isolamento pronto

7/31/2019 Isolamento Pronto

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SUMRIO

INTRODUO ......................................................................................... 3

2 MEIOS DE CULTURA .......................................................................... 8

3 ISOLAMENTO .................................................................................... 103.1 MTODOS CLSSICOS .............................................................. 11

3.1.1 TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS ........................ 113.1.2 TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO .......... 123.1.3 TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO ......... 123.1.4 TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE ............. 143.1.5 TCNICAS EM CULTIVO LQUIDO ...................................... 153.1.6 ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO ............................ 16

3.2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ESPECFICOS ............ 173.2.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS ................................................. 173.2.2 ISOLAMENTO DE BACTRIAS ............................................ 183.2.3 ISOLAMENTO DE ALGAS .................................................... 193.2.4 ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS .................................. 19

4 NOVOS METODOS ............................................................................ 224.1 BASE DOS MTODOS ................................................................ 22

4.1.1 PCR (REAO EM CADEIA DA POLIMERASE) .................. 234.1.2 MARCADORES MOLECULARES ......................................... 26

4.2 MTODOS BASEADOS NA HIBRIDIZAO .............................. 264.2.1 SOUTHERN BLOT ................................................................ 27


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4.2.2 NORTHERN BLOT ................................................................ 274.3 MICROARRANJO ........................................................................ 28

4.4 MTODOS BASEADOS EM MARCADORES DE DNA ............... 29

4.4.1 SSCP ..................................................................................... 294.4.2 DGGE/TGGE ......................................................................... 304.4.3 RFLP ..................................................................................... 314.4.4 VNTR ..................................................................................... 31

5 METAGENOMICA .............................................................................. 325.1 METAGENMICA X OUTRAS TCNICAS ................................. 335.2 A ESTRATGIA DA METAGENMICA ....................................... 355.3 VANTAGENS DESVANTAGENS ................................................. 36

REFERNCIAS ..................................................................................... 38ANEXOS ................................................................................................ 41

ANEXO 1 - Isolation, identification and physiological study of

Lactobacillus fermentumLPB for use as probiotic in chickens ..................... 41ANEXO 2 - Isolation and serological identification of enteropathogenic

Escherichia coliin pasteurized milk in Brazil ................................................. 47

ANEXO 3 - Isolation, properties and kinetics of growth of a

thermophilic Bacillus..................................................................................... 53


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INTRODUO

O crescimento acelerado da populao mundial acentua a preocupaoem relao produo e demanda de alimentos, novos medicamentos, fontes

alternativas de energia entre outras preocupaes com o bem estar das

pessoas, isso sem esquecer-se da conservao do meio ambiente. Neste

sentido, a Biotecnologia apresenta grande contribuio, j que permite o

desenvolvimento de novas e modernas tcnicas sem agredir tanto o meio

ambiente quanto as alternativas oriundas do petrleo, por exemplo. Nestas

tcnicas, a utilizao de microorganismos constante e serve aos mais

diversos fins, como na fixao de nitrognio, no controle biolgico de pragas,

na degradao de resduos no meio ambiente, nas fermentaes, no

desenvolvimento de novos medicamentos e tcnicas de diagnstico, entre

outros. Assim, a explorao dos recursos naturais, realizada com a aplicao

de tcnicas biotecnolgicas que utilizam microorganismos, permite a utilizao

de reas consideradas inicialmente inaproveitveis ou o melhoramento de de

tcnicas j conhecidas. Isto permite a reduo de custos, alm de contribuir

para um menor consumo energtico e para a preservao ambiental. As

vantagens apresentadas na aplicao de tcnicas biotecnolgicas que utilizam

microorganismos propiciaram o reconhecimento da importncia das colees

de culturas de microorganismos ou centros de cepas (que podem fornecer

microrganismos de caractersticas j conhecidas), bem como o aumento da

demanda desse material por parte de universidades, institutos de pesquisa e

empresas.


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Muitas vezes, porm, no se consegue o microrganismo ideal em um

banco de culturas. Para se fazer uso dos microrganismos, ento, deve-se

colet-los, isol-los, testar e medir a sua produo para ento utiliz-los em

larga escala (se for o caso). Um grande exemplo do uso de microrganismo est

na fermentao, j que ele constitui um dos quatro pilares de um processo

fermentativo, ou seja, sua seleo de extrema importncia, pois ele ditar

procedimentos e caractersticas que se seguiro at a obteno do produto

final.

Isolar um microrganismo consiste em obter culturas puras que envolvem

somente o organismo de interesse. Na fase do isolamento, ocorre a seleo de

uma colnia atravs da observao de certas caractersticas como a produo

de determinado produto ou mesmo da prpria morfologia da colnia.

Uma cultura livre de outros microrganismos contaminantes onde o

microrganismo de interesse est presente de forma homognea denominada

cultura axnica. Um cultivo desse tipo d oportunidade de investigao de

caractersticas fisiolgicas e genticas sem a interferncia de outros

microrganismos. Entretanto, muitas vezes um organismo apresenta

determinada atividade ou produo de determinado metablito justamente

devido s interaes com o meio em que est inserido. Isolado, esse

microrganismo pode apresentar a caracterstica investigada em menor

proporo ou mesmo no apresent-la.

