isolamento e identificaÇÃo de leveduras … · quando um nome lhe fora dado. nome do pai. claro,...

LEONARDO DO NASCIMENTO ROLIM

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS PRESENTES EM

FRUTOS TROPICAIS E PERFIL ELETROFORÉTICO DE

SUPERÓXIDO DISMUTASE

Recife 2003

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA





Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Genética da UFPE para obtenção

do título de Mestre em Genética.

Orientador: Dr. José Ferreira dos Santos

Recife

2003





Dissertação Apresentada em ____ / ____ / ____

Banca Examinadora da Dissertação:

Dr. José Ferreira dos Santos

(Orientador)

Dr. Marcos José Correia

(Titular Externo)

Dra. Elza Áurea de Luna Alves Lima

(Titular Interno)

Dr. Marcos Antônio de Morais Junior

(Titular Interno)

Dra. Neiva Tinti de Oliveira

(Suplente Externo)

Dra. Janete Magali de Araújo

(Suplente Interno)

"Diga-lhe que não há jornada que o homem não possa

empreender. Nada há que o homem não possa fazer; nem

desertos que não possa atravessar, nem montanhas que não

possa subir, se puser nisso alma e vontade. O essencial é

contarmos a vida por coisa nenhuma, alegres prontos a

conservá-la ou perdê-la, segundo Deus ordenar."

(O Barão Curtis, em As Minas do Rei Salomão, de Henry Rider

Haggard)

“Se você pensa que pode ou sonha que pode, comece. Uma

jornada de mil milhas inicia-se com o primeiro passo. A

diferença entre o possível e o impossível está na determinação

de cada um. Sabem o que é impossível? É aquilo que ninguém

fez até que alguém o faça.”

(Goethe)

"Por mais penoso que seja, estamos sempre fazendo escolhas.

Parte delas para serem perdidas e outra parte para serem

conquistadas. Tudo não passa de uma grande troca equilibrada

entre sacrifícios e benefícios. Entretanto, às vezes, é melhor

desconhecer do que saber as perdas e os ganhos, pois por mais

que se ganhe, nunca nós aceitamos bem as perdas. Vivemos

com elas pelo resto de nossas vidas como uma maldição."

(Sérgio Roberto Costa Campos)

Dedico este trabalho a todas as pessoas

importantes da minha vida.

Texto para reflexão

PINÓQUIO (Rubem Alves)

Prometi e fiquei devedor. Disse antes que era um dever de honestidade contar a

história do Pinóquio às avessas. Depois de muito pensar, concluí que honestidade é pouco. É

bondade que devemos às crianças. É preciso quebrar o feitiço das histórias que se repetem...

Um bonequinho tão inofensivo... Mas já se tornou hóspede da imaginação dos meninos, e vai

repetindo suavemente aquelas lições que dizem que quem não vai à escola não chega a ser

humano. Claro que há pessoas que se metamorfoseiam em burros, havendo aquelas que

alcançam a dignidade de mulas-sem-cabeça. O que é duvidoso é que o agente de tão

dramática transformação seja a falta de escola. As evidências indicam a falsidade da hipótese:

Na verdade, são as crianças de carne e osso que entram, para sair transformadas em bonecos

de pau...

Assim, peço licença ao leitor acostumado ao sisudo discurso da Ciência. Quero brincar

de Levis Carrol. Entrar de mãos dadas com Alice, espelho a dentro, onde tudo acontece às

avessas. Há uma magia nas imagens invertidas. Parece que, para se ver bem o real, é

necessário pôr os óculos da fantasia. E assim começa a história às avessas...

Era uma vez um menininho de carne e osso, igual a tantos, que se deleitava nas coisas

simples que a vida dá. Ria nos seus mundos de faz-de-conta, voava nas asas dos pássaros,

assustava os peixes, nariz achatado nos vidros dos aquários, assobiava para os perus, andava

na chuva – todas estas coisas que as crianças fazem e que os adultos desejam fazer, e não

fazem por vergonha. Sua vida corria feliz por cima do desejo.

Não sabia que uma conspiração estava em andamento. Tudo começara bem antes,

quando um nome lhe fora dado. Nome do pai. Claro, confissão de intenções: Que o menino

sem nome e sem desejos aceitasse como seus o nome e os desejos de um outro que ele nem

mesmo conhecia. Filho, extensão do pai, realização de desejos não realizados, sobrevivência

do seu corpo, uma pitada de onipotência, uma gota de imortalidade.

“Que vai ser quando crescer? Médico? Diplomata? Cientista?”

E as conversas se prolongavam, temperadas com sorrisos e boas intenções, enquanto

silenciosas se teciam as malhas do desejo em que pai e mãe esperavam

colher/acolher/encolher o menino dos desejos simples...

Até o dia em que lhe foi dito:

– É preciso ir para a escola. Todos os meninos vão. Para se transformarem em gente.

Deixar as coisas de criança. Em cada criança brincante dorme um adulto produtivo. É preciso

que o adulto produtivo devore a criança inútil.

E assim aconteceu. Há certos golpes do destino contra os quais é inútil lutar.

O menino de carne e osso aprendeu coisas curiosas: Nome de heróis, frases que teriam

dito, as alturas dos montes onde nunca subiria, as funduras de mares onde nunca desceria, a

distância de galáxias, o “se” partícula apassivadora, o “se”, símbolo de indeterminação do

sujeito, nomes de cidades de países longínquos, suas populações e riquezas, fórmulas e mais

fórmulas...

Sabia que tudo aquilo deveria ter um motivo. Só que ele não entendia. O desejo

permanecia selvagem. E disto eram prova aquelas notas vermelhas no boletim, testemunha de

como o menino cavalgava longe dos desejos dos outros, conspiradores secretos, escondidos

na monotonia dos currículos que não faziam o seu corpo sorrir...

– Para que serve tudo isto? – ele perguntava.

– Um dia você saberá. – o pai respondia sábio e paciente – Por hora, basta saber que

papai sabe o que é melhor para seu filho...

O menino cresceu. E aconteceu que, em meio às rotinas, veio a se encontrar com dois

cavalheiros bem vestidos e de fala branda, que se puseram a contar histórias de um mundo

encantado sobre o qual ele nunca ouvira falar. Eles disseram de heróis em aventais brancos,

cavalgando microscópios e telescópios, brandindo máquinas fantásticas e aparelhos

misteriosos, em meio a líquidos mágicos que fazem viver e morrer, encastelados em templos

onde as coisas invisíveis ficavam visíveis, e lhe disseram de prodígios de verdade, e lhe

perguntaram se ele não desejava se transformar num mago, num artista... A recompensa? O

poder, o conhecimento de segredos que ninguém conhece, a glória, ser olhado por todos como

um ser diferente, sublime, superior. Se os seus prodígios fossem maior do que os de todos, ele

poderia aparecer no palco supremo da Ciência, em país distante, onde os mortais se revestem

de imortalidade...

O menino grande se lembrou dos sonhos do menino pequeno. E sorriu. Finalmente

chegara o momento de sua realização. Estranhou que os narizes dos respeitáveis cavalheiros

tivessem crescido enquanto falavam. Mas logo o tranqüilizaram:

– É só para te cheirar melhor, meu filho...

Começaram as transformações. Primeiro os olhos: Já não refletiam outros olhares e

nem borboletas... perderam o tom sonhador... aprenderam a concentração, a disciplina. Depois

o corpo, que desaprendeu a dança, o vôo dos papagaios e o brinquedo. Era necessário dedicar-

se totalmente. Os pensamentos abandonaram as fantasias e os contos-de-fadas. Passaram a

morar no mundo das fórmulas e dos experimentos. Até o prazer da comida se satisfez com os

sanduíches rápidos do almoço, e na cama o corpo se esqueceu do corpo...

E aprendeu coisas preciosas. Que o corpo do cientista é neutro. Que ele não se comove

por considerações de valor ou prazer. Que está acima da vida e da morte (tais valores são

coisas de políticos, militares e clérigos), em dedicação total ao saber. Bastava-lhe ser um

devotado servidor do progresso da Ciência.

Mas, tantos sacrifícios acabaram por receber merecida recompensa. A sorte soprou,

favorável, e de seu corpo diferente surgiu uma nova magia, e o palco da imortalidade lhe foi

aberto. Lá, perante todos, compreendeu que valera a pena. Duas lágrimas lhe rolaram pela

face.

Já não era o menino de outrora, carne e osso. Crescera. Estava diferente. Os aplausos

de madeira enchiam a sala. Era a glória. E foi então que o milagre aconteceu. O recinto se

encheu de suave luminosidade, e a Mosca Azul, que até então só habitara seus sonhos, veio de

longe e roçou seu rosto com suas asas. E a grande transformação aconteceu. Era um boneco

de madeira, inteligência pura, sem coração, sem fantasias, sem inocência. E os milhares de

bonecos, iguais, de pé, não paravam de tamanquear os seus aplausos ao novo irmão, enquanto

gritavam o seu nome:

– PINÓQUIO, PINÓQUIO, PINÓQUIO!!!!

viii

Agradecimentos

A Deus, pela força que me deu nos momentos em que fraquejei, por me fazer entender

que a vida é o mais maravilhoso dos dons, por ter colocado no meu caminho pessoas

maravilhosas, por ter me dado momentos felizes que me fizeram sorrir e momentos difíceis

que fortificaram minha alma. E por ser o velhinho mais bem-humorado que já conheci

(embora eu mesmo, às vezes, fique sem entender Suas piadas).

