isolamento em cultivo celular - diagnóstico virológico

7/22/2019 Isolamento em cultivo celular - diagnóstico virológico

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ISOLAMENTO ECULTIVO CELULAR

Ayodhya Ramalho

Universidade Federal da ParaíbaCentro de Ciências Agrárias

Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal



HISTÓRICO DA CULTURA CELULAR

• Técnica desenvolvida para estudar o comportamento decélulas animais fora do organismo.

• 1907 – Harrison• Provar que fibras nervosas eram formadas a partir de células

• 1912 – Carrel• Células cardíacas• Descobriu a necessidade da troca da fonte de nutrientes

• 1951 – George Gey• HeLa

• 1962 – Nakamura et. al• VERO



SISTEMAS BIOLÓGICOS

ISOLAMENTO VIRAL

ANIMAIS

SUSCEPTÍVEIS

OVOSEMBRIONADOS

CULTIVOSCELULARES



SISTEMAS BIOLÓGICOS

VANTAGENS

• SENSIBILIDADE

• MÉTODO PADRÃO DEDIAGNÓSTICO

• DETECÇÃO DE VÍRUSDESCONHECIDO

• CONTROLE DASCONDIÇÕES AMBIENTAIS

DESVANTAGES

• LENTO

• CUSTO

• REALIZAÇÃO COMPLEXA

• NÃO APLICÁVEL A ALGUNS VÍRUS



AMOSTRA CLÍNICA - COLETA



AMOSTRA CLÍNICA – ACONDICIONAMENTO E TRANSPORTE

• Identificação• Recipientes estéreis• Refrigeração a 4°C (maiores períodos: -70° C ou gelo

seco)• Manter as amostras úmidas em meios apropriados

LABORATÓRIO



ANIMAIS SUSCEPTÍVEIS

• INÍCIO DO ISOLAMENTO VIRAL

• FINALIDADES:• AMPLIFICAÇÃO DO AGENTE;

• PRODUÇÃO DE VACINAS;

• CONHECER A FORMA CLÍNICA DA DOENÇA;

• TESTAR A SEGURANÇA DE VACINAS.

Início do século: bovinoseram inoculados com o vírus

da febre aftosa no epitélio

lingual.




• DESVANTAGENS:

• ALTO CUSTO DEMANUTENÇÃO;

• BAIXAREPRODUTIBILIDADE DAENFERMIDADE;

• IMUNIDADE PRÉVIA DOS ANIMAIS;

• USO DESNECESSÁRIO DE ANIMAIS É ANTIÉTICO




• CAMUNDONGOS

• PROVA BIOLÓGICA PARA

O DIAGNÓSTICO DARAIVA

• OCASIONALMENTE

UTILIZADOS PARADIAGNÓSTICO DO VÍRUSDA FEBRE AFTOSA




• VIA DE INOCULAÇÃO DEPENDE DO TIPO DE VÍRUSQUE SE PRETENDE ISOLAR




• EFEITOS DA REPLICAÇÃO VIRAL



OVOS EMBRIONADOSo INÍCIO DO SÉC. 20

o VÍRUS DA GRIPE E VARÍOLA

oGRANDE DIFUSÃO ANTESDO DESENVOLVIMENTODOS CULTIVOS CELULARES

oVÍRUS DA INFLUENZA A E AMAIORIA DOS VÍRUS

AVIÁRIOS



OVOS EMBRIONADOS

• EVIDÊNCIAS DO EFEITO:

• MORTE;

• POUCODESENVOLVIMENTO;

• FORMAÇÃO DE

VESICOPÚSTULAS NAMEMBRANACARIOALANTÓIDE



OVOS EMBRIONADOS

• EVIDÊNCIAS DO EFEITO

Vírus da laringotraqueíte de galinhasPoxvírus aviário em um flamingoVírus ectromelia - varíola murina



ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULAR

• 1948• Primeiro isolamento de

vírus em cultura (Weller &

Enders)

• 1990• Avanços nos métodos de

cultivo celular in vitro.




ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃOCOM FINS DIAGNÓSTICOS

OBTENÇÃO DE ESTOQUES VIRAISPARA CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICAE

MOLECULAR

USO EM TESTESSOROLÓGICOS

PRODUÇÃO DEESTOQUES VIRAIS PARAESTUDOS DA PATOGENIA

PRODUÇÃO DE ANTÍGENOS PARAIMUNIZAÇÃO DE ANIMAIS

PRODUÇÃO DEVACINAS



ISOLAMENTO EM CULTIVO CELULARESCOLHA DAS CÉLULAS UTILIZADAS

• VERO - células de rim de macaco verde;

• SK 6 - células de rim de suíno

• PK15 - células de rim de suíno

• MDBK – células de rim de bovino;

• MDCK – células de rim de cão;

• BHK – células de rim de Hamsters Baby.

• CRIB – células resistentes à infeccção comvírus da diarreia bovina

• CRFK – células do rim felino Crandell

• RK-13 - células do rim de coelho

• HeLa – células de tecido tumoral

ESCOLHA DO MELHOR TIPO CELULAR A SERUSADO DEPENDE DE:

• Especificidade viral;

• Linhagem celular;

• Número de passagem dentro dalinhagem.




Células HeLa




ESCOLHA DAS CÉLULAS UTILIZADAS

MDBK, SK-6, PK15, BT,CULTIVOS PRIMÁRIOS DE

PULMÃO, CORNETO NASAL,RIM E TESTÍCULO DE BOVINO B V

D V

B O

V I N O S

ADENOVÍRUS BOVINO, HERPESVÍRUS BOVINO TIPO 1 E 5,PARAINFLUENZA BOVINA, VÍRUS DA FEBRE AFTOSA . . .





BHK-21, VERO

O V I N O S

E C A P R I N O

S B T V

ECTIMA CONTAGIOSO, ARTRITE ENCEFALITE CAPRINA,PNEUMONIA PROGRESSIVA DOS OVINOS – MAEDI-VISNA . . .





ED, PBMC EQUINO,FIBROBLASTOS DA DERME

EQUINA

E Q U I N O S

E

I A V

ENCEFALOMIELITE EQUINA, INFLUENZA EQUINA, ARTRITEVIRAL EQUINA . . .





PK-15, SK6, MDBK,CULTIVOS PRIMÁRIOS

DE ORIGEM SUÍNA

S

U Í N O S

P R V

ADENOVÍRUS SUÍNO, PESTE SUÍNA CLÁSSICA, PARVOVÍRUSSUÍNO . . .





CV-1, BHK-21, VERO, HeLa ECULTIVOS DE

FIBROBLASTOS DE EMBRIÃO

DE GALINHAS

C A N I N O

S E F E L I N O S

B a b V

PARVOVÍRUS CANINO, CORONAVÍRUS CANINO, ROTAVÍRUSCANINO. . .





CULTIVOS PRIMÁRIOS DE RIMDE EMBRIÃO DE GALINHAS E

DE FIBROBLASTOS DE

GALINHAS E BHK-21

G A L I N H A S

E O U T R A S

A V E S

N D V

DOENÇA DE GUMBORO, VÍRUS DA DOENÇA DE MAREK,POXVÍRUS AVIÁRIO. . .




• RECIPIENTES




• MEIOS DE CULTIVO• BME – Basal de Eagle

• EMEM – Mínimo de Eagle

• MCDB – fibroblastos humanos

• SUPLEMENTAÇÃO• SORO FETAL BOVINO




CULTIVO PRIMÁRIO

ÓRGÃO FRESCO DE UM EMBRIÃOOU FETO

SUBMETIDO A UM PROCESSOMECÂNICO E ENZIMÁTICO

FRACIONAMENTO DO TECIDO EINDIVIDUALIZAÇÃO CELULAR

CULTIVO EM FRASCOS OU

GARRAFAS I N

C L U I R

S E M

P R E O C

O N T R O L E




CULTIVO PRIMÁRIO ADESÃO, MULTIPLICAÇÃO E

FORMAÇÃO DE UMA MONOCAMADA

Células aderentesCélulas não aderentes




CULTIVO PRIMÁRIO

CULTIVO EM MEIO NUTRITIVO +PROMOTORES DO CRESCIMENTO

(37°)

