isolamento e identificaÇÃo de princÍpios ativos de
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DANIELA ENILDA BUFFON
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE PRINCÍPIOS ATIVOS DE
CALOPHYLLUM BRASILIENSE Camb. (CLUSIACEAE)
ITAJAÍ - 2005
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UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
DANIELA ENILDA BUFFON
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE PRINCÍPIOS ATIVOS DE
CALOPHYLLUM BRASILIENSE Camb. (CLUSIACEAE)
Dissertação submetida à Universidade do Vale do Itajaí como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Valdir Cechinel Filho
Itajaí, dezembro 2005.
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho àqueles que estiveram sempre ao meu lado, mesmo que distantes, em especial aos meus pais Danilo Buffon e Enilda Buffon e demais familiares, pelo carinho, compreensão e apoio dedicados.
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AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Professor Cechinel por ter confiado em mim e me dado a honra de trabalhar ao seu lado. A Vânia Floriani e a Gisele Filipi por toda a ajuda na parte experimental. Aos professores do Programa de Pós Graduação de Ciências Farmacêuticas que sempre estiveram dispostos a tirar as dúvidas. A professora Tânia B. Bresolin, coordenadora do Programa de Pós-Graduação e a secretária Rosélia, sempre muito atenciosos. A comissão interna, Rivaldo Niero e Ângela Malheiros pelas sugestões. A banca examinadora, professoras Tomoe Nakashima e Ângela Malheiros por ter aceitado o convite e pelas valiosas sugestões. Ao meu amigo Justus, por ter me despertado o interesse pela pós-graduação. A Suzi, Enilda e Danilo pelo apoio e a todos aqueles que direta ou indiretamente colaboraram para a realização deste trabalho.
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“Ninguém é tão pequeno que não tenha o que ensinar, nem tão grande que não tenha mais o que aprender”.
M. Porteira
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Resumo da Dissertação apresentada à UNIVALI como parte dos requisitos necessários para a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE PRINCÍPIOS ATIVOS DE CALOPHYLLUM BRASILIENSE Camb.
(CLUSIACEAE)
Daniela Enilda Buffon Isaias Agosto/2004
Orientador: Dr. Valdir Cechinel Filho. Área de Concentração: Produtos Naturais e Análogos Sintéticos Bioativos. Palavras-chave:Calophyllum brasiliense, analgesia, princípios bioativos Número de Páginas: 74 O gênero Calophyllum é composto por um grande grupo de árvores tropicais e ricas em substâncias bioativas, sendo muito usadas na medicina popular. A Calophyllum brasiliense, comumente chamada de “Guanandi”, é frequentemente usada para tratar processos dolorosos, inflamações e úlceras. O presente trabalho objetiva isolar e identificar os compostos bioativos das diferentes partes da C. brasiliense. Foram obtidos os extratos metanólicos das diferentes partes da planta (raízes, flores e frutos), os quais foram particionados com clorofórmio para obtenção das frações apolar e polar. Os resultados famacológicos indicam que o extrato metanólico bruto das raízes exibe uma atividade antinociceptiva mais pronunciada na dose de 10mg/Kg i.p., inibindo cerca de 80% as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. Da mesma forma o extrato metanólico bruto das flores e dos frutos mostraram uma considerável atividade antinociceptiva. Pela análise fitoquímica por CCD de todas as partes, usando compostos padrão isolados das folhas observou-se nos frutos os ácidos gálico e protocatético em grandes concentrações e quercetina, amentoflavona e epicatequina não foram detectadas. Nas flores, apenas o ácido protocatético e epicatequina foram detectadas. Entretanto as raízes mostraram uma diferente composição química quando comparadas com as outras partes, e compostos fenólicos foram detectados. Outras classes de compostos como terpenos e xantonas foram encontrados. No teste da formalina ambos extratos clorofórmico e metanólico das raízes inibiram apenas a segunda fase da dor (inflamatória) em cerca de 87% e 76% respectivamente. Da fração clorofórmica das raízes foi isolado dois triterpenos conhecidos, friedelina e ácido betulínico, e uma xantona, identificada como 1,5-dihidroxixantona. Da fração acetato de etila das folhas obteve-se a (-)-epcatequina. Todos compostos foram identificados através de técnicas espectroscópicas e comparação com a literatura ou padrões autênticos. A friedelina e a xantona foram mais potentes do que alguns fármacos usados na clínica.
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Abstract of Dissertation presented to UNIVALI as a partial fulfillment of the requirements for the degree of Master in Farmaceutical Science.
ISOLATION AND IDENTIFICATION OF ACTIVE PRINCIPLES FROM CALOPHYLLUM BRASILIENSE
(CLUSIACEAE).
Daniela Enilda Buffon Isaias Agosto/2004
Advisor: Dr. Valdir Cechinel Filho Area of Concentration: Bioactive Natural and Synthetic Products. Keywords: Calophyllum brasiliense, analgesia, bioactive principles Number of Pages: 74 The genus Calophyllum is a large group of tropical trees and frequently employed in folk medicine for the treatment of several ailments. Calophyllum brasiliense, commonly known in Brazil as Guanandi or Guarandi, is widely used as a remedy for the treatment of inflammation and ulcers. The present study deals to the isolation and identification of bioactive compounds from different parts of this plant. The methanolic extracts of the different parts of the C. brasiliense (root, flowers and fruits), were partitioned with chloroform giving the fractions denominated non polar (non soluble in chloroform). The pharmacological results indicate that the crude mehtanolic extract of the roots exhibits the best antinociceptive activity against the writhing test in the dose of 10mg/Kg i.p., causing inhibition about 80%. Phytochemmical analysis for TLC of all the parts, using previously isolated compounds form leaves permitted the detection of gallic acid and protocatechuic acid in high concentrations in the fruits, and the absence of quercetin, amentoflavone and epicatequina. In the flowers, only the protocatechui acid and epicatechin were detected. However, the roots showed a different chemical composition when compared with the other parts, being detected several phenolic compounds. The methanolic and chloroform extracts inhibited the second phase of the formalin test (76% and 87% respectively). From the chloroformic fraction were isolated two known triterpenos, friedelin and betulinic acid, and a xantone, identified as 1,5-dihidroxixantone, which identified on basis of spectral analysis and comparision with authentic samples. Friedelin and 1,5-dihidroxixantone were more potent than some clinically used drugs against writhing test in mice.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 01- Folhas e frutos de C. brasiliense 06 Figura 02- Fluxograma das atividades realizadas com as raízes 29 Figura 03- Fluxograma dos procedimentos cromatográficos realizados com os frutos de C. brasiliense 31 Figura 04- Fluxograma dos procedimentos cromatográficos da folha de C. brasiliense 32 Figura 05- Espectro de RMN 1 H da 1,5-dihiddroxixantona 40 Figura 06- Efeito antinociceptivo do extrato metanólico bruto das flores 46 Figura 07- Efeito antinociceptivo do extrato e frações dos frutos 47 Figura 08- Efeito antinociceptivo das raízes (extrato bruto, fração polar e apolar) 48 Figura 09- Efeito antinociceptivo da fração polar das raízes nas concentrações de 3, 1, e 0,5mg/Kg, 49 Figura 10- Efeito antinociceptivo da fração polar das raízes nas concentrações de 6 e 3mg/Kg 49 Figura 11- Efeito antinociceptivo da epicatequina 50 Figura 12- Efeito antinociceptivo da friedelina. 51 Figura 13 - Efeito antinociceptivo da 1,5-dihidroxixantona. 51 Figura 14 - Efeito antinociceptivo do extrato metanólico bruto e frações apolares e
Polares das raízes no teste da formalina 53
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LISTA DE TABELAS
Tabela 01- . Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN13C/DEPT para o composto A e dados da literatura para friedelina 38 Tabela 02- Comparação da inibição da ação nociceptiva ou DI50 em relação aos medicamentos aspirina e acetaminofeno 52 Tabela 03- Atividade antinociceptiva do extrato metanólico bruto, fração apolar, ácido acetil salicílico (aspirina) e indometacina no modelo de dor induzida pela formalina via i.p. na dose de 10 mg/Kg 53 Tabela 04 - Atividade antibacteriana para os extratos das diferentes
partes da C. brasiliense 54
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LISTA DE ABEVIATURAS CC – Cromatografia de coluna aberta CCD – Cromatografia de camada delgada CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência CDCC – Cromatografia dupla contra corrente CG – Cromatografia gasosa UV – Ultra violeta IV – Infra vermelho RMN – 1H – Ressonância magnética nuclear de próton RMN – 13C – Ressonância magnética nuclear de carbono EM – Espectrometria de massa PAF – Fator de ativação plaquetária FDCM – Fração diclorometano CIM – Concentração inibitória mínima RPM – Rotações por minuto DMSO – Dimetil sulfóxido EPM – Erro padrão da média I.M. – Inibição máxima DI50 – Dose que inibe 50%
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ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo A – Cópia da “Proof” de artigo aceito para publicação no periódico Die Pharmazie 64 Anexo B – Cópia da “Proof” de artigo aceito para publicação no periódico Naturforsch 68
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SUMÁRIO 1.0- INTRODUÇÃO 01 1.1- Plantas medicinais: estudos fitoquímicos e biológicos 03 2.0- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 05 2.1- Aspectos botânicos do gênero Calophyllum 05 2.1.1- Aspectos químicos e biológicos da C. brasiliense 05 2.2.- C. papuanum 11 2.3- C. fragrans. 12 2.4- C. inophyllum 12 2.5- C. Díspar 16 2.6- C. Thwaitesii 18 2.7- C. gracilipes 19 2.8- C. moonii 20 2.9- C. cordato-oblongum 21 2.10- C. panciflorum 22 2.11-C. caledonicum 23 2.12-C. mucigerim 25 3.0- OBJETIVOS 26 3.1- Objetivos Gerais 26 3.2- Objetivos Específicos 26 4.0- METODOLOGIA 27 4.1- Materiais e Métodos 27 4.2- Material vegetal 27 4.2.1- Raízes de C. brasiliense 28
a) Análise fitoquímica da fração polar 28 b) a) Análise fitoquímica da fração apolar 29
4.2.2- Frutos da C. brasiliense 30 a) Análise fitoquímica da fração polar 30 b) Análise fitoquímica da fração apolar 30
4.2.3- Folhas da C. brasiliense 31 a) Análise fitoquímica da fração polar 31
4.2.4- Flores da C. brasiliense 33 4.3- Atividade biológica. 34 4.3.1- Atividade antinociceptiva de extratos, frações e compostos puros obtidos da C. brasiliense 34
a) Modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 34 b) Modelo da dor induzida pela formalina 34
4.3.2- Análise estatística 35 4.3.3- Atividade antimicrobiana 35 5.0- RESULTADOS E DISCUSSÃO 36 5.1- Investigação fitoquímica 36 5.1.1- Raízes de C. brasiliense 36 5.1.2- Frutos da C. brasiliense 42 5.1.3- Folhas de C. brasiliense 43 5.1.4- Flores de C. brasiliense 44 5.2- Atividade biológica de extratos e frações de C. brasiliense 46 5.2.1- Atividade antinociceptiva 46
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5.2.2- Atividade antimicrobiana 54 6.0- CONCLUSÕES 56 7.0- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 58
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1.0 INTRODUÇÃO
O uso de produtos naturais com propriedades terapêuticas é tão antigo quanto a
civilização humana e, por um longo tempo, produtos minerais, plantas e animais foram as
principais fontes de medicamentos. A Revolução Industrial e o desenvolvimento da química
orgânica propiciaram o uso intenso de produtos sintéticos para fins terapêuticos, devido estes
serem obtidos por síntese orgânica e modificações estruturais em moléculas conhecidas,
aumentando a potência e a eficácia (RATES, 2000).
