JORGE LUIZ FREIRE PINTO

DNA plasmtico e urinrio em pacientes com cncer de mama - possibilidade de um novo marcador de instabilidade

gentica tumoral induzida por quimioterapia

Tese apresentada Faculdade de

Medicina da Universidade de So

Paulo para obteno do ttulo de

Doutor em Cincias

rea de concentrao: Distrbios do

Crescimento Celular, Hemodinmicos

e da Hemostasia

Orientador: Prof. Dr. Auro Del Giglio

So Paulo 2009

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)

Preparada pela Biblioteca da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

reproduo autorizada pelo autor

Pinto, Jorge Luiz Freire DNA plasmtico e urinrio em pacientes com cncer de mama possibilidade de um novo marcador de instabilidade gentica tumoral induzida por quimioterapia / Jorge Luiz Freire Pinto. -- So Paulo, 2009.

Tese(doutorado)--Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo. Departamento de Clnica Mdica.

rea de concentrao: Distrbios do Crescimento Celular, Hemodinmicos e da Hemostasia.

Orientador: Auro Del Giglio.

Descritores: 1.Neoplasias da mama 2.Marcadores biolgicos de tumor 3.Instabilidade de microssatlites 4.Quimioterapia 5.Antineoplsicos alquilantes 6.Segunda neoplasia primria

USP/FM/SBD-339/09

EPGRAFE

Vs que sois a verdadeira fonte da luz e o princpio supremo da sabedoria, difundi sobre as trevas da minha mente o raio do esplendor, removendo as duplas trevas nas quais nasci: o pecado e a ignorncia.

So Toms de Aquino

AGRADECIMENTOS

A Deus, por seu amor inconcebvel, por no se cansar de nos maravilhar

com a sua obra e por ter me oferecido graciosamente a ddiva de observar sua

criao de um ngulo microscpico, porm no menos admirvel.

minha amada esposa Lgia, luz de minha vida e graa divina em meu

caminhar, por seu companheirismo, resignao e toda a ajuda na realizao de

nossos sonhos, o mais sincero agradecimento por todo o amor e exemplo de

competncia e organizao.

Aos meus venerveis pais, Lunder e Graa por todo o empenho, carter,

amor e copiosa caridade crist em minha educao acadmica, moral e

religiosa trs tesouros que nunca me sero roubados.

minha irm Tatiana por seu apoio em todos os momentos vividos

neste trabalho por sua preocupao constante com a realizao deste projeto.

Aos meus cunhados Alexandre, Ramiro, Beatriz, Ana Lcia e Wagner

por toda a amizade e apoio a mim dedicados.

minha av Maria da Graa por todo exemplo de perseverana na vida

apesar de todas as dificuldades, pelo carinho e ateno constantes nestes

ltimos tempos.

s minhas sobrinhas Maria Eduarda e Paula que mesmo ainda

pequeninas iluminam de maneira gigantesca minha vida.

Aos meus sogros Mauro e Marisa por todos os todo o auxilio prestado no

curso deste trabalho e pela prontido em estarem sempre disposio.

A meus avs Geraldo, Maria de Lourdes e Joaquim que da glria de

Deus observam a realizao deste trabalho, sem nunca estarem ausentes.

Aos avs de minha esposa Jorge, Lcia e Linda por todo o carinho e

ateno dispensados a minha pessoa e todo o exemplo de vida que carregam

em si.

Ao meu orientador Professor Doutor Auro del Giglio, por toda a ateno

dispensada em minha formao, por seu notrio carinho ao ensinar, enfim pelo

mdico, professor e religioso exemplar.

Ao professor Doutor Irineu Tadeu Velasco coordenador responsvel pelo

programa de ps graduao do departamento de cincias mdicas da

Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo pela oportunidade dada,

meus agradecimentos.

s secretrias da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo,

Terezinha, Rose e Anglica por todo o auxlio recebido para a resoluo dos

processos envolvidos neste trabalho.

Ao meu amigo Cezar Gustavo, por partilhar seu ouvido amigo, sua

pacincia e toda a amizade nas horas em que tanto ouviu sobre este trabalho.

Ao meu amigo Fernando Luiz Affonso Fonseca, por toda ajuda no

desenvolvimento tcnico deste trabalho e por todos os conselhos e zelo com

que realiza todos os projetos em que se envolve, tal zelo me serve de

inspirao.

minha amiga farmacutica Fernanda Schindler que tanto me ajudou,

nas muitas vezes em que tive de sair de meu trabalho para as mais diversas

tarefas que este projeto me requisitou, deixo impresso minha sincera gratido.

Ao Dr Shigero Harada, meus agradecimentos pela compreenso e apoio

dado para a realizao deste trabalho.

Pmela, Patrcia, Renata, Sarah e Viviane que tanto colaboraram na

realizao deste trabalho pelos muitos momentos que entre uma coleta e outra

que partilhamos e por toda a ajuda nestes momentos.

Aos meus amigos do laboratrio de Anlises Clnicas da Faculdade de

Medicina do ABC, Aleksandra, Ana Paula, Cludia, Vivia, Thas, Leuda,

Luciana, Gabriela, Roseli e Simone por todo o apoio prestado para a realizao

deste trabalho.

s minhas amigas da Disciplina de Bioqumica Eloah, Thers, Carolina

e Sabrina por todas as nossas conversas e apuros passados juntos.

s equipes de enfermagem dos Hospitais Mrio Covas, Anchieta e da

Faculdade de Medicina do ABC pela ajuda na coleta das amostras das

pacientes deste trabalho.

estimada Professora Doutora Lucila Heloisa Simardi Santiago por todo

o carinho respeito e amor demonstrados a minha pessoa todos estes anos, por

sua competncia e carter notvel.

professora Doutora Maria Aparecida Silva Pinhal por todas as

orientaes dirigidas a este trabalho em meu exame de qualificao.

Professora Doutora Ligia Ajaime Azallis por toda a ajuda na

observao e nos precisos conselhos sobre a organizao do trabalho em meu

exame de qualificao.

Ao saudoso e inestimvel Professor Doutor Mrio Motidome que tanto

me ensinou sobre a vida acadmica. Sempre lhe serei grato por seus

ensinamentos e que com a realizao deste trabalho possa cumprir sua ltima

orientao Gambat! Gambat.

A meus amigos Ailton, Francisco, Pricles, Leandro e Jlio pela amizade

mesmo entre um golpe e outro da vida, ainda que por vezes distante.

Ao meu venervel amigo Pe. Flvio de Alcantra, por todas as nossas

discusses e sincera amizade e por uma resposta mais isso voc resolve

fcil! quando o assunto era o presente trabalho.

Aline, Luis Otvio, Renata, Graziela, Danielle, Vanessa, Ana Caroline,

Thelma e Carolina, meus colegas de graduao que sempre me estimularam e

acreditaram em meu potencial para a realizao deste trabalho.

Aos meus amigos da universidade paulista, Enny Fernandes Silva, Alpio

Carmo, Paula Knox, Alessandra Xavier, Luana Cardoso, Margarida, Mercedes

Toledo, Luciana Auad , Eduardo Tarvesa e Luis Barone pelo companheirismo

fundamental a realizao deste trabalho.

Aos meus estimados estagirios Allan, Jssica e Rafael por toda a ajuda

nas horas em que tive de me ausentar por causa deste trabalho.

SUMRIO

RESUMO

SUMMARY

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE TABELAS

LISTA DE FIGURAS

1 INTRODUO ............................................................................. 1

1.1 Epidemiologia do cncer de mama ......................................... 1

1.2 Fatores de risco para o cncer de mama .............................. 2

1.3 Carcinognese mamria ............................................................ 3

1.4 Regies de microssatlites ........................................................ 8

1.4.1 Instabilidade de microssatlites e HNPCC ........... Erro! Indicador no

definido.10

1.4.2 Instabilidade de microssatlites em neoplasia mamria ...................... 11

1.4.3 Instabilidade de microssatlites em clulas sangneas de pacientes

portadoras de carcinoma mamrio. .............................................................. 12

1.5 Avaliaes adicionais da instabilidade genmica .............. 16

1.5.1 DNA plasmtico livre em tumores slidos ....................................... 16

1.5.2 DNA do sedimento urinrio .............................................................. 17

2 OBJETIVOS ................................................................................ 19

3 PACIENTES E MTODOS ...................................................... 20

3.1 Pacientes ..................................................................................... 20

3.2 Extrao de DNA da frao mononuclear do sangue

perifrico ................................................................................................... 21

3.3 Extrao de DNA plasmtico ................................................. 22

3.4 Extrao de DNA urinrio ........................................................ 23

3.5 Amplificao dos microssatlites ........................................... 24

3.6 Determinao de CEA e CA15. 3Erro! Indicador no definido.27

3.7 Anlise estatstica ...................................................................... 27

4 RESULTADOS ........................................................................... 28

4.1 Descrio das pacientes ............................................................. 28

4.2 Anlise da instabilidade genmica por tipo de tratamento ..... 37

4.2.1Tratamento Adjuvante .......................................................................... 38

4.2.2 Tratamento Neoadjuvante ................................................................... 38

4.2.3 Tratamento Paliativo ............................................................................ 40

4.3 Avaliao do DNA plasmtico ............................................... 40

5 DISCUSSO ............................................................................... 47

6 CONCLUSES .......................................................................... 58

7 REFERNCIAS .......................................................................... 59

8 ANEXOS ...................................................................................... 67

Anexo 1 - Termo de consentimento livre e esclarecido ................. 67

Anexo 2 - Tabela de avaliao dos dados clnicos ......................... 70

Anexo 3 - Tabela de avaliao dos dados moleculares ................ 71

RESUMO DNA Plasmtico e Urinrio em paciente com cncer de mama - possibilidade de um novo marcador de instabilidade gentica tumoral induzida por quimioterapia [tese]. So Paulo: Faculdade de medicina, Universidade de So Paulo, 2009.

