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LEILA REGINA GIAROLA
EXPLORANDO A BIODIVERSIDADE BRASILEIRA E OS CONHECIMENTOS
POPULARES: DESENVOLVIMENTO DE FORMULAÇÃO PARA USO TÓPICO COM
EXTRATO DE PTERODON PUBESCENS BENTH. (SUCUPIRA)
CAMPINAS
2015
DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação aos meus pais, Wladimir e Haydee, por SEMPRE estarem ao
meu lado, apoiando todas as minhas escolhas, dando-me discernimento, norte e conforto.
Obrigada por nunca deixarem que eu desistisse dos meus sonhos. E obrigada por me
mostrarem que com carinho, esforço e dedicação, eles são possíveis!
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus por me dar forças e mostrar que quando pensamos
que uma porta se fechou, temos sempre uma janelinha... Aquela “janelinha” que na verdade é
uma passagem enorme, abre caminhos que nunca pudemos imaginar e que são muito
melhores que aqueles um dia planejamos. Os caminhos pelos quais andamos são perfeitos e
tudo acontece no momento certo.
Agradeço aos meus pais, Wladimir e Haydee, por sempre estarem ao meu lado,
apoiando todas as minhas escolhas, dando-me discernimento, norte e conforto. Obrigada por
nunca deixarem que eu desistisse dos meus sonhos. E obrigada por me mostrarem que com
carinho, esforço e dedicação, eles são possíveis!
Minha irmã Raquel, minhas avós, meus tios e primos... Conquistas são muito mais
saborosas quando compartilhadas e comemoradas com vocês! Obrigada por todo apoio e
incentivo! E tenho certeza que os meus avôs estariam orgulhosos por esse momento.
Solange, agradeço imensamente por ajudar a sempre clarear e desvendar os mistérios
dessa complexa e surpreendente jornada da vida! Você também tem participação nessa
conquista.
Professores Carlos Alexandre Krell e Lucilene Colodo do Amaral Ferreira, mesmo que
vocês estejam tão distantes, deixo aqui registrado o quanto agradeço a vocês por tudo o que
me ensinaram. Este resultado tem muito do incentivo e dedicação de vocês e disso nunca me
esquecerei, faz parte de quem sou de onde hoje cheguei. Um dia nos reencontraremos.
Agradeço ao funcionário Rafael por toda ajuda e dedicação e ao Programa de Pós-
graduação em Biociências e Tecnologia de Produtos Bioativos pela oportunidade e estrutura
para o desenvolvimento e conclusão deste trabalho.
Professora Priscila, agradeço primeiramente por ter acreditado e confiado em mim, por
me dar toda estrutura e oportunidade para desenvolver este trabalho. Pri, agradeço além,
obrigada pelo incentivo e todo apoio, ensinar e ajudar a não somente tomar decisões
profissionais, mas também por me ensinar a acreditar em mim. Levarei comigo para sempre
todo o aprendizado desses vários anos de convivência, a amizade e a alegria desse momento.
E que venham as próximas conquistas, profissionais e pessoais!
Professora Mary Ann, obrigada pela oportunidade, todo apoio, estrutura, ensinamento,
bons momentos, conversas e amizade.
Professor Rodney, também agradeço todo apoio, ensinamento, amizade e as muitas
risadas!
Professores Edgar, Gislaine, Guilherme, Laura e Paulo, agradeço por todo apoio,
ensinamentos, trocas de idéias, experiências e inúmeras colaborações para deixar esse
trabalho ainda melhor.
Agradeço ao Professor Edvaldo e o Msc. Thiago, do Intituto de Química / UNICAMP,
por disponibilizarem o reômetro e auxiliarem na condução dos testes de viscosidade.
Aline, Cínthia, Ilza, Janaína, Laís, Letícia, Natália e Verônica: não tenho palavras para
agradecer a ajuda de vocês, em todos os aspectos. Agradeço a amizade, o apoio,
ensinamentos, incentivos, pés no chão e sonhos, o ombro amigo, as risadas e também as
lágrimas, as taças de vinho, os almoços deliciosos com sobremesa e café, as coxinhas, e tudo
mais. O caminhar é mais tranquilo com vocês ao meu lado, o que a princípio parece difícil
acaba sendo fácil e muito bem realizado. Vocês tiveram um papel muito importante nessa
conquista. E com certeza, farão parte das próximas, profissionais e pessoais.
Rogério, Mariana, Michelle, Sica, Vanessa e Karin, agradeço por todo apoio, amizade,
risadas, ensinamentos e toda ajuda nos testes realizados em animais.
Agradeço às alunas de Iniciação Científica, Raquel e Maiara, pela amizade, dedicação
e por me darem a oportunidade de ensinar um pouco do que conheço e aprender bastante
também.
Agradeço à Simone e demais amigos e funcionários da Faculdade de Ciências Médicas
pela ajuda, estrutura e amizade.
Aos amigos do CPQBA, Aninha, Elaine, Giovanna, Fabrício, Humberto, Larissa,
Leila, Núbia, Rosanna, e demais colegas e funcionários do centro de pesquisa. Sempre foi
muito gratificante e produtivo estar com vocês. Agradeço todo apoio, risadas, amizade e troca
de experiências.
Família Imorríveis e Família 4u, posso dizer que ajudaram sim no desenvolvimento e
conclusão do meu trabalho de mestrado, tornaram essa jornada mais leve. Agradeço toda
amizade, apoio, incentivo, risadas e mais risadas. Vocês sempre deram aquela energia para
completar a próxima etapa e fico feliz por estarem comemorando essa conquista comigo.
Agradeço à FAPESP, à CAPES e ao CNPQ pelo auxílio financeiro necessário para a
viabilização deste projeto.
Família e amigos, a vida é mais leve quando temos pessoas queridas ao nosso lado.
Agradeço a todos vocês, que ajudaram direta e indiretamente na realização desse trabalho.
Cada um de vocês é único, e são essas singularidades que ajudam a me completar. A alegria
dessa conquista, que era um sonho e hoje é real, compartilho com vocês.
“A verdadeira coragem é ir atrás de seus sonhos mesmo quando
todos dizem que eles são impossíveis.”
Cora Coralina
RESUMO
Plantas medicinais são utilizadas de acordo com a sabedoria popular, inseridas num contexto
histórico. Sua utilização no preparo de fitoterápicos apresenta grande importância nos
diversos estágios de desenvolvimento da sociedade, sempre fazendo parte da prática
farmacêutica o interesse por fitoterápicos é renovado nos dias de hoje. O manejo do material
vegetal requer uma série de cuidados, uma das alternativas utilizadas para preservar suas
características durante o processamento é a utilização de técnicas de encapsulação, que
protegem das condições adversas do meio e prolongam a vida útil do extrato vegetal. A
espécie Pterodon pubescens Benth. (Leguminosae), conhecida popularmente como sucupira, é
nativa do cerrado brasileiro, utilizada na medicina popular, administrada geralmente através
da via oral, tem suas ações anti-proliferativa, anti-inflamatória e analgésica, cientificamente
comprovadas. Diante de tais propriedades torna-se interessante a veiculação deste extrato em
uma formulação de uso tópico, o que pode resultar em maior facilidade de aplicação, melhor
aceitação do paciente, maior adesão ao tratamento e menor risco de efeitos adversos. O
objetivo desse projeto foi o desenvolvimento de uma formulação de uso tópico contendo
extrato de Pterodon pubescens Benth., avaliar suas condições de estabilidade e determinar seu
prazo de validade. Para isso realizou-se o processo de seleção dos frutos, obtenção do extrato
bruto diclorometano e sua caracterização. Parte desse material foi microencapsulado por
atomização, utilizando a goma do cajueiro como material de parede. As microcápsulas obtidas
foram avaliadas quanto ao rendimento do processo, eficiência de encapsulação, morfologia
por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) e análise de sua distribuição granulométrica.
Em seguida, o extrato bruto microencapsulado e o extrato bruto livre foram veiculados em
bases semissólidas, emulsões e géis, os produtos obtidos foram avaliados em teste de
estabilidade de 180 dias. A base de gel de Carbopol contendo 2,5% de extrato bruto livre foi a
formulação que apresentou melhores resultados. As formulações semissólidas contendo o
extrato microencapsulado se mostraram instáveis, contudo, as microcápsulas obtidas foram
avaliadas em modelo experimental de úlcera induzida por etanol e apresentaram atividade
anti-ulcerogênica, indicando, portanto, a possibilidade de serem veiculadas em formas
farmacêuticas de uso oral. Deste modo sugere-se que a formulação desenvolvida pode ser
utilizada como base para o desenvolvimento de um produto fitoterápico inovador.
Palavras-chave: sucupira; microcápsulas; goma do cajueiro; semissólido; uso tópico; estudo
de estabilidade.
ABSTRACT
Medicinal plants are used according to popular wisdom, inserted in a historical context. Its
use, in the herbal medicines preparation is quite important in various society development
stages, it has always been part of the pharmaceutical practice and today the interest in
medicinal plants is renewed. Handling the plant material requires a lot of care and one of the
alternatives used to preserve their characteristics during all processing steps is the use of
encapsulation techniques, which protects from adverse environmental conditions and prolong
its shelf life. The species Pterodon pubescens Benth. (Leguminosae), commonly known as
sucupira, is native to the Brazilian cerrado and is used in folk medicine and generally
administered through the oral route, with its anti-proliferative, anti-inflammatory and
analgesic actions scientifically proven. Given such properties the use of this extract in a
topical formulation becomes interesting, which can result in easier application, better patient
compliance and smaller risk of adverse effects. The aim of this study was the development of
a topical formulation containing Pterodon pubescens extract, and to evaluate of their stability
conditions and to determine its shelf life. For that, the fruit selection process, crude extract
dichloromethane production and its characterization were done. Part of this material has been
microencapsulated by spray-drying using cashew gum as wall material. Microcapsules
obtained were evaluated for process yield, encapsulation efficiency, morphology by Scanning
Electron Microscopy (SEM) and analysis of its particle size distribution. Then the crude
extract microencapsulated and free crude extract were used on semisolid bases, emulsions and
gels, and the obtained products were evaluated in 180-day stability study. The Carbopol-based
gel containing 2.5% free crude extract was the formulation that showed the best results. The
semisolid formulations containing microencapsulated extract were unstable. However, the
obtained microcapsules were evaluated in an experimental ulcers model induced by ethanol
and showed anti-ulcerogenic activity, thus indicating the possibility of being applied in
pharmaceutical forms for oral use. Thus the developed formulation can be used as a basis for
an innovative herbal medicine development.
keywords: sucupira; microcapsules; cashew gum; semisolids; topical use; stability study.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 Estrutura química do composto ácido 6α,7β-dihidroxivouacapano-17-óico.29
Figura 1.2 Estrutura química do composto geranilgeraniol. ........................................ 29
Figura 1.3 Estrutura química do composto vouacapano-6α, 7β, 14β, 19-tetraol. ......... 30
Figura 1.4 Estrutura química do composto 6α-hidroxivouacapano-7β,17β-lactona. .... 31
Figura 1.5 Estrutura química dos compostos: A) biciclogermacreno, B) trans-cariofileno e C)
α-humuleno. ................................................................................................................ 31
Figura 1.6 Frutos de P. pubescens .............................................................................. 35
Figura 1.7 Compostos relacionados à atividade farmacológica da sucupira................. 36
Figura 1.8 Placa de CCD para avaliação do extrato vegetal obtido. ............................ 37
Figura 1.9 Cromatografia em camada delgada das frações resultantes do fracionamento do
extrato bruto de Sucupira. A amostra “P” é o padrão dos vouacapanos. Fase móvel: n-
hexano/acetato de etila (40/60); revelador: anisaldeído. ............................................... 38
Figura 1.10 Cromatograma do extrato de P. pubescens, onde (A): região referente a presença
de derivados vouacapânicos; (B): Compostos de interesse,vouacapanos (m/z 404), em
destaque. ..................................................................................................................... 39
Figura 1.11 Cromatograma obtido por CLAE apresentando em destaque os isômeros (A)
éster 6α-hidroxi-7β-acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila e (B) éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-
vouacapano-17β-oato de metila (tempo de retenção de 17,6 minutos),correspondentes aos
denominados m/z 404 na técnica de CG-EM. .............................................................. 40
Figura 2.1 Esquemas de microcápsulas contendo diversos tipos de fase interna .......... 42
Figura 2.2 Microcápsulas com múltiplo recheio. ........................................................ 43
Figura 2.3 Foto ilustrativa do equipamento (A) e do modelo esquemático de spray dryer de
bancada (B, adaptado de VALDUGA et al., 2003), utilizado na produção das microcápsulas.
................................................................................................................................... 45
Figura 2.4 Formação da microcápsula através da técnica de atomização. .................... 46
Figura 2.5 Fluxograma do procedimento utilizado para purificação da goma do cajueiro49
Figura 2.6 Imagens que ilustram o processo de microencapsulação. A: Equipamento em
operação; B: Suspensão sendo bombeada em direção ao atomizador; C: Microcápsulas
produzidas passando através do ciclone, seguindo para o recipiente coletor. ................ 54
Figura 2.7 Microcápsulas de Sucupira obtidas pelo processo de spray drying. ............ 54
Figura 2.8 Extração do recheio das microcápsulas de P. pubescens contendo goma do
cajueiro como material de parede. ............................................................................... 55
Figura 2.9 Cromatograma do conteúdo extraído do interior das microcápsulas ........... 56
Figura 2.10 Cromatograma do material presente na superfície das microcápsulas. ...... 57
Figura 2.11 Cromatogramas obtidos na etapa de extração do recheio das microcápsulas e
avaliação da eficiência de microencapsulação comparados ao cromatograma do extrato bruto
livre de P. pubescens. .................................................................................................. 58
Figura 2.12 Preparação das amostras para MEV. A: Stubs; B: Stubs prontos para receber
aplicação das microcápsulas; C: Sputtering; D: sputter coater; E: Finalização do preparo das
amostras; F: Microscópio Eletrônico de Varredura. ..................................................... 62
Figura 2.13 Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura das
microcápsulas de P. pubescens com goma do cajueiro como material de parede, obtidas
através do processo de atomização, onde a imagem A apresenta aumento de 500x, B apresenta
aumento de 750x, C apresenta aumento de 1500x, D apresenta aumento de 1600x e E
apresenta aumento de 2500x. ...................................................................................... 63
Figura 2.14 Curva de distribuição granulométrica das microcápsulas de Sucupira contendo
goma do cajueiro como material de parede. ................................................................. 64
Figura 3.1 Diagrama representando absorção de composto (s) ativo (s), no caso ilustrado
como fármaco, através da pele em direção às possíveis áreas de atuação (STORPIRTIS et al.,
2009). ......................................................................................................................... 69
Figura 3.2 Curvas de fluxo representando o comportamento de vários materiais. (a)
Newtoniano, (b) plástico, (c) pseudoplástico e (d) dilatante (AULTON, 2005). ........... 70
Figura 3.3 Teste de espalhabilidade: placa base sobre papel milimetrado (A); aplicação da
amostra (B); aplicação da lâmina de vidro sobre a amostra (C); aplicação dos pesos (D), onde
atingiu-se um peso máximo de 16,0 g, ao final do procedimento. ................................ 80
Figura 3.4 Instabilidade de F1 observada após o teste de centrifugação: separação de fases,
onde a fração superior é composta pela fase oleosa e a fração inferior é formada pela fase
aquosa da emulsão. ..................................................................................................... 82
Figura 3.5 Formulações contendo extrato de Sucupira microencapsulado: aspecto visualizado
logo após a adição do material vegetal. (A) Placebo de F7 à esquerda da imagem e seu
respectivo produto, ao lado direto. (B) Placebo de F5 à esquerda da imagem e seu respectivo
produto, ao lado direto. ............................................................................................... 85
Figura 3.6 Variações de pH nas três condições de armazenamento das bases F5, F6, F7 e F8:
comparação entre placebo e produto contendo extrato bruto livre. ............................... 87
Figura 3.7 Variações de pH nas três condições de armazenamento das bases F5, F6, F7 e F8:
comparação entre placebo e produto contendo extrato bruto microencapsulado. .......... 88
Figura 3.8 Placebo T0, T6 armazenado à temperatura ambiente, T6 armazenado sob luz
indireta e T6 armazenado em estufa. ........................................................................... 92
Figura 3.9 Produto T0, T6 armazenado à temperatura ambiente, T6 armazenado sob luz
indireta e T6 armazenado em estufa. ........................................................................... 93
Figura 3.10 Produto exposto à temperatura ambiente nos tempos T0, T3 e T6. ........... 93
Figura 3.11 Produto exposto à temperatura elevada nos tempos T0, T3, T6. ............... 93
Figura 3.12 Produto exposto à luz indireta nos tempos T0, T3, T6. ............................ 93
Figura 3.13 Valores de pH do placebo F7 e do produto de F7 contendo 2,5% de extrato bruto
livre de Sucupira observados ao longo dos 180 dias de estudo de estabilidade armazenado à
temperatura ambiente, estufa e luz indireta. ................................................................. 95
Figura 3.14 Doseamento dos compostos vouacapanos no produto F7 contendo 2,5% de
extrato livre de Sucupira exposto à temperatura ambiente (TA). Análises realizadas no início
do estudo de estabilidade (T0), após 90 dias (T3) e 180 dias (T6). ............................... 96
Figura 3.15 CCD para doseamento de vouacapanos. Amostras de produto no início do estudo
(0 dias) e após 90 dias, armazenado à temperatura ambiente. ...................................... 97
Figura 3.16 CCD para doseamento de vouacapanos. Amostras de produto após 180 dias,
armazenado à temperatura ambiente. ........................................................................... 97
Figura 3.17 CCD de amostras de produto após 90 e 180 dias, expostos à luz indireta. 98
Figura 3.18 Espalhabilidade do placebo (A) e do produto (B) verificada no início do estudo:
método selecionado apresenta linearidade ................................................................... 99
Figura 3.19 Reogramas apresentando a variação da viscosidade aparente do placebo F7 e
Produto F7 contendo 2,5% de extrato bruto livre de Sucupira nas três condições de
armazenamento nos tempos T0 (0 dias), T3 (90 dias) e T6 (180 dias). ....................... 103
Figura 3.20 Curvas de fluxo de placebo F7 e Produto F7 contendo 2,5% de extrato bruto livre
de Sucupira: viscosidade das amostras ao final de 180 dias nas três diferentes condições de
armazenamento. ........................................................................................................ 105
Figura 4.1 Representação esquemática da célula de Franz do tipo difusão vertical (Fonte:
www.permegear.com/franz.htm). .............................................................................. 109
Figura 4.2 Liberação dos vouacapanos através de membrana sintética de celulose. .. 112
Figura 5.1 Efeito do tratamento oral com microcápsulas de goma do cajueiro contendo
extrato diclorometano de frutos de P. pubescens em modelo de úlcera gástrica induzida por
etanol. ....................................................................................................................... 118
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 Características da suspensão processada por spray dryer para obtenção de
microcápsulas de Sucupira com goma do cajueiro como material de parede. ............... 50
Tabela 2.2 Compostos monitorados nas três amostras (Extrato bruto livre; Conteúdo Interno
(CI) e Conteúdo Superficial (ES)) avaliadas nas etapas de avaliação da eficiência de
microencapsulação, onde m/z 204 refere-se ao composto volátil cariofileno; m/z 362 e m/z
404 correspondem aos compostos vouacapanos junto aos seus respectivos tempos de retenção
na análise de CG-EM. ................................................................................................. 60
Tabela 2.3 Valores utilizados no cálculo de Eficiência de Microencapsulação (EM). CI
representa a média das quantidades dos vouacapanos (m/z 404) presente no interior das
microcápsulas. ES representa a média das quantidades dos vouacapanos (m/z 404) presente na
superfície externa das microcápsulas. ET é o valor de extrato bruto total das microcápsulas,
formado pela soma da quantidade presente no interior (CI) e quantidade presente na superfície
(ES) das microcápsulas. .............................................................................................. 60
Tabela 3.1 Composição percentual das bases semissólidas testadas. ........................... 73
Tabela 3.2 Composição percentual das formulações contendo o extrato vegetal ativo. 75
Tabela 3.3 Determinações de espalhabilidade e pesos utilizados. ................................ 80
Tabela 3.4 Avaliação da estabilidade das bases semissólidas. ..................................... 81
Tabela 3.5 Resultados de avaliação macroscópica e do teste de centrifugação das formulações
contendo extrato bruto livre e extrato bruto microencapsulado. Os produtos foram
comparados com seu respectivo placebo em cada etapa do teste. ................................. 83
Tabela 3.6 Avaliação macroscópica do placebo de F7 exposto nas três diferentes condições
de armazenamento durante 180 dias. ........................................................................... 91
Tabela 3.7 Avaliação macroscópica do produto de F7 com 2,5% de extrato livre de Sucupira
exposto nas três diferentes condições de armazenamento durante 180 dias. ................. 91
Tabela 3.8 Concentrações de vouacapanos presentes nas amostras de produto analisadas.
................................................................................................................................... 97
Tabela 3.9 Espalhabilidade do placebo F7 e seu produto contendo 2,5% de extrato livre de P.
pubescens exposto à três diferentes condições de armazenamento durante um período de 180
dias. .......................................................................................................................... 100
Tabela 4.1 Parâmetros de liberação dos vouacapanos aplicados em condição de dose infinita
através de membrana sintética de celulose. ................................................................ 112
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 22
OBJETIVOS ........................................................................................................................ 26
CAPÍTULO I: SELEÇÃO, OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE
SUCUPIRA ......................................................................................................................... 27
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 27
1.1 Pterodon pubescens Benth.................................................................................. 27
1.2 Estudos envolvendo a avaliação das atividades farmacológicas da Sucupira ............ 28
2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 33
3 MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................................... 33
3.1 Material Vegetal...................................................................................................... 33
3.2 Extração .................................................................................................................. 34
3.3 Métodos Cromatográficos ....................................................................................... 34
3.3.1 Cromatografia em Camada Delgada .................................................................. 34
3.3.2 Cromatografia em Coluna Filtrante ................................................................... 34
3.3.3 Análise dos constituintes químicos por CG-EM ................................................ 34
3.3.4 Análise dos constituintes químicos por CLAE-DAD ......................................... 35
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 35
4.1 Extração .................................................................................................................. 35
4.2 Métodos cromatográficos ........................................................................................ 36
4.2.1 Cromatografia em camada delgada ................................................................... 37
4.2.2 Cromatografia em Coluna Filtrante ................................................................... 38
4.2.3 Análise dos constituintes químicos por CG-EM ................................................ 38
4.2.4 Análise dos constituintes químicos por CLAE-DAD ......................................... 40
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 40
CAPÍTULO II: MICROENCAPSULAÇÃO DO EXTRATO DE PTERODON PUBESCENS
............................................................................................................................................ 41
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 41
1.1 Microencapsulação ............................................................................................. 41
1.2 Atomização (spray drying) ................................................................................. 44
1.3 Material formador de parede ............................................................................... 46
2 OBJETIVO ....................................................................................................................... 48
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 48
3.1 Purificação da goma do cajueiro .............................................................................. 48
3.2 Microencapsulação.................................................................................................. 50
3.3 Determinação da umidade das microcápsulas .......................................................... 50
3.4 Solubilidade das microcápsulas ............................................................................... 50
3.5 Extração do recheio das microcápsulas e avaliação da eficiência de
microencapsulação ........................................................................................................ 51
3.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) .......................................................... 52
3.7 Determinação da distribuição do tamanho de partículas ........................................... 52
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................. 52
4.1 Purificação da goma do cajueiro .............................................................................. 52
4.2 Microencapsulação, determinação de umidade e rendimento do processo ................ 53
4.3 Solubilidade das microcápsulas ............................................................................... 55
4.4 Extração do recheio das microcápsulas e avaliação da eficiência de
microencapsulação ........................................................................................................ 55
4.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) .......................................................... 62
4.6 Determinação da distribuição do tamanho de partículas ........................................... 64
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................... 65
CAPÍTULO III: DELINEAMENTO DE FORMA FARMACÊUTICA DE USO TÓPICO E
ESTUDO DE ESTABILIDADE .......................................................................................... 66
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 66
1.1 Delineamento de uma forma farmacêutica .......................................................... 66
1.2 Estudo de pré-formulação ................................................................................... 66
1.3 Formas farmacêuticas semissólidas .................................................................... 67
1.4 Estudo da estabilidade de uma forma farmacêutica ............................................. 70
2 OBJETIVOS ..................................................................................................................... 72
3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................................. 72
3.1 Desenvolvimento das formulações .......................................................................... 72
3.1.1 Estudo das bases semissólidas........................................................................... 72
3.1.2 Avaliação da estabilidade das bases semissólidas .............................................. 74
3.1.3 Determinação dos valores de pH ....................................................................... 75
3.1.4 Adição do extrato ativo às bases semissólidas estáveis ...................................... 75
3.2 Estudo de estabilidade ............................................................................................. 76
3.2.1 Etapa I .............................................................................................................. 76
3.2.1.1 Avaliação macroscópica ................................................................................ 77
3.2.1.2 Teste de centrifugação ................................................................................. 77
3.2.1.3 Determinação dos valores de pH ................................................................. 78
3.2.2 Etapa II ................................................................................................................ 78
3.2.2.1 Doseamento dos compostos ativos............................................................... 78
3.2.2.2 Determinação da espalhabilidade ................................................................. 79
3.2.2.3 Determinação da viscosidade....................................................................... 80
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................................ 80
4.1 Desenvolvimento das formulações .......................................................................... 80
4.2 Estudo de estabilidade: Etapa I ................................................................................ 82
4.2.1 Avaliação macroscópica e teste de centrifugação ............................................ 82
4.2.2 Determinação dos valores de pH ..................................................................... 86
4.3 Estudo de estabilidade: Etapa II .......................................................................... 90
4.3.1 Avaliação macroscópica e teste de centrifugação .............................................. 90
4.3.2 Determinação dos valores de pH ....................................................................... 95
4.3.3 Doseamento dos compostos ativos .................................................................... 96
4.3.4 Determinação da espalhabilidade ...................................................................... 98
4.3.5 Determinação da viscosidade .......................................................................... 102
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 106
CAPÍTULO IV: ESTUDOS INICIAIS PARA AVALIAÇÃO DA PERMEAÇÃO
PERCUTÂNEA DO PRODUTO: SELEÇÃO DO LÍQUIDO RECEPTOR ATRAVÉS DA
TÉCNICA DE LIBERAÇÃO PERCUTÂNEA IN VITRO ................................................ 107
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 107
1.1 A pele ................................................................................................................... 107
1.2 Permeação percutânea ...................................................................................... 107
1.3 Permeação percutânea in vitro ............................................................................... 108
2 Objetivos ................................................................................................................. 110
3 Materiais e métodos ................................................................................................. 110
4 Resultados e discussão ............................................................................................. 112
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 113
CAPÍTULO V: ESTUDO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DO EXTRATO BRUTO
DE PTERODON PUBESCENS BENTH. MICROENCAPSULADO COM GOMA DO
CAJUEIRO COMO MATERIAL DE PAREDE ATRAVÉS DE MODELO
EXPERIMENTAL DE ÚLCERA INDUZIDA POR ETANOL. ......................................... 114
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 114
1.1 Atividades farmacológicas da espécie vegetal Pterodon pubescens Benth. ............ 114
1.2 O processo inflamatório e seu tratamento .............................................................. 115
1.3 Avaliação de atividade anti-ulcerogência em modelo experimental de úlcera
induzida por etanol...................................................................................................... 116
2 OBJETIVO ..................................................................................................................... 116
3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................................ 117
3.1 Animais ................................................................................................................ 117
3.2 Atividade anti-ulcerogênica em modelo experimental de úlcera induzida por etanol
................................................................................................................................... 117
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................... 117
5 CONCLUSÃO ................................................................................................................. 119
CONCLUSÃO ................................................................................................................... 120
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................ 121
ANEXO 1: AUTORIZAÇÃO DE ACESSO E DE REMESSA DE COMPONENTE DE
PATRIMÔNIO GENÉTICO .............................................................................................. 136
ANEXO 2: CERTIFICADO - COMISSÃO DE ÉTICA NO USO DE ANIMAIS CEUA-
UNICAMP......................................................................................................................... 137
ANEXO 3: DECLARAÇÃO DE DIREITOS AUTORAIS ................................................. 138
22
INTRODUÇÃO
A utilização de plantas medicinais é tão antiga quanto a raça humana, afinal as plantas
fazem parte da vida do homem desde os seus primórdios e a preparação de medicamentos
fitoterápicos sempre fez parte da prática farmacêutica, sendo inegável sua importância nos
diversos estágios de desenvolvimento da sociedade. Sua utilização baseia-se principalmente
na sabedoria popular e não acontece de maneira isolada, mas sim inserida num contexto
histórico. Com o desenvolvimento da indústria farmoquímica no século XX a preferência
terapêutica voltou-se para os produtos sintéticos, porém o interesse por fitoterápicos foi
renovado devido à transformação da fitoterapia em uma corrente na prática médica
(FERREIRA, 2002).