Observa-se um interesse crescente em terapias alternativas e produtos naturais,
especialmente vegetais com finalidade terapêutica. Este interesse é devido: a ineficiência de
fármacos sintéticos para várias patologias, efeitos colaterais, elevado custo do tratamento
farmacológico, dificuldade da indústria em obter novos agentes terapêuticos, alto custo de
pesquisa e produção de novas moléculas biologicamente ativas, entre outros motivos. Assim,
aliado a estes fatores, encontra-se o dito popular de que “o natural não faz mal” aumentando a
busca por plantas medicinais e suas propriedades de cura (CAPASSO, 2000; RATES, 2000;
NIERO et al., 2003).
As plantas medicinais são importantes fontes de novos medicamentos, o que vem
sendo confirmado nos últimos anos através de pesquisas científicas, especialmente nas áreas
de química e farmacologia. Sabe-se que aproximadamente 25% dos fármacos empregados na
terapêutica são obtidos de forma direta ou indireta de produtos naturais, especialmente plantas
superiores (YUNES et al., 2001).
A partir das plantas medicinais podem ser obtidos medicamentos fitoterápicos
(complexidade de compostos) e fitofármacos (compostos isolados), os quais são formulados a
partir de pesquisas científicas para serem introduzidos no mercado. No entanto, o sucesso de
um trabalho científico depende inicialmente da seleção adequada de uma planta, que pode ser
feita pela observação do uso popular, do conteúdo químico, toxicidade, seleção ao acaso ou a
combinação de muitos critérios (RATES, 2000; YUNES et al., 2001).
A estratégia mais comum para a seleção de uma planta é a observação cuidadosa do
uso desta na medicina popular em diferentes culturas (RATES, 2000). Dados da literatura
revelam que é muito mais provável encontrar atividade biológica em plantas orientadas pelo
seu uso na medicina popular do que em plantas escolhidas ao acaso. Outros aspectos
importantes que devem ser levados em consideração são as informações botânico-
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taxonômicas e químico-taxonômicas, que na maioria dos casos, diferem significantemente em
relação às distintas partes da planta, sendo mais viável, portanto, estudar inicialmente aquela
empregada na medicina popular e posteriormente as outras partes da planta, que também
podem conter princípios ativos de interesse biológico (CECHINEL FILHO, YUNES, 1998;
NIERO et al., 2003).
A abordagem etnofarmacológica é então a estratégia mais utilizada para selecionar
uma planta, seguida de passos como: definição de espécie, idade da planta, local de coleta,
região de incidência da planta, fatores ambientais, forma de coleta, secagem, armazenamento
e outros fatores ligado a espécie vegetal que podem interferir no estudo (MACIEL et al.,
2002). Além desses, a experiência dos pesquisadores também é relevante, já que a
inexperiência podem comprometer resultados experimentais, dispender mais tempo e recursos
para atingir os objetivos da pesquisa (CECHINEL FILHO, YUNES, 1998). Desta forma,
numerosos métodos de extração e estudo de compostos oriundos de plantas têm sido
sugeridos, porém, no caso da procura por princípios ativos, não interessa o composto mais
fácil de separar, ou o que apresenta maior rendimento, ou ainda, aquele que possui a estrutura
mais complexa; pois o que realmente interessa é descobrir compostos que apresentem
atividade biológica. Daí a importância e a necessidade de estudos fitoquímicos guiados pelos
bioensaios, seja in vivo ou in vitro (YUNES et al., 2001).
O reino vegetal tem sido então uma das mais ricas fontes de substâncias orgânicas,
contribuindo de forma significativa para o fornecimento de metabólitos secundários, dos quais
muitos têm sido utilizados como medicamentos, cosméticos, alimentos, agroquímicos, etc
(PINTO et al., 2002; NIERO et al., 2003). Sob este aspecto, o Brasil é o país com maior
potencial para pesquisa com espécies vegetais, pois detém a maior e mais rica biodiversidade
do planeta, distribuída em seis biomas distintos, sendo a Mata Atlântica, uma das mais ricas
em biodiversidade, porém a mais devastada do país. Nesta predomina o clima quente e
tropical, com mais de dez mil espécies, das quais algumas predominantes na região do Vale
do Itajaí e Grande Florianópolis, já foram estudadas quanto a sua importância medicinal, tais
como: Mikania glomerata, Bauhinia forficata, Psychotria ipecacuanha, Ocotea odorífera, e
outras (VIEIRA, 1999).
Visando estudar plantas usadas pela população local, foi selecionada a espécie
Calophyllum brasiliense Camb, que é uma árvore encontrada em florestas tropicais do Sul do
México até o Brasil, amplamente distribuída na Mata Atlântica, e muito utilizada na medicina
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popular (REYES-CHILPA et al., 1997). A C. brasiliense, é comumente conhecida no Brasil
como guanandi ou guarandi, sendo usada pela população para o tratamento de inflamações e
úlceras (SILVA et al., 2001). O infuso e banho preparados com as cascas da árvore é usado
popularmente no tratamento de reumatismo, varicose, hemorróidas e úlceras (SARTORI et
al., 1999).
A Calophyllum brasiliense, é então, uma espécie promissora, devido sua abundância
na região e por suas propriedades medicinais, algumas delas já relatadas em estudos anteriores
com as folhas da planta, porém que carece de investigação químico/biológica das outras
partes da planta, além de dar continuidade aos trabalhos realizados pelo grupo de pesquisa do
Núcleo de Investigações Químico-Farmacêuticas (NIQFAR/UNIVALI) com esta planta.
1.1 Plantas medicinais: estudos fitoquímicos e biológicos
A etnobotânica e a etnofarmacologia empregados na exploração científica
interdisciplinar de agentes biologicamente ativos, baseados em observações e ou usos por
determinados povos, tem proporcionado relativo sucesso na busca de princípios ativos de
plantas, evidenciando que a pesquisa científica deve respeitar a cultura popular e sua
sabedoria, salientando a importância de todos os povos, em especial dos índios, que sempre
fizeram uso das plantas para tratar as enfermidades de suas tribos (HEINRICH, 2000; COX et
al., 2001; MACIEL et al., 2002).
O reino vegetal tem então, contribuído significativamente para o fornecimento de
metabólitos secundários, muitos destes de grande valor agregado devido às mais variadas
aplicações, principalmente como medicamento. Muitas destas substâncias constituem-se,
sobretudo, em modelos para o desenvolvimento de medicamentos sintéticos como: procaína,
cloroquina (derivado quinolínico prescrito para o tratamento de malária), tropicamida, etc.
Outros compostos são comercializados como fitofármacos que são tão importantes quanto os
medicamentos sintéticos, como por exemplo: vimblastina e vincristina extraídos da
Catharantus roseus, utilizados para o tratamento de linfomas e leucemia infantil;
podofilotoxina e os análogos etoposídeo e tenoposídeo, extraídos do rizoma de Podophyllum
peltatum; taxol uma das mais promissoras descobertas para o tratamento do câncer extraído da
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Taxus brevifolia, e mais recentemente, camptotecina um alcalóide extraído da árvore chinesa
Camptotheca acuminata e derivados (PINTO et al., 2002; NIERO et al., 2003).
Deve-se citar ainda, outras substâncias igualmente importantes para a terapêutica
como a pilocarpina, isolada do jaborandi, que é usada no tratamento de glaucoma na forma de
colírios; a rutina isolada da fava d’anta, que compõem medicamentos utilizados para melhorar
a circulação periférica e fortalecer os vasos capilares, cuja atividade também é relatada para a
hesperidina, isolada de frutos cítricos (MARTINS, 2003). Da Digitalis purpúrea e D. lanata
foram isolados a digoxina, digitoxina e o deslanosídeo, que são glicosídeos cardíacos com
potente e seletiva ação sobre o músculo cardíaco; a quinidina, isolada da casca da Cinchona
sp, agente contra a arritmia cardíaca; a papaverina, vasodilatador periférico não narcótico;
teofilina, um importante broncodilatador, que contribuiu para o conhecimento da
fisiopatologia da disfunção erétil, resultando na descoberta do sildenafil (Viagra®) cuja
estrutura molecular foi inspirada na cafeína (NIERO et al., 2003).
Devido a tantas descobertas relevantes a partir de plantas medicinais, atualmente
existem muitas pesquisas em busca de moléculas ativas nas plantas, organismos marinhos,
insetos e microrganismos, o que pode ser evidenciado tanto na área acadêmica como
industrial, mostrando que existe uma ligação ou retroalimentação entre ambas (CECHINEL
FILHO, YUNES, 2001; NIERO et al., 2003). Nesta procura por novos fármacos, os sistemas
de “screening” têm permitido que muitos laboratórios testem milhares de extratos e
compostos em curto espaço de tempo. Estes bioensaios geralmente requerem pouca
quantidade de amostra, são reprodutíveis e indicativos de possíveis atividades farmacológicas,
direcionando as investigações fitoquímicas e assim, a obtenção de um novo medicamento com
menor custo e espaço de tempo (CECHINEL FILHO, YUNES, 2001; RATES, 2001).
As plantas contêm centenas de metabólitos secundários, mas geralmente, apenas os
compostos presentes em maior concentração são isolados e estudados pela fitoquímica
clássica, já que a obtenção destes é bastante complexa. Por isso, é indispensável a análise
biológica das frações e das substâncias puras em relação à sua concentração, a fim de predizer
se o principal componente químico responsável pela atividade biológica foi realmente
determinado, ou se a ação biológica deve-se ao efeito sinérgico de vários compostos
(CECHINEL FILHO, YUNES, 2001).
A preparação dos extratos brutos das plantas é o ponto de partida para a maioria dos
estudos fitoquímicos, que geralmente iniciam pelas pesquisas etnofarmacológica e científica.