O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o

microrganismo desejado, podendo variar desde solo at guas, ar, lodo,

alimentos ou rgos. Caractersticas que um determinado organismo possui


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para se desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores seletivos no

processo de isolamento.

O solo contm uma grande variedade de microrganismos (apenas 1g desolo apresenta de 1 a 10 milhes de espcies de microrganismos), incluindo

bactrias, fungos, protozorios, algas e vrus. Apesar desta diversidade, os

microrganismos cultivveis predominantes entre a microflora do solo so

fungos e bactrias heterotrficas do domnio Bacteria. preciso, contudo, levar

em considerao que a flora microbiana presente numa amostra de solo

depende de vrias caractersticas do solo particular em estudo (por exemplo,

umidade, pH, temperatura, contedo em oxignio gasoso e composio em

material orgnico e inorgnico); e que, alguns destes parmetros ambientais

podem variar, por exemplo, ao longo do ano ou em funo do tipo de utilizao

que dada ao solo (por exemplo, tipo de cultura agrcola, pastoreio, etc.).

Estima-se que somente 1 a 9% de microrganismos presentes no solo

so capazes de formar colnias em meios de cultura laboratoriais, como o

caso dos meios TSA ou PDA. Os outros 91 a 99% da flora bacteriana do solo

correspondem principalmente a clulas no cultivveis.

O isolamento, assim como todo o processo que ir se desenvolver

futuramente, deve ser o mais econmico possvel, levando-se em considerao

a produtividade que ser obtida pelo microrganismo e os gastos necessrios

para isolamento e manuteno do microrganismo em questo. Fatores

importantes na escolha de um microrganismo so: suas caractersticas

nutricionais, pois se almeja obter microrganismos que utilizem substratos

baratos; a temperatura tima, visando o menor gasto com aquecimento ou; a


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compatibilidade com o fermentador utilizado e com o processo de cultivo

desejado; e a estabilidade gentica. Pode ser mais barato comprar uma cultura

do que isol-la da natureza, mas tambm pode ser que se encontre um

organismo muito melhor depois de uma procura extensa no meio ambiente.

Entretanto, geralmente necessrio utilizar uma cepa dos bancos como uma

referncia para comparao com novos microrganismos descobertos atravs

do isolamento da natureza.

Em qualquer laboratrio de pesquisa ou de produo que envolva o uso

de microrganismos, todas as operaes tcnicas devem ser realizadas em

ambientes controlados quanto sua esterilidade. A no-observncia deste

requisito pode dar origem a contaminaes por bactrias e fungos, que

determinam o descarte do produto, impedindo o cumprimento dos

compromissos de produo assumidos e alterando a relao de custo prevista.

Medidas de precauo devem ser tomadas para evitar a contaminao do

ambiente onde so processados produtos da complexidade dos

imunobiolgicos. Especial ateno deve ser dispensada ao treinamento do

pessoal tcnico que trabalha nessas reas, quanto higiene pessoal e

utilizao correta de vestimentas prprias para atividades em reas

controladas, por constituir-se no principal veiculador de partculas viveis,

sejam esporos fngicos ou bactrias. Tambm importante que a amostra seja

identificada com o maior nmero de detalhes (data da coleta, parmetros do

ambiente como pH, temperatura, presso, salinidade, entre outros).


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A tabela 1 mostra o nmero de espcies de seres vivos atualmente

conhecidas e a estimativa das espcies existentes no mundo. Mais adiante

sero abordadas novas tecnologias baseadas na biologia molecular que

realmente contribuem na descoberta desses novos microrganismos, auxiliando

na explorao de toda a diversidade disponvel no planeta.

TABELA 1 - Nmero de espcies de seres vivos atualmente conhecidase estimativa de espcies existentes no mundo

FONTE: AZEVEDO, 1998.


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2 MEIOS DE CULTURA

Os microrganismos tal como outros organismos vivos necessitam deobter os nutrientes apropriados do seu meio ambiente. Para realizar o

isolamento de um microrganismo corretamente, portanto, imprescindvel o

uso de meio de cultivo adequado, levando em conta pH, aerao, presso

osmtica, entre outros fatores. O meio de cultura um material nutriente

preparado em laboratrio, lembrando sempre da correta assepsia, cuja

utilizao importante tanto para o crescimento quanto para transporte e

armazenamento de microrganismos.

Nos meios slidos (os que contem gar) o crescimento pra por

exausto de nutrientes, devendo realizar-se a transferncia de colnias para

novo meio. No entanto estes meios permitem a individualizao das colnias.

Os meios lquidos (sem gar) permitem melhor difuso de metablitos, mas

no o isolamento de colnias.

Os meios de cultivo podem ser:

Meios sintticos (quimicamente definidos): so aqueles em que a

composio qumica exata conhecida. So utilizados normalmente em

trabalhos experimentais em laboratrios ou para o crescimento de seres

autotrficos.

Meios complexos: so aqueles que apresentam algum componente

com composio varivel. Nesse caso esto includos extratos de leveduras,

de carne, de plantas ou produtos da digesto protica como peptonas. O meio

na forma lquida chamado de caldo nutriente; na forma slida, gar nutriente.