Aos meus pais, José Valdir Rolim e Severina M. do Nascimento Rolim, por serem

aqueles com quem eu sempre posso contar. Por tudo que já fizeram por mim e por tudo que

ainda fazem. Espero sinceramente fazer jus a todos os votos de esperança que em mim foram

depositados.

Aos meus irmãos, Daniel e Creuza Frinéia, por terem aprendido a me suportar durante

todos esses anos (e em especial aos anos do meu Mestrado). Obrigado também por todo o

apoio (moral e emocional) que me deram. Meu eterno agradecimento.

À minha tia Maria Diva Rolim de Souza, que, mesmo de tão longe, nunca deixou de

acompanhar minha peregrinação acadêmica. Obrigado por toda a ajuda que me deu, tia.

À Cíntia Gomes de Freitas, minha fofinha, por estar sempre ao meu lado, por ser a luz

da minha vida, por ser uma companheira sem igual e por me fazer ver a vida com novas cores.

Gostaria de escrever muito mais, mas acho que posso resumir tudo citando um trecho da

musica “She”, de Elvis Costelo: “Ela talvez seja a razão pela qual sobrevivo. O porquê e o

para quê pelos quais estou vivo. Aquela por quem me importarei nos bons e maus momentos.

Eu, eu tomarei seu sorriso e suas lágrimas e farei deles todos meus souvenires, pois onde ela

for eu tenho de estar. O propósito de minha vida é ela, ela, ela...”. Amo você, minha fadinha.

À Universidade Federal de Pernambuco pela oportunidade da realização do Curso de

Pós-Graduação em Genética.

Ao meu orientador, Dr. José Ferreira dos Santos, e à Dra. Tania Tassinari Rieger pelo

convívio e por todos os ensinamentos teóricos e práticos dos quais certamente jamais

esquecerei.

ix

Ao Sérgio “Coveiro” Roberto Costa Campos, pelo convívio amigo no Laboratório ao

longo desses anos, por ter uma personalidade esplêndida, que me inspirou em muitos

momentos de minha vida, por todas as conversas que me fizeram amadurecer bastante, pelos

jogos de RPG e pelos livros emprestados, que serviram em muito para aumentar meu gosto

pela leitura. Considero você mais do que um amigo, Coveiro. Na verdade, eu o tenho como

um irmão.

À Sandra Vasconcelos que, embora tenhamos tido muitas brigas e discussões no inicio

de nosso convívio no Laboratório, acabamos nos tornando bons amigos. Foi tudo uma questão

de tempo e de conversas bem divertidas. Agradeço também pelos materiais e equipamentos

que você me forneceu, pois sem eles eu não teria terminado minha Dissertação. Muito

obrigado, Sandy.

Ao Pierre Félix e a Hélio “Lobão” Fernandes pelo convívio alegre no laboratório que

certamente tornou a rotina diária algo muito divertido. Obrigado também pelo conhecimento

trocado e pelas lições de vida, que contribuíram para o amadurecimento de meu caráter.

Valeu!

À Isis Amorim, Dani e Andreza (as Panteras) pelos risos e piadas que foram

divertidíssimos ao longo desses anos.

Ao Bruno Machado Leão, Denis e Dona Yrani Machado, por todo o companheirismo

e carinho que tiveram comigo ao longo de todos esses anos. Considero vocês a minha segunda

família.

Ao Alexandre Bezerra de Carvalho, por ser uma excelente pessoa e por estar sempre

alegre, vendo a vida com otimismo e ânimo. Desejo sucesso na sua carreira profissional e que

continuemos a ser bons amigos.

Ao Amaro Castro, pelo companheirismo e pela troca de idéias que certamente poderão

ser muito úteis tanto no agora como no futuro.

x

Aos “Encouraçados da Federal”: Alexandre Bezerra, Augusto Santiago, Cláudio

Cazal, Marliete Soares, Cléo Leite, Demétrius Lucas, Aline Rendal, Sérgio Xavier, André

Mauricio, Ana Virgínia, Karina Linhares, Yasodhara Lacerda, Sérgio Alves, Conceição de

Paula, Flavia Carolina, Paulo Germano, Isabella Wanderley e todos os outros que foram da

minha turma original de Biológicas, por todos os momentos inesquecíveis pelos quais

passamos. Quantas batalhas, não, galera?

Ao Luiz Rodrigo Gazzaneo, Cleiton Bispo, Rochele Castelo Branco, Débora Suzuki,

Walter Junior, Keila, Juliana, Paloma e todos os outros novos biólogos, pela convivência

alegre e por toda a diversão que já compartilhamos.

Um agradecimento especial aos autores e participantes do livro “Delírios”: Sergio,

Cíntia, Rodrigo, Cleiton, Débora, Rochele e Juliana, por terem, ainda que sem saber, realizado

um antigo sonho meu de escrever um livro de terror.

Aos Antigos, aos Mistérios do Universo, aos Que Observam e aos diferentes aspectos

da minha personalidade: Não poderia deixar de lembrar de vocês neste momento, uma vez

que estiveram comigo, me auxiliando e me dando dores de cabeça, por todos esses anos em

que estou aqui, neste mundo. Apenas para vocês: Fea muape davospade olquilpe duseu. Ó

muape suam vavos iqua ribolde do cearir quo ialdi orpie tes vas. Vino i toli refsos tes inge quo

ialdi via icelpocos? Ortose orpis cumtsalde mou teton i celpolpe.

A todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho,

pelas muitas alegrias, companheirismo, solidariedade e por todos os ótimos momentos que

passamos juntos e que deixarão saudades.

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS...........................................................................................................viii

RESUMO.................................................................................................................................12

1. INTRODUÇÃO...................................................................................................................13

2. OBJETIVOS........................................................................................................................15

3. REVISÃO DA LITERATURA...........................................................................................16

3.1. As leveduras e sua utilização na biotecnologia....................................................16

3.2. As leveduras nas frutas.........................................................................................18

3.3. A enzima superóxido dismutase...........................................................................19

3.4. Genes para SOD...................................................................................................23

3.4.1. SOD1......................................................................................................24

3.4.2. SOD2......................................................................................................25

3.4.3. SOD3......................................................................................................26

4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................................28

5. ARTIGO CIENTÍFICO

Isolamento e identificação de leveduras presentes em frutos e perfil

eletroforético de Superóxido Dismutase ..

Resumo .......................................................................................................................45

.............................................................................43

Introdução ...................................................................................................................46

Metodologia ................................................................................................................48

Resultados ...................................................................................................................51

Discussão ....................................................................................................................56

Abstract........................................................................................................................59

Referências ..................................................................................................................60

6. CONCLUSÕES ...................................................................................................................68

7. ABSTRACT ........................................................................................................................69

Rolim, L. N. Isolamento e identificação de leveduras e perfil de SOD 12

RESUMO

Leveduras são microrganismos unicelulares eucariontes conhecidos por sua

capacidade de fermentar substratos dos quais precisam obter energia. Na natureza são os

contaminantes mais comuns de frutos, gerando prejuízos para indústrias do setor. Por outro

lado, estes microrganismos são bioferramentas muito utilizadas em estudos científicos e com

fins industriais. Assim como os demais organismos aeróbicos, as leveduras usam a enzima

superóxido dismutase (SOD) como defesa contra os efeitos oxidativos nocivos causados pelos

radicais livres. Esta ação antioxidante dos microrganismos produtores é o motivo que desperta

interesse na indústria. Este trabalho teve como objetivo isolar e identificar leveduras

encontradas em frutos e comparar a expressão da SOD. Foram obtidos 472 isolados de

leveduras de amostras de frutos de acerola (Malpighia glabra), de Olinda e Jaboatão dos

Guararapes, e de gogóia (Solanum sp.) do Parque Dois Irmãos, localidades da Região

Metropolitana do Recife (PE – Brasil). Foram identificados taxonomicamente 49 isolados,

que revelou a presença de oito gêneros: Saccharomycodes (36,73%), Kloeckera (24,49%),

Schizoblastosporion (16,32%), Brettanomyces (12,24%), Nadsonia (4,08%), Coccidiascus

(2,04%), Dekkera (2,04%) e Saccharomycopsis (2,04%). O perfil da CuZnSOD destas

leveduras foi estabelecido por eletroforese nativa em gel de amido, revelando uma diversidade

significativa desta enzima entre os gêneros. Além disso, o padrão da CuZnSOD foi

diagnóstico para os gêneros Saccharomycodes, Coccidiascus, Schizoblastosporion e

Saccharomycopsis. Este estudo inicia a caracterização da SOD destes gêneros, contribuindo

para a exploração fisiológica destes microrganismos em estudos posteriores.

Rolim, L. N. Isolamento e identificação de leveduras e perfil de SOD

1. INTRODUÇÃO

A biotecnologia é um dos processos mais antigos de domínio do homem sobre a

natureza e correspondeu, até o século XIX, às práticas empíricas de cruzamento e seleção de

animais e vegetais, além do uso de fermentação para a preservação e enriquecimento de

alimentos. Hoje a biotecnologia busca aproveitar a diversidade das enzimas, outras proteínas e

subprodutos para beneficiar o homem, utilizando organismos e/ou microrganismos

específicos e eficientes para elaborar diferentes produtos. Dentre os vários microrganismos, as

leveduras estão entre os mais versáteis para estudos e utilização industrial.

