janaÍna pereira guimarÃes

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NUTRIÇÃO

JANAÍNA PEREIRA GUIMARÃES

ANÁLISE DE PRESENÇA DE Staphylococcus aureus EM QUEIJOS ARTESANAIS, COMERCIALIZADOS NA CIDADE

DE APUCARANA-PR.

Apucarana

2018

1


ANÁLISE DE PRESENÇA DE Staphylococcus aureus EM

QUEIJOS ARTESANAIS, COMERCIALIZADOS NA CIDADE DE APUCARANA-PR.

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Nutrição da Faculdade de Apucarana – FAP como requisito obrigatório para obtenção de título de Bacharel em Nutrição.

Orientador: Prof. Me. Udson Mikalouski.

Apucarana 2018

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ANÁLISE DE PRESENÇA DE Staphylococcus aureus EM QUEIJOS ARTESANAIS, COMERCIALIZADOS NA CIDADE DE APUCARANA-

PR

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Nutrição da Faculdade de Apucarana – FAP, com objetivo de obtenção do título de Bacharel em Nutrição, com nota final igual a _______, conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:

BANCA EXAMINADORA Me. Udson Mikalouski Faculdade de Apucarana Me. Eduardo do Amaral Todelo Faculdade de Apucarana Me. Vera Lucia Delmonico Vilela Faculdade de Apucarana

Apucarana, ___ de ___________ de 2018.

.

3

DEDICATÓRIA

A minha família pelo apoio e

carinho durante esse período de

faculdade.

4

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por ter me abençoado durante o período de

faculdade, sempre me dando força para não desistir.

À minha família por me apoiarem nos momentos difíceis me ajudando

sempre da maneira como podem e pelas orações.

Ao professor e orientador Udson Mikalouski, pelo apoio e motivação na

realização de todas as etapas deste trabalho.

Aos colegas de turma pelo aprendizado que me proporcionaram durante

esses quatro anos, onde construímos amizades e nos tornamos mais unidos.

Aos professores que compõem o corpo de docentes do curso de Nutrição

da Faculdade de Apucarana – FAP, que contribuíram para a formação de

profissionais qualificados, através da transmissão de seus conhecimentos.

A todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

.

5

“Aquele que não luta pelo futuro que quer,

deve aceitar o futuro que vier”.

Autor Desconhecido

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GUIMARÃES, Janaína Pereira. Análise de presença de Staphylococcus aureus em queijos artesanais, comercializados na cidade de Apucarana-PR. 42p. Trabalho de Conclusão de Curso (Monografia). Graduação em Nutrição da Faculdade de Apucarana. Apucarana-Pr. 2018. RESUMO A maioria dos surtos de intoxicação alimentar ocorre através da ingestão de alimentos que apresentam boa aparência, sabor e odor normais, sem qualquer alteração sensorial visível, desencadeando desconforto ao individuo devido aos seus sintomas. O estudo teve como objetivo analisar presença de Staphylococcus aureus em queijos artesanais, comercializados na cidade de Apucarana-PR. Trata-se de um estudo quali-quantitativo e transversal, no qual se utilizou o método de acordo com o guia de interpretação Placa PetrifilmTM Staph Express para Contagem Expressa de Staphylococcus aureus, com modificações. Foram analisados 8 amostras sendo 4 de queijo e 4 de leite, e das amostras positivas para a bactéria foi realizado teste de sensibilidade a 5 tipos de antibióticos. Observou-se maior contaminação do produto final quando comparado com a matéria-prima e que S. aureus apresentou maior resistência ao antibiótico Azitromicina. Conclui-se que é necessário melhorar a fiscalização das condições higiênicas sanitárias durante a produção, o armazenamento e o transporte do produto, para não causar risco à saúde do consumidor. Palavras-chave: Contaminação de alimentos, Controle de qualidade, Microbiologia de alimentos.

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GUIMARÃES, Janaína Pereira. Analysis of the presence of Staphylococcus aureus in artisanal cheeses, marketed in the city of Apucarana-PR. 42p. Course Conclusion Work (Monograph). Graduation in Nutrition of the Faculty of Apucarana. Apucarana-Pr. 2018.

ABSTRACT

Most outbreaks of food poisoning occur through the ingestion of foods that have good appearance, normal taste and odor, without any visible sensory change, triggering discomfort to the individual due to their symptoms. The objective of this study was to analyze the presence of Staphylococcus aureus in artisanal cheeses, marketed in the city of Apucarana-PR. This is a qualitative and cross-sectional study, using the method according to the interpretation guide Petrifilm ™ Staph Express Plate for Staphylococcus aureus ExpressCount, with modifications. Eight samples were analyzed, 4 of which were cheese and 4 of milk, and of the positive samples for the bacterium, a sensitivity test was performed on 5 types of antibiotics. It was observed a greater contamination of the final product when compared to the raw material and that S. aureus presented greater resistance to the antibiotic Azithromycin. It is concluded that there is a need to improve the monitoring of hygienic health conditions during the production, storage and transport of the product so as not to endanger the health of the consumer. Keywords: Food contamination, Quality control, Food microbiology.

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LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 – Classificação aos antibióticos em 24 horas....................................32

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Curva de crescimento bacteriano.....................................................22 Figura 2 – Placas das amostras de queijos e leites após 24 horas...................27 Figura 3 – Placas das amostras de queijos e leites após 48 horas...................27 Figura 4 – Teste de sensibilidade aos antimicrobianos m 24 horas..................36 Figura 5 – Teste de sensibilidade aos antimicrobianos m 48 horas..................36

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LISTA DE TABELA Tabela 1 – Categoria de bactérias com base na tolerância à temperatura.......20 Tabela 2 – Valores de halos inibitórios esperados para controle de qualidade (mm)...................................................................................................................26 Tabela 3 – Contagem de colônias de coloração vermelha-violeta.....................28 Tabela 4 – Comparação do resultado da contagem de colônias das amostras (A) e (B)..............................................................................................................31 Tabela 5 - Sensibilidade bacteriana a antibiótico em razão do halo de

inibição formado (mm)........................................................................................34