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A tabela 2 mostra alguns tipos de meio de cultivo existentes e em que

ocasies eles devem ser utilizados.

TABELA 2 Meios de cultura

Tipo FinalidadeQuimicamentedefinido

Crescimento de quimioautotrficos e autotrficos e anlisesmicrobiolgicas.

Complexo Crescimento da maioria dos organismos quimio-heterotrficos.

Redutor Crescimento de anaerbios obrigatrios.

Seletivo

Impedir o crescimento de microrganismos no desejados;favorecer o crescimento do organismo de interesse (meioscom telurito de potssio para isolamento de Corynebacteriumdiphtheriae, gar Salmonella-Shigella (SS) e garMacConkey, meios com sais biliares e verde brilhante paraisolamento seletivo de Salmonella)

Diferencial

Diferenciar colnias do organismo de interesse dos outrosmicrorganismos (meio de Teague ou Eosina Azul deMetileno diferencial para coliformes, gar MacConkey para adiferenciao de enterobactrias, gar sangue, agar Baird-

Parker para isolamento e diferenciao de cocos Grampositivos)

Enriquecimento

Semelhante ao seletivo, mas com a caracterstica importantede aumentar o nmero de bactrias de interesse tornando-adetectvel (Caldo Tetrationato e Selenito-Cistina para cultivode Salmonelas, Caldo Tioglicolato para Clostridiumperfringens.)

Fonte: Adaptado de TORTORA et al., 2006.

Alm desses, existem meios com funes menos conhecidas, como os

meios de triagem (para avaliar determinadas atividades metablicas permite

caracterizao e identificao presuntiva de muitos microrganismos), os meios

de identificao (para a realizao de provas bioqumicas e verificao de

funes fisiolgicas de organismos), os meios de dosagem (determinaes de

vitaminas, antibiticos e aminocidos), entre outros.


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Alm do que j foi citado existem, ainda, tcnicas de sucesso que

combinam a utilizao de diferentes meios para aumentar o numero de

isolados ou direcionar o isolamento para uma dada linhagem, por exemplo.

3 ISOLAMENTO

O isolamento inicia com a escolha da fonte mais provvel de conter o

microrganismo desejado. Caractersticas que um determinado organismo

possui para se desenvolver em certo ambiente so usadas como fatores

seletivos no processo de isolamento.

Depois de recolhida a amostra, a cultura pode necessitar ou no de um

pr-tratamento ou enriquecimento do meio sinttico onde a cultura ser feita. O

pr-tratamento uma etapa que facilita o isolamento do microrganismo e

poder ou no ser seguido de um enriquecimento. Ele aplicado em amostras

que no podem ser utilizadas de imediato. O enriquecimento geralmente

aplicado em amostras onde se sabe que o nmero de microrganismos de

interesse pequeno em comparao com o nmero dos outros que l se

encontram. Nesse caso, as condies de cultivo geralmente favorecem o

crescimento e multiplicao do microrganismo de interesse. Apenas depois

dessa(s) etapa(s) o isolamento, chamado de indireto, poder ser seguido,

fazendo-se a caracterizao do microrganismo.

Caso no haja necessidade de nenhum dos dois tratamentos, a

caracterizao do microrganismo poder ser realizada. Se for necessrio um


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pr-tratamento, este poder ou no ser seguido de um enriquecimento. Apenas

depois dessa etapa o isolamento, dito indireto, poder ser feito seguido da

caracterizao do microrganismo.

3.1 MTODOS CLSSICOS

3.1.1 TCNICA DE SEMEADURA POR ESTRIAS

Esse mtodo tambm chamado de esgotamento de ala. Atravs de

uma ala de platina, de um fio de platina ou at mesmo um swab, coleta-se

uma pequena parcela da colnia crescida no meio e espalha-se sobre uma

placa de Petri com gar fazendo movimentos em zigue-zague, formando um

caminho na forma de estrias. importante que a cada mudana de direo no

estriamento, uma parte da amostra anterior seja arrastada para o esgotamento,

para garantir que a cultura continue no procedimento e que se produza o efeito

de diluio. Numa nova seleo, devem ser escolhidas as culturas mais

diludas, que tm maior chance de estarem mais isoladas. A figura 1 ilustra a

direo das estrias na placa, bem como o efeito de diluio esperado, onde em

algumas regies observam-se colnias isoladas.


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FIGURA 1 Semeadura por estrias

FONTE: TORTORA, et al, 2006

3.1.2 TCNICA DE SEMEADURA POR ESPALHAMENTO

Essa tcnica (ilustrada pela figura 2) consiste em despejar um pequeno

volume da soluo de microrganismos ( em geral contendo de 30-300 clulas)

no centro de uma placa de Petri com gar j solidificado com o auxlio de uma

pipeta estril. Em seguida, utiliza-se de uma ala de Drigalski j flambada (de

modo a manter a esterilidade) para espalhar aquele volume depositado por

toda a superfcie do gar. As colnias crescem espalhadas por toda a

superfcie do Agar, por isso essa uma tcnica muito utilizada para purificao

de colnias.

