lipossomas fármacos

Nereide Stela Santos Magalhães

Recife, 2004

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

LABORATÓRIO DE IMUNOPATOLOGIA KEIZO-ASAMI

EVOLUEVOLUÇÃÇÃO DA NANOTECNOLOGIA FARMACO DA NANOTECNOLOGIA FARMACÊÊUTICAUTICALIPOSSOMAS

NANOPARTÍCULASSÍTIO-ESPECÍFICOS

Lipossomas-PEG-Lectina

NanocápsulasNanoesferas

Dex- PLA

Dex- PCL

Dextrana-PCL-Lectina

Groupo SLC/UFPE

ConvencionalNanocápsulas

Lipossomas19701970

19801980

19901990

20002000

CONVENCIONAL

LIPOSSOMAS, NANOPARTÍCULAS

- Metacrilatos- Alquilcianoacrilatos- BiodegradáveisPolímeros pré-formados

•PLA•PLGA•PCL

NanocápsulasNanoesferas

LIPOSSOMASNANOPARTÍCULAS

STEALTH®

PLA-PEGPLGA-PEGPCL-PEG

NanocápsulasNanoesferasLipossomas

Polimerização in situ

�Nanopartículas?

Descritos inicialmente em 1965

Alec D. Bangham

Vesículas esféricas formadas por bicamadas lipídicas com capacidade de incorporar compostos hidrofílicos e hidrofóbicos.

Lipossomas

LIPOSSOMAS

Estrutura das Membranas Biológicas

Leningher, 2000

Figura 1. Arquitetura supramolecular das membranas

Fosfolipídeos

Agregaçãoem água

Leningher, 2000

Estruturas Lipídicas

Figura 2. Agregados de lipídeos anfipáticos dispersos em água

Leningher, 2000

Movimentos dos Lipídeos na Estrutura das Membranas Biológicas

Estruturas Lipídicas• Monocamadas e micelasEm meio aquoso, os lipídeos formam espontaneamenteestruturas.– Monocamadas (baixas concentrações)– Micelas (altas concentrações)

• CMC = concentração crítica micelar)

– Bicamadas lipídicas– Vesículas

• Lipossomas

www.cm.utexas.edu/.../overheads-2/ ch12_lipid-bilayer.jpg

Lipossomas

Micela Bicamada Lipossoma

Compartimentointerno aquoso

Interações não covalentes nasbicamadas lipídicas

• As bicamadas lipídicas possuem tendênciainerente a serem extensas

• As bicamadas lipídicas podem fecharem-se sobre si mesmas e formar vesículas.

• As bicamadas lipídicas são auto-selantes, pois um “orifício” na bicamada é energeticamente desfavorável.

Interações não covalentes nasbicamadas lipídicas

• Hidrofóbicas

• Forças atrativas de van der Waals– Caudas hidrocarbonadas

• Atrações eletrostáticas

• Pontes de hidrogênio– Cabeças polares – água

Moléculas de água são liberadas das caudashidrocarbonadas dos lipídeos quando essas caudasficam sequestradas no interior apolar da bicamada.

Transição de Fases em Bicamadas

• As transições de fases são sempresendotérmicas; o calor é absorvido enquanto a temperatura aumenta durante a transição.

• Fosfolipídeos apresentam temperaturas de transição de fase específicas Tm: aumenta com o comprimento da cadeia alifática, diminui com a insaturação e depende da natureza do grupo polar da cabeça.

Transição de Fases em Membranas

• T<Tm– Bicamada organizada com cadeias alifáticas

relativamente imobilizadas (conformação extendidamáxima),

– Área superficial / lipídeo é mínima– Espessura da bicamada é máxima

• T>Tm– Fase cristalina líquida (mobilidade das cadeias

alifáticas é intermediária entre os estados sólido e líquido de alcanos).

– Área superficial / lipídeo aumenta.– Espessura da bicamada diminui de 10 a 15%.