Tabela 6 – Classificação das amostras conforme o halo de cada antibiótico..35

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LISTA DE SIGLAS Aa Atividade de água ABIQ Associação Brasileira das indústrias de Queijos AMP Ampicilina AZI Azitromicina ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária BPA Boas Práticas Agropecuárias BPF Boas Práticas de Fabricação DTA Doença Transmitidas por Alimentos Eh Potencial de Oxi-redução EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária FAP Faculdade de Apucarana g Gramas H2Op Água Peptonada IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística INTERM Intermediário MAPA Mistério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento mg Miligrama ml Mililitro mm Milímetro NOR Norfloxacin pH Potencial Hidrogeniônico RDC Resolução da Diretoria Colegiada S. aureus Staphylococcus aureus TET Tetraciclina

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TNTC Incontável UFC Unidade de Formação de Colônias VAN Vancomicina VIT Vitamina °C Grau Celsius µm Micrometro

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO.............................................................................................. 14

2 OBJETIVOS.................................................................................................. 16

2.1 Objetivo geral............................................................................................... 16

2.2 Objetivos específicos.................................................................................. 16

3 REFERÊNCIAL TEÓRICO............................................................................ 17

3.1 Alimentos lácteos........................................................................................ 17

3.2 O queijo e suas características nutricionais............................................ 17

3.3 Doenças transmitidas por alimentos (DTA’s)........................................... 18

3.4 Boas práticas de fabricação e manipulação............................................. 19

3.5 Fatores que influenciam o crescimento microbiológico em alimentos. 20

3.6 Bactérias do gênero Staphylococcus....................................................... 22

3.7 Antimicrobianos.......................................................................................... 23

4 METODOLOGIA........................................................................................... 24

4.1 Tipo de metodologia para análise.............................................................. 24

4.2 Preparação das amostras........................................................................... 24

4.3 Inoculação.................................................................................................... 24

4.4 Incubação..................................................................................................... 25

4.5 Teste de sensibilidade ou resistência aos antimicrobianos................... 25

4.6 Contagem de Colônias................................................................................ 25

4.7 Classificação dos microrganismos aos antibióticos............................... 25

4.8 Critério de inclusão..................................................................................... 26

4.9 Critério de exclusão.................................................................................... 26

4.10 Riscos........................................................................................................... 26

4.11 Beneficios.................................................................................................... 26

5 RESULTADO E DISCUSSÃO...................................................................... 27

6 CONCLUSÃO............................................................................................... 37

7 REFERENCIAS............................................................................................. 38

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1 INTRODUÇÃO

A contaminação do alimento por microrganismos e suas toxinas, quando

ingeridos podem causar intoxicação alimentar, classificada como uma doença

transmitida por alimento (DTA), causando incomodo ao indivíduo devido aos seus

sintomas (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2017).

A maioria dos surtos é associada à ingestão de alimentos sem qualquer

modificação sensorial visível, com boa aparência, sabor e odor normal. Isso

acontece quando a porção infectante de patógenos alimentares está presente em

uma menor concentração comparada com a quantidade de microrganismos

responsáveis pela degradação do alimento, sendo um obstáculo para a

rastreabilidade do alimento contaminado, pois os consumidores terão dificuldade em

reconhecer sensorialmente o alimento fonte de DTA, já os alimentos com alguma

alteração sensorial são mais difíceis de causarem surtos devido à sensação

repulsiva que causam aos consumidores (OLIVEIRA et al, 2010).

O Staphylococcus aureus é um dos principais agentes de intoxicações

alimentares em todo o mundo (CDC, 2011 apud Amorim, 2013), a bactéria é

considerada uma das espécies mais comuns e a mais virulenta do seu gênero,

sendo sensíveis a soluções antissépticas, temperaturas elevadas e desinfetantes,

porém, podendo sobreviver por um período longo de tempo em local seco (LIMA et

al, 2015).

As toxinas produzidas pelo S. aureus conhecidas como enterotoxinas são

termoestáveis, ou seja, resistente a temperaturas elevadas e consideradas agentes

predominantes de intoxicação de origem bacteriana no ser humano, nos surtos de

DTA (NACIMENTO E MARTINEZ, 2017).

De acordo com a resolução – RDC nº. 12, de 2 de janeiro de 2001

(ANVISA), o padrão microbiológico para Staphylococcus coagulase positiva é de no

máximo 5x10² UFC/g, em queijos do tipo frescal. Já em leite cru quando o número

de S. aureus excede 104 ou 105 UFC/ml, aumenta-se o risco de ocorrência de

intoxicação estafilocócica, por isso é importante que a concentração dessa bactéria

seja menor que 104 UFC/ml (JAY, 2005).

A produção do queijo de forma artesanal é considerada como um dos

principais causadores de intoxicação alimentar estafilocócica, considerando a sua

composição e forma de produção totalmente manual (OLIVEIRA et al, 2016).

15

Segundo a Lei n° 14.185, de 31 de janeiro de 2002, é considerado queijo artesanal o

queijo confeccionado a partir do leite integral de vaca, fresco e cru, retirado e

beneficiado na propriedade de origem, conforme a tradição histórica e cultural da

área onde for produzido.

Para evitar a contaminação no momento da produção, se faz necessário um

ambiente e utensílios higienizados adequadamente, as matérias-primas devem ser

armazenadas em locais apropriados, limpos, com temperatura ideal para que não

ocorra à proliferação de bactérias, e também a higiene pessoal do manipulador é de

extrema importância, pois o mesmo terá contato direto com as matérias primas e

com o produto final, esses cuidados são essenciais para que se tenha uma boa

qualidade do queijo produzido, sem oferecer risco à saúde do consumidor.

Atualmente, com o aumento da demanda, a maior parte dos produtores

visando lucro acaba se preocupando mais com a quantidade de produção do que

com a qualidade, fazendo com que as boas práticas de fabricação sejam

negligenciadas, o que pode acarretar risco à saúde do consumidor.

16

2 OBJETIVOS:

2.1 Objetivo geral:

Analisar presença de Staphylococcus aureus em queijos artesanais,

comercializados na cidade de Apucarana,PR.

2.2 Objetivo especifico:

Avaliar se a presença de Staphylococcus aureus está de acordo com a

legislação RDC n°12, de 02 de janeiro de 2001.

Analisar a sensibilidade ou resistência aos antimicrobianos das amostras

positivas para Staphylococcus aureus.