O cncer de mama a neoplasia com maior mortalidade entre as mulheres. O emprego de agentes alquilantes no tratamento desta neoplasia pode ocasionar o surgimento de instabilidades genmicas. Tais instabilidades podem estar associadas ao desenvolvimento de neoplasias secundrias como, por exemplo, leucemias. A presente tese avaliou a instabilidade de microssatlites em amostras de sangue, sedimento urinrio e plasma de pacientes portadoras de carcinoma mamrio ao diagnstico, 3 e 6 meses aps o incio do tratamento quimioterpico. Tambm foi avaliada a concentrao do DNA plasmtico livre como possvel marcador tumoral junto aos marcadores sricos CEA e CA15.3, empregados no acompanhamento do cncer de mama. Foram avaliadas as regies de microssatlites: Tp53-ALU, Tp53.PCR15.1, BAT 40, BAT26, FMR2 e APC. Entre as 40 pacientes includas no presente estudo 88,57% apresentaram instabilidade de microssatlites na frao mononuclear do sangue perifrico, 85,8% nas amostras de sedimento urinrio e 62,5% no DNA plasmtico livre. No houve concordncia significativa entre as instabilidades encontradas nos trs tipos de amostra. A concentrao de DNA plasmtico livre das pacientes quando comparada s doadoras sadias apresentou correlao estatisticamente significativa (p>0,0001), e em paciente em regimes neoadjuvantes que responderam objetivamente quimioterapia (p=0,02) e no houve correlao com os marcadores sricos CEA e CA15.3.

SUMMARY Plasmatic and Urinary DNA in patients with breast cancer - possibility of a new tumoral genomic instability marker induced by chemotherapy [thesis]. Sao Paulo: Faculty of Medicine, University of Sao Paulo (Brazil), 2009.

Breast cancer has the major mortality in women among all kind of cancer. The use of alkylating agents at the treatment of this disease is associated with genomic instability. This instability could be associated with the development of secondary cancer, for example, leukemia. The present thesis evaluated microsatellite instability in blood, pellet cells urinary and plasma in patients with breast cancer at diagnosis, 3 and 6 months after the beginning of chemotherapy. There were evaluated also Free Plasmatic DNA concentration as a possible tumoral marker with the serum markers CEA and CA15.3 used in breast cancer follow up. The microsatellites regions assayed were: Tp53-ALU,Tp53.PCR15.1, BAT 40, BAT26, FMR2 e APC.

Among the 40 patients included at the present study 88,57% showed microsallite instability in peripheral mononuclear blood cells, 85,8% in urinary pellet cells samples and 62,5% in Free Plasmatic DNA. There werent statistical significant relationship for the instability found at the three kind of samples assayed. The Free Plasmatic DNA concentration of the patients when compared with healthy donors, showed a statistical significant relationship (p

LISTA DE ABREVIATURAS

ALDH Aldedo desidrogenase

AML(LMA) Leucemia mielide aguda

ATP Adenosina trifosfato

CA 15.3 Antgeno Carboidrato 15.3

CEA Antgeno Carcinoembrionrio

DNA cido desoxirribonuclico

EDTA cido Diamino Triactico

EGFR Fator de crescimento epidermal

Erb-b2 Receptor do fator de crescimento epidrmico

G Gravidade

HNPCC Cancer colo-retal hereditrio sem polipose

IGFs Fatores de crescimento similares insulina

INCA Instituto Nacional do Cncer

LOH Perda de heterozigosidade

MDR-1 Gene de resistncias a mltiplas drogas

mL Mililitro

L Microlitro

MMR Sistema de reparo do mau pareamento do DNA

MSI Instabilidade de Microssatlites

MSI Instabilidade de microssatlites

NaCl Cloreto de sdio

pb Pares de base

PCR Reao da Polimerase em cadeia

PDGF Fator de crescimento derivado de plaquetas

TGF Fator transformante de crescimento

TGF Fator transformante de crescimento

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Seqncia dos primers e tamanho dos fragmentos das regies de

microssatlites que sero analisadas................................................................20

Tabela 2 Concordncias encontradas entre as amostras de sangue e urina.24

Tabela 3 Concentrao de DNA plasmtico livre em doadoras sadias,

determinado por espectrofotometria..................................................................33

Tabela 4 Concentrao de DNA plasmtico livre nas pacientes ao

diagnstico.........................................................................................................34

Tabela 5 Concentraes de DNA plasmtico em comparao com pacientes

controles Teste t-Student para amostras independentes..................................34

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Modelo de diferenciao celular de clulas progenitoras em clulas

mioepiteliais na presena e na ausncia da protena BRCA1.............................5

Figura 2: Via mitocondrial intrnsica da apoptose..............................................10

Figura 3 - porcentagem de eventos (instabilidade de microssatlites ou LOH)

nos marcadores analisados...............................................................................24

Figura 4 Porcentagem de pacientes com instabilidade genmica na frao

mononuclear do sangue perifrico.....................................................................25

Figura 5 Porcentagem de eventos(instabilidade de microssatlites ou LOH)

nos marcadores analisados na urina.................................................................26

Figura 6 Porcentagem de pacientes com instabilidade genmica na

urina...................................................................................................................26

Figura 7 Porcentagem de acometimento das diferentes regies de

microssatlites no DNA plasmtico...................................................................27

Figura 8 Porcentagem de pacientes com acometimento das diferentes

regies de microssatlites estudadas no DNA plasmtico................................28

Figura 9 Porcentagem de concordncia entre as matrizes analisadas........29

Figura 10 Distribuio dos marcadores de microssatlites concordantes......30

Figura 11 Distribuio do nmero de instabilidades nas diferentes regies de

microssatlites estudadas nos pacientes em neoadjuvncia............................31

Figura 12 - Curva ROC avaliando a concentrao do DNA plasmtico de

pacientes ao diagnstico quando comparadas s doadoras.............................35

Figura 13 - Curva ROC avaliando a concentrao do DNA plasmtico de

pacientes com tumores localizados em comparao aos metastticos............36

Figura 14 - Gis de poliacrilamida referentes s amostras de sangue, urina e

plasma para a regio microssatlite TP-53 PCR15.1, de uma paciente em

tratamento neoadjuvante. Ao lado representao grfica dos marcadores CEA

e CA 15.3 e a concentrao de DNA plasmtico livre.......................................37

1 INTRODUO

1.1 Epidemiologia do cncer de mama

O cncer de mama a neoplasia de maior mortalidade entre as

mulheres tanto em pases desenvolvidos, quanto em desenvolvimento.

Segundo levantamento realizado pelo INCA - Instituto Nacional do Cncer -

no ano 2003, essa neoplasia foi responsvel por 9335 bitos. A incidncia

desse cncer no Brasil, no ano de 2008, foi de 49.400 casos, pouco mais de

20% de todos os cnceres diagnosticados em mulheres, e 10% de todas as

neoplasias (www.inca.gov.br).

A neoplasia mamria apresenta a maior incidncia entre as mulheres

seguida pelo cncer de colo do tero (www.inca.gov.br).

O cncer de mama se apresenta incomum antes dos 35 anos, mas a

partir desta faixa etria, a sua incidncia cresce progressivamente

(www.inca.gov.br).

Na dcada de 60 e 70, observou-se um aumento de dez vezes em

sua incidncia e segundo a American Cancerology Society, uma em cada

dez mulheres apresenta a possibilidade de desenvolver a referida neoplasia

(http://www.cancer.org).

1

http://www.inca.gov.br/http://www.inca.gov.br/http://www.inca.gov.br/

1.2 Fatores de risco para o cncer de mama

Entre os fatores de risco para o cncer de mama podemos

mencionar principalmente os seguintes:

- idade: cerca de 12,5% dos casos ocorrem antes dos 45 anos de

idade, enquanto dois teros das pacientes possuem 55 anos ou mais ao

diagnstico da neoplasia maligna (http://www.cancer.org).

- mutaes nos genes BRCA1 e 2: Genes que codificam protenas

que modulam o ciclo celular. Segundo a American Cancer Society mulheres

com mutaes nestes genes apresentam chances superiores a 80% de

desenvolverem neoplasia mamria. O desenvolvimento do carcinoma

mamrio nestas pacientes ocorre mais cedo do que em pacientes sem a

referida mutao (http://www.cancer.org).

- histrico familiar: mulheres com uma parente de primeiro grau

acometida pela neoplasia mamria possuem o dobro do risco de

desenvolv-la. Quando so duas parentes de primeiro grau afetadas o risco

quintuplica. Cerca de 25% das pacientes com cncer de mama possuem

histrico familiar (MacMahon, 2006).

- grupo tnico: a neoplasia mamria acomete com maior incidncia

mulheres caucasianas, enquanto mulheres negras apresentam, por causas

ainda no elucidadas, maior tendncia s neoplasias mais agressivas

(MacMahon, 2006).

- paridade: mulheres que apresentam mltiplas gestaes so menos

acometidas quando comparadas s pacientes com uma ou duas gestaes

(MacMahon, 2006).

2

- amamentao: Mulheres que amamentam por dois anos apresentam

uma reduo no risco do desenvolvimento da neoplasia mamaria

(http://www.cancer.org).

- exposio hormonal: mulheres com menarca mais jovens so mais

susceptveis ao desenvolvimento da neoplasia mamria. Pacientes em uso

de contraceptivos e em terapia de reposio hormonal tambm possuem

uma elevao de risco, no entanto aps alguns anos do fim desses

tratamentos o risco tende a normalizar (MacMahon, 2006).

- obesidade: especialmente aps a menopausa, pois o tecido adiposo

pode produzir estrgeno quando os ovrios param de faz-lo, aumentando

assim o risco para o carcinoma mamrio (http://www.cancer.org).

1.3 Carcinognese mamria

O entendimento dos processos que ocorrem durante a transformao

do tecido mamrio normal em um carcinoma mamrio permanece

incompleto.

Morfologicamente possvel verificar que pacientes que possuem

hiperplasia ductal atpica, estariam mais sujeitas a desenvolver carcinoma in

situ e por fim a forma invasiva da neoplasia mamria (Singletary, 2002).

O desenvolvimento da neoplasia mamria est relacionado a

alteraes genticas e epigenticas como alteraes de expresso de genes

ou seu silenciamento. A ausncia da funo dos genes supressores de

3

tumor e a acelerao do ciclo celular podem levar a uma hiperplasia ductal,

com o acmulo de mutaes ou ainda superexpresso de genes. A

superexpresso do gene ras um dos principais fatores na progresso da

malignidade, mas no no seu surgimento (Singletary, 2002).

O gene supressor de tumor Tp53, conhecido como guardio do

genoma, codifica uma protena que no s regula o ciclo celular, mas

tambm capaz de levar a clula para a morte por apoptose. Apta a ligar-se

ao cido desoxirribonuclico (DNA) em situaes de leso, sinais de

proliferao anmalos, eroso telomrica, hipxia, perda de adeso ou

perda de sinal de sobrevivncia. Esta ligao consegue parar a transcrio

de genes que aceleram o ciclo celular e ainda iniciar a transcrio de outras

protenas de reparo. Desta forma a protena p53 capaz de corrigir erros no

genoma e ainda, se estes erros no forem passveis de correo, impedir a

propagao de clulas com patrimnio gentico alterado atravs da ativao

de vias apoptticas (Singletary, 2002).