• Em bicamadas de fosfolipídeos puros, a transição ocorre em faixa estreita de temperatura. Ex:– Tm dimiristoilfosfatidilcolina = 0,2oC.

• Membranas biológicas apresentam faixa larga de transição de fase e dependem fortemente da composição dos lipídeos e proteínas.


• Para certas bicamadas de lipídeos, uma modificação no estado físico, chamada de pré-transição, ocorre de 5 a 15oC abaixo da Tm. Estas pré-transições envolvem inclinação das cadeias hidrocarbonadas.

• Geralmente a fase de transição está relacionada com uma modificação de volume.

• A transição de fase da bicamada é muito sensível à presença de solutos que interagem com os lipídeos, tais como cátions divalentes, substâncias lipossolúveis, peptídeos e proteínas.

LipossomaLipossomaLipossomaLipossoma

InternalizaçãoInternalizaçãoInternalizaçãoInternalização de de de de lipossomaslipossomaslipossomaslipossomas por por por por célulascélulascélulascélulas

LIPOSSOMAS

• DEFINIÇÃO

São vesículas aquosas, de diâmetro entre 0,1 e 0,5 µm, contituídas de uma ou mais membranas fosfolipídicas de origem natural. O princípio ativo pode estar encapsulado na fase aquosa (hidrofílico) ou ser retido pela membrana (lipofílico).

GLICEROFOSFOLIPÍDEOS• FOSFOLIPÍDEOS

Principais constituintes das membranas biológicas

– Ácido fosfatídico

– Fosfatidilcolina (lecitina)

– Fosfatidiletanolamina

– Fosfatidilglicerol

– Difosfatidilglicerol (cardiolipina)

– Fosfatidilserina

– Fosfatidilinositol

COMPOSIÇÃO DOS LIPOSSOMAS• Lipídeos Características

Fosfatidilcolina de ovo constituinte principal e o mais utilizadoDiestearilfosfatidilcolina menos permeável à fase aquosaDipalmitoilfosfatidilcolina fosfolipídeo sintético totalmente

saturadoFosfatidiletanolamina utilizado em imunolipossomasLisofosfatidilcolina aumenta a permeabilidade lipossomal

pode aumentar a fusão lipossoma-célulaColesterol reduz a permeabilidade dos lipossomas

Incorporação máxima: 50 mol% com relaçãoaos fosfolipídeos totais

Estearilamina confere carga positiva aos lipossomasDicetilfosfato confere carga negativa aos lipossomasÁcido fosfatídico confere carga negativa aos lipossomasEsfinomielina utilizado em imunolipossomasCardiolipídeos lipídeos antigênicos utilizados em

imunolipossomos

VANTAGENS

• São biodegradáveis

• Não possuem antigenicidade

• Protegem as drogas contra a ação enzimática

• Reduz a toxicidade das drogas

• Podem ser direcionados ao local de ação pela

adição de sinais moleculares, anticorpos

monoclonais, hormônios ou glicolipídeos

Classificação�

SUV LUV MLV20-100 nm > 100 nm > 0,5µm0,5 a 1,0 5 a 15 35 a 65

Vesículas multilamelares: MLV (Multilamellar Vesicles)Vesículas pequenas unilamelares: SUV (Small Unilamellar Vesicles)Vesículas grandes unilamelares: LUV (Large Unilamellar Vesicles)

LIPOSSOMAS

www.drugdeliveryparternships.com/html

MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS

• Métodos mecânicos de Dispersão de fosfolipídeos

– Hidratação de filme lipídico

– Homogeneização por ultra-som

– Homogeneização por extrusão

– Microfluidificação

– Dispersão de lipossomas liofilizados

– Dispersão de lipossomas congelados

MÉTODOS DE PREPARAÇÃO DE LIPOSSOMAS

• Métodos mecãnicos de Dispersão de solução

orgânica de fosfolipídeos

– Evaporação em fase reversa

– Injeção em solução etanólica

– Infusão em éter

• Dispersão de micelas mistas

– Eliminação de detergente

Metodologia

Filme lipídico

MLV’s SUV’s

Preparação de Lipossomas

LipidsSolvent

evaporation

Aqueous phase + α-glu-SO4

Ultrasound

Liposomes

LipidsSolvent

evaporation

Aqueous phase + α-glu-SO4

Ultrasound

Liposomes

Metodologia

Fosfatidilcolina de soja - Epikuron 200ColesterolEstearilamina(Acido Úsnico)

