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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE
ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon martinii E SEU
CONSTITUINTE MAJORITÁRIO GERANIOL: INFLUÊNCIA
NA MORTALIDADE E COMPORTAMENTO DE Apis mellifera
(APIDAE)
ANE CAROLINE CELESTINO SANTOS
2017
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRICULTURA E BIODIVERSIDADE
ANE CAROLINE CELESTINO SANTOS
ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon martinii E SEU CONSTITUINTE
MAJORITÁRIO GERANIOL: INFLUÊNCIA NA MORTALIDADE E
COMPORTAMENTO DE Apis mellifera (APIDAE)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Sergipe, como parte das exigências
do Curso de Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade, área de concentração em
Agricultura e Biodiversidade, para obtenção
do título de “Mestre em Ciências”.
Orientador
Prof. Dr. Leandro Bacci
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
2017
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
S237o
Santos, Ane Caroline Celestino
Óleo essencial de Cymbopogon martinii e seu constituinte majoritário geraniol:
influência na mortalidade e comportamento de Apis mellifera (Apidae) / Ane
Caroline Celestino Santos. – São Cristóvão, 2017.
42 f. : il.
Dissertação (Mestrado em Agricultura e Biodiversidade) – Programa de Pós-
Graduação em Agricultura e Biodiversidade, Universidade Federal de Sergipe,
2017.
Orientador: Prof. Dr. Leandro Bacci
1. 1. Essencias e óleos essenciais. 2. Gramínea. 3. Abelha. 4. Terpenos-
Toxicologia. I. Bacci, Leandro, orient. II. Título.
CDU: 665.52/.54
ANE CAROLINE CELESTINO SANTOS
ÓLEO ESSENCIAL DE Cymbopogon martinii E SEU CONSTITUINTE
MAJORITÁRIO GERANIOL: INFLUÊNCIA NA MORTALIDADE E
COMPORTAMENTO DE Apis mellifera (APIDAE)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Sergipe, como parte das exigências
do Curso de Mestrado em Agricultura e
Biodiversidade, área de concentração em
Agricultura e Biodiversidade, para obtenção
do título de “Mestre em Ciências”.
APROVADA em 24 de fevereiro de 2017.
Dr. Paulo Fellipe Cristaldo
UFS
Dr. Mateus Chediak
UFV
Prof. Dr. Leandro Bacci
UFS
(Orientador)
SÃO CRISTÓVÃO
SERGIPE – BRASIL
A minha família por todo carinho e motivação
Dedico
AGRADECIMENTOS
À Deus, pela força e por me proporcionar muitas coisas boas.
À Universidade Federal de Sergipe (UFS), à Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), à Fundação de Apoio à Pesquisa e Inovação Tecnológica
do Estado de Sergipe (FAPITEC) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq) pelos auxílios financeiros para realização deste trabalho.
Ao Programa de Pós-Graduação em Agricultura e Biodiversidade (PPGAGRI) pela
oportunidade de cursar o mestrado.
À banca examinadora pela disponibilidade e contribuição para esta dissertação.
Ao meu orientador Prof. Dr. Leandro Bacci, pela oportunidade de fazer parte desta
equipe, pela amizade, ensinamentos e dedicação pela ciência. À Prof. Drª. Ana Paula Albano
Araújo e o Prof. Dr. Paulo Fellipe Cristaldo, pela dedicação, entusiasmo e ensinamentos.
Ao Prof. Dr. Jodnes por disponibilizar o Apiário e ao Mestre José Washington pelo
colaboração e ensinamentos nos dias de coleta.
Aos meus pais (Roberto e Ana) e meus irmãos (Gabriel e Ruan). Vocês são a minha
melhor motivação! Mainha, muito obrigada pelas orações e por acreditar em mim mesmo nos
momentos difíceis.
A meu noivo Deiver pelo companheirismo e pelas ajudas nos experimentos. À Família
Silveira pelo carinho de sempre.
Aos meus padrinhos, tios e afilhados pelo carinho e amor. Em especial, à tia Sérgia,
por ter me acolhido durante esses sete anos em Aracaju. Ao meu padrinho Antônio Carlos,
pelos conselhos e ensinamentos e ao meu padrinho Pr. Humberto pelas orações.
A todos os demais familiares, pelas orações, confiança e amizade. Principalmente às
minhas primas Emylle, Priscila e Lucélia, pelos conselhos e momentos de distração.
A todos os colegas do laboratório Clínica Fitossanitária (UFS) pela dedicação e
companheirismo vencido a cada dia. Vocês moram no meu coração! A Alexandre, Alisson,
Ana Paula, Ângela, Emile, Lucas, Ruan, Victor e Wallace pela dedicação e ajuda de sempre.
A Abraão, Bruna, Carlisson e Cecília Beatriz pela amizade, ensinamentos e conselhos.
À minha amiga Indira Morgana pelo entusiasmo, conselhos, ensinamentos e
principalmente pela amizade de todas as horas e em qualquer circunstância.
Aos meus amigos, por todo apoio e entusiasmo, vocês foram essenciais nos meus
momentos de agonia! Obrigada amigos de sempre e para sempre.
BIOGRAFIA
ANE CAROLINE CELESTINO SANTOS, nasceu em 11 de novembro de 1992, na
cidade de Aracaju - Sergipe. Filha do agricultor Carlos Roberto Celestino Santos e Ana do
Nascimento Costa Neta. Desde seu nascimento até o ano de 2009, viveu na cidade de Simão
Dias-SE.
Graduou-se em Engenharia Agronômica pela Universidade Federal de Sergipe – UFS,
no ano de 2014. Durante a graduação foi bolsista de Iniciação Científica e Tecnológica na
área de Entomologia Agrícola, trabalhando em estudos sobre utilização de óleos essenciais
para o manejo de pragas, sobre a orientação do Dr. Leandro Bacci.
Em março de 2014 iniciou no Programa de Pós-graduação em Agricultura e
Biodiversidade - UFS, para obtenção do título de mestre em Ciências.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... i
LISTA DE TABELAS .................................................................................................... ii
RESUMO ........................................................................................................................ iii
ABSTRACT .................................................................................................................... iv
1. INTRODUÇÃO GERAL ............................................................................................ 5
2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 7
2. 1. Polinização: a importância ecológica das abelhas ............................................... 7
2. 2. Apis mellifera: organização social e forrageio ..................................................... 7
2. 3. Desordem do colapso da colônia ......................................................................... 8
2. 4. Neonicotinóides: sítio de ação e efeito sobre polinizadores ................................ 10
2. 5. Óleos essenciais de plantas .................................................................................. 10
2. 6. Gênero Cymbopogon: constituição química, atividade biológica e manejo de
colônias de abelhas .......................................................................................................... 11
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 13
4. ARTIGO: Apis mellifera NO ALVO DOS NEONICOTINÓIDES: UM CAMINHO
SEM VOLTA? BIOINSETICIDAS PODEM SER UMA ALTERNATIVA .................. 20
Resumo ........................................................................................................................ 20
Abstract ........................................................................................................................ 21
4.1. Introdução ............................................................................................................ 22
4.2. Material e Métodos .............................................................................................. 23
4.2.1. Coleta dos indivíduos de A. mellifera .......................................................... 23
4.2.2. Obtenção dos compostos e análise do OE .................................................... 23
4.2.3. Bioensaios .................................................................................................... 24
4.2.3.1. Toxicidade ............................................................................................ 24
4.2.3.2. Comportamento individual e coletivo .................................................. 24
4.2.3.3. Locomoção e orientação de voo ............................................................ 25
4.2.4. Análises estatísticas ...................................................................................... 25
4.3. Resultados ............................................................................................................ 26
4.3.1. Constituição química do OE ......................................................................... 26
4.3.2. Toxicidade por vias de exposição por contato e ingestão ............................. 26
4.3.3. Comportamentos individuais e coletivos ...................................................... 26
4.3.4. Locomoção e orientação de voo .................................................................... 26
4.3.4.1. Distância percorrida .............................................................................. 26
4.3.4.2. Atividade dos indivíduos ....................................................................... 26
4.3.4.3. Orientação dos indivíduos ..................................................................... 27
4.3.4.4. Tempo gasto para chegar à luz .............................................................. 27
4.4. Discussão .............................................................................................................. 27
4.5. Referências Bibliográficas .................................................................................... 29
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 42
i
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Esquema do aparato utilizado para a coleta de indivíduos forrageiros da
abelha Apis mellifera; formado por um funil flexível de tela de nylon (80 cm
de comprimento por 30 cm de diâmetro) e um pote plástico (15 cm de
cumprimento x 10 cm diâmetro) inserido com inclinação na direção da luz
do sol, para captura das abelhas. ..................................................................... 35
2 Representação de gaiola utilizada nos bioensaios de locomoção e orientação
de voo (150 cm x 150 cm x 150 cm) de indivíduos forrageiros de Apis
mellifera. Estrutura formada por armação em alumínio e plástico
transparente. .................................................................................................... 36
3 Cromatografia do OE de Cymbopogon martinii analisado por CG-EM e CG-
DIC.................................................................................................................. 37
4 Posição média alcançada pelos indivíduos forrageiros da abelha Apis
mellifera expostos por contato e ingestão à DL20 do OE de Cymbopogon
martinii, geraniol e inseticida imidacloprid após 1 hora (A, C) e 24 horas (B,
D) da exposição .............................................................................................. 38
5 Tempo (%) que os indivíduos forrageiros da abelha Apis mellifera expostos
por contato e ingestão à DL20 do OE de Cymbopogon martinii, geraniol e
inseticida imidacloprid após 1 hora (A, C) e 24 horas (B, D) da exposição
permaneceram parados ou movimentando. Barras seguidas pela mesma letra,
não diferem, entre si, pelo teste de Tukey a P<0,05. * indica que houve
diferenças significativas entre o tempo que a abelha ficou parada e
movimentando ................................................................................................ 39
6 Proporção de indivíduos da abelha Apis mellifera que se direcionaram até
uma fonte luminosa quando expostas por contato e ingestão à DL20 do OE de
Cymbopogon martinii, geraniol e inseticida imidacloprid após 1 hora (A, C)
e 24 horas (B, D) da exposição que chegaram até a luz (%). Barras seguidas
pela mesma letra, não diferem, entre si, pelo teste de Tukey a P<0,05 .......... 40
7 Tempo (s) médio gasto para que 50% dos indivíduos forrageiros da abelha
Apis mellifera chegassem até a luz, quando tratadas por contato e ingestão
com a DL20 do OE de Cymbopogon martinii, do geraniol e do inseticida
imidacloprid após 1 hora (A, C) e 24 horas (B, D) de exposição. Barras
seguidas pela mesma letra, não diferem, entre si, pelo teste de Tukey a
P<0,05 ............................................................................................................. 41
ii
LISTA DE TABELAS
Tabela Página
1 Toxicidade por contato e ingestão do OE de Cymbopogon martinii, geraniol
e inseticida imidacloprid sobre a abelha forrageira Apis mellifera
(µg/abelha), após 24 horas da exposição ........................................................ 32
2 Comportamento individual e coletivo de abelhas forrageiras Apis mellifera
expostas por contato e ingestão a DL20 do OE de Cymbopogon martinii,
geraniol e inseticida imidacloprid................................................................... 33
3 Média da distância máxima percorrida (±EPM) (cm) pelas abelhas
forrageiras Apis mellifera expostas por contato e ingestão à DL20 do OE de
Cymbopogon martinii, geraniol e inseticida imidacloprid após 1 e 24 horas
da exposição .................................................................................................... 34
iii
RESUMO
SANTOS, Ane Caroline Celestino. Óleo essencial de Cymbopogon martinii e seu
constituinte majoritário geraniol: Influência na mortalidade e comportamento de Apis
mellifera (Apidae). São Cristóvão: UFS, 2017. 42p. (Dissertação – Mestrado em Agricultura
e Biodiversidade).*
As abelhas Apis mellifera apresentam grande importância econômica e ecológica por serem
eficientes polinizadores em ambientes naturais e agrícolas. O recente declínio das colônias de
abelhas em todo o mundo tem sido atribuído a diversas causas, dentre elas o uso de inseticidas
neonicotinóides. Apesar disso, nas últimas décadas o uso desses produtos tem aumentado em
escala global. Na tentativa de se avaliar uma alternativa ao uso dos neonicotinóides, neste
trabalho analisamos os efeitos do óleo essencial de Cymbopogon martinii e do seu composto
majoritário geraniol sobre as abelhas Apis mellifera. Para isso, as abelhas foram expostas, via
contato e ingestão, ao óleo essencial de C. martinii, ao geraniol e ao inseticida comercial
imidacloprid, a fim de avaliar os efeitos de toxicidade, alterações comportamentais e
locomoção das abelhas tratadas com estes compostos. Os testes foram conduzidos em
laboratório utilizando indivíduos de A. mellifera. Nossos resultados mostram que a maior
toxicidade ocorre pela via de ingestão e que o imidacloprid causa maior mortalidade às
abelhas do que os demais tratamentos. Embora não tenha sido observada alteração
comportamental (individual e coletiva) entre os indivíduos das colônias, houve uma significa
redução da capacidade de locomoção das abelhas tratadas com imidacloprid. Por outro lado,
os bioinseticidas testados não causaram mudanças na locomoção das abelhas. Assim, nossos
resultados corroboram os efeitos indesejados do imidacloprid já relatados na literatura, e,
sobretudo, ressalta a ausência de efeitos subletais do óleo essencial de C. martinii e do
geraniol e seu potencial como possível alternativa ao manejo de pragas.