A mutao no gene tp53 bem como a ineficincia de sua funo leva

a uma hiperproliferao e acmulo de alteraes genmicas contribuindo

para a tumorignese (Singletary, 2002; Fonseca et al.,2004).

J foram descritas ainda associaes das mutaes do TP-53 como

um fator de retroalimentao negativo para a trombospondina que possui

uma atividade anti-angiognica in vivo, e com a expresso do gene de

resistncia a mltiplas drogas chamado MDR-1 (Devita et al.,1993;

Singletary, 2002).

4

Morfologicamente possvel verificar a mutao no TP-53 em

tumores benignos e em fibroadenomas com aumento de proliferao epitelial

(Singletary, 2002).

Adicionalmente os fatores de crescimento, apresentam papel

importante na alterao do crescimento celular na carcinognese mamria.

A famlia dos receptores para fatores de crescimento como o EGFR

(epidermal growth factor receptor), pode estar superexpressa como, por

exemplo, o C-erb-B2 (Singletary, 2002).

O Erb-b2 uma protena transmembrana com funo tirosina quinase

que se liga a fatores de crescimento desencadeando uma srie de reaes

que levam ao crescimento celular (Browne et al.,2009).

O aumento de sua expresso em pacientes com carcinomas

primrios, ou ainda em tumores benignos com taxa de 25% pode ser

considerado um fator de risco para o desenvolvimento de leses invasivas

(Fonseca et al.,2002; Browne et al.,2009).

A superexpresso de Erb-b2 no observada em clulas displsicas,

fato que pode servir como indicador da transformao entre a displasia e o

carcinoma ductal in situ (Singletary ,2002; Browne et al.,2009).

O receptor Erb-b2 e sua sinalizao j so inclusive alvos para a

teraputica oncolgica, tanto o uso de anticorpos monoclonais quanto

inibidores de tirosina quinase ativadas subsequentemente (Browne et al.,

2009).

Tambm merecem destaque no desenvolvimento do cncer de mama

os fatores de crescimento como o TGF (transforming growth factor ), e os

5

IGFs (Insulin like growth factors). s tumores tambm podem ser

estimulados paracrinamente pelo TGF ( transforming growth factor ) e o

fator de crescimento derivado de plaquetas PDGF. A regulao da sntese e

liberao desses produtos mediada pelo estrgeno, sendo importante no

desenvolvimento dos tumores que apresentem receptores para o referido

hormnio (Devita et al.,1993).

O gene brca1 e brca2 esto envolvidos na gnese de tumores

mamrios em pacientes mais novas e seus tumores so geralmente

basalides,de rpido crescimento, no expressam receptores de estrgeno

progesterona e Erb-B2, e alta imuno-expresso de marcadores de

diferenciao mioepitelial. A hiptese de carcinognese se baseia na

desregulao do processo de auto-renovao das clulas pluripotentes

presentes no tecido mamrio (Foulkes, 2004).

Neste modelo as protenas BRCA1 e 2 agiriam como reguladores da

diferenciao das clulas progenitoras mamrias. Estas protenas

direcionariam o desenvolvimento das clulas em clulas mioepiteliais ou em

clulas luminais. Em modelos in vitro sua importncia foi observada na

alterao de clulas progenitoras de clulas luminais, que no expressam

receptores de estrgeno, em clulas que s expressam. A mutao do

BRCA 1 simulada pela sua ausncia de expresso levou a acmulo de

clulas que no possuam receptores de estrgeno (Liu et al., 2008).

Ainda se observou em tecido mamrio de pacientes portadoras de

mutaes no BRCA1, a presena da aldedo desidrogenase (ALDH), um

marcador de clulas tronco indicando a no diferenciao do tecido mamrio

6

(Figura 1). Tal achado pode corroborar para o papel do BRCA 1 na

carcionognese mamria (Liu et al., 2008).

Figura 1: Modelo de diferenciao celular de clulas progenitoras em clulas mioepiteliais na presena e na ausncia da protena BRCA1 Adaptado de Liu 2008.

7

1.4 Regies de microssatlites

As regies de microssatlites so repeties tandem de nmero

variado em cada indivduo caracterizadas por seu tamanho de um a seis

nucleotdeos: [A]n representao de uma repetio mononucleotdica, [AT]n

uma repetio dinucleotdica e assim sucessivamente (Dietmaier et al.,1997).

As regies microssatlites no codificam protena, e esto

amplamente distribudas pelos cromossomos humanos sendo portanto

representativas da estabilidade genmica (Dietmaier et al., 1997).

As regies de microssatlites esto inseridas no genoma para ajudar

na regulao de genes prximos s mesmas, tais genes encontram-se entre

essas regies, entre eles podemos citar: ilgf, e2f-f e bax, que so genes

codificadores de protenas ligadas ao crescimento e morte celular. Esse

genes se apresentam mutados em tumores que apresentam instabilidade

genmica caracterizada como instabilidade de microssatlites (MSI do ingls

Microsatellite Instability) (Lawes et al.,2003).

As alteraes nas regies microssatlites adjacentes aos genes

supracitados poderiam gerar um desequilbrio entre ciclo celular e apoptose

caracterstico do desenvolvimento de neoplasias (Lawes et al.,2003).

Dada a natureza destas repeties, essas regies esto mais sujeitas

a erros do maquinrio de replicao celular que muitas vezes no capaz

de copi-las fielmente ocasionando erros de replicao. Esses erros so

ocasionados por inseres ou delees de nucleotdeos nessas regies,

acarretando a instabilidade de microssatlites. Para prevenir a perpetuao

8

destes erros existe um complexo sistema de reparo genmico conhecido

como genes de reparo do DNA (mismacht repair sistem-MMR). Esse sistema

enzimtico possui a funo de verificar a fidelidade da fita de DNA recm-

sintetizada com a fita me (Dietmaier et al., 1997).

O reparo do mau pareamento envolve complexos proticos que

possuem homologia com os complexos MutS e Mut L encontrados na

bactria Escherichia coli. Nos seres humanos esses complexos so

compostos por heterodmeros. No complexo MutS podemos mencionar as

protenas MSH2, MSH3 e MSH6. Suas funes podem ser distintas pelos

erros que corrigem, o complexo MutS formado por MSH2 e MSH 6

reconhece inseres de apenas uma base nitrogenada, enquanto os erros

maiores de duas a seis bases nitrogenadas so reconhecidos pelo complexo

MutS composto por MSH2-MSH3 (Buermeyer et al.,2001).

Para a exciso do erro necessrio que o complexo MutS interaja

com o complexo MutL. Este complexo tem funo ATPsica e est ligado a

exciso do fragmento que possui o erro e a ressntese desta regio. Os

heterodmeros descritos do complexo MuL so: Mut MLH1 e PMS2, MutL

MLH1 e PMS1 e MutL MLH1 e MLH3. Os heterodmeros MutS e MutL

interagem entre si, bem como os complexos MutS e MutL . Foi verificado

que o complexo MutL est implicado no crossing over ocorrido durante a

meiose das clulas (Kondo, 2001; Buermeyer et al.,2001).

Tal sistema corrige os erros encontrados na fita atravs de sua

atividade exonuclesica, e prossegue com o ciclo celular. Em situaes em

que os erros encontrados no so corrigveis o sistema de reparo aciona via

9

p53 uma srie de reaes em cascata de sinais celulares que levaro a

morte celular por apoptose. Em situaes em que a expresso dos genes de

reparo do DNA est diminuda ou silenciada, as clulas passam a acumular

erros de replicao o que permitiria o acmulo de mutaes (Lawes et

al.,2003; Dietmaier et a., 1997; Young et al.,2003).

1.4.1 Instabilidade de microssatlites e HNPCC

A instabilidade de microssatlites foi estudada primeiramente em

casos de cncer de colo retal hereditrio no-polipose do ingls HNPCC

(hereditary non polyposis colonretal cancer). A importncia da instabilidade

destas regies genmicas est intimamente ligada a carcinognese e a

mutaes de diferentes genes de reparo do DNA. Em outros tipos de

tumores a instabilidade de microssatlites aparece em menor porcentagem

dos casos (Aaltonen et al.,1993; Anbazhagan et al.,1999 ; Ionov et al.,1993;

Lawes et al.,2003 ; Thibodeau et al.,1993).

10

1.4.2 Instabilidade de microssatlites em neoplasia mamria

A incidncia de instabilidades de microssatlites apresenta uma

grande variao na literatura de 3 a 30% (Halford et al.,2003; Anbazhagan

et al.,1999; Benachenhou et al.,1999; Fujii et al.,1998). As discrepncias

encontradas podem ser explicadas por diferenas nas anlises bem como o

nmero de regies avaliadas, a natureza das repeties dos microssatlites

analisados. Alm de caractersticas clnicas distintas entre as pacientes

includas nestes estudos entre algumas caractersticas pode-se mencionar a

idade das pacientes e a natureza uni ou bilateral da neoplasia mamria.

(Fujii et al.,1998; Iwase et al.,1997). Paulson e Wild observaram um pior

prognstico em pacientes que possuam instabilidade de microssatlites

(Paulson et al., 1996; Wild et al., 2004).

Fu e colaboradores descreveram que a instabilidades de

microssatlite no brao curto do cromossomo 3, ainda que em leses pr-

cancerosas possui grande importncia no desenvolvimento do tumor

mamrio e se correlaciona com pouca diferenciao do carcinoma mamrio

(Fu et al., 2007).

A instabilidade de microssatlites foi observada como possvel

marcador de progresso em carcinomas invasores, correlacionando se ainda

com idade, metstases , grau histolgico e tamanho do tumor (Kim et al.,

2004; Pizzi et al., 2002).

Pizzi e colaboradores demonstram uma diminuio da expresso da

protena P53 nos tumores que apresentavam instabilidade de

microssatlites . No mesmo estudo se observou a troca da populao celular

11

que expressava a P53 pela que possua instabilidade de microssatlites. A

instabilidade se correlacionou ainda com estgios avanados da doena

(Pizzi et al., 2002).

1.4.3 Instabilidade de microssatlites em clulas sangneas de pacientes

portadoras de carcinoma mamrio.

O tecido sanguneo no est envolvido diretamente com a

tumorignese mamria. Contudo, certos tipos de tratamento incluindo

agentes alquilantes, como a ciclofosfamida, podem induzir em clulas

normais instabilidade genmica nas regies de microssatliltes. Fonseca e

colaboradores demonstraram uma incidncia maior do fenmeno em

pacientes que fizeram uso de regimes contendo agentes alquilantes frente a

pacientes que no empregaram tais agentes em seu tratamento (Fonseca et

al., 2005).