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Seguem com a escolha da metodologia a ser empregada onde: a escolha do solvente para
extração e purificação, a preparação e manipulação dos extratos e frações, a purificação das
frações e compostos, a identificação e caracterização dos compostos, são fatores relevantes
para o sucesso da pesquisa fitoquímica (GHISALBERTI, 1993; FERRI, 1996; CECHINEL
FILHO, YUNES, 1998; NEWMAN et al, 2003).
2.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Aspectos Botânicos do Gênero Calophyllum
O gênero Calophyllum (Guttiferae/Clusiaceae) é um grande grupo de árvores tropicais
com aproximadamente 180-200 espécies restritas nos trópicos quentes e úmidos. Algumas
destas espécies são freqüentemente empregadas na medicina popular para tratar injúrias como
dor, processos infecciosos e úlceras, sendo que estudos experimentais têm confirmado alguns
destes efeitos benéficos (OLIVEIRA, 1994; DHARMARATNE et al., 1999).
No hemisfério ocidental, uma das espécies mais distribuídas é a Calophyllum
brasiliense Camb. (figura 1), cuja árvore é encontrada nas florestas tropicais do sul do México
até o Brasil. Estas árvores podem chegar à 40 metros de altura e 1,3 metros de diâmetro. A
madeira é usada para construções, pisos e mobílias (REYES-CHILPA et al., 1997). Esta
planta, comumente conhecida no Brasil como guanandi ou guarandi é freqüentemente usada
na medicina popular para o tratamento de inflamações e úlceras (SILVA et al., 2001). Cascas
da C. brasiliense são utilizados sob a forma de infusos e banhos para tratamento de
reumatismos, varicoses, hemorróidas e úlceras (SARTORI et al., 1999).
2.1.1 Aspectos químicos e biológicos da Calophyllum brasiliense
As plantas do gênero Calophyllum têm sido uma rica fonte de substâncias bioativas,
incluindo cumarinas, xantonas, esteróides, triterpenos e biflavonóides (REYES-CHILPA et
al., 1997; ALI et al., 1999; MACKEE et al., 1998; MOREL et al., 2000; SILVA et al., 2001).
Estudos realizados por Stou e colaboradores relatam o isolamento de uma série de
ácidos com característica estrutural incomum da resina do tronco da C. brasiliense e C.
inophyllum. Uma amostra da resina da C. brasiliense da Costa Rica rendeu aproximadamente
18
95% de uma goma ácida esverdeada consistindo na sua totalidade de dois compostos
isoméricos, ácido brasiliênsico (1) e ácido isobrasiliênsico. Amostras do tronco do C.
inophyllum do Hawai, Ilhas Filipinas e Austrália forneceram resinas similares contendo em
grande parte um isômero adicional, ácido inofiloídico (2), cujas propriedades químicas e
espectrais são similares ao ácido brasiliênsico, divergindo em pequenos detalhes no espectro
de RMN (STOUTet al., 1968).
FIGURA 1: Folhas e frutos de Calophyllum brasiliense Camb.
19
O
O
HOOCO
OH
O
O
HOOCO
OH
(1) (2)
Frações obtidas de árvores de C. brasiliense coletadas em Chiapas no México,
permitiram o isolamento dos compostos: β-sitosterol (3); 6-desoxijacareubin (4); 1,5-
dihidroxi-2-(3,3-dimetilalil)-3-metoxixantona (5); jacareubin (6); 2-(3,3-dimetilalil)-1,3,5-
trihidroxixantona (7); 2-(3,3-dimetilalil)-1,3,5,6-tetrahidroxixantona (8). Neste mesmo
trabalho foi avaliado a ação fungistática de extratos, frações e compostos puros e acetilados
contra Postia placenta. Dentre todos, o extrato metanólico foi o mais ativo e as xantonas
naturais e acetiladas, com padrão de substituição em 1,3,5- trioxigenado, apresentaram perfil
semelhante como agente fungistático (REYES-CHILPA et al., 1997).
HO
OHO
OH
O O
(3) (4)
20
OHO
OH
O OMe
O OHO
OH
O OH
(5) (6)
OHO
OH
O OH
OHO
OH
O OHHO
(7) (8)
Estudos preliminares com as cascas do caule da C. brasiliense, têm demonstrado
atividades gastro-protetora em modelos de úlcera induzidos por etanol, indometacina e stress.
A fração hexânica inibiu significativamente a formação de úlcera no modelo de ulceração
gástrica por indometacina. Já a fração diclorometano, manifestou potente inibição da lesão
gástrica induzida pelo etanol em camundongos, além de diminuir a ulceração nos modelos
induzidos por stress hipotérmico e indometacina (SARTORI et al., 1999).
Silva et al (2001) analisaram a composição química das folhas do C. brasiliense e
verificaram um possível efeito analgésico de algumas frações e compostos isolados,
comparando com fármacos de referência. Da fração acetato de etila obtiveram cinco sólidos
puros, identificados como quercetina (9), ácido gálico (10), ácido protocatético (11), hiperin
ou hiperoside (quercetin-3-O-galactoside) (12), e amentoflavona (13), os quais foram
identificados por comparação direta com amostras autênticas e dados espectrais. Os resultados
farmacológicos indicaram que as frações hexano e acetato de etila exibiram efeito
antinociceptivo similar aos fármacos de referência, enquanto a fração diclorometano não
mostrou atividade significante no teste de contorções abdominais induzidas por ácido acético.
Neste mesmo modelo farmacológico, os compostos quercetina e amentoflavona causaram
considerável inibição. No modelo da formalina, todas as frações exibiram atividade
21
antinociceptiva em relação a segunda fase (dor inflamatória), mas foram praticamente inativos
em relação a primeira fase (dor neurogênica).
OH
OH
HO O
OH
OH
O
COOH
OH
OH
HO
(9) (10)
COOH
OH
OH
OH
OH
HO O
OR
OH
O
(11) (12) R=Galactosil
OHO
OH O
OH
OH
OOH
HO O
(13)
ITO et al (2002), descreveram o isolamento e a identificação de sete novas xantonas
dos galhos da C. brasiliense, coletadas no Brasil, e de dez xantonas já citadas na literatura. As
xantonas inéditas foram identificadas como Brasixantona A (14); Brasixantona C (15), D
(16), E (17), F (18) e G (19), sob a forma de um óleo amarelo, enquanto a Brasixantona B
(20), cristalizou como agulhas. As dez xantonas conhecidas foram: toxiloxantona A (21); 6-
desoxijacareubin (4); 3,8-dihidroxi-1,2-dimetoxixantona (22); 8-desoxigartanin (23);
22
cudraxantona F (24); 4-hidroxixantona (25); 1,2-dimetoxixantona (26); piranojacareubin (27);
garcinina B (28); e latisxantona C (29). Doze xantonas naturais foram testadas pela sua
atividade na inibição da promoção de tumor. Todos os compostos testados mostraram
atividade inibitória da promoção de tumor. As Brasixantonas A, B, C, D, 8-desoxigartanin e
cudraxantona F mostraram 100% de inibição.
O OR3
R2
O OH
R1
R4
Estruturas das xantonas inéditas da C. brasiliense
R1 R2 R3 R4
H OCH3 OH (14)
OOH
H H OH (15)
OH
O
H H OH (26)
H OH OCH3 (17)
H H OH OCH3 (18)
H H OH (20)
23
OH H H (21)
H OH H H (4)
O
R8 O R1
R2
R3
R4R5
R6
R7
Estruturas das xantonas conhecidas da C. brasiliense
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 R8
OCH3 OCH3 OH H H H H OH (22)
OH
OH
OH H OCH3 OH H (19)
OH OH OH H H H (23)
OH OH H OCH3 OH H (24)
H H H H OH H H H (25)
OCH3 OCH3 H H H H H H (26)
24
O O O
OH
OH
O
OH
O OH
O
HO
O
(27) (28)
O O OH
OH
OHO
(29)
Mais recentemente, COTTIGLIA et al (2004) relataram que esta planta, coletada no
México, produz ácidos derivados de cromanona, com potencial antibacteriano, especialmente
contra Bacilus cereus e Staphylococcus epidermitis.
2.2 Calophyllum papuanum
Em Nova Guiné, foi estudada a casca da C. papuanum, cuja extração feita com pentano,
possibilitou a obtenção de uma resina verde-amarelada, de onde foram isolados dois
compostos similares, identificados como ácidos papuânico (30) e isopapuânico (31). Estes
ácidos representam o primeiro par de produtos estereoisoméricos isolados do gênero
Calophyllum (STOUT et al., 1968).
25
OO
OH O
HOOC
O
H
Me
MeO
O
HOOC
(30) (31)
2.3 Calophyllum fragrans
A partir do extrato clorofórmico obtido do tronco desta planta, foram isoladas as
seguintes xantonas: 6-desoxijacareubin (4), 1,5-dihidroxi-6-metoxixantona (32) e (1,7-
dihidroxixantona) (33) (LOCKSLEY et al., 1969).
O
O OH
OHMeO
O
O OH
HO
(32) (33)
2.4 Calophyllum inophyllum
A Calophyllum inophyllum também é utilizada com fins medicinais e ornamentais. Todas
as suas partes têm propriedades terapêuticas, como por exemplo, o óleo das castanhas é usado
em reumatismos, gonorréia e sarna; a goma que sai do tronco é um remédio para feridas e
úlceras. As cascas após decocção são usadas para tratar hemorragias internas e úlceras.
Também há indicações populares de atividades como: anti-séptico, adstringente, expectorante,
26
diurético, purgativo, além de ser usada como agente anti-HIV (POTTI, KURUP, 1970; ALI et
al., 1999).
Duas novas xantonas, nomeadas caloxantonas A(34) e B (35), foram isoladas das
raízes do C. inophyllum, em adição às xantonas conhecidas (macluraxantona (36), 1,5-
diidroxixantona (37)) e (-)epicatequina (38) (IINUMA et al., 1994). Desta espécie ainda,
foram isolados os epímeros (inofinona (39) e isoinofinona (40). Das folhas, foram isolados o
canofilol e o ácido canofílico (ALI et al., 1999).
O O
O OH
HO
HO
O OH
HO
OMe
O O
(34) (35)
O OHO
OH
O OH
O
O OH
OH
(36) (37)
OHO
OH
OH
OH
OH
O
O OH
O
(38) (39)
27
O
O OH
O
(40)
Em outro estudo com esta espécie, foram isolados nove compostos, sendo destes,
cinco xantonas [6-desoxijacareubim (4); 2-(3-metilbut-2-enil)-1,3,5- trihidroxixantona (41);
2-(3-metilbut-2-enil)-1,3,5,6-tetrahidroxixantona (42); 1,3,5-triidroxi6,6’dimetilpirano
(2’,3’,6,7)-4-(1,1-dimetilprop-2-enil) xantona (43); macluraxantona (36)] e um biflavonóide,
amentoflavona (13), o qual inibiu 63% o receptor do fator de ativação plaquetária (PAF)
(JANTAN et al., 2001).