As leveduras são microrganismos eucariontes unicelulares, dependentes de carbono

orgânico como fonte de energia, encontradas em associação com vegetais, húmus ou

quaisquer substratos que forneçam açúcar. Existem diversos aspectos relevantes que tornam

as leveduras importante objeto de estudo. Algumas espécies podem causar doenças em

animais e plantas enquanto outros gêneros são biodegradadores de produtos naturais (frutas,

leite, carnes) ou utilizados industrialmente na produção de vinhos, papel, pão, queijo entre

outros. Dentre todas as leveduras, a Saccharomyces cerevisiae é o microrganismo eucarionte

mais bem estudado, servindo de modelo para diversas análises e estudos.

Atualmente, além do desenvolvimento de linhagens com fins industriais, capazes de

metabolizar lactose, inulina, pectina e outros substratos, melhorias nos sistemas de expressão

gênica das leveduras estão sendo estudadas. Alterações genéticas estão sendo testadas para

que leveduras sejam capazes de degradar dejetos orgânicos industriais, gerando compostos

ricos em proteínas e açúcares, que poderão ser reutilizados em rações animais e outras

aplicações.

Na natureza, as leveduras são os contaminantes mais comuns das frutas, representando

um grande problema para as indústrias que trabalham com esse alimento. O baixo pH e alta

concentração de açúcar nas frutas favorecem o crescimento destes microrganismos, e,


conseqüentemente, causam a deterioração do produto. Os açúcares e ácidos orgânicos das

frutas as tornam excelente substrato para o crescimento de leveduras, podendo dar uma vida

útil relativamente curta ao alimento. Diversos métodos são utilizados para diferenciar a flora

de leveduras presente nos frutos, com o intuito não só de conhecer melhor a diversidade, mas

também de se buscar ferramentas biotecnológicas potenciais.

As leveduras, assim como quaisquer organismos aeróbicos, sempre enfrentam

problemas causados pelos efeitos tóxicos das Espécies Reativas de Oxigênio (ERO). Essas

moléculas são geradas por processos celulares normais, tais como o metabolismo respiratório

e a assimilação de nutrientes por parte da célula, ou por exposição às condições de estresse. A

enzima Superóxido Dismutase (SOD) é a primeira e a mais importante linha de defesa contra

os efeitos oxidativos provocados pelas ERO, particularmente o radical superóxido (O2- ).

Assim como em diversos eucariontes, as leveduras contêm três isoformas de SOD, a

CuZnSOD (produto do gene SOD1) no citosol, a MnSOD (produto do gene SOD2) na matriz

mitocondrial e ECSOD (produto do gene SOD3) localizada no meio extra-celular.

A enzima SOD tem despertado crescente interesse biotecnológico, devido ao seu

emprego como probiótico antioxidante, na prevenção de efeitos de radicais livres no processo

de envelhecimento e na fabricação de cosméticos protetores da pele. Além disso, é de grande

importância como agente antiinflamatório, no tratamento de artrites, e como protetora contra

os efeitos de radiação ionizante. Em leveduras, a SOD age como importante antioxidante

principalmente em fase estacionária de crescimento, na qual é requerida para assegurar a

sobrevivência celular depois de prolongada exposição às condições onde a replicação não é

permitida e onde envelhecimento ocorre, nestes organismos.

A caracterização da SOD de leveduras é de grande interesse biotecnológico, uma vez

que a variabilidade molecular desta enzima pode promover intensa diversidade na intensidade

e atuação de sua função, dependendo de qual organismo a esteja utilizando. Na natureza

podem existir diversas leveduras com potencial para aplicações biotecnológicas. Uma vez que


a maioria das leveduras utilizadas em estudos científicos são de origem européia, o

isolamento de linhagens potenciais em solo brasileiro pode ser de grande interesse econômico,

pois podem levar ao isolamento de enzimas e outros produtos com melhores característica

para aplicação médica, cientifica e econômica. Desta forma, o isolamento de leveduras

permitirá o estudo da produção da SOD e possibilitará o desenvolvimento de projetos visando

a caracterização de outras enzimas de interesse.

2. OBJETIVOS

2.1. Objetivo Geral

O objetivo geral deste trabalho foi o isolamento e identificação de leveduras, bem

como o estabelecimento do perfil eletroforético de expressão da enzima Superóxido

Dismutase.

2.2. Objetivos específicos

1. Isolar leveduras a partir de frutos tropicais;

2. Realizar a identificação taxonômica das leveduras isoladas;

2. Estabelecer o perfil eletroforético e comparar a expressão de SOD destas leveduras.


3. REVISÃO DA LITERATURA

3.1. As Leveduras e sua utilização na Biotecnologia

A biotecnologia pode ser conceituada como o conjunto de técnicas cujos processos

industriais, bem como seus produtos, são obtidos a partir da utilização de organismos vivos ou

de suas partes. O objetivo da biotecnologia atual é aproveitar a diversidade das enzimas,

outras proteínas e subprodutos para beneficiar o homem, utilizando organismos e/ou

microrganismos específicos e eficientes para elaborar diferentes produtos (Carmo, 1993;

Patrício, 1993; Wheals e cols., 1999; Cowan, 2000; Demain, 2000).

As leveduras são microrganismos eucariontes unicelulares, pertencentes à classe

Basidiomycetes ou Ascomycetes (Walker, 1998). A maioria são sapróbios, dependentes de

carbono orgânico como fonte de energia e encontradas em associação com vegetais, húmus ou

quaisquer substratos que forneçam açúcar (Phaff, 1990). Reproduzem-se geralmente por

brotação, embora ocorram gêneros que se reproduzem de outras formas (fissão, fissão-

brotação ou brotação em base larga). Além disso, apesar de serem conhecidas por sua

capacidade fermentativa, nem todas as leveduras fermentam (Lodder, 1970; Kreger-van Rij,

1984). Em particular, seu isolamento e manutenção laboratorial tornam-se facilitados devido à

sua capacidade de sobreviver em ambientes onde poucos microrganismos podem se

desenvolver (Phaff e Stamer, 1987).

Existem diversos aspectos relevantes que tornam as leveduras importante objeto de

estudo. Alguns representantes podem causar doenças em animais e plantas (Rose e Harrison,

1970; Lodder, 1970; Kreger-van Rij, 1984), outros são biodegradadores de produtos naturais

(frutas, leite, carnes) ou utilizados industrialmente na produção de vinhos, papel, pão, queijo

entre outros (Jay, 1970; Frazier, 1976). A utilização extensiva das leveduras começou apenas

no período da Primeira Guerra Mundial, sendo o motivo principal a falta de alimentos,


sobretudo na Alemanha. Após o término da Guerra, um dos primeiros microrganismos a

serem estudados com caráter científico foi a levedura Saccharomyces cerevisiae (Horii e

Oettrer, 1998).

Após os anos que se seguiram à Segunda Grande Guerra, várias indústrias de

fermentação investiram em novos microrganismos que possuíam uma produtividade maior e

em técnicas mais avançadas e sofisticadas, que aumentaram seus lucros comerciais. As novas

descobertas proporcionaram enriquecimento da alimentação animal e humana, bem como das

áreas farmacológicas, químicas e de preparação de mostos sintéticos (Horii e Oettrer, 1998).

Com o crescimento de pesquisas nas áreas da Bioquímica, Fisiologia e Genética, as

leveduras e outros microrganismos de interesse comercial começaram a ser melhorados por

seleção (Montenegro, 1999). A fermentação microbiana permitiu a produção de etanol,

atualmente amplamente utilizado em diversos setores industriais (Demain, 2000). O processo

fermentativo de vários fungos é utilizado também na produção de diversos ácidos de

importância econômica para o homem, como por exemplo, em medicamentos, alimentos,

crescimento de vegetais, processos industriais entre outros. Alguns exemplos desses ácidos

são: ácido cítrico, cógico, glucônico, itacônico, fumárico, lático, gálico entre outros.

(Aharonowitz e Cohen, 1981). O conhecimento do potencial dos microrganismos cresce

continuamente, gerando novas descobertas, tais como o conhecimento químico das vitaminas.

Diversas vitaminas encontradas nos microrganismos já foram bem estudadas, como por

exemplo, as riboflavinas (vitaminas B2), cobalaminas (vitamina B12), beta-caroteno (pró-

vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C) e ergosterol (pró-vitamina D) (Pokorny, 1991).

Atualmente, estão sendo estudadas melhorias nos sistemas de expressão gênica em

leveduras, em complementação ao desenvolvimento de linhagens com fins industriais,

capazes de metabolizar lactose, inulina, pectina e outros substratos (Biely e Slavikova, 1994;

Gupta e Kaur, 1997; Biely e Kremnicky, 1998; Adam e cols., 1999; Blanco e cols., 1999;

Cereghino e Cregg, 1999; Pandey e cols., 1999; Shukla e Kulkarni, 2000; Chae e cols., 2001).