Corroborando com o dado supracitado observou se que em

pacientes com instabilidade de microssatlites a expresso da protena de

reparo hMSH2 estava diminuda (Fonseca et al., 2005).

Um modelo in vitro na linhagem celular MCF-7 foi criado para

averiguar a reduo da expresso da protena de reparo hMSH2

apresentando instabilidade de microssatlites, confirma os dados

observados em pacientes (Marsicano et al., 2008).

12

As leses ao DNA geradas por agentes alquilantes como os

monoaductos so idetificadas pelo sistema de reparo genmico que via P53

encaminha as clulas para apoptose, via intrnsica (figura 2) (Jin, 2005).

Em clulas com expresso deficiente das protenas de reparo no h

acionamento da P53 acumulando alteraes genmicas. Uma das principais

hipteses para essa diminuio na expresso das molculas de reparo a

metilao do promotor dos genes que codificam tais protenas (Li et al.,

2002).

Tal fenmeno epigentico j foi observado no HNPCC. Strazzullo e

colaboradores observaram ausncia de metilao do gene hMLH1 em

pacientes com expresso normal, enquanto 23% das amostras com

deficincia de expresso apresentavam o promotor do referido gene

metilado (Strazzullo et al., 2003).

13

Figura 2: Via mitocondrial intrnseca da apoptose (Jin, 2005). Frente leso genmica encontrada, a P53 ativa a transcrio do complexo noxa/puma que ir inibir as protenas de manuteno da permeabilidade da membrana mitocondrial (Bcl) e ainda ativar a transcrio do gene bax desencadeando o extravasamento do material mitocondrial que ativar a via das caspases.

Alm da classe dos agentes alquilantes outras drogas antineoplsicas

empregadas no tratamento do carcinoma mamrio como as antraciclinas e

os inibidores de topoisomerase foram implicados no aumento do risco para

leucemia mielide aguda e sndrome mielodisplsica aps tratamento (Le

Deley et al.,2007).

14

Esta instabilidade gentica induzida pelo tratamento em tecidos no

comprometidos com o tumor primrio poderia explicar a incidncia de

leucemias agudas e ou mielodisplasias secundrias que acometem cerca de

5% das pacientes com carcinoma mamrio aps o tratamento quimioterpico

(Casorelli et al.,2003; Leoni et al.,1999; Bernard-Marty et al.,2003).

A instabilidade encontrada nas clulas sanguneas poderia ocorrer

tambm no tumor, fato que acarretaria na quimioresistncia do tumor frente

s drogas alquilantes (Bernard-Marty et al.,2003).

As protenas de reparo podem encaminhar as clulas, inclusive as

tumorais, para apoptose, com a reduo da expresso destes genes , a

ligao do frmaco ao DNA permaneceria sem que a clula fosse

encaminhada para a morte. Watanabe e colaboradores demonstraram que

depsitos tumorais extirpados de pacientes com carcinoma ovariano

resistentes a tratamento com cisplatina tinham instabilidade de

microssatlites e reduo do gene hMLH1, mesmo em casos nos quais os

tumores primrios no exibiam este achado antes do tratamento

quimioterpico (Watanabe et al.,2001).

15

1.5 Avaliaes adicionais da instabilidade genmica

1.5.1 DNA plasmtico livre em tumores slidos

A presena de cidos nuclicos livres na circulao descrita desde a

dcada de 70 (Leon et al.,1977), contudo sua associao com doenas de

origem neoplsica foi atestada no final da dcada de 1980 (Stroun et

al.,1989).

A origem do DNA livre na circulao no foi totalmente elucidada,

porm acredita-se que estes cidos nuclicos sejam oriundos de clulas

tumorais que sofreram necrose. Tal processo permitira que as molculas de

DNA permanecem integras na circulao, diferentemente do DNA

condensado encontrado em clulas apoptticas (Ziegler et al.,2002, Wang et

al.,2003).

Em pacientes sadias, o DNA plasmtico livre possivelmente o DNA

oriundo da apoptose das clulas, condensado e de pequeno comprimento, j

em pacientes portadoras de neoplasia esta amostra seria enriquecida por

DNA necrtico, de autlise ou ainda de catstrofe mittica, processos de

morte encontrados nas neoplasias e que liberam DNA mais integro (Umetani

et al., 2006).

O DNA plasmtico livre poderia ento fornecer informaes sobre a

condio genmica do tumor primrio (Johnson, 2002; Silva et al.,1999),

estas informaes seriam teis na avaliao gentica dos tumores primrios,

pois fenmenos como a instabilidade de microssatlites esto associados a

16

um pior prognstico e a resistncia aos agentes quimioterpicos (Watanabe

et al.,2001).

importante tambm ressaltar que a concentrao desses cidos

nuclicos na circulao est associada ao pior prognstico. Sozzi e

colaboradores avaliaram em pacientes portadores de melanoma e cncer de

pulmo, a concentrao de DNA plasmtico livre e a instabilidade de

microssatlites e observou pior prognstico em pacientes com elevao na

concentrao da molcula na circulao (Sozzi et al.,2001,Taback et

al.,2001).

Em tumores mamrios Umetani e colaboradores avaliaram por meio

da regio de microssatlite ALU, a integridade do DNA plasmtico, como

biomarcador para progresso da doena e metstase linfonodal. Desta

forma possvel distinguir o DNA apopttico do necrtico, sendo o ltimo um

marcador potencial para a deteco do DNA neoplsico no sangue (Umetani

et al.,2006).

1.5.2 DNA do sedimento urinrio

A amostra do sedimento urinrio, matriz de fcil acesso, cujo emprego

ainda se faz necessrio avaliar. Possuiria esta amostra o mesmo perfil de

instabilidade gentica do sangue sendo, portanto uma alternativa ainda

menos invasiva. Em trabalhos prvios j foram observados na urina

componentes de leso do estresse oxidativo do DNA por metablitos do

tabaco (Gackowski et al.,2003).

17

A concentrao do DNA urinrio foi empregada como marcador de

morte celular e de nefrotoxicidade. Em modelos experimentais,

camundongos expostos gentamicina, observa-se uma elevao na

concentrao de DNA da urina (Lul et al.,1990).

Li e colaboradores observam ainda que o aumento da excreo de

cidos nuclicos pela urina pode estar relacionada reao de rejeio do

enxerto em pacientes que foram submetidos a transplantes renais (Li et

al.,2005).

Botezatu, em um modelo animal, observou que os cidos nuclicos

liberados no plasma atravessam a barreira renal e chegam urina. Foi

avaliada por meio da seqncia ALU humana, e que o DNA polimrico foi

excretado na ordem de 0,06% em at trs dias (Botezatu et al.,2000). Em

humanos, foi possvel detectar seqncias do cromossomo Y em mulheres

que receberam sangue de homens (Botezatu et al.,2000).

Serdyuk e colaboradores empregaram a reao da polimerase em

cadeia (PCR) na deteco do DNA urinrio. Ainda avaliaram possveis

mutaes no gene k-ras no DNA urinrio em pacientes com cncer de clon

(Serdyuk et al.,2004).

18

2 OBJETIVOS

1. Analisar a instabilidade gnica em amostras de sangue, plasma e

urina de pacientes portadoras de carcinoma mamrio por meio da reao da

polimerase em cadeia analisando a instabilidade de microsatlites ao

diagnstico, trs e seis meses de tratamento quimioterpico.

2. Relacionar a instabilidade gnica encontrada nas diferentes

amostras entre si, com a evoluo clnica das pacientes.

3. Relacionar a concentrao de DNA plasmtico livre com os

marcadores sorolgicos utilizados na abordagem clnica do cncer de mama

(CEA e CA 15.3) e com a resposta ao tratamento quimioterpico.

19

3 PACIENTES E MTODOS

3.1 Pacientes

Foram includas 40 pacientes portadoras de cncer de mama, com

confirmao de diagnstico, encaminhadas ao Centro de Estudos em

Pesquisa Oncolgica da Faculdade de Medicina do ABC, Hospital Estadual

Mrio Covas e do Complexo de Alta Complexidade em Oncologia do

Hospital Anchieta.

As pacientes recrutadas no poderiam ter feito uso de qualquer

tratamento clnico antineoplsico prvio. Tambm no houve qualquer

interveno no tratamento proposto pelo oncologista.

As pacientes includas poderiam estar em tratamento adjuvante,

sendo a primeira amostra colhida antes da primeira infuso quimioterpica

aps a cirurgia.

As pacientes cujo tratamento foi classificado pelo clnico como

neoadjuvante ou paliativo, tambm forneceram as amostras imediatamente

antes da primeira infuso medicamentosa.

Aps assinatura de termo de consentimento livre e esclarecido,

aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa da Faculdade de Medicina do

ABC e pela Comisso de tica para Anlise de Projetos de Pesquisa da

diretoria clnica dos Hospital das Clnicas e da Faculdade de Medicina da

Universidade de So Paulo - CAPPesq, ingressaram no presente projeto.

Foram colhidos 20.0 mL de sangue total por meio de venopuno com anti-

20

coagulante EDTA. As amostras colhidas foram ao diagnstico, trs e seis

meses aps tratamento proposto pelo oncologista clnico. Alm das

amostras de sangue, foram colhidas tambm amostras de urina (amostra

isolada), no mesmo intervalo de tempo em que foi efetuada a coleta de

sangue. A urina foi colhida aps anti-sepsia do trato gnito-urinrio.

3.2 Extrao de DNA da frao mononuclear do sangue

perifrico

Aps coleta de sangue, as amostras foram homogeneizadas para

realizao de contagem de glbulos brancos totais e contagem diferencial.

Para a extrao de DNA da frao mononuclear do sangue perifrico, foi

utilizado o kit GFX (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, USA) e o protocolo

seguido foi: A 100L de sangue total adicionar 500 L da soluo extratora,

incubar a mistura por cinco minutos a temperatura ambiente, sob agitao.

Aps a incubao a mistura foi vertida sobre a coluna de separao do kit

acoplada a um tubo coletor de volume 2 mL. Seguiu-se com uma

centrifugao realizada na microcentrifuga Eppendorf 5415 C a 6800 G por 1

minuto. O contedo eludo no tubo coletor foi descartado. Adicionou-se a

coluna 500 l de soluo extratora e centrifugou-se o conjunto a 6800 G por

1 minuto e descartou o material eludo no tubo coletor. Para a lavagem da

coluna adicionou-se 500l de soluo de lavagem, tampo Tris-EDTA e

etanol absoluto, e centrifuga-se a 20800 G por 3 minutos e o material eludo

21

foi descartado do tubo coletor a fim de limpar a coluna de interferentes e

melhorar a pureza do DNA a ser eludo na etapa seguinte. A eluio do DNA

consistiu na adio de 50l de tampo Tris-EDTA a 70C sobre a coluna

centrifugou-se 6800 G por 1 minuto e foi concluda a extrao do DNA da

amostra.