17

3 REFERENCIAL TEÓRICO

3.1 Alimentos lácteos

Os produtos lácteos são aqueles que têm em sua composição o leite como

principal ingrediente, como exemplo: o queijo, o iogurte, a ricota, o requeijão, os

doces e bebidas lácteas. A causa predominante de deterioração da qualidade

desses produtos é quando ocorre a multiplicação de microrganismos e a rancidez

oxidativa, sendo o tipo de deterioração conforme as características do produto.

(AGEITEC, [200-]).

O leite é um produto oriundo da ordenha completa, ininterrupta, em condições de higiene, de vacas sadias, bem alimentadas e descansadas. O leite de outros animais deve denominar-se segundo a espécie de que proceda. Já os produtos lácteos são os produtos obtidos mediante processamento tecnológico do leite, podendo conter ingredientes, aditivos e coadjuvantes de tecnologia, apenas quando funcionalmente necessários para o processamento. (BRASIL, 2017).

O leite mais usado na alimentação humana é o leite de vaca, no qual a

composição desse leite depende da raça, da alimentação do animal, da

particularidade, da época do ano de lactação entre outros fatores, sendo assim, a

composição do leite de vaca, por 100 ml, pode ter variações como: proteínas de 3 a

4g (caseína 2,87 e albumina 0,56); lipídios de 3 a 6 g; glicídios de 4,6 a 5g; minerais

de 0,7 a 0,75g; vitaminas: “A” de 97 a 785 mcg, “C” de 0,5 a 6,6 mg, “tiamina (B1)”

de 0,10 a 2,5 mg, “riboflavina (B2)” de 0,65 a 100 mg e “niacina” de 0,05 a 0,5 mg.

(ORNELLAS, 2013, p. 67).

De acordo com Muniz et al (2013) o consumo regular de leite e seus

derivados é recomendado por possuírem grande valor nutricional, tendo proteínas

de alto valor biológico, vitaminas e minerais, auxiliando na adequação diária de

recomendação de cálcio e outros nutrientes para o correto funcionamento do

organismo.

3.2 O queijo e suas características nutricionais

Conforme a ABIQ (2018), a composição nutricional do queijo depende do

tipo da matéria prima e tecnologia utilizada em sua produção, porem a maior parte

dos queijos abrange um teor considerável de proteína, sendo aminoácidos

essenciais considerado de alto valor biológico; de minerais como cálcio na qual a

quantidade varia conforme o teor de umidade, quanto maior for esse teor de

18

umidade menor é a quantidade desse mineral e vice-versa; as vitaminas, sendo que

as lipossolúveis dependem da quantidade de lipídios, enquanto as hidrossolúveis

variam conforme o tipo do queijo.

O começo da fabricação de queijo se deu no período paleolítico superior.

Segundo a lenda, o queijo teria sido descoberto por Aristeu, rei da Arcádia, filho de

Apolo. Os egípcios foram um dos primeiros a terem o queijo e o leite como fonte de

sua alimentação, por possuírem uma pastagem cheia de gados. Em muitas tumbas

egípcias foram encontrados queijos feitos de leite de vaca, de cabra e ovelha. É

registrado em passagem bíblica o queijo como um alimento da época, no qual os

romanos foram os responsáveis pela divulgação do queijo pelo mundo. Na idade

média referente à higiene os queijos atingiram um dos pontos mais altos, onde

certas ordens religiosas tiveram maior reconhecimento em virtude da qualidade dos

seus queijos, por conta das regras severas de higiene em sua manufatura, tanto que

o nome queijo deriva do termo medieval formatium, ou “queijo colocado na forma”,

onde os queijos primitivos não eram salgados e eram isentos de soro, sendo apenas

o leite coagulado. Após a Idade Média, ficaria restrita a fabricação de queijos finos

aos mosteiros católicos, com novas receitas criadas pelos monges.

No século XlX a produção que era artesanal passou para a industrial, aumentando

assim sua produção (PORTAL QUEIJOS NO BRASIL, 2015).

O queijo minas artesanal é feito geralmente em propriedades rurais com o

leite cru integral sem nenhum processo de pasteurização, sendo um produto vivo,

em constante mudança, mantendo as bactérias e fermentos naturais que promovem

a maturação e o sabor único ao produto final. (ASSOCIAÇÃO DOS PRODUTORES

DE QUEIJO ARTESANAL ARAXÁ, 2016, p. 15).

Segundo Associação Brasileira das Indústrias de Queijos – ABIQ,

atualmente, a média brasileira de consumo per capita é de 5,4 quilos ao ano, tendo

como objetivo aumentar o consumo até 2030 para 9,6 quilos de queijo por

habitante/ano (MILKPOINT, 2017).

3.3 Doenças transmitidas por alimentos (DTAs)

As doenças transmitidas por alimentos geralmente são de natureza

infecciosa ou tóxica, causada através da ingestão de alimentos contaminados por

microrganismos patógenos. De acordo com o Ministério da Saúde (2017), para ser

considerado um surto de DTA é necessário que dois ou mais indivíduos apresentem

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enfermidades parecidas após a ingestão do alimento de mesma origem, no entanto

para as doenças consideradas de alta gravidade, como botulismo e cólera, apenas

um caso já é considerado surto.

De acordo com Pelczar Jr et al (2011, p. 225), o tipo mais comum de

intoxicação alimentar é a estafilocócica, causado pelo S. aureus, no qual os

alimentos cozidos estão associados com esse tipo de intoxicação com maior

frequência, devido sua contaminação após o preparo, por esse motivo é

indispensável as precauções sanitárias no momento do preparo do alimento e a

refrigeração do alimento a temperatura inferior a 6 a 7°C, não devendo permanecer

por diversas horas à temperatura ambiente antes de serem servidos.

No ano de 2017 foram registrados 12.503 surtos de DTA no Brasil, com

2.340.201 indivíduos expostos ao alimento contaminado, 236.403 doentes e 182

óbitos, com taxa de letalidade 0,08%. A região com maior registro de surtos nesse

ano foi o Sudeste com 39,2 %, seguida pela região Sul com 33,9%, já a região Norte

foi à região com menor registro sendo de apenas 5%. Dos 2.593 surtos com

identificação de agentes etiológicos 92,2% eram bactérias, sendo o S. aureus o

terceiro tipo de bactéria mais identificados (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2018).