Plantas e extratos vegetais foram e continuam sendo de grande relevância, tendo em
vista a utilização de substâncias ativas como protótipos para o desenvolvimento de fármacos e
como fonte de matérias-primas farmacêuticas, tanto para a obtenção de substâncias ativas
isoladas como para a obtenção de adjuvantes ou ainda a obtenção de medicamentos
fitoterápicos, elaborados exclusivamente à base de extratos vegetais (SIMÕES; SCHENKEL,
2002). Entre as razões que justificam o interesse crescente por fitoterápicos estão a escassez
de novas descobertas pelos processos tradicionais de síntese química e maior aceitabilidade
devido à mudança do perfil do consumidor, que atualmente tem dado preferência aos produtos
naturais.
Segundo a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), para a transformação
de uma planta em medicamento deve-se visar à preservação da integridade química e
farmacológica do vegetal, garantindo a constância de sua ação biológica e a segurança de sua
utilização, além de valorizar o seu potencial terapêutico. Portanto, a produção de
medicamentos fitoterápicos requer estudos prévios envolvendo aspectos botânicos,
agronômicos, químicos, estudos farmacológicos e toxicológicos, além do desenvolvimento de
metodologias analíticas e tecnológicas para garantir a padronização do produto (BRASIL,
2011).
O trabalho com fitoterápicos envolve, além da preocupação com a sua eficácia e
cultivo da matéria prima, cautela quanto ao processamento adequado das plantas, já que o
manejo inadequado pode ocasionar destruição de moléculas, implicando na perda da atividade
farmacológica. Como exemplo, pode-se citar o uso do aquecimento excessivo na secagem da
planta ou na evaporação do solvente empregado na extração dos princípios ativos. A vida útil
23
do extrato também é limitada pela exposição ao oxigênio, à umidade e à luminosidade
(HEINRICH et al., 2007). Entre as alternativas que podem ser utilizadas para preservar as
características do material vegetal, destaca-se a encapsulação, que pode ser resultante da
produção de lipossomas, microemulsões, micro e nano partículas poliméricas, que além de
prolongarem o tempo de estocagem de produtos alimentícios e farmacêuticos, são capazes de
compartimentalizar o fármaco em ambientes restritos, de forma a direcioná-lo para regiões
específicas, favorecendo sua interação com diferentes sistemas biológicos, muitas vezes
aumentando sua eficácia e reduzindo possíveis efeitos indesejados (VASIR et al., 2003;
RODRIGUES, 2004; GRANADA et al., 2007; OLIVEIRA e PETROVICK, 2010).
A espécie vegetal, Pterodon pubescens Benth., conhecida popularmente como
Sucupira, é utilizada no tratamento de reumatismo, dores de garganta, problemas da coluna,
além de tônico (fortificante) e depurativo (CARVALHO et al., 1999). Estudos fitoquímicos
com o gênero Pterodon revelaram a presença de alcalóides, isoflavonas e diterpenos. Alguns
autores têm sugerido que o esqueleto vouacapânico de diterpernos furânicos esteja envolvido
com as propriedades anti-iflamatórias do óleo dos frutos de P. pubescens (MAHAJAN e
MONTERIO, 1973; FASCIO et al., 1975; NUNAN et al., 1982; CAMPOS et al., 1994;
CARVALHO et al., 1999; SILVA et al., 2004, SPINDOLA et.al., 2009).
O desenvolvimento deste trabalho foi motivado por resultados de estudos iniciados no
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) /
UNICAMP, que comprovaram as atividades anticâncer in vitro, antinociceptiva e anti-
inflamatória da espécie em ensaios em modelos animais (DENNY, 2002; SPINDOLA, 2006 e
2010; SERVAT, 2010; GRANDO, 2013) e forneceram dados sobre a estabilidade de seu
extrato vegetal, avaliando a influência da técnica de microencapsulação na estabilidade do
extrato bruto e de compostos isolados, por meio de estudos de monitoramento químico.
Estudos de estabilidade envolvendo o extrato bruto de P. pubescens e seus compostos
microencapsulados através da técnica de atomização indicaram que houve a preservação da
atividade farmacológica do extrato vegetal microencapsulado durante o período de 180 dias,
uma melhoria significativa se comparado ao extrato bruto livre, que apresentou enrijecimento
logo após os 30 primeiros dias, impossibilitando seu uso (SERVAT, 2010; SERVAT et al.,
2012). A atomização (spray drying) é uma das técnicas mais antigas empregadas no processo
de obtenção de microcápsulas. Ela permite a obtenção de partículas entre 5 e 500 µm, de alta
qualidade, o equipamento utilizado, spray dryer, possui fácil operação, boa eficiência, ampla
aplicabilidade e permite o processamento de várias matérias-primas, com rapidez e custo
relativamente baixo (FILKOVÁ e MUJUMDAR, 1995; WENDEL e ÇELIK, 1998). Devido
24
ao pequeno tempo de retenção dos produtos na câmara de secagem, tornou-se o principal
equipamento a ser utilizado para materiais que apresentam sensibilidade ao calor, como
alimentos e materiais de origem biológica, dentre eles os extratos e os produtos oriundos de
plantas, corantes, microrganismos, produtos com leveduras, enzimas e proteínas
(RODRIGUES, 2004).
A microencapsulação consiste em um processo onde um material formador de parede
é utilizado para recobrir um recheio, que pode ser composto por partículas de sólidos,
gotículas de líquidos ou materiais gasosos, com o objetivo de isolar a substância de interesse,
protegendo-a das condições adversas do meio e/ou outros ingredientes presentes nas
formulações, aumentando assim a vida útil do produto, além de apresentar outras vantagens,
como facilidade de transporte e de armazenamento (MOREIRA, 2007; OLIVEIRA e
PETROVICK, 2009; SERVAT, 2010). O produto resultante desse processo pode ser
empregado em formulações sólidas, suspensões e outras formas farmacêuticas, sendo que a
liberação do conteúdo interno das microcápsulas pode ocorrer através de mecanismos como
aquecimento, biodegradação, difusão, dissolução, mudança de pH ou ruptura mecânica
(WHORTON, 1995).
A seleção do material de revestimento é determinante para as propriedades físicas e
químicas das cápsulas, o mesmo deve ser capaz de formar filme coesivo com o núcleo e
quimicamente compatível, além de ser adequado à técnica que será utilizada. Geralmente
utilizam-se polímeros hidrofílicos, hidrofóbicos ou uma combinação de ambos (AGNIHOTRI
et al., 2012). O material de parede utilizado neste trabalho é a goma do cajueiro, goma natural
proveniente do Cajueiro (Anacardium occidentale L.), planta originária do Brasil,
praticamente encontrada em todo o nordeste do país. Este material possui aspecto de resina
amarelada solúvel em água, baixa viscosidade em solução e capacidade emulsificante, sendo
um biopolímero versátil, biodegradável e seguro para uso humano (RODRIGUES, 2004;
KUMAR et al., 2012),
A opção pela veiculação do material vegetal proveniente de P. pubescens em
formulações semi-sólidas se deu pela possibilidade de desenvolvimento de um produto com
maior facilidade de aplicação, melhor aceitação do paciente, consequentemente maior adesão
ao tratamento, menor custo, maior facilidade de acesso e redução de efeitos sistêmicos.
A quantidade de extrato vegetal utilizada nas formulações foi de 2,5%, definida de
acordo com levantamento realizado no Formulário de Fitoterápicos da Farmacopéia Brasileira
(BRASIL, 2011), onde extratos vegetais são utilizados em concentrações em torno de 1 a 5%,
incluindo cremes e géis fitoterápicos contendo extratos obtidos de plantas como Aloe vera
25
(L.) Burman f (Babosa), Arnica montana L.(arnica), Calendula officinales L. (calêndula) e
Hamamelis virginiana, atualmente distribuídos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) de
diversas cidades do Estado de São Paulo (BRASIL, 2012). A literatura também apresenta a
utilização de extrato vegetal na faixa de 2 a 5%, sendo possível verificar comprovação de
atividade farmacológica utilizando a concentração média de 2,5% em formulações
semissólidas (CAMELO, 2010; COSTA, 2010; ALONSO, 2011; SOUSA, 2012).
O estudo de estabilidade das formulações representa uma parte crucial para o
desenvolvimento de um novo produto, seja ele um medicamento ou um cosmético, ele é um
parâmetro essencial no processo de controle de qualidade e possíveis instabilidades das
formulações, podendo modificar os três requisitos essenciais: qualidade, eficácia e segurança
de produto farmacêutico ao longo do seu prazo de validade (VICENTINI et al., 2011).
Considerando a instabilidade das formulações semissólidas, inicialmente propostas
neste trabalho, foi realizado estudo de avaliação anti-ulcerogência como alternativa ao uso
tópico. A utilização das microcápsulas por via oral corrobora a base racional para o uso do
extrato na medicina popular e os resultados obtidos neste trabalho incentivam o
desenvolvimento de novos produtos provenientes desta espécie vegetal. As microcápsulas de
P. pubescens obtidas utilizando goma do cajueiro como material de parede foram avaliadas
farmacologicamente em modelo experimental de úlcera induzida por etanol em ratos, onde foi
possível verificar que sua administração oral não causa danos na mucosa gástrica por meio de
resultados de atividade anti-ulcerogênica.
O presente trabalho encontra-se dividido em capítulos, a saber:
Capítulo I: Seleção, Obtenção e Caracterização do extrato de sucupira.
Capítulo II: Microencapsulação do Extrato de Pterodon pubescens.
Capítulo III: Delineamento de forma farmacêutica de uso tópico e estudo de
estabilidade.
Capítulo IV: Estudos iniciais para avaliação da permeação percutânea do produto:
seleção do líquido receptor através da técnica de liberação percutânea in vitro.
Capítulo V: Estudo da atividade farmacológica do extrato bruto de Pterodon
pubescens Benth. microencapsulado com goma do cajueiro como material de parede
através de modelo experimental de úlcera induzida por etanol.
Essa estrutura tem a finalidade de facilitar a compreensão das etapas realizadas e a publicação
dos resultados obtidos.
26
OBJETIVOS
Propor formulação para uso tópico contendo extrato de Pterodon pubescens Benth.
(Sucupira), avaliar suas condições de estabilidade e determinar prazo de validade para o
produto obtido.
Com esta finalidade, os seguintes objetivos específicos foram definidos:
Selecionar frutos de Sucupira;
Obter o extrato bruto do material vegetal;
Caracterizar o extrato bruto diclorometano de P. pubescens;
Microencapsular o extrato bruto de P. pubescens utilizando a goma do cajueiro como
material de parede, através da técnica de atomização;
Avaliar a qualidade das microcápsulas obtidas, rendimento e morfologia;
Desenvolver formulações semissólidas, do tipo emulsão e gel, e selecionar as que
apresentassem melhor estabilidade;
Avaliar a estabilidade preliminar de bases estáveis contendo 2,5% de extrato bruto
livre e microencapsulado de Ptedoron pubescens;
Avaliar a estabilidade das formulações que apresentassem melhores resultados no
estudo preliminar durante um período de 180 dias;
Realizar teste de liberação percutânea e definir o líquido receptor adequado para a
avaliação da permeação percutânea da formulação que apresentasse melhor resultado
no estudo de estabilidade.
27
CAPÍTULO I: SELEÇÃO, OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DO EXTRATO DE
SUCUPIRA
1 Introdução
1.1 Pterodon pubescens Benth.
O gênero Pterodon compreende quatro espécies nativas do Brasil: P. abruptus Benth.,
P. apparucuri Pedersoli, P. pubescens Benth., (P. emarginatus Vogel) e P. polygalaeflorus
Benth. O estudo dessas espécies foi iniciado pela comprovação da atividade anti-cercariana do
óleo do fruto de P. pubescens (MORS et al., 1967), estando o composto 14,15-
epoxigeranilgeraniol e alguns derivados, associados com atividade protetora contra a
penetração de cercárias de Schistosoma mansoni, quando aplicados topicamente na cauda de
ratos (DOS SANTOS FILHO et al., 1972).
A espécie vegetal, Pterodon pubescens Benth. - sinonímia botânica Pterodon
emarginatus Vog. – conhecida popularmente como sucupira, sucupira-branca, faveiro, fava-
de-sucupira, ou sucupira-lisa, é uma árvore da família das Leguminosae-Papillonoideae
encontrada no cerrado brasileiro, principalmente nos estados de Minas Gerais, São Paulo,
Goiás e Mato Grosso do Sul. Esta espécie atinge de 8-16 metros, com tronco de 30-40
centímetros de diâmetro; possui folhas pinadas, com 20-36 folíolos de 3-4 centímetros de
diâmetro (LORENZI, 1998). A morfologia de seus frutos é eurispérmica, variando entre
ovóide, oblonga, elíptica e oblongo-elíptica; e a coloração da testa varia de marrom-claro a
marrom-escuro, quase negro (FERREIRA, 2001; SERVAT, 2010).
Seu uso popular, relatado em um estudo etnobotânico em 30 cidades do interior de
Minas Gerais, demonstra a utilização no tratamento de reumatismo, dores de garganta,
problemas da coluna, como tônico (fortificante) e depurativo (CARVALHO et al., 1999).
Estudos fitoquímicos com o gênero Pterodon revelaram a presença de alcalóides,
isoflavonas e diterpenos. Diterpernos furânicos foram isolados (MAHAJAN e MONTERIO,
1973; FASCIO et al., 1975; CAMPOS et al., 1994) e alguns autores têm sugerido que o
esqueleto vouacapânico de diterpernos furânicos esteja envolvido com as propriedades anti-
inflamatórias do óleo dos frutos de P. pubescens (NUNAN et al., 1982; CARVALHO et al.,
1999; SILVA et al., 2004, SPINDOLA et al., 2009).
28
1.2 Estudos envolvendo a avaliação das atividades farmacológicas da Sucupira
COELHO et al. (2001) realizaram estudos pré-clinicos e demonstraram a atividade do
extrato hidroalcoólico das sementes de P. pubescens em modelo de artrite experimental, além
de ausência de toxicidade subaguda.
Denny (2002) descreveu as atividades antinflamatória e antinociceptiva do óleo bruto
extraído de sementes de Pterodon pubescens Benth. A partir deste pode identificar a fração
ativa através de fracionamentos biomonitorados. Nesse trabalho observou que o efeito anti-
inflamatório foi mantido no edema de pata induzido por carragenina em ratos
adrenalectomizados, sugerindo, dessa forma, que sua ação pode ser independente da liberação
de corticóides endógenos. A atividade antiedematogênica foi confirmada quando avaliada em
modelos de edema de orelha induzido pela aplicação tópica de óleo de cróton, sendo esse
modelo utilizado com freqüência para demonstrar a ação tópica de novas drogas anti-
inflamatórias. Ainda, o óleo das sementes demonstrou atividade antinociceptiva em modelo
de contorções abdominais induzidas por ácido acético e teste da placa-quente, apresentando
toxicidade após 14 dias de administração na dose considerada efetiva nos modelos in vivo,
evidenciada por hipoglicemia, diminuição do peso corporal e por análises
anatomohistopatológicas. O óleo de P. pubescens e uma fração ativa contendo
majoritariamente o composto 6α-acetoxi 7β-hydroxy-vouacapano apresentaram atividade
anti-proliferativa em células tumorais humanas, ação concentração-dependente, apresentando
citotoxicidade em concentrações superiores a 250 µm/mL. A fração ativa apresentou uma
curva de concentração bastante semelhante à do meloxicam, confirmando a hipótese de que as
prostaglandinas produzidas pela ciclooxigenase-2 podem estar relacionadas ao crescimento
tumoral.
Silva et al. (2004) identificaram o composto ácido 6α,7β-dihidroxivouacapano-17-
óico (Figura 1.1) na fração que exibiu atividade anti-edematogênica nos ensaios de edema de
pata induzido por carragenina ou edema de orelha induzido por óleo de cróton, sugerindo o
envolvimento desse composto na atividade anti-inflamatória das frações obtidas do óleo das
sementes de P. pubescens.
29
Figura 1.1 Estrutura química do composto ácido 6α,7β-dihidroxivouacapano-17-óico.
O envolvimento de mecanismos inibitórios tanto centrais como periféricos na
atividade antinociceptiva de extratos das sementes de P. pubescens foi sugerida por Coelho et
al. (2005).
Spindola (2006) descreveu a atividade antinociceptiva do extrato bruto diclorometano
utilizando diferentes modelos experimentais. Desse extrato foram obtidas frações que foram
avaliadas em modelos de nocicepção, permitindo identificar uma fração ativa. Nesse trabalho,
ainda foi possível determinar os componentes geranilgeraniol e 6-hidroxi, 7-
acetoxivouacapano como os componentes majoritários envolvidos na atividade
antinociceptiva. Por fim, foi sugerida a não participação de receptores opióides na atividade
antinociceptiva da fração ativa purificada.
Calixto et al. (2007) demonstraram a atividade antiplaquetária do composto
geranilgeraniol (Figura 1.2) isolado do óleo das frutas de P. pubescens, ação essa atribuída à
inibição da enzima ciclooxigenase.
Figura 1.2 Estrutura química do composto geranilgeraniol.
Menna-Barreto et al. (2008) relataram a atividade contra T. cruzide das frações e do
composto geranilgeraniol obtidos do extrato etanólico de P. pubescens. No mesmo ano
Cardoso et al. demonstraram a atividade supressora de linfócitos T e B, relacionada à
atividade anti-inflamatória do extrato etanólico.
30
Ainda no estudo da atividade antinociceptiva, Dutra et al. (2008) relataram a ação do
óleo essencial e das frações obtidas das sementes de P. emarginatus. O óleo essencial, as
frações hexânicas e butanólicas foram ativas no ensaio das contorções abdominais induzidas
por ácido acético. Óleo essencial e fração metanólica mostraram-se efetivos em ambas as
fases do ensaio da formalina, enquanto a fração hexânica apresentou efeito no teste da placa
quente.A atividade anti-proliferativa do extrato bruto etanólico das sementes de P. pubescens
contra uma linhagem de melanoma humano foi demonstrada por Vieira et al. (2008). O
diterpeno vouacapano-6α, 7β, 14β, 19-tetraol (Figura 1.3), isolado do extrato, demonstrou
acentuada atividade citotóxica, sugerindo ser um promissor agente anti-proliferativo, por
induzir apoptose.
Figura 1.3 Estrutura química do composto vouacapano-6α, 7β, 14β, 19-tetraol.
Spindola et al. (2009) relataram a atividade anti-proliferativa de vouacapanos isolados
do extrato diclorometano das sementes de P. pubescens, indicando a seletividade desses
compostos para a linhagem de próstata testada. Paralelamente, Euzébio et al. (2009)
demonstraram a atividade anti-proliferativa do diterpeno furânico ácido 6α,7β-
dihidroxivouacapano-17-óico, isolado do extrato hexânico dos frutos de P. polygalaeflorus,
e de seus derivados lactônicos obtidos por semisíntese, com destaque para o composto 6α-
hidroxivouacapano-7β,17β-lactona (Figura 1.4) que apresentou alta seletividade para
linhagens de ovário testadas. Constatou-se que a presença de hidroxila livre no carbono 6 e do
anel lactônico 7β,17β são importantes para a atividade anti-proliferativa desses compostos.
31
Figura 1.4 Estrutura química do composto 6α-hidroxivouacapano-7β,17β-lactona.
Dutra et al. (2009a) demonstraram a atividade cicatrizante da fração hexânica obtida
das sementes de P. emarginatus no tratamento de queimaduras cutâneas em coelhos. Além da
fração hexânica, rica no composto ácido 6α,7β-dihidroxivouacapano-17-óico, foi
demonstrada a ação cicatrizante do óleo essencial, possivelmente atribuída aos compostos
biciclogermacreno, trans-cariofileno e α-humuleno (Figura 1.5).
Figura 1.5 Estrutura química dos compostos: A) biciclogermacreno, B) trans-cariofileno e C)
α-humuleno.
O efeito antimicrobiano do óleo essencial obtido das sementes de P. emarginatus
frente ao Staphylococcus aureus e a atividade das frações hexânica e butanólica contra formas
promastigotas de Leishmania amazonensis foi relatada por Dutra et al. (2009b).
Em 2010, Spindola deu sequência aos seus estudos avaliando as atividades
antinociceptiva e antitumoral de compostos isolados do extrato bruto diclorometano de
sementes da Pterodon pubescens Benth. Os resultados (SPINDOLA 2010; 2011)
determinaram importantes aspectos relacionados à farmacodinâmica destes compostos,
demonstrando potencial quimioterápico em estudos de atividade antiproliferativa in vitro em
células tumorais humanas, atribuído aos compostos 6α acetoxi-7β-hidroxivouacapano, éster
32
6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato de metila e 6α,7β-diidroxivouacapano-17β-metilenol,
contra diversas linhagens tumorais, com ênfase na atividade antitumoral específica para a
linhagem de próstata (PC-3), sendo a viabilidade celular avaliada pelo ensaio de
sulforrodamina B (SRB). Os compostos geranilgeraniol e éster 6α,7β-diidroxivouacapano-17β
oato de metila também foram avaliados para seu potencial quimioterápico em estudos in vivo
utilizando o modelo de Tumor Sólido de Ehrlich na pata de camundongos. Foram avaliados
ainda os mecanismos da modulação antinociceptiva atribuída aos compostos geranilgeraniol e
éster 6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato de metila através de diferentes modelos
experimentais in vivo: contorções abdominais induzidas por ácido acético, teste da capsaicina,
teste do glutamato e teste da placa quente.Os mecanismos da ação antinociceptiva receptor-
específica atribuída aos compostos geranilgeraniol e éster 6α,7β-diidroxivouacapano-17β oato
de metila foram estudados através de diferentes modelos experimentais in vivo: alodinia
induzida por adjuvante completo de Freund, hiperalgesia induzida por carragenina e bloqueio
de receptores específicos no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético,
revelando principalmente atividade relacionada a receptores imidazólicos e serotonérgicos.
Spindola et al. (2011) sugeriram o efeito sinérgico existente entre os compostos ativos
Geranilgeraniol e 6α,7β-dihidroxivouacapan0-17β-oato de metila, evidenciado pela
similaridade nas doses efetivas apresentadas para os compostos isolados e o extrato bruto.
