pH 4,4. A concentração inicial de calceína em todas
as formulações foi igual a 3 mM.
A Figura 28 mostra as farmacocinéticas plasmáticas da calceína,
representadas seja através das intensidades de fluorescência dos plasmas
diluídos (gráfico A) ou dos valores calculados da concentração plasmática de
calceína (gráfico B).
Lipossomas Mucoadesivos 105
0 1 2 30.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Tampão acetato 100mM pH4,4
Calceína livre
Calceína em lipossomas sem quitosana
Calceína em lipossomas mucoadesivos
** *
Tempo (horas)
Fluo
resc
ênci
a (u
.a.)
(A)
0 1 2 30.00
0.05
0.10
0.15
Tampão acetato 100mM pH4,4
Calceína livre
Calceína em lipossomas sem quitosana
Calceína em lipossomas mucoadesivos
* * *
Tempo (horas)
Con
cent
raçã
o de
cal
ceín
a (
µµ µµ M)
(B)
Figura 28: Farmacocinéticas plasmáticas da calceína , em camundongos Swiss, após
administração oral de diferentes formulações: lipos somas mucoadesivos contendo
calceína; lipossomas sem quitosana contendo calceín a; calceína livre; e tampão acetato 100
mM pH 4,4 (controle). O gráfico A mostra os valores de fluorescências dos plasmas dos
animais ( λλλλexc=490nm, λλλλem=515nm, fendas=5nm) e o gráfico B mostra as conce ntrações
plasmáticas de calceína. * P<0,05 para as comparações entre os grupos que receb eram as
formulações de calceína com o grupo controle (tampã o acetato) (Two-way ANOVA seguido
de pós teste de Bonferroni). Os dados são mostrados como as médias ± erro padrão (n=6).
Lipossomas Mucoadesivos 106
A comparação dos valores de fluorescência do plasma dos animais do
grupo controle (animais que receberam tampão acetato 100 mM pH 4,4) com
aqueles dos outros grupos que receberam calceína nas diferentes formulações
(calceína livre ou calceína nos lipossomas com ou sem quitosana), mostra
diferenças significativas, indicando que ocorreu uma absorção de calceína pelo
trato gastrointestinal dos animais com todas as formulações de calceína
administradas.
Entretanto, a comparação entre os grupos que receberam as diferentes
formulações de calceína usando o teste Two-way ANOVA não mostrou diferenças
significativas entre eles. Portanto, os níveis de absorção da calceína por via oral
foram semelhantes em todos os grupos, independentemente dela estar na forma
livre ou encapsulada em lipossomas.
Esses resultados sugerem que o pH ácido do suco gástrico e/ou os sais
biliares promoveram uma desestabilização das formulações de lipossomas,
levando à liberação precoce da calceína, que passou a ter o comportamento da
calceína na forma livre.
Para confirmar essa interpretação, procuramos avaliar a cinética de
liberação da calceína a partir das formulações de lipossomas após a adição em
diferentes meios simulando os fluidos biológicos do trato gastrointestinal.
3.3. Liberação da calceína a partir de formulações de lipossomas em
diferentes meios simulando os fluídos biológicos
Foi avaliada a influência de dois fatores sobre a estabilidade dos
lipossomas: a acidificação do meio externo, que ocorre quando os lipossomas
entram em contato com o suco gástrico; e a presença do tensoativo deoxicolato de
sódio como modelo dos sais biliares que são bem conhecidos pelo seu efeito
desestabilizante sob os lipossomas (Arien e col., 1993; Kokkona e col., 2000;
Freund e col., 2000).
Os seguintes meios foram avaliados: tampão acetato 100 mM pH 4,4;
tampão acetato 100 mM pH 4,4 contendo deoxicolato de sódio 0,01% (p/v);
Lipossomas Mucoadesivos 107
tampão HEPES 50 mM/NaCl 100 mM pH 7,4; tampão HEPES 50 mM/NaCl 100
mM pH 7,4 contendo deoxicolato de sódio 0,01%; e solução de HCl 0,1M.
Neste estudo, avaliamos também se a presença de quitosana nos
lipossomas promovia maior ou menor estabilidade, reduzindo ou aumentando a
taxa de calceína liberada, nos diferentes meios estudados.