Palavras-chave: Apidae, palmarosa, terpenos, polinização, efeitos subletais.
___________________
* Comitê Orientador: Leandro Bacci – UFS (Orientador), Paulo Fellipe Cristaldo (Co-orientador) – UFS.
iv
ABSTRACT
SANTOS, Ane Caroline Celestino. Essential oil of Cymbopogon martinii and its major
constituent geraniol: Influence on mortality and behavior of Apis mellifera (Apidae). São
Cristóvão: UFS, 2017. 42p. (Thesis - Master of Science in Agriculture and Biodiversity).*
The bees Apis mellifera are one of great economic and ecological importance because they are
efficient pollinators in natural and agricultural environments. The recent decline of bee
colonies around the world has been attributed to several causes, including the use of
neonicotinoid insecticides. Despite this, the use of these products has increased in recent
decades on a global scale. In an attempt to evaluate an alternative to the use of neonicotinoids,
in this work we analyzed the effects of the essential oil of Cymbopogon martinii and its major
compound on Apis mellifera bees. For this, the bees were exposed, by contact and ingestion,
to C. martinii essential oil, geraniol and commercial insecticide imidacloprid, in order to
evaluate the toxicity, behavioral and locomotion effects of bees treated with these compounds.
The tests were conducted in the laboratory using individuals from A. mellifera. Our results
showed that the highest toxicity occurs through the ingestion route and the imidacloprid
causes higher mortality to the bees than the other treatments. Although there was no
behavioral change (individual and collective) among individuals of the colonies, there was a
significant reduction in the locomotion capacity of bees treated with imidacloprid. On the
other hand, the bioinsecticides tested did not cause changes in the locomotion of the bees.
Thus, our results corroborate the undesirable effects of imidacloprid already reported in the
literature, and, above all, it points out the absence of sublethal effects of the essential oil of C.
martinii and geraniol and its possible potential alternative to pest management.
Key-words: Apidae, palmarosa, terpenes, polinization, sublethal effect
___________________
* Supervising Committee: Leandro Bacci – UFS (Advisor), Paulo Fellipe Cristaldo (Co-advisor) – UFS.
5
1. INTRODUÇÃO GERAL
A produção global de alimentos depende essencialmente dos serviços prestados pelos
polinizadores. Os insetos são responsáveis pela polinização de 75% das espécies existentes,
colaborando com 35% da produção mundial de plantas cultivadas (Klein et al., 2007), serviço
ecológico que corresponde a um valor estimado de 153 bilhões de euros por ano (Gallai et al.,
2009). Colônias da abelha Apis mellifera são frequentemente manejadas para polinização de
culturas. Esta prática frequente é decorrente de diversas características que tornam estes
insetos excelentes polinizadores, como: colônias que abrigam grande número de indivíduos,
hábito generalista, alta eficiência na seleção de fontes alimentares e, capacidade de forrageio a
longas distâncias (Beekman e Ratnieks, 2000; Harrison e Fewell, 2002). Porém, a despeito de
sua grande importância econômica e ecológica, nos últimos anos, as colônias de abelhas têm
apresentado um declínio alarmante - fenômeno conhecido como Desordem do Colapso das
Colônias (DCC). Esta preocupante perda das populações de abelhas tem chamado a atenção
de pesquisadores e produtores em todo o mundo e disparado um alerta para a descoberta dos
mecanismos que geram desta desordem, assim como para a mitigação de seus fatores causais.
O DCC tem sido atribuído a diversos fatores, dentre os quais está a utilização de
pesticidas neonicotinóides (Farooqui, 2013; VanEngelsdorp et al., 2009). Apesar de serem
muito eficientes no controle de pragas, especialmente insetos sugadores, os neonicotinóides
acarretam efeitos subletais indesejáveis em organismos não-alvo, como é o caso das abelhas.
As abelhas contaminadas com resíduos de neonicotinóides apresentam reduzida capacidade
de orientação, redução da memória e da capacidade de aprendizagem, com consequente
redução da eficiência de forrageio e de seus retornos para as colônias (Williamson e Wright,
2013; Zhang e Nieh, 2015). Adicionalmente, outros estudos apontam que os neonicotinóides
podem ainda reduzir a resposta imune das abelhas aumentando sua susceptibilidade a
patógenos com consequente aumento das taxas de mortalidade (Brandt et al., 2016). Apesar
disso, o uso de neonicotinóides apresentou um crescente aumento, em escala global, nos
últimos anos (Jeschke et al., 2011; Morrissey et al., 2015). Desta forma, estudos que visam
meios alternativos que propiciem um menor impacto negativo sobre os organismos não-alvo,
podem contribuir de forma significativa para a manutenção dos serviços ecossistêmicos.
Os produtos do metabólito secundário de plantas (Bakkali et al., 2008), como por
exemplo os óleos essenciais, vêm sendo amplamente estudados com o intuito de selecionar
moléculas naturais bioativas sobre insetos-praga (Huang et al., 2014; Lima et al., 2013;
Peixoto et al., 2015), e que sejam seletivas para insetos não-alvo (Damiani et al., 2009;
Turchen et al., 2016). Os óleos essenciais de plantas consistem em uma mistura de diversos
compostos, principalmente monoterpenos, que se apresentam em diferentes concentrações e
podem, individualmente ou em sinergismo, promover diferentes respostas nos organismos. Os
óleos essenciais do gênero Cymbopogon têm demonstrado eficiência no controle de insetos-
praga (Costa et al., 2013; Deletre et al., 2015; Tavares, Salles e Obrzut, 2010), além de
possuir compostos que são responsáveis pela atração de abelhas para as flores (Abramson et
al., 2006). Por já serem produzidos em escala para uso no setor industrial (ex. cosméticos,
alimentos e fármacos) estes produtos poderiam ser facilmente obtidos para fins de controle de
pragas.
Dentre as plantas do gênero Cymbopogon, C. martinii, conhecida como palmarosa é
originária da Índia e estudos vêm demonstrando ação tóxica sobre fungos, bactérias e insetos
(Lima et al., 2013; Lodhia, Bhatt e Thaker, 2009; Mishra, Kedia e Dubey, 2015). No entanto,
até o momento, nenhum estudo avaliou os efeitos letais e subletais deste óleo essencial sobre
insetos benéficos, inclusive abelhas.
Assim, nesta dissertação objetivou-se analisar os efeitos do óleo essencial de C.
martinii, seu constituinte geraniol e do inseticida imidacloprid sobre abelhas A. mellifera,
visando: (i) identificar e quantificar os compostos presentes no óleo essencial de C. martinii;
(ii) avaliar a toxicidade destes compostos expostos por contato e ingestão as abelhas; (iii)
6
observar as respostas comportamentais (interações individuais e coletivas) e a capacidade
locomotora de abelhas forrageiras tratadas com estes compostos.
7
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Polinização: a importância ecológica das abelhas
Ao longo do processo evolutivo, plantas e animais desenvolveram uma série de
relações que em alguns casos resultaram no sucesso de ambas as partes. Dentre estas
interações, a polinização garantiu o sucesso das plantas, na sua fecundação, produção dos
frutos e consequentemente perpetuação (Klatt et al., 2013; Klein et al., 2007).
Entre os polinizadores, as abelhas são destaque pelo importante papel na manutenção
dos ecossistemas naturais e agricultáveis. Em ambientes naturais a presença destes
polinizadores propicia a conservação da fauna e da flora, pois seus serviços prestados
beneficiam direta ou indiretamente toda a cadeia trófica. Em ambientes agrícolas, essas
abelhas garantem a produção e qualidade de frutos para o agronegócio (Klatt et al., 2013),
além de garantir renda na produção apícola de mel, geléia real e própolis.