Servat (2010) desenvolveu estudos de estabilidade das amostras obtidas do extrato
bruto diclorometano de P. pubescens e da mistura dos isômeros éster 6α-hidroxi-7β-acetoxi-
vouacapano-17β-oato de metila e éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila.
Nesse trabalho também foi demonstrado que a atividade antinociceptiva destes compostos
estava relacionada mais à dor de origem neurogênica do que inflamatória. Essa mistura de
isômeros apresentou especificidade para as linhagens de ovário (NCI-ADR/RES) e mama
MCF-7 (hormônio-dependentes) na atividade anticâncer in vitro. Após o estudo de
estabilidade prolongada (180 dias) tanto o extrato bruto quanto a mistura de isômeros
microencapsulados (por atomização) preservaram a atividade demonstrada inicialmente. Já o
extrato bruto livre apresentou enrijecimento logo no primeiro mês, o que impossibilitou a
manipulação do mesmo. Os isômeros livres mantiveram a atividade antitumoral, entretanto,
após o 180º dia houve um aumento da dose efetiva (SERVAT et al., 2012).
Pereira et al. (2011) determinaram que a fração terpênica da espécie induz a apoptose
de linhagens de leucemia K562 por modulação do gene de expressão. Moraes et al. (2012)
confirmaram que os triterpenos estão envolvidos no efeito anti-inflamatório do extrato
etanólico da espécie Pterodon emarginatus Vogel.
33
Estudos envolvendo a avaliação do extrato e da fração hexânica do extrato etanólico
dos frutos de Pterodon pubescens em modelos de pleurite induzida por carragenina e modelo
de artrite induzida por adjuvante completo de Freund em ratos apresentaram atividade anti-
inflamatória em ambos modelos e ausência de toxicidade, fornecendo uma base racional para
o uso do extrato de sucupira na medicina popular, de acordo com Hoscheid et al. (2013).
Grando (2013) realizou estudos comparando o extrato aquoso e o extrato
diclorometano de P. pubescens. A atividade farmacológica foi observada com o uso de
modelos de contorções abdominais induzidas por ácido acético, lambedura de pata induzida
por formalina e hiperalgesia e edema de pata induzidos por carregenina, sendo possível
observar que o extrato diclorometano apresentou melhor eficácia na avaliação do efeito
antinociceptivo e também atividade antiartrite reumatóide, evidenciadas pela redução do
índice de artrite, índice de alodína e diminuição do número de linfócitos. Também foi
observado que o tratamento ao longo de 14 dias não interferiu nas funções renais e hepáticas
dos animais.
2 Objetivos
Selecionar os frutos, obter o extrato bruto diclorometano de P. pubescens e
caracterizá-lo através de técnicas cromatográficas.
3 Material e métodos
3.1 Material Vegetal
Inicialmente frutos de P. pubescens foram coletadas na cidade de São Carlos (SP), sob
a supervisão do Prof. Dr. Jorge Yoshio Tamashiro do departamento de Botânica do Instituto
de Biologia (IB) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). A exsicata (UEC
1402) foi depositada no Herbarium do IB-UNICAMP. O grupo de pesquisa do CPQBA
avaliou também frutos de outras localidades, coletados em Ponto Chique (MG), Sorriso (MT)
e Bom Jesus da Lapa (BA) (SERVAT, 2010). Devido à disponibilidade imediata, foram
utilizados frutos provenientes de Ponto Chique para a obtenção do extrato bruto
diclorometano.
Este trabalho possui autorização de acesso e remessa de amostra de componente do
patrimônio genético (CGEN) sob o nº 010292/2015-2.
34
3.2 Extração
A obtenção do extrato bruto diclorometano de Sucupira foi realizada segundo
Spindola (2006). Os frutos limpos de P. pubescens foram moídos com gelo seco em
liquidificador Waring Commercial® Laboratory Blender e foi realizada a extração utilizando-
se diclorometano como solvente extrator, por três vezes, em períodos de uma hora e meia
cada, na proporção de 5:1 (solvente: material vegetal) em agitador oscilatório a temperatura
ambiente. O extrato foi filtrado em funil analítico, contendo algodão e sulfato de sódio anidro.
Em seguida foi concentrado sob vácuo, em rotaevaporador Buchi RE 215.
3.3 Métodos Cromatográficos
3.3.1 Cromatografia em Camada Delgada
As cromatografias em camada delgada (CCD) foram efetuadas em cromatofolhas de
alumínio com silicagel (Merck® artigo 5554). Como eluentes, foram utilizadas misturas de
acetato de etila/ n-hexano na proporção 60:40, ambos em grau P.A. A detecção visual dos
compostos foi obtida após pulverização das placas com solução de anisaldeído, composta pela
mistura de ácido acético: ácido sulfúrico: anisaldeído (50:1:0,5), seguida de aquecimento em
estufa a 100ºC durante 1 minuto (SPINDOLA, 2006).
3.3.2 Cromatografia em Coluna Filtrante
As cromatografias do tipo coluna filtrante foram realizadas em funil de placa porosa,
utilizando-se Silicagel 60® (Merck, 0,063-0,200 mm) como fase estacionária e gradientes de
n-hexano e acetato de etila como fase móvel (SERVAT, 2010). As frações recolhidas durante
o processo foram avaliadas por CCD, conforme metodologia descrita no item 3.3.1. Ao final
do processo as amostras com perfis semelhantes foram agrupadas e concentradas sob vácuo
em rotaevaporador Buchi RE 215.
3.3.3 Análise dos constituintes químicos por CG-EM
As amostras foram diluídas em 1 mL de acetato de etila e analisadas por cromatografia
a gás capilar acoplada a um detector de massas. O equipamento utilizado foi GC Hewlett
Packard 5975, série II, diretamente acoplado a um detector seletivo de massas Hewlett
Packard 6890, equipado com coluna de sílica fundida WCOT, 30 m x 0.25 mm, DB-1 ou DB-
5, ou similares. As condições de análise foram: temperatura de injeção: 250°C, temperatura
do detector: 300°C, programa de temperatura: 40°C (2min) -240°C, 5°C/min, 240-300°C,
35
10°C/min, com ou sem razão de split 1:100, gás de arraste He 0,7 bar, 1mL/min (SERVAT,
2010). O tempo total de análise foi de 1 hora e 30 minutos.
3.3.4 Análise dos constituintes químicos por CLAE-DAD
As amostras foram diluídas em acetonitrila (grau cromatográfico) e posteriormente
filtradas em membrana de 0,45 µm antes da injeção no equipamento de cromatografia líquida
de alta eficiência. O equipamento utilizado foi o cromatógrafo Shimadzu acoplado a detector
de UV com arranjo de diodos Shimadzu, software Class VP - 5.03 e equipado com coluna do
tipo Luna 5µ CN - Phenomenex. A metodologia empregada foi baseada em Borges et al
(2013) e as condições de análise desenvolvidas foram: volume de injeção: 20 µL; vazão de
fluxo: 1mL/min; forno: 30ºC; comprimento de onda: 215 nm; fase móvel utilizada: água /
acetonitrila (70:30 v/v). O tempo total de análise foi de 30 minutos.
4 Resultados e Discussão
4.1 Extração
Para o processo de extração foram utilizados 2,480 kg de frutos de Sucupira,
quantidade calculada baseada em todos os testes que foram realizados ao longo do projeto,
constituindo-se, portanto, um lote único de extrato vegetal, excluindo-se as possibilidades de
erros provenientes de amostras de procedência e processos divergentes, além de variabilidade
na composição decorrente da influência de sazonalidade, por exemplo. O rendimento do
processo foi de 46,6% (p/p), compatível com o esperado, cerca de 40%, conforme estudos
realizados anteriormente (SERVAT, 2010). A figura 1.6 apresenta os frutos de Sucupira.
Figura 1.6 Frutos de P. pubescens
36
4.2 Métodos cromatográficos
Os compostos presentes no extrato vegetal bruto da espécie P. pubescens relacionados
à atividade farmacológica estão apresentados na figura 1.7. Na figura verificam-se os nomes
dos compostos e também a razão massa/carga (m/z) pelos quais os mesmos são identificados
nos resultados de cromatografia a gás acoplada a detector de massas.
Figura 1.7 Compostos relacionados à atividade farmacológica da sucupira
Nesse trabalho foram monitorados especificamente os compostos vouacapânicos,
constituintes majoritários dos frutos provenientes de MG. Esses compostos estão relacionados
às atividades antinoceptiva e anti-inflamatória, prováveis alvos para o produto desenvolvido.
A quantidade de geranilgeraniol nessas amostras é muito pequena, sendo muitas vezes não
detectada pela técnica cromatográfica utilizada. A baixa porcentagem desse último composto
não compromete a atividade farmacológica do extrato vegetal (SERVAT, 2010).
Os isômeros de posição m/z 404 - (A) éster 6α-hidroxi-7β-acetoxi-vouacapano-17β-
oato de metila e m/z 404 – (B) éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila,
monitorados nas análises executadas neste trabalho, são referenciados ao longo do texto como
“vouacapanos”.
37
4.2.1 Cromatografia em camada delgada
A técnica de cromatografia em camada delgada foi utilizada como análise preliminar
qualitativa para garantir a presença dos compostos de interesse no extrato vegetal, que foi
posteriormente devidamente caracterizado por CG-EM. O material vegetal proveniente do
processo de extração foi aplicado na placa de sílica junto aos padrões, amostras de compostos
puros isolados pelo grupo de pesquisa do CPQBA, e revelados após a corrida com solução de
anisaldeído (figura 1.8).
Figura 1.8 Placa de CCD para avaliação do extrato vegetal obtido.
A placa de CCD apresentada na figura 1.8 recebeu a aplicação de 5 padrões, sendo os
compostos geranilgeraniol (m/z 288) e vouacapanos (m/z 404) de interesse particular. Os
padrões identificados por A, B e C são outros compostos presentes no extrato, que estão
sendo estudados e caracterizados pelo grupo de pesquisa do CPQBA/UNICAMP, estes
compostos nesse momento auxiliaram somente quanto à informação qualitativa, sem maiores
interferências e resultados significativos para este projeto. Na placa de sílica aplicou-se o
extrato vegetal obtido em duplicata e aplicou-se também uma última amostra referente ao
extrato proveniente de frutos obtidos na região de São Carlos (SP), o qual possui um perfil
38
diferenciado, rico no composto geranilgeraniol (m/z 288). Na placa é possível verificar a
nítida presença de m/z 404 e indícios de m/z 288.
4.2.2 Cromatografia em Coluna Filtrante
A técnica de cromatografia em coluna filtrante foi utilizada para realizar a separação
dos compostos constituintes do extrato bruto, especificamente para a obtenção dos
vouacapanos, que devidamente isolados e purificados, foram utilizados como padrão nas
análises realizadas.
Para isso utilizou-se 35,05 g de extrato de Sucupira e a proporção de amostra
preparada para fase estacionária na coluna foi de 1:5 (m:m).
Finalizado o processo de separação, foram obtidas 105 frações e de acordo com o
perfil apresentado por cada uma delas nas análises de CCD, as mesmas foram reunidas em 12
grupos (Figura 1.9). Os grupos 6 a 10 apresentaram perfil semelhante aos vouacapanos,
utilizados como padrão. O grupo 7 apresentou os compostos de interesse praticamente
isolados e com isso realizou-se a lavagem desse material com n-hexano e acetato de etila,
remoção do sobrenadante e obtenção de cristais de vouacapanos, que foram quantificados por
cromatografia gasosa com detector de ionização de chama (GC-FID), utilizando as mesmas
condições de análise para CG-EM. O rendimento do processo de obtenção do padrão de
vouacapanos foi de 3,5% e o grau de pureza obtido foi de 94,7%.
Figura 1.9 Cromatografia em camada delgada das frações resultantes do fracionamento do
extrato bruto de Sucupira. A amostra “P” é o padrão dos vouacapanos. Fase móvel: n-
hexano/acetato de etila (40/60); revelador: anisaldeído.
4.2.3 Análise dos constituintes químicos por CG-EM
A análise por CG-EM confirmou as informações previamente obtidas pela análise por
CCD. A figura 1.10, apresenta o cromatograma do extrato vegetal obtido, destacando em “A”
P P
Fração 7
39
a região dos compostos voucapanos e em “B”, mais detalhadamente, os compostos
relacionados à atividade farmacológica que foram monitorados nas próximas etapas.
5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
T i m e - - >
A b u n d a n c e
T I C : E B D C - 1 . D \ d a t a . m s ( * )
3 1 . 5 0 3 2 . 0 0 3 2 . 5 0 3 3 . 0 0 3 3 . 5 0 3 4 . 0 0 3 4 . 5 0 3 5 . 0 00
5
1 0
1 5
2 0
2 5
3 0
3 5
4 0
4 5
5 0
5 5
6 0
6 5
7 0
7 5
8 0
8 5
9 0
9 5
T i m e - - >
A b u n d a n c e
T I C : E B D C - 1 . D \ d a t a . m s ( * )
Figura 1.10 Cromatograma do extrato de P. pubescens, onde (A): região referente a presença
de derivados vouacapânicos; (B): Compostos de interesse,vouacapanos (m/z 404), em
destaque.
A
B
40
4.2.4 Análise dos constituintes químicos por CLAE-DAD
A técnica de cromatografia líquida de alta eficiência permitiu a caracterização do
extrato bruto vegetal conforme cromatograma apresentado na figura 1.10.
Figura 1.11 Cromatograma obtido por CLAE-DAD apresentando em destaque os isômeros
(A) éster 6α-hidroxi-7β-acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila e (B) éster 6α-acetoxi-7β-
hidroxi-vouacapano-17β-oato de metila (tempo de retenção de 17,6 minutos), correspondentes
aos denominados m/z 404 na técnica de CG-EM.
A utilização de duas técnicas cromatográficas diferentes para a análise dos
constituintes químicos do extrato bruto diclorometano de Sucupira permitiu otimizar o tempo
de análise das amostras, reduzindo esse período em cerca de 1 hora e também contornar
dificuldades decorrentes da necessidade de volatilização e estabilidade térmica das amostras
para análise por CG-EM, além da possível presença de água nas mesmas, proveniente das
formulações, que pode afetar sua fase estacionária.
5 Conclusão
O processo de obtenção do extrato bruto diclorometano a partir dos frutos de Pterodon
pubescens apresentou rendimento coerente com o relatado na literatura, cerca de 40%, e foi
possível verificar através das técnicas cromatográficas exploradas neste trabalho que os
principais componentes presentes relacionados à sua atividade farmacológica são os
vouacapanos, o que corresponde ao perfil esperado de acordo com região de coleta dos frutos.
Minutes
0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0
mA
U
0
50
100
mA
U
0
50
100
0.7
86
1.0
56
1.8
90
2.7
63
3.4
00
3.8
98
11
.93
3
14
.76
9
17
.63
2
22
.38
5
DAD-215 nm
mix
mix
Retention Time
41
CAPÍTULO II: MICROENCAPSULAÇÃO DO EXTRATO DE PTERODON
PUBESCENS
1 Introdução
1.1 Microencapsulação
A microencapsulação é um processo onde um material formador de parede é utilizado
para recobrir um recheio (pequenas partículas de sólidos, gotículas de líquidos ou materiais
gasosos),com o objetivo de isolar a substância de interesse, protegendo-a das condições
adversas do meio, como oxigênio, luz e umidade e/ou outros ingredientes presentes nas
formulações, aumentando assim a vida útil do produto, além de apresentar vantagens como
facilidade de transporte e de armazenamento (MOREIRA, 2007; OLIVEIRA e PETROVICK,
2009; SERVAT, 2010). O produto resultante desse processo de secagem por atomização é um
pó, que pode ser empregado em formulações sólidas (comprimidos e cápsulas de gelatina
dura), suspensões e outras formas farmacêuticas (RÉ, 1998). A liberação do conteúdo interno
das microcápsulas pode ocorrer através de mecanismos como aquecimento, biodegradação,
difusão, dissolução, mudança de pH ou ruptura mecânica (WHORTON, 1995).
Essa técnica, além de proteger o conteúdo interno, permite manter um líquido no
interior do núcleo do pó formado; transformar o estado físico das substâncias para melhor
manipulação das mesmas; controlar a liberação do material que se encontra no núcleo,
modificar e melhorar sua liberação em locais específicos de ação (drug delivery system);
retardar alterações que podem resultar em perda de aroma, alteração de cor ou perda de valor
nutricional; separar componentes reativos ou incompatíveis; reduzir a taxa de migração do
material do núcleo para o ambiente externo (por exemplo, por evaporação, que é muito rápida
no caso de compostos de sabor não encapsulados); evitar reações prematuras de um substrato;
mascarar compostos de sabor indesejável; reduzir toxicidade, efeitos colaterais e irritação do
trato gastrointestinal; promover melhor solubilidade do núcleo; aumentar a biodisponibilidade
de fármacos pouco solúveis e melhorar a incorporação em sistemas secos, entre outros
(WHORTON, 1995; RODRIGUES, 2004; MOREIRA, 2007; OLIVEIRA e PETROVICK,
2009; SERVAT, 2010).
As cápsulas podem ser classificadas em nano (0,2 µm), micro (0,2 a 500 µm) ou
macrocápsulas (500 µm), podendo ser do tipo reservatório, onde o núcleo fica concentrado
próximo ao centro, rodeado por um filme contínuo, ou do tipo matriz, onde o núcleo é
42
disperso uniformemente pela matriz, podendo apresentar diferenças no formato e tamanho
dependendo do processo e do polímero utilizados, sendo determinantes na sua liberação e
estabilidade (SALIB, 1997; RÉ, 2000; AGNIHOTRI et al., 2012). As figuras abaixo
apresentam esquemas de microcápsulas contendo diversos tipos de fase interna (Figura 2.1) e
microcápsulas com múltiplo recheio (Figura 2.2).
Figura 2.1 Esquemas de microcápsulas contendo diversos tipos de fase interna
(RODRIGUES, 2004).
43
Figura 2.2 Microcápsulas com múltiplo recheio (RODRIGUES, 2004).
O material que será revestido (núcleo) pode ter sua composição variada e quando
líquido pode inclusive conter materiais dispersos ou dissolvidos. Essa versatilidade na escolha
do material a ser utilizado proporciona flexibilidade e várias formas de se alcançar o efeito
desejado. A seleção do material de revestimento será determinante para as propriedades
físicas e químicas das cápsulas, o mesmo deve ser capaz de formar filme coesivo com o
núcleo, quimicamente compatível e proporcionar propriedades como força, flexibilidade,
impermeabilidade, propriedades ópticas e estabilidade além de ser adequado à técnica que
será utilizada. Geralmente utilizam-se polímeros hidrofílicos, hidrofóbicos ou uma
combinação de ambos (AGNIHOTRI et al., 2012). Materiais comumente utilizados como
encapsulantes incluem carboidratos (amidos, dextrinas, sacarose), celuloses
(carboximetilcelulose, acetilcelulose, metilcelulose, etilcelulose, nitrocelulose), lipídios
(parafina, cera, ácido esteárico, triesterina, monoglicerídeo, óleos, gordura hidrogenada),
proteínas (glúten, caseína, gelatina, albumina), gomas (alginato de sódio, carragena, goma
arábica, goma do cajueiro). Éimportante destacar também outro fator a ser considerado na sua
seleção do material de revestimento: o aspecto econômico (RODRIGUES et al., 1993;
SUAVE, 2006; MOREIRA, 2007; SERVAT, 2010; AGNIHOTRI et al., 2012).
Várias técnicas podem ser utilizadas no processo de microencapsulação e são
divididas em (RISCH e REINECCIUS, 1988; JACKSON e LEE, 1991; SHAHIDI & HAN,
1993):
- Métodos físicos: atomização (spray drying), pulverização em banho térmico, leito
fluidizado, extrusão centrífuga com múltiplos orifícios, co-cristalização e liofilização (freeze
drying);
- Métodos químicos: inclusão molecular e polimerização interfacial;
44
- Métodos físico-químicos: coacervação, separação por fase orgânica, pulverização em
agente formador de reticulação e envolvimento lipossômico.
1.2 Atomização (spray drying)
A atomização (spray drying) é uma das técnicas de secagem mais antigas empregadas,
inicialmente considerada uma tecnologia cara devido ao custo do equipamento, hoje é uma
das mais utilizadas, sendo tida como uma das mais baratas (FILKOVÁ e MUJUMDAR,
1995; WENDEL e ÇELIK, 1998).
A atomização permite a obtenção de partículas entre 5 e 500 µm de alta qualidade
(uniformes e esféricas), possibilidade de secar produtos à pressão atmosférica, equipamento
de fácil operação, boa eficiência, ampla aplicabilidade, permite processamento de várias
matérias-primas, rapidez e custo relativamente baixo (FILKOVÁ e MUJUMDAR, 1995;
WENDEL e ÇELIK, 1998). Devido ao pequeno tempo de retenção dos produtos na câmara de
secagem, tornou-se o principal equipamento a ser utilizado para materiais que apresentam
sensibilidade ao calor, como alimentos e materiais de origem biológica, dentre estes, extratos
e produtos oriundos de plantas, corantes, microrganismos, produtos com leveduras, enzimas e
proteínas (RODRIGUES, 2004). Uma limitação desta técnica é restrição ao material formador
de parede que será utilizado, pois o mesmo deve ser solúvel em água (FANG e BHANDARI,
2010).
A microencapsulação é realizada através da dispersão do material ativo (núcleo) em
solução de revestimento, sendo que a substância de revestimento se encontradissolvida e o
material do núcleo é insolúvel no solvente utilizado. A emulsão ou suspensão do agente
encapsulante e do material ativo é bombeada através de um bico atomizador, na forma de
gotículas (spray), para uma câmara de secagem por onde há a passagem de um fluxo de ar
quente, que promove a remoção do solvente da solução de revestimento, formando deste
modo uma membrana ao redor do material ativo, obtendo-se assim o produto
microencapsulado (SUAVE et al., 2006). O equipamento e o modelo esquemático de um
spray dryer de bancada estão ilustrados na figura 2.3.
45
Figura 2.3 Foto ilustrativa do equipamento (A) e do modelo esquemático de spray dryer de
bancada (B, adaptado de VALDUGA et al., 2003), utilizado na produção das microcápsulas
(SERVAT, 2010).
Mais detalhadamente, verifica-se que a evaporação superficial da gotícula conduz à
formação de uma camada de material seco externa. Através desta camada, o líquido situado
no interior da gotícula propaga-se para o exterior. Dependendo da elasticidade e da
permeabilidade da crosta, serão produzidos distintos materiais secos como esferas intactas,
com superfície imperfeita ou fragmentada, sólidas ou ocas (RANKELL et al., 2001). A figura
2.4 apresenta esquematicamente a formação da microcápsula.
46
Figura 2.4 Formação da microcápsula através da técnica de atomização (OLIVEIRA e
PETROVICK, 2009).
1.3 Material formador de parede
A seleção de um polímero adequado à formação de microcápsulas depende das
propriedades químicas e físicas do conteúdo interno, do processo utilizado e das propriedades
finais desejáveis do produto obtido. A retenção do recheio pode ser alterada por fatores como
massa molecular, conformação, função química, espessura e área superficial da parede e
estado físico do encapsulado (GOUBET et al., 1998). O material de parede selecionado deve
possuir boas propriedades emulsificantes, ser um bom formador de filme, ter baixa
47
viscosidade mesmo em soluções com alto teor de sólidos, apresentar baixa higroscopicidade,
baixo custo, não possuir sabor desagradável, ser estável e oferecer boa proteção ao ingrediente
encapsulado (SHAHIDI e HAN, 1993).
Entre os diferentes materiais que podem ser utilizados para esta finalidade destacam-se
as gomas. Gomas podem ser definidas genericamente como substâncias poliméricas que, em
solvente ou agente de inchamento apropriado e mesmo a baixas concentrações, são capazes de
formar dispersões, soluções ou géis. São substâncias incolores, inodoras, insípidas e não
tóxicas. Esse termo aplica-se a hidrocarbonetos de alto peso molecular, borrachas, proteínas,
polissacarídeos e seus derivados, além de alguns polímeros sintéticos (RODRIGUES et al.,
1993). Industrialmente este termo está associado a polissacarídeos e seus derivados e o
solvente utilizado é a água. As gomas naturais podem ser obtidas de exsudatos de árvores,
sementes, algas ou por fermentação biológica, já as modificadas são as derivadas de
polissacarídeos insolúveis, como por exemplo, a celulose (RODRIGUES et al., 1993).
O uso de exsudatos de árvores ao longo dos anos tem sido bastante frequente, podendo
fornecer várias gomas, tais como arábica, caraia, tragacanta, damar e elemi. Entre elas, a
goma arábica ou acácia é o exsudato há mais tempo conhecido, sendo seu uso relatado desde a
época dos egípcios (RODRIGUES, 2004). Esse material encapsulante é proveniente
predominantemente dos troncos e ramos de árvores conhecidas como Acacia senegal L.
Willd., encontrada em regiões desérticas da África. Possui excelente propriedade
emulsificante, estabilizante e protetora da oxidação de voláteis durante as etapas de
processamento e estocagem (BUFFO et al., 2001). Destaca-se também, como goma natural, a
proveniente do Cajueiro (Anacardium occidentale L.), planta originária do Brasil,
praticamente encontrada em todo o nordeste do país. Esse material assemelha-se com a goma
arábica em algumas propriedades, como baixa viscosidade em solução e capacidade
emulsificante (RODRIGUES, 2004). Possui aspecto de resina amarelada solúvel em água e é
obtido através de incisões no tronco e ramos da árvore, sendo esse processo dito
environmental friendly processing (KUMAR et al., 2012). A atividade de extração da goma
do cajueiro, além da utilização da castanha e do pedúnculo da planta, representa fonte de
lucros para o produtor, além de ser uma forma de se aproveitar cajueiros improdutivos, em
fase de declínio ou senescência (RODRIGUES, 2004).