3.3 Extrao de DNA plasmtico

A alquota de 10.0 mL de sangue total colhido com EDTA, foi

submetida centrifugao a 670 g por dez minutos, transferiu-se o plasma

separado para um tubo seco, seguindo-se de uma segunda centrifugao a

1250 g por dez minutos, deste material 1ml foi coletado para a extrao.

Esta primeira centrifugao foi necessria para evitar que as clulas

nucleadas do sangue se rompam e a segunda centrifugao para que o

excesso de protenas seja removido do plasma e no interferisse na

extrao (Stemmer et al.,2003; Zieger et al.,2003).

A extrao foi feita utilizando o kit GFX TM (Amersham Pharmacia

Biotech, Inc, USA) seguindo o seguinte protocolo adaptado:

Em 1ml de amostra foram adicionados a 500l de soluo extratora e

incubada a temperatura ambiente por 10 minutos com agitao ocasional.

Essa mistura foi eluda cinco vezes pela mesma coluna do kit centrifugando-

a 6800 G por 1 minuto e o material presente no tubo coletor descartado.

Aps esse processo seguiu-se o protocolo original do kit. Adicionou-se a

coluna 500 l de soluo extratora e centrifugou-se o conjunto a 6800 G por

22

1 minuto e descartou-se o material eludo para o tubo coletor. Para a

lavagem da coluna adicionou-se 500l de soluo de lavagem e centrifuga-

se a 20800 G por 3 minutos e novamente descartou-se o eludo no tubo

coletor a fim de limpar a coluna de interferentes e melhorar a pureza do DNA

a ser eludo na etapa seguinte. A eluio do DNA consistiu na adio de

20l de gua MiliQ a 70C sobre a coluna e centrifugou-se 6800 G por 1

minuto e concluindo a extrao do DNA da amostra.

3.4 Extrao de DNA urinrio

As amostras de urina foram centrifugadas para obteno do

sedimento urinrio. O sedimento foi avaliado em Cmara de Neubauer para

a classificao dos achados celulares. Aps contagem o sedimento foi

ressuspendido em 1.0 mL de soluo salina e foram efetuadas vrias

lavagens com a mesma soluo para evitarmos contaminao com bactrias

que so freqentemente encontradas em amostras urinrias. O DNA urinrio

foi extrado utilizando o kit GFX TM (Amersham Pharmacia Biotech, Inc, USA),

seguindo o protocolo adaptado para essa finalidade.

Essas amostras foram centrifugadas a 1300 G por 10 minutos para

que ocorresse a sedimentao das clulas presentes na urina. Aps a

centrifugao o sobrenadante foi desprezado e o precipitado ressuspendido

em 1ml de soluo salina (0,9% de NaCl) para a lavagem e submetido a

23

nova centrifugao a 1300 G por 10 minutos. O precipitado de clulas

ressuspendido novamente em 1ml de salina e procedeu-se com a extrao.

Ao material celular adicionou-se 500 l de soluo extratora

encubou-se por 10 minutos a temperatura ambiente. Foi adicionada

mistura na coluna do kit. Seguiu-se com uma centrifugao realizada a 6800

G por 1 minuto. O contedo eludo no tubo coletor foi descartado. Adicionou-

se a coluna 500l de soluo extratora e centrifugou-se o conjunto a 6800 G

por 1 minuto e descartou-se o material eludo no tubo coletor. Para a

lavagem da coluna adicionou-se 500l de soluo de lavagem e centrifugou-

se a 20800 G por 3 minutos e descartou-se o eludo no tubo coletor a fim de

limpar a coluna de interferentes e melhorar a pureza do DNA eludo na etapa

seguinte. A eluio do DNA consistiu na adio de 200ml de tampo Tris-

EDTA a 70C sobre a coluna centrifugou-se 6800 G por 1 minuto e

concluindo a extrao do DNA .

3.5 Amplificao dos microssatlites

Em nossos experimentos foram realizadas amplificaes por meio da

reao da polimerase em cadeia (PCR) para as seqncias de

microssatlites TP53-ALU, TP53-PCR15.1, BAT 40, BAT 26, APC e FMR2.

A regio TP53-ALU uma regio microssatlite pentanucleotdica e a

regio TP53.PCR15.1 apresenta-se como uma regio dinucleotdica ambas

ligadas a regies reguladoras do gene p53.

24

As regies BAT 40 e BAT 26 so mononucleotdicas e j foram

empregadas em trabalhos anteriores no estudo de instabilidade genmica

induzida por quimioterapia ( Fonseca et al., 2005).

A regio APC foi amplamente estudada nos casos de HNPCC uma

regio dinucleotdica cujas alteraes esto presentes tanto em tumores de

alta bem como os de baixa instabilidade de microssatlites.

A regio FMR2 uma repetio pentanucleotdica ligada ao

cromossomo X.

As reaes de PCR empregadas nos trs tipos de amostra, sangue,

plasma e urina sero realizadas com os seguintes reagentes: 1,5 l de DNA

purificado (nas amostras de sangue e plasma) e 3,0 l de DNA purificado

(nas amostras de urina) 2 l de cada primer a 10pmol 3,0 l de

desoxinucleotdeos, dATP, dCTP, dGTP e dTTP, a 200mM 0,45 l de MgCl2

50M , 3,0 l do tampo Tris-HCl 10X, e 0,2 l da enzima Taq polimerase o

volume final foi de 25 l, sendo o volume restante completo por gua

deionizada autoclavada.

Sempre que foram realizadas as reaes de PCR, uma mistura de

todos os reagentes excluindo-se o DNA foi submetida a condies de

reao para servir como controle negativo.

As amostras foram levadas ao termociclador (MJ Research PTC200,

USA) e seguiram as seguintes etapas: 1 ciclo de denaturao de 5 minutos a

94C, e depois 35 ciclos de 1 minuto de denaturao a 94C, 1 ciclo de

anelamento a 63C por 1minuto, 1 ciclo de 72C de extenso por 10 minutos.

25

Regio de

microssatlite

Seqncia Tamanho

(pb)

TP53-ALU GCA CTT TCC TCA ACT CTA CA 400

AAC AGC TCC TTT AAT GGC AG

TP53.PCR15.1 AGG GAT ACT ATT CAG CCC GAG GTG 103-105

ACT GCC ACT CCT TGC CCC ATT C

BAT40 ATT AAC TTC CTA CAC CAC AAC 80-100

GTA GAG CAA GAC CAC CTT G

BAT26 TGA CTA CTT TTG ACT TCA GCC 80-100

AAC CAT TCA ACA TTT TTA ACC C

FMR2 CGG TTA TCC CAG TTC GGC GTC TCT GGG AT 172

TCC ACC TCC CGC TCA GTC AGA CTG CGC T

APC ACT CAC TCT AGT GAT AAA TCG 96-122

AGC AGA TAA GAC AGT ATT ACT AGT T

Tabela 1: Sequncia dos primers e tamanho dos fragmentos das regies de

microssatlites analisadas.

Aps a confirmao da amplificao dos marcadores em gel de

agarose 2 %, as amostras foram denaturadas com formamida e incubadas a

94C por 5 minutos e analisadas em uma eletroforese com a utilizao do

equipamento GenePhor (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) em gis

previamente preparados GebeGel Excel 15/24 (Pharmacia Boitech, Uppsala

Sweden) esse gel possibilitou uma maior resoluo, de 6pb, em fragmentos

de 50 a 200 pb. Aps corrida eletrofortica, o gel foi corado com nitrato de

prata utilizando o aparelho Hoefer Automated Gel Stainer (Pharmacia

Boitech, Uppsala Sweden), seguindo o protocolo de colorao do fabricante.

26

3.6 Determinao de CEA e CA15.3

As amostras de soro obtidas conforme descrito no inicio dessa sesso,

foram submetidas ao estudo para determinao de CEA e CA 15.3. Essa

determinao foi realizada por meio de mtodo quimioluminescente

utilizando reagentes da marca Siemens. As leituras foram realizadas com

auxilio do aparelho IMMULITE 1000 seguindo as normas do fabricante e as

boas prticas laboratoriais em anlises clnicas.

3.7 Anlise estatstica

Foi realizado o teste t de Student para a obteno das correlaes

entre a concentrao de DNA plasmtico livre entre as pacientes e o grupo

controle. Tambm foram construdas curvas ROC para avaliar a

especificidade e sensibilidade da concentrao do DNA plasmtico livre

quando comparados os grupos controle e pacientes e ainda pacientes com

tumores localizados e tumores metastticos.

Os eventos observados no presente trabalho foram contabilizados

para a obteno das freqncias absoluta e relativa.

27

4 RESULTADOS

4.1 Descrio das pacientes

As 40 pacientes includas neste estudo apresentaram mdia de idade

de 52,7 (36-78) (mediana de 52) anos ao diagnstico da neoplasia mamria.

Entre as pacientes uma optou por no colher mais amostras para o

estudo, porm no retirou o consentimento.

Quanto ao tratamento quimioterpico das pacientes elegveis para

anlise, 11 pacientes (27,5%) foram submetidas terapia neoadjuvante, 16

pacientes (40%) fizeram uso de terapia adjuvante, 4 (10%) cujo tratamento

foi considerado paliativo.

Dentre as pacientes includas 3 (7,5%) participaram de um estudo

clnico da eficcia do tratamento pr cirrgico neoajuvante com o agente

antiestrognico chamado fulvestrant, contudo tais pacientes possuam ao

diagnstico estadios classificados como operveis.

Os regimes de quimioterpicos empregados foram combinaes de

antraciclinas, inibidores de formao de microtbulos e agentes alquilantes.

Estes regimes foram: Adriamicina e Ciclofosfamida, Adriamicina

Cliclofosfamida e Paclitaxel, Fluorouracil Epirrubicina e Ciclofosfamida,

Fluorouracil Adriamicina e Ciclofosfamida .

Os agentes alquilantes, no caso a ciclofosfamida, descritos como

indutores de instabilidade genmica em pacientes (Fonseca et al.,2005) e

28

em clulas em cultura (Marisicano et al.,2008) estavam presentes em

92,5%(37) das pacientes do presente estudo.

No presente trabalho as pacientes forneceram 3 amostras de sangue,

de urina e de plasma, nos tempos descritos na seo pacientes e mtodos.