A Figura 29 mostra a influência da adição de deoxicolato de sódio na
cinética de liberação de calceína dos lipossomas com e sem quitosana, quando
incubados a 37ºC.
Lipossomas Mucoadesivos 108
Tampão acetato 100 mM pH 4,4
Lipossomas sem quitosana
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
20
40
60
Tempo (horas)
% d
e c
alce
ína
libe
rada
Lipossomas mucoadesivos
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
20
40
60 * * *
Tempo (horas)
% d
e c
alc
eín
a li
bera
da
A
Tampão HEPES 20 mM/NaCl 100 mM pH 7,4
Lipossomas sem quitosana
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
20
40
60
Tempo (horas)
% d
e c
alc
eín
a li
bera
da
Lipossomas mucoadesivos
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
20
40
60
Tempo (horas)
% d
e c
alc
eín
a li
bera
da
B
Figura 29: Efeito do deoxicolato na taxa (%) de cal ceína liberada de lipossomas aniônicos
(sem quitosana) ou de lipossomas mucoadesivos (com quitosana), quando incubados a
37ºC, em meios de diferentes pHs. Os gráficos A e B referem-se às cinéticas de liberação da
calceína no tampão acetato 100 mM pH 4,4 e no tampã o HEPES 20 mM/NaCl 100 mM pH 7,4,
respectivamente. Legenda: (meio sem deoxicolato 0, 01%); (meio contendo deoxicolato
0,01%). A quantidade de calceína liberada foi deter minada por fluorimetria ( λλλλexc=490 nm;
λλλλem=515 nm; fendas=5 nm) após diluição de uma alíquo ta do meio em tampão HEPES 20
mM/NaCl 100 mM pH 7,4. Os dados mostram as médias ± erro padrão (n=3). *P<0,05 para
comparação entre o meio contendo deoxicolato e o me io sem deoxicolato (Two-way ANOVA
seguido de pós teste de Bonferroni).
Lipossomas Mucoadesivos 109
Os resultados mostram que o deoxicolato aumentou a taxa de calceína
liberada, sendo que o efeito desestabilizante foi mais acentuado em pH 4,4 que
em pH 7,4 e na presença de quitosana do que na sua ausência. Um aumento
significativo da taxa de calceína liberada foi observado apenas no meio pH 4,4 na
presença de quitosana.
O fato dos lipossomas com quitosana terem liberação mais acentuada de
calceína em pH ácido poderia ser explicado pelo caráter catiônico da quitosana,
podendo favorecer a interação do deoxicolato com a bicamada lipídica dos
lipossomas, aumentando assim a liberação de calceína para o meio.
Lipossomas Mucoadesivos 110
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
20
40
60
HCl 0,1M
Tampão Hepes 20mM/NaCl 100mM pH 7,4
Tampão acetato 100mM pH4,4
**
Tempo (horas)
% d
e c
alc
eín
a li
bera
da
A
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.50
20
40
60
HCl 0,1M
Tampão Hepes 20mM/NaCl 100mM pH 7,4
Tampão acetato 100mM pH4,4***
*
Tempo (horas)
% d
e c
alc
eín
a li
bera
da
B
Figura 30: Influência do pH do meio na taxa (%) de calceína liberada de lipossomas
mucoadesivos (gráfico B) ou de lipossoma sem quitos ana (gráfico A), incubados a 37ºC. A
quantidade de calceína liberada foi determinada por fluorimetria ( λλλλexc=490 nm; λλλλem=515
nm; fendas=5 nm), após diluição de uma aliquota do meio em solução de tampão HEPES 20
mM/NaCl 100 mM pH 7,4. ***P<0,001 e * P<0,05 para c omparação do meio contendo HCl com
os outros meios nos tempos de 3 horas e 15 minutos, respectivamente (Two-way ANOVA
seguido de pós teste de Bonferroni). Os dados mostr am as médias ± erro padrão (n=3).