Para que diminua a ocorrência de DTAs é necessário que todo o processo

envolvido na produção do alimento ocorra de forma segura, sendo assim é

importante obedecer as boas práticas de fabricação e manipulação, conforme as

resoluções estabelecidas pela ANVISA (SKAILO; MACHADO, 2017).

3.4 Boas práticas de fabricação e manipulação

Adquirir as boas práticas de fabricação (BPF) é uma grande ferramenta para

ter uma maior qualidade e segurança do alimento, devendo ser aplicada desde a

receptividade da matéria prima até o momento de entregar ao consumidor. A BPF é

um programa dividido em vários itens, sendo eles: instalações; pessoal; operações;

controle de pragas; controle da matéria-prima; registros e documentação e

rastreabilidade (EMBRAPA, 2015).

Para garantir a qualidade do produto final é indispensável realizar os

processos de higienização, auxiliando dessa forma que ele seja inofensivo a saúde

do consumidor decorrente da ausência de perigos físicos, químicos e biológicos

(SINHORINI et al, 2015), e dessa forma a Resolução - RDC nº 216, de 15 de

20

dezembro de 2004 (ANVISA) tem intuito de garantir as condições higiênico-

sanitárias do alimento preparado.

3.5 Fatores que influenciam o crescimento microbiológico em alimentos

Conforme Franco e Landgraf (2005), o crescimento dos microrganismos

depende de diversos fatores, sendo eles fatores intrínsecos, nos quais estão

relacionados com características próprias dos alimentos como atividade de água

(Aa), potencial hidrogeniônico (pH), o potencial de oxi-redução (Eh), a composição

química, fatores antimicrobianos naturais e as interações entre os microrganismos

presentes no alimento, já os fatores extrínsecos são aqueles associados com o

ambiente em que esse alimento se encontra, onde os mais importantes são a

umidade, temperatura do ambiente e a composição química da atmosfera que o

alimento está presente.

Geralmente a velocidade de crescimento e o metabolismo dos

microrganismos são mais rápidos em temperaturas altas e lentos em temperaturas

baixas, porém cada tipo de microrganismo tem a temperatura ideal para o seu

crescimento, onde os considerados mesófilos crescem em temperaturas que variam

de 20° a 40°C, os psicrófilos são capazes de se desenvolver em temperaturas

próximas ao ponto de congelamento podendo variar de 0° a 20°C e os termófilos

que crescem acima de 45°C. (BURTON; ENGELKIRK, [200-], p.104). A tabela 1

mostra a categoria das bactérias conforme tolerância à temperatura.

Tabela 1 – Categoria de bactérias com base na tolerância à temperatura Faixa de temperatura (°C)

Grupo Mínima Ótima Máxima Psicrófilas -20 a 5 0 a 20 19 a 35 Mesófilas 10 a 15 20 a 40 35 a 47 Termófilas 40 a 45 55 a 75 60 a 90

Fonte: Burton e Engelkirk, [200-].

Cada tipo de microrganismo possui um pH ótimo para o seu crescimento,

podendo dessa forma ser classificados de acordo com sua tolerância à acidez ou à

alcalinidade. Os microrganismos classificados como acidófilas se desenvolvem

melhor em pH de 0,1 a 5,4 por ter afinidade com meio ácido, já as alcalófilas em pH

entre 7 a 11,5 e as neutrófilas entre o pH de 5,4 a 8,5 (BLACK, 2002, p. 137).

Como os microrganismos adquirem os nutrientes em solução aquosa para o

seu desenvolvimento, é necessário que o meio onde estejam tenha a presença de

21

água, sendo também que sua composição é de 80 a 90% desse liquido, dessa

maneira se a pressão osmótica do meio ambiente for hipertônica, ou seja, ter uma

maior concentração de soluto no ambiente do que na célula bacteriana, a mesma irá

morrer, pois ocorre à plasmólise que se dá quando a membrana celular e o

citoplasma se retraem, afastando-se da parede celular, impedindo assim sua

multiplicação e crescimento. Portanto a adição de soluto nos alimentos pode ser

utilizada em sua preservação, uma vez que aumentará a pressão osmótica do meio

(TORTORA et al, 2017, p. 152).

O potencial de oxidação-redução (Eh) é uma reação na qual ocorre a

variação do número de oxidação das espécies envolvidas, ou seja, quando os

agentes oxidantes no caso dos microrganismos aeróbios estão na presença de

oxigênio perdem elétrons reduzindo Eh, enquanto que os agentes redutores ganham

elétrons aumentando Eh. A presença ou ausência de uma quantidade adequada de

um agente oxidante-redutor no meio é extremamente importante para o crescimento

e realização de atividades de todos os microrganismos, sendo que para o

desenvolvimento dos microrganismos aeróbios é necessário que o Eh esteja

positivo, já para os microrganismos anaeróbios devem ser Eh negativo, tendo a

exclusão de O2 para o crescimento de alguns deles (JAY, 2005, p. 62).

Normalmente em condições apropriadas o crescimento das bactérias segue

uma curva definida e característica, na qual existem 4 fases, como mostra a figura 1.

Primeira fase de lag (adaptação ou latência): onde os microrganismos se adaptam

ao ambiente, fase exponencial: ocorre à divisão celular em velocidade máxima e

constante, fase estacionária: a multiplicação é reduzida de maneira gradual por

limitação de alguns fatores ambientais, porem a quantidade de bactérias novas é

similar com a quantidade de bactérias mortas e a fase de declínio: quando ocorre a

morte das bactérias gradualmente até que o ambiente se torne estéril, pois também

nessa fase não há divisão celular (TRABULSI e ALTERTHUM, 2008, p.32).

22

Figura 1 - Curva de crescimento bacteriano

Fonte: Joana – Brainly, 2018.

3.6 Bactérias do gênero Staphylococcus

As bactérias são microrganismos unicelulares, procarióticas, composta por

uma parede rígida contendo uma camada de peptidoglicano, realiza sua

multiplicação através de fissão binária e se apresenta de diversas formas

morfológicas, podendo ter de 0,5 µm e 5 µm de comprimento (QUINN et al, 2007, p.

18).

A aparência microscópica de uma bactéria é o meio mais importante para

sua identificação, sendo sua forma determinada pela sua parede rígida. O arranjo

das bactérias também é muito importante, por exemplo, alguns cocos se organizam

em pares (diplococos), em cadeias (estreptococos) e em agrupamentos parecidos

com cachos de uva (estafilococos), sendo estabelecido pela orientação e pelo grau

de ligação das bactérias no momento da divisão celular (LEVINSON, 2016, p. 4).