Pesquisas estão sendo desenvolvidas para que leveduras alteradas geneticamente sejam

capazes de degradar dejetos orgânicos industriais, gerando compostos ricos em proteínas e

açúcares, que podem ser reutilizados em rações animais ou ter outras aplicações

(GarciaGaribay e GomezRuiz, 1996; Roostita e Fleet, 1996; Siso, 1996; Berruga e cols.,

1997; Maullu e cols., 1999). Além disso, linhagens termotolerantes estão sendo usadas para

aumentar a produção industrial de álcool, reduzindo custos e potencializando o tempo de

produção (Banat e cols., 1998; Zalashko e cols., 1998; Sree e cols., 1999; Smits e cols., 2000).

3.2. Leveduras nas frutas

Leveduras são os contaminantes mais comuns das frutas, representando um grande

problema para as indústrias que trabalham com esse alimento (Davenport, 1996). O baixo pH

e a alta concentração de açúcar nas frutas favorecem o crescimento destes microrganismos, e,

conseqüentemente, causam a deterioração do produto (Deak e Beuchat, 1996). Muitos estudos

têm sido publicados sobre o assunto, relatando as leveduras mais comuns que já foram

isoladas de frutos, como Candida spp., Debaryomyces hansenii, Hansenula spp., Rhodotorula

spp., Pichia spp., Dekkera spp., Lodderomyces elongisporus, Hanseniaspora spp.,

Issatchenckia orientalis, Kloeckera spp., Kluyveromyces marxianus, Saccharomyces spp.,

Torulaspora delbrueckii e Zygosaccharomyces spp. (Mainer e Busse, 1992; Beckenkamp,

1997; Cook e cols., 1999; Longo, 1999; Sacho e cols., 2000; Petreikov e cols., 2001).

Os açúcares e os ácidos orgânicos das frutas as tornam excelentes substratos para o

crescimento de leveduras, podendo dar uma vida útil relativamente curta ao alimento. Uma

vez que uma grande variedade de microrganismos reside na superfície das mesmas, basta o

rompimento natural (ou mecânico) do fruto para que as leveduras entrem em contato com os

tecidos internos, gerando prejuízos em alguns setores da indústria (Beckenkamp, 1997; Cook

e cols., 1999; Longo, 1999; Sacho e cols., 2000; Petreikov e cols., 2001; Spotts e cols., 2002).


Diversos métodos são utilizados para diferenciar a flora de leveduras presente nos

frutos. Técnicas tradicionais foram adaptadas usando meios de cultivo seletivos e/ou

diferenciados, pois detectar, isolar e quantificar todas leveduras que porventura habitem num

alimento pode não se mostrar uma tarefa simples (Yamamoto e cols., 1991; Beuchat, 1993).

Cada vez mais, Meios de Cultivo mais eficientes são elaborados para identificar melhor os

diversos grupos de microrganismos que infestam os frutos. Embora os métodos bioquímicos e

taxonômicos possam gerar resultados incertos, os métodos atuais baseados em Biologia

Molecular (hibridização, cariotipagem, RFLP, mtDNA, DNA fingerprinting) estão ao alcance

apenas de laboratórios bem equipados (Martini e Kurtzmam, 1985; Johnston e Mortiner,

1986; Penderson, 1986; Rohm e Lechner, 1990; Yamamoto e cols., 1991; Vancanneyt e cols.,

1991; Ness e cols., 1993; Gillamon e cols., 1994; Malfeito-Ferreira e cols., 1997; Heraz-

Vazquez e cols, 2002).

3.3. A enzima Superóxido Dismutase

Organismos adaptados para uma vida aeróbica sempre enfrentam problemas causados

pelos efeitos tóxicos das Espécies Reativas de Oxigênio (ERO). Essas moléculas são geradas

por processos celulares normais, tais como o metabolismo respiratório e a assimilação de

nutrientes por parte da célula, ou por exposição a condições de estresse (Pereira e cols., 2003).

Muitos dos componentes celulares (lipídios, proteínas, DNA e açúcares) são alvos de ERO,

sofrendo perda de suas funções, o que pode levar à morte celular. Em concentrações

fisiológicas baixas, as ERO são benéficas, pois estão envolvidas com ativação de funções

celulares e no aumento da resistência contra patógenos. Entretanto, altos índices de ERO

contribuem para o desenvolvimento de várias doenças tais como câncer, hipertensão, diabetes,

arteriosclerose, inflamações em geral e envelhecimento precoce (Halliwell, 1989; Englad e

cols., 1998; Halliwell, 2003).


As enzimas Superóxido Dismutase (SOD) são as primeiras e mais importantes na linha

de defesa contra os efeitos oxidativos provocados pelas ERO, particularmente o radical

superóxido O2- . Atualmente, três diferentes isoformas de SOD foram identificadas em

mamíferos, e suas estruturas genômicas, cDNA, e proteínas foram descritos. Duas isoformas

de SOD têm o cobre e o zinco em seus centros catalíticos e estão localizados no citoplasma

celular (CuZn-SOD ou SOD1, codificada pelo gene SOD1) ou no meio extracelular (EC-SOD

ou SOD3, codificada pelo gene SOD3). Embora ambas possuam o mesmo metal em seu sítio

ativo, suas seqüências primárias de nucleotídeos são descritas como sendo quase

completamente diferentes (Hijalmarsson e cols., 1987; Chang e cols,. 1988; Keller e cols,.

1991; Crapo e cols,. 1992). A terceira isoforma de SOD tem manganês (Mn) como cofator e

está localizada na mitocôndria das células aeróbicas (Mn-SOD ou SOD2, codificada pelo

gene SOD2). (Gralla e cols, 1992; Delaunay e cols,. 2000; Lee e cols., 2001). É interessante

citar que Lamarre e cols (2001) conseguiram isolar Mn-SOD extracelular quando estudaram

Candida albicans e que esta SOD diverge pouco na seqüência e estrutura, entre suas formas

intra e extracelular.

Em geral, CuZn-SOD está presente no citoplasma de eucariontes, enquanto que Mn-

SOD encontra-se em procariontes e na mitocôndria de eucariontes. Existe ainda uma forma

especial de SOD, encontrada em eubactérias, archaebactérias e cloroplastos dos eucariontes

chamada Fe-SOD (pois a enzima usa ferro em seu sitio ativo) (Hassan, 1989; Fridovich,

1995). A homologia de aminoácidos e similaridade na estrutura cristalina de Mn-SOD e Fe-

SOD indica que essas duas enzimas têm origem em um ancestral comum, enquanto que

CuZn-SOD é bem distinta em sua estrutura, quando comparada com Mn-SOD ou Fe-SOD

(Hijalmarsson e cols., 1987; Parker e Blake, 1988; Liddell e Knox, 1998).

SOD1 tem uma massa molecular de aproximadamente 32.000 Da e, em células de

mamíferos, é encontrada no citoplasma, mas também em compartimentos nucleares e nos

lisossomos (Chang e cols,. 1988; Keller e cols,. 1991; Crapo e cols,. 1992; Liou e cols,. 1993;


Pohl e cols,. 2002). A enzima SOD3 é a mais recente descoberta na família das SODs, sendo a

menos caracterizada delas. Ela existe como um homotetrâmero de peso molecular 135.000

Da, com alta afinidade por heparina (Marklund e cols,. 1982; Pereira e cols,. 2003). Essa

enzima foi primeiramente detectada no plasma humano e em fluidos cérebro-espinhais. A

expressão da SOD3 é altamente restrita ao tipo de célula e tecido, onde sua atividade pode

exceder as da SOD1 e SOD2 (Marklund e cols,. 1986; Costa & Moradas-Ferreira, 2001;

Haddad, 2002). A Mn-SOD, por sua vez, existe como um homotetrâmero de

aproximadamente 23.000 Da (Moradas-Ferreira & Costa, 2000). Essa enzima já foi registrada

como de função importante na diferenciação celular e na tumorgenese (Clair e cols,. 1994) e

na proteção contra hiperoxidação induzida por intoxicação pulmonar (Wispe e cols,. 1992;

Fridovich, 1997).

A enzima SOD tem despertado crescente interesse biotecnológico, devido ao seu

emprego como probiótico antioxidante, na prevenção de efeitos de radicais livres no processo

de envelhecimento e na fabricação de cosméticos protetores da pele. Além disso, é de grande

importância como agente antiinflamatório, no tratamento de artrites, e como protetora contra

os efeitos de radiação ionizante (Nedeva e cols, 1993; Lods e cols., 2000 Ratcheva e cols.,

2000; Lee e cols., 2001).

A ausência da enzima CuZn-SOD causa fragmentação vacuolar em S. cerevisiae,

decorrente da elevação de oxidação metálica nos vacúolos e da elevada concentração de

metais livres no citoplasma. Estas conseqüências derivam do estresse oxidativo, que altera a

homeostase metálica celular que, por sua vez, aumenta os danos estruturais, especialmente

quando a célula se encontra em fase lag (Longo e cols, 1996; Corson e cols., 1999; Srinivasan

e cols., 2000). Mutantes de S. cerevisiae que não possuem a CuZnSOD mostram diversos

defeitos, tais como a diminuição na taxa de crescimento aeróbico e aumento na demanda de

metal intracelular, como reflexo dos esforços da célula para reconstituir enzimas que são

continuamente inativadas quando em condições de excesso de superóxido (De Freitas e cols.,


2000). Laun e cols (2001) observaram que deleções nos genes que codificam para SOD ou

Catalase, associadas com mudanças na concentração atmosférica de oxigênio, diminuem

consideravelmente o tempo de vida da levedura S. cerevisiae. Além disso, a presença do

antioxidante Glutationa aumenta o período de vida das células, demonstrando a participação

do oxigênio no envelhecimento celular.