O
O
OHOH
OH
O
O
OHOH
OH
HO
(41) (42)
O O
O OH
OH
OH
(43)
28
ITOIGAWA et al (2001), testaram alguns compostos isolados desta espécie de
Calophyllum, em modelos antitumorais in vitro, destacando os derivados 4-fenil-cumarinas,
aos quais são atribuídas atividades inibitórias para a enzima transcriptase reversa do HIV-1.
Os compostos testados foram: 4 fenil-cumarinas tetracíclicas [Inophyllum A (44), Inophyllum
D (45), Inophyllum E (46), Inophyllum C (47)], três tricílicas [Calocumarina A (48),
Calofiloide (49), Apetatolide (50)], duas dimetilciclopropil [Calocumarina B (51),
Calocumarina C (52)] e um ácido cinâmico fenólico [Ácido isocalofílico (53)], onde a
Calocumarina A foi a mais promissora nos testes realizados.
OO
O
O
OH
OO
O
O
OH
(44) (45)
OO
O
O
O
OO
O
O
O
(46) (47)
29
OO
OH
O
O
OOO
O
O
(48) (49)
O
O
OO
O
O
O
O
O
O
(50) (51)
OO
O
O
O
O
OHO
O
COOH
(52) (53)
2.5 Calophyllum dispar
30
Da C. dispar foram estudados o caule e os frutos, onde foram isoladas novos derivados
de 4-fenilcumarinas como: Disparfuram B (54), Disparacetilfuram A (55), Mammea A/AA
desidrociclo F (56), Mammea A/AA metoxiciclo F (57), Mammea A/BA ciclo F (58),
Mammea A/BB ciclo F (59), Mammea A/BC ciclo F (60), Isodisparfuram A (61), Mammea
A/AA ciclo F (62), Mammea A/AB ciclo F (63) (GUILET et al.,2001).
OO
O OH
O
OO
OH
O
O
O
(54) (55)
O OH
OO O
OO
OH
O
O
O
(56) (57)
31
OO
O
OH
O
HO
OO
O
OH
O
HO
(58) (59)
OO
O
OH
HO
O
OO
O
HO
O
(60) (61)
O OH
OO O
HO
OOO
O
HO
OH
(62) (63)
32
2.6 Calophyllum thwaitesii
DHARMARATNE e WANIGASEKERA (1996), determinaram uma potente atividade
anti HIV -1 de compostos provenientes da Calophyllum, Nesta investigação, eles encontraram
nas raízes da C. thwaitesii os seguintes compostos: demetilcalaxantona, trapezifolixantona,
thwaitesixantona, calothwaitesixantona, 6-desoxi-γ-mangostin , acido calozelânico, friedelina
(64), β-sitosterol (3) e uma nova xantona identificada como 11,12-dihidro-thwaitesixantona
(65).
O
O O
OO OH
(64) (65)
2.7 Calophyllum gracilipes
Das folhas da C. gracilipes foi isolado um triterpeno inédito identificado como gracilipeno
(66) além de outros triterpenos e esteróides como: friedelina (64), lupeol (67), lupenona (68),
beta-sitosterol (3), stigmasterol (69), 3-beta-hidroxi-30-norlupan-20-ona , lupano-3 beta-20-
diol, ácido (20R)-3 beta-hidroxilupan-29-óico, ácido betulínico (70) e esqualeno (CAO et al.,
1997).
33
O HO
(66) (67)
O
HO
(68) (69)
HO
COOH
(70)
2.8 Calophyllum moonii
C. moonii é uma árvore endêmica da zona úmida do Sri Lanka, tem folhas verdes o
ano todo. Sete xantonas, dois ácidos cromânicos, quatro triterpenóides, duas piranocumarinas
e sitosterol tem sido previamente relatados do caule, casca do caule, e folhas desta espécie.
Dharmaratne e colaboradores (1997), isolaram do extrato hexânico das raízes de C. moonii
34
um novo composto chamado dombakinaxantona (71), além de: calozeylanoxantona (72),
friedelina (64), taraxerol e sitosterol (3). Calozeylanoxantona (72) foi previamente relatado
como constituinte da C. zeylanicum, mas ele é raro na natureza. Recentemente os mesmos
autores avaliaram a atividade da calozeyloxantona contra enterococos resistentes a
vancomicina e o sinergismo com antibióticos, verificando ação sinérgica entre a
calozeyloxantona e a vancomicina contra enterococos resistentes a vancomicina, mas apenas
parcial sinergismo com outros antibióticos.
O O
O OH
HO
O
O
OH
OH
O
(71) (72)
2.9 Calophyllum cordato-oblongum
Desta espécie já havia sido isolado anteriormente quatro xantonas, três cumarinas, um
ácido cromeno e três triterpenóides. Dharmaratne et al(1997) isolaram cumarinas e triterpenos
dos galhos e brotos desta espécie e estudaram a distribuição das cumarinas nas diferentes
partes desta planta. Dos galhos foram isolados oitos compostos, sete deles foram identificados
como cordatolide A (73), cordatolide B (74), oblongulide (75), fridelina (64), canofilol,
sitosterol (3) e ácido cordato-oblôngico (77).
35
O
O
O
R3
R2
R1
O
O
O
O
O
MeO
(75)
R1 R2 R3
(73) β-CH3 α-CH3 β-OH
(74) β-CH3 α-CH3 α-OH
Dharmaratne e colaboradores (1999) isolaram e elucidaram a estrutura de um novo
ácido cromeno, o ácido isocordato-oblôngico (76) do caule da mesma planta.
O O
OH O
R1R2OOC
R3
R4R5
R6
R1 R2 R3 R4 R5 R6
(76) CH3 CH3 CH3 H CH3 H
(77) CH3 CH3 CH3 H H CH3
2.10 Calophyllum panciflorum
Da C. panciflorum foram isolados os compostos: calofifuran (dibenzofurano inédito),
pancixantonas A e B (xantonas inéditas). Em estudos posteriores, foram isolados novos
biflavonóides, denominados de pancibiflavonol (78), garcinianin (79), GB-2(80), GB-1(81),
GB-2 A (82), GB-1A (83) e GD-IV (84). Todos compostos foram testados biologicamente e
apresentaram significativo efeito inibitório em altas concentrações e fraca citotoxicidade (ITO
et al.,1999).
36
OHO
OH
OH
O
OH
OH
HO OR2
R1
O
R1 R2
(78) OH OH
(79) OH H
OHO
OH
OH
O
OH
OH
HO OR2
O
R1
R1 R2
(80) OH OH
(81) OH H
(82) H OH
(83) H H
37
OHO
OH
OH
O
OH
HO
O
O
(84)
2.11 Calophyllum caledonicum
Da C. caledonicum que é utilizada popularmente na Nova Celedônia como diurética,
foram isolados quatro novas xantonas juntamente com 17 xantonas conhecidas do extrato de
diclorometano do tronco desta planta. As xantonas novas são: caledonixantona A (86);
caledonixantona B (87); caledonixantona C (88) e caledonixantona D (89). Algumas das
outras xantonas conhecidas são: 7-hidroxi-8-metoxixantona (90); 7,8-dimetoxixantona
(91); 6-hidroxi-5-metoxixantona (92); 7-hidroxi-5,6-dimetoxixantona (93) e
dehidrocicloguanandin (94) (MOREL et al., 2000). Em continuação aos estudos, os mesmos
autores isolaram e elucidaram a estrutura de dois novos compostos denominados
caledonixantonas E (95) e F (96) juntamente com alguns compostos já isolados anteriormente:
dehidrocicloguanandim (94); caledonixantona B (87); caloxantona G (97); caledonixantona C
(88); 7-hidroxi-8-metoxixantona (90) e caledonixantona A (86).
O
O
O
HO
O
O
O
(86) (87)
38
O
O
O
HO
O
OOH
OHOMe
OH
(88) (89)
O
OR1
R2
R3
R4
R1 R2 R3 R4
(90) OMe OH H H
(91) OMe OMe H H
(92) H H OH OMe
(93) H OH OMe OMe
O
O
O OH
O OH
O O
OH
OMe
(94) (95)
39
O OH
OH
OMe
O O
OH
O OH
O
OHO
(96) (97)
2.12 Calophyllum mucigerum
Estudos com as cascas de C. mucigerum possibilitaram o isolamento de uma nova
cumariana, denominada de mucigerina, além da xantona cudraxantona C, friedelina (63) e
estigmasterol (67). O extrato bruto desta espécie foi testado contra a linhagem de células
CDM.SS, um tipo de leucemia, onde o extrato apresentou atividade, além de ter moderada
toxicidade contra a larva de Aedes aegyti (EE et al., 2004).
40
3.0 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVOS GERAIS
Investigar a composição química das diferentes partes da Calophyllum brasiliense
(folhas, frutos, flores e raízes) e avaliar a atividade antinociceptiva e antimicrobiana dos
extratos e frações de cada parte da planta, além de analisar a estrutura dos possíveis
compostos bioativos.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1 – Preparar diferentes frações a partir do extrato bruto das distintas partes de C. brasiliense e
analisar os resultados biológicos, quanto às ações antimicrobianas e antinociceptivas, no
intuito de proceder um estudo fitoquímico bio-direcionado.
2 – Submeter as frações que apresentarem atividade a procedimentos cromatográficos (CCD,
CC, etc.) visando separar e purificar seus componentes.
3 - Identificar os compostos isolados através de técnicas de espectroscopia usuais (IV, RMN-1H, RMN-13C) comparando com amostras autênticas.
4 - Avaliar os resultados biológicos dos compostos isolados e comparar com fármacos de
referência utilizados na clínica.
5 – Dar continuidade a estudos anteriores, com as folhas de C. brasiliense, onde foi verificado
a presença de compostos polares não identificados.
41
4 METODOLOGIA
4.1 MATERIAIS E MÉTODOS
Para as cromatografias em coluna (CC), fez-se uso da sílica gel 60 (70-230 mesh)
como fase estacionária e diversos eluentes como fase móvel, variando o tipo e a proporção
conforme a fração utilizada e seu perfil analisado anteriormente em CCD. O diâmetro e a
altura das colunas variaram de acordo com a quantidade de material adsorvido. As eluições
foram feitas com solventes orgânicos, em ordem crescente de polaridade. As frações coletadas
foram evaporadas a temperatura ambiente. As frações foram reunidas conforme as
semelhanças de Rf observadas por cromatografia de camada delgada (CCD).
Para CCD, usou-se placas de sílica Gel 60 F254 adquiridas da Merck como fase
estacionária e diversos eluentes como fase móvel, variando o tipo e a proporção conforme o
comportamento da fração analisada. A visualização dos compostos foi feita utilizando-se luz
ultravioleta como revelador universal, anisaldeído sulfúrico para terpenóides e esteróides que
se apresentam em manchas coradas de rosa ou roxo, cloreto férrico 3% para flavonóides e
compostos fenólicos cujas manchas se apresentam coradas de marrom.