29

Das 40 pacientes includas neste estudo 35 foram elegveis para

avaliao da instabilidade genmica avaliada pelas regies de

microssatlites. Analisamos os marcadores de instabilidade de

microssatlites citados na seo materiais e mtodos do sangue perifrico,

urina e plasma de 35 pacientes.

As pacientes foram consideradas elegveis para a anlise quando

possuam pelo menos 2 coletas. A primeira amostra foi considerada padro

comparativo para as demais amostras obtidas durante o tratamento

sistmico.

Dessa maneira, o critrio empregado na anlise consistia em avaliar

os fragmentos gerados por PCR em gel de poliacrilamida ao diagnstico

(amostra 0) e sua alterao durante o estudo (nas amostras 3 e 6 meses).

As pacientes com apenas 1 coleta no foram avaliadas pois no eram

passveis de avaliao comparativa que o objetivo desse estudo.

Aps a anlise dos gis de poliacrilamida observamos que

aproximadamente 88,57%(31) das pacientes avaliadas apresentaram pelo

menos uma alterao gentica seja ela perda de heterozigosidade (LOH) ou

instabilidade de microssatlites (MSI) no sangue perifrico. Nas amostras de

sedimento urinrio e plasma foram encontradas estas alteraes em pelo

menos uma amostra em 80% (28) dos pacientes.

As figuras 3 e 4 mostram o nmero de eventos de instabilidade

genmica encontrado no sangue perifrico. As instabilidades nas regies

BAT 26, BAT 40 apresentaram-se em maior nmero nas pacientes.

30

16,84

18,95

12,63

16,84

14,7415,79

0,00 2,00 4,00 6,00 8,00

10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00

BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU

% de eventos por marcador de microssatlite no sangue perifrico

Figura 3: Porcentagem de eventos (instabilidade de microssatlites e/ou LOH) nos marcadores analisados.

Ao analisar a porcentagem de pacientes que apresentaram

instabilidade genmica avaliadas pelas regies de microssatlite,

importante ressaltar que embora 88,57 % das pacientes apresentarem

instabilidade genmica, dos 6 marcadores avaliados, o mais expressivo foi o

BAT 26 e menos foi o FMR2 (Figuras 3 e 4).

31

40,00

45,71

31,43

40,00

34,29 37,14

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

50,00

BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU

% de pacientes com instabilidade genmica na FMSP

Figura 4: Porcentagem de pacientes com instabilidade genmica na frao mononuclear do sangue perifrico(FMSP).

A figura a seguir (Figura 5) apresenta a porcentagem de pacientes e

eventos de instabilidade genmica na urina das pacientes do presente

trabalho. Das pacientes, 85,8%(29) apresentaram instabilidade genmica.

Nas amostras de urina foi possvel observar uma significativa diminuio do

nmero de eventos quando comparada com a frao mononuclear do

sangue perifrico. O perfil do acometimento dos marcadores de

microssatlites tambm mostrou-se diferente. Observa-se que as Fraes

ALU e FMR2 so as que demonstraram menor reduo na amostra das

clulas do sedimento urinrio.

32

4,21

7,37

21,05

8,42

11,58

17,89

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU

% de eventos de instabilidade genmica na urina

Figura 5: Porcentagem de eventos (instabilidade de microssatlites e/ou LOH) nos marcadores analisados na urina.

11,43

28,57

42,86

20,00

31,43

42,86

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU

% de pacientes com instabilidade genmica na urina

Figura 6: Porcentagem de pacientes com instabilidade genmica na urina.

33

A concordncia entre as amostras de sangue total e de plasma foi

baixa (14,7%) em relao s alteraes observadas nas 6 regies de

microssatlites estudadas. Quanto ao nmero de pacientes. O DNA

plasmtico apresentou mais instabilidades genmicas quando comparado

urina (figuras 7 e 8).

11,58

16,84 16,84

6,32

8,429,47

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

18,00

BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU

% de eventos de instabilidade genmica nas amostras de plasma

Figura 7: Porcentagem de acometimento das diferentes regies de microssatlites no DNA plasmtico.

34

25,71

34,29

40,00

20,00 20,0022,86

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

BAT40 BAT26 FMR2 TP53PCR15.1 APC ALU

% de pacientes com instabilidade genmica no plasma

Figura 8: Porcentagem de pacientes com acometimento das diferentes regies de microssatlites estudadas no DNA plasmtico.

Embora o nmero de eventos encontrado em porcentagem no seja

muito diferente entre os marcadores de instabilidade de microssatlite,

(figuras 1 a 8) a concordncia do mesmo evento biolgico da instabilidade

de microssatlites (figura 9) no foi observada.

35

7,37

14,74

8,42

1,05

0,00

2,00

4,00

6,00

8,00

10,00

12,00

14,00

16,00

sangue-urina sangue-plasma plasma-urina sangue-urina-plasma

% de concordncia entre os eventos

Figura 9: Porcentagem de concordncia entre as matrizes analisadas.

Sobre o acometimento das regies analisadas, nota-se que a regio

FMR2 ligada ao cromossomo X foi a mais afetada (figura 10), entre as

concordantes.

36

% dos marcadores de instabilidade gentica concordantes

10,34

24,14

37,93

13,79

6,9013,79

BAT40BAT26FMR2TP53PCR15.1APCALU

Figura 10: Distribuio dos marcadores de microssatlites concordantes.

4.2 Anlise da instabilidade genmica por tipo de tratamento

As pacientes foram agrupadas com a finalidade de observar o nmero

de eventos de instabilidade genmica, as alteraes da concentrao do

DNA plasmtico. Para a avaliao da resposta ao tratamento os registros

mdicos das pacientes foram revisados para a classificao das pacientes

com base nos exames clnicos, laboratoriais e anatomopatolgicos.

37

4.2.1Tratamento Adjuvante

Das 16 pacientes submetidas a quimioterapia adjuvante, apenas 4

(25%) no apresentaram instabilidade genmica na frao mononuclear do

sangue perifrico. Tal dado compatvel com trabalhos anteriores de nosso

grupo de estudo (Fonseca et al., 2005).

A mdia de eventos por paciente afetada na frao mononuclear do

sangue perifrico foi de 2,83 eventos por paciente, ou seja, quase 3

instabilidades no painel de microssatlites.

Nmero similar foi encontrado nas anlises da urina destas pacientes

2 (12,5%) pacientes estveis e 87,5% afetadas com mdia de 2,28

instabilidades por paciente afetada.

No plasma, tambm 4 pacientes no possuam instabilidade

genmica, 12 pacientes apresentaram mdia de instabilidades genmicas de

2,58.

Em relao concentrao do DNA plasmtico nestas pacientes foi

constatado que, embora em nveis mais elevados do que em pacientes livres

de doena, a concentrao ao longo dos tempos de coleta diminua ou se

mantinha sem alteraes significativas.

4.2.2 Tratamento Neoadjuvante

Entre as 11 pacientes classificadas como quimioterapia neoadjuvante

nenhuma apresentou painel de microssatlites estvel no sangue perifrico.

38

Quanto distribuio do nmero de regies afetadas as pacientes estavam

amplamente distribudas.

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

1 regio 4regies 7regies 10regies 13regies

Pacientes em Neoadjuvancia

Figura 11: Distribuio do nmero de instabilidades nas diferentes regies de microssatlites estudadas nas pacientes em neoadjuvncia.

Ao se verificar a instabilidade gnica no DNA plasmtico apenas 2

pacientes eram estveis. As amostras de plasma com instabilidade gnica

apresentavam em mdia 2,33 instabilidades por paciente.

Foi observada instabilidade gnica na urina de 9 das 11 pacientes,

sendo que cada paciente afetada apresentou em mdia 2,44 eventos.

Em relao ao DNA plasmtico foi observado que sua concentrao

tende a diminuir aps a cirurgia. Apenas 1 paciente apresentou elevao na

concentrao do DNA plasmtico.

39

Quando avaliada a segunda amostra (3 meses) as pacientes que

responderam ao tratamento quimioterpico apresentaram um aumento na

concentrao de DNA plasmtico livre em comparao ao grupo de

pacientes que no responderam ao tratamento (p=0,02).

4.2.3 Tratamento Paliativo

Entre as 4 pacientes em terapia paliativa 25% no apresentaram

instabilidade genmica no sangue perifrico. As pacientes com instabilidade

gentica apresentaram em mdia 3 instabilidades.

4.3 Avaliao do DNA plasmtico

No presente trabalho foram includas 10 mulheres doadoras livres de

doena com idade inferior a 30 anos e sem histrico de cncer familiar para

validar a tcnica de extrao do DNA plasmtico livre.

Tais determinaes tambm tinham por finalidade verificar se existia

diferena entre as pacientes portadoras de neoplasia mamria e mulheres

ss. As doadoras eram mulheres com idade inferior a 30 anos e sem

histrico de cncer na famlia.

As amostras foram processadas como descrito na sesso pacientes e

mtodos.

Conforme o descrito na literatura as concentraes de DNA

plasmtico livre encontrado nestas doadoras foi inferior quando comparada

40

s pacientes. A mdia da concentrao entre as doadoras foi de 0,12g/mL,

concentraes semelhantes foram encontradas por Stemmer (Stemmer et

al.,2003).

Os resultados obtidos por espectrofotometria so apresentados na

tabela a seguir:

Doadoras [DNA]g/mL

D1 0,2

D2 0,0

D3 0,1

D4 0,1

D5 0,2

D6 0,2

D7 0,1

D8 0,1

D9 0,2

D10 0,0

Tabela 2: Concentrao de DNA plasmtico livre em doadoras sadias, determinado por espectrofotometria.

41

Paciente [DNA]

g/mL Paciente [DNA] g/mL

MG 42 EGS 25 MNL 16 FJLS 12 VP 50 LSP 0

SMJ 18,3 MSS 20 RSB 30 MLX 30 OS 27 ASM 2

GRF 3 VMG 26 LAMJ 1 MMS 19 NM 37 ABV 12 MAL 0 ICJ 14 NT 20 GPS NA AC 27 RCS 12

DBS 42 LPN 12 FMP 42 IAS 13 MIS 4 MNC 60 NGS 11,3 MSFL 36

SMSS 22,9 AG 30 JF 3 MJO 18

NNP 35 INC 1,3 ESN 0 MB 12

Tabela 3: Concentrao de DNA plasmtico livre nas pacientes ao

diagnstico.