Segundo Longo e cols (1999) células de S. cerevisiae com carência de superóxido

dismutase mitocondrial (Mn-SOD) apresentam baixa sobrevivência na fase estacionária de

crescimento celular (fase lag). Isto se deve a uma diminuição na taxa de respiração, ocorrente

na fase exponencial de crescimento, culminando em morte celular na fase lag. Os autores

concluem que o superóxido (O2- ) é produzido na mitocôndria e controlado pela atividade da

Mn-SOD, que age como defesa primária contra essa toxicidade. Quando o equilíbrio entre a

produção de O2- e a atividade da Mn-SOD é interrompido, ocorre liberação de metais dos

grupamentos metalo-sulfurados mitocondriais, provocando, primeiro, a queda na função

mitocondrial e a morte, independentemente dos danos no mtDNA.

A atividade enzimática da SOD1 é dependente da presença do íon cobre, cuja inserção

requer o chaperone de cobre (Copper Chaperone for SOD1 ou CCS). Esta molécula é um

fator citosólico essencial que mantém a homeostase celular do cobre. Sem esta molécula, não

ocorre ligação do cobre com a SOD1, causando um acúmulo de cobre intra-celular que causa

danos oxidativos. Metalochaperones citosólicos têm sido recentemente identificados em

plantas, leveduras, roedores e células humanas (Goto e cols., 2000; Hiromura e cols., 2000;

Schmidt e cols., 2000). Metaloproteínas específicas escoltam o cobre para numerosos alvos

dentro da célula, garantindo proteção dos efeitos tóxicos do cobre livre. Muitas

metaloproteínas têm sido caracterizadas, clonadas e mapeadas em leveduras, ratos e humanos

(Moore e cols., 2000).

3.4. Genes para SOD


Diversos estudos têm sido realizados ao longo dos anos para caracterizar os genes que

codificam as enzimas SOD. Os genes que codificam CuZn-SOD em humanos (Lieman-

Hurwitz e cols., 1982; Sherman e cols., 1983; Hallewell e cols., 1985; Ho e cols., 1987), ratos

(Delabar e cols., 1987), milho (Cannon e cols., 1987), drosófilas (Seto e cols., 1987), bactérias

(Steinman, 1987) e leveduras (Bermingham-McDonogh e cols., 1988, Chaturvedi e cols.,

2001; Cyrne e cols., 2002; Lee e cols, 2002) foram isolados e suas seqüências determinadas.

Da mesma forma, os genes para Mn-SOD de leveduras (Marres e cols., 1985) e para

Escherichia coli (Touati e Ávila, 1986; Sakamoto e Touati, 1984) também já foram descritos

(Autor, 1982; Marres e cols., 1985; Takeda e Ávila, 1986; Hijalmarsson e cols., 1987;

Steinman, 1987; White e Scandalios, 1987).

Leveduras com mutação na Mn-SOD por inativação do gene tornam-se extremamente

sensíveis ao ar, crescendo apenas em líquidos e tendo seu desenvolvimento inibido em meios

de cultivo não-fermentáveis (Van Lonn e cols., 1986). Mutantes Saccharomyces cerevisiae

deficientes em CuZn-SOD crescem normalmente em contato com o ar, mas são muito

sensíveis a concentrações altas (90 – 100%) de oxigênio (Bilinski e cols., 1985). A ausência

de CuZn-SOD, então, deixa a levedura apenas com a opção de viver em anaeróbiose, sendo

que a ausência de Mn-SOD torna-os hipersensíveis aos produtos gerados de suas próprias

reações metabólicas oxidantes (Bilinski e cols., 1985).

3.4.1. SOD1

A seqüência genômica da SOD1 já foi identificada em ratos (Hsu e cols,. 1992; Kim e

cols,. 1993), camundongos (Benedetto e cols., 1991), leveduras (Chaturvedi e cols., 2001) e

humanos (Levanon e col., 1985). A organização genômica do gene da SOD1 revela uma

impressionante similaridade entre os organismos citados, contendo sempre cinco exons e


quatro introns, exceto leveduras, que possuem cinco introns . Nestes microrganismos, o gene

SOD1 possui uma similaridade com mamíferos que varia entre 53 e 65%, tornando-o

filogeneticamente um pouco distante de plantas e mamíferos. Nas leveduras todos os cinco

introns têm uma típica seqüência de junção para splincing, GTNNGY (Chaturved e cols.

2001).

As caixas TATA e CCAAT, assim como algumas regiões altamente conservadas ricas

em conteúdo GC, foram localizadas nos quatro organismos com um padrão similar na região

próxima ao promotor. Um alto nível de homologia na seqüência inicial do gene sugere que

intensos fatores evolucionários preservaram as regiões reguladoras desse setor. A região

terminal do gene SOD1 possui regiões que codificam diferentes comprimentos de cauda Poli-

A, variando entre as espécies. Em ratos, a região de consenso YGTGTTYY e um

agrupamento G/T (necessário para uma eficiente formação do segmento 3’-Terminal) foram

localizados downstream do sinal de poliadenilação. A região promotora do gene SOD1

humano foi bem estudada e alguns supostos sítios para transcrição dos fatores NF1, Sp1, AP1,

AP2, GRE, HSF e NF-κB foram encontradas (Kim e cols., 1994). A função dos fatores de

transcrição Sp1 e Egr-1 em níveis normais e com expressão induzida foram confirmados nos

trabalhos de Minc e cols (1999). Em leveduras, a seqüência genômica SOD1, em leveduras,

possui uma potencial caixa TATA na posição –373. A região 3’ terminal AACAAA, que pode

representar um sinal de poliadenilação, está presente na posição +967 (Chaturved e cols,

2001).

O gene SOD1 está localizado no cromossomo 21 (região 21q22) de humanos

(Levanon e cols., 1985), cromossomo 1 (1q12 14) em bovinos (Schmutz e cols., 1996),

cromossomo 16 (16B4 ter) em camundongos (Francke e cols., 1979) e em um grande

cromossomo (2200 kb), em leveduras (Chaturved e cols., 2001). Destes, o cromossomo 21

humano é intensamente estudado devido à sua associação com a Síndrome de Down.


Pacientes com Down possuem um aumento de 50% na atividade da SOD1 devido aos altos

índices dessa proteína. Por outro lado, mais de 90 diferentes mutações no gene SOD1 estão

associados com Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), também conhecida como Doença de

Lou Gehrig (Rosen e cols., 1993).

3.4.2. SOD2

A completa estrutura genômica da SOD2 foi determinada em humanos (Church e

cols., 1992; Wan e cols., 1994), ratos (Ho e cols., 1991), camundongos (DiSilvestre e cols.,

1995; Jones e cols., 1995) e leveduras (Jeong e cols., 2001). Em bovinos já se têm resultados

parciais de identificação e caracterização (Liu e Foote, 1995; Lourivaldo e cols., 2001). Todos

esses organismos mostram conservação de estrutura e seqüência. A estrutura física do gene da

SOD2 é composta de cinco exons e quatro introns e as regiões promotoras das quatro espécies

compartilham características comuns. Não há, por exemplo, caixas TATA e CAAT

identificadas na região upstream do promotor, embora existam regiões ricas em conteúdo GC

com grande similaridade entre os organismos. Segundo Jones e cols (1988), Dynan (1986) e

Jeong e cols (2001) tais características podem ser típicas de genes altamente conservados. Os

genes humanos e de camundongos possuem, em comum, elementos reguladores

transcricionais NF-κB, sendo que nos humanos este setor encontra-se na região terminal,

enquanto que nos camundongos ela se encontra nos setores iniciais (Jones e cols., 1995).

A importância da função da SOD2 em mamíferos foi confirmada por disrupção do

gene SOD2, que causou neurodegeneração e danos ao coração (Lebovitz e cols., 1996). A

literatura médica descreve amplamente as disfunções decorrentes de deficiência no gene

SOD2 humano que vão desde cardiopatia, doenças neuronais e Mal de Parkison (Rosenblum e


cols., 1996; Van Landeghem e cols., 1999; Hiroi e cols., 1999; Farin e cols., 2001) até ALS

(Parboosingh e cols., 1995; Tomkins e cols., 2001).

3.4.3. SOD3

Em leveduras, a SOD3 é rara de modo que sua ocorrência foi registrada apenas por

Lamarre e cols (2001) em Candida albicans. Análises de Northern blot mostraram que a

transcrição de SOD3 é induzida pela transição do estado leveduriforme para a forma micelial

de C. albicans, e não por estresse oxidativo. A expressão de SOD3 é muito acetuada quando a

célula entra na fase estacionária e enquanto permanece nessa fase, culminando com a

repressão da SOD1. Vale lembrar que a SOD3, neste microrganismo, tem manganês em seu

sitio catalítico (Não cobre/zinco). Em mamíferos, a estrutura genômica da SOD3 já está

determinada (Folz e Crapo, 1994). Na literatura também consta que um genoma parcialmente

clonado, codificando a completa Open Reading Frame (ORF) para a SOD3 de camundongos

está relatada (Carlsson e cols., 1995). Atualmente, clones cDNA de SOD3 já foram isolados e

seqüenciados em humanos (Hjalmarsson e cols., 1987), ratos (Perry e cols., 1993; Willems e

cols., 1993), camundongos (Folz e cols., 1997) e coelhos (Laukkanen e cols., 1995). O gene

SOD3 compartilha 40 a 60% de similaridade com o gene SOD1, mas não com a SOD2. O

gene SOD3 de camundongos consiste de dois exons separados por 4 kb de introns. A região

promotora da SOD3 em humanos e camundongos aparentemente não possui caixas TATA ou

CCAAT (Folz e Crapo, 1994). Em humanos, alguns elementos de resposta transcricional

fazem parte do sistema regulatório de metal e no de resposta antioxidante (Folz e Crapo,

1994).