Hidratação com Tampão Fosfato pH 7,4Filme lipídico

Sonicação

MLV’s SUV’sLipossomas

BrancoLipossomasÁc.Usnico

CHCl3 : MeOH

Preparação de Lipossomas

www.avantilipids.com/ PreparationOfLiposomes2B

CONSERVAÇÃO DE LIPOSSOMAS

• Métodos de Conservação

–Atmosfera de nitrogênio ou argônio

–Temperatura 4°C

–Abrigo da luz

–Liofilização

CONSERVAÇÃO DE LIPOSSOMAS

• Alterações morfológicas e físico-

químicas

–Oxidação e hidrólise de fosfolipídeos

– Interações do tipo Van der Waals

• Agregação

• Presença de cargas negativas ou positivas

CARACTERIZAÇÃO DE LIPOSSOMAS

• Obtenção de uma preparação homogênea

• Determinação do tamanho das vesículas

• Taxa de encapsulação

• Estabilidade físico-química

• Cinética de liberação in vitro

• Estabilidade em fluidos biológicos

• Interação com células

• Biodisponibilidade


• Estabilidade Físico-química

– Aspecto macroscópico

– Aspecto microscópico

– Diâmetro das partículas

– Viscosidade

– Condutividade

– pH

– Potencial de superfície (zeta)

– Temperatura de conservação

– Doseamento do fármaco



– Aspecto macroscópico

• Observação visual

– Cor

– Cremagem

– Exsudato

– Precipitado

– Separação de fase



– Aspecto microscópico

• Microscopia ótica (LUV, MLV)

• Microscopia Eletrônica

– Varredura (observação tridimensional da vesícula)

– Transmissão (observação de MLV)

– Força atômica (caracterização da superfície)

TITULO

Lipossomas

LipossomasÁcido Usnico

Aspecto microscópico de lipossomas contendo ácido úsnico: Partículas uniformes bem distribuídas com tamanho de aproximadamente 130 nm.

DETERMINAÇÃO DO TAMANHO DE VESÍCULAS

MICROFOTOGRAFIA DE LIPOSSOMAS

TÉCNICA DE CRIOFRATURA


• Determinação do tamanho das vesículas

–Contador de partículas Nanosizer

• Espectroscopia de auto-correlação de fótons

• Espalhamento da luz (light scattering)

• Determinação do potencial de superfície

Potencial zeta ξξξξ (carga)

NANOSIZER (PCS)

NANOSIZER


• Taxa de encapsulação• Doseamento do fármaco

• Porcentagem de encapsulação

• Massa de substância encapsulada por

unidade de massa de lipídeo

Metodologia

Taxa de encapsulação de fármacos em lipossomas

• Determinação indireta

A percentagem de incorporação de fármacos em lipossomas pode ser quantificada por HPLC, após separação do fármaco encapsulado do não encapsulado, através de uma ultrafiltração-centrifugação utilizando unidades filtrantesultrafree® (Millipore).