A goma do cajueiro é um biopolímero versátil e biodegradável, sua aplicação nas
indústrias farmacêutica e biotecnológica é crescente. Esse material é seguro para uso humano,
livre de efeitos colaterais e biocompatível (RODRIGUES, 2004; KUMAR et al., 2012), sendo
empregado como agente geleificante, emulsificante, aglutinante e recentemente tem ganhado
48
destaque em sistemas de liberação modificada, entre outras funções. Quimicamente é
constituído principalmente por um heteropolissacarídeo ramificado e sua utilização em
diversas pesquisas tem apresentado resultados terapêuticos satisfatórios. Estudos em que foi
avaliado o efeito do tratamento tópico com o polissacarídeo da goma do cajueiro em lesões
cutâneas experimentais em camundongos demonstraram que houve otimização do processo de
cicatrização (PAIVA, 2003; ANDRADE, 2006); resultado semelhante foi também observado
por Schirato et al., 2006, onde a goma do cajueiro foi utilizada em feridas cutâneas de
camundongos e as mesmas avaliadas frente à fase inflamatória do processo cicatricial, onde
foi possível verificar sinais flogísticos menos acentuados (edema e hiperemia) durante o
período inflamatório no grupo tratado, compatível com um processo de reparação mais
avançado. Há relatos de atividade antitumoral in vitro e ação farmacológica no tratamento de
infecções experimentais pelo Schistosoma mansoni (GADELHA, 2001).
2 Objetivo
Microencapsular o extrato bruto de P. pubescens utilizando a goma do cajueiro como
material de parede utilizando a técnica de atomização e caracterizar o material obtido.
3 Materiais e Métodos
3.1 Purificação da goma do cajueiro
O processo de purificação da goma bruta foi realizado segundo Rodrigues (2004), e
seguiu o procedimento descrito no fluxograma na figura 2.5.
49
Figura 2.5 Fluxograma do procedimento utilizado para purificação da goma do cajueiro.
A goma do cajueiro (809,34 g) foi triturada em liquidificador Waring Commercial®
Laboratory Blender, dissolvida em 1,6 L de água destilada à temperatura ambiente e filtrada
em funil de Büchner com vácuo, utilizando-se um pano de algodão para a retenção de
impurezas. Em seguida, adicionou-se 11,2 L litros de etanol 96°GL em um erlenmeyer,
adicionando-sea goma aos poucos, com o propósito de precipitá-la por insolubilidade no
etanol. O precipitado obtido foi filtrado novamente sob vácuo e lavado com 2L de etanol,
sendo seco em estufa com ventilação forçada a 45°C durante 48 horas. Após a secagem a
goma purificada foi moída e tamizada, totalizando 764,79 g.
DESCARTE
PRECIPITAÇÃO
FILTRADO
FILTRAÇÃO
LAVAGEM
SECAGEM
TRITURAÇÃO
PRECIPITADO
TRITURAÇÃO
DISSOLUÇÃO
FILTRAÇÃO
PRECIPITAÇÃO
GOMA BRUTA
GOMA ISOLADA
50
3.2 Microencapsulação
A obtenção das microcápsulas foi baseada na técnica de atomização (spray drying).
Inicialmente preparou-se uma suspensão (Tabela 2.1) contendo o extrato bruto vegetal, o
material de parede, o tensoativo e a água, sendo esta homogeneizada com o auxílio de
dispersor IKA®T10 Basic-Ultra Turrax
®. O processo de atomização empregou o aparelho
spray dryer Buchi B-290, nas condições operacionais descritas por Servat (2010), ou seja, 180
°C ± 5 °C de ar de entrada, 90-110 °C ± 5 °C de ar de saída, vazão de bombeamento da
suspensão de 6 mL/min, vazão de nitrogênio de 414 L/h e diâmetro do bico atomizador de 2,2
mm.
Tabela 2.1: Características da suspensão processada por spray dryer para obtenção de
microcápsulas de Sucupira com goma do cajueiro como material de parede.
Componente da
suspensão
Extrato de
P. pubescens Goma do cajueiro Tween 80 Água
Função Material de recheio Material de parede Tensoativo Solvente
Quantidade 60 g 240 g 24 g 1176 g
Volume de solução processada: 1,5 L
Porcentagem de recheio: 20%
Porcentagem de sólidos totais: 20%
3.3 Determinação da umidade das microcápsulas
A determinação da umidade das microcápsulas obtidas foi realizada segundo a
Farmacopeia Brasileira (BRASIL, 2010), onde 3,0 g da amostra foram pesados em recipiente
previamente dessescado nas mesmas condições que foram adotadas para a amostra, durante
30 minutos. As amostras (teste realizado em triplicata) foram dessecadas a 105 °C em estufa
GCA Precision Mechanical Convection Oven, durante 5 horas, até peso constante. A
porcentagem de água foi calculada em relação ao material seco ao ar.
3.4 Solubilidade das microcápsulas
A solubilidade em água das microcápsulas obtidas foi determinada segundo Barbosa et
al. (2005). Preparou-se uma mistura das microcápsulas em água destilada, na proporção de
0,4% p/v, e esta foi suavemente agitada até a solubilização do sólido. O pó é considerado
solúvel quando o tempo necessário para a solubilização não for maior que 5 minutos. O tempo
51
total necessário para solubilizar as microcápsulas foi cronometrado e o teste foi realizado a
temperatura ambiente e em triplicata.
3.5 Extração do recheio das microcápsulas e avaliação da eficiência de
microencapsulação
Para as análises por CG-EM do material encapsulado e avaliação da eficiência de
microencapsulação, extraiu-se das microcápsulas o seu conteúdo interno e recuperou-se o
conteúdo externo não encapsulado, de acordo com metodologia descrita por Grando
(2013).Para isso, amostras de 500 mg das microcápsulas obtidas foram pesadas em triplicata
em tubos falcon e lavadas com 10 mLde hexano, para extração dos compostos marcadores
não encapsulados, seguido de agitação por 3 minutos em vórtex e centrifugação por 10
minutos a 3000 rpm. Finalizada essa etapa, o solvente foi separado e evaporado sob vácuo,
em rotaevaporador Buchi RE 125 até secura. O material seco foi diluído em acetato de etila e
encaminhado para análise. Em seguida, as partículas com as superfícies limpas que
permaneceram no fundo dos tubos foram rompidas com a adição de 20 mg de NaCl e 5 mL de
água para a obtenção do seu conteúdo interno. A mistura formada foi agitada em vórtex
durante 3 minutos, posteriormente foi adicionado 5 mL de etanol, para a precipitação da goma
do cajueiro e mais 10 mL hexano, seguido de agitação por mais 3 minutos, para extração dos
compostos marcadores. Os tubos foram centrifugados por 10 minutos a 3000 rpm, e a fase
orgânica, contendo os compostos de interesse, foi evaporada sob vácuo até secura. O processo
de extração com hexano foi realizado três vezes. O material seco também foi diluído em
acetato de etila e encaminhado para CG-EM.
Para o cálculo da eficiência de microencapsulação (EM), utilizou-se a seguinte
equação (BARBOSA et al., 2005):
Onde:
ET: Quantidade de extrato total (conteúdo interno das microcápsulas somado ao conteúdo não
encapsulado, presente na superfície das partículas);
ES: Quantidade de extrato superficial (quantidade de extrato não encapsulado presente na
superfície das microcápsulas).
52
3.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As amostras processadas em spray dryer foram fixadas em fita adesiva dupla face de
cobre em suportes cilíndricos de alumínio de 1 cm de altura por 1 cm de diâmetro (stubs), de
acordo com procedimento descrito por Rosenberg e Young (1993). Os cilindros foram
submetidos à metalização, recobertos com uma fina camada de ouro, através de uma corrente
de 40 mA durante 180 segundos, sob vácuo. Esta técnica, conhecida por sputtering, foi
realizada em um sputter coater (Balzers SCD 050).
As amostras foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), em
microscópio eletrônico de varredura (JEOL JSM-5800LV), sob aceleração de 10 kV e suas
imagens digitalizadas, para observação detalhada das estruturas. Esta avaliação foi realizada
no Laboratório de Microscopia do Instituto de Biologia - UNICAMP.
3.7 Determinação da distribuição do tamanho de partículas
A distribuição do tamanho das microcápsulas produzidas foi determinada através de
aparelho determinador de distribuição de tamanho de partículas baseado no espalhamento de
luz a laser (Malvern). Utilizou-se o módulo de via úmida, empregando-se isopropanol como
meio de dispersão. Foi utilizada uma quantidade de amostra suficiente para atingir níveis
adequados à leitura (cerca de 20% de obscuração).
4 Resultados e Discussão
4.1 Purificação da goma do cajueiro
Esta etapa teve por objetivo isolar a substância de interesse, uma vez que a matéria-
prima utilizada é proveniente da goma bruta da árvore de A. occidentale L., dessa forma
obteve-se o material quimicamente puro e homogêneo, tendo-se o cuidado ao manipular cada
etapa de forma a ser obtidoo maior rendimento possível. Polissacarídeos naturais, como as
gomas, frequentemente vêm misturados com sais inorgânicos, outros materiais de baixo peso
molecular e com espécies como proteínas, ligninas e ácidos nucleicos, que deles precisam ser
separados (RODRIGUES et al., 1993).
A goma bruta utilizada no desenvolver deste projeto foi gentilmente cedida pelo Prof.
Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues, obtida através de doação pessoal e é proveniente
da região nordeste do país. Partiu-se de 809,34g do material e obteve-se ao final do processo
53
764,79g de goma do cajueiro purificada, ou seja, o rendimento do processo foi de 94,5%.
Comparando-se com a referência utilizada, Rodrigues (2004), nota-se que o rendimento dessa
etapa foi 31,0% maior, o que pode ser decorrente da origem da goma do cajueiro bruta. A
metodologia utilizada é interessante pelo fato de utilizar somente etanol e água e não
empregar outros tipos de solventes orgânicos, o que a caracteriza como uma “metodologia
verde” (NGWULUKA et al., 2014).
4.2 Microencapsulação, determinação de umidade e rendimento do processo
A concentração de sólidos presentes no líquido de alimentação exerce grande impacto
sobre a eficiência da operação de secagem. Devido ao custo do processo, o spray dryer deve
operar com o máximo teor de sólidos possível, possibilitando uma utilização adequada do
calor (MASTERS, 1985). Baixas concentrações de sólidos necessitam que grande quantidade
de solvente seja eliminada ou requerem a adição de adjuvantes de secagem, visando à
formação de partículas maiores e à otimização do rendimento do processo (DE CAMPOS,
1996).
A metodologia utilizada, baseada em Servat (2010), difere-se quanto à porcentagem de
sólidos totais utilizada. Na referência utilizada observa-se que a porcentagem de sólidos totais
empregada no preparo da suspensão processada foi de 30% e neste presente trabalho utilizou-
se 20%. Apesar de saber-se que quanto menor o conteúdo de sólidos em uma suspensão
maiores as chances de se obter maior espaço oco interno na partícula (ballooning) e também
existira desvantagem das paredes das microcápsulas tornarem-se menos espessas (CAO et
al., 2000), essa variação foi necessária por conta do material de parede utilizado. Servat
utilizou uma mistura de goma arábica e maltodextrina, na proporção de 1:1 (m/m) como
material de parede, o que resultou na obtenção de uma solução homogênea e de baixa
viscosidade, enquanto nesse trabalho foi utilizada a goma do cajueiro, o que proporcionou a
obtenção de uma suspensão muito densa e heterogênea, havendo a necessidade de aumentar a
quantidade de água utilizada para a obtenção de uma suspensão homogênea, capaz de ser
bombeada adequadamente para o aparelho, em fluxo constante, sem risco de obstruir qualquer
um dos seus componentes.
O processo teve duração total de cerca de 6 horas e foi realizado com auxílio de N2
com a finalidade de se obter um ambiente inerte e garantir a preservação do extrato vegetal.
A determinação da umidade das microcápsulas foi de 1,88% e diante desse valor calculou-se
o rendimento do processo de encapsulação. O rendimento teórico do processo foi de 84,16%
(300 g de sólidos processados e 252,49 g de microcápsulas obtidas), e considerando-se que
54
1,58% deste valor referem-se à umidade residual, o rendimento real foi de 82,58% (300 g de
sólidos processados e 247,74 g de microcápsulas secas obtidas).
A figura 2.6 ilustra o processo de obtenção das microcápsulas através da técnica de
atomização.
Figura 2.6 Imagens que ilustram o processo de microencapsulação. A: Equipamento em
operação; B: Suspensão sendo bombeada em direção ao atomizador; C: Microcápsulas
produzidas passando através do ciclone, seguindo para o recipiente coletor.
A técnica de atomização além de ser uma ferramenta eficaz de pesquisa oferece
capacidade de produção em grande escala. É adequada para a encapsulação de óleos e
oleoresinas e se mostrou adequada para a encapsulação do extrato bruto vegetal de P.
pubescens. A figura 2.7 apresenta o pó obtido nesse processo:
Figura 2.7 Microcápsulas de Sucupira obtidas pelo processo de spray drying.
A B C
55
4.3 Solubilidade das microcápsulas
O material obtido foi considerado solúvel em água, não foi observado precipitado e as
microcápsulas solubilizaram-se dentro dos 5 minutos estimados, conforme metodologia
citada. Porém, observou-se a presença de alguns materiais dispersos, o que foi atribuído ao
material de recheio, composto pelo extrato vegetal bruto de P. pubescens, o qual possui
constituintes apolares, insolúveis em água.
4.4 Extração do recheio das microcápsulas e avaliação da eficiência de
microencapsulação
Seguindo a metodologia apresentada, foi possível visualizar nitidamente a precipitação
da goma do cajueiro e as fases que formaram o sistema bifásico, permitindo a obtenção da
fase orgânica contendo os compostos que se deseja monitorar, conforme apresentado na figura
2.8:
Figura 2.8 Extração do recheio das microcápsulas de P. pubescens contendo goma do
cajueiro como material de parede.
Os materiais isolados e analisados por CG-EM demonstraram que o processo de
microencapsulação foi efetivo.
Os cromatogramas demonstram que analisando o conteúdo interno das
microcápsulas/material vegetal encapsulado (Figura 2.9) foi possível identificar compostos
voláteis e compostos marcadores relacionados à atividade farmacológica do extrato bruto da
espécie vegetal. Os dois tipos de compostos foram preservados durante todo o processo e
Fase orgânica, que contém os compostos monitorados
(conteúdo interno livre).
Fase composta por NaCl, água e etanol.
Goma do cajueiro precipitada.
56
também não foram afetados durante o armazenamento. Essa informação corrobora a
afirmação de que a escolha adequada de material de parede, porcentagem de sólidos e
condições de secagem permitem a obtenção de um produto seco que mantém elevadas
quantidades de material volátil (RODRIGUES e GROSSO, 2008).
5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
T i m e - - >
A b u n d a n c e
T I C : 1 - I N T - C . D \ d a t a . m s ( * )
Figura 2.9 Cromatograma do conteúdo extraído do interior das microcápsulas.
Na análise do extrato presente na superfície das microcápsulas (Figura 2.10) ou
material que não foi encapsulado, nota-se a presença somente dos compostos marcadores, os
quais são menos sensíveis ao processo e possuem maior ponto de ebulição, ao contrário dos
compostos voláteis, que podem ter sido eliminados ao longo do processo e armazenamento. A
figura 2.11 apresenta mais detalhadamente a composição das amostras obtidas nesta etapa
comparando-as ao extrato vegetal livre, obtido logo após o processo de extração.
57
5 . 0 0 1 0 . 0 0 1 5 . 0 0 2 0 . 0 0 2 5 . 0 0 3 0 . 0 0 3 5 . 0 0 4 0 . 0 0 4 5 . 0 0 5 0 . 0 0 5 5 . 0 00
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
T i m e - - >
A b u n d a n c e
T I C : 1 - E X T - C . D \ d a t a . m s ( * )
Figura 2.10 Cromatograma do material presente na superfície das microcápsulas.
58
1: Cromatograma do extrato bruto livre de P. pubescens, onde A: Visão geral do cromatograma, B: Detalhe da região dos
vouacapanos, C: Detalhe da região do voláteis
2: Cromatograma do conteúdo interno das microcápsulas, onde A: Visão geral do cromatograma, B: Detalhe da região dos
vouacapanos, C: Detalhe da região do voláteis
3: Cromatograma do contéudo externo às microcápsulas, onde A: Visão geral do cromatograma, B: Detalhe da região dos
vouacapanos
Legenda:
Região relacionada aos compostos voláteis (Cariofileno, composto volátil em destaque)
Região relacionada aos compostos marcadores (Vouacapanos)
Figura 2.11 Cromatogramas obtidos na etapa de extração do recheio das microcápsulas e
avaliação da eficiência de microencapsulação comparados ao cromatograma do extrato bruto
livre de P. pubescens.
1
A
B
C
2
A
3
A B
B
C
59
Nos cromatogramas apresentados aqui, entre os diferentes compostos voláteis
presentes no extrato bruto de Sucupira, destaca-se o cariofileno (m/z 204), composto que teve
sua identificação com 99% de certeza de acordo com a biblioteca interna do aplicativo
utilizado na interpretação dos resultados obtidos. Ele também é predominante, entre os
voláteis, em outras espécies do gênero Pterodon, é o composto majoritário do óleo essencial
obtido dos frutos deste mesmo gênero (ALVES et al., 2014) e pode estar associado a
propriedades cicatrizantes (DUTRA et al., 2009a).
Nos resultados apresentados nota-se que o conteúdo que foi encapsulado apresenta as
mesmas características que o extrato bruto livre, porém em menor abundância, o que já era
esperado dada a eficiência do processo de encapsulação, discutido adiante. A figura 2.11
permite confirmar que o material vegetal exposto às elevadas temperaturas do equipamento
spray dryer não apresentou alteração significativa em seu perfil, portanto não é afetado pela
ação da mesma, já que a exposição que ocorre é por um período muito breve de tempo,
resultando na preservação do material exposto, corroborando a afirmação de que a utilização
da técnica de atomização é adequada para materiais que apresentam sensibilidade ao calor
(RODRIGUES, 2004). A Tabela 2.2 auxilia a avaliação das amostras analisadas no teste de
avaliação da eficiência de microencapsulação, relacionando-se os compostos monitorados e
seus respectivos tempos de retenção.
60
Tabela 2.2: Compostos monitorados nas três amostras (Extrato bruto livre; Conteúdo Interno
(CI) e Conteúdo Superficial (ES)) avaliadas nas etapas de avaliação da eficiência de
microencapsulação, onde m/z 204 refere-se ao composto volátil cariofileno; m/z 362 e m/z
404 correspondem aos compostos vouacapanos junto aos seus respectivos tempos de retenção
na análise de CG-EM.
Amostra Razão m/z Tempo de retenção (min)
Extrato bruto livre 204 8,622
362 33,096
404 34,280
34,771
Conteúdo interno (CI) 204 8,590
362 33,031
404 34,199
34,682
Conteúdo superficial (ES) 204 Não detectado
362 33,045
404 34,222
34,712
De acordo com a metodologia de extração do conteúdo interno das microcápsulas e
recuperação do conteúdo externo não encapsulado foi possível realizar o cálculo da eficiência
de microencapsulação (teste realizado em triplicata, portanto o valor utilizado no cálculo é o
resultante da média dos resultados obtidos):
Tabela 2.3: Valores utilizados no cálculo de Eficiência de Microencapsulação (EM). CI
representa a média das quantidades dos vouacapanos (m/z 404) presente no interior das
microcápsulas. ES representa a média das quantidades dos vouacapanos (m/z 404) presente na
superfície externa das microcápsulas. ET é o valor de extrato bruto total das microcápsulas,
formado pela soma da quantidade presente no interior (CI) e quantidade presente na superfície
(ES) das microcápsulas.
m/z 404
CI 38,473% ES 53,685% ET 39.079%
40,405% 43,468% 48,914%
38,359% 49,589% 87,993%
39,079% 48,914%
61
O cálculo foi realizado sobre o composto vouacapano com razão m/z 404, o qual
apresentou maior quantidade em todas as amostras, sendo considerado o mais representativo
para esta finalidade.
Dessa forma:
%EM = (87,993% – 48,914%) x 100 %EM = 44,411%
87,993%
Conforme apresentado acima, a eficiência de microencapsulação foi de 44,41%, esse
valor pode ser otimizado com alterações no processo, ou substituição do material de parede,
uma vez que o processo é influenciado pelas características do material selecionado e do
processamento, isto é, parâmetros de operação e equipamento (OLIVEIRA e PETROVICK,
2009).
62
4.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
As etapas de preparação do material para a obtenção das fotomicrografias
compreendeu as etapas apresentadas na figura 2.12.
Figura 2.12 Preparação das amostras para MEV. A: Stubs; B: Stubs prontos para receber
aplicação das microcápsulas; C: Sputtering; D: sputter coater; E: Finalização do preparo das
amostras; F: Microscópio Eletrônico de Varredura.
As fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura mostram a
superfície das microcápsulas predominantemente rugosa, o que é comum para este tipo de
técnica e é resultante da contração das partículas durante a rápida secagem (ROSEMBERG et
al., 1990).
A
[
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a
c
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c
u
m
e
n
63
Figura 2.13 Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura das
microcápsulas de P. pubescens com goma do cajueiro como material de parede, obtidas
através do processo de atomização, onde a imagem A apresenta aumento de 500x, B apresenta
aumento de 750x, C apresenta aumento de 1500x, D apresenta aumento de 1600x e E
apresenta aumento de 2500x.
A fotomicrografia E (Figura 2.13) permite observar claramente a formação de espaço
oco interno na microcápsula (ballooning). Seu conteúdo interno é do tipo líquido, composto
pelo extrato bruto de P. pubescens, o qual manteve suas características preservadas conforme
resultados discutidos anteriormente.
C
A B
D
E
[
D
i
g
i
t
e
u
m
a
c
i
t
a
64
4.6 Determinação da distribuição do tamanho de partículas
A distribuição do tamanho das microcápsulas produzidas foi determinada através de
aparelho determinador de distribuição de tamanho de partículas baseado no espalhamento de
luz a laser (Malvern) e o resultado obtido está apresentado na figura 2.14.
Figura 2.14 Curva de distribuição granulométrica das microcápsulas de Sucupira contendo
goma do cajueiro como material de parede.
A curva de distribuição granulométrica obtida permite verificar tendência bimodal, o
que corresponde a uma população de tamanhos de partículas diferentes para cada pico. Cerca
de 50% da amostra possui tamanho médio inferior a 21,206 µm e cerca de 90% possui
tamanho médio inferior a 233,729 µm. A distribuição observada permite verificar que o
material produzido pela técnica de spray drying levou à produção de microcápsulas, cujo
tamanho corresponde a 0,2 - 500 µm (SALIB, 1997; RÉ, 2000; AGNIHOTRI et al., 2012).
Cerca de 0,4% do material obtido possui tamanho inferior a 0,2 µm e aproximadamente
65
1,76% apresenta tamanho superior a 500 µm, o que pode ser atribuído a partículas que não
conseguiram encapsular o extrato vegetal e à formação de aglomerados, respectivamente. Por
volta de 100 µm é possível verificar um provável início de processo de aglomeração. O
processo de aglomeração pode ocorrer através da formação de pontes de ligação irreversíveis
entre as partículas e consequentemente na formação de partículas de maior tamanho, o que
não compromete a qualidade do material obtido no processo de microencapsulação e é
observado em literatura (RODRIGUES, 2004).
5 Conclusão
A técnica de atomização permitiu a obtenção de microcápsulas de P. pubescens
utilizando a goma do cajueiro como material de parede. A eficiência do processo de
microencapsulação foi de aproximadamente 44% e análises por microscopia eletrônica de
varredura comprovaram a morfologia do material obtido, permitindo inclusive observar a
formação de espaço oco interno, confirmando-se visualmente a formação das cápsulas. Os
resultados de CG-EM mostram que o conteúdo encapsulado preservou as mesmas
características que o extrato bruto livre, contendo os compostos responsáveis pela atividade
farmacológica da espécie vegetal inalterados. A análise da distribuição granulométrica das
microcápsulas obtidas permitiu verificar que aproximadamente 98% do material possui
tamanho adequado, sendo que os 2% faltantes são atribuídos a partículas que não
conseguiram encapsular o extrato vegetal e a formação de aglomerados, situações passíveis de
ocorrer de acordo com a técnica utilizada.
66
CAPÍTULO III: DELINEAMENTO DE FORMA FARMACÊUTICA DE USO
TÓPICO E ESTUDO DE ESTABILIDADE
1 Introdução
1.1 Delineamento de uma forma farmacêutica
Compostos farmacologicamente ativos são raramente administrados na forma de
substâncias químicas puras, sendo mais frequentemente apresentados sob a forma de
cosméticos ou medicamentos, que podem variar desde soluções simples até sistemas de
liberação complexos, sendo essa variação possível de acordo com a seleção apropriada de
adjuvantes de formulação. Os adjuvantes são responsáveis pelas funções de: solubilização,
suspensão, espessamento, conservação, emulsificação, modificação da dissolução, auxíliona
compressibilidade e correção de características organolépticas, proporcionando a obtenção de
várias formas farmacêuticas (AULTON, 2005).