O gene SOD3 está localizado no cromossomo 4 (região 4p21) de humanos

(Hendrickson e cols., 1990) e no meio do cromossomo 5 em camundongos (Folz e cols.,

1997; Suh e cols, 1997). Raras mutações têm sido observadas no SOD3 humano. Substituição


de arginina, na posição 213, para glicina causa um aumento na concentração de SOD3 no

plasma (Folz e cols., 1994; Sandstrom e cols., 1994; Yamada e cols, 1995). Em camundongos,

mutações do gene SOD3 promovem sensibilidade para hiperoxia (Carlsson e cols., 1995),

isquemia cerebral (Sheng e cols., 1999) e demência (Levin e cols., 1998).


4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ARTIGO CIENTÍFICO

Manuscrito preparado para submissão ao periódico Brazilian Journal of Microbiology

ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE LEVEDURAS PRESENTES EM FRUTOS E

PERFIL ELETROFORÉTICO DE SUPERÓXIDO DISMUTASE

Leonardo do Nascimento Rolim, Tania Tassinari Rieger e José Ferreira dos Santos

Laboratório de Genética de Microrganismos,

Departamento de Genética,

Universidade Federal de Pernambuco.

Av. Moraes Rego, s/n. 50732-970, Recife, PE, Brasil.

Fone: 00 55 81 3271 8520

Fax: 00 55 81 3271 8569

E-mail: [email protected]

Título corrente: Isolamento de leveduras e perfil eletroforético da SOD.

Palavras chave: Leveduras; Frutos tropicais; Taxonomia; Superoxido Dismutase.

45

Resumo

Leveduras são microrganismos unicelulares eucariontes conhecidos por sua

capacidade de fermentar substratos dos quais precisam obter energia. Na natureza são os

contaminantes mais comuns de frutos, gerando prejuízos para indústrias do setor. Por outro

lado, estes microrganismos são bioferramentas muito utilizadas em estudos científicos e com

fins industriais. Assim como os demais organismos aeróbicos, as leveduras usam a enzima

superóxido dismutase (SOD) como defesa contra os efeitos oxidativos nocivos causados pelos

radicais livres. Esta ação antioxidante é o motivo que desperta interesse da indústria pelos

microrganismos produtores. Este trabalho teve como objetivo isolar e identificar leveduras

encontradas em frutos e comparar a expressão da SOD. Foram obtidos 472 isolados de

leveduras de amostras de frutos de acerola (Malpighia glabra), de Olinda e Jaboatão dos

Guararapes, e de gogóia (Solanum sp.) do Parque Dois Irmãos, localidades da Região

Metropolitana do Recife (PE – Brasil). Foram identificados taxonomicamente 49 isolados,

que revelou a presença de oito gêneros: Saccharomycodes (36,73%), Kloeckera (24,49%),

Schizoblastosporion (16,32%), Brettanomyces (12,24%), Nadsonia (4,08%), Coccidiascus

(2,04%), Dekkera (2,04%) e Saccharomycopsis (2,04%). O perfil da CuZnSOD destas

leveduras foi estabelecido por eletroforese nativa em gel de amido, revelando uma diversidade

significativa desta enzima entre os gêneros. Além disso, o padrão da CuZnSOD foi

diagnóstico para os gêneros Saccharomycodes, Coccidiascus, Schizoblastosporion e

Saccharomycopsis. Este estudo inicia a caracterização da SOD destes gêneros, contribuindo

para a exploração fisiológica destes microrganismos em estudos posteriores.

Rolim, L. N. Isolamento e identificação de leveduras e perfil da SOD 46

Introdução

A biotecnologia tem mostrado avanços significativos na obtenção de produtos de

grande valor agregado a partir de seres vivos, principalmente microrganismos, com custos

cada vez menores (9). Entre os microrganismos biotecnologicamente importantes, as

leveduras têm tido suas aplicações ampliadas (44). Linhagens estão sendo selecionadas para

fins industriais, tais como a capacidade de metabolizar diversos substratos como a lactose,

inulina, pectina e outros (12, 64). Concomitantemente, leveduras estão sendo alteradas

geneticamente para se tornarem aptas a degradar dejetos orgânicos industriais, gerando

subprodutos que podem ser reaproveitados pela indústria (10, 15, 43, 53). No setor de

produção de álcool, estes microrganismos são agentes cada vez mais elaborados para o

aumento da produção, assim como diminuição nos custos (3, 55, 56, 66).

Neste cenário, a procura por microrganismos com capacidade de produzir novas

substâncias ou compostos com características mais adequadas às necessidades do mercado

é contínua (7, 17, 35, 51, 54). Na natureza, as leveduras podem ser encontradas em diversos

locais, sendo as frutas em decomposição um ambiente comum a diversas espécies (26, 36,

37, 38, 52, 60).

Uma enzima que tem despertado particular interesse, na indústria e na ciência, é a

superóxido dismutase (SOD), devido ao seu emprego como probiótico antioxidante, na

prevenção de efeitos de radicais livres no processo de envelhecimento e na fabricação de

cosméticos protetores da pele. Além disso, é de grande importância como agente

antiinflamatório, no tratamento de artrites e como protetora contra os efeitos de radiação

ionizante (29, 32, 41, 47).


Este trabalho teve por objetivo isolar leveduras a partir de frutos tropicais em

decomposição, com a finalidade de identificar os gêneros e estabelecer o perfil

eletroforético da enzima SOD, servindo como base para um futuro estudo comparado desta

enzima obtida de diferentes leveduras.


Metodologia

Coleta de Frutos

Os frutos para isolamento de leveduras foram coletados na Região Metropolitana do

Recife (PE), sendo 04 amostras de acerola (Malpighia glabra) coletadas em Jaboatão dos

Guararapes, 04 amostras de acerola coletadas em Olinda e 2 amostras da planta selvagem

gogóia (Solanum sp.), coletada no Parque Dois Irmãos. As amostras foram acondicionadas

em tubos de ensaio contendo o meio de cultura estéril YEPD (extrato de levedura 1%,

peptona 2% e dextrose 2%), pH 4,0, acrescido dos antibióticos Ampicilina (1μg/ml) e

Ácido Nalidíxico (5μg/ml), com a finalidade de evitar o crescimento bacteriano. Estes

tubos foram incubados em estufa BOD por 24h a 28oC.

Isolamento, purificação e identificação das leveduras

Após o período de crescimento, as amostras foram diluídas (1:10, 1:100 e 1:1000) e

semeadas em placas de Petri contendo YEPD (solidificado com Agar 2%), pH 4,0,

acrescido dos mesmos antibióticos do meio usado na coleta. As placas foram incubadas em

estufa BOD a 28oC por 24h. A partir de cada placa foram isoladas as colônias que

mostrassem aspectos distintos de forma, coloração, textura ou tamanho, sendo estas

colônias diferentes transferidas para novas placas. Caso a nova placa apresentasse mais de

um tipo de colônia, o processo era repetido até que a levedura estivesse completamente

isolada (38, 49).


A identificação taxonômica das leveduras isoladas foi realizada de acordo com

Barnett e cols. (4) e Lodder (31). As características macroscópicas foram observadas após

crescimento das colônias em meio YEPD pH 4,0, acrescido dos antibióticos Ampicilina

(1μg/ml) e Ácido Nalidíxico (5μg/ml). As características microscópicas, como a presença

de ascósporos, foi observada em microscópio óptico de amostras das culturas após

incubação das leveduras a 28oC por 28 dias em quatro meios de cultura diferentes:

Gorodkova (Glicose 0,1%, Peptona 1% e NaCl 0,5%), Fowell (Acetato de Sódio

trihidratado 0,5% pH 6,5-7,0), McClary (Glicose 0,1%, KCl 0,18%, Extrato de Levedura

0,25% e Acetato de Sódio trihidratado 0,82%) e caldo YM (Extrato de Levedura 3%,

Extrato de Malte 3%, Peptona 5% e Glicose 10% pH 3,7).

Foram realizados diferentes testes em meios seletivos para diferenciar as leveduras

isoladas segundo as seguintes características fisiológicas: produção de ácido a partir de

glicose, hidrólise de uréia, produção de compostos extra-celulares (amido extra-celular) e

assimilação de nitrato.

Para verificar a produção de ácido a partir de glicose, foi utilizado o meio Glicose

Carbonato de Cálcio Agar (Glicose 5%, Extrato de Levedura 0,5 %, Carbonato de Cálcio

0,5% e Agar 2%) em placa de Petri. As colônias foram inoculadas por picada no Meio e as

placas incubadas a 28oC, por um período de até 28 dias. Foram considerados resultados

positivos para a presença de ácido quando a colônia de levedura produzia um halo

translúcido no Meio com diâmetro duas vezes maior que a colônia (4, 31).