O processo de polinização por abelhas pode ocorrer de forma natural ou introduzida
(ex.: utilização de colméias para a polinização de culturas agrícolas). Entretanto, este processo
depende do ambiente a ser explorado e da especialidade das abelhas, como distância e
qualidade dos recursos explorados, pistas na paisagem para recrutamento e reconhecimento da
fonte de alimento (Kennedy et al., 2013), além de características do indivíduo como tamanho
do corpo (Greenleaf et al., 2007), densidade da colônia, comprimento do aparelho bucal
(Knight et al., 2005) entre outros que garantem a polinização.
As abelhas de mel, Apis mellifera, se destacam por ser o principal polinizador de
plantas cultivadas representando aproximadamente 75% das espécies cultivadas
mundialmente (Klein et al., 2007). A utilização e o sucesso de colônias de Apis mellifera no
manejo de culturas agrícolas são frequentemente decorrente da diversidade de características
que tornam estes insetos excelentes polinizadores, como: abundância da espécie, hábito
generalista, alta eficiência em encontrar fontes alimentares e capacidade de forrageio a longas
distâncias (Beekman e Ratnieks, 2000; Harrison e Fewell, 2002).
Apesar das facilidades de manejo de colônias de A. mellifera, a densidade
populacional desses polinizadores vem sendo reduzida, comprometendo os serviços de
polinização das plantas (Ricketts et al., 2008) e consequente redução da produção agrícola
(Novais et al., 2016). Fatores, como por exemplo a intensa influência antrópica no ambiente,
vêm causando alterações no uso da terra e gerando grandes impactos na fauna e na flora,
como por exemplo, o desmatamento de florestas e ampliação de áreas cultivadas (Tscharntke
et al., 2005). A redução de recursos florais e fragmentação de habitats também têm
contribuído para as alterações na estrutura da paisagem e consequente redução e
disponibilidade de polinizadores (Kremen et al., 2007; Vanbergen, 2013). Sendo esses fatores
responsáveis diretamente por problemas nos serviços ecossistêmicos e agricultáveis,
diminuindo a diversidade de espécies e a produção de alimento.
2.2 Apis mellifera: organização social e forrageio
As colônias das abelhas Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae) são estruturadas em
castas, onde cada indivíduo exerce uma função específica dentro da colônia (Winston, 1987).
Este grupo tem como sistema de determinação sexual a haplodiploidia, onde os indivíduos
machos são originários de óvulos não fecundados (haploidia) e as fêmeas de óvulos
fecundados (diploidia) (Carrière, 2003). A rainha e o zangão têm a função reprodutiva,
enquanto que as operárias exercem todas as tarefas não reprodutivas da colônia: limpeza,
alimentação da cria e da rainha, construção do ninho, manutenção da homeostase interna do
ninho, defesa e forrageamento. Estas atividades são realizadas de acordo com polietismo
etário, no qual os indivíduos mais jovens realizam as atividades dentro da colônia e os mais
velhos exercem as atividades fora da colônia onde demanda maior gasto de energia e também
uma maior probabilidade de contaminação por patógenos (Amdam e Page Júnior, 2005; Betti,
Wahl e Zamir, 2016; Winston, 1987). Dentre as atividades realizadas pelas operárias, a
8
limpeza tem como objetivo a higienização da colônia e pode ser realizada pelo próprio
indivíduo (allogromming) ou entre estes (grooming) (Lin et al., 2016; Wilson-Rich et al.,
2009). A alimentação ocorre através da transferência de alimento via oral entre um indivíduo
e outro, chamada de trofolaxia, sendo a base da alimentação proteínas, lipídios e carboidratos
que garantem o bom funcionamento dos indivíduos, bem como energia para a realização das
atividades (Crailsheim, 1998; Winston, 1987). As abelhas operárias, que acumulam néctar,
são as responsáveis pela construção dos favos, através da excreção de cera pelas glândulas
ceríferas (Pirk et al., 2004; Winston, 1987). A manutenção da homeostase do ninho ocorre em
grande parte por meio do comportamento de ventilação (batimento das asas). Esse
comportamento também é executada pelas operárias e tem como função regular as alterações
comportamentais e fisiológicas ocasionadas pelo desbalanço na temperatura (Winston, 1987)
e concentração de dióxido de carbono dentro da colônia (Kastberger et al., 2016; Sudarsan et
al., 2012). Dentre as últimas atividades desempenhadas pelas operárias está a defesa da
colônia contra influências externas (ou seja, invasores e parasitas) (Winston, 1987) e o
forrageamento.
O forrageamento ocorre aproximadamente a partir do 23º dia de vida das abelhas
(Winston, 1987). As abelhas forrageiras têm a função de explorar e coletar de forma eficiente
os recursos alimentares, bem como garantir o alimento para a colônia. Esta atividade demanda
grande consumo de energia e é influenciada pela qualidade e quantidade dos recursos
alimentares a serem coletados, além do excesso de carga transportado a cada viagem do
campo (Rands e Whitney, 2008). A orientação de voo desses indivíduos ocorre por meio da
fototaxia, onde as abelhas utilizam a luz para sua orientação no ambiente (Menzel e Greggers,
1985). Além disso, são utilizadas pistas na paisagem para realizar as atividades de
recrutamento e comunicação entre abelhas forrageiras com o intuito central de encontrar
alimento. A informação da localização (distância e direção), qualidade e quantidade do
recurso é repassada dentro da colônia pela forrageira que localizou a fonte de recurso
alimentar. Este comportamento é chamado de “dança das abelhas” (“waggle dance”). A
capacidade de voo das abelhas forrageiras propicia o sucesso na captura de recurso, bem
como uma excelente estratégia de sobrevivência no ambiente contra predadores e patógenos
(Dosselli et al., 2016).
As interações entre indivíduos também ocorrem por meio de substâncias químicas,
denominadas de feromônios e que são produzidas e liberadas por estruturas especializadas
presentes nas abelhas. Essas substâncias químicas podem atuar no acasalamento (Niño et al.,
2013), reconhecimento da colônia, integração das atividades (Rangel et al., 2016), alarme (Li
et al., 2014), defesa (Breed, Guzmàn-Novoa e Hunt, 2004; Kastberger et al., 1998) e
orientação (Free, Ferguson e Pickett, 1981).
O feromônio de orientação mais conhecido é produzido pela glândula de Nasonov,
formada por sete substâncias voláteis, sendo o geraniol o componente mais abundante (Free,
Ferguson e Pickett, 1981). A glândula de Nasonov está localizada no sétimo tergito
abdominal (Mota e Landim, 1988). A liberação deste feromônio foi observada em rainhas e
operárias, no entanto, as operárias mais velhas são as que possuem uma maior quantidade
dessas substâncias (Mota e Landim, 1988; Winston, 1987). A exposição da glândula ocorre
com a elevação do abdômen e a flexão do último segmento abdominal, acompanhada da
movimentação das asas para dispersão dos voláteis. Esse conjunto de voláteis está diretamente
associado na orientação das forrageiras para o retorno a colônia, na orientação durante a
enxameação e na marcação da fonte de recurso alimentar fora da colônia (Granero et al.,
2005; Mota e Landim, 1988; Schmidt, 1994; Winston, 1987).
2.3 Desordem do colapso da colônia
Nos últimos anos, em todo o mundo, tem sido relatada uma redução significativa nas
colônias de abelhas. Tal redução, conhecido como Desordem do Colapso da Colônia (DCC), é
caracterizado pelo rápido declínio de abelhas forrageiras, que não retornam para a colônia e
9
consequentemente, a colônia sem alimento entra em colapso resultando na morte da mesma
(VanEngelsdorp et al., 2009). As causas relacionadas ao DCC ainda não foram totalmente
elucidadas, no entanto, elas estão relacionadas pela ocorrência de um ou mais fatores que, em
conjunto ou isoladamente, resultam nesta redução.
Os diferentes fatores responsáveis pelo DCC, inclui: a redução da flora e consequente
diminuição de recursos alimentares (Vanbergen, 2013), efeitos climáticos (Dormann et al.,
2008), presença de parasitas (Bernardi e Venturino, 2016; Kang et al., 2016; Santos, Coelho e
Bliman, 2016), patógenos (Bernardi e Venturino, 2016; Chen et al., 2014; Kang et al., 2016;
Organtini et al., 2017; Pettis et al., 2012) e principalmente o uso de pesticidas sintéticos (Gill,
Ramos-Rodriguez e Raine, 2012; Guez, 2013; Pettis et al., 2012).
A presença de parasitas, como o ácaro ectoparasita Varroa destructor, é apontada
como uma das grandes ameaças a apicultura em todo mundo. Este ácaro, ao succionar a
hemolinfa de A. mellifera pode levar à morte destas abelhas, além de transmitir diversos
patógenos como fungos e vírus. As doenças virais mais comuns são a paralisia aguda (ABPV)
e o vírus de asas deformadas (DWV) (Bernardi e Venturino, 2016; Kang et al., 2016;
Organtini et al., 2017). As perdas pela presença apenas do ácaro não são de grandes
dimensões, entretanto, quando aliada a perca por infecções de patógenos toma grandes
proporções (Chen et al., 2014). Outro parasita, Apocephalus borealis, é responsável por ser
vetor de fungos e vírus. O comportamento dos indivíduos contaminados por este parasita é
muito parecido com o colapso das colônias, onde as abelhas abandonam a colônia, reduzindo
consequentemente o número de indivíduos (Core et al., 2012).
Outra forma de contaminação de abelhas ocorre através de fungos, como por exemplo,
o Nosema apis e N. cerana. Esses fungos ficam alojados no intestino de abelhas adultas,
ocasionando posteriormente, a morte desses indivíduos (Higes et al., 2007). Pettis et al.
(2012) constataram que a exposição de colônias ao inseticida imidacloprid resultou em um
aumento de infecção do fungo Nosema spp., indicando assim que a presença desses dois
fatores pode ocasionar o DCC. Outro fungo que pode estar relacionado ao DCC é o
Ascosphaera apis, que infecciona larvas de abelhas diminuindo sua alimentação e assim induz
à deterioração gradual da colônia (Aronstein, Murray e Saldivar, 2010).
Apesar dos fatores mencionados anteriormente, a utilização de pesticidas sintéticos
tem sido considerada o principal fator responsável pelo DCC. Estudos têm demonstrado que a
diversidade de pesticidas influencia no comportamento de abelhas [ex.: locomoção (Cresswell
et al., 2014), aprendizagem (Abramson et al., 2004) e orientação (Gill e Raine, 2014)],
resultando na morte de populações.
A forma de contaminação de abelhas por inseticidas pode ocorrer via contato, através
de resíduos de inseticidas advindos da pulverização das plantas ou no momento da
pulverização. Essa contaminação também pode ocorrer via ingestão, através da alimentação
de néctar e pólen contaminados (Schneider et al., 2012). A penetração do inseticida por
contato pode ocorrer de duas formas: pela cutícula e/ou pelos espiráculos. Após penetrar as
camadas do tegumento do inseto, o inseticida atinge a hemolinfa e se espalha para todos os
sistemas, até alcançar o sítio de ação. Outra forma de penetração, via contato, ocorre através
dos espiráculos. O inseticida, na forma gasosa, percorre o sistema respiratório do inseto
(formado pelos tubos traqueais e ramificações menores chamadas de traqueíolos) onde
posteriormente alcançam os demais tecidos do inseto até chegar ao sítio de ação.