Os espectros na região de absorção do infravermelho (IV) foram obtidos através de um
espectrômetro Bomen-100 (Central Analítica/CCS/UNIVALI). Os espectros de ressonância
magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C foram realizados em espectrômetro Varian XL-
300/CNR-Roma.
4.2 Material vegetal
As folhas da C. brasiliense foram coletadas nos jardins da UFSC (Universidade Federal de
Santa Catarina) em Florianópolis, em dezembro de 1998. As raízes, flores e frutos da C.
brasiliense foram coletadas no mesmo local, nos meses de abril, setembro e dezembro de 2001,
respectivamente. O material foi classificado pelo Dr. Ademir Reis (Departamento de Botânica,
UFSC) e uma exsicata foi depositada no Herbarium Barbosa Rodrigues (Itajaí/SC) sob o número
VC Filho 007.
42
4.2.1 Raízes de C. brasiliense
As raízes foram limpas com o auxílio de uma escova, secas a temperatura ambiente,
trituradas e pesadas. Este material (337,3 g) foi macerado com metanol por sete dias e re-
macerado por mais cinco dias. Após este período o solvente foi evaporado até volume de 125
mL de extrato metanólico bruto, com uma concentração de 234 mg/mL.
Ao extrato metanólico foi acrescentado 100 mL de clorofórmio, repetido por três
vezes, solubilizando compostos mais apolares do extrato e possibilitando a extração destes do
extrato bruto. O mesmo procedimento foi realizado com a adição de acetona. O resíduo foi
denominado de fração polar.
Após análise em CCD, as frações clorofórmica e acetônica foram reunidas numa só
fração denominada de fração apolar, já que o perfil cromatográfico de ambas era muito
semelhante. Para a análise em CCD das frações apolar e polar, foram utilizados vários
sistemas de eluentes, sendo que o clorofórmio e o metanol foram os mais adequados para a
eluição, enquanto que o cloreto férrico foi o revelador mais utilizado devido a grande
quantidade de compostos fenólicos/flavonóides presentes nas frações analisadas.
Após definição do perfil fitoquímico das frações foi realizado o “screening”
farmacológico dos extratos semi-purificados, e aqueles que apresentaram resultados
promissores, foram submetidos primeiramente a procedimentos cromatográficos visando o
isolamento e a purificação dos possíveis princípios ativos presentes na planta. Os
procedimentos descritos podem ser visualizados na figura 02.
a) Análise fitoquímica da fração polar
Foi cromatografado 540 mg da fração polar em CC de sílica gel, que foi eluída com
CHCl3:MeOH em diferentes proporções, com aumento gradual da polaridade. Foram
coletados vários frascos que foram reunidos de acordo com semelhanças observadas por
CCD.
As subfrações obtidas desta CC foram analisadas em CCD, porém não foi possível
isolar compostos puros, já que a fração é riquíssima em compostos muito polares e
provavelmente glicosilados, o que dificulta os processos de purificação. Tentativas de
purificação utilizando Sephadex LH-20 como fase estacionária, também não tiveram êxito.
43
b) Análise fitoquímica da fração apolar
Cromatografou-se em C.C de sílica gel, 450 mg da fração apolar, que foi eluída com
hexano/acetona, em diversas proporções, e as amostras foram coletadas em frascos de
aproximadamente 10 mL, cujo solvente evaporou a temperatura ambiente. Os frascos foram
agrupados conforme perfil fitoquímico analisado em CCD, totalizando 120 subfrações, as
quais após secas e pesadas, foram novamente analisadas em CCD e as que apresentaram
maior grau de pureza foram recromatografadas.
A subfração 5-8 (33 mg) foi purificada através de CC de sílica gel eluída com
hexano/acetona, aumentando-se gradativamente a polaridade. Com este procedimento obteve-
se 16mg de um composto denominado A.
A subfração 9-48 (128 mg) foi recromatografada em CC de sílica gel, eluída com
hexano-acetona, onde isolou-se um sólido amarelo denominado B.
Da subfração 69-87 (148 mg) após recromatografada obteve-se a subfração 63-79,
que foi novamente cromatografada em CC e eluída com hexano/acetona, isolou-se 5 mg de
um composto denominado C.
Extrato MeOH das Raízes de C. brasiliense Partição
Resíduo de particionamento Clorofórmio
Fração Polar Fração Apolar
CC sílica gel CC sílica gel 540 mg 450mg
132 subfrações 120 subfrações
Várias CCs sem êxito de purificação
Compostos Fenólicos 5-8 9-48 69-87 (33mg) (128mg) (148 mg) CC sílica gel CC sílica gel Composto A Composto B Composto C 16mg 3mg 5mg
FIGURA 02: Fluxograma das atividades realizadas com as raízes da C. brasiliense.
44
4.2.2 Frutos da C. brasiliense
Os frutos foram triturados “in natura”, pesados (600 g) e macerados com metanol por
sete dias. O solvente foi evaporado com o auxílio do rotavapor até volume desejado, 172 mL
com uma concentração de 177 mg/mL (5.0 % de compostos extraídos na maceração).
Este extrato bruto foi então particionado com CHCl3, denominado de fração apolar,
cujo rendimento foi de 518 mg. O restante do extrato foi posteriormente particionado com
acetato de etila, que após evaporação do solvente denominou-se de fração polar. O restante do
extrato foi descartado após análise em CCD, já que a amostra demonstrou ser muito rica em
açúcares e compostos glicosilados, os quais dificilmente podem ser purificados em sílica gel.
Este procedimento está demonstrado na figura 03.
a) Análise fitoquímica da fração polar
A fração polar foi cromatografada com sílica gel (280mg de fração) e eluída com
clorofórmio/metanol em diversas proporções, cuja polaridade foi aumentada gradativamente
com o aumento da alíquota de metanol. Desta CC obteve-se 70 subfrações, que foram
analisadas em CCD comparando com padrões autênticos.
b) Análise fitoquímica da fração apolar
Foi realizado uma CC de sílica gel (300mg de fração) eluída com hexano/acetato de
etila aumentando-se a polaridade gradativamente. As subfrações foram reunidas de acordo
com o perfil fitoquímico e comparadas com padrões conhecidos e com as frações obtidas das
raízes, a fim de comparar o perfil fitoquímico das diferentes partes da planta.
45
Extrato MeOH dos Frutos de C. brasiliense Partição
Clorofórmio Acetato de Etila
Fração Apolar (300mg ) Fração Polar (280 mg )
CC sílica gel CC sílica gel
75 subfrações 70 subfrações
Compostos Esteroidais Compostos fenólicos/flavonóides FIGURA 03: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos realizados com os frutos de C.
brasiliense.
4.2.3 Folhas da C. brasiliense
As folhas foram coletadas no campus da UFSC em 1999, as quais após maceradas
com metanol e particionadas com solventes de polaridade crescente, renderam as seguintes
frações: hexano, diclorometano e acetato de etila.
Em estudo anterior, isolou-se cinco compostos e, detectou-se a presença de alguns
compostos polares na fração acetato de etila, que não foram isolados mas que são de interesse
do grupo em isolá-los.
Esta fração acetato de etila foi então, denominada de fração polar e os estudos
fitoquímicos com esta foram re-iniciados, devido o bom rendimento e a presença de
compostos não identificados. Procedimentos demonstrados na figura 04.
a) Análise fitoquímica da fração polar
Foram cromatografados 5 g da fração polar das folhas em sílica gel e eluída com
clorofórmio/metanol em diversas proporções, aumentado-se gradativamente a polaridade do
eluente. Desta CC obteve-se 102 subfrações, que foram analisadas em CCD, e as que
46
apresentaram melhor rendimento e perfil fitoquímico, foram recromatografadas a fim de
purificar os compostos presentes nestas.
A subfração 8-24 (140 mg) foi cromatografada em sílica gel e eluída com
clorofórmio/metanol, com aumento gradual da polaridade. Esta CC possibilitou a obtenção de
60 sub-frações, que foram agrupadas conforme perfil fitoquímico, sendo que a subfração 17-
59 rendeu 41 mg de um composto puro, denominado de D.
A subfração 42-58 (688 mg) também foi cromatografada em sílica gel e eluída com
clorofórmio/metanol, cujas subfrações foram reunidas de acordo com as semelhanças
observadas por CCD Esta CC possibilitou a obtenção de 20 subfrações, sendo que a subfração
11-18 (346 mg) apresentou perfil cromatográfico interessante, sendo então recromatografada
várias vezes, porém não houve sucesso no processo de purificação dos compostos por serem
muito polares.
Extrato MeOH das Folhas de C. brasiliense Partição
Fração Hexano Fração Acetato de Etila Fração DCM Subfrações Fração Polar Subfrações Compostos 8-24 42-58 Compostos Terpenos/esteróides 140mg 688mg Terpenos/esteróides CC sílica gel
17-59 11-18 41mg 346mg
CC silica gel
Composto D Composto fenólico não identificado
47
FIGURA 04: Fluxograma dos procedimentos cromatográficos da folha de C. brasiliense.
4.2.4 Flores da C. brasiliense
As flores frescas (7,1g) foram maceradas com metanol por sete dias. O extrato foi
concentrado em evaporador rotatório até volume desejado, obtendo-se o extrato metanólico
bruto a uma concentração de 530 mg/mL.
Este extrato foi analisado por CCD, onde utilizou-se vários sistemas de eluentes e
padrões conhecidos para esta espécie de planta, além de reveladores específicos para
determinadas classes de compostos, a fim de comparar o perfil fitoquímico das flores com as
demais partes da planta.
Várias CCDs
Extrato MeOH das flores de C. brasiliense
Comparação de perfil fitoquimico
48
4.3 ATIVIDADE BIOLÓGICA
4.3.1 Atividade antinociceptiva de extratos, frações e compostos puros obtidos da C.
brasiliense
a) Modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6% em
camundongos.
Camundongos “Suíços”(25-35g) foram mantidos sob temperatura controlada (22+
2ºC) e iluminação em ciclo claro-escuro de 12 horas com ração e água ad libitum. Os animais
foram aclimatizados no laboratório por 1 hora antes de começar os testes. A resposta
nociceptiva foi induzida através do ácido acético (0,6%) administrado via intraperitoneal, o
qual promove contorções abdominais seguido de extensão de uma das patas posteriores. Os
animais foram pré-tratados com o extrato bruto, fração polar e apolar (10 mg/Kg) de folhas,
flores, frutos e raízes, sendo administrado por via intraperitoneal 30 minutos antes da injeção
do ácido acético. As frações que apresentaram atividade antinociceptiva significativa, foram
avaliadas com concentrações menores como: (6, 3, 1, 0,5 mg/Kg). O grupo controle recebeu
volume semelhante de uma solução salina (NaCl 0,9%).