A avaliao estatstica comparativa entre os dois grupos nos

forneceu um valor de p

DNA (0 meses) DNA (3 meses) DNA (6 meses)Controles Mdia DP 0,15 0,05 --- ---

Adjuvante Mdia DP P 20,29 13,8

0,007 27,38 25,6

0,042 32,8 13,9

0,001

Neoadjuvante Mdia DP P 27,47 15,5

< 0,0001 31,08 22,8

0,023 30,75 22,3

0,002

Paliativo Mdia DP P 15,00 15,3

0,276 37,33 31,8

0,086 35,75 22,1

0,008

Geral Mdia DP P 14,96 2,6 < 0,0001

24,41 4,4 < 0,0001

18,42 3,4 < 0,0001

Tabela 4: Concentraes de DNA plasmtico(g/mL) das pacientes portadoras de cncer de mama em comparao com doadoras sadias durante o perodo do estudo. Teste t-Student para amostras independentes.

Com base nesta correlao estatstica foi construda uma curva ROC

para avaliar a concentrao de DNA plasmtico em pacientes com

carcinoma mamrio e as doadoras saudveis, para avaliar seu emprego na

deteco da atividade tumoral (figura 12). Nesta anlise obtivemos uma

sensibilidade de 96,87% e uma especificidade de 100% e um p< 0,001.

43

Figura 12: Curva ROC avaliando a concentrao do DNA plasmtico de pacientes ao diagnstico quando comparadas s doadoras.

Com relao ao tipo de tratamento no se observou correlaes

estatsticas significativas quando comparou-se a concentrao do DNA

plasmtico em pacientes que apresentaram metstases distncia com as

pacientes com tumores localizados(p=0,233) (figura 13).

44

Figura 13: Curva ROC avaliando a concentrao do DNA plasmtico de pacientes com tumores localizados em comparao aos tumores metastticos.

Em relao concentrao de DNA plasmtico livre e os marcadores

CEA e CA15.3 no se observou nenhuma correlao significante, tambm

no verificamos nenhuma correlao entre as instabilidades de

microssatlites e os marcadores sricos conforme exemplifica a figura 14 a

seguir.

45

Figura 14: esquerda avaliao dos Gis de poliacrilamida nos tempos 0, 3 e 6 meses referentes s amostras de sangue, urina e plasma para a regio microssatlite TP-53 PCR15.1. direita a representao grfica dos marcadores CEA(ng/mL), CA15.3(U/mL) e a concentrao de DNA plasmtico(g/mL) livre avaliados no mesmo perodo. Paciente em tratamento neoadjuvante que realizou 4 ciclos de adriamicina e ciclofosfamida (AC) e 4 ciclos de paclitaxel(T).

Conforme observado na figura acima a presena de LOH na regio

TP53-PCR15.1 na amostra de sangue no tempo 6 e na urina no tempo 3,

enquanto que a amostra de plasma permaneceu estvel, exemplificando a

no concordncia entre os tipos de amostra quando avaliada a instabilidade

genmica.

46

5 DISCUSSO

No presente trabalho, observamos o surgimento de instabilidade

genmica atravs da avaliao das regies de microssatlites em todos os

tipos de amostras colhidas, sangue, plasma e urina.

Na frao mononuclear do sangue perifrico a incidncia encontrada

de 92,5% das pacientes se encontra de acordo com os resultados obtidos

por Fonseca e colaboradores (Fonseca et al., 2005).

O surgimento de instabilidade de microssatlites no sangue perifrico

indica uma ineficincia do sistema de reparo do DNA, os agentes alquilantes

podem reduzir a expresso gnica de protenas de reparo como o hMSH2

(Fonseca et al., 2005). Em modelos experimentais, linfcitos expostos

agentes alquilantes tambm se verifica a diminuio da expresso de tal

protena de reparo (Marsicano et al., 2008) concomitante ao aparecimento

de instabilidade genmica (MIS e LOH).

A homogenidade entre a quantidade de eventos encontrados em

nossos resultados valida o emprego das regies escolhidas mostrando seu

direcionamento para o estudo de instabilidade de microssatlites na frao

mononuclear do sangue perifrico (Fonseca et al., 2005).

Tais instabilidades em clulas da frao mononuclear podem estar

relacionadas gnese de leucemias secundrias. As leucemias secundrias

apresentam mais frequentemente instabilidade de microssatlites e

aberraes cromossmicas (Visani et al., 2000). Visani e colaboradores

associam a exposio prvia a agentes alquilantes como um fator de risco

47

no desenvolvimento destas leucemias, tal fato nos permite avaliar a

presena das instabilidades genticas, aqui representadas pelas regies de

microssatlite como um indicador de genotoxicidade em longo prazo, visto

que tais leucemias surgem no perodo de 5 a 10 anos aps o trmino do

tratamento (Visani et al., 2000).

A leucemia mielide aguda (t-AML) a mais associada ao tratamento

com agentes alquilantes, como a ciclofosfamida. E o risco de seu

desenvolvimento eleva-se de 1 a 2 anos tendo sua maior incidncia entre 5

e 10 anos, aps este perodo o risco diminui (Le Deley et al., 2008).

Adicionando-se ao efeito leucemognico da ciclofosfamida as

pacientes com cncer de mama so muito frequentemente tratadas com

combinaes de antraciclinas, como a adriamicina, e agentes alquilantes. Le

Deley e colaboradores avaliaram o risco do desenvolvimento de leucemias e

sndromes mielodisplsicas em pacientes com cncer de mama tratadas

com antraciclinas. Verificaram que estas apresentam um risco relativo

superior a 3 vezes quando comparadas com outras pacientes (Le Deley et

al., 2008).

Estas leucemias secundrias so geralmente precedidas por

sndromes mielodisplsicas, so resistentes ao tratamento e apresentam

pior prognstico.

O surgimento de instabilidades genticas em um tecido no

comprometido com a carcinognese como a frao mononuclear nos

permite uma nova abordagem sobre os regimes quimioterpicos e as suas

implicaes (Leone et al., 2002; Marsicano et al., 2008).

48

No apenas as mutaes em regies gnicas alvo mas tambm os

fenmenos epigenticos como a hipermetilao de regies promotoras dos

genes supressores de tumor, ou ainda a deacetilao de histonas

contribuem no desenvolvimento de leucemias secundrias. De modo que j

se observou a metilao nos genes das protenas do sistema de reparo do

DNA. A hipermetilao do promotor do gene hMLH1 pode estar relacionada

com o silenciamento e consequentemente com o surgimento das

instabilidades de microssatlites observadas nos resultados do presente

trabalho. (Leone et al., 2002). A ineficincia do sistema de reparo encontrado

pela medida da instabilidade de microssatlites nos permitiria entender em

parte a gnese das translocaes e delees encontradas nas leucemias

secundrias (Leone et al., 2002).

Pode-se aventar a hiptese de que as regies promotoras dos genes

de reparo ou ainda de seus fatores de transcrio estejam hipermetiladas,

justificando a diminuio da expresso de tais protenas consequentemente

gerando as instabilidades de microssatlites. Tal fenmeno epigentico

possui tamanha relevncia que novos esquemas teraputicos implementam

agentes desmetilantes com a finalidade de previnir o surgimento de tal

fenmeno (Leone et al., 2002).

Sobre as amostras de sangue, ainda se faz necessrio questionar seu

emprego como padro de comparao com o tumor, realizado

principalmente para os casos de HNPCC, visto que essas regies

apresentam variaes devido ao tratamento o que comprometeria sua

fidelidade com a estabilidade gentica (Fonseca et al., 2005).

49

Ainda nesse estudo, nos propusemos a avaliar o acometimento de

diferentes matrizes biolgicas expostas ao tratamento sistmico. Dessa

maneira, verificamos que os resultados obtidos em amostras de sedimento

urinrio apresentaram pouca concordncia quando comparados com os

resultados da frao mononuclear. Talvez, a exposio de diferentes

matrizes biolgicas ao tratamento sistmico nos permita avaliar diferentes

resultados de instabilidade genmica mostrando que cada clula possui sua

suscitibilidade a genotoxicidade e ainda essa verificao pode refletir

diferentes interpretaes quanto a funcionalidade do sistema de reparo do

DNA e do envolvimento epigentico.

Das pacientes avaliadas, 62,5% dessas apresentaram instabilidade

de microssatlites na anlise do sedimento urinrio, tal dado nos mostra que

a matriz avaliada pode apresentar menor sensibilidade quando comparada

com a frao mononuclear do sangue perifrico quando utilizado o mesmo

painel de marcadores de microssatlites. Assim, sugere-se que os

marcadores poderiam ser complementados com outros para serem usados

nas amostras do sedimento urinrio. Ressalta-se que estes marcadores

haviam sido validados para anlise da instabilidade genmica na frao

mononuclear do sangue perifrico de mulheres com cncer de mama

(Fonseca et al., 2005).

Molina e colaboradores reportam o emprego da instabilidade de

microssatlites no diagnstico do cncer de bexiga com uma elevada

sensibilidade, no entanto empregando um painel de microssatlites diferente

do usado em nossa avaliao e ainda no referido trabalho so estudadas

50

clulas diretamente relacionadas com a carcinognese no estudo com

cncer de bexiga (Molina et al., 2003).

As instabilidades de microssatlites encontradas no cncer de bexiga

demonstram papel importante na carcinogenese sendo apontadas como um

possvel achado precoce de diferenciao celular em leses pr-malignidade,

pois so encontradas em estgios iniciais da neoplasia (Zulueta et al.,1993).

A Ciclofosfamida, agente alquilante presente nos regimes de 80% das

pacientes, se apresenta como um fator de risco estabelecido para o cncer

de bexiga. Travis e colaboradores descreveram que doses cumulativas de

ciclofosfamida de 50g acarretam em um aumento de 14,5 vezes mais

chance do desenvolvimento do cncer de bexiga (Travis, 2006).

A ciclofosfamida empregada nos regimes antineoplsicos, aps

ativao heptica e reaes subseqentes biotransformada em

aldosfosfamida e acrolena, o primeiro composto possui atividade contra as

clulas neoplsicas e o segundo um potencial causador de cistite

hemorrgica (Hardman et al., 1996).

Cox e colaboradores relatam que a acrolena capaz de inibir a

enzima DNA metilase, interrompendo a metilao e consequentemente

silenciamento gnico, o mesmo composto ainda capaz de se ligar ao

prprio DNA formando aductos que impossibilitam a metilao dos cidos

nuclicos (Cox et al., 1988).

Desta forma a gnese das instabilidades genmicas nas amostras de

sedimento urinrio pode ser oriunda da hipometilao do DNA, um evento

epigentico mais freqente em regies repetitvas como os microssatlites

51

(Ehrlich et al., 2002). Tal achado corrobora com a pouca concordncia

encontrada em nosso trabalho entre as amostras do sedimento urinrio e o

sangue perifrico indicando diferentes mecanismos para as instabilidades de

microssatlites encontradas (Ehrlich et al., 2002; Leone et al., 2002). Esta

diferena de origem das instabilidades genticas encontradas tambm

poderia ajudar a explicar a razo pela qual encontramos pacientes com

painel de microssatlites normal no sangue perifrico e instvel no

sedimento urinrio (Ehrlich et al., 2002).