O gênero Staphylococcus pertence à família Micrococcae, sendo atualmente

33 espécies, no qual a considerada mais virulenta e a S. aureus, onde as cepas

crescem em meios comuns, caldo ou ágar simples, pH =7, à temperatura ótima de

37°C. Após 18-24 horas de incubação, as colônias formadas em placas, são

exibidas com aspectos arredondados, brilhantes e lisas, em que a coloração pode

variar de acinzentado até o amarelo-ouro (SANTOS et al, 2007).

Os Staphylococcus estão distribuídos pela natureza e fazem parte da

microbiota normal da pele e mucosa dos mamíferos. São divididos em duas

categorias: coagulase positiva e coagulase negativa, cuja divisão é baseada na

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capacidade de coagulação do plasma, sendo uma propriedade importante como

marcador de patogenicidade (TRABULSI et al, 2002, p. 181).

O Staphylococcus aureus é o segundo microrganismo causador de surtos de doenças transmitidas por alimentos no Brasil, devido à sua capacidade de produção de enterotoxinas, sendo a Enterotoxina-A a mais frequente. Pelo fato de ser colonizador frequente da pele e membranas mucosas, pode facilmente se infiltrar na cadeia de alimentos, possuindo alta transmissibilidade entre pessoas, animais e alimentos (FURQUIM; MEDINA, 2014, p.182).

De acordo com Costa et al (2012), a contagem de S. aureus auxilia no

controle higiênico dos produtos lácteos por ser usado como indicador de

contaminação após o processo de produção, sendo a quantidade suficiente para

causar intoxicação de 105 e 106 células desse microrganismo por grama de alimento,

no qual dependerá também da suscetibilidade do individuo.

3.7 Antimicrobianos

Os antimicrobianos são fármacos que tem como função bloquear o

crescimento ou destruir os microrganismos, podendo ser os antibióticos, nos quais

as substâncias são naturais ou os quimioterápicos que são substâncias sintéticas

(MOTA et al, 2010).

Conforme Guimarães et al (2010), os antimicrobianos podem ser

classificados de acordo com sua origem em: antibióticos quando são adquiridos

através de organismos vivos, em semissintéticos em que as substâncias naturais

passam por processos laboratorial e os sintéticos que são elaborados

exclusivamente em laboratório, podendo ser classificado também pela ação sobre as

células bacterianas (bacteriostáticos ou bactericidas) ou pelo mecanismo

farmacodinâmico (inibição da síntese da parede celular, inibição da síntese proteica,

inibição da síntese de ácidos nucleicos, desorganização da membrana celular,

interferência no metabolismo celular).

De acordo com Tortora et al (2017, p.17) o uso de antibióticos de maneira

intensiva por longo período ou uso inapropriado, criam um ambiente ideal para que

se desenvolvam as bactérias resistentes a esse fármaco devido as mutações de

genes bacterianos. Dessa forma a bactéria na presença do antibiótico tem vantagem

sobre as outras que são suscetíveis, tendo maior capacidade de multiplicar-se.

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4 METODOLOGIA Analisou-se a presença de S. aureus em 4 queijos artesanais do tipo frescal

e 4 leites utilizados na produção destes queijos, sendo uma amostra de cada

produtor que faz a comercialização do seu produto situados no município de

Apucarana, localizado na região norte do estado do Paraná, que segundo o IBGE

(2018) possui uma população de aproximadamente 133.726 habitantes.

A coleta foi realizada no período de julho/2018, onde os queijos e leites

foram transportados em sua própria embalagem de comercialização, dentro de uma

caixa térmica a 4±1°C, sendo levados para o Laboratório de Microbiologia da

Faculdade de Apucarana – FAP e armazenados por 18±1H na geladeira até o

momento da análise.

O estudo presente é quali-quantitativo e transversal, por avaliar a qualidade

microbiológica do queijo e do leite através da analise de Staphylococcus aureus

presentes nesses alimentos, sendo determinada a analise de um microrganismo em

um único período de tempo.

4.1 Tipo de método para análise

O método utilizado na pesquisa foi de acordo com o guia de interpretação

Placa PetrifilmTM Staph Express para Contagem Expressa de Staphylococcus

aureus, com modificações.

4.2 Preparação das amostras

Foi utilizado 25 g/ml de cada amostra, no qual os queijos foram pesados em

uma balança analítica com o auxílio de um vidro de relógio e um bisturi, já os leites

foram pipetados em sua própria embalagem de comercialização. As unidades

analíticas foram transferidas para frascos de vidro borosilicato com 225 ml de água

peptonada e 2,5 g de peptona de carne, onde foram diluídas e homogeneizadas as

amostras para a realização da inoculação nos meios de cultura.

4.3 Inoculação

A placa Petrifilm foi posicionada em uma superfície plana próximo ao bico de

Bunsen, onde se levantou o filme superior da placa e com uma pipeta posicionada

perpendicularmente a ela, foi colocado 1 ml da amostra no centro do filme, depois o

25

filme superior foi delicadamente solto em cima da amostra evitando formação de

bolhas, distribuindo-se o inoculo sobre a área circular.

4.4 Incubação

As placas foram incubadas com o lado transparente para cima, em uma

temperatura de 36±1ºC, por 24/48horas.

4.5 Teste de sensibilidade ou resistência aos antimicrobianos

Para analisar se o S. aureus têm sensibilidade ou resistência aos

antibióticos, foi usado o método conforme Silva et al. (2010).

Das placas positivas para S. aureus, foram ajustadas suas concentrações

para 1,5 x 108 unidade de acordo com a escala de Mcfarland, depois foi transferido

1ml do tubo para as placas com ágar meio Mueller Hinton para realização de

antibiograma, onde em cada placa foram utilizados os antibióticos: Ampicilina (AMP),

Azitromicina (AZI), Vancomicina (VAN), Norfloxacin (NOR) e Tetraciclina (TET). E

foram medidos os halos em volta dos antibióticos com intervalos de 24±2h e 48±2h

na estufa a 36±1ºC.