O estudo de delineamento da forma farmacêutica consiste na obtenção de resposta
terapêutica previsível em relação ao(s) ativo(s) incorporado(s) em uma formulação, sendo esta
passível de preparação em larga escala e com reprodutibilidade, considerando-se sempre a
resposta que motivou o desenvolvimento do produto. É importante observar estabilidade
química e física, conservação contra contaminação microbiana, uniformidade da dose,
aceitação dos usuários (prescritor e paciente) e embalagem e rotulagem adequadas. Este
processo envolve o conhecimento de propriedades como características físicas e químicas da
substância ativa, conhecimento sobre possíveis alterações que possam ocorrer entre dois ou
mais componentes da formulação (substância ativa versus adjuvante(s) ou adjuvante(s) versus
adjuvante(s)) e ainda avaliaçãodo material de acondicionamento para evitar
incompatibilidades entre a formulação e a embalagem primária (AULTON, 2005). Junto a
essa série de conhecimentos requeridos deve-se sempre considerar fatores que controlam a
escolha da via de administração, bem como possíveis passagens que afetem a absorção dos
compostos responsáveis pela atividade do produto (PIFFERI et al., 1999).
1.2 Estudo de pré-formulação
Esta fase é caracterizada pela avaliação das propriedades físico-químicas do ativo
isolado ou associado a excipientes e é determinante junto às etapas de formulação e produção
para a qualidade do medicamento produzido. Pode-se citar solubilidade, coeficiente de
partição, velocidade de dissolução, forma física de apresentação e estabilidade como
67
parâmetros que podem ser avaliados utilizando metodologias como cromatografia,
espectroscopia e/ou análises térmicas. Ao se analisar extratos vegetais o estudo de pré-
formulação torna-se mais difícil, pois os marcadores disponíveis podem sofrer alterações em
função de pH, polaridade de solventes, temperatura e interações entre excipientes ou veículos
utilizados. Portanto, ao formular produtos contendo ativos naturais, é fundamental a
identificação padronizada de marcadores ou o desenvolvimento de métodos que permitam a
quantificação de grupos químicos purificados antes, durante e após o processo de obtenção do
produto (SILVA JÚNIOR, 2006; ALVES, 2008).
1.3 Formas farmacêuticas semissólidas
Formas farmacêuticas semi-sólidas são quase sempre de uso tópico e compreendem
pomadas, pastas, cremes, géis e outras atualmente menos prescritas, como ceratos, unguentos
e cataplasmas. São largamente utilizadas em medicamentos e cosméticos por suas
propriedades terapêuticas e como veículo para entrega de drogas e agentes cosméticos na pele
(ECCLESTON, 1997).
A opção pelo uso tópico é muitas vezes justificada pela maior facilidade de aplicação,
melhor aceitação do paciente e consequentemente maior adesão ao tratamento, menor custo,
maior facilidade de acesso, redução de efeitos sistêmicos e menor risco de efeitos adversos, já
que não há passagem pelo trato gastrointestinal (PRISTA et al., 1990; OKUYAMA, 2010).
A composição de semissólidos se dá basicamente pela incorporação de uma substância
ativa a uma base semissólida adequada, selecionada através de uma avaliação criteriosa das
propriedades físico-químicas, por exemplo. A preparação dessas formulações deve considerar
aspectos como boa aparência, textura, consistência e facilidade de utilização, é necessário
garantir que o produto apresente mesma eficácia e integridade até o fim da data de expiração
de sua validade (PRISTA et al., 1990; OKUYAMA, 2010).
A seleção da base semissólida apropriada para veicular o(s) composto(s) de interesse
dependedos seguintes fatores: velocidade para liberar o fármaco a partir da base; se é
desejável oclusão da pele; estabilidade do ativo(s) na base; se é desejável a fácil remoção por
lavagem; característica da superfície na qual o produto será aplicado (AULTON, 2005).
Entre as formas farmacêuticas de uso tópico mais utilizadas destacam-se as emulsões e
os géis. Emulsões são preparações obtidas através de bases emulsivas do tipo água/óleo (A/O)
ou óleo/água (O/A), contendo um ou mais princípios ativos ou aditivos dissolvidos ou
dispersos na base adequada. As emulsões são sistemas instáveis constituídos de pelo menos
um líquido imiscível intimamente disperso em outro líquido na forma de gotículas (0,1 a 10
68
µm) estabilizadas pela ação de agente emulsificante (FERREIRA, 2002). Oferecem boa
aderência à pele e fluem com facilidade quando aplicadas à superfície cutânea, sendo
constituídas basicamente de uma fase aquosa (onde é feita a solubilização de ingredientes
hidrossolúveis), fase oleosa (solubilização de ingredientes lipossolúveis), agente
emulsificante, antioxidantes, conservantes, sequestrantes e, opcionalmente, essências e
corantes. Géis são sistemas semissólidos que consistem em suspensões de pequenas partículas
inorgânicas ou de grandes moléculas orgânicas interpenetradas por um líquido (AULTON,
2005). Geralmente são preparados a partir de polímeros sintéticos ou semissintéticos,
constituídos por agente gelificante ou espessante, veículo, conservantes, estabilizantes e
opcionalmente, umectantes.
Cabe ao formulador desenvolver não só um produto dermatológico com aspecto e
características físico-químicas estáveis, mas também um meio que permita que o agente ativo
atinja a região de interesse. O produto não deve ser irritante à pele e deve ser capaz de
incorporar adequadamente todos os excipientes necessários para a formulação. O
conhecimento aprofundado desse sistema é importante para sua otimização, produção e
melhorias, que além de garantirem sua qualidade, segurança e eficácia vão proporcionar a
aceitabilidade do consumidor final ou paciente (ECCLESTON, 1997).
O processo de absorção consiste nas interações composto(s) ativo(s)-veículo e veículo-
pele, que vão influenciar a taxa que o agente responsável pela atividade atinge a superfície da
pele e se permanece na superfície da pele ou penetra através do estrato córneo (ECCLESTON,
1997). A Figura 3.1 apresenta um diagrama onde é representada a absorção do(s) composto(s)
ativo(s), no caso ilustrado como fármaco, através da pele em direção às possíveis áreas de
atuação, após atravessar o estrato córneo (STORPIRTIS et al., 2009):
69
Figura 3.1 Diagrama representando absorção de composto(s) ativo(s), no caso ilustrado como
fármaco, através da pele em direção às possíveis áreas de atuação (STORPIRTIS et al., 2009).
As características reológicas são propriedades importantes a serem consideradas na
fabricação, envase, armazenamento e aplicação de produtos de uso tópico, interferindo na
forma de uso do produto e também na aceitação do produto pelo consumidor (ISAAC et al.,
2013). É importante ter o conhecimento de que a composição do veículo em formulações
tópicas pode influenciar a liberação do ativo por mudanças na permeabilidade do estrato
córneo na pele ou por aumento da atividade termodinâmica das substâncias (ISAAC et al.,
2013). Formulações semissólidas não obedecem à lei de Newton, que é definida pela
velocidade de fluxo ser diretamente proporcional à tensão aplicada, e seguida por fluidos
simples como água ou xarope. Bases semi-sólidas apresentam variação de sua viscosidade de
acordo com a velocidade de cisalhamento (AULTON, 2005).
Outra característica comum às bases semissólidas é o comportamento não-newtoniano
de fluxo pseudoplástico, caracterizado no reograma por iniciar-se na origem e, uma vez que
não há ponto de cedência, o material começa a fluir tão logo uma tensão de cisalhamento seja
aplicada. A inclinação da curva diminui gradualmente com o aumento da velocidade de
cisalhamento (AULTON, 2005). Não há um valor inequívoco de viscosidade que possa ser
considerado característico, a representação é feita por meio de toda a curva de fluxo.
Viscosidade é uma expressão de resistência do fluido ao fluxo: quanto maior a viscosidade,
maior a resistência (CORREA et al, 2005). Essa característica é resultante dos excipientes
normalmente utilizados para dar viscosidade à base, como metilcelulose, carmelose,
polivinilpirrolidona, ácido poliacrílico, entre outros (AULTON, 2005).
70
A lei de Newton pode ser expressa por:
Onde: σ: tensão de cisalhamento; Ƞ: viscosidade; ϒ: velocidade de cisalhamento. O gráfico
obtido por essas informações é denominado reograma ou curva de fluxo. No eixo x apresenta-
se a velocidade de cisalhamento (ϒ), eixo y apresenta-se a tensão de cisalhamento (σ) e a
inclinação dará a viscosidade do fluido.
A figura 3.2 apresenta as curvas de fluxo dos possíveis comportamentos apresentados
por vários materiais e é possível observar o comportamento não-newtoniano de fluxo
pseudoplástico:
Figura 3.2 Curvas de fluxo representando o comportamento de vários materiais. (a)
Newtoniano, (b) plástico, (c) pseudoplástico e (d) dilatante (AULTON, 2005).
1.4 Estudo da estabilidade de uma forma farmacêutica
A produção de um produto deve focar o tempo de vida-de-prateleira coerente com as
propriedades terapêuticas desejadas, sendo função do formulador prolongar essa estabilidade,
sendo esse objetivo alcançado através da seleção adequada de excipientes e também
controlando propriedades reológicas da formulação (ECCLESTON, 1997).
O estudo da estabilidade de uma formulação representa uma parte crucial para o
desenvolvimento de um novo produto, seja ele um medicamento ou um cosmético, sendo um
71
parâmetro essencial no processo de controle de qualidade, a instabilidade da formulação vai
modificar os três requisitos essenciais: qualidade, eficácia e segurança do produto
farmacêutico ao longo do seu prazo de validade (VICENTINI et al., 2011). Informações
provenientes desse estudo podem prever problemas no desenvolvimento do produto,
permitem conhecer possíveis alterações que possam afetar sua ação e impedir que se garantam
características como concentração de componentes, cor, odor e homogeneidade, além de
confirmar que as mesmas não são resultantes de instabilidade da formulação (BRASIL, 2004).
A estabilidade de uma formulação pode ser afetada por fatores ambientais ou
extrínsecos como temperatura, umidade, contato com o ar, luz e o próprio passar do tempo,
que podem afetar as características físicas dos medicamentos e acelerar o processo de
decomposição química da(s) substância(s) ativa(s). A ação de fatores intrínsecos pode ocorrer
por meio de reações como hidrólise, oxidação e fotólise; além defatores inerentes à própria
formulação tais como polimorfismo, incompatibilidade, pH, tamanho da partícula e
vaporização (ANSEL et al., 2000). Esses fatores são provenientes de propriedades físicas e
químicas do princípio ativo e dos excipientes utilizados para viabilizar a forma farmacêutica,
da própria forma farmacêutica em si e sua composição edo processo de fabricação, ou ainda
do tipo/composição e demais propriedades do material de embalagem selecionado (ANSEL et
al., 2000; AULTON, 2005).
Entre os princípios do estudo de estabilidade, os testes devem ser conduzidos sob
condições que permitam fornecer informações sobre a estabilidade do produto utilizando o
menor tempo possível. Para isso amostras devem ser armazenadas em condições que acelerem
mudanças passíveis de ocorrerem durante o prazo de validade. Deve-se estar atento para essas
condições não seremtão extremas que, em vez de acelerarem o envelhecimento, provoquem
alterações que não ocorreriam nas condições reais de estogem (BRASIL, 2004). Recomenda-
se uma sequência de estudos (preliminar, acelerado e de longa duração) de acordo com o tipo
de formulação que está sendo desenvolvida, os quais têm por objetivo avaliar o produto em
etapas, buscando indícios que levem a conclusões sobre sua estabilidade (BRASIL, 2004).
A exposição do produto a diferentes temperaturas, de um modo geral, permite avaliar
o seu comportamento nas seguintes condições: baixa temperatura e temperatura elevada, que
são correlacionadas a amostras mantidas sob temperatura ambiente. São avaliadas alterações
como perda de volume, homogeneidade, creaming, separação de fases, precipitação, entre
outras (AULTON, 2005).
A temperatura é um dos principais fatores causadores da instabilidade dos fármacos e
produtos farmacêuticos, pois pode fornecer energia para acelerar as reações químicas de
72
degradação. A exposição à temperatura elevada promove aumento na velocidade do efeito
creaming nas emulsões, devido à diminuição da viscosidade da fase contínua; há aumento da
motilidade cinética das gotículas dispersas e do agente emulsionante na região de interface e,
além de alterar a viscosidade de toda formulação, causa mudanças na partição e solubilidade
de moléculas entre as fases (AKHTAR et al., 2011). A exposição do produto a baixas
temperaturas leva a formação de cristais de gelo que exercem pressões anômalas sobre as
gotículas dispersas e sobre a camada emulsionante, a qual pode precipitar sob essa condição
(AULTON, 2005). Em todas as etapas é indispensável a avaliação de propriedades
organolépticas, onde comparam-se amostras sob as mesmas condições de temperatura,
luminosidade e embalagem para verificar variações macroscópicas, alterações na aparência,
cor, odor e espalhabilidade. Quanto aos parâmetros físico-químicos, avalia-se valor de pH,
viscosidade, densidade, e em alguns casos é realizado o monitoramento de ingredientes da
formulação. Devem ser avaliados também parâmetros microbiológicos, realizando-se
contagem microbiana e teste de desafio do sistema conservante (Challenge Test) (BRASIL,
2004).
2 Objetivos
Desenvolver formulações semissólidas, do tipo emulsão e gel, contendo extrato bruto
livre e microencapsulado de Ptedoron pubescens na concentração de 2,5%; compará-las e
selecionar a que apresentar o melhor desempenho no estudo de estabilidade.
3 Materiais e Métodos
3.1 Desenvolvimento das formulações
3.1.1 Estudo das bases semissólidas
A composição percentual das bases testadas está descrita na tabela 3.1.
73
Tabela 3.1: Composição percentual das bases semissólidas testadas.
Matéria-prima Nome
comercial
% dos componentes (p/p)
F1 F2 F3 F4 F5 F6 F7 F8
Cera de Abelhas 15,00 - - 8,00 - - - -
Óleo Mineral 50,00 36,70 51,80 57,00 2,00 5,00 - -
Borato de Sódio 1,00 - - - - - - -
Álcool Cetílico - 0,80 2,40 - - - - -
Espermacete - 4,20 - 10,00 - - - -
Lanolina - - 6,00 - - - - -
Óleo de Rícino - - - 5,00 - - - -
Álcool Cetoestearílico
e Cetostearil Sulfato
de Sódio
Lanette N® - - - - 15,00 6,00 - -
Oleato de Decila Cetiol V - - - - 3,00 5,00 - -
Propilenoglicol - - - - 5,00 5,00 5,00
Metilparabeno Nipagin - - - - 0,15 0,15 0,15 0,15
Propilparabeno Nipazol - - - - 0,05 0,10 - -
Glicerina - - - - - - 5,00 - -
Carbômero 940 Carbopol®
940 - - - - - - 1,00 -
Imidazolidinil Uréia Germall®
115 - - - - - - 0,30 0,30
Trietanolamina - - - - - - q.s.p. pH
6 ~7 -
Hidroxietilcelulose Natrosol® - - - - - - - 3,00
Água Deionizada
(qsp) 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
Os métodos de preparo foram os seguintes:
F1 - Cold Cream (F. Bras.I) – (Emulsão A/O): Fundiu-se a fase oleosa (Cera de Abelhas e
Óleo Mineral). Aqueceu-se a fase aquosa (Borato de Sódio e Água). A fase oleosa foi vertida
sobre a fase aquosa e agitou-se até atingir a temperatura ambiente, adquirindo consistência de
creme.
F2 - Emulsão A/O - I: Os componentes da fase oleosa (Álcool Cetílico, Espermacete e Óleo
Mineral) foram fundidos a 60°C. Aqueceu-se a água à mesma temperatura e verteu-se sobre a
fase oleosa, agitando constantemente até adquirir consistência de creme.
74
F3 - Emulsão A/O - II: Fundiu-se os componentes da fase oleosa (Álcool Cetílico. Lanolina
Óleo Mineral) a 60° e aqueceu-se a água nessa mesma temperatura, vertendo-a sobre a
primeira fase. A emulsão formada foi homogeneizada até atingir consistência cremosa.
F4 - Emulsão A/O - III: Fundiu-se a fase oleosa (Cera de Abelhas, Espermacete, Óleo
Mineral e Óleo de Rícino) a 60°C e a fase aquosa foi aquecida também a 60°C. A fase aquosa
foi vertida sobre a fase oleosa e agitou-se até que fosse observado aspecto homogêneo e
cremoso.
F5 - Creme Lanette (Emulsão O/A): Fundiu-se a fase oleosa (Lanette N®, Cetiol V, Óleo
Mineral e Nipazol) a 80ºC e a fase aquosa (Propilenoglicol, Nipagin e Água) foi aquecida à
mesma temperatura. Verteu-se a fase aquosa sobre a fase oleosa, agitando-se até atingir a
temperatura ambiente, adquirindo consistência de creme.
F6 - Loção Lanette (EMULSÃO O/A): Aqueceu-se a fase aquosa (Glicerina, Nipagin e 30
mL de água) até 70°C. Fundiu-se a fase oleosa (Lanette N®, Cetiol V, Óleo Mineral e
Nipazol) até atingir a mesma temperatura. A fase oleosa foi transferida para copo graduado e
adicionou-se fase aquosa, agitando-se vagarosamente. Em seguida, completou-se o volume
com água e agitou-se o produto até completa homogeneização.
F7 - Gel de Carbopol: Pesou-se e hidratou-se o Carbopol, com agitação imediata. Misturou-
se o Nipagin com o Propilenoglicol. O Germall foi dissolvido em pequena quantidade de água
em um recipiente à parte. Os três conteúdos foram misturados em copo graduado e foi
acrescentado o maior volume de água possível. Para finalizar, completou-se o volume com
água deionizada e adicionou-se Trietanolamina (gotas) até o pH desejado.
F8 - Gel de Natrosol: Pesou-se o Natrosol e o mesmo foi transferido para copo graduado.
Adicionou-se o Propilenoglicol com Nipagin solubilizado previamente e agitou-se.
Adicionou-se água pré-aquecida (50°C) e agitou-se continuamente até formação do gel.
3.1.2 Avaliação da estabilidade das bases semissólidas
Todas as bases foram avaliadas sem a adição do ativo quanto à sua estabilidade através
do teste de centrifugação. Para a realização deste teste pesou-se 1 g de cada amostra em tubos
falcon, em triplicata, e as mesmas foram centrifugadas por 30 minutos a 3000 rpm em
centrífuga refrigerada Solab SL-701 à temperatura ambiente (25 ± 2 ºC), e ao final do período
avaliou-se a ocorrência de separação de fases.
75
3.1.3 Determinação dos valores de pH
Para a determinação do valor de pH das bases manipuladas utilizou-se pHmetro
Quimis Q400AS. As amostras foram analisadas após atingirem a temperatura ambiente, o
eletrodo do equipamento, próprio para formulações semi-sólidas, foi introduzido diretamente
no frasco que continha cada amostra e a medida foi registrada após a estabilização do valor
indicado. As medidas foram realizadas em triplicata e a média aritmética desses valores é
apresentada como resultado desta etapa. Também se determinou o pH do extrato
diclorometano, preparando-se uma solução contendo 1 g do material vegetal e 100 mL de
água deionizada, também em triplicata e calculando-se a média dos valores determinados.
3.1.4 Adição do extrato ativo às bases semissólidas estáveis
As bases que se apresentaram estáveis no teste de centrifugação receberam a adição do
extrato vegetal de P. pubescens. O extrato bruto livre foi adicionado na concentração de 2,5%
acrescido de 5,0% de propilenoglicol para auxiliar a incorporação e homogeneização do
material vegetal. A adição desses componentes foi feita após as bases atingirem a temperatura
ambiente, homogeneizando-se com auxílio de bagueta.
As bases que receberam o extrato bruto microencapsulado também utilizaram 5,0% de
propilenoglicol para auxiliar nessa etapa e a quantidade de material vegetal a ser adicionada
foi calculada considerando-se a porcentagem de recheio das microcápsulas (20%) acrescido
do valor referente à umidade residual do extrato ativo microencapsulado (1,88%). Os
materiais que foram pesados nessa etapa estão apresentados na tabela 3.2:
Tabela 3.2: Composição percentual das formulações contendo o extrato vegetal ativo.
Formulações contendo extrato
bruto livre
Formulações contendo extrato
bruto microencapsulado
Componente % (p/p) Componente % (p/p)
Base 92,5%
Base 82,3%
Propilenoglicol 5,0%
Propilenoglicol 5,0%
Extrato vegetal livre 2,5% Microcápsulas contendo
P. pubescens como
conteúdo interno
12,7%
Os produtos obtidos foram acondicionados em frascos de vidro neutro, transparente e
com tampa que garante boa vedação, evitando-se a incorporação de ar durante o envase e
tendo o cuidado de manter um espaço vazio (head space) para possíveis trocas gasosas.
76
3.2 Estudo de estabilidade
3.2.1 Etapa I
O estudo de estabilidade realizado neste trabalho consistiu em uma seleção de testes
presentes no Guia de Estabilidade de Produtos Cosméticos (BRASIL, 2004) e na Resolução
n°1 de 29 de julho de 2005 da ANVISA (BRASIL, 2005) e teve por finalidade auxiliar a
escolha da melhor formulação em uma triagem breve (Etapa I), no período de 15 dias para,
em seguida, avaliá-la ao longo de 180 dias (Etapa II), conduzindo assim os testes de forma
mais assertiva e otimizando o número de amostras e análises, além de proporcionar a
avaliação das formulações de uma forma mais abrangente.
O estudo de estabilidade preliminar, também conhecido como teste de triagem, tem
como objetivo auxiliar e orientar a escolha das formulações, sendo realizado na fase inicial do
desenvolvimento do produto (BRASIL, 2004). Esse estudo, incluído no desenvolvimento
desse projeto por conta do tipo de forma farmacêutica utilizada – formulações semissólidas -
possui duração reduzida e não tem a finalidade de estimar a vida útil do produto, emprega
condições extremas de temperatura com o objetivo de acelerar possíveis reações entre seus
componentes e o surgimento de sinais que devem ser observados e analisados conforme as
características específicas de cada tipo de produto. Nessa etapa recomendava-se que as
amostras que seriam avaliadas fossem envasadas em quantidade suficiente para as avaliações
necessárias, em frascos de vidro neutro e transparente, mas se houvesse incompatibilidade,
outro material de acondicionamento poderia ser selecionado. Ao longo de 15 dias as
formulações deveriam ser expostas a condições de estresse e a periodicidade de avaliação das
amostras poderia variar conforme a experiência técnica, as especificações do produto, as
características especiais de algum componente da formulação ou o sistema conservante
utilizado, porém o mais usual neste estudo preliminar é que sejam avaliadas, inicialmente, no
tempo zero e durante todos os dias em que estiverem submetidas às condições do estudo.
Os parâmetros avaliados no estudo de estabilidade preliminar devem ser definidos
pelo formulador. De modo geral são avaliadas as características organolépticas (aspecto, cor,
odor e sabor, quando aplicável) e características físico-químicas (valor de pH, viscosidade e
densidade, separação de fases ou outros), tomando-se sempre uma amostra como referência,
sendo esta o próprio produto em avaliação mantido à temperatura ambiente e abrigo da luz,
por exemplo, ou ainda uma amostra comercial.
A etapa seguinte compreende o estudo de estabilidade acelerado, o qual consiste em
um estudo projetado para acelerar a degradação química e/ou mudanças físicas de uma
formulação em condições forçadas de armazenamento. Os resultados obtidos, juntamente com
77
os derivados dos estudos de longa duração (terceira e última etapa), podem ser usados para
avaliar efeitos químicos e físicos prolongados em condições não aceleradas e para avaliar o
impacto de curtas exposições a condições fora daquelas estabelecidas no rótulo do produto,
que podem ocorrer durante o transporte ou condições diferentes das esperadas.
O estudo de estabilidade acelerado vem demonstrando empiricamente e com grande
probabilidade de acerto o que ocorreria no produto quando este fosse submetido a condições
normais de armazenamento por longo período de tempo, como ocorre no estudo de longa
duração. Quando resultados obtidos em um estudo de estabilidade aceleradoforem
satisfatórios, baseado em 6 meses de estudo, o prazo de validade provisório da formulação
deve ser de 2 anos, tratando-se do aspecto regulatório para registro do produto junto à
ANVISA, onde tais resultados são apresentados junto aos resultados preliminares de seis
meses de estudo de longa duração. O prazo de validade final do produto é determinado pelo
estudo de estabilidade de longa duração de 12 meses.
As formulações semissólidas obtidas na etapa anterior foram avaliadas no teste de
triagem inicial, durante o período de 15 dias, composto por avaliação macroscópica, avaliação
de estabilidade frente ao teste de centrifugação e determinação do valor de pH. Os testes
foram realizados em triplicata e os produtos foram armazenados em três diferentes condições:
Geladeira: 5 ± 2ºC;
Temperatura ambiente: 25 ± 2ºC;
Estufa termostatizada: 45 ± 2ºC.
3.2.1.1 Avaliação macroscópica
No teste de avaliação macroscópica foram observadas características organolépticas
como cor, odor e aspecto das formulações semissólidas. As amostras que permaneceram à
temperatura de 25 ± 2ºC e abrigo da luz foram tratadas como referência para o produto, sendo
comparadas com as que foram expostas às temperaturas de 45 ± 2ºC e 5 ± 2°C. Durante todo
o teste também foi observado o comportamentodo placebo das formulações testadas, de forma
a concluir se alterações as que fossem observadas não seriam decorrentes da base em si e/ou
do processo de manipulação.