Para detectar a hidrólise de uréia as leveduras foram inoculadas no Meio

Christensen’s (Peptona 0,1%, Glicose 0,1%, Cloreto de Sódio 0,5%, Fosfato de Potássio

monobásico 0,2%, Vermelho de Fenol 0,0012%, Uréia filtrada 2%, Agar 2%) em tubos de


ensaio, incubados a 28oC por até 28 dias. O ensaio foi considerado positivo quando a

coloração do meio mudou de amarelo para rosa (4).

A produção de amido extra-celular foi analisada em Meio Lodder & Kreger-Van Rij

(Sulfato de Amônio 0,2%, Fosfato de Potássio 0,2%, Sulfato de Magnésio heptahidratado

0,1%, Glicose 2%, Tiamina filtrada 0,02%, Agar 2%), pH 4,5, após 15 dias de crescimento

em placa de Petri a 28oC. O resultado positivo ocorreu quando o meio de cultura (substrato

onde as células cresceram) tornou-se azul em contato com a solução de Lugol (Iodo 0,33%

e Iodeto de Potássio 0,66%) (31).

A assimilação de nitrato foi demonstrada com uso do Meio YCB enriquecido com

nitrato de potássio (YCB 11,7% e KNO3 0,78%), onde as leveduras foram incubadas em

tubos de ensaio a 28oC por sete dias. Resultado positivo foi verificado quando o meio

tornou-se vermelho ao serem acrescentadas algumas gotas de Reagente 1 (Ácido

Sulfanílico 0,8%) e Reagente 2 (Alfa-Naftilamina 0,5%) (4, 31).

Perfil eletroforético da SOD

As células foram crescidas em YEPD com antibióticos por 18 horas, lavadas com

tampão fosfato 0,01M e lisadas mecanicamente utilizando contas-de-vidro (“glassbeads”).

Após centrifugação, o sobrenadante de cada amostra celular foi acondicionado a –20oC e

posteriormente utilizado para aplicação em gel.

O perfil eletroforético da enzima superoxido dismutase foi estabelecido através de

eletroforese nativa em gel de amido a 10%, correndo por 08 horas a 5,4 V/cm e 29 mA, em

temperatura de 8oC, utilizando tampão fosfato (pH 7,0) 0,1M nas cubas e 0,01M no gel, de


acordo com Weimer e cols. (62). A coloração com os substratos MTT (10mg/ml) e PMS

(15mg/ml), evidenciou as diferentes bandas em coloração negativa de atividade da SOD.

Resultados

A partir de amostras dos frutos acerola e gogóia foi obtido um total de 472 isolados

de leveduras, após diluição e semeadura em meio YEPD contendo antibióticos. Em todos

os casos, a diluição para semeadura que se mostrou mais adequada para o isolamento foi

1:1000. O número de isolados de cada amostra está apresentado na Tabela 1.

Tabela 1. Número de isolados de leveduras obtidos a partir de amostras de frutos coletadas

em três localidades da Região Metropolitana do Recife (PE).

Local Fruto No isolados

Olinda (PE) Acerola (Malpighia glabra) 76

Jaboatão dos Guararapes (PE) Acerola (Malpighia glabra) 275

Parque Dois Irmãos (Recife, PE) Gogóia (Solanum sp.) 121

TOTAL DE ISOLADOS 472

Foi realizada a identificação taxonômica de 49 isolados, sendo 35 isolados obtidos

de acerola de Jaboatão dos Guararapes, 4 isolados de acerola de Olinda e 10 isolados de

gogóia do Parque Dois Irmãos. Para identificar macroscopicamente as leveduras foram

levados em consideração a cor da colônia, sua superfície, borda e consistência (Tabela 2).

Na análise microscópica, as células foram observadas quanto à forma, o tipo de brotamento

e a formação de pseudomicélio e presença de ascósporos (Tabela 3). Além destes, foram

levados em consideração características fisiológicas tais como o comportamento de cada


isolado em relação à fermentação da glicose, hidrólise da uréia, assimilação de nitrato,

produção de ácido a partir de glicose e síntese de amido extra-celular, conforme pode ser

conferido na Tabela 4.

Das amostras de acerola de Jaboatão dos Guararapes, por comparação dos

resultados segundo os critérios de Barnett e cols (4) e Lodder (31), puderam ser

identificados 8 gêneros, sendo 17 isolados de Saccharomycodes (48,57%), 6 de

Brettanomyces (17,14%), 6 de Kloeckera (17,14%), 2 de Schizoblastosporion (5,71%), 1 de

Saccharomycopsis (2,85%), 1 de Coccidiascus (2,85%), 1 de Nadsonia (2,85%) e 1 de

Dekkera (2,85%). Das amostras de acerola de Olinda todos os 4 isolados pertencem ao

gênero Schizoblastosporion (100%). Das amostras de gogóia do Parque Dois Irmãos foram

obtidos 6 isolados de Kloeckera (60%), 2 de Schizoblastosporion (20%), 1 de Nadsonia

(10%) e 1 de Saccharomycodes (10%).

Tabela 2: Características macroscópicas mais relevantes das leveduras isoladas

Características Macroscópicas Cor Superfície Bordas Consistência

Gêneros B C R L Ru Re I Cr Me

Bretanomyces + + + +

Coccidiascus + + + +

Kloeckera + + + +

Nadsonia + + + +

Dekkera + + + +

Saccharomycodes + + + +

Saccharomycopsis + + + +

Schizoblastosporion + + + +

Legenda: B = Branca; C = Creme; R = Rosa; L = Lisa; Ru = Rugosa; Re = Regular;

I = Irregular; Cr = Cremosa; Me = Membranosa.


Tabela 3: Características microscópicas mais relevantes dos gêneros de leveduras estudadas

Características Microscópicas Forma Brotamento Pseudomicélio Ascósporos

Gêneros El Og Ob Ov Al Esf Si Bi M G F Mc Y G F Mc Y

Bretanomyces + + + + + - - - - - -

Coccidiascus + + - + + - - + + -

Kloeckera + + - - - - - - - -

Nadsonia + + + - - - - - + - -

Dekkera + + - + - - - + - -

Saccharomycodes + + + - + - - - + - -

Saccharomycopsis + + - + - - - + - -

Schizoblastosporion + + + - - - - - - - -

Legenda: Forma: El = Elipsóides; Og = Ogivais; Ob = Oblongas; Ov = Ovais; Al = Alongadas; Esf = Esféricas;

Brotamento: Si = Simples; Bi = Bipolar; M = Multipolar;

Pseudomicélio e Ascósporos (meios de cultura): G = Gorodkova; F = Fowell; Mc = McClary; Y = caldo YM.


Tabela 4: Características fisiológicas mais relevantes dos gêneros de leveduras estudadas

Características Fisiológicas Gêneros

Ferm Hidr Ass Prod Sint

Bretanomyces + - - + -

Coccidiascus + - - - -

Kloeckera + - - + -

Nadsonia + - - + -

Dekkera + - - + -

Saccharomycodes + - - + -

Saccharomycopsis + - - - -

Schizoblastosporion - - - + -

Legenda: Ferm = Fermentação da glicose; Hidr = Hidrólise de uréia; Ass = Assimilação de

nitrato; Prod = Produção de ácido a partir de glicose; Sint = Síntese de amido extra-celular.

Perfil eletroforético da SOD

Em relação à expressão eletroforética da enzima Superóxido Dismutase, os 49 isolados

dos oito gêneros de leveduras identificados foram comparados com o padrão de SOD A

humano, tendo sido observado que todas migraram em direção ao ânodo (Figura 1). Na

comparação realizada, Brettanomyces, Nadsonia e Dekkera apresentaram a mesma migração

relativa do padrão humano, tendo bandas de intensidade similar. Somente Saccharomycodes

apresentou duas bandas de SOD, sendo mais intensa a banda mais anódica, cuja migração

relativa foi maior que o padrão de SOD humana. Em Coccidiascus foi encontrada a SOD com

migração menos anódica. Kloeckera apresentou uma única banda de pouca intensidade e

migração levemente mais anódica do que o padrão humano. Schizoblastosporion produziu a

banda de SOD com maior intensidade, levemente mais anódica que a de Kloeckera. Por fim,

Saccharomycopsis teve a banda mais anódica, com intensidade similar ao padrão humano.


Figura 1: Eletroferograma comparativo do perfil eletroforético da enzima Superóxido

Dismutase entre os gêneros de leveduras isoladas. Coluna 1: padrão humano de SOD A;

Coluna 2: Saccharomycodes; Coluna 3: Brettanomyces; Coluna 4: Coccidiascus; Coluna 5:

Kloeckera; Coluna 6: Schizoblastosporion; Coluna 7: Nadsonia; Coluna 8:

Saccharomycopsis e Coluna 9: Dekkera.


Discussão

Pela variedade de leveduras encontradas neste estudo, tendo sido isolados 8 gêneros

utilizando apenas duas espécies de frutos e uma pequena amostragem, é possível especular

que a Região Nordeste do Brasil provavelmente possui uma alta diversidade destes

microrganismos ao nível de gênero, podendo ser ainda maior se considerado o nível de

espécies. Entretanto, são escassos os trabalhos relativos à micota leveduriforme do Nordeste

(5, 27, 33, 34, 59, 65).