4.6 Contagem de colônias

Colônias de S. aureus podem variar de tamanho, mas todas as colônias

presentes na placa independente do tamanho apresentando de coloração

vermelham-violeta foram contadas. Como o limite máximo de contagem

recomendado na placa PetrifilmTM Staph Express é de 150 colônias S. aureus, as

placas que excederam esse limite tiveram a contagem estimada, multiplicando o

número de colônias de um quadrado por 30, pelas colônias se tornarem TNTC

(incontável). Calculou-se a população e os resultados foram expressos em UFC/g.

4.7 Classificação do microrganismo ao antibiótico

O S. aureus presente em cada amostra foi classificado quanto ao perfil de

resistência de acordo com Laborclin (2011), como mostra a tabela 2, no qual os

valores a baixo da referência foram consideradas resistente, acima do valor de

referência sensível e no valor de referência intermediário.

26

Tabela 2 – Valores de halos inibitórios esperados para Controle de Qualidade (mm)

Agentes Concentração S. aureus

Ampicilina 10µm 27-35 Azitromicina 15µm 21-26 Norfloxacin 10µm 17-28 Tetraciclima 30µm 24-30 Vancomicina 30µm 17-21 Fonte: Laborclin, 2011.

4.8 Critério de inclusão:

Incluídos nessa pesquisa queijos artesanais comercializados pelos

produtores da cidade de Apucarana que realizam a própria produção.

4.9 Critério de exclusão:

Excluídos dessa pesquisa os queijos dos produtores que não são

considerados artesanais e aqueles que o produtor não fizeram a venda do leite

usado na preparação do queijo.

4. 10 Riscos

Pode acontecer o reconhecimento do produto contaminado, porém para

cada produto foi usado um código de identificação.

Existe a possibilidade de se obter um falso resultado se houver manipulação

inadequada do produto analisado e dos materiais do laboratório.

4. 11 Benefícios

Os consumidores poderá ter conhecimento sobre a qualidade microbiológica

do produto podendo ter maior confiabilidade no momento da compra.

5 RESULTADO E DISCUSSÃO Na pesquisa foram utilizadas 8 amostras, sendo 4 de queijos artesanais do

tipo frescal identificadas como amostra de categoria (A) e 4 de leites identificadas

como amostra de categoria (B), todos comercializados pelos próprios produtores,

próximo da data de fabricação, localizados na cidade de Apucarana. As figuras 2 e 3

27

apresentam o desenvolvimento de colônias de coloração azul e de coloração

vermelha-violeta nas placas no período de 24/48 horas, onde as colônias de

coloração vermelha-violeta foram consideradas como S. aureus.

Figura 2 - Placas das amostras dos queijos e leites após 24 horas

Fonte: Autora do trabalho, 2018.

Figura 3 - Placas das amostras dos queijos e leites após 48 horas


Os dados apresentados na tabela 3, observa-se que das 8 amostras

analisadas no período de 24/48 horas, 100 % apresentaram contaminação por S.

aureus, no qual as amostras de queijos expõe valores acima do recomendado pela

legislação vigente para S. aureus e as amostras de leites apresentaram-se com

número de S. aureus abaixo de 105, porem denota-se alta contaminação. Dessa

maneira, comparado com outros estudos pode-se observar que há má qualidade

28

microbiológica tanto do leite cru quanto dos queijos é recorrente, não sendo um

problema atual.

Tabela 3 - Contagem de colônias S. aureus Contagem das placas com 24 horas

Amostra UFC/g

1.A Incontável 2.A 1,14x104 3.A 9,6x102 4.A Incontável 1.B 1,32x104 2.B Incontável 3.B 6x103 4.B 5,4x103

Contagem das placas com 48 horas Amostras UFC/g

1.A Incontável 2.A 3,51x104 3.A 6,39x104 4.A Incontável 1.B 1,26x104 2.B Incontável 3.B 5,4x103 4.B 4,8x103


No estudo de Silva e Seixas (2016), também foi detectado contaminação por

S. aureus em 100% das amostras de leite cru, nas quais houve variação entre

1,4x102 a 6,0x103 UFC/ml, sendo mais de 60% das amostras em desacordo com a

legislação vigente, assim como no estudo de Martins et al (2016), obtiveram 100%

das amostras contaminadas e todas em desacordo com a legislação, com contagem

que variaram de 2,8x103 UFC/ml a 2,3x106 UFC/ml, porém em seu estudo foi

avaliado a presença de todas as bactérias Staphylococcus coagulase positiva,

podendo ser S. aureus.

Para obter-se um leite cru com qualidade microbiológica é necessário vários

fatores como mostra o estudo de Matos et al (2017), no qual foi realizado a

avaliação da qualidade microbiológica do leite após a aplicação de boas práticas

agropecuárias, dirigido por 10 unidades produtoras de queijo artesanal no Estado do

Rio Grande do Sul, no qual observou aumento de 29% na contagem de

Staphylococcus coagulase positiva após a implementação de Boas Práticas

29

Agropecuárias, dessa maneira verificou-se a necessidade de recursos econômicos,

de infraestrutura e humanos capacitados para o sucesso da implementação de BPA

na produção. Com a implementação da BPA e as necessidades supridas pode haver

uma redução nos casos de mastite bovino causados por manejo errôneo, tendo

consequentemente menor risco de contaminação do leite cru.

Na pesquisa de Borges et al (2008) foi avaliado a presença de

Staphylococcus em 100% das amostras de leite cru, com contagens de 8,0x103 a

5,0x106 UFC/ml, sendo verificada a prevalência de S. aureus em 67% e das

amostras de leite pasteurizado todos tiveram ausência desses microrganismos.

A contaminação do leite cru pode acontecer como consequência de uma

mastite bovina, como pelos responsáveis da ordenha quando portadores

assintomáticos de S. aureus, dessa maneira o leite cru não apresentará boa

qualidade microbiológica, sendo necessário passar por processo de pasteurização

para ser utilizado na produção do queijo. Para não ocorrer à transferência desses

microrganismos, conforme Apolinário et al (2014), é necessário a pasteurização do

leite, a maturação prolongada e o controle de temperatura de estocagem, associado

com fatores intrínsecos como pH, atividade de água e a presença de compostos

antimicrobianos produzidos pelas bactérias lácteas para reduzir a contaminação

dessas bactérias patogênicas, no processamento do queijo.