3.1.3 TCNICA DE SEMEADURA POR DERRAMAMENTO

O mtodo de semeadura por derramamento, ou tambm conhecido por

pour plate muito utilizado para bactrias e fungos, principalmente para

contagem de micro-organismos cultivveis na amostra. A amostra original

diluda de forma a se otimizar a separao de colnias. Um pequeno volume da

melhor diluio (que deve ser previamente testada) ento derramado em uma


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placa de Petri sem gar. Em seguida, derrama-se gar fundido na temperatura

de 45C e mistura-se os dois com uma agitao leve da placa, deixa-se o meio

solidificar e incuba-se essa placa. As colnias se desenvolvero tanto acima

quanto abaixo da superfcie (colnias internas). Deve-se tomar cuidado com

microrganismos sensveis ao calor, pois eles certamente podem ser

danificados pelo gar fundido e podem ficar impossibilitados de formar

colnias.

A figura 2 ilustra um comparativo entre o mtodo do espalhamento e o

pour plate.


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FIGURA 2 Comparativo entre a tcnica de semeadura porespalhamento e o pour plate

FONTE: Black, 2002.

3.1.4 TCNICA DE SEMEADURA EM PROFUNDIDADE

Utilizando uma agulha de platina e semeia-se o material contido nela

picando um gar slido contido num tubo. Com isso haver o crescimento de

microrganismos em anaerbios no fundo e aerbios perto da superfcie do

gar. Alm disso, possvel observar caractersticas de mobilidade de

microrganismos. A figura 3 ilustra o processo.


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FIGURA 3 Tcnica de semeadura em profundidade

Fonte: Adaptado de DROVAL, LIMA e HABU, 2001

3.1.5 TCNICAS EM CULTIVO LQUIDO

Geralmente os meios lquidos proporcionam um grande aumento de

determinada populao microbiana. Tambm utilizado quando o

microrganismo inibido pelo meio slido ou no capaz de formar colnia, um

exemplo disso so algumas bactrias que no crescem em meio solido devido

a sua baixa atividade de gua. Para cultivos lquidos, utiliza-se a tcnica das

diluies sucessivas. Toma-se 1g ou 1ml da amostra e dilui-se em 9ml de,

geralmente, uma soluo salina 0,85%. Dessa diluio, toma-se novamente

1ml, que diludo novamente em 9ml de soluo, obtendo a diluio

correspondente a 10-2, e assim sucessivamente, como mostra a figura 4.

Espera-se que em certo momento se obtenha culturas provenientes de

somente uma nica clula. dessa forma que feita o isolamento e a

contagem de clulas de Escherichia coliem guas ou alimentos, por exemplo,

ou para algas, visto que seu habitat natural , em geral, aqutico. Toma-se

para isolamento, em geral, as trs ltimas diluies. A tcnica pode ainda ser

utilizada como prvia para isolamento em cultivo slido.


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FIGURA 4 Diluies sucessivas

FONTE: Adaptado de PRESCOTT, HARLEY e KLEIN, 2002.

3.1.6 ISOLAMENTO EM CULTIVO CONTNUO

Mtodos de isolamento dependendo da capacidade de desenvolvimento

de um microrganismo em determinado meio, sendo que para isso ele dever

produzir um nmero muito maior de clulas do que em relao aos outros.

Cultivo em meio de enriquecimento geralmente feito em Erlenmeyers.

No entanto, o crescimento de um determinado organismo oriundo de uma

amostra variada na forma de batelada pode resultar numa mudana dascondies do meio, e, portanto, ocorre uma variao nas presses seletivas.

Isso pode ser reajustado inoculando uma parcela desse meio de

enriquecimento em um novo meio idntico ao inicial. Aps um bom

desenvolvimento do microrganismo desejado, semeia-se uma alquota em meio

slido.


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A prevalncia do microrganismo desejado com relao aos outros

depender da taxa mxima de crescimento dele com relao aos outros

organismos capazes de tambm crescer no meio. Portanto, aquele capaz de

crescer mais rapidamente com os substratos disponveis ter um nmero maior

de clulas. Em um cultivo contnuo, a taxa de crescimento depende da taxa de

diluio e da concentrao do substrato limitante.

Essa tcnica bastante utilizada na seleo de microrganismos para a

produo de biomassa, mas tambm j foi usada para o isolamento de

bactrias produtoras de enzimas

3.2 ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS ESPECFICOS

3.2.1 ISOLAMENTO DE FUNGOS

Expor placas de Petri, contendo gar Sabouraud dextrose durante 15

minutos em diferentes locais. Cultivar temperatura ambiente. Aps 4 dias

realizar a contagem de colnias crescidas e iniciar a identificao das mesmas.

ISOLAMENTO DE FUNGOS DE LQUIDOS

Para o isolamento de fungos que utilizam a gua como via de disperso,

utiliza-se tcnicas de diluio comuns e semeadura em agar Sabouraud.Para o

isolamento de fungos aquticos, as tcnicas so especficas.

Semeia-se 1 ml da amostra do lquido em agar Sabouraud. Espalhar

com ala de platina e cultivar temperatura ambiente. Aps 4 dias realiza-se a

contagem de colnias crescidas e inicia-se a identificao das mesmas. Em


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alguns casos necessrio proceder diluio da gua e semear pela tcnica

de pour plate.