A Figura 30 mostra a influência do pH do meio na cinética de liberação de
calceína dos lipossomas com e sem quitosana, quando incubados a 37ºC (na
ausência do deoxicolato de sódio). Quando se compara as taxas de calceína
liberada entre os meios de pH 7,4 e de pH 4,4, não observa-se diferença
Lipossomas Mucoadesivos 111
significativa, tanto na presença quanto na ausência de quitosana. Por outro lado, a
solução de HCl 0,1 M induziu um aumento significativo da taxa de calceína
liberada. As taxas de calceína liberada foram também significativamente maiores
no meio de HCl 0,1 M, comparado aos outros meios de pH 4,4 e 7,4.
Na solução de HCl 0,1 M, provavelmente ocorreu um choque osmótico
juntamente com acidificação do meio, contribuindo para desestabilização dos
lipossomas e maior velocidade de liberação da calceína. A presença da quitosana
não promoveu proteção aos lipossomas, sendo que ambos os lipossomas, com ou
sem quitosana, foram desestabilizados e tiveram elevada liberação de calceína.
Em resumo, este estudo mostra que tanto o meio ácido quanto a presença
de tensoativo da família dos sais biliares provocam a desestabilização de
lipossomas com e sem quitosana. O efeito desestabilizante do deoxicolato de
sódio é aumentado na presença de quitosana e em pH ácido, contribuindo para
maior desestabilização dos lipossomas mucoadesivos.
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Foram preparados e caracterizados lipossomas aniônicos, de membrana na
fase gel, contendo calceína, recobertos ou não por quitosana. Estes foram obtidos
com distribuição de tamanho homogênea, com diâmetro hidrodinâmico médio na
faixa de 200nm e eficiência de encapsulação satisfatória de aproximadamente
18%.
O estudo de estabilidade desses lipossomas mostrou que a presença da
quitosana não altera a estabilidade dos lipossomas contendo calceína, quando
armazenados a 4ºC por até 14 dias. Os lipossomas sem quitosana e os
lipossomas com quitosana apresentaram estabilidade satisfatória nas condições
experimentais utilizadas.
A avaliação in vivo da absorção oral, realizada em camundongos Swiss,
mostrou que ocorreu absorção de calceína pelo trato gastrointestinal de todas as
Lipossomas Mucoadesivos 112
formulações administradas, mas que não houve diferença significativa entre elas.
A calceína encapsulada em lipossomas sem e com quitosana mostrou a mesma
farmacocinética plasmática que a calceína administrada na forma livre, sugerindo
uma instabilidade dos lipossomas no suco gástrico ou nos sais biliares, tanto na
presença quanto na ausência de quitosana.
Esta interpretação foi suportada por ensaios de liberação da calceína in
vitro, a partir desses lipossomas, realizados em diferentes meios, mimetizando o
pH do suco gástrico e a presença dos sais biliares. Os resultados mostraram que
o pH ácido e a adição do tensoativo deoxicolato, como modelo de sal biliar,
aumentam a liberação de calceína dos lipossomas. O efeito do deoxicolato de
sódio foi aumentado na presença de quitosana e em pH ácido, contribuindo para
maior desestabilização dos lipossomas.
Podemos concluir que os lipossomas aniônicos de membrana na fase gel,
recobertos ou não com quitosana, quando administrados por via oral, não
permitem alterar a farmacocinética plasmática de um fármaco hidrofílico de massa
molar intermediária, provavelmente por causa da ação permeabilizante dos meios
ácidos e/ou dos sais biliares. Os nossos resultados contradizem o modelo
proposto por Takeuchi e col., 2005, segundo o qual esses lipossomas poderiam
atuar como carreador mucoadesivo para qualquer tipo de fármaco hidrofílico.
De acordo com os nossos resultados, a eficiência dos lipossomas
mucoadesivos para aumentar a biodisponibilidade da insulina por via oral, como
relatado por Takeuchi e col. (2005), poderia ser explicada pela maior eficiência de
retenção de substância de elevada massa molar (como a insulina) ou pela
formação de um complexo insulina-lipídio-quitosana, após desestabilização dos
lipossomas, que poderia atuar como sistema mucoadesivo de liberação
sustentada de insulina.
Referências Bibliográficas 113
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Anexos 122
ANEXOS
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