• Influência de diferentes fatores sobre a

taxa de encapsulação

– Características do fármaco

– Métodos deficientes de separação e marcação

• Substâncias hidrossolúveis

• Substâncias lipossolúveis e anfifílicas

• Caso particular de proteínas

• DNA

ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS


–Acelerada

• Centrifugação

• Ciclos de congelamento-descongelamento (8

h a -18°C e 16 h a 25°C)

• Agitação mecânica (150 evoluções/min)

– Movimento horizontal

ESTABILIDADE DE LIPOSSOMAS


– A longo prazo

Medida de parâmetros físico-químicos em intervalos

de tempo regulares (1, 15, 30, 60, 180, 360, etc dias)

• Tamanho das vesículas

• Doseamento do fármaco

• Viscosidade

• Condutividade

• pH

• Avaliação dos aspectos macroscópico e microscópico

Metodologia

Avaliação da cinética de liberação in vitro

DiretaIndireta

DiáliseDiálise inversa

Meio doadorLipossomas

Meio receptorTampão

LipossomasAvaliação da atividade em células

Teste de citotoxicidadeem células NCIH-292

Teste de citotoxicidadeem células HEp-2

0

20

40

60

80

100

2.5 5 10 20

Concentration µg/ml

% c

ell

via

bili

ty

UA Free Lip Cont Lipos AU

0

20

40

60

80

100

2.5 5 10 20

Concentration µg/ml

% c

ell

via

bili

ty

UA Free Lip Cont Lipos AU

Citotoxicidade de lipossomas contendo ácido úsnico

LIPOSSOMAS COMO MARCADORES

ENDOCITOSE LIPOSSOMAL

VIAS DE ADMINISTRAÇÃO

VIAS de ADMINISTRAÇÃO DE LIPOSSOMAS

• Parenteral (i.v.; i.m.; s.c.;i.c.)

• Cutânea

• Oftálmica

• Nasal

• Pulmonar

NANOTECNOLOGIA FARMACÊUTICA

• Lipossomas (Injetáveis)

– Terapia do Câncer• resistência multi-droga• Cardiotoxicidade

– Doenças Infecciosas

– Terapia Gênica

• Lipossomas (Tópicos)– Farmacêuticos– Cosméticos

APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DE LIPOSSOMAS

• Antibioticoterapia• Insuficiência respiratória neonatal (surfactante pulmonar)

• Enzimas

• Hormônioterapia

• Produtos de contraste

• Produtos radiofarmacêuticos

• DNA

• Vacinas

APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DE LIPOSSOMAS

•Antiparasitários

•Agentes quelantes

•Antitumorais

• Insulina

LIPOSSOMAS ESTERICAMENTE ESTABILIZADOS

PRODUTOS LIPOSSOMAIS

Produto Fármaco Companhia Status

Câncer

DaunoXome® Daunorubicina NeXstar Aprovado Europa, US

Doxil® Doxorubicina Sequus (Alza) Aprovado Europo, US

Evacet® Doxorubicina Liposome Co. Fase III

Annamycin Anamicin Aronex Fase I/II

Cisplatin Cisplatin Aronex Fase II

Atragen® Tretinoina Aronex Fase I/II

Edelfosine Edelfosina Liposome Co. Fase I

Infecções

AmBisome® Amphotericin B NeXstar Aprovado Europa, US

Nyotran® Nistatina Aronex Fase III

MiKasome® Amikacina NeXstar Fase II/III

www.cwru.edu/menu/research/drugdelivery.htm

Targeted

APLICAÇÕES DE LIPOSSOMAS

• Cosmetologia

–Vitaminas hidro e lipossolúveis

– Agentes hidratantes

– Elastina

–Colágeno

– Ácido hialurônico


• Cosmetologia

– Anti-radicais livres

– Antioxidantes

– Agentes rejuvenecedores

(remoção de colesterol)


• Farmácia de Manipulação

– Incorporação de lipossomas pré-fabricados em

• Cremes

• Protetores solares

• Gel

• Gel creme

• Xampu

CONTROLE DE QUALIDADE DE PRODUTOS CONTENDO

LIPOSSOMAS

• Observação macroscópica

– observar a preservação das características iniciais do

produto e detectar sinais de instabilidade

• Observação microscópica

– detectar a presença dos lipossomas na preparação

• Determinação do ativo

lipossomas fármacos

Documents