3.2.1.2Teste de centrifugação
Também foi avaliada a ocorrência ou não de separação de fases das amostras, com a
mesma metodologia descrita anteriormente (item 3.1.2), com a diferença de que desta vez a
78
presença de instabilidade poderia ser decorrente da interação entre a base e o extrato vegetal
bruto.
3.2.1.3Determinação dos valores de pH
Procedimento realizado da mesma forma como descrito anteriormente (item 3.1.3),
sendo que nesta etapa também se avaliou a interação das bases selecionadas junto ao extrato
vegetal.
3.2.2 Etapa II
A formulação que apresentou os melhores resultados na Etapa I foi avaliada nessa
nova etapa, com duração de 180 dias. Todos os testes realizados foram executados em
triplicata. Os produtos foram armazenados em três diferentes condições:
Temperatura ambiente: 25 ± 2ºC e abrigo da luz;
Estufa termostatizada: 40 ± 2ºC;
Luz indireta: condição na qual o produto permaneceu próximo a uma janela, exposto à
luz solar.
Além destas condições, as formulações também foram submetidas à avaliação
macroscópica, realizada da mesma forma descrita anteriormente no item 3.2.1, testes de
centrifugação e determinação do valor de pH, conforme itens 3.1.2 e 3.1.3. Nessa etapa foram
incluídos também os testes de doseamento do ativo, avaliação da espalhabilidade do produto
edeterminação da viscosidade. A avaliação das características organolépticas foi realizada no
início do estudo (T0), após o período de 24 horas dado para a estabilização do produto recém-
manipulado, e nos períodos T1 (após 30 dias), T2 (após 60 dias), T3 (após 90 dias), T4 (após
120 dias), T5 (após 150 dias), T6 (após 180 dias).
Nos períodos T0, T3 e T6 foram realizados o doseamento do composto ativo, teste de
centrifugação, determinação do valor de pH, teste de espalhabilidadee determinação da
viscosidade. Em todos os testes avaliou-se tanto o placebo da formulação quanto o produto.
3.2.2.1 Doseamento dos compostos ativos
Os compostos majoritários responsáveis pela atividade farmacológica foram
monitorados nos tempos T0, T3 e T6. Para isso, preparou-se solução-estoque do padrão dos
vouacapanos com concentração final de 1µg/1 µL e para amostras do produto pesou-se 0,5 g
da formulação e as mesmas foram diluídas em 1 mL de acetato de etila, obtendo-se assim uma
79
concentração teórica de 12,5 mg de extrato por 1 mL (considerando-se que a formulação
possui 2,5% de extrato bruto de Sucupira).
Aplicou-se, em cromatofolhas de alumínio com silicagel (Merck® artigo 5554), 10 µL
das soluções de produto, em triplicata, e concentração crescente de 1 a 6 µL de solução-
estoque do padrão de vouacapanos, para construção da curva analítica. As placas foram
eluídas em misturas de acetato de etila/ n-hexano na proporção 60:40, ambos em grau P.A. A
detecção visual dos compostos foi obtida após pulverização das placas com solução de
anisaldeído, composta pela mistura de ácido acético: ácido sulfúrico: anisaldeído (50:1:0,5),
seguida de aquecimento em estufa a 100ºC durante 1 minuto. Foram utilizados reagentes e
solventes grau P.A. das marcas Aldrich®, Carlo Erba
®, Fischer
®, Fluka
® e Merck
®.
As placas reveladas foram digitalizadas e a análise semi-quantitativa das imagens foi
realizada através do software ImageJ (software de domínio público, versão 1.49t), onde os
valores de área das manchas foram aferidos em sextuplicata e os dados obtidos foram
calculados com o auxílio do software Microsoft Excel®.
3.2.2.2 Determinação da espalhabilidade
Na realização desse teste utilizou-se como base uma folha de papel milimetrado e
sobre ela foram traçados os lados de uma lâmina de vidro para microscopia. Em seguida
traçou-se as diagonais da placa de vidro, formando-se assim o ponto central da mesma (Figura
3.3). Aplicou-se aproximadamente 25 mg de amostraà temperatura ambiente no centro de
uma lâmina de vidro, a qual foi posicionada sobre o desenho feito inicialmente na folha de
papel milimetrado. Uma outra lâmina de vidro, de peso determinado (5,9853 g, ou
aproximadamente 6,0 g), foi então suavemente posicionada sobre a primeira lâmina contendo
a amostra em análise e, após 1 minuto, anotou-se o raio médio do círculo formado pelo
espalhamento da amostra (de SOUZA, 2007). O mesmo procedimento foi seguido, sempre
com intervalos de 1 minuto, adicionando-se pesos aferidos de 2,5 g, 3,0 g e 4,5 g, conforme
tabela 3.3.
80
Figura 3.3 Teste de espalhabilidade: placa base sobre papel milimetrado (A); aplicação da
amostra (B); aplicação da lâmina de vidro sobre a amostra (C); aplicação dos pesos (D), onde
atingiu-se um peso máximo de 16,0 g, ao final do procedimento.
Tabela 3.3: Determinações de espalhabilidade e pesos utilizados.
Determinação Pesos utilizados
1ª Lâmina de vidro (6,0 g)
2ª Lâmina de vidro (6,0 g) + peso 2,5 g
3ª Lâmina de vidro (6,0 g) + peso 2,5 g + peso 3,0 g
4ª Lâmina de vidro (6,0 g) + peso 2,5 g + peso 3,0 g + peso 4,5 g
A partir dos valores de raios médios obtidos foram calculadas as áreas das superfícies
correspondentes, utilizando a fórmula de cálculo de área do círculo: área = πR2, onde π = 3,14
e R = raio do círculo, e construído um gráfico de espalhabilidade.
3.2.2.3 Determinação da viscosidade
A viscosidade das amostras foi estudada em um reômetro Haake RheoStress 1
(Alemanha) usando um sensor tipo placas paralelas de 35 mm diâmetro e os dados foram
analisados pelo software Haake RheoWin Data Manager. Aplicou-se, com uma espátula, uma
quantidade de amostra necessária para cobrir toda a superfície do sistema e o excesso de
material foi removido cuidadosamente. As amostras foram avaliadas mediante a aplicação de
tensão de cisalhamento no intervalo de 0,001 Pa a 300,0 Pa, realizado à temperatura ambiente
(25 ± 2ºC) controlada com banho termostático.
4. Resultados e Discussão
4.1 Desenvolvimento das formulações
Com o extrato vegetal devidamente caracterizado, tanto livre como microencapsulado,
os primeiros testes envolvendo formulação foram iniciados. Nas duas formas em que o extrato
ativo foi utilizado, detectou-se a presença dos compostos monitorados ao longo do trabalho.
A B C D
81
O extrato vegetal foi exposto aos excipientes utilizados como constituintes
majoritários das formulações sem que alterações significativas fossem observadas. Estudos
realizados anteriormente pelo grupo de pesquisa do CPQBA/UNICAMP (ALONSO, 2011)
serviram de base para informações relacionadas á pré-formulação do produto, auxiliando a
continuidade deste trabalho. Verificou-se que o extrato de P. pubescens é solúvel em
propilenoglicol e esse excipiente foi selecionado para auxiliar a incorporação do extrato ativo
nas formulações. Selecionou-se o propilenoglicol como cosolvente pelo fato de álcoois e
glicóis serem rotineiramente utilizados para solubilizar drogas lipofílicas (BENDAS et al.,
1995). O extrato utilizado possui característica lipofílica e a quantidade de cosolvente
utilizada foi de 5,0%, o mínimo necessário para a função desejada, não sendo avaliada a
possível função de promotor de absorção (enhancer).
Sabendo-se da variada composição dos extratos vegetais e das possibilidades de
incompatibilidade química entre os componentes da formulação, o estudo de produtos
contendo extratos vegetais normalmente parte da manipulação de formulações simples a fim
de evitar-se esse tipo de alteração, utilizando-se bases que possuem características precisas de
técnica, sensorial e funcional com média ou alta viscosidade (XAVIER-JUNIOR et al., 2012).
Diante disso, partiu-se de formulações com o menor número possível de constituintes, formas
farmacêuticas semissólidas clássicas como emulsões e géis, presentes tanto no Formulário
Nacional (BRASIL, 2012) quanto na literatura (PRISTA, 1990; FERREIRA, 2002;
AULTON, 2005).
As bases descritas na tabela 3.1 foram manipuladas e avaliadas de acordo com o teste
de centrifugação, verificando-se se a formulação é estável ou instável. Obteve-se o resultado
apresentado na tabela 3.4:
Tabela 3.4: Avaliação da estabilidade das bases semissólidas.
Bases Estáveis Bases Instáveis
F5 - Creme Lanette F1 - Cold Cream
F6 - Loção Lanette F2 - Emulsão A/O -I
F7 - Gel de Carbopol F3 - Emulsão A/O -II
F8 - Gel de Natrosol F4 - Emulsão A/O -III
As bases consideradas estáveis foram avaliadas na Etapa I do estudo de estabilidade.
As bases que apresentaram qualquer sinal de instabilidade nesse momento já indicaram a
necessidade de reformulação (AULTON, 2005; SOUSA, 2012) e foram, portanto,
descartadas. Todas as bases consideradas instáveis (F1, F2, F3, F4) apresentaram separação
82
de fases. A figura 3.4 apresenta a instabilidade observada em F1 após o período de
centrifugação.
Figura 3.4 Instabilidade de F1 observada após o teste de centrifugação: separação de fases,
onde a fração superior é composta pela fase oleosa e a fração inferior é formada pela fase
aquosa da emulsão.
O teste de centrifugação é baseado no princípio da força centrífuga, que separa dois
líquidos a partir de suas densidades e depende também da resistência do filme interfacial.
(XAVIER-JUNIOR et al., 2012). É uma ferramenta importante para avaliar o tempo de vida-
de-prateleira de emulsões (AKHTAR et al., 2011). Esse processo promove uma espécie de
distorção, ruptura de filmes emulsificantes (NASIRIDEEN et al., 1998), promovendo uma
diferença significativa quanto à avaliação da estabilidade de formulações sob essa condição e
sob as condições normais de armazenamento (AULTON, 2005; SOUSA, 2012).
4.2 Estudo de estabilidade: Etapa I
Nesta etapa foram avaliadas as bases estáveis (F5, F6, F7, F8) adicionadas do ativo
(extrato vegetal), na forma livre e na microencapsulada, com a concentração de 2,5%,
manipuladas e armazenadas conforme metodologia descrita.
4.2.1 Avaliação macroscópica e teste de centrifugação
Os resultados observados na avaliação macroscópica e no teste de centrifugação
encontram-se apresentados na tabela 3.5.
83
Tabela 3.5: Resultados de avaliação macroscópica e do teste de centrifugação das
formulações contendo extrato bruto livre e extrato bruto microencapsulado. Os produtos
foram comparados com seu respectivo placebo em cada etapa do teste.
A avaliação das formulações permitiu verificar que o placebo de F5 apresentou
mudança de aspecto a partir do quinto dia de teste. A base apresentou aspecto aerado e
diminuição na viscosidade, o que começou a descaracterizá-la visualmente. Esse mesmo
efeito foi observado nas amostras contendo o extrato vegetal, sendo que os frascos
armazenados em estufa e temperatura ambiente apresentam essa alteração a partir do segundo
dia e os frascos armazenados na geladeira a partir do quinto dia.
O placebo de F6 não apresentou mudanças de aspecto perceptíveis, o que pode ser
favorecido pelo tipo da base, que é mais líquida quando comparada ao F5. Com a adição do
ativo foi possível visualizar nitidamente a mesma alteração de aspecto que ocorreu em F5. A
presença de bolhas de ar e diminuição de viscosidade também descaracterizaram visualmente
esse produto. As amostras armazenadas nas três condições de temperatura apresentaram essa
alteração, sendo possível detectar a partir do segundo dia nas amostras armazenadas na estufa,
terceiro dia na temperatura ambiente e quarto dia na geladeira. Temperaturas elevadas
aceleram reações físico-químicas e químicas, ocasionandoalterações na atividade de
componentes, viscosidade, aspecto, cor e odor do produto.
A instabilidade de emulsões pode ser proveniente da incompatibilidade do extrato
ativo com os demais componentes da formulação; incompatibilidade de agentes
emulsionantes iônicos com substâncias de cargas opostas e presença de eletrólitos (AULTON,
Base Placebo Produto com adição de extrato
bruto livre
Produto com adição de extrato
bruto microencapsulado
F5
Alterações de aspecto Alterações de aspecto Alterações de cor e aspecto
Ausência de separação
de fases Ausência de separação de fases Separação de fases
F6
Sem alterações Alterações de odor e aspecto
Ausência de separação
de fases
Ausência de separação de fases
F7
Sem alterações Alterações de cor e odor Alterações de cor e aspecto
Ausência de separação
de fases
Ausência de separação de fases
Separação de fases
F8
Sem alterações Sem alterações de aspecto
Ausência de separação
de fases Ausência de separação de fases
84
2005; SOUSA, 2012). Apesar de buscar-se formulações do tipo não-iônicas, optou-se pela
utilização das bases F5 e F6, que são emulsões cremosas aniônicas, pelo fato de serem
consideradas veículos adequados para a incorporação de ativos lipossolúveis, como alguns
tipos de vitaminas, óleos e extratos vegetais, entre outros ativos (BRASIL, 2005).
Diante das observações realizadas os testes com as duas emulsões foram
interrompidos no sexto dia por conta das grandes mudanças de aspecto e também valores de
pH, que será abordado adiante.
O placebo de F7 (gel de característica aniônica) não apresentou mudança de aspecto
durante os 15 dias de avaliação em nenhuma das condições de temperatura as quais as
amostras foram expostas, e a adição do ativo a esta base apresentou ligeira alteração de cor
nas amostras armazenadas na estufa, o que foi perceptível a partir do terceiro dia e nesta
condição foi possível também verificar pequena alteração no odor, que ficou mais acentuado a
partir do décimo terceiro dia. As amostras que permaneceram sob temperatura ambiente
também apresentaram cor pouco mais acentuada a partir do décimo quarto dia.
O produto utilizando a base F8 (gel de caráter não iônico) não apresentou alterações
macroscópicas perceptíveis ao longo dos 15 dias de teste, tanto para o placebo quanto para a
formulação contento o extrato vegetal, nas três condições de temperatura.
Com base nos resultados descritos selecionou-se F7 e F5 para veicular o extrato
vegetal microencapsulado. A base F7 foi selecionada por apresentar melhores características
organolépticas quando comparada a F8 e F5, apesar de não ter apresentado bons resultados
com a adição do extrato vegetal livre, foi selecionada para comparar, verificar se os efeitos
observados seriam reproduzidos com o extrato microencapsulado. Essa escolha foi feita
também com o intuito de racionalizar o uso do material vegetal.
A base F6 não foi utilizada, pois sofreu alteração organoléptica importante após a
adição do extrato de Sucupira, diminuindo sua viscosidade. A base F8, não sofreu alterações
organolépticas perceptíveis, no entanto, é uma formulação com um aspecto sensorial
desagradável após aplicação na pele, é pegajosae a embalagem de vidro na qual o produto foi
envasado permitiu visualizar uma espécie de compactação de seu produto, sua manipulação
ao longo dos dias apresentou perda de espalhabilidade, tornando-se sensorial e visualmente
desinteressante.
As formulações contendo extrato microencapsulado apresentaram alteração de aspecto
logo após a adição das microcápsulas, conforme apresentado na figura 3.5:
85
Figura 3.5 Formulações contendo extrato de Sucupira microencapsulado: aspecto visualizado
logo após a adição do material vegetal. (A) Placebo de F7 à esquerda da imagem e seu
respectivo produto, ao lado direto. (B) Placebo de F5 à esquerda da imagem e seu respectivo
produto, ao lado direto.
Na figura 3.5 pode-se observar visualmente que ambas as formulações apresentaram
diminuição na viscosidade. O produto resultante da utilização de F7 (A) adquiriu um aspecto
líquido bem viscoso enquanto o resultante de F5 (B) apresentou tal alteração de forma um
pouco menos pronunciada, pois a formulação manteve o aspecto de semissólido.
Além da alteração imediata de aspecto, as amostras de F7 contendo extrato
microencapsulado apresentaram alteração de cor. Os frascos armazenados na estufa
apresentaram coloração mais acentuada a partir do oitavo dia, enquanto as amostras na
geladeira apresentaram coloração com menos brilho e coloração um pouco mais clara quando
comparadas à amostras expostas a temperatura ambiente, essa alteração iniciou-se a partir do
sexto dia. Os frascos de placebo não apresentaram nenhuma alteração macroscópica.
Incompatibilidades em formulações do tipo gelgeralmente acontecem entre o polímero
formador do gel e os outros constituintes da fórmula, principalmente após a incorporação de
extratos e tinturas, gerando processos de instabilidade, como turbidez, precipitação,
cristalização, alteração da cor, alteração de odor, variação de viscosidade e desestruturação da
cadeia polimérica (SOUSA, 2012). Porém, é importante observar que a incorporação de
extratos vegetais pode causar a ruptura ou o enfraquecimento de forças intermoleculares dos
agentes gelificantes, mudando as características do gel, porém, tais mudanças em sua
viscosidade não implicam necessariamente em instabilidade química (LIM et al., 2008).
Nas formulações utilizando F5 como base, além da alteração de aspecto inicial, foi
possível observar o mesmo aspecto aerado observado na formulação contendo extrato livre.
Houveram também as mesmas alterações de cor descritas para o gel, detectadas a partir do
sexto dia tanto para amostras armazenadas na estufa quanto na geladeira. Suspeita-se que
essas alterações de cores observadas podem ser decorrentes da interação do material de parede
com a água disponível nas bases semissólidas. A goma do cajueiro é solúvel em água e com o
A B
86
passar do tempo ela pode ter se solubilizado, o que pode ter propiciado a exposição do
conteúdo interno das microcápsulas, acentuando a coloração amarelada das formulações
quando armazenadas em estufa. Outra situação que pode ter ocorrido é a em que o material de
parede pode ter reagido com a água presente no sistema e gelificado, resultando em uma
coloração mais clara e opaca quando as formulações foram expostas à baixa temperatura da
geladeira, essa atividade é observada quando a goma do cajueiro é utilizada com esse
propósito.
Os resultados do teste de centrifugação mostraram que nessa etapa nenhuma das
formulações contendo o extrato bruto livre apresentaram separação de fases. O mesmo não
ocorreu para as formulações contendo o extrato microencapsulado, todas as formulações
testadas apresentaram separação de fases. As evidências de instabilidade apresentadas logo
após a adição das microcápsulas em F7 e F5, apresentadas na figura 3.5, confirmaram-se após
a centrifugação dos produtos. As amostras expostas às três condições diferentes de
temperatura apresentaram separação de fases, essa instabilidade indica que os produtos devem
ser reformulados. Essa alteração imediata de viscosidade observada no produto é atribuída à
reação de hidrólise, comum aos polímeros de polissacarídeos solúveis em água, como a goma
do cajueiro, e acelerada por temperaturas elevadas e elevada acidez, segundo informações
técnicas provenientes de fabricantes de excipientes.
4.2.2 Determinação dos valores de pH
A figura 3.6 apresenta os valores de pH observados ao longo dos dias nas três
diferentes condições de armazenamento, comparando-se o placebo com o produto contendo
extrato bruto livre enquanto a figura 3.7 compara da mesma maneira o placebo e o extrato
bruto microencapsulado.
87
Base Placebo Produto com extrato bruto livre
F5
F6
F7
F8
Figura 3.6 Variações de pH nas três condições de armazenamento das bases F5, F6, F7 e F8:
comparação entre placebo e produto contendo extrato bruto livre.
88
Base Placebo Produto com extrato bruto
microencapsulado
F5
F7
Figura 3.7 Variações de pH nas três condições de armazenamento das bases F5, F6, F7 e F8:
comparação entre placebo e produto contendo extrato bruto microencapsulado.
Os gráficos apresentados nas figuras 3.6 e 3.7 demonstram que houve variação no pH
das formulações ao longo dos 15 dias de avaliação. Tais alterações podem ser decorrentes de
oscilações entre as calibrações diárias do pHmetro, por exemplo. O extrato diclorometano de
Sucupira apresenta pH médio de 4,29 e sua adição às bases causou queda no pH inicial das
emulsões (F5 e F6) enquanto os géis (F7 e F8) permaneceram estáveis.
Considerando-se os maiores e menores valores de pH observados ao longo do teste,
em cada uma das três condições avaliadas foi calculada a porcentagem de variação do pH para
as amostras. Para F5 foi possível observar variação de 5,11% para o placebo, de 11,24% para
as formulações contendo extrato livre e de 9,63% para formulações contendo extrato
microencapsulado. Para F6 o placebo variou 14,83% e as formulações com extrato livre
variaram 27,82%. O placebo de F7 variou 5,17%, as formulações com extrato livre variaram
seu pH em 4,82% e 5,24% para as formulações com extrato microencapsulado. Para a F8 o
placebo variou 13,30% e as formulações contendo extrato livre variaram 8,58%.
89
O valor de pH também foi um critério avaliado para a exclusão de formulações, sendo
considerados tanto a porcentagem de variação observada quanto o valor de pH médio
observado. Formulações que apresentaram variações acima de 10% foram consideradas
inapropriadas, já que esse valor foi considerado limite para as oscilações encontradas
(BRASIL, 2004; CEFALI, 2009). A redução de pH de formulações em diferentes condições
de armazenamento pode ser decorrente da produção de algum metabólito ácido ou
decomposição de um dos excipientes durante o processo de aquecimento (AKHTAR et al.,
2011).
Para emulsões, esse tipo de análise é uma ferramenta simples, que sugere início de
instabilidade, uma vez que um significativo decaimento desse parâmetro indica possível
degradação da cadeia do surfactante, o que poderá causar instabilidade entre a fase interna e a
fase externa da emulsão (XAVIER-JUNIOR et al., 2012). Formulações com variação do pH
final podem causar degradação do extrato vegetal, que além dste fator é também afetado por
diferentes condições de armazenamento (VERTUANI et al., 2011).
Também foi considerado como critério o valor de pH cutâneo. O pH da pele normal é
levemente ácido e situa-se entre 4,5 e 6,0. Formulações de uso tópico devem ter o pH
compatível com o da pele, prevenindo dessa maneira uma eventual irritação oriunda de
valores extremos de pH (GOMES e DAMAZIO, 2009). Sendo assim, formulações que
apresentaram pH fora (abaixo) desse intervalo também foram desconsideradas para o estudo
de estabilidade acelerado.
Diante do exposto, os estudos envolvendo F5 e F6 junto ao extrato livre foram
interrompidos no sexto dia. Isso se deu porque além de apresentarem alterações nos aspectos
macroscópicos, as formulações utilizando F5 como base contendo extrato livre apresentaram
pH médio de 4,77 e variação de 11,24% entre o pH mínimo e máximo observado.
Formulações utilizando F6 e extrato livre apresentaram pH médio de 3,96 e variação de pH de
27,82%. Os placebos de F5 e F6 apresentaram pH médio de 6,56 e 5,30, respectivamente,
sendo considerados aceitáveis, e variações de 5,11% e 14,83%, o que leva somente a
considerar F5 como um tipo de base aceitável, se não fossem as mudanças provenientes das
formulações contendo o extrato ativo.
A base F5 se mostrou inadequada para veicular o extrato vegetal livre, mas foi
utilizada na avaliação do extrato microencapsulado. O estudo teve duração de 15 dias para se
avaliar melhor seu desempenho junto ao material vegetal protegido. Apesar do pH médio da
formulação ter sido de 4,33, e de ela ter apresentado separação de fases, o que serviu para
descartá-la, a variação do pH ao longo do teste foi de 9,63% o que foi considerado positivo. A
90
melhora dessa condição comparada ao observado no extrato livre é decorrente da
encapsulação do extrato vegetal.
A base F7 apresentou pH médio de 6,89 para o placebo, 6,87 para formulações
contendo extrato livre e 6,16 para formulações com extrato microencapsulado. Foi a
formulação que apresentou melhor desempenho considerando-se valores de pH (tanto pH
médio quanto porcentagem de variação), porém, o produto contendo o extrato
microencapsulado foi descartado por apresentar separação de fases no teste de centrifugação.
A base F8 apresentou pH médio de 5,85 para o placebo e 5,56 para o produto com
extrato livre. A variação de pH observada para o placebo e as características macroscópicas
descritas levaram ao descarte dessa formulação.
Comparando-se os dois géis, o gel de caráter aniônico apresentou melhor desempenho,
essa observação pode sugerir que não ocorreram incompatibilidades do tipo iônicas,
provenientes de substâncias de cargas opostas, predominando assim componentes com cargas
favoráveis ao sistema proporcionado pelo gel.
Com base nos resultados expostos, o estudo de estabilidade acelerado foi realizado
com a base F7, acrescida de 2,5% de extrato bruto livre como material vegetal ativo.
4.3 Estudo de estabilidade: Etapa II
4.3.1 Avaliação macroscópica e teste de centrifugação
Assim comona Etapa I, a avaliação macroscópica de F7 contendo extrato bruto livre
consistiu em observar características organolépticas como cor, odor e aspecto das formulações
semissólidas. As amostras que permaneceram à temperatura ambiente e ao abrigo da luz (TA)
foram tratadas como referência para o produto, sendo comparadas com as que foram expostas
às temperaturas de 40 ± 2ºC (ESTUFA) e luz indireta (LI). Durante todo o teste também
foram avaliados os placebos das formulações testadas, de forma a concluir que alterações que
fossem observadas não fossem decorrentes da base em si e/ou do processo de manipulação.