SUBCULTIVOS PERIÓDICOS

INDIVIDUALIZAÇÃO DA MONOCAMADA PELA AÇÃOENZIMÁTICA, RESSUSPENSÃO E SEMEADURA EM NOVOS

FRASCOS DE CULTIVO




CULTIVO PRIMÁRIO




CULTIVO PRIMÁRIO

SUBCULTIVOS

PASSAGENS




LINHAGENS CELULARES / LINHAGENS CONTÍNUASDERIVADAS DE CÉLULAS TUMORAIS OU TECIDOS NORMAIS

QUE SOFRERAM TRANSFORMAÇÃO IN VITRO

Pode ser mantido em cultura por um grande período de tempo (quandocomparado às células primárias)




INOCULAÇÃO

DEPOSIÇÃO DO MATERIALSUSPEITO SOBRE AS

MONOCAMADAS

INCUBAÇÃO

MONOCAMADA É LAVADA




REPOSIÇÃO DO MEIO DE CULTIVO

INCUBAÇÃO

OBSERVAÇÃO DIÁRIA DASMONOCAMADAS

AVALIAÇÃO DO EFEITO CITOPÁTICO(ECP)




• PRESERVAÇÃO

• Risco de contaminação

• Perda das características

• Alterações genéticas• Contaminação cruzada

• Alto custo

• CRIOPRESERVAÇÃO




• ECP

• A PRESENÇA DE ALGUNS VÍRUSPODE SER REVELADA PELAS

ALTERAÇÕES DEGENERATIVAS QUEELES INDUZEM NAS CÉLULASINFECTADAS

• HEMADSORÇÃO

• ALGUNS VÍRUS ALTERAM ASUPERFÍCIE DA CÉLULA INFECTADACONFERINDO-LHE AFINIDADE PARAHEMÁCIAS




• INTERFERÊNCIA VIRAL

• VÍRUS QUE NÃO INDUZEM ECP SÃO POSTOS EM EVIDÊNCIARECORRENDO À SUA CAPACIDADE DE INTERFERIR COM A

REPLICAÇÃO DE UM SEGUNDO VÍRUS (INDICADOR), QUEPOSSUI ECP CARACTERÍSTICO

• HEMAGLUTINAÇÃO

• VÍRUS QUE PRODUZEM PROTEÍNAS HEMAGLUTINANTESPODEM SER POSTOS EM EVIDÊNCIA ADICIONANDOSUSPENSÃO DE HEMÁCIAS




ECP

FORMAÇÃO DE CÉLULAS GIGANTES MULTINUCLEADAS(SINCÍCIOS)




ECP

ARREDONDAMENTO CELULAR

Adenovírus

(a) Células de camundongo não infectadas(b) As mesmas células 24h após infecção com o vírus

da estomatite vesicular – superposição




ECP

FORMAÇÃO DE CORPÚSCULOS DE INCLUSÃO




OUTROS ECP

LISE CELULAR

VACUOLIZAÇÃO CITOPLASMÁTICA

PICNOSE

VÍRUS NÃO-CITOPÁTICOS – CIRCOVÍRUS SUÍNO (PCV – 2)



INTRODUÇÃO

• Influenza / gripe aviária (Orthomyxovirus) diferentestipos de epitélios que expressam o receptor dehemaglutinina

• Transmissão

• Epitélio respiratório aviário estudos específicos sobrea função são escassos obtenção de culturasprimárias/ausência de linhas celulares específicas



INTRODUÇÃO

• Peru epitélio de revestimento da traqueia ou células datraqueia em cultura primária:

CILIADO, PODEM SER INFECTADOS POR VÍRUS E MONTARUMA RESPOSTA IMUNE

CÉLULAS DIFÍCEIS DE MANTER IN VITRO – PERDA DAS

CARACTERPISTICAS CELULARES



INTRODUÇÃO

• OBJETIVO

• PREPARAR E MANTER EM CULTURA CÉLULAS EPITELIAIS DOPARÊNQUIMA DO PULMÃO DE GALINHA E COMPARAR AS

SUAS PROPRIEDADES COM PNEUMÓCITOS TIPO II DOSMAMÍFEROS



MATERIAIS E MÉTODOS

VÍRUS

• INFLUENZA AVIÁRIA A DE PATOGENICIDADE

• ESTOQUES VIRAIS FORAM PREPARADOS EM OVOSEMBRIONADOS

H6N2H9N9H1N1H5N9



MATERIAIS E MÉTODOS

LINHAGENS CELULARES DE AVES

• FIBROBLASTOS DF1 DE EMBRIÕES E HEPATÓCITOS LMH

ISOLAMENTO DE CÉLULA EPITELIAL DE PULMÃO

• REMOÇÃO DOS PULMÕES 5-7 SEMANAS

• BRONQUIOS DESCARTADOS – PICADO EM PEDAÇOS• MANUTENÇÃO EM MEIO ADEQUADO

• UTILIZAÇÃO DA CÉLULAS ADERENTES



MATERIAIS E MÉTODOS1. COLORAÇÃO HISTOLÓGICAS

2. COLORAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

3. MICROSCOPIA ELETRÔNICA

4. TIPAGEM DE MHC – genótipo do locus

5. EXPRESSÃO DE COLECTINAS E RNAm TLR

6. CURVA DE CRESCIMENTO DO VÍRUS (produção)

7. QUANTIFICAÇÃO DE RNAsm DE CITOCINASCELULARES



RESULTADOS E DISCUSSÃO

• CLEC213

MICROSCOPIA DE LUZCOLORAÇÃO COM ANTICORPOS MONOCLONAIS DE RATO,ESPECÍFICOS PARA E-CADERINA E PAN-CITOQUERATINA




• Vacúoloscitoplasmáticos

• Vacúolos corados(corante periódico deSchiff) - conteúdopolissacarídico oumucopolissacarídico

• Atividade da FA




• Células cubóides

• Superfície celularirregular commicrovilosidades

• Células com estreitocontato e junçõesapertadas

• Corpos lamelares




• Fenotipagem do MHC• Passagens 30, 91 e 141 apresentaram resultados semelhantes

• As células epiteliais de mamífero podem expressar váriasTLRs que lhes permitem responder a diferentes tipos deagentes patogénicos.• Encontrados nas células epiteliais do pulmão de frango

• Detecção de genoma RNA viral ou intermediários da replicação

• Detecção da proteína não estrutural NS1 – antagonistada viral da resposta antiviral celular




• Presença da NS1 do vírus foi revelada pela técnica deimunofluorescência.




• H6N2 – Indução de citocinas• Expressão muito elevada do gene de IFN- α

• Expressão elevada do gene de IL-8

• Expressão do gene para o TGF - β4

• Expressão mais baixos para LITAF ( via TNF ) e os receptores dequimiocinas CCL5.

• A expressão de IL-1β e o gene CCL4 foi ligeiramente induzida pelainfecção viral

A resposta imune foi caracterizadapor uma elevação substancial a

expressão no gene de IFN O padrão de expressão de citocinasfoi em boa concordância com o queé observado no epitélio do pulmão

de mamíferos




• Ainda não se sabe se o epitélio respiratório das avesestão crucialmente envolvidos na iniciação da respostaimunológica como nos mamíferos.

• Expressão de genes que codificam colectinas para agalinha (CLL e CSPA) identificados como os análogosde proteínas surfactantes pulmonares.• Vacúolos cheios de polissacáridos uma atividade secretória do

CLEC213.



CONCLUSÕES

• Células epiteliais de pulmão infectados com o vírus dagripe deve ser capaz de participar ativamente na respostaimunitária.

• Conseguimos estabelecer uma nova linha de célulasepiteliais de pulmão de galinha.

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