Após a injeção do ácido acético, os animais foram colocados em funis de vidro
individuais, o número de contorções abdominais foi quantificado cumulativamente durante
um período de 20 minutos. A atividade antinociceptiva foi então determinada tomando-se
como base a inibição do número de contorções abdominais dos animais pré-tratados,
comparando-os com o número de contorções abdominais dos animais controle (COLLIER et
al., 1968; BENTHLEY et al., 1981; SOUZA et al., 2003).
b)Modelo da dor induzida pela formalina.
Foram utilizados camundongos “Suíços” entre 25-30 g que foram tratados com o
extrato e frações apolar e polar das raízes de C. brasiliense, 30 minutos antes de iniciar o
experimento. Passado o tempo, os animais receberam 20µl de formalina (2,5%) na região
intraplantar da pata posterior direita e o mesmo volume de solução salina na pata esquerda.
Em seguida, os animais foram colocados individualmente dentro de um funil de vidro
ao lado de um espelho para facilitar a observação. Então foi quantificado durante 30 minutos
o tempo que o animal permanece lambendo ou mordendo a pata injetada com formalina,
sendo esse tempo cronometrado cumulativamente e considerado como indicativo de dor. Duas
49
fases de sensibilidade são observadas neste modelo: a primeira fase aparece nos primeiros 5
minutos após a injeção da formalina (dor neurogênica); e a segunda fase entre 15 a 30
minutos após a injeção do agente flogístico (dor inflamatória). Ao final do tempo de
observação os animais foram sacrificados por deslocamento cervical (HUNSKAAR et al.,
1987).
4.3.2 Análise estatística
As análises estatísticas dos resultados foram realizadas por meio de análise de variância
seguida pelo teste de múltipla comparação utilizando-se o método de Dunnett e/ou analise de
variância, quando apropriado. Valores de p < 0,05 ou menos foram considerados como
indicativos de significância.
4.3.3 Atividade antimicrobiana
A avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos e frações de folhas, flores , frutos
e raízes da C. brasiliense, contra fungos e bactérias, foram realizados pelo método de
concentração inibitória mínima (CIM), o qual consiste na diluição do meio, que produz
resultados quantitativos, ou seja a quantidade mínima de agente antimicrobiano necessária
para inibir o crescimento de um microrganismo específico (BARON; FINEGOLD, 1990). Os
valores da CIM foram determinados conforme descrito por WOODS & WASHINGTON
(1995).
Os procedimentos para análise da atividade antimicrobiana foram feitos em frascos de
vidro de 5mL, onde os compostos dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO), foram
adicionados em séries de dez frascos, em diferentes concentrações. Para leveduras e fungos
filamentosos, a cada frasco foi adicionado 1mL do meio agar Sabouraud dextrosado, e para as
bactérias foi adicionado 1mL do meio de cultura agar Mueller-Hinton. Após homogeneização
da mistura e solidificação dos meios de cultura, os microrganismos previamente ativados
foram inoculados nas séries correspondentes, sendo então incubados a 37°C por 24 à 48 horas
para fungos leveduriformes e por 18 à 24 horas a 37°C para as bactérias. Após o período de
incubação foram realizadas leituras da concentração inibitória mínima através da verificação
do crescimento microbiano (SANTOS et al, 2000).
Todos os testes foram realizados em duplicata. Também foram realizados testes com
os solventes utilizados na solubilização dos extratos e frações, a fim de verificar os efeitos
50
destes sobre os microrganismos testados, já que estes não devem interferir na análise
microbiológica.
5.0 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 – INVESTIGAÇÃO FITOQUÍMICA
5.1.1– Raízes de C. brasiliense
A partir do extrato bruto foi realizado o particionamento com clorofórmio e acetona,
sendo que estes apresentaram perfil fitoquímico semelhante e foram reunidos numa só fração
denominada de fração apolar, totalizando 1,160g. O resíduo do extrato metanólico (fração
aquosa após partição) foi denominado de fração polar (2,24g).
As frações foram submetidas a CCD, sendo eluídas com diversos sistemas de eluentes
e reveladas com anisaldeído sulfúrico e cloreto férrico, já que em análises prévias não
revelavam com outros tipos de compostos. A fração apolar apresentou resultados positivos
para terpenos e esteróides quando revelado com anisaldeído sulfúrico, e também para
compostos fenólicos e flavonóides. Já a fração polar, apresentou apenas resultados positivos
quando revelada com cloreto férrico, indicando somente a presença de compostos
fenólicos/flavonóides, sendo que alguns provavelmente são muito glicosilados, devido a
dificuldade para dissolver a amostra e também eluí-la.
Esta análise fitoquímica preliminar realizada através de CCD, é de relevante
importância, pois permite escolher os melhores eluentes para a realização das CC, além de
revelar parcialmente a quantidade de compostos presentes em cada fração ou subfração
analisada (CECHINEL FILHO, YUNES, 1998).
Cromatografou-se 540 mg da fração polar das raízes de C. brasiliense, que renderam
132 subfrações. Estas após analisadas em CCD e conforme o rendimento, foram
recromatografadas a fim de isolar os compostos presentes. No entanto, devido os compostos
interagirem muito com sílica por causa da polaridade, os rendimentos foram baixíssimos,
além de difícil resolução no método cromatográfico utilizado, mesmo quando utilizou-se
Sephadex LH-20, cujo mecanismo de separação é a exclusão de tamanho.
51
A fração apolar das raízes de C. brasiliense (1,6g), foi cromatografada em sílica gel e
eluída com hexano/acetona em diversas proporções, onde obteve-se 120 subfrações, das quais
após analisadas em CCD, algumas foram selecionadas para serem recromatografadas.
A subfração 5-8 (33 mg) quando recromatografada permitiu o isolamento de 16 mg do
composto A, que apresenta-se sob a forma de um pó branco, solúvel em acetona. Através dos
dados espectrais (näo apresentados neste trabalho) verificou-se que tratava-se do triterpeno
friedelina (64).
O
12
34
5
6
7
8910
11
23
1312
1415
16
1718
1920
21
22
24
25 26
27 28
29 30
(64)
Por meio de deslocamentos químicos de RMN-13C/DEPT (espectro desacoplado em
faixa larga e do tipo DEPT 135 e DEPT 90) observados para o composto A e através de
comparação com dados obtidos anteriormente em nossos laboratórios para o composto
(SERAFIN, 2003) foi possível confirmar a estrutura do composto A como friedelina.
52
TABELA 01 . Valores de deslocamentos químicos (δ) de RMN13C/DEPT para o composto A
e dados da literatura para friedelina (SERAFIN, 2003).
C Friedelina Composto
1 22,25 22,26
2 41,48 41,24
3 213,32 213,32
4 58,23 58,16
5 42,09 42,13
6 41,53 41,51
7 18,24 18,20
8 53,12 53,06
9 37,47 37,40
10 59,54 59,42
11 35,65 35,58
12 30,50 30,47
13 39,71 39,22
14 38,22 38,25
15 32,10 32,06
16 36,05 36,9
17 29,99 29,96
18 42,87 42,63
19 35,35 36,01
20 28,14 28,15
21 32,49 32,37
22 39,24 39,27
23 6,75 6,82
24 14,63 14,63
25 17,92 17,93
26 20,12 20,21
27 18,61 18,65
28 31,78 30,47
29 34,98 35,01
53
30 31,71 31,75
O espectro de RMN-1H mostra sinais de absorções de 1,3 a 2,5 ppm referentes aos
metilenos e metinos. Na região de 0,7 a 1,2 ppm existem 8 sinais como referentes às 8 metilas
da molécula (6 sinais como singletes e 2 como dubletes).
A friedelina tem sido extraída de outras plantas e apresentado efeitos biológicos
promissores. Este composto, isolado do extrato metanólico dos rizomas secos de Drynaria
quercifolia mostrou-se muito eficaz quanto a atividade antibacteriana. Há relatos que
atribuem à friedelina atividades antiúlceras estomacais e contra gastrite (CORDEIRO et al.,
1999; RAMESH et al., 2001; RAMESH et al., 2002). A friedelina possui ainda, efeito
antiinflamatório quando administrado via tópica, inclusive para inflamações oculares (YAO;
CHIOU, 1993; SHIMIZU; TOMOO, 1994; DI STASI et al., 1999).
Da subfração 9-48 (128 mg) obtida a partir da fração apolar das raízes, após processo
de cromatografia, isolou-se 3 mg do composto B, que foi identificado como sendo a xantona
1,5-dihidroxi xantona (37), que se apresenta sob a forma de pó amarelo, solúvel em acetona.
O espectro de RMN-1H indicado na figura 07 confirma os sinais referentes a esta
molécula e estão de acordo com os dados reportados na literatura (INUMA et al, 1994;
MARSTON et al, 1994). A seguir são indicadas as atribuições dos sinais de RMN-1H (300
MHz, CDCl3) para o compostos 1,5-dihidroxixantona: 12,66 (s,1H,OH-C1), 7,82 (dd, 1H,
H8), 7,63 (t, 1H, H-3), 7,38 (dd, 1H, H-6), 7,31 (t, 1H, H-7), 6,98 (dd, 1H, H-4), 6,85 (dd, 1H,
H-2).
Conforme estudos in vitro, esta xantona apresenta alguma atividade citotóxica contra
metabólitos das células KB. É inativa contra protease aspártica secretada pela C. albicans
(NKENGFACK et al., 2002). Possui atividade antifúngica contra Cladosporium
cucumerinum, e algum grau de inibição da monoamino oxidase A e B (ROCHA et al., 1994).
O
O OH
HO
2
3
456
7
8 1
(37)
54
FIGURA 05: Espectro de RMN-1H da 1,5-dihidroxixantona.
55
FIGURA 05: Espectro de RMN-1H da 1,5-dihidroxixantona (300MHz, CDCl3)
56
Da subfração 69-87 (148 mg) isolou-se 5 mg do composto C, ou ácido betulínico (70),
após identificação espectroscópica. Este composto apresenta-se sob a forma de pó branco,
solúvel em acetona. Os espectros de IV e RMN-1H são idênticos àqueles do ácido betulínico
previamente isolado em nossos laboratórios da Ipomoea pes-caprae (KROGH, 1999) e não
foram incluídos neste trabalho. A análise por CO-CCD com amostra autëntica de ácido
betulínico e a determinação de seu ponto de fusão (296˚C; lit (KROGH, 1999 = 298-300˚C)
confirmaram a sua estrutura.