ISOLAMENTO DE DERMATFITOS DO SOLO (Mtodo deVanbreuseghen)

Esta tcnica permite-nos conhecer a biologia dos dermatfitos, seus

ciclos evolutivos e sua ocorrncia em determinada regio. Os dermatfitos tm

a capacidade de crescer em queratina e, devido a este fato, utilizamos plos e

outro material que a contenha como isca para "pescar o dermatfito.

Colocar uma quantidade de terra em placa de Petri estril. Espalhar os

plos sobre a superfcie da terra. Umedecer com gua estril. Fechar e

identificar a placa. Deixar temperatura ambiente, observando-a

periodicamente. Aps crescimento de miclio branco penugento ao redor dos

plos, examin-los entre lmina e lamnula com uma gota de lactofenol azul

algodo.

ISOLAMENTO DE FUNGOS DE SUBSTRATOS ALIMENTARES

Faz-se uma suspenso do substrato em gua destilada estril

(g/ml), uma diluio seriada e semeia-se pela tcnica pour plate em agar

batata acidificado. O material ser diludo adequadamente e a semeadura ser

realizada na superfcie do gar.

3.2.2 ISOLAMENTO DE BACTRIAS

Bactrias existem em grande variedade na natureza, e cada tipo

necessita de um meio de isolamento diferente. Algumas necessitam gar


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suplementado com extratos na concentrao de 10 a 50% do volume total,

outras necessitam de infuses feitas do material da onde foram coletadas (solo,

lama, folhas, pedras, troncos, detritos). Podem ser usados tambm alguns

meios seletivos como gar sangue, verde bile brilhante, MRS, ou McConkey

3.2.3 ISOLAMENTO DE ALGAS

Para isolar eficientemente algas, necessrio simular em parte o

ambiente onde a amostra foi coletada, como pH, temperatura, salinidade,luminosidade. Mtodos de diluio so bastante indicados nesse caso, uma

vez que algas e microalgas so normalmente encontradas em meio lquido. A

filtragem de amostras e posterior inoculao do filtro em novo meio estril

tambm um mtodo utilizado.

3.2.4 ISOLAMENTO DE ACTINOMICETOS

Actinomicetos so bactrias filamentosas que fazem parte da maioria

dos substratos naturais. No difcil isolar actinomicetos de amostras que

tambm contm fungos devido s suas propriedades fisiolgicas distintas. O

uso de antibiticos e antifngicos tambm auxilia no isolamento, como mostra a

tabela 3.


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Tabela 3 - Antibiticos usados e microrganismos alvo que so inibidos

Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.

Os actinomicetos geralmente crescem lentamente, e demoram de 4 a 20

dias para formarem colnias definidas quando incubadas temperatura de 65-

80C . O crescimento desses microrganismos tambm favorecido quando h

no meio de cultivo algum dos componentes listados na tabela 4:


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Tabela 4 - Substncias que estimulam o desenvolvimento deactinomicetos em geral e actinomicetos produtores de antibiticos

Fonte: STANBURY, WHITAKER and HALL, 1995.

Pela tabela 5 percebe-se que a quantidade de actinomicetos obtidos

variando a fonte de carbono e nitrognio e o tipo de meio utilizado.


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Tabela 5 - Comparao de meio AGS com meio de chitin e efeito dasfontes de carbono e nitrognio no meio*

Fonte: EL-NAKEEB and LECHEVALIER, 1963.

4 NOVOS METODOS

4.1 BASE DOS MTODOS

Para a realizao dos mtodos novos de isolamento existem duas

ferramentas principais, a PCR e os marcadores moleculares. Ambos sero

explicados a seguir.


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4.1.1 PCR (REAO EM CADEIA DA POLIMERASE)

A reao em cadeia da polimerase (em ingls, Polymerase Chain

Reaction - PCR) um mtodo utilizado para amplificao(criao de mltiplas

cpias) rpida de segmentos-alvo especficos de DNA ou cDNA sem o uso de

um organismo vivo, a cpia ocorre in vitro. Os produtos de uma PCR sao

chamados amplicons.

Para a execuo da tcnica da PCR preciso que se tenha

conhecimento prvio da sequncia do cido nuclico que se deseja amplificar,

dita sequncia alvo. A partir disto, desenham-se dois iniciadores (primers)

para dar partida ao processo de sntese em um local especfico.Um primer

serve para sintetizar a sequncia alvo no sentido 3 - 5e outro para o sentido

inverso isto , 5-3. O primer uma pequena sequncia de nucleotdeos que

hibridiza no incio da sequncia alvo que se quer amplificar e da qual ele

complementar. Ao reconhecer o primer, a polimerase sintetiza uma cpia

complementar, obedecendo informao contida na sequncia de DNA que

ser replicada (sintetizada). A PCR precisa ainda de deoxinucleosdeos

trifosfatados (dATP; dTTP; dGTP; dCTP) que so quatro componente qumicos

diferentes que atuam como se fossem tijolos na construo da molcula de

DNA.

O primeiro passo para a realizao de um PCR a coleta da amostra

biolgica. O segundo passo consiste em extrair o DNA a partir do material coletado.