Os resultados desta etapa apresentam-se nas tabelas 3.6 e 3.7.
91
Tabela 3.6: Avaliação macroscópica do placebo de F7 exposto nas três diferentes condições
de armazenamento durante 180 dias.
Tabela 3.7: Avaliação macroscópica do produto de F7 com 2,5% de extrato livre de Sucupira
exposto nas três diferentes condições de armazenamento durante 180 dias.
Placebo
Estufa Temperatura Ambiente Luz indireta
0 dias Sem alterações Sem alterações Sem alterações
30 dias Sem alterações Sem alterações Alterações de cor e aspecto
60 dias Sem alterações Sem alterações Alterações de cor, odor e
aspecto
90 dias Sem alterações Sem alterações Alterações de cor, odor e
aspecto
120 dias Sem alterações Sem alterações Alterações de cor, odor e
aspecto
150 dias Sem alterações Sem alterações Alterações de cor, odor e
aspecto
180 dias Sem alterações Sem alterações Alterações de cor, odor e
aspecto
Produto
Estufa Temperatura Ambiente Luz indireta
0 dias Sem alterações Sem alterações Sem alterações
30 dias Sem alterações Sem alterações Sem alterações
60 dias Sem alterações Sem alterações Alterações de cor e
aspecto
90 dias Alterações de cor Sem alterações Alterações de cor, odor e
aspecto
120 dias Alterações de cor e
odor Alterações de cor
Alterações de cor, odor e
aspecto
150 dias Alterações de cor e
odor Alterações de cor
Alterações de cor, odor e
aspecto
180 dias Alterações de cor e
odor Alterações de cor
Alterações de cor, odor e
aspecto
92
Conforme apresentado nas tabelas 3.6 e 3.7, tanto o placebo quanto o produto
apresentaram grande alteração quando expostos à luz indireta. Nestas condições o placebo se
liquefez, enquanto o aspecto do produto também se alterou, apresentando diminuição de
viscosidade, ainda se mantendo como uma forma farmacêutica semissólida. O odor do
produto também se alterou, ficando cada vez mais suave com o passar dos dias de análise e
sua cor também sofreu alteração, tornando-se mais clara. Placebo e produto não tiveram seus
aspectos alterados quando expostos à temperatura elevada ou mesmo à temperatura ambiente
no período de teste, apenas notou-se alteração em sua viscosidade. Amostras do produto
armazenadas em estufa apresentaram leve acentuação do odor a partir do quarto mês. Houve
leve mudança de cor, que se tornou um pouco mais escura, para o produto armazenado em
estufa a partir do terceiro mês e a partir do quarto mês para o produto que permaneceu à
temperatura ambiente.
Figura 3.8 Placebo T0, T6 armazenado à temperatura ambiente, T6 armazenado sob luz
indireta e T6 armazenado em estufa.
T0 T6 - ES T6 - LI T6 - TA
93
Figura 3.9 Produto T0, T6 armazenado à temperatura ambiente, T6 armazenado sob luz
indireta e T6 armazenado em estufa.
Figura 3.10 Produto exposto à temperatura ambiente nos tempos T0, T3 e T6.
Figura 3.11 Produto exposto à temperatura elevada nos tempos T0, T3, T6.
Figura 3.12 Produto exposto à luz indireta nos tempos T0, T3, T6.
T6 - TA T6 - LI T6 - ES T0
T0 T3 T6
T0
T0 T3 T6
T3 T6
94
A alteração observada no placebo exposto à luz indireta é causada pela própria
condição criada em seu armazenamento, não é resultante de instabilidade da formulação ou de
falha ocorrida durante o seu processo de manipulação, uma vez que se produziu um único lote
de base semissólida e o mesmo foi fracionado de acordo com as quantidades necessárias para
cada condição avaliada no estudo de estabilidade acelerado. Se houvesse qualquer problema
relacionado aos fatores expostos acima as mesmas alterações seriam esperadas nos outros
frascos de placebo. Essa mesma amostra, que se mostrou alteradaquando exposta à luz,
apresentou pequena mudança de cor, sem aumento de turbidez ao longo dos 6 meses de
estudo, excluindo-se assim a possibilidade da alteração observada ser decorrente de
contaminação microbiológica.
O fenômeno da perda de viscosidade pode ser decorrente da alteração da estrutura do
carbômero por efeito da radiação UV, que afeta a estrutura estereoquímica do polímero
causando a perda da rede e a conversão para cadeia linear. Segundo literatura técnica
proveniente dos fabricantes da matéria-prima, como este fenômeno não envolve a alteração da
estrutura do ácido acrílico o pH permanece constante, conforme observado, não havendo
mudanças na relação estequiométrica. Nesse trabalho optou-se por utilizar embalagem
impermeável de vidro transparente, justamente para desafiar as amostras, expondo ao máximo
as formulações às diferentes condições de temperatura e luminosidade para determinar as
possíveis alterações produzidas. O Carbopol é um polímero adequado para base gelificante e
selecionado, em estudo comparativo envolvendo o desenvolvimento de um fitoterápico de uso
tópico, como o material que apresentou maior estabilidade nas diferentes condições de
temperatura às quais o produto foi exposto (SINGH et al., 2008).
Alterações de cor e odor também são relatadas na literatura, fitoterápicos de uso tópico
podem apresentar alterações em suas características organolépticas por conta de elevadas
temperaturas e essas alterações não são consideradas significativas, acarretam a necessidade
de orientação ao paciente quanto à temperatura e ao local de acondicionamento adequado, de
acordo com este tipo de formulação (SINGH et al., 2008).
Nessa etapa foi possível observar que, nas diferentes condições avaliadas, nenhuma
das amostras apresentou separação de fases no teste de centrifugação. Esse resultado indica
que o produto em estudo é estável, não tendo sido observadas incompatibilidades entreos
componentes da formulação.
95
4.3.2 Determinação dos valores de pH
A figura 3.13 apresenta os valores de pH do placebo F7 e do produto de F7 contendo
2,5% de extrato bruto livre de Sucupira observados ao longo dos teste (180 dias) em 2
condições de armazenamento, temperatura ambiente e estufa.
Placebo F7 Produto F7 contendo 2,5% de extrato bruto
livre de Sucupira
Figura 3.13 Valores de pH do placebo F7 e do produto de F7 contendo 2,5% de extrato bruto
livre de Sucupira observados ao longo dos 180 dias de estudo de estabilidade armazenado à
temperatura ambiente, estufa e luz indireta.
Os gráficos apresentados demonstram que houve variação no pH das formulações ao
longo do período de avaliação. Considerando-se os maiores e menores valores de pH
observados ao longo do teste, para o placebo foi possível observar variação no pH de 3,23%
para o armazenamento à temperatura ambiente e ao abrigo da luz, de 8,50% para as amostras
armazenadas em estufa, e de 4,99% para as amostras expostas à luz indireta. Para o produto
foi possível observar variação de 3,22% para amostras armazenadas à temperatura ambiente e
ao abrigo da luz, de 9,36% para as amostras armazenadas em estufa, e de 21,93% para as
amostras expostas à luz indireta.
De acordo com o critério definido no estudo anterior, formulações que apresentaram
variação acima de 10% foram consideradas inapropriadas, já que esse valor foi considerado
limite para as oscilações encontradas (BRASIL, 2004; CEFALI, 2009). O produto em estudo
apresentou variação acima do permitido somente quando exposto à luz indireta, como
comentado anteriormente, sabe-se que a alteração observada é resultante do meio
proporcionado pela radiação solar e não decorrente do produto formulado. Tanto a radiação
quanto a elevação da temperatura associada podem levar à produção de metabólito ácido,
96
decomposição de excipiente durante o processo de aquecimento e, degradação do extrato
vegetal causando a redução do pH (AKHTAR et al., 2011). No que se refere à
compatibilidade do pH do produto com o pH da pele, definido no estudo de estabilidade
preliminar, as variações que ocorreram ao longo dos 180 dias são consideradas aceitáveis.
4.3.3 Doseamento dos compostos ativos
Amostras do produto F7, contendo 2,5% de extrato ativo livre e expostas à
temperatura ambiente, foram analisadas nos tempos T0 (início do estudo, após término da
manipulação do produto e sua estabilização), T3 (90 dias) e T6 (180 dias) para doseamento
dos compostos ativos, os vouacapanos. Os resultados encontram-se na figura 3.14.
Figura 3.14 Doseamento dos compostos vouacapanos no produto F7 contendo 2,5% de
extrato livre de Sucupira exposto à temperatura ambiente (TA). Análises realizadas no início
do estudo de estabilidade (T0), após 90 dias (T3) e 180 dias (T6).
Os resultados presentes na figura 3.13 demonstraram de forma semi-quantitativa que
os compostos vouacapanos se mantiveram estáveis nas análises realizadas no início do estudo
e após 90 dias, sendo que a análise seguinte apresentou aumento do teor, provavelmente
devido à perda de água das amostras, concentrado o produto (Tabela 3.8). As amostras
expostas à temperatura elevada apresentaram grande perda de água, não permitindo o
doseamento dos compostos vouacapanos. As amostras expostas à luz indireta não
apresentaram os compostos de interesse nas placas de CCD (Figura 3.16), sugerindo sua
degradação.
97
Tabela 3.8: Concentrações de vouacapanos presentes nas amostras de produto analisadas.
Concentração de vouacapanos (mg/100g de produto ± DP) em
amostras armazenadas à temperatura ambiente
T0 (0 dias) T3 (90 dias) T6 (180 dias)
3,28 ± 0,10 3,12 ± 0,03 8,74 ± 0,40
As concentrações de vouacapanos presentes nas amostras de produto analisadas
(Tabela 3.8) foram calculadas utilizando as equações I e II, sendo a equação I obtida através
da curva analítica construída junto à análise por CCD do produto em 0 e 90 dias (Figura 3.15)
e a equação II construída na análise após 180 dias (Figura 3.16).
I = y = 88,76x + 372,3
II = y = 51,31x + 1017
Figura 3.15 CCD para doseamento de vouacapanos. Amostras de produto no início do estudo
(0 dias) e após 90 dias, armazenado à temperatura ambiente.
Figura 3.16 CCD para doseamento de vouacapanos. Amostras de produto após 180 dias,
armazenado à temperatura ambiente.
Padrão (1 a 6 µL)
Produto TA
90 dias
Produto TA
0 dias
Padrão (1 a 6 µL)
Produto TA
180 dias
98
Figura 3.17 CCD de amostras de produto após 90 e 180 dias, expostos à luz indireta.
A técnica empregada para o doseamento dos compostos vouacapanos foi utilizada de
forma predominantemente qualitativa, uma vez que não permite quantificação precisa, não é
um método sensível. Ela foi utilizada em substituição às técnicas de CG-EM e CLAE-DAD
devido à ocorrência de interferência de contituintes da matriz.
4.3.4 Determinação da espalhabilidade
A espalhabilidade do produto F7 contendo 2,5% de extrato bruto livre de Sucupira foi
determinada ao submeter cerca de 25 mg de amostra a sucessivos acréscimos de peso e
observação do seu espalhamento de acordo com o cálculo da área apresentada. Primeiramente
verificou-se se o método aplicado apresentava linearidade, característica que se confirmou:
com a aplicação dos pesos selecionados ocorreu aumento da espalhabilidade da amostra
(Figura 3.18).
Padrão (1 a 6 µL)
Produto LI
180 dias
Produto LI
90 dias
99
Figura 3.18 Espalhabilidade do placebo (A) e do produto (B) verificada no início do estudo:
método selecionado apresenta linearidade
A tabela 3.9 apresenta os resultados observados das amostras nas três diferentes
condições de armazenamento.
100
Tabela 3.9: Espalhabilidade do placebo F7 e seu produto contendo 2,5% de extrato livre de P.
pubescens exposto à três diferentes condições de armazenamento durante um período de 180
dias.
T0
peso (g) Placebo Produto
raio médio (mm) área média(mm2) ± DP raio médio (mm) área média
(mm2) ± DP 6,00 8,25 213,72 ± 0,75 7,08 157,55 ± 0,81
8,50 9,58 288,38 ± 0,94 8,29 215,88 ± 1,31
11,50 10,50 346,19 ± 1,38 9,29 271,09 ± 1,88
16,00 11,33 403,32 ± 1,25 10,04 316,62 ± 2,25
T3 (90 dias)
TA Placebo Produto
peso (g) raio médio (mm) área média(mm2) ± DP raio médio (mm) área média
(mm2) ± DP 6,00 7,00 153,86 ± 0,88 6,21 121,03 ± 0,95
8,50 8,96 251,99 ± 0,51 7,08 157,55 ± 0,80
11,50 10,13 321,90 ± 0,57 7,79 190,63 ± 0,95
16,00 11,08 385,72 ± 0,51 8,33 218,06 ± 1,40
ESTUFA Placebo Produto
peso (g) raio médio (mm) área média(mm2) ± DP raio médio (mm) área média
(mm2) ± DP 6,00 5,25 86,55 ± 0,90 6,25 122,66 ± 1,15
8,50 5,79 105,33 ± 0,95 7,25 165,05 ± 1,15
11,50 6,29 124,30 ± 1,08 7,96 198,87 ± 1,53
16,00 7,13 159,40 ± 0,88 8,46 224,65 ± 1,61
LI Placebo Produto
peso (g) raio médio (mm) área média(mm2) ± DP raio médio (mm) área média
(mm2) ± DP 6,00
8,21 211,56 ± 0,51
8,50
N/A
9,46 280,90 ± 0,69
11,50
10,29 332,58 ± 0,69
16,00 10,92 374,21 ± 0,62
T6 (180 dias)
TA Placebo Produto
peso (g) raio médio (mm) área média(mm2) ± DP raio médio (mm) área média
(mm2) ± DP 6,00 6,08 116,20 ± 0,62 5,83 106,85 ± 0,56
8,50 7,08 157,55 ± 0,52 6,50 132,67 ± 0,25
11,50 8,21 211,56 ± 0,62 7,17 161,27 ± 0,56
16,00 8,88 247,32 ± 0,50 8,04 203,06 ± 0,38
ESTUFA
Placebo
Produto peso (g) raio médio (mm) área média(mm2) ± DP raio médio (mm) área média
(mm2) ± DP 6,00 4,17 54,51 ± 0,14 4,29 57,83 ± 0,19
8,50 4,88 74,62 ± 0,22 4,83 73,35 ± 0,29
11,50 5,25 86,55 ± 0,22 5,08 81,14 ± 0,19
16,00 5,58 97,89 ± 0,07 5,71 102,32 ± 0,19
LI Placebo Produto
peso (g) raio médio (mm) área média(mm2) ± DP raio médio (mm) área média
(mm2) ± DP 6,00
8,83 245,01 ± 0,94
8,50
N/A
9,96 311,39 ± 1,40
11,50
10,92 374,21 ± 1,75
16,00 11,42 409,27 ± 1,79
101
De acordo com os resultados o placebo de F7 apresenta maior espalhabilidade que o
produto de F7 contendo 2,5% de extrato bruto livre, e essa condição inverte-se quando as
amostras são armazenadas em estufa, onde o produto passa a ter maior espalhabilidade que o
placebo. Tanto o placebo quanto o produto apresentam diminuição na espalhabilidade ao
longo dos 180 dias de estudo, essa alteração é atribuída à perda de água com o passar do
tempo (e mais acentuada quando as amostras se encontram em estufa), que leva a um aumento
na viscosidade e consequente diminuição da espalhabilidade. O comportamento observado no
teste de espalhabilidade é confirmado na determinação da viscosidade. A embalagem utilizada
é impermeável, porém a perda de água é decorrente de uma vedação ineficiente, pois os
frascos apresentaram variação de peso ao longo de estudo, de forma muito variada, não sendo
possível estabelecer um padrão ou outra correlação ao longo do período de estudo.
Não foi possível determinar a espalhabilidade do placebo exposto à luz indireta porque
o mesmo se descaracterizou ao longo do estudo, havendo perda de viscosidade, extravasando
os limites da lâmina utilizada. O produto nessa mesma condição também apresentou grande
mudança de aspecto, mas ainda foi possível determinar sua espalhabilidade, que aumentou ao
longo do estudo, condizendo com o aspecto observado, que se apresentava cada vez menos
viscoso. Tal mudança quase comprometeu a realização do teste no tempo de 180 dias, as
amostras se aproximaram dos limites da lâmina.
A espalhabilidade é uma característica importante para o tipo de formulação em
estudo, sendo responsável pela transferência correta da dose no local de aplicação (ALVES,
2006). Em um produto com boa espalhabilidade observa-se maior distribuição do produto por
área de aplicação, logo após o preparo e sem alteração significativa no decorrer do período de
armazenamento (MILAN et al., 2007).
O estudo realizado mostrou que as formulações analisadas apresentaram alterações ao
longo do tempo. Não foi encontrado nenhum relato na literatura de formulações utilizando
extrato de Sucupira. A princípio é possível afirmar que a adição do extrato vegetal à base
semissólida utilizando o carbômero como doador de viscosidade alterou a espalhabilidade do
produto, conforme descrito anteriormente. O extrato de Sucupira auxiliou na retenção de água
no produto, levando o mesmo a apresentar maior espalhabilidade que o placebo quando
expostos à elevada temperatura, apesar das duas amostras terem espalhabilidade menor que a
apresentada inicialmente. A alteração nas amostras expostas à luz indireta, conforme
justificado anteriormente, permite concluir que a adição do extrato auxiliou de certa forma na
manutenção do aspecto da forma farmacêutica, porém com alteração da sua espalhabilidade.
102
As alterações relatadas correspondem ao observado na literatura, formulações que
também utilizaram Carbopol com a mesma finalidade na formulação, apresentaram alterações
na espalhabilidade coerentes com as observadas: as amostras armazenadas em estufa
apresentaram diminuição na espalhabilidade ao longo do tempo e amostras expostas à luz
indireta apresentaram aumento na espalhabilidade (CORDEIRO et al., 2013).
4.3.5 Determinação da viscosidade
A viscosidade é um dos parâmetros físico-químicos avaliados durante o teste de
estabilidade acelerada que compreende o estudo das propriedades de escoamento de um fluido
(CEFALI, 2009). De acordo com a metodologia descrita anteriormente obteve-se os
reogramas apresentados na figura 3.19.
103
Placebo F7 Produto F7 contendo 2,5% de extrato
bruto livre de Sucupira
Temperatura ambiente
Estufa
Luz Indireta
*Amostra perdeu viscosidade
Figura 3.19 Reogramas apresentando a variação da viscosidade aparente do placebo F7 e
Produto F7 contendo 2,5% de extrato bruto livre de Sucupira nas três condições de
armazenamento nos tempos T0 (0 dias), T3 (90 dias) e T6 (180 dias).
104
Os reogramas apresentados na figura 3.19 apresentam a viscosidade aparente (KPa.s)
em relação à velocidade de cisalhamento (s-1
) e é possível verificar que tanto placebo quanto
produto apresentam diminuição do valor de viscosidade aparente e diminuição da velocidade
de cisalhamento, resultantes de aumento da tensão aplicada (apesar de algumas amostras
apresentarem certa variação no início da análise), sem relação linear, o que caracteriza o
comportamento não-Newtoniano das amostras, esperado pelo tipo de forma farmacêutica
utilizada.
Por esses mesmos reogramas é possível verificar que para ambas as amostras,
armazenadas à temperatura ambiente e em estufa, ocorre aumento da viscosidade ao longo
dos 180 dias de estudo de estabilidade. Nota-se, para placebo e produto, que a viscosidade
observada em estufa é maior que a observada à temperatura ambiente e isso se mantém com o
passar dos dias. As amostras expostas à luz indireta apresentaram redução da viscosidade e a
amostra de placebo acabou por sofrer perda de viscosidade não sendo foi possível avaliá-la
conforme metodologia definida, obtendo-se somente o reograma do produto nessa condição.
Esses resultados correlacionam-se com os obtidos na determinação da espalhabilidade,
conforme esperado.
Ressalta-se que o aumento no valor de viscosidade aparente das formulações é
justificado pela vedação inadequada da embalagem, conforme citado anteriormente, essa
mesma situação, com o mesmo tipo de embalagem utilizada, é observada na literatura, onde a
possível justificativa para tal resultado seriam as trocas gasosas entre o produto e o ambiente,
por meio da tampa do material de acondicionamento, permitindo a rápida evaporação da água
quando a formulação foi armazenada em temperatura elevada (DE FARIA et al., 2012), essa
situação é também descrita nos catálogos das empresas fabricantes do carbômero: o aumento
da viscosidade no envelhecimento do produto é resultante da evaporação de água na
estocagem.
A maioria dos fluidos farmacêuticos (o que se entende por sistemas coloidais ou
dispersos, incluindo emulsões, suspensões e géis) não obedece à lei de Newton, bases
semissólidas apresentam variação de sua viscosidade de acordo com a velocidade de
cisalhamento (AULTON, 2005), esse tipo de comportamento que foi observado, tanto para o
placebo quanto para o produto, no estudo realizado ao longo dos 6 meses. Os reogramas da
figura 3.20 apresentam as curvas de fluxo ao final de 180 dias de estudo.
105
Placebo F7 Produto F7 contendo 2,5% de extrato bruto
livre de Sucupira
Temperatura ambiente
Estufa
Luz Indireta
*Amostra perdeu viscosidade
Figura 3.20 Curvas de fluxo de placebo F7 e Produto F7 contendo 2,5% de extrato bruto livre
de Sucupira: viscosidade das amostras ao final de 180 dias nas três diferentes condições de
armazenamento.
106
As curvas de fluxo apresentadas acima relacionam a tensão de cisalhamento (Pa) em
relação à velocidade de cisalhamento (s-1
) e por meio delas é possível confirmar que tanto o
placebo quanto o produto apresentam outra característica descrita pela literatura para o gel
utilizado, comportamento não-newtoniano de fluxo pseudoplástico. A adição do extrato
vegetal não alterou o comportamento esperado para esse tipo de formulação.
Algumas divergências são observadas entre as determinações de espalhabilidade e
viscosidade e são atribuídas ao modo como os testes foram realizados, além de sensibilidade,
diferença na quantidade de amostra utilizada, presença de bolhas nas amostras e outras
interferências no sensor do equipamento. Segundo literatura fornecida pelos fabricantes do
carbômero pode ocorrer redução da viscosidade do gel de Carbopol quando ativos ácidos são
adicionados a esses géis, e a isso se atribui a pequena variação observada entre placebo e
produto, o qual possui menor viscosidade. O extrato vegetal é pouco mais ácido que a base
formulada, apesar de não se observar variações no pH quando adicionou-se o extrato à base
semissólida, verificando-se pequena variação na viscosidade.
5 Conclusão
O estudo de estabilidade demonstrou que a base F7 (gel de Carbopol) apresentou as
melhores características para ser avaliada com a adição do extrato de Sucupira. A técnica de
microencapsulação do extrato vegetal proporcionou menor variabilidade nos valores de pH
das formulações, mas o material de parede selecionado apresentou incompatibilidade com os
demais excipientes utilizados na formulação, resultando em separação de fases no teste de
centrifugação. O gel de Carbopol contendo 2,5% de extrato vegetal bruto livre apresentou,
além das melhores características organolépticas, valores de pH compatíveis com o pH da
pele e estáveis no estudo de 180 dias, estabilidade no teste de centrifugação e não ocorreram
grandes mudanças de aspecto. A adição do extrato vegetal manteve as características
esperadas para a base selecionada e a via de aplicação desejada, o produto é um fluido não-
Newtoniano pseudoplástico, da mesma forma que o placebo, avaliado paralelamente no
estudo realizado. As alterações observadas na espalhabilidade do produto relacionam-se com
as variações em sua viscosidade e são justificadas pela embalagem utilizada, que mesmo
sendo impermeável não apresentou vedação adequada.
107
CAPÍTULO IV: ESTUDOS INICIAIS PARA AVALIAÇÃO DA PERMEAÇÃO
PERCUTÂNEA DO PRODUTO: SELEÇÃO DO LÍQUIDO RECEPTOR ATRAVÉS
DA TÉCNICA DE LIBERAÇÃO PERCUTÂNEA IN VITRO
1. Introdução
1.1 A pele
A pele é o maior órgão do corpo humano, protege estruturas e órgãos internos do
corpo e controla a passagem de substâncias químicas. É provida da flora cutânea, que pode ser
permanente (microrganismos saprófitos e não patogênicos) e ocasional patogênica (resultante
de contaminação). A pele é estruturada em 3 camadas: epiderme, derme e hipoderme. A
epiderme é a camada mais externa, constituída por epitélio pavimentoso e estratificado,
avascular, com 4 tipos de células (queratinócitos, melanócitos, células de Langerhans e
células de Merkel) e espessura variável ao longo do corpo. A derme tem como função
sustentar e nutrir a epiderme e seus anexos, ela é provida de água (20 a 40% da água do
corpo), tecido conjuntivo firme, flexível e elástico, e é atravessada por vasos sanguíneos
(transporte de nutrientes, remoção de impurezas, regulação da pressão e da temperatura
corpórea). Abaixo dessas camadas encontra-se a hipoderme, que por sua vez, tem a função de
unir a derme aos órgãos, sendo formada por tecido conjuntivo frouxo e adiposo, de espessura
variável, atuando como amortecedor mecânico, barreira térmica e estoque energético
(JUNQUEIRA, 1999).
A pele tem a função essencial de proteger o organismo da desidratação e das agressões
provenientes do meio externo. Desta forma, a pele pode ser dita parcialmente permeável às
substâncias químicas, permite a passagem de compostos ativos em certas condições, podendo
ser considerada uma interface terapêutica. Assim, embora a pele represente uma barreira à
penetração de substâncias, existem várias formas farmacêuticas de uso tópico que sofrem
permeação, inclusive algumas de uso sistêmico (ANSEL et al., 2000; LIRA, 2003).