Segundo literatura, este triterpeno pentacíclico é um promissor agente anti câncer,
sendo citotóxico contra melanoma. Inibe o crescimento das células e não tem efeito colateral
de diminuição de peso. Induz a apoptose. Ele também possui alguma atividade antiviral
(PISHA et al., 1995). Potente anti-inflamatório e anti malárico in vitro. Possui grande
atividade contra HIV-1 e específica citotoxicidade contra uma variedade de células tumorais
melanoma-derivadas (CICHEWICZ et al., 2004)
HO
COOH
(70)
5.1.2– Frutos da C. brasiliense – perfil fitoquímico
Os frutos da C. brasiliense foram macerados em metanol e particionados com
clorofórmio e acetato de etila, que renderam as frações designadas respectivamente de fração
apolar (300 mg) e fração polar (280 mg).
As frações foram analisadas em CCD e posteriormente submetidas a CC, porém não
houve êxito no isolamento de compostos, devido principalmente ao baixo rendimento das
frações .
57
Estas frações e subfrações foram então comparadas com as folhas, raízes e padrões
conhecidos para esta espécie conforme SILVA et al. (2001), a fim de verificar a composição
química das diferentes partes planta.
Detectou-se que os compostos quercetina (9) e amentoflavona (13), abundantes nas
folhas, não estão presentes nos frutos, e o hiperoside (12) parece estar em baixa concentração.
No entanto, os ácidos gálico (10) e protocatético (11) parecem ser abundantes nos frutos.
Foram comparadas ainda, as frações polares dos frutos e raízes, que segundo os resultados
obtidos em CCD, apresentam composição química distinta.
COOH
OH
OH
HO
COOH
OH
OH
OH
OH
HO O
OR
OH
O
R= Galactosil
(10) (11) (12)
5.1.3- Folhas de C. brasiliense – perfil fitoquímico
As folhas da C. brasiliense foram maceradas com metanol e particionadas com
solventes de polaridade crescente, rendendo as frações: hexano, diclorometano e acetato de
etila. Estas frações tiveram seu perfil fitoquímico analisado por CCD e posteriormente
purificadas em CC de sílica gel, o que permitiu o isolamento de alguns compostos, já
descritos em estudo anterior a este (SILVA et al., 2001).
Devido ao bom rendimento da fração acetato de etila e dos resultados promissores do
“screening” farmacológico, denominou-se esta fração como sendo a fração polar das folhas, a
58
qual passou a ser utilizada para novos estudos fitoquímicos, objetivando isolar compostos
observados em CCD mas que ainda não tinham sido identificados.
Cromatografou-se 5 g da fração polar das folhas em CC de sílica gel, eluída com
clorofórmio/metanol em diferentes proporções, com aumento gradual da polaridade. Esta CC
rendeu 101 subfrações que após analisadas em CCD, foram selecionadas para serem
cromatografadas. As subfrações que após analisadas em CCD, continham os compostos
isolados anteriormente, não foram recromatografadas, pois objetivava-se isolar novos
compostos desta fração. Detectou-se, como no estudo anterior, a presença majoritária de ácido
protocatético, ácido gálico e hiperoside (SILVA et al, 2001).
A subfração 8-24 (140 mg) após cromatografada rendeu a subfração 17-59 (41 mg)
que precisou ser recromatografada a fim de purificar o composto D que foi identificado como
sendo (±)epicatequina (38), através de dados espectroscópicos (RMN- 1H, RMN-13C e IV) em
comparação com dados já publicados (AGRAWAL, 1989; VERDI, 2000). Sua estrutura foi
confirmada pro Co-CCD com uma amostra autêntica. A determinação da rotação óptica
(UFPR) confirmou tratar-se do composto (-)-epicatequina (-18,8º., MeOH).
OHO
OH
OH
OH
OH
(38)
5.1.4- Flores de C. brasiliense – perfil fitoquímico
A investigação fitoquímica das flores da C. brasiliense indicou a presença do ácido
protocatético (11) e epicatequina (38), o último em maiores concentrações. Em menores
59
concentrações estão presentes a quercetina (9) e a amentoflavona (13). Não foram feitas
colunas devido à baixa quantidade de material utilizado, sendo que o extrato apenas foi
comparado por CCD com padrões conhecidos.
COOH
OH
OH
OHO
OH O
OH
OH
OOH
HO O
(10) (13)
OH
OH
HO O
OH
OH
O
OHO
OH
OH
OH
OH
(9) (38)
60
5.2 – ATIVIDADE BIOLÓGICA DE EXTRATOS E FRAÇÕES DE C. brasiliense
5.2.1 Atividade antinociceptiva
A atividade antinociceptiva dos extratos, frações e compostos foram analisados pelo
modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos, e também
pelo modelo de dor induzida pela formalina, para o extrato e frações das raízes, as quais
apresentaram bom resultado antinociceptivo no primeiro modelo. As demais partes não foram
testadas devido ao baixo rendimento, não tendo, desta forma, quantidade suficiente para os
testes.
O modelo de dor induzido pelo ácido acético é um modelo simples de nocicepção, não
específico, mas permite avaliar a atividade antinociceptiva tanto a nível central como
periférico. No modelo de dor induzida pela formalina, avalia-se dois tipos de dor, a dor
neurogênica, que é a estimulação direta dos neurônios nociceptivos, e a dor inflamatória, a
qual é acompanhada por mediadores da inflamação (SOUZA et al., 2003).
O resultado apresentado na figura 06 mostra que o extrato metanólico bruto das flores
reduziu o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos
com relação ao grupo controle, inibindo cerca de 70 + 5,5% as contorções abdominais.
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético via i.p. 10 mg/Kg
0
20
40
60
80
Controle Ex. Bruto
Nú
mer
o d
e co
ntor
ções
**
FIGURA 06: Efeito antinociceptivo do extrato metanólico bruto das flores,
administrado via i.p. em relação às contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
61
camundongos. Cada grupo representa a média de 6 a 8 animais, e as barras verticais, os EPM.
Difere significativamente do controle, ** p < 0,01 e *p < 0,05.
Dos frutos da C. brasiliense, foram testados o extrato bruto e as frações polares e
apolares, sendo todos administrados por via i.p. na dose de 10 mg/Kg (figura 07). Todas as
amostras testadas causaram inibição com relação ao grupo controle nas contorções
abdominais induzidas pela injeção de ácido acético em camundongos, mas a fração polar
inibiu cerca de 89,6 % as contorções abdominais, sendo este valor considerado significativo,
enquanto a fração apolar inibiu 27,36% e o extrato bruto 37% sendo estes valores
considerados não significativos.
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético via i .p. 10 mg/Kg (frutos)
0
10
20
30
40
50
60
70
Controle Ex. Bruto Fr. Polar Fr. Apolar
Núm
ero
de
cont
orç
ões
*
FIGURA 07: Efeito antinociceptivo do extrato e frações dos frutos administrados via
i.p. em relação às contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em camundongos. Cada
grupo representa a média de 6 a 8 animais, e as barras verticais, os EPM. Difere
significativamente do controle, ** p < 0,01 e *p < 0,05.
Assim como as demais partes da planta, as raízes também foram testadas neste
modelo, sendo avaliada a atividade antinociceptiva do extrato e das frações apolares e polares,
utilizando a mesma concentração de amostra (10mg/Kg) via i.p. Todas as amostras inibiram
significativamente a nocicepção causada pelo ácido acético em relação ao grupo controle. Os
62
resultados apresentados na figura 08 mostram que a fração apolar inibiu cerca de 98 + 5,5%
as contorções, enquanto a fração polar inibiu 81 + 8% e o extrato bruto 80 + 3,5%.
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético via i.p. 10 mg/Kg
0
10
20
30
40
50
controle ex bruto fr polar fr apolar
Nú
me
ro d
e c
on
torç
ões
** **
**
Figura 08: Efeito antinociceptivo das raízes (extrato bruto, fração polar e apolar) numa
concentração de 10 mg/Kg administrados via i.p. em relação às contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético em camundongos. Cada grupo representa a média de 6 a 8
animais, e as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, ** p < 0,01 e
*p < 0,05.
Comparando os resultados demonstrados acima, observa-se que todas as partes da
planta apresentaram atividade antinociceptiva significativa, principalmente as frações polares
testadas demonstrando que provavelmente os componentes responsáveis pela atividade
observada deve-se a presença de compostos polares como ácidos fenólicos e flavonóides,
abundantes na C. brasiliense.
Devido ao excelente desempenho em relação à atividade antinociceptiva demonstrado
pelas frações das raízes de C. brasiliense, estas foram testadas no mesmo modelo, mas em
concentrações menores, a fim de verificar além de sua eficácia, também a sua potência.
Assim, a figura 09 mostra o efeito antinociceptivo da fração polar, nas concentrações de 3, 1 e
0,5 mg/Kg administrados por via i.p., onde as inibições da nocicepção foram de 61,34%,
48,9% e 45,14% respectivamente, sendo este último valor não significativo. Os compostos
63
apontam um decréscimo gradual da atividade conforme a diminuição da dose, ou seja, o efeito
antinociceptivo demonstra-se dose-dependente.
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético via i.p. fração polar (raízes)
010203040
50607080
Controle 3,0 mg/Kg 1,0mg/Kg 0,5 mg/Kg
Nú
me
ro d
e c
on
torç
õe
s
**
*
FIGURA 09: Efeito antinociceptivo da fração polar das raízes nas concentrações de
3,0; 1,0 e 0,5 mg/Kg, administrados via i.p. em relação às contorções abdominais do grupo
controle, induzidas pelo ácido acético em camundongos. Cada grupo representa a média de 6
a 8 animais, e as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, ** p < 0,01
e *p < 0,05.
Da mesma forma foi avaliada a fração apolar das raízes nas doses de 6,0 e 3,0 mg/Kg
administrados por vi ai.p., onde as inibições da nocicepção foram de 28,6 e 18%
respectivamente sendo estes valores considerados não significativos. Os resultados estão
demonstrados na figura 10.
64
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético via i .p. fração apolar (raízes)
0
10
20
3040
50
60
70
80
Controle 3mg/Kg 6mg/Kg
Nú
me
ro d
e c
on
torç
õe
s
FIGURA 10: Efeito antinociceptivo da fração apolar das raízes nas concentrações de
6,0 e 3,0mg/Kg, administrados via i.p. em relação às contorções abdominais do grupo
controle, induzidas pelo ácido acético em camundongos. Cada grupo representa a média de 6
a 8 animais, e as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, ** p < 0,01
e *p < 0,05.
Assim, embora a fração apolar seja mais eficaz, a fração polar foi bem mais potente,
com DI50 em torno de 1mg/Kg, sendo cerca de 25 vezes mais ativo do que a aspirina e o
paracetamol, fármacos amplamente usados na clínica como analgésicos.