Todas as leveduras isoladas neste trabalho são de ocorrência no campo, conforme

descrito na literatura (27, 34, 45). Dentre elas, os gêneros Brettanomyces, Kloeckera,

Dekkera, Saccharomycodes e Saccharomycopsis são de ocorrência natural em frutos (8, 27,

33, 34, 46, 57, 59, 65). As leveduras do gênero Brettanomyces vivem em associação com

diversos frutos, tendo sido isoladas de vários substratos diferentes, inclusive nos processos

fermentativos da tequila (27, 34). O gênero Kloeckera já foi isolado de diversos frutos, dentre

os quais podem ser citados pitanga (Eugenia uniflora), mangaba (Hancornia speciosa), umbú

(Spondias tuberosa) e acerola (Malpighia glabra) (59). Sua ocorrência também já foi

determinada em frutos tropicais selvagens e em maçã (Malus domestica), carambola

(Averrhoa carambola) e em uvas (Vitis vinifera) (8, 14, 46, 50). O gênero Dekkera, por sua

vez, além de ser isolado em frutas, foi descrito como um contaminante geral, sendo isolado de

queijo, vinho, bebidas fermentadas, temperos e carnes (salgadas ou ressecadas), sobrevivendo

bem aos diversos processos industriais de esterilização alimentar (33). Isolados do gênero

Saccharomycodes foram obtidos por Stead (57), a partir de plantas, frutas e vinho. Youssef e

cols (65) isolaram esta levedura, além de outros gêneros, em frutos de manga (Mangifera

indica), antes de submeter esses frutos aos raios gama, na tentativa de desenvolver um método

eficaz de esterilização de alimentos. Por sua vez, o gênero Saccharomycopsis foi observado


nos trabalhos de Madan e Gulati (34), quando detectaram as leveduras existentes na fauna

microbiana em diversos frutos.

Os demais gêneros encontrados neste trabalho (Nadsonia, Schizoblastosporion e

Coccidiascus), não têm descrição anterior de ocorrência natural em frutos, embora possam

estar presentes devido ao ambiente em volta. O gênero Nadsonia é descrito como sendo de

ocorrência geral, bastando haver fonte de carbono para sua utilização (1, 18, 42). O gênero

Schizoblastosporion é comentado em alguns estudos como sendo uma levedura de solo. Não

há registros de sua associação com frutos, e seu isolamento neste estudo provavelmente se

deva à sua presença no solo, de onde foram coletados os frutos (2, 19, 45). Por fim, o gênero

Coccidiascus é descrito por Ebbert e cols (16) como uma levedura intracelular que parasita a

mosca-das-frutas Drosophila melanogaster, ocorrendo naturalmente nas populações deste

inseto, causando infecções no aparelho digestivo. Portanto, é possível que a presença desta

levedura nos frutos estudados neste trabalho deve-se ao contato de moscas-das-frutas com os

frutos coletados.

Nenhum dos oito gêneros isolados neste estudo possui alguma referência de

investigação da enzima Superóxido Dismutase (SOD), embora esta enzima seja ricamente

estudada em outros microrganismos, tais como Rhodotorula spp, Cryptococcus spp,

Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombi e Udeniomyces spp (11, 13, 23, 30,

39, 40, 48).

A isoforma predominante de SOD em leveduras é a CuZnSOD, que responde por

aproximadamente 90% do total de atividade dismutadora durante o crescimento celular em

meios contendo açúcar (6, 20, 21, 24). Os outros 10% de dismutação correspondem à

atividade da MnSOD (21, 25, 63). A SOD3 é rara e sua ocorrência em leveduras foi registrada

apenas por Lamarre e cols (28), na fase estacionária de crescimento de Candida albicans.

Raramente CuZnSOD é encontrada em procariontes, onde a forma MnSOD está usualmente

presente. Uma forma especial desta enzima, a FeSOD, está presente em procariontes e nos


cloroplastos dos eucariontes (22). Segundo estas observações, provavelmente a SOD

encontrada neste trabalho é a isoforma citoplasmática principal CuZnSOD.

O polimorfismo estrutural detectado neste trabalho na enzima SOD está de acordo

com outras análises já relatadas na literatura, para o estabelecimento do perfil enzimático de

diversos organismos (58, 61, 67). A ausência de variabilidade da SOD nos isolados de uma

mesma espécie já era esperada, uma vez que eles devem ser clones separados durante o

isolamento. No caso dos gêneros identificados para os quais foram obtidos vários isolados, no

entanto, poderia ter ocorrido variação no padrão eletroforético de SOD, que indicaria a

presença de mais de uma espécie ou variação intraespecífica. Os gêneros Saccharomycodes,

Coccidiascus, Schizoblastosporion e Saccharomycopsis puderam ser diferenciados entre si e

das demais leveduras isoladas pelo seu padrão eletroforético da SOD, podendo ser utilizado

como um caráter diagnóstico auxiliar para confirmar suas identificações taxonômicas. A

variabilidade intergenérica da SOD verificada neste estudo, portanto, pode contribuir como

complementação para a identificação taxonômica de alguns gêneros de leveduras.


Isolation and identification of yeasts from tropical fruits and superoxide dismutase electrophoretic profile.

Abstract

Yeasts are unicellular microrganisms known mainly by the ability to ferment the

substrates to obtain energy. They are the commonest contaminants of fruits in nature, causing

significant losts in the fruit industries. However, these microrganisms are biotools largely

used in science and in industries. As aerobic organisms, the yeasts use the superoxide

dismutase (SOD) enzime as a defense mechanism against oxidative effects of free radicals.

This antioxidant activity is the reason of high interest by SOD producing microrganisms. The

objectives of this work were to isolate and taxonomic identificate the yeasts found in the

tropical fruits acerola (Malpighia glabra) and gogoia (Solanum sp.) and compare its SOD

expression. From samples of acerola from Olinda and Jaboatão dos Guararapes and samples

of gogoia from Parque Dois Irmãos, localities of the Metropolitan Region of Recife City (PE

State, Brazil), were obtained 472 yeasts isolates. A total of 49 isolates were taxonomically

identified as belonging to eight genera: Brettanomyces, Kloeckera, Coccidiascus, Nadsonia,

Dekkera, Saccharomycodes, Saccharomycopsis and Schizoblastosporion. The CuZnSOD

profile for these isolates were established by native starch gel electrophoresis, revealing

significative differences between the genera. The CuZnSOD profile can be used as diagnostic

for the genera Saccharomycodes, Coccidiascus, Schizoblastosporion and Saccharomycopsis.

This study begins the SOD characterization for these genera, contributing to the physiologic

exploitation of these microrganisms.


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Conclusões

1. Dos frutos de acerola e de gogóia coletados na Região Metropolitana do Recife (PE),

foram isoladas as leveduras Brettanomyces, Kloeckera, Nadsonia, Dekkera,

Saccharomycodes, Coccidiascus, Schizoblastosporion e Saccharomycopsis;

2. A ocorrência de oito gêneros de leveduras em três amostras sugere que a Região

Nordeste possui alta densidade de leveduras, direta ou indiretamente associadas aos

frutos;

3. O estudo da superóxido dismutase mostrou uma variabilidade significativa desta

enzima entre os gêneros isolados;

4. O perfil da SOD serviu como critério diagnóstico auxiliar para identificação das

leveduras Saccharomycodes, Coccidiascus, Schizoblastosporion e Saccharomycopsis;

5. A caracterização enzimática da SOD, neste estudo, contribuiu para o inicio da

exploração fisiológica destes microrganismos, em estudos posteriores.


7. ABSTRACT

Yeasts are unicellular microrganisms known mainly by the ability to ferment the

substrates to obtain energy. They are the commonest contaminants of fruits in nature, causing

significant losts in the fruit industries. However, these microrganisms are biotools largely

used in science and in industries. As aerobic organisms, the yeasts use the superoxide

dismutase (SOD) enzime as a defense mechanism against oxidative effects of free radicals.

This antioxidant activity is the reason of high interest by SOD producing microrganisms. The

objectives of this work were to isolate and taxonomic identificate the yeasts found in the

tropical fruits acerola (Malpighia glabra) and gogoia (Solanum sp.) and compare its SOD

expression. From samples of acerola from Olinda and Jaboatão dos Guararapes and samples

of gogoia from Parque Dois Irmãos, localities of the Metropolitan Region of Recife City (PE

State, Brazil), were obtained 472 yeasts isolates. A total of 49 isolates were taxonomically

identified as belonging to eight genera: Brettanomyces, Kloeckera, Coccidiascus, Nadsonia,

Dekkera, Saccharomycodes, Saccharomycopsis and Schizoblastosporion. The CuZnSOD

profile for these isolates were established by native starch gel electrophoresis, revealing

significative differences between the genera. The CuZnSOD profile can be used as diagnostic

for the genera Saccharomycodes, Coccidiascus, Schizoblastosporion and Saccharomycopsis.

This study begins the SOD characterization for these genera, contributing to the physiologic

exploitation of these microrganisms.

isolamento e identificaÇÃo de leveduras … · quando um nome lhe fora dado. nome do pai. claro,...

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