Nos regimes de altas doses de ciclofosfamida o agente uroprotetor

metexano largamente empregado para evitar leses na bexiga, por meio

da neutralizao da acroleina por seus radicais sulfidrila (Hardman et al.,

1996; Cox et al., 1988).

Foi possvel verificar que em pacientes que no apresentaram

instabilidade genmica no sangue perifrico apresentaram instabilidade nas

amostras de urina. Ainda em pacientes com instabilidade genmica na

frao mononuclear do sangue apresentaram um perfil de instabilidade

genmica diferente, o que nos permite afirmar que as clulas do trato genito

urinrio so afetadas de maneira diferente pelos regimes quimioterpicos.

Com os avanos nas tcnicas diagnsticas e no aumento da

sobrevida dos pacientes com neoplasias primrias se faz necessria uma

nova abordagem dos riscos em longo prazo dos tratamentos empregados.

Devido genotoxicidade avaliada pela instabilidade das regies de

microssatlites encontradas nas matrizes estudadas no presente trabalho,

permite-se aventar a hiptese de que agentes citoprotetores como a

52

Amifostina poderiam ser empregados para evitar o surgimento deste

fenmeno, tal avaliao foi observada em culturas de clulas de cncer de

mama (Marsicano et al., 2008). Neste trabalho os linfcitos tratados com

Amifostina no apresentaram instabilidade de microssatlite quando

expostas ao melphalano (agente alquilante que no necessita de

metabolismo de primeira passagem).

Os resultados encontrados para as amostras de DNA plasmtico

foram mais discordantes do que a urina em relao ao sangue perifrico. As

discordncias dos eventos encontrados entre o plasma e a frao

mononuclear nos isolam da possibilidade da contaminao do plasma por

DNA do sangue perifrico. Essa diferena entre os perfis de instabilidade de

microssatlites destas amostras pode ser explicada pela origem do DNA. O

DNA avaliado na frao mononuclear do sangue tem origem nas clulas do

sangue e no est relacionado com o tumor primrio, j o DNA plasmtico

apresenta sua origem no tumor, refletindo portanto, o comportamento da

neoplasia primria frente ao tratamento.

Contudo, a no reproduo da homogenidade dos eventos

observados tanto na urina quanto no plasma sugere que o painel estudado

no sangue perifrico no seja o mais adequado para as outras duas matrizes

avaliadas.

importante notar que o DNA presente em baixas concentraes em

indivduos sadios pode ser oriundo de apoptose e lise celular, contudo

Umetani avaliou seqncias repetidas e observou que os fragmentos de

DNA plasmtico oriundos de apoptose no apresentam mais de 200 pares

53

de base, fato que nos permite avaliar com segurana seqncias maiores do

que esta neste tipo de amostra (Umetani et al.,2006).

Schwarzenbach e colaboradores reportam 50% de perdas de

heterozigosidade ao analisar no plasma, a instabilidade de microssatlites

em loci que apresentam alteraes especficas nos tumores

(Schwarzenbach et al.,2004).

Assim como Schwarzenbach, encontramos em nosso trabalho mais

instabilidades genmicas de LOH do que de MSI, contudo observamos uma

maior incidncia da MSI nas amostras de plasma (Schwarzenbach et

al.,2004).

Possivelmente a anlise da instabilidade genmica encontrada no

DNA plasmtico livre reflita o surgimento de quimioresistncia por parte do

tumor primrio. Adicionalmente poderamos aventar que os genes de reparo

das clulas tumorais no conseguiriam encaminhar estas clulas para a

morte celular aps a ligao dos agentes alquilantes fita de DNA.

Ao avaliarmos as mdias de concentrao do DNA plasmtico das

amostras com instabilidade genmica com as que no apresentam tal

fenmeno no encontramos diferena significativa. Desta forma possvel

aventar que o aumento da concentrao do DNA plasmtico seja um

fenmeno do prprio desenvolvimento tumoral, ao passo que o surgimento

de instabilidades de microssatlite neste tipo de amostra componha uma

avaliao da genotoxicidade dos tratamentos anti-neoplsciosintra tumoral

(Schwarzenbach et al.,2004).

54

As concentraes de DNA plasmtico livre encontrado nas amostras

tanto estveis quanto instveis, embora possuam concentraes parecidas

podem divergir quanto integridade do material genmico liberado na

circulao. Umetani e colaboradores propem que a integridade do DNA

plasmtico um marcador para a progresso dos tumores e ainda para

metstase linfonodal (Umetani et al.,2006).

Trabalhos anteriores como o de Schawrzenbach, ao avaliar os

marcadores sricos frente concentrao de DNA plasmtico tambm no

obtiveram correlaes entre estes parmetros (Schwarzenbach et al.,2004).

No caso do CEA e CA 15.3 so antgenos carboidratos que se

encontram na superfcie celular, o CA 15.3 inclusive da superfcie do tecido

epitelial de mama, esses se apresentam aumentados frente ao crescimento

tumoral. J o DNA plasmtico livre liberado no plasma pelos tumores

devido a fenmenos como a necrose, a morte por desprendimento anoikis,

colapso mittico e a morte celular devido ao dos tratamentos

antineoplsicos.

A no concordncia entre as instabilidades genmicas observadas

nas diferentes amostras prope uma genotoxicidade diferente em cada

matriz celular avaliada, seja ela a frao mononuclear do sangue perifrico,

a urina ou ainda o DNA plasmtico de origem tumoral (Umetani et al., 2006).

Contudo, a concordncia encontrada nos marcadores pode nos

remeter a uma maior sensibilidade das regies avaliadas. A regio FMR2

(localizada no cromossomo X) que apresentou uma concordncia de 37,98%

entre as matrizes analisadas poderia ser mais suscetvel ao genotxica

55

dos agentes alquilantes empregados no tratamento das pacientes (Deitmeier

et al., 1997).

Sobre a concentrao do DNA plasmtico podemos observar uma

diferena significativa entre sua concentrao quando avaliamos doadoras

sadias e pacientes portadoras de carcinoma mamrio ao diagnstico (p<

0,001), tal averiguao permite avaliar a liberao de DNA plasmtico como

uma ferramenta diagnstica, ou ainda como uma via de acesso biologia

tumoral.

Nas amostras do presente trabalho colhidas durante o tratamento de

pacientes submetidas terapia neoadjuvante, foi obtida uma correlao de

p=0,02 quando comparou-se a concentrao do DNA plasmtico livre das

pacientes que responderam ao tratamento em relao ao grupo de pacientes

que no responderam ao tratamento.

Novos estudos que avaliem a composio e integridade deste DNA

possibilitaro novas avaliaes sobre a cintica da liberao dos cidos

nuclicos.

Sobre o aumento da concentrao do DNA plasmtico livre aps o

incio do tratamento quimioterpico neoadjuvante poderia ser interpretado

como o DNA de clulas tumorais mortas pelo tratamento quimioterpico

liberadas na circulao sanguinea , desta forma no refletindo a progresso

da doena, mas como resultado da terapia citotxica. Este fato permite

cogitar o uso do DNA plasmtico livre como avaliador da resposta

teraputica no tumor.

56

A caracterizao deste DNA em necrtico ou apopttico proposta por

Umetani e colaboradores pode ser de grande importncia na avaliao do

DNA liberado pelo tumor a fim de identificar o DNA liberado devido ao

tratamento e o liberado pelo prprio crescimento tumoral (Umetani et al.,

2006; Frattini et al., 2008).

Frattini associa a elevao do DNA plasmtico livre em pacientes com

doena recorrente em casos de cncer de colo retal. No mesmo trabalho o

seguimento dos pacientes foi maior frente ao realizado em nossas

avaliaes, portanto novos estudos que acompanhem as pacientes por

maiores perodos de tempo podero verificar se tal achado tambm pode ser

empregado em casos de carcinoma mamrio (Frattini et al., 2008).

Com base nos resultados do presente trabalho pode-se observar um

padro distinto da genotoxicidade induzida pela terapia antineoplsica nas

trs matrizes avaliadas, frao mononuclear do sangue perifrico, sedimento

urinrio e DNA plasmtico livre. Tais diferenas esto relacionadas tanto

origem do DNA avaliado, quanto aos mecanismos envolvidos e as

conseqncias destas alteraes genticas.

Quanto s implicaes das concentraes do DNA plasmtico

podemos aventar seu emprego como um potencial marcador de resposta

teraputica e no de crescimento tumoral como os marcadores sricos.

Estudos de caracterizao deste DNA podero fornecer informaes sobre a

resistncia aos regimes antineoplsicos.

57

6 CONCLUSES

1. Foram encontradas instabilidades genmicas nas regies de

microssatlites analisadas nas amostras de sangue, sedimento urinrio e

plasma das pacientes includas neste estudo.

2. As instabilidades nas regies de microssatlites encontradas nas

diferentes amostras no concordam entre si, sugerindo uma vulnerabilidade

genmica distinta entre os tipos de matrizes analisadas.

3. A concentrao de DNA plasmtico livre no se correlacionou com

os marcadores sricos CEA e CA15.3 usados na abordagem clnica do

cncer de mama. O aumento da concentrao do DNA plasmtico em

pacientes que responderam objetivamente quimioterapia neoadjuvante

poder se constituir em um novo marcador para casos em neoadjuvncia.

Estudos confirmatrios esto em curso para averiguar esta possibilidade.

58

7 REFERNCIAS

Aaltonen L, Peltomaki P, Leach F, Sistonen P, Pylkanen L, Mecklin J, Jarvinen H, Powell S Jen J, Hamilton S, Petersen G, Kinzler K, Vogelstein B, De la Chapelle A. Clues to the pathogenesis of familial colorectal cancer. Science. 1993; 260: 812-816. American Cncer Society diponvel em: http://www.cancer.org/docroot/ CRI/content/CRI_2_4_2X_What_are_the_risk_factors_for_breast_cancer_5.asp ltimo acesso em 03/06/2008. Anbazhagan R, Fujii H, Gabrielson E. Microsatellite instability is uncommon in breast cancer. Clin Cancer Res. 1999; 5:839-44. Benachenhou N, Guiral S, Gorska-Flipot,I, Labuda D, Sinnett D. Frequent loss of heterozygosity at the DNA mismatch-repair loci hMLH1 a