Esta extrao segue um critrio de metodologia bsico, que varia dependendo da

amostra utilizada.


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O terceiro passo consiste em preparar a mistura de reao. A mistura de

reao contm as substncias necessrias para fazer novas cpias de DNA no

processo da PCR. Ento, dentro de um tubo so colocados: a soluo tampo (para

manter a mistura de reao no pH e condies inicas ideais para a reao), os

deoxinucleotdeos j mencionados, os primers, a Taq Polimerase e o DNA

extrado da amostra.

O quarto e ultimo passo consiste na reao em si que feita em uma

mquina especial, chamada de termociclador, que aquece e resfria o tubo em

vrios ciclos consecutivos para amplificar o DNA.

A reao no termociclador ocorre em trs etapas que se repetem em ciclo:

Desnaturao do DNA alvo pelo calor (1 minuto a 94-96C), para separar as

duas cadeias

Associao dos iniciadores por ligaes de hidrognio ao DNA alvo em

cadeia simples (temperaturas entre 50 e 65C, durante 1 minuto; a

temperatura a usar depende da % GC da sequncia a amplificar)

Extenso dos iniciadores atravs da sntese da cadeia complementar de

cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (1 minuto a 72C)

O processo pode ser repetido vrias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possvel

aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentrao de DNA pr-existente (figura

5).


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FIGURA 5 Esquema da PCR.

FONTE: site e-escola, 2011.

A PCR encontra sua principal aplicao em situaes onde a quantidade de

DNA disponvel reduzida. Em teoria, possvel amplificar qualquer DNA. Uma das

principais aplicaes da PCR na medicina forense, onde pequenas amostras de

DNA retiradas da cena de um crime (pedaos de cabelo, gotas de sangue ou saliva,

pedaos de plo ou at mesmo a minscula quantidade de DNA deixada em uma

impresso digital) so amplificadas para serem analisadas pelo mtodo de

fingerprinting. A PCR tambm rotineiramente utilizado em procedimentos

cientficos de biologia molecular como amplificao para gerar mutagnese,

deteco de mutaes ou preparao de fragmentos de DNA para clonagem

(insero em plasmdeo, por exemplo) como tambm pode ser utilizado para

identificao de patgenos que esto presentes em amostras como por a exemplo

identificao de agentes como Cndida sp, Chlamydia trachomatis, HPV Vrus do


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papiloma humano e seus gentipos, HBV Vrus da Hepatite B, etc Alm disso, ela

tambm utilizada na paleontologia para o sequenciamento gnico de animais pr-

histricos.

4.1.2 MARCADORES MOLECULARES

Os marcadores moleculares constituem regies do genoma possveis de

serem detectadas e cuja presena ou ausncia pode caracterizar um organismo

cuja seqncia e funo, na maioria das vezes, so desconhecidas (Gostimsky et

al., 1999).

4.2 MTODOS BASEADOS NA HIBRIDIZAO

A hibridao in situ um mtodo que permite identificar o locus

cromossmico onde se localiza uma determinada sequncia de DNA

previamente clonada. Este mtodo tem como princpio a complementaridade

das bases que reage a organizao de DNA.

O DNA de um esfregao metafsico e o DNA de uma sonda so

transformados em sequncias monocatenares atravs da desnaturao e

posteriormente so postos em contacto em condies de hibridao. Assim a

sonda vai hibridar com a sequncia cromossmica onde se localizam as bases

complementares. Visto que a sonda previamente marcada (com um

fluorocromo), o local de ligao torna-se visvel o que permite identificar

especificamente o local do cromossoma onde se localiza o gene ou a

sequncia no codificadora em causa.


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A realizao desta tcnica pode ser feita usando uma nica sonda ou

at mesmo vrias sondas, cada uma marcada com um fluorocromo diferente.

Esta ltima tcnica chama-se FISH multiplex.

Os padres de bandas de um cromossoma so diversos e depende da

tcnica usada e do corante.

4.2.1 SOUTHERN BLOT

O Southern blot uma tcnica que permite obter informao sobre a

massa molecular e a quantidade relativa de uma determinada sequncia de

DNA. A tcnica uma combinao de electroforese em gel do DNA (este

frequentemente fragmentado por enzimas de restrio antes de fazer o

Southern), transferncia deste para uma membrana e hibridizao com uma

sonda marcada (radioactiva ou fluorescente). Aps a hibridizao, a membrana

lavada para remover sonda no ligada a DNA e obtm-se uma imagem

atravs de autoradiografia ou autofluorescncia. A imagem obtida d a

localizao do DNA que liga a sonda, com a intensidade do sinal dando uma

medida relativa da quantidade de DNA que hibridiza.

4.2.2 NORTHERN BLOT

O Northern blot estuda o perfil de expresso de RNA mensageiro, onde,

quando e quanto de determinado RNA mensageiro (correspondente

expresso de um determinado gene) est presente numa dada amostra. uma

das formas mais simples de determinar em que momento certos genes esto a

ser expressos em sistemas vivos. Neste processo, o RNA separado numa


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electroforese em gel, transferido para uma membrana e detectado de forma

similar ao DNA no Southern blot.