O processo de intoxicação do inseticida por ingestão tem início na cavidade oral das
abelhas, chamada de probóscide, onde ocorre a sucção de néctar contaminado. Esse alimento
contaminado percorre o sistema digestivo até atingir o ventrículo, onde ocorre a digestão. No
mesêntero, o alimento será degradado pelas enzimas digestivas e posteriormente é excretado
pelo ânus, enquanto que o inseticida será translocado através da hemolinfa até o sítio de ação.
Na maioria dos casos os inseticidas agem no sistema nervoso dos insetos impedindo o
funcionamento normal dos eventos axônicos e sinápticos. A resposta desses eventos ocorre
por meio de estímulos que serão expressos pelo sistema muscular através de reações como:
10
hiperexcitação, knock-down, morte, entre outros efeitos (Desneux, Decourtye e Delpuech,
2007; Suchail, Guez e Belzunces, 2001). Dentre os pesticidas utilizados em campo, os
inseticidas do grupo dos neonicotinóides são considerados o principal responsável pelo DCC
(Cresswell, Desneux e vanEngelsdorp, 2012; VanEngelsdorp et al., 2009).
2.4 Neonicotinóides: sítio de ação e efeitos sobre polinizadores
Os neonicotinóides são compostos sintéticos derivados da nicotina presente em plantas
de tabaco Nicotiana tabacum. Essa classe de inseticida é representada pelo acetamiprid,
clothianidin, dinotefuran, imidacloprid, thiacloprid e thiametoxan. Sua utilização em culturas
agrícolas ocorre principalmente para o controle de insetos sugadores (Liang et al., 2012; Qu et
al., 2015), através da pulverização e/ou no tratamento de sementes (Blacquière et al., 2012).
Os neonicotinóides apresentam como características, a ação sistêmica e translaminar,
sendo absorvido pela planta e transportado para as demais partes via xilema (Elbert et al.,
2008; Halm et al., 2006). Eles são de alta persistência no ambiente com amplo espectro de
ação, ocasionando tanto a morte de insetos-pragas como de organismos não alvo (Kasiotis et
al., 2014; Liang et al., 2012; Qu et al., 2015).
Os neonicotinóides possuem modo de ação neurotóxico, atuando sobre canais
sinápticos do sistema nervoso central dos insetos atuando como agonistas de receptores
nicotínicos da acetilcolina (nAChRs) (Matsuda et al., 2001). Esse inseticida imita a ação do
neurotransmissor acetilcolina e impede a degradação pela enzima acetilcolinesterase. Assim, a
enzima permanece ativada e ocasiona a contínua transmissão dos impulsos nervosos. Os
sintomas resultantes dessa intoxicação acarretam problemas nas funções motora, sensorial e
cognitiva, resultando em tremores, hiperatividade, desorientação e consequente morte do
inseto (Suchail, Guez e Belzunces, 2001).
Dentre os insetos não alvo que merece destaque, estão as abelhas. Segundo os estudos
feitos por Christen, Mittner e Fent, (2016), os neonicotinóides além de ocasionar o colapso do
sistema nervoso das abelhas, também alteram os genes relacionados a defesa do sistema
imunológico, sendo o possível motivo da interação deste inseticida com outros fatores, por
exemplo parasitas e patógenos, serem os responsáveis pelo DCC (Pettis et al., 2012; Sánchez-
Bayo et al., 2016). Outros estudos nesta área também comprovam que os inseticidas
neonicotinóides prejudicam a aprendizagem olfativa e a memória de abelhas (Hassani et al.,
2008; Williamson e Wright, 2013; Zhang e Nieh, 2015), alteração da atividade locomotora
(Tomé et al., 2015; Williamson, Willis e Wright, 2014) e influenciam na reprodução dentro
da colônia (Laycock et al., 2012).
2.5 Óleos essenciais de plantas
A utilização de inseticidas sintéticos tem causado sérios problemas econômicos e
ecológicos em todo o mundo. A contaminação do solo, sua persistência no ambiente, e
principalmente toxicidade a organismos não alvo (ex.: abelhas), tem gerado a busca por novos
produtos que não apresentem tais características. Uma possível alternativa a isto são os
inseticidas botânicos como, por exemplo, produtos advindo das plantas.
Os óleos essenciais (OEs) são originários dos metabólitos secundários, responsáveis
principalmente pela defesa nas plantas, estando presente em estruturas vegetais como: folha,
caule, raiz, flor, fruto e semente. A constituição química dos OEs apresenta variações
qualitativas e quantitativas que são influenciadas por fatores como: genética da planta, época
de colheita, método de extração e entre outros (Asbahani et al., 2015; Smitha e Rana, 2015;
Tongnuanchan e Benjakul, 2014).
Os OEs são formados por uma mistura de substâncias envolvendo álcoois, compostos
nitrogenados, oxigenados e principalmente terpenos (Isman, 2006). Os terpenos são moléculas
que apresentam como base a presença de unidades de isoprenos (C5H8), podendo ser
classificados em monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos e triterpenos. Os monoterpenos e
os sesquiterpenos são as moléculas mais encontradas na composição química dos OEs
11
(Bakkali et al., 2008), apresentando características como alta volatilidade e bioatividade
contra fungos (Kordali et al., 2005), bactérias (Sitarek et al., 2017) e principalmente no
controle de pragas (Albuquerque et al., 2013; Benites et al., 2014; Lima et al., 2013; Peixoto
et al., 2015).
No que se refere ao controle alternativo de pragas, estudos têm sido intensificado nos
últimos anos avaliando a bioatividade dos OEs e seus constituintes. A alta volatilidade e baixa
toxicidade a organismos não alvos são as principais características que classificam os OEs
como substâncias seguras para o controle de pragas. No entanto, tais substâncias podem
apresentar efeitos indesejados a organismos não alvos, como por exemplo as abelhas. De
acordo com (Barbosa et al., 2014, 2015), os biopesticidas apresentaram efeitos subletais no
desenvolvimento de Melipona quadrifasciata e Bombus terrestris, bem como toxicidade e
alterações comportamentais sobre A. mellifera (Xavier et al., 2015). Apesar disto, estudos
também comprovam que alguns OEs podem ser promissores para o controle de pragas e
seletivos ou repelentes para abelhas. De fato, o óleo essencial de andiroba Carapa guianensis
não ocasiona a morte de adultos de A. mellifera (Xavier et al., 2015).
Desta forma, estudos que avaliem os efeitos dos OEs e seus constituintes sobre os
organismos não alvos (ex.: abelhas) podem ser essenciais para futura recomendação de
utilização destes compostos no controle de pragas agrícolas sem que provoque efeitos em
organismos não alvo.
2.6 Gênero Cymbopogon: constituição química, atividade biológica e manejo de colônias
de abelhas
O gênero Cymbopogon (Poaceae) possui mais de 100 espécies de plantas descritas nos
países tropicais e dentre estas, 56 são espécies aromáticas (Lorenzi e Matos, 2002). Essas
espécies aromáticas são amplamente utilizadas na indústria para fabricação de cosméticos,
fármacos e perfumaria, sendo a matéria-prima base os OEs e seus compostos mais frequentes,
como por exemplo citronelal, citronelol, geraniol, geranial, neral, citral, linalol, limoneno e
farnesol (Barbosa et al., 2008; Meza e Taborda, 2010; Nath et al., 2002; Pinto et al., 2015;
Smitha e Rana, 2015; Wany et al., 2014).
A escolha do Cymbopogon para esta pesquisa foi devido aos efeitos tóxicos e subletais
dos OEs deste gênero sobre insetos-pragas. O OE de C. nardus, por exemplo, apresentou ação
ovicida em Bemisia tabaci e toxicidade à broca do café Hypothenemus hampei (Mendesil,
Tadesse e Negash, 2012; Tavares, Salles e Obrzut, 2010). Já o OE de C. winterianus
influenciou negativamente a reprodução de Spodoptera frugiperda (Silva et al., 2016). Os
OEs de C. winterianus e C. citratus, foram repelentes a adultos de B. tabaci (Deletre et al.,
2015), e esta última apresentou baixas doses letais para Frankliniella schultzei e Myzus
persicae (Costa et al., 2013). Além do OE, extratos de espécies de Cymbopogon também
apresentam ação inseticida, como por exemplo de C. schoenanthus, que foi tóxico para o
percevejo do mamão Clavigralla tomentosicollis (Ba et al., 2009).
A amplitude de ação inseticida que vêm sendo demonstrada pelos OEs do gênero
Cymbopogon tem bastante potencial para o controle de pragas. No entanto, estudos sobre os
seus efeitos em organismos não alvos também deve ser verificado a fim de elucidar o seu
impacto em tais organismos. Neste sentido, já foi constatado que OE de C. nardus foi menos
tóxico a Apis cerana indica em relação aos OEs de espécies do gênero Apiaceae,
Amaranthaceae, Myrtaceae e Verbenaceae de planta (Kumar, Patyal e Mishra, 1986). Estudos
já demonstram efeito atrativo do OE de Cymbopogon a abelhas, Abramson et al. (2006)
observaram que flores pulverizadas com OE de C. winterianus foram atrativas a A. mellifera.
Similarmente, Leopoldino et al. (2002) observaram que a utilização de C. citratus em caixas-
isca atraem abelhas e auxilia no comportamento de enxameagem. Além desses efeitos, já foi
constatado que a aplicação do OE de C. nardus dentro das colônias de A. mellifera aumenta a
produção de cera e não ocasiona toxicidade aos indivíduos desta abelha (Lomele, Ito e Orsi,
2016).
12
A possível explicação para o efeito desses OEs sobre as abelhas, pode estar
diretamente relacionada com a presença de compostos como o geraniol e citral. Tais
compostos já são utilizados em algumas culturas visando o aumento da visitação de abelhas
forrageiras com consequente benefícios para plantas (Malerbo-Souza, Nogueira-Couto e
Couto, 2004; Waller, 1970)
Cymbopogon martinii é uma planta conhecida popularmente como palmarosa.
Apresenta um crescimento herbáceo e ciclo perene. Neste estudo, este OE foi escolhido pela
similaridade química com outros OEs deste mesmo gênero, além de sua acessível compra no
mercado industrial de essências botânicas. Os constituintes encontrados em menor proporção
no OE de C. martinii foram linalol, acetato de geranila, β-cariofileno e em maior o composto
geraniol com proporções entre 80 e 90% (Lima et al., 2013; Rao, 2001; Smitha e Rana, 2015).