É possível perceber que quando o queijo apresenta uma grande quantidade

de colônias e o mesmo foi preparado com leite cru, possivelmente o leite já estava

contaminado e/ou a contaminação é uma porcentagem referente ao leite

contaminado e a outra porcentagem a falha na BPF, mas quando o queijo apresenta

uma grande contaminação e o leite passou por processo de pasteurização, é

sugestivo de contaminação por erro na execução da BPF. (PAULO et al, 2009).

Em queijos de 2 lotes foram identificados presença de S. aureus em 18,8%

da amostra indicando recontaminação após a pasteurização do leite, relacionado a

falhas na aplicação de BPF (BORGES et al, 2008). No estudo de Amorim et al

(2014), 57% dos queijos industrializados apresentaram contagem de Staphylococcus

coagulase positiva iguais ou maiores do que 5,0x103 UFG/g, podendo indicar

manipulação excessiva e inadequada, além de representar risco potencial pela

possibilidade de serem S. aureus enterotoxigênicos, enquanto que nos queijos

artesanais 100% das amostras apresentavam-se em desacordo com a legislação

para Staphylococcus coagulase positiva sendo que as contagens variaram de

30

3,1x103 UFC/g a 4,7x103 UFG/g e nos queijos de produção informal 100% das

amostras apresentaram elevada contagem para Staphylococcus coagulase positiva

variando de 2,5x106 UFG/g a 1,75x107 UFG/g. Oliveira et al (2016), também

verificaram a presença de S. aureus em queijos artesanais, no qual 100% das

amostras demonstraram estar em desacordo com a RDC n°12, de 02 de janeiro de

2001. E no estudo de Zocche et al (2012), com queijos minas frescal e minas padrão

fabricados industrialmente, 1 amostra de cada tipo de queijo, apresentaram

contaminação de Staphylococcus coagulase positiva acima da legislação.

Ao contrário do estudo de Senger e Bizani (2011), que 40% das amostras de

queijos artesanais apresentaram-se contaminados por S. aureus acima do padrão

estabelecido pela legislação.

Em oposição ao presente estudo, Valiatti et al (2015), analisou 4 amostras

de queijos minas frescal, onde 100% das amostras apresentaram ausência de

Staphylococcus coagulase positiva, tendo esse resultando supostamente por boa

qualidade da matéria prima usado na produção dos queijos e a aplicação eficaz de

BPF.

Conforme Zocche et al (2012), quando a quantidade de Staphylococcus

coagulase positiva for acima do estabelecido pela legislação vigente, essas

bactérias podem ser potencialmente capazes de acarretar DTA, se as cepas

presentes forem produtoras de toxinas.

Essa prevalência de contaminação dos queijos artesanais pode estar

associada com o leite cru usado na produção, podendo já estar contaminado pelo

processo de ordenha de forma incorreta e/ou também por mastite passando

despercebido pelos produtores desses pontos. Nas mastites o S. aureus é

considerado o patógeno predominante, tendo prevalência de 81 a 94% dos casos,

normalmente encontrado no interior da glândula mamaria, canal do teto ou na pele,

principalmente quando apresenta alguma lesão na região (LANGONI et al, 2017

apud CONTRERAS e RODRIGUEZ 2011).

Na tabela 4, podemos observar que prevalece uma maior contaminação do

produto final, no caso o queijo quando comparado com a matéria-prima o leite, pois

3 amostras de categoria (A) deram maior quantidade de colônias presentes de

S.aureus, isso pode ter ocorrido por uma manipulação, armazenamento ou

transporte inadequado do produto final enquanto 1 amostra de categoria (B) deu

maior quantidade de colônias desse microrganismo, onde possivelmente o produtor

31

realizou algum tratamento térmico e adotou a BPF para não ocorrer a

recontaminação do produto final.

Tabela 4 – Comparação do resultado da contagem de colônias das amostras (A) e (B).

Comparação de contaminação do queijo/leite 24/48 horas Amostras Queijo (A) Leite (B)

1 ↑* ↓ 2 ↓* ↑ 3 ↑ ↓ 4 ↑ ↓

Fonte: Autora do trabalho, 2018. ↑* maior quantidade de UFC/g ↓* menor quantidade de UFC/g

Através de todos os estudos mostrados neste trabalho, podemos observar

que mesmo nos queijos fabricados de forma industrial ainda há contaminação acima

da legislação vigente para Staphylococcus coagulase positiva, sugerindo dessa

maneira que o maior índice de contaminação ocorre devido à manipulação,

transporte ou armazenamento inadequado, mas os queijos produzidos de forma

artesanal comparados com os queijos industriais são mais contaminados por essas

bactérias patogênicas provavelmente por conta do leite não passar por processo de

pasteurização aumentando assim a contaminação do produto final e também pelos

próprios produtores que às vezes não possuem conhecimento suficiente de BPF.

Como mostra o gráfico 1 em 24 horas, o antibiótico mais eficaz foi a

Tetraciclina, sendo 62,5% sensível, ao contrário do estudo de Zanette, Scapin e

Rossi (2010), onde a Vancomicina teve maior eficácia com 94,87%, enquanto que a

Tetraciclina foi considerada menos eficaz, 30,77% de resistência, 20,51% intermediário e 48,72%

sensível, porem no presente estudo a eficácia da Vancomicina é de 37,5% sensível, 12,5% resistente

e 50% intermediário aumentando o comprometimento do uso desse antibiótico para algum

tratamento.

32

Gráfico 1 - Classificação aos antibióticos em 24 horas


O antibiótico Norfloxacino assim como a Vancomicina também tem comprometimento com o

seu uso, pois 62,5% são intermediários, a maioria das fluorquinolonas apresenta grande atividade

contra bactérias gram-negativas, como no caso do Norfloxacino, e inicialmente as bactérias do

gênero estafilococos são suscetíveis, mas logo apresentam resistência, principalmente os S. aureus e

os coagulases negativos (BLUMBERG et al, 1991).

No estudo DI Santi et al (2015), considerando-se os valores de concentração inibitória

mínima, o S. aureus mostraram-se 100% suscetíveis a vancomicina, porem conforme Tizotti (2010)

apud Mimica e Mendes (2007), mesmo os glicopeptídeos, como a Vancomicina, serem estabelecidos

como escolha terapêutica em infecções por S. aureus resistente à Meticilina que é um betalâmico, os

autores relatam que cepas dessa bactéria apresentando susceptibilidade reduzida aos glicopeptídeos

em diversos países incluindo o Brasil.