1.2 Permeação percutânea
A permeação das camadas que formam a pele ocorre por difusão através de duas vias:
a via transepidérmica, que compreende a penetração transcelular (através das células) e a
penetração intercelular (entre as células); e via transanexal (através dos folículos pilosos,
glândulas sebáceas e dispositivo pilossebáceo). Se a pele estiver intacta, a principal via de
administração são as camadas epidérmicas e não os folículos pilosos, pois sua área superficial
108
é bastante pequena quando em comparação com a área da pele, que não contém nenhum
desses elementos anatômicos (ANSEL et al., 2000; LIRA, 2003).
A permeação percutânea corresponde, portanto, à liberação do(s) composto(s) ativo(s)
do veículo, primeiramente, seguida da sua penetração através do estrato córneo, passando os
tecidos epidérmicos mais profundos e atingindo a derme, que é vascularizada e onde o(s)
composto(s) tornam-se disponíveis para a absorção sistêmica e atividade farmacológica
(ANSEL et al., 2000; LIRA, 2003; CAON, 2009). Ela depende de três fatores principais e
indissociáveis: a pele, o princípio ativo e o veículo. A escolha do veículo é primordial porque
certos excipientes podem favorecer a penetração na pele, aumentando a afinidade da(s)
molécula(s) ativa(s) pelo estrato córneo ou alterando reversivelmente a permeabilidade deste
(DAL’BELO, 2008).
A permeação percutânea pode ser influenciada pelos seguintes fatores:
- Fatores fisiológicos e patológicos da pele:
Estado da pele;
Idade;
Local de aplicação;
Variação inter-espécies;
Metabolismo cutâneo.
- Fatores físico-químicos:
Hidratação cutânea;
Temperatura;
Características do princípio ativo (como massa molecular, estado de ionização
da molécula, por exemplo);
Concentração inicial;
Relação coeficiente de partição/atividade termodinâmica;
Viscosidade;
pH;
Presença de promotores de permeação.
1.3 Permeação percutânea in vitro
Métodos in vitro avaliam a difusão do material de interesse (composto ou formulação,
por exemplo) para dentro e através da pele em direção a um reservatório contendo líquido
receptor, podendo ser utilizada pele não viável, para avaliar somente a difusão, ou fresca,
metabolicamente ativa para avaliar simultaneamente a difusão e o metabolismo da pele. Tais
109
métodos fornecem um panorama que permite a comparação da entrega de compostos para
dentro e através da pele partindo-se de diferentes formulações e também é um modelo útil
para a avaliação da permeação percutânea em humanos (OECD - Organization for Economic
Cooperation and Development, 2004).
O teste de permeação percutânea in vitro é realizado com o uso de células de difusão
(Figura 4.1). As células de difusão permitem a tomada de amostras analíticas com grande
precisão para a avaliação da permeação de um ativo. Existem diversas células de difusão que
podem ser usadas e apesar de existirem diferenças entre elas, todas apresentam as seguintes
características em comum: (i) duas câmaras: uma doadora, onde é colocado o produto teste, e
outra denominada como receptora, onde é colocado o líquido que receberá a molécula alvo de
estudo, (ii) uma membrana semipermeável que se posiciona entre as duas câmaras, separando-
as fisicamente (podendo ser uma membrana sintética ou pele – que quando utilizada a face
epidérmica fica voltada para a câmara doadora e a face dérmica para a câmara receptora), (iii)
controle de temperatura de forma que a experimentação seja conduzida na temperatura
desejada e constante, (iv) abertura na câmara receptora para a coleta de amostras de líquido
receptor em determinados intervalos ao longo do estudo, para a avaliação da presença de
componentes químicos ou metabolitos (OECD, 2004).
Figura 4.1 Representação esquemática da célula de Franz do tipo difusão vertical (Fonte:
www.permegear.com/franz.htm).
Antes da realização de um estudo de permeação percutânea in vitro é fundamental
determinar a composição do líquido receptor que será usado. A escolha depende do desenho
110
experimental e da molécula alvo do estudo, e a composição final do liquido receptor deve
permitir uma solubilidade adequada da molécula que está sendo estudada, não atue como uma
barreira para a permeação, e que garanta sua estabilidade. É importante também que a
composição dessa solução seja semelhante às condições fisiológicas encontradas in vivo
(OECD, 2004).
Normalmente é usada uma solução salina tamponada nas condições fisiológicas (pH
7,4). Podem ser adicionados solventes orgânicos e/ou surfactantes no intuito de aumentar a
solubilidade de moléculas ativas hidrofóbicas. Contudo, deve-se ter cuidado para que as
alterações no liquido receptor não o torne muito diferente da condição fisiológica. Deve-se
evitar concentrações superiores a 50%(v/v) de solvente orgânico e de 1%(p/v) de surfactantes
(OECD, 2004).
A definição do líquido receptor a ser usado é feita através de experimentação.
Diferentes composições são testadas quanto a sua capacidade de solubilizar a(s) molécula(s)
alvo do estudo. Testa-se também a estabilidade da molécula em solução nesse liquido nas
condições de temperatura e tempo de duração do estudo. É escolhido o líquido receptor que
tenha a menor concentração de solvente orgânico e surfactante que permita uma solubilidade
adequada da (s) molécula(s) alvo do estudo.
2 Objetivos
Determinar líquido receptor adequado para avaliar a permeação percutânea dos
vouacapanos presentes na formulação de gel de Carbopol contendo 2,5% de extrato ativo.
3 Materiais e métodos
O experimento de liberação através de membrana sintética de celulose regenerada com
poros de diâmetro de 0,45 µm foi realizado em célula de difusão vertical tipo Franz com área
de permeação de 0,6 cm2. Utilizou-se formulações de gel de Carbopol contendo 2,5% de
extrato bruto livre de Sucupira, aplicadas na câmara doadora, na quantidade de 1,0 g. O
compartimento receptor foi preenchido com cerca de 4,5 mL de solução composta por 70% de
NaCl 0,9%, 10% de acetato de etila e 20% de metanol, a fim de garantir as condições sink,
isto é, a quantidade permeada do ativo não atingiu 10% de sua solubilidade.
A célula de Franz foi então colocada em um banho aquecido a 32 º C, sob agitação
magnética constante. Em intervalos de tempo pré-estabelecidos (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12 e 24
horas) foram retiradas alíquotas da solução receptora (400 μL) e estas foram analisadas por
111
CLAE-DAD. Após a retirada de cada alíquota foi reposto um volume correspondente ao
retirado.
Após a quantificação por CLAE-DAD (metodologia descrita no Capítulo I) foram
calculados os parâmetros de liberação dos vouacapanos tais como: fluxo e coeficiente de
permeabilidade. Os experimentos foram realizados em no mínimo sextuplicatas.
Para cada célula, foi construído um gráfico relacionando a quantidade de vouacapanos
acumulados no compartimento receptor em função do tempo (intervalos de tempo de cada
coleta). A inclinação da porção linear dos gráficos representa o fluxo de liberação dos
vouacapanos através da membrana sintética. Dessa forma, os dados obtidos a partir dos
experimentos de liberação foram expressos em quantidades cumulativas de vouacapanos
permeados em função do tempo, em um intervalo de 24 horas e analisados de acordo com a
equação 1:
Equação 1 : J = P X Cd
Onde: J é o fluxo de vouacapanos através da membrana sintética, P é o coeficiente de
permeabilidade e Cd é a concentração de vouacapanos presentes na formulação utilizada no
compartimento doador.
Os dados foram expressos em média ± desvio padrão (n = 6).
112
4 Resultados e discussão
A figura 4.2 mostra o perfil da liberação dos vouacapanos a partir da formulação
analisada.
Figura 4.2 Liberação dos vouacapanos através de membrana sintética de celulose.
Os parâmetros avaliados (fluxo e coeficiente de permeabilidade) estão apresentados na
Tabela 4.1.
Tabela 4.1: Parâmetros de liberação dos vouacapanos aplicados em condição de dose infinita
através de membrana sintética de celulose.
Formulação
(vouacapanos em mg)
Fluxo
(µg.cm2.h
-1)
Coeficiente de
permeabilidade
(10-3
cm.h-1
)
3,28 8,51 ± 0,91 2,60 ± 0,28
Os resultados obtidos permitiram verificar que o líquido receptor utilizado é adequado
para a liberação dos compostos vouacapanos do gel de carbopol contendo 2,5% de extrato
ativo vegetal, permitindo sua identificação e quantificação por CLAE-DAD. A utilização de
solventes orgânicos se fez necessária pela insolubilidade dos compostos vouacapanos em
113
água, esses compostos são apolares. Testes realizados previamente, utilizando dois líquidos
receptores diferentes - metanol:NaCl 0,9% (30:70) e Tween 20:NaCl 0,9% (3:97) - se
mostraram inadequados, levando a optar pela adição de outro tipo de solvente orgânico pelo
quais os compostos de interesse possuem solubilidade, sempre atentando-se ao cuidado de
não utilizar concentrações superiores a 50% (v/v), conforme indicado pela OECD (2004) e
utilizando o mínimo possível para o resultado desejado.
Sabe-se que as características de liberação de composto (s) ativo (s) a partir de um
veículo dermatológico podem ser avaliadas determinando-se o coeficiente de partição
óleo/água. Entretanto, estudos de liberação in vitro e in vivo proporcionam dados mais
significativos (SATO et al., 2007), o que representa mais uma vantagem e importância para a
realização desse teste, além ser base para continuidade de estudos in vitro.
As próximas etapas consistem na avaliação da permeação cutânea do produto,
substituindo-se a membrana sintética por membranas naturais (pele humana e/ou de animais),
uma vez que as membranas sintéticas não possuem as propriedades anatômicas e fisiológicas
da pele e funcionam como barreiras de difusão passiva (DAL’BELO, 2008). A contribuição
do estudo de permeação in vitro no desenvolvimento farmacotécnico é inquestionável, pois
representa um procedimento prático, rápido e de baixo custo. Com a metodologia in vitro
pode-se fazer uma seleção previa das formulações antes da realização de testes clínicos
(SATO et al., 2007; BABY et al, 2008).
5 Conclusão
Os resultados obtidos na avaliação da liberação percutânea in vitro do gel de Carbopol
contendo 2,5% de extrato livre de Pterodon pubecens, por meio de célula de difusão vertical
tipo Franz, permitem verificar que o líquido receptor composto por solução de 70% de NaCl
0,9%, 10% de acetato de etila e 20% de metanol é propício para avaliar a liberação dos
compostos vouacapanos presentes na formulação, permitindo sua identificação e
quantificação.
114
CAPÍTULO V: ESTUDO DA ATIVIDADE FARMACOLÓGICA DO EXTRATO
BRUTO DE PTERODON PUBESCENS BENTH. MICROENCAPSULADO COM
GOMA DO CAJUEIRO COMO MATERIAL DE PAREDE ATRAVÉS DE MODELO
EXPERIMENTAL DE ÚLCERA INDUZIDA POR ETANOL.
1 Introdução
1.1 Atividades farmacológicas da espécie vegetal Pterodon pubescens Benth.
A espécie vegetal Pterodon pubescens Benth., conhecida popularmente como
sucupira, é utilizada no tratamento de reumatismo, dores de garganta, problemas da coluna,
como tônico (fortificante) e depurativo (CARVALHO et al., 1999). Estudos fitoquímicos com
o gênero Pterodon revelaram a presença de alcalóides, isoflavonas e diterpenos. Alguns
autores têm sugerido que o esqueleto vouacapânico de diterpernos furânicos esteja envolvido
com as propriedades anti-inflamatórias do óleo dos frutos de P. pubescens (MAHAJAN e
MONTERIO, 1973; FASCIO et al., 1975; NUNAN et al., 1982; CAMPOS et al., 1994;
CARVALHO et al., 1999; SILVA et al., 2004, SPINDOLA et.al., 2009).
COELHO et al. (2001) realizaram estudos pré-clinicos e demonstraram atividade do
extrato hidroalcoólico das sementes de P. pubescens em modelo de artrite experimental e a
ausência de toxicidade subaguda.
Denny (2002) descreveu as atividades antinflamatória e antinociceptiva do óleo bruto
extraído de sementes de Pterodon pubescens Benth. Nesse trabalho observou que o efeito
anti-inflamatório foi mantido no edema de pata induzido por carragenina em ratos
adrenalectomiazados, sugerindo, dessa forma, sua ação ser independente da liberação de
corticóides endógenos. A atividade antiedematogênica foi confirmada quando avaliada em
modelos de edema de orelha induzido pela aplicação tópica de óleo de cróton.
Extrato etanólico apresentou atividades anti-inflamatórias e a atividade anti-
edematogênica observada é atribuída aos compostos geranilgeraniol, farnesol e uma mistura
complexa de furanoditerpenos (SILVA et al., 2004).
Silva et al. (2004) identificaram o composto ácido 6α,7β-dihidroxivouacapano-17-
óico na fração que exibiu atividade anti-edematogênica nos ensaios de edema de pata
induzido por carragenina ou edema de orelha induzido por óleo de cróton, sugerindo o
envolvimento desse composto na atividade anti-inflamatória das frações obtidas do óleo das
sementes de P. pubescens.
115
A administração oral do extrato hidroálcoolico dos frutos de P. pubescens apresenta
atividade antinociceptiva (COELHO et al., 2005; NUCCI et al., 2012) e atividade anti-
inflamatória em modelo experimental de artrite induzida por colágeno (COELHO et al., 2001;
NUCCI et al., 2012) sem alterações de parâmetros hematológicos, clínicos, bioquímicos e
histopatológicos (NUCCI et al., 2012).
Hoscheid et al. (2012) relacionam diretamente os compostos éster 6α-hidroxi-7β-
acetoxi-vouacapano-17β-oato de metila, éster 6α-acetoxi-7β-hidroxi-vouacapano-17β-oato de
metila e 14, 15-epoxigeranilgeraniol com atividade anti-inflamatória.
Estudos envolvendo a avaliação do extrato e da fração hexânica do extrato etanólico
dos frutos de Pterodon pubescens em modelos de pleurite induzida por carragenina e modelo
de artrite induzida por adjuvante completo de Freund em ratos apresentaram atividade anti-
inflamatória em ambos modelos e ausência de toxicidade, fornecendo uma base racional para
o uso do extrato de sucupira na medicina popular, de acordo com Hoscheid et al. (2013).
1.2 O processo inflamatório e seu tratamento
O processo inflamatório, envolvido em diversas patologias, é uma resposta natural do
organismo à infecção ou injúria tecidual e compreende basicamente dois mecanismos de
defesa: uma resposta inespecífica (resposta inata), responsável pelas características da região
inflamada (vermelhidão, edema, calor, dor e alteração de função) e uma resposta imunológica
(resposta específica), na qual há produção de anticorpos específicos contra um determinado
agente agressor (COUTINHO et al., 2009). Quando esse processo se torna crônico apresenta
como consequência vários efeitos indesejáveis ao paciente, como perda de função do tecido
afetado e também outros fatores que acarretam na diminuição de sua qualidade de vida.
Os mediadores químicos envolvidos nesse processo envolvem histamina, metabólitos
do ácido araquidônico (prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos), fator de ativação
plaquetária, bradicinina, óxido nítrico, neuropeptídeos e citocinas (RANG et al., 2007).
Fármacos anti-inflamatórios são capazes de interferir no processo reacional de defesa
do organismo, minimizando os danos e proporcionando maior conforto ao paciente. Os
glicocorticóides têm seu mecanismo de ação baseado na inibição da transcrição do gene da
enzima ciclo-oxigenase-2, responsável pela metabolização do ácido araquidônico, que leva à
produção de prostaglandinas, tromboxanos e leucotrienos; e na indução da proteína
lipocortina, inibidora da enzima fosfolipase A2, o que impede a liberação do ácido
araquidônico dos fosfolipídios das membranas celulares. Os anti-inflamatórios não esteroidais
(AINEs) atuam inibindo a enzima ciclo-oxigenase (COX), impedindo a formação de
116
prostaglandinas, e de tromboxanos, mediadores do processo inflamatório (RANG et al., 2007;
COUTINHO et al., 2009).
Entretanto, a toxicidade associada à terapia crônica com os glicocorticóides limita o
seu uso. Assim, os principais fármacos utilizados no tratamento dos sintomas da inflamação
são os AINEs (RANG et al., 2007). A atuação dos AINEs pode ocorrer sobre duas isoformas
da enzima ciclo-oxigenase com aplicação terapêutica, COX-1 e COX-2, e é a ação dos AINEs
não-seletivos que apresentam diversos efeitos colaterais, entre eles a tendência a produzir
ulceração gástrica e duodenal, já que uma vez inibindo a COX-1, constitutivamente expressa
no estômago, acabam por afetar também sua atividade citoprotetora gástrica (KUMMER e
COELHO, 2002). Tal situação, portanto, estimula a busca por novas moléculas,
potencialmente úteis no tratamento da inflamação.
1.3 Avaliação de atividade anti-ulcerogência em modelo experimental de úlcera
induzida por etanol
O teste de avaliação de atividade anti-ulcerogência em modelo experimental de úlcera
induzida por etanol parte do princípio de que o álcool possui um papel muito importante nas
doenças do trato gastrointestinal. A lesão da mucosa gástrica ocorre devido a uma diminuição
de função da barreira de muco, a principal proteção contra o ácido gástrico. Altas
concentrações de etanol levam a um aumento da permeabilidade epitelial, como conseqüência
de mudanças da diferença de potencial celular que é causado pela re-difusão de íons H+
através da mucosa lesada, e danos da mucosa principalmente devido aos distúrbios vasculares
e diminuição do fluxo sangüíneo local (SIEGMUND et al., 2003). O etanol também induz
estresse oxidativo, danos ao DNA e diminuição dos grupamentos sulfidrílicos não-protéicos
(GSH) das células que é um dos mais importantes fatores de proteção da mucosa gástrica
(REPETTO e LLESUY, 2002).
2 Objetivo
Avaliar a atividade anti-ulcerogênica do extrato bruto de Pterodon pubescens Benth.
microencapsulado com goma do cajueiro como material de parede através de modelo
experimental de úlcera induzida por etanol.
O procedimento realizado está de acordo com o Princípio Ético Animal adotado pelo
Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foi devidamente aprovado pela
Comissão de Ética no Uso de Animais da UNICAMP (Protocolo n. 3691-1, em 15 de
dezembro de 2014).
117
3 Materiais e Métodos
3.1 Animais
Os animais utilizados nos ensaios farmacológicos foram fornecidos pelo Centro de
Bioterismo (CEMIB) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) e utilizados nos
experimentos após período mínimo de sete dias de adaptação ao biotério, com ciclo de claro e
escuro de 12 horas, temperatura controlada (20±2 ºC), com água e ração ad libitum.
3.2 Atividade anti-ulcerogênica em modelo experimental de úlcera induzida por etanol
Após um período de 12 horas em jejum, com acesso livre à água, ratos Wistar machos
pesando em média 250 g, foram separados em grupos de 7 animais sendo que um grupo foi
tratado com solução salina 0,9% (10 mL/kg, via oral, controle negativo), outro com
carbenoxolona (200 mg/kg, via oral, controle positivo), dois com microcápsulas contento
extrato bruto de Pterodon pubescens Benth. nas doses de 10 e 30 mg/kg e um último com
goma do cajueiro. Após 60 minutos do tratamento, foi administrado pela via oral 1 mL de
etanol 96%, de acordo com a metodologia descrita por Donatini et al. (2009). Os animais
foram sacrificados uma hora depois, por deslocamento cervical. Os estômagos foram
retirados, abertos ao longo da maior curvatura e lavados em solução salina 0,9% para
posterior contagem e avaliação das lesões ulcerativas. As análises dos estômagos foram feitas
pelo software Image J e foi calculada a porcentagem de lesão pelo cálculo da área de
lesionada dividido pela área total do estômago.
4 Resultados e Discussão
No modelo de úlcera por etanol a lesão é decorrente a agressão direta do etanol nas
células da mucosa gástrica. Observou-se que o pré-tratamento com as microcápsulas contendo
extrato diclorometano reduziram 48,51 e 78,50% das lesões estomacais nas doses de 10 e 30
mg/kg respectivamente, o grupo tratado com carbenoxolona reduziu 96,41% das úlceras, já
grupo tratado somente com a goma do cajueiro não apresentou diferença significativa quando
comparado ao grupo controle negativo (ANOVA p<0,005). Esse resultado, apresentado na
figura 5.1, demonstra que as microcápsulas contendo extrato de Sucupira apresentou atividade
anti-ulcerogênica.
118
1
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
***Po
rce
nta
ge
m d
e L
esa
o
Tratamento
Veiculo (Sol. NaCl 0,9%)
Goma + Veiculo
Particulas de goma 10 mg.kg-1
Particulas de goma 30 mg.kg-1
Carbenoxolona
**
***
Legenda: Tratamento com microcápsulas de goma do cajueiro contendo extrato diclorometano dos frutos de P.
pubescens (Pp 10, 30 mg/Kg, vo), Carbenoxolona (CBX: 200 mg/Kg, vo.), Controle Negativo (Solução de NaCl
0.9%). Teste de Duncan **p<0,05; ***p<0,005.
Figura5.1 Efeito do tratamento oral com microcápsulas de goma do cajueiro contendo extrato
diclorometano de frutos de P. pubescens em modelo de úlcera gástrica induzida por etanol.
Esses resultados mostram que a atividade anti-ulcerogênica é proveniente do extrato
vegetal, não é resultante da ação do material de parede, e correspondem ao observado por
Grando et al. (2013), que também avaliaram a atividade anti-ulcerogênica do extrato bruto
diclorometano em modelo experimental de úlcera induzida por etanol em ratos, com a
finalidade de investigar possíveis efeitos indesejados na sua utilização no tratamento de
inflamação. Os resultados obtidos mostraram que a utilização de extrato livre de Sucupira
apresentou atividade anti-ulcerogênica, estando assim associada a uma possível opção
terapêutica via oral para o tratamento de inflamação sem acarretar danos na mucosa gástrica.
Os resultados farmacológicos sugerem que a atividade anti-inflamatória do extrato bruto de
Sucupira não está relacionada à inibição da COX ou pode atuar através da inibição seletiva da
COX-2 e o estudo de mecanismos de ação anti-ulcerogênicos em modelos experimentais
diversos podem ser explorados como continuidade desse trabalho.
119
A utilização do extrato microencapsulado reproduz os resultados farmacológicos e
apresenta a vantagem do material vegetal se apresentar em pó, característica que deve ser
considerada nas etapas desenvolvimento de uma forma farmacêutica e etapas de fabricação e
comercialização do produto.
5 Conclusão
As microcápsulas de P. pubescens obtidas utilizando goma do cajueiro como material
de parede foram avaliadas farmacologicamente em modelo experimental de úlcera induzida
por etanol em ratos, onde foi possível verificar que sua administração oral não causa danos na
mucosa gástrica por meio de resultados de atividade anti-ulcerogênica. Esse resultado
demonstra que o extrato bruto de Sucupira apresenta também ação gastro-protetora associada
à sua atividade anti-inflamatória oral, ao contrário de glicocorticóides e anti-inflamatórios não
esteroidais, que são as principais famílias de medicamentos utilizadas atualmente no
tratamento da inflamação e que freqüentemente expõem o paciente ao desenvolvimento de
úlcera gástrica e outros efeitos indesejados. Esse estudo foi realizado como substituição à
aplicação tópica do extrato micoencapsulado, uma vez que as formulações veiculando esse
material vegetal se mostraram instáveis. A utilização das microcápsulas de Sucupira por via
oral corrobora a base racional para o uso do extrato na medicina popular e os resultados
obtidos neste trabalham incentivam o desenvolvimento de novos produtos provenientes desta
espécie vegetal.
120
CONCLUSÃO
Este trabalho apresenta os resultados dos primeiros estudos utilizando o extrato de
Pterodon pubescens em formulações de uso tópico. O material vegetal obtido e caracterizado
foi microencapsulado através da técnica de atomização utilizando a goma do cajueiro como
material de parede, um biopolímero utilizado como substituinte da goma arábica. As
micropartículas obtidas além de preservarem o extrato ativo também permitiram maior
facilidade no manuseio do extrato de Sucupira, conferindo ainda melhora das suas
características organolépticas, que podem ser exploradas como continuidade deste trabalho,
utilizando-se as microcápsulas obtidas em formas farmacêuticas de uso oral além da
utilização de outros materiais de parede para as microcápsulas, como ferramenta de liberação
modificada.
O estudo envolvendo bases semissólidas permitiu verificar que o gel de Carbopol (F7)
foi a base mais adequada para a veiculação do extrato de Sucupira, o produto F7 com 2,5% de
extrato vegtal ativo mostrou-se estável em todos os testes realizados no estudo de
estabilidade, que teve duração de 180 dias, envolvendo a exposição a diferentes condições de
temperatura. O produto mostrou-se compatível com o pH da pele humana e não ocorreram
alterações significativas em seu aspecto. A adição do extrato vegetal livre não alterou a
espalhabilidade e viscosidade do gel.
As informações qualititativas observadas no estudo desenvolvido permitem concluir
que a formulação desenvolvida pode ser utilizada como base para o desenvolvimento de um
produto fitoterápico inovador.
121
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ANEXO 1: Autorização de Acesso e de Remessa de Componente de Patrimônio Genético
137
ANEXO 2: Certificado - Comissão de Ética no Uso de Animais CEUA-UNICAMP
138
ANEXO 3: Declaração de direitos autorais