O OE de C. martinii apresenta atividade antimicrobiana, antibacteriana e inseticida
(Hammer, Carson e Riley, 1999; Lima et al., 2013; Lodhia, Bhatt e Thaker, 2009). Na
literatura, já é possível encontrar uma possível relação entre essa espécie vegetal e abelhas,
através da polinização de flores por A. mellifera (Gaur et al., 2014). Também foi constatada a
utilização deste OE para o controle de Paenibacillus larvae, bactéria causadora do Loque
Americano, responsável por grandes impactos negativos em colônias de abelhas (Fuselli et
al., 2010). Desta forma, estudos que avaliem os efeitos letais e subletais do OE desta espécie e
seu constituinte majoritário geraniol sobre A. mellifera poderá contribuir para um controle
seguro de pragas agrícolas, resultando também em um possível efeito benéfico a esta abelha.
13
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20
4. ARTIGO
Apis mellifera NO ALVO DOS NEONICOTINÓIDES: UM CAMINHO SEM VOLTA?
BIOINSETICIDAS PODEM SER UMA ALTERNATIVA
Periódico a ser submetido: Functional Ecology
RESUMO
O recente declínio mundial das populações de abelhas tem sido alvo de intensa investigação
devido aos enormes prejuízos ecológicos e econômicos resultantes da perda dos serviços de
polinização. Dentre os possíveis fatores causais desse colapso, está o uso de inseticidas do
grupo dos neonicotinóides. Apesar disso, a utilização destes produtos tem aumentado nas
últimas décadas, em escala global. Na tentativa de se avaliar uma alternativa ao uso dos
neonicotinóides, neste trabalho analisamos os efeitos de um bioinseticida e do seu composto
majoritário sobre as abelhas Apis mellifera (Hymenoptera: Apidae), um dos principais agentes
polinizadores de plantas cultivadas. Para isso, as abelhas foram expostas, via contato e
ingestão, ao óleo essencial de Cymbopogon martinii (Poaceae: Poales), ao geraniol e ao
inseticida imidacloprid, a fim de avaliar os efeitos de toxicidade, alterações comportamentais
e locomoção das abelhas tratadas com estes compostos. Os testes foram conduzidos em
laboratório utilizando indivíduos provenientes de quatro colônias de A. mellifera. De forma
geral, houve maior toxicidade via ingestão do que por contato. O inseticida imidacloprid foi
mais tóxico a A. mellifera quando comparado ao óleo essencial e seu composto majoritário.
Nenhum dos tratamentos alterou o comportamento individual e o padrão de interação
comportamental entre os indivíduos das colônias. Por outro lado, imidacloprid, administrado
por via oral, alterou significativamente os comportamentos de locomoção e orientação de vôo
das abelhas. O mesmo não ocorreu para o óleo essencial e o geraniol. Nossos resultados
auxiliam na compreensão dos mecanismos que causam alterações de desordem nas colônias
de abelhas assim como apontam o óleo essencial de C. martinii e seu composto majoritário
como possíveis alternativas para mitigar os efeitos nocivos dos neonicotinóides sobre as
abelhas.
Palavras-chave: Apidae, Cymbopogon martinii, imidacloprid, geraniol, locomoção.
21
ABSTRACT
Título: Apis mellifera on target of neonicotinoids: a way with no retorn? Bioinseticides
can be an alternative.
The recent global decline of bee populations has been intense research due to the enormous
ecological and economic damage resulting from the loss of pollination services. Among the
possible factors that cause this collapse is the use of insecticides from the neonicotinoids
group. Despite this, the use of these products has increased in recent decades on a global
scale. In an attempt to evaluate an alternative to the use of neonicotinoids, this work analyzed
the effects of a bioinseticide and its major compound on Apis mellifera (Hymenoptera:
Apidae), one of the main pollinators of crop plants. For this, the bees were exposed, by topical
application and ingestion, to the essential oil of Cymbopogon martinii (Poaceae: Poales),
geraniol and the insecticide imidacloprid. Were evaluated the toxicity effects, behavioral and
locomotion changes of bees treated with these compounds. The experiments were conducted
in the laboratory using individuals from four colonies of A. mellifera. In general, there was
greater toxicity through ingestion than through contact. The insecticide imidacloprid was
more toxic against A. mellifera when compared the essential oil and its major compound.
None of the treatments altered the individual behavior and the pattern of behavioral
interaction among the individuals of the colonies. On the other hand, imidacloprid,
administered orally, altered the behaviors of locomotion and flight orientation of the bees. The
same did not occur for essential oil and geraniol. Our results support the comprehension of the
mechanisms that cause bees colony collapse disorder as well as point out the essential oil of
C. martinii and its major compound as possible alternatives to mitigate the harmful effects of
neonicotinoids on bees.
Key words: Apidae, Cymbopogon martinii, imidacloprid, geraniol, locomotion.
22
4.1. Introdução
A manutenção da biodiversidade garante a prestação dos serviços ecossistêmicos
naturais, os quais propiciam uma gama de benefícios para o homem (Dirzo et al. 2014).
Dentre estes, a polinização por insetos - realizada principalmente por abelhas (Klein et al.
2007) - representa um serviço crucial para a manutenção da diversidade genética de plantas
silvestres (Knight et al. 2005) e para a produtividade agrícola mundial (Ricketts et al. 2008).
O recente declínio global das populações de abelhas - conhecido como Desordem do Colapso
das Colônias (DCC) - é considerado alarmante devido aos enormes prejuízos econômicos
decorrentes da redução da polinização nas lavouras (Potts et al. 2010). Esta desordem das
colônias tem sido atribuída a múltiplos fatores de stress que parecem agir de forma
sinergética, incluindo: a perda de habitats naturais, incidência de parasitas e doenças e a
intensificação da agricultura (González-Varo et al. 2013; Staveley et al. 2014). Embora a
relativa importância destes fatores ainda seja incerta, o uso de inseticidas do grupo dos
neonicotinóides tem sido apontado como um importante fator envolvido nesta DCC,
principalmente devido aos seus efeitos subletais sobre as abelhas (Henry et al. 2012). Assim,
torna-se de suma importância determinar as causas e encontrar estratégias para mitigar a
redução das populações de abelhas (Gill, Ramos-Rodriguez & Raine 2012).
Os neonicotinóides podem contaminar as abelhas diretamente durante a aplicação em
campo e, principalmente, via consumo de recursos como pólen e néctar de plantas
contaminadas (ex. exposição oral), uma vez que são pesticidas sistêmicos (ex. uma vez
absorvidos pelas plantas, são difundidos em seus tecidos) (Farooqui 2013). Estes inseticidas
agem sobre os artrópodes ocasionando problemas fisiológicos e comportamentais, por
interferir diretamente nos receptores nicotínicos da acetilcolina - neurotransmissor
responsáveis por desencadear a despolarização das membranas pós-sinápticas do sistema
nervoso central (Gbylik-Sikorska, Sniegocki & Posyniak 2015). Embora os efeitos de
toxicidade aguda não sejam sempre observados, efeitos subletais (ex. advindos de doses que
não causam mortalidade direta) podem interferir no colapso das colônias (Henry et al. 2012).
Dentre tais efeitos subletais está a redução da resposta imune das abelhas contaminadas com
neonicotinóides (Brandt et al. 2016), as quais se tornam mais susceptíveis à infecção por
patógenos [ex. Nosema ceranae (Aufauvre et al. 2012) e Varroa destructor (Barron 2012;
Balfour et al. 2016)]. Além disso, outros importantes efeitos subletais incluem a redução das
habilidades de aprendizado e memória das abelhas. Estas alterações podem interferir na
capacidade de orientação, navegação e consequentemente na eficiência de forrageio e do
retorno das abelhas para suas colônias (Henry et al. 2012), culminando assim na redução do
tamanho das populações.
Diversos estudos têm sido desenvolvidos com o intuito de obter produtos eficientes
contra insetos pragas e que tenham reduzidos efeitos negativos em organismos não-alvo
(Isman 2000), como é o caso das abelhas. Os óleos essenciais de plantas (OEs), por exemplo,
consistem em uma complexa mistura de componentes voláteis que podem interagir entre si
desencadeando diferentes funções na planta, como: proteção contra patógenos, herbívoros ou
atração de insetos dispersores de pólen e sementes (Bakkali et al. 2008). Assim, devido à sua
bioatividade, os OEs e seus constituintes isolados - principalmente monoterpenos - podem
consistir em potenciais bioinseticidas. Os OEs são considerados uma alternativa ao uso dos
inseticidas sintéticos para o controle de pragas por apresentarem diversas características
desejáveis, como: eficiência no controle de herbívoros, baixa toxicidade aos organismos não-
alvo, reduzida persistência no ambiente e lenta indução de resistência dos insetos devido à
complexidade de compostos (Koul, Walia & Dhaliwal 2008).
Embora os OEs sejam compostos naturais e considerados ambientalmente seguros,
estes apresentam toxicidade a diversos insetos e podem também causar alterações indesejadas
sobre organismos não-alvo. O OE de plantas de C. martinii, tem como composto majoritário o
geraniol, monoterpeno que também está presente no feromônio de atração e agregação (ex.
23
durante o forrageio) sintetizado pelas abelhas (Trhlin & Rajchard 2011). No entanto, embora
este OE tenha mostrado bioatividade contra diferentes organismos (Ganjewala 2009; Lima et
al. 2013), seus possíveis efeitos sobre a toxicidade, interação comportamental e forrageio das
abelhas ainda não foi investigado.
Uma vez que Apis mellifera são consideradas os mais importantes polinizadores
devido ao seu manejo em culturas agrícolas em todo o mundo (Potts et al. 2010), neste
trabalho, avaliamos a toxicidade e as alterações no comportamento e locomoção destas
abelhas sob efeito do neonicotinóide imidacloprid, do OE de C. martinii e do seu composto
majoritário geraniol.
4.2. Material e Métodos
4.2.1. Coleta dos indivíduos de A. mellifera
Os indivíduos de A. mellifera utilizados nos bioensaios foram provenientes de quatro
colônias mantidas no Apiário Experimental da Universidade Federal de Sergipe, São
Cristóvão, (10°55’S, 38°6’W). A coleta das abelhas forrageiras foi realizada com um funil
flexível de tela de nylon (80 cm de comprimento), que teve uma das extremidades acoplada a
um pote plástico e a outra inserida na entrada da colônia, mantendo-se uma inclinação em
direção a luz do sol (Fig. 1). Os indivíduos capturados foram mantidos em B.O.D. com oferta
de alimento (solução de sacarose a 50%) por no máximo 3 h antes da realização dos
bioensaios.