O antibiótico menos eficaz foi a Azitromicina, sendo 75% resistente. No

estudo de Pereira et al (2009), 55,6% dos S. aureus apresentaram resistência a

Azitromicina, podendo estar ocorrendo através de mecanismos de transferência de

genes interespecíficos e intraespecíficos, aumentando a resistência.

A Ampicilina é o segundo antibiótico menos eficaz, sendo 25% resistente,

37,5% intermediário e 37,5% sensível. No estudo de MORITZ (2016), observou-se

resistência aos beta-lactâmicos, sendo 80,92% resistente a Ampicilina. No teste

realizado por Pereira et al (2009), foi investigado fenotipicamente a hiperprodução

de beta-lactamase pelos Staphylococcus.

0

1

2

3

4

5

6

7

Ampicilina Azitromicina Norfloxacino Tetraciclina Vancomicina

Resistente

Intermediário

Sensível

33

Em 48 horas a bactéria da amostra 2.B (resistência) e 3.B (intermediário)

adquiriram resistência a Ampicilina, as amostras 2.A (intermediário), 1.B (resistência)

e 4.B (intermediário) adquiriram resistência a Azitromicina. A amostra 4.A adquiriu

resistência a Tetraciclina e a amostra 2.B (intermediário) adquiriu resistência a

Vancomicina.

De acordo om Santos et al (2007), a resistência do S. aureus aos antibióticos

tem sido desenvolvida por mutações de genes ou por adquirir genes de resistência

de outras bactérias que já possuem resistência ao antimicrobianos.

A resistência aos antimicrobianos em S. aureus pode ser codificada

cromossomicamente ou mediada por plasmídeos e também resistência mediada por

outros mecanismos, como alteração de permeabilidade de membrana, alteração do

sítio de ação do antimicrobiano, bomba de efluxo e mecanismo enzimático.

(MOREIRA et al, 2013).

Pode ser observado conforme o halo de inibição expresso em (mm) na tabela

5 que a amostra que obteve maior resistência a Azitromicina é a amostra 1. A no

período de 24 e 48 horas, e a amostra mais sensível a Tetraciclina foi a 2. B no

período de 24 horas.

A classificação das amostras referente ao halo de inibição de cada antibiótico

conforme mostra a tabela 5 estão expressas na tabela 6.

34

Tabela 5 - Sensibilidade bacteriana a antibiótico em razão do halo de inibição

formado (mm).

No período de 24 horas Amostras AMP AZI NOR TET VAN Amostra

1.A 18 * 29 34 19

Amostra 2.A

21 20 23 35 22

Amostra 3.A

28 12 20 28 23

Amostra 4.A

33 22 20 26 18

Amostra 1.B

45 21 27 38 23

Amostra 2.B

28 20 28 40 16

Amostra 3.B

40 20 12 30 19

Amostra 4.B

39 20 30 32 20


1.A 13 * 29 35 19

Amostra 2.A

22 21 20 34 23

Amostra 3.A

30 13 30/20 25 23

Amostra 4.A

34 23 20 21 18

Amostra 1.B

44 20 26 35 23

Amostra 2.B

22 12 25 34 17

Amostra 3.B

32 20 11 30 19

Amostra 4.B

40 22 31 31 20


35

Tabela 6 - Classificação das amostras conforme o halo de cada antibiótico.


1.A Resistente Resistente Sensível Sensível Interm.

Amostra 2.A

Resistente Resistente Interm. Sensível Sensível

Amostra 3.A

Interm. Resistente Interm. Interm. Sensível

Amostra 4.A

Interm. Interm. Interm. Interm. Interm.

Amostra 1.B

Sensível Interm. Interm. Sensível Sensível

Amostra 2.B

Interm. Resistente Interm. Sensível Resistente

Amostra 3.B

Sensível Resistente Resistente Interm. Interm.

Amostra 4.B

Sensível Resistente Sensível Sensível Interm.


1.A Resistente Resistente Sensível Sensível Interm.

Amostra 2.A

Resistente Interm. Interm. Sensível Sensível

Amostra 3.A

Interm. Resistente Interm. Interm. Sensível

Amostra 4.A

Interm. Interm. Interm. Resistente Interm.

Amostra 1.B

Sensível Resistente Interm. Sensível Sensível

Amostra 2.B

Resistente Resistente Interm. Sensível Interm.

Amostra 3.B

Interm. Resistente Resistente Interm. Interm.

Amostra 4.B

Sensível Interm. Sensível Sensível Interm.

Fonte: Autora do trabalho, 2018. É demonstrado nas figuras 4 e 5, a formação dos halos referente aos

antibióticos em cada amostra, no qual se pode perceber que dentro de alguns halos

há presença de pontos (brancos), podendo sugerir a formação de resistência das

bactérias ao antibiótico durante o procedimento por mutação.

36

Figura 4 – Teste de sensibilidade aos antimicrobianos em 24 horas


Figura 5 – Teste de sensibilidade aos antimicrobianos em 48 horas


Conforme Andrade et al., (2000), quando algum antibiótico é usado na

medicina veterinária para controle de mastite de forma incontrolada e inadequada

haverá uma maior resistência da bactéria a esses antibióticos, por tanto, quando

essa bactéria for encontrada no leite ou no produto em que esse leite seja usado

como matéria prima o tratamento com tal antibiótico será ineficaz, devendo dessa

maneira encontrar algum outro antimicrobiano que seja eficaz.

37

6 CONCLUSÃO Os queijos artesanais comercializados na cidade de Apucarana precisam de

melhor fiscalização das condições higiênica sanitária durante a produção, o

armazenamento e o transporte do produto, já que as amostras dos queijos

apresentaram maior contaminação comparada às amostras dos leites. Todas as

amostras de queijos apresentaram contagem de S. aureus acima do índice

determinado por lei, não estando de acordo com a RDC nº. 12, de 2 de janeiro de

2001 estabelecida pela ANVISA, levando risco a saúde do consumidor

As bactérias de S. aureus de todas as amostras foram classificadas como

intermediárias ou resistência há algum antibiótico, no qual o uso destes antibióticos

podem não oferecer efeito satisfatório no controle dessas bactérias. Dentre os

antibióticos analisados em teste in vitro apenas a tetraciclina teve maior eficiência.

38

7 REFERÊNCIAS

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