Testou-se ainda, alguns compostos isolados da fração apolar das raízes, como a
friedelina e 1,5-dihidroxi xantona, bem como a epicatequina, isolada da fração polar das
folhas, no modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. A atividade da
epicatequina está representada na figura 11, onde pode-se observar que ocorreu uma inibição
de 70% da nocicepção em relação ao grupo controle, demonstrando que o composto isolado
foi mais ativo que o extrato bruto, provavelmente pela complexidade de compostos presentes
no extrato que podem estar interferindo na ação do composto e, talvez de outros que poderiam
também auxiliar a ação da epicatequina. Por isso, a importância em testar as frações e não
somente o extrato, pois estas são uma semi-purificação dos compostos pela diferença de
polaridade.
65
Contorções abdominais induzidas pelo ácido acético via i.p. 10mg/Kg
01020
30405060
7080
Controle Epicatequina
Nú
mer
o d
e co
nto
rçõe
s
**
FIGURA 11: Efeito antinociceptivo da epicatequina, na dose de 10 mg/Kg,
administrada via i.p. em relação às contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e as barras verticais, os EPM.
Difere significativamente do controle, ** p < 0,01 e *p < 0,05.
Os resultados farmacológicos obtidos demonstram claramente que as raízes exibiram
atividade antinociceptiva mais pronunciada no modelo das contorções abdominais induzidas
pelo ácido acético (10mg/Kg i.p.) causando inibição de 80+3,5% enquanto fármacos de
referência como acetaminifeno e ácido acetil salicílico inibem 38+1 e 35+2%
respectivamente, no mesmo modelo e dose. As flores e frutos também exibiram notável
atividade, mas não foram estudas em detalhes devido ao baixo rendimento evidenciado.
Os compostos friedelina e 1,5-dihidroxixantona, quando administrados
intraperitonialmente, causaram inibição dose-dependente das contorções abdominais (figuras
12 e 13) e foram mais potentes que fármacos de referência, como a 1,5-dihidroxixantona que
foi de 4 a 5 vezes mais ativa.
66
FIGURA 12: Efeito antinociceptivo da friedelina, nas doses de 3, 6 e 10 mg/Kg,
administradas via i.p. em relação às contorções abdominais induzidas pelo ácido acético em
camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e as barras verticais, os EPM.
Difere significativamente do controle, ** p < 0,01 e *p < 0,05.
Figura 13: Efeito antinociceptivo da 1,5-dihidroxixantona, nas doses de 6, 8 e 10
mg/Kg, administrada via i.p. em relação às contorções abdominais induzidas pelo ácido
acético em camundongos. Cada grupo representa a média de 5 a 7 animais, e as barras
verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, ** p < 0,01 e *p < 0,05.
67
TABELA 02 : Comparação da inibição da ação nociceptiva ou DI50 quando for o caso,
dos extratos brutos de flores, frutos, raízes e frações das raízes, além dos compostos friedelina
e 1,5 dihidroxixantona, em relação aos medicamentos aspirina e acetaminofeno, na dose de 10
mg/Kg via i.p. no modelo de dor induzida pelo ácido acético em camundongos.
a Dado retirado de Bresciani et al., 2003. ND= Não determinado
** p < 0,01 e *p < 0,05
Como as raízes da C. brasiliense foram as mais ativas no modelo de dor induzida pelo
ácido acético, o extrato bruto e as frações polar e apolar foram testadas no modelo de dor
induzida pela formalina. O resultado apresentado na figura 14 e tabela 03, teste da formalina,
mostra que o extrato bruto foi mais efetivo na segunda fase da dor (dor de origem
inflamatória) com 87 + 3,5% de inibição, enquanto que na primeira fase a inibição foi de 14 +
3,5% . Ambas frações, polar e apolar, também foram mais efetivas na segunda fase da dor
induzida pela formalina, sendo que a fração polar inibiu cerca de 90% o tempo de latência e a
fração apolar inibiu 76 + 8%. Na primeira fase da dor, pode-se afirmar que as amostras
testadas foram inativas com relação ao grupo controle.
Ácido acético (ip) Inibição (%) DI50 (µmol/Kg)
Ext. bruto flores
Ext.bruto frutos
Ext. bruto raízes
Fr. polar raízes
Fr. apolar raízes
Friedelina
1,5-dihidroxixantona
Aspirina a
Acetaminofen a
70.0 + 5.5 **
65.0+ 2.5 **
80.0 + 3.5 **
81.0 +8.0 **
98.5+ 5.5 **
84.4 + 3.6 **
94.0 + 2.2 **
35.0 + 2.0 *
38.0 + 1.0 *
ND
ND
ND
ND
ND
12.0 (10-14.5)
30.0 (27- 32)
133.0 (73-247)
125.0 (140-240)
68
Efeito antinociceptivo em re lação a primeira fase da dor induzida pela
formalina
0
50
100
150
Controle Ex.Bruto
F. Polar F.Apolar
Tem
po d
e re
açã
o
Efeito antinociceptivo em relação a segunda fase da dor induzida pela
formalina
050
100150200250300
Controle Ex.Bruto
F. Polar F.Apolar
Tem
po d
e re
açã
o
****
FIGURA 14: Efeito antinociceptivo causado pelo extrato metanólico bruto e frações
apolares e polares das raízes, na dose de 10 mg/Kg, administrado via i.p. em relação à
primeira e segunda fase da dor induzidas pela formalina. Cada grupo representa a média de 6
a 8 animais, e as barras verticais, os EPM. Difere significativamente do controle, ** p < 0,01
e *p < 0,05.
TABELA 03 : Atividade antinociceptiva do extrato metanólico bruto, fração apolar,
ácido acetil salicílico (aspirina) e indometacina no modelo de dor induzida pela formalina via
i.p. na dose de 10 mg/Kg
Formalina (i.p.) 1ª Fase IM (%) 2ª Fase IM (%)
Ext. bruto raízes
Fr. Apolar raízes
Aspirinaa
Indometacinaa
14.0 ± 3,5
Inativo
Inativo
Inativo
87.0 ± 3,5 **
76,2 ± 8,0 **
39,0 ± 4,0 *
33,0 ± 5,0 *
a Dado extraído de Bresciani et al, 2003.
** p < 0,01 e *p < 0,05
No teste da formalina, tanto o extrato metanólico bruto como a fração apolar, inibiram
significativamente apenas a segunda fase da dor (inflamatória). Fármacos antiinflamatórios e
analgésicos como ácido acetil salicílico e indometacina exibem resultado similar, porém
menos ativos que os obtidos com a C. brasiliense.
O ácido betulínico não foi incluído neste estudo devido a estudos prévios terem demonstrado atividade antinociceptiva quando isolado da Ipomoea pés-caprae (KROGH et al., 1999).
69
5.2.2 Atividade antimicrobiana
Os testes para avaliar a atividade antibacteriana das diferentes partes da planta foram
feitos através da verificação da CIM (µg/mL) e os resultados estão demonstrados na tabela
04.
TABELA 04 : Atividade antibacteriana dos extratos para as diferentes partes da C.
brasiliense contra bactérias gram-positivas, expressadas como concentração inibitória mínima
(CIM).
Material testado CIM (µg/ml)
B.c. S.a. S.s S.ag. Extrato bruto das raízes >1000 300 900 >1000 Extrato bruto dos galhos >1000 >1000 >1000 >1000 Extrato bruto folhas 900 300 500 700 Extrato bruto das flores 300 200 800 1000 Extrato bruto dos frutos >1000 >1000 >1000 >1000 Vancomicina 0,7 2 2 0,8
Bacillus cereus (B.c.); Staphylococcus aureus (S.a.); Staphylococcus saprophyticus (S.s.); Streptococcus
agalactiae (S.ag.).
Extratos com valores de CIM menores que 100µg/ml foram considerados com boa
atividade antimicrobiana, enquanto CIM com valores entre 100 e 500 µg/ml foram
considerados moderadamente ativos, 500 a 1000 µg/ml foram considerados inativos.
Os resultados indicam que bactérias gram-positivas são inibidas seletivamente pelos
componentes da C. brasiliense. O modelo da seletividade química para bactérias gram-
positivas não é restrito aos compostos desta planta, mas é um fenômeno geral observado na
maioria dos antibióticos.
No entanto, cabe ressaltar que em relação à atividade antibacteriana, S. aureus foi o
microorganismo mais sensível aos extratos.
Nenhuma atividade foi observada contra bactérias gram-negativas (Enterobacter
cloacae, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa e Salmonella
typhymurium) e fungos (Candida albicans e Candida tropicalis).
Parte destes resultados estarão sendo publicados em breve no periódico Z. Naturforsch
(Pretto et al; in press- 2004). Outros resultados mais detalhados serão descritos oportunamente
em outra Dissertação de Mestrado desenvolvida pela aluna Juliana Pretto, que gentilmente
70
cedeu parte dos resultados obtidos para que pudéssemos demonstrar o potencial
antimicrobiano desta planta.
71
6.0 CONCLUSÕES
Os estudos químicos e biológicos realizados com a espécie Calophyllum brasiliense
permitem as seguintes conclusões:
a) Da fração clorofórmica obtida a partir do extrato metanólico bruto das raízes foram
obtidos três compostos, descritos pela primeira vez nesta planta, denominados
friedelina, 1,5-dihidroxi xantona e ácido betulínico.
b) Da fração apolar oriunda do extrato metanólico bruto dos frutos foi possível observar
a presença do hiperosideo em pequenas quantidades, ácido gálico e protocatético em
altas concentrações. Observou-se ainda que os compostos existentes nos frutos são
diferentes dos existentes nas raízes.
c) Da fração acetato de etila obtida a partir do extrato metanólico bruto das folhas foi
possível obter a (-) epicatechina que ainda não havia sido isolada em estudos prévios
com esta fração.
d) Nos estudos biológicos verificou-se que as raízes exibiram atividade antinociceptiva
mais pronunciada no modelo das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético
na dose de 10 mg/Kg com uma inibição de 80% sendo mais ativa que a aspirina e
acetominofeno, que inibem cerca de 38% e 35% respectivamente, no mesmo modelo e
dose. Este resultado confirmou-se no modelo da formalina, na mesma via e dose,
sendo efetivo na segunda fase da dor (inflamatória).
e) Os compostos isolados friedelina e 1,5-dihidroxixantona mostraram atividade
antinociceptiva, causando inibição dose-dependente nas contorções abdominais
induzidas pelo ácido acético e foram 4 a 5 vezes mais ativos que fármacos de
referência. A (-) – epicatechina, na mesma via e dose, mostrou inibição de 70% nas
contorções abdominais.
72
f) Do extrato bruto das flores foi possível verificar a presença do ácido protocatético e (-)
– epicatechina.
g) Atividades antimicrobianas demonstrando para os diferentes órgãos da planta
importante potencial antibacteriano e antifúngico contra microorganismos patogênicos
aos seres humanos, justificando seu uso na medicina popular.
73
7.0 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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79
ANEXO A – Cópia da “proof”de artigo aceito para publicação no periódico Die Pharmazie.
80
81
82
83
ANEXO B- Cópia da “proof” de artigo aceito para publicação no periódico Naturforsch.