.
4.2.2. Obtenção dos compostos e análise do OE
O OE de C. martinii, obtido por arraste a vapor, e o composto geraniol (98% de
pureza) foram adquiridos das empresas Raros Naturals (Macaíba, Rio Grande do Norte,
Brasil) e Sigma-Aldrich® (Steinheim, Germany), respectivamente. O inseticida comercial
utilizado foi o neonicotinóide imidacloprid (Bayer CropScience, São Paulo, SP, Brasil) na
forma de grânulos dispersíveis em água (700 g i.a./Kg).
A análise da composição do OE foi realizada utilizando Cromatografia Gasosa,
acoplada à Espectrometria de Massas (CG/EM) e Detector Iônico de Chamas (CG/EM/DIC),
por meio do equipamento GCMSQP2010 Ultra (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japão),
equipado com um amostrador de injeção automática AOC-20i (Shimadzu Corporation, Kyoto,
Japão). A separação dos componentes do OE foi realizada em uma coluna capilar de sílica
fundida Rtx®-5MS Restek (5%-difenil-95%-dimetilpolisiloxano) com diâmetro interno de 30
m x 0,25 mm e 0,25 μm de espessura de filme, com um fluxo constante de Hélio 5,0, a uma
taxa de 1,0 mL.min-1
. Um µl da amostra do OE foi injetado à temperatura de 280°C, em uma
razão de split de 1:30. A temperatura do forno iniciou em 50°C (isoterma por 1,5 min), sendo
aumentada em 4°C. min-1
até atingir 200°C e em seguida aumentada em 10°C. min-1
até 300
°C, permanecendo nesta temperatura por 5 min.
No CG/EM as moléculas foram ionizadas por elétrons com energia de 70 eV e os
fragmentos analisados por um sistema quadrupolar programado para filtrar fragmentos/íons
com m/z na ordem de 40 a 500 Da, detectados por um multiplicador de elétrons. O processo
de ionização para o CG/DIC foi realizado pela chama proveniente dos gases hidrogênio 5.0
(30 mL.min-1
) e ar sintético (300 mL.min-1
). Os compostos químicos coletados e a corrente
elétrica gerada foram amplificadas e processadas no software GCMS Postrun Analysis
(Labsolutions- Shimadzu).
A identificação dos constituintes do OE de C. martinii foi feita com base na
comparação dos índices de retenção da literatura (Adams 2007). Para o índice de retenção foi
utilizada a equação de Van Den Dool & Kratz (1963) em relação a uma série homóloga de n-
alcanos (nC9-nC31). Também foram utilizadas três bibliotecas do equipamento (WILEY8,
NIST107 e NIST21) que permitiram a comparação dos dados dos espectros com aqueles
constantes das bibliotecas, utilizando um índice de similaridade de 80%.
24
4.2.3. Bioensaios
Os tratamentos utilizados nos bioensaios foram o OE de C. martinii, geraniol e
imidacloprid. Os bioensaios foram realizados em delineamento inteiramente casualizado com
quatro repetições (colônias). Foram realizados bioensaios de toxicidade, comportamento
(individual e coletivo) e locomoção/orientação de voo. As abelhas foram submetidas aos
tratamentos por contato e ingestão. Nos bioensaios comportamentais as variáveis foram
analisadas após 1 e 24 h da exposição das abelhas aos tratamentos.
4.2.3.1. Toxicidade
Para a obtenção das curvas de dose-mortalidade foram utilizadas inicialmente, para
cada via de exposição, doses que resultaram em mortalidades entre 0 e 100% dos indivíduos.
Posteriormente, doses intermediárias foram empregadas com o intuito de se determinar as
curvas. Em todos os casos, cada repetição consistiu em um grupo de oito abelhas forrageiras,
que foram previamente anestesiadas à -8oC por 2 min para permitir a aplicação dos
tratamentos. Os indivíduos tratados foram colocados em placas de Petri (9 x 2 cm) forradas
com papel filtro e com fornecimento de alimento (solução de sacarose a 50%). As placas
foram cobertas com filme plástico e mantidas em B.O.D. (26 ± 2°C; UR 70 ± 5%, sem
fotoperíodo). Testes preliminares indicaram que esta metodologia não afetou a sobrevivência
das abelhas. As observações de mortalidade foram realizadas 24 h após a montagem dos
experimentos.
Para a via de exposição por contato, 1 μL dos tratamentos foi aplicado no pronoto de
cada indivíduo, por meio de uma microseringa de 10 μL (Hamilton, Reno, NV, USA). Para
determinação das doses aplicadas (μg/indivíduo), a massa corporal de 40 indivíduos foi
determinada em balança analítica (AUW220D, Shimadzu). Em todos os tratamentos foi
utilizado o solvente acetona (Panreac, UV-IR-HPLC-GPC PAI-ACS, 99,9%).
Para a via de exposição por ingestão, cada abelha foi acondicionada individualmente
em um tubo plástico cônico (30 mm de comprimento e 9-4 mm de diâmetro) com sua cabeça
direcionada ao menor diâmetro do tubo (4 mm). A parte inferior do tubo (9 mm) foi coberta
com algodão a fim de impedir a fuga do indivíduo. Após o efeito anestésico, foram oferecidos
10 µL de solução de sacarose contendo os tratamentos (OE de C. martinii, geraniol e
imidacloprid). No controle foram administrados apenas 10 µL de solução de sacarose. A
solução básica de sacarose consistiu em uma mistura de polioxietileno (20) mono-
oleatosorbitano (Tween 80) (1%) como agente tensioativo e sacarose a 50%. Apenas foram
avaliadas as abelhas que consumiram totalmente a solução oferecida.
4.2.3.2. Comportamento individual e coletivo
Para avaliar possíveis modificações no comportamento das abelhas submetidas aos
diferentes tratamentos, os indivíduos foram tratados com as DL20 determinadas nos bioensaios
de toxicidade por via de contato e ingestão (Tabela 1).
Os comportamentos individuais e coletivos das abelhas tratadas foram avaliados
conforme metodologia adaptada de Bacci et al. (2015). Os bioensaios visaram avaliar: (i) as
alterações comportamentais individuais ocasionadas nos indivíduos tratados e (ii) as respostas
comportamentais de grupo de indivíduos não-tratados em relação a um indivíduo tratado.
Cada unidade experimental consistiu em uma placa de Petri (9 x 2 cm) contendo oito
abelhas forrageiras. Dentre estes indivíduos, um foi aleatoriamente retirado da placa e
submetido à aplicação de um dos tratamentos, sendo realocado junto ao grupo não-tratado,
após três minutos. As observações comportamentais tiveram início após 30 segundos da
inserção do indivíduo tratado. Foram feitas 10 repetições/ tratamento para cada colônia,
totalizando 160 placas analisadas. Os comportamentos foram registrados por 30 segundos
contínuos intercalados a cada 30 segundos, totalizando 5 min de observação/placa e 800 min
totais de observações.
25
Foram quantificados todos os comportamentos individuais do indivíduo tratado: auto-
limpeza, ventilação (batida das asas) e elevação do abdômen com exibição da glândula de
Nasonov (presente no último anel abdominal). Também foram avaliados os comportamentos
coletivos executados pelos indivíduos não-tratados em relação ao indivíduo tratado:
antenação, limpeza (indivíduo não tratado limpando o indivíduo tratado), trofalaxia, evitação
(do indivíduo tratado pelos não-tratados), atração e agressão.
4.2.3.3. Locomoção e orientação de voo
Para analisar o efeito dos tratamentos sobre a locomoção e a orientação de voo foi
utilizada uma arena (cubo de 150cm x 150cm x 150cm) com armação de alumínio fechada
com plástico transparente. Em uma extremidade superior da arena foi posicionada uma
lâmpada led (10 W e 806 lumens) com inclinação de 45o. Na extremidade oposta, cada abelha
tratada (ou controle) foi inserida individualmente, situando-se assim à uma distância de 259,8
cm da fonte de luz (Fig. 2).
Os indivíduos foram liberados na arena após 1 e 24 h da exposição aos tratamentos. Os
bioensaios para analisar o efeito do tempo de exposição foram conduzidos
independentemente. Para cada tempo de exposição foram analisados 40 indivíduos/colônia,
totalizando 160 indivíduos.
O comportamento de cada indivíduo foi gravado a cada três segundos por um período
de um minuto, totalizando 20 observações/indivíduo. As observações consistiram em registrar
a posição da abelha na arena considerando-se as três dimensões: posição x (comprimento), y
(altura) e z (profundidade). Também foram registrados a atividade dos indivíduos
(movimentado ou parado), o número de indivíduos que chegaram até a luz e o tempo gasto
para chegarem até a fonte luminosa.
4.2.4. Análises estatísticas
Os dados de mortalidade dos bioensaiosde toxicidade por contato e ingestão foram
submetidos à análise de Probit (Finney 1971) usando o procedimento PROC PROBIT do SAS
(SAS Institute Inc 2002). Foram aceitas curvas com probabilidade de aceitação da hipótese de
nulidade maior que 0,05 para o teste 2. Por meio destas curvas foram determinadas as DL20,
DL50 e DL90 com seus respectivos intervalos de confiança a 95% de probabilidade.
Os dados referentes aos comportamentos individual e coletivo (variáveis y) dos
indivíduos em relação aos tratamentos (variáveis x) foram submetidos, independentemente, à
Análise de Deviância (ANODEV) (R Development Core Team 2015).
As variações na locomoção dos indivíduos (orientação de voo) em função dos
tratamentos (variáveis x) também foram analisadas de forma similar. Nestas análises as
variáveis y foram consideradas: a distância máxima percorrida pelos indivíduos, a proporção
média das atividades (movimentado e parado) e o tempo médio gasto para a chegada dos
indivíduos até a fonte luminosa. O tempo médio gasto para chegada dos indivíduos até a luz
foi previamente obtido através de análise de sobrevivência com distribuição Weibull (R
Development Core Team 2015; pacote 'survival'). Neste caso foi medido o tempo médio gasto
para os 10 indivíduos analisados em cada tratamento/colônia chegassem até a fonte de luz.
A proporção média de indivíduos que chegaram à luz (variável y) em função dos
tratamentos (variáveis x) foi analisada utilizando-se ANODEV com distribuição de erros
Binomial (R Development Core Team 2015). Em todos os casos, diferenças entre das médias
entre os tratamentos foram analisadas utilizando teste de Tukey com P<0,05 (R Development
Core Team 2015).
26
4.3. Resultados
4.3.1. Constituição química do OE
Foram identificados e quantificados nove compostos no OE de C. martinii,
representando um total de 99,73% da composição total. O geraniol foi o composto em maior
concentração (85,09%), seguido por acetato de nerila (6,01%). Os demais constituintes
representaram menos de 3% da composição total do OE (Fig. 3).