4.3 MICROARRANJO

Microarranjo, uma tcnica experimental da Biologia Molecular que

busca medir os nveis de expresso de transcritos em larga escala, ou seja,

medindo muitos (em alguns casos todos os) transcritos simultaneamente.

Um DNA microarray, ou DNA-chip, consiste num arranjo pr-definido de

molculas de DNA (fragmentos de DNA genmico, cDNAs ou

oligonucleotdeos) quimicamente ligadas uma superfcie slida, usualmente

lminas de microscpio revestidas com compostos que conferem carga

positiva. Os microarrays tambm podem ser preparados em membranas de

nylonpositivamente carregadas.

Os microarrays so utilizados na deteco e quantificao de cidos

nucleicos (RNAm na forma de cDNA ou DNA genmico) provenientes de

amostras biolgicas, as quais so postas para hibridar com o DNA fixado no

array (hibridao por complementariedade de bases). A deteco possvel

pois as amostras so "marcadas" com fluorocromos cianina 3 (Cy3) ou cianina

5 (Cy5) quando utiliza-se microarraysem vidro ou com o istopo 33-P quando

os arraysso preparados em membranas de nylon.

Para ambos os casos se faz necessrio a gerao de uma imagem de

hibridao, que obtida por meio de leitores (scanners) a laser (para os

fluorocromos) ou leitores de fsforo (para o istopo 33-P). O uso mais

freqente dos microarrays na determinao da expresso gnica (perfil do


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transcriptoma). A alta performance desta tcnica que pode-se determinar a

expresso diferencial de milhares de genes num nico experimento, mas o seu

alto custo faz com que ela nao seja, pelo menos ainda, uma tecnica muito

utilizada.

4.4 MTODOS BASEADOS EM MARCADORES DE DNA

A seguir sero descritos alguns mtodos que utilizam marcadores de

DNA como base.

4.4.1 SSCP

A SSCP, ou tcnica do polimorfismo de conformao da fita simples do

DNA, baseia-se no potencial de formao de estruturas secundrias da fita

simples do DNA que era obtido inicialmente, por meio de desnaturao do

produto de amplificao antes do incio da eletroforese.

Este mtodo utiliza um iniciador contendo o terminal 5 marcado

(fosforilado) e durante o PCR, esse iniciador incorporado uma das fitas do

DNA, que ao ser submetido a um tratamento como uma exonuclease que

reconhece o iniciador fosforilado, a fita marcada digerida preferencialmente.

A migrao da fita simples em um gel de poliacrilamida dependente da

conformao que ela assume de acordo com sua seqncia de bases durante

a eletroforese. Os produtos de amplificao de interesse para a anlise da

comunidade microbiana podem ser posteriormente clonados e sequenciados.


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4.4.2 DGGE/TGGE

As tcnicas baseadas na eletroforese com gis desnaturantes, como o

DGGE (eletroforese em gel com gradiente desnaturante) e TGGE (eletroforese

em gel com gradiente de temperatura) esto sendo amplamente utilizadas nos

estudos de ecologia microbiana.

So tcnicas utilizadas para separar fragmentos de DNA de mesmo

tamanho mas com seqncia de nucleotdeos diferentes. Primeiro feita a

amplificao do DNA atravs de PCR, onde um dos iniciadores apresenta uma

regio rica em G+C (grampo G-C, para impedir a total desnaturao da dupla

fita do DNA durante a eletroforese). Os fragmentos obtidos por PCR, de

mesmo tamanho, so ento separados de acordo com a sua composio

nucleotdica, atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida contendo

gradiente desnaturante (uria e formamida) que rompe as pontes de hidrognio

entre os nucleotdeos, no caso da DGGE. A seqncia de nucleotdeos

determina o momento em que o DNA, inicialmente em fita dupla, passar a

adquirir uma estrutura de fita simples, onde as duas fitas simples se mantm

ligadas pelo grampo. Nesta condio, a velocidade de migrao no gel

extremamente reduzida, ocorrendo a separao de outros fragmentos que

apresentam composio nucleotdica diferente. Para a TGGE, ao invs do

gradiente qumico desnaturante, utilizada uma cuba especial que promove

um gradiente de temperatura.


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4.4.3 RFLP

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) uma tcnica em que

os organismos podem ser diferenciados pela anlise de padres derivados da

clivagem do seu DNA. Se dois organismos diferirem na distncia entre os stios

de clivagem de uma endonuclease de restrio, o comprimento dos fragmentos

produzidos vai diferir quando o DNA for digerido com uma enzima de restrio.

Para a deteco de RFLPs, pode ser usada a me todologia de

Shouthern Blottin. Aps restrio enzimtica os fragmentos de DNA genmico

so sujeitos a electroforese em gel e posteriormente transferidos para um

suporte slido de nitrocelulose atravs do arrastamento por capilaridade. Aps

hibridizao com sondas radioativas este processo possibilita a identificao,

entre milhares de fragmentos de restrio obtidos, de sequncias bem

determinadas.

4.4.4 VNTR

O VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) uma metodologia que

se baseia na existncia de uma sequncia repetitiva especfica ativa em

diferentes indivduos de uma populao.