4.3.2. Toxicidade por vias de exposição por contato e ingestão
A dose necessária dos compostos para matar 50% da população de A. mellifera variou
de 0,066 a 465 µg/abelha. O inseticida imidacloprid foi mais tóxico para as abelhas do que o
OE de C. martinii e seu composto majoritário. Imidacloprid foi cerca de 1979 e 1234
(contato) e 1106 e 652 (ingestão) vezes mais tóxico a A. mellifera do que o OE de C. martinii
e geraniol na DL50, respectivamente. Este padrão se manteve em doses inferiores e superiores
(DL20 e DL90) (Tabela 1). Todos os compostos foram mais tóxicos a A. mellifera quando
administrados via ingestão. O OE de C. martinii, geraniol e imidacloprid foram cerca de 6,4;
6,7 e 3,6 vezes mais tóxicos por ingestão do que por contato, respectivamente (Tabela 1).
4.3.3. Comportamentos individuais e coletivos
Não houve diferença significativa entre todos os tratamentos (OE de C. martinii,
geraniol e imidacloprid) aos quais os indivíduos de A. mellifera foram submetidos, não
alterarando os comportamentos individuais dos indivíduos tratados e nem os comportamentos
coletivos em relação a estes indivíduos, comparando todos os tratamentos (Tabela 2).
4.3.4. Locomoção e orientação de voo
4.3.4.1. Distância percorrida
De forma geral, os tratamentos afetaram negativamente a distância média percorrida
pelas abelhas, sendo que esta redução foi atenuada após 24h da exposição das abelhas. O
efeito dos tratamentos no deslocamento dos indivíduos não diferiu entre as vias de exposição,
com exceção do imidacloprid que mostrou efeito mais deletério por via de ingestão (Tabela
3). Na maioria dos casos, o imidacloprid causou maior limitação no deslocamento de A.
mellifera do que o OE ou seu composto majoritário.
Os tratamentos reduziram significativamente a distância máxima percorrida das
abelhas em relação ao controle após 1h de exposição por contato (Tabela 3, Fig. 4A). Após
24h de exposição por esta mesma via, somente as abelhas tratadas com o OE de C. martinii e
imidacloprid apresentaram menor deslocamento (Tabela 3, Fig. 4B).
Abelhas expostas via ingestão por 1 e 24h ao imidacloprid tiveram o menor
deslocamento entre os tratamentos (Tabela 3, Fig. 4C-D). Apesar do OE de C. martinii e o
geraniol reduzirem o deslocamento de A. mellifera em relação ao controle após 1 h de
exposição (Tabela 3, Fig 4C), com 24 h as abelhas não foram afetadas por estes bioinseticidas
(Tabela 3, Fig 4D).
4.3.4.2. Atividade dos indivíduos
A proporção de indivíduos parado e movimentando foi significativamente alterada
com os tratamentos aplicados por contato (após 1 h: F7;24 = 59,546 e P < 0,001 e após 24 h da
exposição: F7;24 = 141,88 e P < 0,001) e por ingestão (após 1 h: F7;24 = 53,612 e P < 0,001 e
após 24 h da exposição: F7;24 = 53,532 e P < 0,001).
Abelhas expostas por contato ao OE de C. martinii e geraniol após 1h da aplicação
movimentaram a maior parte do tempo de forma semelhante ao observado no controle,
enquanto que as tratadas com imidacloprid mostraram significativa redução da movimentação
(Fig. 5A). No entanto, tal efeito negativo do imidacloprid desapareceu após 24h de exposição
27
(Fig. 5B). Padrão semelhante foi observado nas abelhas tratadas via ingestão. No entanto,
neste caso não houve atenuação do efeito negativo do imidacloprid após 24h de exposição
(Fig. 5 C-D).
4.3.4.3. Orientação dos indivíduos
A proporção de indivíduos chegando até a fonte luminosa foi significativamente
alterada com os tratamentos aplicados por contato (após 1 h: F3;12 = 6,265 e P = 0,008 e após
24 h da exposição: F3;12 = 6,276 e P = 0,008) e por ingestão (após 1 h: F3;12 = 6,688 e P =
0,006 e após 24 h da exposição: F3;12 = 15,929 e P = 0,001).
Todos os tratamentos aplicados por contato (bioinseticidas e imidacloprid), após 1 h
da exposição, resultaram em menor proporção de abelhas chegando até a fonte luminosa
quando comparado ao controle (Fig. 6A). No entanto, após 24h da exposição, somente o
imidacloprid reduziu a proporção de indivíduos que chegaram até a luz (Fig. 6B).
Quando administrados via ingestão (após 1 h e 24 h da exposição), o número de
indivíduos de A. mellifera que chegaram até a luz nos tratamentos OE de C. martinii e
geraniol foi similar ao controle (Fig.6 A-B), diferindo significativamente do imidacloprid, no
qual as abelhas praticamente não conseguiram chegar até a fonte luminosa (Fig.6 C-D).
4.3.4.4. Tempo gasto para chegar na luz
O tempo médio gasto para que 50% dos indivíduos de A. mellifera chegassem até a
fonte luminosa variou significativamente entre os tratamentos aplicados por contato (após 1 h:
F3;12 = 3,943 e P = 0,036 e após 24 h da exposição: F3;12 = 9,179 e P = 0,036) e por ingestão
(após 1 h: F3;12 = 3,624 e P = 0,05 e após 24 h da exposição: F3;12 = 3,5021 e P = 0,05).
O tempo médio gasto para que os indivíduos tratados por contato após 1 h da
exposição com imidacloprid chegassem até a luz foi superior ao controle. Abelhas tratadas
com o OE de C. martinii e geraniol apresentaram tempos intermediários para chegar até a
fonte luminosa (Fig. 7A).
Nas demais situações (Fig. 7B-D), não houve diferença significativa no tempo gasto
para que as abelhas tratadas com OE de C. martinii e geraniol chegarem até a luz em relação
ao controle. Já os indivíduos tratados com imidacloprid praticamente não conseguiram chegar
até a fonte luminosa.
4.4. Discussão
O crescente e alarmante declínio das colônias de abelhas - DCC - tem sido amplamente
notificado. Apesar disso, os neonicotinóides, um dos principais fatores responsáveis pela
DCC, são os inseticidas mais utilizados em todo mundo, tendo este consumo aumentado
substancialmente em escala global na última década (Elbert et al. 2008). No presente trabalho,
demonstramos que a exposição de abelhas A. mellifera ao neonicotinóide imidacloprid
resultou em alta toxicidade e limitou de maneira significativa a capacidade de locomoção e
orientação das abelhas. Por outro lado, nosso estudo destaca que o uso do OE de C. martinii e
de seu composto majoritário (geraniol) além de apresentarem menor toxicidade, não
mostraram efeitos negativos sobre a movimentação das abelhas sob via de exposição oral
(Tabela 1). Esta ausência de efeitos indesejados dos bioinseticidas sobre as abelhas, pode estar
relacionado ao reconhecimento olfativo das abelhas devido à similaridade com as pistas
sociais utilizadas durante sua orientação. Isto pode ser esperado uma vez que o geraniol
consiste em um composto da essência floral de plantas polinizadas por abelhas, sendo também
sintetizado pela glândula de Nasonov e utilizado como feromônio de marcação durante o
forrageio (Chaffiol, Laloi & Pham-Delègue 2005).
Pelo fato de ser facilmente dissolvido em água, o imidacloprid (inseticida sistêmico)
pode ser absorvido pelas raízes e transportado por todos os tecidos da planta, incluindo os
recursos utilizados pelas abelhas (Goulson 2013). Estudos relatam que as concentrações de
28
resíduos de neonicotinóides no néctar e pólen podem variar na faixa de 1-23 ppb e 9-66 ppb,
respectivamente, sendo estas variações dependentes da forma de aplicação do inseticida
(Goulson 2013). Embora as abelhas individualmente a cada evento alimentar no campo
experimentem doses inferiores àquelas utilizadas em alguns estudos feitos em laboratório (ex.
Gill, Ramos-Rodriguez & Raine 2012; Henry et al. 2012), o efeito acumulativo desse
contaminantes nas colônias são difíceis de se prever. Segundo Goulson (2013) a
contaminação das abelhas depende da acumulação dos neonicotinóides durante os eventos de
forrageio ao longo do tempo, incluindo a metabolização e excreção desses contaminantes. Isto
poderia depender também das taxas de ingestão e trofalaxia entre indivíduos e do estoque de
produtos contaminados na colônia.
Estudos relatam redução da imuno-competência dos indivíduos de A. mellifera
tratados com imidacloprid (Brandt et al. 2016). A redução da resposta imune poderia ser
resultante não somente da imunidade humoral em si, mas advinda das alterações
comportamentais entre indivíduos da colônia. Abelhas apresentam relativa reduzida resposta
imune quando comparada a outros insetos. No entanto, esta baixa flexibilidade pode ser
compensada pela 'imunidade social', desencadeada principalmente pelo comportamento de
higiene (ex. remoção de larvas doentes) e allogrooming (ex. remoção de parasitas entre
companheiros de ninho), os quais são modulados principalmente pela capacidade de
reconhecimento entre indivíduos (Evans et al. 2006). Neste trabalho, as doses subletais do
imidacloprid e dos bioinseticidas não alteraram os comportamentos individuais e coletivos
dos indivíduos tratados. Assim, provavelmente qualquer mudança na performance das
colônias de A. mellifera, como possível redução da imunidade não ocorra pela perda da
imunidade social. Adicionalmente, a ausência de alterações comportamentais, permite supor
que as abelhas não sejam capazes de reconhecer os sinais dos inseticidas, o que pode
aumentar o risco de contaminação das colônias. Outros estudos também relataram esta
incapacidade das abelhas de identificar e evitar pesticidas (Sanchez-Bayo & Goka 2014),
inclusive o imidacloprid (Kessler et al. 2015). O composto geraniol, apesar de ser uma
substância comum na composição do feromônio de marcação das abelhas, também não
apresentou nenhuma alteração comportamental entre os indivíduos.
Por outro lado, houve significativa redução da distância total percorrida, da proporção
de tempo movimentando e da orientação de locomoção quando o imidacloprid foi
administrado via ingestão (Fig. 4-5), quando comparado aos demais tratamentos. As
mudanças observadas na capacidade de locomoção e orientação das abelhas em contato com
imidacloprid, poderiam, sob condições de campo resultar em padrão semelhante ao observado
por Henry et al.(2012). Tais autores demonstraram que abelhas contaminadas com
neonicotinóide (thiamethoxam) apresentaram maior mortalidade e falhas no retorno para suas
colônias, em relação às abelhas não contaminadas. Este efeito foi ainda mais deletério quando
as colônias tinham acesso a sítios de forrageio não-familiares e distantes do ninho. Gill et
al.(2012) também verificaram efeitos semelhantes para Bombus terrestris: redução da
performance de forrageio e recrutamento, perda de operários e produtividade da colônia;
sendo estes efeitos intensificados quando as abelhas foram expostas a misturas de inseticidas.