Uma repetio em srie (tandem repeat) uma sequncia curta do

DNA que repetido na forma de head-to-tail num locus cromossmico

especfico. As repeties em srie esto presentes ao longo de todo o genoma

humano; sendo que algumas sequncias so encontradas em somente um

local (denominado VNTRs) e o nmero de unidades repetidas varia entre


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indivduos. Um VNTR nos seres humanos, por exemplo, uma sequncia de

17 pb do DNA repetida entre 70 e 450 vezes no genoma.

5 METAGENOMICA

Denominada tambm de Genmica Ambiental, Ecogenmica ou

Genmica de Comunidades; o termo "metagenmica" foi usado pela primeira

vez por Jo Handelsman (University of Wisconsin) em 1998. Metagenoma o

nome dado ao genoma coletivo da microbiota total encontrada em um

determinado hbitat. Enquanto a metagenmica, em si, a anlise genmica

da comunidade de microrganismos de um determinado ambiente por tcnicas

independentes de cultivo. Essa abordagem consiste na extrao de DNA

diretamente do ambiente e construo de uma biblioteca metagenmica com

este genoma misto. Essa estratgia permite o acesso a genes de bactrias

incultivveis. Atravs de tcnicas de cultivo puro, como as apresentadas

anteriormente, os microrganismos podem ser estudados individualmente.

Entretanto essa abordagem limita a avaliao taxonmica, filogentica e a

estimativa da diversidade microbiana da biosfera, pois apenas cerca de 1% dos

microrganismos so cultivveis em laboratrio pelas tcnicas clssicas de

cultivo.


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5.1 METAGENMICA X OUTRAS TCNICAS

Tantos os mtodos clssicos quanto a metagenmica partem da coleta

da amostra do ambiente. Mas, enquanto a metodologia clssica primeiro cultiva

o microorganismo para obter uma cultura pura para depois isolar o DNA, a

metagenmica inicia diretamente com esse isolamento. Isso faz com que, a

principio, ela esteja apta a isolar 100% da fonte gentica em um ambiente.

A figura 6 apresenta em fluxograma das estratgias para deteco,

monitoramento e caracterizao da diversidade em amostras ambientais,

considerando tanto as tcnicas clssicas quanto as novas.


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FIGURA 6 Estratgias para monitoramento e caracterizao dadiversidade em amostras ambientais.

FONTE: PALMIERI, D. A.

Comparando a figura anterior com a figura 7, que mostra as estratgias

da metagenmica, percebe-se a simplicidade de sua essncia. claro, sem

esquecer a complexidade de cada etapa.


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FIGURA 7 Etapas da metagenmica.

FONTE: SESHADRI, R, 2007

5.2 A ESTRATGIA DA METAGENMICA

A metagenmica se d basicamente por trs etapas:

1. Clonagem: consiste no isolamento e propagao de molculas de

DNA idnticas. O sistema de clonagem molecular se d a partir da estruturao

de um DNA recombinante, que se replicam quando colocado em uma clula


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bacteriana. Na bactria, alm do DNA, existe tambm o plasmdeo, que uma

molcula de DNA circular encontrada em bactrias que podem ser utilizadas

para levar DNA de um organismo para outro de uma espcie diferente.

O plasmdeo retirado da bactria e cortado pela enzima de restrio.

Depois, um fragmento do plasmdeo, se une ao outro fragmento de DNA de um

organismo diferente, que fica sujeito a outra ao de tal enzima de restrio, a

enzima DNA-ligase est comprometida neste processo. Ao final deste

processo, resulta-se um plasmdeo com o nome de vetor, que inserido na

clula bacteriana para se replicar.

2. Seqenciamento: usado para obter informaes importantes sobre a

identificao gentica, variaes e funes gnicas. Feito em equipamentos

especiais para isso. Esses equipamentos vem sendo cada vez mais

modernizados como o caso do Genome Sequencer FLX System de 2010,

que oferece mais de um milho de leituras por corrida e leituras de 400 pares

de bases, adequado para seqenciamento de genomas completos,

caracterizao metagenmica de sistemas complexos e mais.

3. Bioinformtica: aps o seqenciamento preciso ter uma ferramenta

para analisar as sequncias obtidas, a bioinformtica apresenta softwares que

auxiliam nessas analises, principalmente com a existncia das bibliotecas

genmicas.

5.3 VANTAGENS DESVANTAGENS

O maior problema da tcnica o fato de se ter que lidar com um numero

desconhecido de organismos. Nas outras tcnicas o pesquisador tem que se


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preocupar apenas com um organismo, isso facilita para que ele possa manter o

controle de seu experimento.

A tabela 6 mostra uma comparao entre as vantagens e desvantagensda metagenmica.

TABELA 6 Vantagens e desvantagens da metagenmica.

FONTE: Daniel, 2005


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ANEXOS

ANEXO 1 - Isolation, identification and physiological study of

Lactobacillus fermentum

LPB for use as probiotic in chickens


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ANEXO 2 - Isolation and serological identification of

enteropathogenic Escherichia coliin pasteurized milk in Brazil


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ANEXO 3 - Isolation, properties and kinetics of growth of a

thermophilic Bacillus


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isolamento pronto

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