Qualquer comportamento das abelhas no sentido de perceber e evitar fontes contaminadas
poderia reduzir estes efeitos deletérios. Porém, estudos demonstram que A. mellifera, assim
como B. terrestris além de não serem capazes de evitar concentrações dos mais comumente
utilizados neonicotinóides (ex. imidacloprid, thiamethoxam), ainda podem preferir utilizar
estas fontes em detrimento de recursos não-contaminados (Kessler et al. 2015).
Estudos tem mostrado efeito do OE de plantas do gênero Cymbopogon e do geraniol
para controle diversos grupos de insetos praga (Pereira et al. 2008; Caballero-Gallardo,
Olivero-Verbel & Stashenko 2012; Mendesil, Tadesse & Negash 2012; Lima et al. 2013),
incluindo insetos sugadores [OEs: Ricci et al. 2006; Andrade et al. 2013; Pinheiro et al. 2013;
Deletre et al. 2016 e geraniol: Badawy, El-Arami & Abdelgaleil 2010; Baldin et al. 2014;
Salman & Erba 2014; Deletre et al. 2016] para os quais os neonicotinóides são amplamente
29
utilizados (Liang et al. 2012; Qu et al. 2015). Nossos resultados sugerem que a utilização
destes bioinseticidas poderiam contribuir para futuras ações de mitigação e conservação de
colônias de abelhas.
4.5. Referências Bibliográficas
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32
Tabela 1. Toxicidade por contato e ingestão do OE de Cymbopogon martinii, geraniol e
inseticida imidacloprid sobre a abelha forrageira Apis mellifera (µg/abelha), após 24 horas da
exposição.
Tratamento N DL20
(95%IC)
DL50
(95%IC)
DL90
(95%IC) 2 P
Contato
C. martinii 793 189
(141-233)
465
(404-528)
1828
(1451-2535) 2,2 4,22 0,237
Geraniol 354 124
(101-147)
290
(253-333)
1066
(876-1361) 2,3 0,75 0,862
Imidacloprid 352 0,072
(0,05-0,095)
0,235
(0,194-0,28)
1,44
(1,08-2,10) 1,6 5,67 0,127
Ingestão
C. martinii 168 54
(49-58)
73
(69-77)
116
(107-128) 6,4 2,19 0,336
Geraniol 254 18
(15-21)
43
(39-49)
156
(130-196) 2,3 5,94 0,202
Imidacloprid 253 0,038
(0,034-0,042)
0,066
(0,059-0,073)
0,148
(0,123-0,191) 3,6 0,39 0,823
= inclinação.
33
Tabela 2. Comportamento individual e coletivo de abelhas forrageiras Apis mellifera expostas
por contato e ingestão a DL20 do OE de Cymbopogon martinii, geraniol e inseticida
imidacloprid.
Vias de exposição Tipo de
Comportamento Comportamento F P
Contato
Individual
Auto-limpeza 1,4385 0,2697 n.s.
Ventilação 0,4270 0,7869 n.s.
Nasonov 0,5368 0,7110 n.s
Coletivo
Limpeza 1,2946 0,3163 n.s
Antenação 2,2451 0,1129 n.s
Trofalaxia 0,5282 0,7168 n.s
Evitação 2,5521 0,0822 n.s
Atração 2,3788 0,0982 n.s
Agressão 1,4714 0,2601 n.s
Ingestão
Individual
Auto-limpeza 1,9895 0,1479 n.s
Ventilação 1,4175 0,2760 n.s
Nasonov 1,0452. 0,4168
n.s
Coletivo
Limpeza 1,2711 0,3247 n.s
Antenação 1,3556 0,2956 n.s
Trofalaxia 0,6197 0,6554 n.s
Evitação 2,6330 0,0758 n.s
Atração 1,7967 0,1821 n.s
Agressão 0,8704 0,5043 n.s
n.s. teste não significativo (P>0,05).
34
Tabela 3. Média da distância máxima percorrida (±EPM) (cm) pelas abelhas forrageiras Apis
mellifera expostas por contato e ingestão à DL20 do OE de Cymbopogon martinii, geraniol e
inseticida imidacloprid após 1 e 24 horas da exposição.
Via de exposição
Tratamento Contato Ingestão
1 hora 24 horas 1 hora 24 horas
Controle 236,5±28,3 Aa 238,8±28,0 Aa 245,2±19,2 Aa 216,0±36,0 Ab
C. martinii 161,7±46,3 Ba 187,5±42,6 Ba 196,3±43,1 Ba 219,5±36,1 Aa
Geraniol 159,1±47,4 Bb 233,8±25,3 Aa 193,9±42,6 Ba 216,1±31,8 Aa
Imidacloprid 124,3±50,5 Bb 181,3±34,2 Ba 50,6±24,7 Cb 116,2±39,3 Ba
Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na coluna (comparação entre os tratamentos), minúscula na linha
para cada via de exposição (comparação entre os tempos de exposição) e grega na linha para cada tempo de
exposição (comparação entre as vias de exposição), não diferem entre si pelo teste de Tukey a P<0,05%.
35
Figura 1. Esquema do aparato utilizado para a coleta de indivíduos forrageiros da abelha Apis
mellifera; formado por um funil flexível de tela de nylon (80 cm de comprimento por 30 cm
de diâmetro) e um pote plástico (15 cm de cumprimento x 10 cm diâmetro) com inclinação na
direção da luz do sol, para captura das abelhas.
36
Figura 2. Representação de gaiola utilizada nos bioensaios de locomoção e orientação de voo
(150 cm x 150 cm x 150 cm) de indivíduos forrageiros de Apis mellifera. Estrutura formada
por armação em alumínio e plástico transparente.
37
Figura 3. Cromatografia do OE de Cymbopogon martinii analisado por CG-EM e CG-DIC.
Geraniol (85,1%)
Tempo de retenção (s)
38
Figura 4. Posição média alcançada pelos indivíduos forrageiros da abelha Apis mellifera
expostos por contato e ingestão à DL20 do OE de Cymbopogon martinii, geraniol e inseticida
imidacloprid após 1 hora (A, C) e 24 horas (B, D) da exposição.
39
Figura 5. Tempo (%) que os indivíduos forrageiros da abelha Apis mellifera expostos por
contato e ingestão à DL20 do OE de Cymbopogon martinii, geraniol e inseticida imidacloprid
após 1 hora (A, C) e 24 horas (B, D) da exposição permaneceram parados ou movimentando.
Barras seguidas pela mesma letra, não diferem, entre si, pelo teste de Tukey a P<0,05. *
indica que houve diferenças significativas entre o tempo que a abelha ficou parada e
movimentando.
Contato
Parado (%)
0255075100
1 hora
Movimentando (%)
0 25 50 75 100
Imidacloprid
Geraniol
C. martinii
Controle
* a
* a
* a
n.s. b
Parado (%)
0255075100
24 horas
Movimentando (%)
0 25 50 75 100
Imidacloprid
Geraniol
C. martinii
Controle
* a
* a
* a
* a
Ingestão
Parado (%)
0255075100
1 hora
Movimentando (%)
0 25 50 75 100
Imidacloprid
Geraniol
C. martinii
Controle
* a
* a
* a
Parado (%)
0255075100
24 horas
Movimentando (%)
0 25 50 75 100
Imidacloprid
Geraniol
C. martinii
Controle
* a
* a
* a
* b n.s. b
A B
C D
40
Figura 6. Proporção de indivíduos da abelha Apis mellifera que se direcionaram até uma
fonte luminosa quando expostas por contato e ingestão à DL20 do OE de Cymbopogon
martinii, geraniol e inseticida imidacloprid após 1 hora (A, C) e 24 horas (B, D) da exposição
que chegaram até a luz (%). Barras seguidas pela mesma letra, não diferem, entre si, pelo teste
de Tukey a P<0,05.
1 hora
Tratamentos
Chegara
m a
té a
luz (
%)
0
20
40
60
80
100
Contato
Ingestão
A B
C D
a
bb
b
24 horas
Tratamentos
Chegara
m a
té a
luz (
%)
0
20
40
60
80
100 a
ab
a
b
1 hora
Tratamentos
Chegara
m a
té a
luz (
%)
0
20
40
60
80
100 a
a
a
b
24 horas
Tratamentos
Chegara
m a
té a
luz (
%)
0
20
40
60
80
100
a a
a
b
Controle C. martinii Geraniol Imidacloprid Controle C. martinii Geraniol Imidacloprid
Controle C. martinii Geraniol ImidaclopridControle C. martinii Geraniol Imidacloprid
41
Figura 7. Tempo (s) médio gasto para que 50% dos indivíduos forrageiros da abelha Apis
mellifera chegassem até a luz, quando tratadas por contato e ingestão com a DL20 do OE de
Cymbopogon martinii, do geraniol e do inseticida imidacloprid após 1 hora (A, C) e 24 horas
(B, D) de exposição. Barras seguidas pela mesma letra, não diferem, entre si, pelo teste de
Tukey a P<0,05.
1 hora
Tratamentos
Tem
po p
ara
chegar
até
a luz (
s)
0
100
200
300
400
Contato
Ingestão
A B
a
ab ab
b
24 horas
Tratamentos
Tem
po p
ara
chegar
até
a luz (
s)
0
100
200
300
400
b
a
bb
∞
D24 horas
Tratamentos
Tem
po p
ara
chegar
até
a luz (
s)
0
100
200
300
400
b
a
bb
∞
C1 hora
Tratamentos
Tem
po p
ara
chegar
até
a luz (
s)
0
100
200
300
400
b
a
bb
∞
Controle C. martinii Geraniol Imidacloprid Controle C. martinii Geraniol Imidacloprid
Controle C. martinii Geraniol ImidaclopridControle C. martinii Geraniol Imidacloprid
42
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Este estudo destaca que o óleo essencial de C. martinii e seu constituinte geraniol,
apresetam potencial para utilização no manejo de pragas, uma vez que estes não limitaram a
capacidade de deslocamento das abelhas. Por outro lado, nossos resultados corroboram
estudos que mostram os efeitos negativos do imidacloprid na capacidade de forrageio de A.
mellifera.
Portanto, nossos resultados auxiliam na compreensão dos mecanismos que causam
alterações da desordem nas colônias de abelhas assim como apontam o óleo essencial de C.
martinii e seu composto majoritário como possíveis alternativas para mitigar os efeitos
nocivos dos neonicotinóides sobre as abelhas.